pobierz Informator (pdf - 6,3 MB) - Shiuz.com
pobierz Informator (pdf - 6,3 MB) - Shiuz.com
pobierz Informator (pdf - 6,3 MB) - Shiuz.com
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
INFORMATOR Nr 50/3/2011<br />
35-38°C), kontrolując przebieg<br />
ejakulacji, należy pobrać<br />
frakcję 120 ml. Uzyskaną frakcję<br />
objętościową ejakulatu inkubować<br />
1 godz. w temperaturze<br />
pokojowej w celu obniżenia<br />
temperatury nasienia, a zarazem<br />
umożliwienia „opłaszczenia”<br />
plemników substancjami<br />
białkowymi plazmy nasienia.<br />
W okresie inkubacji nasienia<br />
należy przeprowadzić analizę<br />
jego jakości obejmującą mikroskopową<br />
ocenę ruchliwości<br />
i koncentracji plemników (wymagane<br />
zastosowanie komory<br />
„Burkera”), stopnia nasilenia<br />
zjawiska aglutynacji plemników<br />
oraz ich zmian morfologicznych.<br />
Kryterium kwalifikacyjnym<br />
porcji ejakulatu do kriokonserwacji<br />
jest występowanie co najmniej<br />
70% ruchliwych plemników,<br />
zaś odsetek plemników<br />
morfologicznie zmienionych nie<br />
może przekraczać 15% (dyskwalifikować<br />
należy próbę nasienia<br />
zawierającą ponad 5%<br />
plemników z proksymalną lub<br />
dystalną kroplą protoplazmy).<br />
Spełnienie omawianych kryteriów<br />
jakościowych ejakulatu<br />
stanowi przesłankę do podjęcia<br />
etapu dializy. Jak już wcześniej<br />
sygnalizowano wprowadzenie<br />
do procedury metody<br />
dializy nasienia pozwala na redukcję<br />
stężeń niekorzystnych<br />
dla plemników substancji peptydowych<br />
oraz wolnych jonów<br />
nieorganicznych, w tym jonów<br />
cynkowych. Proces dializy<br />
ogranicza zmiany kriogeniczne/<br />
kriobiochemiczne plemników,<br />
co przejawia się ich lepszą ruchliwością<br />
po rozmrożeniu, stabilnością<br />
plazmolemy i funkcjonalnością<br />
mitochondriów.<br />
Pozwala ponadto na zastosowanie<br />
kryterium kwalifikujące-<br />
34<br />
go knury produkujące ejakulaty<br />
o dobrej przydatności do<br />
technologii mrożenia nasienia<br />
metodą „kortowską”. Sposób<br />
prowadzenia dializy umożliwia<br />
jej zainicjowanie bezpośrednio<br />
w laboratorium przekazującym<br />
próbę ejakulatu do kriokonserwacji,<br />
a następnie jej kontynuację<br />
w czasie transportu (do<br />
5 godz.) do laboratorium kriogenicznego,<br />
które przeprowadzi<br />
procedurę mrożenia nasienia.<br />
Pobraną porcję objętościową<br />
ejakulatu (120 ml) po okresie<br />
1 godz. inkubacji w temperaturze<br />
pokojowej, umieszcza<br />
się w specjalnym worku dializacyjnym<br />
(wcześniej przygotowanym)<br />
o przepuszczalności<br />
dla cząsteczek o m.cz. 12-14<br />
kDa, a następnie odpowiednio<br />
zakleszczając końce worka<br />
umieszcza się go w zlewce<br />
o pojemności 3 000 ml, wypełnioną<br />
odpowiednią objętością<br />
rozcieńczalnika Kortowo-3. Objętość<br />
rozcieńczalnika winna<br />
odpowiadać stosunkowi 1 część<br />
nasienia (tzn. 120 ml) : 10 części<br />
rozcieńczalnika. Dializowana<br />
próba nasienia (po ewentualnym<br />
transporcie z terenu) poddawana<br />
jest kolejnym etapom<br />
procedury obejmującej:<br />
• zagęszczenie prób nasienia<br />
przez ich odpowiednie odwirowanie,<br />
• rozrzedzenie osadu plemników<br />
rozcieńczalnikiem B<br />
(11% roztwór laktozy z dodatkiem<br />
5% preparatu LPFo),<br />
• schładzanie prób (ekwilibracja)<br />
3 godz. w temperaturze<br />
5°C.<br />
Ważnym elementem tego<br />
etapu jest skorygowanie ostatecznej<br />
koncentracji plemników<br />
w próbie. Wynosić ona<br />
powinna 750 mln (750x10 6 )<br />
plemników żywych w 1 ml przy<br />
końcowym stężeniu LPFo wynoszącym<br />
5%.<br />
Etapami zamykającymi postępowanie<br />
laboratoryjne jest<br />
glicerolizacja, konfekcjonowanie<br />
nasienia w tuby aluminiowe<br />
i zamrożenie nasienia. Stężenie<br />
glicerolu oraz czas jego kontaktu<br />
z plemnikami są zasadniczymi<br />
czynnikami regulującymi<br />
proces dehydratacji i rehydratacji<br />
plemników knura poddawanych<br />
technologii zamrażania.<br />
W „kortowskiej” metodzie<br />
mrożenia jego końcowe stężenie<br />
w rozcieńczalniku laktoza-<br />
-LPFo wynosi 3%, zaś czas kontaktu<br />
skrócony jest do minimum<br />
związanego z wypełnieniem<br />
nasieniem tub aluminiowych,<br />
a następnie ich zamrożeniu. Na<br />
omawianym etapie niezbędne<br />
jest rygorystyczne przestrzeganie<br />
temperatury rozcieńczalnika,<br />
która winna wynosić 5°C. Po<br />
glicerolizacji nasienia końcowa<br />
koncentracja plemników winna<br />
wynosić 500 mln (500x10 6 )<br />
w 1 ml.<br />
Mrożenie nasienia prowadzone<br />
jest w sterowanej komputerowo<br />
zamrażarce przy zastosowaniu<br />
opracowanego<br />
specjalnie dla metody „kortowskiej”<br />
programu. Po osiągnięciu<br />
w komorze zamrażarki<br />
temperatury mrożenia wynoszącej<br />
-160°C, tuby z próbami<br />
zamrożonego nasienia przenoszone<br />
są do kontenerów z ciekłym<br />
azotem. Kriokonserwowane<br />
nasienie knurów należy<br />
przechowywać w kontenerach<br />
o pojemności co najmniej<br />
30 -50 litrów i średnicy wlewu<br />
8-10 cm.<br />
Unasienianie loch nasieniem<br />
knura według metody „kortowskiej”<br />
prowadzone jest przez<br />
zastosowanie dwóch etapów<br />
przebiegu zabiegu insemina-
Change language