Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>Potravinárstvo</strong><br />
Tab. 1: (pokračovanie)<br />
Organizmus Oxidovaný eikozanoid Metódy analýzy Literatúra<br />
Acanthamoeba castellanii prostaglandíny chromatografia HADAS (1988)<br />
Tetrahymena species PGB, E, F RIA CSABA a NAGY (1987)<br />
Aloe vera PGE2, TXB2, iné prostanoidy rádiometrická analýza AFZAL et al., (1991)<br />
Sója<br />
15S-HPETE, PGF2α pri špec.<br />
podmienkach - LX<br />
RIA, GC-MS GARDNER (1991)<br />
Hmyz hlavne PGE2, PGF2α hlavne GC-MS BLOMQUIST et al., (1991)<br />
Tethys fimbria<br />
tri PG-1,15-laktóny PGE3 a<br />
HPLC, NMR DIMARZO et al., (1991)<br />
Morské živočíchy a iné vyššie a<br />
nižšie stavovce<br />
PGE 2<br />
PG merané ako PGE 2 alebo<br />
PGE 3 a iné<br />
MATERIÁL A METÓDY<br />
10 g sójových bôbov sme nechali cez noc namočených vo<br />
vode (90 ml) pri laboratórnej teplote. Napučanú sóju sme<br />
oddelili dekantáciou a zhomogenizovali v 80 ml 0,05M<br />
fosfátového tlmivého roztoku (KH2PO4 6,80 g/l, NaOH 1,7<br />
g/l, pH=7,7, teplota 5-10°C) 3 min v mixéri. Homogenát<br />
sme kvantitatívne preniesli do odmerného valca a tlmivým<br />
roztokom, doplnili na objem 100 ml. Do troch 250 ml<br />
kultivačných baniek sme odpipetovali po 1ml zriedeného<br />
homogenátu, pridali 49 ml tlmivého roztoku a pH upravili<br />
na 7,4. pomocou 1M NaOH. V slepom pokuse sme<br />
homogenát v banke povarili 2 min. Po ochladení na 0-5°C<br />
sme pridali 90 µl etanolu a 3 µl AA. Pri transformačnom<br />
experimente sme k homogenátu v banke, ktorý bol<br />
ochladený na 0-5°C pridali 90 µl etanolu a 3 µl AA.<br />
Všetky banky sme potom umiestnili na 3 h na závesnú<br />
rotačnú trepačku (3 Hz) a inkubovali pri 28°C. Po<br />
skončení transformácie sme obsah baniek okyslili 5M HCl<br />
na pH = 3 a extrahovali dichlórmetánom (2 x 50 ml). Po<br />
prefiltrovaní extraktu cez bezvodý síran sodný sme<br />
rozpúšťadlo odparili za vákua a odparok rozpustili v 1 ml<br />
chloroformu. 500 µl tohto roztoku sme delili na tenkej<br />
vrstve (Silufol, 20 x 20 cm) v sústave n-heptán : dietyléter<br />
: kyselina octová = 70:30:1 (v/v). Látky, ktoré ostali na<br />
štarte boli zo silikagélu extrahované zmesou metanol :<br />
chloroform = 2:1 (v/v), (3 x 6 ml) a rozpúšťadlo sme<br />
odfúkali v prúde dusíka. Získané metabolity sme po<br />
derivatizácii analyzovali systémom GC/MS. Eikozanoidy<br />
boli analyzované po prevedení hydroxy-, keto- a<br />
karboxylových skupín na trimetylsilyléterové, Ometyloxímové<br />
a metylesterové deriváty. Derivatizáciu<br />
sme uskutočňovali nasledovným postupom (PACE-<br />
ASCIAK, 1989):<br />
Metylestery: Ku vzorke zbavenej rozpúšťadiel sme pridali<br />
0.5 ml roztoku diazometánu (pripraveného z N-metyl-Nnitrózo-p-toluénsulfónamidu<br />
v zmesi éter : metanol (9:1,<br />
v/v). Obsah sme dôkladne premiešali a nechali reagovať<br />
275<br />
TMSO OTMS<br />
323<br />
173<br />
425<br />
COOCH 3<br />
Sumárny vzorec: C 27 H 52 O 4 Si 2<br />
Mh = 496<br />
bioanalýza (svalstvo žalúdka<br />
potkana)<br />
GERWICK (1993)<br />
30 min pri laboratórnej teplote. Po skončení reakcie boli<br />
rozpúšťadlá odfúkané dusíkom do sucha.<br />
O-metyloxímy: K suchej vzorke sme pridali 50 µl roztoku<br />
metoxyamínhydrochloridu v pyridíne (20 mg/ml) a<br />
inkubovali 1h pri 60°C (prípadne nechali reagovať cez noc<br />
pri laboratórnej teplote). Po skončení reakcie sme<br />
rozpúšťadlo odfúkali dusíkom, pridali 20 µl vody a<br />
metylestery-metyloxímy sme extrahovali 2 x 50 µl<br />
etylacetátu. Rozpúšťadlo sme opäť odfúkali v prúde<br />
dusíka.<br />
Trimetylsilylétery: K suchej vzorke sme pridali 100 µl bis-<br />
(trimetylsilyl)-trifluoroacetamidu (BSTFA) a inkubovali<br />
15 min pri 60°C (alebo nechali reagovať cez noc pri<br />
laboratórnej teplote). Po skončení reakcie sme BSTFA<br />
odfúkali prúdom dusíka. Derivatizovanú vzorku sme<br />
rozpustili v heptáne a analyzovali metódou GC/MS za<br />
týchto podmienok:<br />
Prístroj: GC/MS 25RFA (Kratos Analytical, Manchester)<br />
Kolóna: CP Sil 8CB (Supelco, USA), dĺžka - 25 m,<br />
vnútorný priemer - 0.32 mm,<br />
hrúbka fázy – 0,12 µm<br />
Prietok He: 1 ml/min<br />
Nástrek: 1 µl heptánového roztoku, splitless (30 s)<br />
Teplota injektora: 250°C<br />
Teplotný program: 80°C (1 min), 10°C/min - 250°C<br />
Spôsob ionizácie: elektrónovým nárazom (EI), energia<br />
elektrónov: 70 eV<br />
Teplota iónového zdroja: 240°C<br />
Rýchlosť scanu (rozvoja spektra): 0,6s/dekáda<br />
VÝSLEDKY A DISKUSIA<br />
Keďže sójový homogenát intenzívne transformoval<br />
exogénnu AA na polárne, PG-podobné látky (po 1 h<br />
biotransformácie bol stupeň premeny AA asi 21%,)<br />
pokúsili sme sa identifikovať jednotlivé sójové AA<br />
metabolity. Interpretácia záznamu GC/MS vyhovuje<br />
fragmentačným schémam uvedený nižšie.<br />
Obr. 1: Fragmentačná schéma pre MeTMS derivát 14,15-<br />
dihydroxy-5,8,11-eikozatriénovej kyseliny. Majoritné ióny<br />
sú podčiarknuté.<br />
ročník 4 83 1/2010
Change language