You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
aminokyselín a ión-párového činidla (súčasť mobilnej<br />
fázy). Mobilná fáza bola po príprave odplynená.<br />
Prístroje<br />
LC/ESI-MS-MS analýzy kvantitatívneho stanovenia<br />
voľných aminokyselín sa vykonali na HPLC systéme<br />
Agilent 1200 (Waldbronn, Germany) pozostávajúceho z<br />
binárnej pumpy, autosamplera a termostatu kolón,<br />
spojeného s Agilent 6410 Triple Quad detektorom a ESI<br />
interfacom. Analytická separácia sa uskutočnila na kolóne<br />
Purospher ® STAR RP-8ec (150 mm x 4.6 mm, 3 µm) a pri<br />
izokratickej elúcii. Ako mobilná fáza sa použila zmes 100<br />
ml acetonitrilu a 500 ml vodného roztoku PFOA (0.05<br />
mmol/l) pri prietoku 0,5 ml.min -1 . a pri teplote 25°C.<br />
Nastavené parametre pre ESI-MS-MS systém v tzv.<br />
MRM-móde (MRM= multiple reaction monitoring)<br />
umožňovali meranie tzv.“in-source generation“<br />
protonizovaných molekulových iónov sledovaných<br />
analytov aj použitého vnútorného štandardu (d3-Glu),<br />
a tiež umožňovali produkciu kolízne indukovaných<br />
fragmentových iónov sledovaných analytov (Tab. 1). Pre<br />
stanovenie aminokyselín boli nastavené nasledujúce<br />
parametre iónového zdroja: prietok sušiaceho plynu (N2) 8<br />
l/min., teplota sušiaceho plynu 320°C, tlak v nebulizéri 50<br />
psi, napätie v kapiláre 3 kV, fragmentor 50, dwell 50.<br />
Tabuľka 1: MRM prechody a použitý vnútorný štandard<br />
pre stanovenie voľných aminokyselín<br />
Amino- Kolízna Prekurkyselina<br />
energia zorový<br />
ión<br />
[M+H] +<br />
ProduktoVnúvý ión torný<br />
quantifier štandard<br />
(qualifier)<br />
Asn 12 133 74 (87) d3-Glu<br />
Asp 12 134 74 (88) d3-Glu<br />
Ala 6 90 44 (90) d3-Glu<br />
Arg 10 175 116 (158) d3-Glu<br />
Cys 12 122 76 (122,<br />
105)<br />
d3-Glu<br />
Gln 12 147 84 (130) d3-Glu<br />
Glu 12 148 84 (102) d3-Glu<br />
d3-Glu 12 151 87 (105)<br />
Gly 6 76 30 (76) d3-Glu<br />
His 12 156 110 (83) d3-Glu<br />
Hyp 12 132 86 (68) d3-Glu<br />
Ile 8 132 86 (69) d3-Glu<br />
Leu 8 132 86 (69) d3-Glu<br />
Lys 12 147 84 (130) d3-Glu<br />
Met 8 150 104 (133) d3-Glu<br />
Phe 10 166 120 (103) d3-Glu<br />
Pro 6 116 70 (116) d3-Glu<br />
Ser 12 106 60 (106) d3-Glu<br />
Thr 8 120 74 (102) d3-Glu<br />
Trp 10 205 146 (188) d3-Glu<br />
o-Tyr 8 182 136 (119) d3-Glu<br />
p-Tyr 8 182 165 (123) d3-Glu<br />
Val 6 118 72 (118) d3-Glu<br />
Príprava vzorky<br />
Zásobné roztoky aminokyselín 1000 µg.ml -1 boli<br />
pripravené rozpustením 25 mg každej aminokyseliny v 25<br />
ml deionizovanej vody. Pracovné štandardy boli<br />
pripravené zriedením zásobných roztokov aminokyselín<br />
<strong>Potravinárstvo</strong><br />
tak, aby vznikli roztoky s koncentráciou 0,02 – 4,00 µg.ml -<br />
1 . Každý roztok pracovného štandardu obsahoval 0.5<br />
µg/ml vnútorného štandardu (d3-Glu). Obsah jednotlivých<br />
aminokyselín vo vzorke bol určený z lineárnej kalibračnej<br />
závislosti pre príslušnú aminokyselinu (r 2 > 0,99)<br />
a vztiahnutý na návažok vzorky.<br />
Jemne pomletá alebo zhomogenizovaná vzorka (2 g) bola<br />
navážená do 30 ml centrifugačnej skúmavky. Ku vzorke sa<br />
pridalo 20 ml z roztoku kyseliny octovej (c= 0,2 mmol/l) a<br />
100 µl vnútorného štandardu zriedeného 1:10. Zmes sa 2<br />
min. miešala na Vortexe a potom sa centrifugovala pri<br />
8720 g a 0°C po dobu 10 min. 8 ml z číreho supernatantu<br />
sa prenieslo do deliaceho lievika a extrahovalo 3-krát 4 ml<br />
n-hexánu (hexánové vrstvy boli odstránené). Vodná vrstva<br />
bola pred LC/MS analýzou filtrovaná cez 0,45 µm<br />
nylonový striekačkový filter. (opakovateľnosť prípravy<br />
vzorky vyjadrená ako RSD < 10 %).<br />
Zo získaných údajov sa vypočítali základné štatistické<br />
parametre (priemer a smerodajná odchýlka) a na určenie<br />
štatistickej významnosti rozdielov dvoch priemerov sa<br />
použil Lordov test. Kritická hodnota uα pre 3 merania a<br />
hladinu významnosti α = 0,05 je 0,636.<br />
VÝSLEDKY A DISKUSIA<br />
V rámci tejto štúdie sa pre vzájomné porovnanie<br />
analyzovali 2 vzorky vlašských orechov (líšiacich sa<br />
stanovišťom aj rokom zberu) a 1 vzorka lieskových<br />
orechov (2 typy obalových materiálov). Od producentov<br />
orechov sa zistilo, že vzorka vlašských orechov bola zmes<br />
odrôd Apollo a Jupiter v nedefinovanom pomere, zatiaľ čo<br />
u lieskovcov sa nepodarilo zistiť odrodu.<br />
Na vytvorenie profilu voľných aminokyselín<br />
v sledovaných orechoch sa využila metóda kvapalinovej<br />
chromatografie v spojení s hmotnostnou detekciou<br />
(Özcan, <strong>2006</strong>), ktorá je rýchla a umožňuje simultánne<br />
stanovenie 22 voľných aminokyselín bez derivatizácie.<br />
Esenciálne aminokyseliny (histidín, lyzín, fenylalanín,<br />
metionín, leucín, izoleucín, valín a threonín) majú<br />
nenahraditeľné miesto v ľudskej výžive a niektoré<br />
vykazujú aj organoleptické vlastnosti.<br />
Pre radiačne neošetrené vzorky vlašských a lieskových<br />
orechov sa zistili porovnateľné hodnoty obsahu voľných<br />
aminokyselín (tab. 2a, b) s údajmi publikovanými<br />
Özcanom (<strong>2006</strong>), s výnimkou obsahu arginínu a histidínu,<br />
ktoré sa zaraďujú medzi hydrofilné bázické<br />
aminokyseliny. V našich vzorkách sa stanovil približne 10násobok<br />
obsahu arginínu a histidínu v porovnaní<br />
s výsledkami publikovanými Özcanom (<strong>2006</strong>). Malé<br />
rozdiely medzi vzorkami vlašských orechov môžu byť<br />
spôsobené odrodovým zložením, poveternostnými<br />
vplyvmi, stanovišťom, atď.<br />
Ošetrením orechov radiačným žiarením sa sledovala<br />
redukcia nežiadúcej mikroflóry, ale zároveň mohlo<br />
dochádzať k nežiadúcim reakciám medzi voľnými<br />
aminokyselinami a oxidovanými lipidmi, pričom<br />
k oxylabilným zlúčeninám patria hlavne sírne<br />
aminokyseliny (cystein, metionín) (Velíšek, 2002). Z<br />
výsledkov senzorického hodnotenia je zrejmé, že pre 50 %<br />
posudzovateľov z 10-členného hodnotiteľského panela je<br />
použitie už 5 kGy dávky žiarenia pre ošetrenie vlašských<br />
orechov na hrane konzumentskej prijateľnosti v dôsledku<br />
prítomnosti potuchnutej, zoxidovanej, nahorklej chuti a<br />
ročník 4 5 1/2010
Change language