111222333

ČESKÝ LÉKOPIS

2017

–

Doplněk 2020

(ČL 2017 – Dopl. 2020)

PHARMACOPOEA BOHEMICA

MMXVII

–

ADDENDUM MMXX

(Ph. B. MMXVII – Add. MMXX)

Praha, 2020

Pragae, MMXX

Grada Publishing, a.s.

OZNÁMENÍ

o vydání Českého lékopisu 2017 – Doplňku 2020

Ministerstvo zdravotnictví České republiky, na základě zmocnění § 11 písm. c) a d) zákona č. 378/2007 Sb.,

o léčivech a o změnách a doplnění některých souvisejících zákonů, ve znění pozdějších předpisů, oznamuje

vydání Českého lékopisu 2017 – Doplňku 2020, podle kterého se závazně postupuje od 1. prosince 2020.

Český lékopis 2017 – Doplněk 2020 vydalo nakladatelství GRADA Publishing, a.s., U Průhonu 22, Praha 7,

které zajistí jeho distribuci v průběhu měsíce listopadu 2020.

Ministr:

Mgr. et Mgr. Adam Vojtěch

Český lékopis 2017 – Doplněk 2020

Český lékopis 2017 – Doplněk 2020 obsahuje v Evropské části lékopisu překlad textů desátého vydání

Evropského lékopisu [European Pharmacopoeia 10 th Edition (1/2020)] a jeho dvou doplňků [Supplement 10.1

(4/2020) a Supplement 10.2 (7/2020)]. Národní část lékopisu obsahuje česká specifika.

Za správnost textu zodpovídá Ministerstvo zdravotnictví České republiky.

Grafické zpracování textu © Grada Publishing, a.s.

Vydala Grada Publishing, a.s.,

U Průhonu 22, Praha 7

První vydání, 2020

EAN 8594049240821

PŘEDMLUVA ČL 2017 – DOPL. 2020


Český lékopis 2017 – Doplněk 2020 (ČL 2017 – Dopl. 2020)

je dalším doplňkem Českého lékopisu ČL 2017. Rozhodnutí

vydat evropské 10. vydání pouze formou doplňku k Českému

lékopisu vyplynulo z posouzení počtu nových (26)

a změněných (740) textů k nezměněným (2766), které oproti

9. vydání činí asi 30 %. Protože se ale jedná o velké množství

textů (je zde zahrnuto nejen 10. vydání, ale i dva následující

doplňky), bylo tedy nutné publikaci rozdělit do dvou dílů

a použít jiné řazení kapitol, než v předchozích letech. První

díl obsahuje Národní část, Obecnou část Evropské části

a začátek Speciální části (vakcíny pro humánní i veterinární

použití, rostlinné drogy, radiofarmaka, homeopatika a vlákna).

Ve druhém dílu pokračuje Speciální část Evropské části

novými a revidovanými chemickými a biologickými články

pro léčivé látky, pomocné látky a léčivé přípravky.

Evropská část ČL 2017 – Dopl. 2020 obsahuje překlady 632

nových a změněných textů Ph. Eur. 10.0, závazného od

1. 1. 2020, 74 textů Ph. Eur. – Suppl. 10.1, závazného od

1. 4. 2020, a 53 textů Ph. Eur. – Suppl. 10.2, závazného od

1. 7. 2020.

V Evropské části je uvedeno celkem 766 textů, v Obecné

části je 70 obecných statí (z toho 5 nových), 6 revidovaných

obecných článků a 10 revidovaných obecných článků lékových

forem. Ve Speciální části jsou obsaženy texty 33 revidovaných

vakcín pro humánní použití a 40 článků vakcín

pro veterinární použití (z toho 1 nová), 4 revidované články

radiofarmak, 47 článků rostlinných drog (z toho 4 nové),

12 článků homeopatických přípravků (z toho 1 nový) a 2 revidované

články chirurgických šicích vláken pro použití

u člověka. Chemických a biologických článků pro léčivé

látky, pomocné látky a léčivé přípravky je uvedeno 540

(z toho 15 nových).

Navíc jako errata nově přetiskujeme s původním označením 7

textů, u kterých se v předchozím vydání vyskytly chyby. Byly

opraveny tiskové chyby v obecných statích 2.1.4 Síta a 5.1.10

Pokyny pro použití zkoušky na bakteriální endotoxiny, chemické

názvy nečistot v článcích Ammonii glycyrrhizas (1772)

a Olanzapinum (2258), český název v článku Hydrocodoni

hydrogenotartras dihemihydricus (1784) a název zkoumadla

v článcích rostlinných drog Myrtilli fructus recens (1602)

a Myrtilli fructus recentis extractum siccum raffinatum et

normatum (2394).

V části Zkoumadla jsou pro lepší identifikaci vedle názvu

zkoumadla nově uvedena evropská sedmimístná identifikační

čísla (v kurzívě).

V souladu s terminologií z oblasti metrologie uvedené ve

Sborníku technické harmonizace 2010, 2. vydání, bylo

Lékopisnou komisí doporučeno důsledně dodržovat překlady

anglického výrazu „accuracy“ českým termínem

„přesnost“ a výrazu „precision“ termínem „preciznost“.

V Evropské části lékopisu se vypouští obecné statě

2.6.24 Ptačí virové vakcíny: zkoušky na cizí agens v inokulech

a 2.6.25 Ptačí živé virové vakcíny: zkoušky na cizí

agens v šaržích konečného přípravku a články Sennae

angustifoliae fructus (0208) a Insulinum bovinum (1637).

Národní část ČL 2017 – Dopl. 2020 obsahuje celkem

22 textů. V její Obecné části jsou v plném znění uvedeny

tabulky I, II, III, IV, V, X a XII, které zahrnují léčivé látky

uvedené v ČL 2017, doplňcích 2018, 2019 i v tomto doplňku.

Obecná část dále obsahuje přehled aktualizovaných

zkoumadel použitých v národních článcích (kde je nadále

používáno značení „RN“) a referenčních látek použitých

v národních článcích (i zde je nadále používáno značení

„CRLN“). Národní referenční látky je možné objednat na

internetových stránkách www.sukl.cz.

Ve Speciální části Národní části je uveden nový článek

Adeps suillus stabilisatus a přepracovaný a znovu revidovaný

článek Butamirati citras. Dále byly revidovány články

Acaciae mucilago, Aqua carminativa rubra, Aqua

conservans, Mannitoli infusio, Propranololi hydrochloridi

solutio cum acido citrico, Propranololi hydrochloridi

solutio cum natrii hydrogenophosphate (redakční oprava

textu); Ethanolum benzino denaturatum (změna limitu pro

obsah benzínu) a články Ibuprofeni suppositorium, Paracetamoli

suppositorium, Paracetamoli suppositorium pro

infantibus a Sulfathiazoli globulus (ve složení opraven

odkaz na evropský článek Cacao oleum (2607)).

Z Národní části se vypouští článek Deferasiroxum (z důvodu

nahrazení evropským článkem Deferasiroxum (2933)

publikovaným v Ph. Eur. - Suppl. 10.3 se závazností

od 1. ledna 2021).

Články Adeps suillus stabilisatus a Butamirati citras byly

předloženy k veřejnému šetření (notifikovány) a pod číslem

2020/348/CZ byly oznámeny v souladu se směrnicí Evropského

parlamentu a Rady (EU) 2015/1535 ze dne 9. září 2015

o postupu při poskytování informací v oblasti technických

předpisů a předpisů pro služby informační společnosti.

Český lékopis 2017 – Dopl. 2020 je též dostupný v elektronické

verzi, která je prodávána buď v kompletu s knižním

vydáním, nebo samostatně, a obsahuje všechny nerevidované

texty ČL 2017, společně s novými a revidovanými

texty ČL 2017 – Dopl. 2018, Dopl. 2019 a Dopl. 2020.

Elektronická verze má informativní charakter a v případě

pochybností nebo sporu je rozhodující pouze tištěná verze.

Na tomto místě bych chtěla co nejsrdečněji poděkovat všem

pracovníkům, kteří se podíleli na přípravě předkládaného

Českého lékopisu 2017 – Dopl. 2020. V první řadě děkuji

členům odborných sekcí a pracovních skupin Lékopisné

komise MZ ČR, zejména pracovníkům Státního ústavu pro

kontrolu léčiv, Ústavu pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů

a léčiv, obou farmaceutických fakult a pracovníkům

některých nemocničních lékáren za jejich zájem, cenné

rady a připomínky. Dále bych chtěla poděkovat členům

Technického sekretariátu Lékopisné komise MZ ČR, zejména

tajemnici komise Ing. Haně Bízkové, za obětavou práci

při koordinaci přípravy celého díla a při konečném zpracování

textů. V neposlední řadě patří můj dík též Ministerstvu

zdravotnictví ČR za podporu a vydavatelství Grada

Publishing, a. s. za hmotné zajištění díla.

V Praze dne 31. ledna 2020

doc. PharmDr. Ludmila Matysová, Ph.D.

předsedkyně Lékopisné komise

Ministerstva zdravotnictví ČR

ČL 2017 – Dopl. 2020 3




je druhým doplňkem Českého lékopisu ČL 2017. V Evropské

části obsahuje překlady šestého až osmého doplňku devátého

vydání Evropského lékopisu (Suppl. 9.6 – 9.8). Během

přípravy ČL 2017 – Dopl. 2019 se změnilo významně

složení skupin expertů a pracovních skupin Evropské lékopisné

komise i odborných sekcí a pracovních skupin Lékopisné

komise MZ ČR, proto do tohoto doplňku je, kromě

Složení Lékopisné komise MZ ČR v Národní části, opět uvedeno

Složení Evropské lékopisné komise v Evropské části.

V Evropské části je uvedeno celkem 364 textů, z toho

v Obecné části je 50 obecných statí (z toho 4 nové), 6 obecných

článků (z toho 1 nový) a 3 revidované obecné články

lékových forem. Ve Speciální části jsou obsaženy texty

43 vakcín pro humánní použití (z toho 1 nový) a 2 revidované

články vakcín pro veterinární použití, 6 článků radiofarmak

(z toho 2 nové), 37 článků rostlinných drog (z toho

7 nových), 2 články homeopatických přípravků (z toho

1 nový) a 3 články chirurgických šicích vláken pro použití

u zvířat (z toho 1 nový). Chemických a biologických článků

pro léčivé látky, pomocné látky a léčivé přípravky je uvedeno

212 (z toho 27 nových). Oproti Evropskému lékopisu

znovu přetiskujeme 4 opravené články (označené 9.0):

Histidini hydrochloridum monohydricum (0910), Histidinum

(0911), Triethylis citras (1479) (chyba v odstavci Nečistoty)

a Norethisteroni acetas (0850) (chyběl český název).

V Evropské části lékopisu se vypouští 6 článků: Aqua valde

purificata (1927), Chlorpropamidum (1087), Oxprenololi

hydrochloridum (0628), Dihydroergotamini tartras (0600),

Filum polyamidicum-6/6 sterile in fuso ad usum veterinarium

(0610) a Filum polyamidicum-6 sterile in fuso ad

usum veterinarium (0609).



tabulky I, II, III, IV, V, VI a XII, které zahrnují léčivé látky

uvedené v ČL 2017, ČL 2017 – Dopl. 2018 i v tomto doplňku.

Revidovaná Tabulka X, uvádějící platné Standardní

názvy lékových forem, způsobů podání a obalů, je rovněž

uvedena v plném znění. Obecná část dále obsahuje přehled

aktualizovaných zkoumadel použitých v národních článcích

(kde je nadále používáno značení „RN“) a referenčních látek

použitých v národních článcích (i zde je nadále používáno

značení „CRLN“), které je možno objednat na internetových

stránkách www.sukl.cz.

Ve Speciální části Národní části jsou uvedeny dva revidované

články Ethacridini lactatis solutio (oprava tiskové

chyby – chybělo složení 1% roztoku) a Ichthammoli

unguentum (změna v obsahu síry). Tyto články byly předloženy

k veřejnému šetření (notifikovány) a pod číslem

2019/109/CZ byly oznámeny v souladu se směrnicí Evropského

parlamentu a Rady (EU) 2015/1535 ze dne 9. září

2015 o postupu při poskytování informací v oblasti technických

předpisů a předpisů pro služby informační společnosti.

Národní článek Cacao oleum se vypouští, neboť bude

nahrazen evropským článkem Theobromatis oleum (2607),

který bude publikován v Ph. Eur. 10.0 se závazností

od 1. ledna 2020.


verzi, která je prodávána samostatně nezávisle na

knižním vydání a obsahuje všechny nerevidované texty

ČL 2017, společně s novými a revidovanými texty

ČL 2017 – Dopl. 2018 a ČL 2017 – Dopl. 2019.








některých nemocničních lékáren za jejich zájem,

cenné rady a připomínky. Dále bych chtěla poděkovat členům

Technického sekretariátu Lékopisné komise MZ ČR,

zejména tajemnici komise Ing. Haně Bízkové, za obětavou

práci při koordinaci přípravy celého díla a při konečném

zpracování textů. V neposlední řadě patří můj dík též Ministerstvu

zdravotnictví ČR za podporu a vydavatelství

Grada Publishing, a. s. za hmotné zajištění díla.





4 ČL 2017 – Dopl. 2020

PŘEDMLUVA K ČL 2017 – DOPL. 2018

PŘEDMLUVA K ČL 2017 – DOPL. 2018


je prvním doplňkem nového Českého lékopisu ČL 2017.

V Evropské části obsahuje překlady prvního až pátého

doplňku devátého vydání Evropského lékopisu (Suppl. 9.1 až

9.5). Celkem se jedná o 418 textů, z toho je v Obecné části

49 obecných statí (4 nové, 45 revidovaných), 9 revidovaných

obecných článků lékových forem a 6 revidovaných obecných

článků, včetně článku Producta fermentationis (1468), který

byl rozhodnutím AP-CPH (18) 1 Výboru pro farmaceutika

a farmaceutickou péči Rady Evropy zezávazněn rychlou revizí

v souladu s Úmluvou pro vypracování Evropského lékopisu

od 1. dubna 2018. Jeho text byl současně publikován na

internetových stránkách www.sukl.cz.

Ve Speciální části jsou obsaženy texty vakcín pro humánní

(celkem 6 revidovaných článků) a veterinární použití (rovněž

6 revidovaných článků), radiofarmak (14 článků, z toho

4 nové), rostlinných drog (55 článků, z toho 14 nových),

většinou z oblasti tradiční čínské medicíny, homeopatik

(14 článků, z toho 4 nové) a chirurgických šicích vláken

(4 revidované články). Textů speciálních revidovaných nebo

korigovaných chemických článků pro léčivé a/nebo pomocné

látky je 255, z toho je 20 článků nových.



tabulky I, II, III, IV, V, VI a XII, které zahrnují léčivé látky

uvedené v ČL 2017 i v tomto doplňku. Revidovaná Tabulka

X, uvádějící platné Standardní názvy lékových forem,

způsobů podání a obalů, je rovněž uvedena v plném znění.

Dále obsahuje v Obecné části přehled aktualizovaných

zkoumadel použitých v národních článcích (kde je nadále

používáno značení „RN“) a referenčních látek použitých

v národních článcích (i zde je nadále používáno značení

„CRLN“), které jsou dostupné po objednání na internetových

stránkách www.sukl.cz.

Ve Speciální části Národní části je znovu uveden článek Butamirati

citras, limity nečistot jsou upraveny v souladu

s obecnými texty Evropské části lékopisu. Do souladu

s obecnou statí 5.1.4 Mikrobiologická jakost nesterilních

léčivých přípravků a látek pro farmaceutické použití byl revizí

uveden i článek Acidi salicylici unguentum 1% cum etheroleo

lavandulae. Tyto články byly předloženy k veřejnému

šetření (notifikovány) a pod číslem 2018/085/CZ byly oznámeny

v souladu se směrnicí Evropského parlamentu a Rady

2015/1535/ES ze dne 9. září 2015 o postupu při poskytování

informací v oblasti technických norem a předpisů a pravidel

pro služby informační společnosti.

Během přípravy ČL 2017 – Dopl. 2018 se změnilo složení

některých odborných sekcí a pracovních skupin Lékopisné

komise MZ ČR. Seznam je uveden v úvodu Národní části

ČL 2017 – Dopl. 2018.


verzi, která je prodávána samostatně nezávisle na

knižním vydání a obsahuje texty ČL 2017 společně

s novými a revidovanými texty ČL 2017 – Dopl. 2018.








některých nemocničních lékáren za jejich zájem,

cenné rady a připomínky. Dále bych chtěla poděkovat členům

Technického sekretariátu Lékopisné komise MZ ČR,

zejména tajemnici komise RNDr. Haně Lomské, za obětavou

práci při koordinaci přípravy celého díla a při konečném

zpracování textů. V neposlední řadě patří můj dík též

Ministerstvu zdravotnictví ČR za podporu a vydavatelství

Grada Publishing, a. s., za hmotné zajištění díla.





ČL 2017 – Dopl. 2020 5

PŘEDMLUVA K ČL 2017

PŘEDMLUVA K ČL 2017

Český lékopis 2017 (ČL 2017) je novým kompletním vydáním

Českého lékopisu a zároveň pokračováním ve vydávání

závazné normy pro jakost léčiv, jakými byly ČL 1997,

ČL 2002, ČL 2005, ČL 2009 a jejich doplňky.

Nový Český lékopis předkládáme naší odborné zdravotnické

veřejnosti s poměrně značným časovým odstupem daným

skutečností, že předlohy Evropské části, 7. a 8. vydání

Evropského lékopisu, obsahovaly tak malá procenta nových

a revizních textů, že zcela postačovalo jejich vydání formou

doplňků.

ČL 2017 jako úplné vydání všech textů umožňuje přiblížit

názvy článků a názvy zkoumadel Evropskému lékopisu

a provést celou řadu drobných textových změn sledujících

nové vědecko-technické směry daných oborů. Názvy solí

organických sloučenin ve zkoumadlech i článcích byly

upraveny tak, aby odpovídaly jak Evropskému lékopisu, tak

také platným pravidlům českého organického názvosloví

vycházejícího z pravidel IUPAC. V části Zkoumadla jsou

pro lepší orientaci ponechány i názvy původní s odkazem

na název nový. Změněné názvy jsou vždy doplněny názvy

původními formou synonym, aby naší odborné zdravotnické

veřejnosti byla práce s lékopisnými texty ulehčena.

Výše uvedené změny jsou promítnuty i do Národní části

ČL 2017.

ČL 2017 obsahuje v Evropské části překlady devátého vydání

Evropského lékopisu (Ph. Eur. 9.0), což zahrnuje celkem

2329 článků a 358 obecných textů, z toho je 19 nových

a revidovaných obecných textů a 866 nových a revidovaných

článků léčivých nebo pomocných látek a léčivých přípravků.

Dále obsahuje text článku Erythromycini ethylsuccinas,

který byl rychlou revizí zezávazněn Výborem pro

farmaceutika a farmaceutickou péči Rady Evropy v souladu

s Úmluvou pro vypracování Evropského lékopisu rozhodnutím

AP-CPH (17) 1 od 1. května 2017.

Národní část ČL 2017 obsahuje v Obecné části přehled aktualizovaných

zkoumadel použitých v národních článcích

(kde je nadále používáno značení „RN“) a referenčních látek

použitých v národních článcích, které jsou dostupné po

objednání na internetových stránkách www.sukl.cz. Dále je

v Obecné části uvedeno 16 tabulek. Tabulky I, II, III, IV, V,

VI, VIII, XII a XV jsou doplněny o údaje nově zařazených

látek či přípravků a nebudou zde již uvedeny látky, které

byly v některém z předchozích vydání z lékopisu vypuštěny.

Tabulka X je doplněna o údaje nově zařazených Standardních

termínů lékových forem, způsobů podání

a obalů/uzávěrů v uspořádání, jak je uvedeno v evropské

databázi. Do tabulky XI byly doplněny nové prvky.

Ve Speciální části Národní části nejsou uvedené články nadále

rozdělovány na skupiny Léčivé látky a Léčivé přípravky,

články jsou uvedeny v abecedním pořadí. Z obsahu Národní

části ČL 2017 jsou vypuštěny některé články, např.

článek Dronabinolum (pro jeho neaktuálnost), články

Aminophenazonum, Pix fagi a Pix lithanthracis (doložené

karcinogeny, dnes již obsoletní) a s tím související články

Carbonis detergens tinctura a Gelatum Holt. Vypuštěny

jsou ještě články Glyceroli suppositorium (zařazen mezi

zdravotnické prostředky) a Solutio Galli-Valerio (rovněž

není léčivým přípravkem). Článek Butamirati citras je

rovněž vypuštěn, limity nečistot nebyly v souladu s obecnými

texty Evropské části lékopisu.

Během přípravy ČL 2017 se změnilo složení některých

skupin expertů i pracovních skupin Evropské lékopisné

komise i odborných sekcí a pracovních skupin Lékopisné

komise MZ ČR.

Přehledy nového složení uvádí ČL 2017 v úvodu jednotlivých

částí vždy k danému datu.

Český lékopis 2017 je též dostupný v elektronické verzi, která

je prodávána samostatně, nezávisle na knižním vydání.



Českého lékopisu 2017. V první řadě děkuji členům odborných

sekcí a pracovních skupin Lékopisné komise MZ ČR,

zejména pracovníkům Státního ústavu pro kontrolu léčiv,

Ústavu pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv,

obou farmaceutických fakult a pracovníkům některých

nemocničních lékáren za jejich zájem, cenné rady a připomínky.

Dále bych chtěla poděkovat členům Technického

sekretariátu Lékopisné komise MZ ČR za obětavou práci

při koordinaci přípravy celého díla a při náročném konečném

zpracování textů. V neposlední řadě patří můj dík též

Ministerstvu zdravotnictví ČR za podporu a nakladatelství

Grada Publishing, a. s., za hmotné zajištění díla. Na přípravě

ČL 2017 se již bohužel nemohl podílet můj předchůdce

doc. PharmDr. Miloš Macháček, CSc., který v únoru 2016

zemřel, ale svojí mnohaletou činností v Lékopisné komisi

položil pevný základ i tomuto vydání Českého lékopisu.


doc. RNDr. Veronika Opletalová, Ph.D.



6 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Obsah

Předmluva ČL 2017 – Dopl. 2020 ............................................... 3

Předmluva ČL 2017 – Dopl. 2019 ............................................... 4

Předmluva k ČL 2017 – Dopl. 2018 ............................................ 5

Předmluva k ČL 2017 .................................................................. 6

EVROPSKÁ ČÁST

I Předmluva k 10. vydání Evropského lékopisu ..................... 33

Předmluva k 9. vydání Evropského lékopisu ....................... 36

II Úvod k 10. vydání Evropského lékopisu .............................. 39

Úvod k 9. vydání Evropského lékopisu ................................ 43

III Složení Evropské lékopisné komise, skupin expertů

a pracovních skupin .............................................................. 48

IV Texty v Evropské části ČL 2017 – Dopl. 2020 .................... 60

Nové ...................................................................................... 60

Revidované a korigované ..................................................... 60

Errata ................................................................................... 67

Vypuštěné ............................................................................. 68

IV Texty ČL 2017 - Dopl. 2019 ................................................ 69

Nové ...................................................................................... 69


Vypuštěné ............................................................................. 73

IV Texty ČL 2017 – Dopl. 2018 ................................................ 74

Nové ...................................................................................... 74


Vypuštěné ............................................................................. 78

IV Texty ČL 2017 ...................................................................... 79

Nové ...................................................................................... 79


OBECNÉ STATĚ A OBECNÉ ČLÁNKY

1 Všeobecné zásady .................................................................... 89

1.1 Obecná ustanovení ........................................................ 89

1.2 Další ustanovení týkající se obecných statí a článků ...... 90

1.3 Obecné statě ................................................................... 91

1.4 Lékopisné články (monografie) .................................... 91

1.5 Značky a symboly ......................................................... 94

1.6 Jednotky mezinárodní soustavy (SI) použité

v lékopisu a vztah k jiným jednotkám .......................... 96

2 Zkušební metody ................................................................ 99

2.1 Přístroje a jiné pomůcky ke zkoušení ........................ 99

2.1.1 Kapátka ........................................................ 99

2.1.2 Porovnávací tabulka stupňů pórovitosti

pro filtry ze slinutého skla1 ......................... 99

2.1.3 Ultrafialové lampy pro analytické účely ...... 99

2.1.4 Síta ............................................................. 100

2.1.5 Zkumavky pro porovnávací zkoušky ......... 101

2.1.6 Detekční trubičky pro plyny ...................... 101

2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody .................. 102

2.2.1 Čirost a stupeň opalescence tekutin ........... 102

2.2.2 Stupeň zbarvení tekutin ............................. 103

2.2.3 Potenciometrické stanovení pH ................. 105

2.2.4 Přibližné hodnoty pH roztoků .................... 106

2.2.5 Relativní hustota ........................................ 107

2.2.6 Index lomu ................................................. 107

2.2.7 Optická otáčivost ....................................... 107

2.2.8 Viskozita .................................................... 108

2.2.9 Měření kapilárním viskozimetrem ............. 109

2.2.10 Viskozita – měření rotačním

viskozimetrem ............................................ 110

2.2.11 Destilační rozmezí ..................................... 112

2.2.12 Teplota varu ............................................... 112

2.2.13 Stanovení vody destilací ............................ 113

2.2.14 Teplota tání – kapilární metoda ................. 113

2.2.15 Teplota tání – metoda v otevřené

kapiláře ...................................................... 114

2.2.16 Teplota tání – stanovení v kovovém

bloku .......................................................... 114

2.2.17 Teplota skápnutí ......................................... 114

2.2.18 Teplota tuhnutí ........................................... 116

2.2.19 Ampérometrické titrace ............................. 116

2.2.20 Potenciometrické titrace ............................ 117

2.2.21 Fluorimetrie ............................................... 117

2.2.22 Atomová emisní spektrometrie .................. 117

2.2.23 Atomová absorpční spektrometrie ............. 119

2.2.24 Absorpční spektrofotometrie

v infračervené oblasti ................................. 121

2.2.25 Absorpční spektrofotometrie

v ultrafialové a viditelné oblasti ................ 124

2.2.26 Papírová chromatografie ............................ 128

2.2.27 Tenkovrstvá chromatografie ...................... 129

2.2.28 Plynová chromatografie ............................. 131

2.2.29 Kapalinová chromatografie ....................... 132

2.2.30 Vylučovací chromatografie ....................... 134

2.2.31 Elektroforéza .............................................. 134

2.2.32 Ztráta sušením ............................................ 141

2.2.33 Nukleární magnetická rezonanční

spektrometrie ............................................. 141

2.2.34 Termická analýza ....................................... 145

2.2.35 Osmolalita .................................................. 148

2.2.36 Potenciometrické stanovení koncentrace

iontů pomocí iontově selektivních

elektrod ...................................................... 149

2.2.37 Rentgenová fluorescenční

spektrometrie ............................................. 150

2.2.38 Konduktivita .............................................. 152

2.2.39 Stanovení distribuce molekulových

hmotností v dextranu ................................. 154

2.2.40 Spektroskopie v blízké infračervené

oblasti ......................................................... 155

2.2.41 Cirkulární dichroismus .............................. 161

2.2.42 Hustota pevných látek ................................ 163

2.2.43 Hmotnostní spektrometrie ......................... 163

2.2.44 Celkový obsah organického uhlíku

ve vodě pro farmaceutické použití ............. 166

2.2.45 Superkritická fluidní chromatografie ......... 167

2.2.46 Chromatografické separační metody ......... 168

2.2.47 Kapilární elektroforéza .............................. 175

2.2.48 Ramanova spektroskopie ........................... 180

2.2.49 Metody měření viskozimetrem s padající

kuličkou a automatickým viskozimetrem

s valící se kuličkou .................................... 183

2.2.54 Izoelektrická fokusace ............................... 183

2.2.55 Mapování peptidů ...................................... 185

2.2.56 Analýza aminokyselin ............................... 189

2.2.57 Atomová emisní spektrometrie

s indukčně vázaným plazmatem ................ 197

2.2.58 Hmotnostní spektrometrie s indukčně

vázaným plazmatem .................................. 198

2.2.59 Analýza glykanů v glykoproteinech .......... 200

2.2.61 Charakteristika krystalických pevných

látek mikrokalorimetrií a rozpouštěcí

kalorimetrií ................................................ 206

2.2.63 Přímá ampérometrická a pulzní

elektrochemická detekce ............................ 209

2.2.64 Identifikace peptidů nukleární

magnetickou rezonanční spektrometrií ...... 210

2.2.65 Voltametrické titrace ................................. 211

2.2.66 Detekce a měření radioaktivity .................. 211

ČL 2017 – Dopl. 2020 7

OBSAH

2.3 Zkoušky totožnosti ................................................... 219

2.3.1 Zkoušky totožnosti iontů a funkčních

skupin ........................................................ 219

2.3.2 Totožnost mastných olejů tenkovrstvou

chromatografií ........................................... 222

2.3.3 Totožnost fenothiazinových derivátů

tenkovrstvou chromatografií ..................... 223

2.3.4 Pach ........................................................... 223

2.4 Limitní zkoušky ....................................................... 224

2.4.1 Amonium ................................................... 224

2.4.2 Arsen ......................................................... 224

2.4.3 Vápník ....................................................... 225

2.4.4 Chloridy ..................................................... 225

2.4.5 Fluoridy ..................................................... 225

2.4.6 Hořčík ........................................................ 225

2.4.7 Hořčík a kovy alkalických zemin .............. 226

2.4.8 Těžké kovy ................................................ 226

2.4.9 Železo ........................................................ 229

2.4.10 Olovo v cukrech ........................................ 229

2.4.11 Fosforečnany ............................................. 229

2.4.12 Draslík ....................................................... 229

2.4.13 Sírany ......................................................... 229

2.4.14 Síranový popel ........................................... 230

2.4.15 Nikl v polyolech ........................................ 230

2.4.16 Celkový popel ............................................ 230

2.4.17 Hliník ......................................................... 230

2.4.18 Volný formaldehyd .................................... 230

2.4.19 Alkalické nečistoty v mastných

olejích ........................................................ 231

2.4.20 Stanovení elementárních nečistot .............. 231

2.4.21 Cizí oleje v mastných olejích

tenkovrstvou chromatografií ..................... 235

2.4.22 Podíl mastných kyselin plynovou

chromatografií ........................................... 236

2.4.23 Steroly v mastných olejích ........................ 238

2.4.24 Totožnost a kontrola zbytkových

rozpouštědel ............................................... 241

2.4.25 Ethylenoxid a dioxan ................................. 246

2.4.26 N,N-Dimethylanilin ................................... 247

2.4.27 Těžké kovy v rostlinných drogách

a přípravcích z rostlinných drog ................ 247

2.4.28 Kyselina 2-ethylhexanová ......................... 250

2.4.29 Mastné kyseliny v olejích bohatých

na omega-3-kyseliny ................................. 250

2.4.30 Ethylenglykol a diethylenglykol

v ethoxylovaných látkách .......................... 252

2.4.31 Nikl v hydrogenovaných rostlinných

olejích ........................................................ 253

2.4.32 Celkový cholesterol v olejích bohatých

na omega-3-kyseliny ................................. 253

2.5 Stanovení obsahu ..................................................... 255

2.5.1 Číslo kyselosti ........................................... 255

2.5.2 Číslo esterové ............................................ 255

2.5.3 Číslo hydroxylové ..................................... 255

2.5.4 Číslo jodové ............................................... 255

2.5.5 Číslo peroxidové ........................................ 256

2.5.6 Číslo zmýdelnění ....................................... 257

2.5.7 Nezmýdelnitelné látky ............................... 257

2.5.8 Dusík v primárních aromatických

aminech ..................................................... 258

2.5.9 Dusík mineralizací s kyselinou

sírovou ....................................................... 258

2.5.10 Spalování organických látek v kyslíku ...... 258

2.5.11 Chelatometrické titrace .............................. 258

2.5.12 Semimikrostanovení vody ......................... 259

2.5.13 Hliník v adsorbovaných vakcínách ........... 260

2.5.14 Vápník v adsorbovaných vakcínách .......... 260

2.5.15 Fenol v imunosérech a vakcínách ............. 260

2.5.16 Bílkoviny v polysacharidových

vakcínách ................................................... 260

2.5.17 Nukleové kyseliny

v polysacharidových vakcínách ................. 260

2.5.18 Fosfor v polysacharidových vakcínách ..... 261

2.5.19 O-Acetyl v polysacharidových

vakcínách ................................................... 261

2.5.20 Hexosaminy v polysacharidových

vakcínách ................................................... 261

2.5.21 Methylpentosy v polysacharidových

vakcínách ................................................... 262

2.5.22 Kyseliny uronové v polysacharidových

vakcínách ................................................... 262

2.5.23 Kyselina sialová v polysacharidových

vakcínách ................................................... 262

2.5.24 Oxid uhličitý v plynech ............................. 263

2.5.25 Oxid uhelnatý v plynech ............................ 263

2.5.26 Oxid dusnatý a oxid dusičitý v plynech .... 264

2.5.27 Kyslík v plynech ........................................ 265

2.5.28 Voda v plynech .......................................... 265

2.5.29 Oxid siřičitý ............................................... 265

2.5.30 Oxidanty .................................................... 266

2.5.31 Ribosa v polysacharidových

vakcínách ................................................... 266

2.5.32 Mikrostanovení vody ................................. 266

2.5.33 Celkové bílkoviny ..................................... 267

2.5.34 Kyselina octová v syntetických

peptidech ................................................... 270

2.5.35 Oxid dusný v plynech ................................ 270

2.5.36 Číslo anisidinové ....................................... 271

2.5.37 Stanovení methyl-, ethyl- a isopropyl-

-methansulfonátu v kyselině

methansulfonové ....................................... 271


-methansulfonátu v léčivých látkách ......... 272

2.5.39 Stanovení methansulfonylchloridu

v kyselině methansulfonové ...................... 273


-toluensulfonátu v léčivých látkách ........... 274


-benzensulfonátu v léčivých látkách ......... 275

2.6 Biologické zkoušky ................................................. 277

2.6.1 Zkouška na sterilitu ................................... 277

2.6.2 Mykobakterie ............................................. 280

2.6.7 Mykoplazmata ........................................... 280

2.6.8 Zkouška na pyrogenní látky ...................... 286

2.6.10 Zkouška na přítomnost histaminu ............. 287

2.6.11 Zkouška na hypotenzivní látky .................. 287

2.6.12 Mikrobiologické zkoušení nesterilních

produktů: stanovení počtu

mikroorganismů ......................................... 288

2.6.13 Mikrobiologické zkoušení nesterilních

produktů: zkoušky na specifikované

mikroorganismy ......................................... 293

2.6.14 Bakteriální endotoxiny .............................. 298

2.6.15 Aktivátor prekalikreinu ............................. 303

2.6.16 Zkouška na cizí agens v humánních

virových vakcínách .................................... 303

2.6.17 Zkouška antikomplementární aktivity

imunoglobulinu ......................................... 306

2.6.18 Zkouška neurovirulence živých virových

vakcín ........................................................ 308

2.6.20 Hemaglutininy anti-A a anti-B .................. 308

2.6.21 Techniky amplifikace nukleových

kyselin ....................................................... 310

2.6.22 Aktivované koagulační faktory ................. 315

2.6.26 Zkouška na protilátky anti-D

v imunoglobulinu lidském ......................... 315

2.6.27 Mikrobiologická kontrola buněčných

přípravků ................................................... 316

2.6.30 Zkouška aktivace monocytů ...................... 319

8 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

2.6.31 Mikrobiologické zkoušení rostlinných

léčivých produktů pro perorální použití

a extraktů pro jejich přípravu ..................... 326

2.6.33 Zbytkový pertusový toxin .......................... 329

2.6.34 Stanovení bílkovin hostitelských buněk .... 331

2.6.35 Kvantifikace a charakterizace zbytkové

DNA hostitelských buněk .......................... 337

2.6.36 Mikrobiologické zkoušení živých

biologických léčivých přípravků:

stanovení počtu mikrobiálních

kontaminantů ............................................. 339

2.6.37 Principy detekce cizích virů

v imunologických veterinárních léčivých

přípravcích kultivačními metodami ........... 344

2.6.38 Mikrobiologické zkoušení živých

biologických léčivých přípravků: zkoušky

na specifikované mikroorganismy ............. 345

2.7 Metody stanovení účinnosti ..................................... 350

2.7.1 Imunochemické metody ............................. 350

2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti

antibiotik .................................................... 352

2.7.4 Stanovení účinnosti lidského

koagulačního faktoru VIII ......................... 360

2.7.5 Stanovení účinnosti heparinu ..................... 361

2.7.6 Stanovení účinnosti adsorbované

vakcíny proti záškrtu .................................. 362

2.7.7 Stanovení účinnosti vakcíny proti

dávivému kašli (celobuněčné) ................... 367

2.7.8 Stanovení účinnosti adsorbované

vakcíny proti tetanu ................................... 368

2.7.9 Zkouška na Fc funkci imunoglobulinu ...... 372


koagulačního faktoru VII ........................... 374


koagulačního faktoru IX ............................ 375

2.7.12 Stanovení účinnosti heparinu

v koagulačních faktorech ........................... 376


imunoglobulinu anti-D ............................... 376


hepatitidě A ................................................ 379


hepatitidě B (rDNA) .................................. 380

2.7.16 Stanovení účinnosti bezbuněčné vakcíny

proti dávivému kašli .................................. 381


antitrombinu III .......................................... 384


koagulačního faktoru II .............................. 384


koagulačního faktoru X ............................. 385

2.7.20 Stanovení účinnosti inaktivované

vakcíny proti poliomyelitidě (in vivo) ....... 385


von Willebrandova faktoru ........................ 387


koagulačního faktoru XI ............................ 388

2.7.23 Stanovení počtu buněk CD34/CD45+

v přípravcích pro krvetvorbu ..................... 388

2.7.24 Průtoková cytometrie ................................. 390

2.7.25 Stanovení účinnosti inhibitoru

lidského plazminu ...................................... 392

2.7.27 Flokulační hodnota (Lf) difterického

a tetanického toxinu a toxoidu

(Ramonovo stanovení) ............................... 392

2.7.28 Stanovení buněk tvořících kolonie

u lidských krvetvorných

progenitorových buněk .............................. 393

2.7.29 Stanovení počtu jaderných buněk

a životaschopnosti ...................................... 395


proteinu C .................................................. 396


proteinu S ................................................... 398

2.7.32 Stanovení účinnosti lidského inhibitoru

alfa-1-proteinasy ........................................ 398

2.7.34 Stanovení účinnosti lidského inhibitoru

C 1-esterasy ................................................. 399

2.7.35 Stanovení účinnosti/obsahu složek

vakcíny nefelometricky ............................. 399

2.8 Farmakognostické metody ....................................... 401

2.8.1 Popel nerozpustný v kyselině

chlorovodíkové .......................................... 401

2.8.2 Cizí příměsi ................................................ 401

2.8.3 Stomata (průduchy) a stomatální

index .......................................................... 401

2.8.4 Číslo bobtnavosti ....................................... 402

2.8.5 Voda v silicích ........................................... 402

2.8.6 Cizí estery v silicích ................................... 402

2.8.7 Mastné oleje a zpryskyřičnatělé silice

v silicích ..................................................... 402

2.8.8 Pach a chuť silic ......................................... 402

2.8.9 Zbytek po odpaření silic ............................ 402

2.8.10 Rozpustnost silic v ethanolu ...................... 402

2.8.11 Stanovení cineolu v silicích ....................... 403

2.8.12 Silice v rostlinných drogách ...................... 403

2.8.13 Zbytky pesticidů ........................................ 404

2.8.14 Třísloviny v rostlinných drogách ............... 406

2.8.15 Číslo hořkosti ............................................. 406

2.8.16 Zbytek po vysušení u extraktů ................... 407

2.8.17 Ztráta sušením u extraktů ........................... 407

2.8.18 Stanovení obsahu aflatoxinu B 1

v rostlinných drogách ................................ 407

2.8.20 Rostlinné drogy: vzorkování

a příprava vzorku ....................................... 409

2.8.21 Stanovení obsahu kyselin aristolochových


2.8.22 Stanovení obsahu ochratoxinu A


2.8.23 Mikroskopické hodnocení rostlinných

drog ............................................................ 414

2.8.24 Index pěnění ............................................... 415

2.8.25 Vysokoúčinná tenkovrstvá

chromatografie pro rostlinné drogy

a přípravky z rostlinných drog ................... 415

2.9 Metody farmaceutické technologie ......................... 417

2.9.1 Zkouška rozpadavosti tablet a tobolek ...... 417

2.9.2 Zkouška rozpadavosti rektálních

a vaginálních přípravků ............................. 419

2.9.3 Zkouška disoluce pevných lékových

forem .......................................................... 420

2.9.4 Zkouška disoluce transdermálních

přípravků .................................................... 426

2.9.5 Hmotnostní stejnoměrnost pevných

jednodávkových lékových forem ............... 428

2.9.6 Obsahová stejnoměrnost

jednodávkových lékových forem ............... 428

2.9.7 Oděr neobalených tablet ............................ 429

2.9.8 Pevnost tablet ............................................. 430

2.9.9 Měření konzistence penetrometricky ......... 430

2.9.10 Stanovení ethanolu ..................................... 432

2.9.11 Stanovení methanolu a propan-2-olu ......... 434

2.9.12 Klasifikace velikosti částic prášků

sítováním ................................................... 436

2.9.14 Stanovení měrné plochy povrchu

průnikem vzduchu ..................................... 436

2.9.16 Sypnost ...................................................... 438

2.9.17 Zkouška na využitelný objem

parenterálních přípravků ............................ 439

2.9.18 Přípravky k inhalaci: aerodynamické

stanovení jemných částic ........................... 439

ČL 2017 – Dopl. 2020 9

OBSAH

2.9.19 Hodnocení kontaminace částicemi pod

hranicí viditelnosti ..................................... 451

2.9.20 Hodnocení kontaminace viditelnými

částicemi .................................................... 454

2.9.22 Stanovení doby deformace lipofilních

čípků .......................................................... 454

2.9.23 Stanovení hustoty pevných látek

plynovým pyknometrem ............................ 456

2.9.25 Zkouška disoluce léčivých žvýkacích

gum ............................................................ 457

2.9.26 Specifický povrch adsorpcí plynu ............. 462

2.9.27 Hmotnostní stejnoměrnost jednotlivých

dávek ve vícedávkových obalech .............. 465

2.9.29 Pravá disoluce ............................................ 465

2.9.31 Analýza velikosti částic laserovou

difrakcí ....................................................... 466

2.9.32 Stanovení porozity a distribuce velikosti

pórů pevných látek rtuťovou

porozimetrií ............................................... 470

2.9.33 Charakterizace krystalických a částečně

krystalických pevných látek rentgenovou

práškovou difrakcí (XRPD) ....................... 472

2.9.34 Sypná hustota a setřesná hustota

prášků ........................................................ 478

2.9.35 Jemnost prášků .......................................... 480

2.9.36 Tok prášku ................................................. 480

2.9.37 Optická mikroskopie ................................. 483

2.9.38 Odhad distribuce velikosti částic

analytickým proséváním ............................ 485

2.9.39 Interakce voda-pevná látka:

stanovení izoterem sorpce desorpce

a aktivity vody ........................................... 488

2.9.40 Stejnoměrnost dávkových jednotek ........... 492

2.9.41 Oděr granulí a sféroidů .............................. 495

2.9.42 Zkouška disoluce lipofilních tuhých

lékových forem .......................................... 496

2.9.43 Zdánlivá disoluce ...................................... 497

2.9.44 Přípravky k rozprašování:

charakteristika ........................................... 498

2.9.45 Smáčivost pórovitých pevných látek

a prášků ...................................................... 501

2.9.47 Stejnoměrnost dávkových jednotek

při použití velkého počtu vzorků ............... 504

2.9.49 Stanovení tokových vlastností prášků

metodami smykové cely ............................ 507

2.9.52 Skenovací elektronová mikroskopie ......... 510

3 Obaly a obalový materiál ................................................. 515

3.1 Materiály používané pro výrobu obalů ................... 515

3.1.3 Polyolefiny ................................................ 515

3.1.4 Polyethylen bez přísad pro obaly

parenterálních a očních přípravků ............. 519

3.1.5 Polyethylen s přísadami pro obaly


3.1.6 Polypropylen pro obaly a uzávěry


3.1.7 Poly(ethylen – vinyl-acetát) pro obaly

a hadičky přípravků parenterální

výživy ........................................................ 528

3.1.8 Silikonový olej používaný jako

mazivo ....................................................... 530

3.1.9 Silikonový elastomer pro uzávěry

a hadičky .................................................... 531

3.1.10 Materiály na bázi neměkčeného

poly(vinylchloridu) pro obaly

na neinjekční vodné roztoky ...................... 532

3.1.11 Materiály na bázi neměkčeného

poly(vinylchloridu) pro obaly na pevné

lékové formy k perorálnímu podání .......... 534

3.1.13 Přísady do polymerů .................................. 536

3.1.14 Materiály na bázi měkčeného

polyvinylchloridu pro obaly na vodné

roztoky k infuzi ......................................... 540

3.1.15 Poly(ethylen-tereftalát) pro obaly

na přípravky, které nejsou určeny

k parenterálnímu podání ............................ 544

3.2 Obaly ....................................................................... 546

3.2.1 Skleněné obaly pro farmaceutické

použití ........................................................ 546

3.2.2 Obaly a uzávěry z plastů

pro farmaceutické použití .......................... 553

3.2.2.1 Obaly z plastů na vodné roztoky

pro infuzi ................................................... 554

3.2.9 Pryžové uzávěry obalů na vodné

parenterální přípravky, prášky

a lyofilizované prášky ............................... 554

3.3 Obaly na lidskou krev a krevní složky

a materiály použité k jejich výrobě; soupravy

pro transfuzi krve a materiály použité k jejich

výrobě; injekční stříkačky ....................................... 557

3.3.1 Materiály pro obaly na lidskou krev

a krevní složky ........................................... 557


polyvinylchloridu pro obaly na lidskou

krev a krevní složky .................................. 557


polyvinylchloridu pro hadičky

používané v soupravách pro transfuzi

krve a krevních složek ............................... 561

3.3.4 Sterilní obaly z plastů na lidskou krev

a krevní složky ........................................... 564

3.3.5 Prázdné sterilní obaly z měkčeného

polyvinylchloridu na lidskou krev

a krevní složky ........................................... 566

3.3.6 Sterilní obaly z měkčeného


obsahující antikoagulační roztok ............... 568

3.3.7 Soupravy pro transfuzi krve a krevních

složek ......................................................... 568

3.3.8 Sterilní injekční stříkačky z plastů

na jedno použití ......................................... 571

4 Zkoumadla ........................................................................ 573

4.1 Zkoumadla, standardní roztoky pro limitní

stanovení nečistot, tlumivé roztoky ......................... 573

4.1.1 Zkoumadla ................................................. 573

4.1.2 Standardní roztoky pro limitní

stanovení nečistot ...................................... 747

4.1.3 Tlumivé roztoky ........................................ 753

4.2 Odměrná analýza ..................................................... 762

4.2.1 Primární standardy pro odměrné

roztoky ....................................................... 762

4.2.2 Odměrné roztoky ....................................... 762

5 Obecné texty ..................................................................... 768

5.1 Obecné texty ke sterilitě .......................................... 768

5.1.1 Metody přípravy sterilních produktů ......... 768

5.1.2 Biologické indikátory a příbuzné

mikrobiální přípravky použité

při výrobě sterilních produktů ................... 772

5.1.3 Účinnost protimikrobních

konzervačních látek ................................... 776

5.1.4 Mikrobiologická jakost nesterilních

léčivých přípravků a látek

pro farmaceutické použití .......................... 777

5.1.5 Používání pojmu F 0 při sterilizaci

vodných přípravků parou ........................... 778

5.1.6 Alternativní metody kontroly

mikrobiologické jakosti ............................. 779

5.1.7 Virová bezpečnost ..................................... 790

10 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

5.1.8 Mikrobiologická jakost rostlinných

léčivých produktů pro perorální použití

a extraktů pro jejich přípravu ..................... 790

5.1.9 Pokyny k použití zkoušky na sterilitu ........ 791

5.1.10 Pokyny pro použití zkoušky

na bakteriální endotoxiny .......................... 792

5.1.11 Stanovení baktericidní, fungicidní

a levurocidní účinnosti antiseptických

léčivých přípravků ..................................... 796

5.2 Obecné texty k technologii vakcín .......................... 798

5.2.1 Terminologie použitá v článcích

biologických produktů ............................... 798

5.2.2 Chovy kuřat prosté specifikovaných

patogenů pro produkci a kontrolu

jakosti vakcín ............................................. 799

5.2.3 Buněčné substráty pro produkci

humánních vakcín ...................................... 802

5.2.4 Buněčné kultury pro produkci vakcín

pro veterinární použití ................................ 807

5.2.5 Management cizích agens

u imunologických veterinárních

léčivých přípravků ..................................... 809

5.2.6 Hodnocení bezpečnosti veterinárních

vakcín a imunosér ...................................... 820

5.2.7 Hodnocení účinku veterinárních

vakcín a imunosér ...................................... 823

5.2.8 Minimalizace rizika přenosu agens

zvířecí spongiformní encefalopatie

humánními a veterinárními léčivými

přípravky .................................................... 824

5.2.9 Hodnocení bezpečnosti každé šarže

imunosér pro veterinární použití ................ 838

5.2.11 Bílkovinné nosiče pro produkci

konjugovaných polysacharidových

vakcín pro humánní použití ....................... 839

5.2.12 Vstupní suroviny biologického původu

pro produkci léčivých přípravků pro

buněčnou a genovou terapii ....................... 840

5.2.13 Zdravé chovy kuřat pro produkci

inaktivovaných vakcín pro veterinární

použití ........................................................ 844

5.2.14 Náhrada in vivo stanovení kontroly

jakosti vakcín metodami ........................... 845

5.3 Statistické analýzy výsledků biologických

zkoušek .................................................................... 848

5.4 Zbytková rozpouštědla ............................................ 880

5.5 Tabulka závislosti hustoty na obsahu ethanolu

(lihová tabulka) ........................................................ 888

5.6 Stanovení účinnosti interferonů ............................... 898

5.7 Tabulka fyzikálních vlastností radionuklidů ........... 901

5.8 Harmonizace lékopisu ............................................. 907

5.9 Polymorfie ............................................................... 908

5.10 Kontrola nečistot v látkách pro farmaceutické

použití ...................................................................... 908

5.11 Vlastnosti v lékopisných článcích ........................... 912

5.12 Referenční standardy ............................................... 912

5.14 Léčivé přípravky pro přenos genů

pro humánní použití ................................................. 916

5.15 Funkční charakteristiky pomocných látek ............... 930

5.16 Krystalinita .............................................................. 932

5.17 Doporučení pro zkoušky lékových forem ............... 934

5.17.1 Doporučení pro zkoušku disoluce ............. 934

5.19 Příprava radiofarmak ............................................... 936

5.20 Elementární nečistoty .............................................. 943

5.21 Chemometrické metody pro analytická data ........... 944

5.22 Názvy rostlinných drog používaných

v tradiční čínské medicíně ....................................... 965

5.23 Články pro extrakty z rostlinných drog

(informační stať) ...................................................... 967

5.24 Chemické zobrazování ............................................ 969

5.25 Procesní analytická technologie .............................. 975

Obecné články ........................................................................... 979

Anticorpora monoclonalia ad usum humanum .......................... 979

Corpora ad usum pharmaceuticum ............................................. 981

Etherolea ..................................................................................... 984

Immunosera ad usum veterinarium ............................................ 986

Immunosera ex animale ad usum humanum .............................. 989

Olea plantarum pinguia .............................................................. 991

Plantae medicinales .................................................................... 993

Plantarum medicinalium extracta ............................................... 995

Plantarum medicinalium praeparata ........................................... 999

Praecursores chimici ad radiopharmaceutica ............................. 999

Praeparata pharmaceutica ......................................................... 1000

Producta ab ADN recombinante ............................................... 1002

Producta allergenica ................................................................. 1006

Producta biotherapeutica viva ad usum humanum ................... 1008

Producta cum possibili transmissione vectorium

encephalopathiarum spongiformium animalium ................ 1010

Producta fermentationis ............................................................ 1010

Radiopharmaca ......................................................................... 1012

Species ...................................................................................... 1016

Species solubiles ....................................................................... 1017

Vaccina ad usum humanum ..................................................... 1017

Vaccina ad usum veterinarium ................................................. 1021

Obecné články lékových forem ............................................. 1027

Poznámky ................................................................................. 1027

Auricularia ................................................................................ 1028

Capsulae ................................................................................... 1029

Emplastra transcutanea ............................................................. 1031

Granula ..................................................................................... 1032

Gummi manducabilia medicinalia ............................................ 1033

Inhalanda .................................................................................. 1034

Inserta intraruminalia ............................................................... 1040

Liquida cutanea ........................................................................ 1040

Liquida cutanea ad usum veterinarium ..................................... 1041

Liquida peroralia ...................................................................... 1042

Nasalia ...................................................................................... 1044

Ocularia .................................................................................... 1046

Oromucosalia ............................................................................ 1048

Parenteralia ............................................................................... 1052

Praeadmixta ad alimenta medicata ad usum veterinarium ....... 1054

Praeparata ad irrigationem ........................................................ 1055

Praeparata intramammaria ad usum veterinarium .................... 1055

Praeparata intrauterinae ad usum veterinarium ........................ 1056

Praeparata pharmaceutica in vasis cum pressu ......................... 1058

Praeparata semisolida ad usum cutaneum ................................ 1058

Praeparata semisolida peroralia ad usum veterinarium ............ 1061

Pulveres adspersorii .................................................................. 1061

Pulveres perorales ..................................................................... 1062

Rectalia ..................................................................................... 1063

Spumae medicatae .................................................................... 1065

Styli .......................................................................................... 1065

Tabulettae ................................................................................. 1066

Tampona medicata ................................................................... 1069

Vaginalia .................................................................................. 1069

SPECIÁLNÍ ČÁST

ČLÁNKY (MONOGRAFIE)

Abacaviri sulfas ........................................................................ 1072

Acaciae gummi dispersione desiccatum ................................... 1074

Acamprosatum calcicum .......................................................... 1075

Acarbosum ................................................................................ 1076

Acebutololi hydrochloridum .................................................... 1078

Aceclofenacum ......................................................................... 1080

Acemetacinum .......................................................................... 1083

Acesulfamum kalicum .............................................................. 1084

Acetazolamidum ....................................................................... 1086

Acetonum ................................................................................. 1087

Acetylcholini chloridum ........................................................... 1088

Acetylcysteinum ....................................................................... 1089

Acetyldigoxinum beta .............................................................. 1091

ČL 2017 – Dopl. 2020 11

OBSAH

Acetylenum 1% in nitrogenio intermixtum .............................. 1094

Acetyltryptophanum racemicum .............................................. 1095

Acetyltyrosinum ....................................................................... 1098

Aciclovirum .............................................................................. 1099

Acidum aceticum glaciale ........................................................ 1102

Acidum acetylsalicylicum ........................................................ 1102

Acidum adipicum ..................................................................... 1104

Acidum alginicum .................................................................... 1105

Acidum amidotrizoicum dihydricum ....................................... 1105

Acidum 4-aminobenzoicum ..................................................... 1107

Acidum aminocaproicum ......................................................... 1109

Acidum ascorbicum ................................................................. 1110

Acidum asparticum .................................................................. 1112

Acidum benzoicum .................................................................. 1114

Acidum boricum ....................................................................... 1115

Acidum chenodeoxycholicum .................................................. 1115

Acidum citricum anhydricum .................................................. 1117

Acidum citricum monohydricum ............................................. 1118

Acidum edeticum ..................................................................... 1119

Acidum etacrynicum ................................................................ 1120

Acidum folicum hydricum ....................................................... 1121

Acidum formicum .................................................................... 1123

Acidum fusidicum hemihydricum ............................................ 1124

Acidum glutamicum ................................................................. 1128

Acidum hydrochloricum concentratum .................................... 1129

Acidum hydrochloricum dilutum ............................................. 1129

Acidum iopanoicum ................................................................. 1129

Acidum ioxaglicum .................................................................. 1130

Acidum lacticum ...................................................................... 1132

Acidum lacticum S ................................................................... 1133

Acidum lactobionicum ............................................................. 1134

Acidum maleicum .................................................................... 1135

Acidum malicum racemicum ................................................... 1135

Acidum mefenamicum ............................................................. 1136

Acidum methacrylicum et ethylis acrylas

polymerisatum 1 : 1 ........................................................... 1138

Acidum methacrylicum et ethylis acrylas

polymerisatum 1 : 1 dispersio 30% .................................... 1139

Acidum methacrylicum et methylis methacrylas

polymerisatum 1 : 1 ........................................................... 1140

Acidum methacrylicum et methylis methacrylas

polymerisatum 1 : 2 ........................................................... 1141

Acidum nalidixicum ................................................................. 1143

Acidum nicotinicum ................................................................. 1144

Acidum niflumicum ................................................................. 1145

Acidum nitricum ...................................................................... 1147

Acidum octanoicum ................................................................. 1147

Acidum oleicum ....................................................................... 1148

Acidum oxolinicum .................................................................. 1149

Acidum palmiticum .................................................................. 1150

Acidum phosphoricum concentratum ...................................... 1151

Acidum phosphoricum dilutum ................................................ 1151

Acidum pipemidicum trihydricum ........................................... 1152

Acidum salicylicum ................................................................. 1153

Acidum sorbicum ..................................................................... 1154

Acidum stearicum .................................................................... 1155

Acidum sulfuricum ................................................................... 1156

Acidum tartaricum ................................................................... 1157

Acidum thiocticum ................................................................... 1157

Acidum tiaprofenicum ............................................................. 1159

Acidum tolfenamicum .............................................................. 1160

Acidum tranexamicum ............................................................. 1162

Acidum trichloraceticum .......................................................... 1163

Acidum undecylenicum ........................................................... 1164

Acidum ursodeoxycholicum .................................................... 1164

Acidum valproicum .................................................................. 1166

Acidum zoledronicum monohydricum .................................... 1168

Acitretinum .............................................................................. 1170

Adapalenum ............................................................................. 1171

Adeninum ................................................................................. 1172

Adenosinum ............................................................................. 1173

Adeps lanae .............................................................................. 1175

Adeps lanae cum aqua .............................................................. 1179

Adeps lanae hydrogenatus ........................................................ 1180

Adeps solidus ........................................................................... 1181

Adeps solidus cum additamentis .............................................. 1182

Aer medicinalis ........................................................................ 1184

Aer medicinalis artificiosus ...................................................... 1186

Alaninum .................................................................................. 1187

Albendazolum .......................................................................... 1188

Albumini humani solutio .......................................................... 1190

Alcohol benzylicus ................................................................... 1192

Alcohol cetylicus ...................................................................... 1194

Alcohol cetylstearylicus ........................................................... 1194

Alcohol cetylstearylicus emulsificans A .................................. 1195

Alcohol cetylstearylicus emulsificans B .................................. 1197

Alcohol 2,4-dichlorobenzylicus ............................................... 1198

Alcohol isopropylicus .............................................................. 1200

Alcohol oleicus ......................................................................... 1201

Alcohol polyvinylicus .............................................................. 1202

Alcohol stearylicus ................................................................... 1203

Alcoholes adipis lanae .............................................................. 1203

Alcuronii chloridum ................................................................. 1204

Alfacalcidolum ......................................................................... 1206

Alfadexum ................................................................................ 1207

Alfentanili hydrochloridum hydricum ..................................... 1209

Alfuzosini hydrochloridum ...................................................... 1210

Algeldratum .............................................................................. 1212

Alimemazini hemitartras .......................................................... 1213

Allantoinum .............................................................................. 1214

Allopurinolum .......................................................................... 1215

Almagatum ............................................................................... 1217

Almotriptani malas ................................................................... 1218

Alprazolamum .......................................................................... 1220

Alprenololi hydrochloridum ..................................................... 1222

Alprostadilum ........................................................................... 1224

Alteplasum ad iniectabile ......................................................... 1226

Altizidum .................................................................................. 1230

Aluminii chloridum hexahydricum .......................................... 1231

Aluminii hydroxidum hydricum ad adsorptionem ................... 1232

Aluminii magnesii silicas ......................................................... 1233

Aluminii natrii silicas ............................................................... 1235

Aluminii phosphas hydricus ..................................................... 1236

Aluminii phosphatis gelatum ................................................... 1237

Aluminii stearas ....................................................................... 1238

Aluminii sulfas hydricus .......................................................... 1240

Alverini citras ........................................................................... 1241

Amantadini hydrochloridum .................................................... 1242

Ambroxoli hydrochloridum ..................................................... 1243

Amfetamini sulfas .................................................................... 1245

Amikacini disulfas ................................................................... 1246

Amikacinum ............................................................................. 1249

Amiloridi hydrochloridum dihydricum .................................... 1252

Aminoglutethimidum ............................................................... 1253

Aminophyllinum anhydricum .................................................. 1255

Aminophyllinum hydricum ...................................................... 1257

Amiodaroni hydrochloridum .................................................... 1259

Amisulpridum .......................................................................... 1261

Amitriptylini hydrochloridum .................................................. 1263

Amlodipini besilas ................................................................... 1264

Ammoniae solutio concentrata ................................................. 1266

Ammonii bromidum ................................................................. 1267

Ammonii chloridum ................................................................. 1268

Ammonii glycyrrhizas .............................................................. 1268

Ammonii hydrogenocarbonas .................................................. 1269

Ammonio methacrylatis copolymerum A ................................ 1270

Ammonio methacrylatis copolymerum B ................................ 1271

Amobarbitalum ........................................................................ 1272

Amobarbitalum natricum ......................................................... 1273

Amorolfini hydrochloridum ..................................................... 1274

Amoxicillinum natricum .......................................................... 1276

Amoxicillinum trihydricum ..................................................... 1279

12 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Amphotericinum B ................................................................... 1281

Ampicillinum anhydricum ........................................................ 1283

Ampicillinum natricum ............................................................ 1286

Ampicillinum trihydricum ........................................................ 1289

Amygdalae oleum raffinatum ................................................... 1291

Amygdalae oleum virginale ..................................................... 1292

Amylmetacresolum ................................................................... 1293

Amylum pregelificatum ............................................................ 1294

Anastrozolum ........................................................................... 1295

Antazolini hydrochloridum ...................................................... 1297

Antithrombinum III humanum densatum ................................. 1298

Apomorphini hydrochloridum hemihydricum ......................... 1300

Aprepitantum ............................................................................ 1302

Aprotinini solutio concentrata .................................................. 1303

Aprotininum ............................................................................. 1306

Aqua ad dilutionem solutionum concentratarum

ad haemodialysim ............................................................... 1308

Aqua ad extractas praeparandas ............................................... 1310

Aqua pro iniectione .................................................................. 1311

Aqua purificata ......................................................................... 1314

Arachidis oleum hydrogenatum ............................................... 1317

Arachidis oleum raffinatum ...................................................... 1317

Argenti nitras ............................................................................ 1318

Argentum colloidale ad usum externum ................................... 1318

Arginini aspartas ....................................................................... 1319

Arginini hydrochloridum .......................................................... 1320

Argininum ................................................................................. 1321

Argonum ................................................................................... 1323

Aripiprazolum ........................................................................... 1324

Articaini hydrochloridum ......................................................... 1326

Ascorbylis palmitas .................................................................. 1328

Asparaginum monohydricum ................................................... 1328

Aspartamum ............................................................................. 1330

Atazanaviri sulfas ..................................................................... 1332

Atenololum ............................................................................... 1334

Atomoxetini hydrochloridum ................................................... 1336

Atorvastatinum calcicum trihydricum ...................................... 1338

Atovaquonum ........................................................................... 1341

Atracurii besilas ........................................................................ 1342

Atropini sulfas monohydricus .................................................. 1345

Atropinum ................................................................................. 1347

Azaperonum ad usum veterinarium .......................................... 1349

Azathioprinum .......................................................................... 1350

Azelastini hydrochloridum ....................................................... 1352

Azithromycinum hydricum ...................................................... 1353

Bacampicillini hydrochloridum ................................................ 1357

Bacitracinum ............................................................................. 1359

Bacitracinum zincum ................................................................ 1364

Baclofenum ............................................................................... 1368

Bambuteroli hydrochloridum ................................................... 1370

Barbitalum ................................................................................ 1371

Barii sulfas ................................................................................ 1372

Beclometasoni dipropionas anhydricus .................................... 1372

Beclometasoni dipropionas monohydricus ............................... 1376

Benazeprili hydrochloridum ..................................................... 1379

Bendroflumethiazidum ............................................................. 1381

Benperidolum ........................................................................... 1382

Benserazidi hydrochloridum .................................................... 1383

Bentonitum ............................................................................... 1385

Benzalkonii chloridi solutio ..................................................... 1385

Benzalkonii chloridum ............................................................. 1388

Benzathini benzylpenicillinum tetrahydricum ......................... 1390

Benzathini phenoxymethylpenicillinum tetrahydricum ........... 1392

Benzbromaronum ..................................................................... 1394

Benzethonii chloridum ............................................................. 1396

Benzocainum ............................................................................ 1397

Benzoylis peroxidum cum aqua ............................................... 1398

Benzydamini hydrochloridum .................................................. 1400

Benzylis benzoas ...................................................................... 1401

Benzylpenicillinum kalicum ..................................................... 1402

Benzylpenicillinum natricum ................................................... 1404

Betacarotenum .......................................................................... 1406

Betadexum ................................................................................ 1408

Betahistini dihydrochloridum ................................................... 1410

Betahistini dimesilas ................................................................. 1411

Betamethasoni acetas ............................................................... 1413

Betamethasoni dipropionas ...................................................... 1414

Betamethasoni natrii phosphas ................................................. 1417

Betamethasoni valeras .............................................................. 1419

Betamethasonum ...................................................................... 1421

Betaxololi hydrochloridum ....................................................... 1423

Bezafibratum ............................................................................ 1425

Bicalutamidum ......................................................................... 1426

Bifonazolum ............................................................................. 1428

Biotinum ................................................................................... 1429

Biperideni hydrochloridum ...................................................... 1431

Bisacodylum ............................................................................. 1433

Bismuthi subcarbonas ............................................................... 1435

Bismuthi subgallas ................................................................... 1436

Bismuthi subnitras ponderosus ................................................. 1437

Bismuthi subsalicylas ............................................................... 1437

Bisoprololi fumaras .................................................................. 1438

Bleomycini sulfas ..................................................................... 1441

Boldinum .................................................................................. 1443

Boraginis oleum raffinatum ...................................................... 1444

Brimonidini tartras ................................................................... 1445

Bromazepamum ........................................................................ 1446

Bromhexini hydrochloridum .................................................... 1448

Bromocriptini mesilas .............................................................. 1449

Bromperidoli decanoas ............................................................. 1452

Bromperidolum ........................................................................ 1454

Brompheniramini maleas ......................................................... 1456

Brotizolamum ........................................................................... 1457

Budesonidum ............................................................................ 1458

Bufexamacum ........................................................................... 1461

Buflomedili hydrochloridum .................................................... 1462

Bumetanidum ........................................................................... 1464

Bupivacaini hydrochloridum monohydricum .......................... 1465

Buprenorphini hydrochloridum ................................................ 1467

Buprenorphinum ....................................................................... 1469

Buserelinum .............................................................................. 1472

Buspironi hydrochloridum ....................................................... 1474

Busulfanum .............................................................................. 1476

Butylhydroxyanisolum ............................................................. 1477

Butylhydroxytoluenum ............................................................. 1477

Butylparabenum ....................................................................... 1478

Butylscopolaminii bromidum ................................................... 1480

Cabergolinum ........................................................................... 1482

Cacao oleum ............................................................................. 1483

Calcifediolum monohydricum .................................................. 1484

Calcii acetas .............................................................................. 1485

Calcii ascorbas dihydricus ........................................................ 1486

Calcii carbonas ......................................................................... 1487

Calcii chloridum dihydricum .................................................... 1488

Calcii chloridum hexahydricum ............................................... 1489

Calcii dobesilas monohydricus ................................................. 1489

Calcii folinas hydricus .............................................................. 1490

Calcii glucoheptonas ................................................................ 1493

Calcii gluconas anhydricus ....................................................... 1494

Calcii gluconas monohydricus ................................................. 1495

Calcii gluconas monohydricus pro iniectione .......................... 1496

Calcii glycerophosphas ............................................................. 1497

Calcii hydrogenophosphas anhydricus ..................................... 1498

Calcii hydrogenophosphas dihydricus ...................................... 1499

Calcii hydroxidum .................................................................... 1500

Calcii lactas anhydricus ............................................................ 1501

Calcii lactas monohydricus ...................................................... 1502

Calcii lactas pentahydricus ....................................................... 1502

Calcii lactas trihydricus ............................................................ 1503

Calcii laevulinas dihydricus ..................................................... 1503

ČL 2017 – Dopl. 2020 13

OBSAH

Calcii levofolinas hydricus ....................................................... 1504

Calcii pantothenas .................................................................... 1507

Calcii phosphas ........................................................................ 1509

Calcii stearas ............................................................................ 1510

Calcii sulfas dihydricus ............................................................ 1512

Calcipotriolum anhydricum ..................................................... 1512

Calcipotriolum monohydricum ................................................ 1515

Calcitoninum salmonis ............................................................. 1518

Calcitriolum .............................................................................. 1521

Camphora D ............................................................................. 1522

Camphora racemica .................................................................. 1524

Candesartanum cilexetilum ...................................................... 1525

Capecitabinum .......................................................................... 1527

Captoprilum .............................................................................. 1529

Carbacholum ............................................................................ 1532

Carbamazepinum ...................................................................... 1533

Carbasalatum calcicum ............................................................ 1535

Carbidopum monohydricum .................................................... 1536

Carbimazolum .......................................................................... 1539

Carbo activatus ......................................................................... 1540

Carbocisteinum ........................................................................ 1541

Carbomera ................................................................................ 1542

Carbonei dioxidum ................................................................... 1543

Carbonei monoxidum ............................................................... 1545

Carbonei monoxidum 5% in nitrogenio intermixtum .............. 1546

Carboplatinum .......................................................................... 1547

Carboprostum trometamolum .................................................. 1548

Carboxymethylamylum natricum A ......................................... 1549

Carboxymethylamylum natricum B ......................................... 1550

Carboxymethylamylum natricum C ......................................... 1552

Carisoprodolum ........................................................................ 1553

Carmellosum ............................................................................ 1554

Carmellosum calcicum ............................................................. 1555

Carmellosum natricum ............................................................. 1555

Carmellosum natricum conexum ............................................. 1556

Carmellosum natricum substitutum humile ............................. 1558

Carmustinum ............................................................................ 1559

Carprofenum ad usum veterinarium ......................................... 1560

Carrageenanum ........................................................................ 1562

Carteololi hydrochloridum ....................................................... 1563

Carthami oleum raffinatum ...................................................... 1564

Carvedilolum ............................................................................ 1565

Cefaclorum monohydricum ..................................................... 1566

Cefadroxilum monohydricum .................................................. 1568

Cefalexinum monohydricum .................................................... 1570

Cefalotinum natricum ............................................................... 1571

Cefamandoli nafas .................................................................... 1573

Cefapirinum natricum .............................................................. 1575

Cefatrizinum propylenglycolum .............................................. 1576

Cefazolinum natricum .............................................................. 1577

Cefepimi dihydrochloridum monohydricum ............................ 1580

Cefiximum trihydricum ............................................................ 1583

Cefoperazonum natricum ......................................................... 1584

Cefotaximum natricum ............................................................. 1586

Cefoxitinum natricum .............................................................. 1588

Cefpodoximum proxetilum ...................................................... 1590

Cefprozilum monohydricum .................................................... 1593

Cefradinum ............................................................................... 1596

Ceftazidimum pentahydricum .................................................. 1598

Ceftazidimum pentahydricum et natrii carbonas

pro iniectione ..................................................................... 1600

Ceftriaxonum natricum trihemihydricum ................................ 1603

Cefuroximum axetilum ............................................................ 1604

Cefuroximum natricum ............................................................ 1606

Celecoxibum ............................................................................ 1608

Celiprololi hydrochloridum ...................................................... 1609

Cellaburatum ............................................................................ 1611

Cellacefatum ............................................................................ 1612

Cellulae stirpes haematopoieticae humanae ............................. 1613

Cellulosi acetas ......................................................................... 1614

Cellulosi pulvis ......................................................................... 1615

Cellulosum microcristallinum .................................................. 1619

Cellulosum microcristallinum et carmellosum natricum ......... 1622

Cera alba ................................................................................... 1623

Cera carnauba ........................................................................... 1623

Cera flava ................................................................................. 1624

Cetirizini dihydrochloridum ..................................................... 1625

Cetostearomacrogolum ............................................................ 1627

Cetostearylis isononanoas ........................................................ 1628

Cetrimidum .............................................................................. 1628

Cetylis palmitas ........................................................................ 1629

Cetylpyridinii chloridum monohydricum ................................ 1630

Chitosani hydrochloridum ........................................................ 1631

Chlorali hydras ......................................................................... 1632

Chlorambucilum ....................................................................... 1632

Chloramphenicoli natrii succinas ............................................. 1634

Chloramphenicoli palmitas ...................................................... 1635

Chloramphenicolum ................................................................. 1637

Chlorcyclizini hydrochloridum ................................................ 1638

Chlordiazepoxidi hydrochloridum ........................................... 1639

Chlordiazepoxidum .................................................................. 1640

Chlorhexidini diacetas .............................................................. 1641

Chlorhexidini digluconatis solutio ........................................... 1644

Chlorhexidini dihydrochloridum .............................................. 1647

Chlormadinoni acetas ............................................................... 1649

Chlorobutanolum anhydricum ................................................. 1651

Chlorobutanolum hemihydricum ............................................. 1653

Chlorocresolum ........................................................................ 1654

Chloroquini diphosphas ........................................................... 1655

Chloroquini sulfas monohydricus ............................................ 1656

Chlorphenamini maleas ............................................................ 1656

Chlorpromazini hydrochloridum .............................................. 1658

Chlorprothixeni hydrochloridum ............................................. 1660

Chlortalidonum ........................................................................ 1662

Chlortetracyclini hydrochloridum ............................................ 1663

Cholesterolum .......................................................................... 1666

Cholesterolum ad usum parenteralem ...................................... 1668

Chondroitini natrii sulfas .......................................................... 1669

Chymotrypsinum ...................................................................... 1672

Ciclesonidum ............................................................................ 1673

Ciclopiroxum ............................................................................ 1674

Ciclopiroxum olaminum .......................................................... 1676

Ciclosporinum .......................................................................... 1678

Cilastatinum natricum .............................................................. 1679

Cilazaprilum monohydricum ................................................... 1681

Cimetidini hydrochloridum ...................................................... 1683

Cimetidinum ............................................................................. 1685

Cinchocaini hydrochloridum .................................................... 1687

Cineolum .................................................................................. 1688

Cinnarizinum ............................................................................ 1689

Ciprofibratum ........................................................................... 1691

Ciprofloxacini hydrochloridum hydricum ............................... 1692

Ciprofloxacinum ...................................................................... 1694

Cisatracurii besilas ................................................................... 1696

Cisplatinum .............................................................................. 1701

Citaloprami hydrobromidum .................................................... 1702

Citaloprami hydrochloridum .................................................... 1704

Cladribinum .............................................................................. 1706

Clarithromycinum .................................................................... 1708

Clazurilum ad usum veterinarium ............................................ 1711

Clebopridi malas ...................................................................... 1713

Clemastini fumaras ................................................................... 1715

Clenbuteroli hydrochloridum ................................................... 1716

Clindamycini hydrochloridum ................................................. 1718

Clindamycini phosphas ............................................................ 1720

Clioquinolum ............................................................................ 1723

Clobazamum ............................................................................ 1724

Clobetasoli propionas ............................................................... 1725

Clobetasoni butyras .................................................................. 1727

Clofaziminum ........................................................................... 1729

Clofibratum .............................................................................. 1730

Clomifeni citras ........................................................................ 1731

14 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Clomipramini hydrochloridum ................................................. 1733

Clonazepamum ......................................................................... 1735

Clonidini hydrochloridum ........................................................ 1736

Clopamidum ............................................................................. 1737

Clopidogreli besilas .................................................................. 1739

Clopidogreli hydrochloridum ................................................... 1741

Clopidogreli sulfas .................................................................... 1743

Closantelum natricum dihydricum ad usum veterinarium ....... 1745

Clotrimazolum .......................................................................... 1747

Cloxacillinum natricum monohydricum ................................... 1749

Clozapinum ............................................................................... 1750

Cocaini hydrochloridum ........................................................... 1752

Cocois oleum raffinatum .......................................................... 1753

Cocoylis octanodecanoas .......................................................... 1754

Codeini hydrochloridum dihydricum ....................................... 1755

Codeini phosphas hemihydricus ............................................... 1757

Codeini phosphas sesquihydricus ............................................. 1760

Codeinum monohydricum ........................................................ 1762

Codergocrini mesilas ................................................................ 1765

Coffeinum ................................................................................. 1766

Coffeinum monohydricum ....................................................... 1768

Colchicinum ............................................................................. 1770

Colecalciferoli pulvis ................................................................ 1772

Colecalciferolum ...................................................................... 1773

Colecalciferolum densatum oleosum ....................................... 1775

Colecalciferolum in aqua dispergibile ...................................... 1776

Colestyraminum ....................................................................... 1778

Colistimethatum natricum ........................................................ 1779

Colistini sulfas .......................................................................... 1782

Copolymerum macrogolo et alcoholi poly(vinylico)

constatum ........................................................................... 1784

Copolymerum methacrylatis butylati basicum ......................... 1786

Copovidonum ........................................................................... 1787

Cortisoni acetas ........................................................................ 1790

Cresolum crudum ..................................................................... 1792

Crospovidonum ........................................................................ 1793

Crotamitonum ........................................................................... 1794

Cupri sulfas anhydricus ............................................................ 1796

Cupri sulfas pentahydricus ....................................................... 1796

Cyanocobalaminum .................................................................. 1797

Cyclizini hydrochloridum ......................................................... 1798

Cyclopentolati hydrochloridum ................................................ 1800

Cyclophosphamidum monohydricum ...................................... 1801

Cyproheptadini hydrochloridum sesquihydricum .................... 1802

Cyproteroni acetas .................................................................... 1803

Cysteini hydrochloridum monohydricum ................................. 1805

Cystinum ................................................................................... 1807

Cytarabinum ............................................................................. 1809

Dacarbazinum ........................................................................... 1811

Dalteparinum natricum ............................................................. 1813

Danaparoidum natricum ........................................................... 1814

Dapsonum ................................................................................. 1817

Daunorubicini hydrochloridum ................................................ 1818

Decylis oleas ............................................................................. 1819

Deferiproni solutio peroralis ..................................................... 1820

Deferiproni tabulettae ............................................................... 1821

Deferipronum ........................................................................... 1822

Deferoxamini mesilas ............................................................... 1823

Dembrexini hydrochloridum monohydricum

ad usum veterinarium ......................................................... 1826

Demeclocyclini hydrochloridum .............................................. 1827

Deptropini citras ....................................................................... 1829

Dequalinii dichloridum ............................................................. 1831

3-O-Desacyl-4'-monophosphoryllipidum A ............................. 1832

Desfluranum ............................................................................. 1834

Desipramini hydrochloridum .................................................... 1836

Deslanosidum ........................................................................... 1837

Desloratadinum ......................................................................... 1838

Desmopressinum ...................................................................... 1839

Desogestrelum .......................................................................... 1841

Detomidini hydrochloridum ad usum veterinarium ................. 1842

Dexamethasoni acetas .............................................................. 1843

Dexamethasoni isonicotinas ..................................................... 1846

Dexamethasoni natrii phosphas ................................................ 1847

Dexamethasonum ..................................................................... 1850

Dexamfetamini sulfas ............................................................... 1852

Dexchlorpheniramini maleas .................................................... 1854

Dexpanthenolum ...................................................................... 1856

Dextranomerum ........................................................................ 1857

Dextranum 1 pro iniectione ...................................................... 1857

Dextranum 40 pro iniectione .................................................... 1858



Dextrinum ................................................................................. 1861

Dextromethorphani hydrobromidum monohydricum .............. 1862

Dextromoramidi tartras ............................................................ 1864

Dextropropoxypheni hydrochloridum ...................................... 1864

Diacereinum ............................................................................. 1866

Diazepamum ............................................................................. 1868

Diazoxidum .............................................................................. 1870

Dibrompropamidini diisethionas .............................................. 1871

Dibutylis phthalas ..................................................................... 1872

Diclazurilum ad usum veterinarium ......................................... 1873

Diclofenacum kalicum ............................................................. 1875

Diclofenacum natricum ............................................................ 1876

Dicloxacillinum natricum monohydricum ............................... 1878

Dicycloverini hydrochloridum ................................................. 1880

Didanosinum ............................................................................ 1881

Dienogestum ............................................................................. 1883

Diethylcarbamazini citras ......................................................... 1885

Diethylenglycoli monoethylicum etherum ............................... 1887

Diethylenglycoli palmitostearas ............................................... 1888

Diethylis phthalas ..................................................................... 1889

Diethylstilbestrolum ................................................................. 1890

Difloxacini hydrochloridum trihydricum


Digitoxinum .............................................................................. 1893

Digoxinum ................................................................................ 1894

Dihydralazini sulfas dihemihydricus ........................................ 1898

Dihydrocodeini tartras .............................................................. 1899

Dihydroergocristini mesilas ..................................................... 1901

Dihydroergotamini mesilas ...................................................... 1903

Dihydrostreptomycini sulfas ad usum veterinarium ................ 1906

Dihydrotachysterolum .............................................................. 1908

Dikalii clorazepas monohydricus ............................................. 1910

Diltiazemi hydrochloridum ...................................................... 1911

Dimenhydrinatum ..................................................................... 1913

Dimercaprolum ......................................................................... 1915

Dimethylacetamidum ............................................................... 1916

Dimethylis sulfoxidum ............................................................. 1917

Dimeticonum ............................................................................ 1918

Dimetindeni maleas .................................................................. 1919

Dinatrii calcii edetas hydricus .................................................. 1921

Dinatrii clodronas tetrahydricus ............................................... 1922

Dinatrii cromoglicas ................................................................. 1923

Dinatrii edetas dihydricus ......................................................... 1925

Dinatrii etidronas ...................................................................... 1926

Dinatrii pamidronas pentahydricus .......................................... 1926

Dinitrogenii oxidum ................................................................. 1927

Dinoprostonum ......................................................................... 1929

Dinoprostum trometamolum .................................................... 1930

Diosminum ............................................................................... 1932

Diphenhydramini hydrochloridum ........................................... 1934

Diphenoxylati hydrochloridum ................................................ 1935

Dipivefrini hydrochloridum ..................................................... 1936

Diprophyllinum ........................................................................ 1938

Dipyridamolum ........................................................................ 1939

Dirithromycinum ...................................................................... 1941

Disopyramidi phosphas ............................................................ 1943

Disopyramidum ........................................................................ 1945

Disulfiramum ............................................................................ 1946

ČL 2017 – Dopl. 2020 15

OBSAH

Dithranolum ............................................................................. 1947

Dobutamini hydrochloridum .................................................... 1948

Docetaxelum anhydricum ........................................................ 1949

Docetaxelum trihydricum ......................................................... 1952

Docusatum natricum ................................................................ 1953

Dodecylis gallas ....................................................................... 1954

Domperidoni maleas ................................................................ 1955

Domperidonum ........................................................................ 1957

Donepezili hydrochloridum anhydricum ................................. 1959

Donepezili hydrochloridum monohydricum ............................ 1960

Dopamini hydrochloridum ....................................................... 1962

Dopexamini dihydrochloridum ................................................ 1963

Dorzolamidi hydrochloridum ................................................... 1965

Dosulepini hydrochloridum ..................................................... 1967

Doxaprami hydrochloridum monohydricum ............................ 1969

Doxazosini mesilas ................................................................... 1970

Doxepini hydrochloridum ........................................................ 1972

Doxorubicini hydrochloridum .................................................. 1973

Doxycyclini hyclas ................................................................... 1975

Doxycyclinum monohydricum ................................................. 1977

Doxylamini hydrogenosuccinas ............................................... 1979

Dronedaroni hydrochloridum ................................................... 1980

Droperidolum ........................................................................... 1981

Drospirenonum ......................................................................... 1983

Duloxetini hydrochloridum ...................................................... 1985

Dutasteridum ............................................................................ 1987

Dydrogesteronum ..................................................................... 1989

Ebastinum ................................................................................. 1991

Econazoli nitras ........................................................................ 1992

Econazolum .............................................................................. 1993

Edrophonii chloridum .............................................................. 1995

Emedastini difumaras ............................................................... 1995

Enalaprilatum dihydricum ........................................................ 1997

Enalaprili maleas ...................................................................... 1999

Enilconazolum ad usum veterinarium ...................................... 2001

Enoxaparinum natricum ........................................................... 2002

Enoxolonum ............................................................................. 2005

Enrofloxacinum ad usum veterinarium .................................... 2006

Entacaponum ............................................................................ 2008

Entecavirum monohydricum .................................................... 2009

Ephedrini hydrochloridum ....................................................... 2011

Ephedrini racemici hydrochloridum ........................................ 2013

Ephedrinum anhydricum .......................................................... 2014

Ephedrinum hemihydricum ...................................................... 2015

Epinastini hydrochloridum ....................................................... 2015

Epinephrini tartras .................................................................... 2017

Epinephrinum ........................................................................... 2018

Epirubicini hydrochloridum ..................................................... 2020

Eplerenonum ............................................................................ 2022

Ergocalciferolum ...................................................................... 2024

Ergometrini maleas .................................................................. 2026

Ergotamini tartras ..................................................................... 2028

Erythritolum ............................................................................. 2030

Erythromycini estolas ............................................................... 2031

Erythromycini ethylsuccinas .................................................... 2035

Erythromycini lactobionas ....................................................... 2039

Erythromycini stearas ............................................................... 2043

Erythromycinum ...................................................................... 2046

Erythropoietini solutio concentrata .......................................... 2051

Escitaloprami oxalas ................................................................ 2056

Escitalopramum ........................................................................ 2058

Esketamini hydrochloridum ..................................................... 2061

Esomeprazolum magnesicum dihydricum ............................... 2062

Esomeprazolum magnesicum trihydricum ............................... 2064

Esomeprazolum natricum ......................................................... 2066

Estradioli benzoas .................................................................... 2068

Estradioli valeras ...................................................................... 2070

Estradiolum hemihydricum ...................................................... 2072

Estriolum .................................................................................. 2073

Estrogena coniugata ................................................................. 2075

Etamsylatum ............................................................................. 2079

Etanerceptum ............................................................................ 2080

Ethacridini lactas monohydricus .............................................. 2085

Ethambutoli dihydrochloridum ................................................ 2086

Ethanolum 96% (V/V) .............................................................. 2088

Ethanolum anhydricum ............................................................ 2090

Ether anestheticus ..................................................................... 2092

Ether solvens ............................................................................ 2093

Ethinylestradiolum ................................................................... 2093

Ethionamidum .......................................................................... 2096

Ethosuximidum ........................................................................ 2097

Ethylcellulosum ........................................................................ 2099

Ethylendiaminum ..................................................................... 2101

Ethylenglycoli monopalmitostearas ......................................... 2101

Ethylis acetas ............................................................................ 2102

Ethylis oleas ............................................................................. 2103

Ethylmorphini hydrochloridum dihydricum ............................ 2103

Ethylparabenum ....................................................................... 2105

Ethylparabenum natricum ........................................................ 2106

Etilefrini hydrochloridum ......................................................... 2108

Etodolacum .............................................................................. 2110

Etofenamatum .......................................................................... 2112

Etomidatum .............................................................................. 2114

Etoposidum .............................................................................. 2115

Eugenolum ............................................................................... 2119

Everolimusum .......................................................................... 2121

Exemestanum ........................................................................... 2124

Factoris VIIa coagulationis humani (ADNr) solutio

concentrata ......................................................................... 2126

Factoris IX coagulationis humani (ADNr) pulvis

pro solutione iniectabili ..................................................... 2131

Factoris IX coagulationis humani (ADNr) solutio

concentrata ......................................................................... 2134

Factor VII coagulationis humanus ........................................... 2140

Factor VIII coagulationis humanus .......................................... 2141

Factor VIII coagulationis humanus (ADNr) ............................ 2142

Factor IX coagulationis humanus ............................................. 2144

Factor XI coagulationis humanus ............................................. 2145

Factor von Willebrand humanus .............................................. 2146

Famotidinum ............................................................................ 2147

Febantelum ad usum veterinarium ........................................... 2149

Felbinacum ............................................................................... 2150

Felodipinum ............................................................................. 2151

Felypressinum .......................................................................... 2153

Fenbendazolum ad usum veterinarium .................................... 2154

Fenbufenum .............................................................................. 2155

Fenofibratum ............................................................................ 2157

Fenoteroli hydrobromidum ...................................................... 2158

Fentanyli citras ......................................................................... 2159

Fentanylum ............................................................................... 2161

Fenticonazoli nitras .................................................................. 2163

Ferri chloridum hexahydricum ................................................. 2165

Ferrosi fumaras ......................................................................... 2165

Ferrosi gluconas hydricus ........................................................ 2167

Ferrosi sulfas heptahydricus ..................................................... 2168

Ferrosi sulfas siccatus .............................................................. 2169

Fexofenadini hydrochloridum .................................................. 2170

Fibrini glutinum ....................................................................... 2172

Fibrinogenum humanum .......................................................... 2174

Filgrastimi solutio concentrata ................................................. 2174

Filgrastimi solutio iniectabilis .................................................. 2177

Finasteridum ............................................................................. 2180

Fingolimodi hydrochloridum ................................................... 2181

Fipronilum ad usum veterinarium ............................................ 2183

Flavoxati hydrochloridum ........................................................ 2184

Flecainidi acetas ....................................................................... 2185

Flubendazolum ......................................................................... 2187

Flucloxacillinum magnesicum octahydricum .......................... 2188

Flucloxacillinum natricum monohydricum .............................. 2190

Fluconazolum ........................................................................... 2192

16 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Flucytosinum ............................................................................ 2194

Fludarabini phosphas ................................................................ 2196

Fludrocortisoni acetas ............................................................... 2198

Flumazenilum ........................................................................... 2200

Flumequinum ............................................................................ 2201

Flumetasoni pivalas .................................................................. 2202

Flunarizini dihydrochloridum ................................................... 2204

Flunitrazepamum ...................................................................... 2205

Flunixini megluminum ad usum veterinarium ......................... 2206

Fluocinoloni acetonidum .......................................................... 2208

Fluocortoloni pivalas ................................................................ 2210

Fluoresceinum .......................................................................... 2212

Fluoresceinum natricum ........................................................... 2214

Fluorouracilum ......................................................................... 2215

Fluoxetini hydrochloridum ....................................................... 2217

Flupentixoli dihydrochloridum ................................................. 2219

Fluphenazini decanoas .............................................................. 2221

Fluphenazini dihydrochloridum ............................................... 2223

Fluphenazini enantas ................................................................ 2225

Flurazepami hydrochloridum ................................................... 2227

Flurbiprofenum ......................................................................... 2228

Fluspirilenum ............................................................................ 2229

Flutamidum ............................................................................... 2231

Fluticasoni propionas ................................................................ 2232

Flutrimazolum .......................................................................... 2234

Fluvastatinum natricum hydricum ............................................ 2236

Fluvoxamini maleas .................................................................. 2238

Follitropini solutio concentrata ................................................. 2240

Follitropinum ............................................................................ 2246

Formaldehydi solutio 35% ....................................................... 2252

Formoteroli fumaras dihydricus ............................................... 2253

Foscarnetum natricum hexahydricum ...................................... 2256

Fosfomycinum calcicum monohydricum ................................. 2257

Fosfomycinum dinatricum ........................................................ 2258

Fosfomycinum trometamolum ................................................. 2260

Fosinoprilum natricum ............................................................. 2261

Framycetini sulfas .................................................................... 2264

Fructosum ................................................................................. 2266

Fulvestrantum ........................................................................... 2267

Furosemidum ............................................................................ 2269

Gabapentinum ........................................................................... 2271

Gadobutrolum monohydricum ................................................. 2272

Gadodiamidum hydricum ......................................................... 2274

Galactosum ............................................................................... 2276

Galantamini hydrobromidum ................................................... 2278

Gammadexum ........................................................................... 2281

Ganciclovirum .......................................................................... 2283

Gefitinibum ............................................................................... 2285

Gelatina ..................................................................................... 2286

Gemcitabini hydrochloridum .................................................... 2287

Gemfibrozilum ......................................................................... 2289

Gentamicini sulfas .................................................................... 2290

Gestodenum .............................................................................. 2293

Glibenclamidum ....................................................................... 2295

Gliclazidum .............................................................................. 2297

Glimepiridum ........................................................................... 2298

Glipizidum ................................................................................ 2301

Glucagonum humanum ............................................................ 2303

Glucosamini hydrochloridum ................................................... 2305

Glucosamini sulfas et kalii chloridum ...................................... 2306

Glucosamini sulfas et natrii chloridum ..................................... 2307

Glucosum anhydricum .............................................................. 2309

Glucosum liquidum .................................................................. 2310

Glucosum liquidum dispersione desiccatum ............................ 2311

Glucosum monohydricum ........................................................ 2312

Glutathionum ............................................................................ 2314

Glycerolformalum .................................................................... 2316

Glyceroli dibehenas .................................................................. 2316

Glyceroli distearas .................................................................... 2317

Glyceroli monolinoleas ............................................................ 2318

Glyceroli monooctanoas ........................................................... 2320

Glyceroli monooctanodecanoas ............................................... 2321

Glyceroli monooleas ................................................................. 2322

Glyceroli monostearas 40-55 .................................................... 2323

Glyceroli trinitratis solutio ....................................................... 2325

Glycerolum ............................................................................... 2327

Glycerolum 85% ....................................................................... 2328

Glyceromacrogoli cocoates ...................................................... 2330

Glyceromacrogoli hydroxystearas ............................................ 2331

Glyceromacrogoli laurates ....................................................... 2332

Glyceromacrogoli linoleates ..................................................... 2333

Glyceromacrogoli 20 monostearas ........................................... 2334

Glyceromacrogoli 6 octanodecanoas ........................................ 2335

Glyceromacrogoli octanodecanoates ........................................ 2335

Glyceromacrogoli oleates ......................................................... 2337

Glyceromacrogoli ricinoleas .................................................... 2338

Glyceromacrogoli stearates ...................................................... 2339

Glycinum .................................................................................. 2340

Glycopyrronii bromidum .......................................................... 2342

Gonadorelini acetas .................................................................. 2344

Gonadotropinum chorionicum ................................................. 2346

Gonadotropinum sericum equinum ad usum veterinarium ...... 2346

Goserelinum ............................................................................. 2347

Gossypii oleum hydrogenatum ................................................. 2349

Gramicidinum ........................................................................... 2350

Granisetroni hydrochloridum ................................................... 2352

Griseofulvinum ......................................................................... 2353

Guaiacolum .............................................................................. 2355

Guaifenesinum .......................................................................... 2357

Guanethidini monosulfas .......................................................... 2358

Guar galactomannanum ............................................................ 2359

Halofantrini hydrochloridum .................................................... 2361

Haloperidoli decanoas .............................................................. 2362

Haloperidolum .......................................................................... 2364

Halothanum .............................................................................. 2366

Helianthi oleum raffinatum ...................................................... 2367

Helium ...................................................................................... 2368

Heparina massae molecularis minoris ...................................... 2369

Heparinum calcicum ................................................................. 2372

Heparinum natricum ................................................................. 2374

Heptaminoli hydrochloridum ................................................... 2377

Hexamidini diisetionas ............................................................. 2378

Hexetidinum ............................................................................. 2379

Hexylresorcinolum ................................................................... 2380

Histamini dihydrochloridum .................................................... 2382

Histidini hydrochloridum monohydricum ................................ 2383

Histidinum ................................................................................ 2384

Homatropini hydrobromidum ................................................... 2386

Homatropini methylbromidum ................................................. 2387

Hyaluronidasum ....................................................................... 2389

Hydralazini hydrochloridum .................................................... 2390

Hydrargyri dichloridum ............................................................ 2391

Hydrocodoni hydrogenotartras dihemihydricus ....................... 2391

Hydrocortisoni acetas ............................................................... 2394

Hydrocortisoni hydrogenosuccinas .......................................... 2396

Hydrocortisonum ...................................................................... 2398

Hydrogenii peroxidum 3% ....................................................... 2401

Hydrogenii peroxidum 30% ..................................................... 2402

Hydromorphoni hydrochloridum ............................................. 2402

Hydroxocobalamini acetas ....................................................... 2403

Hydroxocobalamini hydrochloridum ....................................... 2405

Hydroxocobalamini sulfas ........................................................ 2406

Hydroxycarbamidum ................................................................ 2407

Hydroxychloroquini sulfas ....................................................... 2408

Hydroxyethylamyla .................................................................. 2410

Hydroxyethylis salicylas .......................................................... 2414

Hydroxypropylamylum ............................................................ 2415

Hydroxypropylamylum pregelificatum .................................... 2417

Hydroxypropylbetadexum ........................................................ 2419

Hydroxyzini dihydrochloridum ................................................ 2421

ČL 2017 – Dopl. 2020 17

OBSAH

Hyetellosum ............................................................................. 2423

Hymecromonum ....................................................................... 2425

Hymetellosum .......................................................................... 2426

Hyoscyamini sulfas dihydricus ................................................ 2427

Hyprolosum .............................................................................. 2429

Hyprolosum substitutum humile .............................................. 2431

Hypromellosi phthalas ............................................................. 2432

Hypromellosum ........................................................................ 2433

Ibuprofenum ............................................................................. 2436

Ichthammolum ......................................................................... 2438

Idoxuridinum ............................................................................ 2439

Ifosfamidum ............................................................................. 2440

Imatinibi mesilas ...................................................................... 2442

Imidaclopridum ad usum veterinarium .................................... 2445

Imipenemum monohydricum ................................................... 2447

Imipramini hydrochloridum ..................................................... 2448

Immunoglobulinum anti-T lymphocytorum ex animale

ad usum humanum ............................................................. 2449

Immunoglobulinum humanum anti-D ...................................... 2453

Immunoglobulinum humanum anti-D

ad usum intravenosum ....................................................... 2454

Immunoglobulinum humanum hepatitidis A ........................... 2454

Immunoglobulinum humanum hepatitidis B ........................... 2455

Immunoglobulinum humanum hepatitidis B

ad usum intravenosum ....................................................... 2455

Immunoglobulinum humanum morbillicum ............................ 2456

Immunoglobulinum humanum normale ad usum

intramuscularium ............................................................... 2456


intravenosum ...................................................................... 2458


subcutaneum ...................................................................... 2460

Immunoglobulinum humanum rabicum ................................... 2462

Immunoglobulinum humanum rubellae ................................... 2464

Immunoglobulinum humanum tetanicum ................................ 2464

Immunoglobulinum humanum varicellae ................................ 2467

Immunoglobulinum humanum varicellae ad usum

intravenosum ...................................................................... 2467

Indapamidum ............................................................................ 2467

Indinaviri sulfas ethanolas ........................................................ 2470

Indometacinum ......................................................................... 2472

Infliximabum solutio concentrata ............................................ 2474

Inhibitor alfa-1 proteinasi humanus ......................................... 2480

Inhibitor C 1-esterasi humanus .................................................. 2482

Inositolum ................................................................................ 2483

Insulini biphasici iniectio ......................................................... 2484

Insulini isophani biphasici iniectio ........................................... 2484

Insulini isophani iniectio .......................................................... 2484

Insulini solubilis iniectio .......................................................... 2485

Insulini zinci amorphi iniectio in suspensione ......................... 2485

Insulini zinci cristallini iniectio in suspensione ....................... 2485

Insulini zinci iniectio in suspensione ....................................... 2486

Insulinum aspartum .................................................................. 2487

Insulinum glarginum ................................................................ 2489

Insulinum humanum ................................................................. 2491

Insulinum lisprum .................................................................... 2494

Insulinum porcinum ................................................................. 2496

Interferoni alfa-2 solutio concentrata ....................................... 2499

Interferoni beta-1a solutio concentrata ..................................... 2502

Interferoni gamma-1b solutio concentrata ............................... 2505

Iodixanolum ............................................................................. 2508

Iodum ....................................................................................... 2512

Iohexolum ................................................................................ 2512

Iopamidolum ............................................................................ 2516

Iopromidum .............................................................................. 2519

Iotrolanum ................................................................................ 2522

Ipratropii bromidum monohydricum ........................................ 2525

Irbesartanum ............................................................................. 2527

Irinotecani hydrochloridum trihydricum .................................. 2529

Isoconazoli nitras ..................................................................... 2532

Isoconazolum ........................................................................... 2533

Isofluranum .............................................................................. 2534

Isoleucinum .............................................................................. 2536

Isomaltum ................................................................................. 2537

Isoniazidum .............................................................................. 2539

Isoprenalini hydrochloridum .................................................... 2541

Isoprenalini sulfas dihydricus .................................................. 2542

Isopropylis isostearas ............................................................... 2542

Isopropylis myristas ................................................................. 2543

Isopropylis palmitas ................................................................. 2544

Isosorbidi dinitras dilutus ......................................................... 2545

Isosorbidi mononitras dilutus ................................................... 2547

Isotretinoinum .......................................................................... 2548

Isotridecanomacrogolum .......................................................... 2550

Isoxsuprini hydrochloridum ..................................................... 2551

Isradipinum .............................................................................. 2553

Itraconazolum ........................................................................... 2554

Ivermectinum ........................................................................... 2557

Jecoris aselli domestici oleum .................................................. 2560

Jecoris aselli oleum (typus A) .................................................. 2565

Jecoris aselli oleum (typus B) .................................................. 2569

Josamycini propionas ............................................................... 2574

Josamycinum ............................................................................ 2576

Kalii acetas ............................................................................... 2580

Kalii aluminii sulfas dodecahydricus ....................................... 2580

Kalii bromidum ........................................................................ 2581

Kalii carbonas ........................................................................... 2582

Kalii chloridum ........................................................................ 2582

Kalii citras monohydricus ........................................................ 2583

Kalii clavulanas ........................................................................ 2584

Kalii clavulanas trituratus ........................................................ 2586

Kalii dihydrogenophosphas ...................................................... 2588

Kalii disulfis ............................................................................. 2589

Kalii hydrogenoaspartas hemihydricus .................................... 2589

Kalii hydrogenocarbonas ......................................................... 2590

Kalii hydrogenophosphas ......................................................... 2591

Kalii hydrogenotartras .............................................................. 2592

Kalii hydroxidum ..................................................................... 2592

Kalii iodidum ........................................................................... 2593

Kalii natrii tartras tetrahydricus ............................................... 2594

Kalii nitras ................................................................................ 2594

Kalii perchloras ........................................................................ 2595

Kalii permanganas .................................................................... 2596

Kalii sorbas ............................................................................... 2596

Kalii sulfas ............................................................................... 2597

Kanamycini monosulfas monohydricus ................................... 2598

Kanamycini sulfas acidus ......................................................... 2599

Kaolinum ponderosum ............................................................. 2600

Ketamini hydrochloridum ........................................................ 2600

Ketobemidoni hydrochloridum ................................................ 2601

Ketoconazolum ........................................................................ 2603

Ketoprofenum .......................................................................... 2605

Ketorolacum trometamolum .................................................... 2607

Ketotifeni fumaras .................................................................... 2609

Labetaloli hydrochloridum ....................................................... 2611

Lacca ........................................................................................ 2613

Lacosamidi solutio infundibilis ................................................ 2614

Lacosamidi solutio peroralis .................................................... 2615

Lacosamidi tabulettae ............................................................... 2616

Lacosamidum ........................................................................... 2618

Lactitolum monohydricum ....................................................... 2620

Lactosum anhydricum .............................................................. 2622

Lactosum monohydricum ......................................................... 2624

Lactulosi solutio ....................................................................... 2625

Lactulosum ............................................................................... 2627

Lamivudinum ........................................................................... 2630

Lamotriginum ........................................................................... 2632

Lansoprazolum ......................................................................... 2634

Lauromacrogolum .................................................................... 2635

18 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Lauromacrogolum 400 ............................................................. 2637

Leflunomidum .......................................................................... 2640

Letrozolum ............................................................................... 2641

Leucinum .................................................................................. 2642

Leuprorelinum .......................................................................... 2644

Levamisoli hydrochloridum ..................................................... 2646

Levamisolum ad usum veterinarium ........................................ 2647

Levetiracetamum ...................................................................... 2649

Levocabastini hydrochloridum ................................................. 2651

Levocarnitinum ......................................................................... 2653

Levodopum ............................................................................... 2655

Levodropropizinum .................................................................. 2656

Levofloxacinum hemihydricum ............................................... 2658

Levomentholum ........................................................................ 2660

Levomepromazini hydrochloridum .......................................... 2661

Levomepromazini maleas ......................................................... 2662

Levomethadoni hydrochloridum .............................................. 2663

Levonorgestrelum ..................................................................... 2665

Levothyroxinum natricum hydricum ........................................ 2669

Lidocaini hydrochloridum monohydricum ............................... 2671

Lidocainum ............................................................................... 2672

Lincomycini hydrochloridum monohydricum ......................... 2674

Lini oleum virginale ................................................................. 2676

Liothyroninum natricum ........................................................... 2676

Lisinoprilum dihydricum .......................................................... 2678

Lithii carbonas .......................................................................... 2680

Lithii citras tetrahydricus .......................................................... 2681

Lobelini hydrochloridum .......................................................... 2681

Lomustinum .............................................................................. 2683

Loperamidi hydrochloridum ..................................................... 2684

Loperamidi oxidum monohydricum ......................................... 2686

Lopinavirum ............................................................................. 2687

Loratadinum ............................................................................. 2692

Lorazepamum ........................................................................... 2694

Losartanum kalicum ................................................................. 2695

Lovastatinum ............................................................................ 2698

Lufenuronum ad usum veterinarium ........................................ 2700

Lymecyclinum .......................................................................... 2702

Lynestrenolum .......................................................................... 2704

Lysini acetas ............................................................................. 2706

Lysini hydrochloridum ............................................................. 2707

Macrogola ................................................................................. 2709

Macrogola massae molecularis magnae ................................... 2711

Macrogoli 30 dipolyhydroxystearas ....................................... 2712

Macrogoli 15 hydroxystearas ................................................... 2712

Macrogoli oleas ........................................................................ 2713

Macrogoli 40 sorbitoli heptaoleas .......................................... 2714

Macrogoli stearas ...................................................................... 2715

Magaldratum ............................................................................. 2716

Magnesii acetas tetrahydricus ................................................... 2717

Magnesii aluminometasilicas ................................................... 2717

Magnesii chloridum hexahydricum .......................................... 2718

Magnesii chloridum tetrahemihydricum .................................. 2719

Magnesii citras anhydricus ....................................................... 2720

Magnesii citras dodecahydricus ............................................... 2721

Magnesii citras nonahydricus ................................................... 2721

Magnesii gluconas .................................................................... 2722

Magnesii glycerophosphas ....................................................... 2723

Magnesii hydrogenoaspartas dihydricus .................................. 2723

Magnesii hydroxidum ............................................................... 2726

Magnesii lactas dihydricus ....................................................... 2726

Magnesii oxidum leve .............................................................. 2727

Magnesii oxidum ponderosum ................................................. 2728

Magnesii peroxidum ................................................................. 2728

Magnesii pidolas ....................................................................... 2729

Magnesii stearas ....................................................................... 2730

Magnesii subcarbonas levis ...................................................... 2733

Magnesii subcarbonas ponderosus ........................................... 2734

Magnesii sulfas heptahydricus ................................................. 2735

Magnesii trisilicas ..................................................................... 2735

Malathionum ............................................................................ 2736

Maltitolum ................................................................................ 2737

Maltitolum liquidum ................................................................. 2739

Maltodextrinum ........................................................................ 2740

Mangani gluconas ..................................................................... 2741

Mangani glycerophosphas hydricus ......................................... 2741

Mangani sulfas monohydricus .................................................. 2742

Mannitolum .............................................................................. 2743

Maprotilini hydrochloridum ..................................................... 2745

Marbofloxacinum ad usum veterinarium ................................. 2746

Maydis amylum ........................................................................ 2748

Maydis oleum raffinatum ......................................................... 2749

Mebendazolum ......................................................................... 2749

Mebeverini hydrochloridum ..................................................... 2751

Meclozini dihydrochloridum .................................................... 2753

Medroxyprogesteroni acetas ..................................................... 2754

Mefloquini hydrochloridum ..................................................... 2757

Megestroli acetas ...................................................................... 2758

Megluminum ............................................................................ 2761

Mel ............................................................................................ 2762

Meldonium dihydricum ............................................................ 2763

Meloxicamum ........................................................................... 2765

Melphalanum ............................................................................ 2766

Menadionum ............................................................................. 2769

Mentholum racemicum ............................................................. 2769

Mepivacaini hydrochloridum ................................................... 2770

Meprobamatum ........................................................................ 2772

Mepyramini maleas .................................................................. 2773

Mercaptopurinum monohydricum ............................................ 2774

Meropenemum trihydricum ...................................................... 2776

Mesalazinum ............................................................................ 2777

Mesnum .................................................................................... 2781

Mesterolonum ........................................................................... 2782

Mestranolum ............................................................................. 2783

Metacresolum ........................................................................... 2784

Metamizolum natricum monohydricum ................................... 2786

Metformini hydrochloridum ..................................................... 2787

Methadoni hydrochloridum ...................................................... 2789

Methanolum .............................................................................. 2791

Methanum ................................................................................. 2792

Methanum 2% in nitrogenio intermixtum ................................ 2793

Methenaminum ......................................................................... 2794

Methioninum ............................................................................ 2795

Methioninum racemicum ......................................................... 2796

Methotrexatum ......................................................................... 2797

Methylcellulosum ..................................................................... 2800

Methyldopum sesquihydricum ................................................. 2802

Methyleni chloridum ................................................................ 2804

Methylergometrini maleas ........................................................ 2805

Methylis nicotinas .................................................................... 2807

Methylis salicylas ..................................................................... 2808

Methylparabenum ..................................................................... 2810

Methylparabenum natricum ..................................................... 2811

Methylphenidati hydrochloridum ............................................. 2813

Methylphenobarbitalum ........................................................... 2814

Methylprednisoloni acetas ........................................................ 2816

Methylprednisoloni hydrogenosuccinas ................................... 2818

Methylprednisolonum .............................................................. 2820

Methylpyrrolidonum ................................................................ 2823

Methylrosanilinii chloridum ..................................................... 2824

Methyltestosteronum ................................................................ 2825

Methylthioninii chloridum hydricum ....................................... 2826

Metixeni hydrochloridum monohydricum ............................... 2828

Metoclopramidi hydrochloridum monohydricum .................... 2829

Metoclopramidum .................................................................... 2830

Metolazonum ............................................................................ 2832

Metoprololi succinas ................................................................ 2834

Metoprololi tartras .................................................................... 2836

Metrifonatum ............................................................................ 2838

Metronidazoli benzoas ............................................................. 2839

Metronidazolum ....................................................................... 2840

ČL 2017 – Dopl. 2020 19

OBSAH

Mexiletini hydrochloridum ...................................................... 2842

Mianserini hydrochloridum ...................................................... 2843

Miconazoli nitras ...................................................................... 2845

Miconazolum ............................................................................ 2847

Midazolamum .......................................................................... 2849

Milbemycinum oximum ad usum veterinarium ....................... 2852

Minocyclini hydrochloridum dihydricum ................................ 2854

Minoxidilum ............................................................................. 2857

Mirtazapinum ........................................................................... 2858

Misoprostolum ......................................................................... 2860

Mitomycinum ........................................................................... 2862

Mitoxantroni dihydrochloridum ............................................... 2863

Modafinilum ............................................................................. 2865

Mofetilis mycophenolas ........................................................... 2866

Molgramostimi solutio concentrata .......................................... 2868

Molsidominum ......................................................................... 2871

Mometasoni furoas ................................................................... 2873

Mometasoni furoas monohydricus ........................................... 2876

Montelukastum natricum ......................................................... 2879

Moranteli hydrogenotartas ad usum veterinarium ................... 2882

Morphini hydrochloridum trihydricum .................................... 2883

Morphini sulfas pentahydricus ................................................. 2885

Moxidectinum ad usum veterinarium ...................................... 2887

Moxifloxacini hydrochloridum ................................................ 2891

Moxonidinum ........................................................................... 2893

Mupirocinum ............................................................................ 2894

Mupirocinum calcicum dihydricum ......................................... 2896

Nabumetonum .......................................................................... 2899

Nadololum ................................................................................ 2900

Nadroparinum calcicum ........................................................... 2902

Naftidrofuryli hydrogenooxalas ............................................... 2904

Naloxoni hydrochloridum dihydricum ..................................... 2906

Naltrexoni hydrochloridum ...................................................... 2908

Nandroloni decanoas ................................................................ 2910

Naphazolini hydrochloridum ................................................... 2913

Naphazolini nitras .................................................................... 2914

Naproxenum ............................................................................. 2915

Naproxenum natricum .............................................................. 2918

Nateglinidum ............................................................................ 2920

Natrii acetas trihydricus ........................................................... 2922

Natrii alendronas trihydricus .................................................... 2923

Natrii alginas ............................................................................ 2924

Natrii amidotrizoas ................................................................... 2925

Natrii aminosalicylas dihydricus .............................................. 2927

Natrii ascorbas .......................................................................... 2928

Natrii aurothiomalas ................................................................. 2930

Natrii benzoas ........................................................................... 2931

Natrii bromidum ....................................................................... 2932

Natrii carbonas anhydricus ....................................................... 2933

Natrii carbonas decahydricus ................................................... 2933

Natrii carbonas monohydricus ................................................. 2934

Natrii cetylo- et stearylosulfas ................................................. 2934

Natrii chloridum ....................................................................... 2936

Natrii citras dihydricus ............................................................. 2937

Natrii cyclamas ......................................................................... 2938

Natrii dihydrogenophosphas dihydricus .................................. 2940

Natrii disulfis ............................................................................ 2940

Natrii fluoridum ....................................................................... 2941

Natrii fusidas ............................................................................ 2941

Natrii glycerophosphas hydricus .............................................. 2944

Natrii hyaluronas ...................................................................... 2945

Natrii hydrogenocarbonas ........................................................ 2948

Natrii hydrogenophosphas anhydricus ..................................... 2948

Natrii hydrogenophosphas dihydricus ...................................... 2949

Natrii hydrogenophosphas dodecahydricus ............................. 2950

Natrii hydroxidum .................................................................... 2950

Natrii iodidum .......................................................................... 2951

Natrii lactatis solutio ................................................................ 2951

Natrii lactatis S solutio ............................................................. 2952

Natrii laurilsulfas ...................................................................... 2953

Natrii lauroylsarcosinas ad usum externum ............................. 2954

Natrii molybdas dihydricus ...................................................... 2956

Natrii mycophenolas ................................................................ 2957

Natrii nitris ............................................................................... 2958

Natrii nitroprussias dihydricus ................................................. 2958

Natrii octanoas ......................................................................... 2959

Natrii peroxoboras hydricus ..................................................... 2960

Natrii phenylbutyras ................................................................. 2961

Natrii picosulfas monohydricus ............................................... 2962

Natrii polystyrensulfonas ......................................................... 2964

Natrii propionas ........................................................................ 2965

Natrii risedronas dihemihydricus ............................................. 2966

Natrii salicylas .......................................................................... 2967

Natrii selenis anhydricus .......................................................... 2968

Natrii selenis pentahydricus ..................................................... 2969

Natrii stearas ............................................................................. 2969

Natrii stearylis fumaras ............................................................ 2970

Natrii sulfas anhydricus ............................................................ 2971

Natrii sulfas decahydricus ........................................................ 2972

Natrii sulfis anhydricus ............................................................ 2973

Natrii sulfis heptahydricus ....................................................... 2973

Natrii tetraboras decahydricus .................................................. 2974

Natrii thiosulfas pentahydricus ................................................ 2974

Natrii valproas .......................................................................... 2975

Neohesperidin-dihydrochalconum ........................................... 2977

Neomycini sulfas ...................................................................... 2979

Neostigminii bromidum ........................................................... 2980

Neostigminii metilsulfas .......................................................... 2982

Netilmicini sulfas ..................................................................... 2983

Nevirapinum anhydricum ......................................................... 2985

Nevirapinum hemihydricum .................................................... 2986

Nicardipini hydrochloridum ..................................................... 2988

Nicergolinum ............................................................................ 2989

Nicethamidum .......................................................................... 2991

Niclosamidum anhydricum ...................................................... 2992

Niclosamidum monohydricum ................................................. 2993

Nicorandilum ............................................................................ 2994

Nicotinamidum ......................................................................... 2995

Nicotini ditartras dihydricus ..................................................... 2996

Nicotini resinas ......................................................................... 2998

Nicotinum ................................................................................. 2999

Nifedipinum ............................................................................. 3001

Nifuroxazidum ......................................................................... 3002

Nilotinibi hydrochloridum monohydricum .............................. 3004

Nilutamidum ............................................................................ 3006

Nimesulidum ............................................................................ 3007

Nimodipinum ........................................................................... 3009

Nitrazepamum .......................................................................... 3010

Nitrendipinum .......................................................................... 3012

Nitrofuralum ............................................................................. 3013

Nitrofurantoinum ...................................................................... 3014

Nitrogenii oxidum .................................................................... 3015

Nitrogenum .............................................................................. 3016

Nitrogenum oxygeno depletum ................................................ 3017

Nizatidinum .............................................................................. 3018

Nomegestroli acetas ................................................................. 3020

Nonoxinolum 9 ......................................................................... 3021

Norepinephrini hydrochloridum ............................................... 3022

Norepinephrini tartras monohydricus ...................................... 3024

Norethisteroni acetas ................................................................ 3026

Norethisteronum ....................................................................... 3028

Norfloxacinum ......................................................................... 3029

Norfluranum ............................................................................. 3031

Norgestimatum ......................................................................... 3037

Norgestrelum ............................................................................ 3038

Nortriptylini hydrochloridum ................................................... 3039

Noscapini hydrochloridum hydricum ...................................... 3041

Noscapinum .............................................................................. 3042

Nystatinum ............................................................................... 3043

Octoxinolum 10 ........................................................................ 3045

Octreotidum .............................................................................. 3045

Octyldodecanolum ................................................................... 3047

20 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Octylis gallas ............................................................................ 3048

Oenotherae oleum raffinatum ................................................... 3049

Ofloxacinum ............................................................................. 3049

Olanzapini embonas monohydricus ......................................... 3051

Olanzapinum ............................................................................. 3053

Oleomacrogolum ...................................................................... 3054

Olivae oleum raffinatum ........................................................... 3055

Olivae oleum virginale ............................................................. 3056

Olmesartanum medoxomilum .................................................. 3057

Olsalazinum dinatricum ............................................................ 3059

Omega-3 acidorum esteri ethylici 60 ....................................... 3062

Ethylestery ................................................................................ 3062

Omega-3 acidorum esteri ethylici 90 ....................................... 3064

Omega-3 acidorum triglycerida ................................................ 3066

Omeprazolum ........................................................................... 3069

Omeprazolum magnesicum ...................................................... 3070

Omeprazolum natricum monohydricum ................................... 3072

Ondansetroni hydrochloridum dihydricum .............................. 3074

Orbifloxacinum ad usum veterinarium ..................................... 3076

Orciprenalini sulfas .................................................................. 3077

Orphenadrini citras ................................................................... 3079

Orphenadrini hydrochloridum .................................................. 3081

Oryzae amylum ........................................................................ 3082

Oseltamiviri phosphas .............................................................. 3083

Ouabainum octahydricum ........................................................ 3085

Oxacillinum natricum monohydricum ..................................... 3086

Oxaliplatinum ........................................................................... 3089

Oxazepamum ............................................................................ 3091

Oxcarbazepinum ....................................................................... 3093

Oxeladini citras ......................................................................... 3095

Oxfendazolum ad usum veterinarium ...................................... 3096

Oxitropii bromidum .................................................................. 3098

Oxybuprocaini hydrochloridum ............................................... 3099

Oxybutynini hydrochloridum ................................................... 3100

Oxycodoni hydrochloridum ...................................................... 3102

Oxygenum ................................................................................ 3103

Oxygenum 93% ........................................................................ 3104

Oxymetazolini hydrochloridum ................................................ 3106

Oxytetracyclini hydrochloridum .............................................. 3107

Oxytetracyclinum dihydricum .................................................. 3109

Oxytocini solutio concentrata ................................................... 3111

Oxytocinum .............................................................................. 3112

Paclitaxelum ............................................................................. 3114

Pancreatis pulvis ....................................................................... 3119

Pancuronii bromidum ............................................................... 3122

Pantoprazolum natricum sesquihydricum ................................ 3123

Papaverini hydrochloridum ...................................................... 3125

Paracetamolum ......................................................................... 3127

Paraffinum liquidum ................................................................. 3129

Paraffinum perliquidum ............................................................ 3129

Paraffinum solidum .................................................................. 3130

Paraldehydum ........................................................................... 3131

Parnaparinum natricum ............................................................ 3132

Paroxetini hydrochloridum anhydricum ................................... 3132

Paroxetini hydrochloridum hemihydricum ............................... 3135

Pefloxacini mesilas dihydricus ................................................. 3137

Pemetrexedum dinatricum heptahydricum ............................... 3139

Penbutololi sulfas ..................................................................... 3142

Penicillaminum ......................................................................... 3143

Pentaerithrityli tetranitras trituratus .......................................... 3145

Pentamidini diisetionas ............................................................. 3147

Pentazocini hydrochloridum ..................................................... 3148

Pentazocini lactas ..................................................................... 3149

Pentazocinum ........................................................................... 3150

Pentobarbitalum ........................................................................ 3150

Pentobarbitalum natricum ........................................................ 3152

Pentoxifyllinum ........................................................................ 3154

Pentoxyverini citras .................................................................. 3156

Pepsini pulvis ............................................................................ 3157

Pergolidi mesilas ...................................................................... 3159

Perindoprilum erbuminum ....................................................... 3160

Permethrinum ........................................................................... 3164

Perphenazinum ......................................................................... 3165

Pethidini hydrochloridum ......................................................... 3167

Phenazonum ............................................................................. 3168

Pheniramini maleas .................................................................. 3169

Phenobarbitalum ....................................................................... 3171

Phenobarbitalum natricum ....................................................... 3172

Phenolphthaleinum ................................................................... 3174

Phenolsulfonphthaleinum ......................................................... 3175

Phenolum .................................................................................. 3176

Phenoxyethanolum ................................................................... 3176

Phenoxymethylpenicillinum ..................................................... 3177

Phenoxymethylpenicillinum kalicum ....................................... 3179

Phentolamini mesilas ................................................................ 3181

Phenylalaninum ........................................................................ 3183

Phenylbutazonum ..................................................................... 3184

Phenylephrini hydrochloridum ................................................. 3186

Phenylephrinum ........................................................................ 3188

Phenylhydrargyri acetas ........................................................... 3189

Phenylhydrargyri boras ............................................................ 3190

Phenylhydrargyri nitras ............................................................ 3190

Phenylpropanolamini hydrochloridum .................................... 3191

Phenytoinum ............................................................................. 3193

Phenytoinum natricum ............................................................. 3194

Phloroglucinolum anhydricum ................................................. 3196

Phloroglucinolum dihydricum .................................................. 3198

Pholcodinum monohydricum ................................................... 3200

Phospholipida ex ovo pro iniectione ........................................ 3202

Phospholipida ex soia pro iniectione ........................................ 3204

Phthalylsulfathiazolum ............................................................. 3206

Physostigmini salicylas ............................................................ 3207

Phytomenadionum racemicum ................................................. 3208

Phytosterolum ........................................................................... 3209

Picotamidum monohydricum ................................................... 3211

Pilocarpini hydrochloridum ...................................................... 3211

Pilocarpini nitras ....................................................................... 3213

Pimobendanum ad usum veterinarium ..................................... 3214

Pimozidum ................................................................................ 3215

Pindololum ............................................................................... 3217

Pioglitazoni hydrochloridum .................................................... 3218

Piperacillinum monohydricum ................................................. 3220

Piperacillinum natricum ........................................................... 3221

Piperazini adipas ....................................................................... 3224

Piperazini citras hydricus ......................................................... 3224

Piperazinum hexahydricum ...................................................... 3225

Piracetamum ............................................................................. 3226

Pirenzepini dihydrochloridum monohydricum ........................ 3227

Piretanidum .............................................................................. 3229

Pirfenidonum ............................................................................ 3230

Piroxicamum ............................................................................ 3231

Piscis oleum omega-3 acidis abundans .................................... 3233

Pisi amylum .............................................................................. 3235

Pivampicillinum ....................................................................... 3236

Pivmecillinami hydrochloridum ............................................... 3238

Plasma humanum ad separationem .......................................... 3239

Plasma humanum coagmentatum conditumque

ad exstinguendum virum .................................................... 3241

Podophyllotoxinum .................................................................. 3243

Poloxamera ............................................................................... 3245

Polyacrylatis dispersio 30% ..................................................... 3247

Polymyxini B sulfas ................................................................. 3248

Polysorbatum 20 ....................................................................... 3249

Polysorbatum 40 ....................................................................... 3250

Polysorbatum 60 ....................................................................... 3251

Polysorbatum 80 ....................................................................... 3252

Polyvinylacetatis dispersio 30% ............................................... 3254

Polyvinylis acetas ..................................................................... 3255

Povidonum ................................................................................ 3257

Povidonum iodinatum .............................................................. 3260

Praeparata insulini iniectabilia ................................................. 3261

ČL 2017 – Dopl. 2020 21

OBSAH

Pramipexoli dihydrochloridum monohydricum ....................... 3263

Prasugreli hydrochloridum ....................................................... 3265

Pravastatinum natricum ............................................................ 3267

Prazepamum ............................................................................. 3269

Praziquantelum ......................................................................... 3270

Prazosini hydrochloridum ........................................................ 3271

Prednicarbatum ........................................................................ 3273

Prednisoloni acetas ................................................................... 3275

Prednisoloni natrii phosphas .................................................... 3277

Prednisoloni pivalas ................................................................. 3278

Prednisolonum .......................................................................... 3279

Prednisonum ............................................................................. 3282

Pregabalinum ............................................................................ 3284

Prilocaini hydrochloridum ....................................................... 3286

Prilocainum .............................................................................. 3287

Primaquini diphosphas ............................................................. 3289

Primidonum .............................................................................. 3290

Probenecidum ........................................................................... 3292

Procainamidi hydrochloridum .................................................. 3293

Procaini benzylpenicillinum monohydricum ........................... 3294

Procaini hydrochloridum .......................................................... 3296

Prochlorperazini maleas ........................................................... 3297

Progesteronum .......................................................................... 3298

Proguanili hydrochloridum ...................................................... 3301

Prolinum ................................................................................... 3302

Promazini hydrochloridum ....................................................... 3304

Promethazini hydrochloridum .................................................. 3304

Propacetamoli hydrochloridum ................................................ 3306

Propafenoni hydrochloridum ................................................... 3308

Propanolum .............................................................................. 3309

Propanthelinii bromidum ......................................................... 3311

Propofolum ............................................................................... 3312

Propranololi hydrochloridum ................................................... 3314

Propylenglycoli dilauras ........................................................... 3315

Propylenglycoli dioctanodidecanoas ........................................ 3316

Propylenglycoli monolauras ..................................................... 3317

Propylenglycoli monopalmitostearas ....................................... 3318

Propylenglycolum .................................................................... 3319

Propylis gallas .......................................................................... 3320

Propylparabenum ..................................................................... 3321

Propylparabenum natricum ...................................................... 3323

Propylthiouracilum ................................................................... 3324

Propyphenazonum .................................................................... 3325

Protamini sulfas ........................................................................ 3326

Prothrombinum multiplex humanum ....................................... 3328

Protirelinum .............................................................................. 3329

Proxyphyllinum ........................................................................ 3331

Pseudoephedrini hydrochloridum ............................................ 3332

Pullulanum ............................................................................... 3333

Pyranteli embonas .................................................................... 3334

Pyrazinamidum ........................................................................ 3335

Pyridostigminii bromidum ....................................................... 3337

Pyridoxini hydrochloridum ...................................................... 3338

Pyrimethaminum ...................................................................... 3339

Pyrrolidonum ............................................................................ 3341

Quetiapini fumaras ................................................................... 3342

Quinaprili hydrochloridum ....................................................... 3345

Quinidini sulfas dihydricus ...................................................... 3347

Quinini hydrochloridum dihydricum ..................................... 3349

Quinini sulfas dihydricus ......................................................... 3351

Rabeprazolum natricum ........................................................... 3353

Rabeprazolum natricum hydricum ........................................... 3354

Racecadotrilum ........................................................................ 3356

Raloxifeni hydrochloridum ...................................................... 3358

Raltegraviri tabulettae .............................................................. 3360

Raltegraviri tabulettae manducabiles ....................................... 3362

Raltegravirum kalicum ............................................................. 3363

Ramiprilum .............................................................................. 3365

Ranitidini hydrochloridum ....................................................... 3368

Rapae oleum raffinatum ........................................................... 3370

Regorafenibum monohydricum ............................................... 3370

Remifentanili hydrochloridum ................................................. 3372

Repaglinidum ........................................................................... 3375

Reserpinum .............................................................................. 3377

Resorcinolum ........................................................................... 3377

Ribavirinum .............................................................................. 3378

Riboflavini natrii phosphas ...................................................... 3380

Riboflavinum ............................................................................ 3382

Ricini oleum hydrogenatum ..................................................... 3383

Ricini oleum raffinatum ........................................................... 3385

Ricini oleum virginale .............................................................. 3386

Rifabutinum .............................................................................. 3387

Rifampicinum ........................................................................... 3388

Rifamycinum natricum ............................................................. 3390

Rifaximinum ............................................................................ 3392

Rilmenidini phosphas ............................................................... 3394

Risperidonum ........................................................................... 3395

Ritonavirum .............................................................................. 3397

Rivastigmini hydrogenotartras ................................................. 3401

Rivastigminum ......................................................................... 3403

Rizatriptani benzoas ................................................................. 3405

Rocuronii bromidum ................................................................ 3407

Ropiniroli hydrochloridum ....................................................... 3409

Ropivacaini hydrochloridum monohydricum .......................... 3411

Rosuvastatini tabulettae ........................................................... 3413

Rosuvastatinum calcicum ......................................................... 3415

Rotigotinum .............................................................................. 3419

Roxithromycinum .................................................................... 3421

Rupatadini fumaras .................................................................. 3424

Rutosidum trihydricum ............................................................ 3425

Sacchari sphaerae ..................................................................... 3427

Saccharinum ............................................................................. 3427

Saccharinum natricum .............................................................. 3429

Saccharosi monopalmitas ......................................................... 3430

Saccharosi stearas ..................................................................... 3431

Saccharosum ............................................................................ 3433

Saccharosum liquidum ............................................................. 3434

Salbutamoli sulfas .................................................................... 3436

Salbutamolum .......................................................................... 3439

Salmeteroli xinafoas ................................................................. 3442

Salmonis domestici oleum ....................................................... 3443

Saquinaviri mesilas .................................................................. 3446

Scopolamini hydrobromidum trihydricum ............................... 3448

Scopolaminum .......................................................................... 3449

Selamectinum ad usum veterinarium ....................................... 3450

Selegilini hydrochloridum ........................................................ 3452

Selenii disulfidum .................................................................... 3454

Serinum .................................................................................... 3454

Sertaconazoli nitras .................................................................. 3456

Sertralini hydrochloridum ........................................................ 3457

Serum bovinum ........................................................................ 3460

Sesami oleum raffinatum ......................................................... 3462

Sevofluranum ........................................................................... 3463

Sildenafili citras ....................................................................... 3465

Silica ad usum dentalem ........................................................... 3467

Silica colloidalis anhydrica ...................................................... 3468

Silica colloidalis hydrica .......................................................... 3469

Silica hydrophobica colloidalis ................................................ 3469

Simeticonum ............................................................................ 3470

Simvastatinum .......................................................................... 3471

Sitagliptini phosphas monohydricus ........................................ 3474

Sitagliptini tabulettae ............................................................... 3476

Sojae oleum hydrogenatum ...................................................... 3477

Sojae oleum raffinatum ............................................................ 3478

Solani amylum ......................................................................... 3479

Solifenacini succinas ................................................................ 3479

Solutiones ad conservationem partium corporis ...................... 3481

Solutiones anticoagulantes et sanguinem humanum

conservantes ....................................................................... 3482

22 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Solutiones concentratae pro haemofiltratione

et haemodiafiltratione ......................................................... 3485

Solutiones pro dialysi peritoneali ............................................. 3487

Solutiones pro haemodialysi ..................................................... 3490

Solutiones pro haemofiltratione et haemodiafiltratione ........... 3493

Somatostatinum ........................................................................ 3495

Somatropini solutio concentrata ............................................... 3496

Somatropini solutio iniectabilis ................................................ 3499

Somatropinum .......................................................................... 3500

Somatropinum pro iniectione ................................................... 3503

Sorbitani lauras ......................................................................... 3505

Sorbitani oleas .......................................................................... 3506

Sorbitani palmitas ..................................................................... 3506

Sorbitani sesquioleas ................................................................ 3507

Sorbitani stearas ........................................................................ 3508

Sorbitani trioleas ....................................................................... 3508

Sorbitolum ................................................................................ 3509

Sorbitolum liquidum cristallisabile .......................................... 3511

Sorbitolum liquidum non cristallisabile ................................... 3512

Sorbitolum liquidum partim dehydricum ................................. 3513

Sotaloli hydrochloridum ........................................................... 3513

Spectinomycini dihydrochloridum pentahydricum .................. 3515

Spectinomycini sulfas tetrahydricus


Spiramycinum ........................................................................... 3519

Spiraprili hydrochloridum monohydricum ............................... 3522

Spironolactonum ....................................................................... 3524

Squalanum ................................................................................ 3526

Squalenum ................................................................................ 3527

Stannosi chloridum dihydricum ............................................... 3528

Stanozololum ............................................................................ 3529

Stavudinum ............................................................................... 3530

Stearomacrogolum .................................................................... 3532

Stearopolypropylenglycolum ................................................... 3533

Streptokinasi solutio concentrata .............................................. 3535

Streptomycini sulfas ................................................................. 3537

Sucralfatum ............................................................................... 3538

Sucralosum ............................................................................... 3539

Sufentanili citras ....................................................................... 3541

Sufentanilum ............................................................................. 3543

Sulbactamum natricum ............................................................. 3545

Sulfacetamidum natricum monohydricum ............................... 3547

Sulfadiazinum ........................................................................... 3548

Sulfadimethoxinum .................................................................. 3550

Sulfadimethoxinum natricum ad usum veterinarium ............... 3551

Sulfadimidinum ........................................................................ 3553

Sulfadoxinum ........................................................................... 3555

Sulfafurazolum ......................................................................... 3555

Sulfaguanidinum ....................................................................... 3556

Sulfamerazinum ........................................................................ 3557

Sulfamethizolum ....................................................................... 3558

Sulfamethoxazolum .................................................................. 3560

Sulfamethoxypyridazinum ad usum veterinarium .................... 3561

Sulfanilamidum ........................................................................ 3562

Sulfasalazinum ......................................................................... 3563

Sulfathiazolum .......................................................................... 3565

Sulfinpyrazonum ...................................................................... 3566

Sulfobutylbetadexum natricum ................................................ 3568

Sulfur ad usum externum .......................................................... 3571

Sulindacum ............................................................................... 3572

Sulpiridum ................................................................................ 3573

Sultamicillini tosilas dihydricus ............................................... 3575

Sultamicillinum ........................................................................ 3577

Sumatriptani succinas ............................................................... 3580

Suxamethonii chloridum dihydricum ....................................... 3582

Suxibuzonum ............................................................................ 3583

Tacalcitolum monohydricum .................................................... 3585

Tacrolimusum monohydricum ................................................. 3586

Tadalafilum ............................................................................... 3589

Talcum ...................................................................................... 3592

Tamoxifeni citras ...................................................................... 3594

Tamsulosini hydrochloridum ................................................... 3596

Tanninum .................................................................................. 3598

Tapentadoli hydrochloridum .................................................... 3599

Teicoplaninum .......................................................................... 3601

Telmisartanum .......................................................................... 3603

Temazepamum ......................................................................... 3606

Temozolomidum ...................................................................... 3607

Tenoxicamum ........................................................................... 3609

Terazosini hydrochloridum dihydricum ................................... 3610

Terbinafini hydrochloridum ..................................................... 3613

Terbutalini sulfas ...................................................................... 3615

Terconazolum ........................................................................... 3616

Terfenadinum ........................................................................... 3617

Teriparatidum ........................................................................... 3619

Terlipressinum .......................................................................... 3622

Terpinum monohydricum ......................................................... 3624

Testosteroni decanoas ............................................................... 3626

Testosteroni enantas ................................................................. 3627

Testosteroni isocaproas ............................................................ 3630

Testosteroni propionas ............................................................. 3631

Testosteronum .......................................................................... 3633

Tetracaini hydrochloridum ....................................................... 3635

Tetracainum .............................................................................. 3636

Tetracosactidum ....................................................................... 3637

Tetracyclini hydrochloridum .................................................... 3638

Tetracyclinum ........................................................................... 3640

Tetrazepamum .......................................................................... 3642

Tetryzolini hydrochloridum ..................................................... 3643

Theobrominum ......................................................................... 3644

Theophyllinum ......................................................................... 3644

Theophyllinum monohydricum ................................................ 3646

Thiamazolum ............................................................................ 3647

Thiamini hydrochloridum ......................................................... 3649

Thiamini nitras ......................................................................... 3650

Thiamphenicolum ..................................................................... 3652

Thiocolchicosidum ex ethanolo cristallisatum ......................... 3653

Thiocolchicosidum hydricum ................................................... 3656

Thiomersalum ........................................................................... 3658

Thiopentalum natricum et natrii carbonas ................................ 3659

Thioridazini hydrochloridum ................................................... 3661

Thioridazinum .......................................................................... 3662

Threoninum .............................................................................. 3664

Thymolum ................................................................................ 3666

Tiabendazolum ......................................................................... 3666

Tiamulini fumaras ad usum veterinarium ................................ 3667

Tiamulinum ad usum veterinarium .......................................... 3670

Tianeptinum natricum .............................................................. 3673

Tiapridi hydrochloridum .......................................................... 3675

Tibolonum ................................................................................ 3676

Ticarcillinum dinatricum .......................................................... 3678

Ticlopidini hydrochloridum ..................................................... 3679

Tigecyclinum ............................................................................ 3681

Tilidini hydrochloridum hemihydricum ................................... 3683

Timololi maleas ........................................................................ 3685

Tinidazolum .............................................................................. 3687

Tinzaparinum natricum ............................................................ 3689

Tioconazolum ........................................................................... 3689

Tiotropii bromidum monohydricum ......................................... 3690

Titanii dioxidum ....................................................................... 3692

Tizanidini hydrochloridum ....................................................... 3693

Tobramycinum ......................................................................... 3695

Tocoferoli alfa acetas ............................................................... 3697

Tocoferoli alfa RRR acetas ....................................................... 3699

Tocoferoli alfa acetatis pulvis .................................................. 3700

Tocoferoli alfa hydrogenosuccinas ........................................... 3701

Tocoferoli alfa RRR hydrogenosuccinas .................................. 3703

Tocoferolum alfa ...................................................................... 3705

Tocoferolum alfa RRR .............................................................. 3707

Tolbutamidum .......................................................................... 3708

Tolnaftatum .............................................................................. 3709

ČL 2017 – Dopl. 2020 23

OBSAH

Tolterodini hydrogenotartras .................................................... 3711

Topiramatum ............................................................................ 3713

Torasemidum ............................................................................ 3714

Tosylchloramidum natricum trihydricum ................................ 3716

Toxinum botulinicum typus A pro iniectione .......................... 3716

Toxinum botulinicum typus B pro iniectione .......................... 3718

Tramadoli hydrochloridum ...................................................... 3720

Tramazolini hydrochloridum monohydricum .......................... 3722

Trandolaprilum ......................................................................... 3723

Trapidilum ................................................................................ 3725

Trehalosum dihydricum ........................................................... 3726

Tretinoinum .............................................................................. 3727

Triacetinum .............................................................................. 3729

Triamcinoloni acetonidum ....................................................... 3729

Triamcinoloni hexacetonidum ................................................. 3731

Triamcinolonum ....................................................................... 3733

Triamterenum ........................................................................... 3734

Tribenosidum ........................................................................... 3736

Tributylis acetylcitras ............................................................... 3737

Tributylis phosphas .................................................................. 3738

Triclabendazolum ad usum veterinarium ................................. 3739

Triethylis citras ......................................................................... 3741

Trifluoperazini hydrochloridum ............................................... 3742

Triflusalum ............................................................................... 3742

Triglycerida media ................................................................... 3744

Triglyceroli diisostearas ........................................................... 3744

Trihexyphenidyli hydrochloridum ........................................... 3745

Trimebutini maleas ................................................................... 3746

Trimetazidini dihydrochloridum .............................................. 3748

Trimethadionum ....................................................................... 3749

Trimethoprimum ...................................................................... 3750

Trimipramini maleas ................................................................ 3752

Tritici amylum .......................................................................... 3754

Tritici oleum raffinatum ........................................................... 3755

Tritici oleum virginale .............................................................. 3756

Trolaminum .............................................................................. 3756

Trometamolum ......................................................................... 3758

Tropicamidum .......................................................................... 3759

Tropisetroni hydrochloridum ................................................... 3761

Trospii chloridum ..................................................................... 3763

Troxerutinum ............................................................................ 3764

Trypsinum ................................................................................ 3765

Tryptophanum .......................................................................... 3767

Tuberculini aviarii derivatum proteinosum purificatum .......... 3770

Tuberculini bovini derivatum proteinosum purificatum .......... 3771

Tuberculini derivatum proteinosum purificatum ad usum

humanum ........................................................................... 3772

Tuberculinum pristinum ad usum humanum ........................... 3774

Tylosini phosphas ad usum veterinarium ................................. 3775

Tylosini phosphatis solutio ad usum veterinarium ................... 3781

Tylosini tartras ad usum veterinarium ...................................... 3786

Tylosinum ad usum veterinarium ............................................. 3791

Tyrosinum ................................................................................ 3797

Tyrothricinum .......................................................................... 3798

Ubidecarenonum ...................................................................... 3800

Urea .......................................................................................... 3801

Urofollitropinum ...................................................................... 3802

Urokinasum .............................................................................. 3804

Valacicloviri hydrochloridum anhydricum .............................. 3806

Valacicloviri hydrochloridum hydricum .................................. 3809

Valinum .................................................................................... 3812

Valnemulini hydrochloridum ad usum veterinarum ................ 3814

Valsartanum ............................................................................. 3816

Vancomycini hydrochloridum ................................................. 3817

Vanillinum ................................................................................ 3822

Vardenafili hydrochloridum trihydricum ................................. 3823

Vaselinum album ..................................................................... 3824

Vaselinum flavum .................................................................... 3825

Vecuronii bromidum ................................................................ 3826

Vedaprofenum ad usum veterinarium ...................................... 3828

Venlafaxini hydrochloridum .................................................... 3829

Verapamili hydrochloridum ..................................................... 3830

Vigabatrinum ............................................................................ 3833

Vinblastini sulfas ...................................................................... 3834

Vincaminum ............................................................................. 3835

Vincristini sulfas ...................................................................... 3836

Vindesini sulfas ........................................................................ 3839

Vinorelbini ditartras ................................................................. 3840

Vinpocetinum ........................................................................... 3843

Vitamini A pulvis ..................................................................... 3844

Vitaminum A ............................................................................ 3845

Vitaminum A densatum oleosum ............................................. 3847

Vitaminum A in aqua dispergibile ........................................... 3848

Voriconazolum ......................................................................... 3850

Warfarinum natricum ............................................................... 3853

Warfarinum natricum clathratum ............................................. 3854

Xanthani gummi ....................................................................... 3856

Xylazini hydrochloridum ad usum veterinarium ..................... 3857

Xylitolum ................................................................................. 3858

Xylometazolini hydrochloridum .............................................. 3860

Xylosum ................................................................................... 3862

Yohimbini hydrochloridum ...................................................... 3863

Zanamivirum hydricum ............................................................ 3865

Zidovudinum ............................................................................ 3866

Zinci acetas dihydricus ............................................................. 3869

Zinci acexamas ......................................................................... 3870

Zinci chloridum ........................................................................ 3872

Zinci gluconas .......................................................................... 3872

Zinci oxidum ............................................................................ 3873

Zinci stearas ............................................................................. 3874

Zinci sulfas heptahydricus ........................................................ 3875

Zinci sulfas hexahydricus ......................................................... 3875

Zinci sulfas monohydricus ....................................................... 3875

Zinci undecylenas ..................................................................... 3876

Ziprasidoni hydrochloridum monohydricum ........................... 3877

Ziprasidoni mesilas trihydricus ................................................ 3879

Zolmitriptanum ........................................................................ 3881

Zolpidemi tartras ...................................................................... 3884

Zopiclonum .............................................................................. 3885

Zuclopenthixoli decanoas ......................................................... 3887

Vakcíny pro humánní použití ............................................... 3889

BCG ad immunocurationem .................................................... 3889

Vaccinum anthracis adsorbatum ab colato culturarum

ad usum humanum ............................................................. 3890

Vaccinum cholerae perorale inactivatum ................................. 3892

Vaccinum diphtheriae adsorbatum ........................................... 3893

Vaccinum diphtheriae, cum contento reducto antigeni,

adsorbatum ......................................................................... 3895

Vaccinum diphtheriae et tetani adsorbatum ............................. 3896

Vaccinum diphtheriae et tetani, cum contento reducto

antigeni(orum), adsorbatum ............................................... 3897

Vaccinum diphtheriae, tetani et hepatitidis B (ADNr)

adsorbatum ......................................................................... 3898

Vaccinum diphtheriae, tetani et pertussis ex cellulis

integris adsorbatum ............................................................ 3899

Vaccinum diphtheriae, tetani et pertussis sine cellulis

ex elementis praeparatum adsorbatum ............................... 3901


ex elementis praeparatum, cum contento reducto

antigeni (antigenorum), adsorbatum .................................. 3902

Vaccinum diphtheriae, tetani et poliomyelitidis

(inactivatum), cum contento reducto antigeni(orum),

adsorbatum ......................................................................... 3904

Vaccinum diphtheriae, tetani, pertussis ex cellulis integris

et poliomyelitidis inactivatum adsorbatum ........................ 3906

Vaccinum diphtheriae, tetani, pertussis ex cellulis integris,

poliomyelitidis inactivatum adsorbatum et haemophili

stirpe b coniugatum ............................................................ 3908

24 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Vaccinum diphtheriae, tetani, pertussis sine cellulis

ex elementis praeparatum adsorbatum et haemophili



ex elementis praeparatum et hepatitidis B (ADNr)

adsorbatum ......................................................................... 3912


ex elementis praeparatum et poliomyelitidis

inactivatum adsorbatum ..................................................... 3914


ex elementis praeparatum et poliomyelitidis (inactivatum),

cum contento reducto antigeni (antigenorum),

adsorbatum ......................................................................... 3916


ex elementis praeparatum, hepatitidis B (ADNr),

poliomyelitidis inactivatum adsorbatum et haemophili



ex elementis praeparatum, poliomyelitidis inactivatum

adsorbatum et haemophili stirpe b coniugatum ................. 3921

Vaccinum encephalitidis ixodibus advectae inactivatum ......... 3924

Vaccinum febris flavae vivum .................................................. 3926

Vaccinum febris typhoidis ........................................................ 3930

Vaccinum febris typhoidis polysaccharidicum ........................ 3930

Vaccinum febris typhoidis vivum perorale (stirpe Ty 21a) ...... 3932

Vaccinum haemophili stirpe b coniugatum .............................. 3934

Vaccinum haemophili stirpe b et meningococcale classis C

coniugatum ......................................................................... 3936

Vaccinum hepatitidis A inactivatum adsorbatum ..................... 3937

Vaccinum hepatitidis A inactivatum adsorbatum et febris

typhoidis polysaccharidicum .............................................. 3939

Vaccinum hepatitidis A inactivatum et hepatitidis B (ADNr)

adsorbatum ......................................................................... 3940

Vaccinum hepatitidis A inactivatum virosomale ..................... 3941

Vaccinum hepatitidis B (ADNr) ............................................... 3944

Vaccinum influenzae inactivatum ex cellulis corticisque

antigeniis praeparatum ....................................................... 3946

Vaccinum influenzae inactivatum ex cellulis virisque

integris praeparatum ........................................................... 3948

Vaccinum influenzae inactivatum ex corticis antigeniis

praeparatum ........................................................................ 3951


praeparatum virosomale ..................................................... 3952

Vaccinum influenzae inactivatum ex viris integris

praeparatum ........................................................................ 3955

Vaccinum influenzae inactivatum ex virorum fragmentis

praeparatum ........................................................................ 3956

Vaccinum influenzae vivum intranasale .................................. 3958

Vaccinum meningococcale classis C coniugatum .................... 3961

Vaccinum meningococcale classium A, C, W135 et Y

coniugatum ......................................................................... 3963

Vaccinum meningococcale polysaccharidicum ....................... 3965

Vaccinum morbillorum vivum ................................................. 3967

Vaccinum morbillorum, parotitidis et rubellae vivum ............. 3968

Vaccinum morbillorum, parotitidis, rubellae et varicellae

vivum .................................................................................. 3969

Vaccinum papillomaviri humani (ADNr) ................................ 3970

Vaccinum parotitidis vivum ..................................................... 3974

Vaccinum pertussis ex cellulis integris adsorbatum ................. 3975

Vaccinum pertussis sine cellulis copurificatum

adsorbatum ......................................................................... 3977

Vaccinum pertussis sine cellulis ex elementis

praeparatum adsorbatum .................................................... 3979

Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum ......................... 3980

Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum

coniugatum adsorbatum ..................................................... 3982

Vaccinum poliomyelitidis inactivatum ..................................... 3984

Vaccinum poliomyelitidis perorale .......................................... 3988

Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum ....................... 3993

Vaccinum rotaviri vivum perorale ............................................ 3996

Vaccinum rubellae vivum ......................................................... 3998

Vaccinum tetani adsorbatum .................................................... 4000

Vaccinum tuberculosis (BCG) cryodesiccatum ....................... 4001

Vaccinum varicellae vivum ...................................................... 4003

Vaccinum variolae vivum ........................................................ 4004

Vaccinum zonae vivum ............................................................ 4009

Vakcíny pro veterinární použití ............................................ 4011

Vaccinum actinobacillosis inactivatum ad suem ...................... 4011

Vaccinum adenovirosis caninae inactivatum ........................... 4012

Vaccinum adenovirosis caninae vivum .................................... 4013

Vaccinum anaemiae infectivae pulli vivum ............................. 4015

Vaccinum anthracis vivum ad usum veterinarium ................... 4016

Vaccinum aphtharum epizooticarum inactivatum

ad ruminantes ..................................................................... 4017

Vaccinum Bordetellae bronchisepticae vivum ad canem ......... 4019

Vaccinum bronchitidis infectivae aviariae inactivatum ........... 4020

Vaccinum bronchitidis infectivae aviariae vivum .................... 4022

Vaccinum brucellosis (Brucella melitensis stirpe Rev. 1)

vivum ad usum veterinarium .............................................. 4024

Vaccinum bursitidis infectivae aviariae inactivatum ............... 4025

Vaccinum bursitidis infectivae aviariae vivum ........................ 4027

Vaccinum calicivirosis felinae inactivatum .............................. 4029

Vaccinum calicivirosis felinae vivum ...................................... 4030

Vaccinum chlamydiosis felinae inactivatum ............................ 4031

Vaccinum cholerae aviariae inactivatum .................................. 4032

Vaccinum Clostridii botulini ad usum veterinarium ................ 4033

Vaccinum Clostridii chauvoei ad usum veterinarium .............. 4034

Vaccinum Clostridii novyi B ad usum veterinarium ................ 4035

Vaccinum Clostridii perfringentis ad usum veterinarium ........ 4037

Vaccinum Clostridii septici ad usum veterinarium .................. 4039

Vaccinum coccidiosidis vivum ad pullum ............................... 4041

Vaccinum colibacillosis fetus a partu recentis

inactivatum ad ruminantes ................................................. 4044

Vaccinum colibacillosis fetus a partu recentis

inactivatum ad suem ........................................................... 4046

Vaccinum diarrhoeae viralis bovinae inactivatum ................... 4047

Vaccinum diarrhoeae vituli coronaviro illatae

inactivatum ......................................................................... 4049

Vaccinum diarrhoeae vituli rotaviro illatae inactivatum .......... 4050

Vaccinum encephalomyelitidis infectivae aviariae

vivum ................................................................................. 4051

Vaccinum erysipelatis suillae inactivatum ............................... 4053

Vaccinum furunculosidis ad salmonideos inactivatum

cum adiuvatione oleosa ad iniectionem ............................. 4054

Vaccinum hepatitidis viralis anatis stirpe I vivum ................... 4055

Vaccinum herpesviris equini inactivatum ................................ 4057

Vaccinum influenzae equinae inactivatum ............................... 4058

Vaccinum influenzae inactivatum ad suem .............................. 4060

Vaccinum laryngotracheitidis infectivae aviariae vivum ......... 4062

Vaccinum leptospirosis bovinae inactivatum ........................... 4063

Vaccinum leptospirosis caninae inactivatum ........................... 4065

Vaccinum leucosis felinae inactivatum .................................... 4067

Vaccinum mannheimiae inactivatum ad bovidas ..................... 4068

Vaccinum mannheimiae inactivatum ad ovem ......................... 4069

Vaccinum morbi Aujeszkyi ad suem inactivatum .................... 4071

Vaccinum morbi Aujeszkyi ad suem vivum

ad usum parenteralem ........................................................ 4073

Vaccinum morbi Carrei vivum ad canem ................................. 4075

Vaccinum morbi Carrei vivum ad mustelidas .......................... 4076

Vaccinum morbi haemorrhagici cuniculi inactivatum ............. 4078

Vaccinum morbi Marek vivum ................................................ 4079

Vaccinum morbi oris rubri inactivatum

ad Oncorhynchum mykissem ............................................. 4081

Vaccinum morbi partus diminutionis MCMLXXVI

inactivatum ad pullum ........................................................ 4082

Vaccinum Mycoplasmatis galliseptici inactivatum .................. 4084

Vaccinum myxomatosidis vivum ad cuniculum ...................... 4085

Vaccinum necrosis pancreaticae infectivae inactivatum

ad salmonideos cum adiuvatione oleosa

ad iniectionem .................................................................... 4087

ČL 2017 – Dopl. 2020 25

OBSAH

Vaccinum panleucopeniae felinae infectivae

inactivatum ......................................................................... 4088

Vaccinum panleucopeniae felinae infectivae vivum ................ 4089

Vaccinum parainfluenzae viri bovini vivum ............................ 4091

Vaccinum parainfluenzae viri canini vivum ............................ 4092

Vaccinum paramyxoviris 3 aviarii ad meleagrem

inactivatum ......................................................................... 4093

Vaccinum parvovirosis caninae inactivatum ........................... 4094

Vaccinum parvovirosis caninae vivum .................................... 4096

Vaccinum parvovirosis inactivatum ad suem .......................... 4097

Vaccinum pasteurellae inactivatum ad ovem ........................... 4098

Vaccinum pestis anatis vivum .................................................. 4100

Vaccinum pestis classicae suillae vivum ex cellulis ................ 4101

Vaccinum pneumoniae enzooticae suillae inactivatum ........... 4103

Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum .......................... 4104

Vaccinum pseudopestis aviariae vivum ................................... 4106

Vaccinum rabiei inactivatum ad usum veterinarium ............... 4108

Vaccinum rabiei perorale vivum ad vulpem

et nyctereutem .................................................................... 4111

Vaccinum rhinitidis atrophicantis ingravescentis suillae

inactivatum ......................................................................... 4113

Vaccinum rhinotracheitidis infectivae bovinae

inactivatum ......................................................................... 4115

Vaccinum rhinotracheitidis infectivae bovinae vivum ............ 4117

Vaccinum rhinotracheitidis infectivae vivum

ad meleagrem ..................................................................... 4118

Vaccinum rhinotracheitidis viralis felinae inactivatum ........... 4119

Vaccinum rhinotracheitidis viralis felinae vivum .................... 4120

Vaccinum Salmonellae Enteritidis ad pullum inactivatum ...... 4122

Vaccinum Salmonellae Enteritidis perorale vivum

ad pullum ........................................................................... 4123

Vaccinum Salmonellae Typhimurium ad pullum

inactivatum ......................................................................... 4126

Vaccinum Salmonellae Typhimurium perorale vivum

ad pullum ........................................................................... 4127

Vaccinum tenosynovitidis viralis aviariae vivum .................... 4129

Vaccinum tetani ad usum veterinarium .................................... 4131

Vaccinum variolae gallinaceae vivum ..................................... 4132

Vaccinum vibriosidis ad salmonideos inactivatum .................. 4133

Vaccinum vibriosidis aquae frigidae ad salmonideos

inactivatum ......................................................................... 4135

Vaccinum viri syncytialis meatus spiritus bovini vivum ......... 4136

Imunoséra pro humánní použití ........................................... 4138

Immunoserum botulinicum ...................................................... 4138

Immunoserum contra venena viperarum europaearum ............ 4139

Immunoserum diphthericum .................................................... 4140

Immunoserum gangraenicum (Clostridium novyi) .................. 4140

Immunoserum gangraenicum (Clostridium perfringens) ......... 4141

Immunoserum gangraenicum (Clostridium septicum) ............. 4142

Immunoserum gangraenicum mixtum ..................................... 4143

Immunoserum tetanicum ad usum humanum .......................... 4143

Imunoséra pro veterinární použití ....................................... 4145

Immunoserum tetanicum ad usum veterinarium ...................... 4145

Alergeny .................................................................................. 4147

Acari ad producta allergenica ................................................... 4147

Fragmenta epithelii phaneraeque bestiarum

ad producta allergenica ...................................................... 4148

Hymenopteri venena ad producta allergenica .......................... 4149

Mucores ad producta allergenica ............................................. 4150

Polines ad producta allergenica ................................................ 4151

Rostlinné drogy a přípravky z rostlinných drog ................. 4153

Rostlinné drogy: úvod .............................................................. 4153

Abelmoschi flos ....................................................................... 4153

Absinthii herba ......................................................................... 4155

Acaciae gummi ......................................................................... 4156

Acanthopanacis gracilistyli radicis cortex ............................... 4157

Achyranthis bidentatae radix .................................................... 4159

Agar .......................................................................................... 4161

Agni casti fructus ..................................................................... 4161

Agni casti fructus extractum siccum ........................................ 4162

Agrimoniae herba ..................................................................... 4163

Akebiae caulis .......................................................................... 4164

Alchemillae herba .................................................................... 4166

Allii sativi bulbus pulveratus ................................................... 4167

Aloe barbadensis ...................................................................... 4169

Aloe capensis ........................................................................... 4170

Aloes extractum siccum normatum .......................................... 4171

Althaeae folium ........................................................................ 4172

Althaeae radix .......................................................................... 4173

Amomi fructus ......................................................................... 4174

Amomi fructus rotundus .......................................................... 4176

Andrographidis herba ............................................................... 4178

Anemarrhenae asphodeloides rhizoma .................................... 4180

Angelicae archangelicae radix ................................................. 4182

Angelicae dahuricae radix ........................................................ 4183

Angelicae pubescentis radix ..................................................... 4185

Angelicae sinensis radix ........................................................... 4187

Anisi etheroleum ...................................................................... 4189

Anisi fructus ............................................................................. 4191

Anisi stellati etheroleum .......................................................... 4192

Anisi stellati fructus ................................................................. 4194

Arnicae flos .............................................................................. 4195

Arnicae tinctura ........................................................................ 4198

Astragali mongholici radix ....................................................... 4199

Atractylodis lanceae rhizoma ................................................... 4201

Atractylodis macrocephalae rhizoma ....................................... 4202

Aucklandiae radix .................................................................... 4203

Aurantii amari floris etheroleum .............................................. 4205

Aurantii amari flos ................................................................... 4207

Aurantii amari pericarpii tinctura ............................................. 4208

Aurantii amari pericarpium ...................................................... 4209

Aurantii dulcis pericarpii etheroleum ....................................... 4210

Ballotae nigrae herba ................................................................ 4211

Balsamum peruvianum ............................................................. 4213

Balsamum tolutanum ............................................................... 4213

Belamcandae chinensis rhizoma .............................................. 4214

Belladonnae folii extractum siccum normatum ....................... 4216

Belladonnae folii tinctura normata ........................................... 4217

Belladonnae folium .................................................................. 4219

Belladonnae pulvis normatus ................................................... 4220

Benzoe sumatranus ................................................................... 4221

Benzoe tonkinensis ................................................................... 4222

Benzois sumatrani tinctura ....................................................... 4223

Benzois tonkinensis tinctura .................................................... 4224

Betulae folium .......................................................................... 4225

Bistortae rhizoma ..................................................................... 4226

Boldi folii extractum siccum .................................................... 4227

Boldo folium ............................................................................ 4229

Bupleuri radix ........................................................................... 4230

Calendulae flos ......................................................................... 4232

Camelliae sinensis non fermentata folia .................................. 4234

Capsici acris extractum spissum normatum ............................. 4236

Capsici fructus .......................................................................... 4237

Capsici oleoresina raffinata et normata .................................... 4238

Capsici tinctura normata .......................................................... 4240

Carthami flos ............................................................................ 4241

Carvi etheroleum ...................................................................... 4242

Carvi fructus ............................................................................. 4244

Caryophylli floris etheroleum .................................................. 4244

Caryophylli flos ........................................................................ 4245

Centaurii herba ......................................................................... 4246

Centellae asiaticae herba .......................................................... 4247

Chamomillae romanae flos ...................................................... 4249

Chelidonii herba ....................................................................... 4251

Cimicifugae rhizoma ................................................................ 4252

Cinchonae cortex ...................................................................... 4255

Cinchonae extractum fluidum normatum ................................. 4257

26 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Cinnamomi cassiae etheroleum ................................................ 4258

Cinnamomi cortex .................................................................... 4259

Cinnamomi zeylanici corticis etheroleum ................................ 4260

Cinnamomi zeylanici folii etheroleum ..................................... 4261

Citri etheroleum ........................................................................ 4262

Citri reticulatae etheroleum ...................................................... 4264

Citri reticulatae pericarpium ..................................................... 4265

Citronellae etheroleum ............................................................. 4266

Clematidis armandii caulis ....................................................... 4267

Codonopsidis radix ................................................................... 4269

Coicis semen ............................................................................. 4270

Colae semen .............................................................................. 4272

Colophonium ............................................................................ 4273

Coptidis rhizoma ...................................................................... 4273

Coriandri etheroleum ................................................................ 4275

Coriandri fructus ....................................................................... 4276

Corydalis tuber ......................................................................... 4277

Crataegi folii cum flore extractum fluidum

quantificatum ...................................................................... 4279

Crataegi folii cum flore extractum siccum ............................... 4280

Crataegi folium cum flore ........................................................ 4281

Crataegi fructus ........................................................................ 4282

Curcumae longae rhizoma ........................................................ 4284

Curcumae xanthorrhizae rhizoma ............................................. 4285

Cyamopsidis seminis pulvis ..................................................... 4287

Cynarae folii extractum siccum ................................................ 4288

Cynarae folium ......................................................................... 4289

Cynosbati fructus ...................................................................... 4290

Digitalis purpureae folium ........................................................ 4291

Dioscoreae nipponicae rhizoma ............................................... 4293

Dioscoreae oppositifoliae rhizoma ........................................... 4294

Drynariae rhizoma .................................................................... 4295

Echinaceae angustifoliae radix ................................................. 4297

Echinaceae pallidae radix ......................................................... 4299

Echinaceae purpureae herba ..................................................... 4300

Echinaceae purpureae radix ...................................................... 4302

Ecliptae herba ........................................................................... 4305

Eleutherococci radix ................................................................. 4306

Ephedrae herba ......................................................................... 4308

Equiseti herba ........................................................................... 4310

Eucalypti etheroleum ................................................................ 4311

Eucalypti folium ....................................................................... 4312

Eucommiae cortex .................................................................... 4314

Evodiae fructus ......................................................................... 4315

Fagopyri herba .......................................................................... 4317

Filipendulae ulmariae herba ..................................................... 4319

Foeniculi amari fructus ............................................................. 4320

Foeniculi amari fructus etheroleum .......................................... 4321

Foeniculi amari herbae etheroleum .......................................... 4323

Foeniculi dulcis fructus ............................................................ 4325

Frangulae cortex ....................................................................... 4326

Frangulae corticis extractum siccum normatum ....................... 4327

Fraxini folium ........................................................................... 4328

Fraxini rhynchophyllae cortex .................................................. 4330

Fucus ......................................................................................... 4331

Fumariae herba ......................................................................... 4332

Gardeniae fructus ...................................................................... 4333

Gastrodiae tuber ........................................................................ 4335

Gentianae radix ......................................................................... 4336

Gentianae tinctura ..................................................................... 4338

Ginkgo extractum siccum raffinatum et quantificatum ............ 4338

Ginkgo folium .......................................................................... 4341

Ginseng extractum siccum ....................................................... 4343

Ginseng radix ............................................................................ 4344

Graminis rhizoma ..................................................................... 4346

Gummiresina myrrha ................................................................ 4347

Hamamelidis cortex .................................................................. 4348

Hamamelidis folium ................................................................. 4349

Harpagophyti extractum siccum ............................................... 4350

Harpagophyti radix ................................................................... 4351

Hederae folium ......................................................................... 4352

Hibisci sabdariffae flos ............................................................. 4354

Hippocastani semen .................................................................. 4355

Hippocastani seminis extractum siccum normatum ................. 4357

Houttuyniae herba .................................................................... 4358

Hydrastidis radix ...................................................................... 4360

Hyperici herba .......................................................................... 4362

Hyperici herbae extractum siccum quantificatum .................... 4363

Ipecacuanhae extractum fluidum normatum ............................ 4366

Ipecacuanhae pulvis normatus .................................................. 4366

Ipecacuanhae radix ................................................................... 4368

Ipecacuanhae tinctura normata ................................................. 4369

Isatidis radix ............................................................................. 4370

Juniperi etheroleum .................................................................. 4372

Juniperi fructus ......................................................................... 4373

Lavandulae etheroleum ............................................................ 4374

Lavandulae flos ........................................................................ 4375

Lavandulae latifoliae etheroleum ............................................. 4377

Leonuri herba ........................................................................... 4378

Levistici radix ........................................................................... 4379

Lichen islandicus ...................................................................... 4381

Ligustici sinensis rhizoma ........................................................ 4381

Ligustici radix et rhizoma ......................................................... 4383

Lini semen ................................................................................ 4385

Liquiritiae extractum siccum ad saporandum ........................... 4385

Liquiritiae radix ........................................................................ 4386

Lupuli flos ................................................................................ 4388

Lycii fructus ............................................................................. 4389

Lycopi herba ............................................................................. 4390

Lythri herba .............................................................................. 4392

Magnoliae biondii flos immaturus ........................................... 4393

Magnoliae officinalis cortex ..................................................... 4395

Magnoliae officinalis flos ......................................................... 4397

Malvae folium .......................................................................... 4398

Malvae sylvestris flos ............................................................... 4400

Marrubii herba .......................................................................... 4401

Mastix ....................................................................................... 4402

Mate folium .............................................................................. 4403

Matricariae etheroleum ............................................................. 4405

Matricariae extractum fluidum ................................................. 4407

Matricariae flos ......................................................................... 4408

Melaleucae etheroleum ............................................................. 4410

Meliloti herba ........................................................................... 4411

Melissae folii extractum siccum ............................................... 4412

Melissae folium ........................................................................ 4413

Menthae arvensis etheroleum partim mentholi

depletum ............................................................................. 4414

Menthae piperitae etheroleum .................................................. 4416

Menthae piperitae folii extractum siccum ................................ 4417

Menthae piperitae folium ......................................................... 4418

Millefolii herba ......................................................................... 4420

Myristicae etheroleum .............................................................. 4421

Myrrhae tinctura ....................................................................... 4422

Myrtilli fructus recens .............................................................. 4422

Myrtilli fructus recentis extractum siccum raffinatum

et normatum ....................................................................... 4424

Myrtilli fructus siccus ............................................................... 4426

Niaouli typo cineolo etheroleum .............................................. 4427

Notoginseng radix .................................................................... 4428

Oleae folii extractum siccum .................................................... 4429

Oleae folium ............................................................................. 4430

Olibanum indicum .................................................................... 4432

Ononidis radix .......................................................................... 4433

Ophiopogonis tuber .................................................................. 4434

Opii extractum siccum normatum ............................................ 4435

Opii pulvis normatus ................................................................ 4437

Opii tinctura normata ................................................................ 4438

Opium crudum .......................................................................... 4440

Origani herba ............................................................................ 4441

Orthosiphonis folium ................................................................ 4443

ČL 2017 – Dopl. 2020 27

OBSAH

Paeoniae radix alba .................................................................. 4444

Paeoniae radix rubra ................................................................. 4446

Paeoniae suffruticosae radicis cortex ....................................... 4448

Papaveris rhoeados flos ............................................................ 4450

Passiflorae extractum siccum ................................................... 4451

Passiflorae herba ...................................................................... 4452

Pauliniae semen ........................................................................ 4453

Pelargonii radix ........................................................................ 4454

Persicariae tinctoriae folium .................................................... 4455

Pini pumilionis etheroleum ...................................................... 4456

Pini sylvestris etheroleum ........................................................ 4458

Horní okraj desky ..................................................................... 4458

Piperis fructus ........................................................................... 4459

Piperis longi fructus ................................................................. 4461

Plantaginis folium .................................................................... 4463

Plantaginis ovatae semen ......................................................... 4464

Plantaginis ovatae testa ............................................................ 4465

Platycodonis radix .................................................................... 4465

Polygalae radix ......................................................................... 4467

Polygoni avicularis herba ......................................................... 4469

Polygoni cuspidati rhizoma et radix ......................................... 4470

Polygoni multiflori radix .......................................................... 4472

Polygoni orientalis fructus ....................................................... 4474

Poria ......................................................................................... 4475

Primulae radix .......................................................................... 4476

Prunellae spica ......................................................................... 4477

Pruni africanae cortex .............................................................. 4479

Psyllii semen ............................................................................ 4480

Puerariae lobatae radix ............................................................. 4480

Puerariae thomsonii radix ........................................................ 4482

Quercus cortex ......................................................................... 4483

Quillajae cortex ........................................................................ 4484

Ratanhiae radix ......................................................................... 4486

Ratanhiae tinctura ..................................................................... 4487

Rehmanniae radix ..................................................................... 4487

Rhamni purshianae cortex ........................................................ 4489

Rhamni purshianae extractum siccum normatum .................... 4491

Rhei radix ................................................................................. 4492

Ribis nigri folium ..................................................................... 4493

Rosmarini etheroleum .............................................................. 4494

Rosmarini folium ..................................................................... 4496

Rubi idaei folium ...................................................................... 4497

Rusci radix ............................................................................... 4499

Salicis cortex ............................................................................ 4501

Salicis corticis extractum siccum ............................................. 4502

Salviae lavandulifoliae etheroleum .......................................... 4503

Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma ..................................... 4504

Salviae officinalis folium ......................................................... 4506

Salviae sclareae etheroleum ..................................................... 4507

Salviae tinctura ......................................................................... 4508

Salviae trilobae folium ............................................................. 4509

Sambuci nigrae flos .................................................................. 4510

Sanguisorbae radix ................................................................... 4512

Schisandrae chinensis fructus .................................................. 4512

Scutellariae radix ...................................................................... 4514

Sennae folium ........................................................................... 4515

Sennae fructus .......................................................................... 4518

Sennae folii extractum siccum normatum ................................ 4520

Serenoae extractum .................................................................. 4521

Serenoae fructus ....................................................................... 4524

Serpylli herba ........................................................................... 4526

Serratulae coronatae herba ....................................................... 4527

Silybi mariani extractum siccum raffinatum

et normatum ....................................................................... 4529

Silybi mariani fructus ............................................................... 4530

Sinomenii caulis ....................................................................... 4532

Solidaginis herba ...................................................................... 4533

Solidaginis virgaureae herba .................................................... 4535

Sophorae flavescentis radix ...................................................... 4537

Sophorae japonicae flos ........................................................... 4538

Sophorae japonicae flos immaturus ......................................... 4540

Stephaniae tetrandrae radix ...................................................... 4542

Stramonii folii pulvis normatus ................................................ 4543

Stramonii folium ...................................................................... 4545

Tanaceti parthenii herba ........................................................... 4546

Taraxaci radix ........................................................................... 4547

Taraxaci radix cum herba ......................................................... 4548

Terebinthinae etheroleum ......................................................... 4550

Thymi herba ............................................................................. 4551

Thymi typo thymolo etheroleum .............................................. 4553

Tiliae flos ................................................................................. 4554

Tormentillae rhizoma ............................................................... 4555

Tormentillae tinctura ................................................................ 4556

Tragacantha .............................................................................. 4556

Trifolii fibrini folium ................................................................ 4557

Trigonellae foenugraeci semen ................................................ 4558

Typhae pollis ............................................................................ 4559

Uncariae rhynchophyllae ramulus cum uncis .......................... 4561

Urticae folium .......................................................................... 4562

Urticae radix ............................................................................. 4564

Uvae ursi folium ....................................................................... 4565

Valerianae extractum aquosum siccum .................................... 4566

Valerianae extractum siccum ................................................... 4567

Valerianae radix ....................................................................... 4568

Valerianae radix minutata ........................................................ 4570

Valerianae tinctura ................................................................... 4572

Verbasci flos ............................................................................. 4573

Verbenae citriodoratae folium .................................................. 4574

Verbenae herba ......................................................................... 4575

Violae herba cum flore ............................................................. 4577

Zanthoxyli bungeani pericarpium ............................................ 4579

Zingiberis rhizoma ................................................................... 4580

Homeopatické přípravky ....................................................... 4515

Úvod ......................................................................................... 4581

Praeparata homeopathica ......................................................... 4581

Granula ad praeparata homeopathica ....................................... 4582

Granula homeopathica imbuta ................................................. 4583

Granula homeopathica velata ................................................... 4583

Plantae medicinales ad praeparata homeopathica .................... 4584

Tincturae maternae ad praeparata homeopathica ..................... 4585

Via praeparandi stirpes homeopathicas et potentificandi ......... 4586

Acidum picricum ad praeparata homeopathica ........................ 4602

Acidum succinicum ad praeparata homeopathica .................... 4603

Adonis vernalis ad praeparata homeopathica ........................... 4603

Allium sativum ad praeparata homeopathica ........................... 4605

Amanita phalloides ad praeparata homeopathica ..................... 4606

Ammonii carbonas ad praeparata homeopathica ..................... 4608

Anamirta cocculus ad praeparata homeopathica ...................... 4608

Apis mellifera ad praeparata homeopathica ............................. 4610

Arseni sesquioxidum ad praeparata homeopathica .................. 4611

Atropa belladonna ad praeparata homeopathica ...................... 4612

Barii chloridum dihydricum ad praeparata

homeopathica ..................................................................... 4613

Benzinum ad praeparata homeopathica ................................... 4614

Cadmii sulfas hydricus ad praeparata homeopathica ............... 4614

Calcii fluoridum ad praeparata homeopathica ......................... 4615

Calcii iodidum tetrahydricum ad praeparata

homeopathica ..................................................................... 4615

Croci sativi stigma ad praeparata homeopathica ...................... 4616

Cupri acetas monohydricus ad praeparata homeopathica ........ 4617

Cuprum ad praeparata homeopathica ....................................... 4618

Delphinium staphisagria ad praeparata homeopathica ............. 4619

Digitalis purpurea ad praeparata homoeopathica ..................... 4620

Ferrum ad praeparata homeopathica ........................................ 4622

Hedera helix ad praeparata homeopathica ............................... 4623

Histaminum ad praeparata homeopathica ................................ 4624

Hydrastis canadensis ad praeparata homeopathica .................. 4625

Hyoscyamus niger ad praeparata homeopathica ...................... 4626

Hypericum perforatum ad praeparata homeopathica ............... 4627

Kalii dichromas ad praeparata homeopathica .......................... 4628

Magnesii fluoridum ad praeparata homeopathica .................... 4628

28 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Magnesii hydrogenophosphas trihydricus

ad praeparata homeopathica ............................................... 4629

Natrii tetrachloroauras dihydricus ad praeparata

homeopathica ..................................................................... 4630

Selenium ad praeparata homeopathica ..................................... 4630

Semecarpus anacardium ad praeparata homeopathica ............. 4631

Strychnos ignatii ad praeparata homeopathica ......................... 4633

Strychnos nux-vomica ad praeparata homeopathica ................ 4635

Sulfur ad praeparata homeopathica .......................................... 4637

Urtica dioica ad praeparata homeopathica ............................... 4638

Radiofarmaka a výchozí materiál pro radiofarmaka ......... 4640

Acidum medronicum ad radiopharmaceutica ........................... 4640

Albumini humani iodinati ( 125 I) solutio iniectabilis ................. 4641

Alovudini ( 18 F) solutio iniectabilis ........................................... 4642

Ammoniae ( 13 N) solutio iniectabilis ......................................... 4644

Aquae ( 15 O) solutio iniectabilis ................................................ 4645

Aquae tritiatae ( 3 H) solutio iniectabilis .................................... 4646

Calcii trinatrii pentetas hydricus

ad radiopharmaceutica ....................................................... 4647

Carbonei oxidum ( 15 O) ............................................................. 4648

Cholini ([ 11 C]methyl) solutio iniectabilis ................................. 4649

Chromii ( 51 Cr) edetatis solutio iniectabilis ............................... 4650

Cupri tetramibi tetrafluoroboras ad radiopharmaceutica .......... 4651

Cyanocobalamini ( 57 Co) capsulae ............................................ 4652

Cyanocobalamini ( 57 Co) solutio ............................................... 4653

Cyanocobalamini ( 58 Co) capsulae ............................................ 4654

Cyanocobalamini ( 58 Co) solutio ............................................... 4655

Fludeoxyglucosi ( 18 F) solutio iniectabilis ................................ 4655

Flumazenili (N-[ 11 C]methyl) solutio iniectabilis ...................... 4658

Fluoridi ( 18 F) solutio ad radiosignandum ................................. 4659

Fluorocholini ( 18 F) solutio iniectabilis ..................................... 4660

Fluorodopae ( 18 F) ab nucleophila substitutione solutio

iniectabilis .......................................................................... 4663

Fluorodopae ( 18 F) substitutione ab electrophila solutio

iniectabilis .......................................................................... 4666

Fluoroethyl-L-tyrosini ( 18 F) solutio iniectabilis ....................... 4668

Fluoromisonidazoli ( 18 F) solutio iniectabilis ............................ 4671

Gallii ( 67 Ga) citratis solutio iniectabilis .................................... 4673

Gallii ( 68 Ga) chloridi solutio ad radiosignandum ..................... 4674

Gallii ( 68 Ga) edotreotidi solutio iniectabilis ............................. 4675

Indii ( 111 In) chloridi solutio ...................................................... 4678

Indii ( 111 In) oxini solutio .......................................................... 4679

Indii ( 111 In) pentetatis solutio iniectabilis ................................. 4679

Iobenguani ( 123 I) solutio iniectabilis ......................................... 4680

Iobenguani ( 131 I) solutio iniectabilis

ad usum diagnosticum ........................................................ 4681

Iobenguani ( 131 I) solutio iniectabilis

ad usum therapeuticum ...................................................... 4682

Iobenguani sulfas ad radiopharmaceutica ................................ 4683

Iodomethylnorcholesteroli ( 131 I) solutio iniectabilis ................ 4684

Kryptonum ( 81m Kr) ad inhalationem ........................................ 4685

Lutetii ( 177 Lu) solutio ad radiosignandum ................................ 4685

Methionini ([ 11 C]methyl) solutio iniectabilis ........................... 4687

Natrii acetatis ([1- 11 C]) solutio iniectabilis .............................. 4689

Natrii chromatis ( 51 Cr) solutio sterilis ...................................... 4690

Natrii fluoridi ( 18 F) solutio iniectabilis ..................................... 4691

Natrii iodidi ( 123 I) solutio ad radiosignandum .......................... 4691

Natrii iodidi ( 123 I) solutio iniectabilis ....................................... 4692

Natrii iodidi ( 131 I) capsulae ad usum diagnosticum .................. 4693

Natrii iodidi ( 131 I) capsulae ad usum therapeuticum ................ 4694

Natrii iodidi ( 131 I) solutio .......................................................... 4695

Natrii iodidi ( 131 I) solutio ad radiosignandum .......................... 4696

Natrii iodohippuras dihydricus ad radiopharmaceutica ............ 4697

Natrii iodohippuratis ( 123 I) solutio iniectabilis ......................... 4698

Natrii iodohippuratis ( 131 I) solutio iniectabilis ......................... 4699

Natrii molybdatis ( 99 Mo) fissione formati solutio .................... 4700

Natrii pertechnetatis ( 99m Tc) acceleratore formati

solutio iniectabilis .............................................................. 4702

Natrii pertechnetatis ( 99m Tc) fissione formati solutio

iniectabilis .......................................................................... 4703

Natrii pertechnetatis ( 99m Tc) sine fissione formati solutio

iniectabilis .......................................................................... 4705

Natrii phosphatis ( 32 P) solutio iniectabilis ................................ 4705

Natrii pyrophosphas decahydricus

ad radiopharmaceutica ....................................................... 4706

Oxygenum ( 15 O) ....................................................................... 4707

Raclopridi ([ 11 C]methoxy) solutio iniectabilis ......................... 4708

Rhenii sulfidi colloidalis et technetii ( 99m Tc) solutio

iniectabilis .......................................................................... 4710

Stanni colloidalis et technetii ( 99m Tc) solutio

iniectabilis .......................................................................... 4711

Stanni pyrophosphatis et technetii ( 99m Tc) solutio

iniectabilis .......................................................................... 4711

Strontii ( 89 Sr) chloridi solutio iniectabilis ................................ 4713

Sulfuris colloidalis et technetii ( 99m Tc) solutio

iniectabilis .......................................................................... 4714

Technetii ( 99m Tc) bicisatis solutio iniectabilis .......................... 4714

Technetii ( 99m Tc) et albumini humani solutio iniectabilis ........ 4715

Technetii ( 99m Tc) et etifenini solutio iniectabilis ...................... 4717

Technetii ( 99m Tc) exametazimi solutio iniectabilis .................. 4718

Technetii ( 99m Tc) gluconatis solutio iniectabilis ...................... 4720

Technetii ( 99m Tc) macrosalbi suspensio iniectabilis ................. 4721

Technetii ( 99m Tc) mebrofenini solutio iniectabilis ................... 4722

Technetii ( 99m Tc) medronati solutio iniectabilis ....................... 4723

Technetii ( 99m Tc) mertiatidi solutio iniectabilis ....................... 4724

Technetii ( 99m Tc) microsphaerarum suspensio iniectabilis ...... 4725

Technetii ( 99m Tc) oxidronati solutio iniectabilis ...................... 4726

Technetii ( 99m Tc) pentetatis solutio iniectabilis ....................... 4728

Technetii ( 99m Tc) sestamibi solutio iniectabilis ....................... 4729

Technetii ( 99m Tc) succimeri solutio iniectabilis ...................... 4730

Tetra-O-acetylmannosi triflas ad radiopharmaceutica ............. 4731

Thallosi ( 201 Tl) chloridi solutio iniectabilis .............................. 4732

Xenoni ( 133 Xe) solutio iniectabilis ........................................... 4733

Yttrii ( 90 Y) chloridi solutio ad radiosignandum ....................... 4734

Chirurgická šicí vlákna pro použití u člověka ..................... 4736

Úvod ......................................................................................... 4736

Chorda resorbilis sterilis ........................................................... 4736

Fila non resorbilia sterilia ......................................................... 4738

Fila resorbilia synthetica monofilamenta sterilia ..................... 4741

Fila resorbilia synthetica torta sterilia ...................................... 4743

Chirurgická šicí vlákna pro použití u zvířat ........................ 4746

Chorda resorbilis sterilis in fuso ad usum veterinarium ........... 4746

Fila non resorbilia sterilia in fuso ad usum

veterinarium ....................................................................... 4747

Filum bombycis tortum sterile in fuso ad usum

veterinarium ....................................................................... 4749

Filum ethyleni polyterephtalici sterile in fuso ad usum

veterinarium ....................................................................... 4749

Filum lini sterile in fuso ad usum veterinarium ....................... 4749

Filum polyamidi sterile in fuso ad usum veterinarium ............. 4750

Vaty .......................................................................................... 4751

Lana cellulosi regenerati .......................................................... 4751

Lana gossypii depurata ............................................................. 4752

NÁRODNÍ ČÁST

I Složení Lékopisné komise Ministerstva zdravotnictví

České republiky .................................................................. 4755

II Texty v Národní části Českého lékopisu 2017 ................... 4757

Revidované a korigované ................................................... 4757

Vypuštěné ........................................................................... 4757

II Texty v Národní části Českého lékopisu –

Doplňku 2018 ..................................................................... 4758

Nové ................................................................................... 4758

Revidované a korigované .................................................. 4758

ČL 2017 – Dopl. 2020 29

OBSAH


Doplňku 2019 .................................................................... 4759


Vypuštěné texty ................................................................. 4759


Doplňku 2020 .................................................................... 4760

Nové ................................................................................... 4760


Vypuštěné .......................................................................... 4760

OBECNÁ ČÁST

Obecné statě ............................................................................. 4762

Zkoumadla použitá v národních článcích ................................ 4762

Referenční látky použité v národních článcích ........................ 4764

Tabulky .................................................................................... 4765

Tabulka I: Omamné a psychotropní látky ................................ 4765

Tabulka II: Venena ................................................................... 4767

Tabulka III: Separanda ............................................................. 4768

Tabulka IV: Doporučené terapeutické dávky léčiv

pro dospělé ......................................................................... 4778

Tabulka V: Doporučené terapeutické dávky léčiv pro děti ...... 4856

Tabulka VI: Doporučené dávky některých oficinálních

léčiv používaných u zvířat ................................................. 4883

Tabulka VII: Závislost relativní hustoty na obsahu

ethanolu .............................................................................. 4917

Tabulka VIII: Izotonizace vodných roztoků léčiv

připravovaných v lékárnách ............................................... 4927

Tabulka X: Standardní názvy lékových forem, způsobů

podání a obalů .................................................................... 4935

Tabulka XI: Relativní atomové hmotnosti prvků ..................... 4967

Tabulka XII: Česko-anglické názvy referenčních

standardů EDQM použitých v Českém lékopisu ............... 4970

Tabulka XIII: Látkové koncentrace léčivých látek .................. 5028

Tabulka XIV: Převod hmotnostních a objemových

množství kapalných látek ................................................... 5030

Tabulka XV: Vytěsňovací koeficienty čípků ........................... 5031

Tabulka XVI: Skladování a doba použitelnosti přípravků

připravených v lékárně ....................................................... 5033

SPECIÁLNÍ ČÁST

Acaciae mucilago ..................................................................... 5037

Acidi borici aqua ophthalmica ................................................. 5037

Acidi borici et acidi salicylici solutio ethanolica

cum glycerolo .................................................................... 5038

Acidi borici et acidi salicylici solutio ethanolica

cum resorcinolo .................................................................. 5038

Acidi borici oculoguttae ........................................................... 5039

Acidi borici solutio 3% ............................................................ 5040

Acidi borici solutio ethanolica ................................................. 5040

Acidi borici unguentum 10% ................................................... 5040

Acidi salicylici solutio ethanolica ............................................ 5041

Acidi salicylici solutio ethanolica cum resorcinolo ................. 5042

Acidi salicylici unguentum ...................................................... 5042

Acidi salicylici unguentum 1% cum etheroleo

lavandulae .......................................................................... 5043

Acidum peraceticum 4% .......................................................... 5043

Acidum peraceticum 15% ........................................................ 5044

Acidum peraceticum 35% ........................................................ 5045

Adeps suillus ............................................................................ 5046

Adeps suillus stabilisatus ......................................................... 5046

Alcoholis cetylici cremor ......................................................... 5048

Alcoholis cetylici unguentum .................................................. 5048

Alcoholum adipis lanae cremor ............................................... 5048

Alcoholum adipis lanae unguentum ......................................... 5049

Althaeae sirupus ....................................................................... 5049

Aluminii acetotartratis cremor ................................................. 5050

Aluminii acetotartratis otoguttae .............................................. 5051

Aluminii acetotartratis solutio .................................................. 5051

Ammoniae solutio 10% ............................................................ 5052

Anisi spiritus compositus ......................................................... 5052

Aqua carminativa ..................................................................... 5053

Aqua carminativa rubra ............................................................ 5053

Aqua conservans ...................................................................... 5054

Argenti diacetyltannas albuminatus ......................................... 5054

Argenti diacetyltannatis albuminati rhinoguttae ...................... 5055

Argenti nitratis unguentum compositum .................................. 5056

Atropini sulfatis oculoguttae .................................................... 5056

Aurantii pericarpium dulce ...................................................... 5057

Bentoniti dispersio ................................................................... 5058

Bergamottae etheroleum .......................................................... 5058

Butamirati citras ....................................................................... 5060

Calcii hydroxidi solutio ............................................................ 5062

Calcii chloridi solutio ............................................................... 5062

Calcii oxidum ........................................................................... 5063

Calcii sulfas hemihydricus ....................................................... 5063

Camphorae spiritus ................................................................... 5064

Cannabis sativae oleum ............................................................ 5064

Carbethopendecinii bromidum ................................................. 5066

Chloramphenicoli oculoguttae ................................................. 5068

Cremor anionicus ..................................................................... 5068

Cremor nonionicus ................................................................... 5069

Cremor refrigerans ................................................................... 5070

Darrowi infusio ........................................................................ 5070

Dexamethasoni acetas solutio 1% ............................................ 5071

Dextrani 40 infusio ................................................................... 5072

Dextrani 70 infusio ................................................................... 5072

Ergotamini tartras trituratus ..................................................... 5073

Ethacridini lactatis solutio ........................................................ 5074

Ethanolum 60% ........................................................................ 5074

Ethanolum 70% ........................................................................ 5075

Ethanolum 85% ........................................................................ 5075

Ethanolum benzino denaturatum .............................................. 5075

Ethylmorphini hydrochloridi oculoguttae ................................ 5076

Farfarae folium ......................................................................... 5077

Fluoresceini natrici oculoguttae ............................................... 5078

Formaldehydi Kutvirti gargarisma ........................................... 5079

Galla ......................................................................................... 5080

Gallarum tinctura ..................................................................... 5081

Geranii etheroleum ................................................................... 5082

Glucosi infusio ......................................................................... 5082

Glyceroli unguentum ................................................................ 5083

Hartmanni infusio ..................................................................... 5084

Homatropini hydrobromidi oculoguttae ................................... 5085

Homatropini hydrobromidi oculoguttae euacida ..................... 5086

Ibuprofeni suppositorium ......................................................... 5087

Ichthammoli unguentum .......................................................... 5087

Iodi solutio aquosa ................................................................... 5088

Iodi solutio ethanolica .............................................................. 5088

Iodi solutio glycerolica ............................................................. 5089

Jecoris aselli unguentum compositum ..................................... 5089

Kalii et natrii iodidi oculoguttae .............................................. 5090

Kalii iodidi oculoguttae ............................................................ 5091

Macrogoli unguentum .............................................................. 5091

Magnesii sulfatis solutio 20% .................................................. 5092

Mannitoli infusio ...................................................................... 5092

Melissae herba .......................................................................... 5093

Menthae piperitae herba ........................................................... 5094

Methylcellulosi mucilago ......................................................... 5095

Methylrosanilinii chloridi solutio ............................................. 5095

Natrii chloridi infusio isotonica ............................................... 5096

Natrii chloridi infusio isotonica cum glucoso .......................... 5096

Natrii tetraboratis globulus ....................................................... 5097

Natrii tetraboratis oculoguttae cum acido borico ..................... 5098

Natrii tetraboratis oculoguttae sine acido borico ..................... 5099

Natrii tetraboratis solutio glycerolica ....................................... 5099

Natrii tetraboratis solutio glycerolica cum trimecaino

hydrochlorido ..................................................................... 5100

Oculoguttae viscosae isotonicae .............................................. 5101

Paracetamoli suppositorium ..................................................... 5101

Paracetamoli suppositorium pro infantibus .............................. 5102

30 ČL 2017 – Dopl. 2020

OBSAH

Petroselini radix ........................................................................ 5102

Phenolum liquefactum .............................................................. 5103

Pilocarpini hydrochloridi oculoguttae ...................................... 5104

Pilocarpini hydrochloridi oculoguttae cum natrii

chlorido .............................................................................. 5104

Plantaginis extractum fluidum .................................................. 5105

Plantaginis sirupus .................................................................... 5106

Propranololi hydrochloridi solutio cum acido citrico ............... 5106

Propranololi hydrochloridi solutio cum natrii

hydrogenophosphate .......................................................... 5107

Ringeri infusio .......................................................................... 5108

Ringeri infusio cum glucoso ..................................................... 5109

Ringeri infusio cum natrii lactate ............................................. 5110

Salia pro gargarismate pulvis ................................................... 5111

Salviae herba ............................................................................ 5112

Sapo kalinus .............................................................................. 5113

Sinapis etheroleum artificiale ................................................... 5114

Sirupus simplex ........................................................................ 5114

Solutio Castellani sine fuchsino ............................................... 5115

Solutio Fraeser .......................................................................... 5116

Solutio Jarisch .......................................................................... 5117

Solutio phenoli camphorata ...................................................... 5117

Spiritus ethereus ....................................................................... 5118

Spiritus saponatus ..................................................................... 5118

Spiritus saponis kalini ............................................................... 5119

Sulfathiazoli globulus ............................................................... 5119

Sulfuris pasta 50% .................................................................... 5120

Sulfuris pasta composita ........................................................... 5120

Sulfuris suspensio ..................................................................... 5121

Suxamethonii diiodidum .......................................................... 5121

Tetracaini hydrochloridi oculoguttae ....................................... 5122

Thymi extractum fluidum ......................................................... 5123

Tinctura amara .......................................................................... 5124

Trimecaini hydrochloridum ...................................................... 5125

Unguentum constituens pro antibioticis ................................... 5127

Unguentum emulsificans anionicum ........................................ 5127

Unguentum emulsificans nonionicum ...................................... 5128

Unguentum molle ..................................................................... 5128

Unguentum ophthalmicum simplex ......................................... 5129

Unguentum simplex ................................................................. 5129

Unguentum Whitfield ............................................................... 5130

Veratri albi radix ...................................................................... 5131

Zinci oxidi gelatina mollis ........................................................ 5131

Zinci oxidi pasta ....................................................................... 5132

Zinci oxidi pasta 50% ............................................................... 5132

Zinci oxidi pasta mollis ............................................................ 5133

Zinci oxidi pasta salicylata ....................................................... 5133

Zinci oxidi suspensio ................................................................ 5134

Zinci oxidi suspensio cum levomentholo ................................. 5134

Zinci oxidi unguentum ............................................................. 5135

Zinci sulfatis oculoguttae ......................................................... 5136

Zinci sulfatis solutio ................................................................. 5137

VATY

Cellulosum ligni ....................................................................... 5138

Lana mixta depurata ................................................................. 5138

ČL 2017 – Dopl. 2020 31

EVROPSKÁ ČÁST

I PŘEDMLUVA K 10. VYDÁNÍ EVROPSKÉHO LÉKOPISU


Před několika málo lety (v roce 2014) jsme měli příležitost

si připomenout 50. výročí Evropského lékopisu. Letos

(v roce 2019) slavíme jiné výročí, a to 10. vydání základního

závazného dokumentu pro jakost léčivých látek a přípravků.

Od doby, kdy 8 zakládajících států zahájilo práci na Evropském

lékopise (v roce 1964), se svět výrazně změnil. Dnes

žijeme v globalizovaném světě, kde zboží, léčivé přípravky,

léčivé a pomocné látky nevyjímaje, jsou vyráběny a distribuovány

po celé planetě.

Evropský lékopis s tímto rozvojem držel krok: dnes je evropskou

referenční autoritou pro jakost léčivých přípravků

s globálním vlivem. Texty zveřejněné na jeho stránkách

jsou veřejnými, legálními a závaznými standardy ve 38

členských státech a v Evropské unii (EU), které jsou signatáři

Úmluvy o vypracování Evropského lékopisu. Evropská

lékopisná komunita se za poslední tři roky rozrostla, přistoupením

Moldavské republiky k Úmluvě v roce 2017

a příchodem tří nových pozorovatelských států (Indie

a Japonsko v roce 2016 a Republika Uzbekistán v roce

2018), což jasně ilustruje trvalou výzvu a dynamiku Evropského

lékopisu. Pozoruhodná skutečnost, že pozorovateli je

dnes 6 evropských zemí, 22 neevropských zemí, Taiwanský

úřad pro kontrolu léčiv a potravin (TFDA) a Světová zdravotnická

organizace (WHO) dokazuje, že Evropský lékopis

slouží nejen zdraví několika stovek milionů evropských občanů,

ale má také celosvětový dopad.

Činnosti Evropského lékopisu jsou koordinovány Evropským

direktorátem pro jakost léčiv & péči o zdraví (EDQM). Tuto

činnost provádí 20 skupin expertů a asi 40 aktivních pracovních

skupin. Celkem se jedná o více než 700 členů, kterými

jsou experti z Evropy i mimo ni. Od roku 2016 je členství

rozšířeno také o experty z celého světa, jehož smyslem je

držet krok se současnou globalizací trhu a zároveň obohatit

diskuse v rámci skupin.

Je mým osobním přesvědčením, že každý, kdo je zapojen

do práce na Evropském lékopisu může být velmi hrdý, že je

možné vytvořit a průběžně aktualizovat dílo obsahující více

než 2500 textů, z nichž každý lze přijmout pouze pomocí

jednomyslného souhlasu členských států Evropského lékopisu.

Je to vynikající důkaz toho, že lidé mohou skutečně

překonat potenciální bariéry a kulturní rozdíly.

Publikace 10. vydání Evropského lékopisu je ideální příležitostí

ohlédnout se za jeho vývojem od 1. do 10. vydání.

1. vydání bylo vytištěno ve formě tří vázaných svazků mezi

lety 1968 a 1976.

2. vydání, publikované v roce 1980, bylo uspořádáno do nového

formátu ve formě volných listů v pořadači; nový svazek

vycházel uprostřed každého roku a obsahoval všechny texty

přijaté Evropskou lékopisnou komisí v předešlém roce. Toto

druhé vydání skončilo publikováním 19. svazku v roce 1995.

3. vydání Evropského lékopisu obsahovalo asi 1200 textů

a bylo poprvé vydáno ve dvou formách: jako elektronická

verze (CD-ROM) a jako tištěná verze (kniha formátu A4).

Toto vydání bylo publikováno v roce 1996 s předpokládaným

publikačním cyklem 5 let. Aby byla zajištěna aktuálnost

lékopisu, byl každý rok vydáván doplněk, který byl

postupně zapracováván do jediného doplňkového svazku

k hlavnímu vydání.

Od 4. vydání, publikovaného v knize a na CD-ROM, byl publikační

cyklus zkrácen na 3 roky, se třemi nekumulativními

doplňky ročně (v roce publikování hlavního vydání pouze

dva doplňky), tento harmonogram pokračuje dodnes. V roce

2003 (Doplněk 4.6) vstoupil Evropský lékopis do nové éry

spuštěním online verze, která uživatelům dává na výběr ze tří

různých formátů. V roce 2009 (Doplněk 6.7) byla místo

CD-ROM použita DVD verze, která byla v roce 2010

(7. vydání) nahrazena USB verzí. Od roku 2017 (Doplněk

9.3) je k dispozici online verze, umožňující stahování.

10. vydání Evropského lékopisu obsahuje 2792 textů. Od

počátečního 1. vydání se třemi vázanými svazky jsme urazili

dlouhou cestu!

Poslední 3 roky měl jsem tu čest působit jako 18. zvolený

předseda Evropské lékopisné komise. Výzvy byly četné, ale

díky ochotě spolupracovat, připravenosti najít kompromisy

a nadšení všech zúčastněných pokračoval vývoj Evropského

lékopisu velmi dobře. Na některé pokroky provedené

v tomto období bych vás rád upozornil.

– Na základě rozhodnutí Evropské lékopisné komise

(COM, dále jen Komise) vytvořit články léčivých přípravků

obsahující chemicky definované léčivé látky,

bylo v Doplňku 9.8 přijato a publikováno 7 nových článků

[Deferiproni solutio peroralis (2987), Deferiproni tabulettae

(2986), Lacosamidi solutio infundibilis (2991),

Lacosamidi solutio peroralis (2990), Lacosamidi tabulettae

(2989), Raltegraviri tabulettae (2938), Raltegraviri

tabulettae manducabiles (2939)]. Všechny tyto články

byly vypracovány postupem P4 pro produkty s patentovou

ochranou z jediného zdroje. Prvním článkem léčivého

přípravku obsahujícího chemicky definovanou léčivou

látku byl Sitagliptini tabulettae (2927), který byl publikován

již v 8. vydání Evropského lékopisu.

– Od posledního vydání dosáhla Komise důležitého milníku

v oblasti biologických léčivých přípravků. Pilotní fáze

P4Bio byla úspěšně zakončena přijetím článku Etanerceptum

(2895) a stala se dalším důkazem toho, že problémy

při standardizaci biologických léčivých přípravků,

vyplývající z jejich složitosti a různorodosti, lze překonat

a že specifikace těchto článků jsou slučitelné se vznikem

biologicky podobných léčivých přípravků (biosimilars).

Přijetí článku Infliximabum solutio concentrata (2928)

v listopadu 2017, společně se zpětnou vazbou od zúčastněných

stran během veřejných konzultací ve Pharmeuropě

ukázala, že je proveditelné nastavit smysluplné kvalitativní

požadavky na komplexní monoklonální protilátky (mAbs)

s molekulovými hmotnostmi asi 150 kDa. V zájmu dosažení

tohoto cíle bude Komise pokračovat v nastavování veřejných

standardů pro léčbu pomocí mAbs vývojem vhodných

obecných požadavků a metodik použitelných pro různé

atributy jakosti společné pro třídy/podtřídy mAbs (např.

standardy založené na TNF-α produktech).

Předmluva

k 10. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 33


– Komise pokračovala v aktualizaci obecných statí Evropského

lékopisu prostřednictvím revizí a vypracování nových

textů. Byly přijaty nové obecné statě:

– Chemické zobrazování (5.24), první text tohoto typu na

světě, který byl zaveden do lékopisu. Tato stať obsahuje

specifická doporučení, jak posoudit účinnost chemických

zobrazovacích systémů používaných pro kvalitativní

a kvantitativní zkoušení.

– Procesní analytická technologie (5.25) se zaměřením na

propojení analytických metod s výrobním procesem jako

prostředek pro zlepšení řízení procesu a porozumění

procesu.

– Skenovací elektronová mikroskopie (2.9.52), zaměřená

na aplikaci této metody na farmaceutické materiály, od

výzkumu po kontrolu jakosti.

Revize byly zaměřeny na široce používané obecné statě:

– Ztráta sušením (2.2.32)

– Osmolalita (2.2.35)

– Absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti

(2.2.24)

– Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné

oblasti (2.2.25)

– Komise dále dolaďovala strategii implementace ICH

Q3D pokynu pro elementární nečistoty a přijala revidované

verze obecných článků Corpora ad usum pharmaceuticum

(2034) a Praeparata pharmaceutica (2619),

stejně jako revidované verze obecných statí Elementární

nečistoty (5.20) a Stanovení elementárních nečistot

(2.4.20). Z důvodu implementace ICH Q3D pokynu do

Evropského lékopisu bylo revidováno velké množství

jednotlivých článků.

– Důležitého milníku bylo také dosaženo nastavením kvalitativních

požadavků na živé biologické léčivé přípravky

(LBPs) - což jsou léčivé přípravky obsahující živé mikroorganismy,

jako jsou bakterie nebo kvasinky - přijetím

standardů jakosti pro LBP pro humánní použití. Jedná se

o obecný článek Producta biotherapeutica viva ad usum

humanum (3053) a 2 obecné statě Mikrobiologické zkoušení

živých biologických léčivých přípravků: stanovení

počtu mikrobiálních kontaminantů (2.6.36) a Mikrobiologické

zkoušení živých biologických léčivých přípravků:

zkoušky na specifikované mikroorganismy (2.6.38).

– Komisí byl také přijat revidovaný obecný článek Producta

ab ADN recombinante (0784). V tomto článku jsou

uvedeny obecné požadavky na výrobu a kontrolu léčivých

produktů vyrobených rekombinantní DNA technologií

včetně požadavků na účinné látky v těchto produktech.

Několik částí textu bylo aktualizováno, včetně

odstavce Produkce, článek byl zcela přepracován

a zmodernizován v souladu s doporučeními a pokyny

Mezinárodní rady pro harmonizaci technických požadavků

pro humánní léčivé látky (ICH), Evropské lékové

agentury (EMA) a Světové zdravotnické organizace

(WHO).

– Obecný článek Corpora ad usum pharmaceuticum

(2034) byl revidován za účelem objasnění požadavků

zkoušky na bakteriální endotoxiny a jejich sladění

s politikou týkající se tohoto tématu, kterou Komise

schválila na svém 149. zasedání v červnu 2014. Tato revize

je v souladu s revizí statě Pokyny pro použití zkoušky

na bakteriální endotoxiny (5.1.10) publikované v Doplňku

8.8 Evropského lékopisu, který také obsahuje doporučení

pro stanovení limitů a informace o tom, jak hodnotit

pyrogenitu látek. Odkaz na Pokyn k limitům genotoxických

nečistot (Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities)

uveřejněný EMA byl rovněž nahrazen odkazem

na nové Pokyny pro posuzování a kontrolu DNA reaktivních

(mutagenních) nečistot v léčivech k omezení potenciálního

karcinogenního rizika (ICH M7) [Guideline on

Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic)

Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic

Risk].

– Nově zavedená obecná stať Vysokoúčinná tenkovrstvá

chromatografie pro rostlinné drogy a přípravky z rostlinných

drog (HPTLC, 2.8.25) významně přispěla ke zlepšení

chromatografických zkoušek totožnosti v článcích rostlinných

drog a přípravků z rostlinných drog. Tato nová

metoda nejen zlepšuje selektivitu, ale také umožňuje objektivnější

hodnocení pozorovaných skvrn pomocí markerů

intenzity. Popsané vybavení zajišťuje standardní přípravu

desek a zahrnuje systém pro elektronický záznam

chromatogramů.

– Komise pokračovala v úsilí výrazně snížit požadovaný

počet pokusných zvířat zavedením vědeckých postupů,

upravujících metody použité v článcích a obecných statích,

kdekoliv je to možné, aby se v Evropském lékopisu

uplatnily 3R principy [nahrazování (replacing), snižování

(reducing) a zlepšování (refining)] použití zvířat

ve vědeckých postupech. Příkladem tohoto úsilí je přijetí

nové obecné statě usnadňující zavedení in vitro metod jako

náhrady stávajících in vivo metod pro kontrolu jakosti

vakcín (5.2.14). Tato obecná stať poskytuje návod, jak

validovat alternativní in vitro metody v případech, kdy

přímé vzájemné porovnání s existující in vivo metodou

není možné. Po přijetí této nové stati Komise přijala revidované

verze obecných článků Vaccina ad usum humanum

(0153) a Vaccina ad usum veterinarium (0062) za

účelem omezení zkoušení na zvířatech a podpory použití

alternativ.

V roce 2017 Komise schválila úplné vypuštění zkoušky

na neškodnost z Evropského lékopisu. Jako součást tohoto

procesu bylo přijato 49 revizí článků, ze kterých byla

tato zkouška vypuštěna, z toho 36 článků se týká vakcín

pro humánní použití. Obecná stať Zkouška na neškodnost

(2.6.9) se stala zastaralou, a proto byla z Evropského lékopisu

vyřazena.

– Komise také usilovala o nahrazení používání nebezpečných

chemických látek, kdykoli je to možné, což vedlo

k revizi mnoha článků a obecných statí.

Tento výčet – který není ani úplný, ani vyčerpávající - ilustruje

působivou dynamiku Evropského lékopisu a ochotu

Komise společně s národními lékopisnými autoritami

a odborníky z členských zemí, i mimo ně, držet krok

s novým vývojem.

V tomto období vzniklo také několik nových pracovních

skupin a některé starší neaktivní skupiny byly znovu uvedeny

v činnost za účelem řešení vznikajících problémů:

34 ČL 2017 – Dopl. 2020


– Byla vytvořena pracovní skupina Pyrrolizidinové alkaloidy

(PA WP), která byla pověřena vypracováním obecné

stati na zkoušení Pyrrolizidinových alkaloidů (2.8.26).

Toto rozhodnutí bylo přijato v reakci na poptávku evropských

regulačních autorit a v návaznosti na zprávy z některých

členských států Evropského lékopisu týkající se

zjištění, že některé rostlinné léčivé přípravky a potravinové

doplňky jsou kontaminovány rostlinami obsahujícími

pyrrolizidinové alkaloidy.

– Pracovní skupina Produkty genové terapie byla znovu

uvedena v činnost v reakci na nedávný vývoj v této oblasti.

Pracovní skupina byla pověřena revizí obecné statě

Léčivé přípravky pro přenos genů pro humánní použití

(5.14) vzhledem k nově vypracovaným lékopisným textům,

jako je obecná stať Vstupní suroviny biologického

původu pro produkci léčivých přípravků pro buněčnou

a genovou terapii (5.2.12). Tato pracovní skupina se rovněž

podílela na revizi transverzálních textů vypracovaných

jinými skupinami expertů nebo pracovními skupinami

Evropského lékopisu, např. na obecné stati Kvantifikace

a charakterizace zbytkové DNA hostitelských buněk

(2.6.35).

Kromě toho Komise zahájila aktivity zaměřené na objevování

nových přístupů pro oblasti, ve kterých se stávající postupy

projevily jako omezující:

– Jedním příkladem je pilotní fáze článků tradiční čínské

medicíny (TCM), kde se zjišťuje, zda je možné ve zkouškách

nahradit kapalinovou chromatografii semikvantitativní

HPTLC. Cílem je prokázat, že může být dosaženo

stejného rozhodnutí při stanovení analytickými markery

a že „otisk prstu“ (fingerprinting) může vést k smysluplnější

charakterizaci vícesložkových směsí, jako jsou rostlinné

drogy.

– Komise také identifikovala semikvantitativní „otisk prstu“

(fingerprinting) jako potenciální nový přístup k řešení

problémů spojených s homeopatickými přípravky a znovu

zařadila důležité položky z této oblasti do pracovního

programu.

Na závěr této předmluvy bych nejprve chtěl poděkovat

všem členům Evropské lékopisné komise za jejich důvěru

a podporu, která nám umožnila učinit podstatné pokroky

v tak mnoha oblastech.

Zvláštní poděkování patří paní ředitelce EDQM dr. Susanne

Keitel, mým dvěma místopředsedům, prof. Torbjörnu Arvidssonovi

a dr. Hildě Köszegi Szalai, tajemnici Evropské

lékopisné komise paní Cathie Vielle a jejím dvěma zástupcům,

paní dr. Emmanuelle Charton a dr. Ulrichu Rosemu za

jejich vynikající práci a podporu během mého předsednictví.

Velmi otevřené a konstruktivní výměny názorů, které

mezi námi proběhly, nám umožnily účinně a úspěšně vést

práci Evropské lékopisné komise – a díky nim se má práce

stala také mým potěšením.

Nakonec bych chtěl upřímně poděkovat všem předsedům

a odborníkům ve skupinách expertů a pracovních skupinách,

stejně jako zaměstnancům EDQM a národním lékopisným

autoritám. Evropský lékopis je možný pouze díky

všudypřítomnému nadšení, tvrdé práci a vzájemné spolupráci.

Díky vašemu odhodlání a úsilí bude Evropský lékopis nadále

zajišťovat jakost léčiv ve prospěch pacientů na mnoho

dalších let.

Dr. Tobias Gosdschan,

předseda Evropské lékopisné komise

28.únor 2019

Předmluva

k 10. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 35



V roce 1964 podepsalo pod záštitou Rady Evropy osm zakládajících

států Úmluvu o vypracování Evropského lékopisu

(dále Úmluva). V říjnu 2014 jsem jako sedmnáctý volený

předseda Evropské lékopisné komise měl to potěšení oslavit

společně se svými kolegy 50. výročí Evropského lékopisu.

Při této příležitosti se shromáždilo více než 300 delegátů ze

45 zemí na konferenci ve Štrasburku, aby diskutovalo využití

Evropského lékopisu a připravilo cestu pro jeho budoucnost.

Delegáti konference poskytli velmi pozitivní zpětnou vazbu

k využití článků a statí a Evropský lékopis byl označen jako

úzce spolupracující se všemi zúčastněnými a odrážející jejich

potřeby. Tato konference také dala příležitost k ohlédnutí

zpět na 50 let Evropského lékopisu a k úvahám o tom, jak daleko

jsme již došli při vytváření jednotného referenční standardu

pro výrobu a kontrolu jakosti léčivých přípravků na evropském

trhu.

Harmonizace, kterou Evropský lékopis přinesl, jasně přispívá

k ochraně veřejného zdraví a k usnadnění volného

pohybu léčivých přípravků v Evropě. Farmaceutický svět

prodělal během posledních 50 let dramatické změny a stal

se globalizovaným trhem s léčivými látkami a léčivými přípravky.

To vedlo ke snahám harmonizovat standardy na

globální úrovni a k tlaku na Evropský lékopis, Japonský lékopis

a Lékopis Spojených států amerických, aby společně

založily Lékopisnou diskuzní skupinu [Pharmacopoeial

Discussion Group (PDG)] v roce 1989. PDG od té doby řeší

některé problémy tohoto stále globalizovanějšího trhu

a uplatňování vědeckého pokroku, kterého bylo dosaženo

mezinárodní harmonizací monografií pro pomocné látky

a obecné metody v těsné návaznosti na aktivity Mezinárodní

rady pro harmonizaci technických požadavků pro humánní

léčivé přípravky (ICH). Podrobné informace

o pracovním programu PDG jsou pravidelně zveřejňovány

ve Pharmeuropě a výsledky této práce se odrážejí v obecné

stati 5.8 Harmonizace lékopisu.

Když se přesuneme do příštích 50 let vývoje Evropského

lékopisu, shledává Evropská lékopisná komise, že vysoké

procento léčivých farmaceutických látek (API) již nyní pochází

ze zemí mimo Evropu, Japonsko a Spojené státy americké

a že je tady další potřeba vzájemné spolupráce mimo

hranice PDG, mezi světovými lékopisy. Světová zdravotnická

organizace (WHO) se chopila iniciativy ke svolání

schůzky těchto světových lékopisů a k harmonizaci jejich

přístupů a připravila pokyn Správná lékopisná praxe pro

vývoj lékopisných článků. Evropský lékopis, ve spolupráci

s dalšími lékopisy, hrál v přípravě tohoto pokynu aktivní

úlohu a těší se na její využití pomáhající budoucí harmonizaci.

Je jasné, že Evropský lékopis má ve světě ideální postavení

k tomu, aby usnadnil globální harmonizační přístup k zajištění

vhodných jakostních standardů. Je to dáno tím, že Úmluva

o vypracování Evropského lékopisu má nyní 38 signatářů

a 28 pozorovatelů, včetně WHO, a řadu nových pozorovatelů,

jako jsou Korejská republika (2015), Azerbájdžánská republika

(2014), Taiwanský úřad pro léky a potraviny (2013)

a Jihoafrická republika (2013).

Jako další odraz globálního statutu Evropského lékopisu

rozhodla Evropská lékopisná komise přehodnotit své postupy

schvalování expertů z neevropských členských států

tak, aby mohli být jmenováni sekretariátem. Toto rozhodnutí

je součástí politiky zaměřené na další začleňování pozorovatelských

států a výrobců mimo Evropu do práce na

Evropském lékopisu. Komise se také rozhodla zjednodušit

a urychlit nominační proces odstraněním rozdílů mezi „experty“

a „specialisty“ a odstraněním limitu umožňujícího

členskému státu jmenovat pouze jednoho experta do dané

skupiny a také zjednodušit proces jmenování ad-hoc specialistů,

aby se podpořila práce na Evropském lékopisu. Evropská

lékopisná komise vidí tyto změny jako další cestu

k různorodému přístupu, který již máme a který posiluje

postavení Evropského lékopisu na světové scéně.

Toto deváté vydání je publikováno ve třech tištěných svazcích,

protože bylo třeba zohlednit rostoucí počet textů. Nabytí

účinnosti devátého vydání je 1. ledna 2017 a toto vydání

bude během dalších tří let doplněno osmi doplňky, které

budou obsahovat texty schválené na zasedáních Evropské

lékopisné komise (třemi během jednoho roku). Evropský

lékopis se stále vydává ve dvou oficiálních jazycích

Rady Evropy, tj. angličtině a francouzštině, v knižní podobě

i elektronicky (on-line verze a formou USB klíče). Za povšimnutí

stojí, že některé členské státy pořizují překlady

Evropského lékopisu do místního jazyka a že texty Evropského

lékopisu mohou být začleněny do existujících národních

lékopisů, jako je tomu v Britském nebo Španělském

královském lékopisu. Tyto postupy přispívají k dalšímu

všeobecnému rozšíření standardů publikovaných

v Evropském lékopisu.

Co je nového v devátém vydání? Je zde mnoho oblastí, na

které bych vás rád upozornil.

Za prvé, po opakovaných žádostech schválila Evropská lékopisná

komise obecné principy přípravy článků konečných

přípravků obsahujících chemicky definovanou léčivou látku.

Tyto principy byly načrtnuty v části Obecné zásady,

v obecných článcích pro lékové formy a v obecném článku

Praeparata pharmaceutica (2619). Po úspěšném pilotním

projektu rozhodla Evropská lékopisná komise o přípravě

článků pro přípravky, které byly registrovány nejméně

v jednom z členských států, a pro jejichž léčivou látku již

byl publikován článek v Evropském lékopisu, nebo je

v pracovním programu. Stejně jako u ostatních lékopisných

článků je příprava a revize článků konečných přípravků

předmětem veřejných konzultací, berou se v úvahu poslední

vědecké poznatky a související léčivé přípravky, které jsou

v daném čase registrovány. Prvním článkem konečného

přípravku obsahujícího chemicky definovanou léčivou látku

byl Sitagliptin tablety (2927) publikovaný jako součást

osmého vydání Evropského lékopisu. Rozhodnutí zařadit

do Evropského lékopisu články konečných přípravků bylo

vřele přijato mnoha národními lékopisy a registračními autoritami,

stejně jako sesterskými lékopisy po celém světě.

Zájem průmyslu o tuto novou aktivitu je nejlépe doložen

zvyšujícími se počty návrhů nových článků v této oblasti.

36 ČL 2017 – Dopl. 2020


Za druhé, jako vždy, je jednou ze silných stránek Evropského

lékopisu kontrola nečistot. Tato práce pokračuje

a profil nečistot v článcích odráží existující cesty syntézy

schválené oprávněnými autoritami členských zemí. Revizní

mechanismus zajišťující, aby nové analytické metody

v článcích zůstaly robustní, byly validovány a založeny na

mezilaboratorním zkoušení (všechny metody publikované

v Evropském lékopisu jsou experimentálně ověřovány), je

na místě pro nově schválené produkty (např. nové zdroje,

nové způsoby). Do článků se promítá registrační praxe

aplikováním ICH Q3A (R2) pokynu na látky se zaměřením

na kvantitativní aspekty prostřednictvím obecného článku

Corpora ad usum pharmaceuticum (2034), který se použije

pro všechny takové látky, bez ohledu, zda mají nebo nemají

individuální článek v Evropském lékopisu. S rostoucí globalizací

dodavatelských řetězců opět existuje neustálá potřeba

aktualizovat monografie tak, aby odrážely současné

schválené specifikace.

Evropský lékopis bude aktualizovat část Příbuzné látky

v článcích protože pokyn Evropské lékové agentury (European

Medicines Agency, EMA) týkající se limitů genotoxických

nečistot, který vstoupil v platnost v roce 2007, je

od 1. ledna 2016 nahrazen pokynem ICH M7 [Assessment

and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in

pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk].

Evropská lékopisná komise (Pracovní skupina pro těžké

kovy) připravuje zavedení ICH Q3D pokynu na elementární

nečistoty. Stávající obecná stať 5.20 Rezidua kovových katalyzátorů

nebo kovových reakčních činidel kopírující pokyn

EMA (EMEA/CHMP/SWP/4446/2000) na specifikaci

limitů reziduí kovových katalyzátorů nebo kovových reakčních

činidel bude revidována, aby se v ní odrazily principy

pokynu ICH Q3D (v Evropě vstupuje v platnost

v červnu 2016 pro nově registrované přípravky a v prosinci

2017 pro již registrované přípravky). Současná stať Evropského

lékopisu 2.4.20 Stanovení reziduí kovových katalyzátorů

nebo kovových reakčních činidel popisující obecný postup

pro stanovení reziduí kovových katalyzátorů nebo kovových

reakčních činidel v látkách pro farmaceutické použití,

bude v důsledku toho také revidována. Společně s ostatními

obecnými statěmi vztahujícími se k analýze elementárních

nečistot budou tyto revize v potřebném rozsahu sladěny

s posledními požadavky uvedenými v pokynu ICH Q3D.

Jako poslední úkol byly ze všech jednotlivých článků látek

pro humánní použití a pro humánní a veterinární použití odstraněny

odkazy na stať 2.4.8 Těžké kovy, u látek pro pouze

veterinární použití byly ponechány.

Za třetí, Evropská lékopisná komise pracuje na vývoji politiky

pro testování bakteriálních endotoxinů v látkách pro

farmaceutické použití. V rámci této politiky nebude do nových

článků látek pro farmaceutické použití vložena zkouška

na bakteriální endotoxiny, pokud nemusí být popsány

specifické metody zkoušení, např. když je požadována specifická

cesta přípravy vzorku nebo se musí použít specifické

zkoumadlo. Pokud bude do nových článků zkouška vložena,

nebude se uvádět žádný limit pro bakteriální endotoxiny.

Budou platit požadavky obecného článku Corpora ad

usum pharmaceuticum (2034). Specifikace pro zkoušku na

bakteriální endotoxiny budou ve stávajících jednotlivých

článcích pro látky pro farmaceutické použití ponechány

a pro zachování dobře zavedených požadavků na bakteriální

endotoxiny zůstanou v jednotlivých článcích také již zavedené

limity. Aby mohla být tato politika uplatněna, byla

obecná stať 5.1.10 Pokyny pro použití zkoušky na bakteriální

endotoxiny rozšířena tak, aby zahrnovala další úvahy

týkající se určení limitů pro bakteriální endotoxiny a obecný

článek Corpora ad usum pharmaceuticum (2034) bude

pozměněn v souladu s politikou zkoušení bakteriálních endotoxinů.

Bylo vytvořeno velké množství pracovních skupin pracujících

s nově vzniklými otázkami:

(1) Byla ustavena nová Pracovní skupina pro živé bioterapeutické

přípravky (LBP), což jsou léčivé přípravky obsahující

živé mikroorganismy, jako jsou bakterie nebo

kvasinky. Vzhledem k tomu, že na Evropském trhu je

mnoho rozličných typů těchto přípravků, byla pracovní

skupina pověřena vypracováním článku pro živé bioterapeutické

přípravky, aby se vyhovělo jasně definované

potřebě harmonizovaných kritérií jakosti.

(2) Pracovní skupina pro zkoušku druhé totožnosti (SIT),

byla ustavena a vypracovala revidovaný pokyn definující

kritéria pro zkoušky druhé totožnosti (2.) (pouze pro

používání v lékárnách). Rozhodovací schéma potřeby

zkoušek druhé totožnosti se rovněž vyvíjí a výsledkem

jsou revize několika lékopisných článků s úpravou nebo

vypuštěním zkoušek druhé totožnosti. Tato práce byla

nezbytná proto, že některé zkoušky není možné provádět

v lékárnách, a také aby se zabránilo použití škodlivých

látek a látek spadajících pod Nařízení EU REACH

(Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction

of Chemical Substances).

(3) Evropský lékopis v současnosti obsahuje více než

300 obecných textů (obecných statí a obecných článků)

a Evropská lékopisná komise zřídila novou pracovní

skupinu, která má za úkol je revidovat. Tato Pracovní

skupina pro obecné metody byla zřízena po rozhodnutí

Komise hledat strategii, jak zvládnout potřebu revidovat

a v některých případech přepsat statě, aby se zajistilo

udržení tempa s inovacemi přístrojů a metod. I když

mnoho textů je pravidelně udržováno a modernizováno,

některé zůstaly nedotčeny, a proto lze očekávat velké

množství práce. Pracovní skupina pro obecné metody

bude také zodpovědná za vytvoření celého pracovního

programu a stanovení jeho priorit a přípravu návrhů pro

Evropskou lékopisnou komisi, jak nejlépe obsáhnout

revizi obecných textů. Pracovní skupina bude také kontrolovat

obsah a míru podrobností v obecných textech

ještě ve stadiu poslední fáze návrhů a povede přípravu

obecných textů.

Pokud jde o obecnější vývoj Evropského lékopisu:

– Evropská lékopisná komise přidala do svého pracovního

programu obecný článek pro společně zpracované pomocné

látky (co-processed excipients). Společně zpracované

pomocné látky jsou kombinací dvou nebo více pomocných

látek navrženou tak, aby se zlepšily vlastnosti

pomocných látek bez toho, že by došlo k významným

chemickým změnám.

Předmluva

k 9. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 37


– Po pečlivém zvážení a detailním vyhodnocení článku Voda

pro injekci rozhodla Evropská lékopisná komise umožnit

kromě destilace i použití reverzní osmózy při přípravě

vody pro injekci. Článek Voda pro injekci (0169) je nyní

v souladu s tím revidován pracovní skupinou Voda pro

farmaceutické použití v úzké spolupráci s pracovními

skupinami EMA (GMP/GDP Inspectors Working Group,

CHMP, CVMP a QWP).

– Stylizační pokyny Evropské lékopisné komise byly také

revidovány a byl zaveden nový přístup k upřesnění stupně

hydratace v názvech článků. Od nynějška bude článek určený

pro hydratovanou formu, ať už přesně definovanou

nebo ne, uvádět v názvu článku, v chemickém vzorci

a v chemickém názvu odpovídající stupeň hydratace. Pokud

je článek určen pro hydratovanou i nehydratovanou

formu, do jeho názvu a chemického názvu se tento údaj

neuvede, ale v chemickém vzorci je uvedeno xH2O. Tato

výjimka bude jasně vyjádřena v Definici přidáním následující

věty: „Může být bezvodá nebo může obsahovat

proměnlivé množství vody.“ Navíc se v názvu článku pro

bezvodé látky nadále nebude uvádět označení „bezvodý“,

pokud není zdůvodněno jinak. Pro nové články se stupeň

hydratace uvádí, kdekoliv je to vhodné. Pro již existující

články, kde ještě není uveden, bude zavedení stupně hydratace

do názvu posouzeno při nejbližší technické revizi

článku (včetně on-line publikace ve Pharmeuropě). Mnoho

existujících článků (např. pro některé anorganické látky)

obsahuje v názvu slovo „hydratovaný“. Ty budou posouzeny

případ od případu.

– Evropská lékopisná komise pokračuje v posuzování a revizích

stávajících textů ve smyslu zařazení konceptů technologie

analýzy procesu (PAT), zkoušení pro propouštění

v reálném čase (RTRT) a jakosti zaručené projektem

(QbD). Komise připravila obecnou stať z oblasti chemometrie

5.21 Chemometrické metody pro analytická data,

tedy modelování analytických dat [tj. analýzy hlavních

komponent, „vytěžení dat“ (data mining), chemické zobrazování

(imaging) atd.] a revize obecných statí měřicích

technik rozšířené o modelování analytických dat (2.2.40

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti a 2.2.48

Ramanova spektroskopie).

– Evropská lékopisná komise pokračovala v úsilí výrazně

snížit požadovaný počet zvířat zavedením revidovaných

vědeckých postupů použitých v článcích i obecných statích,

kdekoliv je to možné, aby Evropský lékopis uplatnil

princip 3R, tj. nahrazení (replacing), snížení (reducing)

nebo zlepšování (refining) použití zvířat ve vědeckých

postupech.

Pokračovalo úsilí Evropské lékopisné komise, aby se řešila

hlavní témata definovaná na Pracovním setkání o budoucnosti

biologických článků (Workshop on the future of monographs

in the field of biologicals) organizovaném EDQM

v roce 2011:

– Pracovní skupina Suroviny pro buněčné přípravky a přípravky

pro přenos genů vypracovala novou obecnou stať

5.2.12 Vstupní suroviny biologického původu pro produkci

léčivých přípravků pro buněčnou a genovou terapii,

která je publikována v tomto devátém vydání. Stať je založena

na uvedení jakostních požadavků potřebných pro

pro sérum a jeho náhrady, bílkoviny získané rekombinantní

DNA technologií (jako jsou růstové faktory a cytokiny)

a bílkoviny extrahované z biologických materiálů

(jako jsou enzymy a polyklonální protilátky), pokud jsou

tyto biologické látky použité jako vstupní suroviny.

– Pracovní skupina Bílkoviny hostitelské buňky pracuje na

návrhu obecné statě na stanovení obsahu bílkovin hostitelské

buňky, která přinese doporučení pro vývoj, validaci

a použití pracovních nebo komerčních souprav (kitů) nebo

zkušebních metod pro detekci a kvantifikaci.

– Pracovní skupina P4-BIO v rámci své rozšířené působnosti

vypracovala článek Lidský koagulační faktor IX

(rDNA) prášek pro injekci (2994) a pracuje na dalších

článcích pro biologické látky.

– Pracovní skupina Monoklonální protilátky pracuje v rámci

pilotní fáze projektu na infliximabu s cílem přinést informace

pro potenciální vypracování řady obecných metodik,

které by mohly být uplatněny na široký rozsah monoklonálních

protilátek. Racionalizace metod by měla

přispět k lepší standardizaci rozličných produktů/přípravků,

které jsou v současné době na trhu nebo ve vývoji.

Volbou koncentrovat se na jednu monoklonální protilátku,

infliximab, chce Evropská lékopisná komise vyzkoušet

robustnost takového přístupu.

Na závěr, moje role předsedy je rozmanitá a provokativní,

ale nesmírně zajímavá a přinášející uspokojení, a já bych

chtěl poděkovat všem členům Evropské lékopisné komise

za jejich důvěru a podporu, které nám umožnily udělat velký

pokrok v celé řadě témat. Chtěl bych poděkovat ředitelce

EDQM dr. Susanne Keitel, svým dvěma místopředsedům

dr. Tobiasi Gosdschanovi a panu Eriku Wolthersovi,

tajemnici Evropské lékopisné komise paní Cathie Vielle

a jejím dvěma zástupcům dr. Emmanuelle Charton a dr.

Ulrichu Rosemu (i jeho předchůdci dr. Michaelu Wiererovi)

za jejich vynikající práci a podporu během mého předsednictví.

Jako člen pracovní skupiny CHMP EMA

a vedoucí QWP EMA jsem zároveň v jedinečné pozici rozpoznat,

jak mnoho přispívají aktivity Evropského lékopisu

k zajištění jakosti léčiv ve prospěch pacientů.

Evropská lékopisná komise existuje pouze díky obětavosti

a úsilí jednotlivých zúčastněných expertů a podpoře zaměstnanců

EDQM a já bych jim chtěl za jejich těžkou práci

poděkovat. Evropský lékopis má nyní 2329 článků a 358

obecných statí a zůstává referenčním bodem v Evropě i ve

světě a má silnou pozici jít vpřed do budoucnosti.

Dr. Jean-Louis Robert,

předseda Evropské lékopisné komise

březen 2016

38 ČL 2017 – Dopl. 2020

II ÚVOD K 10. VYDÁNÍ EVROPSKÉHO LÉKOPISU


Příprava Evropského lékopisu probíhá pod záštitou Rady

Evropy v souladu s Úmluvou o vypracování Evropského

lékopisu (European Treaty Series No. 50, dále jen Úmluva),

jak je upraveno v Protokolu o Úmluvě (European Treaty

Series No. 134, dále jen Protokol), podepsaném vládami

38 členských zemí (Belgie, Bosny a Hercegoviny, Bulharska,

Černé Hory, České republiky, Dánska, Estonska, Finska,

Francie, Chorvatska, Islandu, Irska, Itálie, Kypru, Lotyšska,

Litvy, Lucemburska, Maďarska, Malty, Moldavské

republiky, Německa, Nizozemska, Norska, Polska, Portugalska,

Rakouska, Rumunska, Řecka, Severní Makedonie,

Slovenské republiky, Slovinska, Spojeného království Velké

Británie a Severního Irska, Srbska, Španělska, Švédska,

Švýcarska, Turecka a Ukrajiny) a Evropské unie.

Za přípravu Evropského lékopisu zodpovídá Evropská lékopisná

komise (dále jen Komise), jmenovaná v souladu

s článkem 5 výše zmíněné Úmluvy. Komisi tvoří delegace

jmenované smluvními stranami. Každá delegace má nejvýše

tři členy, vybrané podle jejich schopností podílet na řešení

úkolů, které spadají do působnosti Komise.

Pozorovatelé ze států, které nejsou členy Komise, a z mezinárodních

organizací jsou zváni na zasedání Komise ve

shodě s jejím Organizačním a jednacím řádem. Pozorovatelé

jsou v současné době z Albánie, Alžírska, Argentiny,

Arménie, Austrálie, Ázerbájdžánu, Běloruska, Brazílie,

Číny, Gruzie, Guiney, Indie, Izraele, Japonska, Jihoafrické

republiky, Kanady, Kazachstánu, Korejské republiky,

Madagaskaru, Malajsie, Maroka, Ruské federace, Senegalu,

Singapuru, Syrské arabské republiky, Spojených států amerických,

Tchajwanského úřadu pro kontrolu potravin a léků

(TFDA), Tuniska, Uzbekistánu a Světové zdravotnické

organizace (WHO).

Úmluva je otevřená pro podpisy evropských zemí a status

pozorovatele slouží evropským zemím, které se chtějí stát

řádnými členy, k seznámení se s pracovními metodami

Komise. Komise uznává, že vztahy se zeměmi mimo Evropu

jsou z pohledu globalizace dodavatelských řetězců farmaceutických

látek a přípravků nezbytné. Pozorovatelský

status pro neevropské státy pomáhá tyto vztahy podporovat

usnadněním regulační spolupráce a výměnou informací

a pracovních dokumentů, stejně jako účastí na vědecké práci

Komise.

Desáté vydání Evropského lékopisu obsahuje téměř 3000

článků a obecných statí. To by nebylo možné bez přispění

a úsilí sítě více než 700 expertů různých farmaceutických

vědních disciplín z celého světa. Účast expertů a dalších zainteresovaných

subjektů na procesu vypracovávání Evropských

lékopisných norem je klíčová pro vývoj spolehlivých

a aktuálních článků.

Funkce Komise ustavené článkem 6 Úmluvy a podrobněji

doplněné v Protokolu jsou:

Článek 6

„Podle článku 4 Úmluvy funkcemi komise jsou:

(a) určování základních principů, na jejichž základě se vypracovává

Evropský lékopis;

(b) rozhodování o metodách analýzy vhodných pro tento

účel;

(c) vytváření podmínek pro přípravu lékopisných článků

a rozhodování, které z nich budou začleněné do Evropského

lékopisu;

(d) doporučování termínů, ve kterých budou rozhodnutí

technického charakteru vztahující se k Evropskému lékopisu,

zavedena na území smluvních stran“. Evropský

direktorát pro jakost léčiv & péči o zdraví (European

Directorate for the Quality of Medicines & Health Care,

EDQM) Rady Evropy podporuje Komisi ve vypracování

a revidování textů Evropského lékopisu prostřednictvím

vědeckého sekretariátu. Rovněž zodpovídá za zavádění,

výrobu, monitorování a distribuci referenčních

standardů potřebných pro lékopisné články. EDQM je

aktivní také v řadě jiných oblastí vztahujících se

k ochraně veřejného zdraví, např. certifikace jakosti léčivých

farmaceutických látek ze specifických zdrojů

a biologická standardizace.

Ve shodě s požadavky Úmluvy se smluvní strany zavazují

podniknout nezbytná opatření k zajištění toho, aby se články

Evropského lékopisu staly oficiálními normami používanými

na jejich vlastním území.

CÍL EVROPSKÉHO LÉKOPISU

Cílem Evropského lékopisu je podporovat veřejné zdraví

poskytnutím uznávaných obecných norem pro jakost léčiv

a jejich složek. Takové normy mají být základem bezpečného

používání léčiv nemocnými. Navíc existence těchto

norem usnadňuje volný pohyb léčivých přípravků v Evropě

i mimo ni.

Články a jiné texty Evropského lékopisu jsou určené pro

potřeby:

– regulačních autorit;

– těch, kteří se zabývají kontrolou jakosti léčivých přípravků

a jejich složek;

– výrobců léčivých přípravků a jejich jednotlivých složek.

Globalizace přináší nové výzvy z hlediska jakosti léčivých

látek a léčivých přípravků. Reakcí na tyto výzvy je rozšíření

působení Evropského lékopisu na mezinárodní úroveň

a úzká spolupráce se všemi zúčastněnými stranami na vytváření

norem jakosti vhodných pro léčivé přípravky vyvinuté

ve stále globálnějším světě.

SÍDLO EVROPSKÉ LÉKOPISNÉ KOMISE

Evropská lékopisná komise pořádá svá zasedání ve Štrasburku,

který je sídlem Rady Evropy.

OBECNÉ PRINCIPY

Obecná pravidla pro výklad lékopisných textů jsou dána

v části Všeobecné zásady. Současně je třeba vzít na vědomí

následující informace.

Obecné principy použité při přípravě lékopisných textů jsou

uvedeny v pokynech (Rules of procedure, Guide for work,

Code of practice) a v Technických pokynech volně přístupných

na internetových stránkách EDQM. Tyto principy se

Úvod

k 10. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 39


pravidelně revidují, obvykle bez zpětného uplatnění, takže

dříve uveřejněné články nemusí vždy vyhovovat posledním

doporučením. Kdekoliv by tento nesoulad měl dopad na veřejné

zdraví, články se revidují ihned.

Je známo, že obecné statě se používají také nezávisle na lékopisných

článcích; v těchto případech se uživatelům doporučuje

řídit se technickými pokyny, které poskytují rozsáhlé

informace o použití mnoha těchto metod.

Obecné a jednotlivé články (monografie). Normy Evropského

lékopisu jsou uvedeny formou obecných a jednotlivých

článků. Obecné články zajišťují normy, které co nejlépe

splňují výše stanovené cíle a vycházejí vstříc potřebám

uživatelů. Je obvykle nezbytné použít jeden nebo více

obecných článků společně s jednotlivým článkem. Pokud je

látka nebo léčivý přípravek předmětem ustanovení jak

obecného článku, tak i jednotlivého článku, články se vzájemně

doplňují. Jednotlivý článek může mimořádně obsahovat

výjimku z jednoho nebo více ustanovení obecného

článku.

Protože z praktických důvodů není možné zahrnout do každého

jednotlivého článku odkaz na vhodný nebo potenciálně

vhodný obecný článek, tyto odkazy se neuvádí s výjimkou

případů, kdy je nutné se vyhnout nejasnostem. Pro

usnadnění uživatelům identifikovat ty obecné články, které

jsou pro použití v jednotlivém článku potřebné, je v každém

novém vydání lékopisu a v každém doplňku uveden seznam

obecných článků.

Použití zvířat. Ve shodě s evropskou Úmluvou o ochraně

obratlovců používaných pro pokusné a jiné vědecké účely

[European Convention for the Protection of Vertebrate

Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes

(CETS No. 123)], připravené pod záštitou Rady Evropy,

se Komise zavázala, že omezí používání zvířat při lékopisných

zkouškách, kdekoliv je to možné, a podpoří zainteresované

subjekty ve vyhledávání alternativních postupů.

Zkoušení na zvířatech je do článků zařazeno pouze tehdy,

jestliže bylo jasně prokázáno, že je to naprosto nezbytné

k dosažení dostatečné kontroly pro lékopisné účely a neexistuje

žádná jiná alternativa..

Hydráty. Pokud článek odkazuje na hydratovanou formu,

ať už dobře definovanou nebo ne, uvádí se odpovídající

stupeň hydratace (mono-, di-, tri-, n-hydrát nebo jen hydrát)

v názvu článku, chemickém vzorci a v chemickém názvu.

U nehydratované formy není v názvu uvedeno „bezvodý“,

pokud to není zdůvodněno. Pokud se článek týká obou forem

(nehydratovaná forma i hydrát), do názvu článku ani

chemického názvu se to neuvádí, ale v chemickém názvu je

uvedeno „nH2O“.

Chirální látky. Články na chirální látky popisující určitý

enantiomer, obsahují i zkoušku potvrzující enantiomerní

čistotu, obvykle pomocí chirální kapalinové chromatografie.

Zkouška na racemický charakter využívající optickou

otáčivost se zařazuje pouze tehdy, existuje-li informace

o specifické optické otáčivosti enantiomerů, což ukazuje, že

taková zkouška by měla být vzhledem k enantiomerní čistotě

rozlišující. Pokud se mohou k zamýšlenému účelu použít

jiné metody, jako je chirální kapalinová chromatografie,

uvádějí se místo optické otáčivosti.

Polymorfie. Vykazuje-li látka polymorfii, obvykle se to

uvádí v části Vlastnosti. Obecně se v článcích nevyžaduje

žádná konkrétní krystalická forma; v ojedinělých případech,

kdy se článek týká určité krystalické formy, je předepsána

např. zkouška totožnosti infračervenou absorpční spektrofotometrií.

V těchto případech se zaznamená spektrum látky

v pevném stavu bez překrystalizování a předepsaná chemická

referenční látka (CRL) je v požadované krystalické

formě. Navíc vedle těchto výjimečných případů, v závislosti

na funkci dané látky v léčivém přípravku, může být pro

výrobce nezbytné zajistit použití určité krystalické formy.

Informace uvedená v části Vlastnosti je míněna jako upozornění

pro uživatele na nutnost vyhodnotit toto hledisko

během vývoje léčivého přípravku. V úvahu by se měl také

brát obecný článek Corpora ad usum pharmaceuticum

(2034) a obecná stať 5.9 Polymorfie.

Nečistoty. Obecný článek Corpora ad usum pharmaceuticum

(2034) společně s obecnou statí 5.10. Kontrola nečistot

v látkách pro farmaceutické použití popisují přístup ke

kontrole nečistot v jednotlivých článcích včetně vysvětlení,

jak chápat limity u zkoušky na Příbuzné látky.

Podle současné obecné politiky Komise, týkající se látek

pro farmaceutické použití, se do článků zařazují kvantitativní

zkoušky na nečistoty. Většina starších článků vypracovaných

před uplatňováním této politiky byla revidována

zavedením kvantitativních metod. Tam, kde článek nevyhovuje

obecným přístupům, je třeba doplnit požadavky

v jednotlivém článku, aby byly v souladu s obecným článkem

Corpora ad usum pharmaceuticum (2034), použitím

rozhodovacího diagramu v obecné stati 5.10.

Články léčivých přípravků obsahujících chemicky definované

léčivé látky uvádějí limity pro degradační produkty

vzniklé během výroby a skladování léčivého přípravku,

včetně syntetických nečistot, které jsou také degradačními

produkty. Za tímto účelem jsou v článcích zevedeny kvantitativní

zkoušky.

Elementární nečistoty. Strategie pro kontrolu elementárních

nečistot byla sladěna s pokynem Q3D Mezinárodní rady

pro harmonizaci technických požadavků pro humánní

léčivé přípravky (ICH) a základní principy tohoto pokynu

jsou uvedeny v obecné stati 5.20 Elementární nečistoty. Požadavky

na kontrolu elementárních nečistot, která je silně

založena na řízení rizik, jsou uvedeny v obecných článcích

Praeparata pharmaceutica (2619) a Corpora ad usum

pharmaceuticum (2034), zatímco existující zkoušky na

elementární nečistoty byly z jednotlivých článků vypuštěny

(např. 2.4.8 Těžké kovy).

Zbytková rozpouštědla. Požadavky na zbytková rozpouštědla

jsou uvedeny v obecném článku Corpora ad usum

pharmaceuticum (2034) a v obecné stati 5.4 Zbytková rozpouštědla.

Proto jsou všechny léčivé a pomocné látky předmětem

příslušné zkoušky na zbytková rozpouštědla, i když

v jednotlivém článku není žádná specifická zkouška uvedena.

Tyto požadavky byly uvedeny do souladu s pokynem

ICH Q3C.

Bakteriální endotoxiny. V červnu 2014 Komise schválila

novou politiku týkající se bakteriálních endotoxinů v látkách

pro farmaceutické použití. Obecný článek Corpora

ad usum pharmaceuticum (2034) uvádí, že látka musí

40 ČL 2017 – Dopl. 2020


vyhovovat zkoušce na bakteriální endotoxiny (BET), pokud

je označena jako „prostá bakteriálních endotoxinů“, nebo

pokud je určena pro výrobu parenterálních přípravků nebo

přípravků pro výplach bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího

bakteriální endotoxiny. Článek odkazuje na

obecné statě 2.6.14 Bakteriální endotoxiny a 5.1.10 Pokyny

pro použití zkoušky na bakteriální endotoxiny. Podle obecného

článku Parenteralia (0520), musí farmaceutické přípravky

pro parenterální podání vyhovovat zkoušce na bakteriální

endotoxiny.

Články pro látky pro farmaceutické použití vypracované po

zavedení této politiky nepředepisují zkoušku na bakteriální

endotoxiny, tento aspekt je zohledněn požadavky obecného

článku Corpora ad usum pharmaceuticum (2034). Výjimkou

z tohoto pravidla je zachování zkoušky v nových článcích,

např. pokud se musí použít specifická příprava vzorku

nebo specifická metoda. V takových případech není stanoven

žádný limit. U všech článků pro látky pro farmaceutické

použití publikovaných před zavedením nové politiky, je

zkouška na bakteriální endotoxiny zachována; v těchto

článcích zůstávají stávající limity, aby se použití těchto

dobře zavedených limitů zachovalo.

Vybavení, zkoumadla. Jako pomoc uživatelům jsou prostřednictvím

databáze znalostí (Knowledge database, viz

dále) dostupné informace o chromatografických kolonách,

které byly shledány vyhovujícími při vývoji článků i obecných

metod. Informace o jiném vybavení a zkoumadlech

jsou také uvedeny, pokud se to považuje za užitečné. Tyto

informace jsou uvedeny jako doporučení a neznamená to,

že jiné kolony, zařízení nebo zkoumadla, než která jsou

uvedena, nejsou vhodná.

Homeopatické přípravky. V samostatné části lékopisu

jsou uvedeny články týkající se metod přípravy homeopatických

základních látek a homeopatických potenciací,

obecné články homeopatických přípravků, matečných tinktur

pro homeopatické přípravky, rostlinných drog pro homeopatické

přípravky a jednotlivých článků pro výchozí

látky a homeopatické základní látky používané v homeopatických

přípravcích. Pokud se pro homeopatické přípravky

použije stejná látka jako pro ostatní přípravky, platí článek

uvedený v hlavní části lékopisu.

Rostlinné drogy a přípravky z rostlinných drog (včetně

drog tradiční čínské medicíny). Všechny příslušné články

jsou uvedeny v samostatné části Evropského lékopisu.

Chráněné druhy. Články, zejména na rostlinné drogy, se

mohou týkat materiálu získaného z chráněných druhů. Začleněním

těchto článků nejsou dotčena opatření na ochranu

těchto druhů národním nebo mezinárodním právem.

Patenty. Popisy subjektů uvedených v lékopisu, které jsou

předmětem patentové ochrany, neudělují práva na používání

těchto patentů jinou osobou nebo jinými osobami než

vlastníky dotyčných patentů.

ČLÁNKY PRO FARMACEUTICKÉ PŘÍPRAVKY

Obecný článek Praeparata pharmaceutica (2619) je referenčním

zdrojem norem lékopisu pro léčivé látky, pomocné

látky a lékové formy, které se používají při výrobě/přípravě

farmaceutických přípravků; není však zamýšlen jako návod

na jejich přípravu, protože existují specifické postupy zahrnující

metody výroby a s nimi spojené kontroly.

Harmonizace a standardizace farmaceutických přípravků se

řeší prostřednictvím návrhů obecných článků lékových forem

určujících pravidla společná pro všechny přípravky,

kterých se článek týká a vývojem standardních zkušebních

metod pro léčivé přípravky. Zařazení těchto obecných článků

a metod do lékopisu poskytuje oprávněným autoritám

a výrobcům obecný základ pro přípravu a posuzování žádostí

o registraci. Kromě toho, po úspěšné pilotní fázi, jsou

nyní běžně vypracovávány jednotlivé články léčivých přípravků

obsahujících chemicky definované léčivé látky.

Jako standardy pro stanovení obsahu v těchto přípravcích se

mohou použít referenční standardy pro stanovení obsahu

léčivých a pomocných látek, za dodržení podmínek uvedených

v obecné stati 5.12 Referenční standardy.

PRACOVNÍ PROGRAM

Pracovní program (vypracování nových článků nebo obecných

statí nebo revize stávajících textů) se rozhoduje na

Komisi při jednom ze tří zasedání v průběhu roku. Obecně,

kdykoliv vyjádří dva členské státy přání vypracovat článek,

zařadí Komise tento požadavek do pracovního programu.

Změny v pracovním programu se uvádějí na internetových

stránkách EDQM a ve Pharmeuropě. Informace jsou také

poskytovány asociacím výrobců zaregistrovaným u Sekretariátu

a styčným kontaktům spolupracujících výrobců

a v databázi znalostí EDQM (Knowledge database) (včetně

důvodů revize). Sekretariát vyzývá zúčastněné strany, aby

se na něj obracely s jakýmkoliv přáním spolupracovat.

PROCES CERTIFIKACE

Proces certifikace shody s lékopisnými články umožňuje

výrobcům prokázat, že jakost jejich látky je vhodně kontrolována

odpovídajícími články [viz Public Health Committee

(Partial Agreement) Resolution AP – CSP (07) 1 nebo

následující revize dostupná v EDQM a na jeho internetových

stránkách] a pomáhá při použití lékopisných článků

v žádostech o registrace, doplněné o další zkoušky připojené

k certifikátu, kde je to vhodné. Certifikace se také používá

na rostlinné drogy, přípravky z rostlinných drog a látky

představující riziko přenosu spongiformní encefalopatie

(TSE). Certifikáty shody vydává EDQM pouze pro látky

vyráběné ve vhodném systému jakosti. Certifikáty se vydávají

vzhledem k publikovaným článkům. Podrobnosti

o průběhu certifikace lze získat od sekretariátu Komise a na

internetových stránkách EDQM. Denně aktualizovaný přehled

vydaných, zrušených a pozastavených certifikátů je

dostupný online na internetových stránkách EDQM.

PUBLIKACE

Oficiální Evropský lékopis lze získat v anglické (The European

Pharmacopoeia) nebo francouzské (Pharmacopée Européenne)

verzi. Každý rok se vydávají tři doplňky.

Zezávaznění. Datum zezávaznění lékopisných článků se

stanoví Rezolucí Výboru pro farmaceutika a farmaceutickou

péči [Resolution of the European Committee on

Pharmaceuticals and Pharmaceutical Care (Partial

Agreement)] Rady Evropy na základě doporučení Komise.

Toto datum je obvykle jeden rok po přijetí a asi šest měsíců

od uveřejnění. Pokud se musí nějaký článek zezávaznit dří-

Úvod

k 10. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 41


ve, než je datum příštího vydání lékopisu nebo jeho doplňku,

vydá Výbor pro farmaceutika a farmaceutickou péči rezoluci

obsahující úplný zezávazněný text. Text se též uveřejní

pro informaci ve Pharmeuropě a uvede se na internetových

stránkách EDQM, jako součást Rezoluce. V českém

překladu je takto zezávazněný text uveden v plném znění na

internetových stránkách SÚKL.

Pharmeuropa, Fórum Evropského lékopisu (the European

Pharmacopoeia Forum). Texty se zveřejňují čtyřikrát ročně

(s lhůtou pro připomínky) jako pomoc pro vypracování

článků a jako prostředek pro informování o lékopisných

a k lékopisu se vztahujících záležitostech. Je tedy velice důležité,

že výrobci a uživatelé látek poskytují zpětnou vazbu

k návrhům článků (draftům). Pharmeuropa Bio & Scientific

Notes, publikace registrovaná bibliografickými službami,

zahrnuje vědecké práce spojené s ustavením biologických

referenčních přípravků a validací biologických metod

v rámci Biologického standardizačního programu EDQM,

a různé aspeky farmaceutické analýzy a dalších oborů vztahujících

se k lékopisu. Pharmeuropa i Pharmeuropa Bio

jsou dostupné pouze online jako bezplatné publikace.

Databáze znalostí (Knowledge database). Internetové

stránky EDQM umožňují přístup k databázi obsahující různé

informace, které se vztahují k článkům a k dalším textům

a jsou určené k usnadnění jejich správného použití.

Jedná se o tyto informace:

– stav článků (např. zda se článek připravuje nebo reviduje,

společně s krátkým popisem, pokud je to považováno za

vhodné);

– typické chromatogramy (nebo jiná počáteční data) získané

pro určité chromatografické separace a názvy chromatografických

kolon použitých při vývoji článků;

– dodavatele zkoumadel a vybavení, které může být pro některé

uživatele obtížné vyhledat;

– revize článků na základě vývoje, počínaje pátým vydáním;

– stav harmonizace;

– ostatní potřebné informace.

Archiv (online). Archiv Evropského lékopisu obsahuje kopie

prvního až devátého vydání v PDF formátu. Je dostupný

pro všechny uživatele Evropského lékopisu s aktuálním

předplatným a registrovaným EPID kódem.

Internetové stránky. Informace o činnosti a mnoha dalších

aspektech Evropského lékopisu jsou k dispozici na internetových

stránkách EDQM (www.edqm.eu).

HelpDesk. Uživatelé posílají EDQM mnoho technických

a jiných otázek. Ty by se měly předkládat prostřednictvím

HelpDesk na internetových stránkách EDQM. EDQM bude

řešit dotazy, které se vztahují k použití článků a dalších textů

Evropského lékopisu. HelpDesk má sekci často pokládaných

dotazů, kterou by měl uživatel před položením své

otázky prostudovat.

Program revize. Návrhy na revizi textu mohou předkládat

Komisi delegace, předseda Komise nebo předsedové skupin

expertů a pracovních skupin. Požadavky na revize by se

měly předkládat prostřednictvím národních lékopisných autorit

členských států nebo, pokud to není možné, přímo

EDQM prostřednictvím služby HelpDesk. Návrhy na revizi

článků se musí doložit dostatečnými údaji, které potřebu

revize opravňují. Články a jiné texty Evropského lékopisu

jsou revidovány následně po rozhodnutí Komise. Návrhy

revidovaných textů se uveřejňují ve Pharmeuropě.

COMBISTATS

Určité zkoušky v článcích, zejména biologická stanovení,

vyžadují statistickou analýzu výsledků. EDQM vyvinul počítačový

program CombiStats, který se může použít ke statistické

analýze biologických ředění pro stanovení obsahu.

Informace o tomto programu, podmínkách přístupu a jeho

použití jsou uvedeny na internetových stránkách EDQM.

MEZINÁRODNÍ HARMONIZACE

Ve stále globalizovanějším světě se potřeba globálních norem

jakosti stala stále naléhavější. Normy jsou rozhodujícím

nástrojem pro registraci, dozor nad trhem, volný pohyb

a obchod s léčivy mezi oblastmi a zeměmi. Kromě jiných

harmonizačních iniciativ se Evropský lékopis zapojuje do

procesu harmonizace s Japonským lékopisem a s Lékopisem

Spojených států amerických v rámci neformální struktury,

která se označuje jako Lékopisná diskusní skupina

[Pharmacopoeial Discussion Group (PDG)].

Kde se provádí harmonizace obecných statí, je jejím cílem

dosažení zaměnitelných metod nebo požadavků, aby prokázání

shody s obecnou statí jednoho ze tří lékopisů znamenalo,

že stejný výsledek se získá za použití obecné stati kteréhokoliv

z dalších lékopisů. Mezinárodní rada pro harmonizaci

technických požadavků pro humánní léčivé přípravky

(ICH) vydala tematické přílohy s informacemi o omezeném

počtu těchto textů za účelem usnadnění jejich zezávaznění

s cílem pomoci regulačním autoritám a dalším uživatelům

uznávat zaměnitelnost vybraných harmonizovaných obecných

statí. Více informací je k dispozici na internetových

stránkách ICH (ich.org).

Kde je harmonizace článků provedena, je cílem dosáhnout

stejných požadavků pro všechny vlastnosti produktu. Informace

o všech neharmonizovaných částech a požadavcích

jednotlivých lékopisů jsou zahrnuty do příslušných obecných

statí a článků Evropského lékopisu.

42 ČL 2017 – Dopl. 2020



Příprava Evropského lékopisu probíhá pod záštitou Rady

Evropy v souladu s požadavky Úmluvy o vypracování Evropského

lékopisu (European Treaty Series No. 50, dále jen

Úmluva), jak je upraveno v Protokolu o Úmluvě (European

Treaty Series No. 134, dále jen Protokol), podepsaném vládami

37 členských zemí (Belgie, Bosny-Hercegoviny, Bulharska,

„Bývalé jugoslávské republiky Makedonie“, Černé

Hory, České republiky, Dánska, Estonska, Finska, Francie,

Chorvatska, Islandu, Irska, Itálie, Kypru, Lotyšska, Litvy,

Lucemburska, Maďarska, Malty, Německa, Nizozemska,

Norska, Polska, Portugalska, Rakouska, Rumunska, Řecka,

Slovenské republiky, Slovinska, Spojeného království Velké

Británie a Severního Irska, Srbska, Španělska, Švédska,

Švýcarska, Turecka a Ukrajiny) a Evropské unie.

Za přípravu Evropského lékopisu zodpovídá Evropská lékopisná

komise (dále jen Komise), jmenovaná v souladu

s článkem 5 výše zmíněné Úmluvy. Komisi tvoří delegace

jmenované smluvními stranami. Každá delegace má nejvýše

tři členy vybrané podle jejich schopností podílet na řešení

úkolů, které spadají do působnosti Komise.

Pozorovatelé ze států, které nejsou členy Komise, a z mezinárodních

organizací jsou zváni na zasedání Komise ve

shodě s jejím Organizačním a jednacím řádem. Pozorovatelé

jsou v současné době z Albánie, Alžírska, Argentiny,

Arménie, Austrálie, Azerbájdžánské republiky, Běloruska,

Brazílie, Kanady, Číny, Gruzie, Guinejské republiky, Izraele,

Jihoafrické republiky, Kazachstánu, Korejské republiky,

Madagaskaru, Malajsie, Moldávie, Maroka, Ruské federace,

Senegalu, Singapurské republiky, Sýrie, Tuniska, Spojených

států amerických, Taiwanského úřady pro potraviny

a léky (TFDA) a Světové zdravotnické organizace (WHO).

Úmluva je otevřená pro podpisy evropských zemí a status

pozorovatele slouží evropským zemím, které se chtějí stát

řádnými členy, k seznámení se s pracovními metodami

Komise. Komise uznává, že vztahy se zeměmi mimo Evropu

jsou z pohledu globalizace dodavatelských řetězců farmaceutických

látek a přípravků nezbytné. Pozorovatelský

status pro neevropské státy pomáhá tyto vztahy podporovat

usnadněním regulační spolupráce a výměnou informací

a pracovních dokumentů, stejně jako účastí na vědecké práci

Komise.

Deváté vydání Evropského lékopisu obsahuje téměř 3 000

článků a obecných textů. To by nebylo možné bez přispění

a úsilí sítě více než 700 expertů různých farmaceutických

vědních disciplín členských a pozorovatelských států Komise.

Účast expertů a dalších zainteresovaných subjektů na

procesu vypracovávání Evropských lékopisných standardů

je klíčová pro vývoj spolehlivých a aktuálních článků.

Ve snaze vzít v úvahu dramatické změny, kterými v posledních

50 letech prochází okolní prostředí a které vedou

k vytvoření opravdu globalizovaného farmaceutického světa,

revidovala Komise své pracovní postupy tak, aby umožnila

nominaci expertů z neevropských členských a pozorovatelských

států. Toto rozhodnutí přijaté na 153. zasedání

Komise (listopad 2015) je součástí promyšlené politiky začlenit

do práce na Evropském lékopisu další výrobce a jiné

zainteresované subjekty mimo Evropu. Experti z celého

světa, ať už jsou z regulačních/oprávněných autorit, průmyslu

nebo akademické sféry, budou schopni se podílet na

přípravě Evropského lékopisu.

Funkce Komise stanovené článkem 6 Úmluvy a podrobněji

doplněné v Protokolu jsou:

Článek 6

„Podle článku 4 Úmluvy mají být funkcemi komise:

(a) určování základních principů, na jejichž základě se vypracovává

Evropský lékopis;

(b) rozhodování o metodách analýzy vhodných pro daný

účel;

(c) vytváření podmínek pro přípravu lékopisných článků

a rozhodování, které z nich budou začleněné do Evropského

lékopisu;

(d) doporučování termínů, ve kterých budou rozhodnutí

technického charakteru vztahující se k Evropskému

lékopisu zavedena na území smluvních stran.“

Evropský direktorát pro jakost léčiv & péči o zdraví (European

Directorate for the Quality of Medicines & Health Care,

EDQM) Rady Evropy podporuje Komisi ve vypracování

a revidování textů Evropského lékopisu prostřednictvím

vědeckého sekretariátu. Rovněž zodpovídá za zavádění, výrobu,

monitorování a distribuci referenčních standardů potřebných

pro lékopisné články. EDQM je aktivní také v řadě

jiných oblastí vztahujících se k ochraně veřejného zdraví,

např. certifikace jakosti léčivých farmaceutických látek

ze specifických zdrojů a biologická standardizace.

Ve shodě s požadavky Úmluvy se smluvní strany zavazují

podniknout nezbytná opatření k zajištění toho, aby se články

Evropského lékopisu staly oficiálními normami používanými

na jejich vlastním území.

CÍL EVROPSKÉHO LÉKOPISU

Cílem Evropského lékopisu je podporovat veřejné zdraví

poskytnutím uznávaných obecných norem pro jakost léčiv

a jejich složek. Takové normy mají být základem bezpečného

používání léčiv nemocnými. Navíc existence těchto

norem usnadňuje volný pohyb léčivých přípravků v Evropě

a mimo ni.

Články a jiné texty Evropského lékopisu jsou určené pro

potřeby:

– oprávněných autorit;

– těch, kteří se zabývají kontrolou jakosti léčivých přípravků

a jejich složek;

– výrobců léčivých přípravků a jejich jednotlivých složek.

Evropský lékopis se v mezinárodním měřítku široce využívá.

Jelikož globalizace a rozšíření mezinárodního obchodu

představují rostoucí potřebu rozvoje norem pro jakost léčivých

látek a přípravků, spolupracuje Komise úzce se všemi

uživateli lékopisu v celosvětovém měřítku.

SÍDLO EVROPSKÉ LÉKOPISNÉ KOMISE

Evropská lékopisná komise sídlí ve Štrasburku, stejně jako

její nadřízená organizace Rada Evropy.

Úvod

k 9. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 43


OBECNÉ PRINCIPY

Obecná pravidla pro výklad lékopisných textů jsou dána

v části Obecné zásady. Vedle toho je třeba vzít na vědomí

také následující informace.

Obecné principy pro přípravu lékopisných článků jsou uvedeny

v Technických pokynech dostupných na internetových

stránkách EDQM. Použité principy se čas od času revidují

bez úplného zpětného uplatnění, takže články již uveřejněné

se nemusí vždy řídit posledními doporučeními, ale kdekoliv

se vyskytne problém s dopadem na veřejné zdraví,

články se ihned revidují.

Je zjištěno, že obecné statě se používají i jinde než v lékopisných

článcích. Za těchto okolností se uživatelům doporučuje

řídit se Technickými pokyny, které poskytují rozsáhlé

informace o použití mnoha z těchto metod.

Obecné a speciální články. Standardy Evropského lékopisu

jsou představovány obecnými a speciálními články. Používání

obecných článků se v posledních letech vyvíjelo, aby

se zajistily standardy, které nejlépe splňují výše stanovené

cíle a vycházejí vstříc potřebám uživatelů. Od čtvrtého vydání

se rozsah obecných článků rozšířil, pokud není uvedeno

jinak, aby zahrnul i produkty, pro které neexistují speciální

články. Nyní je obvykle nezbytné použít jeden nebo více

obecných článků společně se speciálním článkem. Tam,

kde je látka předmětem ustanovení jak obecného článků,

tak i speciálního článku, se oba články vzájemně doplňují.

Speciální článek může mimořádně obsahovat výjimku

z jednoho nebo více ustanovení obecného článku.

Protože není prakticky možné zahrnout do každého speciálního

článku odkaz na vhodný nebo potenciálně vhodný obecný

článek, nepokračuje se v odkazování s výjimkou případů,

kdy je nutné se vyhnout nejasnostem. V každém novém vydání

Evropského lékopisu a v každém doplňku se uvádí Seznam

obecných článků, aby uživatelé mohli určit články, které

jsou pro použití ve speciálním článku potřebné.

Použití zvířat. Ve shodě s evropskou Úmluvou o ochraně

obratlovců používaných pro pokusné a jiné vědecké účely

(European Convention on the Protection of Animals Used

for Experimental and Other Scientific Purposes – Sborník

mezinárodních smluv č. 123 – European Treaty Series

No. 123), připravené pod záštitou Rady Evropy, se Komise

zavázala, že omezí používání laboratorních zvířat při lékopisných

zkouškách, kdekoliv je to možné, a podpoří ty, kteří

jsou napojeni na její činnost, ve vyhledávání alternativních

postupů. Zkoušení na zvířatech je do článků zařazeno

pouze tehdy, když bylo jasně prokázáno, že je to nezbytné,

aby se dosáhlo kontroly dostatečné pro lékopisné účely.

Hydráty. V roce 2014 schválila Komise novou politiku pro

hydráty (viz Stylizační pokyny dostupné na internetových

stránkách EDQM). Pokud je článek určen pro hydratovanou

formu, buď přesně definovanou, nebo ne, uvádí se odpovídající

stupeň hydratace (mono-, di-, tri-, n-hydrát nebo jen

hydrát) v názvu článku, v chemickém vzorci a v chemickém

názvu. Pokud není uvedeno jinak, neuvádí se v názvu

článku označení „bezvodý“.

Pro nové články se stupeň hydratace uvádí, kdekoliv je to

vhodné. Pro již existující články, kde ještě není uveden, bude

zavedení stupně hydratace do názvu posouzeno při nejbližší

technické revizi článku (včetně on-line publikace ve

Pharmeuropě). Mnoho existujících článků (např. pro některé

anorganické látky) obsahuje v názvu slovo „hydratovaný“.

Ty budou posouzeny případ od případu. V listopadu

2014 rozhodla Komise vypustit v devátém vydání z názvu

slovo „bezvodý“ i u některých článků, které již byly v Evropském

lékopisu publikovány. Tyto články byly ve Pharmeuropě

zveřejněny k všeobecné informaci.

Chirální látky. Články na chirální látky popisující určitý

enantiomer obsahují i zkoušku potvrzující enantiomerní čistotu,

obvykle měřením optické otáčivosti. Podle současného

přístupu se zkouška na racemický charakter využívající optickou

otáčivost nyní zařazuje pouze tehdy, existuje-li informace

o specifické optické otáčivosti enantiomerů, která

naznačuje, že taková zkouška by měla být ve smyslu enantiomerní

čistoty rozlišující. Jestliže se k danému účelu může

použít jiná metoda, jako je cirkulární dichroismus, předepíše

se tato zkouška místo zkoušky optické otáčivosti.

Polymorfie. Vykazuje-li látka polymorfii, obvykle se to

uvádí v části Vlastnosti. Obecně se v článcích nevyžaduje

žádná konkrétní krystalická forma; výjimečně se v ojedinělých

článcích určitá krystalická forma specifikuje, např.

zkouškou totožnosti infračervenou absorpční spektrofotometrií.

Vyžaduje se, aby spektrum bylo zaznamenáno za

použití látky v pevném stavu bez překrystalizování za předpokladu,

že určitá chemická referenční látka (CRL) je

v požadované krystalické formě. Avšak u látek jiných, než

jsou tyto výjimečné případy, v závislosti na použití dané

látky v nějaké lékové formě může být pro výrobce nezbytné

zajistit, aby se použila její určitá krystalická forma. Informace

uvedená v části Vlastnosti je míněna tak, aby upozornila

uživatele na potřebu hodnotit toto hledisko během vývoje

lékové formy. Obecný článek Corpora ad usum pharmaceuticum

(2034) a obecná stať 5.9 Polymorfie by se také

měly brát v úvahu.

Specifičnost stanovení obsahu. Při vypracování článků pro

chemické léčivé látky dává obecně Komise přednost provedení

kontroly nečistot (nečistot vztahujících se k výrobě

látky a k rozkladným produktům) dobře navrženou částí

Zkoušky na čistotu s metodami udávajícími stabilitu před

zařazením stanovení obsahu specifického pro účinnou látku.

Proto se navrhuje v článku celý soubor požadavků, který

zajišťuje vhodnou jakost daného produktu během celé

doby použitelnosti.

Nečistoty. Na základě přehodnocení metodiky kontroly

nečistot byla do 5. vydání zahrnuta nová obecná stať

5.10 Kontrola nečistot v látkách pro farmaceutické použití.

Ta popisuje spolu s obecným článkem Corpora ad usum

pharmaceuticum (2034) postup kontroly nečistot ve speciálních

článcích a zahrnuje vysvětlení toho, jak by se měly

chápat limity u zkoušky na Příbuzné látky.

V současné době se podle obecných zásad Komise zařazují

do článků kvantitativní zkoušky na nečistoty. Většina nejstarších

článků vypracovaných před zavedením tohoto opatření

byla revidována zavedením kvantitativních metod.

Tam, kde článek nevyhovuje tomuto obecnému ustanovení,

předpokládá se, že požadavky speciálního článku je třeba

doplnit, aby byly v souladu s obecným článkem Corpora ad

usum pharmaceuticum (2034).

44 ČL 2017 – Dopl. 2020


Nečistoty nejsou dostupné jako referenční standardy ani se

nemohou získávat pro experimentální účely s výjimkou případů,

kde se požadují pro použití v článku, v tomto případě

se za názvem nečistoty uvádí označení „CRL“.

Chromatografické kolony. Jako pomoc uživatelům je

k dispozici prostřednictvím internetových stránek EDQM

(viz také Knowledge database – Databáze znalostí uvedená

dále) informace o chromatografických kolonách, u kterých

bylo shledáno během vývoje článku a obecných metod, že

jsou vyhovující. Tam, kde se to považuje za vhodné, je také

přidána informace o jiném zařízení a o zkoumadlech. Tato

informace se podává bez záruky a neznamená to, že jiné kolony,

zařízení nebo zkoumadla než ty, které jsou specifikované,

nejsou vhodné.

Zbytková rozpouštědla. Požadavky na zbytková rozpouštědla

jsou uvedeny v obecném článku Corpora ad usum

pharmaceuticum (2034) a v obecné stati 5.4 Zbytková rozpouštědla.

Proto všechny léčivé a pomocné látky jsou předmětem

příslušné zkoušky na zbytková rozpouštědla, dokonce,

i když v jednotlivém článku není žádná specifická

zkouška uvedena. Tyto požadavky byly uvedeny v souvislosti

s pokynem ICH (International Conference on Harmonisation)

k dané problematice.

Elementární nečistoty. Limity pro rezidua kovových katalyzátorů

nebo reakčních kovových činidel, které byly definovány

s ohledem na pokyn Evropské lékové agentury (European

Medicines Agency, EMA), byly uvedeny v obecné

stati 5.20 Rezidua kovových katalyzátorů nebo reakčních

kovových činidel a nejsou právně závazné pro uživatele Evropského

lékopisu, dokud nebude na tuto stať uveden odkaz

v článcích. Odkazy na obecnou stať 2.4.8 Těžké kovy byly

z jednotlivých článků léčivých látek pro farmaceutické použití

odstraněny, s výjimkou látek určených pouze pro veterinární

použití. Po přijetí ICH Q3D pokynu Výborem pro

humánní léčivé přípravky (Committee for Medicinal Products

for Human Use, CHMP) Komise definovala strategii

přijmout ho v Evropském lékopisu a sladit ho s časovým

plánem zavedení přijatým CHMP. Komise se rozhodla revidovat

stať 5.20 tak, aby byla v souladu s pokynem ICH

Q3D. Podrobnosti k této strategii přijetí v Evropském lékopisu

jsou uvedeny na internetových stránkách EDQM.

Homeopatické přípravky. V samostatné části lékopisu

jsou uvedeny články na metody přípravy homeopatických

základních látek a homeopatických potenciací, obecné

články na homeopatické přípravky a matečné tinktury pro

homeopatické přípravky, rostlinné drogy pro homeopatické

přípravky a jednotlivé články na základní látky a homeopatické

základní látky používané v homeopatických přípravcích.

Rozumí se, že použije-li se stejná látka jak pro homeopatické,

tak pro jiné přípravky, platí článek uvedený

v hlavní části lékopisu.

Rostlinné drogy a přípravky z rostlinných drog (včetně

drog tradiční čínské medicíny). Všechny příslušné články

jsou seskupeny do samostatné části Evropského lékopisu.

Funkční charakteristiky. Na základě rozhodnutí komise

byl v článcích vytvořen zvláštní informační odstavec, aby

byla zdůrazněna potřeba věnovat pozornost funkčním charakteristikám

pomocných látek a aby byla podpořena harmonizace

metod pro jejich hodnocení. Obsahem tohoto odstavce

nejsou závazné požadavky, charakteristiky však mohou

být důležité pro dané použití pomocné látky. Charakteristiky

se mohou uvádět různými způsoby:

– pouze uvedením názvu dané charakteristiky;

– uvedením názvu a vhodné zkušební metody, přednostně

metody uvedené v Evropském lékopisu;

– uvedením názvu, vhodné zkušební metody a typických hodnot

(přípustných odchylek nebo tolerance dané hodnoty);

tyto hodnoty nebo jejich přípustné odchylky se používají

k definování vhodné jakosti pomocné látky pro dané použití.

Ve všech případech nejsou vhodné metody a kritéria přijatelnosti

uvedené jako závazné požadavky, ale jako pomocné

návody. Rozhodnutí týkající se kontroly funkčních charakteristik

pomocných látek zůstávají na farmaceutickém

výrobci a berou se jako součást znalostí formulace přípravku,

pro který se mají použít; metody stanovení, kritéria přijatelnosti

a přípustné odchylky se určují na základě smluvních

vztahů mezi dodavateli a zpracovateli pomocné látky.

Patenty. Popis výrobků, které jsou předmětem patentové

ochrany, uvedený v lékopisu neznamená v žádném případě,

že práva udělená těmito patenty se mohou volně používat

jinou osobou nebo jinými osobami než vlastníky dotyčných

patentů.

Čísla CAS (Chemical Abstract Service Registry Number).

Od šestého vydání byla do článků, kde je to vhodné, zařazena

pro informaci čísla CAS ve snaze umožnit uživateli

pohodlný přístup k užitečným informacím. Dříve se tato

čísla zveřejňovala pouze u zkoumadel pro použití při vyhledávání

dodavatelů. Čísla CAS jsou registrovanou

ochrannou známkou Americké chemické společnosti (American

Chemical Society).

Chráněné druhy. Články, zejména na rostlinné drogy, se

mohou týkat materiálu získaného z chráněných druhů. Začleněním

těchto článků nejsou dotčena opatření na ochranu

těchto druhů národním nebo mezinárodním právem.

ČLÁNKY PRO FARMACEUTICKÉ PŘÍPRAVKY

Do osmého vydání nebyly články na individuální farmaceutické

přípravky vypracovávány, s výjimkou imunosér pro

humánní použití, imunosér pro veterinární použití, některých

biologických přípravků, jako jsou insulinové přípravky,

radiofarmaceutických přípravků, vakcín pro humánní

použití a vakcín pro veterinární použití.

Do sedmého vydání byl začleněn obecný článek Praeparata

pharmaceutica (2619). Účelem tohoto článku je být referenčním

zdrojem norem lékopisu pro léčivé látky, pomocné

látky a lékové formy, které se používají při výrobě/přípravě

farmaceutických přípravků; není však zamýšlen jako návod

na jejich přípravu, protože existují specifické návody zahrnující

metody výroby a s nimi spojené kontroly.

Harmonizace a standardizace farmaceutických přípravků se

dosud řešila cestou návrhů obecných článků lékových forem

určujících pravidla společná pro všechny přípravky

v rámci předmětu článku a cestou vývoje standardních zkušebních

metod pro konečné přípravky. Zahrnutí těchto

obecných článků a metod do lékopisu poskytuje obecný základ

pro oprávněné autority a výrobce pro přípravu a posuzování

přihlášek k registraci.

Úvod

k 9. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 45


V roce 2012 se však Komise rozhodla revidovat svůj postoj

a iniciovala počáteční fázi přípravy článků pro jednotlivé

farmaceutické přípravky, aby se prozkoumala jejich další

realizovatelnost a využitelnost. První článek konečného

přípravku obsahujícího chemicky definovanou léčivou látku

Sitagliptin tablety (2927) byl Komisí přijat v březnu 2015

a byl publikován v Doplňku 8.7 Evropského lékopisu. Přijetím

tohoto článku rozhodla Komise o rozšíření rozsahu

Evropského lékopisu o články jednotlivých farmaceutických

přípravků; od té doby bylo do jejího pracovního programu

přijato mnoho takových přípravků.

Jako standardy pro stanovení obsahu v těchto přípravcích se

mohou použít referenční standardy ustanovené pro stanovení

obsahu léčivých a pomocných látek, za dodržení podmínek

uvedených v obecné stati 5.12 Referenční standardy.

PRACOVNÍ PROGRAM

Pracovní program (příprava nových článků nebo obecných

statí nebo revize stávajících textů) se rozhoduje na Komisi

při jednom ze tří zasedání v průběhu roku. Obecně, kdykoliv

vyjádří dva členské státy přání, aby se připravil článek,

zařadí Komise tento požadavek do pracovního programu.

Změny v pracovním programu se uvádějí na internetových

stránkách EDQM a ve Pharmeuropě. Informace se také

předávají asociacím výrobců registrovaným na Sekretariátu

a spolupracujícím výrobcům. Sekretariát vyzývá zúčastněné

strany, aby se na něj obracely s jakýmkoliv přáním spolupracovat.

PROCES CERTIFIKACE

Proces certifikace shody lékopisných článků z hlediska kontroly

jakosti nějakého produktu z daného zdroje [viz Public

Health Committee (Partial Agreement) Resolution AP – CSP

(07) 1 nebo následující revize dostupná v EDQM a na jeho

internetových stránkách] se vytvořil jako pomoc pro použití

lékopisných článků v žádostech o registrace. Certifikace byla

v poslední době rozšířena i na rostlinné drogy, přípravky

z rostlinných drog a na rizika přenosu spongiformní encefalopatie

(TSE). Certifikáty shody vydává EDQM pouze pro

látky vyráběné ve vhodném systému jakosti. Certifikáty se

poskytují se zřetelem na publikované články. Podrobnosti

o rozvržení tohoto schématu lze získat od sekretariátu Komise

a na internetových stránkách EDQM. Denní přehled vydaných,

zrušených a pozastavených certifikátů je také k dispozici

na internetových stránkách EDQM.

PUBLIKACE

Oficiální Evropský lékopis lze získat v anglické (The European

Pharmacopoeia) nebo francouzské (Pharmacopée

Européenne) verzi jako knihu se třemi doplňky ročně

a v elektronické formě (on-line verze, včetně verze pro tablety

a USB klíče).

Archiv. Archiv Evropského lékopisu obsahuje první až

osmé vydání v PDF formátu. Je dostupný pro všechny uživatele

Evropského lékopisu s aktuálním předplatným (papírová

podoba, on-line verze nebo USB klíč) a s registrací

EPID kódu.

Pharmeuropa, Fórum Evropského lékopisu (the European

Pharmacopoeia Forum), je časopis publikovaný čtyřikrát

ročně jako pomoc pro vypracování článků a jako prostředek

pro informaci o záležitostech lékopisných a k lékopisu se

vztahujících. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes je publikace

registrovaná bibliografickými službami. Zahrnuje vědecké

práce vztahující se k ustavení biologických referenčních

přípravků a validaci biologických metod v rámci Biologického

standardizačního programu EDQM, a různým

aspektům farmaceutické analýzy a dalších oborů vztahujících

se k lékopisu. Od roku 2012, jsou obě publikace dostupné

pouze on-line, bez poplatku, a jednotlivé návrhy

(drafty) a vědecké články jsou zveřejňovány průběžně.

Internetové stránky. Informace o činnosti a řadě dalších

aspektů Evropského lékopisu jsou k dispozici na internetových

stránkách EDQM (www.edqm.eu).

Databáze znalostí (Knowledge database). Internetové

stránky EDQM umožňují přístup k databázi obsahující různé

druhy informací, které se vztahují k článkům a jsou určené

k usnadnění jejich správného použití. Jsou to tyto informace:

– stav článků (např. zda revize postupuje, společně s krátkým

popisem, pokud je to považováno za vhodné);

– chromatografické kolony použité při vývoji článků;

– dodavatelé zkoumadel a zařízení, které může být pro některé

uživatele obtížné vyhledat;

– revize článků na základě vývoje, počínaje pátým vydáním;

– ostatní potřebné informace.

HelpDesk. Uživatelé posílají EDQM mnoho technických

a jiných dotazů. Ty by se měly předkládat prostřednictvím

HelpDesk na internetových stránkách EDQM. EDQM bude

řešit dotazy, které se vztahují k použití článků Evropského

lékopisu. HelpDesk má sekci často pokládaných dotazů,

kterou by měl uživatel před položením své otázky prostudovat.

Zezávaznění. Datum zezávaznění lékopisných článků se

stanoví Rezolucí Výboru pro farmaceutika a farmaceutickou

péči [Resolution of the Committee on Pharmaceuticals

and Pharmaceutical Care (Partial Agreement)] Rady Evropy

na základě doporučení Komise. Toto datum je obvykle

asi jeden rok po přijetí a asi šest měsíců od uveřejnění. Pokud

se má nějaký článek zezávaznit dříve, než je datum

příštího vydání lékopisu nebo jeho doplňku, vydá Výbor

pro farmaceutika a farmaceutickou péči rezoluci obsahující

úplný zezávazněný text. Text se též uveřejní pro informaci

v časopise Pharmeuropa a uvede se na internetových stránkách

EDQM, jako součást Rezoluce. V českém překladu je

takto zezávazněný text uveden v plném znění na internetových

stránkách SÚKL.

Program revize. Články a další texty Evropského lékopisu

se revidují podle potřeby na základě rozhodnutí Komise.

Návrhy revizí se uveřejňují v časopise Pharmeuropa. Návrhy

na revizi předkládají Komisi delegace, předseda Komise

nebo předsedové skupiny expertů. Požadavky na revize

jinými subjekty by se měly předkládat prostřednictvím

národních lékopisných autorit členských států nebo, tam

kde to není možné, přímo EDQM prostřednictvím služby

HelpDesk. Návrhy na revizi článků se musí doložit dostatečnými

údaji, které potřebu revize opravňují.

46 ČL 2017 – Dopl. 2020


COMBISTATS

Určité zkoušky v článcích, zejména biologická stanovení,

vyžadují statistickou analýzu výsledků. EDQM vyvinul počítačový

program CombiStats, který se může použít ke statistické

analýze biologických ředění pro stanovení obsahu.

Informace o tomto programu a podmínkách přístupu k němu

a jeho použití jsou uvedeny na internetových stránkách

EDQM.

MEZINÁRODNÍ HARMONIZACE

Globalizace a expanze současného mezinárodního obchodu

představuje rostoucí potřebu rozvoje norem pro jakost léčiv

v celosvětovém měřítku. Normy jsou rozhodujícím nástrojem

pro registraci, dozor trhu, volný pohyb a obchod s léčivy

mezi světadíly a zeměmi. Evropský lékopis se účastní

procesu harmonizace s Japonským lékopisem a Lékopisem

Spojených států amerických v rámci informační struktury

nazývané Lékopisná diskusní skupina [Pharmacopoeial

Discussion Group (PDG)]. Informace o stavu harmonizovaných

textů jsou uvedeny v obecné stati 5.8 Harmonizace

lékopisu a na internetových stránkách EDQM (stránka

PDG).

Kde se provádí harmonizace obecných statí, je jejím cílem

dosažení zaměnitelných metod nebo požadavků, aby prokázání

shody s obecnou statí jednoho ze tří lékopisů znamenalo,

že stejný výsledek se získá za použití obecné stati kteréhokoliv

z dalších lékopisů. Pokud byly oficiální deklarací

Mezinárodní rada pro harmonizaci technických požadavků

pro humánní léčivé přípravky (ICH) doporučeny zaměnitelnosti,

jsou uvedeny v obecné stati 5.8 Harmonizace lékopisu.

Zůstanou-li nějaké rozdíly v harmonizovaných obecných

statích, je o tom v této obecné stati podána informace.

Tam, kde se provádí harmonizace článků, je cílem dosáhnout

stejných požadavků pro všechny vlastnosti produktu.

Obecná stať 5.8 Harmonizace lékopisu zahrnuje informace

o každé neharmonizované části a místních požadavcích.

Kromě PDG, se Evropský lékopis také aktivně zapojuje do

řady dalších mezinárodních harmonizačních iniciativ, jako

je WHO iniciativa návrhu „Správná lékopisná praxe“

(Good Pharmacopoeial Practices), který by měl sloužit jako

základ pro budoucí sdílení prací a spolupráci mezi světovými

lékopisy.

Úvod

k 9. vydání

evropského

lékopisu

ČL 2017 – Dopl. 2020 47

III SLOŽENÍ EVROPSKÉ LÉKOPISNÉ KOMISE, SKUPIN EXPERTŮ A PRACOVNÍCH SKUPIN

III SLOŽENÍ EVROPSKÉ LÉKOPISNÉ KOMISE,

SKUPIN EXPERTŮ A PRACOVNÍCH SKUPIN

SLOŽENÍ EVROPSKÉ LÉKOPISNÉ KOMISE

Předseda:

dr. T. GOSDSCHAN

Místopředsedové: prof. T. ARVIDSSON

dr. H. KOSZEGI-SZALAI

Členové komise:

Belgie (BE):

prof. dr. J. HOOGMARTENS

dr. K. VAN LANDUYT

Bosna a Hercegovina (BA):

A. BORIC

T. PONORAC

dr. A. UZUNOVIC

Bulharsko (BG): prof. S. BOGDANOVA

dr. S. V. BRANCHEV

S. TONCHEVA

Bývala jugoslávská republika Makedonie (MK):

dr. M. DARKOVSKA SERAFIMOVSKA

prof. dr. A. DIMITROVSKA

prof. E. JANEVIK-IVANOVSKA

Černá Hora (ME):

Česká republika (CZ):

dr. H. BÍZKOVÁ

prof. L. MATYSOVÁ

dr. J. MAXA

Dánsko (DK):

Estonsko (EE):

dr. B. MOESGAARD

dr. L. OLSEN

A. UHRENHOLT VESTERGAARD

E. HOLST

S. LEITO

Evropská komise (EU):

O. GROSS

Finsko (FI):

Francie (FR):

M.-R. HELLE

dr. P. SALO

dr. T. WIKBERG

Chorvatsko (HR): G. BENKOVIC

P. JAKSIC

dr. S. TERZIC

Irsko (IE):

Island (IS):

Itálie (IT):

dr. C. CLEMENCIN

dr. R. KIESGEN DE RICHTER

M. CATIBUSIC

N. FANNING

L. WALLS

J. LENHARDSSON

dr. E. BOSSU

Kypr (CY):

Litva (LT):

Lotyšsko (LV):

dr. E. COGLIANDRO

dr. C. PINI

A. PAPHITOU

R. MOCKUTE

dr. I. BARENE

I. KALVE

Lucembursko (LU):

J. GENOUX-HAMES

Maďarsko (HU): dr. H. KÖSZEGI-SZALAI

prof. J. J. LIPTAK

Malta (MT):

Moldávie (MD):

Německo (DE):

Ch. CARABOTT CASTAGNA

A. GARUTA

M. SOLOVIOV

prof. V. VALICA

dr. D. BARTEL

prof. dr. U. HOLZGRABE

dr. J. NORWIG

Nizozemsko (NL): dr. D. DE KASTE

P. M.J.M. JONGEN

dr. Y. M.A.W. VAN KOOIJ

Norsko (NO):

Polsko (PL):

G. BRUGAARD

dr. E. LECIEJEWICZ ZIEMECKA

prof. J. PACHECKA

Portugalsko (PT): prof. J. M. CORREIA NEVES SOUSA

LOBO

dr. M. J. PORTELA

Rakousko (AT):

dr. F. LACKNER

dr. A. MAYRHOFER

G. VEIDER

Rumunsko (RO): A. CRUPARIU

Řecko (GR):

prof. M. A. KOUPPARIS

dr. A. MAKRITIS

Slovenská republika (SK):

E. MOSTENICKÁ

Slovinsko (SI):

Srbsko (RS):

Španělsko (ES):

A. OBREZA

T. TEKAVCIC GLOVER

prof. dr. U. URLEB

prof. D. AGBABA

M. MALESEVIC

S. UBAVIC

dr. C. DE LA MORENA CRIADO

prof. F. FERNANDEZ GONZALEZ

48 ČL 2017 – Dopl. 2020


Švédsko (SE):

prof. T. ARVIDSSON

dr. A. LARHED

Švýcarsko (CH): dr. L. BRUCKNER

dr. A. H. PFENNINGER

Turecko (TR):

Ukrajina (UA):

prof. dr. Y. ÇAPAN

dr. F. KOC

prof. dr. I. VURAL

dr. O. GRYZODUB

L. KONOSHEVYCH

Velká Británie (GB):

dr. S. ATKINSON

prof. A. DAVIDSON

prof. K. TAYLOR

Pozorovatelé:

Albánie (AL): A. DAUTLLAR

A. SKENDERAJ

Alžírsko (DZ): prof. A. GHARBI

Argentina (AR): dr. C. A. CHIALE

Arménie (AM): L. GHAZARYAN

Austrálie (AU): TGA Laboratories

Ázerbájdžán (ZA): H. GURBANOV

Bělorusko (BY): dr. S. MARCHANKA

Brazílie (BR): A. L. LOPES DA SILVA

dr. F. SMIDT LARA RESENDE

Čína (CN): dr. W. ZHANG

Evropská léková agentura (EMA):

S. GOVER

Gruzie (GE): dr. L. TSIKLAURI

Guinea (GN): dr. R. LAMAH

Indie (IN) dr. R. KUMAR

dr. D. KUMAR SHARMA

dr. G. N. SINGH

Izrael (IL): dr. O. AXELROD

Japonsko (JP) U. KATSUAKI

M. MATSUHAMA

Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA)

Jižní Afrika (ZA):

Kanada (CA): dr. L. ELMGREN

Kazachstán (KZ): dr. Z. JAZYLBEKOVA

dr. A. TULEGENOVA

Korejská republika (KR):

dr. W. SHIN

Madagaskar (MG): dr. Y. RAKOTOBE

Malajsie (MY): A. L. TAN

Maroko (MA): dr. O. BOUAZZA

Moldávie (MD): prof. V. VALICA

Ruská federace (RU):

V. KOSENKO

A. NIKITINA

prof. dr. E. I. SAKANJAN

Senegal (SN): prof. A. M. DIEYE

Singapur (SG): dr. N. P. CHEAH

Spojené státy americké (US):

dr. P. NITHYANANDAN

Sýrie (SY): dr. H. ABBOUD

Taiwan (TW): dr. H.-P. CHANG

dr. H.-F. CHENG

Y. Ch. YANG

Tunis (TN): S. BAHRI HICHERI

L. MAHJOUBI

Uzbekistán (UZ): A. DUSMATOV

F. MURATOVA

A. TEMIROV

WHO: dr. S. KOPP

SKUPINY EXPERTŮ

Skupina 1 – Mikrobiologie

Předseda: dr. V'. FENTON-MAY

Experti:

AR

AU

BA

CH

CH

DE

DE

DE

DK

ES

FI

FR

FR

GB

NL

NL

NL

PL

PT

SE

SE

M. C. FERNANDEZ

K. LONGSTAFF

D. SOFTIC

dr. M. GOVERDE

A. STAERK

dr. S. DEUTSCHMANN

dr. J. GEBEL

dr. K.-M. HANSCHMANN

dr. P. ANNEL

dr. S. LOPEZ HERNANDEZ

T. VIRTANEN

dr. Th. BONNEVAY

dr. J. LAPORTE

I. VENET

dr. M. CLAASSEN WILLEMSE

prof. dr. E. R. VAN DEN HEUVEL

G. VERDONK

prof. dr. S. TYSKI

dr. M. MIRANDA

dr. C. GONZALEZ-REY

dr. S. KARLSSON

Skupina 6 – Biologické a biotechnologické produkty

Předseda: dr. C. PINI

Experti:

AT

AT

AU

AU

AU

BE

CA

CH

CH

CH

CN

DE

DE

DE

DE

DK

ES

ES

ES

ES

FR

GB

dr. M. SCHIESTL

dr. P. TURECEK

dr. E. SARAVOLAC

dr. S. SMITH

dr. K. GRANT

prof. dr. J. DEMEESTER

dr. S. SAUVE

dr. R. BURGENER

dr. J. HOERNSCHEMEYER

G. RUECK

prof. Ch. LIANG

prof. S. ALBAN

dr. W. ARZ

prof. H.-CH. MAHLER

dr. B. SCHMAUSER

dr. A. M. JESPERSEN

dr. J. CABANAS

S. CARUNCHO

G. DIAZ

dr. G. FRANCO

dr. O. GARINOT

dr. Ch. BURNS

Složení

evropské

lékopisné

komise…

ČL 2017 – Dopl. 2020 49


HU dr. Z. URBANYI

IE dr. M. MILFORD

IT dr. L. LIVERANI

IT dr. F. MARINO

KR S.-K. SUH

MK prof. A. GROZDANOVA

NL dr. P. M.J.M. JONGEN

NL dr. E. KELLENBACH

NO dr. Th. S. SAUNDERS

PL dr. M. JAWORSKA

PT A. L. URMAL RIBEIRO

SE dr. E. MULUGETA

Pozorovatelé:

EMA S. GILL

TFDA dr. M.-K. YEH

Skupina 6B – Lidská plazma a přípravky z plazmy

Předseda: dr. J. DODT

Experti:

AT dr. Ch. KEFEDER

AT dr. P. TURECEK

AU dr. A. ADISA

AU dr. G. SMITH

CA dr. W. STEVENS

CH dr. K. BEOGLI-STUBER

CH dr. D. STADLER

DE dr. S. BREITNER-RUDDOCK

DE dr. N. GROSS

DK P. OSTFLEDT

EMA A. CAVALEIRO SANCHES

ES dr. M. JOSE CASAN

ES dr. I. RODRIGO CASTRO

FI M. LANKINEN

FR V. LIÈVRE

GB dr. A. R. HUBBARD

IT dr. M. WIRZ

NL dr. M. VAN DE BOVENKAMP

PT L. M. MEIRINHOS SOARES

SE A.-Ch. HINZ

TR prof. dr. I. VURAL

TW dr. H.-F. CHENG

US dr. Ch. KIMCHI-SARFATY

US dr. M. OVANESOV

Skupina 7 – Antibiotika

Předseda: dr. E. M. NADAL ELDUAYEN

Experti:

AT dr. E. GRILL

AT dr. K. WINNA

BE prof. dr. E. ADAMS

BE dr. B. WOLF

BG S. IVANOVA GOCHEVA

CH dr. A. JAUS

CZ dr. J. MAXA

DE dr. U. LIPKE

DK R. KLASSON

FR J.-P. ETCHEGARAY

GB J. SUMAL

NL dr. J. W. H. SMEETS

PT

PT

SE

SI

dr. D. BARBOSA

C. VIEIRA

dr. M. LAVEN

K. KREFT

Pozorovatelé:

QWP dr. T. AGASOSTER

Skupina 9 – Anorganická chemie

Předseda: dr. M. TÜRCK

Experti:

CH

DE

ES

FR

GB

IN

MK

TR

dr. Ch. GEYER

dr. U. REICHERT

prof. dr. E. M. VAZQUEZ-LOPEZ

S. DUTEIL

Ch. T. GODDARD

dr. M. GANGRADE

prof. dr. J. TONIC RIBARSKA

C. BABAC CETIN

Skupina 9G – Medicinální plyny

Předseda: dr. G. LEE

Experti:

AT

BE

BR

CH

DE

DE

DE

DE

ES

FR

GB

IT

NL

SE

dr. M. SCHOEFNAGL

dr. V. VERGOTE

D. MICHELS CORTEZ

dr. H. ESCHENHOF

F. FOERSTER

dr. S HERBIG

dr. C PILGER

dr. K. ZUECHNER

A. PONS

F. SIMONDET

P. HENRYS

dr. L. FERRARI

dr. J. DEN HARTIGH

dr. L. V. FREDERIKSEN

Skupina 10A – Organická chemie – syntetické

a semisyntetické produkty

Předseda: prof. T. ARVIDSSON

Experti:

CH

CH

CZ

DE

DE

DK

ES

FR

GB

IL

NL

PT

PT

SI

TR

TR

TR

dr. M. LANGOS-MABBOUX

dr. S. STEINER

dr. J. MAXA

dr. R. FENDT

M. MENTGEN-WOLNY

dr. B. MOESGAARD

M. T. GONZALEZ VAZQUEZ

prof. Ch. HERRENKNECHT

D. MALPAS

dr. M. PESACHOVICH

M. KLOP

dr. M. J. PORTELA

dr. P. CATALAO

dr. B. MITROVIC

O. KARBAN

T. ULUYOL

dr. B. USLU

50 ČL 2017 – Dopl. 2020


Skupina 10B – Organická chemie – syntetické


Předseda: dr. G. TOROK

Experti:

AT

CZ

DE

DE

DE

ES

FI

GB

IT

NL

PL

PT

RS

SI

SE

TR

dr. A. MAYRHOFER

H. DRAŠAROVÁ

dr. F. AGUILAR-PARRILLA

dr. F. JELLEN

dr. W. TRENTMANN

dr. J. M. DE CIURANA I GAY

A. LEHTOLA

dr. E. BUSH

dr. R. FERRETTI

T. WEEL

prof. A. JELINSKA

dr. G. MATA

dr. K. DRLJEVIC

dr. G. ARH

P. BAKY

G. G. KAYAR

Skupina 10C – Organická chemie – syntetické


Předseda: dr. W. ARZ

Experti:

BR

CH

CZ

DE

DE

ES

FR

GB

HU

IL

IT

MK

NL

PL

SE

SI

SI

G. RAMOS FERRONATTO

M. CONTI

dr. J. HUMHEJOVÁ

dr. K. HAUFF

dr. S. SABBAH

dr. J. CLARAMUNT CAMPANA

dr. P. GIMENO

dr. J. MCKENDRICK

dr. I. KAPUI

A. MARCOVICH

dr. E. BOSSU

dr. K. BREZOVSKA

R. WAGENAAR

dr. K. BOSZKO

dr. Th. ANDERSSON

N. LALJEK

dr. A. ROTAR

Skupina 10D – Organická chemie – syntetické


Předseda: dr. Ch. BRENIER

Experti:

CH

CH

CN

CZ

DE

DE

DE

DE

ES

GB

KR

MK

R. ALDER

dr. Ch. STEUER

dr. Y. LIU

T. KUTEK

dr. D. BARTSCHAT

prof. dr. U. HOLZGRABE

dr. U. REICHERT

dr. M. TÜRCK

B. DIAZ BARCO

Ch. T. GODDARD

prof. Y. KWON

A. POCEVA PANOVSKA

SE

SI

TR

M.-L. SJOHOLM

dr. Z. CASAR

prof. S. SUZEN

Skupina 11 – Organická chemie – přírodní,

semisyntetické a syntetické produkty

Předseda: prof. dr. U. HOLZGRABE

Experti:

CH

CH

CH

CN

CN

DE

DE

FR

GB

GB

IN

IT

MK

NL

SE

TR

TR

TR

TW

ZA

dr. E. FISCHER

J.-P. KNAPP

M. RICHTER

prof. dr. X. WU

prof. Q. ZHANG

dr. G. JILGE

dr. D. JUNG

J. ROTGER

dr. A. LUCATELLI

M. TUBBY

dr. M. GANGRADE

dr. F. VILLA

dr. J. ACEVSKA

dr. E. LAMME

dr. B. PERSSON

prof. E. NEMUTLU

H. OZCELIK

prof. dr. E. PALASKA

prof. K.-H. LEE

dr. M. LITEDU

Skupina 12 – Lékové formy a technologie lékových

forem

Předseda: dr. R. HORDER

Experti:

AT

AT

BA

BA

BG

CH

CH

CZ

DE

DE

DE

DE

DE

DE

DK

EE

ES

ES

FI

FR

GB

HU

IE

KR

NL

NO

PT

J. WOEGERER

C. BARANYI

S. OMEROVIC

T. PONORAC

prof. M. DIMITROV

dr. B. HAENI

dr. H. ROCKSTROH

dr. Z. ŠKLUBALOVÁ

dr. A. BURCHARDT

dr. L. FROEHLICH

dr. K. HORN

dr. J. KRAEMER

prof. H.-Ch. MAHLER

dr. T. POSSET

prof. dr. A. BAUER-BRANDL

dr. K. KOGERMANN

dr. C. DE LA MORENA CRIADO

M. URENA

dr. L. PELTONEN

E. BLOUET ABDELHAC

prof. S. R. WICKS

dr. B. SZABADY

dr. M. MORRIS

prof. K. S. KIM

dr. Ch. H. VERMAAT

prof. S. A. SANDE

P. M. RAMOS MARTINHO FIGUEIREDO

Složení

evropské

lékopisné

komise…

ČL 2017 – Dopl. 2020 51


SE

TR

TR

US

dr. A. LARHED

dr. F. KOC

prof. S. SAHIN

dr. E. PARENTE

Skupina 13A – Rostlinné drogy a přípravky

z rostlinnýchdrog

Předseda: prof. dr. S. CANIGUERAL

Experti:

AT

BA

BE

BG

CH

CH

CH

DE

DE

DE

ES

ES

FR

FR

FR

GR

GR

IT

NL

PL

PL

PT

TR

TR

prof. dr. R. BAUER

dr. T. BOSNIC

dr. J. CORTHOUT

prof. I. IONKOVA

dr. B. HENEKA

dr. E. REICH

dr. L. ZANGERLE

K. REH

C. VALDER

dr. F. WAIMER

F. LORENZO GARCIA

dr. P. PAIS

dr. D. BELLENOT

E. DADOLE

D. GUEDON

dr. M. HALABALAKI

prof. I. CHINOU (HMPC)

dr. F. VILLA

dr. J. VAN DER NAT

K. PAWLOWICZ

K. TOMASZEWSKA

dr. A. P. MARTINS

H. M. BAYRAK

prof. dr. H. G. SALTAN

Skupina 13B – Rostlinné drogy a přípravky

z rostlinných drog

Předseda: K. REH

Experti:

AT

BE

CA

CH

CH

CN

DE

DE

DE

ES

ES

FR

FR

GB

GR

IE

IT

KR

MK

NL

PL

PL

SE

prof. dr. B. KOPP

prof. dr. M. FREDERICH

dr. J. EADES

prof. dr. B. MEIER

dr. E. REICH

dr. M. SHUANGCHENG

dr. A. HOFMANN

dr. Ch. KAESBAUER

dr. B. KLIER

dr. J. C. QUINTELA FERNANDEZ

prof. dr. S. CANIGUERAL

dr. C. CLEMENCIN

dr. D. BELLENOT

P. ANDERSON

prof. A.-L. SKALTSOUNIS

dr. J. J. WALSH

dr. F. VILLA

prof. dr. J.-S. KANG

dr. G. STEFKOV

dr. J. VAN DER NAT

dr. B. GULANOWSKI

dr. A. KOWALCZUK

dr. R. BURMAN

TR

prof. dr. L. O. DEMIREZER

Pozorovatelé:

EMA dr. B. H. KROES

Skupina 13H – Mastné oleje a jejich deriváty, polymery

Předseda: prof. dr. L. MEINEL

Experti:

AT

DE

DE

DE

DE

DE

ES

FR

FR

FR

GB

GB

IS

NL

NO

TR

dr. J. MOESSLACHER

dr. S. BISCHOF

dr. M. GOLL-TILLMANN

dr. M. LOTTER

prof. dr. M. PEIN-HACKELBUSCH

dr. W.-R. SCHLAG

dr. J. FERREIRA

S. BESSET

L. BOUT

J.-P. ETCHEGARAY

dr. R. CAWTHORNE

dr. M. EVANS

dr. A. HALLDORSSON

L. H.T. DEDEREN

dr. H. BREIVIK

M. S. BAY

Skupina 14 – Radiofarmaka

Předseda: dr. T. KROON

Experti:

AT

AT

BE

CH

CZ

DE

DE

DE

DE

DE

DK

ES

ES

FR

GB

IN

IT

MK

NO

PL

SE

TR

dr. C. DECRISTOFORO

dr. H. KVATERNIK

prof. dr. A. VERBRUGGEN

dr. C. DUMAS

dr. O. LEBEDA

prof. dr. G. J. MEYER

dr. M. Th. MUELLER

O. Ch. NEELS

prof. dr. B. NEUMAIER

dr. R. SUCHI

I. O. JENSEN

F. BLANCO RODRIGUEZ

dr. I. RAMIREZ DE ARELLANO SERNA

dr. Ph. GERVAIS

dr. R. D. PICKETT

dr. A. KORDE

dr. P. A. SALVADORI

prof. E. JANEVIK-IVANOVSKA

B. T. HARBO

dr. P. GARNUSZEK

dr. G. ANTONI

prof. S. ERDOGAN

Skupina 15 – Vakcíny a séra pro humánní použití

Předseda: dr. S. R. ANDERSEN

Experti:

AT

AU

BE

BE

CA

CH

CH

H. SCHINDL

dr. S. CRAIG

dr. T. PRONCE

dr. G. WAETERLOOS

dr. D. SMITH

dr. L. BRUCKNER

dr. R. GYSIN

52 ČL 2017 – Dopl. 2020


CZ

CZ

DE

DE

DE

DE

DE

DE

DK

DK

ES

FI

FR

FR

GB

GB

IT

IT

NL

NL

NO

RS

SE

TR

US

dr. R. POSPÍŠIL

dr. E. VÍTKOVÁ

dr. B. KEGEL

dr. B. KRAEMER

dr. E. KRETZSCHMAR

dr. H. MUCKENFUSS

dr. V. OEPPLING

dr. R. THUERMER

dr. S. E. JENSEN

dr. E. OSTERGAARD

dr. I. PEREZ GONZALEZ

P. SORMUNEN

dr. D. GARCIA

dr. L. MALLET

dr. S. SCHEPELMANN

dr. P. STICKINGS

dr. L. CAMPITELLI

dr. Ch. VON HUNOLSTEIN

A. AKKERMANS

dr. J. BERGERS

A. DYBWAD

dr. R. CEBEDZIC

dr. P. STJÄRNKVIST

F. SENGUN

dr. R. LEVIS

Pozorovatelé:

EMA dr. R. SHIVJI

Skupina 15V – Vakcíny a séra pro veterinární použití

Předseda: dr. C. LORTEAU

Experti:

AT

BE

CH

CH

CZ

DE

DE

DE

DK

ES

ES

ES

FI

FR

FR

GB

GB

HU

NL

NO

PL

SE

SK

TR

dr. D. PULLIRSCH

dr. P. GROGNET

dr. L. BRUCKNER

dr. H. P. OTTIGER

dr. R. SMÍTALOVÁ

dr. B. KRAEMER

dr. I. LEMKE

dr. A. MOTITSCHKE

dr. P. L. FRANDSEN

dr. R. BULLIDO

M. J. FERRER

dr. B. HERNANDEZ BLANCO

dr. M. JAKAVA-VILJANEN

dr. Ch. MIRAS

prof. J.-M. PERSON

dr. A. M. BRADY

dr. R. COONEY

dr. E. HORVATH

dr. T. VAN DER HEIJDEN

prof. Ø. EVENSEN

prof. dr. B. CUVELIER-MIZAK

M. ERIKSSON

dr. R. KOVACOVA

dr. M. ALKAN

Skupina 16 – Materiály, obaly a uzávěry z plastů

Předseda: dr. S. SCHMIDT

Experti:

AT

AU

BE

BE

CH

CH

CH

DE

DE

DE

DE

DE

DK

ES

FR

NL

SE

TR

TR

dr. J. EMIG

dr. P. FARRINGTON

dr. C. DELBERGHE

dr. R. JANSSEN

H. KOLLER

dr. H. ROEHL

dr. J. THUERK

dr. B. BOLTRES

dr. A. HAUK

dr. P. HENCKEN

dr. W. KAMMER

dr. R. OTTER

dr. V. N. HANDLOS

dr. M. R. VIRTO GARCIA

dr. P. GIMENO

dr. P. KARSTEN

dr. B. ERLANDSSON

dr. B. BABÜR

O. COLAK

Skupina P4 – Postup 4 (chemické látky s patentovou

ochranou)

Předseda: dr. A. MAYRHOFER

Experti:

BA

CH

CH

DE

EE

ES

FR

GB

HR

LT

NL

NO

PT

RS

TR

TR

S. BESLAGIC

dr. P. SCOGNAMIGLIO-WEBER

dr. J. TROMP

dr. Th. GUMZ

S. LEITO

dr. I. DORRONSORO DIAZ

dr. D. CHAUVEY

S. YOUNG

G. BENKOVIC

R. MOCKUTE

dr. M. KUBBINGA

dr. A. MIHAILOVA

R. PIMENTEL

dr. M. MALESEVIC

M. S. BAY

dr. U. SALGIN GOKSEN

PRACOVNÍ SKUPINY

Skupina ALG – Alergeny

Předseda: prof. dr. S. VIETHS

Specialisté:

AT dr. Ch. KEFEDER

CH dr. M. GAUTSCHI

DE dr. F. SCHULER

DK Ch. G. HOUGHTON

ES dr. M. TIMON JIMENEZ

FR A. BERTOCCHI

GB dr. A. COOK

IT dr. C. PINI

TR dr. F. KOC

Složení

evropské

lékopisné

komise…

ČL 2017 – Dopl. 2020 53


Skupina BET – Zkouška na bakteriální endotoxiny

Předseda: dr. I. SPREITZER

Specialisté:

AU A. SMITH

CH dr. P. BRUEGGER

DE dr. S. DEUTSCHMANN

DE dr. J. REICH

DE dr. M. RIETH

ES dr. S. LOPEZ HERNANDEZ

FR dr. Th. BONNEVAY

FR M. PLANA

GB dr. K. NORDGREN

IT dr. E. COCCIA

IT dr. C. SIGNORETTI

NO H. JARSTADMARKEN

PT dr. M. MIRANDA

TR A. DEMIRTAS

TR dr. M. K. DERICI

US dr. E. GUSTCHINA

Skupina CE – Kapilární elektroforéza

Předseda: prof. dr. U. HOLZGRABE

Specialisté:

BE prof. dr. A. VAN SCHEPDAEL

DE prof. H. WAETZIG

CH dr. O. GROSCHE

CH dr. D. LAY

SE dr. A. AMINI

Skupina CEL – Celulosa

Předseda: dr. Ch. MUEHLENFELD

Specialisté:

CH dr. J. BUND

DE dr. W. LAZIK

DE dr. M. MINTERT

NL dr. E. IZEBOUD

Skupina CND – Konduktivita

Specialisté:

CH dr. A. H. PFENNINGER

DE dr. N. GREIDZIAK

DE dr. K. REITHMAYER

FR dr. A. RAGON

Skupina COL – Barevnost – instrumentální metody

Předseda: prof. H. J. DE JONG

Specialisté:

DE dr. J. MOELLER-KEMSA

DE dr. S. PAUKER

FR Ph. VILLATTE

SE dr. P. CINTHIO

Skupina CRB – Cukry

Předseda: dr. P. PALLAS

Specialisté:

AT dr. Th. LANGE

BE G. HAEST

DE dr. D. MARTIN

ES L. MAS ESCOSA

FR E. GOIDIN

HU dr. T. SOHAJDA

NL dr. A. JANSSEN

SE dr. M. SKOOG

Skupina CST – Chromatografické separační metody

Předseda: prof. dr. J. HOOGMARTENS

Specialisté:

BE dr. B. WOLF

CH D. GLAUSER

CH dr. V. MEYER

CN prof. M.-J. WANG

CZ dr. T. GRAFNETTEROVÁ

DE dr. S. LAMOTTE

GB S. YOUNG

HU B. KAPUSI

PL dr. K. FILIP

PT dr. P. CATALAO

PT N. SIMOES

SE dr. A. KARLSSON

SI dr. B. PIRNAT

TR prof. dr. S. A. OZKAN

US M. CUTRERA

Skupina CTP – Produkty buněčné terapie

Předseda: dr. G. MIGLIACCIO

Specialisté:

CH dr. O. HORN LOHRENS

DE J.-O. KARO

DE dr. H. LOESSNER

DE dr. J. SCHERER

DE dr. U. SCHURIG

DK dr. A. EKBLOND

ES dr. S. LOPEZ HERNANDEZ

ES dr. C. S. ROJO GOZALO

FI dr. H. SUILA

FR B. BIREBENT

IT dr. R. BOTTA

SE dr. A. BARBU

Skupina DIA – Dialyzační roztoky


Specialisté:

BE dr. C. DELBERGHE

DE dr. N. GREIDZIAK

FR E. BLOUET ABDELHAC

FR dr. A. RAGON

NL prof. dr. D. J. TOUW

Skupina EXP – Pomocné látky

Předseda: prof. A. GAYOT

Specialisté:

BG F. SVETOSLAVOV

CH dr. J. BUND

CH dr. P. FURRER

CH dr. H. SCHMITTER

DE prof. dr. M. PEIN-HACKELBUSCH

DE dr. G. WARNKE

54 ČL 2017 – Dopl. 2020


FR E. BLOUET ABDELHAC

GB C. MROZ

HU prof. dr. R. ZELKO

NL dr. H. TALSMA

SE dr. S. SCHANTZ

Skupina EXT – Extrakty

Specialisté:

AT dr. R. LAENGER

CH dr. B. HENEKA

CH prof. dr. B. MEIER

DE dr. F. WAIMER

DE dr. B. KLIER

DE K. REH

ES prof. dr. S. CANIGUERAL

ES G. GARCIA LORENTE

ES dr. P. PAIS

FR D. GUEDON

GB dr. L. ANDERSON

GB dr. M. E. PIRES

IT dr. F. VILLA

Skupina GEL – Želatina

Specialisté:

DE dr. A. PROBST

FR S. AUDOLY

Skupina GLS – Skleněné obaly

Předseda: dr. J. ZUERCHER

Specialisté:

CH dr. H. ROEHL

CH dr. J. THUERK

CN dr. H. SUN

DE dr. B. BOLTRES

DE dr. K. HENNIG

DE dr. P. NATSCHER

DE dr. M. ROESSLER

ES dr. M. R. VIRTO GARCIA

IT dr. E. GUADAGNINO

Skupina GTP – Produkty genové terapie

Specialisté:

AT dr. D. PULLIRSCH

BE prof. dr. P. DECLERCK

CH dr. P. KEMPNA BUKOVAC

CH prof. dr. A. MARTI

DE dr. B. ANLIKER

DK dr. Th. G. JENSEN

ES dr. J. M. FOMINAYA GUTIERREZ

FR dr. L. JEANSON LEH

FR dr. V. RIDOUX

GB dr. Y. ZHAO

IT dr. M. C. GALLI

IT dr. F. NAPPI

NL dr. H. HERMSEN

SE dr. A. STAHLBOM

US M. ALAI SAFAR

US dr. R. VATSAN

Skupina HM – Těžké kovy

Předseda: dr. M. TÜRCK

Specialisté:

BE Ph. DE RAEVE

DE prof. K. GUENTHER

CH dr. J. HUBER

CH dr. M. WILHELM

FR S. DUTEIL

GB A. EVANS

SE R. ARNDT

Skupina HMM – Homeopatické výrobní metody

Předseda: prof. W. KNOESS

Specialisté:

CH M. SPOHN

DE prof. dr. R. DANIELS

DE U. NORWIG

DE dr. Ch. KIRCHNER

FR T.-H. DUFAT

FR prof. A. GAYOT

GB dr. R. PASK-HUGHES

GB J. SUMAL

IT dr. B. BRUNO

NL dr. J. VAN DER NAT

Skupina HOM – Homeopatické výchozí materiály

a základní látky

Předseda: prof. dr. M. KEUSGEN

Specialisté:

AT K. WENGER

CH dr. M. MENNET-VON EIFF

DE Ch. BUSH

DE dr. Ch. VON DER HEIDT

FR dr. T. H. DUFAT

FR dr. K. TAOUBI

GB dr. R. PASK-HUGHES

GB J. SUMAL

IT dr. B. BRUNO

NL dr. J. VAN DER NAT

TR prof. I. I. CANKAYA

Skupina ICP – Spektrometrie s indukčně vázaným

plazmatem

Specialisté:

CH dr. J. HUBER

DE dr. A. LANG

DE prof. dr. K. GUENTHER

ES dr. M. MORENO CUARTAS

FR S. DUTEIL

IT dr. F. PETRUCCI

Skupina INH – Inhalanda

Předseda: dr. S. LEINER

Specialisté:

BA A. ELEZOVIC

CH dr. S. EDGE

DE dr. C. NOPITSCH-MAI

GB prof. K. TAYLOR

Složení

evropské

lékopisné

komise…

ČL 2017 – Dopl. 2020 55


NL P. CASPERS

SE dr. J. O. SVENSSON

Skupina LBP – Živé biologické léčivé přípravky

Předseda: dr. Ch. VON HUNOLSTEIN

Specialisté:

DE dr. K. BUSS

DE dr. H. LOESSNER

DE I. PIETER

DK N. PRINGLER

ES dr. A. SAGREDO

FR dr. N. CHARLIER-BRET

FR M. CORDAILLAT-SIMMONS

GB dr. A. STEVENSON

IT dr. M. J. GOMEZ MIGUEL

SE P. ALHADEFF

SE L. LUNDKVIST

Skupina LEC – Lecithiny

Specialisté:

DE dr. D. BRUNS

DE dr. A. SCHOEPPE

DE dr. M. GOLL-TILLMANN

SE dr. H. SKOG

Skupina MAB – Monoklonální protilátky

Předseda: dr. J. VESTERINEN

Specialisté:

AT dr. R. MAYER

AT dr. D. PULLIRSCH

AU dr. E. SARAVOLAC

CA dr. O. TOUNEKTI

CH dr. M. DIBOUNE

CH L. RANDON

CN L. WANG

DE dr. D. KARRA

DE dr. N. KEIL

DE R. KRON

ES dr. M. A. ORTIZ ROSALES

FR A. BECK

FR J.-B. GRAFF

FR J.-C. OURLIN

GB dr. P. VARLEY

GB dr. S. PRIOR

GB dr. M. WADHWA

KR S.-K. SUH

KR dr. J.-S. YOO

NL dr. M. VAN DER PLAS

PT dr. M. F. ALVES DE ALMEIDA

SE dr. I. AGERKVIST

TW prof. M.-N. SHIU

Skupina MG – Obecné metody

Předseda: prof. dr. M. ULMSCHNEIDER

Specialisté:

CH dr. M. LANGOS-MABBOUX

CH L. RANDON

CH M. CONTI

DE dr. M. HOERNIG

DE dr. N. NIEDERLAND

DE dr. Ch. SAAL

ES dr. R. FERNANDEZ GRANDA

FI dr. T. WIKBERG

FR prof. Ch. HERRENKNECHT

GB S. BOLAND

GB dr. E. GRAY

SE dr. J. MODIN

Skupina NBC – Nebiologické komplexy

Předseda: prof. G. BORCHARD

Specialisté:

CH dr. E. PHILIPP

DE prof. H. BUNJES

DE dr. R. THUERMER

ES dr. M. R. VIRTO GARCIA

IT dr. L. LIVERANI

Skupina P4BIO – Postup 4 (biologické látky)

Předseda: P. M. J. M. JONGEN

Specialisté:

AT dr. D. PULLIRSCH

DE dr. J. DODT

DE dr. J. ENGELBERGS

DE dr. N. KEIL

DE dr. C. LIPPERHEIDE

FR J. KORIMBOCUS MOLIN

GB dr. L. BOTH

GB dr. M. WADHWA

PT A. L. URMAL RIBEIRO

SE dr. I. AGERKVIST

Skupina PA – Pyrrolizidinové alkaloidy

Předseda: dr. R. BURMAN

Specialisté:

AT prof. dr. G. BONN

CH M. LUOND

CH dr. A. SCHENK

DE dr. B. KLIER

DE K. REH

DE prof. dr. M. TAWAB

DE dr. A. THESE

ES A. MULA DALTELL

FR dr. D. BELLENOT

FR O. SAPERAS

GB S. J. MACDONALD SHARMAN

GR prof. I. CHINOU

PL dr. T. MROCZEK

Skupina PaedF – Pediatrické přípravky

Předseda: prof. dr. J. BREITKREUTZ

Specialisté:

AT dr. P. HOFBAUER

BG prof. M. DIMITROV

CH dr. P. SCOGNAMIGLIO-WEBER

DE dr. H. REIMANN

DE dr. Th. ZAPF

DK dr. I. LARSSON

EMA dr. S. WANG

56 ČL 2017 – Dopl. 2020


FI

FR

GB

GB

NL

PT

RS

SE

SI

dr. M. HELIN-TANNINEN

L. MALEC

dr. K. BRACHT

prof. T. NUNN

prof. dr. D. BASTIAANS

P. M. RAMOS MARTINHO FIGUEIREDO

dr. Z. JOVIC

B. HEDIN

dr. I. TEGELJ

Skupina PAT – Technologie analýzy procesu

Předseda: dr. M. MORRIS

Specialisté:

AT dr. W. SCHUH

BE prof. dr. Th. DE BEER

CH dr. L. LIESUM

CH prof. dr. M. ULMSCHNEIDER

DE prof. W. KESSLER

DE dr. J. LIMBERG

DK prof. dr. J. RANTANEN

FR L. SARGI CAIZERGUES

NO dr. O. HOLTE

TR prof. dr. B. AKSU

Skupina POW – Prášky

Předseda: prof. S. IBRIC

Specialisté:

CH dr. E. JOHN

CH dr. S. KRIMMER

CH dr. M. MUTZ

DE prof. dr. M. THOMMES

ES prof. J. J. TORRADO

ES prof. G. TORRADO

FR prof. dr. P. C. TCHORELOFF

SI dr. P. SVETE

TR prof. dr. Y. CAPAN

TR dr. M. UYGUN

Skupina PRP – Prekursory pro radiofarmaka

Předseda: prof. dr. A. VERBRUGGEN

Specialisté:

BE dr. C. GAMEIRO-PARIS

CH dr. Ch. SCHWEINSBERG

DE D. COLDITZ

DE dr. W. A. HOEPPING

DK B. CORYDON-PETERSEN

NL dr. M. DE JONG

PL prof. dr. R. MIKOLAJCZAK

Skupina PST – Zbytky pesticidů

Specialisté:

DE dr. B. KLIER

FR O. SAPERAS

IT dr. G. RAMASCHI

Skupina SIT – Zkoušky druhé totožnosti

Předseda: dr. T. GUMZ

Specialisté:

AT A. DOEBROESY

CH V. FAHR GRATZL

CH C. GOLAZ

CH dr. C. HUBER

DE dr. M. HOERNIG

HR P. JAKSIC

Skupina ST – Standardní názvy

Předseda: dr. S. E. HILLVER

Specialisté:

AT M. PONGRATZ

BA J. ANICIC

CH dr. Ph. WEYERMANN

DE dr. Th. ZAPF

DK H. KASSEM

EE M. EELMAEE

ES dr. C. DE LA MORENA CRIADO

FR dr. M.-Ch. ANNEQUIN

GB dr. M. AHMED

IT dr. P. QUARANTA

LT dr. R. MIKALAUSKAS

NL G. THOLE

NO N. MALVIK

PT prof. J. M. CORREIA NEVES SOUSA LOBO

RS S. UBAVIC

SI T. TEKAVCIC GLOVER

TR prof. dr Y. OZKAN

US S. BRAJOVIC

US dr. Y. TSAI

Pozorovatelé:

EMA dr. I. CHICHARO

EMA J. GONZALEZ NOGUERAS

Skupina SUT – Šicí vlákna

Předseda: dr. H. PEETERS

Specialisté:

DE dr. B. BATKE

DE dr. C. FUCHS

ES dr. L. FUNK

GB dr. P. DOBSON

GB L. FERRIS

IT dr. F. LAZZARO

TR U. BESKAN

TR dr. M. ELCAN

Skupina TCM – Tradiční čínská medicína

Předseda: prof. dr. R. BAUER

Specialisté:

AT dr. R. LAENGER

BE prof. dr. P. DUEZ

CH dr. E. REICH

CH dr. S.-Y. WANG-TSCHEN

DE dr. U. M. GASSER

DE prof. D.-A. GUO

DE dr. R. HOENOW

DE dr. R. SCHERUEBL

DE E.-A. STOEGER

FR dr. T. H. DUFAT

GB C. LENIHAN

IT prof. dr. A. R. BILIA

Složení

evropské

lékopisné

komise…

ČL 2017 – Dopl. 2020 57


NL

PL

TR

TW

dr. M. WANG

prof. dr. K. GLOWNIAK

prof. dr. I. ERDOGAN ORHAN

prof. dr. Y. S. CHANG

Pozorovatelé:

AU prof. dr. K. CHAN

Skupina VIT – Vitaminy

Předseda: dr. M. LANGOS-MABBOUX

Specialisté:

BE dr. E. HAULOTTE

CH dr. G. SCHIEFER

DE dr. R. FENDT

FR dr. P. ANGER

PL dr. A. BURZYNSKA-PRAJZNER

PL dr. M. JAWORSKA

Skupina VSADM – Vibrační spektroskopie

a modelování analytických dat

Předseda: prof. dr. M. ULMSCHNEIDER

Specialisté:

AT dr. W. SCHUH

DE prof. dr. K. BAUMANN

DE dr. Ch. SAAL

DE prof. dr. H. W. SIESLER

ES dr. M. ALCALA BERNARDEZ

FR dr. H. REBIERE

PL W. OZIMINSKI

SE dr. M. JOSEFSON

SI K. KREFT

Skupina WAT – Voda pro farmaceutické použití


Specialisté:

CH dr. H.-J. ANDERS

CH dr. Ph. BLANCO

CH dr. A. H. PFENNINGER

DE F. ROEDER

DE dr. H. SCHULZ

ES dr. J.-M. RODRIGUEZ PACHON

FR dr. A. RAGON

NL dr. D. J. TOUW

SE dr. I. THORSON KAIJA

SI dr. M. KRAMER

SKUPINY EXPERTŮ S DOČASNĚ POZASTAVENOU

ČINNOSTÍ

Skupina CRP – Příprava složených radiofarmak

Specialisté:

BE prof. dr. J. AERTS

CH dr. R. HESSELMANN

DE dr. Ch. KRUMMEICH

DE prof. dr. H.-J. MACHULLA

DE dr. J. ZESSIN

FR dr. N. RIZZO-PADOIN

NL dr. Th. KROON

Skupina HCP – Bílkoviny hostitelské buňky

Specialisté:

CH dr. O. ANDERKA

CH dr. R. GYSIN

CH dr. K. T. HO

CH dr. S. PAHLICH

DE dr. J. ENGELBERGS

DE dr. E. FRIEDL

DE dr. M. WIEDMANN

GB dr. A. KIPPEN

SE dr. K. SEWERIN

Skupina HFA – Propelenty

Specialisté: prof. H. J. DE JONG

Skupina MQH – Mikrobiologická jakost

rostlinných drog

Specialisté:

CH dr. S.-Y. WANG-TSCHEN

DE dr. B. KLIER

Skupina MSL – Alkyl-mesiláty

Specialisté:

DE dr. M. KERST

GB prof. J. M. MIDGLEY

DE dr. U. WOLLEIN

FR dr. C. CIVADE DELAY

Skupina MYC – Mykoplazmata

Specialisté:

AT dr. Ph. STEFFEN

DE dr. S. DEUTSCHMANN

DE J.-O. KARO

DE dr. H.-J. ZOLLER

DK dr. J. S. JENSEN

Skupina NMR – Nukleární magnetická rezonanční

spektroskopie

Specialisté:

CH prof. dr. U. FREY

DE prof. dr. U. HOLZGRABE

DE prof. dr. M. VEIT

FR prof. Ch. HERRENKNECHT

PL dr. L. KOZERSKI

SE dr. T. RUNDLOEF

SI dr. M. CRNUGELJ

Skupina PHP – Farmaceutické přípravky

Specialisté:

AT dr. E. LEITNER

BA E. VRANJES

CH dr. T. GOSDSCHAN

DK dr. V. N. HANDLOS

FR dr. A. LE

GB dr. G. LEE

GB dr. V'. FENTON-MAY

NL dr. Y. M. A. W. VAN KOOIJ

SE dr. I. THORSON-KAIJA

SK dr. T. TESAR

58 ČL 2017 – Dopl. 2020


Skupina RCG – Suroviny pro produkci léčivých

přípravků pro buněčnou a genovou terapii

Specialisté:

CH dr. O. HORN-LOHRENS

DE dr. Th. HINZ

FI dr. J. VESTERINEN

GB dr. L. BISSET

NL dr. A. JORRITSMA-SMIT

EMA dr. C. VOLTZ-GIROLT

Skupina ROP – Jednací řád

Předseda: dr. T. GOSDSCHAN

Specialisté:

DE dr. H. PEETERS

ES dr. C. DE LA MORENA CRIADO

GB dr. J. POUND

Skupina STA – Statistika

Specialisté:

CH C. BIES

DE dr. N. BENDA

FR H. THEVENIN

GB dr. R. E. GAINES DAS

Skupina WXT – Voda pro přípravu extraktů

z rostlinných drog

Specialisté:

CH D. PISCITELLO

DE K. REH

FR J.-M. SEIGNEURET

Složení

evropské

lékopisné

komise…

Skupina SRP – Speciální revizní program

Specialisté:

DE dr. T. GUMZ

GB A. EVANS

NL dr. E. LAMME

ČL 2017 – Dopl. 2020 59

IV TEXTY V EVROPSKÉ ČÁSTI ČL 2017 – DOPL. 2020


vysvětlivky:

bez označení jsou texty uvedené v Ph. Eur. 10.0

*texty uvedené v Ph. Eur. Suppl. 10.1

**texty uvedené v Ph. Eur. Suppl. 10.2

NOVÉ

Obecné statě

2.6.35 Kvantifikace a charakterizace zbytkové DNA

hostitelských buněk

2.6.37 Principy detekce cizích virů v imunologických

veterinárních léčivých přípravcích pomocí

kultivačních metod**

2.9.49 Stanovení tokových vlastností prášků metodami

smykové cely

2.9.52 Skenovací elektronová mikroskopie

5.25 Procesní analytická technologie (PAT)*

Články

Almotriptani malas (2970)*

Benzydamini hydrochloridum (2759)

Cacao oleum (2607)

Donepezili hydrochloridum anhydricum (2582)*

Donepezili hydrochloridum monohydricum (3067)*

Dronedaroni hydrochloridum (3039)

Octreotidum (2414)

Olanzapini embonas monohydricus (3047)**

Prasugreli hydrochloridum (3040)

Rosuvastatini tabulettae (3008)*

Squalenum (2805)

Tapentadoli hydrochloridum (3035)

Tetracainum (2909)

Topiramatum (2616)

Vincaminum (1800)

Vakcíny pro veterinární použití

Vaccinum necrosis pancreaticae infectivae inactivatum

ad salmonideos cum adiuvatione oleosa ad iniectionem

(3063)

Rostlinné drogy a přípravky z rostlinných drog

Abelmoschi flos (2827)

Rehmanniae radix (2569)*

Rubi idaei folium (2950)*

Serratulae coronatae herba (2754)

Homeopatické přípravky

Adonis vernalis ad praeparata homeopathica (2832)*

Obecné statě

REVIDOVANÉ A KORIGOVANÉ

1 Všeobecné zásady (1.1 až 1.6)

2.2.5 Relativní hustota

2.2.25 Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové

a viditelné oblasti

2.2.29 Kapalinová chromatografie

2.2.31 Elektroforéza

2.2.47 Kapilární elektroforéza*

2.4.23 Steroly v mastných olejích

2.4.24 Totožnost a kontrola zbytkových rozpouštědel*

2.4.25 Ethylenoxid a dioxan

2.4.26 N,N-Dimethylanilin

2.4.32 Celkový cholesterol v olejích bohatých

na omega-3-kyseliny

2.5.19 O-Acetyl v polysacharidových vakcínách


-methansulfonátu v kyselině methansulfonové


-methansulfonátu v léčivých látkách

2.5.39 Stanovení methansulfonylchloridu v kyselině

methansulfonové


-toluensulfonátu v léčivých látkách


-benzensulfonátu v léčivých látkách

2.6.8 Zkouška na pyrogenní látky

2.6.16 Zkouška na cizí agens v humánních virových

vakcínách**

2.6.33 Zbytkový pertusový toxin 1

2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

2.7.8 Stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti

tetanu

2.7.23 Stanovení CD34+/CD45+ buněk v přípravcích

pro krvetvorbu

2.7.35 Stanovení účinnosti/obsahu složek vakcíny

nefelometricky

2.8.9 Zbytek po odpaření silic

2.8.25 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie pro

rostlinné drogy a přípravky z rostlinných drog

2.9.1 Zkouška rozpadavosti tablet a tobolek

2.9.10 Stanovení ethanolu

2.9.11 Stanovení methanolu a propan-2-olu

2.9.20 Hodnocení kontaminace viditelnými částicemi

3.1.13 Přísady do polymerů

3.1.14 Materiály na bázi měkčeného polyvinylchloridu

pro obaly na vodné roztoky k infuzi

3.2 Obaly

3.3 Obaly na lidskou krev a krevní složky a materiály

použité k jejich výrobě; soupravy pro transfuzi

krve a materiály použité k jejich výrobě; injekční

stříkačky

3.3.1 Materiály pro obaly na lidskou krev akrevní

složky 2

––––––––––––––––––––––––––––––

1

v ČL 2017 Zbytkový pertusový toxin a nevratnost pertusového toxoidu

2

v ČL 2017 obecná stať 3.1.1

60 ČL 2017 – Dopl. 2020



pro obaly na lidskou krev a krevní složky 3


pro hadičky používané v soupravách pro transfuzi

krve a krevních složek 4

3.3.4 Sterilní obaly z plastů na lidskou krev a krevní

složky 5

3.3.5 Prázdné sterilní obaly z měkčeného

polyvinylchloridu na lidskou krev a krevní složky 6

3.3.6 Sterilní obaly z měkčeného polyvinylchloridu na

lidskou krev obsahující antikoagulační roztok 7

3.3.7 Soupravy pro transfuzi krve a krevních složek 8

3.3.8 Sterilní injekční stříkačky z plastů na jedno

použití 9

4 Zkoumadla (nová a revidovaná)

5.1.2 Biologické indikátory a příbuzné mikrobiální

přípravky použité k výrobě sterilních produktů

5.1.6 Alternativní metody kontroly mikrobiologické

jakosti

5.2.4 Buněčné kultury pro produkci vakcín pro

veterinární použití 10 **

5.2.5 Management cizích agens u imunologických

veterinárních léčivých přípravků 11 **

5.2.12 Vstupní suroviny biologického původu pro

produkci léčivých přípravků pro buněčnou

a genovou terapii

5.2.13 Zdravé chovy kuřat pro produkci inaktivovaných

vakcín pro veterinární použití**

5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek

5.8 Harmonizace lékopisu

5.9 Polymorfie

5.10 Kontrola nečistot v látkách pro farmaceutické

použití

5.12 Referenční standardy

5.15 Funkční charakteristiky pomocných látek

5.16 Krystalinita

5.21 Chemometrické metody pro analytická data

5.22 Názvy rostlinných drog používaných v tradiční

čínské medicíně*

5.24 Chemické zobrazování

Obecné články

Immunosera ad usum veterinarium (0030)**

Immunosera ex animale ad usum humanum (0084)

Praecursores chimici ad radiopharmaceutica (2902)

Producta biotherapeutica viva ad usum humanum (3053)

Vaccina ad usum humanum (0153)

Vaccina ad usum veterinarium (0062)**

Obecné články lékových forem

Auricularia (0652)

Liquida cutanea (0927)

Nasalia (0676)

Ocularia (1163)

Parenteralia (0520)

Praeparata intramammaria ad usum veterinarium (0945)

Praeparata semisolida ad usum cutaneum (0132)

Pulveres perorales (1165)

Rectalia (1145)

Vaginalia (1164)

Články

Acetyltyrosinum (1384)

Acidum 4-aminobenzoicum (1687)

Acidum folicum hydricum (0067)

Acidum oxolinicum (1353)

Acidum palmiticum (1904)

Acidum tiaprofenicum (1157)*

Acidum tranexamicum (0875)*

Acidum zoledronicum monohydricum (2743)*

Adeps lanae (0134)

Adeps lanae hydrogenatus (0969)

Adeps solidus (0462)

Adeps solidus cum additamentis (2731)

Alcohol benzylicus (0256)

Alcohol cetylicus (0540)

Alcohol cetylstearylicus (0702)

Alcohol cetylstearylicus emulsificans A (0801)

Alcohol cetylstearylicus emulsificans B (0802)

Alcohol isopropylicus (0970)

Alcohol oleicus (2073)

Alcohol stearylicus (0753)

Alcoholes adipis lanae (0593)

Alfacalcidolum (1286)

Alimemazini hemitartras (2650)

Almagatum (2010)

Alprazolamum (1065)

Alprenololi hydrochloridum (0876)

Altizidum (2185)*

Aluminii hydroxidum hydricum ad adsorptionem (1664)

Aluminii magnesii silicas (1388)

Aluminii stearas (1663)

Alverini citras (2156)

Amantadini hydrochloridum (0463)

Amikacini disulfas (1290)

Amiloridi hydrochloridum dihydricum (0651)*

Amoxicillinum natricum (0577)

Amphotericinum B (1292)

Ampicillinum natricum (0578)

Apomorphini hydrochloridum hemihydricum (0136)

Aprotinini solutio concentrata (0579)

Aprotininum (0580)

Arachidis oleum hydrogenatum (1171)

Arginini hydrochloridum (0805)

Aripiprazolum (2617)

Articaini hydrochloridum (1688)

Asparaginum monohydricum (2086)*

Atazanaviri sulfas (2898)*

Atenololum (0703)*

Atropini sulfas monohydricus (0068)

Texty

v evropské

části ČL 2017 –

Dopl. 2020

––––––––––––––––––––––––––––––

3

v ČL 2017 obecná stať 3.1.1.1

4

v ČL 2017 obecná stať 3.1.1.2

5


6


7


8


9


10

v ČL 2017 Buněčné kultury pro produkci veterinárních vakcín

11

v ČL 2017 Látky živočišného původu pro produkci

imunologických veterinárních léčivých přípravků

ČL 2017 – Dopl. 2020 61


Atropinum (2056)

Azelastini hydrochloridum (1633)

Bacitracinum (0465)

Bacitracinum zincum (0466)

Benserazidi hydrochloridum (1173)

Benzalkonii chloridi solutio (0371)

Benzalkonii chloridum (0372)

Benzathini benzylpenicillinum tetrahydricum (0373)

Benzocainum (0011)*

Benzylis benzoas (0705)

Benzylpenicillinum kalicum (0113)

Benzylpenicillinum natricum (0114)

Biotinum (1073)

Biperideni hydrochloridum (1074)

Bismuthi subsalicylas (1495)

Bleomycini sulfas (0976)

Boldinum (2971)

Boraginis oleum raffinatum (2105)

Brimonidini tartras (2760)

Bromhexini hydrochloridum (0706)

Brompheniramini maleas (0977)

Bupivacaini hydrochloridum monohydricum (0541)

Buserelinum (1077)

Calcii folinas hydricus (0978)

Calcii glucoheptonas (1399)

Calcii levofolinas hydricus (1606)

Calcitoninum salmonis (0471)

Candesartanum cilexetilum (2573)

Captoprilum (1079)

Carbimazolum (0884)

Carboxymethylamylum natricum A (0983)

Carboxymethylamylum natricum B (0984)

Carboxymethylamylum natricum C (1566)

Carmellosum natricum (0472)

Carmellosum natricum conexum (0985)

Carmellosum natricum substitutum humile (1186)

Carmustinum (1187)

Carthami oleum raffinatum (2088)

Cefalotinum natricum (0987)

Cefamandoli nafas (1402)

Cefapirinum natricum (1650)

Cefazolinum natricum (0988)

Cefepimi dihydrochloridum monohydricum (2126)

Cefoperazonum natricum (1404)

Cefotaximum natricum (0989)

Cefoxitinum natricum (0990)

Ceftazidimum pentahydricum (1405)

Ceftazidimum pentahydricum et natrii carbonas

pro iniectione (2344)

Ceftriaxonum natricum trihemihydricum (0991)

Cefuroximum axetilum (1300)

Cefuroximum natricum (0992)

Cellulosum microcristallinum (0316)

Cetylis palmitas (1906)

Chloramphenicoli natrii succinas (0709)

Chloramphenicoli palmitas (0473)

Chloramphenicolum (0071)

Chlorobutanolum anhydricum (0382)

Chlorobutanolum hemihydricum (0383)

Chlorocresolum (0384)

Chlorpromazini hydrochloridum (0475)

Chlortalidonum (0546)

Chlortetracyclini hydrochloridum (0173)*

Cholesterolum (0993)

Cholesterolum ad usum parenteralem (2397)

Ciclopiroxum (1407)

Ciclosporinum (0994)

Cilastatinum natricum (1408)

Cladribinum (2174)

Clemastini fumaras (1190)

Clindamycini phosphas (0996)

Clioquinolum (2111)

Clobetasoli propionas (2127)*

Clofibratum (0318)

Clomifeni citras (0997)**

Clonidini hydrochloridum (0477)

Clopidogreli besilas (2790)

Clopidogreli hydrochloridum (2791)

Clopidogreli sulfas (2531)

Cloxacillinum natricum monohydricum (0661)

Codeini hydrochloridum dihydricum (1412)

Codeini phosphas hemihydricus (0074)

Codeinum monohydricum (0076)

Coffeinum (0267)

Coffeinum monohydricum (0268)

Colestyraminum (1775)

Colistimethatum natricum (0319)

Colistini sulfas (0320)

Copolymerum macrogolo et alcoholi poly(vinylico)

constatum (2523)

Copovidonum (0891)

Crospovidonum (0892)

Cyclizini hydrochloridum (1092)

Cysteini hydrochloridum monohydricum (0895)

Cytarabinum (0760)

Dacarbazinum (1691)

Danaparoidum natricum (2090)

Daunorubicini hydrochloridum (0662)

Deferiproni solutio peroralis (2987)

Deferoxamini mesilas (0896)

Demeclocyclini hydrochloridum (0176)*

Desfluranum (1666)

Desipramini hydrochloridum (0481)

Desloratadinum (2570)

Desmopressinum (0712)

Detomidini hydrochloridum ad usum veterinarium (1414)

Dexchlorpheniramini maleas (1196)

Diacereinum (2409)

Dibutylis phthalas (0762)

Diclofenacum kalicum (1508)

Diclofenacum natricum (1002)

Dicloxacillinum natricum monohydricum (0663)

Dicycloverini hydrochloridum (1197)

Diethylenglycoli monoethylicum etherum (1198)

Diethylenglycoli palmitostearas (1415)

Diethylis phthalas (0897)

Dihydrostreptomycini sulfas ad usum veterinarium (0485)

Dimethylis sulfoxidum (0763)*

Dimetindeni maleas (1417)

Dinatrii clodronas tetrahydricus (1777)

Diprophyllinum (0486)*

Docusatum natricum (1418)

62 ČL 2017 – Dopl. 2020


Doxorubicini hydrochloridum (0714)

Doxycyclini hyclas (0272)

Doxycyclinum monohydricum (0820)

Doxylamini hydrogenosuccinas (1589)

Duloxetini hydrochloridum (2594)

Edrophonii chloridum (2106)

Enalaprili maleas (1420)

Enilconazolum ad usum veterinarium (1720)

Enrofloxacinum ad usum veterinarium (2229)

Epirubicini hydrochloridum (1590)

Ergometrini maleas (0223)*

Erythromycini lactobionas (1098)

Erythropoietini solutio concentrata (1316)

Escitaloprami oxalas (2733)*

Estrogena coniugata (1512)

Ethacridini lactas monohydricus (1591)

Ethanolum 96% (V/V) (1317)

Ethanolum anhydricum (1318)

Ethylcellulosum (0822)

Ethylenglycoli monopalmitostearas (1421)

Etofenamatum (1513)

Eugenolum (1100)

Everolimusum (2918)

Exemestanum (2766)*

Factoris VIIa coagulationis humani (ADNr) solutio

concentrata (2534)

Factoris IX coagulationis humani (ADNr) solutio

concentrata (2522)

Felypressinum (1634)

Fenoteroli hydrobromidum (0901)

Fentanyli citras (1103)

Fenticonazoli nitras (1211)

Filgrastimi solutio concentrata (2206)

Filgrastimi solutio iniectabilis (2848)

Flucloxacillinum natricum monohydricum (0668)

Fluocortoloni pivalas (1212)*

Fluphenazini decanoas (1014)*

Fluphenazini enantas (1015)*

Follitropini solutio concentrata (2286)

Follitropinum (2285)

Foscarnetum natricum hexahydricum (1520)

Fosfomycinum dinatricum (1329)

Framycetini sulfas (0180)

Fulvestrantum (2443)

Gadobutrolum monohydricum (2735)

Gadodiamidum hydricum (2225)

Galactosum (1215)

Galantamini hydrobromidum (2366)

Gammadexum (2769)*

Gelatina (0330)

Gemcitabini hydrochloridum (2306)

Gentamicini sulfas (0331)

Glipizidum (0906)

Glucagonum humanum (1635)

Glyceroli dibehenas (1427)

Glyceroli distearas (1428)

Glyceroli monooctanoas (2213)

Glyceroli monooctanodecanoas (2392)

Glyceroli monostearas 40–55 (0495)

Glycerolum (0496)

Glycerolum 85% (0497)

Gonadorelini acetas (0827)

Gonadotropinum chorionicum (0498)

Gonadotropinum sericum equinum ad usum veterinarium

(0719)

Gossypii oleum hydrogenatum (1305)

Gramicidinum (0907)

Guaiacolum (1978)

Halothanum (0393)

Heparina massae molecularis minoris (0828)

Heparinum calcicum (0332)

Heparinum natricum (0333)

Heptaminoli hydrochloridum (1980)

Histidini hydrochloridum monohydricum (0910)

Hyaluronidasum (0912)

Hydroxychloroquini sulfas (2849)

Hydroxyethylamyla (1785)

Hydroxypropylamylum (2165)

Hydroxypropylamylum pregelificatum (2645)

Hyetellosum (0336)

Hyoscyamini sulfas dihydricus (0501)

Hyprolosum (0337)

Hyprolosum substitutum humile (2083)

Hypromellosum (0348)

Imidaclopridum ad usum veterinarium (2924)

Imipenemum monohydricum (1226)

Immunoglobulinum anti-T lymphocytorum ex animale

ad usum humanum (1928)

Immunoglobulinum humanum morbillicum (0397)

Infliximabum solutio concentrata (2928)

Insulinum aspartum (2084)

Insulinum glarginum (2571)

Insulinum humanum (0838)

Insulinum lisprum (2085)

Insulinum porcinum (1638)

Interferoni alfa-2 solutio concentrata (1110)

Interferoni beta-1a solutio concentrata (1639)

Interferoni gamma-1b solutio concentrata (1440)

Iohexolum (1114)

Iopamidolum (1115)

Irbesartanum (2465)

Irinotecani hydrochloridum trihydricum (2675)*

Isoprenalini hydrochloridum (1332)*

Isoprenalini sulfas dihydricus (0502)

Isopropylis myristas (0725)

Isopropylis palmitas (0839)

Isosorbidi dinitras dilutus (1117)*

Isosorbidi mononitras dilutus (1118)*

Isotridecanomacrogolum (2730)

Isoxsuprini hydrochloridum (1119)

Jecoris aselli oleum (typus A) (1192)

Jecoris aselli oleum (typus B) (1193)

Kalii clavulanas (1140)

Kalii dihydrogenophosphas (0920)

Kanamycini monosulfas monohydricus (0032)

Kanamycini sulfas acidus (0033)

Labetaloli hydrochloridum (0923)

Lactosum anhydricum (1061)

Lauromacrogolum (1124)

Lauromacrogolum 400 (2046)

Leuprorelinum (1442)

Levocabastini hydrochloridum (1484)

Texty

v evropské


Dopl. 2020

ČL 2017 – Dopl. 2020 63


Levocarnitinum (1339)*

Levodropropizinum (1535)

Levonorgestrelum (0926)*

Lincomycini hydrochloridum monohydricum (0583)

Lisinoprilum dihydricum (1120)*

Lomustinum (0928)

Loratadinum (2124)

Losartanum kalicum (2232)

Lynestrenolum (0558)

Macrogoli 30 dipolyhydroxystearas (2584)

Macrogoli 15 hydroxystearas (2052)

Magnesii hydrogenoaspartas dihydricus (1445)

Magnesii stearas (0229)

Maydis amylum (0344)

Maydis oleum raffinatum (1342)*

Meldonium dihydricum (2624)

Menadionum (0507)

Mepivacaini hydrochloridum (1242)

Mepyramini maleas (0278)

Mercaptopurinum monohydricum (0096)*

Meropenemum trihydricum (2234)

Mesterolonum (1730)

Metacresolum (2077)

Metformini hydrochloridum (0931)*

Methadoni hydrochloridum (0408)

Methanolum (1989)

Methylcellulosum (0345)

Methyleni chloridum (0932)

Methylis salicylas (0230)

Methylpyrrolidonum (1675)

Metoclopramidi hydrochloridum monohydricum (0674)

Mianserini hydrochloridum (0846)

Minocyclini hydrochloridum dihydricum (1030)

Molgramostimi solutio concentrata (1641)

Mometasoni furoas (1449)*

Naftidrofuryli hydrogenooxalas (1594)

Nandroloni decanoas (1992)*

Naphazolini hydrochloridum (0730)

Naphazolini nitras (0147)

Natrii aminosalicylas dihydricus (1993)

Natrii aurothiomalas (1994)

Natrii cetylo- et stearylosulfas (0847)

Natrii cyclamas (0774)

Natrii hyaluronas (1472)

Natrii lactatis S solutio (2033)

Natrii phenylbutyras (2183)

Natrii propionas (2041)

Natrii stearylis fumaras (1567)

Natrii sulfas decahydricus (0100)*

Neomycini sulfas (0197)

Neostigminii bromidum (0046)

Neostigminii metilsulfas (0626)

Netilmicini sulfas (1351)

Nevirapinum hemihydricum (2479)

Nicardipini hydrochloridum (2776)

Nomegestroli acetas (1551)*

Norfluranum (2257)

Nystatinum (0517)

Octyldodecanolum (1136)

Oenotherae oleum raffinatum (2104)

Olmesartanum medoxomilum (2600)

Olsalazinum dinatricum (1457)

Orphenadrini citras (1759)

Orphenadrini hydrochloridum (1760)

Oseltamiviri phosphas (2422)

Oxacillinum natricum monohydricum (2260)

Oxeladini citras (1761)

Oxfendazolum ad usum veterinarium (1458)*

Oxymetazolini hydrochloridum (0943)*

Oxytetracyclini hydrochloridum (0198)

Oxytetracyclinum dihydricum (0199)**

Oxytocini solutio concentrata (0779)

Oxytocinum (0780)

Paclitaxelum (1794)

Papaverini hydrochloridum (0102)

Pemetrexedum dinatricum heptahydricum (2637)

Penicillaminum (0566)

Pentoxifyllinum (0851)*

Perindoprilum erbuminum (2019)*

Permethrinum (1762)

Phenoxymethylpenicillinum (0148)**

Phenoxymethylpenicillinum kalicum (0149)**

Phentolamini mesilas (1138)

Phenylpropanolamini hydrochloridum (0683)

Phytomenadionum racemicum (3011)

Phytosterolum (1911)

Piperacillinum natricum (1168)

Piperazinum hexahydricum (0425)

Piscis oleum omega-3 acidis abundans (1912)

Plasma humanum ad separationem (0853)

Plasma humanum coagmentatum conditumque

ad exstinguendum virum (1646)

Poloxamera (1464)

Polymyxini B sulfas (0203)

Polysorbatum 80 (0428)

Polyvinylacetatis dispersio 30% (2152)

Polyvinylis acetas (1962)

Praeparata insulini iniectabilia (0854)*

Pramipexoli dihydrochloridum monohydricum (2416)

Praziquantelum (0855)

Prazosini hydrochloridum (0856)*

Prednicarbatum (1467)*

Primaquini diphosphas (0635)*

Procaini benzylpenicillinum monohydricum (0115)

Propanolum (2036)

Propofolum (1558)

Propranololi hydrochloridum (0568)

Propylenglycoli monopalmitostearas (1469)

Propylis gallas (1039)

Protamini sulfas (0569)

Protirelinum (1144)

Pyranteli embonas (1680)*

Pyridostigminii bromidum (1255)

Pyridoxini hydrochloridum (0245)

Pyrimethaminum (0288)*

Pyrrolidonum (2180)

Rabeprazolum natricum (2868)

Rabeprazolum natricum hydricum (2331)*

Raltegravirum kalicum (2887)

Ranitidini hydrochloridum (0946)**

Remifentanili hydrochloridum (2644)

Reserpinum (0528)

64 ČL 2017 – Dopl. 2020


Ricini oleum hydrogenatum (1497)*

Ricini oleum raffinatum (2367)

Ricini oleum virginale (0051)

Rifamycinum natricum (0432)

Rilmenidini phosphas (2020)

Rivastigmini hydrogenotartras (2630)

Rosuvastatinum calcicum (2631)*

Rupatadini fumaras (2888)

Saccharinum (0947)

Saccharinum natricum (0787).

Salmeteroli xinafoas (1765)

Sertralini hydrochloridum (1705)

Sevofluranum (2269)

Sildenafili citras (2270)

Sitagliptini phosphas monohydricus (2778)

Sitagliptini tabulettae (2927)

Sojae oleum hydrogenatum (1265)

Sojae oleum raffinatum (1473)

Solifenacini succinas (2779)

Solutiones ad conservationem partium corporis (1264)

Solutiones anticoagulantes et sanguinem humanum

conservantes (0209)

Somatostatinum (0949)

Somatropini solutio concentrata (0950)

Somatropini solutio iniectabilis (2370)

Somatropinum (0951)

Somatropinum pro iniectione (0952)

Spectinomycini dihydrochloridum pentahydricum (1152)

Spectinomycini sulfas tetrahydricus ad usum

veterinarium (1658)

Spiramycinum (0293)

Squalanum (1630)*

Stearopolypropylenglycolum (2602)

Streptokinasi solutio concentrata (0356)

Streptomycini sulfas (0053)

Sucralfatum (1796)

Sufentanili citras (1269)

Sulbactamum natricum (2209)

Sulfadimethoxinum natricum ad usum veterinarium (2745)

Sulfaguanidinum (1476)

Sulfamerazinum (0358)

Sulfamethizolum (0637)*

Sulfobutylbetadexum natrium (2804)

Sultamicillini tosilas dihydricus (2212)

Sultamicillinum (2211)

Sumatriptani succinas (1573)

Tacalcitolum monohydricum (2272)

Tacrolimusum monohydricum (2244)

Tadalafilum (2606)

Tamsulosini hydrochloridum (2131)

Terbutalini sulfas (0690)

Teriparatidum (2829)

Terpinum monohydricum (2940)

Testosteroni decanoas (1736)

Testosteroni enantas (1048)

Testosteroni isocaproas (1737)

Testosteronum (1373)*

Tetracyclini hydrochloridum (0210)

Tetryzolini hydrochloridum (2101)

Thiamazolum (1706)

Thiamini hydrochloridum (0303)

Thiamini nitras (0531)

Thiocolchicosidum ex ethanolo cristallisatum (2896)

Thiocolchicosidum hydricum (2814)*

Thiomersalum (1625)

Tianeptinum natricum (2022)

Tiapridi hydrochloridum (1575)

Ticarcillinum dinatricum (0956)

Tigecyclinum (2825)

Tilidini hydrochloridum hemihydricum (1767)

Tizanidini hydrochloridum (2578)

Tobramycinum (0645)

Tocoferoli alfa acetas (0439)

Tocoferoli alfa RRR acetas (1257)

Tocoferoli alfa acetatis pulvis (0691)

Tocoferoli alfa hydrogenosuccinas (1258)

Tocoferoli alfa RRR hydrogenosuccinas (1259)

Tocoferolum alfa (0692)

Tocoferolum alfa RRR (1256)

Tolterodini hydrogenotartras (2781)

Tosylchloramidum natricum trihydricum (0381)

Toxinum botulinicum typus A pro iniectione (2113)

Toxinum botulinicum typus B pro iniectione (2581)

Tributylis acetylcitras (1770)

Tributylis phosphas (1682)

Triethylis citras (1479)

Triglycerida media (0868)

Trimebutini maleas (2182)

Trimetazidini dihydrochloridum (1741)

Trimethoprimum (0060)

Tritici amylum (0359)

Tritici oleum raffinatum (1379)

Tritici oleum virginale (1480)

Trolaminum (1577)

Troxerutinum (2133)

Tuberculini aviarii derivatum proteinosum purificatum

(0535)

Tuberculini bovini derivatum proteinosum purificatum

(0536)

Tylosini phosphas ad usum veterinarium (2802)

Tylosini tartras ad usum veterinarium (1274)

Tylosinum ad usum veterinarium (1273)

Urofollitropinum (0958)

Urokinasum (0695)

Valsartanum (2423)

Vancomycini hydrochloridum (1058)

Vardenafili hydrochloridum trihydricum (2782)

Vecuronii bromidum (1769)

Vigabatrinum (2305)

Vinblastini sulfas (0748)

Vincristini sulfas (0749)

Vindesini sulfas (1276)

Vinorelbini ditartras (2107)

Voriconazolum (2576)

Xylitolum (1381)

Xylometazolini hydrochloridum (1162)*

Zanamivirum hydricum (2611)*

Ziprasidoni mesilas trihydricus (2649)

Zolpidemi tartras (1280)*

Texty

v evropské


Dopl. 2020

ČL 2017 – Dopl. 2020 65


Vakcíny pro humánní použití

Vaccinum anthracis adsorbatum ab colato culturarum

ad usum humanum (2188)

Vaccinum diphtheriae adsorbatum (0443)

Vaccinum diphtheriae, cum contento reducto antigeni,

adsorbatum (0646)

Vaccinum diphtheriae et tetani adsorbatum (0444)

Vaccinum diphtheriae et tetani, cum contento reducto

antigeni(orum), adsorbatum (0647)

Vaccinum diphtheriae, tetani et pertussis ex cellulis integris

adsorbatum (0445)


ex elementis praeparatum adsorbatum (1931)


ex elementis praeparatum, cum contento reducto

antigeni (antigenorum), adsorbatum (2764)

Vaccinum diphtheriae, tetani et poliomyelitidis

(inactivatum), cum contento reducto antigeni(orum),

adsorbatum (2328)


ex elementis praeparatum adsorbatum et haemophili

stirpe b coniugatum (1932)


ex elementis praeparatum et hepatitidis B (ADNr)

adsorbatum (1933)


ex elementis praeparatum et poliomyelitidis inactivatum

adsorbatum (1934)



(inactivatum), cum contento reducto antigeni

(antigenorum), adsorbatum (2329)



poliomyelitidis inactivatum adsorbatum

et haemophili stirpe b coniugatum (2067)


ex elementis praeparatum, poliomyelitidis inactivatum

adsorbatum et haemophili stirpe b coniugatum (2065)

Vaccinum febris flavae vivum (0537)**

Vaccinum febris typhoidis polysaccharidicum (1160)

Vaccinum influenzae inactivatum ex cellulis corticisque

antigeniis praeparatum (2149)

Vaccinum influenzae inactivatum ex cellulis virisque

integris praeparatum (2308)


praeparatum (0869)


praeparatum virosomale (2053)

Vaccinum influenzae inactivatum ex viris integris

praeparatum (0159)

Vaccinum influenzae inactivatum ex virorum fragmentis

praeparatum (0158)

Vaccinum influenzae vivum intranasale (2772)**

Vaccinum morbillorum, parotitidis, rubellae et varicellae

vivum (2442)

Vaccinum pertussis sine cellulis copurificatum adsorbatum

(1595)

Vaccinum pertussis sine cellulis ex elementis praeparatum

adsorbatum (1356)

Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum (0966)

Vaccinum poliomyelitidis inactivatum (0214)

Vaccinum poliomyelitidis perorale (0215)

Vaccinum tetani adsorbatum (0452)

Vaccinum varicellae vivum (0648)

Vaccinum zonae vivum (2418)


Vaccinum adenovirosis caninae vivum (1951)**

Vaccinum anaemiae infectivae pulli vivum (2038)**

Vaccinum bronchitidis infectivae aviariae inactivatum

(0959)**

Vaccinum bronchitidis infectivae aviariae vivum (0442)**

Vaccinum bursitidis infectivae aviariae inactivatum

(0960)**

Vaccinum bursitidis infectivae aviariae vivum (0587)**

Vaccinum calicivirosis felinae vivum (1102)**

Vaccinum coccidiosidis vivum ad pullum (2326)**

Vaccinum diarrhoeae vituli coronaviro illatae inactivatum

(1953)**

Vaccinum diarrhoeae vituli rotaviro illatae inactivatum

(1954)**

Vaccinum encephalomyelitidis infectivae aviariae vivum

(0588)**

Vaccinum hepatitidis viralis anatis stirpe I vivum (1315)**

Vaccinum laryngotracheitidis infectivae aviariae vivum

(1068)**

Vaccinum morbi Aujeszkyi ad suem inactivatum (0744)**

Vaccinum morbi Aujeszkyi ad suem vivum ad usum

parenteralem (0745)**

Vaccinum morbi Carrei vivum ad canem (0448)**

Vaccinum morbi Carrei vivum ad mustelidas (0449)**

Vaccinum morbi haemorrhagici cuniculi inactivatum

(2325)**

Vaccinum morbi Marek vivum (0589)**

Vaccinum morbi oris rubri inactivatum ad Oncorhynchum

mykissem (1950) 12

Vaccinum morbi partus diminutionis MCMLXXVI

inactivatum ad pullum (1202)**

Vaccinum myxomatosidis vivum ad cuniculum (1943)**

Vaccinum panleucopeniae felinae infectivae vivum

(0251)**

Vaccinum parainfluenzae viri bovini vivum (1176)**

Vaccinum parainfluenzae viri canini vivum (1955)**

Vaccinum paramyxoviris 3 aviarii ad meleagrem

inactivatum (1392)**

Vaccinum parvovirosis caninae vivum (0964)**

Vaccinum parvovirosis inactivatum ad suem (0965)**

Vaccinum pestis anatis vivum (1938)**

Vaccinum pestis classicae suillae vivum ex cellulis

(0065)**

Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum (0870)**

Vaccinum pseudopestis aviariae vivum (0450)**

Vaccinum rabiei perorale vivum ad vulpem et nyctereutem

(0746)**

––––––––––––––––––––––––––––––

12

v ČL 2017 Vaccinum yersiniosidis ad salmonideos inactivatum

66 ČL 2017 – Dopl. 2020


Vaccinum rhinotracheitidis infectivae bovinae vivum

(0696)**

Vaccinum rhinotracheitidis infectivae vivum ad meleagrem

(2461)**

Vaccinum rhinotracheitidis viralis felinae vivum (1206)**

Vaccinum tenosynovitidis viralis aviariae vivum (1956)**

Vaccinum variolae gallinaceae vivum (0649)**

Vaccinum viri syncytialis meatus spiritus bovini vivum

(1177)**

Imunoséra pro humánní použití

Immunoserum botulinicum (0085)

Immunoserum contra venena viperarum europaearum

(0145)


Rostlinné drogy: úvod (90029) 13

Achyranthis bidentatae radix (2999)

Akebiae caulis (2472)

Aloes extractum siccum normatum (0259)

Amomi fructus (2554)

Amomi fructus rotundus (2555)

Anisi stellati fructus (1153)

Aurantii dulcis pericarpii etheroleum (1811)

Belladonnae pulvis normatus (0222)

Calendulae flos (1297)*

Capsici acris extractum spissum normatum (2529)

Cinnamomi cassiae etheroleum (1496)

Cinnamomi zeylanici corticis etheroleum (1501)

Citri reticulatae etheroleum (2355)

Crataegi fructus (1220)*

Curcumae longae rhizoma (2543)

Cynarae folium (1866)

Foeniculi amari fructus (0824)

Foeniculi dulcis fructus (0825)

Fraxini rhynchophyllae cortex (2452)*

Gentianae tinctura (1870)

Hibisci sabdariffae flos (1623)

Hydrastidis radix (1831)

Juniperi etheroleum (1832)

Mastix (1876)

Myristicae etheroleum (1552)

Myrrhae tinctura (1877)

Ophiopogonis tuber (3000)*

Opii tinctura normata (1841)

Origani herba (1880)

Persicariae tinctoriae folium (2727)

Piperis longi fructus (2453)

Piperis fructus (2477)

Salviae tinctura (1889)

Sennae folium (0206)*

Sennae fructus (0207) 14 *

Serenoae extractum (2579)

Serenoae fructus (1848)

Stramonii folii pulvis normatus (0247)

Thymi typo thymolo etheroleum (1374)

Zingiberis rhizoma (1522)


Homeopatické přípravky: úvod (90006) 15

Amanita phalloides ad praeparata homeopathica (2290)

Anamirta cocculus ad praeparata homeopathica (2486)

Atropa belladonna ad praeparata homeopathica (2489)

Delphinium staphisagria ad praeparata homeopathica

(2289)

Hydrastis canadensis ad praeparata homeopathica (2500)

Magnesii fluoridum ad praeparata homeopathica (2676)*

Magnesii hydrogenophosphas trihydricus ad praeparata

homeopathica (2505)

Semecarpus anacardium ad praeparata homeopathica

(2094)

Strychnos ignatii ad praeparata homeopathica (2513)

Strychnos nux-vomica ad praeparata homeopathica (2514)

Radiofarmaka a výchozí materiál pro radiofarmaka

Cholini ([ 11 C]methyl) solutio iniectabilis (2462)

Cupri tetramibi tetrafluoroboras ad radiopharmaceutica

(2547)

Fluorocholini ( 18 F) solutio iniectabilis (2793)

Technetii ( 99m Tc) mebrofenini solutio iniectabilis (2393)*

Chirurgická šicí vlákna pro použití u člověka

Chirurgická šicí vlákna pro použití u člověka: úvod

(90004) 16 *

Fila non resorbilia sterilia (0324)

ERRATA

Texty, které v Evropském lékopise nemají opravu, ale jsou

opraveny v Českém lékopise a nově přetištěny.

Obecné statě

2.1.4 Síta

5.1.10 Pokyny pro použití zkoušky na bakteriální

endotoxiny

Články

Ammonii glycyrrhizas (1772)

Hydrocodoni hydrogenotartras dihemihydricus (1784)

Olanzapinum (2258)


Myrtilli fructus recens (1602)

Myrtilli fructus recentis extractum siccum raffinatum

et normatum (2394)

Texty

v evropské


Dopl. 2020

––––––––––––––––––––––––––––––

13

v ČL 2017 Úvod

14

v ČL 2017 Sennae acutifoliae fructus

15

v ČL 2017 Úvod

16

v ČL 2017 Úvod

ČL 2017 – Dopl. 2020 67


k 1.7.2020

VYPUŠTĚNÉ

2.6.24 Ptačí virové vakcíny: zkoušky na cizí agens

v inokulech

2.6.25 Ptačí živé virové vakcíny: zkoušky na cizí agens

v šaržích konečného přípravku

k 1.4.2020

Insulinum bovinum (1637)

Sennae angustifoliae fructus (0208)

k 1.7.2019

Dihydroergotamini tartras (0600)

Filum polyamidicum-6/6 sterile in fuso ad usum

veterinarium (0610)

Filum polyamidicum-6 sterile in fuso ad usum veterinarium

(0609)

k 1.4.2019

Aqua valde purificata (1927)

Chlorpropamidum (1087)

Oxprenololi hydrochloridum (0628)

k 1. 1. 2019

2.6.9 Zkouška na neškodnost

Desoxycortoni acetas (0322)

Emetini dihydrochloridum pentahydricum (0081)

Phytomenadionum (1036)

k 1. 1. 2018

Vaccinum cholerae (0154)

Vaccinum cholerae cryodesiccatum (0155)

Vaccinum febris typhoidis cryodesiccatum (0157)

k 1. 7. 2017

2.6.19 Zkouška neurovirulence vakcíny proti

poliomyelitidě (perorální)

k 1. 4. 2017

2.2.60 Teplota tání – instrumentální metoda

68 ČL 2017 – Dopl. 2020

IV TEXTY ČL 2017 – DOPL. 2019

IV TEXTY ČL 2017 - DOPL. 2019

Obecné statě

NOVÉ

9.7 2.2.63 Přímá ampérometrická a pulzní

elektrochemická detekce

9.7 2.6.36 Mikrobiologické zkoušení živých


stanovení počtu mikrobiálních

kontaminatů

9.7 2.6.38 Mikrobiologické zkoušení živých


zkoušky na specifikované

mikroorganismy

9.8 2.8.24 Index pěnění

Obecné články

9.7 Producta biotherapeutica viva ad usum humanum

(3053)

Články

9.6 Acidum zoledronicum monohydricum (2743)

9.7 Atazanaviri sulfas (2898)

9.6 Benzathini phenoxymethylpenicillinum

tetrahydricum (2636)

9.7 Boldinum (2971)

9.7 Deferiproni solutio peroralis (2987)

9.8 Deferiproni tabulettae (2986)

9.7 Dexamfetamini sulfas (2752)

9.7 Esomeprazolum natricum (2923)

9.7 Everolimusum (2918)

9.8 Filgrastimi solutio iniectabilis (2848)

9.8 Fingolimodi hydrochloridum (2988)

9.6 Imidaclopridum ad usum veterinarium (2924)

9.6 Infliximabum solutio concentrata (2928)

9.7 Lacosamidi solutio infundibilis (2991)

9.7 Lacosamidi solutio peroralis (2990)

9.8 Lacosamidi tabulettae (2989)

9.8 Levofloxacinum hemihydricum (2598)

9.7 Magnesii aluminometasilicas (2854)

9.8 Mebeverini hydrochloridum (2097)

9.8 Nilotinibi hydrochloridum monohydricum (2993)

9.6 Phytomenadionum racemicum (3011)

9.6 Podophyllotoxinum (2750)

9.8 Regorafenibum monohydricum (3012)

9.6 Rotigotinum (3014)

9.6 Solutiones concentratae pro haemofiltratione

et haemodiafiltratione (2770)

9.8 Sulfobutylbetadexum natrium (2804)

9.7 Terpinum monohydricum (2940)


9.8 Vaccinum meningococcale classium A, C, W135

et Y coniugatum (3066)

Rostlinné drogy

9.7 Achyranthis bidentatae radix (2999)

9.7 Corydalis tuber (2976)

9.6 Gastrodiae tuber (2721)

9.7 Ligustici radix et rhizoma (2431)

9.8 Ophiopogonis tuber (3000)

9.6 Sophorae flavescentis radix (2440)

9.7 Typhae pollis (2937)

Homeopatika

9.6 Digitalis purpurea ad praeparata homeopathica

(2705)


9.7 Fluorodopae ( 18 F) ab nucleophila substitutione

solutio iniectabilis (2481)

9.7 Yttrii ( 90 Y) chloridi solutio ad radiosignandum

(2803)

Chirurgická šicí vlákna pro použití u zvířat

9.8 Filum polyamidi sterile in fuso ad usum

veterinarium (3083)

Obecné statě


9.6 2.2.9 Měření kapilárním viskozimetrem

9.6 2.2.17 Teplota skápnutí

9.7 2.2.24 Absorpční spektrofotometrie

v infračervené oblasti

9.6 2.2.28 Plynová chromatografie

9.6 2.2.29 Kapalinová chromatografie

9.6 2.2.30 Vylučovací chromatografie

9.8 2.2.32 Ztráta sušením

9.8 2.2.35 Osmolalita

9.6 2.2.38 Konduktivita

9.8 2.3.2 Totožnost mastných olejů tenkovrstvou

chromatografií

9.6 2.4.20 Stanovení elementárních nečistot

9.7 2.4.29 Mastné kyseliny v olejích bohatých na

omega-3-kyseliny

9.8 2.5.32 Mikrostanovení vody

9.8 2.6.20 Hemaglutininy anti-A a anti-B

9.7 2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti

antibiotik

9.7 2.7.14 Stanovení účinnosti vakcíny proti

hepatitidě A

9.8 2.7.16 Stanovení účinnosti bezbuněčné vakcíny

proti dávivému kašli

9.8 2.8.12 Silice v rostlinných drogách

9.6 2.8.13 Zbytky pesticidů

9.8 2.9.10 Stanovení ethanolu

9.8 2.9.11 Stanovení methanolu a propan-2-olu

9.7 2.9.23 Stanovení hustoty pevných látek

plynovým pyknometrem

9.7 2.9.31 Analýza velikosti částic laserovou

difrakcí

9.7 2.9.33 Charakterizace krystalických a částečně

krystalických pevných látek

rentgenovou práškovou difrakcí

(XRPD)

9.7 2.9.34 Sypná hustota a setřesná hustota prášků

9.7 2.9.35 Jemnost prášků

Texty

v ČL 2017

– Dopl. 2019

ČL 2017 – Dopl. 2020 69


9.7 2.9.39 Interakce voda-pevná látka: stanovení

izoterem sorpce-desorpce a aktivity

vody

9.6 3.1.1.1 Materiály na bázi měkčeného

polyvinylchloridu pro obaly na

lidskou krev a krevní složky

9.6 3.1.1.2 Materiály na bázi měkčeného

polyvinylchloridu pro hadičky

používané v soupravách pro transfuzi

krve a krevních složek

9.6 3.1.13 Přísady do polymerů

9.6 3.1.14 Materiály na bázi měkčeného

polyvinylchloridu pro obaly na vodné

roztoky k infuzi

9.6 3.2.1 Skleněné obaly pro farmaceutické použití

9.6 3.2.3 Sterilní obaly z plastů na lidskou krev

a krevní složky

9.6 3.2.4 Prázdné sterilní obaly z měkčeného


a krevní složky

9.6 3.2.5 Sterilní obaly z měkčeného


obsahující antikoagulační roztok

9.8 4.1.1 Zkoumadla

9.8 4.1.2 Základní roztoky pro limitní stanovení

nečistot

9.8 4.1.3 Tlumivé roztoky

9.8 4.2.1 Základní látky pro odměrné roztoky

9.8 4.2.2 Odměrné roztoky

9.7 5.1.4 Mikrobiologická jakost nesterilních

léčivých přípravků a látek pro

farmaceutické použití

9.7 5.1.8 Mikrobiologická jakost rostlinných

léčivých produktů pro perorální

použití a extraktů pro jejich přípravu

9.7 5.8 Harmonizace lékopisu

9.7 5.14 Léčivé přípravky pro přenos genů pro

humánní použití

9.8 5.22 Názvy rostlinných drog používaných

v tradiční čínské medicíně

9.7 5.23 Články pro extrakty z rostlinných drog

(informační stať)

9.6 5.24 Chemické zobrazování

Obecné články

9.6 Immunosera ex animale ad usum humanum (0084)

9.7 Plantarum medicinalium extracta (0765)

9.7 Praeparata pharmaceutica (2619)

9.7 Producta ab ADN recombinante (0784)

9.6 Producta allergenica (1063)


9.6 Granula (0499)

9.6 Praeparata pharmaceutica in vasis cum pressu

(0523)

9.6 Styli (1154)

Články

9.8 Acaciae gummi dispersione desiccatum (0308)

9.8 Acidum ascorbicum (0253)

9.8 Acidum mefenamicum (1240)

9.6 Acidum methacrylicum et ethylis acrylas

polymerisatum 1:1 (1128)

9.8 Acidum tolfenamicum (2039)

9.7 Acetonum (0872)

9.6 Albendazolum (1386)

9.7 Alfentanili hydrochloridum hydricum 1 (1062)

9.7 Amfetamini sulfas (0368)

9.6 Amikacini disulfas (1290)

9.7 Amiloridi hydrochloridum dihydricum (0651)

9.6 Amisulpridum (1490)

9.6 Ammonio methacrylatis copolymerum A (2081)

9.6 Ammonio methacrylatis copolymerum B (2082)

9.7 Amorolfini hydrochloridum (2756)

9.6 Aprotinini solutio concentrata (0579)

9.6 Aprotininum (0580)

9.6 Arachidis oleum hydrogenatum (1171)

9.6 Arachidis oleum raffinatum (0263)

9.8 Asparaginum monohydricum (2086)

9.6 Azithromycinum hydricum (1649)

9.6 Bacitracinum (0465)

9.6 Bacitracinum zincum (0466)

9.6 Benzathini benzylpenicillinum tetrahydricum 2

(0373)

9.7 Betacarotenum (1069)

9.8 Betadexum (1070)

9.6 Butylscopolaminii bromidum (0737)

9.7 Calcii folinas hydricus (0978)

9.6 Calcii hydrogenophosphas anhydricus (0981)

9.7 Calcii levofolinas hydricus 3 (1606)

9.8 Calcii pantothenas (0470)

9.6 Calcifediolum monohydricum (1295)

9.6 Calcipotriolum anhydricum (2011)

9.6 Calcipotriolum monohydricum (2284)

9.8 Carboplatinum (1081)

9.7 Cefazolinum natricum (0988)

9.7 Cellulae stirpes haematopoieticae humanae (2323)

9.7 Cellulosi acetas (0887)

9.6 Cellulosum microcristallinum (0316)

9.7 Chloramphenicolum (0071)

9.6 Chlorobutanolum anhydricum (0382)

9.6 Chlorobutanolum hemihydricum (0383)

9.8 Chlorprothixeni hydrochloridum (0815)

9.6 Cinchocaini hydrochloridum (1088)

9.7 Closantelum natricum dihydricum ad usum

veterinarium (1716)

9.6 Colecalciferolum densatum oleosum (0575)

9.6 Colistini sulfas (0320)

9.7 Crospovidonum (0892)

9.6 Cystinum (0998)

9.6 Cytarabinum (0760)

9.8 Desfluranum (1666)

9.6 Dextrinum (1507)

9.6 Dihydrostreptomycini sulfas ad usum veterinarium

(0485)

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

v ČL 2017 Alfentanili hydrochloridum

2

v ČL 2017 Benzathini benzylpenicillinum

3

v ČL 2017 Calcii levofolinas pentahydricus

70 ČL 2017 – Dopl. 2020


9.6 Dihydrotachysterolum (2014)

9.7 Dikalii clorazepas monohydricus 4 (0898)

9.7 Dosulepini hydrochloridum (1314)

9.8 Doxazosini mesilas (2125)

9.6 Ebastinum (2015)

9.7 Entecavirum monohydricum (2815)

9.7 Ergocalciferolum (0082)

9.8 Erythritolum (1803)

9.6 Erythropoietini solutio concentrata (1316)

9.8 Etanerceptum (2895)

9.8 Ethacridini lactas monohydricus (1591)

9.6 Ethosuximidum (0764)

9.7 Ethylcellulosum (0822)

9.7 Fibrini glutinum (0903)

9.8 Filgrastimi solutio concentrata (2206)

9.8 Flupentixoli dihydrochloridum (1693)

9.6 Follitropini solutio concentrata (2286)

9.6 Follitropinum (2285)

9.8 Fructosum (0188)

9.6 Galantamini hydrobromidum (2366)

9.7 Glipizidum (0906)

9.8 Glucosamini sulfas et kalii chloridum (2708)

9.8 Glucosamini sulfas et natrii chloridum (2447)

9.6 Glycerolum (0496)

9.6 Glycerolum 85% (0497)

9.6 Goserelinum (1636)

9.6 Granisetroni hydrochloridum (1695)

9.7 Griseofulvinum (0182)

9.6 Guaifenesinum (0615)

9.8 Heparina massae molecularis minoris (0828)

9.0 Histidini hydrochloridum monohydricum (0910)

9.0 Histidinum (0911)

9.8 Hydrocortisoni acetas (0334)

9.6 Hydroxyethylamyla (1785)

9.6 Hypromellosum (0348)

9.6 Ibuprofenum (0721)

9.6 Imatinibi mesilas (2736)

9.7 Indometacinum (0092)

9.8 Inositolum (1805)

9.6 Ipratropii bromidum monohydricum (0919)

9.8 Isomaltum (1531)

9.6 Kalii sulfas (1622)

9.6 Kanamycini monosulfas monohydricus (0032)

9.6 Kanamycini sulfas acidus (0033)

9.8 Lactitolum monohydricum (1337)

9.8 Lactulosi solutio (0924)

9.8 Lactulosum (1230)

9.8 Lauromacrogolum (1124)

9.6 Levocarnitinum (1339)

9.6 Lidocaini hydrochloridum monohydricum (0227)

9.8 Loperamidi hydrochloridum (0929)

9.8 Macrogoli stearas (1234)

9.8 Magnesii pidolas (1619)

9.8 Maltitolum (1235)

9.8 Maltitolum liquidum (1236)

9.8 Mannitolum (0559)

9.8 Megluminum (2055)

9.6 Mepivacaini hydrochloridum (1242)

9.8 Mesalazinum (1699)

9.6 Methylcellulosum (0345)

9.8 Methylis salicylas (0230)

9.8 Methylthioninii chloridum hydricum (1132)

9.7 Miconazoli nitras (0513)

9.7 Miconazolum (0935)

9.6 Milbemycinum oximum ad usum veterinarium

(2536)

9.8 Moxifloxacini hydrochloridum (2254)

9.7 Mupirocinum calcicum dihydricum (1451)

9.7 Mupirocinum (1450)

9.8 Natrii ascorbas (1791)

9.6 Natrii hydrogenophosphas dodecahydricus (0118)

9.7 Natrii molybdas dihydricus (1565)

9.6 Natrii sulfas anhydricus (0099)

9.6 Natrii sulfas decahydricus (0100)

9.7 Nicergolinum (1998)

9.0 Norethisteroni acetas (0850)

9.7 Norfloxacinum (1248)

9.7 Nortriptylini hydrochloridum (0941)

9.6 Nystatinum (0517)

9.8 Oxaliplatinum (2017)

9.8 Oxfendazolum ad usum veterinarium (1458)

9.7 Paclitaxelum (1794)

9.6 Pantoprazolum natricum sesquihydricum (2296)

9.8 Parnaparinum natricum (1252)

9.6 Pentobarbitalum (0200)

9.6 Pentobarbitalum natricum (0419)

9.6 Phenytoinum (1253)

9.6 Phenytoinum natricum (0521)

9.7 Phloroglucinolum anhydricum (2301)

9.7 Phloroglucinolum dihydricum (2302)

9.8 Phospholipida ex ovo ad iniectabile (2315)

9.8 Phospholipida ex soia ad iniectabile (2316)

9.7 Poloxamera (1464)

9.7 Polymyxini B sulfas (0203)

9.8 Prazosini hydrochloridum (0856)

9.6 Primaquini diphosphas (0635)

9.8 Procaini benzylpenicillinum monohydricum (0115)

9.8 Prochlorperazini maleas (0244)

9.7 Proguanili hydrochloridum (2002)

9.6 Protamini sulfas (0569)

9.7 Pyrimethaminum (0288)

9.6 Quetiapini fumaras (2541)

9.8 Ramiprilum (1368)

9.6 Ranitidini hydrochloridum (0946)

9.7 Ricini oleum raffinatum (2367)

9.6 Rifamycinum natricum (0432)

9.6 Ropiniroli hydrochloridum (2604)

9.7 Saccharinum (0947)

9.7 Saccharinum natricum (0787)

9.7 Sertralini hydrochloridum (1705)

9.7 Simvastatinum (1563)

9.6 Solutiones pro dialysi peritoneali (0862)

9.6 Solutiones pro haemodialysi (0128)

9.6 Solutiones pro haemofiltratione

et haemodiafiltratione (0861)

9.8 Sorbitolum (0435)

9.8 Sorbitolum liquidum cristallisabile (0436)

9.8 Sorbitolum liquidum non cristallisabile (0437)

Texty

v ČL 2017

– Dopl. 2019

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

4

v ČL 2017 Dikalii clorazepas

ČL 2017 – Dopl. 2020 71


9.8 Sorbitolum liquidum partim dehydricum (2048)

9.8 Spironolactonum (0688)

9.6 Streptokinasi solutio concentrata (0356)

9.6 Streptomycini sulfas (0053)

9.8 Teicoplaninum (2358)

9.7 Telmisartanum (2154)

9.7 Temozolomidum (2780)

9.6 Tigecyclinum (2825)

9.6 Toxinum botulinicum typus A pro iniectione (2113)

9.6 Toxinum botulinicum typus B pro iniectione (2581)

9.8 Trandolaprilum (2245)

9.0 Triethylis citras (1479)

9.8 Valacicloviri hydrochloridum anhydricum (1768)

9.8 Valacicloviri hydrochloridum hydricum (2751)

9.8 Vancomycini hydrochloridum (1058)

9.8 Xylazini hydrochloridum ad usum veterinarium

(1481)


9.6 Vaccinum anthracis adsorbatum ab colato

culturarum ad usum humanum (2188)

9.8 Vaccinum diphtheriae, tetani et pertussis sine

cellulis ex elementis praeparatum adsorbatum

(1931)

9.8 Vaccinum diphtheriae, tetani et pertussis sine

cellulis ex elementis praeparatum, cumcontento

reducto antigeni (antigenorum), adsorbatum

(2764)

9.8 Vaccinum diphtheriae, tetani, pertussis sine cellulis

ex elementis praeparatum adsorbatum



ex elementis praeparatum et hepatitidis B

(ADNr) adsorbatum (1933)



inactivatum adsorbatum (1934)



(inactivatum), cum contento reducto antigeni

(antigenorum), adsorbatum (2329)



poliomyelitidis inactivatum adsorbatum



ex elementis praeparatum, poliomyelitidis

inactivatum adsorbatum et haemophili stirpe b

coniugatum (2065)

9.6 Vaccinum encephalitidis ixodibus advectae

inactivatum (1375)

9.6 Vaccinum febris flavae vivum (0537)

9.6 Vaccinum febris typhoidis (0156)

9.6 Vaccinum febris typhoidis polysaccharidicum

(1160)

9.6 Vaccinum haemophili stirpe b coniugatum (1219)

9.6 Vaccinum hepatitidis A inactivatum adsorbatum

(1107)

9.6 Vaccinum hepatitidis A inactivatum adsorbatum

et febris typhoidis polysaccharidicum (2597)

9.6 Vaccinum hepatitidis A inactivatum et hepatitidis B

(ADNr) adsorbatum (1526)

9.6 Vaccinum hepatitidis A inactivatum virosomale

(1935)

9.6 Vaccinum hepatitidis B (ADNr) (1056)

9.8 Vaccinum influenzae inactivatum ex cellulis

corticisque antigeniis praeparatum (2149)

9.8 Vaccinum influenzae inactivatum ex cellulis

virisque integris praeparatum (2308)

9.8 Vaccinum influenzae inactivatum ex corticis

antigeniis praeparatum (0869)

9.8 Vaccinum influenzae inactivatum ex corticis

antigeniis praeparatum virosomale (2053)

9.8 Vaccinum influenzae inactivatum ex viris integris

praeparatum (0159)

9.8 Vaccinum

influenzae inactivatum ex virorum fragmentis

praeparatum (0158)

9.6 Vaccinum meningococcale classis C coniugatum

(2112)

9.6 Vaccinum meningococcale polysaccharidicum

(0250)

9.6 Vaccinum morbillorum vivum (0213)

9.6 Vaccinum morbillorum, parotitidis et rubellae vivum

(1057)

9.6 Vaccinum morbillorum, parotitidis, rubellae

et varicellae vivum (2442)

9.6 Vaccinum papillomaviri humani (ADNr) (2441)

9.6 Vaccinum parotitidis vivum (0538)

9.8 Vaccinum pertussis sine cellulis copurificatum

adsorbatum (1595)

9.8 Vaccinum pertussis sine cellulis ex elementis

praeparatum adsorbatum (1356)

9.6 Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum

(0966)

9.6 Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum

coniugatum adsorbatum (2150)

9.6 Vaccinum poliomyelitidis inactivatum (0214)

9.6 Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum

(0216)

9.6 Vaccinum rubellae vivum (0162)

9.6 Vaccinum varicellae vivum (0648)

9.6 Vaccinum variolae vivum (0164)

9.6 Vaccinum zonae vivum (2418)


9.8 Vaccinum bursitidis infectivae aviariae vivum

(0587)

9.8 Vaccinum influenzae equinae inactivatum (0249)

Rostlinné drogy

9.8 Acaciae gummi (0307)

9.8 Agni casti fructus extractum siccum (2309)

9.6 Akebiae caulis (2472)

9.8 Alchemillae herba (1387)

9.6 Allii sativi bulbus pulveratus (1216)

9.7 Atractylodis lanceae rhizoma (2560)

9.7 Atractylodis macrocephalae rhizoma (2559)

9.8 Aurantii dulcis pericarpii etheroleum (1811)

9.8 Cynosbati fructus (1510)

9.6 Evodiae fructus (2718)

72 ČL 2017 – Dopl. 2020


9.8 Ginseng radix (1523)

9.6 Harpagophyti radix (1095)

9.6 Isatidis radix (2566)

9.8 Juniperi fructus (1532)

9.6 Marrubii herba (1835)

9.8 Matricariae flos (0404)

9.7 Menthae piperitae etheroleum (0405)

9.7 Myrtilli fructus recentis extractum siccum

raffinatum et normatum (2394)

9.6 Myrtilli fructus recens (1602)

9.6 Myrtilli fructus siccus (1588)

9.8 Notoginseng radix (2383)

9.8 Pini pumilionis etheroleum (2377)

9.6 Platycodonis radix (2660)

9.8 Polygalae radix (0202)

9.7 Puerariae lobatae radix (2434)

9.7 Puerariae thomsonii radix (2483)

9.8 Serenoae extractum (2579)

9.7 Serenoae fructus (1848)

9.6 Silybi mariani extractum siccum raffinatum

et normatum (2071)

9.6 Trigonellae foenugraeci semen (1323)

Homeopatika

9.8 Acidum succinicum ad praeparata homeopathica

(2824)


9.7 Cholini ([ 11 C]methyl) solutio iniectabilis (2462)

9.7 Fluorocholini ( 18 F) solutio iniectabilis (2793)

9.6 Gallii ( 68 Ga) edotreotidi solutio iniectabilis (2482)

9.8 Technetii ( 99m Tc) mebrofenini solutio iniectabilis

(2393)

k 1.7.2019

VYPUŠTĚNÉ

Dihydroergotamini tartras (0600)

Filum polyamidicum-6/6 sterile in fuso ad usum

veterinarium (0610)

Filum polyamidicum-6 sterile in fuso ad usum veterinarium

(0609)

k 1.4.2019

Aqua valde purificata (1927)

Chlorpropamidum (1087)

Oxprenololi hydrochloridum (0628)

k 1. 1. 2019

2.6.9 Zkouška na neškodnost

Desoxycortoni acetas (0322)

Emetini dihydrochloridum pentahydricum (0081)

Phytomenadionum (1036)

k 1. 1. 2018




k 1. 7. 2017



k 1. 4. 2017


Texty

v ČL 2017

– Dopl. 2019


9.8 Filum bombycis tortum sterile in fuso ad usum

veterinarium (0606)

9.8 Filum lini sterile in fuso ad usum veterinarium

(0608)

ČL 2017 – Dopl. 2020 73



Obecné statě

NOVÉ

9.1 2.6.34 Obsah bílkovin hostitelských buněk

9.2 5.1.11 Stanovení baktericidního, fungicidního

nebo levurocidního účinku antiseptických

léčivých produktů

9.3 5.2.14 Náhrada in vivo stanovení kontroly jakosti

vakcín in vitro metodami

9.3 5.24 Chemické zobrazování

Rostlinné drogy

9.3 Andrographidis herba (2712)

9.4 Bupleuri radix (2562)

9.4 Camelliae sinensis non fermentata folia (2668)

9.1 Coptidis rhizoma (2715)

9.2 Dioscoreae nipponicae rhizoma (2890)

9.2 Evodiae fructus (2718)

9.4 Houttuyniae herba (2722)

9.4 Ligustici sinensis rhizoma (2634)

9.1 Lycopi herba (2723)

9.3 Magnoliae biondii flos immaturus (2742)

9.4 Mate folium (2678)

9.4 Paeoniae suffruticosae radicis cortex (2474)

9.4 Pauliniae semen (2669)

9.4 Platycodonis radix (2660)

Radiofarmaka

9.4 Cholini ([ 11 C]methyl) solutio iniectabilis (2462)

9.3 Lutetii ( 177 Lu) chloridi solutio ad radiosignandum

(2798)

9.3 Natrii pertechnetatis ( 99m Tc) acceleratore formati

solutio iniectabilis (2891)

9.2 Natrii pyrophosphas decahydricus

ad radiopharmaceutica (2552)

Homeopatika

9.5 Acidum succinicum ad praeparata homeopathica

(2824)

9.3 Ammonii carbonas ad praeparata homeopathica

(2916)

9.5 Calcii fluoridum ad praeparata homeopathica (2996)

9.2 Selenium ad praeparata homeopathica (2844)

Články

9.3 Acetylenum 1% in nitrogenio intermixtum (2903)

9.4 Acidum formicum (2809)

9.3 Carbonei monoxidum 5% in nitrogenio intermixtum

(2904)

9.5 Deferipronum (2236)

9.5 Etanerceptum (2895)

9.3 Factoris IX coagulationis humani (ADNr) pulvis

pro solutione iniectabili (2994)

9.5 Fipronilum ad usum veterinarium (2869)

9.1 Gadodiamidum hydricum (2225)

9.4 Gammadexum (2769)

9.2 Isopropylis isostearas (2867)

9.5 Lacosamidum (2992)

9.3 Methanum 2% in nitrogenio intermixtum (2905)

9.2 Milbemycinum oximum ad usum veterinarium

(2536)

9.5 Mometasoni furoas monohydricus (2858)

9.3 Nicardipini hydrochloridum (2776)

9.2 Phospholipida ex ovo ad iniectabile (2315)

9.4 Phospholipida ex soia ad iniectabile (2316)

9.5 Raltegraviri tabulettae (2938)

9.5 Raltegraviri tabulettae manducabiles (2939)

9.4 Raltegravirum kalicum (2887)

9.2 Remifentanili hydrochloridum (2644)

9.3 Rupatadini fumaras (2888)

9.4 Saccharosum liquidum (2797)

9.3 Tacrolimusum monohydricum (2244)

9.2 Terlipressinum (2646)

9.4 Tigelcyclinum (2887)

9.3 Tylosini phosphas ad usum veterinarium (2802)

9.5 Zolmitriptanum (2737)

Obecné statě


9.2 1 Všeobecné zásady (1.1 až 1.6)

9.3 2.1.6 Detekční trubičky pro plyny

9.2 2.2.1 Čirost a stupeň opalescence tekutin

9.5 2.2.7 Optická otáčivost

9.4 2.2.8 Viskozita

9.1 2.2.14 Teplota tání – kapilární metoda

9.4 2.2.32 Ztráta sušením

9.3 2.2.37 Rentgenová fluorescenční spektrometrie

9.2 2.2.46 Chromatografické separační metody

9.3 2.2.49 Metody měření viskozimetrem s padající

kuličkou a automatickým

viskozimetrem s valící se kuličkou 1

9.3 2.2.56 Analýza aminokyselin

9.4 2.4.2 Arsen

9.5 2.4.20 Stanovení elementárních nečistot 2

9.4 2.4.31 Nikl v hydrogenovaných rostlinných

olejích

9.4 2.5.12 Semimikrostanovení vody

9.4 2.5.32 Mikrostanovení vody

9.3 2.6.14 Bakteriální endotoxiny

9.4 2.6.16 Zkouška na cizí agens v humánních

virových vakcínách

9.3 2.6.17 Zkouška antikomplementární aktivity

imunoglobulinu

9.2 2.6.27 Mikrobiologická kontrola buněčných

přípravků 3

9.2 2.6.30 Zkouška aktivace monocytů

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

v ČL 2017 Měření viskozimetrem s padající kuličkou

2

v ČL 2017 Stanovení reziduí kovových katalyzátorů nebo kovových reakčních činidel

3

v ČL 2017 Mikrobiologická kontrola buněčných produktů

74 ČL 2017 – Dopl. 2020


9.3 2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti

antibiotik

9.1 2.7.5 Stanovení účinnosti heparinu

9.3 2.7.9 Zkouška na Fc funkci imunoglobulinu

9.1 2.9.14 Stanovení měrné plochy povrchu

průnikem vzduchu

9.1 2.9.40 Stejnoměrnost dávkových jednotek

9.4 3.1.3 Polyolefiny

9.2 3.1.4 Polyethylen bez přísad pro obaly

parenterálních a očních přípravků

9.4 3.1.5 Polyethylen s přísadami pro obaly


9.4 3.1.6 Polypropylen pro obaly a uzávěry


9.2 3.1.7 Poly(ethylen – vinyl-acetát) pro obaly

a hadičky přípravků parenterální

výživy

9.5 3.2.9 Pryžové uzávěry obalů na vodné,

práškové a lyofilizované parenterální

přípravky

9.1-5 4 Zkoumadla

9.2 5.1.1 Metody přípravy sterilních produktů

9.2 5.1.2 Biologické indikátory a příbuzné

mikrobiální přípravky použité

k výrobě sterilních produktů 4

9.2 5.1.6 Alternativní metody kontroly

mikrobiologické jakosti

9.3 5.2.3 Buněčné substráty pro produkci

humánních vakcín

9.2 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických

zkoušek

9.5 5.4 Zbytková rozpouštědla

9.2 5.7 Tabulka fyzikálních vlastností

radionuklidů


9.5 5.12 Referenční standardy

9.2 5.15 Funkční charakteristiky pomocných látek

9.3 5.20 Elementární nečistoty 5

9.4 5.22 Názvy rostlinných drog používaných

v tradiční čínské medicíně

Obecné články

9.3 Corpora ad usum pharmaceuticum (2034)

9.2 Plantae medicinales (1433)

9.5 Praeparata pharmaceutica (2619)

RZ 6 Producta fermentationis (1468)

9.5 Vaccina ad usum humanum (0153)

9.5 Vaccina ad usum veterinarium (0062)


9.2 Poznámky (1502)

9.4 Capsulae (0016)

9.3 Gummi manducabilia medicinalia (1239)

9.4 Inhalanda (0671)

9.3 Inserta intraruminalia (1228)

9.3 Liquida cutanea ad usum veterinarium (1808)

9.3 Liquida peroralia (0672)

9.3 Oromucosalia (1807)

9.3 Tabulettae (0478)


9.5 Vaccinum diphtheriae, tetani, pertussis ex cellulis

integris, poliomyelitidis inactivatum adsorbatum



ex elementis praeparatum adsorbatum et

haemophili stirpe b coniugatum (1932)



poliomyelitidis inactivatum adsorbatum et

haemophili stirpe b coniugatum (2067)


ex elementis praeparatum, poliomyelitidis

inactivatum adsorbatum et haemophili stirpe b

coniugatum (2065)

9.5 Vaccinum haemophili stirpe b coniugatum (1219)

9.1 Vaccinum poliomyelitidis perorale (0215)


9.5 Vaccinum anaemiae infectivae pulli vivum (2038)

9.5 Vaccinum aphtharum epizooticarum inactivatum ad

ruminantes (0063)

9.2 Vaccinum furunculosidis ad salmonideos

inactivatum cum adiuvatione oleosa ad

iniectionem (1521)

9.2 Vaccinum vibriosidis ad salmonideos inactivatum

(1581)

9.2 Vaccinum vibriosidis aquae frigidae ad salmonideos

inactivatum (1580)

9.2 Vaccinum yersiniosidis ad salmonideos inactivatum

(1950)


9.2 Acanthopanacis gracilistyli radicis cortex 7 (2432)

9.3 Angelicae dahuricae radix (2556)

9.3 Angelicae pubescentis radix (2557)

9.1 Angelicae sinensis radix (2558)

9.2 Anisi fructus (0262)

9.2 Astragali mongholici radix (2435)

9.2 Aucklandiae radix (1797)

9.2 Belladonnae folii extractum siccum normatum (1294)

9.2 Belladonnae folii tinctura normata (1812)

9.2 Belladonnae folium (0221)

9.2 Belladonnae pulvis normatus (0222)

9.3 Clematidis armandii caulis (2463)

9.3 Codonopsidis radix (2714)

9.2 Coicis semen (2454)

9.4 Cynarae folii extractum siccum (2389)

9.4 Cynarae folium (1866)

9.2 Drynariae rhizoma (2563)

9.2 Ecliptae herba (2564)

9.2 Eucommiae cortex (2412)

Texty

v ČL 2017

– Dopl. 2018

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

4

v ČL 2017 Biologické indikátory pro sterilizaci

5

v ČL 2017 Rezidua kovových katalyzátorů nebo reakčních kovových činidel

6

Rychlé zezávaznění od 1. 4. 2018

7

v ČL 2017 Acanthopanacis gracilistyli cortex

ČL 2017 – Dopl. 2020 75


9.2 Fumariae herba (1869)

9.2 Gummiresina myrrha (1349)

9.5 Lavandulae etheroleum (1338)

9.5 Lavandulae flos (1534)

9.5 Lavandulae latifoliae etheroleum (2419)

9.3 Lycii fructus (2612)

9.2 Magnoliae officinalis cortex (2567)

9.3 Magnoliae officinalis flos (2568)

9.2 Menthae piperitae folii extractum siccum (2382)

9.2 Menthae piperitae folium (0406)

9.2 Myrrhae tinctura (1877)

9.2 Polygoni orientalis fructus (2726)

9.3 Puerariae lobatae radix (2434)

9.3 Puerariae thomsonii radix (2483)

9.1 Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma (2663)

9.1 Schisandrae chinensis fructus (2428)

9.2 Stramonii folii pulvis normatus (0247)

9.2 Stramonii folium (0246)

9.4 Terebinthinae etheroleum (1627)

9.3 Uncariae rhynchophyllae ramulus cum uncis (2729)

9.1 Valerianae radix (0453)

9.1 Valerianae radix minutata (2526)

Radiofarmaka

9.2 Acidum medronicum ad radiopharmaceutica (2350)

9.3 Calcii trinatrii pentetas hydricus ad

radiopharmaceutica (2353)

9.2 Cupri tetramibi tetrafluoroboras ad


9.3 Fluoroethyl-L-tyrosini ( 18 F) solutio iniectabilis (2466)

9.2 Iobenguani sulfas ad radiopharmaceutica (2351)

9.2 Natrii iodohippuras dihydricus ad


9.2 Technetii ( 99m Tc) bicisatis solutio iniectabilis (2123)

9.2 Technetii ( 99m Tc) mebrofenini solutio iniectabilis

(2393)

9.2 Technetii ( 99m Tc) sestamibi solutio iniectabilis (1926)

9.2 Tetra-O-acetylmannosi triflas ad radiopharmaceutica

(2294)

Homeopatika

9.1 Praeparata homeopathica (1038)

9.1 Granula homeopathica imbuta (2079)

9.2 Via praeparandi stirpes homeopathicas et

potentificandi (2371)

9.5 Amanita phalloides ad praeparata homeopathica

(2290)

9.5 Arseni sesquioxidum ad praeparata homeopathica

(1599)

9.2 Atropa belladonna ad praeparata homeopathica

(2489)

9.1 Histaminum ad praeparata homeopathica (2671)

9.5 Natrii tetrachloroauras dihydricus ad praeparata

homeopathica (2141)

9.3 Strychnos ignatii ad praeparata homeopathica (2513)

9.3 Strychnos nux-vomica ad praeparata homeopathica

(2514)

Články

9.3 Aceclofenacum (1281)


9.3 Acidum asparticum (0797)

9.0 Acidum citricum monohydricum (0456)

9.5 Acidum folicum hydricum 8 (0067)

9.3 Acidum nicotinicum (0459)

9.5 Acitretinum (1385)

9.4 Albendazolum (1386)

9.4 Alcohol benzylicus (0256)

9.3 Alcohol polyvinylicus (1961)

9.3 Alfadexum (1487)

9.1 Alfuzosini hydrochloridum (1287)

9.3 Aluminii magnesii silicas (1388)

9.3 Alverini citras (2156)

9.2 Ambroxoli hydrochloridum (1489)

9.2 Amiloridi hydrochloridum dihydricum (0651)

9.3 Anastrozolum (2406)

9.1 Aqua pro iniectione (0169)

9.4 Aqua purificata (0008)

9.1 Atenololum (0703)

9.3 Atropinum (2056)

9.3 Atropini sulfas monohydricus (0068)

9.3 Azithromycinum hydricum 9 (1649)

9.1 Bacitracinum (0465)

9.1 Bacitracinum zincum (0466)

9.4 Benzocainum (0011)

9.2 Benzylpenicillinum kalicum (0113)

9.2 Benzylpenicillinum natricum (0114)


9.3 Betamethasoni dipropionas (0809)

9.5 Biotinum (1073)

9.1 Bromhexini hydrochloridum (0706)

9.5 Butylscopolaminii bromidum (0737)

9.4 Carbidopum monohydricum (0755)

9.1 Carboxymethylamylum natricum A (0983)

9.1 Carboxymethylamylum natricum B (0984)

9.4 Carmellosum calcicum (0886)

9.2 Cefepimi dihydrochloridum monohydricum (2126)

9.4 Cefiximum trihydricum (1188)

9.4 Cefprozilum monohydricum (2342)

9.3 Ceftazidimum pentahydricum (1405)

9.3 Ceftazidimum pentahydricum et natrii carbonas pro

iniectione (2344)

9.2 Cefuroximum axetilum (1300)


9.1 Chloramphenicolum (0071)

9.4 Chlorhexidini diacetas (0657)

9.3 Chlorhexidini digluconatis solutio (0658)

9.4 Chlorhexidini dihydrochloridum (0659)

9.2 Cholesterolum ad usum parenteralem (2397)

9.4 Cimetidini hydrochloridum (1500)

9.4 Cimetidinum (0756)

9.4 Cisatracurii besilas (2763)

9.3 Citaloprami hydrobromidum (2288)

9.3 Citaloprami hydrochloridum (2203)

9.4 Clarithromycinum (1651)

9.3 Clemastini fumaras (1190)

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

8

v ČL 2017 Acidum folicum

9

v ČL 2017 Azithromycinum

76 ČL 2017 – Dopl. 2020


9.3 Clindamycini hydrochloridum (0582)

9.5 Clomifeni citras (0997)

9.5 Codeini hydrochloridum dihydricum (1412)

9.5 Codeini phosphas hemihydricus (0074)

9.5 Codeinum monohydricum (0076)

9.4 Colchicinum (0758)

9.4 Colistimethatum natricum (0319)

9.4 Copolymerum methacrylatis butylati basicum (1975)

9.3 Copovidonum (0891)

9.3 Deferoxamini mesilas (0896)

9.2 Dembrexini hydrochloridum monohydricum

ad usum veterinarium (2169)

9.4 Dextranum 1 pro iniectione (1506)


9.1 Dicycloverini hydrochloridum (1197)

9.2 Dihydralazini sulfas dihemihydricus (1310)

9.2 Dinoprostonum (1311)


9.2 Enrofloxacinum ad usum veterinarium (2229)

9.3 Erythromycini ethylsuccinas (0274)

9.2 Erythromycini lactobionas (1098)

9.3 Esketamini hydrochloridum (1742)

9.1 Estradiolum hemihydricum (0821)

9.5 Estriolum (1203)



9.1 Etoposidum (0823)

9.5 Factoris VIIa coagulationis humani (ADNr) solutio

concentrata (2534)

9.3 Factoris IX coagulationis humani (ADNr) solutio

concentrata (2522)

9.4 Fentanyli citras (1103)

9.4 Fentanylum (1210)

9.3 Filgrastimi solutio concentrata (2206)

9.2 Fluorouracilum (0611)

9.5 Follitropini solutio concentrata (2286)

9.5 Follitropinum (2285)

9.2 Foscarnetum natricum hexahydricum (1520)

9.4 Furosemidum (0391)

9.4 Gabapentinum (2173)

9.3 Gadobutrolum monohydricum (2735)

9.3 Gefitinibum (2866)

9.3 Gelatina (0330)

9.5 Gemfibrozilum (1694)

9.5 Glucosamini hydrochloridum (2446)



9.1 Glucosum anhydricum (0177)

9.1 Glucosum monohydricum (0178)

9.2 Glyceroli monostearas 40-55 (0495)

9.1 Glyceromacrogoli laurates (1231)

9.1 Glyceromacrogoli linoleates (1232)

9.1 Glyceromacrogoli octanodecanoates (1184)

9.1 Glyceromacrogoli oleates (1249)

9.1 Glyceromacrogoli stearates (1268)

9.4 Gonadorelini acetas (0827)

9.4 Gonadotropinum chorionicum (0498)


9.3 Heparinum calcicum (0332)

9.3 Heparinum natricum (0333)

9.2 Hydralazini hydrochloridum (0829)

9.3 Hydroxychloroquini sulfas (2849)

9.5 Hydroxyzini dihydrochloridum (0916)

9.3 Hyetellosum (0336)

9.5 Hyprolosum substitutum humile (2083)

9.2 Imatinibi mesilas (2736)

9.4 Imipenemum monohydricum (1226)

9.3 Insulinum bovinum (1637)

9.5 Insulinum glarginum (2571)

9.3 Insulinum porcinum (1638)

9.5 Interferoni beta-1a solutio concentrata (1639)

9.3 Irinotecani hydrochloridum trihydricum (2675)

9.4 Isomaltum (1531)

9.5 Isoniazidum (0146)

9.5 Isotretinoinum (1019)

9.4 Kalii hydroxidum (0840)

9.4 Labetaloli hydrochloridum (0923)

9.3 Lactitolum monohydricum (1337)

9.3 Lactosum anhydricum (1061)

9.3 Lactosum monohydricum (0187)

9.5 Lactulosi solutio (0924)

9.5 Lactulosum (1230)

9.3 Lansoprazolum (2219)

9.4 Levetiracetamum (2535)

9.3 Levocabastini hydrochloridum (1484)

9.3 Magnesii hydrogenoaspartas dihydricus (1445)

9.0 Magnesii oxidum leve 10 (0040)

9.2 Mangani sulfas monohydricus (1543)


9.4 Meclozini dihydrochloridum (0622)

9.2 Mesnum (1674)

9.4 Methylprednisoloni acetas (0933)

9.4 Methylrosanilinii chloridum (1990)

9.4 Metoclopramidi hydrochloridum monohydricum

(0674)

9.4 Metoclopramidum (1348)

9.2 Minocyclini hydrochloridum dihydricum (1030)

9.5 Molgramostimi solutio concentrata (1641)

9.5 Mometasoni furoas (1449)

9.1 Montelukastum natricum (2583)

9.5 Nadroparinum calcicum (1134)

9.3 Naloxoni hydrochloridum dihydricum (0729)

9.4 Natrii cetylo- et stearylosulfas (0847)

9.1 Natrii laurilsulfas (0098)

9.5 Neostigminii metilsulfas (0626)

9.2 Netilmicini sulfas (1351)

9.3 Nevirapinum anhydricum (2255)

9.4 Nicergolinum (1998)

9.3 Norepinephrini hydrochloridum (0732)

9.3 Norepinephrini tartras monohydricus (0285)



9.4 Octyldodecanolum (1136)

9.3 Olivae oleum raffinatum (1456)

9.3 Olivae oleum virginale (0518)

9.2 Omega-3 acidorum esteri ethylici 90 (1250)

Texty

v ČL 2017

– Dopl. 2018

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

10

v ČL 2017 Magnesii oxidum levis

ČL 2017 – Dopl. 2020 77


9.2 Oseltamiviri phosphas (2422)


9.4 Paracetamolum (0049)

9.5 Paraffinum liquidum (0239)

9.5 Paraffinum perliquidum (0240)

9.1 Phenoxymethylpenicillinum (0148)

9.1 Phenoxymethylpenicillinum kalicum (0149)

9.1 Pholcodinum monohydricum (0522)

9.5 Pimobendanum ad usum veterinarium 11 (2179)

9.2 Plasma humanum coagmentatum conditumque ad

exstinguendum virum (1646)

9.2 Polysorbatum 80 (0428)

9.3 Polyvinylacetatis dispersio 30% (2152)

9.3 Polyvinylis acetas (1962)

9.2 Povidonum (0685)

9.3 Prednisonum (0354)

9.2 Pregabalinum (2777)

9.4 Prilocaini hydrochloridum (1363)

9.4 Prilocainum (1362)

9.3 Primidonum (0584)

9.2 Procaini benzylpenicillinum monohydricum (0115)

9.2 Proguanili hydrochloridum (2002)

9.2 Propylenglycoli dilauras (2087)



9.1 Sesami oleum raffinatum (0433)

9.5 Sevofluranum (2269)

9.2 Sildenafili citras (2270)

9.1 Sitagliptini phosphas monohydricus (2778)

9.3 Sojae oleum raffinatum (1473)

9.3 Solifenacini succinas (2779)

9.5 Somatropinum (0951)

9.5 Somatropini solutio concentrata (0950)

9.5 Somatropinum pro iniectione (0952)

9.1 Sorbitani lauras (1040)

9.1 Sorbitani oleas (1041)

9.1 Sorbitani palmitas (1042)

9.1 Sorbitani sesquioleas (1916)

9.1 Sorbitani stearas (1043)

9.1 Sorbitani trioleas (1044)

9.2 Spiramycinum (0293)

9.5 Stearopolypropylenglycolum (2602)

9.4 Sucralfatum (1796)

9.2 Sucralosum (2368)

9.4 Sulfadimethoxinum (2741)

9.4 Sulfadimethoxinum natricum ad usum veterinarium

(2745)

9.2 Sulfasalazinum (0863)


9.4 Tenoxicamum (1156)

9.3 Thiocolchicosidum ex ethanolo cristallisatum (2896)

9.3 Thiocolchicosidum hydricum (2814)

9.3 Tiotropii bromidum monohydricum (2420)

9.3 Trimebutini maleas (2182)

9.3 Troxerutinum (2133)

9.3 Tylosini phosphatis solutio ad usum veterinarium

(1661)

9.3 Tylosini tartras ad usum veterinarium (1274)

9.3 Tylosinum ad usum veterinarium (1273)

9.4 Urofollitropinum (0958)

9.4 Urokinasum (0695)



9.1 Vecuronii bromidum (1769)

9.3 Vindesini sulfas (1276)

9.4 Vinorelbini ditartras (2107)

9.3 Vitamini A pulvis (0218)

9.3 Vitaminum A densatum oleosum (0219)

9.3 Vitaminum A in aqua dispergibile (0220)

9.2 Xanthani gummi (1277)

Chirurgická šicí vlákna pro použití u člověka

9.5 Fila non resorbilia sterilia (0324)


9.5 Filum ethyleni polyterephtalici sterile in fuso ad

usum veterinarium (0607)

9.5 Filum polyamidicum-6/6 sterile in fuso ad usum

veterinarium (0610)

9.5 Filum polyamidicum-6 sterile in fuso ad usum

veterinarium (0609)

k 1. 1. 2018

VYPUŠTĚNÉ




k 1. 7. 2017



k 1. 4. 2017


––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

11

v ČL 2017 Pimobendanum

78 ČL 2017 – Dopl. 2020

IV TEXTY ČL 2017

IV TEXTY ČL 2017

NOVÉ


Obecné statě

9.0 2.7.35 Stanovení účinnosti/obsahu složek

vakcíny nefelometricky

9.0 2.8.25 Vysokoúčinná tenkovrstvá

chromatografie pro rostlinné drogy

a přípravky z rostlinných drog

9.0 5.2.12 Vstupní suroviny biologického původu

pro produkci léčivých přípravků pro

buněčnou a genovou terapii

9.0 5.2.13 Zdravé chovy kuřat pro produkci

inaktivovaných vakcín pro veterinární

použití


9.0 Vaccinum rhinotracheitidis infectivae bovinae

inactivatum (2674)

Obecné statě

9.0 2.2.27 Tenkovrstvá chromatografie

9.0 2.4.24 Totožnost a kontrola zbytkových

rozpouštědel

9.0 2.5.28 Voda v plynech

9.0 2.9.6 Obsahová stejnoměrnost jednodávkových

lékových forem

9.0 4 Zkoumadla

9.0 5.2.3 Buněčné substráty pro produkci

humánních vakcín


Obecné články

9.0 Producta allergenica (1063)

9.0 Vaccina ad usum humanum (0153)

9.0 Vaccina ad usum veterinarium (0062)

Texty

ČL 2017


9.0 Akebiae caulis (2472)

9.0 Codonopsidis radix (2714)

9.0 Gardeniae fructus (2565)

9.0 Hippocastani semen (1830)

9.0 Hippocastani seminis extractum siccum normatum

(1829)

9.0 Paeoniae radix alba (2424)

9.0 Paeoniae radix rubra (2425)

9.0 Polygoni cuspidati rhizoma et radix (2724)

9.0 Polygoni orientalis fructus (2726)

9.0 Uncariae rhynchophyllae ramulus cum uncis (2729)

9.0 Zanthoxyli bungeani pericarpium (2656)


9.0 Magnesii fluoridum ad praeparata homeopathica

(2676)

Alergeny

9.0 Acari ad producta allergenica (2625)

9.0 Fragmenta epithelii phaneraeque bestiarum ad

producta allergenica (2621)

9.0 Hymenopteri venena ad producta allergenica (2623)

9.0 Mucores ad producta allergenica (2626)

9.0 Pollines ad producta allergenica (2627)

Články (Monografie)

9.0 Aprepitantum (2757)

9.0 Clopidogreli besilas (2790)

9.0 Clopidogreli hydrochloridum (2791)

9.0 Escitalopramum (2758)

9.0 Hydroxychloroquini sulfas (2849)

9.0 Irinotecani hydrochloridum trihydricum (2675)

9.0 Tacalcitolum monohydricum (2272)


9.0 Teriparatidum (2829)


9.0 Pulveres adspersorii (1166)

9.0 Tampona medicata (1155)


9.0 Vaccinum adenovirosis caninae inactivatum (1298)

9.0 Vaccinum anaemiae infectivae pulli vivum (2038)

9.0 Vaccinum aphtharum epizooticarum inactivatum ad

ruminantes (0063)

9.0 Vaccinum bronchitidis infectivae aviariae

inactivatum (0959)

9.0 Vaccinum bursitidis infectivae aviariae inactivatum

(0960)

9.0 Vaccinum calicivirosis felinae inactivatum (1101)

9.0 Vaccinum chlamydiosis felinae inactivatum (2324)

9.0 Vaccinum cholerae aviariae inactivatum (1945)

9.0 Vaccinum colibacillosis fetus a partu recentis

inactivatum ad ruminantes (0961)

9.0 Vaccinum colibacillosis fetus a partu recentis

inactivatum ad suem (0962)

9.0 Vaccinum diarrhoeae viralis bovinae inactivatum

(1952)

9.0 Vaccinum diarrhoeae vituli coronaviro illatae

inactivatum (1953)

9.0 Vaccinum diarrhoeae vituli rotaviro illatae

inactivatum (1954)

9.0 Vaccinum erysipelatis suillae inactivatum (0064)

9.0 Vaccinum furunculosidis ad salmonideos

inactivatum cum adiuvatione oleosa ad

iniectionem (1521)

9.0 Vaccinum herpesviris equini inactivatum (1613)

9.0 Vaccinum influenzae equinae inactivatum (0249)

9.0 Vaccinum influenzae inactivatum ad suem (0963)

9.0 Vaccinum leptospirosis bovinae inactivatum (1939)

9.0 Vaccinum leptospirosis caninae inactivatum (0447)

9.0 Vaccinum leucosis felinae inactivatum (1321)

9.0 Vaccinum mannheimiae inactivatum ad bovidas

(1944)

ČL 2017 – Dopl. 2020 79

IV TEXTY ČL 2017

9.0 Vaccinum mannheimiae inactivatum ad ovem

(1946)

9.0 Vaccinum morbi Aujeszkyi ad suem inactivatum

(0744)

9.0 Vaccinum morbi haemorrhagici cuniculi inactivatum

(2325)

9.0 Vaccinum morbi partus diminutionis MCMLXXVI

inactivatum ad pullum (1202)

9.0 Vaccinum Mycoplasmatis galliseptici inactivatum

(1942)

9.0 Vaccinum panleucopeniae felinae infectivae

inactivatum (0794)

9.0 Vaccinum paramyxoviris 3 aviarii ad meleagrem

inactivatum (1392)

9.0 Vaccinum parvovirosis caninae inactivatum (0795)

9.0 Vaccinum parvovirosis inactivatum ad suem (0965)

9.0 Vaccinum pasteurellae inactivatum ad ovem (2072)

9.0 Vaccinum pneumoniae enzooticae suillae

inactivatum (2448)

9.0 Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum (0870)

9.0 Vaccinum rabiei inactivatum ad usum

veterinarium (0451)

9.0 Vaccinum rhinotracheitidis viralis felinae

inactivatum (1207)

9.0 Vaccinum Salmonellae Enteritidis ad pullum

inactivatum (1947)

9.0 Vaccinum Salmonellae Typhimurium ad pullum

inactivatum (2361)

9.0 Vaccinum vibriosidis ad salmonideos inactivatum

(1581)

9.0 Vaccinum vibriosidis aquae frigidae ad salmonideos

inactivatum (1580)

9.0 Vaccinum yersiniosidis ad salmonideos

inactivatum (1950)


9.0 Iobenguani sulfas ad radiopharmaceutica (2351)


9.0 Aloe capensis (0258)

9.0 Betulae folium (1174)

9.0 Chamomillae romanae flos (0380)

9.0 Cyamopsidis seminis pulvis (1218)

9.0 Hyperici herba (1438)

9.0 Hyperici herbae extractum siccum quantificatum

(1874)

9.0 Mastix (1876)

9.0 Prunellae spica (2439)

9.0 Rhamni purshianae extractum siccum normatum

(1844)

9.0 Rusci radix (1847)


9.0 Praeparata homeopathica (1038)

9.0 Granula ad praeparata homeopathica (2153)

9.0 Tincturae maternae ad praeparata homeopathica

(2029)

9.0 Via praeparandi stirpes homeopathicas et

potentificandi (2371)

9.0 Amanita phalloides ad praeparata homeopathica

(2290)

9.0 Barii chloridum dihydricum ad praeparata

homeopathica (2142)

9.0 Calcii iodidum tetrahydricum ad praeparata

homeopathica (2144)

9.0 Hedera helix ad praeparata homeopathica (2092)

9.0 Hydrastis canadensis ad praeparata homeopathica

(2500)

9.0 Hyoscyamus niger ad praeparata homeopathica

(2091)

9.0 Hypericum perforatum ad praeparata homeopathica

(2028)

9.0 Magnesii hydrogenophosphas trihydricus ad

praeparata homeopathica (2505)

9.0 Natrii tetrachloroauras dihydricus ad praeparata

homeopathica (2141)

9.0 Strychnos ignatii ad praeparata homeopathica (2513)

9.0 Strychnos nux-vomica ad praeparata homeopathica

(2514)

9.0 Sulfur ad praeparata homeopathica (2515)

Články (Monografie)

9.0 Abacaviri sulfas (2589)

9.0 Acaciae gummi dispersione desiccatum (0308)

9.0 Acamprosatum calcicum (1585)

9.0 Acarbosum (2089)

9.0 Acebutololi hydrochloridum (0871)

9.0 Aceclofenacum (1281)

9.0 Acemetacinum (1686)

9.0 Acesulfamum kalicum (1282)

9.0 Acetazolamidum (0454)

9.0 Acetylcholini chloridum (1485)

9.0 Acetylcysteinum (0967)

9.0 Acetyltryptophanum racemicum (1383)

9.0 Acetyltyrosinum (1384)

9.0 Acidum aceticum glaciale 1 (0590)

9.0 Acidum acetylsalicylicum (0309)

9.0 Acidum adipicum (1586)

9.0 Acidum alginicum (0591)

9.0 Acidum amidotrizoicum dihydricum (0873)

9.0 Acidum 4-aminobenzoicum (1687)

9.0 Acidum aminocaproicum (0874)


9.0 Acidum asparticum (0797)

9.0 Acidum benzoicum (0066)

9.0 Acidum boricum (0001)

9.0 Acidum chenodeoxycholicum (1189)

9.0 Acidum citricum anhydricum (0455)

9.0 Acidum citricum monohydricum (0456)

9.0 Acidum edeticum (1612)

9.0 Acidum etacrynicum (0457)

9.0 Acidum glutamicum (0750)

9.0 Acidum hydrochloricum concentratum 2 (0002)

9.0 Acidum hydrochloricum dilutum 3 (0003)

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

v ČL 2009 Acidum aceticum 99%

2

v ČL 2009 Acidum hydrochloricum 35%

3

v ČL 2009 Acidum hydrochloricum 10%

80 ČL 2017 – Dopl. 2020

IV TEXTY ČL 2017

9.0 Acidum ioxaglicum (2009)

9.0 Acidum lacticum (0458)

9.0 Acidum lacticum S (1771)

9.0 Acidum lactobionicum (1647)

9.0 Acidum maleicum (0365)

9.0 Acidum malicum racemicum (2080)

9.0 Acidum nalidixicum (0701)

9.0 Acidum nicotinicum (0459)

9.0 Acidum niflumicum (2115)

9.0 Acidum nitricum 4 (1549)

9.0 Acidum octanoicum (1401)

9.0 Acidum oxolinicum (1353)

9.0 Acidum phosphoricum concentratum 5 (0004)

9.0 Acidum phosphoricum dilutum 6 (0005)

9.0 Acidum pipemidicum trihydricum (1743)

9.0 Acidum salicylicum (0366)

9.0 Acidum sorbicum (0592)

9.0 Acidum stearicum (1474)

9.0 Acidum sulfuricum (1572)

9.0 Acidum tartaricum (0460)

9.0 Acidum tiaprofenicum (1157)

9.0 Acidum tranexamicum (0875)

9.0 Acidum ursodeoxycholicum (1275)

9.0 Acidum valproicum (1378)

9.0 Acitretinum (1385)

9.0 Adapalenum (2445)

9.0 Adeninum (0800)

9.0 Adeps lanae hydrogenatus (0969)

9.0 Alaninum (0752)

9.0 Alcohol polyvinylicus (1961)

9.0 Alfadexum (1487)

9.0 Algeldratum (0311)

9.0 Allopurinolum (0576)

9.0 Almagatum (2010)

9.0 Alprenololi hydrochloridum (0876)

9.0 Aluminii chloridum hexahydricum (0971)

9.0 Aluminii hydroxidum hydricum ad adsorptionem

(1664)

9.0 Aluminii phosphas hydricus (1598)

9.0 Aluminii phosphatis gelatum (2166)

9.0 Aluminii sulfas hydricus (0165)

9.0 Alverini citras (2156)

9.0 Amantadini hydrochloridum (0463)

9.0 Ambroxoli hydrochloridum (1489)

9.0 Aminoglutethimidum (1291)

9.0 Aminophyllinum anhydricum (0300)

9.0 Aminophyllinum hydricum (0301)

9.0 Amiodaroni hydrochloridum (0803)

9.0 Amisulpridum (1490)

9.0 Amitriptylini hydrochloridum (0464)

9.0 Ammoniae solutio concentrata (0877)

9.0 Ammonii bromidum (1389)

9.0 Ammonii chloridum (0007)

9.0 Ammonii glycyrrhizas (1772)

9.0 Ammonii hydrogenocarbonas (1390)

9.0 Ammonio methacrylatis copolymerum A (2081)

9.0 Ammonio methacrylatis copolymerum B (2082)

9.0 Amorolfini hydrochloridum (2756)

9.0 Amoxicillinum natricum (0577)

9.0 Ampicillinum anhydricum (0167)

9.0 Ampicillinum natricum (0578)

9.0 Amylum pregelificatum (1267)

9.0 Antazolini hydrochloridum (0972)

9.0 Arginini aspartas (2096)

9.0 Arginini hydrochloridum (0805)

9.0 Argininum (0806)

9.0 Articaini hydrochloridum (1688)

9.0 Ascorbylis palmitas (0807)

9.0 Asparaginum monohydricum (2086)

9.0 Aspartamum (0973)

9.0 Atomoxetini hydrochloridum (2640)

9.0 Atorvastatinum calcicum trihydricum (2191)

9.0 Azithromycinum (1649)

9.0 Barii sulfas (0010)

9.0 Beclometasoni dipropionas anhydricus (0654)

9.0 Benazeprili hydrochloridum (2388)

9.0 Benserazidi hydrochloridum (1173)

9.0 Bentonitum (0467)

9.0 Benzbromaronum (1393)

9.0 Betacarotenum (1069)


9.0 Betahistini dimesilas (1071)

9.0 Betaxololi hydrochloridum (1072)

9.0 Bezafibratum (1394)

9.0 Bicalutamidum (2196)

9.0 Biotinum (1073)

9.0 Biperideni hydrochloridum (1074)

9.0 Brompheniramini maleas (0977)

9.0 Buflomedili hydrochloridum (1398)

9.0 Bupivacaini hydrochloridum monohydricum (0541)

9.0 Butylhydroxyanisolum (0880)

9.0 Calcii acetas 7 (2128)

9.0 Calcii ascorbas dihydricus (1182)

9.0 Calcii carbonas (0014)

9.0 Calcii chloridum dihydricum (0015)

9.0 Calcii chloridum hexahydricum (0707)

9.0 Calcii dobesilas monohydricus (1183)

9.0 Calcii folinas hydricus (0978)

9.0 Calcii glucoheptonas (1399)

9.0 Calcii gluconas anhydricus (2364)

9.0 Calcii gluconas monohydricus (0172)

9.0 Calcii gluconas monohydricus pro iniectione (0979)

9.0 Calcii glycerophosphas (0980)

9.0 Calcii hydrogenophosphas anhydricus (0981)

9.0 Calcii hydrogenophosphas dihydricus (0116)

9.0 Calcii hydroxidum (1078)

9.0 Calcii lactas anhydricus (2118)

9.0 Calcii lactas monohydricus (2117)

9.0 Calcii lactas pentahydricus (0468)

9.0 Calcii lactas trihydricus (0469)

9.0 Calcii laevulinas dihydricus (1296)

9.0 Calcii levofolinas pentahydricus (1606)

Texty

ČL 2017

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

4

v ČL 2009 Acidum nitricum 70%

5

v ČL 2009 Acidum phosphoricum 85%

6

v ČL 2009 Acidum phosphoricum 10%

7

v ČL 2009 Calcii acetas anhydricus

ČL 2017 – Dopl. 2020 81

IV TEXTY ČL 2017

9.0 Calcii pantothenas (0470)

9.0 Calcii phosphas (1052)

9.0 Calcii stearas (0882)

9.0 Calcii sulfas dihydricus (0982)

9.0 Calcipotriolum anhydricum (2011)

9.0 Captoprilum (1079)

9.0 Carbacholum (1971)

9.0 Carbamazepinum (0543)

9.0 Carbasalatum calcicum (1185)

9.0 Carbidopum monohydricum (0755)

9.0 Carbocisteinum (0885)

9.0 Carbomera (1299)

9.0 Carboxymethylamylum natricum A (0983)

9.0 Carboxymethylamylum natricum B (0984)

9.0 Carboxymethylamylum natricum C (1566)

9.0 Carisoprodolum (1689)

9.0 Carmellosum (2360)

9.0 Carmellosum calcicum (0886)

9.0 Carmellosum natricum (0472)

9.0 Carmellosum natricum conexum (0985)

9.0 Carmellosum natricum substitutum humile (1186)

9.0 Carvedilolum (1745)

9.0 Cefaclorum monohydricum (0986)

9.0 Cefamandoli nafas (1402

9.0 Cefoperazonum natricum (1404)

9.0 Cefprozilum monohydricum (2342)

9.0 Ceftazidimum pentahydricum (1405)

9.0 Celecoxibum (2591)

9.0 Cellaburatum (1406)

9.0 Cellacefatum (0314)


9.0 Cellulosi pulvis (0315)

9.0 Cellulosum microcristallinum (0316)

9.0 Cetostearylis isononanoas (1085)

9.0 Chitosani hydrochloridum (1774)

9.0 Chlorali hydras (0265)

9.0 Chlorobutanolum anhydricum (0382)

9.0 Chloroquini diphosphas (0544)

9.0 Chloroquini sulfas monohydricus (0545)

9.0 Chlorphenamini maleas (0386)

9.0 Chlorpromazini hydrochloridum (0475)

9.0 Chlorpropamidum (1087)

9.0 Chlorprothixeni hydrochloridum (0815)

9.0 Chlortetracyclini hydrochloridum (0173)

9.0 Cholesterolum ad usum parenteralem (2397)

9.0 Chondroitini natrii sulfas (2064)

9.0 Ciclesonidum (2703)

9.0 Ciclopiroxum (1407)

9.0 Ciclopiroxum olaminum (1302)

9.0 Ciclosporinum (0994)

9.0 Cilastatinum natricum (1408)

9.0 Cimetidini hydrochloridum (1500)

9.0 Cimetidinum (0756)

9.0 Cinchocaini hydrochloridum (1088)

9.0 Cinnarizinum (0816)

9.0 Ciprofloxacini hydrochloridum hydricum (0888)

9.0 Ciprofloxacinum (1089)

9.0 Citaloprami hydrobromidum (2288)

9.0 Citaloprami hydrochloridum (2203)

9.0 Clarithromycinum (1651)

9.0 Clebopridi malas (1303)

9.0 Clofaziminum (2054)

9.0 Clomipramini hydrochloridum (0889)

9.0 Clopamidum (1747)

9.0 Clopidogreli sulfas (2531)

9.0 Clozapinum (1191)

9.0 Coffeinum (0267)

9.0 Coffeinum monohydricum (0268)

9.0 Colecalciferoli pulvis (0574)

9.0 Colecalciferolum in aqua dispergibile (0598)

9.0 Colestyraminum (1775)

9.0 Copolymerum methacrylatis butylati basicum (1975)

9.0 Copovidonum (0891)

9.0 Crospovidonum (0892)

9.0 Cupri sulfas anhydricus (0893)

9.0 Cyclophosphamidum monohydricum (0711)

9.0 Cysteini hydrochloridum monohydricum (0895)

9.0 Cystinum (0998)

9.0 Deferoxamini mesilas (0896)

9.0 Demeclocyclini hydrochloridum (0176)

9.0 Deptropini citras (1308)

9.0 Desipramini hydrochloridum (0481)

9.0 Desloratadinum (2570)

9.0 Dexamethasoni acetas (0548)

9.0 Dexchlorpheniramini maleas (1196)

9.0 Dexpanthenolum (0761)

9.0 Dextranomerum (2238)






9.0 Diazepamum (0022)

9.0 Diclofenacum kalicum (1508)

9.0 Diclofenacum natricum (1002)

9.0 Didanosinum (2200)

9.0 Diethylcarbamazini citras (0271)

9.0 Diltiazemi hydrochloridum (1004)

9.0 Dimethylacetamidum (1667)

9.0 Dimethylis sulfoxidum (0763)

9.0 Dimeticonum (0138)

9.0 Dinatrii calcii edetas hydricus (0231)

9.0 Dinatrii clodronas tetrahydricus (1777)

9.0 Dinatrii cromoglicas (0562)

9.0 Dinatrii edetas dihydricus (0232)

9.0 Dinatrii etidronas (1778)

9.0 Dinatrii pamidronas pentahydricus (1779)

9.0 Diosminum (1611)

9.0 Diprophyllinum (0486)

9.0 Dirithromycinum (1313)

9.0 Disopyramidi phosphas (1005)

9.0 Disopyramidum (1006)

9.0 Disulfiramum (0603)

9.0 Dobutamini hydrochloridum (1200)

9.0 Docetaxelum anhydricum (2593)

9.0 Docetaxelum trihydricum (2449)

9.0 Docusatum natricum (1418)

9.0 Dodecylis gallas (2078)

9.0 Domperidoni maleas (1008)

9.0 Domperidonum (1009)

9.0 Dopamini hydrochloridum (0664)

9.0 Dopexamini dihydrochloridum (1748)

82 ČL 2017 – Dopl. 2020

IV TEXTY ČL 2017


9.0 Doxaprami hydrochloridum monohydricum (1201)

9.0 Doxepini hydrochloridum (1096)

9.0 Doxycyclini hyclas (0272)

9.0 Doxycyclinum monohydricum (0820)

9.0 Droperidolum (1010)

9.0 Duloxetini hydrochloridum (2594)

9.0 Dutasteridum (2641)

9.0 Enalaprilatum dihydricum (1749)

9.0 Enalaprili maleas (1420)

9.0 Enoxolonum (1511)

9.0 Entacaponum (2574)

9.0 Ephedrinum anhydricum (0488)

9.0 Epinastini hydrochloridum (2411)

9.0 Ergocalciferolum (0082)

9.0 Ergotamini tartras (0224)

9.0 Erythromycini estolas (0552)

RZ Erythromycini ethylsuccinas (0274) 8

9.0 Erythromycini lactobionas (1098)

9.0 Erythromycini stearas (0490)

9.0 Erythromycinum (0179)

9.0 Esketamini hydrochloridum (1742)

9.0 Etamsylatum (1204)

9.0 Ethacridini lactas monohydricus (1591)

9.0 Ethambutoli dihydrochloridum (0553)

9.0 Ethionamidum (0141)



9.0 Ethylendiaminum (0716)

9.0 Ethylparabenum natricum (2134)

9.0 Etilefrini hydrochloridum (1205)

9.0 Etodolacum (1422)

9.0 Etofenamatum (1513)

9.0 Etoposidum (0823)

9.0 Famotidinum (1012)

9.0 Fenbufenum (1209)

9.0 Fenofibratum (1322)

9.0 Ferri chloridum hexahydricum (1515)

9.0 Ferrosi gluconas hydricus (0493)

9.0 Fexofenadini hydrochloridum (2280)

9.0 Flavoxati hydrochloridum (1692)

9.0 Flecainidi acetas (1324)

9.0 Fluconazolum (2287)

9.0 Flucytosinum (0766)

9.0 Fludarabini phosphas (1781)

9.0 Flumequinum (1517)

9.0 Fluorouracilum (0611)

9.0 Fluoxetini hydrochloridum (1104)

9.0 Flupentixoli dihydrochloridum (1693)

9.0 Fluphenazini decanoas (1014)

9.0 Fluphenazini dihydrochloridum (0904)

9.0 Fluphenazini enantas (1015)

9.0 Flurbiprofenum (1519)

9.0 Flutamidum (1423)

9.0 Flutrimazolum (1424)

9.0 Fluvastatinum natricum hydricum (2333)

9.0 Fluvoxamini maleas (1977)

9.0 Foscarnetum natricum hexahydricum (1520)

9.0 Fosfomycinum calcicum monohydricum (1328)

9.0 Fosfomycinum dinatricum (1329)

9.0 Fosfomycinum trometamolum 9 (1425)

9.0 Fosinoprilum natricum (1751)

9.0 Fulvestrantum (2443)

9.0 Furosemidum (0391)

9.0 Gabapentinum (2173)

9.0 Galantamini hydrobromidum (2366)

9.0 Ganciclovirum (1752)

9.0 Gemcitabini hydrochloridum (2306)

9.0 Gemfibrozilum (1694)

9.0 Glibenclamidum (0718)

9.0 Gliclazidum (1524)

9.0 Glucosamini hydrochloridum (2446)



9.0 Glucosum anhydricum (0177)

9.0 Glucosum liquidum (1330)

9.0 Glucosum liquidum dispersione desiccatum (1525)

9.0 Glutathionum (1670)

9.0 Glycerolformalum (1671)

9.0 Glyceroli monolinoleas (1429)

9.0 Glyceroli monooleas (1430)

9.0 Glyceroli monostearas 40–55 (0495)

9.0 Glycerolum (0496)

9.0 Glycerolum 85% (0497)

9.0 Glyceromacrogoli hydroxystearas (1083)

9.0 Glyceromacrogoli laurates (1231)

9.0 Glyceromacrogoli linoleates (1232)

9.0 Glyceromacrogoli 20 monostearas (2044)

9.0 Glyceromacrogoli octanodecanoates (1184)

9.0 Glyceromacrogoli oleates (1249)

9.0 Glyceromacrogoli ricinoleas (1082)

9.0 Glyceromacrogoli stearates (1268)

9.0 Glycinum (0614)


9.0 Guanethidini monosulfas (0027)

9.0 Guar galactomannanum (0908)

9.0 Halofantrini hydrochloridum (1979)

9.0 Heparina massae molecularis minoris (0828)

9.0 Heparinum calcicum (0332)

9.0 Heparinum natricum (0333)

9.0 Heptaminoli hydrochloridum (1980)

9.0 Hexetidinum (1221)

9.0 Histidini hydrochloridum monohydricum (0910)

9.0 Histidinum (0911)

9.0 Hydralazini hydrochloridum (0829)

9.0 Hydroxycarbamidum (1616)

9.0 Hydroxyethylamyla (1785)

9.0 Hydroxypropylbetadexum (1804)

9.0 Hydroxyzini dihydrochloridum (0916)

9.0 Hyetellosum (0336)

9.0 Hymecromonum (1786)

9.0 Hymetellosum (0346)

9.0 Hyprolosum (0337)

9.0 Hypromellosi phthalas (0347)

9.0 Hypromellosum (0348)

9.0 Ibuprofenum (0721)

Texty

ČL 2017

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

8

článek byl zezávazněn rychlou revizí z 1. 5. 2017

9

v ČL 2009 Fosfomycinum trometamoli

ČL 2017 – Dopl. 2020 83

IV TEXTY ČL 2017

9.0 Ifosfamidum (1529)

9.0 Imipramini hydrochloridum (0029)

9.0 Indapamidum (1108)

9.0 Indinaviri sulfas ethanolas (2214)

9.0 Indometacinum (0092)

9.0 Iodixanolum (2215)

9.0 Iohexolum (1114)

9.0 Iopamidolum (1115)

9.0 Iopromidum (1753)

9.0 Iotrolanum (1754)

9.0 Irbesartanum (2465)

9.0 Isofluranum (1673)

9.0 Isoleucinum (0770)

9.0 Isoniazidum (0146)

9.0 Isotretinoinum (1019)

9.0 Isoxsuprini hydrochloridum (1119)

9.0 Ivermectinum (1336)

9.0 Josamycinum (1983)

9.0 Kalii acetas (1139)

9.0 Kalii aluminii sulfas dodecahydricus (0006)

9.0 Kalii bromidum (0184)

9.0 Kalii carbonas (1557)

9.0 Kalii chloridum (0185)

9.0 Kalii citras monohydricus (0400)

9.0 Kalii dihydrogenophosphas (0920)

9.0 Kalii disulfis (2075)

9.0 Kalii hydrogenoaspartas hemihydricus (2076)

9.0 Kalii hydrogenocarbonas (1141)

9.0 Kalii hydrogenophosphas (1003)

9.0 Kalii hydrogenotartras (1984)

9.0 Kalii hydroxidum (0840)

9.0 Kalii iodidum (0186)

9.0 Kalii natrii tartras tetrahydricus (1986)

9.0 Kalii nitras (1465)

9.0 Kalii perchloras (1987)

9.0 Kalii sorbas (0618)

9.0 Kalii sulfas (1622)

9.0 Kaolinum ponderosum (0503)

9.0 Ketamini hydrochloridum (1020)

9.0 Ketoconazolum (0921)

9.0 Ketoprofenum (0922)

9.0 Ketorolacum trometamolum 10 (1755)

9.0 Labetaloli hydrochloridum (0923)

9.0 Lacca (1149)

9.0 Lactosum anhydricum (1061)

9.0 Lactosum monohydricum (0187)

9.0 Lamivudinum (2217)

9.0 Lamotriginum (1756)

9.0 Leflunomidum (2330)

9.0 Leucinum (0771)

9.0 Levamisoli hydrochloridum (0726)

9.0 Levetiracetamum (2535)

9.0 Levocarnitinum (1339)

9.0 Levodopum (0038)

9.0 Lidocaini hydrochloridum monohydricum (0227)

9.0 Lincomycini hydrochloridum monohydricum (0583)

9.0 Lithii carbonas (0228)

9.0 Lithii citras tetrahydricus (0621)

9.0 Lopinavirum (2615)

9.0 Losartanum kalicum (2232)

9.0 Lovastatinum (1538)

9.0 Lufenuronum ad usum veterinarium 11 (2177)

9.0 Lysini acetas (2114)

9.0 Lysini hydrochloridum (0930)

9.0 Macrogola (1444)

9.0 Macrogoli stearas (1234)

9.0 Magaldratum (1539)

9.0 Magnesii acetas tetrahydricus (2035)

9.0 Magnesii chloridum hexahydricum (0402)

9.0 Magnesii chloridum tetrahemihydricum (1341)

9.0 Magnesii citras anhydricus (2339)

9.0 Magnesii citras dodecahydricus (2401)

9.0 Magnesii citras nonahydricus (2402)

9.0 Magnesii gluconas (2161)

9.0 Magnesii glycerophosphas (1446)

9.0 Magnesii hydrogenoaspartas dihydricus (1445)

9.0 Magnesii hydroxidum (0039)

9.0 Magnesii lactas dihydricus (2160)

9.0 Magnesii oxidum levis (0040)

9.0 Magnesii oxidum ponderosum (0041)

9.0 Magnesii peroxidum (1540)

9.0 Magnesii pidolas (1619)

9.0 Magnesii subcarbonas levis (0042)

9.0 Magnesii subcarbonas ponderosus (0043)

9.0 Magnesii sulfas heptahydricus (0044)

9.0 Magnesii trisilicas (0403)

9.0 Maltodextrinum (1542)

9.0 Mangani gluconas (2162)

9.0 Mangani glycerophosphas hydricus (2163)

9.0 Mangani sulfas monohydricus (1543)


9.0 Mefloquini hydrochloridum (1241)

9.0 Megluminum (2055)

9.0 Meloxicamum (2373)

9.0 Mepivacaini hydrochloridum (1242)

9.0 Meprobamatum (0407)

9.0 Mepyramini maleas (0278)

9.0 Meropenemum trihydricum (2234)

9.0 Mesalazinum (1699)

9.0 Mesnum (1674)

9.0 Metamizolum natricum monohydricum (1346)

9.0 Metformini hydrochloridum (0931)

9.0 Methenaminum (1545)

9.0 Methioninum (1027)

9.0 Methioninum racemicum (0624)

9.0 Methotrexatum (0560)

9.0 Methylcellulosum (0345)

9.0 Methyldopum sesquihydricum (0045)

9.0 Methyleni chloridum (0932)

9.0 Methylparabenum natricum (1262)

9.0 Methylphenidati hydrochloridum (2235)

9.0 Methylpyrrolidonum (1675)

9.0 Metoclopramidi hydrochloridum monohydricum

(0674)

9.0 Metoclopramidum (1348)

9.0 Metolazonum (1757)

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

10

v ČL 2009 Ketorolacum trometamoli

11

v ČL 2009 Lufenuronum anhydricum ad usum veterinarium

84 ČL 2017 – Dopl. 2020

IV TEXTY ČL 2017

9.0 Metoprololi succinas (1448)

9.0 Metoprololi tartras (1028)

9.0 Metrifonatum (1133)

9.0 Metronidazoli benzoas (0934)

9.0 Metronidazolum (0675)

9.0 Mexiletini hydrochloridum (1029)

9.0 Minocyclini hydrochloridum dihydricum (1030)

9.0 Minoxidilum (0937)

9.0 Mirtazapinum (2338)

9.0 Modafinilum (2307)

9.0 Mofetilis mycophenolas (1700)

9.0 Molsidominum (1701)

9.0 Montelukastum natricum (2583)

9.0 Nabumetonum (1350)

9.0 Nadololum (1789)

9.0 Naftidrofuryli hydrogenooxalas (1594)

9.0 Naproxenum (0731)

9.0 Naproxenum natricum (1702)

9.0 Nateglinidum (2575)

9.0 Natrii acetas trihydricus (0411)

9.0 Natrii alendronas trihydricus(1564)

9.0 Natrii alginas (0625)

9.0 Natrii amidotrizoas (1150)

9.0 Natrii aminosalicylas dihydricus (1993)

9.0 Natrii ascorbas (1791)

9.0 Natrii benzoas (0123)

9.0 Natrii bromidum (0190)

9.0 Natrii carbonas anhydricus (0773)

9.0 Natrii carbonas decahydricus (0191)

9.0 Natrii carbonas monohydricus (0192)

9.0 Natrii chloridum (0193)

9.0 Natrii citras dihydricus (0412)

9.0 Natrii cyclamas (0774)

9.0 Natrii dihydrogenophosphas dihydricus (0194)

9.0 Natrii disulfis (0849)

9.0 Natrii glycerophosphas hydricus (1995)

9.0 Natrii hyaluronas (1472)

9.0 Natrii hydrogenocarbonas (0195)

9.0 Natrii hydrogenophosphas anhydricus (1509)

9.0 Natrii hydrogenophosphas dihydricus (0602)

9.0 Natrii hydrogenophosphas dodecahydricus (0118)

9.0 Natrii hydroxidum (0677)

9.0 Natrii iodidum (0196)

9.0 Natrii lactatis solutio (1151)

9.0 Natrii lactatis S solutio (2033)

9.0 Natrii molybdas dihydricus (1565)

9.0 Natrii nitris (1996)

9.0 Natrii octanoas (1471)

9.0 Natrii peroxoboras hydricus 12 (1997)

9.0 Natrii phenylbutyras (2183)

9.0 Natrii polystyrensulfonas (1909)

9.0 Natrii propionas (2041)

9.0 Natrii risedronas dihemihydricus (2572)

9.0 Natrii salicylas (0413)

9.0 Natrii stearylis fumaras (1567)

9.0 Natrii sulfas anhydricus (0099)

9.0 Natrii sulfas decahydricus (0100)

9.0 Natrii sulfis anhydricus (0775)

9.0 Natrii sulfis heptahydricus (0776)

9.0 Natrii tetraboras decahydricus (0013)

9.0 Natrii thiosulfas pentahydricus (0414)

9.0 Natrii valproas (0678)

9.0 Neohesperidin-dihydrochalconum (1547)

9.0 Nevirapinum anhydricum (2255)

9.0 Nevirapinum hemihydricum (2479)

9.0 Nicethamidum (0233)

9.0 Niclosamidum anhydricum (0679)

9.0 Nicotinamidum (0047)

9.0 Nifuroxazidum (1999)

9.0 Nilutamidum (2256)

9.0 Nimesulidum (1548)

9.0 Nizatidinum (1453)

9.0 Nonoxinolum 9 (1454)

9.0 Norethisteroni acetas (0850)



9.0 Nystatinum (0517)

9.0 Octoxinolum 10 (1553)

9.0 Octyldodecanolum (1136)

9.0 Octylis gallas (2057)

9.0 Ofloxacinum (1455)

9.0 Olanzapinum (2258)

9.0 Olmesartanum medoxomilum (2600)

9.0 Olsalazinum dinatricum (1457)

9.0 Omeprazolum natricum monohydricum (1032)

9.0 Orciprenalini sulfas (1033)

9.0 Orphenadrini citras (1759)

9.0 Orphenadrini hydrochloridum (1760)

9.0 Oxybuprocaini hydrochloridum (1251)

9.0 Oxybutynini hydrochloridum (1354)

9.0 Oxytetracyclini hydrochloridum (0198)

9.0 Oxytetracyclinum dihydricum (0199)


9.0 Pantoprazolum natricum sesquihydricum (2296)

9.0 Paracetamolum (0049)

9.0 Paroxetini hydrochloridum anhydricum (2283)

9.0 Paroxetini hydrochloridum hemihydricum (2018)

9.0 Pefloxacini mesilas dihydricus (1460)

9.0 Pemetrexedum dinatricum heptahydricum (2637)

9.0 Penbutololi sulfas (1461)

9.0 Penicillaminum (0566)

9.0 Pentamidini diisetionas (1137)

9.0 Pentobarbitalum natricum (0419)

9.0 Pentoxifyllinum (0851)

9.0 Phenazonum (0421)

9.0 Pheniramini maleas (1357)

9.0 Phenolphthaleinum (1584)

9.0 Phenylalaninum (0782)

9.0 Phenylbutazonum (0422)

9.0 Phenylpropanolamini hydrochloridum (0683)

9.0 Phenytoinum (0153)

9.0 Phenytoinum natricum (0521)

9.0 Phloroglucinolum anhydricum (2301)

9.0 Phloroglucinolum dihydricum (2302)

9.0 Phthalylsulfathiazolum (0352)

9.0 Picotamidum monohydricum (1358)

Texty

ČL 2017

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

12

v ČL 2009 Natrii perboras hydricus

ČL 2017 – Dopl. 2020 85

IV TEXTY ČL 2017

9.0 Pindololum (0634)

9.0 Pioglitazoni hydrochloridum (2601)

9.0 Piperacillinum monohydricum (1169)

9.0 Piperacillinum natricum (1168)

9.0 Piperazini adipas (0423)

9.0 Piperazini citras hydricus (0424)

9.0 Piperazinum hexahydricum (0425)

9.0 Piracetamum (1733)

9.0 Piretanidum (1556)

9.0 Piroxicamum (0944)

9.0 Pivmecillinami hydrochloridum (1359)

9.0 Polyacrylatis dispersio 30% (0733)





9.0 Polyvinylacetatis dispersio 30% (2152)

9.0 Polyvinylis acetas (1962)

9.0 Povidonum (0685)

9.0 Pramipexoli dihydrochloridum monohydricum

(2416)

9.0 Pravastatinum natricum (2059)

9.0 Prazepamum (1466)

9.0 Praziquantelum (0855)

9.0 Prilocaini hydrochloridum (1363)

9.0 Prilocainum (1362)

9.0 Primidonum (0584)

9.0 Probenecidum (0243)

9.0 Procainamidi hydrochloridum (0567)

9.0 Procaini hydrochloridum (0050)

9.0 Prolinum (0785)

9.0 Promethazini hydrochloridum (0524)

9.0 Propacetamoli hydrochloridum (1366)

9.0 Propafenoni hydrochloridum (2103)

9.0 Propranololi hydrochloridum (0568)

9.0 Propylenglycoli monolauras (1915)

9.0 Propylenglycolum (0430)

9.0 Propylis gallas (1039)

9.0 Propylparabenum natricum (1263)

9.0 Propylthiouracilum (0525)

9.0 Propyphenazonum (0636)

9.0 Protamini sulfas (0569)

9.0 Proxyphyllinum (0526)

9.0 Pyranteli embonas (1680)

9.0 Pyrazinamidum (0859)

9.0 Pyridostigminii bromidum (1255)

9.0 Pyridoxini hydrochloridum (0245)

9.0 Pyrrolidonum (2180)

9.0 Quetiapini fumaras (2541)

9.0 Quinaprili hydrochloridum (1763)

9.0 Raloxifeni hydrochloridum (2375)


9.0 Ribavirinum (2109)

9.0 Riboflavini natrii phosphas (0786)

9.0 Rifampicinum (0052)

9.0 Rifamycinum natricum (0432)

9.0 Rifaximinum (2362)

9.0 Ritonavirum (2136)

9.0 Rivastigmini hydrogenotartras (2630)

9.0 Rivastigminum (2629)

9.0 Rizatriptani benzoas (2585)

9.0 Rocuronii bromidum (1764)

9.0 Ropivacaini hydrochloridum monohydricum (2335)

9.0 Rosuvastatinum calcicum (2631)

9.0 Roxithromycinum (1146)

9.0 Sacchari sphaerae (1570)

9.0 Saccharinum (0947)

9.0 Saccharinum natricum (0787)

9.0 Saccharosi monopalmitas (2319)

9.0 Saccharosi stearas (2318)

9.0 Saquinaviri mesilas (2267)

9.0 Selamectinum ad usum veterinarium (2268)

9.0 Selegilini hydrochloridum (1260)

9.0 Serinum (0788)


9.0 Sildenafili citras (2270)

9.0 Silica ad usum dentalem (1562)

9.0 Silica colloidalis anhydrica (0434)

9.0 Silica colloidalis hydrica (0738)

9.0 Silica hydrophobica colloidalis (2208)

9.0 Simeticonum (1470)

9.0 Simvastatinum (1563)

9.0 Sorbitani lauras (1040)

9.0 Sorbitani oleas (1041)

9.0 Sorbitani palmitas (1042)

9.0 Sorbitani sesquioleas (1916)

9.0 Sorbitani stearas (1043)

9.0 Sorbitani trioleas (1044)

9.0 Sotaloli hydrochloridum (2004)

9.0 Spiramycinum (0293)

9.0 Stannosi chloridum dihydricum (1266)

9.0 Sucralfatum (1796)

9.0 Sucralosum (2368)

9.0 Sulbactamum natricum (2209)

9.0 Sulfacetamidum natricum monohydricum (0107)

9.0 Sulfadiazinum (0294)

9.0 Sulfadimethoxinum (2741)

9.0 Sulfadimidinum (0295)

9.0 Sulfadoxinum (0740)

9.0 Sulfafurazolum (0741)

9.0 Sulfaguanidinum (1476)

9.0 Sulfamerazinum (0358)

9.0 Sulfamethizolum (0637)

9.0 Sulfamethoxazolum (0108)

9.0 Sulfanilamidum (1571)

9.0 Sulfasalazinum (0863)

9.0 Sulfathiazolum (0742)

9.0 Sulfinpyrazonum (0790)

9.0 Sulindacum (0864)

9.0 Sulpiridum (1045)

9.0 Sultamicillini tosilas dihydricus (2212)

9.0 Sultamicillinum (2211)

9.0 Sumatriptani succinas (1573)

9.0 Suxibuzonum (1574)

9.0 Tamsulosini hydrochloridum (2131)

9.0 Teicoplaninum (2358)

9.0 Tenoxicamum (1156)

9.0 Terazosini hydrochloridum dihydricum (2021)

9.0 Tetracaini hydrochloridum (0057)

9.0 Tetracyclini hydrochloridum (0210)

9.0 Tetracyclinum (0211)

9.0 Theobrominum (0298)

86 ČL 2017 – Dopl. 2020

IV TEXTY ČL 2017

9.0 Theophyllinum (0299)

9.0 Theophyllinum monohydricum (0302)

9.0 Thiamazolum (1706)

9.0 Thiamini hydrochloridum (0303)

9.0 Thiamini nitras (0531)

9.0 Thiamphenicolum (0109)

9.0 Thioridazini hydrochloridum (0586)

9.0 Thioridazinum (2005)

9.0 Threoninum (1049)

9.0 Tiabendazolum (0866)

9.0 Tiapridi hydrochloridum (1575)

9.0 Ticlopidini hydrochloridum (1050)

9.0 Tilidini hydrochloridum hemihydricum (1767)

9.0 Timololi maleas (0572)

9.0 Tinidazolum (1051)

9.0 Tiotropii bromidum monohydricum (2420)

9.0 Titanii dioxidum (0150)

9.0 Tizanidini hydrochloridum (2578)

9.0 Tocoferoli alfa hydrogenosuccinas (1258)

9.0 Tocoferoli alfa RRR hydrogenosuccinas (1259)

9.0 Tolbutamidum (0304)

9.0 Torasemidum (2132)

9.0 Tramadoli hydrochloridum (1681)

9.0 Trapidilum (1576)

9.0 Trehalosum dihydricum (2297)

9.0 Tretinoinum (0693)

9.0 Triamcinoloni hexacetonidum (0867)

9.0 Tribenosidum (1740)

9.0 Tributylis acetylcitras (1770)

9.0 Tributylis phosphas (1682)

9.0 Triethylis citras (1479)

9.0 Triflusalum (1377)

9.0 Triglycerida media 13 (0868)

9.0 Trimebutini maleas (2182)

9.0 Trimethadionum (0440)

9.0 Trimethoprimum (0060)

9.0 Trimipramini maleas (0534)

9.0 Trolaminum (1577)

9.0 Trometamolum (1053)

9.0 Troxerutinum (2133)

9.0 Tryptophanum (1272)

9.0 Tyrosinum (1161)

9.0 Urea (0743)



9.0 Valinum (0796)

9.0 Valsartanum (2423)

9.0 Vancomycini hydrochloridum (1058)

9.0 Venlafaxini hydrochloridum (2119)

9.0 Verapamili hydrochloridum (0573)

9.0 Vigabatrinum (2305)

9.0 Voriconazolum (2576)

9.0 Xanthani gummi (1277)

9.0 Xylosum (1278)

9.0 Zidovudinum (1059)

9.0 Zinci chloridum (0110)

9.0 Zinci gluconas (2164)

9.0 Ziprasidoni hydrochloridum monohydricum (2421)

9.0 Zopiclonum (1060)

9.0 Zuclopenthixoli decanoas (1707)

Texty

ČL 2017

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

13

v ČL 2009 Triglycerida saturata media

ČL 2017 – Dopl. 2020 87

OBECNÉ STATĚ

a

OBECNÉ ČLÁNKY

1.1 OBECNÁ USTANOVENÍ

1 VŠEOBECNÉ ZÁSADY

10.0:10000

Všeobecné

zásady

1.1

1.1 OBECNÁ USTANOVENÍ

Všeobecné zásady se týkají všech článků a ostatních textů

lékopisu.

Oficiální Evropský lékopis je vydáván v anglickém a francouzském

jazyce. Překlad do národních jazyků je umožněn

signatářským státům Úmluvy o vypracování Evropského lékopisu.

V případě pochybností nebo sporu je rozhodující

pouze anglická nebo francouzská verze Evropského lékopisu.

Pojem „lékopis“ bez bližšího určení znamená v tomto překladu

Český lékopis. Jeho oficiální zkratka je ČL. Oficiální

zkratka pro Evropský lékopis je Ph. Eur.

Uvedení názvu nebo podnázvu článku v textu jiného článku

znamená, že předmět článku vyhovuje požadavkům citovaného

článku. Takové odkazy na články jsou v lékopisných

textech uváděny názvem a číslem článku kurzívou.

Léčivý přípravek musí vyhovovat požadavkům lékopisu po

celou dobu jeho použitelnosti; odlišnou dobu použitelnosti

a/nebo specifikace pro otevřené nebo načaté obaly může

povolit oprávněná autorita. Předmět jakéhokoliv jiného

článku musí vyhovovat po celou dobu používání. Dobu použitelnosti

a datum, od něhož se tato doba počítá, schvaluje

oprávněná autorita na základě výsledků stabilitních studií.

Ustanovení článků jsou závazná, pokud není ve Všeobecných

zásadách nebo v článcích uvedeno jinak. Obecné stati

se stávají pro daný článek závaznými, pokud se na ně

v článku odkazuje, je-li takový odkaz učiněn způsobem,

který vyjadřuje, že příslušný text, na který se odkazuje, je

citován pouze pro informaci, pak závazný není.

Léčivé látky, pomocné látky, léčivé přípravky a jiné produkty

popsané v článcích jsou určeny pro humánní a veterinární

použití (není-li výslovně vymezeno pouze jedno

z těchto použití).

Systémy jakosti. Standardy jakosti reprezentované články

jsou platné pouze tam, kde jsou předmětné materiály produkovány

v rámci vhodného systému jakosti. Systém jakosti

musí zajistit, že produkty důsledně splňují požadavky

lékopisu.

Alternativní metody. Zkoušky na čistotu a stanovení obsahu

(účinnosti, aktivity) popsané v lékopisu jsou oficiální

metody, na nichž jsou založeny lékopisné normy. Se souhlasem

oprávněné autority se pro kontrolní účely mohou

použít alternativní analytické metody za předpokladu, že tyto

metody umožní jednoznačné rozhodnutí, že by se dosáhlo

shody se standardy v článcích, kdyby byly použity oficiální

metody. V případě pochybností nebo sporu jsou rozhodující

pouze lékopisné analytické metody.

Prokázání shody s lékopisem

(1) Látka nemá lékopisnou jakost, pokud nevyhovuje všem

požadavkům uvedeným v článku. To však neznamená,

že provedení všech zkoušek popsaných v článku je pro

výrobce nezbytnou podmínkou při určení, že výrobek

před uvolněním do použití vyhovuje lékopisu. Výrobce

může získat jistotu, zda nějaký výrobek je lékopisné jakosti

na základě kvalifikace kontroly, společně s kontrolní

strategií a údaji získanými např. z validačních

studií výrobního procesu.

(2) Ke zlepšení kontroly jakosti se může využít procesní

analytická technologie (PAT) a/nebo zkoušení pro propouštění

v reálném čase (RTRT, real-time release testing),

včetně parametrického propouštění, jako alternativy

konečného zkoušení produktu. Potřeba vyhovět požadavkům

lékopisu nevylučuje tedy možnost uchýlit se

ke zkoušení v reálném čase (tzv. paralelní testování)

v určitých situacích, kdy je to oprávněnou autoritou považováno

za vhodné.

(3) Omezení zkoušek na zvířatech: snahou Evropského lékopisu

je postupné omezování zkoušek na zvířatech

v souladu s principem „3R“ obsaženém v Evropské

úmluvě o ochraně obratlovců používaných pro pokusné

nebo jiné vědecké účely (The European Convention for

the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental

and Other Scientific Purposes). K prokázání

shody s lékopisem, viz odstavec (1), mohou výrobci

zvážit zavedení dalších systémů monitorování shodnosti

výroby. Se souhlasem oprávněné autority a ve shodě

s lékopisem se výběr zkoušek stanoví tak, aby použití

zvířat v předepsaných zkouškách na zvířatech bylo minimalizováno,

jak jen je to možné.

Stupně jakosti materiálu. Některé materiály, které jsou

předmětem lékopisného článku, mohou existovat v různé jakosti

vhodné pro různé účely. Pokud není v článku uvedeno

jinak, požadavky platí pro všechny stupně jakosti tohoto materiálu.

V některých článcích, zejména těch, které se týkají

pomocných látek, může být pro informaci připojen seznam

funkčních charakteristik důležitých pro jejich použití. Pro informaci

mohou být též uvedeny zkušební metody pro stanovení

jedné nebo více těchto funkčních charakteristik.

Obecné články. U látek a přípravků, které jsou předmětem

jednotlivých článků, se také požaduje, aby vyhovovaly souvisejícím

příslušným obecným článkům. Odkazy na tyto

související obecné články nejsou obvykle v jednotlivých

článcích uvedeny.

Obecné články platí pro všechny látky a přípravky v rozsahu

uvedeném v části Definice, kromě případů, kde úvod

omezuje použití, např. pro látky a přípravky, které jsou

předmětem lékopisného článku.

Obecné články lékových forem se vztahují na všechny přípravky

definovaného druhu. Požadavky nemusí být pro daný

léčivý přípravek úplné a oprávněná autorita může k požadavkům

uvedeným v obecném článku pro danou lékovou

formu stanovit další dodatečné požadavky.

Obecné články a jednotlivé články se doplňují. Jestliže

ustanovení obecného článku neplatí pro určitý výrobek, je

to v daném článku výslovně uvedeno.

ČL 2017 – Dopl. 2020 89

1.2 DALŠÍ USTANOVENÍ TÝKAJÍCÍ SE OBECNÝCH STATÍ A ČLÁNKŮ

Validace lékopisných metod. Zkušební metody uvedené

v článcích a obecných statích byly validovány v souladu

s přijatou odbornou praxí a současnými doporučeními pro

analytické validace. Pokud není v článku nebo obecné stati

uvedeno jinak, validace zkušebních metod se po analytikovi

nepožadují.

Zavádění lékopisných metod. Uživatel musí při zavádění

lékopisné metody posoudit míru vhodnosti použití metody

podle aktuálních podmínek nutných k prokázání shody s odpovídajícími

články, obecnými statěmi a systémy jakosti.

Konvenční výrazy. Výraz „oprávněná autorita“ značí národní,

nadnárodní nebo mezinárodní orgán nebo organizaci,

které mají oprávnění rozhodovat příslušnou problematiku.

Může to být např. národní lékopisná autorita, autorita vystavující

povolení k uvádění léčiva na trh, nebo oficiální kontrolní

laboratoř. V České republice se oprávněnou autoritou

v oblasti humánních léčiv rozumí zejména Státní ústav pro

kontrolu léčiv a Ministerstvo zdravotnictví ČR, v oblasti veterinárních

biopreparátů a léčiv Ústav pro státní kontrolu veterinárních

biopreparátů a léčiv a Ministerstvo zemědělství

ČR, v oblasti zabezpečující krizové situace (nouzový stav,

stav ohrožení státu a válečný stav) Ministerstvo obrany ČR.

Výrazy „není-li stanoveno jinak“, „není-li předepsáno jinak“

a „není-li zdůvodněno a schváleno jinak“ znamenají, že požadavky

ustanovení platí, pokud oprávněná autorita neschválí

změnu nebo výjimku zdůvodněnou pro daný případ.

Ustanovení obsahující výraz „by měl“ jsou informativní

nebo doporučující.

V některých článcích nebo jiných textech se zkoumadlo,

mikroorganismus, zkušební metoda apod. charakterizuje

výrazem „vhodný“ nebo „odpovídající“; nejsou-li kritéria

vhodnosti popsána v článku, vhodnost je prokazována

oprávněné autoritě.

Léčivý přípravek. a) Látka nebo kombinace látek prezentovaná

s tím, že má léčebné nebo preventivní vlastnosti v případě

onemocnění lidí nebo zvířat, nebo b) látka nebo kombinace

látek, kterou lze použít a podat lidem a/nebo zvířatům,

a to buď za účelem obnovy, úpravy či ovlivnění fyziologických

funkcí prostřednictvím farmakologického, imunologického

nebo metabolického účinku, nebo za účelem

stanovení lékařské diagnózy.

Rostlinný léčivý přípravek. Léčivý přípravek obsahující jako

účinné složky nejméně jednu rostlinnou látku nebo nejméně

jeden rostlinný přípravek, nebo nejméně jednu rostlinnou

látku v kombinaci s nejméně jedním rostlinným přípravkem.

Léčivá látka. Látka použitá ve výrobě nebo přípravě léčivého

přípravku, která způsobuje jeho účinek; tento účinek je

zpravidla farmakologický, imunologický nebo spočívá

v ovlivnění metabolismu.

Pomocná látka. Látka, která není léčivou látkou a je v použitém

množství bez vlastního léčebného účinku a umožňuje

nebo usnadňuje výrobu, přípravu a uchovávání léčivých

přípravků nebo jejich podávání, nebo příznivě ovlivňují

farmakokinetické vlastnosti léčivých látek obsažených

v léčivých přípravcích. Jsou to např. adjuvancia, stabilizátory,

protimikrobní látky, ředidla, antioxidanty.

Zaměnitelné metody. Některé obecné stati obsahují ustanovení,

že dotyčný text je harmonizován s odpovídajícím

textem Japonského lékopisu a/nebo Lékopisu Spojených

států amerických a že tyto texty jsou vzájemně zaměnitelné.

To znamená, že jestliže je zjištěno, že nějaká látka nebo

přípravek vyhovuje za použití zaměnitelné metody požadavku

jednoho z těchto lékopisů, vyhovuje též požadavkům

Evropského lékopisu, a tedy i Českého lékopisu.

V případě pochybností nebo sporu je rozhodující pouze text

Evropského lékopisu.

Odkazy na regulační dokumenty. Články a obecné stati

mohou obsahovat odkazy na dokumenty vydané regulačními

autoritami pro léčiva, např. nařízení a poznámky k pokynům

Evropské unie. Tyto odkazy jsou poskytovány uživatelům

lékopisu pro informaci. Zahrnutí takových odkazů neupravuje

postavení uvedených dokumentů, které mohou být

závazné nebo doporučující.

1.2 DALŠÍ USTANOVENÍ TÝKAJÍCÍ SE OBECNÝCH STATÍ A ČLÁNKŮ

Množství. Množství, předepsaná ve zkouškách na čistotu

s číselnými limity a ve stanoveních obsahu (účinnosti, aktivity),

jsou přibližná. Skutečně použité množství, které se

může lišit od předepsaného nejvýše o 10 %, se přesně zváží

nebo odměří a výsledek se počítá z tohoto přesného množství.

Ve zkouškách na čistotu, kde limit není udán číselně,

ale zpravidla vyplývá z porovnání s chováním porovnávací

látky za stejných podmínek, se použije ke zkoušce předepsané

množství. Zkoumadla se používají v předepsaných

množstvích.

Množství se naváží nebo odměří s přesností přiměřenou

udanému stupni přesnosti. Při vážení odpovídá přesnost

±5 jednotkám za poslední udanou číslicí (např. 0,25 g znamená

0,245 g až 0,255 g). Při měření objemu, jestliže číslice

za desetinnou čárkou je nula nebo číslo končí nulou

(např. 10,0 ml nebo 0,50 ml), se použije pipeta, odměrná

baňka nebo byreta, podle toho, co je vhodné. Jinak se může

použít odměrný válec nebo dělená pipeta. Objemy udané

v mikrolitrech se měří mikropipetou nebo mikrostříkačkou.

V určitých případech neodpovídá přesnost, na níž jsou

množství udávána, počtu platných číslic vyjádřených

v udaných číselných požadavcích. Vážení a měření se potom

provádějí s dostatečnou přesností v souladu s analytickými

zvyklostmi.

Přístroje a postupy. Odměrné skleněné nádoby odpovídají

požadavkům třídy A příslušné mezinárodní normy vydané

Mezinárodní organizací pro normalizaci (International Organisation

for Standardisation).

Není-li předepsáno jinak, analytické postupy se provádějí

při teplotě 15 °C až 25 °C.

Porovnávací zkoušky, není-li předepsáno jinak, se provádějí

za použití stejných zkumavek z bezbarvého průhledného

neutrálního skla s plochou základnou a s vnitřním průměrem

16 mm. Zkumavky s větším vnitřním průměrem je

možné použít, jestliže se použitý objem tekutiny příslušně

upraví (2.1.5). Stejné objemy porovnávaných kapalin se

pozorují shora dolů ve směru podélné osy zkumavky proti

90 ČL 2017 – Dopl. 2020

1.3 OBECNÉ STATĚ

bílému pozadí nebo, je-li třeba, proti černému pozadí.

Zkoušení se provádí v rozptýleném světle.

Jakékoliv rozpouštědlo použité ve zkouškách na čistotu nebo

ve stanovení obsahu (účinnosti, aktivity), při kterých se

má použít indikátor, se nejdříve neutralizuje na tento indikátor,

pokud není předepsána slepá zkouška.

Vodní lázeň. Výraz „vodní lázeň“ znamená lázeň vroucí

vody, není-li uvedena jiná teplota vody. Jiné metody zahřívání

se mohou použít za předpokladu, že nebude překročena

teplota 100 °C nebo předepsaná teplota.

Sušení a žíhání do konstantní hmotnosti. Výrazy „vysušený

do konstantní hmotnosti“ a „vyžíhaný do konstantní

hmotnosti“ znamenají, že dvě po sobě jdoucí vážení se neliší

o více než 0,5 mg; druhé vážení následuje po další době

sušení nebo žíhání přiměřené povaze a množství zbytku.

Jestliže je sušení předepsáno za použití jednoho z výrazů

„v exsikátoru“, „ve vakuu“ nebo „ve vakuové sušárně“,

provádí se za podmínek popsaných ve stati Ztráta sušením

(2.2.32).

Zkoumadla. Správné provádění analytických postupů popsaných

v lékopisu a spolehlivost výsledků závisí částečně

na jakosti použitých zkoumadel. Zkoumadla jsou popsána

v obecné stati Zkoumadla (4). Předpokládá se použití zkoumadel

analytického stupně jakosti. Pro některá zkoumadla

jsou zařazeny zkoušky na ověření jejich vhodnosti.

Rozpouštědla. Neuvádí-li se název rozpouštědla, znamená

výraz „roztok“ vodný roztok.

Kde je použití vody předepsáno nebo zahrnuto v analytických

postupech popsaných v lékopisu nebo pro přípravu

zkoumadel, použije se voda vyhovující požadavkům článku

Aqua purificata (0008), s tou výjimkou, že pro četné účely

nejsou požadavky na bakteriální endotoxiny (Čištěná voda

nerozplněná) a mikrobiální kontaminace (Čištěná voda

rozplněná) potřebné. Výraz „voda destilovaná“ označuje

čištěnou vodu připravenou destilací.

Výraz „ethanol“ bez specifikace označuje ethanol bezvodý.

Výraz „alkohol“ bez specifikace označuje ethanol 96%“.

Jiná ředění ethanolu se označují výrazem „ethanol“

s uvedením objemového procenta ethanolu (C2H6O).

Vyjadřování obsahu. Při vyjadřování obsahu se výraz

„procento“ (%) používá podle okolností v jednom ze dvou

významů:

– procenta m/m (hmotnostní procenta, hmotnost v hmotnosti)

udávají počet gramů látky ve 100 gramech konečného

přípravku/produktu; v Českém lékopisu se označení

m/m obvykle nepoužívá; pokud není uvedeno, o jaká procenta

se jedná, rozumí se procenta hmotnostní;

– procenta V/V (objemová procenta, objem v objemu) udávají

počet mililitrů látky ve 100 mililitrech konečného

přípravku/produktu.

Procenta hmotnostně objemová a procenta objemově hmotnostní

nejsou v Ph. Eur. ani v Českém lékopisu povolena.

Potřebné koncentrace se vyjadřují za použití příslušných

jednotek, obvykle jako g/l nebo ml/kg.

Výraz „ppm“ (parts per million) použitý v Ph. Eur. odpovídá

hmotnosti v hmotnosti, pokud není uvedeno jinak.

V Českém lékopisu je tento výraz nahrazen podle potřeby

údaji µg/g, pokud není uvedeno jinak, viz ČSN ISO 80000-1:

2011 (01 1300).

Teplota. Kde analytický postup uvádí teplotu bez číselných

hodnot, mají obecně používané výrazy tento význam:

– v mrazicím boxu: pod –15 °C;

– v chladničce: 2 °C až 8 °C;

– v chladu: 8 °C až 15 °C;

– při teplotě místnosti: 15 °C až 25 °C.

Všeobecné

zásady

1.3

1.3 OBECNÉ STATĚ

Obaly. Materiály používané pro obaly jsou popsány

v obecné stati Materiály používané pro výrobu obalů (3.1).

Obecné názvy používané pro materiály, zvláště pro plasty,

zahrnují skupinu výrobků lišících se nejen ve vlastnostech

základní složky, ale také v použitých přísadách. Zkušební

metody a limity pro tyto materiály závisí na jejich formulaci

a jsou závazné pouze pro materiály, jejichž složení je definováno

v úvodu ke specifikacím. Použití materiálů s jiným

složením a příslušné zkušební metody a limity podléhají

schválení oprávněnou autoritou.

Specifikace pro obaly v obecné stati Obaly (3.2) byly vypracovány

k obecnému použití pro obaly uvedené kategorie,

ale vzhledem k velké rozmanitosti dostupných obalů

a možnému dalšímu vývoji, nevylučuje uveřejnění specifikací

ve zdůvodněných případech použít obaly, které odpovídají

specifikacím jiným, schváleným oprávněnou autoritou.

V lékopisných článcích se může odkazovat na definice

a specifikace obalů uvedené ve stati Obaly (3.2). Obecné

články lékových forem mohou v části Definice/Výroba

vyžadovat použití určitých druhů obalů; některé jiné články

mohou v části Skladování uvést druh obalu, který se

doporučuje pro dané použití.

1.4 LÉKOPISNÉ ČLÁNKY (MONOGRAFIE)

Lékopisné články (dále články) se člení na části: záhlaví

článku (název; Ar/Mr; CAS), definice, výroba (produkce),

vlastnosti, zkoušky totožnosti, zkoušky na čistotu, stanovení

obsahu (účinnosti), funkční charakteristiky, skladování,

označování a nečistoty. Podle svého charakteru nemusí

článek nutně obsahovat všechny části.

ZÁHLAVÍ ČLÁNKŮ

NÁZVY

Hlavní názvy lékopisných článků v Ph. Eur. jsou v anglickém

nebo francouzském jazyce a vedlejší název je v latinském

jazyce. V Českém lékopisu je jako hlavní název

upřednostněn název latinský a jako vedlejší název je uveden

ČL 2017 – Dopl. 2020 91


název český. Jako synonymální název je uveden název latinský

Ph. Eur., pokud je rozdílný. Označení, zda se jedná

o omamnou nebo psychotropní látku, venenum nebo separandum,

zda jde o článek přeložený z Ph. Eur. nebo o české

specifikum již součástí názvu není. Články přeložené

z Ph. Eur. jsou zařazeny v Evropské části lékopisu a vedle

názvu je uvedeno číslo publikace a číslo evropského článku.

Národní články mají uveden pouze rok zezávaznění a tvoří

Národní část lékopisu.

RELATIVNÍ ATOMOVÉ A MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI

Relativní molekulová hmotnost (Mr), popřípadě relativní

atomová hmotnost (Ar) a strukturní vzorec se uvádějí na začátku

každého článku tam, kde je to vhodné, a nejsou součástí

analytických standardů pro popisovanou látku.

REGISTRAČNÍ ČÍSLO CAS (CHEMICAL ABSTRACTS

SERVICE REGISTRY NUMBER)

Registrační čísla CAS jsou zařazena pro informaci v článcích,

kde je lze uplatnit, ke zpřístupnění užitečných informací

pro uživatele. CAS Registry Number ® je registrovaná

obchodní známka Americké chemické společnosti (American

Chemical Society).

DEFINICE

Ustanovení uvedená v části Definice podávají oficiální definici

látky, přípravku nebo jiného výrobku, který je předmětem

článku.

U chemických látek patří do definice český chemický název

vytvořený podle zásad IUPAC (International Union of Pure

and Applied Chemistry) a zásad českého názvosloví anorganické

a organické chemie 1 bez ohledu na Pravidla českého

pravopisu.

Rozmezí/limity obsahu (účinnosti). Kde jsou předepsána/y

rozmezí/limity obsahu (účinnosti), stanoví se tato rozmezí/tyto

limity metodou popsanou v části Stanovení obsahu

(účinnosti).

Rostlinné drogy. V článcích rostlinných drog se v části

Definice uvádí, zda je předmětem článku např. celá droga

nebo práškovaná droga. Pokud se článek týká celé i práškované

drogy, definice článku to jasně udává.

PRODUKCE/VÝROBA

Ustanovení části Produkce/Výroba upozorňují na určité

aspekty výrobního postupu, ale nemusí být vyčerpávající.

Uvádějí povinné požadavky pro výrobce, pokud není uvedeno

jinak. Mohou se týkat např. výchozích materiálů,

vlastního výrobního postupu a jeho validace a kontroly,

mezioperačních kontrol nebo zkoušení, které má být prováděno

výrobcem u konečného přípravku/produktu, buď

u vybraných šarží, nebo u každé šarže před propuštěním.

Tato ustanovení nemohou vždy být ověřena na vzorku konečného

přípravku/produktu nezávislým analytikem.

Oprávněná autorita si může ověřit dodržování těchto pokynů,

např. kontrolou údajů získaných od výrobce, inspekcí

nebo zkoušením vhodných vzorků.

Nepřítomnost části Produkce/Výroba neznamená, že se nevyžaduje

věnovat pozornost požadavkům uvedeným výše.

Výběr vakcinačního kmene, výběr složení vakcíny.

V části Produkce/Výroba mohou být definovány charakteristiky

vakcinačního kmene nebo složení vakcíny. Není-li

uvedeno jinak, zkušební metody pro ověřování těchto charakteristik

jsou určeny pro informaci jako příklad vhodných

metod. Se souhlasem oprávněné autority se mohou použít

jiné zkušební metody bez validace proti metodě uvedené

v článku.

POTENCIÁLNÍ PADĚLKY

Vzhledem ke zvyšujícímu se počtu podvodů a případů padělání,

mají být pro uživatele lékopisu dostupné informace,

které pomohou určit padělané materiály (např. léčivé či pomocné

látky, meziprodukty, nerozplněné a konečné přípravky/produkty).

K tomuto účelu se může do této části článků látek, u kterých

se objevila nebo se dají očekávat rizika úmyslné kontaminace,

zařadit metoda detekce potenciálních padělků

a odpovídající limity, společně s připomenutím, že všechny

stupně výroby a zdroje jsou podrobeny vhodnému systému

jištění jakosti. Četnost zkoušení výrobci nebo uživateli

(např. výrobci meziproduktů, nerozplněných a konečných

přípravků/produktů, kde je to vhodné) závisí na posouzení

rizika; v úvahu je třeba brát úroveň znalostí celého dodavatelského

řetězce a národní požadavky.

Tato část klade požadavky na celý dodavatelský řetězec, od

výrobců k uživatelům (např. výrobce meziproduktů, nerozplněných

a konečných přípravků/produktů, kde je to relevantní).

Nepřítomnost této části v článku neznamená, že

není třeba věnovat pozornost požadavkům uvedeným výše.

VLASTNOSTI

Údaje uvedené v části Vlastnosti jsou informativní a nejsou

lékopisnými požadavky.

Rozpustnost. V ustanoveních týkajících se rozpustnosti

v části Vlastnosti mají (pro teplotu 15 °C až 25 °C) použité

výrazy tento význam.

Popisný výraz

velmi snadno rozpustný

snadno rozpustný

dobře rozpustný

mírně rozpustný

těžce rozpustný

velmi těžce rozpustný

prakticky nerozpustný

Přibližný objem

rozpouštědla

(ml/g rozpuštěné látky)

méně než 1

1 až 10

10 až 30

30 až 100

100 až 1000

1000 až 10 000

více než 10 000

Výraz „částečně rozpustný” se používá k popisu směsi, kde

se rozpustí jen některé ze složek. Výraz „mísitelný” se používá

k popisu kapaliny, která je mísitelná v každém poměru

s uvedeným rozpouštědlem.

ZKOUŠKY TOTOŽNOSTI

Rozsah. Zkoušky uvedené v části Zkoušky totožnosti nejsou

navrženy tak, aby plně potvrdily chemickou

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

Bláha, K., Ferles, M., Staněk, J. a kol.: Nomenklatura organické chemie. 3. rozšířené a upravené vydání. Praha: Academia, 1985.

Klikorka, J., Hanzlík, J.: Názvosloví anorganické chemie. 3. upravené a rozšířené vydání. Praha: Academia, 1987.

Průvodce názvoslovím organických sloučenin podle IUPAC. 1. vydání. Praha: Academia, 2000.

92 ČL 2017 – Dopl. 2020


strukturu nebo složení výrobku, ale jejich záměrem je s přijatelným

stupněm jistoty potvrdit, že výrobek odpovídá

označení na obalu.

První a druhá totožnost. Některé články mají členění

zkoušek totožnosti označených jako první totožnost (1.:)

a druhá totožnost (2.:). Zkouška nebo zkoušky označené

první totožnost se mohou použít za všech okolností. Zkouška

nebo zkoušky označené druhá totožnost se mohou použít

v lékárnách za předpokladu, že se může prokázat, že látku

nebo přípravek lze zcela vysledovat k ověřené šarži, která

byla kompletně přezkoušena podle lékopisného článku

a vyhovuje všem jeho požadavkům.

Některé články uvádějí dva nebo více souborů zkoušek pro

účely první totožnosti, které jsou si rovnocenné a mohou se

použít nezávisle na sobě. Jeden nebo více těchto souborů

obvykle obsahuje odkazy na zkoušky předepsané v části

Zkoušky na čistotu daného článku. Mohou posloužit ke

zjednodušení práce analytika provádějícího zkoušky totožnosti

a předepsané zkoušky na čistotu. Např. jeden ze souborů

zkoušek odkazuje na zkoušku Enantiomerní čistota,

zatímco jiný soubor odkazuje na zkoušku Specifická optická

otáčivost: v obou případech se jedná o totéž, tedy

o ověření, že je přítomen správný enantiomer.

Práškované rostlinné drogy. Články rostlinných drog mohou

obsahovat schematické nákresy totožnosti práškované

drogy. Tyto nákresy doplňují úplný popis v příslušné

zkoušce totožnosti.

ZKOUŠKY NA ČISTOTU A STANOVENÍ OBSAHU

(ÚČINNOSTI, AKTIVITY)

Rozsah. Požadavky nejsou koncipovány tak, aby braly

v úvahu všechny možné nečistoty. Není možné např. předpokládat,

že lze tolerovat nějakou nečistotu, která není zjistitelná

pomocí předepsaných zkoušek, jestliže zkušenost

a správná farmaceutická praxe požadují, aby nebyla přítomna.

Viz též dále uvedenou část Nečistoty.

Výpočty. Jestliže se vyžaduje, aby výsledek zkoušky byl

počítán na vysušenou nebo bezvodou látku nebo na jiný základ,

provede se stanovení ztráty sušením, obsahu vody nebo

jiné vlastnosti metodou předepsanou v příslušné zkoušce

článku. Sousloví „vysušená látka“ nebo „bezvodá látka“ je

uvedeno za výsledkem v závorce.

Kde se kvantitativně stanovuje zbytkové rozpouštědlo, neprovádí

se zkouška Ztráta sušením a při výpočtu obsahu

látky se bere v úvahu obsah zbytkového rozpouštědla, specifická

optická otáčivost a specifická absorbance. Další

údaje se v jednotlivých článcích neuvádějí.

Limity. Předepsané limity jsou založeny na údajích získaných

v běžné analytické praxi; berou v úvahu běžné analytické

chyby, přijatelné odchylky při výrobě a přípravě

a znehodnocení v rozsahu ještě považovaném za přijatelný.

U předepsaných limitů pro určení, zda výrobek vyhovuje

požadavkům příslušného článku, nejsou dovoleny žádné

další odchylky.

Při zjišťování shody s číselným limitem se vypočítaný

výsledek zkoušky na čistotu nebo stanovení obsahu

(účinnosti, aktivity) nejdříve zaokrouhlí na uvedený počet

platných číslic, pokud není předepsáno jinak. Limity, bez

ohledu na to, zda jsou vyjádřeny v procentech nebo v absolutních

hodnotách, se považují za významné včetně posledních

platných číslic (např. číslo 140 je vyjádřeno třemi

platnými číslicemi). Poslední číslice takto zaokrouhleného

výsledku se zvětšuje o jednu, jestliže číslice, která po ní následuje

u zaokrouhlovaného čísla, je 5 nebo číslice větší

než 5, kdežto jestliže je tato číslice menší než 5, zůstává poslední

číslice beze změny.

Uvádění povoleného limitu nečistot. Kritéria přijatelnosti

pro příbuzné látky jsou uvedena v jednotlivých článcích

buď porovnáním plochy píků (porovnávací zkoušky), nebo

číselnými hodnotami. Přibližný tolerovaný obsah nečistoty

nebo součtu nečistot může být uveden pro porovnávací

zkoušky v závorce pouze pro informaci. Kladné či záporné

posouzení obsahu nečistot se určí podle shody nebo neshody

s danou zkouškou. Není-li pro označenou nečistotu předepsáno

použití referenční látky, může se její obsah vyjádřit

jako jmenovitá koncentrace látky použité pro přípravu porovnávacího

roztoku předepsaného v článku, není-li uvedeno

jinak.

Rostlinné drogy. Pro rostlinné drogy se síranový popel,

celkový popel, ve vodě rozpustná látka, v ethanolu 96%

rozpustná látka, obsah vody, obsah silice a obsah účinné

látky počítají s odkazem na drogu, která nebyla zvlášť pro

tento případ vysušena, pokud není v článku předepsáno

jinak.

Ekvivalenty. Je-li uveden ekvivalent látky, mají se pro lékopisné

účely při aplikaci určitého článku použít pouze

uvedená čísla.

Biologické zkoušky. Při použití zvířat ke stanovení účinnosti

a k jiným biologickým zkouškám je nutno dodržovat

zákon č. 255/2017 Sb., na ochranu zvířat proti týrání ve

znění pozdějších předpisů a vyhlášku č. 299/2014 Sb., kterou

se mění vyhláška č. 419/2012 Sb., o ochraně pokusných

zvířat.

Živné půdy (kultivační média). Živné půdy (média) popsané

v článcích a obecných statích byly pro zamýšlený

účel shledány jako vyhovující. Nicméně složky živné půdy

(média), zvláště ty biologického původu, jsou proměnlivé

jakosti a pro optimální provedení (přípravu) může být úprava

koncentrace některých složek nezbytná, zejména u:

– peptonů a masových nebo kvasničných výtažků s ohledem

na jejich nutriční vlastnosti;

– tlumivých přísad;

– žlučových solí, žlučových výtažků, deoxycholátu

a barvicích přísad v závislosti na jejich selektivních

vlastnostech;

– antibiotik s ohledem na jejich účinnost.

SKLADOVÁNÍ

Informace a doporučení uvedená v části Skladování nejsou

zcela závazné. Oprávněná autorita může předepsat zvláštní

podmínky skladování, které se musí dodržovat. Český lékopis

předepisuje navíc proti Ph. Eur. zvláštní podmínky

skladování pro následující skupiny léčiv: omamné látky,

psychotropní látky, venena a separanda, viz Tabulky I až III

v Národní části.

Produkty popsané v lékopisu se skladují tak, aby se zabránilo

jejich kontaminaci a pokud možno i jejich znehodnocení.

Jsou-li doporučeny speciální podmínky skladování

Všeobecné

zásady

1.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 93

1.5 ZNAČKY A SYMBOLY

včetně druhu obalu (viz také stať 1.3) a limity teploty skladování,

jsou v článku uvedeny.

V článcích se v části označené Skladování používají následující

výrazy v uvedeném významu.

Ve vzduchotěsných obalech znamená, že produkt se skladuje

ve vzduchotěsném obalu (3.2). Ve vlhké atmosféře je

třeba obal otevírat opatrně. Nízkého obsahu vlhkosti lze dosáhnout,

je-li to nutné, použitím vysoušedla v obalu za podmínky,

že se vyloučí přímý kontakt vysoušedla s výrobkem.

Chráněn před světlem znamená, že produkt se skladuje buď

v obalu z materiálu, který dostatečně absorbuje aktinické

světlo a tím chrání obsah před změnou způsobenou světlem,

nebo v obalu vloženém do vnějšího obalu, který rovněž poskytuje

takovou ochranu, nebo se skladuje na takovém místě,

které je před světlem zcela chráněno.

OZNAČOVÁNÍ

Označování léčiv je obecně předmětem nadnárodních a národních

předpisů a mezinárodních dohod. Ustanovení uvedená

v části Označování nejsou proto vyčerpávající a navíc

jsou pro lékopisné účely závazná pouze ta ustanovení, která

jsou nutná k prokázání shody nebo neshody s článkem.

Jakákoliv další ustanovení týkající se označování jsou zařazena

v lékopisu jako doporučení. Lékopisná ustanovení týkající

se označování se mohou uvést na vnitřním obalu,

vnějším obalu nebo v příbalové informaci, nebo

v analytickém certifikátu přiloženém k výrobku, podle rozhodnutí

oprávněné autority.

VAROVÁNÍ

Materiály popsané v článcích a zkoumadla určená pro použití

v lékopisu mohou být zdraví škodlivé, pokud se nedodržují

odpovídající bezpečnostní opatření. Zásady správné praxe

v kontrolní laboratoři a ustanovení souvisejících předpisů je

třeba neustále zachovávat. Na jednotlivá rizika se v určitých

článcích upozorňuje pomocí varování; absence takových

oznámení neznamená, že žádné riziko neexistuje.

NEČISTOTY

Měl by být uveden seznam všech známých a potenciálních

nečistot, které byly detekovány zkouškami v určitém článku,

viz též stať 5.10 Kontrola nečistot v látkách pro farmaceutické

použití. Nečistoty se označují písmenem nebo písmeny

abecedy. Kde písmeno chybí, nečistota označená tímto

písmenem byla vypuštěna ze seznamu během přípravy

článku před jeho uveřejněním nebo během jeho revize.

FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY POMOCNÝCH LÁTEK

Články pomocných látek mohou obsahovat část Funkční

charakteristiky. Tyto charakteristiky, zkušební metody pro

jejich stanovení a limity nejsou povinnými požadavky,

nicméně mohou být důležité pro použití pomocné látky

a jsou uvedeny pro informaci (viz také část 1.1 Všeobecná

ustanovení).

REFERENČNÍ STANDARDY

Některé články vyžadují použití referenčních standardů

(chemické referenční látky, rostlinné referenční standardy,

biologické referenční přípravky, referenční spektra), viz také

stať 5.12 Referenční standardy. V případě arbitráže jsou

rozhodující pouze oficiální referenční standardy které vyhlašuje

Evropská lékopisná komise. Tyto referenční standardy

lze získat v Evropském direktorátu pro jakost léčiv

(EDQM; European Directorate for the Quality of Medicines

& Health Care). Informace o dostupných referenčních

standardech a prohlášení o použitelnosti šarže lze získat na

webových stránkách EDQM. Seznam referenčních standardů

Evropské lékopisné komise je uveden v Tabulce XII, Národní

části Českého lékopisu.

Český lékopis předepisuje referenční standardy jednak připravené

Evropskou lékopisnou komisí pro články přeložené

z Ph. Eur., jednak referenční standardy připravené Lékopisnou

komisí MZ pro články představující česká specifika.

Seznam referenčních standardů určených pro zkoušení podle

článků představujících česká specifika se uveřejňuje na

webových stránkách Státního ústavu pro kontrolu léčiv

a tyto referenční standardy lze objednat v sekretariátu Lékopisné

komise MZ.

Referenční látky pro radiofarmaka jsou látky s definovanou

čistotou a jsou vždy opatřeny příslušným osvědčením

s uvedením jakosti a doby použitelnosti. Získávají se od

Českého metrologického institutu – Inspektorátu pro ionizující

záření, Radiová 1, Praha 10.


A

A

[ ] %

Ar

20

[ a]

D

BRP

CRL

20

d 20

1 1cm

absorbance

specifická absorbance

relativní atomová hmotnost

specifická optická otáčivost

biologický referenční přípravek

chemická referenční látka

relativní hustota

HRL rostlinný referenční standard

λ

vlnová délka

m. j. mezinárodní jednotka

mol/l molarita (v Ph. Eur. označeno M)

Mr relativní molekulová hmotnost

index lomu

n D

20

Ph. Eur. j.

jednotka Evropského lékopisu

ppb jedna biliontina z celku (parts per billion)

(µg/kg nebo µg/l)

ppm jedna miliontina z celku (parts per million)

(mg/kg nebo µg/g nebo µg/ml)

R

zkoumadlo uvedené v obecné stati

4 Zkoumadla

RF retardační faktor (viz obecnou stať 2.2.46)

RS roztok zkoumadla

Rst poměr vzdálenosti středu skvrny zkoušené

látky od místa nanášení ke vzdálenosti středu

skvrny porovnávací látky od místa nanášení

používaný v chromatografii

TT teplota tání

TV teplota varu

94 ČL 2017 – Dopl. 2020


VR látka použitá jako primární standard pro odměrnou

analýzu (viz obecnou stať 4.2.1)

VS odměrný roztok (viz obecnou stať 4.2.2)

ZKRATKY POUŽÍVANÉ V ČLÁNCÍCH TÝKAJÍCÍCH

SE IMUNOSÉR, IMUNOGLOBULINŮ A VAKCÍN

CFU jednotky vytvářejících kolonie

LD50 statisticky stanovené množství látky, u něhož

po podání specifikovaným způsobem lze

předpokládat, že v daném období usmrtí

50 % pokusných zvířat

MLD nejmenší letální dávka

L+/10 dávka nejmenší množství toxinu, které v podmínkách

zkoušky, smícháno s 0,1 m. j. antitoxinu

a podáno specifikovaným způsobem, usmrtí

v daném období pokusná zvířata

L+ dávka nejmenší množství toxinu, které v podmínkách

zkoušky, smícháno s 1 m. j. antitoxinu

a podáno specifikovaným způsobem, usmrtí


Lr/100 dávka nejmenší množství toxinu, které v podmínkách


a vstříknuto intrakutánně, způsobí v daném

období charakteristickou reakci v místě

podání

Lp/10 dávka nejmenší množství toxinu, které v podmínkách


a podáno specifikovaným způsobem, paralyzuje


Lo/10 dávka největší množství toxinu, které v podmínkách


a podáno specifikovaným způsobem, nezpůsobí

v daném období pokusným zvířatům toxické

příznaky

Lf dávka množství toxinu nebo toxoidu, které v nejkratším

období vyvločkuje s 1 m. j. antitoxinu

CCID50 statisticky stanovené množství viru, u něhož

lze předpokládat, že infikuje 50 % buněčných

kultur, do nichž bylo přidáno

EID50 statisticky stanovené množství viru, u něhož

lze předpokládat, že infikuje 50 % embryonovaných

vajec, do nichž bylo inokulováno

ID50 statisticky stanovené množství viru, u něhož

lze předpokládat, že infikuje 50 % zvířat,

jimž bylo inokulováno

PD50 statisticky stanovená dávka vakcíny, u níž

lze v podmínkách zkoušek předpokládat, že

ochrání 50 % zvířat před čelenžní dávkou

toxinů nebo mikroorganismů, proti nimž je

účinná

ED50 statisticky stanovená dávka vakcíny, u níž

lze v podmínkách zkoušky předpokládat, že

u 50 % zvířat navodí tvorbu specifických

protilátek na antigeny související s vakcínou

PFU

SPF

jednotky vytvářející poky nebo jednotky

vytvářející plaky

prostý specifikovaných patogenů

SBÍRKY MIKROORGANISMŮ

ATCC American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209, USA

C.I.P. Collection de Bactéries de l’Institut Pasteur

B.P. 52, 25 rue du Docteur Roux

75724 Paris Cedex 15, France

IMI International Mycological Institute

Bakeham Lane

Surrey TW20 9TY, Great Britain

I.P. Collection Nationale de Culture de Microorganismes

(C.N.C.M.)

Institut Pasteur

25, rue du Docteur Roux

75724 Paris Cedex 15, France

NCIMB National Collection of Industrial and Marine

Bacteria Ltd

23 St Machar Drive

Aberdeen AB2 1RY, Great Britain

NCPF National Collection of Pathogenic Fungi

London School of Hygiene and Tropical

Medicine

Keppel Street

London WC1E 7HT, Great Britain

NCTC National Collection of Type Cultures

Central Public Health Laboratory

Colindale Avenue

London NW9 5HT, Great Britain

NCYC National Collection of Yeast Cultures

AFRC Food Research Institute

Colney Lane

Norwich NR4 7UA, Great Britain

NITE Biological Resource Center

Department of Biotechnology

National Institute of Technology

and Evaluation

2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba,

292-0818

Japan

S.S.I. Statens Serum Institut

80 Amager Boulevard, Copenhagen,

Denmark

CCM Česká sbírka mikroorganismů

Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity

Tvrdého 14, 602 00 Brno

CNCTC Česká národní sbírka typových kultur

mikroorganismů

Státní zdravotní ústav

Centrum epidemiologie

a mikrobiologie

Šrobárova 48, 100 42 Praha 10

Všeobecné

zásady

1.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 95

1.6 JEDNOTKY MEZINÁRODNÍ SOUSTAVY (SI) POUŽITÉ V LÉKOPISU A VZTAH K JINÝM JEDNOTKÁM

1.6 JEDNOTKY MEZINÁRODNÍ SOUSTAVY (SI) POUŽITÉ V LÉKOPISU

A VZTAH K JINÝM JEDNOTKÁM

MEZINÁRODNÍ SOUSTAVA JEDNOTEK (SI)

Mezinárodní soustava jednotek zahrnuje dvě hlavní skupiny

jednotek, jmenovitě základní jednotky a odvozené jednotky 1 .

Základní jednotky jsou metr, kilogram, sekunda, ampér,

kelvin, mol a kandela.

Odvozené jednotky jsou tvořeny ze základních jednotek

podle algebraických vztahů mezi odpovídajícími veličinami.

Některé z těchto odvozených jednotek mají speciální

názvy a symboly. Odvozené jednotky používané v lékopisu

jsou uvedeny v tabulce 1.6-1.

Některé důležité a všeobecně používané jednotky, které

nejsou součástí soustavy SI, uvádí tabulka 1.6-2.

Předpony uvedené v tabulce 1.6-3 se používají při vytváření

názvů a symbolů dekadických násobků a dílů jednotek SI.

POZNÁMKY

1. V lékopisu se používá Celsiova stupnice teplot (symbol

je t). Je definována vztahem:

t = T – To,

v němž To je definována jako 273,15 K. Celsiova nebo

stostupňová stupnice se vyjadřuje ve stupních Celsia

(symbol °C). Jednotka „stupeň Celsia“ se rovná jednotce

„kelvin“.

2. Výrazy pro koncentrace používané v lékopisu jsou definovány

ve Všeobecných zásadách.

3. Radián je rovinný úhel mezi dvěma poloměry kružnice,

které na obvodě vytínají oblouk stejné délky, jakou má

poloměr.

4. V lékopisu jsou definovány podmínky odstřeďování porovnáním

zrychlení a normálního tíhového zrychlení (g):

g = 9,806 65 m · s –2 .

5. V lékopisu jsou použity některé veličiny bez rozměrů:

relativní hustota (2.2.5), absorbance (2.2.25), specifická

absorbance (2.2.25) a index lomu (2.2.6).

6. Mikrokatal je definovaný jako enzymová aktivita, která

za definovaných podmínek přemění (např. hydrolýzou)

1 mikromol substrátu za sekundu.

Tab. 1.6-1 Odvozené jednotky použité v lékopisu a vztah k jiným jednotkám

Veličina

Název Symbol Název Symbol

vlnočet

vlnová

délka

plošný

obsah

objem

ν

λ

A, S

V

reciproký

metr

mikrometr

nanometr

čtverečný

metr

krychlový

metr

Jednotka

Vyjádření

v základních

jednotkách SI

1/m m –1

µm

nm

10 –6 m

10 –9 m

m 2 m 2

kmitočet v hertz Hz s –1

hustota

rychlost

ρ

v

kilogram na

krychlový

metr

metr za

sekundu

Vyjádření

v jiných

jednotkách SI

Převod jiných

jednotek

na jednotky SI

m 3 m 3 1 ml = 1 cm 3 = 10 –6 m 3

kg/m 3 kg · m –3

m/s m · s –1

síla F newton N m · kg · s –2

tlak,

mechanické

napětí

p pascal Pa m –1 · kg · s –2 N · m –2

1 g/ml = 1 g/cm 3 =

= 10 3 kg · m –3

1 dyn = 1 g · cm · s –2 = 10 –5 N

1 kp = 9,806 65 N

1 dyn/cm 2 = 10 –1 Pa =

= 10 –1 N · m –2

1 atm = 101 325 Pa =

= 101,325 kPa

1 bar = 10 5 Pa = 0,1 MPa

1 mm Hg = 133,322 387 Pa

1 Torr = 133,322 368 Pa

1 psi = 6,894 757 kPa

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

Definice jednotek užívaných v Mezinárodní soustavě jsou uvedeny v knize „Le Système International d’Unités (SI)“, vydané Bureau International

des Poids et Mesures, Pavillon de Breteuil, F-92310, Sèvres. V České republice jsou veličiny, jednotky, značky a převodní

činitele systému mezinárodních jednotek SI vydávány a doplňovány Českým normalizačním institutem v normách řady ČSN ISO 80000.

96 ČL 2017 – Dopl. 2020


Tab. 1.6-1 Dokončení

Veličina

Název Symbol Název Symbol

dynamická

viskozita

kinematická

viskozita

η

v

pascalsekunda

čtverečný

metr

za sekundu

Jednotka

Vyjádření

v základních

jednotkách SI

Vyjádření

v jiných

jednotkách SI

Pa · s m –1 · kg · s –1 N · s · m –2

m 2 /s m 2 · s –1

Pa · s · m 3 × kg –1

N · m · s · kg –1

energie W joule J m 2 · kg · s –2 N · m

výkon

(tepelný tok)

pohlcená

dávka

(radiační

energie)

rozdílový

elektrický

potenciál,

napětí

elektrický

odpor

elektrický

náboj

aktivita

vztažená

k radionuklidu

látková

koncentrace,

molární

koncentrace

hmotnostní

koncentrace

katalytická

aktivita

P watt W m 2 · kg · s –3

N × m × s –1

J · s –1

Převod jiných

jednotek

na jednotky SI

1 P = 10 –1 Pa · s =

= 10 –1 N · s · m –2

1 cP = 1 mPa · s

1 St = 1 cm 2 × s –1 =

= 10 –4 m 2 × s –1

1 erg = 1 cm 2 · g · s –2 =

1 dyn · cm = 10 –7 J

1 cal = 4,1868 J

1 erg/s = 1 dyn · cm · s –1 =

= 10 –7 W = 10 –7 N · m · s –1 =

= 10 –7 J · s –1

D gray Gy m 2 · s –2 J · kg –1 1 rad = 10 –2 Gy

U volt V m 2 × kg · s –3 · A –1 W · A –1

R ohm W m 2 · kg · s –3 · A –2 V · A –1

Q coulomb C A · s

A becquerel Bq s –1

c

ρ

mol na

krychlový

metr

kilogram

na krychlový

metr

mol/m 3 mol · m –3

kg/m 3 kg · m –3

Z katal kat mol · s –1

1 Ci = 37 · 10 9 Bq =

= 37 · 10 9 s –1

1 mol/l = 1 M =

= 1 mol/dm 3 =

= 10 3 mol · m –3

1 g/l = 1 g/dm 3 =

= 1 kg · m –3

Všeobecné

zásady

1.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 97


Tab. 1.6-2 Jednotky, které nejsou v SI, ale jsou akceptovány pro použití s jednotkami SI

čas

Veličina

Název

minuta

hodina

den

Jednotka

Symbol

min

h

d

Hodnota v SI jednotkách

1 min = 60 s

1 h = 60 min = 3600 s

1 d = 24 h = 86 400 s

rovinný úhel stupeň ° 1° = (π/180) rad

objem litr l (L) 1 l = 1 dm 3 = 10 –3 m 3

hmotnost

tuna

dalton

t

Da

frekvence otáčení otáčka za minutu ot/min

(r/min)

1 t = 10 3 kg

1 Da = 1,660539040(20) · 10 –27 kg

1 ot/min (r/min) = (1/60) s –1

energie elektronvolt eV 1 eV = 1,602176634 · 10 –19 J

Tab. 1.6-3 Dekadické násobky a díly SI jednotek

Činitel Předpona Značka Činitel Předpona Značka

10 18 exa E 10 –1 deci d

10 15 peta P 10 –2 centi c

10 12 tera T 10 –3 mili m

10 9 giga G 10 –6 mikro μ

10 6 mega M 10 –9 nano n

10 3 kilo k 10 –12 piko p

10 2 hekto h 10 –15 femto f

10 1 deka da 10 –18 atto a

98 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.1.1 KAPÁTKA

2 ZKUŠEBNÍ METODY

2.1 PŘÍSTROJE A JINÉ POMŮCKY KE ZKOUŠENÍ

2.1.1 KAPÁTKA

6.0:20101

2.1.2 POROVNÁVACÍ TABULKA STUPŇŮ

PÓROVITOSTI PRO FILTRY ZE

SLINUTÉHO SKLA 1 6.0:20102

Zkušební

metody

2.1

Tab. 2.1.2-1

Obr. 2.1.1-1 Standardní kapátko (rozměry v milimetrech)

Pokud se používá pojem „kapka“, rozumí se tím kapka získaná

za použití níže popsaného standardního kapátka.

Standardní kapátko (viz obrázek 2.1.1-1) je vyrobeno

z prakticky bezbarvého skla a je na dolním konci zakončeno

kruhovým otvorem v rovině kolmé k ose kapátka.

Mohou se použít jiná kapátka, pokud vyhovují následující

zkoušce.

Kapátko se pečlivě vyčistí a upevní ve vertikální poloze.

20 kapek vody R, které při teplotě (20 ±1) °C volně vykapou

z kapátka konstantní rychlostí 1 kapka/s, váží

(1000 ±50) mg.

S každým kapátkem se provedou tři stanovení. Výsledky

jednotlivých stanovení se neliší od průměru ze tří stanovení

o více než 5 %.

Stupeň

pórovitosti

(Ph. Eur.) 2

Maximální

průměr

pórů

v mikrometrech

Německo Francie Velká

Británie

1,6 méně než 5f – –

1,6

– 1–2,5 5 – 5

4 1,6–4 – – –

– 4–6 – 5 –

10 4–10 4f – 4

16 10–16 4 4 –

40 16–40 3 3 3

– 40–50 – – 2

100 40–100 2 2 –

– 100–120 – – 1

160 100–160 1 1 –

– 150–200 0 0 –

250 160–250 – – –

– 200–500 – 00 –

Speciální použití

Průměry v mikrometrech.

< 2,5 – bakteriologická filtrace;

4 až 10 – ultrajemná filtrace, dělení mikroorganismů

velkého průměru;

10 až 40 – analytická filtrace, velmi jemná filtrace rtuti,

velmi jemná disperze plynů;

40 až 100 – jemná filtrace, filtrace rtuti, jemná disperze

plynů;

100 až 160 – filtrace hrubých materiálů, disperze a promývání

plynů, předfiltry při použití jiných filtračních

materiálů;

160 až 500 – filtrace velmi hrubých materiálů, disperze

a promývání plynů.

2.1.3 ULTRAFIALOVÉ LAMPY PRO

ANALYTICKÉ ÚČELY

6.0:20103

Ultrafialové lampy pro analytické účely se zpravidla skládají

ze rtuťové výbojky, která slouží jako zdroj ultrafialo-

––––––––––––––––––––––––––––––

1

Uváděné hodnoty jsou přibližné.

2

Evropský lékopis přijal systém, který vyhlásila Mezinárodní organizace pro standardizaci (ISO, přejato do ČSN 70 4850).

ČL 2017 – Dopl. 2020 99

2.1.4 SÍTA

vého světla, a ze vhodného filtru, který eliminuje viditelnou

část spektra emitovaného výbojkou. Pokud lékopis předepisuje

ve zkoušce použití ultrafialového světla o vlnové délce

254 nm nebo 365 nm, použije se lampa, která se skládá ze

rtuťové výbojky a filtru, jejichž emisní pásmo má maximum

intenzity při 254 nm nebo 365 nm. Použitá lampa

umožňuje spolehlivou detekci standardní skvrny natrium-

-salicylátu o průměru asi 5 mm na vrstvě silikagelu G R,

pokud se skvrna pozoruje v běžné poloze vzhledem ke

zdroji záření.

Pro ověřování tohoto požadavku se nanáší 5 µl roztoku natrium-salicylátu

R (0,4 g/l) v ethanolu 96% R 1 pro lampy

s maximem při 254 nm a 5 µl roztoku (2 g/l) v ethanolu

96% R pro lampy s maximem při 365 nm. Vzdálenost

mezi lampou a chromatografickou deskou, nastavená při

zkoušce uvedené v lékopisném článku, nemá být větší než

vzdálenost nastavená při tomto ověřování.

2.1.4 SÍTA

6.0:20104

Používají se síta se čtvercovými otvory zhotovená ze vhodných

materiálů. Pro jiné než analytické účely mohou být

použita síta s kruhovými otvory, jejichž vnitřní průměry

jsou 1,25násobky velikosti čtvercových otvorů odpovídajícího

síta. Materiál, ze kterého jsou síta zhotovena, nesmí

reagovat s prosívanou látkou. Stupeň rozdrobnění je předepsán

v jednotlivých článcích tak, že číslo síta, jehož hodnota

odpovídá jmenovité velikosti otvorů v mikrometrech, je

uvedeno v závorce za názvem látky (viz tabulku 2.1.4-1).

Mezní odchylka 1 velikosti otvorů pro jednotlivý otvor (+X):

velikost otvorů nepřesahuje jmenovitou velikost otvorů

o více než X, které se vypočítá podle vzorce:

0,75

( w ) 0,25

4( w )

2

X = +

3

v němž značí:

w – velikost otvorů v mikrometrech.

Mezní odchylka velikosti otvorů pro průměrnou velikost

otvorů (±Y): průměrná velikost otvorů se neodchyluje od

jmenovité velikosti otvorů o více než ±Y, které se vypočítá

podle vzorce:

0,98

Y = w

27

+ 1,6 .

Střední mezní odchylka (+Z): nejvýše 6 % z celkového počtu

otvorů může mít velikost mezi „jmenovitou +X“

a „jmenovitou +Z“. Z je vyjádřeno vzorcem:

X + Y

Z = .

2

Průměr drátu (d): průměry drátu uvedené v tabulce 2.1.4-1

se vztahují na protkávané kovové drátěné pletivo vsazené

do rámu. Jmenovité průměry drátu se mohou lišit od těchto

hodnot v mezích limitů dmax a dmin. Tyto limity definují přípustné

rozpětí výběru přibližně ±15 % od jmenovitých

hodnot. Dráty ve zkoušeném sítu musí mít přibližně stejné

průměry v osnově a útku.

,

Tab. 2.1.4-1 (hodnoty jsou uvedeny v mikrometrech)

Číslo síta

(jmenovitá

velikost

otvorů)

11 200

8000

5600

4000

2800

2000

1400

1000

710

500

355

250

180

125

90

63

45

38

pro

jednotlivý

otvor nejvýše

Mezní odchylky velikosti otvorů

pro

průměrný

otvor

střední mezní

odchylka

doporučený

jmenovitý

průměr

Průměr drátů

rozpětí volby

+X ±Y +Z d dmax dmin

770

600

470

370

290

230

180

140

112

89

72

58

47

38

32

26

22

–

350

250

180

130

90

70

50

30

25

18

13

9,9

7,6

5,8

4,6

3,7

3,1

–

560

430

320

250

190

150

110

90

69

54

43

34

27

22

18

15

13

–

2500

2000

1600

1400

1120

900

710

560

450

315

224

160

125

90

63

45

32

30

2900

2300

1900

1700

1300

1040

820

640

520

360

260

190

150

104

72

52

37

35

2100

1700

1300

1200

950

770

600

480

380

270

190

130

106

77

54

38

27

24

––––––––––––––––––––––––––––––

1

Mezinárodní norma ISO 3310-1 (1975) [ČSN ISO 3310-1 (2006)].

100 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.1.5 ZKUMAVKY PRO POROVNÁVACÍ ZKOUŠKY

2.1.5 ZKUMAVKY PRO POROVNÁVACÍ

ZKOUŠKY

6.0:20105

Zkumavky pro porovnávací zkoušky jsou zkumavky z bezbarvého

skla s jednotným vnitřním průměrem, jejichž dno

je ploché a průhledné.

Sloupec kapaliny se pozoruje v rozptýleném světle shora

ve směru podélné osy zkumavky proti bílému nebo v případě

potřeby černému pozadí.

Předpokládá se použití zkumavek s vnitřním průměrem

16 mm. Mohou se použít i zkumavky s větším vnitřním

průměrem za předpokladu, že objem zkoušené kapaliny se

zvětší tak, aby výška sloupce ve zkumavce nebyla menší

než výška sloupce předepsaného objemu ve zkumavce

s vnitřním průměrem 16 mm.

2.1.6 DETEKČNÍ TRUBIČKY PRO PLYNY

9.3:20106

Detekční trubičky pro plyny jsou zatavené trubičky vyrobené

z průhledného inertního materiálu, které umožňují po

odlomení zátavů průchod plynu. Obsahují zkoumadla adsorbovaná

na inertních nosičích, která jsou vhodná k vizuální

detekci sledované látky. Je-li to nutné, mohou obsahovat

také předřazené vrstvy a/nebo adsorpční filtry k odstranění

látek, které ruší detekci sledované látky. Vrstva indikátoru

obsahuje buď jedno zkoumadlo pro detekci dané

nečistoty, nebo více zkoumadel pro detekci několika různých

látek (jednovrstvá nebo vícevrstvá trubička).

Zkouška se provádí průchodem předepsaného objemu zkoušeného

plynu detekční trubičkou. Délka zbarvené vrstvy

nebo intenzita barevné změny indikuje na dělené stupnici

přítomnost sledovaných nečistot.

Kalibrace detekčních trubiček se ověřuje podle pokynů výrobce.

Pracovní podmínky. Zkouška se provádí podle pokynů výrobce

nebo podle následujícího postupu.

Zdroj plynu se připojí ke vhodnému regulátoru tlaku a jehlovému

ventilu. Ohebná hadička zakončená dílem Y se připojí

k jehlovému ventilu a průtok zkoušeného plynu se seřídí

tak, aby procházel hadičkou vhodnou rychlostí (viz obrázek

2.1.6-1). Připraví se detekční trubička a připojí se k odběrové

pumpičce podle pokynů výrobce. Volný konec detekční trubičky

se krátkou hadičkou připojí ke druhému konci dílu Y.

Pumpičkou se provede potřebný počet nasátí plynu tak, aby

detekční trubičkou prošel vhodný objem zkoušeného plynu.

Odečte se hodnota udaná délkou zabarvené vrstvy nebo intenzitou

zbarvení na dělené stupnici. V případě negativního

výsledku mohou být detekční trubičky ověřeny pomocí kalibračního

plynu, který obsahuje sledovanou nečistotu.

Vzhledem k široké škále používaných kompresorových

olejů je nezbytné ověřit reaktivitu detekční trubičky pro

použitý olej. Informace o reaktivitě různých olejů jsou

popsány v příbalové informaci dodávané společně

s trubičkou. Pokud není použitý olej v letáku uveden, výrobce

trubiček musí ověřit reaktivitu trubičky a, je-li to

nutné, určí trubičku specifickou pro tento olej.

Trubička k detekci arsanu. Je to skleněná zatavená trubička

obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče pro zlatitou

sůl nebo jiný vhodný indikátor. Minimální zjistitelná

hodnota je 0,25 ml/m 3 nebo méně, s relativní směrodatnou

odchylkou nejvýše 20 %.

Trubička k detekci fosfanu. Je to skleněná zatavená trubička

obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče pro zlatitou

sůl nebo jiný vhodný indikátor. Minimální zjistitelná

hodnota je 0,2 ml/m 3 nebo méně, s relativní směrodatnou


Trubička k detekci oleje. Je to skleněná zatavená trubička

obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče pro kyselinu sírovou

jako indikátor. Minimální zjistitelná hodnota je

0,1 mg/m 3 s relativní směrodatnou odchylkou nejvýše 30 %.

Trubička k detekci oxidu dusnatého a oxidu dusičitého.

Je to skleněná zatavená trubička obsahující adsorpční filtry

a vhodné nosiče pro oxidační vrstvu (sůl šestimocného

chromu) a difenylbenzidin jako indikátor. Minimální zjistitelná

hodnota je 0,5 ml/m 3 s relativní směrodatnou odchylkou

nejvýše 15 %.

Trubička k detekci oxidu siřičitého. Je to skleněná zatavená

trubička obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče pro

jod a škrob jako indikátor. Minimální zjistitelná hodnota je

0,5 ml/m 3 s relativní směrodatnou odchylkou nejvýše 15 %.

Trubička k detekci oxidu uhelnatého. Je to skleněná zatavená

trubička obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče

pro oxid jodičný, oxid seleničitý a kyselinu sírovou jako

indikátory. Minimální zjistitelná hodnota je 5 ml/m 3 nebo

méně, s relativní směrodatnou odchylkou nejvýše 15 %.

Trubička k detekci oxidu uhličitého. Je to skleněná zatavená

trubička obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče

pro hydrazin a violeť krystalovou jako indikátory. Minimální

zjistitelná hodnota je 100 ml/m 3 s relativní směrodatnou


Trubička k detekci sulfanu. Je to skleněná zatavená trubička

obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče pro olovnatou

sůl jako indikátor. Minimální zjistitelná hodnota je

0,2 ml/m 3 nebo méně, s relativní směrodatnou odchylkou

nejvýše 10 %.

Trubička k detekci vodní páry. Je to skleněná zatavená

trubička obsahující adsorpční filtry a vhodné nosiče pro

chloristan hořečnatý jako indikátor. Minimální zjistitelná

hodnota je 67 ml/m 3 nebo méně, s relativní směrodatnou


1 = zdroj plynu

2 = regulátor tlaku

3 = jehlový ventil

4 = spojovací díl Y

5 = detekční trubička

6 = nasávací pumpička

7 = výstup do atmosféry

Obr. 2.1.6-1 Schéma detekční trubičky pro plyny

Zkušební

metody

2.1

ČL 2017 – Dopl. 2020 101

2.2.1 ČIROST A STUPEŇ OPALESCENCE TEKUTIN

2.2 FYZIKÁLNÍ A FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ METODY

2.2.1 ČIROST A STUPEŇ OPALESCENCE

TEKUTIN

9.2:20201

Opalescence je jev vznikající absorpcí nebo rozptylem světla

submikroskopickými částicemi nebo následkem optické

hustoty nehomogenit. Čirý roztok neobsahuje částice, ani

nehomogenity.

Kapalina je čirá, jestliže její čirost je stejná jako u vody R

nebo použitého rozpouštědla při zkoušení za dále uvedených

podmínek, nebo jestliže nejeví silnější opalescenci

než porovnávací suspenze I (viz Tabulku 2.2.1-1).

V článcích se požaduje vizuální metoda za použití definovaných

porovnávacích suspenzí (viz Tabulku 2.2.1-1). Pro

posouzení shody s požadavky článku lze také použít dále

uvedené instrumentální metody, jestliže se prokáže vhodnost

přístroje, jak je popsáno dále, a jestliže byla provedena

kalibrace s porovnávacími suspenzemi I až IV a vodou R

nebo použitým rozpouštědlem.

VIZUÁLNÍ METODA

Použijí se stejné zkumavky z bezbarvého průhledného neutrálního

skla s plochým dnem a s vnitřním průměrem

15 mm až 25 mm. Porovnává se zkoušená kapalina s čerstvě

připravenou porovnávací suspenzí (jaká je popsána dále).

Zajistí se, aby výška vrstev v obou zkumavkách byla

stejná (asi 40 mm).

Roztoky se porovnávají v rozptýleném denním světle 5 min

po přípravě porovnávací suspenze, pozorují se ve svislé poloze

proti černému pozadí.

Test způsobilosti. Rozptyl světla musí být takový, aby bylo

možno snadno rozlišit porovnávací suspenzi I od vody R,

a porovnávací suspenzi II od porovnávací suspenze I (viz

Tabulku 2.2.1-1).

INSTRUMENTÁLNÍ METODA

Přístrojové hodnocení čirosti a opalescence zajišťuje zkoušku

s větší rozlišitelností, která není závislá na vizuální

schopnosti analytika. Pro sledování jakosti a řízení procesu,

zvláště u stabilitních studií, je číselné hodnocení užitečnější.

Např. předběžné číselné údaje stability se mohou použít

k určení, zda daná šarže přípravku přesáhne limity použitelnosti

před uplynutím doby použitelnosti.

TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE

Když se suspenze pozoruje v pravém úhlu ke směru dopadajícího

světla, systém ukazuje opalescenci způsobenou odrazem

světla od částic suspenze (Tyndallův jev). Určitá část

světelného paprsku vstupujícího do zakalené tekutiny jí

prochází, jiná část je absorbována a zbývající část je rozptýlena

suspendovanými částicemi. Jev světla rozptýleného

suspendovanými částicemi se měří nepřímo pozorováním

propuštěného světla (turbidimetrií) nebo přímo pozorováním

rozptýleného světla (nefelometrií). Turbidimetrie

a nefelometrie jsou spolehlivější v nízkých rozmezích zákalu,

kde je lineární vztah mezi hodnotami zákalu a signály

detektoru. Jestliže se stupeň zákalu zvyšuje, nejsou všechny

částice vystaveny dopadajícímu světlu a rozptýlené nebo

absorbované záření jinými částicemi se nemůže dostat

k detektoru.

Základem kvantitativního měření je sestrojení kalibrační

křivky. Linearita se musí prokázat za použití nejméně čtyř

koncentrací. Musí se prokázat, že porovnávací suspenze

mají stabilní stupeň opalescence a musí být připraveny za

jasně definovaných podmínek.

MĚŘENÍ V POMĚROVÉM NASTAVENÍ

Stanovení opalescence barevných kapalin se provádí přístroji

v poměrovém nastavení, protože barva způsobuje negativní

interferenci, zeslabení jak dopadajícího, tak rozptýleného

světla a snižuje hodnotu zákalu (turbidity). Vliv je

tak velký, že dokonce ani pro slabě zabarvené vzorky nelze

použít běžné nefelometry.

V turbidimetrii nebo nefelometrii v poměrovém nastavení

se stanoví vztah mezi měřením propustnosti a měřením

rozptýleného světla pod úhlem 90°. Při tomto postupu se

kompenzuje úbytek rozptýleného světla způsobený zbarvením

vzorku. Přístroje v poměrovém nastavení používají jako

zdroj světla wolframovou lampu se spektrální citlivostí

při asi 550 nm pracující při žhavicí teplotě barevného vlákna

2700 K. Mohou se použít i jiné vhodné světelné zdroje.

Jako detektory se obvykle používají silikonové fotodiody

a fotonásobiče, které zaznamenávají změny světla rozptýleného

nebo propuštěného vzorkem. Rozptýlené světlo je měřeno

primárním detektorem pod úhlem (90 ±2,5)°. Jiné detektory

měří zadní a čelní světlo (světlo odražené dopředu)

a současně také světlo propuštěné. Výsledky se získají výpočtem

poměru hodnoty světla rozptýleného pod úhlem 90°

k součtu hodnot světla odraženého dopředu a světla propuštěného.

Použité přístroje se kalibrují proti standardům o známé

hodnotě zákalu a jsou schopné hodnotu zákalu změřit automaticky.

Výsledky zkoušky se odečítají přímo na přístroji

a porovnávají se s požadavky v jednotlivých článcích.

Alternativně se může vliv zbarvení vzorku také eliminovat

použitím diody emitující infračervené světlo (IR LED)

o emisním maximu při 860 nm se spektrální šířkou pásu

60 nm jako světelného zdroje přístroje.

POŽADAVKY NA PŘÍSTROJE

Přístroje splňují následující charakteristiky a pro posouzení

shody s požadavky článku uvedené instrumentální metody

lze také místo vizuálního posouzení použít dále popsané

porovnávací suspenze.

– Měrná jednotka: jednotky NTU (nephelometric turbidity

units) jsou založeny na zákalu primárního formazinového

standardu. Také se používají jednotky FTU (formazin

turbidity units) nebo FNU (formazin nephelometry units),

které jsou ekvivalentní k NTU v oblastech o nízkém zákalu

(do 40 NTU). Tyto jednotky se používají u všech tří

instrumentálních metod (nefelometrie, turbidimetrie i v poměrovém

nastavení).

– Rozsah měření: 0,01 NTU až 1100 NTU.

– Rozlišení: 0,01 NTU pro rozsah 0 NTU až 9,99 NTU;

0,1 NTU pro rozsah 10,0 NTU až 99,9 NTU; a 1 NTU

pro rozsah ˃ 100 NTU.

– Přesnost: ±(10 % odečtu + 0,01 NTU) pro rozsah 0 NTU

až 20 NTU; ±7,5 % pro rozsah 20 NTU až 1100 NTU.

– Opakovatelnost: ±0,05 NTU pro rozsah 0 NTU až

20 NTU; ±2 % odečtu pro rozsah 20 NTU až 1100 NTU.

102 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.2 STUPEŇ ZBARVENÍ TEKUTIN

Přístroje s jiným rozsahem měření nebo rozlišením, přesností

a opakovatelností, než je uvedeno výše, se mohou použít,

jestliže jsou dostatečným způsobem validovány a jsou

způsobilé pro zamýšlené použití.

KONTROLA ZPŮSOBILOSTI PŘÍSTROJE

– Kalibrace: provádí se s nejméně čtyřmi porovnávacími

suspenzemi formazinu pokrývajícími celý rozsah měřených

hodnot. Mohou se použít porovnávací suspenze popsané

v této stati nebo vhodné porovnávací standardy kalibrované

na primární porovnávací suspenze.

– Rozptýlené světlo:˂ 0,15 NTU pro rozsah 0 NTU až

10 NTU; ˂ 0,5 NTU pro rozsah 10 NTU až 1100 NTU.

Rozptýlené světlo je definováno jako světlo, které dosáhne

nefelometrického detektoru, ale není rozptýleno vzorkem.

Představuje vždy pozitivní interferenci a je významným

zdrojem chyb v nízkých oblastech měření zákalu.

Zdroje rozptylu světla zahrnují: nepravidelnosti

a praskliny kyvet se vzorkem, vnitřní odrazy optického

systému, znečištění optiky nebo komory pro kyvetu prachem,

a elektronický šum. Parametry přístroje mohou také

způsobit rozptyl světla. V poměrovém nastavení je

vliv rušivého světla zanedbatelný.

Zkouška metody pro analýzu specifických látek/produktů

musí také být ověřena, aby se prokázala její analytická způsobilost.

Přístroj a metoda by měly být ve shodě s vlastnostmi

zkoušené látky.

Měření standardů a vzorků by mělo být provedenou za stejné

teploty, upřednostňuje se rozmezí 20 °C až 25 °C.

POROVNÁVACÍ SUSPENZE

Formazin má několik vhodných vlastností, které předurčují

jeho použití jako standardu pro turbidimetrii. Může se reprodukovatelně

připravovat ze surovin se stanoveným obsahem.

Pro fyzikální vlastnosti je vhodný jako světlo rozptylující

kalibrační standard. Polymer formazinu sestává

z řetězců o různé délce, které se skládají do nahodilých

konfigurací. Výsledkem je široký rozsah částic různých velikosti

a tvarů, které analyticky odpovídají částicím různých

velikosti a tvarů ve skutečném vzorku. K přípravě stabilních

zředěných porovnávacích standardů pro turbidimetrii

se mohou použít komerčně dostupné stabilizované formazinové

suspenze po porovnání se standardy připravenými

popsaným způsobem.

Všechny dále popsané fáze přípravy porovnávacích suspenzí

probíhají při (25 ±3) °C.

Roztok hydrazin-sulfátu. 1,0 g hydrazin-sulfátu R se rozpustí

ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. Nechá se stát 4 h až 6 h.

Primární suspenze pro opalescenci (formazinová suspenze).

Ve 100ml baňce se zabroušenou skleněnou zátkou

se rozpustí 2,5 g methenaminu R ve 25,0 ml vody R, přidá

se 25,0 ml roztoku hydrazin-sulfátu. Promíchá se a nechá se

stát 24 h. Tato suspenze je stabilní dva měsíce, jestliže se

skladuje ve skleněných nádobách bez defektů povrchu. Suspenze

nesmí přilnout ke stěně nádoby a před použitím se

musí dobře promíchat.

Standard pro opalescenci. 15,0 ml primární suspenze pro

opalescenci se zředí vodou R na 1000,0 ml. Čerstvě připravená

suspenze se může uchovávat nejdéle 24 h.

Porovnávací suspenze. Porovnávací suspenze se připravují

v čas potřeby podle tabulky 2.2.1-1; před použitím se smíchají

a protřepou.

Tab. 2.2.1-1

standard pro

opalescenci

I II III IV

5,0 ml 10,0 ml 30,0 ml 50,0 ml

voda R 95,0 ml 90,0 ml 70,0 ml 50,0 ml

Měření porovnávacích suspenzí I až IV v poměrovém nastavení

vykazuje lineární vztah mezi koncentracemi a naměřenými

hodnotami NTU (viz tabulku 2.2.1-2).

Tab. 2.2.1-2

Formazinové suspenze Hodnoty opalescence

(NTU)

porovnávací suspenze I 3

porovnávací suspenze II 6

porovnávací suspenze III 18

porovnávací suspenze IV 30

standard pro opalescenci 60

primární suspenze pro opalescenci

4000


6.0:20202

Hodnocení stupně zbarvení tekutin v barevné řadě hnědá,

žlutá, červená se provádí jednou ze dvou metod níže uvedených,

předepsaných v jednotlivých článcích.

Tekutina je bezbarvá, jestliže je stejného vzhledu jako voda

R nebo rozpouštědlo, nebo není-li více zbarvena než porovnávací

barevný roztok H9.

METODA I


skla s vnějším průměrem 12 mm. Porovnávají se

2,0 ml zkoušené tekutiny se 2,0 ml vody R nebo rozpouštědla

nebo porovnávacího barevného roztoku (viz tabulky porovnávacích

barevných roztoků), jak je předepsáno v článku.

Porovnávání se provádí v rozptýleném denním světle

proti bílému pozadí kolmo k podélné ose zkumavky.

METODA II


skla s plochým dnem a s vnitřním průměrem 15 mm

až 25 mm. Porovnává se zkoušená tekutina s vodou R nebo

rozpouštědlem nebo s porovnávacím barevným roztokem

(viz tabulky porovnávacích barevných roztoků), jak je předepsáno

v článku. Výška vrstvy je 40 mm. Porovnávání se

provádí v rozptýleném denním světle proti bílému pozadí

shora ve směru podélné osy zkumavky.

ZKOUMADLA

Základní barevné roztoky

Žlutý roztok

46 g chloridu železitého R se rozpustí v asi 900 ml směsi

25 ml kyseliny chlorovodíkové R a 975 ml vody R a zředí se

stejnou směsí na 1000,0 ml. Titračně se stanoví skutečný obsah,

který se stejnou směsí upraví na 45,0 mg FeCl3.6H2O

v mililitru. Roztok se skladuje chráněn před světlem.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 103


Stanovení obsahu. Ve 250ml kuželové baňce se zabroušenou

zátkou se smíchá 10,0 ml připraveného roztoku, 15 ml

vody R, 5 ml kyseliny chlorovodíkové R a 4 g jodidu draselného

R. Baňka se uzavře, nechá se stát 15 min v temnu

a pak se přidá 100 ml vody R. Uvolněný jod se titruje thiosíranem

sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml roztoku

škrobu RS jako indikátoru, který se přidá před koncem titrace.

1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 27,03 mg

FeCl3.6H2O.

Červený roztok

60 g chloridu kobaltnatého R se rozpustí v asi 900 ml směsi


stejnou směsí na 1000,0 ml. Titračně se stanoví skutečný

obsah, který se stejnou směsí upraví na 59,5 mg

CoCl2.6H2O v mililitru.

Stanovení obsahu. Ve 250ml kuželové baňce se zabroušenou

zátkou se smíchá 5,0 ml připraveného roztoku, 5 ml

peroxidu vodíku zředěného RS, 10 ml roztoku hydroxidu

sodného R (300 g/l) a opatrně se vaří 10 min. Po ochlazení

se přidá 60 ml kyseliny sírové zředěné RS a 2 g jodidu draselného

R. Baňka se uzavře a vzniklá sraženina se rozpustí

mírným třepáním. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným

0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml škrobu RS jako indikátoru,

který se přidá před koncem titrace. Titruje se do vzniku

růžového zbarvení.


CoCl2.6H2O.

Modrý roztok

63 g síranu měďnatého R se rozpustí v asi 900 ml směsi


stejnou směsí na 1000,0 ml. Stanoví se skutečný obsah, který

se stejnou směsí upraví na 62,4 mg CuSO4.5H2O v mililitru.

Stanovení obsahu. V 250ml kuželové baňce se zabroušenou

zátkou se smíchá 10,0 ml připraveného roztoku, 50 ml vody

R, 12 ml kyseliny octové zředěné RS a 3 g jodidu draselného

R. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným

0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml škrobu RS jako indikátoru,

který se přidá před koncem titrace. Titruje se do vzniku

světle hnědého zbarvení.


CuSO4.5H2O.

Standardní barevné roztoky

Smícháním tří základních barevných roztoků se připraví pět

standardních barevných roztoků (viz tabulku 2.2.2-1).

Tab. 2.2.2-1

Standardní

barevný roztok

H (hnědý)

HŽ (hnědožlutý)

Ž (žlutý)

ZŽ (zelenožlutý)

Č (červený)

Množství roztoku v mililitrech

žlutý

roztok

3,0

2,4

2,4

9,6

1,0

červený

roztok

3,0

1,0

0,6

0,2

2,0

modrý

roztok

2,4

0,4

0,0

0,2

0,0

kyselina

chlorovodíková

(10 g/l

HCl)

1,6

6,2

7,0

0,0

7,0

Porovnávací barevné roztoky pro Metody I a II

Zředěním standardních barevných roztoků se připraví porovnávací

barevné roztoky (viz tabulky 2.2.2-2 až 2.2.2-6).

Tab. 2.2.2-2 Porovnávací barevné roztoky H

Porovnávací

barevný roztok

H1

H2

H3

H4

H5

H6

H7

H8

H9


standardní kyselina

roztok H chlorovodíková

(10 g/l HCl)

75,0

50,0

37,5

25,0

12,5

5,0

2,5

1,5

1,0

Tab. 2.2.2-3 Porovnávací barevné roztoky HŽ

Porovnávací

barevný roztok

HŽ1

HŽ2

HŽ3

HŽ4

HŽ5

HŽ6

HŽ7

25,0

50,0

62,5

75,0

87,5

95,0

97,5

98,5

99,0


standardní kyselina

roztok HŽ chlorovodíková

(10 g/l HCl)

100,0

75,0

50,0

25,0

12,5

5,0

2,5

Tab. 2.2.2-4 Porovnávací barevné roztoky Ž

Porovnávací

barevný roztok

Ž1

Ž2

Ž3

Ž4

Ž5

Ž6

Ž7

0,0

25,0

50,0

75,0

87,5

95,0

97,5


standardní

roztok Ž

100,0

75,0

50,0

25,0

12,5

5,0

2,5

Tab. 2.2.2-5 Porovnávací barevné roztoky ZŽ

Porovnávací

barevný roztok

ZŽ1

ZŽ2

ZŽ3

ZŽ4

ZŽ5

ZŽ6

ZŽ7

kyselina

chlorovodíková

(10 g/l HCl)

0,0

25,0

50,0

75,0

87,5

95,0

97,5


standardní

roztok ZŽ

25,0

15,0

8,5

5,0

3,0

1,5

0,75

kyselina

chlorovodíková

(10 g/l HCl)

75,0

85,0

91,5

95,0

97,0

98,5

99,25

104 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.3 POTENCIOMETRICKÉ STANOVENÍ PH

Tab. 2.2.2-6 Porovnávací barevné roztoky Č

Porovnávací

barevný roztok

Č1

Č2

Č3

Č4

Č5

Č6

Č7


standardní

roztok Č

100,0

75,0

50,0

37,5

25,0

12,5

5,0

kyselina

chlorovodíková

(10 g/l HCl)

0,0

25,0

50,0

62,5

75,0

87,5

95,0

SKLADOVÁNÍ

Pro Metodu I mohou být porovnávací barevné roztoky

skladovány v uzavřených zkumavkách z bezbarvého průhledného

neutrálního skla s vnějším průměrem 12 mm,

chráněny před světlem.

Pro Metodu II se připravují porovnávací barevné roztoky ze

standardních barevných roztoků těsně před použitím.

2.2.3 POTENCIOMETRICKÉ STANOVENÍ pH

8.8:20203

Hodnota pH vodných roztoků je definována jako záporná

hodnota dekadického logaritmu aktivity oxoniových iontů,

je vyjádřena konvenčně jako koncentrace oxoniových iontů

v roztoku. Pro praktické účely se používá konvenční stupnice

pH. Hodnota pH zkoušeného roztoku je vztažena na

hodnotu pH referenčního roztoku (pHs) podle vzorce:

v němž značí:

E – potenciál článku se zkoušeným roztokem vyjádřený

ve voltech;

Es – potenciál článku s roztokem o známém pH (pHS) vyjádřený

ve voltech;

k – změna potenciálu na jednotku změny pH vypočítaná

z Nernstovy rovnice a vyjádřená ve voltech.

Tab. 2.2.3-1 Hodnoty k při různých teplotách

Teplota (°C)

15

20

25

30

35

pH = pH

s

E - E

-

k

k (V)

0,0572

0,0582

0,0592

0,0601

0,0611

Při potenciometrickém stanovení pH se měří rozdíl potenciálu

mezi dvěma vhodnými elektrodami ponořenými do

zkoušeného roztoku. Jedna z těchto elektrod (indikační) je

citlivá na oxoniové ionty (obvykle elektroda skleněná)

a druhá elektroda je srovnávací (např. argentchloridová

elektroda). Často jsou obě elektrody spojeny do jedné kombinované

elektrody vybavené teplotní sondou.

s

,

Přístroj. Měřicím přístrojem je obvykle voltmetr se vstupním

odporem nejméně stonásobně větším než odpor použitých

elektrod. Je běžně kalibrován v jednotkách pH a jeho

rozlišovací schopnost má být nejméně 0,05 jednotek pH

nebo nejméně 0,003 V.

Současné pH metry jsou ovládané mikroprocesorem a pracují

s programovým vybavením nebo softwarem podle daných

pokynů.

Údržba elektrod. Elektrody se uchovávají vhodným způsobem

a podle doporučení výrobce (např. v elektrolytu nebo ve

vhodném skladovacím roztoku). Elektrody se před měřením

vizuálně zkontrolují. U plnitelných elektrod se prověří, zda

nejsou ve skleněné nádržce elektrody vzduchové bubliny

a zda je hladina vnitřního elektrolytu dostatečná. Plnicí otvor

musí zůstat během měření otevřený. Doporučuje se také prověřit

membránu srovnávací elektrody. Před prvním použitím,

nebo pokud se elektroda skladuje mimo elektrolyt, je třeba ji

oživit podle pokynů výrobce. Pokud je ustalování pH příliš

pomalé (tj. je dlouhá časová odezva) nebo je nulový posun

(zero point shift), snížená strmost směrnice (reduced slope),

nebo se pozorují jiné obtíže při kalibraci, elektrodu je pravděpodobně

třeba vyčistit nebo vyměnit. Čištění se provádí

v závislosti na povaze vzorku a je popsáno v manuálu výrobce.

Doporučuje se pravidelné čištění.

Kalibrace a podmínky měření. Není-li v článku uvedeno jinak,

provádějí se všechna měření při stejné teplotě, jaká se

použila při kalibraci (±2,5 °C), obvykle v rozmezí od 20 °C

do 25 °C. Tabulka 2.2.3-2 vyjadřuje změny pH v závislosti

na teplotě u řady referenčních tlumivých roztoků používaných

pro kalibraci přístroje. Pro korekci teploty je třeba se

řídit pokyny výrobce.

Kalibrace se skládá ze stanovení směrnice (např. 95 % až

105 %) a nastavení nuly měřicího systému. Většina komerčně

dostupných pH metrů nabízí vlastní autotest nebo

zkoušku startu, při kterém se např. porovná směrnice a asymetrie

zkoušených potenciálů se specifikacemi dodanými

výrobcem. Přístroj se kalibruje za použití nejméně dvou

tlumivých roztoků vybraných tak, aby očekávaná hodnota

pH zkoušeného roztoku ležela mezi hodnotami pH tlumivých

roztoků, které se od sebe liší o nejméně 2 jednotky

pH. Kalibrace musí být ověřena použitím jiného tlumivého

roztoku, jehož pH leží uprostřed rozsahu stupnice, a odečet

se nesmí lišit o více než 0,05 jednotek pH od hodnoty odpovídající

tomuto roztoku.

Jako referenční tlumivé roztoky se používají komerčně dostupné

certifikované referenční materiály. Alternativně mohou

být připraveny vlastní tlumivé roztoky z roztoků uvedených

v tabulce 2.2.3-2. Tyto roztoky musí být navázané

na primární standardy. Kalibrace by se měla provádět pravidelně,

pokud možno každý den používání, nebo před

každou sérií měření.

Elektrody se ponoří do zkoušeného roztoku a odečítání se

provede za stejných podmínek, jaké byly použity u referenčních

tlumivých roztoků.

Pokud se měří suspenze, emulze, nevodné roztoky nebo

roztoky částečně nevodného charakteru, kalibruje se systém

výše popsaným způsobem, odečet pH může být považován

pouze za přibližný odhad správné hodnoty. Pro měření pH

těchto směsí se musí použít vhodné elektrody.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 105

2.2.4 PŘIBLIŽNÉ HODNOTY pH ROZTOKŮ

Tab. 2.2.3-2 pH referenčních tlumivých roztoků při různých teplotách

Teplota

(ºC)

15

20

25

30

35

DpH

Dt

1

Kaliumtetraoxalát

0,05 mol/l

C4H3KO8

.2H2O

1,67

1,68

1,68

1,68

1,69

1

Změna pH na stupeň Celsia.

Kaliumhydrogentartarát

nasycený

při 25 °C

Kaliumdihydrogen-citrát

0,05 mol/l

Kaliumhydrogenftalát

0,05 mol/l

C4H5KO6 C6H7KO7 C8H5KO4

3,56

3,55

3,55

3,80

3,79

3,78

3,77

3,76

4,00

4,00

4,01

4,02

4,02

Dihydrogenfosforečnan

draselný

0,025 mol/l

+

hydrogenfosforečnan

sodný

0,025 mol/l

KH2PO4 +

Na2HPO4

6,90

6,88

6,87

6,85

6,84

Dihydrogenfosforečnan

draselný

0,0087 mol/l

+

hydrogenfosforečnan

sodný

0,0303 mol/l

KH2PO4 +

Na2HPO4

7,45

7,43

7,41

7,40

7,39

Tetraboritan

sodný

0,01 mol/l

Na2B4O7

.10H2O

9,28

9,23

9,18

9,14

9,10

Uhličitan

sodný

0,025 mol/l

+

hydrogenuhličitan

sodný

0,025 mol/l

Na2CO3 +

NaHCO3

10,12

10,06

10,01

9,97

9,93

Hydroxid

vápenatý

nasycený

při 25 °C

Ca(OH)2

12,81

12,63

12,45

12,29

12,13

+0,001 –0,0014 –0,0022 +0,0012 –0,0028 –0,0028 –0,0082 –0,0096 –0,034

PŘÍPRAVA REFERENČNÍCH TLUMIVÝCH

ROZTOKŮ

Kalium-tetraoxalát 0,05 mol/l. 12,61 g C4H3KO8.2H2O se

rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na

1000,0 ml.

Kalium-hydrogentartarát nasycený při 25 °C. Nadbytek

C4H5KO6 se intenzivně protřepává s vodou prostou oxidu

uhličitého R při 25 °C. Přefiltruje se nebo dekantuje. Připraví

se těsně před použitím.

Kalium-dihydrogencitrát 0,05 mol/l. 11,41 g C6H7KO7 se


1000,0 ml. Připraví se těsně před použitím.

Kalium-hydrogenftalát 0,05 mol/l. 10,13 g C8H5KO4 předem

sušeného 1 h při (110 ±2) °C se rozpustí ve vodě prosté

oxidu uhličitého R a zředí se jí na 1000,0 ml.

Dihydrogenfosforečnan draselný 0,025 mol/l + hydrogenfosforečnan

sodný 0,025 mol/l. 3,39 g KH2PO4

a 3,53 g Na2HPO4, oba předem sušené 2 h při (120 ±2) °C,

se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na

1000,0 ml.

Dihydrogenfosforečnan draselný 0,0087 mol/l + hydrogenfosforečnan

sodný 0,0303 mol/l. 1,18 g KH2PO4

a 4,30 g Na2HPO4, oba předem sušené 2 h při (120 ±2) °C,

se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na

1000,0 ml.

Tetraboritan sodný 0,01 mol/l. 3,80 g Na2B4O7.10H2O se


1000,0 ml. Skladuje se za chránění před vzdušným oxidem

uhličitým.

Uhličitan sodný 0,025 mol/l + hydrogenuhličitan sodný

0,025 mol/l. 2,64 g Na2CO3 a 2,09 g NaHCO3 se rozpustí

ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 1000,0 ml.

Skladuje se za chránění před vzdušným oxidem uhličitým.

Hydroxid vápenatý nasycený při 25 °C. Nadbytek hydroxidu

vápenatého R se protřepává při 25 °C s vodou prostou

oxidu uhličitého R a dekantuje se při 25 °C. Skladuje se za

chránění před vzdušným oxidem uhličitým.

SKLADOVÁNÍ TLUMIVÝCH ROZTOKŮ

Tlumivé roztoky se skladují ve vhodných chemicky odolných,

vzduchotěsných obalech, jako jsou skleněné obaly

třídy I nebo obaly z plastů vhodné pro vodné roztoky.

2.2.4 PŘIBLIŽNÉ HODNOTY pH ROZTOKŮ

8.6:20204

Přibližná hodnota pH se určí za použití proužku s indikátorem

pH R. Alternativně je možné použít indikátory pH, popsané

v tabulce 2.2.4-1.

Tab. 2.2.4-1

Reakce pH Indikátor

zásaditá

slabě zásaditá

silně zásaditá

>8

8 – 10

>10

papír lakmusový červený R

fenolftalein RS

modř thymolová RS

papír s fenolftaleinem R

modř thymolová RS

neutrální 6 – 8 červeň methylová RS

červeň fenolová RS

kyselá

slabě kyselá

silně kyselá

<6

4 – 6

<4

červeň methylová RS

modř bromthymolová RS1

červeň methylová RS

zeleň bromkresolová RS

papír s červení Kongo R

106 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.5 RELATIVNÍ HUSTOTA

2.2.5 RELATIVNÍ HUSTOTA

Relativní hustota

10.0:20205

látky je poměr hmotnosti určitého objemu

látky při teplotě t1 ke hmotnosti stejného objemu vody

při teplotě t2.

20

Pokud není určeno jinak, používá se relativní hustota .

20

Relativní hustota se také často vyjadřuje jako .

Může být též použita hustota r20, která je definována jako

hmotnost jednotky objemu látky při 20 °C. Udává se v kilogramech

na krychlový metr nebo v gramech na krychlový

centimetr (1 kg × m –3 = 10 –3 g × cm –3 ). Číselné vztahy mezi

relativní hustotou a hustotou udávanou v gramech na

krychlový centimetr jsou:

r20 = 0,998203 × nebo = 1,00180 × r20,

20

20

r20 = 0,999972 × nebo = 1,00003 × r20,

20

d 4

20

= 0,998230 × .

Relativní hustota nebo hustota se měří s přesností na tolik

desetinných míst, kolik je uvedeno v článku, pomocí pyknometru

(pevné látky nebo kapaliny), hydrostatické váhy

(pevné látky), hustoměru (kapaliny) nebo digitálního hustoměru

s vibračním převodníkem (kapaliny nebo plyny).

Při stanovení vážením se vztlak vzduchu zanedbává, což

může do měření vnést chybu jedné jednotky na třetím desetinném

místě. Při použití hustoměru nemá vztlak vzduchu

vliv.

Vibrační hustoměr. Přístroj se skládá z:

– trubice ve tvaru U, obvykle z borokřemičitého skla, obsahující

zkoušenou kapalinu;

– magnetoelektrického nebo piezoelektrického excitačního

systému, který způsobuje, že trubice vibruje jako konzolový

oscilátor charakteristickou frekvencí závislou na

hustotě zkoušené kapaliny;

– zařízení pro měření oscilační periody (T), které může také

umožňovat přímé odečítání hustoty, nebo se hustota vypočítá

za použití konstant A a B, jak je popsáno dále.

Rezonanční frekvence (f) je funkcí tuhosti pružiny (c)

a hmotnosti (m) systému:

tedy:

t1

d t 2

20

d 20

d 4

d 20

kde značí:

M – hmotnost trubice;

V – vnitřní objem trubice.

T

2

f

2

20

d 20

d 4

1

= =

2

T

1

×

4π

2

Zavedení dvou konstant A = c / 4π × V a B = M/V vede

ke klasické rovnici pro vibrační převodník:

2

r = A × T - B .

Konstanty A a B se stanoví s trubicí ve tvaru U naplněnou

dvěma různými vzorky známé hustoty, např. odplyněné

vody R a vzduchu. Kontrolní měření se provádí denně za

použití odplyněné vody R. Výsledky získané při kontrolním

měření za použití odplyněné vody R by se neměly lišit

c

m

æ M r × V

= ç +

è c c

2

,

ö

÷×4π

ø

2

( )

,

d 4

d 20

od porovnávací hodnoty (r20 = 0,998203 g · cm –3 ,

20

= 1,000000) o více, než je jeho specifická chyba.

d 20

Např. přístroj uvádějící ±0,0001 g · cm –3 by měl ukazovat

0,9982 ±0,0001 g · cm –3 , aby byl vhodný pro další měření,

jinak je nutné ho znovu nastavit. Kalibrace s certifikovanými

referenčními materiály se provádí v pravidelných intervalech.

Měření se provádí stejným způsobem jako kalibrace.

Pokud je třeba vyhnout se tvoření bublinek a zkrátit

dobu potřebnou pro stanovení, vytemperuje se zkoušená

kapalina před převedením do trubice v termostatu na 20 °C.

Faktory ovlivňující přesnost jsou:

– rovnoměrná teplota v celé trubici;

– nelinearita rozložení hustoty;

– rušivé rezonanční jevy;

– viskozita; roztoky o vyšší viskozitě, než je viskozita kalibračních

roztoků, mají hustotu zdánlivě vyšší, než je její

skutečná hodnota.

Vlivům nelinearity a viskozity se můžeme vyhnout použitím

kalibračních roztoků, které mají viskozitu a hustotu

blízkou zkoušené kapalině (±5 % pro hustotu, ±50 % pro

viskozitu). Hustoměr může mít funkci pro automatickou

korekci viskozity a opravu chyb vyplývajících z teplotních

změn a nelinearity.

Přesnost je funkcí opakovatelnosti a stability kmitočtu oscilátoru,

která je závislá na stálosti objemu, hmotnosti a tuhosti

pružiny nádobky.

Hustoměry jsou schopny dosáhnout přesnosti měření

s chybou řádově od 1 ∙ 10 –3 g · cm –3 až 1 ∙ 10 –5 g · cm –3

a opakovatelností od 1 ∙ 10 –4 g · cm –3 až 1 ∙ 10 –6 g · cm –3 .

2.2.6 INDEX LOMU

6.0:20206

Index lomu prostředí vztažený na vzduch se udává jako

poměr sinu úhlu dopadu paprsku světla ve vzduchu k sinu

úhlu lomu paprsku světla v daném prostředí.

Pokud není uvedeno jinak, měří se index lomu při teplotě

(20 ±0,5) °C při vlnové délce D-linie sodíkového světla

20

(l = 589,3 nm); užívaný symbol je potom .

n D

Refraktometry obvykle stanovují mezní úhel. Základní částí

těchto přístrojů je hranol o známém indexu lomu, který je

ve styku se zkoušenou kapalinou.

Ke kalibraci přístroje se použijí certifikované referenční

materiály.

Při použití bílého světla je refraktometr vybaven příslušným

kompenzačním zařízením. Přístroj umožňuje přesný

odečet nejméně na tři desetinná místa a je vybaven zařízením

umožňujícím práci při předepsané teplotě. Stupnice

teploměru je dělena po 0,5 °C nebo přesněji.

2.2.7 OPTICKÁ OTÁČIVOST

9.5:20207

Optická otáčivost (také se označuje optická aktivita) je

schopnost chirálních látek stáčet rovinu lineárně polarizovaného

světla.

Pravotočivé látky se označují (+) (tj. při pohledu směrem k dopadajícímu

světelnému paprsku otáčejí rovinu polarizovaného

světla ve směru hodinových ručiček). Levotočivé látky se

označují (–) (tj. otáčejí proti směru hodinových ručiček).

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 107

2.2.8 VISKOZITA

Úhel optické otáčivosti (α) kapaliny je úhel otočení roviny

polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové

délce D-linie sodíku (l = 589,3 nm) měřený při 20 °C

a tloušťce vrstvy kapaliny 1,00 dm.

Specifická optická otáčivost

[ a] 20

D

látky v roztoku se vypočítá

jako úhel a, o který se otočí rovina polarizovaného světla,

jak je definován výše, vztažený k tloušťce vrstvy v kyvetě

1,00 dm a koncentraci zkoušené látky 1 g/ml. Specifická

optická otáčivost látky v roztoku je vždy vyjádřena

pro dané rozpouštědlo a pro danou koncentraci.

Některé polarimetry nepoužívají sodíkovou výbojku, v tom

případě se měření provede o vlnové délce 589 nm místo

589,3 nm.

V určitých případech specifikovaných v článcích se úhel

optické otáčivosti měří při jiných teplotách a jiných vlnových

délkách a/nebo v kyvetách o tloušťce vrstvy jiné než

1,00 dm.

V konvenčním systému přijatém lékopisem se specifická

optická otáčivost vyjadřuje bez jednotek; skutečnou jednotkou

se rozumí stupně krát mililitry na decimetr a gram

[(°) × ml × dm –1 × g –1 ].

ZAŘÍZENÍ

Polarimetr se obvykle sestává ze:

– zdroje světla, např. sodíkové výbojky, elektroluminiscenční

diody (LED) nebo jiného zdroje světla schopného poskytnout

záření požadované vlnové délky (589 nm, neníli

v článku předepsáno jinak); pokud je zdroj světla polychromatický,

je nezbytné vymezit požadovanou vlnovou

délku, např. optickým filtrem;

– polarizátoru a analyzátoru;

– tloušťky vrstvy vzorku v kyvetě 1,00 dm, pokud není

v článku uvedeno jinak;

– detekčního systému měření úhlu optické otáčivosti; musí

být schopen poskytnout údaje s přesností nejméně 0,01°,

pokud není v článku uvedeno jinak;

– systému řízení teploty, který umožňuje odečet teploty

s přesností na 0,1°C; může být součástí polarimetru (např.

Peltierův systém), nebo může být externí jednotkou pro

regulaci teploty (např. cyklický kryostat); musí být schopen

udržovat teplotu kapaliny v rozmezí ±0,5 °C předepsané

teploty.

NASTAVENÍ ZAŘÍZENÍ

Přesnost stupnice je obvykle kontrolována v blízkosti hodnoty,

která má být měřena, nebo v příslušném rozsahu, obvykle

pomocí certifikovaných křemenných destiček. Mohou

být vhodné také jiné certifikované referenční materiály

(např. roztoky sacharosy).

Měření optické otáčivosti se může použít ke kvantifikaci

množství enantiomeru nebo poměru enantiomerů přítomných

ve vzorku. Pro tyto účely se musí kontrolovat linearita

(např. za použití roztoků sacharosy).

POSTUP

Nastaví se nulová poloha polarimetru a úhel otočení kapaliny

při vlnové délce 589 nm a teplotě (20 ±0,5) °C, pokud

není předepsáno jinak. Nulová poloha polarimetru se nastaví

s uzavřenou kyvetou; pro neředěné kapaliny pomocí

prázdné kyvety a pro roztoky látek pomocí kyvety naplněné

rozpouštědlem, které bylo použito k přípravě zkoušeného

roztoku při stejné teplotě.

Postup přípravy zkoušeného roztoku látky je popsán v příslušném

článku.

Specifická optická otáčivost při teplotě t a vlnové délce λ se

vypočítá podle následujících vzorců; pro neředěné kapaliny

se do výpočtu zahrne hustota kapaliny:

pro látky v roztoku:

a

a l

l × r

t

[ ] = ,

t

[ ] = ,

a l

v nichž značí:

a – úhel otočení ve stupních měřený při teplotě t a vlnové

délce λ;

l – tloušťku vrstvy vzorku v polarimetrické kyvetě

v decimetrech;

rt – hustotu stanovenou při teplotě měření (t) v gramech

na krychlový centimetr; pro účely lékopisu je hustota

nahrazena relativní hustotou (2.2.5).

c – koncentraci roztoku v gramech na litr.

Pokud jsou limity pro optickou otáčivost nebo specifickou

optickou otáčivost uvedeny pro vysušenou látku, bezvodou

látku nebo látku prostou rozpouštědla, výsledek musí být

korigován na ztrátu sušením (2.2.32), obsah vody (2.5.12

nebo 2.5.32) nebo obsah rozpouštědla, podle toho, co je

vhodné.

2.2.8 VISKOZITA

9.4:20208

Dynamická viskozita nebo koeficient viskozity (h) je tangenciální

síla připadající na jednotku povrchu a vyjádřená

jako smykové napětí (t) v pascalech, potřebná k tomu, aby

se dvě rovnoběžné vrstvy kapaliny o ploše 1 metr čtverečný

navzájem posunuly o vzdálenost (x) 1 metr rychlostí (v)

1 metr za sekundu.

Rychlostní gradient dv/dx udává smykový poměr D a vyjadřuje

se v reciprokých sekundách (s –1 ). Pro dynamickou

viskozitu (h) platí:

h = t/D.

Jednotkou dynamické viskozity je pascalsekunda (Pa × s).

Nejpoužívanější menší jednotkou je milipascalsekunda

(mPa × s).

Kinematická viskozita (n) kapaliny měřené při stejné teplotě,

vyjádřená v metrech čtverečných za sekundu, je poměr

dynamické viskozity (h) a hustoty (r) v kilogramech na

metr krychlový. Pro kinematickou viskozitu platí:

n = h/r.

Kinematická viskozita se obvykle vyjadřuje v milimetrech

čtverečných za sekundu (mm 2 × s –1 ).

Kapilární viskozimetr lze používat pro stanovení viskozity

newtonských kapalin a rotační viskozimetr pro stanovení

viskozity newtonských i nenewtonských kapalin. Jiné viskozimetry

lze používat za předpokladu, že jejich správnost

a přesnost jsou přinejmenším stejně uspokojivé jako

u viskozimetrů popsaných v příslušných statích.

t

1000a

l × c

108 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.9 MĚŘENÍ KAPILÁRNÍM VISKOZIMETREM

2.2.9 MĚŘENÍ KAPILÁRNÍM

VISKOZIMETREM

9.6:20209

PRINCIP

Stanovení viskozity pomocí vhodné velikosti kapilárního

viskozimetru (Ubeholdeho typu) se provádí při teplotě

(20,0 ±0,1) °C, není-li předepsáno jinak. Měří se čas potřebný

k tomu, aby hladina kapaliny klesla od jedné značky

ke druhé.

ZAŘÍZENÍ

Hlavní součásti kapilárního viskozimetru Ubelohdeho typu

jsou uvedeny na obrázku 2.2.9-1 1 .

Přístroj se kalibruje při teplotě použité při měření s využitím

nejméně dvou certifikovaných referenčních materiálů,

které mají viskozitu v rozsahu viskozimetru.

Vypočítá se konstanta viskozimetru (k) vyjádřená v milimetrech

čtverečných za sekundu za použití následujícího

vzorce:

h

k = ,

rt

v němž značí:

h – dynamickou viskozitu certifikovaného referenčního

materiálu v milipascalsekundách;

r – hustotu certifikovaného referenčního materiálu v miligramech

na mililitr krychlový;

t – dobu průtoku certifikovaného referenčního materiálu

potřebnou k poklesu od horní značky k dolní značce

v sekundách.

Zkušební

metody

2.2

Obr. 2.2.9-1 Kapilární viskozimetr Ubelohdeho typu

POSTUP

Vybere se kapilární viskozimetr vhodné velikosti, aby se

získala minimální doba průtoku 200 s.

Kalibrace

Kapilární viskozimetr se kalibruje v pravidelných intervalech,

jak je definováno v systému řízení jakosti a v pokynech

k použití zařízení.

Vypočítá se průměr ze získaných hodnot.

Postup

Trubicí (L) (viz obrázek 2.2.9-1) se naplní baňka viskozimetru

(část A) dostatečným množstvím zkoušené kapaliny

(předem vytemperované na teplotu 20 °C, není-li uvedeno

jinak). Zajistí se, aby hladina kapaliny v části (B) byla pod

ústím ventilační trubice (M). Viskozimetr se ve svislé poloze

ponoří do vodní lázně o teplotě (20,0 ±0,1) °C (není-li

předepsáno jinak) a nechá se stát nejméně 30 min, aby se

teploty vyrovnaly. Trubice (M) se uzavře a hladina kapaliny

v trubici (N) se nasaje asi 8 mm nad značku (E). V této poloze

se kapalina zadrží uzavřením horního ústí trubice (N)

a otevřením trubice (M). Otevře se trubice (N) a s přesností

na jednu pětinu sekundy se změří stopkami časový interval

poklesu hladiny kapaliny od značky (E) ke značce (F).

Doba průtoku zkoušené kapaliny je průměr ze tří po sobě

jdoucích měření. Výsledek je platný, pokud relativní směrodatná

odchylka tří po sobě jdoucích měření je nejvýše

2,0 %.

Výpočet

Vypočítá se kinematická viskozita (ν) (2.2.28) v milimetrech

čtverečných za sekundu podle vzorce:

n = kt,

v němž značí:

k – konstantu viskozimetru v milimetrech čtverečných za

sekundu;

t – dobu průtoku zkoušené kapaliny v sekundách.

Dynamická viskozita h (2.2.28) v milipascalsekundách se

vypočítá podle vzorce:

h = krt,

v němž značí:

r – hustotu zkoušené kapaliny při teplotě použité k měření

viskozity v miligramech na milimetr krychlový.

Hustota se může získat vynásobením relativní hustoty

zkoušené kapaliny číslem 0,99820 (měření při 20 °C) nebo

číslem 0,99704 (měření při 25 °C).

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

Evropský lékopis přijal systém, který vyhlásila mezinárodní organizace pro standardizaci (ISO)

ČL 2017 – Dopl. 2020 109

2.2.10 VISKOZITA – MĚŘENÍ ROTAČNÍM VISKOZIMETREM

2.2.10 VISKOZITA – MĚŘENÍ ROTAČNÍM

VISKOZIMETREM

6.0:20210

Principem metody je měření síly působící na rotor (torzní

síla), který se otáčí při konstantní úhlové rychlosti (rychlost

otáčení) v kapalině. Rotační viskozimetry se používají pro

měření viskozity newtonských (smykově nezávislé viskozity)

i nenewtonských kapalin (smykově závislé viskozity

nebo zdánlivé viskozity). Rotační viskozimetry se mohou

rozdělit do dvou skupin, a to absolutní a relativní viskozimetry.

U absolutních viskozimetrů je proudění v měřicí geometrii

dobře definováno. Výsledky měření v absolutních

hodnotách viskozity mohou být srovnávány s jakýmikoliv

jinými absolutními hodnotami. V relativních viskozimetrech

není proudění v měřicí geometrii definováno. Výsledky

měření jsou v relativních hodnotách viskozity, které nemohou

být srovnávány s absolutními hodnotami nebo

s jinými relativními hodnotami, pokud nejsou stanoveny

stejnou metodou s relativním viskozimetrem.

K dispozici jsou různé měřicí systémy pro dané rozsahy

viskozity, stejně jako několik rychlostí otáčení.

PŘÍSTROJE

Nejběžnější jsou následující typy přístrojů:

SOUSTŘEDNÉ VÁLCOVÉ VISKOZIMETRY

(ABSOLUTNÍ VISKOZIMETRY)

V soustředných válcových viskozimetrech (souosý dvouválcový

viskozimetr nebo jednoduchý souosý válcový viskozimetr),

se viskozita měří tak, že se kapalina umístí mezi

vnitřní a vnější válec. Měření viskozity se může provádět

otáčením vnitřního válce (viskozimetr typu Searle, viz obrázek

2.2.10-1) nebo otáčením vnějšího válce (viskozimetr

typu Couette, viz obrázek 2.2.10-2). Pro laminární proudění

je viskozita (nebo zdánlivá viskozita) η vyjádřená v pascalsekundách

dána vzorcem:

1 æ M ö

æ

1 1

ö

M

η = ç ÷

ç

-

÷

= k ,

ω è 4πh

ø ç 2 2

R

ω

i R

÷

è 0 ø

v němž značí:

M – torzní sílu v newtonmetrech působící na povrch válce;

ω – úhlovou rychlost v radiánech za sekundu;

h – výšku ponoření vnitřního válce do kapalného prostředí

v metrech;

Ri – poloměr vnitřního válce v metrech;

R0 – poloměr vnějšího válce v metrech;

k – konstantu přístroje vyjádřenou v radiánech na kubický

metr.

Pro nenewtonské kapaliny je nezbytné stanovit smykové

napětí (τ) nebo smykový poměr (γ), při kterém se měření

provádí. Při úzkém rozmezí podmínek (podmínky vyhovující

v absolutních viskozimetrech) je vztah mezi M a τ

a také mezi ω a γ proporcionální:

t =

AM

g =

Bw

,

kde A a B jsou konstanty přístroje a vypočítají se pomocí

následujících vzorců:

– pro soustředný povrch:

– pro kužel-desky:

v nichž značí:

M – torzní sílu v newtonmetrech působící na povrch kužele

nebo válce;


Ri – poloměr vnitřního válce v metrech;

R0 – poloměr vnějšího válce v metrech;

R – poloměr kužele v metrech;

h – výšku ponoření vnitřního válce do kapalného prostředí

v metrech;

a – úhel mezi plochým diskem a kuželem v radiánech;

t – smykové napětí v pascalech (Pa);

γ – smykový poměr v recipročních sekundách (s –1 ).

Obr. 2.2.10-1

Obr. 2.2.10-2

2

i

1R

+

A =

4πh

R

2

R0

2 2

i R0

3

A =

2π R

3

VISKOZIMETRY KUŽEL-DESKA

(ABSOLUTNÍ VISKOZIMETRY)

Ve viskozimetru kužel-deska se kapalina umístí do prostoru

mezi plochý disk a kužel svírající přesně vymezený úhel.

2

i

2

0

R

B =

R

B = 1

a

,

2

0

2

i

+ R

- R

,

110 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.10 VISKOZITA – MĚŘENÍ ROTAČNÍM VISKOZIMETREM

Měření viskozity se může provádět otáčením kužele, viz obrázek

2.2.10-3 nebo plochého disku, viz obrázek 2.2.10-4.

Pro laminární proudění je viskozita (nebo zdánlivá viskozita)

η vyjádřená v pascalsekundách dána následujícím vzorcem:

æ M ö æ 3a

h = ç ÷

ç

è w ø è 2p

R

ö M

÷ = k ,

ø w

v němž značí:

M – torzní sílu v newtonmetrech působící na povrch kužele

nebo válce;


α – úhel mezi plochým diskem a kuželem v radiánech;

R – poloměr kužele v metrech;

k – konstantu přístroje vyjádřenou v radiánech na kubický

metr.

Konstanty A a B přístroje (viz soustředné válcové viskozimetry).

3

Zkušební

metody

2.2

Obr. 2.2.10-5

Obr. 2.2.10-3

Obr. 2.2.10-4

VŘETENOVÉ VISKOZIMETRY

(RELATIVNÍ VISKOZIMETRY)

Ve vřetenových viskozimetrech se viskozita stanoví otáčením

vřetene (např. válcovitého, viz obrázek 2.2.10-5, nebo

diskovitého tvaru, viz obrázek 2.2.10-6) ponořeného do kapaliny.

Relativní hodnoty viskozity (nebo zdánlivé viskozity)

se mohou přímo vypočítat za použití přepočítávacích

faktorů odečtením ze stupnice při dané rychlosti otáčení.

Konstanta přístroje k může být obecně stanovena při různých

rychlostech otáčení za použití certifikované viskozimetrické

kalibrační kapaliny. Viskozita η pak odpovídá

vzorci:

M

h = k .

w

Obr. 2.2.10-6

Postup. Viskozita (nebo zdánlivá viskozita) se měří podle

pokynů pro obsluhu rotačního viskozimetru. Teplota pro

měření viskozity je předepsána v článku. Pro nenewtonské

systémy se v článku uvádí typ viskozimetru, který se má

použít. Pokud se použijí absolutní viskozimetry, uvede se

úhlová rychlost nebo smykový poměr, při kterém se měření

provádí. Pokud není možné získat uvedený smykový poměr

přesně, použije se smykový poměr poněkud vyšší a nižší

a provede se interpolace.

S relativními viskozimetry není smykový poměr ve všech

částech vzorku stejný, a proto nemůže být definován. Za

těchto podmínek má viskozita nenewtonských kapalin stanovená

podle předcházejícího vzorce relativní charakter,

který závisí na typu vřetena a úhlové rychlosti, stejně jako

na rozměrech nádobky na vzorek (Ø = nejméně 80 mm)

a na hloubce ponoření vřetena. Získané hodnoty jsou porovnatelné

pouze tehdy, jestliže se postupuje za přesně stejných

experimentálních podmínek.

ČL 2017 – Dopl. 2020 111

2.2.11 DESTILAČNÍ ROZMEZÍ

2.2.11 DESTILAČNÍ ROZMEZÍ

8.5:20211

Destilační rozmezí je teplotní interval, vztažený na tlak

101,3 kPa, uvnitř kterého se kapalina nebo její určitá část

předestiluje za následujících podmínek.

Zařízení. Zařízení (viz obrázek 2.2.11-1) se skládá z destilační

baňky (A), chladiče (B) připojeného k postrannímu

ramenu destilační baňky a zakončeného hladce zahnutým

nástavcem (C) (alonží). Alternativně, místo nástavce může

být dolní konec chladiče zahnutý. Teploměr se vloží do

hrdla baňky tak, aby horní konec nádržky teploměru byl

o 5 mm níže, než je spojení hrdla baňky se spodní stěnou

boční trubice. Teploměr je odečítán s přesností na nejméně

0,2 °C a pokrývá rozsah nejméně 50 °C. Po dobu stanovení

musí být baňka včetně jejího hrdla chráněna vhodným způsobem

před proudícím vzduchem.

Postup. Do baňky (A) se převede 50,0 ml zkoušené kapaliny

a několik kousků porézního materiálu. Destilát se jímá

do 50ml válce děleného po 1 ml. Chlazení tekoucí vodou je

nevyhnutelné u kapalin destilujících níže než 150 °C. Baňka

se zahřívá tak, aby bylo rychle dosaženo varu. Zaznamená

se teplota, při které spadne do válce první kapka destilátu.

Zahřívání se nastaví tak, aby kapalina destilovala

konstantní rychlostí 2 ml/min až 3 ml/min. Zaznamená se

teplota, při které předestiloval celý objem kapaliny nebo její

předepsaná část. Objem předestilované kapaliny se měří

při 20 °C.

Zjištěné teploty se korigují na barometrický tlak podle

vzorce:

t = t + k( 101,3 - ),

1 2

b

v němž značí:

t1 – korigovanou teplotu;

t2 – zjištěnou teplotu při barometrickém tlaku b;

k – korekční faktor podle tabulky 2.2.11-1, pokud není

uveden jinak;

b – barometrický tlak během destilace vyjádřený

v kilopascalech.

Tab. 2.2.11-1 Korekční faktor teploty v závislosti na tlaku

Destilační teplota

do 100 °C

101 °C až 140 °C

141 °C až 190 °C

191 °C až 240 °C

nad 240 °C

Korekční faktor k

0,30

0,34

0,38

0,41

0,45

2.2.12 TEPLOTA VARU

8.5:20212

Teplota varu je korigovaná teplota, při které je tlak páry

nad kapalinou 101,3 kPa.

Přístroj. Použije se stejný přístroj jako při stanovení destilačního

rozmezí (2.2.11) s výjimkou umístění teploměru,

který je vložen do hrdla baňky tak, že dolní konec nádržky

teploměru je v jedné rovině s dolním koncem hrdla destilační

baňky. Baňka je umístěna na desce z izolačního materiálu

s otvorem o průměru 35 mm.

Postup. Do baňky (A) se převede 20 ml zkoušené kapaliny

a několik kousků porézního materiálu. Baňka se zahřívá

tak, aby bylo co nejrychleji dosaženo varu. Zaznamená se

teplota, při které začne stékat kapalina v místě bočního ramene

baňky do chladiče.

Zjištěná teplota se koriguje na barometrický tlak podle

vzorce:

t = t + k( 101,3 - ),

1 2

b

v němž značí:

t1 – korigovanou teplotu;

t2 – teplotu zjištěnou při barometrickém tlaku b;

k – korekční faktor (viz tabulku 2.2.11-1 ve stati 2.2.11

Destilační rozmezí);

b – barometrický tlak zjištěný v době stanovení, v kilopascalech.

Obr. 2.2.11-1 Zařízení

na stanovení destilačního

rozmezí (rozměry

v milimetrech)

112 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.13 STANOVENÍ VODY DESTILACÍ

2.2.13 STANOVENÍ VODY DESTILACÍ

6.0:20213

Zařízení (viz obrázek 2.2.13-1) se skládá ze skleněné baňky

(A), která je připojena skleněnou trubicí (D) k cylindrické

kondenzační části (B) zakončené odměrnou trubicí (E)

s uzávěrem, dělenou po 0,1 ml. Na zabroušené hrdlo části

(B) je nasazen zpětný chladič (C). Jako zdroj tepla je

vhodné použít elektrický vařič s reostatem nebo olejovou

lázeň. Horní část baňky a spojovací trubice (D) mohou být

opatřeny tepelnou izolací.

Postup. Použije se přístroj dokonale vymytý a vysušený.

Do baňky se odměří 200 ml toluenu R a asi 2 ml vody R.

Destiluje se dvě hodiny, potom se nechá asi 30 min chladit

a odečte se množství předestilované vody s přesností na

0,05 ml. Do baňky se kvantitativně převede množství zkoušené

látky navážené s přesností 1 %, které obsahuje 2 ml až

3 ml vody. Jestliže je zkoušená látka polotuhé konzistence,

váží se na lodičce z kovové fólie. Přidá se několik kousků

porézního materiálu a baňka se 15 min opatrně zahřívá.

Když začne toluen vřít, destiluje se rychlostí asi 2 kapky/s,

dokud se neoddestiluje většina vody, a potom se zvýší

rychlost destilace asi na 4 kapky/s. Když byla předestilována

všechna voda, opláchne se vnitřek chladiče toluenem R.

Pokračuje se ještě 5 min v destilaci a pak se odstaví zdroj

tepla. Odměrná trubice se nechá ochladit na teplotu místnosti

a nechají se stéci všechny kapky vody ze stěn do odměrné

trubice. Když se voda a toluen úplně oddělí, odečte

Obr. 2.2.13-1 Zařízení na stanovení vody destilací (rozměry

v milimetrech)

se množství vody a vypočítá se procentuální podíl vody ve

zkoušené látce podle vzorce:

( n2

- n ) ,

1000

1

m

v němž značí:

m – hmotnost zkoušené látky v gramech;

n1 – množství vody získané z první destilace v mililitrech;

n2 – celkové množství vody z obou destilací v mililitrech.

2.2.14 TEPLOTA TÁNÍ – KAPILÁRNÍ

METODA

9.1:20214

Teplota tání stanovená kapilární metodou je teplota, při které

poslední pevná částice v kompaktním sloupci zkoušené

látky v kapiláře přejde do kapalné fáze. Teplota tání stanovená

touto metodou má specifickou metodologii (např.

rychlost zahřívání) popsanou v této stati. Podobně, kdykoliv

se požaduje použití certifikovaných referenčních materiálů,

jejich certifikované hodnoty se vztahují k popisovanému

analytickému postupu.

Pokud je v článku předepsáno, stejné zařízení i metoda se

použije pro stanovení dalších faktorů, jako je tvorba menisku

nebo rozmezí teploty tání, které charakterizují chování

zkoušené látky při tání.

Zařízení. Zařízení se skládá z kovového zahřívacího bloku

opatřeného jednou nebo více dutinami pro kapiláry, nebo

z vhodné skleněné nádoby obsahující tekutou lázeň (např.

vodu, tekutý parafin nebo silikonový olej) a vybavenou

vhodným zahříváním a mícháním. Zařízení je opatřeno

senzorem teploty nebo vhodným ověřeným teploměrem

umožňujícím odečet s přesností alespoň na 0,1 °C.

Vzorky jsou do zařízení vloženy ve skleněných kapilárách.

Rozměry jsou vybrány podle požadavků výrobce, typicky

o vnějším průměru 1,3 mm až 1,5 mm a o tloušťce stěny

0,1 mm až 0,3 mm. V některých zařízeních se místo kapilár

používají skleněná sklíčka.

Zařízení umožňuje zahřívat vzorky rychlostí 1 °C/min nebo

nižší. Přesnost zařízení je nejvýše ±0,5 °C.

Detekce může být vizuální nebo instrumentální. Při instrumentální

detekci se obvykle provede obrazový záznam

a následná analýza nebo měření propuštěného nebo odraženého

světla od vzorku fotodetektorem.

Postup. Látka se předem upraví, jak je popsáno v článku.

Velké krystaly se vyřadí, protože by mohly vést k falešným

výsledkům. Je-li třeba, vzorky se rozdrtí na jemný prášek.

Pokud není předepsáno jinak, práškovaná látka se suší 24 h

ve vakuu nad silikagelem bezvodým R. Do kapiláry se

vpraví dostatečné množství látky tak, aby vznikl kompaktní

sloupec, jak je předepsáno výrobcem zařízení (např. o výšce

4 mm až 6 mm). Zařízení se zahřeje na teplotu asi o 5 °C

nižší, než je předpokládaná teplota tání. Teplota se nechá

stabilizovat a pak se kapilára umístí do zařízení. Nakonec

se nastaví rychlost zahřívání na asi 1 °C/min, pokud není

předepsáno jinak.

Při instrumentální detekci se postupuje podle požadavků

výrobce zařízení pro stanovení teploty tání. Při vizuální de-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 113

2.2.15 TEPLOTA TÁNÍ – METODA V OTEVŘENÉ KAPILÁŘE

tekci se zaznamená teplota, při které poslední částice zkoušené

látky přejde do kapalné fáze.

Vzorky lze měřit souběžně, pokud zařízení umožňuje měření

více vzorků najednou.

Test způsobilosti. Test způsobilosti se provede před měřením,

např. výběrem vhodného referenčního materiálu, jehož

teplota tání je blízká předpokládané teplotě tání zkoušené

látky.

Kvalifikace/Kalibrace zařízení. Zařízení se kvalifikuje/kalibruje

pravidelně podle požadavků výrobce zařízení, za

použití nejméně dvou certifikovaných referenčních materiálů,

které jsou vybrány s ohledem na rozsah, pro který je zařízení

použito. Použijí se kapiláry stejného rozměru jako

kapiláry, které byly použity k měření vzorku.

Pokyny, jak porovnat hodnoty získané z certifikovaných referenčních

materiálů s hodnotami z certifikátů, lze nalézt na

webových stránkách European Reference Materials (ERM)

(Application note 1).

2.2.15 TEPLOTA TÁNÍ – METODA

V OTEVŘENÉ KAPILÁŘE

6.0:20215

Následující metodou se u určitých látek stanoví teplota tání

(také označovaná jako teplota tání posunem a teplota tání

vzestupem).

Používají se skleněné kapiláry otevřené na obou koncích,

dlouhé asi 80 mm, o vnějším průměru 1,4 mm až 1,5 mm

a o vnitřním průměru 1,0 mm až 1,2 mm.

Pro stanovení se použije pět kapilár a každá se naplní do

výše asi 10 mm zkoušenou látkou připravenou předepsaným

způsobem. Kapiláry se nechají stát vhodnou dobu při

předepsané teplotě.

Není-li předepsáno jinak, jsou látky s voskovitou konzistencí

před naplněním do kapiláry opatrně a úplně roztaveny

na vodní lázni. Kapiláry se nechají stát 2 h při 2 °C až 8 °C.

Potom se jedna kapilára připevní na teploměr dělený po

0,5 °C tak, aby sloupec zkoušené látky byl těsně u nádržky

teploměru. Teploměr s kapilárou se umístí v kádince, aby

nádržka byla ve vzdálenosti 1 cm ode dna kádinky. Kádinka

se naplní vodou do výše 5 cm. Voda se zahřívá tak, aby

její teplota stoupala rychlostí 1 °C/min.

Jako teplota tání se zaznamená teplota, při níž sloupec látky

v kapiláře začne stoupat.

Tento postup se opakuje i s dalšími čtyřmi kapilárami. Výslednou

teplotu tání udává průměr všech pěti stanovení.

2.2.16 TEPLOTA TÁNÍ – STANOVENÍ

V KOVOVÉM BLOKU

8.5:20216

Okamžitá teplota tání se vypočítá podle vzorce:

t

1

+ t 2

2

v němž značí:

t1 – první odečtenou teplotu;

t2 – druhou teplotu odečtenou za dále popsaných podmínek.

,

Zařízení. Zařízení se skládá z kovového bloku odolného

vůči zkoušené látce, s dobrou tepelnou vodivostí (např.

mosaz) a s velmi hladkou leštěnou vrchní plochou. Blok se

rovnoměrně zahřívá jemně regulovatelným plynovým kahanem

nebo pomocí zařízení elektrického ohřevu s jemnou

regulací. V bloku je válcovitá dutina dostatečně široká pro

vložení teploměru, který je ve stejné poloze při kalibraci

zařízení i při stanovení teploty tání zkoušené látky. Válcovitá

dutina je rovnoběžná s horním hladkým povrchem bloku

ve vzdálenosti asi 3 mm od něho. Přístroj se kalibruje za

použití vhodných látek o známé teplotě tání.

Postup. Blok se zahřeje vhodnou rychlostí na teplotu asi

10 °C pod očekávanou teplotou tání, potom se nastaví rychlost

zahřívání asi na 1 °C/min. V pravidelných intervalech

se na blok v blízkosti nádržky teploměru vkládá několik

částic práškované zkoušené látky, pokud je třeba i vysušené,

za podmínek uvedených u kapilární metody. Po každém

stanovení se povrch bloku očistí. Zaznamená se teplota

t1, při které látka taje ihned při prvním kontaktu s povrchem

bloku. Další zahřívání bloku se zastaví. Během ochlazování

se vkládá opět v pravidelných intervalech několik

částic látky na blok. Povrch bloku se opět očistí po každém

stanovení. Zaznamená se teplota t2, při níž zkoušená látka

v kontaktu s blokem přestává okamžitě tát.

Kalibrace zařízení. Zařízení se kalibruje za použití referenčních

látek pro teplotu tání doporučených Světovou

zdravotnickou organizací nebo jiných vhodných látek.

2.2.17 TEPLOTA SKÁPNUTÍ

9.6:20217

Teplota skápnutí je teplota, při níž skápne první kapka tající

zkoušené látky z nádobky za definovaných podmínek.

Pokud v článku není specifikována metoda, použije se metoda

A. Jakékoliv změny metody A na metodu B se validují.

METODA A

Zařízení. Zařízení (viz obrázek 2.2.17-1) se skládá ze dvou

vzájemně sešroubovaných kovových pouzder (A) a (B).

V pouzdru (A) je upevněn teploměr. Kovová nádobka ve

tvaru pohárku je dvěma upínacími pásky volně připevněna

k dolní části pouzdra (B). Pevné podpěry o délce 2 mm zaručují

přesnou polohu nádobky a slouží k vycentrování teploměru.

Otvor ve stěně pouzdra (B) slouží k vyrovnávání

tlaku. Nádobka musí mít hladký povrch a hrany výtokového

ústí musí svírat se stěnou nádobky pravý úhel. Teploměr

má tvar a velikost odpovídající obrázku 2.2.17-1. Dělení

teploměru je od 0 °C do 110 °C, vzdálenost 1 mm na stupnici

odpovídá 1 °C. Nádržka teploměru má průměr

(3,5 ±0,2) mm a výšku (6,0 ±0,3) mm. Zařízení je umístěno

v ose zkušební zkumavky o délce asi 200 mm a vnějším

průměru asi 40 mm a je upevněno ve zkušební zkumavce

pomocí zátky, kterou prochází teploměr a jež je opatřena

boční drážkou. Otvor nádobky je ve vzdálenosti asi 15 mm

ode dna zkušební zkumavky. Celé zařízení je ponořeno do

kádinky o objemu asi 1 litr naplněné vodou. Dno zkušební

zkumavky je asi 25 mm ode dna kádinky. Hladina vody dosahuje

k horní části pouzdra (A). K zabezpečení stejné teploty

vody se použije míchadlo.

114 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.17 TEPLOTA SKÁPNUTÍ

Zkušební

metody

2.2

A = horní část kovového pouzdra

B = dolní část kovového pouzdra

C = otvor k vyrovnávání tlaku

D = pevná podpěra

E = upínací pásky

F = kovová nádobka na

vzorek

Obr. 2.2.17-1 Zařízení pro stanovení teploty skápnutí

(rozměry v milimetrech)

Postup. Zkoušená látka se připraví, jak je uvedeno v příslušném

článku, a nádobka na vzorek se naplní až po okraj.

Pomocí kopistky se odstraní přebytek látky na obou koncích

nádobky. Po sešroubování pouzder (A) a (B) se nádobka

zatlačí do krytu v pouzdře (B) až k pevné podpěře. Přebytečná

zkoušená látka vytlačená teploměrem se opět odstraní

kopistkou. Zařízení se umístí do vodní lázně tak, jak

bylo popsáno výše. Vodní lázeň se zahřívá a když je teplota

asi 10 °C pod očekávanou teplotou skápnutí, nastaví se

rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. Zaznamená se teplota,

při níž skápne první kapka. Měření se provede třikrát vždy

s novým vzorkem zkoušené látky. Rozdíl mezi jednotlivými

hodnotami stanovení je nejvýše 3 °C. Teplota skápnutí

zkoušené látky je aritmetický průměr ze tří stanovení.

METODA B – AUTOMATICKÁ METODA

Zařízení. Zařízení (viz obrázek 2.2.17-2) se skládá z montážní

kazety zahrnující držák, ve kterém je volně připevněná

nádobka ve tvaru pohárku se vzorkem a pod nádobkou

je umístěn trubkový sběrač s vodorovnou světelnou štěrbinou.

Toto zařízení je uloženo do ohřívacího bloku, který se

skládá z kovového válce s válcovitým otvorem podél vodorovné

osy kazety. Je zde ještě další úzký válcovitý otvor

osazený teplotní sondou, která je umístěna v úrovni nádobky

na vzorek. Ohřívací blok je obklopen elektrickým zahřívacím

prvkem. Pod ohřívacím blokem je namontovaná

lampa tak, aby svazek paprsků procházel světelnou štěrbinou

trubkového sběrače, proti které je umístěn fotosenzor.

Ohřívací část je schopna udržet ohřívací blok na přesně

A = držák nádobky F = zahřívací prvek

B = ohřívací blok

G = nádobka na vzorek

C = zdroj světla

H = fotosenzor

D = světelná štěrbina J = trubkový sběrač

E = montážní kazeta K = teplotní sonda

Obr. 2.2.17-2 Zařízení pro automatické stanovení teploty

skápnutí

předem definované teplotě a pomalu a stejnoměrně zahřívat

předem definovanou rychlostí.

Postup. Zkoušená látka se připraví podle postupu uvedeného

v příslušném článku, a potom se postupuje podle pokynů

výrobce zařízení. Pomocí kopistky se odstraní přebytek látky

na obou koncích nádobky. Nádobka se zatlačí do držáku,

na nádobku se přitlačí trubkový sběrač a montážní kazeta

se umístí do ohřívacího bloku. Zařízení se nastaví na

počáteční izotermické podmínky a rychlost zahřívání se

upraví tak, jak je uvedeno v článku. Spustí se teplotní program.

Když skápne první kapka roztavené zkoušené látky

štěrbinou ve dně nádobky na vzorek, přeruší se paprsek

světla, a signál z fotosenzoru zajistí automatické odečtení

teploty ohřívacího bloku.

Kalibrace. Zařízení se použije podle pokynů výrobce a provede

se předepsaná kalibrace a test způsobilosti v pravidelných

intervalech v závislosti na použitém zařízení a na

zkoušené látce. Jako certifikované referenční materiály se

obvykle používají kyselina benzoová a benzofenon, mohou

se použít i jiné materiály, pokud se prokáže, že nejsou polymorfní.

Postupuje se podle dále uvedeného popisu nebo

podle pokynů výrobce zařízení. Pro každý z obou certifikovaných

referenčních materiálů se připraví tři nádobky na

vzorek a umístí se na čistý povrch. Do každé nádobky na

vzorek se vpraví malé množství vzorku a tyčinkou (o průměru

asi 4,5 mm) se přitlačí dolů. Ověří se, že otvor je zcela

uzavřen. Nádobka na vzorek se naplní asi z poloviny

a tyčinkou (o průměru asi 9 mm) se stlačí, potom se nádobka

na vzorek zcela naplní a, je-li třeba, opět se stlačí, dokud

nádobka není zcela napěchovaná.

ČL 2017 – Dopl. 2020 115

2.2.18 TEPLOTA TUHNUTÍ

Teplotní program pro kyselinu benzoovou: počáteční teplota

= 118,0 °C; rychlost zahřívání = 0,2 °C/min; konečná teplota

= 126,0 °C; po vložení nádobky při 118 °C se dodrží

čekací doba 30 s než se zahájí zahřívání.

Teplotní program pro benzofenon: počáteční teplota =

44,0 °C; rychlost zahřívání = 0,2 °C/min; konečná teplota

= 56,0 °C; po vložení nádobky při 44 °C se dodrží

čekací doba 30 s než se zahájí zahřívání.

Ověří se výsledky tří jednotlivých měření: zkouška je platná,

jestliže odchylka jednotlivých hodnot od průměru je

nejvýše 0,3 °C.

Vypočítá se korigovaná průměrná teplota (T2) podle následujícího

vzorce:

v němž značí:

T1 – F,

T1 – průměrnou teplotu skápnutí pro tři vzorky ve °C;

F – vyrovnání rozdílů mezi teplotou vzorku a teplotou

v ohřívacím bloku, kde se měří teplota; může se lišit

v závislosti na typu zařízení pro automatické měření

teploty skápnutí a je prováděno výrobcem zařízení.

Přesnost teplotní stupnice je vyhovující, pokud │T2 – T0│

není vyšší než 0,3 °C, vezme-li se v úvahu teplota skápnutí

certifikovaného referenčního materiálu (T0).

2.2.18 TEPLOTA TUHNUTÍ

6.0:20218

Teplota tuhnutí je nejvyšší teplota naměřená během tuhnutí

podchlazené kapaliny.

Přístroj. Přístroj (viz obrázek 2.2.18-1) se skládá ze zkumavky

asi o průměru 25 mm a délce 150 mm umístěné uvnitř

jiné zkumavky asi o průměru 40 mm a délce 160 mm.

Vnitřní zkumavka je uzavřena zátkou, kterou prochází teploměr

asi 175 mm dlouhý se stupnicí dělenou po 0,2 °C.

Teploměr je upevněn tak, aby jeho nádržka byla asi 15 mm

ode dna zkumavky. Zátka má další otvor, kterým prochází

držadlo míchadla vyrobeného ze skleněné tyčinky nebo jiného

vhodného materiálu, vytvarované na jednom konci

v pravém úhlu k tyčince do smyčky o vnějším průměru asi

18 mm. Vnitřní zkumavka se svým obalem je umístěna

uprostřed 1000ml kádinky naplněné 20 mm od horního

okraje vhodnou chladicí kapalinou. Do chladicí lázně je

umístěn teploměr.

Postup. Do vnitřní zkumavky se vpraví dostatečné množství

kapaliny nebo předem roztavené zkoušené látky tak,

aby byla ponořena nádržka teploměru, a rychlým ochlazením

se stanoví přibližná teplota tuhnutí. Vnitřní zkumavka

se přemístí do lázně asi o 5 °C teplejší než přibližná teplota

tuhnutí a ponechá se v ní, dokud se všechna látka až na několik

posledních krystalků neroztaví. Kádinka se naplní

vodou nebo nasyceným roztokem chloridu sodného o teplotě

asi o 5 °C nižší než předpokládaná teplota tuhnutí. Vnitřní

zkumavka se zasune do vnější, ověří se přítomnost ponechaných

zárodečných krystalů a důkladně se míchá, až nastane

tuhnutí. Zaznamená se nejvyšší teplota pozorovaná

během tuhnutí.

Obr. 2.2.18-1 Přístroj na stanovení teploty tuhnutí (rozměry

v milimetrech)

2.2.19 AMPÉROMETRICKÉ TITRACE

8.6:20219

Při ampérometrických titracích se bod ekvivalence stanoví

měřením změny proudu mezi dvěma elektrodami (indikační

elektrodou a srovnávací elektrodou nebo dvěma indikačními

elektrodami) ponořenými ve zkoušeném roztoku a udržovanými

při konstantním rozdílu potenciálu v závislosti na

množství přidaného odměrného roztoku.

Potenciál indikační elektrody má být dostatečný, aby se zajistilo

dosažení limitního proudu elektrochemicky aktivní

látky.

Přístroj. Přístroj má regulovatelný zdroj napětí a citlivý

mikroampérmetr. Měřicí systém obvykle sestává z indikační

elektrody (např. platinové, rotující diskové nebo uhlíkové

elektrody) a srovnávací elektrody (např. argentchloridové

elektrody).

Může být také použito zařízení se třemi elektrodami, které

obsahuje kromě indikační a srovnávací elektrody též polarizovatelnou

pomocnou elektrodu.

Postup. Potenciál indikační elektrody se nastaví na předepsanou

hodnotu a do grafu se vynese závislost počátečního

proudu a proudu získaného během titrace na množství přidávaného

odměrného roztoku. Odměrný roztok se přidá

v minimálně třech následných množstvích, jejichž celkový

objem se rovná asi 80 % teoretického objemu odpovídajícího

předpokládanému bodu ekvivalence. Tyto tři hodnoty

mají ležet v přímce. Odměrný roztok se přidává dále za

předpokládaný bod ekvivalence v minimálně třech dalších

množstvích. Získané hodnoty rovněž mají ležet v přímce.

Bod ekvivalence se nachází na průsečíku obou přímek.

V případě ampérometrické titrace se dvěma indikačními

elektrodami se zaznamená celá titrační křivka a použije se

ke zjištění bodu ekvivalence.

116 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.20 POTENCIOMETRICKÉ TITRACE

2.2.20 POTENCIOMETRICKÉ TITRACE

8.6:20220

Při potenciometrických titracích (odměrná titrace s potenciometrickým

stanovením bodu ekvivalence) se bod ekvivalence

stanoví měřením změn potenciálu mezi dvěma

elektrodami (buď indikační elektrodou a srovnávací elektrodou,

nebo kombinovanou elektrodou) ponořenými ve

zkoušeném roztoku v závislosti na spotřebě přidaného odměrného

roztoku.

Přístroj. Přístroj využívá milivoltmetr. Může se použít komerčně

dostupný automatický titrátor. Postupuje se podle

návodu výrobce za použití elektrod doporučených pro popsaný

druh titrace.

Použitá indikační elektroda závisí na stanovované látce

a může to být skleněná elektroda nebo kovová elektroda

(např. platinová, zlatá nebo stříbrná).

Při acidobazických titracích se obvykle používá kombinace

skleněná-argentchloridová elektroda.

Postup. Zkoušený roztok se připraví předepsaným způsobem.

Odměrný roztok se přidá v dostatečném množství se

zřetelem na rychlost titrace a pokles spotřeby v blízkosti

bodu ekvivalence. Odměrný roztok se přidává za očekávaný

bod ekvivalence, aby bod ekvivalence bylo možné určit

přesně.

Bodu ekvivalence se při titraci dosáhne, když změna potenciálu

v závislosti na přidaném objemu odměrného roztoku

je maximální, a je vyjádřena odpovídající spotřebou odměrného

roztoku. Určení bodu ekvivalence může být ulehčeno

zaznamenáním první nebo druhé derivace křivky. Při

potenciometrických titracích slabých kyselin nebo zásad

nevodnými rozpouštědly se provede slepá zkouška, nebo

je-li to třeba, směs rozpouštědel se předem zneutralizuje.

V případech, kde je potenciometrická detekce neproveditelná,

se směs rozpouštědel může předem zneutralizovat titrací

za použití vhodného indikátoru. Některé příklady jsou

uvedeny dále:

Odměrný roztok

kyselina chloristá

tetrabutylamonium-hydroxid

hydroxid sodný v ethanolu

Indikátor

violeť krystalová RS

roztok modři thymolové R

(3 g/l) v methanolu R

thymolftalein RS

2.2.21 FLUORIMETRIE

6.0:20221

Fluorimetrie je metoda, která se používá k měření intenzity

fluorescenčního záření emitovaného zkoušenou látkou ve

vztahu k intenzitě fluorescenčního záření standardu.

Postup. Zkoušená látka se rozpustí v rozpouštědle nebo ve

směsi rozpouštědel uvedených v článku, roztok se převede

do kyvety nebo fluorimetrické trubice (průtokové kyvety)

a osvětlí se excitačním, co nejvíce monochromatickým

světlem o vlnové délce předepsané v článku.

Měří se intenzita emitovaného záření v úhlu 90° vzhledem

k excitačnímu paprsku po průchodu filtrem, který propouští

zejména záření při vlnové délce fluorescence. Může se použít

také jiný typ zařízení, pokud je zajištěno, že získané výsledky

jsou identické.

Pro stanovení se nejprve umístí do přístroje rozpouštědlo

nebo směs rozpouštědel použitých k rozpouštění stanovované

látky a přístroj se nastaví na nulu. Vloží se roztok

standardu a nastaví citlivost přístroje tak, aby odečtená

hodnota byla větší než 50. Při změně šířky štěrbiny je třeba

znovu nastavit nulu a měřit intenzitu fluorescence standardu.

Nakonec se vloží roztok neznámé koncentrace a odečte

se na přístroji intenzita fluorescence. Koncentrace cx zkoušené

látky v měřeném roztoku se vypočítá podle vzorce:

Ixcs

c x = ,

I

v němž značí:

cs – koncentraci roztoku standardu;

Ix – intenzitu fluorescence emitované roztokem zkoušené

látky;

Is – intenzitu fluorescence emitované roztokem standardu.

Pokud intenzita fluorescence není přímo úměrná koncentraci,

je vhodnější použít pro měření kalibrační křivku.

V některých případech může být měření provedeno vzhledem

k pevnému standardu (např. fluorescenčnímu sklu nebo

roztoku jiné fluorescenční látky). V takových případech

se koncentrace zkoušené látky musí stanovit s použitím

předem sestrojené kalibrační křivky za stejných podmínek.

2.2.22 ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE

6.0:20222

OBECNÝ PRINCIP

Atomová emise je proces, ke kterému dochází při emisi

elektromagnetického záření excitovanými atomy nebo ionty.

V atomové emisní spektrometrii je vzorek vystaven teplotě

dostatečně vysoké, aby vyvolala nejen disociaci na

atomy, ale také aby způsobila dostatečné množství kolizních

excitací a ionizací přítomných atomů vzorku. Jestliže

jsou atomy a ionty v excitovaných stavech, mohou klesat

do nižších stavů termálními nebo zářivými (emisními)

energetickými přechody a emituje se elektromagnetické záření.

Emisní spektrum prvku obsahuje poněkud více čar než

odpovídající absorpční spektrum.

Atomová emisní spektrometrie je metoda pro stanovení koncentrace

prvku ve vzorku měřením intenzity jedné z emisních

čar atomové páry prvku generované ze vzorku. Stanovení se

provádí při vlnové délce odpovídající této emisní čáře.

Tato stať se zabývá pouze atomizací v plameni. Metoda

atomové emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem

(ICP-AES) je popsána v jiné obecné stati.

PŘÍSTROJ

Obvykle se skládá:

– ze zařízení pro zavádění vzorku a rozprašování;

– z plamene pro generování stanovovaných atomů;

– z monochromátoru;

– z detektoru;

– z jednotky pro vyhodnocování dat.

Pro plamen se může použít kyslík, vzduch a hořlavé plyny,

jako je vodík, acetylen, propan nebo butan. Atomizační

zdroj je kritický, protože musí poskytovat dostatečnou

energii pro atomizaci a excitaci atomů. Atomová spektra

s

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 117


emitovaná z plamene mají výhodu, že jsou jednodušší než

spektra emitovaná z jiných zdrojů; hlavní nevýhodou je, že

plameny nejsou dostatečně intenzivní pro vyvolání emise

mnoha prvků umožňující jejich určení. Pro přípravu zkoušených

a porovnávacích roztoků je vhodná okyselená voda,

mohou se také použít organická rozpouštědla za předpokladu,

že rozpouštědlo nebude ovlivňovat stabilitu plamene.

INTERFERENCE

Spektrální interference se redukuje nebo eliminuje volbou

vhodné emisní čáry pro měření nebo nastavením štěrbiny

pro spektrální šířku pásu. Fyzikální interference se koriguje

zředěním roztoku vzorku, úpravou matrice nebo použitím

metody standardních přídavků. Chemická interference se

redukuje použitím chemických modifikátorů nebo ionizačních

tlumivých látek.

PAMĚŤOVÝ EFEKT

Paměťový efekt způsobený nánosem stanovované látky

v přístroji se může omezit pečlivým promýváním mezi měřeními,

zředěním měřených roztoků (pokud je to možné)

a tedy omezením obsahu jejich solí, a co nejkratším nasáváním

roztoku.

POSTUP

Kdekoliv to je možné, doporučuje se použití laboratorních

pomůcek z plastu.

S atomovým emisním spektrometrem se pracuje podle návodu

výrobce při předepsané vlnové délce. Experimentální

podmínky (teplota plamene, nastavení hořáku, použití iontové

tlumivé látky, koncentrace roztoků) se optimalizují pro

stanovovaný prvek a podle matrice vzorku. Kontrolní roztok

se zavede do atomizéru a signál přístroje se nastaví na

nulu nebo na hodnotu kontrolního roztoku. Zavede se nejkoncentrovanější

porovnávací roztok a citlivost se nastaví

tak, aby se získal vhodný signál.

Pro měření se doporučuje použít koncentrace, které leží

v lineární části kalibrační křivky. Není-li to možné, kalibrační

křivky mohou být také zakřivené, pak se používají

se vhodným kalibračním softwarem.

Stanovení se provádějí porovnáváním s porovnávacími roztoky

o známých koncentracích stanovovaného prvku buď

metodou přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních

přídavků (Metoda II).

METODA I – PŘÍMÁ KALIBRACE

Pro běžné měření se připravují a měří tři porovnávací roztoky

stanovovaného prvku a kontrolní roztok.

Připraví se roztok zkoušené látky (zkoušený roztok), jak je

předepsáno v článku, a nejméně tři porovnávací roztoky

stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou

hodnotu ve zkoušeném roztoku. Pro účely stanovení

obsahu jsou optimální kalibrační hodnoty mezi 0,7násobkem

až 1,3násobkem očekávaného obsahu stanovovaného

prvku nebo v limitu předepsaném v článku. Pro účely

zkoušky na čistotu jsou kalibrační hodnoty mezi detekčním

limitem a 1,2násobkem limitu specifikovaného pro stanovovaný

prvek. Jakákoliv zkoumadla používaná k přípravě

zkoušeného roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům

a ke kontrolnímu roztoku ve stejné koncentraci.

Každý z roztoků se zavede do přístroje, přičemž počet opakovaných

měření musí být stejný pro každý roztok, aby se

zajistilo rovnoměrné odečítání.

Výpočet. Sestrojí se kalibrační křivka z průměru odečtů

získaných s porovnávacími roztoky vynesením průměrů jako

funkce koncentrace. Z takto získané křivky se určí koncentrace

prvku ve zkoušeném roztoku.

METODA II – STANDARDNÍ PŘÍDAVKY

Do nejméně tří stejných odměrných baněk se přidají stejné

objemy roztoků zkoušené látky (zkoušený roztok) připravené,

jak je předepsáno. Do každé baňky, kromě jediné, se

přidá postupně se zvyšující objem porovnávacího roztoku

obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku tak,

aby se připravila série roztoků obsahujících stoupající koncentraci

daného prvku, které poskytují odezvu v lineární

části kalibrační křivky, je-li to možné. Obsah každé baňky

se zředí rozpouštědlem po značku. Každý z roztoků se zavede

do přístroje, přičemž počet opakovaných měření musí

být stejný pro každý roztok, aby se zajistilo rovnoměrné

odečítání.

Výpočet. Vypočítá se lineární rovnice grafu za použití metody

nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace

stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.

VALIDACE METODY

Uspokojivé provedení postupů předepsaných v článcích se

ověřuje ve vhodných časových intervalech.

LINEARITA

Připraví a analyzují se nejméně čtyři porovnávací roztoky

v kalibračním rozmezí a kontrolní roztok. Provede se nejméně

pět opakovaných měření.

Kalibrační křivka se vypočítá regresní analýzou pomocí

metody nejmenších čtverců ze všech naměřených údajů.

Vynese se regresní křivka, průměry, naměřené údaje a interval

spolehlivosti kalibrační křivky. Pracovní postup je

platný, jestliže:

– korelační koeficient je nejméně 0,99;

– odchylky každé kalibrační hodnoty jsou nahodile rozděleny

kolem kalibrační křivky.

Vypočítá se průměr a relativní směrodatná odchylka pro

nejnižší a nejvyšší kalibrační hodnotu.

Je-li poměr stanovené směrodatné odchylky nejnižší a nejvyšší

kalibrační hodnoty mimo rozmezí 0,5 až 2,0, může se

získat přesnější odhad kalibrační křivky za použití vážené

lineární regrese. Pro údaje se použije lineární a kvadratická

váhová funkce, aby se nalezla nejvhodnější váhová funkce.

Jestliže průměry porovnané s kalibrační křivkou vykazují

odchylku od linearity, použije se dvojrozměrná lineární regrese.

PŘESNOST

Přesnost se ověřuje přednostně za použití certifikovaných

referenčních materiálů (CRM). Pokud to není možné, provede

se zkouška výtěžnosti.

Výtěžnost. Pro stanovení obsahu by se měla získat výtěžnost

90 % až 110 %. Pro jiná stanovení, např. pro stanovení

stopového prvku, není zkouška platná, jestliže výtěžnost

je mimo rozmezí 80 % až 120 % teoretické hodnoty.

Výtěžnost se může určit pomocí vhodného porovnávacího

roztoku matrice, ke kterému se přidá známé množství stanovované

látky (koncentrace uprostřed kalibračního rozmezí).

118 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.23 ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE

OPAKOVATELNOST

Opakovatelnost pro stanovení obsahu je nejvýše 3 % a pro

zkoušku na nečistoty nejvýše 5 %.

MEZ STANOVITELNOSTI

Ověří se, že mez stanovitelnosti (určená např. pomocí přiblížení

10 s) je nižší než hodnota, která se má měřit.

2.2.23 ATOMOVÁ ABSORPČNÍ

SPEKTROMETRIE

6.0:20223

OBECNÝ PRINCIP

Atomová absorpce je proces, ke kterému dochází, jestliže

atom v základním stavu absorbuje elektromagnetické záření

určité vlnové délky a přechází do excitovaného stavu. Atomy

v základním stavu absorbují energii o jejich rezonanční

frekvenci a elektromagnetické záření je zeslabeno v důsledku

rezonanční absorpce. Absorpce energie je ve skutečnosti

přímou funkcí počtu přítomných atomů.

Tato stať poskytuje obecné informace a definuje postupy

používané při stanovení prvků atomovou absorpční spektrometrií,

a to buď atomizací v plameni, elektrotermickým

vypařováním v grafitové pícce, generováním hydridů, nebo

metodou studených par pro rtuť.

Atomová absorpční spektrometrie je metoda pro stanovení

koncentrace prvku ve vzorku měřením absorpce elektromagnetického

záření atomovými parami prvku generovanými

ze vzorku. Stanovení se provádí při vlnové délce jedné

z absorpčních (rezonančních) čar stanovovaného prvku.

Množství absorbovaného záření je podle Lambertova-Beerova

zákona úměrné koncentraci prvku.

PŘÍSTROJ

Obvykle se skládá:

– ze zdroje záření;

– ze zařízení pro zavádění vzorku;

– z atomizéru vzorku;

– z monochromátoru nebo polychromátoru;

– z detektoru;

– z jednotky pro vyhodnocování dat.

Přístroj je obvykle vybaven systémem pro korekci pozadí.

Jako zdroje záření jsou používány výbojky s dutou katodou

a bezelektrodové výbojky (EDL). Emise záření takových

lamp poskytuje spektrum analyzovaného prvku vykazující

velmi úzké čáry s pološířkou asi 0,002 nm.

Existují tři druhy atomizace vzorku:

– Plamenová metoda

Plamenový atomizér se skládá z rozprašovacího systému

s pneumatickou tvorbou aerosolu, z regulace toku plynů

a z hořáku. Pro získání teploty v rozsahu asi 2000 K až

3000 K se obvykle používají směsi paliva a oxidačního

činidla. Topným plynem může být propan, vodík

a acetylen; jako oxidační činidlo se používá vzduch

a oxid dusný. Konstrukce hořáku je přizpůsobena použitým

plynům a průtok plynu je nastavitelný. Vzorky se

rozprašují, vhodným rozpouštědlem na přípravu zkoušených

a porovnávacích roztoků je okyselená voda. Mohou

se také použít organická rozpouštědla, za předpokladu, že

rozpouštědlo neovlivní stabilitu plamene.

– Elektrotermická atomizační metoda

Elektrotermický atomizér je obecně složen z grafitové žárové

trubice a elektrického zdroje. Elektrotermická atomizace

v grafitové žárové trubici atomizuje celý vzorek

a udržuje atomové páry v optické dráze po delší dobu,

což zlepšuje detekční limit. Kapalné i pevné vzorky se

zavádějí přímo do grafitové žárové trubice, která se zahřívá

v programovatelné sérii kroků pro vysušení vzorku

a odstranění hlavních matricových složek pyrolýzou

a pak pro atomizaci celé stanovované látky. Žárová trubice

se nakonec čistí za použití teploty vyšší, než je atomizační

teplota. Průtok inertního plynu během fáze pyrolýzy

v grafitové žárové trubici umožňuje lepší provedení

atomizačního procesu.

– Metoda studených par a hydridová metoda

Atomové páry se také mohou generovat mimo spektrometr.

To je případ metody studených par pro rtuť nebo

pro určité prvky tvořící hydridy, jako je arsen, antimon,

bismut, selen a cín. U rtuti se atomy generují chemickou

redukcí chloridem cínatým nebo tetrahydridoboritanem

sodným a vzniklé atomové páry se transportují proudem

inertního plynu do nevyhřívané křemenné kyvety instalované

v optické dráze přístroje. Generované hydridy se

transportují inertním plynem do vyhřívané kyvety, v níž

jsou rozloženy na atomy.

INTERFERENCE

Při měřeních využívajících atomové absorpční spektrometrie

se vyskytují chemické, fyzikální, ionizační a spektrální

interference. Chemická interference se kompenzuje přidáním

modifikátorů matrice, uvolňujících činidel nebo využitím

vyšší teploty získané při použití plamene oxid dusnýacetylen;

použitím specifických ionizačních tlumivých látek

(např. lanthanu nebo cesia) se kompenzuje ionizační interference;

zředěním vzorku metodou standardních přídavků

nebo přizpůsobením matrice se eliminuje fyzikální interference

vyvolaná vysokým obsahem soli nebo viskozitou.

Spektrální interference je výsledkem překrývání rezonančních

čar a může se vyloučit použitím odlišné rezonanční

čáry. Použitím Zeemanovy korekce pozadí se také kompenzují

spektrální interference a interference způsobené molekulární

absorpcí, především při použití elektrotermické atomizace.

Spektrální interferenci může také způsobit použití

víceprvkové výbojky s dutou katodou. Specifická a nespecifická

absorpce se měří ve spektrálním rozmezí definovaném

šířkou pásu vymezeného monochromátorem (0,2 nm

až 2 nm).

KOREKCE POZADÍ

Rozptyl světla a pozadí při plamenové nebo elektrotermické

atomizaci zvětšuje měřené hodnoty absorbance. Absorpce

pozadí zahrnuje široký rozsah vlnových délek (má spojitý

charakter), zatímco atomová absorpce má čárový charakter

o velmi úzkém vlnovém rozmezí asi 0,005 nm až

0,02 nm. Absorpce pozadí se může v principu korigovat

použitím kontrolního roztoku přesně stejného složení jako

vzorek, ale bez daného stanovovaného prvku, i když je tato

metoda často nepraktická. Při elektrotermické atomizační

metodě se musí optimalizovat teplota pyrolýzy, aby se

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 119

2.2.23 ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE

účinně eliminovaly rozkladné produkty matrice, které působí

absorpci pozadí. Korekce pozadí se také může provádět

za použití dvou různých světelných zdrojů, a to lampy

s dutou katodou, která měří celkovou absorpci (prvek + pozadí),

a deuteriové lampy se spojitou emisí, která měří pouze

absorpci pozadí. Pozadí se koriguje odečtením signálu

deuteriové lampy od signálu lampy s dutou katodou. Tato

metoda je omezena pouze na vlnové délky v rozsahu emise

deuteriové lampy od 190 nm do 400 nm. Pozadí se může

také změřit odečítáním na neabsorbující čáře blízko rezonanční

čáry a pak odečtením výsledků od měření na rezonanční

čáře. Jiná metoda pro korekci absorpce pozadí je

Zeemanův jev (založená na Zeemanově rozdělení absorpční

čáry v magnetickém poli). Toto je zvláště důležité, jestliže

absorpce pozadí vykazuje jemnou strukturu. Metoda umožňuje

účinnou korekci pozadí v rozmezí 185 nm až 900 nm.

VOLBA OPERAČNÍCH PODMÍNEK

Po výběru vhodné vlnové délky a šířky štěrbiny pro daný

prvek se musí určit následující parametry:

– korekce pro nespecifickou absorpci pozadí;

– chemické modifikátory nebo ionizační tlumivé látky, které

se musí přidat ke vzorku stejně jako ke kontrolnímu

a porovnávacím roztokům;

– zředění vzorku, aby se minimalizovaly např. fyzikální interference;

– detaily teplotního programu, předehřívání, sušení, pyrolýza,

atomizace, postatomizace s pracovní a udržovací dobou;

– průtok inertního plynu;

– vhodné modifikátory matrice pro elektrotermickou atomizaci

(pícka);

– chemická redukční činidla pro stanovení rtuti nebo jiných

hybridotvorných prvků společně s teplotou kyvety pro

studené páry nebo vyhřívané kyvety;

– specifikace druhu pícky (s přepážkami, platforma podle

L´vova, atd.)

POSTUP

Pokud je to možné, doporučuje se použití laboratorních pomůcek

z plastu. Příprava pevných vzorků může vyžadovat

rozpuštění, rozklad (většinou za použití mikrovlnné trouby),

spálení nebo kombinaci těchto metod k vyčištění matrice

vzorku a/nebo odstranění složek obsahujících uhlík.

Pokud se pracuje v otevřeném systému, neměla by spalovací

teplota kvůli těkavosti některých kovů přesáhnout

600 °C; pokud není v článku stanoveno jinak.

S atomovým absorpčním spektrometrem se pracuje podle

návodu výrobce při předepsané vlnové délce. Kontrolní

roztok se vpraví do atomizéru a signál přístroje se nastaví

tak, že ukazuje maximální propustnost. Hodnota kontrolního

roztoku se může určit použitím rozpouštědla k vynulování

přístroje. Vpraví se nejkoncentrovanější porovnávací

roztok a citlivost se nastaví tak, aby se získal maximální

signál absorbance. Přístroj se potom promyje, aby se zabránilo

kontaminaci a paměťovému efektu. Po skončení analýzy

se opět promyje vodou R nebo okyselenou vodou.

Pokud se používá metoda dávkování pevného vzorku, jsou

všechny detaily postupu uvedeny v článku.

Je třeba zajistit, aby stanovované koncentrace ležely nejlépe

v lineární části kalibrační křivky. Není-li to možné, kalibrační

křivky mohou být také zakřivené, pak se používají

se vhodným kalibračním softwarem.

Stanovení se provádějí porovnáním s porovnávacími roztoky

známých koncentrací stanovovaného prvku buď metodou

přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních

přídavků (Metoda II).

METODA I – PŘÍMÁ KALIBRACE

Pro běžné měření se připraví a měří tři porovnávací roztoky

a kontrolní roztok.

Připraví se roztok zkoušené látky (zkoušený roztok), jak je

předepsáno v článku, a nejméně tři porovnávací roztoky

stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou

hodnotu ve zkoušeném roztoku. Pro účely stanovení

obsahu jsou optimální kalibrační hodnoty 0,7násobek až

1,3násobek očekávaného obsahu stanovovaného prvku nebo

v limitu předepsaném v článku. Pro účely zkoušky na

nečistoty jsou kalibrační hodnoty mezi detekčním limitem

a 1,2násobkem limitu specifikovaného pro stanovovaný prvek.

Jakákoliv zkoumadla používaná k přípravě zkoušeného

roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům a ke kontrolnímu

roztoku ve stejné koncentraci.

Měřené roztoky se zavádějí do přístroje, přičemž počet opakovaných

měření musí být stejný pro všechny roztoky, aby

se zajistilo rovnoměrné odečítání.

Výpočet. Sestrojí se kalibrační křivka z průměru odečtů

získaných s porovnávacími roztoky vynesením průměrů jako

funkce koncentrace. Ze získané křivky se určí koncentrace

prvku ve zkoušeném roztoku.

METODA II – STANDARDNÍ PŘÍDAVKY

Do nejméně tří stejných odměrných baněk se přidají stejné

objemy roztoků zkoušené látky (zkoušený roztok) připravené,

jak je předepsáno. Do každé baňky, kromě jedné, se

přidá postupně se zvyšující objem porovnávacího roztoku

obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku tak,

aby se získala série roztoků obsahujících stoupající koncentraci

tohoto prvku, které poskytují odezvu v lineární části

křivky, je-li to možné. Obsah každé baňky se zředí rozpouštědlem

po značku. Každý z roztoků se zavede do přístroje

za použití stejného počtu opakovaných měření, aby

se zajistilo rovnoměrné odečítání.

Výpočet. Vypočítá se lineární rovnice grafu použitím metody

nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace

stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.

VALIDACE METODY

Uspokojivé provedení metod předepsaných v článcích se


LINEARITA




Kalibrační křivka se proloží regresní analýzou pomocí metody

nejmenších čtverců ze všech naměřených údajů. Vynese

se regresní křivka, průměry, naměřené údaje a interval

spolehlivosti kalibrační křivky. Pracovní postup je platný,

jestliže:




120 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.24 ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE V INFRAČERVENÉ OBLASTI


nejnižší a nejvyšší kalibrační hodnotu.

Je-li poměr určené směrodatné odchylky nejnižší a nejvyšší

kalibrační hodnoty mimo rozmezí 0,5 až 2,0, může se získat

přesnější odhad kalibrační křivky za použití vážené lineární

regrese. Pro údaje se použije lineární a kvadratická




PŘESNOST

Přesnost se ověřuje přednostně za použití certifikovaných




90 % až 110. Pro jiná stanovení, např. pro stanovení

stopového prvku, zkouška není platná, jestliže výtěžnost je

mimo rozmezí 80 % až 120 % teoretické hodnoty. Výtěžnost

se může určit pomocí vhodného porovnávacího roztoku

matrice, ke kterému se přidá známé množství stanovované

látky (koncentrace uprostřed kalibračního rozmezí).

OPAKOVATELNOST



MEZ STANOVITELNOSTI



2.2.24 ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE

V INFRAČERVENÉ OBLASTI

9.7:20224

PRINCIP

Spektrofotometrie pracující v infračervené oblasti (také

známá jako infračervená (IČ) spektroskopie) je založena na

interakci infračerveného záření s látkami, které ovlivňují

vibrační energii molekul a vyvolávají intermolekulární a intramolekulární

vibrace specifických frekvencí. Výsledkem

je infračervené absorpční spektrum s charakteristickými pásy,

které se shodují s funkčními skupinami v molekule.

Oblast infračervených vlnových délek může být dále rozdělena

na tři podoblasti, pro které byla obecně přijata konvence:

0,8 µm až 2,5 µm se nazývá blízká infračervená oblast,

2,5 µm až 25 µm střední infračervená oblast a 25 µm až

1000 µm daleká infračervená oblast. Protože v IČ spektroskopii

se běžněji používá vlnočet než vlnová délka, lze jej

přepočítat podle následujícího vzorce:

1

n = × 10 l

~ 4

kde ν̃ je vlnočet v reciprokých centimetrech (cm –1 ) a λ je

vlnová délka v mikrometrech. Tedy blízká infračervená

oblast (NIR) je od 12 500 cm –1 do 4000 cm –1 , střední infračervená

oblast (MIR) je od 4000 cm –1 do 400 cm –1 a daleká

infračervená oblast (FIR) je od 400 cm –1 do 10 cm –1 .

Tato stať se týká pouze spektroskopie ve střední infračervené

oblasti, tj. od 4000 cm –1 do 400 cm –1 (2,5 µm až

,

25 µm), pro zjednodušení je dále označena jako infračervená.

V této oblasti se základní molekulární vibrace funkčních

skupin objevují ve spektru jako absorpční pásy. Oblast

pod 1500 cm –1 je známa jako oblast „otisku prstu“, je velmi

komplexní a informativní částí spektra charakterizujícího

molekulu, která je hodnocena.

Střední infračervená oblast je obklopena blízkou infračervenou

oblastí, kde jsou detekovány (2.2.40) svrchní tóny

(overtones) a kombinační základní vibrace, zvláště funkčních

skupin C-H, N-H a O-H a dalekou infračervenou oblastí,

kde jsou pozorovány absorpční pásy spojené s typem

krystalové mřížky, vodíkovými vazbami, úhlovou deformační

vibrací těžkých atomů a molekulární rotací.

POUŽITÍ

Absorpční pásy v IČ spektrech jsou charakteristické pro

složení funkčních skupin sloučenin, proto je IČ spektroskopie

široce používána k identifikaci látek a poskytování informací

o jejich struktuře. Může se také použít pro kvantitativní

aplikace, což vyžaduje stanovení matematického

vzájemného vztahu mezi intenzitou záření absorbovaného

vzorkem a koncentrací zkoušené složky ve vzorku.

IČ spektroskopie se ve farmaceutické oblasti široce používá

pro chemickou a fyzikální analýzu v laboratořích, a má širokou

variabilitu aplikací během procesu výroby. IČ spektroskopie

umožňuje využít technologie analýzy procesu (PAT)

v rámci pokročilé strategie řízení.

Chemická analýza:

– identifikace léčivých a pomocných látek, lékových forem,

meziproduktů výrobního procesu, chemikálií a obalového

materiálu;

– stanovení jakosti léčivých látek a pomocných látek, lékových

forem, meziproduktů výrobního procesu a obalového

materiálu, včetně porovnání spekter od šarže k šarži

a posuzování změny dodavatele;

– kvantifikace léčivých látek v matrici vzorku, stanovení

vody a obsahu rozpouštědla;

– kvantifikace nečistot, např. v plynech, anorganických

materiálech;

– řízená reakce, např. chemická syntéza.

Fyzikální analýza:

– stanovení vlastností látek v pevném stavu, jako je polymorfie.

OMEZENÍ

Použití IČ spektroskopie zahrnuje následující důležitá

omezení:

– pro jednoznačnou identifikaci látky může být nezbytné

použití doplňující techniky;

– nemohou být rozlišeny samotné enantiomery látky;

– nemusí být vhodnou metodou pro stopovou analýzu;

– podmínky přípravy vzorku (např. tlak, rozpouštědlo)

mohou měnit krystalickou formu látky, která vykazuje

polymorfii;

– u heterogenních vzorků může být problematický omezený

objem vzorkování.

ZPŮSOBY MĚŘENÍ

IČ měření jsou založena na průchodu záření vzorkem nebo

povrchem vzorku a měření zeslabení paprsku při různých

vlnových délkách. To odpovídá dvěma hlavním způsobům

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 121


měření, tj. měření propustnosti a měření úplné zeslabené reflektance.

Nicméně, pro specifické aplikace existují i jiné

způsoby (např. difuzní a zrcadlová reflektance).

TRANSMISNÍ MĚŘENÍ

Tento způsob je založen na stanovení transmitance (T),

a sice schopnostivzorku propouštět infračervené záření při

dané vlnové délce (vlnočtu). Definuje ji následující poměr:

T =

v němž značí:

Io – intenzitu dopadajícího záření;

I – intenzitu prošlého záření.

Výsledné spektrum se může odečítat přímo jako závislost

transmitance (T) (osa pořadnic y) na vlnové délce nebo

vlnočtu (osa úseček x). Může být také odečtena jako absorbance

(A) (osa pořadnic y), která je vzhledem k transmitanci

(T) vyjádřena vzorcem:

v němž značí:

a – molární absorpční koeficient vzorku v centimetrech

čtverečných na mol (cm 2 · mol –1 );

b – tloušťku vzorku v centimetrech;

c – koncentraci vzorku v molech na kubický centimetr

(mol · cm –3 ).

MĚŘENÍ ZESLABENÉ ÚPLNÉ REFLEKTANCE

Měření zeslabené úplné reflektance (ATR) je založeno na

úplném vnitřním odrazu. Vzorek s indexem lomu n2 je

v těsném kontaktu s krystalem (diamant, germanium, selenid

zinečnatý nebo jiný vhodný materiál), jehož n1 je větší

než n2. Paprsek IČ světla prochází krystalem. Jestliže úhel

α mezi dopadajícím paprskem a rozhraním vzorek-krystal

překročí kritickou hodnotu αc, je teoreticky všechno záření

odraženo (úplný vnitřní odraz). Nicméně vzniká tlumená

vlna, která lehce proniká do vzorku, a část energie je absorbována.

Úplný odraz je zeslabený, což umožňuje vytvořit

absorpční spektrum. Prakticky se k zesílení absorpční intenzity

často používají vícenásobné vnitřní odrazy, nicméně

některá příslušenství k přístroji umožňují měření absorpce

jednoho odrazu.

Hloubka průniku dp je obvykle v řádech několika mikrometrů

a pro vlnovou délku λ je udávána následujícím vzorcem:

kde dp je hloubka průniku, λ je vlnová délka, α je úhel dopadu

a n1 a n2 jsou indexy lomu odrazového prvku, respektive

vzorku.

Vzhledem k vzájemnému vztahu mezi těmito parametry

(hloubkou průniku, vlnovou délkou, úhlem dopadu a indexy

lomu) je intenzita absorpce v ATR větší při delších vlnových

délkách (tj. kratších vlnočtech) a ve srovnání

s odpovídajícím transmisním spektrem se objeví mírné posuny

pásů. Proto při identifikaci látek není vhodné porovnávat

ATR spektra s transmisními spektry.

I

I 0

æ 1 ö æ I0 ö

A = log ç ÷ = log ç ÷ = a × b × c ,

è T ø è I ø

l n1

d p =

2

2p

sin a -

,

( n n )

2

2

1

,

PŘÍSTROJE

Nejčastěji používané IČ spektrometry jsou spektrometry

s Fourierovou transformací (FT-IR), které se obvykle skládají

z:

– vhodného polychromatického zdroje světla, např. vodivé

keramické tyčinky;

– interferometru;

– příslušenství pro měření vzorku, např. držáku vzorku;

– detektoru;

– vhodného softwaru pro nastavení spektrometru a pro

spektrální vyhodnocení a zpracování dat.

Mohou být použity i jiné spektrometry založené na alternativních

principech, pokud jsou splněny požadavky popsané

v části Kontrola správné funkce přístroje.

Pro studium malých částí vzorku nebo pro chemické zobrazování

mohou být také použity IČ spektrometry ve spojení

s mikroskopem.

IČ spektroskopie může být propojena s jinými analytickými

technikami, jako je termická analýza nebo chromatografie.

KONTROLA SPRÁVNÉ FUNKCE PŘÍSTROJE

Přesnost stupnice vlnočtů a spektrální rozlišení jsou kritické

parametry a je třeba je ověřit. Dále popsané zkoušky lze

použít pro kontrolu přístroje, jeho výkonu a pro kvalifikaci.

Mohou být také použity jako testy způsobilosti systému.

Tyto parametry se kontrolují pomocí vhodných referenčních

materiálů, které jsou vybrány a uvedeny v závislosti

na technice měření (např. transmisní nebo ATR).

Pro kvantitativní analýzu musí být také definována vhodná

kritéria pro kontrolu absorpční intenzity.

STUPNICE VLNOČTŮ

Stupnice vlnočtů se typicky ověřuje použitím polystyrenového

filmu, který vykazuje IČ absorpční pásy při vlnočtech

uvedených v tabulce 2.2.24-1.

Tab. 2.2.24-1 Polohy pásů a přijatelné tolerance polystyrenového

filmu použitého k ověření přesnosti vlnočtu

Poloha pásu (cm –1 )

Transmise

ATR

Tolerance (cm –1 )

906,6 906,1 ±1,0

1028,3 1027,7 ±1,0

1601,2 1601,0 ±1,0

3060,0 3059,7 ±1,0

Při jiných způsobech měření než transmisním nebo ATR

musí uživatel definovat referenční materiály.

SPEKTRÁLNÍ ROZLIŠENÍ

Spektra zaznamenaná transmisním způsobem. Spektrální

rozlišení se typicky ověřuje použitím polystyrenového

filmu o tloušťce asi 35 µm.

Kritéria přijatelnosti (viz obrázek 2.2.24-1): rozdíl mezi hodnotami

absorbance v absorpčním minimu při 2870 cm –1 (A)

a absorpčním maximu při 2849,5 cm –1 (B) je větší než 0,33;

rozdíl mezi hodnotami absorbance v absorpčním minimu

při 1589 cm –1 (C) a absorpčním maximu při 1583 cm –1 (D)

je větší než 0,08.

Spektra zaznamenaná způsobem ATR. Vhodné kritérium

hodnocení pro kontrolu spektrálního rozlišení je třeba definovat

podle specifikací pro každý přístroj.

122 ČL 2017 – Dopl. 2020


Absorbance

Obr. 2.2.24-1 Typické IČ spektrum polystyrenu používané

k ověření spektrálního rozlišení

Při jiných způsobech měření než transmisním nebo ATR

musí uživatel definovat referenční materiály.

POSTUP

Vlnočet (cm –1 ) Vlnočet (cm –1 )

PŘÍPRAVA A MĚŘENÍ VZORKU

Příprava a měření vzorku se liší podle fyzikálního stavu

vzorku a způsobu měření.

Transmisní způsob se používá pro průhledné vzorky, jako

jsou čisté kapaliny, roztoky, plyny nebo vhodně připravené

taveniny a tablety alkalických halogenidů. Pro kapaliny

a plyny lze použít kyvety s pevnou nebo proměnlivou

tloušťkou a okénka propouštějící IČ. Pro alkalické halogenidové

tablety se používají speciální držáky vzorků. Metoda

odrazu, např. ATR, je vhodná proměření širokého rozsahu

vzorků v pevném a kapalném stavu.

Některé způsoby přípravy (např. pro tablety a taveniny při

transmisním měření nebo pro pevné látky při měření ATR)

zahrnují mletí a/nebo použití tlaku, které může vyvolat neočekávané

krystalové změny.

Transmisní způsob měření

Látka se upraví jedním z následujících postupů v závislosti

na stavu vzorku (pevná látka, kapalina nebo plyn). Pokud

pásy vzorku ve spektru mají nejnižší propustnost méně než

5 %, pak se toto spektrum pro další analýzu dat nepoužije.

Kapaliny. Kapaliny se hodnotí buď jako film mezi dvěma

destičkami propustnými pro infračervené záření, nebo v kyvetě

s okénky vhodné tloušťky, které jsou propustné pro infračervené

záření.

Kapaliny nebo pevné látky v roztoku. Připraví se roztok

zkoušené látky ve vhodném rozpouštědle. Zvolí se koncentrace

a tloušťka kyvety tak, aby se získalo vyhovující spektrum.

Dobré výsledky se obvykle získají s koncentracemi

od 10 g/l do 100 g/l pro tloušťku kyvety 0,5 mm až

0,1 mm. Absorpce rozpouštědla je obvykle kompenzována

tím, že se postupně změří spektrum rozpouštědla

a zkoušeného roztoku a absorpční pásy rozpouštědla se

odečtou od spektra zkoušeného roztoku.

Pevné látky dispergované v pevné látce (tabletě). Zkoušená

látka se rozdrtí, vezmou se v úvahu případné možné změny

(např. krystalická forma), a smíchá se s vhodný množstvím

jemně práškovaného a vysušeného bromidu draselného R

nebo chloridu draselného R, pokud není uvedeno jinak.

K získání spektra vhodné intenzity obvykle postačuje připravit

tabletu o průměru 10 mm až 15 mm ze směsi několika

miligramů (např. 1 mg až 2 mg) zkoušené látky

v několika stovkách miligramů (např. 300 mg až 400 mg)

halogenidu. Je-li zkoušená látka hydrochlorid, doporučuje

se použít chlorid draselný R. Směs se pečlivě rozetře,

vhodná forma se jí stejnoměrně naplní a slisuje se pod tlakem

asi 800 MPa. Tablety s látkami, které jsou za normálních

atmosférických podmínek nestabilní nebo hygroskopické,

se slisují za použití vakua. Příčinou vzniku špatných

tablet mohou být některé faktory, jako jsou nedostatečné

rozmělnění nebo přílišné roztírání, vlhkost nebo nečistoty

v disperzním médiu. Například přítomnost vody ve vzorku

nebo v bromidu draselném může vyvolat zákal tablety

a vznikne nízké transmisní spektrum. Tableta se vyřadí,

vykazuje-li při vizuální kontrole nerovnoměrnou propustnost

nebo, je-li transmitance při asi 2000 cm –1 (5 µm)

v nepřítomnosti specifického absorpčního pásu menší než

60 % v propustnosti nebo větší než 0,22 v absorbanci bez

kompenzace, není-li předepsáno jinak.

Pevné látky dispergované v kapalině (tavenina). Rozetře se

malé množství zkoušené látky s minimálním množstvím

parafinu tekutého R nebo jiné vhodné kapaliny; k přípravě

vhodné suspenze stačí zpravidla několik miligramů (např.

5 mg až 10 mg) zkoušené látky a jedna kapka parafinu tekutého

R. Suspenze se stlačí mezi dvě destičky propustné

pro infračervené záření. Tavenina se vyřadí ze zkoušky,

pokud je při vizuálním hodnocení vidět nedostatek v rovnoměrné

propustnosti, nebo kde spektrum vykazuje rysy

jako:

– nízkou propustnost při 4000 cm –1 ;

– velmi šikmo nakloněnou základní linii mezi 4000 cm –1

a asi 2500 cm –1 ;

– poměr relativních intenzit některých absorpčních pásů,

který je menší než očekávaný.

Tavenina pevných látek. Pokud je předepsána v článku, vytvoří

se film roztavené hmoty a upevní se vhodným držákem.

Odpařený roztok. Pokud je v článku předepsán, zkoušená

látka se rozpustí ve vhodném rozpouštědle. Odpařením

rozpouštědla se připraví film na vhodném nosiči a upevní

se vhodným držákem.

Plyny. Plyny se zkoušejí v kyvetě propustné pro infračervené

záření. Kyveta se evakuuje a naplní se na požadovaný

tlak pomocí kohoutu nebo jehlového ventilu při použití

vhodné trubice pro převod plynu mezi kyvetou a nádobou

obsahující zkoušenou látku. Je-li třeba, upraví se tlak v kyvetě

na tlak atmosférický použitím plynu propustného pro

infračervené záření (např. dusík R nebo argon R), nebo se

promyje vzduchem prostým oxidu uhličitého. Kompenzace

vody, oxidu uhličitého nebo jiných atmosférických plynů

musí být uvedena v odpovídajícím protokolu měření.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 123

2.2.25 ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE V ULTRAFIALOVÉ A VIDITELNÉ OBLASTI

Metoda ATR (Metoda zeslabené úplné reflektance)

ATR je vhodná pro kapalné a pevné vzorky a nevyžaduje

žádnou přípravu, kromě jednoduché úpravy jako je rozdrcení

velkých krystalů a hrubého materiálu. Postupuje se následujícím

způsobem v závislosti na stavu vzorku (kapalina

nebo pevná látka).

Kapaliny. Vzorek se umístí do kontaktu s krystalem.

Pevné látky. Zajistí se, aby zkoušená látka byla v těsném

a rovnoměrném kontaktu s celým povrchem krystalu buď

použitím tlaku, nebo se látka rozpustí ve vhodném rozpouštědle,

výsledným roztokem se pak pokryje krystal a odpaří

se do sucha.

METODY

Infračervená spektroskopie se většinou používá k identifikaci

látek, ale může být rovněž použita pro kvantitativní

aplikace. Kvantitativní analýza (podle Beerova-Lambertova

zákona, v němž absorbance vzorku je úměrná jeho koncentraci)

nebude v této stati popisována.

Měření se provádí s vhodně připraveným vzorkem. Údaje

jsou následně zpracovány a vyhodnoceny, buď k identifikaci

látek, nebo k jejich kvantifikaci (např. na základě integrace

IČ absorpčních pásů).

Spektrální jakost může být zesílena matematickými předběžnými

zpracováními. V praxi jsou však omezena na

spektrální normalizaci a odečet pásů způsobených oxidem

uhličitým a vodní párou. Stejné předběžné zpracování se

provádí pro spektrum vzorku i pro referenční spektrum.

Identifikace

Zkoušená látka se upraví vhodným způsobem a zaznamená

se spektrum v rozmezí od 4000 cm –1 do 650 cm –1 , pokud

není předepsáno jinak.

Porovná se spektrum zkoušené látky se spektrem Ph. Eur.

chemické referenční látky (CRL) nebo s Ph. Eur. referenčním

spektrem.

Spektrum aktuální šarže Ph. Eur. CRL může být zaznamenáno

pro okamžité použití nebo uchováno, např. v knihovně

spekter pro budoucí konzultaci. Uložené spektrum, může

být použito, pokud je zajištěna jeho zpětná dohledatelnost

k aktuální šarži CRL.

V případě látek, které nejsou uvedeny v jednotlivých lékopisných

článcích, mohou být použity vhodné referenční

standardy.

Pokaždé musí být zaznamenána spektra za použití stejných

operačních podmínek a postupů, a zejména stejného způsobu

měření.

Pokud se spektra zaznamenaná v pevném stavu liší od referenčních

spekter získaných, jak je uvedeno dále, zkoušená

i referenční látka se zpracují stejným způsobem tak, aby

vykrystalizovaly nebo vznikly ve stejné krystalové formě,

nebo se postupuje tak, jak je předepsáno v článku, a pak se

opět zaznamenají spektra. Tento postup však musí být proveden

pouze u látek, u kterých článek nezahrnuje zvláštní

formu látky, která vykazuje polymorfii.

Pro identifikaci může být použito několik srovnávacích postupů,

analytik musí doložit a zdůvodnit metodu srovnání

a zvláštní kritéria přijatelnosti, která umožňují je vyhodnotit.

Spektra lze porovnat buď překrytím spekter (v celém

spektrálním rozsahu nebo v oblasti zájmu uvedené v článku),

nebo pomocí softwarových matematických výpočtů.

Je možné například provést:

– vizuální porovnání založené na polohách píků a relativních

intenzitách, není-li uvedeno jinak; poloha a relativní

velikost transmisních minim (nebo absorpčních maxim)

ve spektru získaném se zkoušenou látkou odpovídají poloze

a relativní velikosti v referenčním spektru;

– výpočet korelačního koeficientu mezi dvěma spektry; tato

hodnota se vypočítá pomocí softwaru a identifikační mez

uvádění je definována uživatelem;

– hodnocení chemometrických metod (např. Eukleidovská

vzdálenost, Mahalanobisova vzdálenost, klasifikační metody);

tyto metody umožňují analytikem nastavit, posoudit

a zvalidovat chemometrický model (viz 5.21 Chemometrické

metody pro analytická data).

NEČISTOTY V PLYNECH

Pro analýzu nečistot v plynech se použije kyveta propustná

pro infračervené záření s vhodnou optickou dráhou (např.

1 m až 20 m). Kyveta se naplní způsobem uvedeným v odstavci

Plyny. Detekce a kvantifikace nečistot se provede

podle postupu popsaného v článku.

2.2.25 ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE

V ULTRAFIALOVÉ A VIDITELNÉ

OBLASTI

10.0:20225

PRINCIP

Spektrofotometrie (nebo spektroskopie) v ultrafialové

a viditelné oblasti (UV-Vis) je založena na schopnosti atomů,

molekul a iontů absorbovat světlo při specifických

vlnových délkách v ultrafialové (přibližně 180 nm až

400 nm) a viditelné oblasti spektra (přibližně 400 nm až

800 nm). Tato absorpce je spojena se změnami energie

elektronů formou dočasných přechodů elektronů do excitovaného

stavu na vyšší energetickou hladinu (orbital). Protože

každá energetická hladina molekuly nebo molekulového

iontu má také přidružené vibrační a rotační podhladiny,

vede to k mnoha povoleným přechodům, které je obecně

nemožné oddělit, čímž se vytvářejí absorpční pásy spíše

než ostré linie. Tyto pásy jsou charakteristické pro funkční

skupiny a vazby v molekule.

Spektroskopická měření v ultrafialové a viditelné oblasti

zahrnují vystavení vzorku světlu a měření zeslabení a/nebo

rozptylu vznikajícího (procházejícího nebo odraženého)

světla buď při jediné vlnové délce, nebo ve specifikovaném

rozsahu vlnových délek.

POUŽITÍ

Spektroskopie v ultrafialové a viditelné oblasti se tradičně

používá pro kvantitativní a kvalitativní analýzu kapalných

vzorků (ale je také vhodná pro pevné a plynné zkoušené

látky a má další použití, jako je stanovení fyzikálních nebo

chemických vlastností.

Spektroskopie v ultrafialové a viditelné oblasti popsaná

v této stati může být použita různými způsoby:

– pokud článek nebo obecná stať odkazuje na tuto obecnou

stať, jsou požadavky popsané v příslušných odstavcích této

stati povinné;

124 ČL 2017 – Dopl. 2020


– pokud se používá jako detekční metoda v chromatografických

systémech, jak je popsáno v obecné stati 2.2.46,

požadavky uvedené v příslušných odstavcích této stati

jsou povinné;

– pokud se používá jako nástroj procesní analytické technologie

(PAT) pro aplikace PAT podobné aplikacím popsaným

v této stati, platí ustanovení této stati. Pro ostatní

aplikace PAT jsou zásady stejné, kritéria jsou však stanovena

s ohledem na zamýšlený účel analýzy za použití přístupu

založeného na posouzení rizika.

ZAŘÍZENÍ

Spektrofotometry používané pro měření v ultrafialové a viditelné

oblasti se obvykle skládají z:

– vhodného zdroje světla (jako je deuteriová lampa pro ultrafialovou

oblast, wolfram-halogenová lampa pro viditelnou

oblast nebo xenonová lampa pro pokrytí celého

rozsahu ultrafialové a viditelné oblasti); spektrofotometry

v ultrafialové a viditelné oblasti často mají dva zdroje;

– monochromátoru, jako je mřížkový systém;

– jiných optických součástí, jako jsou čočky nebo zrcadla,

které přenášejí světlo přístrojem a mohou být rovněž použity

ke generování více než jednoho paprsku světla, tj.

ve dvoupaprskových spektrofotometrech, na rozdíl od

jednopaprskových spektrofotometrů;

– nádoby na vzorky, držáku nebo vzorkovacího zařízení;

příklady zahrnují konvenční kyvety, sondy s optickými

vlákny a ponorné transmisní cely (např. z křemene o vysoké

čistotě nebo safíru propouštějících záření v ultrafialové

a viditelné oblasti); výběr závisí na zamýšleném použití,

přičemž zvláštní pozornost je věnována vhodnosti

pro daný typ analyzovaného vzorku;

– jednokanálového (např. fotonásobiče, fotodiody) nebo vícekanálového

detektoru [např. fotodiodové pole (photodiode

array, PDA) nebo senzory s nábojově vázanou

strukturou (charge-coupled device, CCD)];

– vhodných počítačových systémů pro zpracování a vyhodnocování

dat.

Kontrola kyvet. Pro stolní přístroje se používají kyvety

nebo cely s definovanou délkou optické dráhy. Mohou být

vyrobeny z různých materiálů, jako je křemen nebo sklo.

Tolerance délky dráhy křemenné a skleněné kyvety je

±0,5 % (např. pro 1cm kyvetu ±0,005 cm). Mohou se také

použít plastové kyvety, ale interval tolerance je širší; proto

jejich použití musí být důkladně zdůvodněno a založeno na

posouzení rizika.

Pro kontrolu čistoty okének optické kyvety a jakýchkoliv

významných rozdílů v jejich tloušťce nebo rovnoběžnosti

lze použít následující metodu: kyveta se naplní vodou R

a změří se její zdánlivá absorbance proti vzduchu při

240 nm pro křemenné kyvety a při 650 nm pro skleněné

kyvety. Kyvety se v držáku otočí o 180° a opět se změří

zdánlivá absorbance při stejné vlnové délce.

Při použití skenovacích přístrojů se doporučuje skenovat

optickou oblast zájmu.

Používají-li se dvoupaprskové spektrofotometry, měla by

být přijata opatření (např. stejné kyvety), aby se zajistilo,

že jakýkoliv rozdíl mezi absorbancí kyvet nebude mít významný

dopad na analýzu, která má být provedena.

Kritéria přijatelnosti:

– zdánlivá absorbance není větší než 0,093 pro 1cm křemenné

kyvety (ultrafialová oblast) a 0,035 pro 1cm

skleněné kyvety (viditelná oblast);

– absorbance měřená po otočení (180°) se neliší o více než

0,005 od dříve získané hodnoty.

MĚŘENÍ

Transmisní měření. Je založeno na měření transmitance

(T) vzorku umístěného mezi světelným zdrojem a detektorem

při dané vlnové délce v ultrafialové a viditelné oblasti.

Transmitance je poměr intenzity procházejícího světla

k intenzitě dopadajícího světla a je vyjádřena následujícím

vzorcem:

v němž značí:

I – intenzitu procházejícího záření;

I0 – intenzitu dopadajícího záření.

Spektrum může být získáno vynesením změny v transmitanci

(T) nebo absorbanci (A) jako funkce vlnové délky.

Absorbance je definována jako dekadický logaritmus převrácené

hodnoty transmitance (T) pro monochromatické

záření. Je to bezrozměrná veličina vyjádřená v jednotkách

absorbance (AU) a je vyjádřena rovnicí:

Podle Lambertova-Beerova zákona, který platí pro čiré zředěné

roztoky bez interferujících fyzikálně-chemických faktorů,

je absorbance (A) úměrná tloušťce vrstvy (l), kterou

záření prochází vzorkem, a koncentraci (c) látky v roztoku

podle vzorce:

,

A = e × c × l ,

v němž značí:

ε – molární absorpční koeficient v litrech na mol na centimetr;

c – molární koncentraci látky v roztoku v molech na litr;

l – tloušťku absorpční vrstvy v centimetrech.

1%

Specifická absorbance ( A 1 cm) látky se obecně používá

v článcích a je vztažena k absorbanci (A) následujícím způsobem:

v němž značí:

A A × cm × l ,

cm – koncentraci látky v roztoku v gramech na

100 mililitrů;

1%

( A 1 cm) představuje specifickou absorbanci rozpuštěné látky

a vztahuje se k absorbanci roztoku 1 g/100 ml (neboli

1 % m/V) měřenou v 1cm kyvetě nebo cele při definované

vlnové délce. Vztah mezi a ε je:

v němž značí:

T =

10e

= ,

M

Mr – relativní molekulovou hmotnost.

I

I 0

æ 1 ö æ I

0

A = log ç ÷ = log ç

è T ø è I

= 1%

1cm

A 1

1%

cm

1%

1cm

A

r

ö

÷

ø

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 125


Měření transmitance nebo absorbance se obvykle používají

pro kapaliny (disperze a roztoky), ale mohou být také použity

pro pevné látky (včetně tablet a tobolek). Pro měření

pevných látek se použije vhodné příslušenství. Vzorky kapalin

se měří v cele nebo kyvetě s vhodnou tloušťkou vrstvy

(obvykle 0,01 cm až 1 cm) a vyrobené z materiálu, který

je propustný pro záření v ultrafialové a viditelné oblasti,

nebo pomocí sondy s optickými vlákny ve vhodném uspořádání,

ponořené do kapaliny.

Měření difuzní reflektance. Tento způsob poskytuje míru odrazivosti

(reflektance) (R), která je dána následující rovnicí:

I

R = ,

I 0

v němž značí:

I – intenzitu světla odraženého a/nebo rozptýleného vzorkem;

I0 – intenzitu světla odraženého a/nebo rozptýleného pozadím

nebo referenčním reflexním povrchem.

V závislosti na chemickém složení a fyzikálních vlastnostech

vzorku může být záření v ultrafialové a viditelné oblasti

při průchodu vzorkem absorbováno. Při měření difuzní

reflektance je to právě neabsorbované záření, které je částečně

odráženo a/nebo rozptýleno zpět ze vzorku, jež je měřeno

detektorem. Reflektanční spektra v ultrafialové a viditelné

oblasti se obvykle získají výpočtem a vynesením

log (1/R) jako funkce vlnové délky.

Tento způsob měření se používá obecně pro pevné látky.

Vzorek se zkouší buď ve vhodném zařízení (např. držák

vzorku), nebo v přímém kontaktu se sondou. Při monitorování

procesu může být materiál analyzován přes rozhraní leštěného

okénka (např. křemen nebo safír), nebo za použití inline

sondy. Je třeba dbát na to, aby podmínky měření byly co

nejvíce reprodukovatelné od jednoho vzorku ke druhému.

Provoz zařízení. Faktory dále uvedené ovlivňují spektrální

odezvu a musí se vždy vzít v úvahu.

Vybere se způsob měření, který je vhodný pro zamýšlenou

aplikaci a typ vzorku.

Stanoví se podmínky měření s přihlédnutím k velikosti

vzorku a vzorkovací sondě tak, aby byl dosažen uspokojivý

poměr signálu k šumu (např. velikost paprsku, doba měření

a počet měření). U skenovacích spektrofotometrů se také

vybere rozsah skenování, rychlost skenování a šířka

štěrbiny, které poskytují potřebné optické rozlišení pro zamýšlenou

aplikaci, aniž by ztratily požadovaný poměr signálu

k šumu nebo linearitu analytické metody. Při použití

spektrofotometrů se souborem senzorů není nutné upravit

velikost paprsku, rozsah skenování, rychlost skenování nebo

šířku štěrbiny, protože optické rozlišení je obvykle fixní

a vždy se zaznamenává celé spektrum.

Před měřením absorbance by měla být nastavena nebo určena

nulová poloha absorpce (korekce základní linie) pro požadované

vlnové délky nebo vhodný rozsah vlnových délek.

U aplikací PAT je při měření pohyblivých materiálů nebo

vzorků třeba zajistit, aby nedocházelo k zanesení čidla

(např. žádná kontaminace nebo hromadění materiálu)

Není-li v článku uvedeno jinak, změří se absorbance při

délce optické dráhy 1 cm při předepsané vlnové délce.

Pokud je v článku uvedena jediná hodnota pro polohu absorpčního

maxima nebo minima, musí uživatel určit polohu

vlnové délky. Pokud není předepsáno jinak, může se získaná

hodnota lišit nejvýše o ±2 nm.

Kvantitativní měření by nemělo vycházet z hodnot absorbance

vyšších než 2,0.

Korekce pozadí. Zvolí se vhodný spektroskopický slepý

vzorek (např. vzduch, kontrolní rozpouštědlo, pevný materiál).

Pokud není předepsáno jinak, všechna měření se provádějí

v porovnání se stejným rozpouštědlem nebo stejnou

směsí rozpouštědel (slepý vzorek).

Změří se slepý vzorek a samotný vzorek v krátkém časovém

rozmezí buď paralelně ve dvoupaprskových spektrofotometrech,

nebo postupně v jednopaprskových spektrofotometrech.

Hodnoty absorbance slepého vzorku i vzorku

musí být v operačním rozsahu zařízení, jak je specifikováno

výrobcem.

U stolních přístrojů absorbance rozpouštědla měřená proti

vzduchu a při předepsané vlnové délce nesmí přesáhnout

0,4 a pokud možno by měla být menší než 0,2.

U chromatografických systémů může být transmitance mobilní

fáze použita jako slepá zkouška.

V některých aplikacích PAT může být nemožné vyjmout

sondu pro měření pozadí. Měly by být proto zvažovány

různé možnosti, včetně použití interních referenčních roztoků,

měření slepého vzorku pomocí druhého detektoru

apod. Pouze spektra, naměřená proti slepému vzorku se

stejnými optickými vlastnostmi, mohou být mezi sebou

přímo porovnávána.

Pro měření reflektance se použijí běžné slepé vzorky zahrnující

keramiku, fluoropolymery, jako je polytetrafluorethylen

(PTFE), prášky, jako je síran barnatý (BaSO4)

a oxid hořečnatý (MgO), ale je také možné použít i jiné

vhodné materiály.

MATEMATICKÉ ZPRACOVÁNÍ

SPEKTRÁLNÍCH DAT

V případě analýzy s jedinou vlnovou délkou, která se používá

k určení koncentrace neznámého vzorku (např. jak je

předepsáno v článcích), matematické zpracování spočívá

v určení regrese fotometrického odečtu (absorbance) na

koncentraci standardních vzorků.

V případě spekter v celém rozsahu, jak pro režim difúzní

reflektance, tak pro transmisní režim, může být nutné data

zpracovat před tím, než je možné vytvořit klasifikační nebo

kalibrační model. Cílem může být např. snížení kolísání

základní linie (baseline drift) nebo korekce rozptylu způsobeného

změnami velikosti částic v pevných vzorcích. Např.

pro zlepšení rozlišení nebo citlivosti může být použita první

a druhá derivace nebo derivace vyššího řádu spektra. Toto

předběžné zpracování může být užitečným prostředkem pro

zjednodušení dat, a tím pro snížení odchylek, které mohou

způsobit interference v následně použitých matematických

modelech.

Široký rozsah způsobů zpracování, jako je škálování, vyhlazení,

normalizace a derivatizace, lze aplikovat jednotlivě

nebo v kombinaci. Další informace jsou uvedeny v obecné

stati 5.21 Chemometrické metody pro analytická data.

126 ČL 2017 – Dopl. 2020



Funkčnost spektrofotometru je kontrolována (automaticky

nebo ručně) v pravidelných intervalech, jak je definováno

v systému řízení jakosti a předepisováno použitím zařízení

a aplikace. Např. zařízení vystavená změnám teploty a vlhkosti

mohou vyžadovat častější zkoušení správné funkce.

Požadavky na kontrolu správné funkce přístroje pro různé

způsoby měření jsou shrnuty v tabulce 2.2.25-1. Pokud je

to vhodné, mohou být provedeny další zkoušky.

Přesnost vlnové délky, přesnost absorbance a linearita jsou

kontrolovány pomocí certifikovaných referenčních materiálů,

jako jsou pevné filtry nebo kapalné filtry, ve vhodných

zatavených kyvetách, nebo pomocí roztoků připravených

v laboratoři, jak je popsáno dále.

Kontrola přesnosti vlnových délek. Přesnost vlnové délky

příslušného počtu pásů v zamýšleném spektrálním rozsahu

se ověřuje pomocí jednoho nebo více referenčních materiálů,

např. se použijí pevné nebo kapalné filtry (např. chloristan

holmitý RS), aby se ověřila poloha absorpčních pásů,

nebo se změří emise ze zdroje světla, aby se zkontrolovala

poloha emisní čáry. V tabulce 2.2.25-2 jsou uvedeny příklady

vlnových délek používaných ke kontrole přesnosti

vlnových délek. Při použití certifikovaných referenčních

materiálů je referenční vlnová délka uvedena na odpovídajícím

certifikátu.

Některé přístroje mohou mít automatickou nebo zabudovanou

funkci kontroly přesnosti vlnové délky.

U chromatografických systémů je také možné kontrolovat

přesnost vlnových délek měřením absorbance roztoku kofeinu

R (0,05 mg/ml) v methanolu R; absorpčního maxima

je dosaženo při 272 nm a minima při 244 nm.

Kritéria přijatelnosti

Doporučuje se zkoušet nejméně dvě vlnové délky, které

vymezují zamýšlený spektrální rozsah.

U stolních přístrojů pro spektroskopii v ultrafialové a viditelné

oblasti je tolerance pro přesnost vlnových délek

Tab. 2.2.25-2 Příklady vlnových délek použitých ke kontrole

přesnosti vlnové délky

Poznámka: Vlnová délka se mění s rozlišením přístroje

roztoky

pevné

filtry

Materiál

cerium v kyselině

sírové

didymium v kyselině

chloristé

holmium v kyselině

chloristé

Vlnové délky (nm)

201,1; 211,4; 222,6;

240,4; 253,7

511,8; 731,6; 794,2

241,1; 287,2; 361,3;

451,4; 485,2; 536,6;

640,5

didymiové sklo 513,5

holmiové sklo 279,3; 360,9; 453,4;

637,5

lampy deuteriová 486,0; 656,1

rtuťová (nízkotlaká) 184,9; 253,7; 312,5;

365,0; 404,7; 435,8;

546,1; 577,0; 579,1

neonová 717,4

xenonová 541,9; 688,2; 764,2

v kyvetách ±1 nm při vlnových délkách pod 400 nm

a ±3 nm při vlnových délkách 400 nm a vyšších.

Pro chromatografické systémy je tolerance pro přesnost vlnových

délek ±2 nm pro celý rozsah ultrafialové a viditelné

oblasti.

U aplikací PAT se doporučuje tolerance ±2 nm pro celý

rozsah ultrafialové a viditelné oblasti. Pro některé aplikace

PAT však mohou být potřebné širší toleranční intervaly,

v takovém případě musí uživatel definovat požadovanou

přesnost vlnových délek v závislosti na zamýšleném účelu

a s využitím přístupu založeném na posouzení rizik.

Parametry přístroje (zejména vstupní optika, jako je šířka

štěrbiny nebo průměr optického vlákna) ovlivňují rozlišení

a musí být stejné jako parametry určené pro skutečná měření.

Zkušební

metody

2.2

Tab. 2.2.25-1 Minimální zkoušky, které mají být provedeny pro kontrolu správné funkčnosti zařízení

Účel

kvantita-tivní

nebo limitní

zkouška

zkouška

totožnosti

Metoda

na základě měření

absorbance při jedné

nebo více

identifikovaných

vlnových délkách (např.

stanovení obsahu nebo

zkouška na nečistoty)

na základě vlnové délky

absorpčních maxim nebo

minim

na základě měření

absorpce a vlnové délky

absorpčních maxim

na základě porovnání

spektra se spektrem

referenční látky

Přesnost

vlnové

délky

Přesnost

absorbance

Fotometrická

linearita

Rozptýlené

světlo

x x x x

Rozlišení/

Spektrální

šířka pásu

je-li

požadováno

v článku

x – – x –

x x – x –

x x – – –

ČL 2017 – Dopl. 2020 127

2.2.26 PAPÍROVÁ CHROMATOGRAFIE

Kontrola přesnosti absorbance. Přesnost absorbance se

ověřuje při vhodném počtu vlnových délek v zamýšleném

spektrálním rozsahu pomocí vhodných pevných nebo kapalných

filtrů, aby se ověřilo, zda absorbance měřená při

zkoušené vlnové délce odpovídá certifikované specifické

absorbanci filtru nebo hodnotě absorbance, která je vypočítána

z certifikované specifické absorbance. Může být použita

kyselina nikotinová pro kvalifikaci zařízení CRL.

Doporučuje se zkoušet přesnost absorbance při zvolených

vlnových délkách za použití jednoho nebo více pevných

nebo kapalných filtrů s různými hodnotami absorbance;

minimálně by se mělo provést ověření pro dvě hodnoty

blízké mezím očekávaného rozsahu absorbance.

U chromatografických systémů a aplikací PAT nemusí být

zkoušení přesnosti absolutní absorbance nezbytné za předpokladu,

že se změří standardní křivka, jak je požadováno.

Pro měření za použití kyseliny nikotinové pro kvalifikaci

zařízení CRL je certifikovaná specifická absorbance uvedena

v příslušném certifikátu.

Roztok kyseliny nikotinové se může připravit následujícím

způsobem: 57,0 mg až 63,0 mg kyseliny nikotinové pro kvalifikaci

zařízení CRL se rozpustí v roztoku kyseliny chlorovodíkové

(0,1 mol/l) připraveném z kyseliny chlorovodíkové

R a zředí se stejným roztokem kyseliny na 200,0 ml;

2,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným roztokem kyseliny

na 50,0 ml tak, aby výsledná koncentrace byla 12 mg/l.

Tyto objemy se mohou upravit, aby se získaly roztoky

o různých koncentracích kyseliny nikotinové (až do asi

40 mg/l), pro účely zkoušení různých hodnot absorbance.

Absorbance se měří při 213 nm a při 261 nm.


Rozdíl mezi naměřenou absorbancí a absorbancí certifikovaného

materiálu je ±0,010 nebo ±1 %, podle toho, která

hodnota je větší, pro každou kombinaci vlnové délky

a hodnocené absorbance (platí pro hodnoty absorbancí ne

větší než 2). Tolerance pro vyšší hodnoty absorbance by

měly být definovány na základě posouzení rizik.

Kontrola fotometrické linearity. Fotometrická linearita se

kontroluje v zamýšleném spektrálním rozsahu. V ultrafialové

oblasti mohou být pro kontrolu přesnosti absorbance

použity filtry, stejně jako roztoky kyseliny nikotinové nebo

kofeinu. Ve viditelné oblasti lze použít neutrální skleněné

filtry. Před provedením zkoušky se ověří, že absorbance

standardů je kompatibilní se zamýšleným lineárním rozsahem.

Mohou se použít roztoky se zvyšujícími se koncentracemi

kyseliny nikotinové pro kvalifikaci zařízení CRL (např.

5 mg/l až 40 mg/l) v roztoku kyseliny chlorovodíkové

(0,1 mol/l) připravené z kyseliny chlorovodíkové R. Absorbance

se měří při 213 nm a 261 nm.

U chromatografických systémů je také možné kontrolovat

fotometrickou linearitu za použití roztoků kofeinu R

(0,5 mg/l až 50 mg/l) ve vodě pro chromatografii R.

Absorbance se měří při 273 nm.

Kritérium přijatelnosti

Koeficient determinace (R 2 ) není menší než 0,999.

Limit rozptýleného světla. Rozptýlené světlo se určuje při

vhodné vlnové délce za použití vhodných pevných nebo

kapalných filtrů nebo roztoků připravených interně. Parametry

přístroje použité pro zkoušku [např. šířka štěrbiny

a druh zdroje světla (např. deuteriová nebo wolframová

lampa)] musí být shodné s parametry určenými pro skutečná

měření.


Kritérium přijatelnosti závisí na použitých filtrech nebo použitých

roztocích, např.:

– absorbance je nejméně 3,0 při použití roztoku jodidu sodného

R (10 g/l) při 220 nm, roztoku jodidu draselného R

(10 g/l) při 250 nm nebo roztoku dusitanu sodného R

(50 g/l) při 340 nm a 370 nm;

– absorbance je nejméně 2,0 při použití roztoku chloridu

draselného R (12 g/l) při 198 nm.

Tyto hodnoty platí při použití 1cm kyvety a vody R jako

kontrolní kapaliny.

Kontrola rozlišení. Pokud je v článku předepsáno, měří se

rozlišení zařízení buď pomocí vhodných certifikovaných

referenčních materiálů, nebo zaznamenáním spektra roztoku

toluenu R 0,02% (V/V) v hexanu R nebo v heptanu R,

přičemž se jako kontrolní kapalina použije hexan R nebo

heptan R.


Pro měření prováděná s roztokem připraveným výše popsaným

způsobem je minimální poměr absorbance v maximu

(269 nm) k absorbanci v minimu (266 nm) uveden v článku.

ZPŮSOBILOST SYSTÉMU

Před měřením vzorku mohou být vyžadovány zkoušky způsobilosti

systému k ověření kritických parametrů, které

mohou mít vliv na výsledek.

Tyto zkoušky mohou zahrnovat přesnost vlnových délek,

přesnost absorbance, rozptýlené světlo a fotometrickou linearitu.

Zkoušky funkčnosti systému, např. zkoušky prováděné

při automatickém zkoušení zařízení, mohou být považovány

za součást testů způsobilosti systému.

V případě spektrofotometrické detekce v ultrafialové

a viditelné oblasti se pro chromatografické systémy použijí

dodatečné testy způsobilosti systému, pokud jsou předepsány

v článku a/nebo v obecné stati 2.2.46 Chromatografické

separační metody.

2.2.26 PAPÍROVÁ CHROMATOGRAFIE

6.0:20226

VZESTUPNÁ PAPÍROVÁ CHROMATOGRAFIE

Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných

rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část

komory je zabroušená a opatřená dobře těsnicím víkem.

V horní části komory je zařízení umožňující zavěšení chromatografického

papíru a jeho ponoření do mobilní fáze bez

otevření komory. Na dně komory je umístěna miska obsahující

mobilní fázi, do které může být papír ponořen. Jako

chromatografický papír se použije vhodný filtrační papír

nastříhaný do pruhů dostatečné délky, ne užších než

2,5 cm; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala

ve směru vláken papíru.

128 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.27 TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE

Pracovní postup. Mobilní fáze, která je předepsána v článku,

se nalije do misky na dně komory do výšky 2,5 cm. Pokud

je předepsáno v článku, nalije se stacionární fáze i mezi

stěny komory a misku. Komora se uzavře a nechá se stát

po dobu 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V uvedeném intervalu

teplot se komora udržuje i v průběhu další analýzy.

Na papír se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie

(start) ve vzdálenosti 3 cm od jednoho konce. Mikropipetou

se nanese na start ve formě skvrny objem roztoku, který

je uveden v lékopisném článku. Jestliže celkový objem

nanášeného roztoku by vytvořil skvrnu o větším průměru

než 10 mm, roztok se nanáší po částech v opakovaných

dílčích dávkách tak, aby se před každým dalším nanášením

rozpouštědlo odpařilo. Provádí-li se na stejném pruhu

papíru chromatografie více než jednoho vzorku, vzdálenost

mezi sousedními skvrnami na startu nemá být menší

než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory,

která se uzavře víkem, a nechá se stát 1 h 30 min. Potom

se papír ponoří do mobilní fáze a vyvíjí se do předepsané

vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se vyjme

a nechá se uschnout na vzduchu. Během vyvíjení se

papír chrání před přímým světlem.

SESTUPNÁ PAPÍROVÁ CHROMATOGRAFIE

Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných

rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část

komory je zabroušená a opatřená dobře těsnícím víkem.

Víko má středový otvor o průměru asi 1,5 cm uzavíratelný

těžkou skleněnou deskou nebo zátkou. V horní části komory

je umístěn žlábek pro rozpouštědlo se zařízením k zavěšení

chromatografického papíru. Na každé straně žlábku

jsou paralelně nad jeho horními okraji umístěny dvě skleněné

vodicí tyče podpírající papír tak, aby se žádná jeho

část nedotýkala stěn komory. Chromatografický papír je

tvořen vhodným filtračním papírem nastříhaným na pruhy

dostatečné délky a vhodné šíře, tj. mezi 2,5 cm a délkou

žlábku; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala ve

směru vláken papíru.

Pracovní postup. Na dno komory se nalije rozpouštědlo

uvedené v článku do výše 2,5 cm. Komora se uzavře

a nechá stát 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V tomto rozmezí

teplot se komora v průběhu analýzy udržuje. Na papír

se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie (start)

v takové vzdálenosti od jednoho konce, aby po zajištění

tohoto konce papíru ve žlábku s rozpouštědlem zbytek

papíru volně splýval přes vodicí tyč a start byl několik cm

pod vodicí tyčí a paralelně s ní. Pomocí mikropipety se

nanese na start objem roztoku, který je uveden v článku.

Jestliže celkový objem, který je nutno nanést, by vytvořil

skvrnu o větším průměru než 10 mm, je nutno nanášet

roztok po částech tak, aby se před každým následujícím

nanášením rozpouštědlo odpařilo. Provádí-li se na stejném

pruhu papíru chromatografie více než jednoho vzorku,

pak vzdálenost mezi sousedními skvrnami nemá být menší

než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory,

která se uzavře víkem, a nechá se stát 1 h 30 min.

Do žlábku se otvorem ve víku vpraví dostatečné množství

mobilní fáze, komora se uzavře a papír se vyvíjí do předepsané

vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se

vyjme z komory a nechá uschnout na vzduchu. Během

vyvíjení se papír chrání před přímým světlem.


9.0:20227

Tenkovrstvá chromatografie je separační metoda, u které

stacionární fázi tvoří vhodný materiál nanesený v rovnoměrné

tenké vrstvě na skleněný, kovový nebo plastový

podklad (desku). Roztoky stanovovaných látek se na vrstvu

nanášejí před vyvíjením. Dělení (separace) je založeno na

adsorpci, rozdělení, iontové výměně nebo na kombinaci

těchto mechanismů a dochází k němu migrací (vyvíjením)

rozpuštěných látek v rozpouštědle nebo vhodné směsi rozpouštědel

(mobilní fáze) tenkou vrstvou (stacionární fáze).

ZAŘÍZENÍ

Desky. Chromatografie se provádí za použití desek předem

potažených vrstvou, popsaných ve stati Zkoumadla (4.1.1).

Velikost částic silikagelu je uvedena za názvem zkoumadla

u zkoušek, kde je silikagel použit.

Předběžná úprava vrstev. Před dělením může být nezbytné

vrstvy promýt, např. může být provedeno vyvíjení vhodným

rozpouštědlem. Vrstvy mohou být rovněž impregnovány

vyvíjením, ponořením nebo postřikem. Je-li to nutné,

mohou se vrstvy před použitím aktivovat zahříváním v sušárně

při 120 °C po dobu 20 min.

Chromatografická komora s plochým nebo dvojžlábkovým

dnem z inertního průhledného materiálu vhodné velikosti

pro použité desky, opatřená dobře těsnicím víkem.

Komora pro horizontální vyvíjení je opatřena žlábkem pro

mobilní fázi a přídavným zařízením umožňujícím přímý

kontakt mobilní fáze a stacionární fáze.

Mikropipety, mikrostříkačky (injekční), kalibrované

kapiláry pro jedno použití nebo jiné nanášecí zařízení, které

je vhodné pro správné nanášení roztoků.

Fluorescenční detekční zařízení pro přímé hodnocení fluorescence

nebo zhášení fluorescence.

Zařízení a zkoumadla pro vizualizaci. Použijí se vhodná

zařízení, umožňující přenos zkoumadel na desku (postřikem,

ponořením nebo vystavením působení par) a kde je to

vhodné, zahřátí desky, aby se oddělené skvrny zviditelnily.

Dokumentace. Ke zdokumentování chromatogramu se

může použít např. fotografie nebo počítačový soubor.

PRACOVNÍ POSTUP

Nanášení vzorku. Předepsaný objem roztoků se nanáší ve

vhodné vzdálenosti od dolního okraje a bočních okrajů desky

rovnoběžně s dolním okrajem. Vzdálenost mezi středy kruhových

skvrn je nejméně 10 mm (u vysokoúčinných desek

5 mm) a mezi okraji skvrn ve formě proužků 5 mm (u vysokoúčinných

desek 2 mm). Roztoky se nanášejí po dostatečně

malých dávkách tak, aby se získaly kruhové skvrny o průměru

2 mm až 5 mm (u vysokoúčinných desek 1 mm až 2 mm)

nebo proužky délky 10 mm až 20 mm (u vysokoúčinných

desek 5 mm až 10 mm) a šířky 1 mm až 2 mm.

V článku, kde je možné použít normální i vysokoúčinné

desky, jsou pracovní podmínky pro vysokoúčinnou desku

uvedeny v hranaté závorce [ ] za podmínkami pro normální

desku.

Vertikální vyvíjení. Stěny chromatografické komory se

vyloží filtračním papírem. Do chromatografické komory se

nalije podle její velikosti takové množství mobilní fáze, aby

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 129


po impregnaci filtračního papíru byla vrstva ponořena do

vhodné hloubky, vzhledem k rozměrům použité desky. Pro

nasycení se komora uzavře víkem a nechá se stát 1 h při

20 °C až 25 °C. Není-li předepsáno jinak, chromatografické

dělení se provádí v nasycené komoře.

Nanese se předepsaný objem roztoků výše popsaným způsobem.

Po odpaření rozpouštědla z nanesených roztoků se

deska s vrstvou vloží do chromatografické komory tak, aby

byla v co nejvíce vertikální poloze a skvrny nebo proužky

byly nad hladinou mobilní fáze. Komora se uzavře, udržuje

se při teplotě 20 °C až 25 °C a chrání se před slunečním

světlem. Deska s vrstvou se vyjme, když mobilní fáze dosáhne

předepsané vzdálenosti mezi místem nanášení a čelem

mobilní fáze, vysuší se a provede se vizualizace chromatogramů

předepsaným způsobem.

Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení

vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém

na směr prvního vyvíjení.

Horizontální vyvíjení. Nanese se předepsaný objem roztoků

výše popsaným způsobem. Po odpaření rozpouštědla z nanesených

roztoků se vpraví injekční stříkačkou nebo pipetou

do žlábku komory dostatečné množství mobilní fáze. Deska

s vrstvou se do chromatografické komory umístí horizontálně

a spojí se s mobilní fází zařízením podle pokynů výrobce.

Je-li předepsáno, vyvíjení se zahájí z obou stran současně.

Komora se uzavře a udržuje se při teplotě 20 °C až 25 °C.

Deska s vrstvou se vyjme, když mobilní fáze dosáhne vzdálenosti

předepsané v článku, vysuší se a provede se vizualizace

chromatogramů předepsaným způsobem.

Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení

vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém

na směr prvního vyvíjení.

VIZUÁLNÍ HODNOCENÍ

Zkouška totožnosti. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného

roztoku se vizuálně porovnává s odpovídající skvrnou

na chromatogramu porovnávacího roztoku. Porovnává

se zbarvení, velikost a retardační faktor (RF) obou skvrn.

Retardační faktor (RF) je definován jako poměr vzdálenosti

místa nanášení a středu skvrny ke vzdálenosti čela mobilní

fáze od místa nanášení.

Ověření separační schopnosti pro zkoušky totožnosti. Obvykle

je dostačující provedení testu způsobilosti popsaného

ve stati Zkoumadla (4.1.1). Pouze ve zvláštních případech

může být v článku předepsáno další kritérium pro test způsobilosti.

Zkouška na příbuzné látky. Vedlejší skvrna (skvrny) na

chromatogramu zkoušeného roztoku se vizuálně porovnává

(porovnávají) s odpovídající(mi) skvrnou (skvrnami) na

chromatogramu porovnávacího roztoku obsahujícího nečistotu

(nečistoty) nebo se skvrnou na chromatogramu porovnávacího

roztoku připraveného ředěním zkoušeného roztoku.

Ověření separační schopnosti. Požadavky na ověření separační

schopnosti jsou uvedeny v příslušném článku.

Ověření detekční schopnosti. Detekční schopnost je dostatečná,

je-li skvrna (nebo proužek) na chromatogramu nejvíce

zředěného porovnávacího roztoku zřetelně viditelná.

KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

Požadavky na rozlišení a dělení jsou uvedeny v jednotlivých

článcích.

Látky oddělené tenkovrstvou chromatografií a detekovatelné

v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra mohou být

stanoveny přímo na desce s vrstvou za použití vhodného

přístrojového vybavení. Deska s vrstvou se hodnotí měřením

reflektance dopadajícího světla, přičemž se pohybuje

buď deska, nebo měřicí zařízení. Podobně za použití vhodného

optického systému může být měřena fluorescence.

Látky obsahující radionuklidy mohou být kvantifikovány

třemi způsoby: přímým měřením radioaktivity podél celého

chromatogramu [viz článek Radiofarmaca (0125)] nebo po

rozstříhání desky na proužky měřením radioaktivity každého

jednotlivého proužku za použití vhodného detektoru nebo

po seškrabání stacionární fáze a rozpuštění ve vhodné

scintilační kapalině měřením její radioaktivity za použití

kapalinového scintilačního detektoru.

Zařízení. Přístrojové vybavení pro přímé měření na desce

s vrstvou se skládá:

– ze zařízení pro přesné umístění a reprodukovatelné dávkování

množství látek na vrstvu;

– z mechanického zařízení pro pohyb desky nebo měřicího

zařízení ve směru osy x nebo osy y;

– ze zapisovače a vhodného integrátoru nebo počítače;

– pro látky detekovatelné v ultrafialové nebo viditelné oblasti

spektra: pro měření reflektance nebo transmitance z fotometru

se zdrojem světla, z optického zařízení schopného

generovat monochromatické světlo a z fotoelektrického

článku odpovídající citlivosti; jestliže se měří fluorescence,

použije se navíc vhodný filtr k odstínění světla použitého

k excitaci, zatímco emitované záření nebo jeho specifická

část je propuštěno dále;

– pro látky obsahující radionuklidy: z vhodného zařízení

pro měření radioaktivity, u kterého je ověřena oblast linearity.

Postup. Předepsaným způsobem se připraví zkoušený roztok

a, je-li třeba, připraví se i porovnávací roztoky stanovované

látky ve stejném rozpouštědle jako zkoušený roztok.

Nanesou se stejné objemy všech připravených roztoků

a chromatogram se vyvíjí.

Látky detekovatelné v ultrafialové a viditelné oblasti spektra.

Připraví se a nanesou se nejméně tři porovnávací roztoky,

v nichž jsou koncentrace zkoušené látky v rozpětí jejího

očekávaného obsahu ve zkoušeném roztoku (asi 80 %,

100 % a 120 %). Po skončeném vyvíjení se postříká, je-li

třeba, předepsaným zkoumadlem a zaznamená se reflektance,

transmitance nebo fluorescence chromatogramů zkoušeného

roztoku a porovnávacích roztoků. Naměřené hodnoty

se použijí pro výpočet množství látky ve zkoušeném roztoku.

Látky obsahující radionuklidy. Připraví se a nanese se

zkoušený roztok, jehož koncentrace je asi 100 % očekávané

hodnoty. Radioaktivita se stanoví jako funkce délky dráhy;

radioaktivita každého výsledného píku se vyjádří jako procento

z celkového množství radioaktivity.

Kritéria pro posouzení způsobilosti systému jsou popsána

ve stati Chromatografické separační metody (2.2.46). Rozsah,

ve kterém se může provádět nastavení parametrů

chromatografického systému tak, aby byla splněna kritéria

způsobilosti systému, je rovněž uveden v této stati.

130 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.28 PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE

2.2.28 PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE

9.6:20228

PRINCIP

Plynová chromatografie (GC) je separační metoda založená

na rozdílu v distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze: mobilní

fází je nosný plyn pohybující se skrz nebo podél stacionární

fáze, která je umístěna v koloně. Je použitelná pro

látky nebo jejich deriváty, které lze převést do plynné fáze

za použitých teplot.

Plynová chromatografie je založena především na mechanismu

adsorpce nebo na distribuci hmotností.

PŘÍSTROJ

Přístroj se obvykle skládá z:

– dávkovacího zařízení,

– chromatografické kolony umístěné v termostatu,

– jednoho nebo několika detektorů,

– systému pro zpracování dat.

Nosný plyn protéká kolonou a pak detektorem při regulované

rychlosti nebo tlaku.

Stanovení se provádí buď při konstantní teplotě, nebo podle

daného teplotního programu.

DÁVKOVACÍ ZAŘÍZENÍ

Nástřik může být prováděn buď do vstřikovací komůrky,

která může být opatřena děličem toku, nebo přímo na začátek

kolony za použití stříkačky nebo dávkovací smyčky.

Nástřiky plynné fáze mohou být prováděny pomocí statických

nebo dynamických head-space dávkovacích systémů.

Dynamické head-space dávkovací systémy pro adsorpci

a desorpci obsahují probublávací zařízení, pomocí kterého

jsou těkavé látky uvolňovány z roztoku a vyplavovány do

absorpční kolonky udržované na nízké teplotě. Zadržené

látky jsou pak desorbovány do mobilní fáze rychlým ohřátím

absorpční kolonky.

Statické head-space dávkovací systémy obsahují termostatovanou

komůrku, do které se vkládají uzavřené nádobky

obsahující pevné nebo kapalné vzorky na předem stanovenou

dobu, potřebnou k ustavení rovnováhy těkavých složek

vzorku mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází. Po

dosažení této rovnováhy je předem určené množství plynné

fáze z lahvičky dávkováno do plynového chromatografu.

STACIONÁRNÍ FÁZE

Stacionárními fázemi jsou naplněny kolony, které mohou

být:

– kapilární kolona, jejíž stacionární fází může být pevná

látka pokrývající vnitřní povrch kolony (např. makrogol

20 000), nebo kapalná látka chemicky vázaná na

vnitřní povrch kolony (např. dimethylpolysiloxan);

– kolona naplněná stacionární fází, kterou může být pevná

látka (např. oxid hlinitý, oxid křemičitý) nebo inertní

pevný nosič (obvykle porézní polymer) impregnovaný

nebo pokrytý kapalinou.

Kapilární kolony, vyrobené z taveného křemene, mají

vnitřní průměr 0,1 mm až 0,53 mm a délku nejméně 5 m.

Stacionární fázi tvoří film o tloušťce 0,1 µm až 5,0 µm.

Náplňové kolony, vyrobené ze skla nebo z kovu, jsou obvykle

1 m až 3 m dlouhé s vnitřním průměrem 2 mm až 4 mm.

MOBILNÍ FÁZE

Retenční čas dané složky a účinnost kolony závisí na průtokové

rychlosti nosného plynu; retenční čas je přímo úměrný

délce kolony a rozlišení je úměrné druhé odmocnině délky

kolony.

Průtoková rychlost nosného plynu se obvykle vyjadřuje

v mililitrech za minutu při atmosférickém tlaku a stanovené

teplotě. Měří se na výstupu z detektoru buď kalibrovaným

mechanickým zařízením, nebo bublinkovým průtokoměrem,

zatímco kolona je termostatem udržována na pracovní

teplotě.

Lineární průtoková rychlost nosného plynu kolonou je nepřímo

úměrná druhé mocnině vnitřního průměru kolony pro

daný průtokový objem.

Nejčastěji používanými nosnými plyny jsou helium, dusík

a vodík.

DETEKTORY

Obvykle se používají plamenoionizační detektory, ale podle

účelu analýzy mohou být použity i další detektory: elektronového

záchytu, dusíko-fosforový, hmotnostní spektrometr,

tepelně vodivostní nebo spektrofotometr v infračervené oblasti.

PRACOVNÍ POSTUP

Kolona, dávkovací zařízení a detektor se stabilizují při teplotách

a průtokových rychlostech/tlacích plynů předepsaných

v lékopisných článcích, pokud není dosaženo stabilní

základní linie. Připraví se zkoušený roztok (zkoušené roztoky)

a porovnávací roztok (roztoky), jak je předepsáno.

Nastřikované roztoky musí být prosty pevných částic.

Kritéria pro posouzení vhodnosti systému jsou popsána ve

stati 2.2.46 Chromatografické separační metody. V této stati

je rovněž uveden rozsah, v jakém mohou být nastaveny

parametry chromatografického systému, aby byly splněny

požadavky testu způsobilosti.

Statická head-space plynová chromatografie

Statická head-space plynová chromatografie je metoda

zvláště vhodná pro dělení a stanovení těkavých látek přítomných

v pevných nebo kapalných vzorcích. Tato metoda

je založena na analýze plynné fáze, která je v rovnováze

s pevnou nebo kapalnou fází.

PŘÍSTROJ

Přístroj se skládá z plynového chromatografu opatřeného

zařízením pro zavádění zkoušeného vzorku, které může být

připojeno k modulu, jenž automaticky ovládá tlak a teplotu.

Je-li to nutné, může být připojeno zařízení pro eliminaci

rozpouštědel.

Analyzovaný vzorek se vpraví do lahvičky opatřené vhodným

uzávěrem a systémem ventilů umožňujícím průchod

nosného plynu. Lahvička se umístí do nádobky vyhřívané

termostatem na vhodnou teplotu podle povahy zkoušeného

vzorku.

Vzorek se zahřívá na tuto teplotu dostatečně dlouho, aby se

ustavila rovnováha mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou

fází.

Nosný plyn se zavádí do nádobky a po předepsaném čase

se otevře vhodný ventil, takže plyn expanduje a unáší odpařené

látky do chromatografické kolony.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 131

2.2.29 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

Místo chromatografu speciálně vybaveného pro zavádění

vzorků je také možné použít plynotěsnou stříkačku a běžný

chromatograf. Ustavení rovnováhy pak probíhá v oddělené

komůrce a plynná fáze se dávkuje do kolony při zajištění

podmínek zaručujících, že nedojde k porušení rovnováhy.

PRACOVNÍ POSTUP

Použitím porovnávacích vzorků se určí vhodné instrumentální

podmínky k dosažení vhodné odezvy.

PŘÍMÁ KALIBRACE

Do stejných lahviček se umístí odděleně zkoušený vzorek

a všechny porovnávací vzorky, jak je předepsáno v lékopisném

článku, přičemž se zabrání kontaktu mezi dávkovacím

zařízením a vzorky.

Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží do prostoru udržovaného

termostatem na teplotě a tlaku předepsaných v článku;

po ustavení rovnováhy se provede chromatografická

analýza za předepsaných podmínek.

STANDARDNÍ PŘÍDAVEK

Do sady stejných vhodných lahviček se umístí stejné objemy

zkoušeného vzorku. Do všech lahviček, kromě jedné, se

přidají vhodná množství porovnávacích vzorků, které obsahují

známé koncentrace stanovované látky, takže vznikne

řada vzorků obsahujících postupně vzrůstající koncentrace

stanovované látky.

Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží se do prostoru udržovaného

termostatem na teplotě a tlaku předepsaných

v lékopisném článku. Po ustavení rovnováhy se provede

chromatografická analýza za předepsaných podmínek.

Metodou nejmenších čtverců se vypočítá lineární rovnice

přímky a z ní se určí koncentrace stanovované látky ve

zkoušeném vzorku.

Alternativně se vynesou do grafu střední hodnoty naměřených

dat proti přidaným množstvím stanovované látky. Extrapoluje

se přímka spojující body na grafu, až protne osu koncentrací.

Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os představuje

koncentraci stanovované látky ve zkoušeném vzorku.


10.0:20229

PRINCIP

Kapalinová chromatografie (LC) je separační metoda založená

na rozdílu v distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze,

z nichž mobilní fází je kapalina, která prostupuje stacionární

fází naplněnou do kolony.

Kapalinová chromatografie je založena zejména na mechanismu

adsorpce, distribuci hmotností, výměny iontů,

vylučování podle velikosti nebo na stereochemických

interakcích.

Pokud není specifikováno jiným způsobem, všechny informace

dále uvedené jsou platné jak pro standardní kapalinovou

chromatografii, tak pro kapalinovou chromatografii

používající kolony se zmenšenou velikostí částic (např. pod

2 μm). Ty vyžadují instrumentaci, která se vyznačuje možností

používat vyšší tlaky (typicky nad 100 MPa, tzn. asi

15 000 psi), nižším rozšiřování pásů po výstupu z kolony,

zlepšením gradientového mísení a vyšší vzorkovací rychlostí

v detekčním systému.

PŘÍSTROJ


– čerpacího systému;

– dávkovacího zařízení;

– chromatografické kolony (může se použít i regulátor teploty

kolony);

– jednoho nebo několika detektorů;

– zařízení na zpracování dat.

Mobilní fáze je do systému přiváděna z jednoho nebo více

zásobníků a je čerpána do dávkovacího zařízení, pak protéká

kolonou, obvykle konstantní rychlostí, a potom detektorem/detektory.

ČERPACÍ SYSTÉMY

Čerpací systémy pro kapalinovou chromatografii musí zajistit

přivádění mobilní fáze regulovanou průtokovou rychlostí.

Kolísání tlaku má být co nejmenší, čehož se dosahuje

např. průchodem tlakovaného rozpouštědla zařízením

na tlumení pulzů. Hadičky a všechny spoje musí být schopny

odolat tlaku vyvinutému čerpacím systémem. Čerpací

systémy mohou být vybaveny zařízením pro odstranění zachycených

vzduchových bublin.

Čerpací systémy ovládané mikroprocesory jsou schopny

přesně přivádět mobilní fázi buď s konstantním složením

(izokratická eluce), nebo se složením, které se mění podle

předem daného programu (gradientová eluce). V případě

gradientové eluce se používají čerpací systémy, které dodávají

rozpouštědlo (rozpouštědla) z více zásobníků a mísení

rozpouštědel se dosahuje buď v části čerpadla s nízkým tlakem

(před natlakováním), nebo v tlakované části čerpadla

(čerpadel).

DÁVKOVACÍ ZAŘÍZENÍ

Roztok vzorku se dávkuje do protékající mobilní fáze na

čelo kolony nebo do jeho blízkosti pomocí dávkovacího

zařízení, které je schopno pracovat při vysokém tlaku. Používají

se zařízení s dávkovací smyčkou o konstantním

nebo proměnném objemu pro ruční nebo automatické

dávkovače. Částečné plnění smyčky při ručním dávkování

může nepříznivě ovlivnit preciznost nastřikovaného objemu.

STACIONÁRNÍ FÁZE

V kapalinové chromatografii se používá mnoho typů stacionárních

fází, jako jsou:

– oxid křemičitý nebo oxid hlinitý, běžně používané

v chromatografii s normálními fázemi (polární stacionární

fáze a nepolární mobilní fáze), kde je separace založena

na rozdílech v adsorpci na stacionární fázi a/nebo

hmotnostní distribuci mezi mobilní a stacionární fází

(rozdělovací chromatografie);

– různé druhy chemicky modifikovaných nosičů připravených

z polymerů nebo oxidu křemičitého, nebo z porézního

grafitu, používané v chromatografii s normálními

fázemi a v chromatografii s obrácenými fázemi (nepolární

stacionární fáze a polární mobilní fáze), kde je separace

založena hlavně na rozdělování molekul;

– pryskyřice nebo polymery s kyselými nebo zásaditými

skupinami používané v iontoměničové chromatografii,

kde je separace založena na konkurenci iontů, které se

mají oddělit, a iontů, které jsou obsaženy v mobilní fázi;

132 ČL 2017 – Dopl. 2020


– porézní oxid křemičitý nebo polymery používané ve vylučovací

chromatografii (2.2.30), kde je separace založena

na rozdílech v objemech molekul, odpovídající

sterickému vylučování;

– speciálně upravené stacionární fáze, např. s deriváty celulosy

nebo amylosy, s bílkovinami nebo peptidy, cyklodextriny

atd., používané pro separaci enantiomerů

(chirální chromatografie).

Většina separací je založena na kapalinové chromatografii

s obrácenými fázemi využívající chemicky upravený oxid

křemičitý jako stacionární fáze. Povrch nosiče, tj. silanolové

skupiny oxidu křemičitého, se upravuje reakcí s různými

silanovými činidly za vzniku kovalentně vázaných silylových

derivátů, které pokrývají proměnlivé množství aktivních

míst na povrchu nosiče. Povaha vázané fáze je důležitým

parametrem pro stanovení separačních vlastností

chromatografického systému.

Pokud není výrobcem uvedeno jinak, předpokládá se, že

kolony pro chromatografii s obrácenými fázemi s náplní

na bázi silikagelu jsou stabilní v mobilních fázích o zdánlivém

pH v rozmezí 2,0 až 8,0. Kolony plněné porézním

grafitem nebo částicemi polymerních materiálů, jako je styren-divinylbenzen

kopolymer, jsou stabilní v širším rozsahu

pH.

V některých případech je vhodná chromatografie s normálními

fázemi, která využívá jako stacionární fázi neupravený

oxid křemičitý nebo polárními skupinami chemicky upravený

oxid křemičitý (např. se skupinami kyanpropylovými

nebo diolovými) v kombinaci s nepolární mobilní fází.

Pro analytické separace se nejběžněji používají stacionární

fáze, které mají velikost částic 2 µm až 10 µm. Částice mohou

mít kulovitý nebo nepravidelný tvar, různou porozitu

a specifickou plochu povrchu. Tyto vlastnosti přispívají

k chromatografickému chování jednotlivých stacionárních

fází. V případě obrácených fází jsou doplňujícími určujícími

faktory druh stacionární fáze, míra vazeb vyjádřená

např. jako obsah vázaného uhlíku a zda má stacionární

fáze stíněné silanolové skupiny (tj. část zbytkových

silanolových skupin je silylována). Jestliže stacionární fáze

obsahuje zbytkové silanolové skupiny, mohou analyzované

látky, zejména bazické, vykazovat chvostování píků.

Vedle porézních částic se mohou použít materiály s porézním

povrchem nebo monolitické materiály.

Pokud není v článku uvedeno jinak, používají se v analytické

chromatografii kolony vyrobené z nerezové oceli, které

mají různé délky a vnitřní průměry. Kolony s vnitřním

průměrem menším než 2 mm jsou často označovány jako

mikrokolony.

Během analýzy se musí udržovat konstantní teplota mobilní

fáze a kolony. Většina separací se provádí při teplotě místnosti,

ale některé vyžadují pro optimální výkon jinou teplotu.

MOBILNÍ FÁZE

V kapalinové chromatografii s normálními fázemi se obecně

používají organická rozpouštědla s nízkou polaritou.

Aby se dosáhlo reprodukovatelných výsledků, je nutné

přísně řídit obsah zbytkové vody v rozpouštědlech použitých

v mobilní fázi.

V kapalinové chromatografii s obrácenými fázemi se používají

vodné mobilní fáze, obvykle s organickými rozpouštědly

a/nebo modifikátory.

Složky mobilní fáze se obvykle filtrují, aby z nich byly odstraněny

částice větší než 0,45 µm (nebo větší než 0,2 µm,

pokud je stacionární fáze tvořena částicemi o velikosti pod

2 µm a pokud se použijí zvláštní detektory, např. detektory

s rozptýleným světlem). Vícesložkové mobilní fáze se připravují

odměřením požadovaných objemů (pokud nejsou

předepsány hmotnosti) jednotlivých složek a jejich následným

smícháním. Jinou možností je přivádět rozpouštědla

pomocí jednotlivých čerpadel ovládaných ventily, které

umožňují míchání složek v požadovaném poměru. Rozpouštědla

jsou před čerpáním do systému obvykle odplyněna

probubláváním heliem, v ultrazvukové lázni a/nebo se

používají membránová či vakuová zařízení zařazená přímo

do systému, která zabraňují tvorbě vzduchových bublin

v cele detektoru.

Rozpouštědla pro přípravu mobilní fáze obvykle neobsahují

stabilizátory a, je-li použit detektor v ultrafialové oblasti

spektra, jsou propustná pro vlnovou délku používanou při

detekci. Používaná rozpouštědla a jiné složky mobilní fáze

mají mít vhodnou jakost. Zejména, je-li jednou ze složek

mobilní fáze voda nebo vodný roztok, použije se pro přípravu

voda pro chromatografii R. Úprava pH, je-li nutná, je

účinná pouze pro vodnou složku mobilní fáze, ne pro celou

směs. Aby se zabránilo krystalizaci solí při používání tlumivých

roztoků nebo roztoků solí, systém se po dokončení

analýzy patřičně promyje směsí vody a malého množství

organické části mobilní fáze [5 % (V/V)].

Mobilní fáze mohou obsahovat další složky, např. ionty

s opačným nábojem u chromatografie s iontovým párováním

nebo chirální selektor v případě chirální chromatografie

s nechirálními stacionárními fázemi.

DETEKTORY

Nejběžněji používanými detektory jsou spektrofotometry

pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/Vis)

(včetně detektorů s diodovým polem) (2.2.25). Mohou se

také použít fluorescenční spektrofotometry, diferenční refraktometry

(RI), elektrochemické detektory (ECD), detektory

na bázi rozptylu světla, aerosolové detektory nabitých

částic (CAD), hmotnostní spektrometry (MS) (2.2.43), detektory

pro měření radioaktivity (radiometrické detektory),

detektory na bázi víceúhlového rozptylu světla (MALS)

nebo jiné detektory.

POSTUP

Předepsanou mobilní fází s předepsanou průtokovou rychlostí

se při teplotě místnosti nebo teplotě specifikované

v lékopisném článku uvede kolona do rovnováhy, při níž je

dosaženo stability základní linie.

Připraví se roztok (roztoky) zkoušené látky a požadovaný

porovnávací roztok (roztoky). Roztoky nesmí obsahovat

pevné částice.



je také uveden rozsah, v němž se mohou nastavit parametry

chromatografického systému, aby byly splněny požadavky

testu způsobilosti.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 133

2.2.30 VYLUČOVACÍ CHROMATOGRAFIE

2.2.30 VYLUČOVACÍ CHROMATOGRAFIE

9.6:20230

PRINCIP

Vylučovací chromatografie je metoda kapalinové chromatografie

(2.2.29), která rozděluje molekuly v roztoku podle

jejich velikosti. Pokud se používá organická mobilní fáze,

je metoda známa jako gelová chromatografie, používá-li se

vodná mobilní fáze, nazývá se tato metoda gelová filtrace.

Vzorek se vnáší na kolonu, která je naplněna gelem nebo

náplní tvořenou porézními částicemi a je unášen mobilní

fází kolonou. K dělení podle velikosti molekul dochází

opakovanou výměnou molekul rozpuštěných látek mezi

rozpouštědlem v mobilní fázi a stejným rozpouštědlem

v nepohyblivé (stagnantní) kapalné fázi uvnitř pórů náplně

(stacionární fáze). Rozmezí velikostí pórů náplně určuje

rozmezí velikosti molekul, pro nějž lze dosáhnout separace.

Molekuly, které jsou tak malé, že mohou proniknout do všech

pórů, jsou eluovány celkovým objemem mobilní fáze Vt (také

znám jako celkový permeační objem). Naproti tomu molekuly

větší než největší póry náplně migrují kolonou pouze

v prostoru mezi částicemi náplně, aniž by byly jakkoliv zadržovány,

a jsou eluovány retenčním objemem nezadržované

složky V0 (také znám jako vylučovací objem nebo mrtvý objem).

K separaci podle velikosti molekul dochází mezi retenčním

objemem nezadržované složky a celkovým objemem mobilní

fáze, přičemž použitelného dělení se obvykle dosahuje

v prvních dvou třetinách tohoto rozmezí.

ZAŘÍZENÍ

Základem zařízení je chromatografická kolona různé délky

a vnitřního průměru, v případě potřeby udržovaná termostatem,

naplněná separačním materiálem schopným dělení

v příslušném rozsahu velikosti molekul. Náplní může být

měkký nosič (jako je nabobtnalý gel), nebo tuhý nosič (jako

je sklo, oxid křemičitý nebo sesíťovaný organický polymer

kompatibilní s rozpouštědlem). Tuhé nosiče obvykle umožňují

rychlejší tlakové separace.

Jeden konec kolony je obvykle připojen ke vhodnému zařízení

pro nástřik vzorku, jako je průtokový adaptér, dávkovač

se septem nebo nastřikovací ventil, a může se také připojit

ke vhodnému čerpadlu pro regulaci průtoku eluentu.

Mobilní fáze se zvolí podle typu vzorku, separačního média

a metody detekce. Eluent obvykle protéká kolonou konstantní

rychlostí. Alternativně se může vzorek nastřikovat

přímo na povrch náplně kolony zbavený kapaliny, nebo je-

-li vzorek hustší než eluent, může se navrstvit pod eluent.

Výstup z kolony je obvykle připojen k vhodnému detektoru

spojenému s automatickým zapisovačem, který umožňuje

záznam relativních koncentrací separovaných složek vzorku.

Jako detektory se mohou použít spektrofotometry pro

měření v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/Vis) (2.2.25),

diferenční refraktometry (RI), luminiscenční detektory, detektory

na bázi víceúhlového rozptylu světla (MALS) nebo

jiné detektory. V případě potřeby se může připojit automatický

sběrač frakcí.

POSTUP

Před provedením separace se náplň upraví a naplní do kolony

tak, jak je popsáno v článku nebo v návodu výrobce.



je uveden rozsah, v němž se parametry chromatografického

systému mohou nastavit, aby se splnily požadavky

testu způsobilosti.

STANOVENÍ RELATIVNÍHO ZASTOUPENÍ SLOŽEK

VE SMĚSÍCH

Provede se separace podle lékopisného článku. Pokud je to

možné, zaznamenává se plynule eluce složek a měří se odpovídající

plochy píků. Jestliže se separace složek vzorku

zaznamenává prostřednictvím fyzikálně-chemické vlastnosti,

k níž všechny sledované složky přispívají ekvivalentními

odezvami (např. všechny složky mají stejnou specifickou

absorbanci), vypočítá se relativní množství každé složky

tak, že se plocha píku dané složky dělí součtem ploch

píků všech sledovaných složek. Jestliže se tyto odezvy

u jednotlivých složek liší, vypočítá se obsah za pomoci kalibračních

křivek získaných s kalibračními standardy, které

jsou předepsány v lékopisném článku.

STANOVENÍ MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ

Vylučovací chromatografie se může použít pro stanovení

molekulových hmotností porovnáním s vhodnými kalibračními

standardy, které jsou předepsány v lékopisném článku.

Retenční objemy kalibračních standardů se vynášejí

v závislosti na logaritmu molekulových hmotností těchto

standardů. Graf se obvykle blíží přímce v oblasti mezi vylučovacím

objemem a celkovým permeačním objemem pro

použité separační prostředí. Z kalibrační křivky se stanoví

molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka pro molekulové

hmotnosti platí pouze pro daný systém makromolekulární

látka – rozpouštědlo, který byl použit za předepsaných experimentálních

podmínek.

STANOVENÍ DISTRIBUCE VELIKOSTI MOLEKUL

POLYMERŮ

Vylučovací chromatografie se může použít pro stanovení

distribuce velikostí molekul polymerů. Porovnání vzorků je

však platné pouze v případě, že jsou výsledky získány za

stejných experimentálních podmínek. Porovnávací látky

použité pro kalibraci a metody stanovení distribuce velikosti

molekul jsou uvedeny v daném lékopisném článku.

2.2.31 ELEKTROFORÉZA

10.0:20231

♦1 OBECNÝ PRINCIP

Nabité částice rozpuštěné nebo dispergované v roztoku

elektrolytu migrují působením elektrického pole ve směru

elektrody opačné polarity. Při gelové elektroforéze je pohyb

částic zpomalován interakcemi s okolní gelovou matricí,

která působí jako molekulové síto. Protichůdné působení

elektrické síly a molekulového prosévání vede k různým

migračním rychlostem podle velikosti, tvaru a náboje částic.

Vzhledem k jejich odlišným fyzikálně-chemickým

vlastnostem migrují různé makromolekuly směsi během

elektroforézy různými rychlostmi, a tak se rozdělují do jednotlivých

frakcí. Elektroforetické separace se mohou provádět

v systémech bez podpůrných fází (např. separace ve

1

––––––––––––––––––––––––––––––

1

Tato stať byla harmonizována, viz stať 5.8 Harmonizace lékopisu.

134 ČL 2017 – Dopl. 2020


volném roztoku při kapilární elektroforéze) a ve stabilizujících

médiích, jako jsou tenkovrstvé desky, filmy nebo

gely.

2 VOLNÁ ELEKTROFORÉZA NEBOLI

ELEKTROFORÉZA S POHYBLIVÝM ROZHRANÍM

Tato metoda se používá hlavně ke stanovení elektroforetické

pohyblivosti, přičemž experimentální charakteristiky

jsou přímo měřitelné a reprodukovatelné. Využívá se hlavně

pro látky s vysokými relativními molekulovými hmotnostmi

a s nízkými difuzními koeficienty. Poloha rozhraní

se na počátku stanoví fyzikálními metodami, jako je refraktometrie

nebo konduktometrie. Po aplikaci elektrického

pole se po přesně změřeném čase pozorují nová rozhraní

a jejich vzájemná poloha. Je nutno volit takové pracovní

podmínky, aby bylo možné určit tolik rozhraní, kolik je

složek.

3 ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA V NOSIČI

Pro tuto metodu postačuje pouze malé množství vzorku.

Povaha nosiče, jako je papír, agarový gel, acetát celulosy,

škrob, agarosa, methakrylamid, směsný gel, zavádí řadu

dalších faktorů ovlivňujících elektroforetickou pohyblivost:

a) následkem porozity nosiče je naměřená migrační

vzdálenost menší než skutečná migrační dráha;

b) některé nosiče nejsou elektroneutrální a mohou někdy

vyvolat významný elektroendoosmotický tok;

c) jakékoliv zahřívání v důsledku Jouleova efektu může

způsobit odpařování kapaliny z nosiče, což v důsledku

kapilarity způsobí pohyb roztoku od krajů do středu;

iontová síla má z tohoto důvodu tendenci postupně

vzrůstat.

Rychlost migrace potom závisí na čtyřech hlavních faktorech,

zejména na pohyblivosti nabité částice, elektroendoosmotickém

toku, toku způsobenému odpařováním a intenzitě

elektrického pole. Proto je nezbytné pracovat za

zcela přesně definovaných experimentálních podmínek a

používat, kdekoliv je to možné, referenční látky.

Zařízení pro elektroforézu se skládá ze:

– zdroje stejnosměrného elektrického proudu, jehož napětí

se může regulovat a především stabilizovat;

– elektroforetické komory, obvykle pravoúhlé, vyrobené ze

skla nebo pevného plastu se dvěma oddělenými prostory,

anodickým a katodickým, obsahujícími roztok elektrolytu;

v každém prostoru je ponořena elektroda, např. platinová

nebo grafitová; elektrody jsou propojeny vhodně

izolovanými vodiči se zdrojem stejnosměrného proudu,

jehož kladný pól se připojí k anodě a záporný pól ke katodě;

hladina kapaliny v obou prostorech se udržuje na

stejné úrovni, aby se předešlo toku způsobenému sifonovým

efektem.

Elektroforetická komora je uzavřena vzduchotěsným víkem,

které udržuje během operace vlhkostí nasycenou

atmosféru a snižuje odpařování rozpouštědla. Z bezpečnostních

důvodů se používá zařízení k přerušení elektrického

proudu při sejmutí víka. Překročí-li elektrický

výkon 10 W, doporučuje se chlazení nosiče;

– zařízení na upevnění nosiče:

proužková elektroforéza – proužek nosiče, předem navlhčený

používaným roztokem elektrolytu a ponořený na

obou koncích do elektrodových prostorů je vhodně napnutý

a upevněný k podložce nosiče, aby se zabránilo difuzi

elektrolytu; podložkou může být vodorovný rámeček, podstavec

ve tvaru obráceného V nebo deska s vyčnívajícími

hroty umístěnými ve vhodných vzdálenostech;

gelová elektroforéza – zařízení se skládá ze skleněné desky

(např. mikroskopické sklíčko), na jejíž celou plochu je

nanesena pevně přilnavá vrstva gelu stejné tloušťky; elektrické

spojení mezi gelem a vodivým roztokem je zajištěno

různými způsoby podle druhu použitého zařízení; je

třeba učinit předběžné opatření, aby se zabránilo kondenzaci

vlhkosti nebo vysychání pevné vrstvy;

– měřicího nebo detekčního zařízení.

Postup. Roztok elektrolytu se nalije do elektrodových prostorů.

Nosič nasycený elektrolytem se umístí do komory

způsobem vhodným pro dané zařízení. Vyznačí se místo

startu a nanese se vzorek. Na předepsanou dobu se zapojí

elektrický proud. Po vypnutí zdroje se nosič vyjme z komory,

vysuší se a separované látky se vizualizují.

4 ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM

GELU V TRUBIČKÁCH

Při tomto typu elektroforézy je stacionární fází gel, který je

připraven ze směsi akrylamidu a N,N´-methylenbisakrylamidu.

Gely jsou připraveny do trubiček délky 7,5 cm

a vnitřního průměru 0,5 cm. Na každou trubičku se nanáší

jeden roztok.

Zařízení. Skládá se ze dvou nad sebou umístěných nádobek

na tlumivý roztok vyrobených z vhodného materiálu, jako

je poly(methyl)methakrylát. Každá nádobka je vybavena

platinovou elektrodou. Elektrody jsou připojeny ke zdroji

umožňujícímu práci buď při konstantním proudu, nebo při

konstantním napětí. Zařízení má na dně horní nádobky několik

držáků stejně vzdálených od elektrody.

Postup. Před polymerací gelu by se měly roztoky odplynit

a gely použít těsně po přípravě. Připraví se směs gelu podle

předpisu a nalije se do vhodných skleněných trubiček

s uzavřeným dnem do stejné výšky asi 1 cm od horního

okraje. Je nutné zajistit, aby v trubičce nezůstaly bublinky

vzduchu. Směs gelu se převrství vodou R, aby se zamezilo

přístupu vzduchu, a nechá se zpolymerovat. Tvorba gelu trvá

obvykle asi 30 min a je ukončena, když se objeví ostré

rozhraní mezi gelem a vrstvou vody. Vrstva vody se odstraní.

Dolní nádobka se naplní předepsaným tlumivým

roztokem a odejmou se uzávěry trubiček. Trubičky se

upevní do držáků v horní nádobce tak, aby dolní část trubiček

byla ponořena v tlumivém roztoku dolní nádobky. Trubičky

se opatrně naplní předepsaným tlumivým roztokem.

Připraví se zkoušený roztok a kontrolní roztok, oba obsahují

předepsané značkovací barvivo, zahustí se např. tím, že

se v nich rozpustí sacharosa R. Tyto roztoky se nanášejí na

povrch gelu jednotlivých trubiček, přičemž se pro každý

roztok použije jiná trubička. Do horní nádobky se nalije

stejný tlumivý roztok. Elektrody se připojí ke zdroji elektrické

energie a elekroforéza se nechá probíhat za předepsané

teploty a při předepsaném konstantním napětí nebo

předepsané intenzitě proudu. Zdroj energie se vypne

v okamžiku, kdy značkovací barvivo doputuje téměř

k dolní nádobce. Trubičky se ze zařízení okamžitě vyjmou

a gel se z nich uvolní. Předepsaným způsobem se určí poloha

jednotlivých zón v elektroforeogramu.♦

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 135


5 ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM

GELU S NATRIUM-DODECYL-SULFÁTEM

(SDS–PAGE)

5-1 SDS–PAGE – GELY O JEDNOTNÉ KONCENTRACI

Rozsah působnosti. Gelová elektroforéza v polyakrylamidu

se používá ke kvalitativní charakterizaci bílkovin v biologických

přípravcích, ke kontrole čistoty a ke kvantitativní

analýze.

Účel. Analytická gelová elektroforéza je vhodná metoda,

kterou se prokazuje totožnost a homogenita bílkovin ve

farmaceutických přípravcích. Tato metoda se rutinně používá

ke stanovení molekulových hmotností bílkovin a bílkovinných

podjednotek a ke stanovení složení podjednotek

purifikovaných bílkovin.

Náhradou za gely a zkoumadla popsané v tomto textu je

možno použít komerčně běžně dostupné gely a zkoumadla

za předpokladu, že poskytují odpovídající výsledky a že

vyhovují validačním požadavkům uvedeným v odstavci

Validace zkoušky.

5-1-1 Charakteristiky polyakrylamidových gelů

Síťovací vlastnosti polyakrylamidových gelů jsou založeny

na trojrozměrné síti vláken a pórů, kterou tvoří bifunkční

bisakrylamidové sesíťování polyakrylamidových řetězců.

Polymerace je obvykle katalyzovaná tvorbou volných radikálů

z peroxodisíranu diamonného a N,N,N',N'-tetramethylethylendiaminu

(TEMED).

Zvyšováním koncentrace akrylamidu v gelu se snižuje

účinná velikost jeho pórů. Účinná velikost pórů gelu je pracovně

definovaná jeho prosívacími vlastnostmi, tj. odporem,

který klade pohybu makromolekul. Jsou dány limity

koncentrací akrylamidu, které se mohou používat. Při vysokých

koncentracích akrylamidu se gel láme mnohem snáze

a je s ním obtížnější manipulace. Se snižující se velikostí

pórů gelu se snižuje i migrační rychlost průchodu bílkovin

gelem. Úpravou velikosti pórů gelu pomocí změny koncentrace

akrylamidu se může optimalizovat rozlišovací schopnost

metody pro daný bílkovinný produkt. Proto se daný

gel fyzikálně charakterizuje odpovídajícím složením akrylamidu

a bisakrylamidu.

Stav bílkoviny je vedle složení gelu důležitým faktorem

elektroforetické pohyblivosti. U bílkovin závisí elektroforetická

pohyblivost na hodnotě pK nabitých skupin a velikosti

molekuly. Je ovlivňována typem, koncentrací, teplotou

a hodnotou pH tlumivého roztoku, silou pole a vlastnostmi

materiálu nosiče.

5-1-2 Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

za denaturačních podmínek

Metoda uvedená jako příklad je omezena na analýzu monomerních

polypeptidů s hmotnostním rozmezím od 14 000

do 100 000 daltonů. Hmotnostní rozmezí je možné rozšířit

různými technikami (např. použitím gradientových gelů,

zvláštního tlumivého systému). Třeba tricin-SDS gely, které

používají tricin jako koncový iont v elektroforetickém

elektrodovém tlumivém roztoku (místo glycinu, jak je

popsáno zde v metodě) jsou schopné dělit velmi malé bílkoviny

a peptidy v rozmezí 10 000 do 15 000 daltonů.

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za denaturačních

podmínek s použitím glycin-SDS je nejrozšířenější způsob

elektroforézy ke stanovení farmaceutické jakosti bílkovinných

produktů a bude předmětem vzorové metody. Typická

analytická elektroforéza bílkovin se provádí v pozakrylamidových

gelech za podmínek zajišťujících rozštěpení

bílkovin na jejich jednotlivé polypeptidové podjednotky

a současně minimalizujících jejich shlukování. Nejčastěji se

používá silně aniontový detergent SDS v kombinaci se zahříváním,

při kterém se bílkoviny štěpí před jejich aplikací

na gel. Denaturované polypeptidy váží natrium-dodecyl-sulfát,

stávají se záporně nabitými a vykazují stálý poměr

náboj/hmotnost, bez ohledu na druh bílkoviny. Protože

množství navázaného natrium-dodecyl-sulfátu je téměř

vždy úměrné molekulové hmotnosti polypeptidu a je nezávislé

na jeho sekvenci, SDS polypeptidové komplexy migrují

polyakrylamidovým gelem s pohyblivostí závislou na

velikosti polypeptidu.

U všech výsledných detergent-polypeptidových komplexů se

předpokládá stejný funkční vztah mezi jejich elektroforetickou

pohyblivostí a molekulovou hmotností. SDS komplexy

migrují směrem k anodě předvídatelným způsobem, přičemž

nízkomolekulární komplexy se pohybují rychleji než vysokomolekulární.

Molekulová hmotnost bílkovin se tudíž může

určovat z jejich relativní pohyblivosti v kalibrované SDS-

-PAGE a intenzita určitého pruhu v poměru k jiným nežádoucím

pruhům v gelu může být měřítkem čistoty.

Modifikace polypeptidového skeletu, jako je N- nebo

O-glykosylace, může změnit zdánlivou molekulovou hmotnost

bílkoviny, protože natrium-dodecyl-sulfát se neváže na

sacharidovou složku způsobem podobným polypeptidu, tudíž

není udržován stálý poměr náboje ke hmotnosti. V závislosti

na stupni glykosylace a jiných posttranslačních

modifikacích nemusí být zdánlivá molekulová hmotnost

bílkovin skutečným odrazem hmotnosti polypeptidového

řetězce.

Redukční podmínky. Polypeptidové podjednotky a trojrozměrná

struktura jsou v bílkovinách často udržovány přítomností

disulfidických vazeb. Cílem SDS-PAGE analýzy

za redukčních podmínek je porušení této struktury redukcí

disulfidických vazeb. Úplná denaturace a štěpení bílkovin

působením 2-merkaptoethanolu (2-ME) nebo dithiothreitolu

(DTT) vede k rozvinutí skeletu polypeptidu a jeho následné

komplexaci s natrium-dodecyl-sulfátem. Za těchto

podmínek může být molekulová hmotnost polypeptidových

podjednotek přijatelně počítána lineární regresí (nebo přesněji,

nelineární regresí) z molekulových hmotností přítomných

vhodných standardů.

Neredukční podmínky. Pro některé analýzy není úplné

štěpení bílkovin na peptidové podjednotky žádoucí. Nepůsobí-li

se redukčními činidly, jako je 2-ME nebo DTT,

zůstávají disulfidické kovalentní vazby neporušeny a je

zachována konformace oligomeru bílkoviny. Oligomerní

komplexy natrium-dodecyl-sulfát-bílkovina se pohybují

pomaleji než podjednotky natrium-dodecyl-sulfát-polypeptid.

Kromě toho nemohou být neredukované bílkoviny

kompletně nasyceny natrium-dodecyl-sulfátem, a tudíž nemohou

vázat detergent v konstantním hmotnostním poměru.

Kromě toho, omezují disulfidické vazby uvnitř řetězce

prostorový tvar molekul obvykle takovým způsobem, aby

se redukoval Stokesův poloměr molekuly, proto se redukuje

i zdánlivá molekulová hmotnost Mr. Tím je stanovení

136 ČL 2017 – Dopl. 2020


Tab. 2.2.31-1 Příprava separačního gelu

Složky roztoku

6% akrylamid

Objemy složek (ml) na objem gelové formy

5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml

voda R 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5

roztok akrylamidu (1) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0

Tris 1,5 mol/l (pH 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

100 g/l SDS (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

100 g/l APS (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED (5) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04

8% akrylamid

voda R 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2


Tris 1,5 mol/l (pH 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

100 g/l SDS (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

100 g/l APS (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED (5) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03

10% akrylamid

voda R 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8


Tris 1,5 mol/l (pH 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

100 g/l SDS (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

100 g/l APS (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

12% akrylamid

voda R 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5


Tris 1,5 mol/l (pH 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

100 g/l SDS (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

100 g/l APS (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

14% akrylamid

voda R 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8


Tris 1,5 mol/l (pH 8,8) (2) 1,2 2,5 3,6 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

100 g/l SDS (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

100 g/l APS (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

15% akrylamid

voda R 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5


Tris 1,5 mol/l (pH 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

100 g/l SDS (3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

100 g/l APS (4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

(1)

Roztok akrylamidu: akrylamid-bisakrylamid (29 : 1) 30% RS

(2)

Tris 1,5 mol/l (pH 8,8): tlumivý roztok trometamolový o pH 8,8 (1,5 mol/l) R

(3)

100 g/l SDS: roztok natrium-dodecyl-sulfátu R (100 g/l)

(4)

100 g/l APS: roztok peroxodisíranu diamonného R (100 g/l). Peroxodisíran diamonný poskytuje volné radikály, které řídí polymeraci

akrylamidu a bisakrylamidu. Roztoky peroxodisíranu diamonného se rozkládají rychle, proto se připravují denně čerstvé.

(5)

TEMED: tetramethylethylendiamin R

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 137


molekulové hmotnosti těchto molekul pomocí SDS-PAGE

analýzy méně přesné než analýzy plně denaturovaných polypeptidů,

a je proto nezbytné, aby jak standardy, tak neznámé

bílkoviny byly pro platná srovnání v podobné konfiguraci.

5-1-3 Charakteristiky diskontinuálního tlumivého

systému gelové elektroforézy

Nejoblíbenější elektroforetická metoda k charakterizaci

komplexních směsí bílkovin používá diskontinuální tlumivý

systém zahrnující dva navazující gely: rozlišovací neboli

separační (dolní) gel a zaostřovací (horní) gel. Tyto dva gely

jsou zhotoveny s odlišnou porozitou a obsahují roztoky

o různém pH a iontové síle. Kromě toho se v gelu a v elektrodových

tlumivých roztocích používají ionty s různou pohyblivostí.

Diskontinuita tlumivých roztoků způsobuje koncentrování

velkých objemů vzorků v zaostřovacím gelu

a vede ke zlepšení rozlišení. Po zapnutí proudu se v zóně

vzorku vytvoří spád napětí, jehož působením bílkoviny putují

do zaostřovacího gelu. Glycinátové ionty z elektrodového

tlumivého roztoku následují bílkoviny do zaostřovacího

gelu. Rychle se vytvoří oblast pohybujícího se rozhraní

s vysoce pohyblivými chloridovými ionty v čele

a s relativně pomalými glycinátovými ionty vzadu. Lokalizovaný

vysokonapěťový gradient tvořící se mezi zónami

vedoucího a koncového iontu způsobuje, že SDS-bílkovinné

komplexy vytvářejí úzké zóny a migrují mezi zónami

chloridu a glycinátu. V širokých limitech, bez ohledu na

výšku zóny aplikovaného vzorku, se všechny SDS-bílkoviny

koncentrují do velmi úzké oblasti a vstupují do rozlišovacího

gelu jako tenká, dobře definovaná zóna o vysoké

hustotě bílkovin. Zaostřovací gel s velkými póry nezpomaluje

migraci většiny bílkovin a slouží hlavně jako antikonvekční

prostředí. Na rozhraní zaostřovacího a separačního

gelu jsou bílkoviny silně zpomaleny vlivem omezené velikosti

pórů separačního gelu a diskontinuality tlumivého

systému, která také přispívá k zaostření bílkovin.

V rozlišovacím gelu jsou bílkoviny dále zpomalovány vlivem

sesíťování matrice. Glycinové ionty předstihnou bílkoviny,

které se pak pohybují v oblasti stálého pH tvořeného

trometamolem a glycinem. Molekulární síťování způsobuje,

že se komplexy SDS-polypeptid oddělují na základě

svých molekulových hmotností.

5-1-4 Příprava vertikálních SDS polyakrylamidových

gelů s diskontinuálními tlumivými roztoky

Tato část popisuje přípravu gelů za použití přesné instrumentace.

Netýká se předlitých gelů. Pro předlité gely nebo

pro jiné komerčně dostupné vybavení se musí postupovat

podle pokynů výrobce.

Doporučuje se používat čisté roztoky komerčních zkoumadel.

Pokud to není možné, a pokud není čistota zkoumadla

dostatečná, je třeba provést předúpravu. Např. jakýkoliv

znečištěný roztok vyžadující filtraci musí být také deionizován

přes směsný iontoměnič (anex/katex), aby se odstranila

kyselina akrylová a další nabité degradační produkty.

Jsou-li respektovány předepsané podmínky uchovávání,

roztoky akrylamidu/bisakrylamidu a pevný peroxodisíran

jsou stabilní po dlouhou dobu.

Sestavení kazety pro odlévání gelu. Dvě skleněné desky

(např. o velikosti 10 cm ´ 8 cm), polytetrafluorethylenový

hřeben, dva vymezovače a silikonová kaučuková hadice

(např. o průměru 0,6 mm ´ 35 cm) se očistí slabým detergentem,

důkladně se opláchnou vodou a ethanolem bezvodým

a desky se nechají usušit při teplotě místnosti. Vymezovače

a hadice se namažou nesilikonovým tukem. Vymezovače

se umístí podél každé ze dvou krátkých stran

skleněné desky 2 mm od okrajů a 2 mm od dlouhé strany

odpovídající dolní části gelu. Hadice se začne pokládat na

skleněnou desku za použití jednoho vymezovače jako vodítka.

Hadice se pečlivě svine na dně vymezovače a pokládá

se podél dlouhé strany skleněné desky. Zatímco se přidržuje

jedním prstem podél dlouhé strany, hadice se opět

stočí a položí se ke druhé krátké straně skleněné desky za

použití druhého vymezovače jako vodítka. Druhá skleněná

deska se umístí přesně nad první a forma se přitlačí rukou.

Na každou ze dvou krátkých stran formy se umístí dvě

svorky, na delší stranu gelové formy se pečlivě umístí čtyři

svorky a tak se vytvoří dno gelové formy. Ověří se, že hadice

prochází kolem okraje skleněných desek a nebyla

vytlačena při umísťování svorek. Gelová forma je takto

připravena k nalití gelu.

Příprava gelu. V diskontinuálním tlumivém SDS polyakrylamidovém

gelu se doporučuje nejprve nalít separační

gel, nechat jej zpolymerovat a potom nalít zaostřovací gel,

neboť oba gely se liší ve složení akrylamid/bisakrylamidu,

tlumivém roztoku a hodnotě pH.

Příprava separačního (rozlišovacího) gelu. V kuželové

baňce se připraví vhodný objem roztoku obsahujícího požadovanou

koncentraci akrylamidu pro separační gel za použití

hodnot daných v tabulce 2.2.31-1. Složky se smíchají

v předepsaném pořadí. Pokud je třeba, roztok se před přidáním

roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu

(TEMED) zfiltruje, je-li to nutné za použití

vakua, přes acetát-celulosovou membránu o velikosti pórů

0,45 µm. Roztok se udržuje pod vakuem za kroužení filtrační

jednotkou, dokud se v roztoku již netvoří bublinky.

Přidá se vhodné množství roztoku peroxodisíranu diamonného

a tetramethylethylendiaminu podle tabulky 2.2.31-1,

krouživým pohybem se promíchá a ihned se nalije do mezery

mezi dvěma skleněnými deskami formy. Nechá se dostatečný

prostor pro zaostřovací gel (délka zubů hřebenu

plus 1 cm navíc). Za použití zúžené skleněné pipety se roztok

opatrně převrství isobutylalkoholem nasyceným vodou.

Gel se nechá ve vertikální poloze při teplotě místnosti zpolymerovat.

Příprava zaostřovacího gelu. Po úplné polymeraci (asi

30 min) se odlije isobutylalkohol a horní část gelu se několikrát

opláchne vodou, aby se odstranil zbytek isobutylalkoholu

a nezpolymerizovaný akrylamid. Z horní části gelu se

odsaje co možná nejvíce kapaliny a poté se okrajem papírového

ubrousku odstraní zbývající voda.

V kuželové baňce se připraví vhodný objem roztoku obsahujícího

požadovanou koncentraci akrylamidu za použití

hodnot daných v tabulce 2.2.31-2. Složky se smíchají v předepsaném

pořadí. Pokud je třeba, roztok se před přidáním

roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu

zfiltruje, je-li to nutné za použití vakua, přes acetát-celulosovou

membránu (velikost pórů 0,45 µm). Roztok

se udržuje pod vakuem za kroužení filtrační jednotkou,

dokud se v roztoku již netvoří bublinky. Přidá se vhodné

138 ČL 2017 – Dopl. 2020


množství roztoku peroxodisíranu diamonného a tetramethylethylendiaminu

podle tabulky 2.2.31-2. Krouživým

pohybem se promíchá a ihned se nalije do mezery mezi

dvěma skleněnými deskami formy, přímo na povrch zpolymerovaného

rozlišovacího gelu. Do zaostřovacího gelu se

ihned vloží čistý polytetrafluorethylenový hřeben, přičemž

se dbá na to, aby pod hřebenem nezůstaly vzduchové bublinky.

Přidá se další roztok zaostřovacího gelu, aby se zcela

zaplnily prostory hřebenu. Gel se nechá ve vertikální poloze

při teplotě místnosti zpolymerovat.

Příprava vzorků. Pokud není v článku uvedeno jinak, postupuje

se následujícím způsobem:

Příprava vzorků (neredukční podmínky). Smíchají se stejné

objemové díly směsi obsahující vodu R se zkoušeným přípravkem

nebo referenčním přípravkem a SDS-PAGE koncentrovaného

tlumivého roztoku pro vzorek R.

Příprava vzorků (redukční podmínky). Smíchají se stejné

objemové díly směsi obsahující vodu R se zkoušeným přípravkem

nebo referenčním přípravkem a SDS-PAGE koncentrovaného

tlumivého roztoku pro vzorek pro redukční

podmínky R, který obsahuje 2-ME (nebo DTT) jako redukční

činidlo.

Koncentrace popsaná v článku se může měnit v závislosti

na bílkovině a metodě barvení.

Úprava vzorku: 5 min se nechá ve vroucí vodní lázni nebo

zahřívacím bloku nastaveném na 100 °C, pak se ochladí.

Teplota a čas se, vzhledem k možnému štěpení bílkovin

během zahřívání, mohou v článku změnit.

Umístění gelu do elektroforetického zařízení a elektroforetická

separace. Po úplné polymeraci gelu (asi 30 min)

se opatrně odstraní polytetrafluorethylenový hřeben. Jamky

se ihned vypláchnou vodou nebo SDS-PAGE elektrodovým

tlumivým roztokem R, aby se odstranil nezpolymerovaný

akrylamid. Je-li to nutné, napřímí se zuby zaostřovacího gelu

pomocí tupé hypodermické jehly připevněné k injekční

stříkačce. Na krátké straně se odstraní svorky, opatrně se

vytáhnou hadice a svorky se opět nasadí. Na druhé krátké

straně se postupuje podobně. Hadice se odstraní i z dolní

části gelu. Kazeta s gelem se umístí do elektroforetického

zařízení. Horní i dolní nádobka se naplní elektroforetickými

tlumivými roztoky. Všechny bubliny, které se zachytily na

dně gelu mezi skleněnými deskami, se odstraní, nejlépe zahnutou

hypodermickou jehlou připevněnou k injekční stříkačce.

Nikdy se neprovádí pre-elektroforéza, tj. připojení

napětí před aplikací vzorku, protože tím dochází k porušení

diskontinuity tlumivých systémů.

Před aplikací vzorku se každá jamka pečlivě opláchne SDS-

-PAGE elektrodovým tlumivým roztokem R. Zkoušený

a kontrolní roztok se připraví v doporučeném vzorkovém

tlumivém roztoku a upraví se, jak je specifikováno

v příslušném článku. Do jamek zaostřovacího gelu se aplikuje

vhodný objem jednotlivých vzorků. Elektroforéza se

spustí podle podmínek doporučených výrobcem zařízení.

Výrobci SDS-PAGE zařízení mohou dodávat gely různých

rozměrů o různé tloušťce; a tím pro různou dobu, po kterou

elektroforéza probíhá, aplikovaný proud, respektive napětí,

se mohou pro zajištění optimálního dělení lišit. Ověří se, že

barevné čelo se pohybuje směrem k separačnímu gelu.

Přiblíží-li se barvivo ke dnu gelu, elektroforéza se zastaví.

Kazeta s gelem se vyjme ze zařízení a skleněné desky se

opatrně oddělí. Odstraní se vymezovače a zaostřovací gel

a ihned se pokračuje barvením.

5-2 SDS-PAGE - GELY S KONCENTRAČNÍM

GRADIENTEM

Gradientové gely (rozlišovací gely) se připravují s rostoucí

koncentrací akrylamidu od vrcholu ke dnu gelu. Příprava

gradientových gelů vyžaduje vybavení pro tvorbu gradientu.

Hotové gradientové gely jsou komerčně dostupné a používají

se v souladu se specificky doporučenými protokoly.

Gradientové gely nabízejí oproti gelům s fixní koncentrací

některé výhody. Některé bílkoviny, které migrují na gelech

s fixní koncentrací spolu, mohou být pomocí gradientových

gelů rozlišeny. Během elektroforézy bílkoviny migrují,

dokud velikost pórů nezastaví jejich další postup, efekt zaostření

vede k tvorbě ostřejších pásů. Jak je ukázáno v tabulce

2.2.31-3, gradientové gely také umožňují separaci bílkovin

o širším rozsahu molekulových hmotností než gel

s fixní koncentrací.

Níže uvedená tabulka udává navržené složení lineárního

gradientu, vztahuje rozsah koncentrací akrylamidu k rozsahu

odpovídající molekulové hmotnosti bílkovin. Je třeba

vzít v úvahu, že pro specifické použití mohou být připraveny

i jiné tvary gradientu (např. konkávní).

Zkušební

metody

2.2

Tab. 2.2.31-2 Příprava zaostřovacího gelu

Složky roztoku

Objemy složek (ml) na objem gelové formy

1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 10 ml

voda R 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8


Tris 1,0 mol/l (pH 6,8) (2) 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25

100 g/l SDS (3) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1

100 g/l APS (4) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1

TEMED (5) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01

(1)

Roztok akrylamidu: akrylamid/bisakrylamid (29 : 1) 30% RS

(2)

Tris 1,0 mol/l (pH 6,8): tlumivý roztok trometamolový o pH 6,8 (1 mol/l) R

(3)

100 g/l SDS: roztok natrium-dodecyl-sulfátu R (100 g/l)

(4)

100 g/l APS: roztok peroxodisíranu diamonného R (100 g/l). Peroxodisíran diamonný poskytuje volné radikály, které řídí polymeraci

akrylamidu a bisakrylamidu. Roztok peroxodisíranu diamonného se rozkládá rychle, proto se připravuje denně čerstvý.

(5)

TEMED: tetramethylethylendiamin R

ČL 2017 – Dopl. 2020 139


Tab. 2.2.31-3

Akrylamid

(%)

Rozsah bílkovin

(kDa)

5–15 20–250

5–20 10–200

10–20 10–150

8–20 8–150

Gradientové gely se také používají pro stanovení molekulové

hmotnosti a stanovení čistoty bílkovin.

5-3 DETEKCE BÍLKOVIN V GELECH

Coomassie barvení a barvení stříbrem jsou nejrozšířenějšími

metodami barvení bílkovin a jsou detailněji popsány dále.

Jsou dostupné i další komerční barvení, detekční metody

a komerční kity. Např. fluorescenční barvení umožňuje

zviditelnění pomocí fluorescence a často poskytne lineární

odezvu v širokém rozsahu koncentrací bílkoviny, často

o několik řádů vyšších v závislosti na bílkovině. Coomassie

barvení má úroveň detekce bílkovin asi 1 µg až 10 µg bílkoviny

na pás. Barvení stříbrem je nejcitlivější metodou

barvení bílkovin v gelech a může se detekovat pás obsahující

10 ng až 100 ng. Tyto hodnoty jsou považovány pro tyto

gely za dostatečně robustní. V literatuře lze občas nalézt

i vyšší citlivost o jeden nebo dva řády.

Odezva u Coomassie barvení má lineárnější průběh než

u barvení stříbrem; nicméně odezva a rozsah závisí na bílkovině

a době vyvíjení. Obě metody, Coomassie barvení

i barvení stříbrem, mohou být méně reprodukovatelné, pokud

je barvení zastaveno subjektivně, např. pokud se barvení

zdá být na pohled uspokojivé. Použití širokých dynamických

rozsahů porovnávacích bílkovin je velmi důležité,

neboť napomáhá při určení citlivosti a linearity experimentu.

Všechny kroky při barvení gelu se provádějí za použití

rukavic, při teplotě místnosti, jemným třepáním (např. na

orbitální třepačce) a za použití vhodné nádoby.

Coomassie barvení. Gel se ponoří do velkého přebytku

barvicího roztoku modři kyselé 83 RS a nechá se stát nejméně

1 h. Pak se barvicí roztok odstraní.

Gel se odbarví velkým přebytkem odbarvovacího roztoku

RS, který se několikrát vymění, až jsou obarvené pruhy

bílkovin jasně rozlišitelné na čistém pozadí. Čím důkladněji

je gel odbarven, tím menší množství bílkoviny se může detekovat.

Odbarvování se může urychlit přidáním několika

gramů anexu nebo malé houby do odbarvovacího roztoku

RS.

POZNÁMKA: Kyselé ethanolové roztoky, používané v tomto

procesu, nefixují úplně bílkoviny v gelu. To může vést ke

ztrátě některých nízkomolekulárních bílkovin během barvení

a odbarvování tenkých gelů. Trvalé fixace se dosáhne

tak, že se gel nechá stát ve směsi objemových dílů kyseliny

trichloroctové R, methanolu R a vody R (1 + 4 + 5) po dobu

1 h před ponořením do barvicího roztoku modři kyselé

RS.

Barvení stříbrem. Gel se ponoří do velkého přebytku fixačního

roztoku RS a nechá se stát po dobu 1 h. Fixační

roztok R se odstraní, přidá se čerstvý fixační roztok RS

a inkubuje se nejméně 1 h nebo, je-li to vhodné, přes noc.

Fixační roztok RS se odstraní a gel se promývá velkým

přebytkem vody R po dobu 1 h. Gel se poté nechá nasáknout

15 min v roztoku glutaraldehydu R 1% (V/V) a dvakrát

po dobu 15 min se promývá velkým přebytkem vody R,

pak se nechá 15 min nasáknout ve tmě čerstvým zkoumadlem

s dusičnanem stříbrným R. Nakonec se gel promývá

třikrát po dobu 5 min velkým přebytkem vody R a ponoří se

asi na 1 min do vyvíjecího roztoku RS, dokud nedojde

k uspokojivému obarvení. Vyvíjení se zastaví inkubací

v blokačním roztoku RS po dobu 15 min a gel se opláchne

vodou R.

5-4 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

Gely se fotografují nebo skenují ještě vlhké nebo po vhodném

postupu sušení. V současnosti je komerčně dostupný

software pro fotografování gelů a okamžitou analýzu vlhkých

gelů.

V závislosti na použité barvicí metodě se s gely zachází

poněkud odlišným způsobem. Při Coomassie barvení se po

odbarvovacích krocích ponechá gel stát v roztoku glycerolu

R (100 g/l) nejméně 2 h (je možná inkubace přes noc).

Pro barvení stříbrem se ke konečnému oplachování přidá

jeden krok, a to ponechání gelu 5 min v roztoku glycerolu

R (20 g/l).

Sušení obarvených SDS-PAGE gelů je jednou z metod

k získání trvalé dokumentace. Tato metoda často vede

k potrhání gelu během sušení mezi celulosovými filmy.

Dvě fólie porézního celulosového filmu se ponoří do vody

R a inkubují se 5 min až 10 min. Jedna z fólií se umístí

na sušicí rámeček. Gel se opatrně uchopí a položí se na celulosový

film. Odstraní se všechny zachycené vzduchové

bubliny a okolo okrajů gelu se nalije několik mililitrů vody

R. Druhá fólie se umístí na gel shora a opět se odstraní

zachycené vzduchové bubliny. Dokončí se sestavení sušicího

rámečku, který se umístí do sušárny nebo se ponechá

při teplotě místnosti, dokud se neusuší.

5-5 STANOVENÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI

Molekulové hmotnosti bílkovin se stanovují srovnáním jejich

pohyblivostí s pohyblivostí několika standardů bílkovin

o známých molekulových hmotnostech. Pro kalibraci

gelů jsou dostupné směsi předem obarvených a neobarvených

bílkovin s přesně známými molekulovými hmotnostmi

spojené pro homogenní barvení. Jsou dostupné v různých

rozmezích molekulových hmotností. Koncentrované

zásobní roztoky bílkovin o známé molekulové hmotnosti se

ředí vhodným vzorkovým tlumivým roztokem a aplikují se

na stejný gel jako zkoušený vzorek bílkoviny.

Okamžitě po ukončení elektromigrace se v gelu označí poloha

značkovacího barviva bromfenolové modři, aby byl

identifikován vedoucí okraj elektroforetického iontového čela.

To se může provést vystřižením zářezů na okrajích gelu

nebo vložením jehly s nasátým indickým inkoustem do gelu

na čelo barviva. Po barvení se měří migrační vzdálenost každého

bílkovinného pásu (standardů i neznámých bílkovin) od

počátku separačního gelu. Migrační vzdálenost každé bílkoviny

se dělí vzdáleností, kterou urazilo barvivo. Normalizované

migrační vzdálenosti se vztahují k relativním pohyblivostem

bílkovin (vztaženo k čelu barviva) nebo RF. Sestrojí

se křivka logaritmu relativních molekulových hmotností (Mr)

standardů bílkovin jako funkce hodnot RF. Neznámé moleku-

140 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.32 ZTRÁTA SUŠENÍM

lové hmotnosti se mohou určit lineární regresní analýzou

(nebo přesnější nelineární regresní analýzou) nebo interpolací

z křivek log Mr proti RF, pokud se hodnoty neznámých

vzorků nacházejí v přibližně lineární části grafu.

5-6 VALIDACE ZKOUŠKY

Zkoušku lze hodnotit, jestliže cílový rozsah rozlišení gelu

byl prokázán rozložením vhodných standardů molekulových

hmotností, např. podél 80 % délky gelu.

Separace získané pro příslušné pásy předpokládaných bílkovin

musí vykazovat lineární vztah mezi logaritmem molekulové

hmotnosti a RF. Pokud se zaznamená sigmoidní

křivka, pak se pro výpočet použijí pouze údaje z lineární

části křivky. Další validační požadavky se s ohledem na

zkoušený vzorek mohou specifikovat v příslušném článku.

Validovat se musí také citlivost. K ověření způsobilosti systému

se provede analýza referenční bílkoviny o koncentraci

odpovídající očekávanému limitu současně se zkoušeným

vzorkem.

5-7 KVANTIFIKACE NEČISTOT

SDS-PAGE se často používá jako limitní zkouška pro

nečistoty. Pokud jsou nečistoty kvantifikovány normalizací

k hlavnímu pásu za použití integračního denzitometru nebo

analýzou obrazu, odezvy musí být validovány na linearitu.

Je třeba poznamenat, že v závislosti na metodě detekce

a typu bílkoviny (popsané v části 5.3) se lineární rozsah

může měnit, ale lze jej během každé analýzy posoudit za

použití jednoho nebo více standardů pokrývajících příslušný

rozsah koncentrace bílkoviny.

Tam, kde je limit nečistot v článku specifikován, měl by se

ředěním zkoušeného roztoku připravit porovnávací roztok

odpovídající dané úrovni nečistot. Např. pokud je limit

5 %, připraví se porovnávací roztok ředěním zkoušeného

roztoku v poměru 1 : 20. Žádná nečistota (žádný pás jiný

než hlavní pás) na elektroforeogramu zkoušeného roztoku

nesmí být intenzivnější než hlavní pás porovnávacího

roztoku.

Za validovaných podmínek mohou být nečistoty kvantifikovány

normalizací k hlavnímu pásu za pomoci integrovaného

denzitometru nebo analýzou obrazu.

2.2.32 ZTRÁTA SUŠENÍM

9.8:20232

PRINCIP

Ztráta sušením je ztráta hmotnosti po vysušení za předepsaných

podmínek, počítaná v procentech.

Sušení do konstantní hmotnosti znamená, že výsledek dvou

po sobě jdoucích vážení se neliší o více než 0,5 mg, druhé

vážení se provádí po dalším sušení po dobu nejméně

30 min za podmínek předepsaných pro zkoušenou látku.

ZAŘÍZENÍ

Zařízení se obvykle skládá z:

– váženek vyrobených z inertního materiálu, které lze snadno

sušit do konstantní hmotnosti; jejich průměr je dostatečně

velký, aby vrstva zkoušené látky nepřevyšovala asi

5 mm;

– analytických vah umožňujících stanovit změnu hmotnosti

o 0,1 mg;

– v závislosti na postupu se použije: exsikátor, vakuová

komora, vakuová sušárna nebo běžná laboratorní sušárna;

v některých případech sušárna s nastavitelnou specifikovanou

teplotou ±2 °C; jsou vhodné vakuové sušárny, ve

kterých lze snížit tlak až na asi 2 kPa; kvalifikace sušáren

se provádí v souladu se zavedenými postupy řízení systému

jakosti, například za použití vhodného certifikovaného

referenčního materiálu (může se použít natrium-

-aminosalicylát dihydrát pro kvalifikaci přístroje CRL).

K sušení se mohou použít i jiná zařízení, jako mikrovlnné

trouby, halogenové lampy, infračervené lampy nebo smíšené

technologie pod podmínkou, že je prokázáno, že splňují

daný účel.

POSTUP

Doporučuje se provést zkoušku v prostředí, které minimálně

ovlivňuje měření vzorku (například vlhkost).

Zváží se prázdná váženka, která byla předem nejméně

30 min sušená za podmínek předepsaných pro zkoušenou

látku, pak se zváží váženka naplněná předepsaným množstvím

zkoušené látky. Suší se do konstantní hmotnosti nebo

se suší po předepsanou dobu. Pokud je předepsána určitá

teplota sušení a nikoliv rozmezí teplot, sušení se provede

při předepsané teplotě ±2 °C.

Použije se jeden z dále uvedených postupů, pokud není

v článku předepsán jiný způsob:

– „V exsikátoru“. Sušení se provádí nad asi 100 g molekulárního

síta R při atmosférickém tlaku a při teplotě místnosti.

– „Ve vakuu“. Sušení se provádí nad asi 100 g molekulárního

síta R při tlaku nepřevyšujícím 2,5 kPa, při teplotě

místnosti nebo při teplotě předepsané v článku.

– „V sušárně při specifikované teplotě“. Sušení se provádí

při atmosférickém tlaku v sušárně při teplotě předepsané

v článku.

Po sušení v sušárně se váženka se vzorkem nechá vychladit

na teplotu místnosti v exsikátoru a zváží se.

Hmotnost vzorku je rozdíl mezi hmotností naplněné váženky

a hmotností vysušené prázdné váženky.

Ztráta sušením je rozdíl v hmotnosti vzorku před a po sušení,

vyjádřeno v procentech.

2.2.33 NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÁ

REZONANČNÍ SPEKTROMETRIE

6.3:20233

ÚVOD

Nukleární magnetická rezonanční (NMR) spektrometrie je

analytická metoda vhodná zvláště pro vyhodnocování chemické

struktury organických molekul interpretací jejich

NMR spekter, která poskytují např. jádra 1 H nebo jádra X

typu 13 C, 19 F, 15 N, 31 P. Spektra se mohou využít pro kvalitativní

a kvantitativní účely.

Integrované intenzity NMR signálů jsou za vhodných experimentálních

podmínek přímo úměrné počtu jaderných

spinů skupiny v molekule zodpovědné za signál. Tyto integrály

se mohou použít pro kvantitativní analýzu.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 141

2.2.33 NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÁ REZONANČNÍ SPEKTROMETRIE

OBECNÉ PRINCIPY

Vložení souboru jader s momentem setrvačnosti a magnetickým

momentem do statického magnetického pole (B0)

způsobí, že se jádra uspořádají do různých, kvantově mechanicky

řízených orientací vzhledem k ose magnetického

pole. Tyto orientace se liší energií. Oscilující vysokofrekvenční

magnetické pole (B1) kolmé k B0 vyvolá přechody

mezi těmito orientacemi s absorpcí energie. Podle rezonanční

podmínky ω 0 = γB 0 (g = gyromagnetický poměr,

w0 = Larmorova frekvence) se může měnit buď magnetické

pole B0, nebo frekvence (w1) pole B1, aby se získalo spektrum

[metoda „continuous-wave“ (CW)]. V současnosti se

ozáření polem B1 dosahuje použitím radiofrekvenčního

(RF) pulzu [metoda s Fourierovou transformací (FT)]. Koherentní

záření emitované během návratu do původního

stavu se pozoruje ve formě klesající křivky nazvané zánik

(doznívání) volné indukce [free induction decay (FID)].

Následující Fourierovou transformací se získá spektrum ve

frekvenční oblasti, poskytující informace o struktuře molekuly.

Během akvizice FID signálu se může použít dodatečné

radiofrekvenční pole k potlačení skalárních interakcí

(zprostředkovaných chemickými vazbami) mezi jádry (tzv.

„dekapling“). Pro kvalitativní a kvantitativní účely se mohou

použít jedno- a vícedimenzionální techniky, vzorky

mohou být buď v kapalném, nebo pevném stavu.

Důležité strukturní informace se odvozují z následujících

spektroskopických parametrů:

Rezonanční frekvence

počet rezonančních signálů

(singlety, multiplety)

chemický posun δ

(parts per million, ppm)

intenzita rezonančních

signálů

multiplicita signálů

spin-spinová interakční

konstanta n J (Hz)

Druh pozorovaných jader

počet chemicky rozdílných

skupin jader

chemická povaha a okolí

pozorovaných strukturních

skupin

relativní počet rezonujících

jader v chemicky

rozdílných skupinách

počet jader, která jsou

skalárně vázány

k pozorovanému jádru

velikost štěpení signálů,

odpovídající geometrii, kde

je n-počet vazeb mezi

interagujícími jádry

Korelace různých spektrálních parametrů (např. chemický

posun a interakční konstanta nebo chemické posuny různých

jader uvnitř jednoho molekulárního systému) se mohou

provádět homo- a heteronukleárními dvou- a vícedimenzionálními

metodami. Informace o relaxačních časech

T1 a T2, nukleárních Overhauserových efektech (NOEs)

a o kinetice časově závislých procesů jsou dostupné

z vhodných experimentů.

PŘÍSTROJ

NMR spektrometr s vysokým rozlišením se skládá nejméně

z následujících částí:

– magnetu pro poskytování konstantního magnetického pole

B0;

– termostatované sondy, sloužící k umístění vzorku, k přivedení

radiofrekvenčního pulzu a k detekci záření emitovaného

vzorkem;

– elektronické konzole pro generování radiofrekvenčních

pulzů o vysokém výkonu a pro sběr a digitalizaci FID

signálu; tato jednotka také zajišťuje stabilitu elektroniky

přístroje;

– zařízení pro akvizici a zpracování dat (počítač);

a může také obsahovat:

– průtokovou kyvetu pro spojení kapalinové chromatografie

s NMR nebo pro průtokovou injekční analýzu;

– systém pro vytváření pulzních gradientů pole NMR.

Vysoké magnetické pole se generuje supravodivou cívkou

v Dewarově nádobě naplněné kapalným heliem. Sonda obvykle

obsahuje vzorek v kyvetě s vnějším průměrem 5 mm

nebo v průtokové kyvetě a je připojena k elektronice RF

kabely pro frekvenci lockovacího signálu a frekvence jader

1 H a X. Významná jsou přídavná zařízení pro ladění elektronických

obvodů („tuning“ a „matching“), často se používá

také řízení teploty vzorku termostatem.

Mělo by se prokázat, že NMR spektrometr pracuje správně.

K tomu jsou obvykle vhodné zkoušky měření šířky čáry

v poloviční výšce pro definované píky za definovaných

akvizičních podmínek, poměry signálu k šumu (S/N) pro

standardní vzorky, výkon pulzu (měřeno jako délka 90 o

pulzu) a reprodukovatelnost pulzu. Všichni výrobci přístrojů

vydávají specifikace a protokoly pro měření těchto

parametrů pro specifické kombinace přístroj/sonda; měla

by se prokázat shoda s těmito specifikacemi.

NMR S FOURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT–NMR)

Současné spektrometry běžně pracují na základě principu

Fourierovy transformace (FT): po excitaci vzorku radiofrekvenčním

pulzem vhodné frekvence (n), amplitudy (B1)

a času (tp) a po následujícím krátkém mrtvém čase (td) (aby

byla elektronika přístroje schopna přijmout signál) se zesílený

analogový FID signál vzorkuje během akvizičního času

(tac) a digitalizuje analogově digitálním převodníkem

(analogue-to-digital convertor, ADC), výsledky se uloží

do paměti spektrometru. Před digitalizací je výstup přijímače

zesílen, aby se maximalizovala citlivost bez saturace

analogově digitálního převodníku. V případě pozorování

jader X zahrnuje standardní experiment, je-li to nutné, širokopásmový

dekapling jader 1 H, tj. ozáření všech protonů

během experimentu. Pro zvýšení poměru signálu k šumu se

může větší počet FID signálů koherentně akumulovat a sečíst.

Fourierova transformace převede data v časové doméně

na spektrum ve frekvenční doméně.

PARAMETRY

Následující akviziční parametry ovlivňují výsledek FT-

-NMR experimentu a měly by se proto správně nastavit

a kontrolovat.

Délka pulzu (tp). Excitační pulz směřuje podél osy x v tzv.

rotující souřadné soustavě, jeho trvání (neboli „šířka“ tp)

určuje sklápěcí úhel (q) a tudíž intenzitu (I) rezonančního

signálu:

θ = γ¢×

B1 × τ P

M y = M 0 ×sin θ

(1)

(2)

142 ČL 2017 – Dopl. 2020


Pozorovaná magnetizace My je maximální při q = 90°. Doba

pulzu musí být krátká, aby všechny signály v dané spektrální

šířce (SW) byly excitovány. Magnetizace klesá v důsledku

relaxačních procesů.

Mrtvý čas (td). Mrtvý čas je doba mezi koncem pulzu a začátkem

akvizice, je nezbytný z technických důvodů a musí se

mu věnovat pozornost, protože může ovlivňovat intenzity signálu

a jeho fázi. Rychle klesající signály (vyvolávající vznik

širokých spektrálních linií) se redukují v intenzitě více než

pomalu klesající signály (vyvolávající úzké spektrální linie).

Akviziční čas (tac). Akviziční čas se vztahuje ke spektrální

šířce (tj. celé pozorované oblasti) a k počtu digitálních datových

bodů (DP) shromážděných během akvizice signálu.

DP

t ac

=

2SW

Maximální intenzity signálu a maximálního poměru signálu

k šumu se dosáhne, jestliže

t ac ≈ 1,2/(pn 1/2 ), kde n1/2 je plná šířka v poloviční výšce

(fwhh), ale měla by být nastavena větší než 5/(pn1/2), aby se

minimalizovala deformace signálu.

Opakovací čas (tr). Spin-mřížková relaxace (T1) určuje dobu

potřebnou k tomu, aby se spinový systém vrátil po pulzu do

rovnovážného stavu. Relaxace se může zkrátit za použití

speciálních činidel. Pro kvantitativní účely se musí opakovací

čas zvolit vhodně vzhledem ke spin-mřížkové relaxaci (T1)

a sklápěcímu úhlu (q), aby se zabránilo saturačním efektům.

Zesílení přijímače. Detekovaný analogový signál vzorku

je zesílen před digitalizací a uložením. Zesílení by mělo být

nastaveno automaticky nebo manuálně tak, aby signál nezahltil

analogově digitální převodník (což by způsobilo deformaci

signálu) a aby bylo možno generovaný nahodilý

šum v měřicí sondě digitalizovat (tj. šum je nenulový).

OPTIMALIZACE AKVIZIČNÍCH A PROCESNÍCH

PARAMETRŮ PRO KVANTITATIVNÍ ÚČELY

Kromě akvizičních parametrů je intenzita signálu ovlivněna

také několika procesními parametry. Po akumulaci dostatečného

počtu skenů je výsledný FID signál podroben Fourierově

transformaci. Pro spolehlivé kvantitativní účely se

musí optimalizovat následující parametry.

Digitální rozlišení. Digitální rozlišení je rozdíl frekvencí

mezi jednotlivými datovými body. Vyhodnocovaný signál

musí mít nejméně pět digitálních bodů v horní polovině

signálu, který se má integrovat. Pro zlepšení digitálního

rozlišení se mohou před transformací přidat dodatečné body

nulové intenzity na konec experimentálního FID signálu

(„doplnění nulami“).

Poměr signálu k šumu (S/N). Je to poměr mezi intenzitami

(jako výška píku) určitého signálu v NMR spektru

a nahodilými fluktuacemi v tomto signálu, které jsou obvykle

měřeny v oblasti spektra, která neobsahuje žádné signály

stanovované látky. Špatný poměr signálu k šumu omezuje

přesnost integrace píku a kvantitativní analýzy. Poměr

signálu k šumu rovný nebo větší než 150 : 1 umožňuje integraci

píku se směrodatnou odchylkou menší než 1 %.

Současné spektrometry mají softwarové algoritmy pro měření

poměru signálu k šumu vybraných píků. Může být obtížné

získat dostatečně vysoké hodnoty poměru signálu

(3)

k šumu při analýze zředěných roztoků a zejména při detekci

jiných jader než 1 H. Metody pro zvýšení poměru signálu

k šumu zahrnují:

– zvýšení počtu akumulovaných skenů (n), protože poměr

signálu k šumu stoupá s n ;

– použití exponenciálního násobení FID signálů před Fourierovou

transformací; exponenciální násobící faktor by

měl být řádově stejný jako šířka signálu v poloviční výšce

(fwhh);

– použití spektrometrů s vyšším magnetickým polem B0,

protože poměr signálu k šumu je úměrný B0 3/2 ;

– použití digitálního filtrování pro redukci šumu;

– použití sond, které mají vyšší citlivost – poměr objemu

vzorku a cívky, tzv. „filling factor“;

– použití kryosond, které redukují tepelný šum.

Integrační oblast. Intenzita NMR signálů se získá integrací

kvazianalogového signálu buď schodovitou závislostí,

nebo přesněji integrací separovaných linií a prezentací digitálních

dat. V kapalném stavu mají NMR signály tvar Lorentzových

křivek. Pokud není v článku specifikováno jinak,

nebo když dochází k překryvu signálů, musí se použít

stejný integrační rozsah, vyjádřený jako násobek šířky píku

v poloviční výšce (fwhh), pro sledovaný a referenční signál.

Dynamický rozsah. Dynamický rozsah analogově digitálního

převodníku (ADC) určuje minimální intenzitu čáry,

která se může pozorovat nebo kvantifikovat, když se integrují

dva signály se stejnou šířkou čáry ve spektru. 16bitový

analogově digitální převodník umožňuje identifikaci

signálu 0,003% intenzity vztažené k silnému signálu kompletně

vyplňujícímu dynamický rozsah analogově digitálního

převodníku.

NMR VZORKŮ V ROZTOKU

Většina NMR experimentů se provádí ve zředěných roztocích

(asi 1%) stanovované látky ve vhodném rozpouštědle,

které může být obohaceno vhodným standardem pro kalibraci

chemického posunu.

Rozpouštědla. Rozpouštědlo musí být schopné rozpustit

stanovovanou látku bez dalších interakcí, pokud není jiný

záměr. Pro minimalizaci silných signálů rozpouštědla se

musí použít plně deuterovaná rozpouštědla (deuteriumoxid

R, chloroform deuterovaný R, aceton deuterovaný R,

methanol deuterovaný R atd.). Atomy rozpouštědla dávají

signály, které se snadno identifikují jejich chemickým posunem

a mohou se použít pro kalibrování osy chemického

posunu (sekundární reference).

Referencování. Spektrální veličina nejvíce závislá na chemickém

okolí atomu v molekule je chemický posun, označovaný

d a vyjádřený v ppm (parts per million). Chemický

posun mezi rezonancí jádra X aktivního v NMR (dX,vzorek)

se měří v ppm jako rozdíl mezi rezonanční frekvencí tohoto

jádra (nX,vzorek) a rezonanční frekvencí vnitřního referenčního

standardu (nX,reference), obě hodnoty v hertzech, děleno

základní operační frekvencí spektrometru (nX,reference),

v megahertzech, při daném B0:

δ

X,vzorek

=

( ν - ν )

X,vzorek

ν

X,reference

X,reference

(4)

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 143


Podle dohody je standardem pro přesné referencování chemického

posunu rezonance 1 H tetramethylsilanu R (TMS)

při dTMS = 0. Formálně, jestliže stupnice 1 H posunu byla

vztažena vzhledem k TMS, může se vypočítat přesná frekvence

rezonance jakéhokoliv jádra X a kalibrovat stupnice

jeho chemického posunu. Frekvence sekundárního referenčního

standardu při dX = 0 ppm (nX,reference) se vypočítá

z 1 H frekvence TMS (nH,TMS) a tabulkové hodnoty poměru

(XX,reference) izotopově specifické frekvence vztažené k této

frekvenci 1 H v TMS:

ν ×

X, reference

= νH,TMS

ΞX,reference

Referenční standardy při dX = 0 ppm a odpovídající hodnoty

XX, reference jsou uvedeny dále:

Jádro Voda a ΞX, reference Jiná

rozpouštědla

(5)

ΞX, reference

1 H DSS b 1,00000000 TMS 1,00000000

13 C DSS b 0,25144953 TMS 0,25145020

15 N NH3 0,10132912 CH3NO2 0,10136767

19

F CF3COOH neuvedeno CCl3F 0,94094011

31 P H3PO4 (85%) 0,40480742 (CH3O)3PO 0,40480864

a chemický posun závisí na hodnotě pH

b DSS = natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonát

V praxi se chemické posuny jádra X uvádějí přímo za použití

vhodného standardu. V 1 H a 13 C NMR se používá hlavně

vnitřní standardizace, kde se standard přidává přímo do

sledovaného systému. V 15 N, 19 F a 31 P je NMR často vhodná

vnější standardizace, kde vzorek a standard jsou umístěny

odděleně v koaxiálních válcových kyvetách.

Uzamčení (lockování). Aby se zabránilo posunu spektra

s časem, provádí se stabilizační postup nazývaný lockování

frekvence pole. Používá se k tomu signál 2 H (deuteria)

vznikající v deuterovaných rozpouštědlech, pokud není

v článku specifikováno jinak.

KVALITATIVNÍ ANALÝZA

Hlavní použití pro kvalitativní NMR analýzu je zkouška totožnosti,

ve které se porovnává spektrum 1 H nebo 13 C

zkoušeného vzorku se spektrem porovnávacího vzorku nebo

méně často s publikovaným referenčním spektrem.

Spektra standardu a zkoušeného vzorku se musí zpracovat

za použití stejného postupu a operačních podmínek. Signály

v obou spektrech nebo charakteristické oblasti ve spektrech

si musí odpovídat polohou, intenzitou a multiplicitou.

V určitých případech může být vhodné matematické srovnání,

jako výpočet korelačního koeficientu. Není-li dostupný

referenční standard, může se použít pracovní standard,

jehož totožnost byla prokázána alternativními metodami,

nebo prokázání, že NMR spektrum se plně shoduje se

strukturou uvedenou pro tento materiál.

KVANTITATIVNÍ ANALÝZA

Intenzita signálu v základním NMR experimentu je integrovaná

plocha pod měřenou křivkou signálu. Jen v případech,

kdy dva signály mají stejnou šířku v poloviční výšce

(fwhh) a stejnou multiplicitu, může jako míra intenzity

sloužit výška signálu. Za podmínek v podstatě kompletní

relaxace mezi skeny je intenzita signálu (IA) skutečnou mírou

počtu (NA) jader zodpovědných za signál:

I = K × N

A

S

Konstanta KS zahrnuje základní konstanty, vlastnosti vzorku

a akviziční parametry a může se zanedbat v případě, kdy

jsou porovnávány intenzity signálů, poskytující přímý vztah

mezi počtem jader ve dvou porovnávaných strukturních

skupinách A a B:

I

I

A

B

N

=

N

A

B

Počet jader (Ni) patřících do různých strukturních skupin

jedné molekuly jsou malá celá čísla.

Změřené hodnoty jsou zaokrouhleny na malá celá čísla.

Správný průběh akvizice a zpracování je však snadno kontrolován

srovnáním přesných intenzit ve spektru jakékoliv

vhodné organické sloučeniny se známou strukturou.

Navíc ke skutečnosti, že intenzity signálů vznikajících od

každé složky směsi jsou vzájemně ve vztahu vyjádřeném

malými celými čísly, může se relativní molární množství

těchto složek měřit porovnáním normalizovaných intenzit

rezonancí různých složek. Molární poměr dvou složek směsi

se vypočítá podle následující rovnice:

n

n

A

B

I

=

I

A

B

Stanovení je platné pouze v případech, kdy je známa struktura

molekul, pro které jsou stanoveny IA a IB (nebo alespoň

hodnoty N pro sledované skupiny). Stanovení se provádí

buď metodou vnitřního standardu, nebo metodou normalizace

signálu.

Metoda vnitřního standardu. Hmotnost (mA) stanovované

látky (A) se může stanovit, jestliže se k roztoku přidá známá

hmotnost (mB) látky (B) se známým procentuálním obsahem

(PB) jako standard intenzity. Rovnice (8) může být

převedena na rovnici (9):

(6)

(7)

(8)

IA

NB

M A PB

m ,

A = × × × mB

×

(9)

I N M 100

B

A

kde Mi jsou molekulové hmotnosti.

Standard intenzity se musí zvolit pečlivě; měl by být zcela

rozpustný v rozpouštědle použitém pro stanovovanou látku,

měl by poskytovat jen malý počet signálů a sledovaná skupina

by měla mít signál v „prázdné“ spektrální oblasti.

K tomuto účelu se doporučují látky vysoké čistoty a s relativně

vysokou molekulovou hmotností.

Metoda normalizace. Relativní poměry složek ve směsi,

stupeň substituce ve strukturně modifikovaném polymeru

nebo množství kontaminující látky se mohou stanovit porovnáním

relativních intenzit přítomných rezonancí.

Experimentální metoda by se měla validovat, aby se zajistilo,

že nedochází k žádnému překryvu příslušných signálů.

A

N

×

N

B

B

A

144 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.34 TERMICKÁ ANALÝZA

Pokud má kontaminující látka nedostatečně definovanou

strukturu nebo molekulovou hmotnost (např. emulgátor),

umožní přídavky známých množství této látky zkonstruovat

kalibrační křivku.

METODA

Příprava vzorku. Vzorek se rozpustí v rozpouštědle, do

kterého by se mohl přidat vhodný referenční materiál pro

kalibraci chemického posunu, jak je předepsáno v článku.

Pro kvantitativní analýzu nesmí roztoky obsahovat pevné

částice. Některé kvantitativní analýzy mohou vyžadovat

přídavek vnitřního standardu, takže se mohou porovnat integrace

rezonancí zkoušeného vzorku a referenčního materiálu.

Vhodné referenční látky a koncentrace se uvádějí

v jednotlivých článcích. Při jiných kvantitativních analýzách

se výsledek získá porovnáním relativních intenzit

dvou nebo všech rezonancí, které poskytuje zkoušený vzorek.

Vzorek se nadávkuje do kyvety, kyveta se uzavře

a vloží se do NMR magnetu, nastaví se experimentální parametry

a provede se experiment. Hlavní experimentální

parametry jsou uvedeny v článku.

Pracovní postup. Vzorek v sondě se vytemperuje a přístroj

se optimalizuje, aby se dosáhlo nejlepších rezonančních

podmínek a maximalizoval se poměr signálu k šumu, naladí

se sonda a provede se nastavení pro dosažení maximální

homogenity magnetického pole v celém objemu vzorku

(tzv. „šimování – shimming“). Údaje včetně parametrů se

zaznamenají nebo se uloží v počítači. Experiment se může

skládat ze sekvence několika pulzů, prodlev a akvizice

a jednotlivé FID signály se v paměti počítače sčítají, přičemž

se potlačí nahodilý šum. Když se dosáhne vhodného

poměru signálu k šumu, FID signál se uloží. Spektrum ve

frekvenční doméně se vytváří Fourierovou transformací sečtených

FID signálů.

NMR V PEVNÉM STAVU

Vzorky v pevném stavu se mohou analyzovat s použitím

NMR spektrometrů speciálně vybavených pro tento účel.

Určité technické postupy umožňují pozorovat individuální

linie odpovídající individuálním pozicím atomů, což představuje

cenné rozšíření použitelnosti NMR rovněž na anorganické

materiály.

Jednou z metod je rychlá rotace (4 kHz až 30 kHz) práškovaného

vzorku v rotoru (vnější průměr asi 4 mm), nakloněném

v úhlu 54,7° („magický úhel“) vzhledem k ose magnetického

pole B0. Tato metoda se nazývá rotace pod magickým

úhlem (magic angle spinning, MAS). Jiný efektivní

prostředek je vysokovýkonný dekapling a třetí metodou je

přenos polarizace ze snadno excitovatelného jádra k jádru

méně polarizovatelnému, tj. křížová polarizace (cross polarisation,

CP). Kombinace těchto metod umožňuje získat vysoce

rozlišená spektra obsahující mnoho informací o chemických

a strukturních detailech pevných sklovitých, amorfních

a krystalických materiálů keramického, polymerního

nebo mineralogického původu.

Jestliže se NMR používá pro pevné látky, jsou všechny podrobnosti

postupů uvedeny v článku.

1


8.6:20234

Termická analýza je skupina metod, při kterých se měří

změna fyzikální vlastnosti látky v závislosti na teplotě.

Nejběžněji se užívají metody, při nichž se měří změny

hmotnosti nebo změny energie vzorku látky.

Tyto metody mají různá použití:

– stanovení fázových přeměn;

– stanovení změn v chemickém složení;

– stanovení čistoty.

TERMOGRAVIMETRIE

Termogravimetrie (TG) nebo termogravimetrická analýza

(TGA) je metoda, při které se zaznamenává hmotnost vzorku

látky jako funkce programovaně kontrolované teploty.

Zařízení. Základními složkami termovah jsou zařízení pro

ohřev nebo chlazení látky podle zadaného teplotního programu,

nosič vzorku v kontrolované atmosféře, elektrické

váhy, elektrické propojení výstupního signálu se zapisovačem

nebo počítačem.

Kalibrace teploty. Senzor teploty v blízkosti vzorku, nebo

v kontaktu se vzorkem se kalibruje pomocí Curieovy teploty

ferromagnetické látky, jakou je nikl. V případě, kdy je

zařízení schopno současně provádět termogravimetrii/termogravimetrickou

analýzu, diferenční termickou analýzu

(DTA) nebo diferenční skenovací kalorimetrii (DSC), se

mohou použít stejné certifikované referenční materiály jako

pro diferenční termickou analýzu a diferenční skenovací

kalorimetrii, např. indium, cín a/nebo zinek.

Kalibrace elektrických vah. Odpovídající množství vhodného

certifikovaného referenčního materiálu (např. kalcium-oxalátu

monohydrátu CRL) se umístí do nosiče vzorku

a zaznamená se jeho hmotnost. Nastaví se rychlost ohřevu

podle pokynů výrobce (např. 5 °C/min) a spustí se zahřívání.

Zaznamenává se termogravimetrická křivka jako graf

s teplotou nebo časem na ose úseček stoupající zleva doprava

a hmotností na ose pořadnic klesající shora dolů. Zahřívání

se zastaví při teplotě asi 250 °C. Na grafu se změří

vzdálenost mezi počáteční a konečnou hmotnostně teplotní

prodlevou nebo hmotnostně časovou prodlevou, která odpovídá

úbytku hmotnosti. Deklarovaný úbytek hmotnosti

pro certifikovaný referenční materiál je uveden v označení

na obalu.

Postup. Stejným způsobem se postupuje v případě zkoušené

látky, za použití podmínek uvedených v lékopisném

článku. Úbytek hmotnosti zkoušené látky se vypočítá ze

vzdálenosti změřené v získaném grafu. Ztráta hmotnosti se

vyjádří jako ∆m/m (%).

Používá-li se přístroj častěji, provádí se kalibrace teploty

pravidelně. Jinak se tyto kalibrace provádějí před každým

měřením.

Protože podmínky jsou rozhodující, uvádějí se pro každé měření

tyto parametry: tlak nebo průtoková rychlost, složení

plynu, množství vzorku, rychlost zahřívání, teplotní rozsah,

úprava vzorku zahrnující případnou izotermickou periodu.

Zkušební

metody

2.2

––––––––––––––––––––––––––––––

1

Tento článek byl harmonizován, viz stať 5.8 Harmonizace lékopisu.

ČL 2017 – Dopl. 2020 145


DIFERENČNÍ SKENOVACÍ KALORIMETRIE

Diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) je metoda, která

se může použít k demonstraci energetických jevů, které

provázejí zahřívání (nebo chlazení) látky (nebo směsi látek)

a ke stanovení změn entalpie a specifického tepla a teplot,

při kterých tyto jevy nastávají.

Metoda se používá ke stanovení rozdílu v toku tepla

(s ohledem na teplotu) uvolňovaného nebo absorbovaného

zkoušeným vzorkem ve srovnání s referenční celou, v závislosti

na teplotě. Jsou dostupné dva typy zařízení pro diferenční

skenovací kalorimetrii. Jedny používají kompenzaci

napětí k udržení nulového teplotního rozdílu mezi

vzorkem a referenční celou. Druhé používají konstantní

rychlost ohřevu a detekují teplotní rozdíl jako rozdíl toku

tepla mezi vzorkem a referenční celou.

Zařízení. Zařízení pro kompenzaci napětí diferenční skenovací

kalorimetrie se skládá z pícky obsahující nosič

vzorků s referenční a měřicí celou. Zařízení pro tepelný tok

diferenční skenovací kalorimetrie se skládá z pícky obsahující

jednu celu s nosičem referenční a měřicí nádobky.

K přístroji jsou připojeny: zařízení pro programování teploty,

termický detektor (detektory) a záznamové zařízení,

které může být spojeno s počítačem. Měření se provádějí

v kontrolované atmosféře.

Kalibrace zařízení. Kalibrace zařízení pro teplotní a entalpické

změny se provádí pomocí vhodných certifikovaných

materiálů nebo referenčních standardů.

Kalibrace teploty. Může se provádět pomocí certifikovaných

referenčních materiálů s vnitřními termickými vlastnostmi,

jako je teplota tání čistých kovů nebo organických

látek, nebo teplota fázového přechodu krystalických anorganických

solí nebo oxidů. Ke kalibraci se obvykle používá

teplota tání india, cínu a/nebo zinku.

Kalibrace množství tepla. Pro přesné stanovení množství

vyměněného tepla (entalpické změny) zkoušeného vzorku,

založené na určitých fyzikálních změnách doprovázejících

změnu teploty, je nutné kalibrovat zařízení pomocí

vhodných certifikovaných referenčních materiálů.

Stejně jako kalibrace teploty se kalibrace množství tepla

může provádět pomocí vhodných certifikovaných referenčních

materiálů vykazujících známé konečné entalpické

změny, které závisejí na fyzikálních změnách, jako

je tání čistých kovů a/nebo organických látek, nebo fázovém

přechodu krystalických anorganických solí. Ke

kalibraci se obvykle používá skupenské teplo tání india,

cínu a/nebo zinku.

Postup měření. Do vhodné nádobky se naváží přiměřené

množství zkoušené látky a umístí se do nosiče vzorku.

Prázdná nádobka se umístí do referenčního držáku. Nastaví

se počáteční a konečná teplota a rychlost ohřevu

podle operačních podmínek uvedených v lékopisném

článku.

Zahájí se analýza a zaznamenává se diferenční skenovací

kalorimetrická křivka, s teplotou nebo časem na ose úseček

(stoupající zleva doprava) a změnou energie na ose pořadnic

(specifikuje se, zda se jedná o endotermní nebo o exotermní

změnu).

Teplota, při které jev nastává (počáteční teplota), odpovídá

průsečíku (A) prodloužené základní linie s tangentou

v bodě největšího sklonu (inflexní bod) křivky, viz obrázek

2.2.34-1. Konec tepelného jevu je indikován píkem na

křivce.

Entalpie jevu je úměrná ploše pod křivkou, vymezené základní

linií; faktor úměrnosti se stanoví z měření skupenského

tepla tání známé látky (např. indium) za stejných

podmínek měření.

Každý termogram může být provázen těmito údaji: použité

podmínky měření, záznam poslední kalibrace, množství

a identifikace vzorku (zahrnující tepelnou historii), obal,

atmosféra (totožnost, průtoková rychlost, tlak), směr

a rychlost teplotní změny, citlivost přístroje a záznamového

zařízení.

POUŽITÍ

Fázové přeměny. Stanovení teploty, změny tepelné kapacity

a entalpie fázových přeměn podstoupených látkou jako

funkce teploty. Přechody, které lze pozorovat, jsou uvedeny

v tabulce 2.2.34-1.

Tab. 2.2.34-1

přechod pevná látka –

– pevná látka:


– kapalina:


– plyn:

přechod kapalina – pevná

látka:

přechod kapalina – plyn:

alotropie – polymorfie

desolvatace

amorfní – krystalická forma

tání

skelný přechod

sublimace

tuhnutí

překrystalizování

skelný přechod

odpařování

Obr. 2.2.34-1 Termogram

146 ČL 2017 – Dopl. 2020


Změny chemického složení. Měřením reakčního tepla a teplot

za daných experimentálních podmínek se např. může

určit kinetika rozkladu nebo desolvatace.

Použití fázových diagramů. Sestavování fázových diagramů

pro směsi pevných látek může být důležitým krokem v přípravě

a optimalizaci lyofilizačního procesu.

Stanovení čistoty. Měření teploty a skupenského tepla tání

podílu tavené látky pomocí diferenční skenovací kalorimetrie

umožňuje stanovení obsahu nečistot látky z jednoduchého

termického diagramu, vyžadujícího použití jen několika

miligramů vzorku bez potřeby opakovaného přesného

měření pravé teploty.

Teoreticky se tání krystalické zcela čisté látky při konstantním

tlaku charakterizuje skupenským teplem tání ∆Hf v nekonečně

úzkém rozmezí odpovídajícím teplotě tání T0.

Rozšíření tohoto rozmezí je citlivým indikátorem nečistot.

Vzorky stejné látky, jejichž obsahy nečistot se liší o několik

desetin procenta, poskytují tedy termické diagramy, které

se znatelně liší, viz obrázek 2.2.34-2.

Stanovení molární čistoty pomocí diferenční skenovací kalorimetrie

je založeno na použití matematické aproximace

integrované formy van´t Hoffovy rovnice použité na

koncentrace (nikoliv na aktivity) v binárním systému

[ln(1–x2) » –x2 a T·T0 » T0 2 ]. Pro malá množství nečistot

x2 ˂˂ 1 a pro teploty blízké teplotě tání T0 lze psát rovnici

následovně, kde T a x2 jsou proměnné:

T = T

2

RT0

0 - × x2

DH

f

, (1)

v níž značí:

T – teplotu vzorku v kelvinech;

T0 – teplotu tání chemicky čisté látky v kelvinech;

R – plynovou konstantu pro ideální plyny v joulech

∙ kelvin –1 ∙ mol –1 ;

∆Hf – molární skupenské teplo tání čisté látky

v joulech ∙ mol –1 ;

x2 – molární podíl nečistot, tj. počet molekul nečistoty

dělený celkovým počtem molekul v kapalné fázi

(nebo v tavenině) při teplotě T (vyjádřené

v kelvinech);

Tedy stanovení čistoty pomocí diferenční skenovací kalorimetrie

je omezeno na stanovení nečistot tvořících s hlavní

složkou eutektickou směs, které jsou přítomny ve zkoušené

látce v molárním podílu obvykle menším než 2 %.

Tuto metodu nelze použít pro:

– amorfní látky;

– solváty nebo polymorfní sloučeniny, které jsou v rozsahu

experimentálních teplot nestabilní;

– nečistoty tvořící s hlavní složkou pevné roztoky;

– nečistoty, které jsou nerozpustné v kapalné fázi nebo

v tavenině hlavní složky.

V průběhu zahřívání zkoušené látky nečistoty zcela roztají

při eutektické teplotě. Nad touto teplotou obsahuje pevná

fáze jen čistou látku. Jak teplota stoupá progresivně od eutektické

teploty k teplotě tání čisté látky, klesá molární

frakce nečistoty v kapalné fázi, zatímco množství zkapalněné

čisté látky stoupá. Pro všechny teploty nad eutektickým

bodem platí:

1

x 2 = × x

F

, (2)

v němž značí:

F – roztavený podíl zkoušené látky;

*

– molární podíl nečistoty ve zkoušené látce.

x 2

Když celý vzorek roztaje, F = 1 a x2 =

*.

Jestliže se rovnice (2) zkombinuje s rovnicí (1), získá se

rovnice:

T

*

2

Hodnota skupenského tepla tání čisté látky se získá integrací

píku tání.

Teplota tání T0 čisté látky se extrapoluje ze závislosti na

teplotě (vyjádřené v kelvinech) proti 1/F. Směrnice křivky

α (získaná po linearizaci, je-li třeba) odpovídající

*

2 x2

*

RT , umožňuje výpočet .

D

0

H f

*

x 2

Podíl násobený 100 udává molární podíl pro celkové eutektické

nečistoty v procentech.

x 2

2

RT0

1 *

= T0

- × × x 2

DH

f F

x 2

Zkušební

metody

2.2

Obr. 2.2.34-2 Termické

diagramy podle čistoty

ČL 2017 – Dopl. 2020 147

2.2.35 OSMOLALITA

2.2.35 OSMOLALITA

PRINCIP

9.8:20235

OBECNĚ

Osmolalita je mírou celkového počtu chemických složek

(entit) v kilogramu rozpouštědla, a tím poskytuje informace

o osmotickém tlaku roztoku. Osmolalita závisí na molální

koncentraci rozpuštěné látky (rozpuštěných látek) v roztoku,

jejich disociaci a odchylce tohoto roztoku od ideálního

chování (Raoultův zákon).

Jednotkou osmolality je osmol na kilogram (osmol/kg), ale

obvykle se používá odvozená jednotka miliosmol na kilogram

(mosmol/kg).

Osmolalita (xm) roztoku obsahujícího i rozpuštěných látek

je dána vzorcem:

å

ξ m i i m,i

= u m F ,

v němž značí:

ui – počet entit vytvořených disociací jedné molekuly

i-té rozpuštěné látky; ui je rovno 1, pokud není roztok

ionizován (nedisociovaný);

mi – molalita i-té rozpuštěné látky v roztoku v molech na

kilogram rozpouštědla;

Fm,i – molální osmotický koeficient (bezrozměrná veličina).

Molální osmotický koeficient je mírou odchylky roztoku od

ideálního chování. Pro ideální roztok je osmolalita rovna

molalitě (F = 1).

V případě reálných, neideálních roztoků, je molální osmotický

koeficient ovlivněn interakcemi mezi jednotlivými

složkami (např. molekulami, ionty, rozpouštědlem) roztoku.

Čím složitější je složení roztoku, tím těžší je určit Φ.

Z tohoto důvodu se, jako praktický prostředek ke stanovení

osmolality pomocí celkové míry příspěvku různých rozpuštěných

látek přítomných v roztoku, používá měření koligativní

vlastnosti, jako je snížení bodu tuhnutí.

PRINCIP MĚŘENÍ

Není-li předepsáno jinak, osmolalita se stanovuje měřením

snížení teploty tuhnutí (DTf) roztoku. Vzájemný vztah mezi

osmolalitou a snížením teploty tuhnutí vyjadřuje následující

vzorec:

DT

=

f k f

x ,

kde kf je molální kryoskopická konstanta, která závisí na

rozpouštědle. Hodnota kf pro vodu je 1,86 K/osmol (tj. přidání

1 molu nedisociovaného roztoku k 1 kg vody vede ke

snížení teploty tuhnutí o 1,86 K).

ZAŘÍZENÍ

Osmometr pro měření snížení teploty tuhnutí obvykle se

skládá ze:

– vhodné měřicí kyvety;

– zařízení pro chlazení vzorku;

– rezistoru citlivého na teplotu (termistor) opatřenému zařízením

pro průběžné měření proudu nebo měření rozdílu

potenciálů, který je schopen zaznamenat snížení teploty

tuhnutí nebo přímo poskytuje hodnotu osmolality;

m

– zařízení pro míchání vzorku a/nebo indukující (vyvolávající)

tuhnutí, pokud dojde k podchlazení.

POSTUP

KALIBRACE

Připraví se porovnávací roztoky, jak je uvedeno v tabulce

2.2.35-1, je-li třeba za použití vysušeného chloridu sodného

R. Ke kalibraci osmometru se mohou použít komerčně

dostupné certifikované roztoky s osmolalitami stejnými nebo

podobnými těm, které jsou uvedené v tabulce 2.2.35-1.

Kalibrace zařízení se provede v souladu s pokyny výrobce.

Nastaví se nulová hodnota přístroje za použití vody R. Provede

se kalibrace přístroje pomocí nejméně dvou porovnávacích

roztoků uvedených v tabulce 2.2.35-1. Kalibrace se

potvrdí za použití nejméně jednoho dodatečného porovnávacího

roztoku o známé osmolalitě (viz tabulku 2.2.35-1).

Pokud možno, vybere se porovnávací roztok s osmolalitou

v rozmezí ±50 mosmol/kg očekávané hodnoty zkoušeného

roztoku nebo blízko střední hodnoty očekávaného rozsahu

osmolality zkoušených roztoků. Doporučuje se, aby odečty

byly v rozmezí ±4 mosmol/kg osmolality zvoleného porovnávacího

roztoku.

Tab. 2.2.35-1 Porovnávací roztoky pro kalibraci osmometru

Množství chloridu

sodného R ve vodě R

(g/kg)

Osmolalita,

xm

(mosmol/kg)

Kryoskopické

snížení, DTf

(K)

3,087 100 0,186

6,260 200 0,372

9,463 300 0,558

12,684 400 0,744

15,916 500 0,930

19,147 600 1,116

22,380 700 1,302

POSTUP

Před každým měřením se kyveta vypláchne zkoušeným

roztokem. Zařízení je naprogramované tak, aby indukovaný

počátek tuhnutí zkoušeného roztoku začal při teplotě nižší,

než je očekávaná teplota tuhnutí. Vhodný objem zkoušeného

roztoku se převede do kyvety podle pokynů výrobce zařízení

a zapne se chladicí systém. Zařízení indikuje dosažení

rovnováhy.

Se zkoušenými roztoky se zkouška provede za stejných podmínek

(teplota chlazení a objem), které byly použity ke kalibraci

přístroje. V závislosti na typu zařízení se osmolalita

odečte přímo nebo se vypočítá ze snížení teploty tuhnutí.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže nalezená hodnota osmolality

zkoušeného roztoku leží v rozsahu kalibrační křivky.

148 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.36 POTENCIOMETRICKÉ STANOVENÍ KONCENTRACE IONTŮ POMOCÍ IONTOVĚ SELEKTIVNÍCH ELEKTROD

2.2.36 POTENCIOMETRICKÉ STANOVENÍ

KONCENTRACE IONTŮ POMOCÍ

IONTOVĚ SELEKTIVNÍCH

ELEKTROD

8.6:20236

Za ideálních podmínek závisí potenciál E iontové selektivní

elektrody lineárně na logaritmu aktivity ai příslušného iontu,

což vyjadřuje Nernstova rovnice:

v níž značí:

E0 – standardní elektrodový potenciál použitého přístroje;

R – plynovou konstantu;

T – absolutní teplotu;

F – Faradayovu konstantu;

zi – náboj příslušného iontu včetně znaménka.

Při konstantní iontové síle platí vzorec:

v němž značí:

Ci – molární koncentraci příslušného iontu;

f – aktivitní koeficient (ai = f Ci);

Pokud označíme:

kde S je směrnice lineární části kalibrační křivky této elektrody,

pak platí následující vzorce:

Je-li:

pak lze psát:

E = E +

RT

,303 log

z F

2 a

0 i

k

E = E + log f C i,

0

z

i

RT

k = .

F

k

E log

'

0

+ f = E0

a S =

z

E = E'

+ S log

Potenciometrické stanovení koncentrace příslušného iontu

se provádí měřením potenciálního rozdílu mezi dvěma

vhodnými elektrodami ponořenými do zkoušeného roztoku.

Indikační elektroda je pro stanovovaný iont selektivní, druhá

elektroda je referenční.

Zařízení. Použije se voltmetr umožňující měření s přesností

na nejméně 0,1 milivoltů (mV), jehož vstupní impedance je

alespoň stokrát větší než impedance použitých elektrod.

Iontově selektivní elektrody mohou být elektrody s krystalickou

či nekrystalickou membránou nebo se vhodnou pevnou

matricí (např. skleněné elektrody), nebo elektrody

s (pozitivně či negativně) nabitými nebo nenabitými pohyblivými

nosiči náboje, nebo tzv. senzitivované elektrody

(enzym-substrát elektrody, plynové indikační elektrody).

Srovnávací elektrodou je zpravidla argentchloridová elektroda,

případně se solným můstkem naplněným vhodným

neinterferujícím roztokem.

i

0

C i

- logC = pC ,

i

E = E 0

' - SpC i

.

i

i

.

k

z

i

,

,

Postup měření. Měření se provádí při konstantní teplotě

±0,5 °C, přičemž se berou v úvahu změny směrnice části kalibrační

křivky elektrody s teplotou (viz tabulku 2.2.36-1).

Za použití tlumivých roztoků popsaných v článku se upraví

iontová síla, případně i pH analyzovaného roztoku a elektroda

se do rovnovážného stavu uvede ponořením do analyzovaného

roztoku za pomalého a rovnoměrného míchání,

dokud nejsou měřené hodnoty ustáleny.

Tab. 2.2.36-1 Hodnoty k při různých teplotách

Teplota (°C)

20

25

30

k

0,0582

0,0592

0,0602

Jestliže se elektrodový systém používá často, pravidelně se

kontroluje opakovatelnost, stabilita odezvy a linearita kalibrační

křivky či výpočtový algoritmus v koncentračním

rozmezí zkoušeného roztoku. Nepoužívá-li se systém často,

provede se tato zkouška před každou sérií měření. Odezva

elektrody se může považovat za lineární, pokud je směrnice

S kalibrační křivky přibližně rovna k/zi na jednotku pCi.

METODA I (PŘÍMÁ KALIBRACE)

Alespoň třikrát za sebou se změří potenciál nejméně tří porovnávacích

roztoků pokrývajících očekávanou koncentraci

zkoušeného roztoku. Vypočítá se kalibrační křivka nebo se

do grafu vynese střední hodnota získaného potenciálu E

proti koncentraci stanovovaného iontu, vyjádřeno jako

– log Ci nebo pCi.

Zkoušený roztok se připraví, jak je předepsáno v lékopisném

článku. Příslušný potenciál se třikrát změří a z jeho

průměrné hodnoty se pomocí kalibrační křivky určí koncentrace

stanovovaného iontu.

METODA II (VÍCENÁSOBNÝ STANDARDNÍ

PŘÍDAVEK)

Zkoušený roztok se připraví, jak je předepsáno v lékopisném

článku. Změří se rovnovážný potenciál ET tohoto roztoku

o objemu VT, který obsahuje neznámou koncentraci CT

stanovovaného iontu. Provedou se alespoň tři následné přídavky

porovnávacího roztoku o koncentraci Cs, která leží

uvnitř lineární části kalibrační křivky, a o objemu Vs, který

je zanedbatelný ve srovnání s VT (Vs ≤ 0,01 VT). Po každém

přídavku se změří potenciál a vypočítá se rozdíl potenciálů

ΔE mezi tímto změřeným potenciálem a rovnovážným

potenciálem ET.

Mezi rozdílem potenciálů ΔE a koncentrací stanovovaného

iontu platí:

nebo

æ C D =

ç +

SV

E S log 1

è CTV

10

DE

S

CSV

= 1+

C V

v nichž značí:

VT – objem zkoušeného roztoku;

CT – koncentraci stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku;

T

S

T

,

S

T

ö

÷

ø

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 149

2.2.37 RENTGENOVÁ FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE

Vs – přidaný objem porovnávacího roztoku;

Cs – koncentraci stanovovaného iontu v porovnávacím roztoku;

S – směrnici kalibrační křivky elektrody stanovenou experimentálně

při konstantní teplotě měřením rozdílu mezi

potenciály získanými se dvěma porovnávacími roztoky,

jejichž koncentrace se desetinásobně liší a které

leží v oblasti, kde je kalibrační křivka lineární.

Do grafu se vynese závislost 10 (osa pořadnic y) proti Vs

(osa úseček x) a získaná závislost (přímka) se extrapoluje,

aby protnula osu x. V tomto průsečíku je koncentrace CT

stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku dána vzorcem:

METODA III (JEDEN STANDARDNÍ PŘÍDAVEK)

K objemu VT zkoušeného roztoku připraveného tak, jak je

předepsáno v lékopisném článku, se přidá objem Vs porovnávacího

roztoku obsahujícího takové množství stanovovaného

iontu, o němž je známo, že poskytuje odezvu v lineární

části kalibrační křivky. Za stejných podmínek se připraví

slepá zkouška. Alespoň třikrát se změří potenciály zkoušeného

roztoku a kontrolního roztoku před a po přidání porovnávacího

roztoku. Koncentrace CT stanovovaného iontu

se vypočítá pomocí následující rovnice, provede se nezbytná

korekce na slepou zkoušku:

v níž značí:

C

VT – objem zkoušeného roztoku nebo kontrolního roztoku;

CT – koncentraci stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku;

Vs – přidaný objem porovnávacího roztoku;

Cs – koncentraci stanovovaného iontu v porovnávacím roztoku;

DE – rozdíl mezi průměrnými hodnotami potenciálů měřenými

před a po přidání Vs;

S – směrnici kalibrační křivky elektrody stanovenou experimentálně

při konstantní teplotě měřením rozdílu mezi

potenciály získanými se dvěma porovnávacími roztoky,

jejichž koncentrace se desetinásobně liší a které

leží v oblasti, kde je kalibrační křivka lineární.

2.2.37 RENTGENOVÁ FLUORESCENČNÍ

SPEKTROMETRIE

9.3:20237

ΔE

S

CSV

CT

= -

V

T

=

DE

C V

S

T

S

.

( V + V )

S

10

T S

-VT

S

,

PRINCIPY METODY

Rentgenová fluorescenční spektrometrie (XRF) je založena

na měření rentgenových paprsků emitovaných atomy tvořícími

vzorek po excitaci vnějším zdrojem záření. Pokud dojde

k dostatečnému energetickému záření při nárazu na

atom analyzovaného vzorku, dochází k vyražení elektronu

z vnitřní obalové slupky atomu. Mezera, která tak ve slupce

vznikne, je vyplněna přechodem elektronu z výšekvantové

slupky, přičemž se současně vyzáří kvantum charakteristického

fluorescenčního rentgenového záření. Toto rentgenové

záření je charakteristické, protože jeho energie je specifická

pro každý prvek (atom). Měřením energie a intenzity

se získají kvalitativní a kvantitativní údaje o elementárním

složení zkoušeného materiálu.

Rentgenová fluorescenční spektrometrie je vhodná pro tekuté,

pevné a práškové materiály a je široce používána jako

prostředek pro zkoušení farmaceutických složek a produktů

na toxické prvky nebo elementární nečistoty, pro kontrolu

jakosti a mezioperační zkoušení. Používá se také k identifikaci

anorganických cizích prvků u padělaných léčivých

přípravků. Vzhledem k tomu, že rentgenová fluorescenční

spektrometrie může být neinvazivní, je vhodná pro technologie

analýzy procesu (PAT), jako je analýza nežádoucích

stop katalyzátoru v léčivé látce.

ZAŘÍZENÍ

Rentgenový fluorescenční spektrometr (nebo analyzátor) se

skládá ze tří základních částí:

– zdroje budicího záření (např. rentgenová trubice, proud

elektronů, pokud se používá skenovací elektronový mikroskop

nebo, zřídka radioizotop),

– prostředku pro opakovatelnou prezentaci vzorků,

– detektoru.

V závislosti na použité rentgenové detekční metodě se používá

vlnově disperzní (WD) nebo energodisperzní (ED)

spektrometr.

Ve vlnově disperzním spektrometru je rentgenové záření ze

vzorku směřováno na difrakční krystal, který je rozptýlí do

přesných úhlů v závislosti na jejich energii. Intenzita rozptýlených

rentgenových paprsků se měří postupně čítacím

detektorem.

V energodisperzním spektrometru je rentgenové záření ze

vzorku směřováno na detektor v pevném stavu, který generuje

elektrický impuls o výšce úměrné energii každého detekovaného

rentgenového fotonu. Během měření spektrometrem

se získá rentgenové spektrum vzorku, které obsahuje

úplné informace o jeho složení. Energodisperzní spektrometr

lze také kombinovat se skenovacím elektronovým

mikroskopem (SEM). Výrazný pokrok v miniaturizaci

a automatizaci vedl k vývoji ručních spektrometrů pro měření

v terénu.

Některé přístroje jsou dodávány s počáteční kalibrací nastavenou

u výrobce zařízení, která umožňuje provádět semikvantitativní

analýzy.

VLIV MATRICE A INTERFERENCE

Intenzita charakteristických rentgenových paprsků analyzovaných

prvků není nezbytně lineární vzhledem ke koncentraci

ovlivněné matricí. Intenzita fluorescence měřená

1

pro daný prvek závisí nejen na koncentraci tohoto prvku ve

vzorku, ale také na absorpci budicího a fluorescenčního záření

matricí. Je známo, že přítomnost a koncentrace dalších

prvků (analytů) ve vzorku, složení matrice vzorku a velikost

částic vzorku materiálu přispívají k vlivům matrice.

Přítomnost vlivu matrice musí být brána v úvahu při jakékoliv

kalibrační metodě použité pro kvantitativní stanovení.

Při nízkých koncentracích je linearita obvykle dobře zachována,

což značně usnadňuje kalibraci spektrometru. Intenzita

fluorescenčního záření emitovaného prvkem v dané matrici

a při dané vlnové délce je pak úměrná koncentraci to-

150 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.37 RENTGENOVÁ FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE

hoto prvku a nepřímo úměrná hmotnostnímu absorpčnímu

koeficientu matrice při této vlnové délce.

PŘÍPRAVA VZORKU

Je nezbytné, aby byl vzorek dostatečně silný, aby intenzita

charakteristik naměřených rentgenovým zářením nebyla

ovlivněna změnami v tloušťce vzorku.

Tekuté vzorky. Analyzují se „jako takové“ za předpokladu,

že roztok se skládá z čistě jedné fáze a má dostatečně nízkou

těkavost. Požaduje se použití zvláštního držáku vzorku

kapaliny a komerčně dostupného podpěrného okna složeného

z vhodného polymerního filmu (propouštějícího rentgenové

záření a odolného vůči rozpouštědlům). Alternativně

mohou být tekuté vzorky přeneseny na povrch disku

a před analýzou vysušeny.

Práškové vzorky. Mohou být analyzovány „jako takové“

ve speciálních nádobkách pro vzorek se dnem vyrobeným

z tenkého polymerního filmu, propouštějícího rentgenové záření.

Po přenesení prášku do nádobky na vzorky je třeba jemně

poklepat, dokud se nedosáhne dalšího setřesení materiálu.

V případě potřeby může být po setřesení přidáno do nádobky

více materiálu. Další alternativou pro přípravu práškového

vzorku, která je vhodnější pro analýzu vlnově disperzním

spektrometrem, je stlačení prášku vzorku do pelety, buď

s pojivem (např. práškovou celulosou, voskem nebo ethylcelulosou),

nebo bez pojiva. Hmotnost porovnávacího materiálu

a zkoušeného materiálu musí být přibližně stejná a výsledné

pelety musí být přibližně 5 mm silné nebo více.

Pevné vzorky. Analyzují se umístěním přímo na měřicí okno

spektrometru, zajistí se, aby bylo zcela zakryto. Pevné

vzorky pro vlnově disperzní spektrometr mohou být třeba

rozřezány do jednotného tvaru s plochým povrchem pro

opakovatelnou analýzu, zatímco vzorky lze měřit „jako takové“

pomocí energodisperzního spektrometru za předpokladu,

že vzorek má dostatečnou hloubku.

Fúze. Metoda fúzních perliček/peciček může být použita

pro přípravu pevných a práškových vzorků (např. minerálů

nebo oxidů), jestliže předmět zájmu není těkavý. Vzorek se

homogenně smíchá s tavidlem (např. tetraboritanem lithným)

a převede do platinové nádoby; může se přidat rozvolňovadlo

a/nebo oxidační činidlo, pokud je to nutné, aby

se např. zabránilo poškození nádoby. Směs se zahřívá při

vhodné teplotě za míchání nádobou krouživým pohybem,

dokud se nedosáhne homogenní taveniny. V případě potřeby

se tavenina přenese do formy s plochým dnem, udržuje

se ve vodorovné poloze a ochlazuje za podmínek, zachovávají

jeho vlastnosti, jako sklo.

POSTUP

Podmínky měření. Přístroj se nastaví a použije se podle

pokynů výrobce. Měření se může provádět ve vakuu,

v atmosféře dusíku nebo hélia, aby se zlepšila citlivost metody

pro kvantifikaci světelných prvků.

Referenční standardy. Standardy požadované pro kalibraci,

způsobilost systému nebo kontrolu správné funkce přístroje

jsou připraveny z certifikovaných referenčních materiálů

(CRM). Pro farmaceutické použití mohou být mnohem

typičtější standardy s vysokým obsahem uhlíku.

Kalibrace. Vybraný kalibrační model musí být pro daný

účel vhodný. K dispozici jsou různé metody kalibrace,

včetně přístupu „základních parametrů“, empirické kalibrace,

Compton/Rayleighovy normalizace a vícenásobné lineární

regrese (MLR).

Test způsobilosti. Tato zkouška musí být provedena před

analýzou, aby byly zajištěny uspokojivé výsledky měřicího

systému. Může se také provést ověření kalibrace systému.

Kritéria přijatelnosti: měřicí systém je vhodný, pokud koncentrace

získaná pro kontrolní materiál obsahující požadovaný

prvek (prvky) v použitém rozmezí koncentrací se neliší

od skutečné koncentrace o více než 5 % pro zkoušku stanovení

obsahu a o 20 % pro zkoušku na nečistoty. Při použití

koncentrací stanovených z porovnávacích metod, jako je

atomová absorpční spektrometrie, by měla být přesnost kalibrace

rentgenové fluorescenční spektrometrie srovnána

s referenční metodou. V tomto případě může být pro stanovení

mnohem výstižnější kritérium přijatelnosti 10 %.

Analýza. U vzorků jsou měřeny stejné parametry, jaké byly

použity během kalibrace přístroje.

KONTROLA VÝKONNOSTI ZAŘÍZENÍ

Tyto parametry platí také pro kvalifikaci zařízení.

Specifické postupy, kritéria přijatelnosti a časové intervaly

pro charakterizaci výkonnosti rentgenové fluorescenční

spektrometrie závisí na přístroji a jeho zamýšleném použití.

Prokázat stabilní výkonnosti přístroje po delší dobu poskytuje

určitou jistotu, že lze dosáhnout spolehlivých měření.

Následující zkoušky mohou být provedeny ve vhodných intervalech

definovaných podle postupů systému jakosti uživatele,

aby byla zajištěna odpovídající výkonnosti přístroje

pro rentgenovou fluorescenční spektrometrii.

Osy x a y

Doporučuje se, aby osa x (energie nebo úhel píku) a osa y

(intenzita) byly ověřeny alespoň po instalaci a potom ve

vhodných intervalech, které jsou definovány podle postupů

systému jakosti uživatele. Při ověřování osy x je třeba vzít

v úvahu polohu píku u energodisperzní rentgenové fluorescenční

spektrometrie a úhel píku a počáteční rychlost

při ověřování osy y u vlnově disperzní rentgenové fluorescenční

spektrometrie.

Rozlišení detektoru

Vypočítá se rozlišení (celková šířka v polovině výšky)

vztažené na energii použitou při kalibraci přístroje.

Kritéria přijatelnosti: hodnota rozlišení by se neměla od

hodnoty stanovené při kalibraci přístroje odchylovat o více

než 20 % pro zkoušky stanovení obsahu a o 25 % pro

zkoušky totožnosti nebo zkoušky na elementární nečistoty.

VALIDAČNÍ POŽADAVKY

Cílem ověření metody rentgenové fluorescenční spektrometrie

je prokázat, že postup měření je vhodný pro daný účel

(stanovení obsahu, obsahovou stejnoměrnost, limitní zkoušky

a zkoušky totožnosti). Pokud je nutná příprava vzorků, je

nezbytné, aby byly zkušební materiály před každým krokem

přípravy obohaceny. Např., pokud má být zkoušený materiál

digerován, musí být na počátku procesu digesce obohacen.

Pro stanovení nečistot jsou validační požadavky obecně

uvedeny ve stati 2.4.20. Pro jiné účely je validace provedena

podle příslušných kritérií pokynů ICH.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 151

2.2.38 KONDUKTIVITA

2.2.38 KONDUKTIVITA

9.6:20238

ÚVOD

Tato obecná stať poskytuje informace, jak provádět měření

konduktivity (měrné elektrické vodivosti) tekutin, včetně

čistých kapalin. Je určena při použití u tekutin, kdy se konduktivita

používá k měření, monitorování nebo ke kontrole

chemického rozdělení (např. chemické čistoty nebo koncentrace

iontů), nebo k jinému použití, kde je třeba znát nebo

kontrolovat iontovou charakteristiku tekutiny.

Použití metody je určeno (ale není omezeno pouze na ně)

pro roztoky, které mohou být použity při čištění (clean-in-

-place), pro chromatografickou detekci, přípravky iontových

roztoků, detekci konečného bodu, dávkování, fermentaci

a přípravu tlumivých roztoků. V některých případech

může být měření konduktivity rozšířeno na čisté organické

tekutiny, jako jsou alkoholy a glykoly, vykazující slabý

signál, který se významně zvýší, jestliže je organická tekutina

kontaminována vodou nebo solemi.

Konduktivita je měření schopnosti tekutiny vést elektrický

proud pomocí jejich iontů. Schopnost jakéhokoliv iontu

vést elektrický proud přímo souvisí s pohyblivostí tohoto

iontu. Konduktivita je přímo úměrná koncentracím iontů

v tekutině podle následujícího vzorce:

všechny ionty

k = 1000 åCili

,

v němž značí:

κ – konduktivitu v siemensech na centimetr;

Ci – koncentraci iontu i v molech na litr;

λi – specifickou molární konduktanci (měrnou molární

elektrickou vodivost) iontu i v siemensech na centimetr

čtverečný na mol (S ∙ cm 2 ∙ mol –1 ).

Přestože jednotkou konduktivity v mezinárodní soustavě SI

je siemens na metr (S ∙ m –1 ), v průmyslu se historicky konduktivita

roztoku udává v siemensech na centimetr (S ∙ cm –1 ).

Z rovnice vyplývá, že konduktivita není iontově selektivní,

protože odpovídá všem iontům. Navíc specifická molární

konduktance každého iontu je rozdílná. Výsledkem je, pokud

není procentuální koncentrace iontů v roztoku vymezená

a známá, že přesná koncentrace iontových skupin nemůže

být stanovena měřením konduktivity. Nicméně např.

v roztocích jednotlivých solí, kyselin nebo zásad (např.

v roztocích žíravin používaných při čištění) může být koncentrace

iontů stanovena přímo. Navzdory nedostatku iontové

specifičnosti je konduktivita cenný laboratorní a procesní

nástroj pro měření a kontrolu celkového obsahu iontů,

protože je úměrná součtu koncentrací všech skupin iontů

(aniontů i kationtů) ve zředěných roztocích, jak je popsáno

ve výše uvedeném vzorci. Při vyšších koncentracích není

závislost konduktivity na koncentraci přesně lineární. Měření

konduktivity nelze použít u pevných látek nebo plynů,

ale může se použít u kondenzátů plynů.

Další proměnnou, která ovlivňuje měření konduktivity, je

teplota tekutiny. Jestliže se teplota tekutiny zvyšuje, zvyšuje

se i konduktance iontů. Tento fyzikálně-chemický jev je

1

i

důvodem pro požadavek kompenzace teploty během zkoušení

vodivých tekutin.

Konduktivita (měrná elektrická vodivost) (κ) je úměrná

konduktanci (elektrické vodivosti) (G) tekutiny mezi dvěma

elektrodami podle vzorce:

k =

æ d ö

G × ç ÷ = G × K ,

è A ø

v němž značí:


G – konduktanci v siemensech;

d – vzdálenost mezi elektrodami v centimetrech;

A – plochu vodivých elektrod v centimetrech čtverečných;

K – konstantu cely v reciprokých centimetrech, která je

shodná s poměrem d/A.

Rezistivita (měrný elektrický odpor) (r) tekutiny se vyjadřuje

v ohmcentimetrech (W ∙ cm) a je reciprokou hodnotou

konduktivity podle vzorce:

1 1 R

r = = = ,

k G × K K

v němž značí:

r – rezistivitu v ohmcentimetrech;


G – konduktanci v siemensech;

R – odpor v ohmech, která je reciprokou hodnotou konduktance

(G);

K – konstantu cely v reciprokých centimetrech.

ZAŘÍZENÍ

Měření konduktivity se skládá ze stanovení odporu tekutiny

mezi nebo v okolí elektrod vodivostního senzoru. Základním

přístrojovým vybavením při měření odporu je obvod

měřící odpor a vodivostní senzor, které jsou obvykle propojené

kabelem, pokud je senzor oddělen od uživatelského

rozhraní.

Měření odporu se provádí působením střídavého napětí nebo

proudu (AC, střídavý elektrický proud, kdy dochází

k pravidelné změně směru průtoku elektrického náboje) na

elektrody, měřením proudu (nebo napětí) a výpočtem odporu

na základě Ohmova zákona. Střídavý zdroj se používá, aby

nedocházelo k polarizaci (shromažďování iontů) elektrod.

Podle použitého přístroje se automaticky nastaví frekvence

měření v závislosti na podmínkách měření, přičemž do měřicího

systému může být zařazeno více obvodů měřících

odpor. Tyto obvody mohou být součástí vysílače nebo senzoru

měřicího systému.

Vodivostní senzor se skládá nejméně ze dvou elektrických

vodičů stálých rozměrů a geometrie, oddělených elektrickým

izolátorem. Elektrody, izolátor a jakékoliv další ponořené

části jsou vyrobeny z materiálů nereagujících s tekutinou,

se kterou mohou přijít do kontaktu. Také senzory musí být

konstruovány tak, aby byly schopné odolat okolním podmínkám

(pracovní nebo okolní teplota, tlak, čištění).

Většina vodivostních senzorů je vybavena teplotními sondami

(čidly), jako je platinové odporové teplotní čidlo

(RTD) nebo termistor s negativní teplotní závislostí (NTC

termistor), zabudovanými do senzoru, i když vnější teplotu

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


152 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.38 KONDUKTIVITA

je možné měřit. Měření teploty se provádí kvůli kompenzaci

teploty při měření konduktivity.

STANOVENÍ KONSTANTY VODIVOSTNÍ CELY

Konstanta vodivostní cely se stanovuje kvůli normalizaci

měření konduktance (nebo odporu) pro zařízení se dvěma

elektrodami.

Konstanta cely se stanoví ponořením vodivostního senzoru

do roztoku o známé konduktivitě. Roztoky o známé konduktivitě

se připraví podle specifických předpisů národních autorit

nebo se použijí komerčně dostupné certifikované referenční

roztoky, jejichž konduktivita je v rozmezí 5 μS ∙ cm –1

až 200 000 μS ∙ cm –1 v závislosti na požadované úrovni přesnosti.

Alternativně se může konstanta vodivostní cely určit

porovnáním s jinými referenčními měřicími systémy (také je

dostupný akreditovaný kalibrační servis).

(POZNÁMKA: závislost konduktivity na koncentraci není

přesně lineární.)

Naměřená konstanta cely vodivostního senzoru musí být

v rozmezí 5 % od jmenovité hodnoty uvedené v certifikátu

senzoru, pokud není předepsáno jinak.

U moderních vodivostních senzorů se obvykle konstanta

cely nemění po celou dobu jejich životnosti. Pokud se při

kalibraci zjistí změna konstanty, je vhodné vyčistit senzor

podle návodu výrobce a pak kalibraci zopakovat. Někdy se

může objevit „paměťový efekt“, zvláště při změnách z vysokých

na nízké koncentrace, jestliže senzor nebyl dobře

opláchnutý.

KALIBRACE TEPLOTY

K dodatečnému ověření konstanty cely senzoru musí být

zabudované teplotní čidlo (nebo externí teplotní čidlo)

vhodně kalibrováno pro dané použití, aby se mohl použít

přesný algoritmus kompenzace teploty. Přesnost teploty,

která je požadována, závisí na kritičnosti teploty při použití.

Obvykle postačuje přesnost ±1 °C.

KALIBRACE MĚŘICÍHO ELEKTRONICKÉHO

ZAŘÍZENÍ

Měřicí obvod systému je v podstatě zařízení měřicí AC odpor.

Pro měřicí systém s přenosem signálu analogovým kabelem

se požaduje vhodné ověření a/nebo kalibrace měřicího

obvodu. Toho je dosaženo odpojením měřicího obvodu

od elektrod senzoru, připojením sledovatelných odporů

o známé hodnotě stejným kabelem z měřicího systému

k měřenému obvodu a ověřením, že naměřený odpor odpovídá

hodnotě známého odporu s přijatelnou tolerancí. Typické

kritérium přijatelnosti pro přesnost odporu je pod 2 %

pro odpory vyšší než 100 W a pro nižší odpory vzroste na

5 %. Nicméně je doporučeno, aby bylo použité kritérium

vhodné pro měření s požadovanou přesností.

Pro vodivostní systém, ve kterém nemůže být měřicí obvod

odpojen od elektrod (např. pokud je měřicí systém a elektrody

v jednom společném plášti), může být obtížné přesně

nastavit nebo ověřit přesnost obvodu, v závislosti na konstrukci

senzoru. Alternativní metodou pro ověření integrity

měřicího systému je systém kalibrace podle postupu pro

stanovení konstanty cely pro každý měřicí obvod, který je

určen k použití.

Jestliže ověření/kalibrace konstanty cely, teplotního čidla

a měřicího obvodu je prováděno ve stejném servisním intervalu,

je doporučeno provést nejdříve ověření měřicího obvodu,

pak teplotního čidla a nakonec ověření konstanty cely. Protože

všechny tyto parametry jsou obvykle velmi stabilní díky moderním

elektronickým zařízením a stabilní konstrukci senzorů,

není požadována častá kalibrace (např. každodenní). Porovnání

s kvalifikovaným referenčním systémem je také vhodným

způsobem kalibrace. Kalibrace se provádí ve vhodných intervalech

stanovených systémem jištění jakosti.

KOMPENZACE TEPLOTY

Protože konduktivita tekutiny je závislá na teplotě, je nezbytné

provádět při měření konduktivity kompenzaci teploty,

pokud není předepsáno jinak (např. čištěná voda, voda

pro injekci). Vhodným algoritmem kompenzace teploty se

zajistí, že změny zaznamenané při měření konduktivity se

odrazí ve změnách koncentrace a ne ve změnách teploty.

Měření konduktivity se obvykle provádí při 25 °C. Pro lineární

kompenzaci teploty se obecně používá teplotní

koeficient podle následujícího vzorce:

v němž značí:

k =

25

[ 1+

a( T - 25)

]

κ25 – konduktivitu kompenzovanou na 25 °C;

κT – konduktivitu při teplotě T;

α – koeficient tepelné vodivosti;

T – teplotu měření.

Koeficient tepelné vodivosti 2,1 % na stupeň Celsia se běžně

používá pro mnoho roztoků solí. Většina solných roztoků

má koeficienty tepelné vodivosti v rozmezí 1,9 % až

2,2 % na stupeň Celsia. V závislosti na tekutém vzorku

mohou být vhodné i jiné způsoby kompenzace teploty. Data

nelineární teplotní kompenzace pro různé roztoky jsou široce

dostupné, např. je popisuje norma ISO 7888 Jakost

vod – Stanovení elektrické konduktivity. V případech velmi

nízké konduktivity (pod 10 μS ∙ cm –1 ), jakou má např. čištěná

voda pro farmaceutické použití, je třeba provézt dvě

kompenzace. Jednu pro vlastní konduktivitu vody a druhou

pro ostatní druhy iontů ve vodě. Tyto kompenzace jsou obvykle

sloučeny a začleněny do mikroprocesorem řízených

systémů měření konduktivity. Avšak nejsou součástí všech

dodávaných technologií pro měření konduktivity.

MĚŘENÍ KONDUKTIVITY TEKUTIN

Pro jednorázové off-line měření se senzor očistí měřenou

tekutinou a pak se do ní ponoří. Zajistí se, aby poloha senzoru

v nádobě neovlivňovala měření konduktivity, jelikož

stěny nádob mohou při určitém uspořádání elektrod ovlivnit

měření. Zaznamená se teplota a teplotně kompenzovaná

konduktivita.

Pro kontinuální on-line a at-line měření se čistý senzor

umístí do trubice, tanku nebo jiné nádoby a opláchne se,

pokud je to nutné. Provede se správný postup instalace, aby

se předešlo tvorbě bublin a shlukování částic v okolí elektrod.

Zajistí se, aby poloha senzoru v trubici nebo tanku neovlivňovala

měření konduktivity, protože umístění elektrod

v blízkosti povrchů může ovlivnit měření. Zaznamená se

teplota a teplotně kompenzovaná konduktivita.

Pro jednorázové i kontinuální měření se zajistí, aby všechny

ponořené části senzoru byly kompatibilní s měřenou tekutinou

a s teplotou měření.

k

T

,

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 153

2.2.39 STANOVENÍ DISTRIBUCE MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ V DEXTRANU

2.2.39 STANOVENÍ DISTRIBUCE

MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ

V DEXTRANU

6.0:20239

Distribuce (zastoupení) jednotlivých molekulových hmotností

v dextranu se stanoví metodou vylučovací chromatografie

(2.2.30).

Zkoušený roztok. 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v mobilní

fázi a zředí se jí na 10 ml.

Značkovací roztok. 5 mg glukosy R a 2 mg dextranu

V0 CRL se rozpustí v 1 ml mobilní fáze.

Kalibrační roztoky. Odděleně se rozpustí vždy v 1 ml mobilní

fáze 15 mg dextranu 4 pro kalibraci CRL, 15 mg dextranu

10 pro kalibraci CRL, 20 mg dextranu 40 pro kalibraci

CRL, 20 mg dextranu 70 pro kalibraci CRL a 20 mg

dextranu 250 pro kalibraci CRL.

Roztok pro test způsobilosti. Rozpustí se buď 20 mg dextranu

40 pro test způsobilosti CRL (pro dextran 40), nebo

20 mg dextranu 60/70 pro test způsobilosti CRL (pro dextran

60 a dextran 70) v 1 ml mobilní fáze.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

– kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm, naplněné

agarosou síťovanou pro chromatografii R, nebo do série

spojených kolon délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm

naplněných polyetherovým hydroxylovaným gelem pro

chromatografii R;

– mobilní fáze připravené ze 7 g síranu sodného bezvodého

R a 1 g chlorbutanolu R v 1 litru vody R; průtoková

rychlost je 0,5 ml/min až 1 ml/min se udržuje konstantní

±1 % za hodinu;

– diferenčního refraktometru jako detektoru;

– dávkovací smyčky 100 µl až 200 µl.

Teplota systému se udržuje konstantní (±0,1 °C).

KALIBRACE CHROMATOGRAFICKÉHO SYSTÉMU

Nastříkne se opakovaně zvolený objem značkovacího roztoku.

Chromatogram ukáže dva píky, z nichž první odpovídá

dextranu V0 CRL a druhý glukose R. Z elučního objemu

píku dextranu V0 se vypočítá volný objem V0 a z elučního

objemu píku glukosy se vypočítá celkový objem Vt.

Nastříkne se zvolený objem každého z kalibračních roztoků.

Zakreslí se pečlivě základní linie každého z chromatogramů.

Každý chromatogram se rozdělí na p (nejméně šedesát)

stejně velkých vertikálních úseků (odpovídajících

stejným elučním objemům). V každém úseku i odpovídajícím

elučnímu objemu Vi se změří výška linie chromatogramu

yi nad základní linií a vypočítá se distribuční koeficient

Ki za použití vzorce:

v němž značí:

( Vi

-V0

)

( V -V

) ,

t

0

V0 – volný objem kolony stanovený pomocí píku dextranu

V0 CRL na chromatogramu značkovacího roztoku;

Vt – celkový objem kolony stanovený pomocí píku glukosy

R na chromatogramu značkovacího roztoku;

(1)

Vi – eluční objem úseku i na chromatogramu jednotlivých

kalibračních roztoků.

Provede se kalibrace za použití některé z následujících

metod.

Kalibrace grafická. S použitím vzorce (1) se vypočítá pro

každý dextran pro kalibraci distribuční koeficient Kmax odpovídající

maximální výšce linie chromatogramu. Hodnoty

Kmax se vynesou do grafu na semilogaritmický papír (na

osu x) proti deklarované molekulové hmotnosti odpovídající

maximální výšce linie chromatogramu (Mmax) každého

z dextranů pro kalibraci a glukosy. Získanými body se proloží

první kalibrační křivka, přičemž se extrapoluje z bodu

Kmax vypočítaného pro dextran 250 pro kalibraci CRL

k nejnižší vypočítané hodnotě K získané pro tuto CRL (viz

obrázek 2.2.39-1). Za využití této první kalibrační křivky se

pro každý chromatogram transformují všechny hodnoty Ki

na odpovídající molekulové hmotnosti Mi, čímž se získá

distribuce molekulových hmotností. Pro každý dextran pro

kalibraci se pomocí rovnice (3) uvedené níže vypočítá

průměrná molekulová hmotnost Mw. Jestliže se vypočítané

hodnoty Mw neliší o více než 5 % od hodnot deklarovaných

pro každý dextran pro kalibraci a průměrný rozdíl je

v rozmezí ±3 %, kalibrační křivka se může použít pro stanovení

distribuce molekulových hmotností. V opačném

případě se kalibrační křivka posune podél osy y a výše popsaný

postup se opakuje, až se vypočítané a deklarované

hodnoty Mw neliší o více než 5 %.

Kalibrace výpočtem křivky. Z rovnic (2) a (3) uvedených

níže se použitím vhodné metody 1 vypočítají hodnoty pro b1,

b2, b3, b4 a b5 tak, aby se hodnoty Mw pro dextrany pro kalibraci

lišily nejvýše o 5 % od hodnot deklarovaných a Mw

glukosy činila 180 ±2:

M i = b5

+ e

2 3

( b + b K + b K + b K )

kde značí:

p – počet úseků dělících chromatogramy;

yi – výšku chromatografické linie nad základní linií

v úseku i;

Mi – molekulovou hmotnost v úseku i.

4


Nastříkne se zvolený objem příslušného roztoku pro test

způsobilosti systému.

p

Průměrná molekulová hmotnost dextranu pro test způsobilosti

CRL. Vypočítá se průměrná molekulová hmotnost

Mw způsobem popsaným v odstavci Kalibrace chromatografického

systému za použití buď kalibrační křivky, nebo

hodnot b1, b2, b3, b4 a b5, získaných výše uvedeným způsobem.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže Mw je:

– 41 000 až 47 000 (dextran 40 pro test způsobilosti CRL);

– 67 000 až 75 000 (dextran 60/70 pro test způsobilosti CRL).

1

i

2

å( yiM

i )

i=

1

M w =

p

å yi

i=

1

i

,

3

i

(2)

(3)

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

Je vhodná iterativní metoda Gaussova-Newtonova modifikovaná Hartleyem (Hartley, O.: Tecnometrics, 3 (1961) a Nilsson, G., Nilsson,

K.: J. Chromat., 101 (1974) 137, nejlépe ve spojení s programem pro nelineární regresi.

154 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.40 SPEKTROSKOPIE V BLÍZKÉ INFRAČERVENÉ OBLASTI

– 190 000 až 230 000 (dextran 60/70 pro test způsobilosti

CRL).

Průměrná molekulová hmotnost 10% nízké frakce dextranu.

Pro 10% nízkou frakci dextranu, eluovanou v úseku m

a před ním, se vypočítá Mw podle vzorce:

kde m je dáno vzorci:

p

å( yiM

i )

i=

m

M w =

p

å yi

i=

m

,

(7)

Zkušební

metody

2.2

p æ p ö

÷

å y ç

i £ 0, 1

çå

yi

÷

i= 1 èi=

1 ø

(8)

Tečkovaná čára odpovídá extrapolované části křivky. Vodorovné

přímky v dolní části obrázku znázorňují šířku a polohu

chromatografické linie každého z dextranů pro kalibraci.

Obr. 2.2.39-1 Příklad kalibrační křivky

Průměrná molekulová hmotnost 10% vysoké frakce dextranu.

Pro 10% vysokou frakci dextranu eluovanou

pro úsek chromatogramu n se vypočítá Mw podle vzorce:

kde n je dáno vzorci:

å( yiM

i )

i=

1

M w =

n

å yi

i=

1

, (4)

v nichž značí:

p – počet úseků dělících chromatogram;

yi – výšku linie chromatogramu nad základní linií

v úseku i;


Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že Mw 10% vysoké

frakce dextranu je:

– 110 000 až 130 000 (dextran 40 pro test způsobilosti

CRL);

n

n æ p ö

÷

å y ç

i £ 0, 1

çå

yi

÷

i= 1 èi=

1 ø

n+

1 æ p ö

å yi

> 0,1 ç ÷

å yi

,

ç ÷

i= 1 èi=

1 ø

(5)

(6)

p æ p ö

å yi

> 0,1ç

å y ÷

i ,

ç ÷

i= m-1 èi=

1 ø

v nichž značí:

p – počet úseků dělících chromatogramy;

yi – výšku linie chromatogramu nad základní linií

v úseku i;


Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že Mw 10% nízké

frakce dextranu je:

– 6000 až 8500 (dextran 40 pro test způsobilosti CRL);

– 7000 až 11 000 (dextran 60/70 pro test způsobilosti

CRL).

DISTRIBUCE MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ

ZKOUŠENÉHO DEXTRANU

Nastříkne se zvolený objem zkoušeného roztoku a vypočítá

se Mw pro celkovou distribuci molekulových hmotností, Mw

pro 10% vysokou frakci dextranu a Mw pro 10% nízkou

frakci dextranu způsobem popsaným v odstavci Způsobilost

systému.

2.2.40 SPEKTROSKOPIE V BLÍZKÉ

INFRAČERVENÉ OBLASTI

8.0:20240

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR spektroskopie)

je metoda, která má široké a rozmanité uplatnění ve

farmaceutické analýze. Blízká infračervená oblast leží

v rozsahu 780 nm až 2500 nm (12 800 cm –1 až 4000 cm –1 ).

Absorpční pásy spekter v blízké infračervené oblasti odpovídají

převážně vyšším harmonickým vibracím a kombinacím

základních vibrací C-H, N-H, O-H a S-H ve střední infračervené

oblasti (MIR). Spektra obsahují kombinovanou

chemickou a fyzikální informaci a většinou může být tato

informace získána použitím vhodného matematického

zpracování naměřených dat. Intenzita absorpčních pásů

v blízké infračervené oblasti (NIR) je mnohem nižší, než je

intenzita jejich základních vibrací ve střední infračervené

oblasti (MIR). Protože absorptivity v blízké infračervené

oblasti mají nízké hodnoty, záření může pronikat až do

hloubky několika milimetrů, včetně pevných látek. Kromě

(9)

ČL 2017 – Dopl. 2020 155


toho je mnoho materiálů v blízké infračervené oblasti relativně

propustných, jako např. sklo.

Měření se může provádět přímo in situ ve vzorcích k doplnění

standardních zkušebních postupů. NIR měření se může

provádět nespojeně (off-line), připojeně (at-line) nebo spojeně

(in-line), a pro technologie analýzy procesu (process

analytical technology, PAT) také on-line (paralelně). Pro

identifikaci mohou být požadovány vhodné chemometrické

metody. Avšak pokud jsou splněna kritéria pro specifičnost

kvalitativní metody, lze použít pro chemickou identifikaci

nebo charakterizaci pevného stavu přímé porovnání neupraveného,

nebo předem upraveného spektra zkoušené chemické

látky se spektrem referenční látky.

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti má velmi široké

uplatnění pro chemické, fyzikální a procesní analýzy, např.:

Chemická analýza:

– identifikace léčivých a pomocných látek, lékových forem,

meziproduktů během výrobního procesu, chemických

látek (zkoumadel) a obalových materiálů;

– kvalifikace léčivých látek a pomocných látek, lékových

forem, meziproduktů během výrobního procesu a obalových

materiálů, včetně porovnání spekter od šarže k šarži

a posouzení změny dodavatele;

– kvantifikace léčivých látek v matrici vzorku, stanovení

chemických hodnot, jako je číslo hydroxylové, stanovení

absolutního obsahu vody, stanovení stupně hydroxylace

a kontrola obsahu rozpouštědel.

Fyzikální analýza:

– krystalická forma a krystalinita, polymorfie, solvatace,

velikost částic;

– rozpadavost, tvrdost;

– vlastnosti filmů.

Analýza procesu:

– monitorování jednotlivých operací, jako je syntéza, krystalizace,

mísení, sušení, granulace a potažení pro účely

kontroly procesů;

– kontrola a určení konečného bodu.

Měření v blízké infračervené oblasti jsou ovlivněna mnoha

chemickými a fyzikálními faktory, které jsou popsány dále.

Reprodukovatelnost a spolehlivost výsledků závisí na kontrole

těchto faktorů a měření jsou obvykle platná pouze pro

definovaný kalibrační model.

PŘÍSTROJE

Všechna NIR měření jsou založena na průchodu záření

vzorkem nebo povrchem vzorku a měření zeslabení (prošlého

nebo odraženého) paprsku. Spektrometry pro měření

spekter v blízké infračervené oblasti se skládají z vhodného

zdroje záření (např. vysoce stabilizovaná wolframová

a křemíková lampa), z monochromátoru nebo interferometru

a z detektoru. Jako monochromátory se obvykle

používají optoakustické laditelné filtry (AOTF), mřížky

nebo hranoly. NIR přístroje mají zpravidla jednopaprskové

uspořádání, nicméně některé přístroje používají vnitřní

standardizaci a mohou proto být dvoupaprskové (např.

přístroje s diodovým polem). Jako materiál detektoru se

např. používá křemík, sulfid olovnatý a arsenid gallitoinditý.

Přístroje jsou obvykle vybaveny standardním držákem

kyvet, někdy se používají sondy s optickým vláknem,

propustné ponorné cely, lahvičky z neutrálního borosilikátového

skla a otočné nebo posuvné držáky vzorku. Výběr

techniky závisí na dané aplikaci, zvláštní pozornost je

nutno věnovat přípravě vzorku podle jeho typu. Součástí

systému je obvykle zařízení pro sběr dat a vyhodnocení

(např. software a počítač).

Je běžné vyjadřovat vlnovou délku (λ) v nanometrech a vlnočet

(ν) v reciprokých centimetrech (cm -1 ), v závislosti na

metodě měření a přístroji. Přepočet mezi nm a cm -1 se provede

podle následujícího vzorce:

1

n cm

10 7

-1 = × l

METODY MĚŘENÍ

Transmisní měření. Transmitance (T) je mírou poklesu

intenzity záření prošlého vzorkem při dané vlnové délce.

Vzorek je v optickém paprsku umístěn mezi zdrojem

a detektorem. Toto uspořádání je u mnoha konvenčních

spektrometrů obdobné. Výsledné spektrum se může

odečítat přímo jako závislost transmitance (T) a/nebo

absorbance (A) (osa pořadnic y) na vlnové délce nebo

vlnočtu (osa úseček x).

T =

v němž značí:

Io – intenzitu dopadajícího záření;

I – intenzitu prošlého záření;

æ 1 ö æ I ö

= -log

T = log ç ÷ = log ç ÷ .

è T ø è I ø

Měření difuzní reflektance. Reflektance (R) je vyjádřením

poměru intenzity světla odraženého vzorkem (I) k intenzitě

světla odraženého pozadím nebo referenčním reflexním

povrchem (Ir). NIR záření může v závislosti na chemickém

složení a fyzikálních vlastnostech vzorku pronikat dostatečně

hluboko do vzorku, kde dochází k jeho absorpci

kombinačními a vyššími harmonickými vibracemi stanovované

látky. Neabsorbované záření je odráženo vzorkem na

detektor. NIR reflektanční spektra se obvykle získají vypočítáním

a vynesením závislosti log (1/R) (osa pořadnic y) na

vlnové délce nebo vlnočtu (osa úseček x).

v němž značí:

I – intenzitu světla difuzně odraženého vzorkem;

Ir – intenzitu světla odraženého pozadím nebo referenčním

reflexním povrchem;

æ 1 ö æ I

r ö

= log ç ÷ = log ç ÷ .

è R ø è I ø

Měření transflektance. Jedná se o kombinaci transmitance

s reflektancí. Při měření transflektance (T*) se použije zrcadlo

nebo difuzní reflexní povrch, aby se záření prošlé

vzorkem odrazilo zpět do vzorku a dráha paprsku se zdvojnásobila.

Neabsorbované záření se odráží zpět ze vzorku na

detektor. Výsledné spektrum se může odečítat přímo jako

závislost transflektance (T*) a/nebo absorbance (A*) (osa

pořadnic y) na vlnové délce nebo vlnočtu (osa úseček x).

I

I 0

,

,

nm

A

0

A R

R =

I

I r

.

156 ČL 2017 – Dopl. 2020


T * =

v němž značí:

I – intenzitu prošlého a odraženého záření měřeného se

vzorkem;

IT – intenzitu prošlého a odraženého záření referenčního

materiálu jako pozadí;

A* æ 1 ö æ I ö

= log ç ÷ = logç

T ÷ .

è T * ø è I ø

PŘÍPRAVA VZORKU/ZPŮSOB MĚŘENÍ

Příprava a způsob měření vzorku se mohou měnit

v závislosti na použité metodě. Pro všechny metody přípravy

vzorku je nutné splnit následující požadavky:

– optimalizace doby měření a počtu skenů pro optimalizaci

poměru signálu k šumu;

– nalezení nejvhodnějšího způsobu měření pro danou aplikaci

(měření transmise, difuzní reflektance nebo transflektance);

– nalezení nejlepší orientace vzorku (např. k minimalizaci

vlivu ražby na tabletách);

– výběr nejvhodnějšího příslušenství (např. transmisní kyvety,

nebo ponorné sondy);

– optimalizace délky dráhy paprsku při měření transmise

a transflektance;

– nalezení vhodného spektroskopického referenčního materiálu

(pozadí);

– prokázání spolehlivosti referenčního materiálu pro měření

pozadí v průběhu času, jeho stability a reprodukovatelnosti

měření pozadí;

– získání reprezentativního spektra (např. nastavením doby

měření, počtu skenů, sčítáním jednotlivých spekter, nebo

zvětšením šířky paprsku) při měření pohyblivých materiálů

nebo vzorků (měření související s výrobními procesy);

– zajištění prostupnosti senzoru, tj. zabránění např. hromadění

materiálu nebo kontaminaci;

– zdůvodnění podmínek měření (doba měření, velikost paprsku)

v závislosti na minimální velikosti vzorku.

V některých případech analýzy procesu není možné vyjmout

sondu pro změření referenčního pozadí, musí se proto

uvážit jiné možnosti, zahrnující vnitřní standardizaci,

měření pozadí druhým detektorem atd. Pouze spektra změřená

proti pozadí stejných optických vlastností se mohou

porovnávat přímo.

Transmisní měření. Měření transmitace (T) závisí na transmisním

spektru pozadí použitém pro výpočet. Pozadím může

být například vzduch, polymerová destička, prázdná kyveta,

rozpouštědlo (kontrolní roztok) nebo v některých případech

porovnávací vzorek. Tato metoda se používá převážně pro

měření kapalin (zředěných nebo nezředěných), disperzí, roztoků

a pevných látek (včetně tablet a tobolek). Měření transmitance

pevných látek vyžaduje použití vhodného příslušenství.

Vzorky kapalin se měří v kyvetě vhodné tloušťky (obvykle

0,5 mm až 4 mm) propustné pro záření v blízké infračervené

oblasti, nebo po ponoření sondy s optickým vláknem

ve vhodném uspořádání.

I

I

T

,

Měření difuzní reflektance. Tato metoda se používá převážně

pro měření pevných látek. Vzorky se měří přímo nebo

ve vhodném zařízení (např. držák vzorku), nebo přímým

kontaktem se sondou s optickým vláknem. Při monitorování

procesů se materiál může analyzovat přes leštěné okénko

na rozhraní (např. safír) nebo za použití in-line sondy

s optickým vláknem. Musí se zajistit maximální možná reprodukovatelnost

podmínek měření pro jednotlivé vzorky.

Záření odražené materiálem použitým jako pozadí se zaznamená

pro získání základní linie a potom se změří reflektance

jednoho nebo více měřených analytických vzorků.

Jako pozadí se obvykle používají keramické disky, termoplastické

pryskyřice a zlato, nebo lze použít i jiné vhodné

materiály.

Měření transflektance. Tato metoda se používá převážně

pro měření kapalin, suspenzí a čirých plastových materiálů.

Odrazový reflektor se umístí za vzorkem, takže zdvojnásobuje

dráhu paprsku. Toto uspořádání se může použít

pro měření reflektance a měření sondou s optickým vláknem,

je-li geometrie přístroje taková, že zdroj a detektor

jsou na stejné straně vzorku. Vzorek se umístí v kyvetě se

zrcadlem nebo jiným vhodným difuzním reflektorem z kovu

nebo inertní látky (např. oxid titaničitý), která neabsorbuje

v blízké infračervené oblasti. Kapaliny se mohou také

měřit za použití in-line sondy pro měření transflektance.

FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ SPEKTRÁLNÍ ODEZVU

Okolní prostředí. Před zahájením měření se musí vzít

v úvahu teplota a vlhkost okolí.

Plocha pro prezentaci vzorku. Před měřením se musí plocha

pro prezentaci vzorku nebo konec sondy očistit od

zbytků. Podobně by na rozhraní vzorku (in-line nebo on-

-line) neměl být zjevně nahromaděný produkt nebo kontaminace

ovlivňující požadované měření.

Teplota vzorku. Vliv teploty je důležitý především při měření

vodných roztoků a mnoha kapalin, neboť rozdíl několika

stupňů může způsobit měřitelné změny spekter, které

mohou podstatně ovlivnit analýzu. Vliv teploty je třeba brát

v úvahu také při měření pevných látek a prášků obsahujících

vodu.

Vlhkost a zbytková rozpouštědla. Vlhkost a zbytky rozpouštědel

ve vzorku mohou způsobit vznik výrazných absorpčních

pásů v NIR oblasti.

Tloušťka vzorku. Je známo, že tloušťka vzorku je zdrojem

změn ve spektru a musí být posouzena a/nebo kontrolována,

zvláště pro měření transmitance při analýze tablet a tobolek.

Pro měření stlačených prášků se „nekonečné“ tloušťky

obvykle dosahuje při tloušťce vzorku větší než 5 mm

(např. v lahvičce).

Optické vlastnosti vzorku. U pevných látek je nutno vzít

v úvahu rozptyl záření jak na povrchu, tak uvnitř vzorku.

Pro spektra fyzikálně, chemicky nebo opticky heterogenních

vzorků je někdy třeba zvětšení velikosti paprsku, případně

změření většího počtu vzorků, nebo otáčení sondy,

aby se získalo reprezentativní spektrum. Některé faktory

jako rozdíly v kompaktnosti nebo velikosti částic v práškových

materiálech nebo úprava povrchu vzorku mohou způsobit

významné změny ve spektru.

Formy pevného stavu. Rozdíly ve formách pevného stavu

(polymorfní látky, hydráty, solváty a amorfní formy) ovliv-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 157


ňují vibrační spektra. Proto se mohou u pevných látek na

základě spekter v blízké infračervené oblasti rozlišit jejich

různé krystalické formy, včetně formy amorfní. Vyskytuje-

-li se látka v několika krystalických formách, musí se zajistit,

aby kalibrační vzorky měly formy distribuovány podle

požadované aplikace odpovídající danému účelu.

Stáří vzorků. Chemické, fyzikální nebo optické vlastnosti

vzorků se mohou během času měnit. V závislosti na podmínkách

skladování mohou pevné vzorky buď absorbovat,

nebo desorbovat vodu a část amorfního materiálu může krystalizovat.

Sada kalibračních vzorků pro NIR kalibraci by měla

být dostatečně reprezentativní, aby zahrnovala variabilitu

budoucích měřených vzorků a změny jejich matrice.

PŘEDBĚŽNÁ ÚPRAVA SPEKTRÁLNÍCH DAT

V mnoha případech, zvláště při měření reflektance, je vhodné

před vytvořením klasifikačního nebo kalibračního modelu

provést matematickou úpravu spektra. Cílem může být např.

redukce změn v základní linii, zmenšení vlivu změn známých

proměnných, které interferují v následných matematických

modelech, nebo zjednodušení dat před použitím.

V některých případech se může také provést normalizace

spekter nebo korekce rozptylu, např. použitím transformace

Standardní normální proměnná (SNV). Předběžné úpravy

spektrálních dat mohou zahrnovat např. vyjmutí části spektra

a redukci šumu a výpočet první nebo druhé derivace spektra.

Výpočet derivací vyššího řádu se nedoporučuje z důvodu

zvýšení spektrálního šumu.


Přístroj je nutno používat podle pokynů výrobce a v pravidelných

intervalech provádět předepsaná ověřování týkající

se použití přístroje a aplikací. Pro in-line a on-line aplikace

se musí ověřit použití alternativního způsobu kontroly správné

funkce přístroje. Např. se použijí standardy zabudované

v přístroji nebo oddělené sondy/kanály, aby se prokázala

způsobilost přístroje (trvání použitelnosti).

Před skenováním vzorku se může požadovat provedení testů

způsobilosti systému a musí se přezkoušet vlastnosti přístroje,

které by mohly ovlivnit konečné měření (obvykle fotometrický

šum a správnost vlnové délky). Interval, ve kterém

se ověření správné funkce přístroje provádí, se musí

posoudit s ohledem na odhadované riziko v závislosti na

typu přístroje a jeho umístění. Např. přístroje umístěné

v drsných podmínkách, kde je kolísaní teploty a vlhkosti,

mohou potřebovat častější provádění testu způsobilosti. Také

je třeba uvážit případy, kdy měřicí systém (např. in-line

sonda nebo průtoková kyveta) nelze vyjmout. Některá příslušenství

jsou navržena podle požadavků zákazníka, a proto

je třeba odpovídající přezkoušení způsobilosti systému.

Ověření a kalibrace stupnice vlnových délek nebo vlnočtů

(neprovádí se u přístrojů s filtrem). Pro ověření použité

stupnice vlnových délek, obvykle v rozsahu 780 nm až

2500 nm (12 800 cm –1 až 4000 cm –1 ) nebo v určeném spektrálním

rozsahu, se použije vhodný standard (nebo několik

standardů) s charakteristickými maximy nebo minimy vlnových

délek, v nichž se provádí měření. Vhodnými referenčními

materiály jsou např. dichlormethan R, mastek R,

lampy s referenčními vlnovými délkami nebo směs oxidů

vzácných zemin. Lze také použít jiné vhodné standardy.

Zaznamená se spektrum a změří se poloha nejméně tří pásů

rozložených v celém použitém rozsahu. Pro oxidy vzácných

zemin poskytuje vhodné referenční materiály Národní

ústav pro standardy a technologie (National Institute of

Standards and Technology; NIST). Přístroje s Fourierovou

transformací (FT) mají lineární rozsah frekvencí, proto je

postačující certifikace vlnové délky na jednu frekvenci.

Ověření a kalibrace fotometrické linearity. Použije se sada

transmisních nebo reflexních standardů, pro které jsou

známy hodnoty transmitance nebo reflektance v procentech.

Pro měření reflektance jsou dostupné standardy polymerů

obohacených uhlíkem. Zajistí se, aby absorbance použitých

materiálů odpovídaly danému lineárnímu pracovnímu

rozsahu metody. K následnému ověření fotometrické

linearity lze jako referenční hodnoty použít počáteční zjištěné

hodnoty absorbancí. Nelineární kalibrační modely

a tudíž i nelineární odezvy jsou přípustné s prokázaným

souhlasem uživatele. Spektra standardů reflektance a transmitance

vykazují variabilitu způsobenou rozdílem v experimentálních

podmínkách, za kterých byly kalibrovány výrobcem,

a v podmínkách, za kterých jsou následně používány.

Proto hodnoty reflektance v procentech udávané pro

sadu kalibračních standardů nemusí být vždy vhodné pro

provedení „absolutní“ kalibrace pro daný přístroj. Avšak po

dobu, po kterou se standardy chemicky nebo fyzikálně nemění

a pokud se použije stejné referenční pozadí, které bylo

použito pro získání certifikovaných hodnot, dávají následná

měření stejných standardů za stejných podmínek,

včetně přesného polohování vzorku, informaci o dlouhodobé

stabilitě fotometrické odezvy. Pro dlouhodobou stabilitu

je přijatelná tolerance ±2 %; provádí se pouze, pokud se

používají spektra bez předběžné úpravy.

Doporučení pro podmínky použité při kontrole způsobilosti

přístroje pro různé způsoby měření jsou shrnuty v tabulce

2.2.40-1.

KVALITATIVNÍ ANALÝZA

(IDENTIFIKACE A CHARAKTERIZACE)

Vytvoření knihovny referenčních spektrálních dat.

Zaznamenají se spektra vhodného počtu reprezentativních

vzorků látky známé totožnosti vykazujících změny typické

pro zkoušenou látku (např. fyzikální forma, velikost částic

apod.). Knihovny se sestavují za použití reprezentativních

vzorků za daných okolních podmínek. Sada spekter představuje

informaci, kterou lze použít pro identifikaci zkoušeného

vzorku.

Soubor spekter uložených v knihovně může mít různou

formu v závislosti na matematickém zpracování použitém

při identifikaci. Mohou to být:

– všechna jednotlivá spektra reprezentující látku;

– průměrné spektrum z měřených šarží každé chemické

látky;

– popis variability spektra látky, je-li třeba.

Počet látek v databázi závisí na dané aplikaci. Všechna

spektra v knihovně mají stejné:

– spektrální rozsahy a počty datových bodů;

– techniky měření;

– zpracování dat.

Pokud se tvoří podskupiny, výše uvedená kritéria se použijí

nezávisle pro každou skupinu. Podskupiny se jednotlivě validují.

Původní spektrální data pro vytvoření spektrální

158 ČL 2017 – Dopl. 2020


Tab. 2.2.40-1 Kontrola způsobilosti přístroje

Způsob měření Odraz/reflexe Transflektance Transmise

Ověření stupnice vlnových

délek (neprovádí se

u přístrojů s filtrem).

Laboratorní/mobilní

zařízení

Provozní přístroj

Typické přijatelné tolerance pro shodu se standardními hodnotami jsou:

±1,0 nm při 780 nm (±16 cm –1 při 12800 cm –1 );

±1,0 nm při 1200 nm (±8 cm –1 při 8300 cm –1 );

±1,0 nm při 1600 nm (±6 cm –1 při 6250 cm –1 );

±1,5 nm při 2000 nm (±4 cm –1 při 5000 cm –1 );

±1,5 nm při 2500 nm (±2 cm –1 při 4000 cm –1 ).

Pro každý použitý pás referenčního materiálu se použijí výše uvedené tolerance pro nejbližší

vlnovou délku nebo vlnočet. U přístrojů s diodovým polem dosahuje rozlišení (vlnová délka

mezi pixely) nejčastěji hodnoty 10 nm/pixel. Toto rozlišení se musí upravit tak, aby bylo

v souladu se spektrálním rozlišením. Pro správnost vlnové délky jsou rozhodující algoritmy

pro nalezení píků a při jejich použití je prakticky přijatelná tolerance ±2 nm. Alternativně se

použijí kritéria přijatelnosti dle specifikace výrobce.

Měří se s mastkem R ve

vhodném médiu nebo pomocí

sond s optickým vláknem.

Mastek R je vhodný ke kalibraci,

neboť má charakteristické

pásy při 948 nm, při

1391 nm a při 2312 nm.

Alternativně se pro ověření

správnosti vlnových délek

mohou použít jiné standardy,

vhodné pro oblast vlnových

délek, ve které se provádí

měření. Např. pokud je vestavěn,

měří se vnitřní standard

polystyrenu, nebo NIST

standard či jiný ověřitelný

materiál a pro kalibraci se

vyhodnotí tři pásy rozložené

v celém použitém rozsahu

vlnových délek.

Suspenze vysušeného oxidu

titaničitého R (1,2 g) v asi

4 ml dichlormethanu R se

měří přímo v kyvetě nebo za

použití sondy. Oxid titaničitý

neabsorbuje v NIR oblasti.

Spektra se zaznamenají

s největší nominální šířkou

pásu přístroje 10 nm při

2500 nm (16 cm –1 při

4000 cm –1 ). Dichlormethan

má charakteristické ostré pásy

při 1155 nm, 1366 nm,

1417 nm, 1690 nm, 1838 nm,

1894 nm, 2068 nm a 2245 nm.

Pro kalibraci se vyberou tři

pásy rozložené v celém

použitém rozsahu vlnových

délek. Mohou se též použít

jiné vhodné standardy, jako je

tekutý transflektanční

standard smíchaný s oxidem

titaničitým nebo jiným

reflexním médiem.

Může se použít dichlormethan

R; má charakteristické

ostré pásy při 1155 nm,

1366 nm, 1417 nm, 1690 nm,

1838 nm, 1894 nm, 2068 nm

a 2245 nm.

Pro kalibraci se vyberou tři

pásy rozložené v celém použitém

rozsahu vlnových

délek. Mohou se též použít

jiné vhodné standardy.

Pokud není prakticky možné měřit ověřitelný referenční materiál v místě měření vzorku, použije

se vnitřní standard, např. polystyren, skleněné vlákno nebo rozpouštědlo a/nebo vodní pára.

Alternativně lze připojit i druhý kanál/sondu.

Pro FT přístroje může být provedena kalibrace stupnice vlnových délek za použití úzkého izolovaného

pásu voda-vodní pára, např. pásu 7306,74 cm –1 , 7299,45 cm –1 , 7299,81 cm –1 nebo

úzkého pásu certifikovaného referenčního materiálu.

Zkušební

metody

2.2

Ověření opakovatelnosti

vlnových délek (neprovádí

se u přístrojů s filtrem)


zařízení


Směrodatná odchylka vlnových délek je v souladu se specifikacemi výrobce přístroje, pokud

není vědecky zdůvodněno jinak.

Opakovatelnost vlnových délek se ověří za použití vhodného vnějšího nebo vnitřního standardu.

Opakovatelnost vlnových délek se ověří za použití vhodného vnějšího nebo vnitřního standardu.

ČL 2017 – Dopl. 2020 159


Tab. 2.2.40-1 Pokračování

Způsob měření Odraz/reflexe Transflektance Transmise

Ověření fotometrické linearity

a stability odezvy 1


zařízení


Měří se absorbance čtyř fotometrických standardů rozložené v celém rozsahu pracovní metody.

Použijí se čtyři reflektanční

standardy v rozsahu 10 % až

99 %, např. 10 %, 20 %,

40 % a 80 %. Někdy je

vhodné použít 2 % standard.

Vynese se závislost změřených

hodnot absorbance proti

referenčním hodnotám absorbance

a provede se např.

lineární regrese. Přijatelné

tolerance jsou 1,00 ±0,05 pro

směrnici a 0,00 ±0,05 pro

úsek na souřadné ose pro

první ověření fotometrické

linearity přístroje. Pro následná

ověření fotometrické

linearity se mohou použít

počáteční hodnoty zjištěných

absorbancí jako porovnávací

hodnoty.

Pro měření transflektance se

použijí vhodné reflektanční

nebo transmitanční standardy

a kritéria.

Použijí se čtyři transmitanční

standardy, aby se pokryly

hodnoty absorbancí v celém

pracovním rozsahu hodnot

absorbancí v modelu. Vynese

se závislost změřených hodnot

absorbance proti referenčním

hodnotám absorbance,

a provede se např. lineární

regrese. Přijatelné tolerance

jsou 1,00 ±0,05 pro

směrnici a 0,00 ±0,05 pro

úsek na souřadné ose pro

první ověření fotometrické

linearity přístroje. Pro následná

ověření fotometrické

linearity se mohou použít

počáteční hodnoty zjištěných

absorbancí jako porovnávací

hodnoty.

Pokud reflektance a transmitance standardu nemůže být měřena ve stejném místě jako vzorek,

použijí se fotometrické standardy zabudované v přístroji.

Pro ověření fotometrické linearity provozního přístroje lze použít vnitřní fotometrické standardy.

V takovém případě se ověří tolerance dané výrobcem.

Ověření fotometrického

šumu 1


zařízení


Pro měření fotometrického šumu se použije ve vhodném fotometrickém rozsahu spektra

vhodný standard reflektance, např. bílá reflexní keramická destička nebo standardy polymerů

obohacených uhlíkem. Postupuje se podle návodu a specifikací výrobce.

Měří se reflektance standardu, který má nízkou

odrazivost (low flux standard), např. 5 %

nebo 10 % standardu polymeru obohaceného

uhlíkem ve vhodném rozsahu vlnových délek

podle pokynů výrobce a vypočítá se fotometrický

šum jako rozdíl maximální

a minimální hodnoty.

Jak je uvedeno výše nebo, pokud to není

prakticky možné, použije se ke zkoušení

šumu standard zabudovaný v přístroji

a specifikace výrobce.

Měří se transmitance standardu, který má vysokou

odrazivost (high flux standard), např.

90 % nebo 99 % standardu polymeru obohaceného

uhlíkem ve vhodném rozsahu vlnových

délek/vlnočtů podle pokynů výrobce

a vypočítá se fotometrický šum jako rozdíl

maximální a minimální hodnoty.

Jak je uvedeno výše, nebo pokud to není

prakticky možné, použije se ke zkoušení

šumu standard zabudovaný v přístroji

a specifikace výrobce.

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1

Ověření fotometrické linearity a Ověření fotometrického šumu nejsou vyžadována pro přístroje, na kterých se provádějí metody pro jednoduché

identifikace, při kterých se nepoužívají fotometrické absorbance jako část strategie modelu (např. jednoduchá korelace s absorbujícími

vlnovými délkami).

160 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.41 CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS

knihovny se musí archivovat. Při provádění jakékoliv matematické

úpravy musí být věnována pozornost tomu, aby

nedošlo k nežádoucím změnám, jelikož by základní informace

(důležité pro kvalifikaci metody) mohly být ztraceny.

Způsobilost použitého algoritmu by měla být prokázána

úspěšnou validací metody a důvody pro použití úpravy musí

být ve všech případech doloženy.

Přímé porovnání spektra látky s referenčním spektrem.

Kde to dovoluje specifičnost metody, nevyžaduje se pro

účely kvalitativní chemické nebo fyzikální identifikace použití

referenční spektrální knihovny pro přímé porovnání

reprezentativního spektra zkoušené látky se spektrem referenční

látky.

Vyhodnocování dat. Přímé porovnání reprezentativního

spektra zkoušené látky se spektrem referenční látky se provádí

s jednotlivými nebo průměrnými referenčními spektry

všech látek v databázi na základě jejich matematické korelace

nebo jiných vhodných algoritmů. S algoritmem se pro

klasifikaci může použít sada známých referenčních průměrných

spekter a variabilita tohoto průměru; případně se

provede vizuální porovnání spekter, pokud je doložena specifičnost.

Používají se různé algoritmy, jako je analýza základních

složek (principal component analysis, PCA),

klastrová analýza, a nezávislé modelování podle analogie

tříd (soft independent modelling by class analogy, SIMCA).

Spolehlivost algoritmu vybraného pro daný účel se má validovat

následujícím způsobem.

Validace modelu. Metody identifikace používající přímé

spektrální porovnání musí být validovány v souladu s postupem

validací identifikačních metod.

Validační parametry pro kvalitativní metody jsou robustnost

a specifičnost.

LIMITNÍ ANALÝZA

Relativní porovnání spekter. Kalibrace se nevyžaduje,

pokud se porovnává soubor spekter pro účely limitní analýzy,

jako je maximální nebo minimální absorbance, při které

zkoušená látka absorbuje. Také při kontrole konečného bodu

sušení lze použít kvalitativní přístup pro určitou absorbující

vlnovou délku. Vhodnost spektrálních rozsahů

a úpravy spekter (jsou-li použity) se musí pro daný účel

prokázat.

Specifičnost. Relativní rozlišení limitní zkoušky se musí

prokázat. Rozsah zkoušení specifičnosti závisí na aplikaci

a rizicích, která se kontrolují. Změny v koncentracích matrice

v operačním rozsahu metody nesmí významně ovlivnit

měření.

ANALÝZA TRENDU

Relativní porovnání spekter. Pokud se porovnává soubor

spekter pro účely analýzy vývoje sledovaného procesu,

není kalibrace nezbytně nutná, např. pro stanovení statistických

parametrů, jako je průměr, medián a směrodatná

odchylka, se použije metoda „moving block“. Tento

postup se používá pro analýzu dat např. při monitorování

stejnoměrnosti mísení za použití NIR spektroskopie. Pro

analýzy trendu musí být použity vhodné spektrální rozsahy

a algoritmy.

Specifičnost. Relativní rozlišení pro analýzu trendu musí

být prokázáno. Rozsah zkoušení specifičnosti závisí na

aplikaci a rizicích, která se kontrolují. Změny v koncentracích

matrice v operačním rozsahu metody nesmí významně

ovlivnit měření.


Vytvoření knihovny referenčních spektrálních dat pro

kalibrační model. Kalibrace je proces vytvoření matematického

modelu, který dává do souvislosti odezvu z analytického

přístroje a vlastnosti vzorků. Může se použít jakýkoliv

kalibrační algoritmus, který je jasně definován přesným

matematickým vyjádřením a poskytuje vhodné výsledky.

Zaznamenají se spektra vhodného počtu reprezentativních

vzorků se známými nebo v budoucnu stanovenými

hodnotami obsahu v měřeném rozsahu (např. obsah

vody). Počet vzorků pro kalibraci závisí na složitosti matrice

vzorku a interferencích (např. teplota, velikost částic

atd.). Všechny vzorky musí poskytnout kvantitativní výsledky

v intervalu kalibrace, který je definován pro daný

účel metody. Obvykle se používá násobná lineární regrese

(multiple linear regression, MLR), metoda částečných nejmenších

čtverců (partial least squares, PLS) a regrese základních

složek (principal component regression, PCR).

Pro PLS nebo PCR kalibrace se vynesou koeficienty a/nebo

hodnoty zatížení, a oblasti vysokých koeficientů se porovnají

se spektrem stanovované látky. Závislost předpokládané

zbytkové chyby sumy čtverců (PRESS) na počtu faktorů

je vhodným diagnostickým nástrojem pro usnadnění (nebo

zjednodušení) optimalizace počtu PCR nebo PLS faktorů.

Předběžná úprava dat. Výběr vlnové délky nebo vyloučení

určitých oblastí vlnových délek spektra může zvýšit přesnost

a robustnost kalibračních modelů. Pro data se může použít

komprese vlnových délek (průměrování vlnové délky).

Validační parametry modelu. Analytická kritéria přijatelnosti,

která jsou brána v úvahu při provádění validace NIR

metod, jsou podobná kritériím, která se vyžadují pro jakoukoliv

jinou analytickou metodu. Specifická kritéria přijatelnosti

pro každý parametr validace musí vyhovovat danému

použití metody. Validační parametry pro kvantitativní metody

jsou správnost, linearita, přesnost (opakovatelnost

a reprodukovatelnost), robustnost a specifičnost.

HODNOCENÍ TRVÁNÍ PLATNOSTI MODELU

Validované NIR modely je nutno průběžně hodnotit a provádět

monitorování validačních parametrů.

PŘENESENÍ DATABÁZE

Při přenesení databáze na jiný přístroj se musí vzít v úvahu

spektrální rozsah, počet datových bodů, spektrální rozlišení

a jiné parametry. Musí se použít další postupy a kritéria,

aby se prokázalo, že platnost modelu pro novou databázi

nebo jiný přístroj trvá.


6.0:20241

Jako cirkulární dichroismus se označuje rozdíl absorbancí

levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla

u opticky aktivní látky v oblasti jejího absorpčního pásu.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 161


Přímé měření poskytuje střední algebraickou hodnotu podle

vzorce:

DA = A L

- A R

,

v němž značí:

DA – diferenční cirkulárně dichroickou absorbanci;

AL – absorbanci levotočivě cirkulárně polarizovaného světla;

AR – absorbanci pravotočivě cirkulárně polarizovaného

světla.

Cirkulární dichroismus se vypočítá podle vzorce:

D e = e

L

- e

DA

= ,

c × l

v němž značí:

De – molární cirkulární dichroismus nebo molární diferenční

dichroickou absorptivitu vyjádřenou

v litrech ∙ mol –1 ∙ cm –1 ;

eL – molární absorptivitu (2.2.25) levotočivě cirkulárně polarizovaného

světla;

eR – molární absorptivitu pravotočivě cirkulárně polarizovaného

světla;

c – koncentraci zkoušeného roztoku v mol ∙ litr –1 ;

R

Vzájemný vztah mezi molární elipticitou a molárním cirkulárním

dichroismem udává následující rovnice:

4500

π

[ Q] = 2,303De

» 3300De

Molární elipticita se často používá při analýze bílkovin

a nukleových kyselin. V tomto případě se molární koncentrace

vyjadřuje jako monomerní zbytek vypočítaný pomocí

vzorce:

molekulová hmotnost

počet aminokyselin

Střední relativní molekulová hmotnost monomerního zbytku

je 100 až 120 (obvykle 115) pro bílkoviny a asi 330 pro

nukleové kyseliny (ve formě sodných solí).

Přístroj. Zdrojem světla (S) je xenonová lampa (viz obrázek

2.2.41-1); světlo prochází dvojitým monochromátorem

(M) s křemennými hranoly (P1, P2).

Lineární světelný paprsek z prvního monochromátoru se

štěpí na dvě složky, které jsou ve druhém monochromátoru

polarizovány v pravých úhlech. Výstupní štěrbina v monochromátoru

eliminuje mimořádný paprsek.

.

.

l

– tloušťku vrstvy v kyvetě v centimetrech.

K charakterizaci cirkulárního dichroismu se mohou používat

také následující veličiny:

Faktor nesymetrie:

e – molární absorptivita (2.2.25).

Molární elipticita:

g =

De

,

e

Některé typy přístrojů měří přímo hodnotu elipticity Q, vyjádřenou

ve stupních. Při použití těchto přístrojů se může

molární elipticita vypočítat pomocí následujícího vzorce:

[ Q]

Q × M

= ,

c × l ×10

v němž značí:

[Q] – molární elipticitu vyjádřenou

ve stupních ∙ cm 2 ∙ decimol –1 ;

Q – hodnotu elipticity odečtenou na přístroji;

M – relativní molekulovou hmotnost zkoušené látky;

c – koncentraci zkoušeného roztoku v g ∙ ml –1 ;

l – tloušťku vrstvy v kyvetě v centimetrech.

Získané polarizované monochromatické světlo prochází opticky

aktivním modulátorem (Cr); výsledkem je střídavé

cirkulárně polarizované světlo.

Paprsek pak prochází zkoušeným vzorkem (C) a dopadá na

fotonásobič (PM) spojený se zesilovačem, který produkuje

dva elektrické signály: jedním je stejnosměrný proud Vc

a druhým střídavý proud s modulační frekvencí Vac charakteristickou

pro zkoušený vzorek. Fáze udává znaménko cirkulárního

dichroismu. Poměr Vac/Vc je úměrný diferenční

absorpci DA, která vytvořila signál. Dichrograf běžně pracuje

v oblasti vlnových délek 170 nm až 800 nm.

Kalibrace přístroje

Přesnost stupnice absorbance. 10,0 mg isoandrosteronu R

se rozpustí v dioxanu R a zředí se stejným rozpouštědlem

na 10,0 ml. Spektrum cirkulárního dichroismu roztoku se

zaznamená v rozmezí vlnových délek 280 nm až 360 nm.

V maximu při 304 nm je hodnota De rovna +3,3.

Pro toto měření se může také použít roztok kyseliny

(1S)-(+)-10-kafrsulfonové R.

Linearita modulace. 10,0 mg kyseliny (1S)-(+)-10-kafrsulfonové

R se rozpustí ve vodě R a zředí se stejným rozpouštědlem

na 10,0 ml. Přesná koncentrace kafrsulfonové kyse-

Obr. 2.2.41-1 Optické

schéma dichrografu

162 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.42 HUSTOTA PEVNÝCH LÁTEK

liny v roztoku se určí ultrafialovou spektrofotometrií

(2.2.25) s použitím specifické absorbance, jejíž hodnota při

285 nm je 1,49.

Spektrum cirkulárního dichroismu se zaznamená mezi

185 nm a 340 nm. Hodnota De změřená v maximu při

290,5 nm je rovna +2,2 až +2,5. Hodnota De změřená

v maximu při 192,5 nm je rovna –4,3 až –5.

Pro kalibraci se může také použít (1S)-(+) nebo antipod

(1R)-(–)-amonium-10-kafrsulfonát R.

2.2.42 HUSTOTA PEVNÝCH LÁTEK

6.6:20242

Hustota pevných látek odpovídá jejich průměrné hmotnosti

vztažené na jednotku objemu a je obvykle vyjadřována

v gramech na krychlový centimetr (g/cm 3 ), ačkoliv mezinárodní

jednotka je kilogram na krychlový metr (g/cm 3 =

= 1000 kg/m 3 ).

Na rozdíl od plynů a kapalin, jejichž hustota závisí pouze

na teplotě a tlaku, závisí hustota pevných látek také na jejím

uspořádání, a proto se mění s krystalickou strukturou

a stupněm krystalinity.

Jsou-li pevné látky amorfní nebo částečně amorfní, může

jejich hustota záviset také na způsobu přípravy, zpracování

a skladování.

Na rozdíl od kapalin mohou tedy být hustoty dvou chemicky

ekvivalentních pevných látek různé a tato různost odráží

rozdíl ve struktuře pevného stavu. Hustota částic je důležitá

fyzikální charakteristika farmaceutických prášků.

Hustota pevné částice může dosahovat různých hodnot

v závislosti na metodě použité k měření jejího objemu.

Je užitečné rozlišovat tři způsoby vyjadřování hustoty:

– pravá hustota, která zahrnuje pouze pevnou frakci materiálu;

v případě krystalického materiálu se pravá hustota

také nazývá krystalická hustota;

– hustota částic, která zahrnuje také objem pórů mezi částicemi;

– sypná hustota, která dále zahrnuje prázdný objem vzniklý

mezi částicemi uspořádanými ve vrstvě prášku.

PRAVÁ HUSTOTA

Pravá hustota látky je poměr hmotnosti k objemu primitivní

buňky (unit cell, nejmenší jednotky ve stavbě krystalu),

s výjimkou všech dutin, které nejsou základní částí molekulového

uspořádání. Je to vnitřní vlastnost specifikované

krystalové struktury látky a měla by proto být nezávislá na

metodě stanovení. Pravá hustota se stanoví výpočtem.

Získá se za použití krystalografických údajů (objem a složení

primitivní buňky), např. z údajů rentgenové difrakce

buď z monokrystalu, nebo upřesněním krystalické struktury

na základě údajů rentgenové difrakce prášků.

HUSTOTA ČÁSTIC

Hustota částic bere v úvahu jak pravou hustotu, tak i porozitu

mezi částicemi (uzavřené a/nebo experimentálně nedostupné

otevřené póry). Hustota částic tedy závisí na změřeném

objemu, jehož hodnota však závisí na metodě měření.

Hustota částic se může stanovit za použití jedné ze dvou

následujících metod.

Hustota měřená plynovým pyknometrem se stanoví změřením

objemu, který zaujímá prášek o známé hmotnosti; tento

objem je ekvivalentní objemu plynu nahrazeného práškem

v plynovém pyknometru (2.9.23). Při měření hustoty plynovým

pyknometrem určený objem nezahrnuje objem otevřených

pórů, avšak zahrnuje objem uzavřených pórů nebo

pórů nedostupných pro plyn. Z důvodů vysoké difuzní

schopnosti (difuzivity) helia, které je pro tyto účely přednostně

voleno, je většina otevřených pórů pro plyn dosažitelná.

Hustota jemně rozemletého prášku měřená plynovým

pyknometrem se tedy obecně příliš neliší od pravé hustoty.

Proto tato hustota nejlépe odpovídá pravé hustotě amorfních

nebo částečně krystalických vzorků a je proto široce

použitelná pro vzorky zpracovávaných farmaceutických

prášků.

Hustota měřená rtuťovým porozimetrem se také nazývá

granulární hustota. Objem určený touto metodou také zahrnuje

objem uzavřených pórů nebo pórů nedostupných pro

rtuť, avšak zahrnuje jen objem otevřených pórů menších,

než je určitý limit velikosti. Tento limit velikosti pórů, neboli

minimální dosažitelný průměr pórů, závisí na maximálním

tlaku potřebném k průniku rtuti během měření; za

tlaků normálně používaných neproniká rtuť do nejjemnějších

pórů, které jsou pro helium dosažitelné. Pro jeden vzorek

se mohou získat různé granulární hustoty, neboť hustota

získaná pro každý použitý tlak rtuti odpovídá limitní velikosti

pórů při tomto tlaku.

SYPNÁ A SETŘESNÁ HUSTOTA

Sypná hustota prášku zahrnuje podíl volného objemu mezi

částicemi. Sypná hustota tedy závisí na hustotě částic prášku

a na prostorovém uspořádání částic ve vrstvě prášku.

Sypnou hustotu je často velmi obtížné změřit s dobrou reprodukovatelností,

protože sebemenší porušení vrstvy může

vést k jiné hodnotě. Při uvádění získané hodnoty je tedy

nutno specifikovat, jak bylo stanovení provedeno.

Sypná hustota a setřesná hustota se stanoví způsobem popsaným

ve stati 2.9.34 Sypná hustota a setřesná hustota

prášků.

2.2.43 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

6.0:20243

Hmotnostní spektrometrie je metoda založená na přímém

měření hodnoty poměru hmotnosti a počtu kladných nebo

záporných elementárních nábojů iontů v plynné fázi (m/z)

získaných po ionizaci analyzované látky. Tento poměr se

vyjadřuje v atomových hmotnostních jednotkách (1 a. h. j.

je jedna dvanáctina atomové hmotnosti 12 C) nebo v daltonech

(1 Da je hmotnost vodíkového atomu).

Ionty produkované v iontovém zdroji přístroje se urychlují

a pak separují v analyzátoru a následně detekují v detektoru.

Veškeré tyto procesy probíhají v uzavřeném prostoru, ve kterém

systém čerpadel udržuje vakuum 10 –3 Pa až 10 –6 Pa.

Ve výsledném hmotnostním spektru se vynáší relativní

nadbytek různých druhů přítomných iontů jako funkce poměru

m/z. Signál příslušející určitému iontu se obvykle reprezentuje

několika píky odpovídajícími statistickému zastoupení

jednotlivých izotopů v tomto iontu. Charakteristický

soubor izotopických píků tvoří izotopický profil cha-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 163


rakteristický pro danou strukturu (nejmenší u malých molekul).

Pík reprezentující nejvíce zastoupené izotopy daného

atomu se nazývá monoizotopický pík.

Informace získané hmotnostní spektrometrií jsou kvalitativní

(určení molekulové hmotnosti, informace o struktuře

z pozorovaných fragmentových iontů) nebo kvantitativní

(s použitím vnitřních nebo vnějších standardů) s dosahovanými

detekčními limity řádu pikomolů až femtomolů.

DÁVKOVÁNÍ VZORKU

Prvním krokem při analýze je dávkování vzorku bez přílišného

narušení vakua přístroje. Při běžné metodě tzv. přímého

dávkování kapaliny je roztok vzorku ve vhodném rozpouštědle

s pomocí sondy přímého vstupu vnesen do prostoru

iontového zdroje (v křemenném kelímku, na vlákně nebo na

kovové destičce). Systém vakuových uzávěrů zajišťuje postupné

snižování tlaku při zasouvání sondy, odpaření rozpouštědla

mimo prostor iontového zdroje a vylučuje přímou

expozici iontového zdroje atmosférickému tlaku.

Jiné způsoby dávkování umožňují s využitím vhodného zařízení

vzájemně separovat složky směsi před vstupem

do hmotnostního spektrometru.

Plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie

(GC-MS). Při použití vhodných kapilárních nebo semikapilárních

kolon je možno konec kolony umístit přímo do prostoru

iontového zdroje bez nutnosti použití separátoru nosného

plynu.

Kapalinová chromatografie/hmotnostní spektrometrie

(LC-MS). Tato kombinace je vhodná pro analýzu polárních,

málo těkavých sloučenin a látek tepelně nestálých,

které není možno analyzovat kombinací GC-MS. Metoda je

komplikována obtížemi při ionizaci z kapalné fáze. Mezi

kapalinový chromatograf a hmotnostní spektrometr je nutno

zařadit některé z dále uvedených rozhraní:

– rozhraní pro přímý vstup kapaliny: mobilní fáze je rozprášena

a rozpouštědlo je odpařeno před vstupem do iontového

zdroje;

– rozhraní pro vstup desolvatovaného vzorku: zajišťuje

rozprášení mobilní fáze (do maximálního průtoku

0,6 ml/min) a následné odsušení kapalné fáze v desolvatační

komůrce; vzorek v podobě neutrálních částic vstupuje

do vlastního prostoru iontového zdroje; tato technika

je vhodná pro analýzu málo polárních látek s hmotností

do 1000 Da;

– rozhraní s pohybujícím se páskem: mobilní fáze se vzorkem,

s maximální průtokovou rychlostí do 1 ml/min, je

kontinuálně nanášena na smyčku z kovového pásku

a přes systém vakuových uzávěrů unášena do prostoru

iontového zdroje; během pohybu dochází k odpaření rozpouštědla

a vzorek je v prostoru iontového zdroje ionizován;

tato metoda není vhodná pro analýzu vysoce polárních

a tepelně nestálých látek.

Ostatní typy rozhraní (elektrosprej, termosprej, chemická

ionizace za atmosférického tlaku) jsou ve své podstatě ionizačními

metodami a jsou dále popsány v odstavci věnovaném

způsobům ionizace.

Superkritická fluidní chromatografie/hmotnostní spektrometrie

(SFC-MS). Mobilní fáze je většinou tvořena

oxidem uhličitým udržovaným při superkritické teplotě a

tlaku. Průchodem přes vyhřívaný restriktor, který je umístěn

mezi kolonou a iontovým zdrojem, dochází k jejímu

převedení do plynné fáze.

Kapilární elektroforéza/hmotnostní spektrometrie

(CE-MS). Eluent je přes vhodné rozhraní veden do hmotnostního

spektrometru. K zajištění účinného transportu analyzovaných

látek i při extrémně malých průtocích nosného

elektrolytu separační kapilárou (řádu několika mikrolitrů za

minutu) se často využívá průtoková rychlost pomocné kapaliny.

Využitelnost CE-MS je do značné míry limitována

velmi malým množstvím dávkovaného vzorku a nutností

použít těkavé tlumivé roztoky.

ZPŮSOBY IONIZACE

Ionizace nárazem elektronu (EI). Vzorek v plynné fázi se

ionizuje proudem elektronů, jejichž kinetická energie (obvykle

70 eV) je vyšší než ionizační energie vzorku. Ve spektru

je možno, kromě molekulárního iontu M + , pozorovat

i ionty fragmentové, které jsou charakteristické pro strukturu

pozorovaných molekul. Tato metoda je hlavně limitována

nutností převést vzorek do plynné fáze a nehodí se pro látky

polární, tepelně nestálé nebo vysokomolekulární. Je vhodná

pro spojení hmotnostní spektrometrie s plynovou chromatografií,

v některých případech s kapalinovou chromatografií.

Chemická ionizace. Tento způsob ionizace využívá pro přenos

energie na ionizovanou molekulu vzorku tzv. reakční

plyn (methan, amoniak, oxid dusnatý, oxid dusičitý nebo

kyslík). Pro hmotností spektrum po chemické ionizaci je

v závislosti na použitém reakčním plynu charakteristická přítomnost

kvazimolekulárního iontu typu (M + H) + , (M – H) – ,

nebo aduktových iontů vznikajících mezi vzorkem a použitým

plynem. Ve srovnání s EI ionizací je obecně produkováno

méně fragmentových iontů. Pro ionizaci tepelně nestálých

látek se využívá varianta desorpční chemické ionizace,

kdy vzorek nanesený na žhavené kovové vlákno se

velmi rychle odpaří vlivem Joulova-Thomsonova jevu.

Ionizace nárazem urychlených atomů nebo iontů

[fast-atom bombardment (FAB) or fast-ion bombardment

ionisation (liquid secondary-ion mass spectrometry)

(LSIMS)]. Vzorek rozpuštěný ve viskózní netěkavé

matrici (např. glycerol) se nanáší na kovovou destičku a ionizuje

se proudem urychlených neutrálních atomů (např. argonu,

xenonu nebo cesiových iontů s vysokou kinetickou

energií). Při ionizaci vznikají ionty typu (M + H) + , (M – H) –

nebo ionty aduktů s vlastním vzorkem nebo matricí. Tento

způsob ionizace je vhodný pro polární a tepelně nestálé látky,

umožňuje i ionizaci makromolekul do hmotnosti asi

10 kDa. Pokud je do mobilní fáze přidáno 1 % až 2 % glycerolu,

je tato metodika ionizace kompatibilní s kapalinovou

chromatografií. Průtok mobilní fáze musí být velmi

nízký (několik mikrolitrů za minutu). Tyto ionizační metody

rovněž umožňují analýzu látek separovaných tenkovrstvou

chromatografií přímo na separační destičce, která se po

nanesení tenké vrstvy matrice vloží do iontového zdroje.

Ionizace a desorpce polem. Vzorek převedený do plynné

fáze se ionizuje elektrickým polem v blízkosti wolframového

vlákna pokrytého mikrojehličkami (ionizace polem) nebo

se vzorek nanese na toto vlákno (emitor) (desorpce polem).

K ionizaci vzorku dochází po vložení napětí mezi

emitor a protielektrodu (asi 10 kV) přímo z pevné fáze. Ty-

164 ČL 2017 – Dopl. 2020


to dvě metody produkují především molekulární ionty typu

M + a (M + H) + a využívají se pro ionizaci málo polárních

a/nebo tepelně nestálých látek.

Ionizace desorpcí laserem v přítomnosti matrice

[matrix-assisted laser desorption ionisation (MALDI)].

Vzorek ve vhodné matrici se nanese na kovovou destičku

a ionizuje se zářením pulzního laseru (oblast vlnových délek

od UV do IČ, délka trvání pulzu od pikosekund až k nanosekundám).

Tento způsob ionizace hraje klíčovou roli při analýze

makromolekulárních látek s hmotností více než

100 kDa, ale omezuje se na spojení s průletovými hmotnostními

analyzátory (viz dále).

Elektrosprej. Při tomto způsobu ionizace probíhá za atmosférického

tlaku. Vzorky v roztoku se přivádějí do iontového

zdroje kovovou kapilárou, na jejíž konec je vloženo

napětí asi 5 kV. Ke zjednodušení rozprašování se může použít

plyn. Desolvatace výsledných mikrokapiček produkuje

jednou nebo vícenásobně nabité ionty. Průtokové rychlosti

se pohybují v rozmezí několika mikrolitrů za minutu až

1 ml/min. Tato metoda ionizace je vhodná pro analýzu polárních

látek a biomolekul do molekulových hmotností až

100 kDa. Může být spojena s kapalinovou chromatografií

nebo kapilární elektroforézou.

Chemická ionizace za atmosférického tlaku [atmospheric-pressure

chemical ionisation (APCI)]. Ionizace

probíhá za atmosférického tlaku působením dostatečně

intenzivního elektrického pole v okolí elektrody udržované

na potenciálu několika kV a vystavené proudu dusíku. Výsledné

ionty jsou většinou jednou nabité, typu (M + H) + ,

(M – H) – v závislosti na podmínkách ionizace. Průtokové

rychlosti použité při tomto způsobu ionizace mohou dosahovat

až 2 ml/min, proto je tato metoda ionizace ideální pro

spojení s kapalinovou chromatografií.

Termosprej. Vzorek v mobilní fázi obsahující vodu, organické

modifikátory a těkavý elektrolyt (nejčastěji amonium-acetát)

se rozpráší průchodem kovovou kapilárou za

kontrolované teploty. Přijatelné průtokové rychlosti se mohou

pohybovat v rozmezí 1 ml/min až 2 ml/min. Ionty elektrolytu

ionizují analyzované složky. V případě čistě organického

rozpouštědla se může produkce iontů nahradit nebo

podpořit působením elektrického výboje asi 800 V. Tato

metoda ionizace je kompatibilní s použitím kapalinové

chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií.

ANALYZÁTORY

Rozdíly v účinnosti hmotnostních analyzátorů jsou v zásadě

dány dvěma parametry:

– hmotnostním rozsahem, tj. rozsahem, ve kterém se mohou

měřit poměry m/z;

– rozlišovací schopností definovanou jako schopnost separovat

dva ionty stejné intenzity, poskytující píky s poměry,

m/z lišícími se o DM, jejichž překryv je vyjádřen výškou

překryvu danou v procentech; např. rozlišovací

schopnost (M/DM) 1000 s 10% překryvem umožní rozdělit

poměry m/z 1000 a 1001, které se překrývají v 10 %

výšky signálu. V některých případech (např. v kvadrupólových

analyzátorech, průletových analyzátorech a iontových

pastích) je však rozlišovací schopnost definována

podílem molekulové hmotnosti iontu pozorovaného píku

a jeho šířky v polovině jeho výšky.

Magnetické a elektrostatické analyzátory. Ionty produkované

v iontovém zdroji se urychlují napětím V a (v závislosti

na konfiguraci přístroje) fokusují na vstup magnetického

analyzátoru (magnetické pole B) nebo elektrostatického

analyzátoru (elektrostatické pole E). V magnetickém

poli ionty opisují dráhu o poloměru r danou Laplaceovou

rovnicí:

B r

m z =

2V

Aby ionty rozdílné hmotnosti dopadly na fixní místo na detektoru,

je nutno v průběhu měření periodicky měnit (skenovat)

hodnoty B anebo V. Obvyklé je skenování B při konstantní

hodnotě V, anebo skenování V při konstantní hodnotě

B. Za magnetickým analyzátorem se obvykle umísťuje

elektrostatický analyzátor (elektrický sektor), který disperguje

svazek procházejících iontů podle kinetických energií

a umožňuje tím podstatně zvýšit rozlišovací schopnost přístroje.

Maximální rozlišení takto uspořádaného přístroje

(tzv. dvousektorového) dosahuje hodnot 10 000 až 150 000

a v mnoha případech umožňuje stanovení hodnoty poměrů

m/z s dostatečnou přesností pro určení elementárního

složení pozorovaných iontů. Analyzovatelná hmotnost jednou

nabitých iontů dosahuje hodnot v rozmezí 2 kDa až

15 kDa. Některé ionty se mohou v prostorech bez vlivu

elektrického a magnetického pole mezi zdrojem iontů a detektorem

rozpadat buď spontánně (metastabilní přechody),

nebo kolizemi s molekulami plynné látky v tzv. kolizní cele

(kolizně aktivovaná disociace). Pozorování těchto rozpadů

je velmi užitečné pro určení struktury látky, stejně tak pro

charakterizaci specifické složky ve směsi bez předchozího

dělení. Studium tohoto typu rozpadu se často realizuje s pomocí

tandemové hmotnostní spektrometrie. V závislosti na

místě rozpadu existuje několik metod:

– způsob dceřiných iontů (určení fragmentačních cest daného

tzv. rodičovského iontu): B/E je konstantní [mass-

-analysed ion kinetic energy spectroscopy (MIKES)];

– způsob rodičovských iontů (určení všech iontů, které při

svém rozpadu poskytnou iont o specifickém poměru m/z):

B 2 /E je konstantní;

– způsob neutrálních ztrát (detekce všech iontů odštěpujících

stejný neutrální fragment): B/E(1–E/E0) 1/2 je konstantní,

v němž E0 je základní napětí vkládané na elektrický

sektor.

Kvadrupólové filtry. Tyto analyzátory jsou tvořeny čtyřmi

paralelními kovovými tyčemi kruhového nebo hyperbolického

průřezu. Jsou uspořádány symetricky vzhledem k trajektorii

procházejících iontů, tyče orientované proti sobě

jsou elektricky propojené. Potenciály vkládané na oba protější

páry jsou opačné a sestávají ze stejnosměrné a střídavé

složky. Ionty různých hmotností produkované v iontovém

zdroji jsou postupně propouštěny přes kvadrupól změnou

velikosti vkládaných napětí (poměr stejnosměrné a střídavé

složky zůstává konstantní). Běžný rozsah hmotností analyzovatelných

iontů leží v rozsahu 1 a. h. j. až 2000 a. h. j.

v závislosti na provedení může dosahovat maximální hodnoty

až 4000 a. h. j. Kvadrupólový filtr dosahuje obecně

nižší rozlišovací schopnosti než magnetický analyzátor,

2

2

.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 165

2.2.44 CELKOVÝ OBSAH ORGANICKÉHO UHLÍKU VE VODĚ PRO FARMACEUTICKÉ POUŽITÍ

přesto však je možno získat monoizotopický profil jednou

nabitých iontů v celém hmotnostním rozsahu. Kvadrupólové

filtry je možno kombinovat a získat přístroje typu tandemových

hmotnostních spektrometrů, kde jsou v sérii zařazeny

tři kvadrupóly Q1, Q2 a Q3 (Q2 slouží jako kolizní

cela a není skutečným analyzátorem; nejčastěji používaným

kolizním plynem je argon).

Nejběžnější způsoby skenování trojitého kvadrupólového

přístroje jsou:

– způsob dceřiných iontů: Q1 propouští vybraný rodičovský

iont, který fragmentuje v kolizní cele Q2; produkty rozpadu

(dceřiné ionty) jsou analyzovány v Q3;

– způsob rodičovských iontů: Q3 propouští pouze iont o vybraném

m/z, zatímco Q1 skenuje daný hmotnostní rozsah;

pouze ionty rozpadající se na vybraný fragment jsou detekovány;

– způsob neutrálních ztrát: Q1 a Q3 skenují určitý hmotnostní

rozsah s posunem odpovídajícím hmotnostní diferenci

při odštěpení vybraného neutrálního fragmentu charakteristického

pro produkt nebo pro určitou třídu složek.

Hmotnostní spektra je možno také získat s pomocí přístrojů

kombinujících kvadrupólové filtry s magnetickými analyzátory

nebo elektrostatickými sektory. Tyto přístroje označujeme

jako hybridní hmotnostní spektrometry.

Iontová past. Tento analyzátor je funkční obdobou kvadrupólových

filtrů s trojrozměrným elektrostatickým polem.

Iontová past umožňuje získat spektra iontových produktů

několika generací dceřiných iontů (MS n ).

Analyzátory iontové cyklotronové rezonance. Ionty vystavené

homogennímu magnetickému poli o dostatečně velké

intenzitě se pohybují po uzavřených kruhových drahách. Jejich

úhlovým rychlostem je možno s využitím algoritmu

Fourierovy transformace přiřadit příslušné hodnoty m/z. Tento

jev se nazývá iontová cyklotronová rezonance. Analyzátory

tohoto druhu tvořené supravodivými magnety dosahují extrémně

vysoké rozlišovací schopnosti (do 1 000 000 a výše)

a umožňují provádět experimenty (MS n ). Zásadním požadavkem

funkce těchto analyzátorů je velmi nízký tlak řádu

10 –7 Pa.

Průletové analyzátory. Ionty produkované v iontovém zdroji

jsou akcelerovány napětím V v rozsahu 10 kV až 20 kV. Pak

procházejí analyzátorem tvořeným tzv. letovou trubicí o délce

25 cm až 150 cm bez vlivu elektrického a magnetického pole.

Doba průletu t iontu letovou trubicí k detektoru je přímo

úměrná druhé odmocnině z poměru m/z. Teoreticky je hmotnostní

rozsah tohoto analyzátoru neomezený, v praxi je omezen

typem použitého iontového zdroje (metodou ionizace nebo

desorpce). Tyto analyzátory se využívají zejména při analýze

makromolekulárních látek do hmotnosti až několika set kDa.

Tato metoda je velmi citlivá (pro analýzu jsou postačující

množství řádově jednotek pikomolů). Přesnost měření a dosažitelné

rozlišení je možno výrazně zvýšit použitím elektrostatického

zrcadla (reflektronu).

SBĚR DAT

V zásadě existují tři způsoby získávání dat.

Způsob kompletního spektra. Zaznamenává se celkový

signál získaný ve zvoleném rozsahu hodnot m/z. Hmotnostní

spektrum zobrazuje relativní intenzity různých druhů

iontů jako funkci m/z. Získané výsledky jsou v zásadě kvalitativní.

Pro rychlou identifikaci struktury reprezentované

získaným hmotnostním spektrem je možno využít počítačového

porovnání s referenčními knihovnami spekter.

Fragmentometrický způsob [selected-ion monitoring].

Je zpracován pouze signál příslušející iontu o vybraném

m/z [single-ion monitoring (SIM)], popř. několika vybraným

iontům [multiple-ion monitoring (MIM)], charakteristickým

pro zkoušenou látku. S využitím tohoto způsobu

sběru dat je možno podstatně snížit detekční limit metody.

Kvantitativní nebo semikvantitativní stanovení je možno

provádět s použitím interních a externích standardů (např.

deuterovaných standardů). Tento typ měření není možno

provádět s průletovými analyzátory.

Fragmentometrický způsob zdvojené hmotnostní spektrometrie

[multiple reaction monitoring (MRM)]. V tomto

případě je možno specificky sledovat unimolekulární nebo

bimolekulární rozpad vybraného prekurzorového iontu charakteristického

pro analyzovanou látku. Díky vysoké selektivitě,

specifičnosti a citlivosti je tento způsob mimořádně

vhodný pro kvantitativní studie s použitím vhodných vnitřních

standardů (např. deuterovaných standardů). Tento druh

analýz je možno provádět pouze na hmotnostních spektrometrech

se třemi kvadrupóly v sérii, přístrojích s iontovou

pastí nebo analyzátory iontové cyklotronové rezonance.

KALIBRACE

Kalibrace umožňuje přiřadit detekovanému signálu správnou

hodnotu m/z. Obecně se kalibrace provádí s pomocí

vhodné porovnávací látky. Je možno provádět kalibraci externí

(odděleně od vlastního měření) nebo interní (porovnávací

látka se přidává přímo do analyzovaného vzorku). Počet

iontů nebo bodů nutných pro spolehlivou kalibraci závisí

na druhu použitého analyzátoru a na požadované přesnosti

měření. Např. v případě magnetických analyzátorů,

kdy hodnota m/z závisí exponenciálně na magnetické indukci,

je nutno kalibrovat na maximální počet bodů.

DETEKCE SIGNÁLU A ZPRACOVÁNÍ DAT

Ionty separované v analyzátoru jsou převedené na elektrické

signály detekčním systémem typu fotonásobiče nebo

elektronásobiče. Signál je dále zesílen, digitalizován a zpracován

v počítači. S pomocí vhodného programového vybavení

jsou kromě sběru dat zajištěny další nezbytné funkce,

jako je kalibrace, rekonstrukce spekter, automatická kvantifikace,

archivování a tvorba nebo využití knihovny hmotnostních

spekter. Počítač kontroluje různé fyzikální parametry

související s chodem a nastavením přístroje.

2.2.44 CELKOVÝ OBSAH ORGANICKÉHO

UHLÍKU VE VODĚ

PRO FARMACEUTICKÉ POUŽITÍ

6.0:20244

Stanovení celkového obsahu organického uhlíku [total organic

carbon determination (TOC)] je nepřímým měřítkem

organických sloučenin obsažených ve vodě pro farmaceutické

použití. Stanovení celkového obsahu organického uhlíku

se může použít také pro kontrolu provádění různých

operací při přípravě léčivých přípravků.

166 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.45 SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ CHROMATOGRAFIE

Pro stanovení celkového obsahu organického uhlíku je dostupná

řada vhodných metod. Tato obecná stať nepředpisuje

danou metodu, která se má použít, ale popisuje postupy

používané pro kvalifikaci zvolené metody a interpretaci výsledků

u limitních zkoušek. Porovnávací roztok se analyzuje

ve vhodných intervalech v závislosti na četnosti měření;

pro přípravu tohoto roztoku je použita látka, u níž se předpokládá,

že je snadno oxidovatelná (např. sacharosa) při

koncentraci nastavené tak, aby odezva přístroje odpovídala

limitu celkového obsahu organického uhlíku, který se má

měřit. Pro stanovení způsobilosti systému je analyzován

roztok látky, u níž se předpokládá, že je obtížně oxidovatelná

(např. 1,4-benzochinon).

Společné pro různé typy přístrojů, které se používají pro

měření celkového obsahu organického uhlíku ve vodě pro

farmaceutické použití, je to, že se v nich dosahuje úplné

oxidace organických molekul ve vzorku vody za vzniku

oxidu uhličitého, jehož množství je následně změřeno

a výsledek se používá pro výpočet koncentrace uhlíku ve

vodě.

Použitý přístroj musí rozlišit organický uhlík a anorganický

uhlík, později přítomný jako uhličitan. Tohoto rozlišení se

může dosáhnout buď změřením anorganického uhlíku

a odečtením od celkového uhlíku, nebo odstraněním anorganického

uhlíku ze vzorku před oxidací. Při odstraňování

anorganického uhlíku se mohou strhnout i organické molekuly,

ale takovýto organický uhlík je ve vodě pro farmaceutické

použití přítomen v zanedbatelném množství.

Přístroj. Použije se kalibrovaný přístroj instalovaný buď

v přímém spojení, nebo odděleně. Ověří se způsobilost systému

ve vhodných intervalech, jak je popsáno dále. Přístroj

musí mít mez detekce udávanou výrobcem 0,05 mg uhlíku

v litru nebo méně.

TOC voda (voda pro stanovení celkového obsahu organického

uhlíku). Použije se vysoce čištěná voda splňující následující

požadavky:

– vodivost: nejvýše 1,0 µS ∙ cm –1 při 25 °C;

– celkový organický uhlík: nejvýše 0,1 mg/l.

Podle typu použitých přístrojů může být obsah těžkých kovů

a mědi kritický. Je proto třeba dodržovat pokyny výrobce

přístroje.

Příprava skleněného nádobí. Použije se skleněné nádobí,

z něhož byly velice pečlivě odstraněny organické látky. Pro

konečné opláchnutí se použije TOC voda.

Porovnávací roztok. Sacharosa R se suší 3 h při 105 °C

a pak se rozpustí v TOC vodě tak, aby získaný roztok obsahoval

1,19 mg sacharosy v litru (0,50 mg uhlíku v litru).

Zkoušený roztok. Voda, která se má zkoušet, se při řádném

dodržování opatření zabraňujících znečištění shromáždí ve

vzduchotěsném obalu, přičemž zbývající prázdný prostor

v obalu musí být co nejmenší. Zkouška se provede co nejdříve,

aby se snížilo znečištění vody z obalu a z uzávěru na

minimum.

Roztok pro způsobilost systému. 1,4-benzochinon R se rozpustí

v TOC vodě tak, aby získaný roztok obsahoval

0,75 mg 1,4-benzochinonu v litru (0,50 mg uhlíku v litru).

Kontrolní TOC voda. Použije se TOC voda získaná současně

s vodou použitou pro přípravu porovnávacího roztoku

a roztoku pro způsobilost.

Kontrolní roztoky. Kromě kontrolní TOC vody, se připraví

vhodné kontrolní roztoky pro vynulování přístroje nebo

další roztoky potřebné pro stanovení základní linie nebo

pro nastavení kalibrace podle pokynů výrobce; provede se

slepá zkouška pro nastavení nulové polohy přístroje.

Způsobilost systému. Provede se měření s následujícími

roztoky a zaznamenají se odezvy. Vypočítá se účinnost

odezvy v procentech za použití vzorce:

r - r

r - r

ss w

×

100 ,

v němž značí:

rw – TOC vodu;

rs – porovnávací roztok;

rss – roztok pro způsobilost systému.

s

w

Systém je způsobilý, jestliže účinnost odezvy je 85 % až

115 % teoretické odezvy.

Pracovní postup. Provede se měření se zkoušeným roztokem

a zaznamená se odezva (ru). Zkoušený roztok vyhovuje

zkoušce, jestliže ru není větší než rs – rw.

Tato metoda se může také použít u přímo spojeného přístrojového

systému, který byl patřičně kalibrován a u něhož

byla ověřena způsobilost systému. Umístění přístroje se

musí zvolit tak, aby bylo zajištěno, že odezvy jsou charakteristické

pro použitou vodu.

2.2.45 SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ

CHROMATOGRAFIE

6.0:20245

Superkritická fluidní chromatografie (SFC) je separační

metoda, kde mobilní fází je kapalina v superkritickém nebo

v subkritickém stavu. Stacionární fází v koloně jsou buď

jemné rozptýlené pevné částice (jako je oxid křemičitý nebo

porézní grafit), chemicky modifikované stacionární fáze,

které se používají v kapalinové chromatografii, nebo v kapilárních

kolonách sesíťované kapalné filmy rovnoměrně

nanesené na stěnách kolony.

SFC je založena na mechanismu adsorpce nebo rozdělování.

PŘÍSTROJ

Přístroj se obvykle skládá z chlazeného čerpacího systému,

dávkovacího zařízení, chromatografické kolony opatřené

termostatem, detektoru, regulátoru tlaku a zařízení na zpracování

dat (nebo integrátoru, nebo zapisovače).

Čerpací systémy

Čerpací systémy musí zaručovat konstantní průtokovou

rychlost mobilní fáze. Aby bylo minimalizováno kolísání

tlaku, je systém vybaven zařízením na tlumení pulzů natlakované

mobilní fáze. Hadičky a všechny spoje musí být

schopny odolat tlaku vyvinutému čerpacím systémem.

Systémy kontrolované mikroprocesorem jsou schopné

přesně přivádět mobilní fázi buď za konstantních, nebo

měnících se podmínek v souladu se zadaným programem.

V případě gradientové eluce se používá čerpací systém, který

přivádí rozpouštědlo (rozpouštědla) z příslušných zásob-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 167

2.2.46 CHROMATOGRAFICKÉ SEPARAČNÍ METODY

níků a míchání rozpouštědel probíhá buď na nízkotlaké,

nebo vysokotlaké straně čerpadla (čerpadel).

Dávkovací zařízení

Nástřik se provádí přímo na začátek kolony dávkovacím

ventilem.

Stacionární fáze

Stacionární fáze jsou v kolonách, které byly popsány ve

statích Kapalinová chromatografie (2.2.29) (náplňové kolony)

a Plynová chromatografie (2.2.28) (kapilární kolony).

Kapilární kolony mají vnitřní průměr nejvýše 100 µm.

Mobilní fáze

Obvykle se používá oxid uhličitý, který může obsahovat

polární modifikátory, jako je methanol, propan-2-ol nebo

acetonitril. Složení, tlak (hustota), teplota a průtoková rychlost

předepsané mobilní fáze jsou buď konstantní po celou

dobu chromatografického postupu (izokratická, izodenzitická,

izotermická eluce), nebo se mohou měnit podle definovaného

programu (gradientová eluce modifikátoru, tlaku

(hustoty), teploty nebo průtokové rychlosti).

Detektory

Nejběžněji používanými detektory jsou spektrofotometry

v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/VIS) a plamenoionizační

detektory. Lze též používat detektory rozptylu světla,

spektrofotometry absorbující v infračervené oblasti, tepelně

vodivostní detektory nebo jiné speciální detektory.

PRACOVNÍ POSTUP

Připraví se zkoušený roztok/zkoušené roztoky a porovnávací

roztok/porovnávací roztoky způsobem popsaným v lékopisném

článku. Roztoky nesmí obsahovat pevné částice.


stati Chromatografické separační metody (2.2.46). V této

stati je rovněž uveden rozsah, v jakém mohou být nastaveny

parametry chromatografického systému, aby se splnily

požadavky testu způsobilosti.

2.2.46 CHROMATOGRAFICKÉ SEPARAČNÍ

METODY

9.2:20246

Chromatografické separační metody jsou vícestupňové separační

metody, kde jsou složky vzorku rozdělovány mezi

dvě fáze, z nichž jedna je stacionární a druhá mobilní.

Stacionární fáze může být pevná látka nebo kapalina nanesená

na tuhý nosič nebo gel. Stacionární fáze se může

naplnit do kolon, rovnoměrně rozprostřít do vrstvy nebo

filmu atd. Mobilní fáze může být plynná, kapalná nebo

kapalina v superkritickém stavu. Separace může být založena

na adsorpci, hmotnostní distribuci (rozdělování),

výměně iontů atd., nebo na rozdílech ve fyzikálně-chemických

vlastnostech molekul, jako je velikost, hmotnost,

objem atd.

Tato stať obsahuje definice a výpočty společných parametrů

a obecné požadavky pro test způsobilosti systému. Principy

separace, přístroje a metody jsou pak uvedeny

v následujících obecných statích:

– papírová chromatografie (2.2.26);

– tenkovrstvá chromatografie (2.2.27);

– plynová chromatografie (2.2.28);

– kapalinová chromatografie (2.2.29);

– vylučovací chromatografie (2.2.30);

– superkritická fluidní chromatografie (2.2.45).

DEFINICE

Test způsobilosti a kritéria přijatelnosti byly v lékopisných

článcích nastaveny za použití dále definovaných parametrů.

U některých přístrojů se mohou určité parametry, jako je

poměr signálu k šumu a rozlišení, vypočítat za použití softwaru

dodaného výrobcem přístroje. Je odpovědností uživatele

zajistit, aby metody výpočtu použité v softwarovém

vybavení byly slučitelné s lékopisnými požadavky. Pokud

tomu tak není, musí se provést nezbytné korekce.

Chromatogram

Je to grafický nebo jiný záznam odezvy detektoru, koncentrace

eluované látky nebo jiné veličiny použité jako měřítko

této koncentrace v závislosti na čase nebo objemu. Idealizované

chromatogramy představují řadu gaussovských píků

na základní linii (viz obrázek 2.2.46-1).

Pík

Je to část chromatogramu zaznamenávající odezvu detektoru,

pokud se z kolony eluuje jediná složka (nebo dvě, nebo

více nerozdělených složek).

Pík se může definovat plochou píku, nebo výškou píku (h)

a šířkou píku v poloviční výšce (wh), nebo výškou píku (h)

a šířkou píku mezi body inflexe (wi). Pro gaussovské píky

(viz obrázek 2.2.46-1) platí vzorec:

w

h

= 1,

18wi

.

Retenční čas (tR)

Je to čas potřebný pro eluci složky (viz obrázek 2.2.46-1,

stupnice základní linie v minutách).

Retenční objem (VR)

Je to objem mobilní fáze potřebný pro eluci složky. Může

se vypočítat z retenčního času a z průtokové rychlosti (F)

v mililitrech za minutu podle vzorce:

V t × F .

R

= R

Mrtvý čas (tM)

Je to čas potřebný pro eluci nezadržované složky (viz obrázek

2.2.46-1, stupnice základní linie v minutách). Ve vylučovací

chromatografii se používá symbol t0 (viz dále).

Mrtvý objem (VM)

Je to objem mobilní fáze potřebný pro eluci nezadržované

složky. Může se vypočítat z mrtvého času a z průtokové

rychlosti (F) v mililitrech za minutu podle vzorce:

V M

= t M

× F .

Ve vylučovací chromatografii se používá symbol V0 (viz dále).

Retenční faktor (k)

Retenční faktor [též známý jako hmotnostní distribuční

poměr (Dm) nebo kapacitní faktor (k´)] je definován jako:

množství složky ve stacionární fázi VS

k =

= K ,

množství složky v mobilní fázi

C V

M

168 ČL 2017 – Dopl. 2020


Zkušební

metody

2.2

Obr. 2.2.46-1

Obr. 2.2.46-2

ČL 2017 – Dopl. 2020 169


v němž značí:

KC – distribuční konstantu (rovnovážný distribuční

koeficient);

VS – objem stacionární fáze;

VM – objem mobilní fáze.

Retenční faktor složky se může určit z chromatogramu za

použití vzorce:

tR

- tM

k = .

t

M

Celkový čas mobilní fáze (tt)

Ve vylučovací chromatografii je to retenční čas složky, jejíž

molekuly jsou menší než nejmenší póry stacionární fáze

(viz obrázek 2.2.46-2).

Celkový objem mobilní fáze (Vt)

Ve vylučovací chromatografii je to retenční objem složky, jejíž

molekuly jsou menší než nejmenší póry stacionární fáze.

Může se vypočítat z celkového času mobilní fáze a z průtokové

rychlosti (F) v mililitrech za minutu podle vzorce:

V t

= t t

× F .

Retenční čas nezadržované složky (t0)

Ve vylučovací chromatografii je to retenční čas složky, jejíž

molekuly jsou větší než největší póry stacionární fáze

(viz obrázek 2.2.46-2).

Retenční objem nezadržované složky (V0)

Ve vylučovací chromatografii je to retenční objem složky,

jejíž molekuly jsou větší než největší póry stacionární fáze.

Může se vypočítat z retenčního času nezadržované složky

a z průtokové rychlosti (F) v mililitrech za minutu podle

vzorce:

V = t 0

× F .

0

tR

- t0

0

= .

tt

- t0

Distribuční konstanta (K0)

Ve vylučovací chromatografii mohou být eluční charakteristiky

složky na určité koloně dány distribuční konstantou

(již zmíněným distribučním koeficientem), která se vypočítá

podle vzorce:

Retardační faktor (RF)

Retardační faktor [známý také jako retenční faktor (Rf)],

používaný v planární chromatografii, je poměr vzdálenosti

místa nanášení a středu skvrny ke vzdálenosti čela mobilní

fáze od místa nanášení (viz obrázek 2.2.46-3).

v němž značí:

b – migrační vzdálenost stanovované látky;

a – migrační vzdálenost čela mobilní fáze.

K

R =

F

b

a

,

A = čelo mobilní fáze B = skvrna C = linie startu

Obr. 2.2.46-3

Počet pater (N)

Účinnost kolony (zdánlivá účinnost) se může vypočítat jako

počet pater (známý také jako počet teoretických pater)

z údajů, které jsou v závislosti na metodě získány za podmínek

izotermických, izokratických nebo izopyknických.

Použije se následující vzorec, hodnoty tR a wh se musí vyjádřit

ve stejných jednotkách:

æ t ö

R

N = 5,54

ç ÷ ,

è wh

ø

v němž značí:

tR – retenční čas píku odpovídajícího dané složce;

wh – šířku píku v polovině jeho výšky.

Počet pater se mění se stanovovanou složkou, stejně jako

s kolonou, teplotou kolony, mobilní fází a retenčním časem.

Mrtvý objem (D)

Mrtvý objem chromatografického systému (známý také jako

objem zpoždění gradientu) je objem mezi místem, kde

dochází ke smísení složek mobilní fáze, a začátkem kolony.

Může se stanovit následujícím postupem.

Kolona. Chromatografická kolona se nahradí vhodnou kapilárou

(např. 1 m × 0,12 mm).

Mobilní fáze:

– mobilní fáze A: voda R;

– mobilní fáze B: roztok acetonu R 0,1% (V/V).

Čas

(min)

Mobilní fáze A

(% V/V)

Mobilní fáze B

(% V/V)

0–20 100 ® 0 0 ® 100

20–30 0 100

Průtoková rychlost. Nastaví se tak, aby se dosáhlo dostatečného

zpětného tlaku (např. 2 ml/min).

Detekce. Spektrofotometrický detektor, 265 nm.

Změří se doba (t0,5) v minutách, za kterou vzroste absorbance

o 50 % (viz obrázek 2.2.46-4).

2

170 ČL 2017 – Dopl. 2020


D = t D

× F ,

v němž značí:

tD – t0,5 – 0,5tG (v minutách);

tG – předem definovanou dobu gradientu (= 20 min);

F – průtokovou rychlost (v mililitrech za minutu).

R

s

1,18 a

=

w

( RF2

- RF1) ,

v němž značí:

RF1, RF2 – retardační faktory píků;

wh1, wh2 – šířky píků v polovině jejich výšky;

a – migrační vzdálenost čela mobilní fáze.

h1

+ w

Poměr výšky píku k sedlu (p/v)

Jestliže není dosaženo oddělení dvou píků na základní linii, lze

použít jako kritérium způsobilosti systému ve zkoušce na příbuzné

látky poměr výšky píku k sedlu (viz obrázek 2.2.46-6):

h2

Zkušební

metody

2.2

Obr. 2.2.46-4

Faktor symetrie (As)

Faktor symetrie píku (viz obrázek 2.2.46-5) se vypočítá

podle vzorce:

v němž značí:

A =

S

2d

w0,05 – šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky;

d – vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku

a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky.

Hodnota As rovna 1,0 značí symetrii píku. Je-li As > 1,0

jedná se o chvostování píku, je-li As < 1,0 jedná se o čelní

asymetrii píku (pozvolný náběh).

w

0,05

,

v němž značí:

p v =

Hp – výšku menšího píku nad extrapolovanou základní

linií;

Hv – výšku nejnižšího bodu křivky oddělující menší pík

a větší pík nad extrapolovanou základní linií.

H

H

p

v

,

Obr. 2.2.46-5

Rozlišení (Rs)

Rozlišení mezi píky dvou složek (viz obrázek 2.2.46-1) se

může vypočítat podle vzorce:

R

s

=

1,18 ( tR2

- tR1) ,

v nichž značí:

tR1, tR2 – retenční časy píků;

wh1, wh2 – šířky píků v poloviční výšce.

w

h1

+ w

h2

kde tR2 > tR1,

V kvantitativní planární chromatografii s použitím denzitometrie

se místo retenčních časů používají migrační vzdálenosti;

rozlišení mezi píky dvou složek se vypočítá podle vzorce:

Obr. 2.2.46-6

Relativní retence (r)

Relativní retence se vypočítá jako odhad podle vzorce:

v němž značí:

r =

t

t

Ri

Rst

tRi – retenční čas sledovaného píku;

tRst – retenční čas referenčního píku (obvykle pík odpovídající

zkoušené látce);

tM – mrtvý čas.

Nekorigovaná relativní retence (rG) se vypočítá podle vzorce:

-

-

t

r

G

=

t

Ri

Rst

t

t

M

.

M

,

ČL 2017 – Dopl. 2020 171


Pokud není uvedeno jinak, hodnoty pro relativní retence uvedené

v článcích odpovídají nekorigované relativní retenci.

V planární chromatografii se používají retardační faktory

RFst a RFi místo tRst a tRi.

Poměr signálu k šumu (S/N)

Krátkodobý šum ovlivňuje přesnost stanovení složek. Poměr

signálu k šumu se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

H – výšku píku (viz obrázek 2.2.46-7) odpovídajícího dané

složce na chromatogramu předepsaného porovnávacího

roztoku měřenou od vrcholu píku k extrapolované základní

linii signálu, který je sledován na vzdálenosti rovné

nejméně pětinásobku šířky píku v polovině jeho výšky;

h – rozpětí šumu na chromatogramu získaném při slepé

zkoušce, sledovaném na vzdálenosti rovné nejméně pětinásobku

šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu

předepsaného porovnávacího roztoku, a to

pokud možno rovnoměrně na obě strany od místa, kde

by se měl nacházet sledovaný pík.

Obr. 2.2.46-7

Opakovatelnost

Opakovatelnost odezvy se vyjadřuje jako odhad relativní

směrodatné odchylky [sr (%)] v procentech pro řadu následných

měření pro nejméně tři nástřiky nebo pro měření

porovnávacího roztoku a vypočítá se podle vzorce:

v němž značí:

s r

S N =

2H

h

yi – jednotlivé hodnoty vyjádřené jako plocha píku, výška

píku nebo poměr ploch u metody vnitřního standardu;

y – průměr jednotlivých hodnot;

n – počet jednotlivých hodnot.


Jednotlivé části použitého zařízení se musí kvalifikovat

a musí být schopné dosáhnout přesnosti požadované pro

provedení zkoušky nebo stanovení obsahu.

Test způsobilosti systému představuje nedílnou součást

metody a slouží k zajištění přiměřené účinnosti chromatografického

systému. Pro hodnocení účinnosti kolony se

,

( y - y)

100 å i

(%) =

y n -1

2

,

používají následující parametry: zdánlivá účinnost, retenční

faktor (hmotnostní distribuční poměr), rozlišení

a faktor symetrie.

Faktory, které mohou ovlivnit chromatografické chování,

zahrnují:

– složení, iontovou sílu, teplotu a zdánlivé pH mobilní fáze;

– průtokovou rychlost, rozměry kolony, teplotu kolony

a tlak;

– charakteristiky stacionární fáze, včetně typu nosiče (na

bázi částic nebo monolitického), velikosti částic nebo makropórů,

porozity, specifického povrchu;

– rozsah chemické modifikace (vyjádřeno jako stínění silanolových

skupin, obsah vázaného uhlíku atd.) u nosičů

používaných v chromatografii s obrácenými fázemi a jinými

modifikacemi povrchů.

Pokud není v lékopisném článku uvedeno jinak, musí být

splněny následující požadavky:

– ve zkoušce na příbuzné látky nebo stanovení obsahu je

faktor symetrie píku na chromatogramu porovnávacího

roztoku použitého pro kvantifikaci 0,8 až 1,5, pokud není

předepsáno jinak;

– při stanovení obsahu účinné látky, kde je pro čistou látku

hodnota 100 %, se maximální povolená relativní směrodatná

odchylka [sr (%)max] pro definované limity vypočítá

pro řadu nástřiků porovnávacího roztoku podle následujícího

vzorce:

s (%)

r

max

KB

=

t

n

,

90%, n-1

v němž značí:

K – konstantu (0,349) získanou ze vzorce

0,6

t 90%, 5 0,6

K = × , v němž představuje požadovanou

relativní směrodatnou odchylku v procen-

2 6

2

tech pro šest nástřiků a pro B = 1,0;

B – horní limit definovaný v jednotlivých lékopisných

článcích minus 100 %;

n – počet opakovaných nástřiků porovnávacího roztoku

(3 £ n £ 6);

t90%,n–1 – Studentův parametr t při 90% pravděpodobnosti

(oboustranný) pro n – 1 stupňů volnosti.

Pokud není předepsáno jinak, nepřevyšuje maximální povolená

relativní směrodatná odchylka příslušné hodnoty uvedené

v tabulce 2.2.46-1. Tento požadavek se nepoužívá ve

zkoušce na příbuzné látky.

Tab. 2.2.46-1 Požadavky na opakovatelnost

Počet jednotlivých nástřiků

3 4 5 6

Maximální povolená relativní

B (%)

směrodatná odchylka

2,0 0,41 0,59 0,73 0,85

2,5 0,52 0,74 0,92 1,06

3,0 0,62 0,89 1,10 1,27

– ve zkoušce na příbuzné látky je mez stanovitelnosti píku

(odpovídající poměru signálu k šumu = 10) stejná nebo

nižší než limit zanedbatelnosti.

172 ČL 2017 – Dopl. 2020


Stanovená kritéria způsobilosti systému se mají dodržet

během celého chromatografického postupu. Analytik vybere

vhodný způsob monitorování shody v závislosti na

různých faktorech (četnosti použití metody a zkušenosti

s chromatografickým systémem).

ÚPRAVA CHROMATOGRAFICKÝCH PODMÍNEK

Rozsah, v němž se mohou různé parametry chromatografické

zkoušky upravit tak, aby byla splněna kritéria způsobilosti

systému, aniž by přitom byla podstatně pozměněna

metoda, je uveden dále. Úpravy podmínek pro gradientové

eluce jsou více kritické než pro izokratické eluce, protože

mohou vést k posunu píků do jiných částí gradientu a tím

k nesprávnému určení píků, maskování píků nebo takovému

posunu píků, že k eluci dojde mimo předepsaný eluční

čas. Jiné než tyto změny vyžadují revalidaci metody. Popsané

chromatografické podmínky byly validovány během

vypracovávání lékopisného článku.

V metodách jsou začleněny testy způsobilosti systému, aby

se zajistila separace požadovaná pro uspokojivé provedení

zkoušky na čistotu nebo stanovení obsahu. Protože použité

stacionární fáze jsou popsány obecně a komerčně je k dispozici

vždy celá řada takovýchto fází lišících se chromatografickým

chováním, může být pro splnění předepsaných

požadavků na způsobilost systému nezbytná určitá úprava

chromatografických podmínek.

Zejména u metod kapalinové chromatografie s obrácenými

fázemi se úpravou různých parametrů nedosáhne vždy

uspokojivé separace. V takovém případě pak může být nutné

zaměnit kolonu za jinou kolonu stejného typu (např. oktadecylsilylovaný

silikagel), která bude vykazovat žádoucí

chromatografické chování. Informace o kolonách, které byly

použity při vypracovávání článku, jsou dostupné na webové

stránce EDQM (Evropský direktorát pro jakost léčiv)

v sekci Knowledge Database.

Pro kritické parametry je jejich úprava jasně stanovena v lékopisném

článku tak, aby byla zajištěna způsobilost systému.

Tenkovrstvá chromatografie a papírová chromatografie

Složení mobilní fáze. Množství minoritní složky rozpouštědla

se může upravit v rozmezí ±30 relativních procent nebo

±2 absolutní procenta, podle toho, která hodnota je větší;

pro minoritní složku tvořící 10 % mobilní fáze umožňuje

úprava ±30 relativních procent rozsah 7 % až 13 %, zatímco

úprava ±2 absolutní procenta umožňuje rozsah 8 % až

12 %, relativní hodnota bude tedy větší; pro minoritní složku

tvořící 5 % mobilní fáze umožňuje úprava ±30 relativních

procent rozsah 3,5 % až 6,5 %, zatímco úprava ±2 absolutní

procenta umožňuje rozsah 3 % až 7 %, absolutní

hodnota bude tedy v tomto případě větší. Žádná jiná složka

se nemění o více než 10 absolutních procent.

Hodnota pH vodné složky mobilní fáze. ±0,2 hodnoty pH,

pokud není v článku uvedeno jinak, nebo ±1,0 hodnoty pH,

když zkoušená látka není ionizovaná.

Koncentrace solí v tlumivém roztoku tvořícím součást mobilní

fáze. ±10 %.

Nanášený objem. 10 % až 20 % předepsaného objemu, jestliže

se používají vrstvy s jemnými částicemi (2 μm až 10 μm).

Kapalinová chromatografie, izokratická eluce

Složení mobilní fáze. Množství minoritní složky rozpouštědla

se může upravit v rozmezí ±30 relativních procent nebo

±2 absolutní procenta, podle toho, která hodnota je větší

(viz příklad uvedený výše). Žádnou další složku nelze měnit

o více než 10 absolutních procent.

Hodnota pH vodné složky mobilní fáze. ±0,2 hodnoty pH,

pokud není v článku předepsáno jinak, nebo ±1,0 hodnoty

pH, když zkoušená látka není ionizovaná.


fáze. ±10 %.

Průtoková rychlost. ±50 %; větší úpravy jsou přijatelné,

pokud se změní rozměry kolony (viz vzorec uvedený dále).

Parametry kolony

Stacionární fáze:

– změna identity substituentu stacionární fáze není povolena

(např. nahrazení C18 za C8);

– velikost částic: zmenšení nejvýše o 50 %; zvětšení

není povoleno.

Rozměry kolony:

– délka: ±70 %;

– vnitřní průměr: ±25 %.

Pokud se změní rozměry kolony, může se průtoková

rychlost upravit podle potřeby za použití následujícího

vzorce:

v němž značí:

l d

F = F

2

2

2 2

1 2

l1d1

F1 – průtokovou rychlost uvedenou v článku

v mililitrech za minutu;

F2 – upravenou průtokovou rychlost v mililitrech za minutu;

l1 – délku kolony uvedenou v článku v milimetrech;

l2 – délku použité kolony v milimetrech;

d1 – vnitřní průměr kolony uvedený v článku v milimetrech;

d2 – vnitřní průměr použité kolony v milimetrech.

Teplota. ±10 %, kde je pracovní teplota specifikována,

pokud není předepsáno jinak.

Vlnová délka detektoru. Úprava není povolena.

Nastřikovaný objem. Může se zmenšit za předpokladu, že

detekce píku (píků) a opakovatelnost stanovovaného píku

(stanovovaných píků) je vyhovující; zvýšení není povoleno.

Kapalinová chromatografie, gradientová eluce

Úprava chromatografických podmínek pro gradientový systém

vyžaduje větší opatrnost než pro izokratický systém.

Složení mobilní fáze/gradientová eluce. Malé úpravy složení

mobilní fáze a gradientu jsou přijatelné, pokud se zajistí že:

– požadavky způsobilosti systému jsou splněny;

– hlavní pík (píky) se eluuje (eluují) do ±15 % uvedeného

retenčního času (uvedených retenčních časů);

– eluční síla konečného složení mobilní fáze není slabší než

u předepsaného složení.

Pokud nelze dosáhnout shody s požadavky způsobilosti

systému, je často vhodnější uvážit mrtvý objem chromatografického

systému nebo vyměnit kolonu.

Mrtvý objem chromatografického systému. Konfigurace použitého

zařízení může významně změnit rozlišení, retenční

,

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 173


čas a relativní retence popsané v konkrétní metodě. To může

být způsobeno zvětšeným mrtvým objemem chromatografického

systému. Lékopisné články, pokud možno, začleňují

izokratickou část před startem gradientového programu

tak, aby se mohly upravit časové body gradientu

s přihlédnutím k rozdílům mezi mrtvými objemy chromatografického

systému použitého pro vývoj metody a aktuálně

použitým chromatografickým systémem. Je na zodpovědnosti

uživatele, aby přizpůsobil délku izokratické části

použitému analytickému zařízení. Pokud je mrtvý objem

chromatografického systému použitý při vypracování metody

uveden v článku, mohou se časové body (t min) uvedené

v tabulce gradientu nahradit korigovanými časovými

body (tc min) vypočítanými za použití následujícího vzorce:

v němž značí:

D – mrtvý objem chromatografického systému v mililitrech;

D0 – mrtvý objem chromatografického systému použitý při

vývoji metody v mililitrech;

F – průtoková rychlost v mililitrech za minutu.

Izokratická část uvedená pro tyto účely se může vynechat,

pokud jsou dostupné validované údaje pro použití metody

bez této části.

Hodnota pH vodné složky mobilní fáze. Úprava není povolena.


fáze. Úprava není povolena.

Průtoková rychlost. Úprava je přijatelná, pokud se změní

rozměry kolony (viz vzorec uvedený dále).

Parametry kolony


– změna identity substituentu stacionární fáze není povolena

(např. nahrazení C18 za C8);

– velikost částic: úprava není povolena.

Rozměry kolony:

– délka: ±70 %;


Pokud se změní rozměry kolony, průtoková rychlost se

může upravit podle potřeby za použití následujícího

vzorce:

v němž značí:

( D D0

) ,

-

t c

= t -

F

l d

F = F

2

2

2 2

1

,

2

l1d1

F1 – průtokovou rychlost uvedenou v článku v mililitrech

za minutu;

F2 – upravenou průtokovou rychlost v mililitrech za minutu;

l1 – délku kolony uvedenou v článku v milimetrech;

l2 – délku použité kolony v milimetrech;

d1 – vnitřní průměr kolony uvedený v článku v milimetrech;

d2 – vnitřní průměr použité kolony v milimetrech.

Teplota. ±5 %, kde je pracovní teplota specifikována,

pokud není předepsáno jinak.



detekce píku (píků) a opakovatelnost stanovovaného píku

(stanovovaných píků) je vyhovující; zvýšení není povoleno.

Plynová chromatografie

Parametry kolony



není povoleno (náplňové kolony);

– tloušťka filmu: –50 % až +100 % (kapilární kolony).

Rozměry kolony:

– délka: ±70 %;


Průtoková rychlost. ±50 %.

Teplota. ±10 %.

Nastřikovaný objem a dělicí objem. Může se upravit za

předpokladu, že detekce a opakovatelnost jsou vyhovující.

Superkritická fluidní chromatografie

Složení mobilní fáze. Pro náplňové kolony se může množství

minoritní složky rozpouštědla upravit v rozmezí

±30 relativních procent nebo ±2 absolutní procenta, podle

toho, která hodnota je větší. Při použití kapilárních kolon

není úprava povolena.


Parametry kolony



není povoleno (náplňové kolony).

Rozměry kolony:

– délka: ±70 %;

– vnitřní průměr:

±25 % (náplňové kolony);

±50 % (kapilární kolony).

Průtoková rychlost. ±50 %.

Teplota. ±5 °C, kde je pracovní teplota specifikována.


detekce a opakovatelnost je vyhovující; zvýšení není povoleno.


Během kvantitativní analýzy se nepřihlíží k píkům rozpouštědel

a zkoumadel nebo k píkům mobilní fáze nebo matrice

vzorku.

– Citlivost detektoru. Citlivost detektoru je výstupní signál

na jednotku koncentrace nebo jednotku hmotnosti látky

v mobilní fázi, která vstupuje do detektoru. Relativní faktor

odezvy detektoru, běžně uváděný jako odezvový faktor,

vyjadřuje citlivost detektoru k dané látce, vztaženou

ke standardní látce. Korekční faktor je převrácená hodnota

odezvového faktoru.

– Metoda vnějšího standardu. Koncentrace stanovované

složky (stanovovaných složek) se určí porovnáním odezvy

píku složky (píků složek) naměřené pro zkoušený

roztok a odpovídající odezvy naměřené pro porovnávací

roztok.

174 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.47 KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA

– Metoda vnitřního standardu. Ke zkoušenému roztoku

a porovnávacímu roztoku se přidají stejná množství látky,

kterou lze rozlišit od zkoušené látky (vnitřní standard).

Vnitřní standard se vybere tak, aby nereagoval se zkoušenou

látkou, byl stálý a neobsahoval nečistoty se stejným

retenčním časem jako zkoušená látka. Koncentrace zkoušené

látky se stanoví porovnáním poměru ploch píků nebo

výšek píků stanovované látky a vnitřního standardu

pro zkoušený roztok a odpovídajícího poměru pro porovnávací

roztok.

– Metoda normalizace. Obsah složek ve zkoušené látce

v procentech se vypočítá stanovením plochy odpovídajícího

píku jako procenta celkové plochy všech píků, s výjimkou

píků rozpouštědel, zkoumadel nebo píků mobilní

fáze nebo matrice vzorku a píků, jejichž plocha je rovna

limitu zanedbatelnosti nebo nižší.

– Kalibrační postup. Stanoví se vztah mezi měřeným nebo

vyhodnocovaným signálem (y) a množstvím (koncentrace,

hmotnost atd.) stanovované látky (x) a vypočítá se kalibrační

funkce. Výsledky analýzy se vypočítají ze změřeného

nebo vyhodnoceného signálu stanovované látky

pomocí inverzní funkce.

Ve zkouškách na příbuzné látky, jak metodou vnějšího

standardu, kdy se použije pro porovnání zředěný roztok

zkoušené látky, tak metodou normalizace, se použijí korekční

faktory uvedené v lékopisném článku (tj. je-li odezvový

faktor mimo rozmezí 0,8 až 1,2).

Jestliže je ve zkoušce na příbuzné látky předepsán celkový

obsah nečistot nebo stanovení obsahu některé nečistoty, je

důležité zvolit vhodné nastavení prahové hodnoty a vhodné

podmínky pro integraci ploch píků. U takovýchto zkoušek

je limit zanedbatelnosti (tj. limit, při kterém nebo pod kterým

se k píku nepřihlíží) obecně 0,05 %. Plochy píků nečistot,

které nejsou úplně odděleny od hlavního píku, jsou

přednostně integrovány za použití extrapolace sedlo – sedlo

(tangenciální oddělení minoritního píku).


10.1:20247

OBECNÉ PRINCIPY

Kapilární elektroforéza je fyzikální analytická metoda založená

na migraci elektricky nabitých stanovovaných látek

rozpuštěných v roztoku elektrolytu kapilárou vlivem stejnosměrného

elektrického pole.

Migrační rychlost stanovované látky v elektrickém poli

o intenzitě E je určena elektroforetickou pohyblivostí stanovované

látky a elektroosmotickou pohyblivostí tlumivého

roztoku v kapiláře. Elektroforetická pohyblivost rozpuštěné

látky (µep) závisí na jejích vlastnostech (elektrický náboj,

velikost a tvar molekuly) a na vlastnostech tlumivého

roztoku, v němž migrace probíhá (typ a iontová síla roztoku

elektrolytu, hodnota pH, viskozita a přísady). Elektroforetická

rychlost (nep) rozpuštěné látky je, za předpokladu kulového

tvaru nabité molekuly, dána vzorcem:

æ q ö æV

ö

n

ep

= µ

ep

× E = ç ÷ × ç ÷ ,

è 6πhr

ø è L ø

1

v němž značí:

q – efektivní náboj rozpuštěné látky;

h – viskozitu roztoku elektrolytu;

r – Stokesův poloměr rozpuštěné látky;

V – vložené napětí;

L – celkovou délku kapiláry.

Vlivem elektrického pole vzniká uvnitř kapiláry naplněné

tlumivým roztokem tok rozpouštědla nazývaný elektroosmotický

tok. Rychlost elektroosmotického toku je dána

elektroosmotickou pohyblivostí (µeo), která závisí na hustotě

náboje na vnitřní stěně kapiláry a vlastnostech tlumivého

roztoku. Elektroosmotická rychlost (neo) je dána vzorcem:

æ ez ö æV

ö

n

eo

= µ

eo

× E = ç ÷ × ç ÷ ,

è h ø è L ø

v němž značí:

e – permitivitu tlumivého roztoku;

z – elektrokinetický (zeta) potenciál povrchu kapiláry.

Rychlost rozpuštěné látky (n) je dána vzorcem:

n = n ep

+ n eo

Elektroforetická pohyblivost a elektroosmotická pohyblivost

stanovované látky mohou mít stejný, nebo opačný

směr v závislosti na náboji rozpuštěné látky. V normální

kapilární elektroforéze migrují anionty opačným směrem

než elektroosmotický tok a jejich rychlosti jsou nižší než

elektroosmotická rychlost. Kationty migrují stejným směrem

jako elektroosmotický tok a jejich rychlosti jsou vyšší

než elektroosmotická rychlost. Při velké elektroosmotické

rychlosti se vzhledem k elektroforetické rychlosti rozpuštěných

látek mohou kationty a anionty separovat současně.

Čas (t), který rozpuštěná látka potřebuje k migraci po vzdálenosti

(l), tj. od místa nástřiku do bodu detekce (efektivní

délka kapiláry), je dán vzorcem:

t =

n

l

+ n

=

Obecně mají nepotažené křemenné kapiláry při hodnotě pH

vyšší než 3 na své vnitřní stěně záporný náboj odpovídající

ionizovaným silanolovým skupinám, proto je elektroosmotický

tok od anody ke katodě. Pro získání dobré reprodukovatelnosti

migrační rychlosti rozpuštěných látek musí zůstat

elektroosmotický tok konstantní od analýzy k analýze. Pro

některá použití je nutné snížit nebo potlačit elektroosmotický

tok modifikací vnitřní stěny kapiláry nebo změnou koncentrace,

složení a/nebo hodnoty pH tlumivého roztoku.

Po nástřiku vzorku do kapiláry migruje každý iont stanovovaného

vzorku nosným elektrolytem jako nezávislá zóna

podle své elektroforetické pohyblivosti. Rozptyl zóny, což

je rozšíření pásu každé rozpuštěné látky, je výsledkem několika

různých jevů. V ideálním případě je jediným příspěvkem

k rozšíření zóny rozpuštěné látky molekulární

difuze rozpuštěné látky podél kapiláry (podélná difuze).

V tomto ideálním případě je účinnost separace, vyjádřená

jako počet teoretických pater (N), dána vzorcem:

.

l × L

( µ + µ ) V

ep eo ep eo

×

.

Zkušební

metody

2.2

––––––––––––––––––––––––––––––

1


ČL 2017 – Dopl. 2020 175


µ

ep

+ µ

eo

× V × l

,

2 × D × L

v němž značí:

D – molekulární difuzní koeficient rozpuštěné látky

v tlumivém roztoku.

V praxi mohou k rozšíření pásu významně přispívat i jiné

jevy, jako je uvolňované teplo, adsorpce vzorku na stěnu

kapiláry, rozdíly elektrické vodivosti vzorku a tlumivého

roztoku (elektrodisperze), délka vstřikovacího pístu, velikost

(délka) detekční cely a nestejná úroveň hladin elektrolytu

v elektrodových nádobkách.

Separace mezi dvěma pásy (vyjádřené jako rozlišení RS) se

může dosáhnout modifikací elektroforetické pohyblivosti

stanovované látky, elektroosmotické pohyblivosti vyvolané

v kapiláře a zvýšením účinnosti pro pás každé stanovované

látky podle vzorce:

v němž značí:

N =

( )

( µ

epb

- µ

epa

)

( µ + µ )

µepa a µepb – elektroforetické pohyblivosti dvou separovaných

stanovovaných látek;

– střední elektroforetickou pohyblivost dvou

µ ep

R

S

=

N

4

1

stanovovaných látek µ = µ + .

2

ZAŘÍZENÍ

Zařízení pro kapilární elektroforézu se skládá:

– z řiditelného zdroje stejnosměrného vysokého napětí;

– ze dvou nádobek na tlumivý roztok, udržovaných na stejné

úrovni, obsahujících předepsaný anodický a katodický

roztok;

– ze dvou elektrod (anody a katody) ponořených do nádobek

s tlumivým roztokem a připojených ke zdroji;

– ze separační kapiláry (obvykle z taveného křemene),

která, je-li používána s určitými druhy detektorů, má

v místě detekce opticky průhledné okénko; konce kapiláry

jsou umístěny v nádobkách s tlumivým roztokem;

kapilára je naplněna roztokem předepsaným v lékopisném

článku;

– ze vhodného vstřikovacího systému;

– z detektoru schopného sledovat množství zkoumané látky

procházející úsekem kapiláry v daném čase, je obvykle

založen na absorpční spektrofotometrii (ultrafialové a viditelné)

nebo fluorimetrii, ale pro určitá použití může být

vhodná vodivostní, ampérometrická nebo hmotnostně

spektrometrická detekce; alternativní metodou používanou

k detekci látek neabsorbujících UV záření a nefluoreskujících

je nepřímá detekce;

– z termostatového systému schopného udržovat konstantní

teplotu uvnitř kapiláry (doporučuje se pro získání dobré

opakovatelnosti separace);

– ze zapisovače a vhodného integrátoru nebo počítače.

ep

eo

,

( )

ep epb

µ

epa

Pro přesnou kvantitativní analýzu je kritické určení způsobu

dávkování a jeho automatizace. Dávkování může být

hydrodynamické (hydrostatické, tlakové nebo vakuové)

a elektrokinetické. Množství každé složky vzorku dávkované

elektrokineticky závisí na její elektroforetické pohyblivosti,

takže používání tohoto způsobu nástřiku vede k různému

zastoupení nabitých složek v kapiláře.

Použije se kapilára, tlumivé roztoky, metoda předúpravy

kapiláry, roztok vzorku a migrační podmínky předepsané

v článku uvažované látky. Použitý roztok elektrolytu se

zfiltruje, aby se odstranily částice, a odplyní, aby se zabránilo

tvorbě bublin, které způsobují rušení při detekci nebo

přerušení elektrického proudu v kapiláře během separace.

Pro každou analytickou metodu se musí vyvinout důkladný

promývací postup, aby se dosáhlo reprodukovatelných migračních

časů rozpuštěných látek.

ZÓNOVÁ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA

PRINCIP

Při zónové kapilární elektroforéze jsou stanovované látky

separovány v kapiláře obsahující pouze tlumivý roztok bez

jakéhokoliv média zabraňujícího proudění. Při této metodě

dochází k separaci na základě různé rychlosti migrace jednotlivých

složek migrujících v oddělených pásech. Rychlost

každého pásu závisí na elektroforetické pohyblivosti

rozpuštěné látky a elektroosmotickém toku v kapiláře

(viz Obecné principy). Pro zvýšení účinnosti separace látek,

které jsou adsorbovány na povrch z taveného křemene, se

mohou použít kapiláry s potaženým vnitřním povrchem.

Tato varianta kapilární elektroforézy se může použít pro

analýzu jak malých (Mr < 2000), tak i velkých molekul

(2000 < Mr < 100 000). Díky vysoké účinnosti, které se

v kapilární elektroforéze ve volném roztoku dosahuje, se

může provádět separace molekul, které mají jen nepatrný

rozdíl v poměru náboje k hmotnosti. Tento způsob separace

umožňuje také separaci chirálních látek přidáním chirálního

selektoru do separačního tlumivého roztoku.

OPTIMALIZACE

Optimalizace separace je komplexní proces, v němž mohou

hrát významnou roli různé separační parametry. Hlavní faktory,

které je třeba brát v úvahu při vývoji separace, jsou instrumentální

parametry a parametry roztoku elektrolytu.

Instrumentální parametry

Napětí. K optimalizaci vloženého napětí a teploty kolony je

užitečné zaznamenávat Jouleovo teplo. Čas separace je nepřímo

úměrný vloženému napětí. Zvýšení napětí však může

způsobit nadměrnou tvorbu tepla, které zvyšuje teplotu, výsledkem

je gradient viskozity tlumivého roztoku v kapiláře.

Tento jev způsobuje rozšíření pásu a snižuje rozlišení.

Polarita. Polarita elektrody může být normální (anoda na

vstupu a katoda na výstupu) a elektroosmotický tok směřuje

ke katodě. Pokud je elektroda přepólovaná, elektroosmotický

tok jde mimo výstup a pouze nabité stanovované látky

s elektroforetickou pohyblivostí vyšší než elektroosmotický

tok budou směřovat k výstupu.

Teplota. Teplota ovlivňuje především viskozitu a elektrickou

vodivost tlumivého roztoku, a tím i migrační rychlost.

V některých případech může zvýšení teploty způsobit konformační

změny bílkovin, což pozmění jejich migrační čas

a účinnost separace.

Kapilára. Rozměry kapiláry (délka a vnitřní průměr) ovlivňují

čas analýzy, účinnost separace a kapacitu. Zvýšení celkové

délky snižuje intenzitu elektrického pole (při konstantním

napětí), což prodlouží migrační čas. Pro daný tlu-

176 ČL 2017 – Dopl. 2020


mivý roztok a intenzitu elektrického pole závisí uvolněné

teplo a tím i rozšíření pásu vzorku na vnitřním průměru kapiláry.

Ten také ovlivňuje detekční limit, který dále závisí

na nastříknutém objemu vzorku a použitém detekčním systému.

Jelikož adsorpce složek vzorku na stěnu kapiláry omezuje

účinnost, musí se při vývoji separační metody brát v úvahu

postupy, které těmto interakcím zabraňují. V případě bílkovin

bylo navrženo několik metod, jak zabránit adsorpci na

stěnu kapiláry. Některé z těchto metod vyžadují pouze modifikaci

složení tlumivého roztoku (použití extrémní hodnoty

pH, adsorpce kladně nabitých přísad tlumivého roztoku).

V jiných případech je vnitřní stěna kapiláry potažena polymerem

kovalentně vázaným na oxid křemičitý, který zabraňuje

interakcím mezi bílkovinami a záporně nabitým

křemenným povrchem. Pro tyto účely jsou dostupné komerční

kapiláry potažené neutrálními hydrofilními, kationtovými

a aniontovými polymery.

Parametry roztoku elektrolytu

Typ tlumivého roztoku a koncentrace. Vhodné tlumivé roztoky

pro kapilární elektroforézu mají přiměřenou tlumivou

kapacitu ve vybrané oblasti pH a nízkou elektrickou vodivost,

aby se minimalizoval procházející elektrický proud.

Pro minimalizaci deformace pásu je důležité přizpůsobit

pohyblivost iontu tlumivého roztoku pohyblivosti rozpuštěné

látky, pokud je to možné. Pro zaostření pásu vzorku

v kapiláře, které zvyšuje separační účinnost a zlepšuje detekci,

je také důležitý typ použitého rozpouštědla vzorku.

Zvýšení koncentrace tlumivého roztoku (pro danou hodnotu

pH) snižuje elektroosmotický tok a rychlost rozpuštěné

látky.

Hodnota pH tlumivého roztoku. Hodnota pH tlumivého roztoku

může ovlivnit separaci změnou náboje stanovované

látky nebo přísad a změnou elektroosmotického toku. Při

separaci bílkovin a peptidů se při změně pH z hodnoty nad

izoelektrickým bodem (pI) na hodnotu pod izoelektrickým

bodem změní výsledný náboj rozpuštěné látky ze záporného

na kladný. Zvýšení hodnoty pH tlumivého roztoku

obecně zvyšuje elektroosmotický tok.

Organická rozpouštědla. Organické modifikátory (methanol,

acetonitril atd.) se mohou přidat do vodného tlumivého

roztoku pro zvýšení rozpustnosti zkoušené látky nebo jiných

přísad a/nebo pro ovlivnění stupně ionizace složek

vzorku. Přídavek těchto organických modifikátorů do tlumivého

roztoku obecně způsobuje snížení elektroosmotického

toku.

Přísady pro chirální separace. Pro separaci enantiomerů se

do separačního tlumivého roztoku přidává chirální selektor.

Nejběžněji používané chirální selektory jsou cyklodextriny,

ale mohou se také používat cyklické polyethery (crown

ethery), polysacharidy a bílkoviny. Jelikož chirální rozlišení

je řízeno rozdílnými interakcemi chirálního selektoru

s každým z enantiomerů, závisí dosažené rozlišení chirálních

látek do značné míry na typu použitého chirálního selektoru.

V tomto ohledu může být pro vývoj dané separace

užitečné zkoušet cyklodextriny s různou velikostí dutiny

(a-, b-, nebo g-cyklodextrin) nebo modifikované cyklodextriny

s neutrálními (methyl-, ethyl-, hydroxyalkyl- atd.) nebo

ionizovatelnými (aminomethyl-, karboxymethyl-, sulfobutylether

atd.) skupinami. Při použití modifikovaných

cyklodextrinů se musí brát v úvahu odchylky mezi jednotlivými

šaržemi ve stupni substituce cyklodextrinů, které

mohou ovlivňovat selektivitu. Další faktory, které řídí rozlišení

při chirálních separacích, jsou koncentrace chirálního

selektoru, složení a hodnota pH tlumivého roztoku a teplota.

Dosažené rozlišení se může také pozměnit použitím organických

přísad, jako je methanol nebo močovina.

KAPILÁRNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA

PRINCIP

V kapilární gelové elektroforéze se separace provádí

v kapiláře naplněné gelem, který působí jako molekulové

síto. Molekuly se stejnými poměry náboje ke hmotnosti

jsou separovány podle velikostí molekul, protože malé molekuly

se pohybují v síti gelu snadněji a tedy migrují rychleji

než větší molekuly. Různé biologické makromolekuly

(např. bílkoviny a fragmenty DNA), které mají stejné poměry

náboje k molekulové hmotnosti, se mohou separovat

kapilární gelovou elektroforézou podle jejich molekulové

hmotnosti.

CHARAKTERISTIKY GELŮ

V kapilární elektroforéze se používají dva typy gelů: trvale

potažené gely a dynamicky potažené gely. Trvale potažené

gely, jako je sesíťovaný polyakrylamid, se připravují

v kapiláře polymerací monomerů. Jsou obvykle navázány

na stěnu z taveného křemene a nemohou se odstranit bez

zničení kapiláry. Pokud se gely používají pro analýzu bílkovin

za redukčních podmínek, obsahuje separační tlumivý

roztok obvykle natrium-dodecyl-sulfát a vzorky jsou před

nástřikem denaturovány zahříváním ve směsi natrium-dodecyl-sulfátu

a 2-merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu.

Při použití za neredukčních podmínek (např. dotyk s protilátkou)

se 2-merkaptoethanol nebo dithiothreitol nepoužijí.

Separace v sesíťovaných gelech se může optimalizovat

modifikací separačního tlumivého roztoku (jak je naznačeno

v oddíle zónová kapilární elektroforéza) a regulací porozity

gelu při jeho přípravě. Porozita sesíťovaných polyakrylamidových

gelů může být ovlivněna změnou koncentrace

akrylamidu a/nebo zastoupením síťovadla. Je pravidlem, že

snížení porozity gelu vede ke snížení pohyblivosti rozpuštěných

látek. Vzhledem k tuhosti těchto gelů se může používat

pouze elektrokinetický nástřik.

Dynamicky potažené gely jsou hydrofilní polymery, jako

jsou lineární polyakrylamid, deriváty celulosy, dextranu

atd., které se mohou rozpustit ve vodných separačních tlumivých

roztocích za vzniku separačního média působícího

rovněž jako molekulové síto. Tato separační média se připravují

snáze než sesíťované polymery. Mohou se připravit

v nádobce a tlakem naplnit do kapiláry s potaženou vnitřní

stěnou (bez elektroosmotického toku). Výměna gelu před

každým nástřikem obecně zlepšuje reprodukovatelnost separace.

Porozita gelů se může zvýšit použitím polymerů

o vyšší molekulové hmotnosti (při dané koncentraci polymeru)

nebo snížením koncentrace polymeru (při dané molekulové

hmotnosti polymeru). Snížení porozity gelu vede

ve stejném tlumivém roztoku ke snížení pohyblivosti rozpuštěné

látky. Rozpuštěním těchto polymerů v tlumivém

roztoku vznikají roztoky s nízkou viskozitou, proto se může

použít jak hydrodynamický, tak elektrokinetický nástřik.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 177


KAPILÁRNÍ IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE

PRINCIP

Při izoelektrické fokusaci migrují molekuly vlivem elektrického

pole, pokud jsou nabité, v gradientu pH utvářeném

amfolyty se širokým rozsahem pI (polyaminokarboxylové

kyseliny), rozpuštěnými v separačním tlumivém roztoku.

Třemi základními kroky izoelektrické fokusace jsou plnění,

fokusace a mobilizace.

Plnění. Mohou se použít dva postupy:

– jednostupňové plnění: vzorek se smíchá s amfolyty a zavede

se do kapiláry tlakem nebo vakuem;

– postupné plnění: do kapiláry se postupně zavede vedoucí

tlumivý roztok, amfolyty, vzorek smíchaný s amfolyty,

opět samotné amfolyty a nakonec koncový tlumivý

roztok; objem vzorku musí být dostatečně malý, aby

neovlivňoval gradient pH.

Fokusace. Vlivem vloženého napětí migrují amfolyty podle

svého výsledného náboje ke katodě nebo k anodě, takže

vytvářejí gradient pH od anody (nižší pH) ke katodě

(vyšší pH). Během tohoto kroku se separované složky pohybují,

dokud nedosáhnou pH odpovídajícího jejich izoelektrickému

bodu (pI) a proud pak poklesne na velmi

malé hodnoty.

Mobilizace. Pokud je k detekci požadována mobilizace,

použije se jedna z následujících metod:

– v první metodě se mobilizace dosáhne během fokusace vlivem

elektroosmotického toku; elektroosmotický tok musí

být dostatečně malý, aby se dosáhlo fokusace složek;

– ve druhé metodě se mobilizace dosáhne působením pozitivního

tlaku po fokusaci;

– ve třetí metodě se mobilizace dosáhne po fokusaci přidáním

solí do katodové nebo anodové nádobky (v závislosti

na směru pro vybranou mobilizaci), aby se změnila hodnota

pH v kapiláře, když je vloženo napětí; protože se

změní hodnota pH, bílkoviny a amfolyty se mobilizují ve

směru elektrodové nádobky, která obsahuje přidané soli,

a procházejí detektorem.

Dosažená separace vyjádřená jako ΔpI závisí na gradientu

pH (dpH/dx), počtu amfolytů s rozdílnou hodnotou pI, molekulárním

difuzním koeficientu (D), intenzitě elektrického

pole (E) a změně elektroforetické pohyblivosti stanovované

látky v závislosti na pH (-dµ/dpH):

DpI

= 3 ×

( dpH dx)

(-

dµ

dpH)

D

E

OPTIMALIZACE

Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace,

jsou:

Napětí. Při kapilární izoelektrické fokusaci se používá

velmi vysoká intenzita elektrického pole, 300 V/cm až

1000 V/cm při fokusačním kroku.

Kapilára. Podle zvolené metody mobilizace (viz výše) se

musí snížit nebo potlačit elektroosmotický tok. Ke snížení

elektroosmotického toku slouží kapiláry s potaženou vnitřní

stěnou.

Roztoky. Anodová nádobka je naplněna roztokem s hodnotou

pH nižší, než je pI nejkyselejšího amfolytu, a katodová

.

nádobka roztokem s hodnotou pH vyšší, než je pI nejzásaditějšího

amfolytu. Nejčastěji se používá kyselina fosforečná

pro anodu a hydroxid sodný pro katodu.

Přidání polymeru, jako je např. methylcelulosa, vede zvýšením

viskozity k potlačení proudění (pokud je nějaké)

a elektroosmotického toku. Jsou dostupné komerční amfolyty

v mnoha rozsazích pH, které se mohou smíchat k získání

rozšířené oblasti pH. Široké rozsahy pH jsou používány

k odhadu izoelektrického bodu, zatímco užší rozsahy

ke zvýšení přesnosti. Kalibrace se provádí přiřazením migračního

času izoelektrickému bodu pro sérii standardních

bílkovin (se známými hodnotami izoelektrického bodu).

Pokud je to nutné, zabrání se srážení bílkovin během fokusace

přidáním přísad, jako např. glycerolu, tenzidů, močoviny

nebo obojetných iontů (zwitteriontů) do tlumivého

roztoku. V závislosti na koncentraci však močovina denaturuje

bílkoviny.

MICELÁRNÍ ELEKTROKINETICKÁ

CHROMATOGRAFIE (MEKC)

PRINCIP

Při micelární elektrokinetické chromatografii se separace

provádí v elektrolytovém roztoku, který obsahuje tenzid

v koncentraci vyšší než kritická micelární koncentrace

(cmc). Molekuly rozpuštěné látky jsou rozděleny podle jejího

rozdělovacího koeficientu mezi vodný tlumivý roztok

a pseudostacionární fázi tvořenou micelami. Tato metoda se

tedy může považovat za kombinaci elektroforézy a chromatografie.

Je to metoda, která se může použít pro separaci jak

neutrálních, tak nabitých rozpuštěných látek při zachování

účinnosti, rychlosti a instrumentální vhodnosti kapilární

elektroforézy. Jedním z nejčastěji používaných tenzidů

v micelární elektrokinetické chromatografii je aniontový

tenzid natrium-dodecyl-sulfát, i když se také používají jiné,

např. kationtové tenzidy, jako jsou cetrimoniové soli.

Separační mechanismus je následující. Při neutrálním a alkalickém

pH se tvoří silný elektroosmotický tok, který unáší

ionty i neutrální molekuly separačního tlumivého roztoku

směrem ke katodě. Pokud se jako tenzid použije natrium-dodecyl-sulfát,

má elektroforetická migrace aniontových micel

opačný směr, tj. k anodě. Výsledkem je, že celková rychlost

migrace micel je zpomalena ve srovnání s objemovým tokem

elektrolytu. V případě neutrálních rozpuštěných látek, kdy se

stanovovaná látka může rozdělit mezi micely a vodný tlumivý

roztok a nemá elektroforetickou pohyblivost, bude migrační

rychlost stanovované látky záviset pouze na rozdělovacím

koeficientu mezi micelou a vodným tlumivým roztokem.

Na elektroforeogramu jsou píky každé z nenabitých

rozpuštěných látek vždy mezi píkem indikátoru elektroosmotického

toku a píkem indikátoru micel (čas ohraničený těmito

dvěma píky se nazývá separační okno). Migrační rychlost

elektricky nabitých rozpuštěných látek závisí jak na jejich

rozdělovacím koeficientu mezi micelami a vodným tlumivým

roztokem, tak na jejich elektroforetické pohyblivosti

v roztoku neobsahujícím micely.

Protože mechanismus neutrálních a slabě ionizovaných

rozpuštěných látek je v micelární elektrokinetické chromatografii

v podstatě chromatografický, migrace rozpuštěné

látky a rozlišení mohou být vysvětleny pojmem retenční

faktor rozpuštěné látky (k´), známým též jako hmotnostní

178 ČL 2017 – Dopl. 2020


distribuční poměr (Dm), což je poměr látkového množství

rozpuštěné látky v micelách k látkovému množství rozpuštěné

látky v mobilní fázi. Pro neutrální látku je k´ dáno

vzorcem:

t - t

æ t ö

R

t

ç

t

÷

0 × 1 -

è mc ø

R 0

k ´ =

= K ×

v němž značí:

tR – migrační čas rozpuštěné látky;

t0 – čas analýzy nezadržované rozpuštěné látky (určí se

nástřikem indikátoru elektroosmotického toku, který

nevstupuje do micel, např. methanolu);

tmc – migrační čas micel (měří se nástřikem micelového indikátoru,

jako je Sudan III, který migruje nepřetržitě

zadržován micelami);

K – rozdělovací koeficient rozpuštěné látky;

VS – objem micelární fáze;

VM – objem mobilní fáze.

Podobně je rozlišení dvou těsně migrujících látek (RS) dáno

vzorcem:

R

S

=

æ t ö

0

1-

ç

÷

N a -1

k¢

è t

b

mc

× × ×

ø ,

4 a k¢

b

+ 1 æ t ö

0

1+

k¢

×

ç

÷

a

è tmc

ø

v němž značí:

N – počet teoretických pater pro jednu z rozpuštěných

látek;

a – selektivitu;

k'a, k'b – retenční faktory obou rozpuštěných látek

(kde k'b > k'a).

Podobně, ale ne identicky, jsou dány rovnice pro hodnoty

k´ a RS elektricky nabitých rozpuštěných látek.

OPTIMALIZACE

Hlavní parametry, které je třeba brát v úvahu při vývoji separace

pomocí micelární elektrokinetické chromatografie, jsou

parametry instrumentální a parametry roztoku elektrolytu.

Instrumentální parametry

Napětí. Čas separace je nepřímo úměrný vloženému napětí.

Zvýšení napětí však může způsobit nadměrnou tvorbu tepla,

které tvoří gradient teploty a viskozity v průřezu kapiláry.

Tento jev může být významný při použití vysoce vodivých

tlumivých roztoků, jakými jsou roztoky obsahující

micely. Nedostatečný odvod tepla způsobuje rozšíření pásů

a snižuje rozlišení.

Teplota. Změny teploty v kapiláře ovlivňují rozdělovací

koeficient látky mezi tlumivým roztokem a micelami, kritickou

micelární koncentraci a viskozitu tlumivého roztoku.

Tyto parametry přispívají k migračnímu času rozpuštěných

látek. Použití dobrého chladicího systému zlepšuje reprodukovatelnost

migračních časů rozpuštěných látek.

Kapilára. Stejně jako v kapilární elektroforéze ve volném

roztoku ovlivňují rozměry kapiláry (délka a vnitřní průměr)

čas analýzy a účinnost separace. Prodloužení kapiláry snižuje

intenzitu elektrického pole (při konstantním napětí),

V

V

S

M

,

zvyšuje migrační čas a zvyšuje účinnost separace. Vnitřní

průměr ovlivňuje odvod tepla (pro daný tlumivý roztok

a intenzitu elektrického pole) a následně rozšíření pásu

vzorku.

Parametry roztoku elektrolytu

Typ tenzidu a koncentrace. Typ tenzidu (povrchově aktivní

látky), stejně jako stacionární fáze v chromatografii, ovlivňuje

rozlišení, neboť spoluurčuje selektivitu separace. Také

hodnota log k´ neutrální látky vzrůstá lineárně s koncentrací

tenzidu v mobilní fázi. Protože rozlišení při micelární elektrokinetické

chromatografii dosahuje maxima, když se k´

přiblíží k hodnotě , ovlivňuje změna koncentrace

t mc

t 0

tenzidu v mobilní fází dosažené rozlišení.

Hodnota pH tlumivého roztoku. I když hodnota pH neovlivňuje

rozdělovací koeficient neionizovaných rozpuštěných

látek, může ovlivnit elektroosmotický tok v nepotažené kapiláře.

Snížení hodnoty pH tlumivého roztoku snižuje elektroosmotický

tok, a tím zvyšuje rozlišení neutrálních rozpuštěných

látek při micelární elektrokinetické chromatografii.

Výsledkem je delší čas analýzy.

Organická rozpouštědla. Pro zlepšení separace hydrofobních

látek při micelární elektrokinetické chromatografii se

mohou do roztoku elektrolytu přidat organická rozpouštědla

(methanol, propan-1-ol, acetonitril atd.). Přídavek těchto

rozpouštědel obvykle snižuje migrační čas a selektivitu

separace. Protože přídavek organických rozpouštědel

ovlivňuje kritickou micelární koncentraci, může se daná

koncentrace tenzidu použít pouze s určitou maximální koncentrací

organického rozpouštědla, nad níž dochází k rozpadu

micel. Rozpad micel v přítomnosti vysokého obsahu

organického rozpouštědla neznamená vždy, že separace není

dále možná, v některých případech tvoří hydrofobní interakce

mezi monomerem iontového tenzidu a neutrálními

látkami solvofobní komplexy, které se mohou separovat

elektroforeticky.

Přísady pro chirální separace. Pro separaci enantiomerů

chirálních látek použitím micelární elektrokinetické chromatografie

je v micelárním systému obsažen chirální selektor

buď kovalentně vázaný na tenzid, nebo přidaný do

micelárního separačního média. Mezi micely tvořené molekulami,

které obsahují skupiny s vlastnostmi chirálního

selektoru, patří soli N-dodekanoyl-L-aminokyselin, soli žlučových

kyselin atd. Chirálního rozlišení se také může dosáhnout

přidáním chirálních selektorů, jako jsou cyklodextriny,

do elektrolytového roztoku, který obsahuje micelizovaný

achirální tenzid.

Další přísady. Modifikace selektivity přidáním činidel do

tlumivého roztoku se může provádět různými způsoby. Přidání

různých typů cyklodextrinů do tlumivého roztoku se

může také použít k potlačení interakcí hydrofobních rozpuštěných

látek s micelami a tím ke zvýšení selektivity pro

tento typ látek.

Ke zlepšení selektivity separace se při micelární elektrokinetické

chromatografii používá přídavku látek, které mohou

ovlivnit interakce rozpuštěné látky s micelou adsorpcí na

micely. Touto přísadou může být druhý tenzid (ionogenní

nebo neionogenní), který způsobuje vznik směsných micel,

nebo kationty kovů, které se rozpouštějí v micelách a tvoří

koordinační komplexy s rozpuštěnými látkami.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 179

2.2.48 RAMANOVA SPEKTROSKOPIE


Plochy píků se musí vydělit odpovídajícími migračními časy

za vzniku korigovaných ploch, aby se kompenzoval:

– posun migračních časů od analýzy k analýze, a tím zmenšil

rozptyl odezvy;

– rozdíl v odezvách složek vzorku s různými migračními

časy.

Pokud se použije vnitřní standard, ověří se, že žádný pík

zkoušené látky není překryt píkem vnitřního standardu.

VÝPOČTY

Ze získaných hodnot se vypočítá obsah zkoušené složky

nebo složek. Je-li předepsán obsah jedné nebo více složek

zkoušené látky v procentech, vypočítá se stanovením korigované

plochy píku (píků) jako procenta celkové korigované

plochy všech píků vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv

přidaného činidla (metoda normalizace). Doporučuje

se použití automatického integračního systému (integrátoru

nebo systému pro sběr a zpracování dat).


Pro kontrolu chování systému kapilární elektroforézy se

používají parametry způsobilosti systému. Výběr těchto parametrů

závisí na použitém způsobu kapilární elektroforézy.

Jsou to: retenční faktor (k´) (pouze pro micelární elektrokinetickou

chromatografii), počet teoretických pater (N),

faktor symetrie píku (AS) a rozlišení (RS). V předchozích

částech byly popsány teoretické výrazy pro N a RS, ale dále

se uvádějí praktičtější rovnice pro výpočet těchto parametrů

z elektroforeogramů.

ZDÁNLIVÝ POČET TEORETICKÝCH PATER

Zdánlivý počet teoretických pater (N) se může vypočítat

pomocí vzorce:

5 æ t

,54 ÷ ö

R

N = ×

ç

è wh

ø

v němž značí:

tR – migrační čas nebo vzdálenost podél základní linie mezi

bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného

píku;

wh – šířku píku v polovině jeho výšky.

ROZLIŠENÍ

Rozlišení (RS) mezi píky dvou složek s podobnými výškami

se může vypočítat pomocí vzorce:

R

S

1,18×

=

w

( t - t )

h1

R2

+ w

h2

R1

,

, kde tR2 > tR1,

v němž značí:

tR1 a tR2 – migrační časy nebo vzdálenosti podél základní

linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými

z vrcholů dvou sousedních píků;

wh1 a wh2 – šířky píků v polovině jejich výšky.

Pokud je to vhodné, může se rozlišení vypočítat změřením

výšky sedla (Hv) mezi dvěma částečně rozdělenými píky

porovnávacího roztoku a výšky menšího píku (Hp) a vypočítáním

poměru píku k sedlu:

p =

v

H

H

p

v

.

2

FAKTOR SYMETRIE PÍKU

Faktor symetrie píku (AS) se může vypočítat podle vzorce:

v němž značí:

w

A S

=

2d

w0,05 – šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky;

d – vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku

a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky.

Jako parametry způsobilosti systému jsou uvedeny testy

opakovatelnosti ploch (směrodatná odchylka ploch nebo

poměrů ploch k migračním časům) a opakovatelnosti migračních

časů (směrodatná odchylka migračních časů).

Opakovatelnost migračních časů slouží jako test způsobilosti

promývacího procesu kapiláry. Alternativním postupem,

jak zabránit nedostatečné opakovatelnosti migračních

časů, je použití relativních migračních časů vztažených

k vnitřnímu standardu.

Pro stanovení příbuzných látek je vhodná zkouška ověření

poměru signálu k šumu porovnávacího roztoku (nebo určení

meze stanovitelnosti).

POMĚR SIGNÁLU K ŠUMU

Mez detekce odpovídá hodnotě poměru signálu k šumu

rovné 3, mez stanovitelnosti hodnotě rovné 10. Poměr

signálu k šumu (S/N) se vypočítá podle vzorce:

S 2H

= ,

N h

v němž značí:

H – výšku píku odpovídajícího dané složce na elektroforeogramu

předepsaného porovnávacího roztoku, měřenou

mezi vrcholem píku a extrapolovanou základní linií

signálu; signál se sleduje v rozsahu rovném dvacetinásobku

šířky píku v polovině jeho výšky;

h – rozsah šumu na elektroforeogramu získaném při slepé

zkoušce a zaznamenaném ve vzdálenosti rovné dvacetinásobku

šířky píku v polovině jeho výšky na elektroforeogramu

předepsaného porovnávacího roztoku; pokud

je to možné, je tato vzdálenost situována rovnoměrně na

obě strany od místa, kde by se tento pík nacházel.


8.7:20248

Vzorek v Ramanově spektroskopii je ozařován intenzivním

monochromatickým světlem (obvykle laserem). Většina záření

je rozptýlena vzorkem při vlnové délce shodné s dopadajícím

světlem; tento proces je znám jako Rayleighův rozptyl

nebo elastický rozptyl světla. Pouze 10 –6 až 10 –8 dopadajících

fotonů je rozptýleno vzorkem při vlnových délkách,

které jsou oproti původnímu zdroji světla posunuty;

tento posun světla je znám jako Ramanův rozptyl nebo neelastický

rozptyl světla. Rozdíly mezi vlnovou délkou dopadajícího

světla a vlnovými délkami Ramanova rozptýleného

světla jsou známy jako Ramanovy posuny a jsou závislé

na molekulových vibracích uvnitř vzorku. Rozptýlené

světlo o nižší energii se nazývá Stokesův rozptyl a rozptýlené

světlo o vyšší energii anti-Stokesův rozptyl. Obvykle

se analyzuje Stokesův rozptyl.

0,05

,

180 ČL 2017 – Dopl. 2020


Ramanovo spektrum lze získat z kapalin, pevných látek

i plynných vzorků.

Ramanova spektroskopie je vhodná neinvazivní metoda pro

stanovení vlastností v pevné fázi a pro chemickou identifikaci,

např. pro detekci změn v polymorfních formách. Ramanova

spektroskopie zahrnuje četné metodiky, jako jsou

zpětný rozptyl, transmitance, rezonanční Ramanova spektroskopie

[resonance Raman spectroscopy (RR)], spektroskopie

s povrchově zesíleným Ramanovým rozptylem [surface-enhanced

Raman spectroscopy (SERS)], hrotem zesílená

Ramanova spektroskopie [tip-enhanced Raman spectroscopy

(TERS)], prostorově vyvážená Ramanova spektroskopie

[spatially offset Raman spectroscopy (SORS)],

Ramanova optická aktivita [Raman optical activity (ROA)],

koherentní anti-Stokesova Ramanova spektroskopie [coherent

anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS)], stimulovaná

Ramanova spektroskopie [stimulated Raman spectroscopy

(SRS)] a konfokální Ramanova spektroskopie [confocal

Raman (CF) spectroscopy]. Sama o sobě je vhodná

jako zobrazovací metoda.

Ramanova spektroskopie je komplementární metoda k infračervené

spektrometrii. Obě metody sledují základní vibrace

molekul uvnitř materiálu. Mají však různé citlivosti pro různé

funkční skupiny v materiálu. Ramanova spektroskopie je

zejména vhodná pro zkoumání nepolárních vazeb, funkčních

skupin a vibrací, které jsou vysoce symetrické (např. jednoduché

nebo násobné vazby C-C), ale je méně citlivá pro polární

vazby (např. C=O) a vibrace, které jsou asymetrické.

Proto např. voda, která silně ovlivňuje infračervená spektra,

vykazuje slabý Ramanův rozptyl a proto má minimální rušivý

vliv na výsledné spektrum. Vodné roztoky jsou tak velmi

vhodné pro Ramanovu spektroskopii.

Hlavním omezením Ramanovy spektroskopie je to, že

zkoušená látka nebo nečistoty v ní obsažené mohou vykazovat

fluorescenci, která překrývá Ramanův signál. Potlačení

fluorescence se dosáhne výběrem laseru s delší vlnovou

délkou, např. laseru s budicí linií v blízké infračervené

oblasti.

Ramanova spektroskopie je rychlá a neinvazivní analytická

metoda a může se provádět nespojeně (off-line) a také připojeně

(at-line), pro technologii analýzy procesu [Process

Analytical Technology (PAT)] paralelně (on-line) nebo

spojeně (in-line). Ramanovy spektrometry mohou být umístěny

ve velké vzdálenosti od bodu měření, pokud se pro

kontrolu vzorků na dlouhé vzdálenosti použijí optická

vlákna. Ramanova spektroskopie má širokou proměnlivost

použití pro chemické, fyzikální a procesní analýzy a může

proto být použita pro detekci padělků a kontrolu jakosti,

například pro:

– chemické analýzy: identifikaci a kvantifikaci léčivých látek,

pomocných látek;

– fyzikální analýzy: identifikaci a kvantifikaci pevných forem

(např. polymorfie a solváty) a krystalinitu;

– procesní analýzy: monitorování biologických a chemických

reakcí, syntéz, krystalizací, granulací, míchání, sušení,

lyofilizací, lisování, enkapsulací a potahování či

obalování.

PŘÍSTROJE

K záznamu Ramanových spekter slouží různé druhy spektrometrů,

nejběžnější jsou stolní disperzní zařízení, zahrnující

mikroskop spojený s Ramanovým spektrometrem

s Fourierovou transformací (FT) a přenosné Ramanovy

spektrometry.

Ramanovy spektrometry obvykle tvoří následující části:

– zdroj monochromatického záření, obvykle laser poskytující

záření vlnové délky v ultrafialové, viditelné nebo

blízké infračervené oblasti; je třeba vzít v úvahu, že výběr

frekvence a intenzita laseru by měly být v souladu s očekávaným

použitím a s měřeným materiálem;

– vhodná optika (čočky, zrcadla nebo sestavy z optických

vláken) pro přívod monochromatického světla do vzorku

a pro sběr světla rozptýleného vzorkem;

– optické zařízení (monochromátor nebo filtr), které propouští

frekvenčně posunutý Ramanův rozptyl a potlačuje

průchod intenzivních rušivých frekvencí (Rayleighův

rozptyl) na detektor; a

– disperzní zařízení (s mřížkou nebo hranolem polychromátoru)

v kombinaci se štěrbinami propouštějícími záření

určité vlnové délky a s jednokanálovým nebo vícekanálovým

detektorem (např. charge-coupled device, CCD);

nebo

– interferometr s detektorem, který zaznamenává intenzitu

rozptýleného světla v závislosti na čase, a počítač

(s vhodným softwarem), který převádí data na frekvenci

nebo vlnočet Fourierovou transformací.

PŘÍPRAVA VZORKU

Ramanova spektra pevných látek, kapalin a plynů lze měřit

buď přímo, nebo ve vhodných obalech, jako jsou skleněné

lahvičky, obvykle bez předchozí přípravy vzorku nebo ředění.

Použije-li se Ramanova spektroskopie, měřená plocha

a objem vzorku mohou být malé (zejména pokud je zařízení

spojené s mikroskopem); je třeba dbát na to, aby měření bylo

reprezentativní. Toho lze dosáhnout např. otáčením

vzorku, provedením vícečetných měření různých vzorků

přípravku, zvětšením osvětlené plochy při redukci zvětšení

mikroskopu (fokusací), zúžením (defokusací) laserového

paprsku nebo změnou ohniskové vzdálenosti mezi měřeními

v různých hloubkách.

Ne vždy je možné považovat Ramanovu spektrometrii za

nedestruktivní metodu. Energie transmitovaná laserem závisí

na délce trvání expozice a na vlnové délce, což může

změnit fyzikální stav a vzorek se může porušit.


Předepsané kalibrace a/nebo testy způsobilosti systému se

provádějí v souladu s pokyny výrobce v pravidelných intervalech

v závislosti na použití přístroje.

Kalibrace vlnových délek systémů s Fourierovou transformací

se provede vnitřním laserem (He-Ne). Ke kalibraci

disperzních systémů se mohou obvykle použít emisní spektra

nízkotlakých výbojek vykazující charakteristická maxima

při vlnových délkách v celém spektrálním rozsahu přístroje

(např. neonové výbojky nebo nízkofrekvenční rtuťové,

argonové, kryptonové nebo xenonové lampy).

Ověření stupnice vlnočtů. Ověření stupnice vlnočtů Ramanova

posunu se provádí pomocí vhodného standardu, který

má charakteristická maxima v dané oblasti vlnových délek,

např. organické látky jako polystyren, paracetamol nebo

cyklohexan (viz tabulku 2.2.48-1).

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 181


Měly by být vybrány nejméně tři vlnočtové posuny pokrývající

pracovní rozsah přístroje zamýšleného pro měření.

být ověřena stupnice vlnočtů při stejném optickém rozlišení,

které je použito při rozboru vzorku. U všech mřížek použitých

k měření Ramanových spekter by měla být ověřena

přesnost Ramanova posunu.

Ověření stupnice intenzity odezvy. Absolutní a relativní intenzity

Ramanových pásů jsou ovlivňovány několika faktory,

mezi něž patří:

– polarizace budicího záření;

– polarizace Ramanova rozptýleného záření;

– intenzita budicího záření;

– odezva přístroje;

– fokusace a geometrie vzorku;

– sypná hustota pevných vzorků;

– index lomu (n) nebo změna indexu lomu (Δn) mezi zkoušenou

látkou a okolním prostředím;

– velikost částic a distribuce velikosti částic;

– rozptýlený průřez;

– absorpční průřez.

Vhodná kritéria přijatelnosti se mění v závislosti na použití,

ale ve většině případů lze dosáhnout toho, že relativní intenzity

pásů změřené jeden den se liší o ±10 % nebo o méně

v porovnání s relativními intenzitami pásů změřenými

následující den. Kalibrace odezvy může být provedena za

použití standardů pro bílé světlo nebo pro luminiscenční

sklo (např. NIST SRM 2241), které je obvykle používané

výrobci Ramanových spektrometrů.

KVALITATIVNÍ METODY

Protože se k identifikaci používá posun pozice frekvence,

není pro zkoušenou látku i referenční standard nutné použít

stejnou intenzitu laseru. Vzorek se měří ve stejném fyzikálním

stavu (např. kapalném, pevném) jako referenční materiál,

nebo v jakém je uveden v knihovně. Ramanovy techniky

umožňují provádět neinvazivní měření vzorku, aniž by

se vyjmul z obalu. Nicméně některé obalové materiály mohou

rušit měření, zvláště v případech, kdy absorbují při vlnové

délce budicího laseru.

Identifikace s použitím referenčního standardu. Zkoušená

látka a referenční standard se připraví stejným způsobem

a zaznamenají se spektra za stejných pracovních podmínek.

Maxima ve spektru zkoušeného materiálu odpovídají polohou,

a je-li to vhodné, relativní intenzitou spektru referenčního

standardu. Pokud se spektra zaznamenaná v pevném stavu

liší v polohách maxim, zkoušený materiál i referenční standard

se upraví stejným způsobem tak, aby krystalizovaly nebo

vznikly ve stejné pevné formě, nebo se postupuje tak, jak

je předepsáno v článku, a pak se zaznamenají spektra.

Identifikace s použitím knihovny referenčních spektrálních

dat. Zaznamenají se spektra vhodného počtu materiálů,

které vykazují typické rozdíly (výrobce, šarže, velikost

částic, profil nečistot, apod.) a vyhovují požadavkům uvedeným

v článku nebo stanoveným specifikacím. Počet

a výběr vzorků v databázi závisí na specifickém použití.

Pro usnadnění kvalitativního porovnání se může provést

vhodná matematická úprava Ramanova spektra (např. korekce

pozadí, minimální a maximální normalizace, vektorová

normalizace, derivatizace). Během validačního postupu

je nutno potvrdit schopnost databáze selektivně

Tab. 2.2.48-1. Vlnočtové posuny (a přijatelné tolerance) polystyrenu,

paracetamolu a cyklohexanu

Vlnočtové

posuny A)

(cm –1 )

Stolní

spektrometry

(cm –1 )

Tolerance

Přenosné

spektrometry

(cm –1 )

polystyren B) 620,9 ±1,5 ±2,5

1001,4 ±1,5 ±2,0

1031,8 ±1,5 ±2,0

1602,3 ±1,5 ±3,0

3054,3 ±3,0 NA E)

paracetamol C) 797,2 ±1,5 ±2,5

857,9 ±1,5 ±2,0

1168,5 ±1,5 ±2,0

1236,8 ±1,5 ±2,0

1323,9 ±1,5 ±2,5

1648,4 ±1,5 ±3,0

2931,1 ±2,0 NA E)

cyklohexan D) 801,3 ±1,5 ±2,5

1028,3 ±1,0 ±2,0

1266,4 ±1,0 ±2,0

1444,4 ±1,0 ±2,5

2852,9 ±2,0 ±3,0

A)

Standardní pokyny pro standardizaci Ramanových vlnočtů

ke kalibraci spektrometru (Standard guide for Raman shift

standards for spectrometer calibration, American Society

for Testing and Materials ASTME 1840).

B)

Polystyrenový film (např. 76 μm), pelety (např.

NIST 706a) nebo tyčinka.

C)

Paracetamol pro kvalifikaci přístroje CRL (který představuje

monoklinickou formu I).

D)

Cyklohexan R.

E)

NA: mimo rozsah detektoru.

Pro disperzní Ramanovy spektrometry, které používají vícenásobné

mřížky pro různé spektrální rozlišení, by měla

identifikovat danou látku a dostatečně ji odlišit od ostatních

materiálů v databázi.

KVANTATIVNÍ METODY

Kvantitativní stanovení vyžaduje, aby zkoušená látka

i referenční standard byly měřeny laserem o stejné intenzitě

a frekvenci. Zajistí se, že materiál se měří ve stejném fyzikálním

stavu (např. kapalném, pevném) a rozsahu koncentrací

jako referenční standard použitý ke kalibraci. Přestože

Lambertův-Beerův zákon pro Ramanovu spektroskopii neplatí,

intenzita Ramanova spektra je přímo úměrná koncentraci

zkoušených látek, nicméně pro pevné vzorky a suspenze

by intenzita Ramanova spektra mohla být ovlivněna

matricí (např. fluorescencí a vlastní absorpcí). Signál Ramanova

spektra je ovlivněn indexem lomu materiálu, velikostí

částic a jejich distribucí (malé částice dávají relativně

intenzivnější Ramanův rozptyl než velké částice), sypnou

hustotou, rozptýleným průřezem, absorpčním průřezem,

atd. (viz také Ověření stupnice intenzity odezvy).

182 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.49 METODY MĚŘENÍ VISKOZIMETREM S PADAJÍCÍ KULIČKOU A AUTOMATICKÝM VISKOZIMETREM ...

2.2.49 METODY MĚŘENÍ VISKOZIMETREM

S PADAJÍCÍ KULIČKOU

A AUTOMATICKÝM VISKOZIMETREM

S VALÍCÍ SE KULIČKOU

9.3:20249

Stanovení dynamické viskozity newtonských kapalin se

provádí viskozimetrem s padající kuličkou nebo s valící se

kuličkou při (20,0 ±0,1) °C, pokud není v článku uvedeno

jinak. Stanoví se čas potřebný k tomu, aby testovací kulička

spadla nebo se přemístila ve zkoušené kapalině od jedné

rysky ke druhé nebo od jednoho čidla k druhému.

METODA A – VISKOZIMETR S PADAJÍCÍ KULIČKOU

Přístroj. Viskozimetr s padající kuličkou se skládá ze skleněné

trubice vložené do pláště, který umožňuje přesné udržování

teploty, a ze šesti kuliček vyrobených ze skla, ze slitiny

niklu se železem nebo z oceli, které mají různé hustoty

a průměry. Trubice je připevněna tak, že její osa je vychýlena

o (10 ±1)° vzhledem ke svislé ose. Trubice má dvě

rysky určující vzdálenost, kterou má kulička urazit. Komerčně

dostupné přístroje jsou vybaveny tabulkami udávajícími

konstanty, hustotu kuliček a vhodnost různých kuliček

pro očekávaný rozsah viskozity.

Postup. Čistá suchá trubice viskozimetru, předběžně vytemperovaná

na (20,0 ±0,1) °C, se naplní zkoušenou kapalinou

tak, aby se zabránilo tvorbě bublin. Vybere se kulička

vhodná pro rozsah viskozity kapaliny, aby doba pádu (doba

měření) nebyla menší než 30 s. Vloží se do trubice, která se

uzavře, a roztok se ponechá při (20 ±0,1) °C nejméně

15 min. Kulička se nechá padat kapalinou mezi dvěma ryskami

nejprve jednou bez měření. Pak se nechá znovu padat

a stopkami (s přesností nejméně na 1/5 s) se měří čas potřebný

k tomu, aby kulička spadla od horní k dolní rysce.

K získání nejméně čtyř časů se měření opakuje nejméně

třikrát. Výsledek je platný jen tehdy, pokud se dvě po sobě

jdoucí měření neliší o více než 1,5 %.

Z průměrné doby měření se vypočítá dynamická viskozita

(h) v milipascalsekundách podle vzorce:

v němž značí:

k – konstantu v milimetrech čtverečných za sekundu na

druhou (mm 2 /s 2 );

r1 – hustotu použité kuličky v gramech na centimetr krychlový

(g/cm 3 );

r2 – hustotu zkoušené kapaliny v gramech na centimetr

krychlový (g/cm 3 ), získanou vynásobením její relativní

20

hustoty číslem 0,9982;

d 20

( r - ) ,

h = k r ×

1 2 t

t – průměrnou dobu měření pohybu kuličky v sekundách.

METODA B – AUTOMATICKÝ VISKOZIMETR

S VALÍCÍ SE KULIČKOU

Přístroj. Automatický viskozimetr s valící se kuličkou se

skládá z několika kapilár vyrobených ze skla nebo jiného

vhodného materiálu o různých průměrech uzavřených

v termostaticky řízeném bloku, který umožňuje přesné řízení

teploty; kuličky jsou vyrobeny z nerezové oceli (popřípadě

potaženy) nebo z jiných vhodných materiálů; pohon

motoru se umístí tak, aby úhel sklonu kapilár, vzhledem

ke svislé ose, byl od (10,0 ±0,2)° do (80,0 ±0,2)°. Přístroj

má nejméně dvě čidla pro stanovení doby měření určující

předem definovanou vzdálenost, kterou má kulička

urazit. Komerčně dostupné přístroje jsou vybaveny tabulkami

udávajícími konstanty, hustotu kuliček a vhodnost

různých kapilár pro očekávaný rozsah viskozity. Řízení

teploty, řízení úhlu sklonu, stanovení doby měření, opakování

měření a výpočty střední a relativní směrodatné odchylky

jsou prováděny pomocí softwaru přístroje.

Postup. Software přístroje se nastaví tak, aby se provedl

odečet z nejméně čtyř časů měření (dva cykly vpřed/vzad)

a s relativní směrodatnou odchylkou nejvýše 0,5 %. Vybere

se kapilára, kulička a úhel sklonu vhodné pro očekávaný

rozsah viskozity zkoušené kapaliny tak, aby se dosáhlo doby

měření nejméně 20 s na vzdálenost 100 mm nebo času

úměrnému jiným vzdálenostem. Jestliže k viskozimetru není

připojen digitální denzitometr, zajistí se, aby hodnota

hustoty zkoušené kapaliny byla specifikována v softwaru

přístroje. Čistá suchá kapilára viskozimetru se naplní zkoušenou

kapalinou tak, aby se zabránilo tvorbě bublin. Ihned

po naplnění kapiláry se zahájí měření.

Přístroj automaticky vypočítá dynamickou viskozitu (η)

v milipascalsekundách a kinematickou viskozitu (v)

v milimetrech čtverečných za sekundu.

2.2.54 IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE

6.6:20254

OBECNÉ PRINCIPY

Izoelektrická fokusace (IEF) je elektroforetická metoda dělení

bílkovin podle jejich izoelektrického bodu. Dělení se

provádí ve vrstvě polyakrylamidového nebo agarosového

gelu, který obsahuje směs amfoterních elektrolytů (amfolytů).

Vlivem elektrického pole migrují amfolyty gelem a vytvářejí

gradient pH. V některých případech se používají gely,

které obsahují imobilizovaný gradient pH připravený

včleněním slabých kyselin a zásad do specifických oblastí

sítě gelu během jeho přípravy. Když dosáhnou nanesené

bílkoviny oblasti gelu, která má pH stejné jako jejich izoelektrický

bod (pI), jejich náboj se neutralizuje a migrace

ustane. Gradient může být vytvořen přes různé oblasti pH

podle vybrané směsi amfolytů.

TEORETICKÁ HLEDISKA

Pokud je bílkovina v místě svého izoelektrického bodu, nemá

celkový náboj a nemůže se pohybovat gelovou matricí

vlivem elektrického pole. Může se nicméně z tohoto místa

pohybovat difuzí. Gradient pH přinutí bílkovinu zůstat pouze

v místě jejího izoelektrického bodu, a tak ji koncentruje; tento

koncentrační efekt se nazývá fokusace. Zvýšení vloženého

napětí nebo snížení objemu vzorku vede ke zlepšení dělení

pásů. Vložené napětí je omezeno vznikajícím teplem, které

se musí odvádět. Použití tenkých gelů a výkonných chladicích

desek řízených termostatickým cirkulátorem zabraňuje

spálení gelu a umožňuje strmou fokusaci. Separace se odhaduje

určením minimálního rozdílu pI (DpI), který je nutný

pro oddělení dvou sousedních pásů podle vzorce:

1

Zkušební

metody

2.2

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


ČL 2017 – Dopl. 2020 183

2.2.54 IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE

DpI

= 3×

æ dpH ö

D ç ÷

è dx

ø

,

æ dμ

ö

Eç

- ÷

è dpH ø

v němž značí:

D – difuzní koeficient bílkoviny;

E – intenzitu elektrického pole ve voltech na centimetr;

dµ

- – změnu pohyblivosti s pH v oblasti blízké pI.

dpH

dµ

Protože D a - se nemohou pro danou bílkovinu změnit,

zlepší se separace použitím užšího rozsahu pH a zvý-

dpH

šením intenzity elektrického pole.

Rozlišení mezi pásy bílkovin na IEF gelu připraveném

s nosnými amfolyty může být velmi dobré. Lepšího rozdělení

se může dosáhnout při použití imobilizovaných pH

gradientů, kde tlumivé látky, které jsou analogické s nosnými

amfolyty, jsou kopolymerovány v gelové matrici.

Bílkoviny vykazující pI lišící se o 0,02 jednotek pH se mohou

rozdělit při použití gelu připraveného s nosnými amfolyty,

zatímco imobilizované gradienty pH mohou rozdělit

bílkoviny lišící se přibližně o 0,001 jednotek pH.

PRAKTICKÁ HLEDISKA

Zvláštní pozornost se musí věnovat vlastnostem vzorku

a/nebo přípravě. Problematický může být obsah soli ve

vzorku a nejlepší je připravit vzorek, je-li to možné, v deionizované

vodě nebo v roztoku amfolytů (2 %) s použitím

dialýzy nebo gelové filtrace, je-li třeba.

Čas potřebný pro dokončení fokusace v tenkovrstvých polyakrylamidových

gelech se určuje nanesením zbarvené

bílkoviny (např. hemoglobinu) na různá místa povrchu gelu

a zapojením elektrického pole: rovnovážného stavu se dosáhne,

když poskytují všechny nanášky identický profil pásu.

V některých protokolech je dokončení fokusace identifikováno

časem uplynulým od nanesení vzorku.

IEF gel se může použít pro zkoušku totožnosti, pokud se

porovnává profil migrace v gelu s vhodným standardním

přípravkem a s IEF kalibračními bílkovinami. IEF gel se

může použít pro limitní zkoušku, pokud je optická hustota

pásu izoelektrické fokusace subjektivně porovnatelná s optickou

hustotou pásů objevujících se ve standardním přípravku,

nebo se může použít jako kvantitativní zkouška za

podmínky validace, pokud se optická hustota měří denzitometrem

nebo podobným zařízením pro určení relativní

koncentrace bílkoviny v pásech.

PŘÍSTROJ

Přístroj pro IEF se skládá z:

– kontrolovatelného generátoru s konstantním napětím,

proudem a výkonem; používá se napětí 2500 V, které se

považuje za optimální při dané sestavě pracovních podmínek;

může se použít konstantní výkon až 30 W;

– pevné plastové IEF komory, která obsahuje chladicí desku

ze vhodného materiálu k podpoře gelu;

– plastového krytu s platinovými elektrodami připojenými

na gel pomocí papírových pásků vhodné šířky, délky

a tloušťky, impregnovaných roztoky anodického elektrolytu

a katodického elektrolytu.

IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE V POLYAKRYL-

AMIDOVÝCH GELECH: DETAILNÍ POSTUP

Následující postup je detailním popisem izoelektrické fokusace

na hustých polyakrylamidových deskových gelech, které

se použijí, pokud není v článku stanoveno jinak.

PŘÍPRAVA GELŮ

Forma. Forma (viz obrázek 2.2.54-1) se skládá ze skleněné

desky (A), na které je umístěn polyesterový film (B) pro

usnadnění manipulace s gelem, jednoho nebo více vymezovačů

(C), druhé skleněné desky (D) a svorek, které drží

strukturu pohromadě.

Polyakrylamidový gel 7,5%. 29,1 g akrylamidu R a 0,9 g

methylenbisakrylamidu R se rozpustí ve 100 ml vody R. Ke

2,5 objemovým dílům tohoto roztoku se přidá směs amfolytů

předepsaná v článku a zředí se vodou R na 10 objemových

dílů. Opatrně se zamíchá a roztok se odplyní.

Obr. 2.2.54-1 Forma

Příprava formy. Na dolní skleněnou desku se umístí polyesterový

film, na něj se umístí vymezovač a druhá skleněná

deska a upevní se svorkami. Před použitím se roztok míchá

na magnetické míchačce a přidá se 0,25 objemového dílu

roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l) a 0,25 objemového

dílu tetramethylethylendiaminu R. Roztokem se

okamžitě naplní prostor mezi skleněnými deskami formy.

POSTUP

Forma se rozebere a s pomocí polyesterového filmu se gel

přenese na chladicí podložku navlhčenou několika mililitry

vhodné kapaliny tak, aby se zabránilo tvorbě bublin. Připraví

se zkoušené roztoky a porovnávací roztoky tak, jak je

předepsáno v článku. Na gel se umístí proužky papíru velikosti

asi 10 mm ´ 5 mm pro nanášení vzorku a každý se

napustí předepsaným množstvím zkoušených a porovnávacích

roztoků. Také se nanese předepsané množství roztoku

bílkovin se známými izoelektrickými body jako značkovače

pH pro kalibraci gelu. V některých protokolech má gel

připravené jamky, do nichž se vnáší roztok vzorku místo

184 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.55 MAPOVÁNÍ PEPTIDŮ

použití impregnovaných papírových proužků. Ustřihnou se

dva proužky papíru o délce gelu a napustí se elektrolytovými

roztoky: kyselým pro anodu a zásaditým pro katodu.

Složení anodového a katodového roztoku je popsáno v

článku. Tyto papírové proužky se umístí na každou stranu

gelu několik milimetrů od hrany. Kryt se připevní tak, že

elektrody jsou v kontaktu s proužky (s ohledem na katodový

a anodový pól). V izoelektrické fokusaci se pokračuje za

použití elektrických parametrů popsaných v článku. Proud

se vypne, když je migrace směsi standardních bílkovin stabilizována.

Pinzetou se odstraní proužky pro nanesení

vzorků a dva elektrodové proužky. Gel se ponoří do fixačního

roztoku pro izoelektrickou fokusaci v polyakrylamidovém

gelu RS. Inkubuje se 30 min za mírného třepání při

teplotě místnosti. Roztok se slije a přidá se 200 ml odbarvovacího

roztoku RS. Inkubuje se 1 h za třepání. Gel se slije

a přidá se barvicí roztok modři kyselé 83 RS. Inkubuje se

30 min. Gel se odbarvuje pasivní difuzí v odbarvovacím

roztoku RS, dokud nejsou pásy dobře viditelné proti čirému

pozadí. Poloha a intenzita pásů na elektroforegramu se určí

způsobem předepsaným v článku.

ODCHYLKY OD DETAILNÍHO POSTUPU

(PODMÍNĚNO VALIDACÍ)

Kde je odkaz na obecnou metodu izoelektrické fokusace,

mohou být odchylky v metodologii nebo postupu předmětem

validace. Ta zahrnuje:

– použití komerčně dostupných předlitých gelů a komerčních

barvicích a odbarvovacích kitů;

– použití imobilizovaných gradientů pH;

– použití tyčinkových gelů;

– použití gelových kazet s odlišnými rozměry, včetně ultratenkých

gelů (0,2 mm);

– odchylky v postupu nanášení vzorku, včetně odlišných

objemů vzorku nebo použití masek pro nanášení vzorků

a proužků jiných než papírových;

– použití alternativních analytických podmínek, včetně odchylek

elektrického pole v závislosti na rozměrech gelu

a vybavení a použití pevných migračních časů namísto

subjektivní interpretace stability pásů;

– začlenění pre-fokusačního kroku;

– použití automatizovaného vybavení;

– použití agarosových gelů.

VALIDACE POSTUPU IZOELEKTRICKÉ FOKUSACE

Pokud se k detailnímu postupu použijí alternativní metody,

musí se validovat. Pro validaci dělení se mohou použít následující

kritéria:

– tvorba stabilního gradientu pH s žádoucími charakteristikami,

hodnocené např. s použitím barevných značkovačů

pH se známými izoelektrickými body;

– porovnání elektroforegramu chemické referenční látky se

zkoušeným přípravkem;

– jakákoliv další validační kritéria, jak je předepsáno

v článku.

SPECIFIKOVANÉ ODCHYLKY OD OBECNÉ

METODY

Odchylky od obecné metody požadované pro analýzu specifických

látek mohou být předepsány v článku. Obsahují:

– přídavek močoviny do gelu (koncentrace 3 mol/l často

postačuje k udržení bílkovin v roztoku, ale může se použít

až 8 mol/l): některé bílkoviny se v jejich izoelektrickém

bodě srážejí; v tomto případě se do předpisu gelu

včlení močovina pro udržení bílkovin v roztoku; pokud se

použije močovina, mohou se používat jen čerstvé roztoky,

aby se zabránilo karbamylaci bílkovin;

– použití alternativních barvicích metod;

– použití gelových přísad, jako jsou neionogenní tenzidy

(např. oktylglukosid) nebo tenzidy s obojetnými ionty

(zwitterionty) (např. CHAPS nebo CHAPSO), a přidání

amfolytů ke vzorku, aby se zabránilo shlukování nebo

srážení bílkovin.

BODY K UVÁŽENÍ

Vzorky se mohou nanést na jakoukoliv oblast gelu, ale neměly

by se nanášet v blízkosti žádné elektrody, aby se ochránily

před extrémním prostředím pH. Během vývoje metody

může analytik zkusit nanést bílkoviny na třech místech gelu

(např. uprostřed a na obou koncích); profil bílkoviny nanesené

na opačných koncích gelu nemusí být totožný.

Pokud je gel fokusován příliš dlouho, může se vyskytnout jev

známý jako katodický drift, kde se gradient pH časem rozpadá.

Ačkoliv podstata jevu není známa, faktory vedoucími ke katodickému

driftu mohou být elektroosmóza a absorpce oxidu uhličitého.

Katodický drift je pozorován, když fokusované bílkoviny

migrují z katodového konce gelu. Pro omezení tohoto jevu

mohou být použity imobilizované gradienty pH.

Účinné chlazení (přibližně 4 °C) podkladu, na němž leží

gel, je během fokusace důležité. Vysoké intenzity pole používané

během IEF mohou vést k přehřívání a ovlivňovat

kvalitu fokusovaného gelu.


6.6:20255

Je to zkouška totožnosti bílkovin, zvláště bílkovin získaných

technologií rekombinatní DNA. Zahrnuje chemické nebo enzymatické

zpracování bílkoviny, při kterém vznikají peptidové

fragmenty a následné rozdělení a identifikace těchto

fragmentů reprodukovatelným způsobem. Je to průkazná

zkouška, která je schopná identifikovat téměř jakékoliv změny

jednotlivých aminokyselin pocházející z případů, jakými

jsou chyby ve čtení komplementární DNA (cDNA) nebo bodové

mutace. Mapování peptidů je srovnávací postup, neboť

získaná informace porovnaná se shodně zpracovanou porovnávací

látkou potvrzuje primární strukturu bílkoviny, je

schopná detekovat, zda došlo ke změnám ve struktuře, a prokazuje

konzistentnost postupu a genetickou stabilitu. Každá

bílkovina má jedinečnou strukturu, které je nutné porozumět,

aby vědecké a analytické přístupy umožnily validovaný vývoj

peptidové mapy s dostatečnou specifičností.

Tato stať poskytuje podrobný návod k použití mapování

peptidů a jeho validaci pro charakterizaci analyzované bílkoviny,

k hodnocení stability produktů získaných expresí

z buněk pomocí rekombinantní DNA a pro hodnocení konzistentnosti

celého postupu k vyhodnocení stability produktu,

stejně jako k ověření totožnosti bílkoviny nebo ke zjištění

přítomnosti bílkovinné varianty.

1

Zkušební

metody

2.2

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


ČL 2017 – Dopl. 2020 185


Mapování peptidů není obecnou metodou, ale zahrnuje vývoj

specifických map pro každou jednotlivou bílkovinu.

Ačkoliv se tento postup rychle vyvíjí, jsou určité metody,

které jsou obecně přijaty. Kde je to vhodné, budou v jednotlivých

článcích uvedeny variace těchto metod.

Na peptidovou mapu se může pohlížet jako na „otisk prstu“

bílkoviny a je konečným výsledkem několika chemických

postupů, které přinášejí komplexní porozumění struktuře

analyzované bílkoviny. Pro vývoj postupu jsou nutné čtyři

základní kroky: izolace a purifikace bílkoviny, pokud je bílkovina

součástí směsi; selektivní štěpení peptidových vazeb;

chromatografické dělení peptidů; analýza a identifikace

těchto peptidů. Zkoušený vzorek se štěpí a zkouší současně

s porovnávací látkou. Úplné rozštěpení peptidových

vazeb nastává spíše tehdy, když se místo chemických štěpicích

činidel použijí takové enzymy, jako jsou endoproteasy

(např. trypsin). Mapa musí obsahovat dostatek peptidů,

aby dávala smysl. Na druhou stranu, jestliže je příliš mnoho

fragmentů, ztrácí mapa svoji specifičnost, neboť mnoho

bílkovin bude mít stejný profil.

IZOLACE A PURIFIKACE

Izolace a purifikace jsou nezbytné pro analýzu nerozplněných

léčiv nebo lékových forem obsahujících interferující

pomocné látky nebo bílkovinné nosiče. Tyto kroky jsou

v případě potřeby uvedeny v příslušném lékopisném článku.

Kvantitativní uvolnění bílkoviny z lékové formy je třeba

validovat.

SELEKTIVNÍ ŠTĚPENÍ PEPTIDOVÝCH VAZEB

Výběr přístupu použitého ke štěpení peptidových vazeb závisí

na zkoušené bílkovině. Tento výběr zahrnuje stanovení

typu štěpení, které se použije (enzymatické nebo chemické),

a typu štěpicího činidla ve zvolené kategorii.

Některá štěpicí činidla a jejich specifičnost jsou uvedeny

v tabulce 2.2.55-1. Tento seznam není úplný a bude se rozšiřovat,

jak se budou zjišťovat další štěpicí činidla.

Předběžná úprava vzorku. V závislosti na velikosti nebo

konfiguraci bílkoviny se mohou použít různé přístupy

k předběžné úpravě vzorků. Jestliže se použije trypsin jako

štěpicí činidlo pro bílkoviny s molekulovou hmotností větší

než 100 000 Da, musí se chránit lysinové zbytky působením

kyseliny citrakonové nebo maleinové, jinak vznikne

příliš mnoho peptidů.

Předběžná úprava štěpicího činidla. Předběžná úprava

štěpicích činidel, zvláště enzymatických, může být nezbytná

pro purifikaci, aby se zajistila reprodukovatelnost mapy.

Např. trypsin použitý jako štěpicí činidlo by se měl ošetřit

tosyl-L-fenylalanin-chlormethyl-ketonem, aby se inaktivoval

chymotrypsin. Pokud je k dispozici malé množství bílkoviny,

mohou se úspěšně použít jiné metody, jako je purifikace

trypsinu kapalinovou chromatografií (HPLC) nebo

imobilizace enzymu na gelové vrstvě.

Předběžná úprava bílkoviny. Za určitých podmínek může

být nezbytné zahustit vzorek nebo oddělit bílkovinu od pomocných

látek a stabilizátorů použitých ve složení přípravku,

pokud tyto interferují s postupem mapování. Fyzikální

postupy použité k předběžné úpravě mohou zahrnovat ultrafiltraci,

kolonovou chromatografii a lyofilizaci. K rozbalení

bílkoviny před mapováním se mohou použít jiné

úpravy, jako přidání chaotropních činidel (např. močovina).

Aby se enzymu umožnil úplný přístup k místům štěpení

a povolilo se určité rozvinutí bílkoviny, je před štěpením

často nutné redukovat a alkylovat disulfidové vazby.

Štěpení trypsinem může vnést do peptidové mapy dvojznačnosti,

způsobené vedlejšími reakcemi, které nastanou

během štěpicích reakcí, jako jsou nespecifické štěpení, deamidace,

disulfidová izomerizace, oxidace zbytků methioninu

nebo tvorba pyroglutamových skupin vzniklých deamidací

glutaminu na N-konci peptidu. Dále se mohou vytvořit

píky autohydrolýzou trypsinu, jejichž intenzita závisí

na poměru trypsinu k bílkovině. Aby se předešlo autohydrolýze,

mají se roztoky proteas připravit při pH, jež pro ně

není optimální (např. pH 5 pro trypsin), takže enzym bude

aktivní až po zředění tlumivým roztokem pro štěpení.

Stanovení optimálních štěpicích podmínek. Faktory, které

ovlivňují úplnost a účinnost štěpení bílkovin, jsou stejné

Tab. 2.2.55-1 Příklady štěpicích činidel

Typ Činidlo Specifičnost

enzymatické trypsin (EC 3.4.21.4) C-koncový Arg a Lys

chymotrypsin (EC 3.4.21.1)

C-konec tvořený hydrofobními zbytky (např. Leu,

Met, Ala, aromatické aminokyseliny)

pepsin (EC 3.4.23.1 a 2)

nespecifické štěpení

lysyl-endopeptidasa (Lys-C-endopeptidasa) C-koncový Lys

(EC 3.4.21.50)

glutamyl-endopeptidasa (z kmene V8 S. aureus) C-koncové Glu a Asp

(EC 3.4.21.19)

peptidyl-Asp-metalo-endopeptidasa

N-koncová Asp

(endoproteinasa Asp-N)

klostripain (EC 3.4.22.8)

C-koncový Arg

chemické bromkyan C-koncový Met

kyselina 2-nitro-5-thio-kyanbenzoová

N-koncový Cys

kyselina O-jodosobenzoová

C-koncový Trp a Tyr

zředěná kyselina

Asp a Pro

BNPS-skatol

Trp

186 ČL 2017 – Dopl. 2020


jako faktory, jež mohou ovlivnit jakékoliv chemické nebo

enzymatické reakce.

Hodnota pH reakčního prostředí. Optimální pH reakční

směsi pro působení daného štěpicího činidla se určí empiricky.

Např. když se používá jako štěpicí činidlo bromkyan,

je nezbytné silně kyselé prostředí (např. pH 2, kyselina

mravenčí), avšak když se používá jako štěpicí činidlo trypsin,

je optimální slabě alkalické prostředí (pH 8). Je všeobecným

pravidlem, že hodnota pH reakčního prostředí nesmí

měnit chemickou integritu bílkoviny během štěpení

a hodnota pH sama se nesmí měnit v průběhu fragmentační

reakce.

Teplota. Pro většinu štěpení je vhodná teplota v rozmezí

25 °C až 37 °C. Použitá teplota je určena k omezení vedlejších

chemických reakcí na minimum. Podle typu zkoušené

bílkoviny se určí teplota reakčního prostředí, neboť některé

bílkoviny jsou náchylnější k denaturaci, jestliže se teplota

reakce zvýší. Např. štěpení rekombinantního hovězího somatotropinu

se provádí při 4 °C, neboť při vyšších teplotách

se sráží při štěpení.

Čas. Je-li k dispozici dostatečné množství vzorku, zváží se

časová studie průběhu, aby se určila optimální doba k získání

reprodukovatelné mapy a předešlo se neúplnému štěpení.

Doba štěpení kolísá mezi 2 h až 30 h. Reakce se zastaví

přidáním kyseliny, která neinterferuje s mapou nebo

zmrazením.

Množství štěpicího činidla. Ačkoliv se k úspěšnému dosažení

přiměřeně rychlého rozštěpení (tj. 6 h až 20 h) používá

nadbytek štěpicího činidla, minimalizuje se jeho množství,

aby se předešlo jeho přispění do chromatografické

mapy. Všeobecně se používá poměr bílkoviny k protease

v rozsahu 20 : 1 až 200 : 1. Doporučuje se přidávat štěpicí

činidlo ve dvou nebo více dávkách, aby se optimalizovalo

štěpení. Nicméně konečný reakční objem by měl být dostatečně

malý, aby usnadnil následující krok peptidového

mapování, tj. dělení. K identifikaci artefaktů štěpení, které

mohou interferovat s následnou analýzou, se provede slepá

zkouška za použití všech zkoumadel, s výjimkou zkoušené

bílkoviny.

CHROMATOGRAFICKÉ DĚLENÍ

K dělení peptidů pro mapování se používají různé metody.

Výběr metody závisí na mapované bílkovině. Metody

úspěšně použité k dělení peptidů jsou uvedeny v tabulce

2.5.55-2. V této stati je popsána nejpoužívanější technika –

chromatografické separace s použitím kapalinové chromatografie

(HPLC) s obrácenými fázemi.

Čistota rozpouštědel a mobilních fází je kritickým faktorem

při separaci HPLC. Pro HPLC s obrácenými fázemi se doporučují

komerčně dostupná rozpouštědla a voda ve stupni

jakosti pro HPLC. Rozpuštěné plyny představují v gradientovém

systému problém, neboť rozpustnost plynu ve směsi

může být nižší než v jednotlivém rozpouštědle. Pro odplyňování

se často používá odplynění vakuem a míchání v ultrazvukové

lázni. Jestliže se do HPLC systému dostanou

s rozpouštědly pevné částice, mohou poškodit těsnost ventilů

čerpadel nebo znečistit vstupní část chromatografické

kolony. Proto se také doporučuje filtrace jak před čerpadlem,

tak za ním.

Tab. 2.2.55-2 Metody používané k dělení peptidů

kapalinová chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi

iontoměničová chromatografie (IEC)

hydrofobní interakční chromatografie (HIC)

elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE) v nedenaturačních

podmínkách

elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti

natrium-dodecyl-sulfátu (SDS-PAGE)

kapilární elektroforéza (CE)

vysokonapěťová papírová chromatografie (PCHV)

vysokonapěťová papírová elektroforéza (HVPE)

Chromatografická kolona. Výběr chromatografické kolony se

pro každou bílkovinu provede empiricky. Optimální dělení poskytují

kolony naplněné oxidem křemičitým o velikosti pórů

10 nm nebo 30 nm. Pro malé peptidy jsou vhodnější kolony naplněné

silikagelem pro chromatografii oktylsilylovaným R (3 μm až

10 μm) a silikagelem pro chromatografii oktadecylsilylovaným R

(3 μm až 10 μm) než kolony naplněné silikagelem pro chromatografii

butylsilylovaným R (5 μm až 10 μm).

Rozpouštědlo. Nejpoužívanějším rozpouštědlem je voda

s acetonitrilem jako organickým modifikátorem, k němuž

se přidá nejvýše 0,1 % kyseliny trifluoroctové. Je-li třeba

pro rozpuštění produktů hydrolýzy, přidá se propan-1-ol

nebo propan-2-ol za předpokladu, že toto přidání příliš nezvýší

viskozitu hydrolyzátu.

Mobilní fáze. Používají se mobilní fáze s tlumivými roztoky

obsahující fosforečnany, aby se zajistila určitá pružnost

při výběru podmínek pH, neboť posun hodnoty pH k rozmezí

3,0 až 5,0 zlepšuje dělení peptidů obsahujících kyselé

zbytky (např. kyseliny glutamové a asparagové). Při hodnotách

pH mezi 2 až 7 (nebo vyšším v případě nosičů z polymerů)

se může použít s acetonitrilovým gradientem také

fosforečnan sodný nebo draselný, amonium-acetát a kyselina

fosforečná. Často se používá acetonitril s přídavkem kyseliny

trifluoroctové.

Gradient. Gradient může být lineární, nelineární nebo

stupňovitý. K dělení směsí komplexů se doporučuje mírný

gradient. Gradienty se upravují, aby se získalo dobré rozlišení

jednoho nebo dvou píků, které se stanou markery této

zkoušky.

Izokratická eluce. Izokratické HPLC systémy s jednou

mobilní fází se používají pro jejich snadné použití a lepší

odpovědi detektoru. Někdy je nesnadné určit optimální složení

mobilní fáze pro zřetelné rozlišení každého píku.

V izokratickém HPLC systému se nepoužívají mobilní fáze,

u nichž mírné změny ve složení nebo v hodnotě pH významně

ovlivňují retenční časy píků na peptidové mapě.

Jiné parametry. Pro dosažení dobré reprodukovatelnosti je

obvykle nezbytná kontrola teploty kolony. Průtoková rychlost

mobilní fáze je v rozmezí 0,1 ml/min až 2,0 ml/min

a detekce peptidů se provádí UV detektorem při 200 nm až

230 nm. Mohou se použít i jiné metody detekce (např. derivatizace

za kolonou), ale nejsou tak robustní ani obecně

použitelné jako UV detekce.

Validace. Tato část popisuje experimentální metody pro

celkové vyhodnocení vhodnosti zkušební metody pro za-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 187


mýšlené použití. Kritéria přijatelnosti pro vhodnost systému

(test způsobilosti) závisí na nalezených kritických parametrech

zkoušky, které ovlivní interpretaci a přijatelnost výsledků.

Tyto kritické parametry jsou zároveň kritériem monitorujícím

peptidové štěpení a analýzu peptidů. Indikátorem

ukončení štěpení je porovnání s referenční látkou, která

byla ošetřena stejným způsobem jako zkoušená bílkovina.

Použití referenční látky současně se zkoušenou bílkovinou

je klíčové ve vývoji a potvrzení limitů vhodnosti systému.

Pro dodatečné porovnání je navíc k referenční látce připojen

vzorový chromatogram. Jinými možnými indikátory

mohou být vizuální hodnocení rozpustnosti bílkoviny nebo

peptidu, ověření nepřítomnosti původní bílkoviny nebo měření

odezvy peptidu v závislosti na štěpení. Kritické parametry

vhodnosti systému pro analýzu peptidů závisí na jednotlivých

způsobech dělení a detekce peptidů a na požadavcích

analýzy dat.

Je-li mapování peptidů použito jako zkouška totožnosti, zahrnuje

požadavky na vhodnost systému pro identifikované

peptidy selektivitu a přesnost. V tomto případě, stejně jako

při identifikaci variantní bílkoviny, poskytuje určení primární

struktury peptidových fragmentů v peptidové mapě

porovnáním s peptidovou mapou referenční látky pro specifickou

bílkovinu jak ověření známé primární struktury, tak

určení variantních bílkovin. Doporučenou metodou pro určení

rozlišení peptidů je použití štěpené referenční látky pro

danou bílkovinu. Pro analýzu variantní bílkoviny se může

použít charakteristická směs variantní látky a referenční

látky, zvláště když se variantní peptid nachází v oblasti

mapy s nižším rozlišením. Ukazatelem konzistence peptidového

profilu může být prostě počet větších detekovaných

peptidů. Ukazatel je však nejlépe definován rozlišením peptidových

píků. Chromatografické parametry, jako je rozlišení

dvou píků od sebe, maximální šířka píku, plocha píku,

faktory symetrie píku a účinnost kolony, se mohou použít

pro definování rozlišení peptidu. V závislosti na zkoušené

bílkovině a použité metodě separace se může nezbytně požadovat

rozlišení jednoho nebo více peptidů.

Opakování analýzy hydrolyzátu referenční látky pro zkoušenou

bílkovinu poskytuje měřítka pro přesnost a kvantitativní

výtěžnost. Výtěžnost identifikovaných peptidů je všeobecně

zjišťována použitím vnitřních nebo vnějších standardů

peptidu. Přesnost se vyjádří jako relativní směrodatná

odchylka (RSD). Ve výtěžnosti identifikovaných peptidů

i v přesnosti lze očekávat rozdíly; proto by se měly stanovit

limity použitelnosti systému pro výtěžnost i pro přesnost

identifikace peptidů. Tyto limity jsou specifické pro

danou bílkovinu a jsou uvedeny v jednotlivých lékopisných

článcích.

Nejprve se vizuálně porovnají relativní retence, odezvy píku

(plocha píku nebo jeho výška), počty píků a celkový profil

eluce. Potom se zkouška doplní a potvrdí matematickou analýzou

poměrů odezvy píku a chromatografickým profilem

směsi stejných objemových dílů hydrolyzátu zkoušeného

vzorku a referenční látky (směs 1 : 1). Jestliže všechny píky

v hydrolyzátu zkoušeného vzorku a v hydrolyzátu referenční

látky mají stejné relativní retence a stejné poměry odezvy píku,

je potvrzena totožnost zkoušené látky.

Jestliže píky, které se nejdříve eluovaly s významně rozdílnými

relativními retencemi, jsou pak pozorovány jako

jednotlivé píky ve směsi 1 : 1, počáteční rozdíl ukazuje

na variabilitu systému. Nicméně, jestliže jsou pozorovány

ve směsi 1 : 1 oddělené píky, je to důkazem, že každý

pík odpovídá jinému peptidu. Je-li pík ve směsi 1 : 1 významně

širší než odpovídající pík v hydrolyzátu jak

zkoušeného vzorku, tak referenční látky, může to znamenat

přítomnost více různých peptidů. Navrhuje a provádí

se počítačové rozpoznání vzorů s použitím softwaru

pro analýzu údajů získaných při mapování peptidů, ale

problémy spojené s validací softwaru počítače vylučují

v nejbližší době jeho použití v lékopisných zkouškách.

Jiné používané automatizované postupy využívají matematické

vzorce, modely a vzory. Takovými postupy jsou

pro identifikaci peptidů např. automatizované identifikace

sloučenin spektrofotometrií v infračervené oblasti

a spektrální analýza v ultrafialové oblasti s detekcí v diodovém

poli. Tyto metody jsou omezeny nedostatečným

rozlišením, společnou elucí fragmentů nebo absolutními

rozdíly v odpovědi píků mezi fragmenty při štěpení referenční

látky a zkoušeného vzorku.

Pro vybranou skupinu důležitých píků, které byly správně

identifikovány na peptidové mapě, se může provést numerické

porovnání retenčních časů píků a ploch píků nebo výšek

píků. Plochy píků se mohou vypočítat ve vztahu k jednomu

píku, který jako vnitřní standard vykazuje relativně

malé odchylky. Přitom je třeba pamatovat na to, že integrace

plochy píku je citlivá na kolísání základní linie a snadno

vnese do analýzy chybu. Jiná možnost je vypočítat procentuální

výšku každého peptidového píku ze součtu výšek

všech píků zkoušeného vzorku a porovnat ji s odpovídajícími

relativními výškami píků (v procentech) referenční

látky. Možnost autohydrolýzy trypsinu se monitoruje vytvořením

peptidové mapy kontrolního vzorku, tj. peptidové

mapy získané působením trypsinu na kontrolní vzorek.

Minimálním požadavkem pro kvalifikaci mapování peptidů

je schválený postup zkoušky, který jako kontrolu zkoušky

zahrnuje test způsobilosti. V počátečním stadiu regulačního

procesu obvykle postačuje kvalifikace mapování peptidů

bílkoviny. Jak se regulační schvalovací proces vyvíjí, mohou

se do doplňující kvalifikace zkoušení vkládat dílčí validace

analytického postupu, aby se zajistilo, že metoda bude

provedena tak, jak se zamýšlelo při vývoji peptidové

mapy pro specifikovanou bílkovinu.

ANALÝZA A IDENTIFIKACE PEPTIDŮ

Následující část tvoří směrnici pro použití mapování peptidů

při vývoji na podporu požadavků regulační autority.

Použití peptidové mapy jako nástroje kvality nepožaduje

úplnou charakterizaci jednotlivých peptidových píků. Nicméně

validace mapování peptidů na podporu požadavků

regulační autority vyžaduje přísnou charakteristiku každého

jednotlivého píku v peptidové mapě. Metody charakterizace

píků sahají od N-koncového sekvenování každého peptidového

píku s následnou analýzou aminokyselin až po hmotnostní

spektrometrii (MS).

Když se pro charakterizaci používá N-koncové sekvenování

a analýza aminokyselin, provede se separace s větším množstvím

látky. To však může ovlivnit rozlišení peptidových

píků a je nutné se použitím empirických údajů přesvědčit,

že nedošlo k žádné ztrátě v rozlišení. Eluáty odpovídající

188 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.56 ANALÝZA AMINOKYSELIN

specifickým peptidovým píkům se sbírají, zahušťují pomocí

vakua a je-li třeba, znovu se provede chromatografie. Velikost

peptidů může omezit analýzu aminokyselin ve fragmentech.

Je-li blokován N-konec, je třeba jej před sekvenováním

uvolnit. Pro účely charakterizace se může též použít

C-koncové sekvenování bílkovin kombinací karboxypeptidasy

a metody ionizace desorpcí laserem v přítomnosti matrice

spojené s analyzátorem (matrix-assisted laser desoption

ionisation coupled to time-of-flight, MALDI-TOF).

Pro charakterizaci peptidových fragmentů se použije hmotnostní

spektrometrie (MS). Analýza struktury se provede

buď přímým dávkováním izolovaných peptidů, nebo použitím

spojeného systému hmotnostní spektrometrie a kapalinové

chromatografie (on-line LC-MS). To obecně zahrnuje

ionizaci elektrospreji, ionizaci typu MALDI-TOF-MS

a ionizaci nárazem rychlých atomů (fast-atom bombardment,

FAB). K sekvenování modifikovaných bílkovin

a k určení typu modifikace aminokyseliny se také používá

zdvojená hmotnostní spektrometrie (tandem MS). K přiřazení

disulfidových vazeb k různým peptidům obsahujícím

sulfhydrylové skupiny se použije metoda porovnání hmotnostních

spekter hydrolyzátů získaných před redukcí a po

redukci.

Pokud jsou části primární struktury na peptidové mapě nezřetelné,

může se sestavit sekundární peptidová mapa. Cílem

validované metody charakterizace bílkoviny pomocí

mapování peptidů je nalézt a potvrdit nejméně 95 % teoretického

složení struktury bílkoviny.


9.3:20256

Analýzou aminokyselin se rozumí metody používané ke

stanovení složení aminokyselin nebo obsahu bílkovin, peptidů,

a jiných farmaceutických přípravků. Bílkoviny a peptidy

jsou makromolekuly složené z kovalentně vázaných

zbytků aminokyselin seskupených v lineární polymery.

Sekvence aminokyselin v bílkovině nebo peptidu určuje

vlastnosti molekuly. Za bílkoviny se považují velké molekuly,

které se obvykle vyskytují jako složené struktury se

specifickým tvarem, zatímco peptidy jsou menší a mohou

se skládat pouze z několika aminokyselin. Analýza aminokyselin

se může použít ke stanovení obsahu bílkovin a peptidů,

k určení totožnosti bílkovin nebo peptidů na základě

jejich aminokyselinového složení, k potvrzení strukturní

analýzy bílkovin a peptidů, k vyhodnocení fragmentačních

postupů pro mapování peptidů a k detekci atypických aminokyselin,

které mohou být přítomné v bílkovině nebo peptidu.

Před analýzou aminokyselin je nutné hydrolyzovat

bílkoviny/peptidy na jednotlivé aminokyseliny. Po hydrolýze

bílkoviny/peptidu se provádí analýza aminokyselin

stejným způsobem jako analýza volných aminokyselin

v jiných farmaceutických přípravcích. Aminokyseliny přítomné

ve zkoušeném vzorku se pro analýzu obvykle derivatizují.

PŘÍSTROJ

Metody používané pro analýzu aminokyselin jsou obvykle

založeny na chromatografickém rozdělení aminokyselin

1

přítomných ve zkoušeném vzorku. Současné techniky používají

pro analytické účely s výhodou automatizované

chromatografické přístroje. Přístrojem pro analýzu aminokyselin

může být nízkotlaký nebo vysokotlaký kapalinový

chromatograf schopný vytvářet gradienty mobilní fáze, které

na chromatografické koloně dělí stanovované aminokyseliny.

Pokud se nepoužije předkolonová derivatizace, musí

být přístroj vybaven zařízením pro derivatizaci za kolonou.

Pro detekci se obvykle používá spektrofotometrický detektor

v ultrafialové nebo viditelné oblasti nebo fluorescenční

detektor, v závislosti na použité derivatizační metodě. Záznamové

zařízení (např. integrátor) se používá k transformaci

analogového signálu z detektoru a pro kvantifikaci.

Upřednostňuje se používání instrumentace vyhrazené pouze

pro analýzu aminokyselin.

OBECNÁ OPATŘENÍ

Při analýze aminokyselin je třeba se vždy zaměřit na kontaminaci

pozadí. Je nezbytné používat zkoumadla s vysokým

stupněm čistoty (např. nízká čistota kyseliny chlorovodíkové

může přispět ke kontaminaci glycinem). Analytická

zkoumadla se obvykle obměňují vždy po několika týdnech

a používají se pouze rozpouštědla v jakosti pro HPLC. Případnou

kontaminaci zkoumadel, která může být mikrobiální

nebo cizími látkami, lze snížit filtrací před jejich použitím.

Nádoby s rozpouštědly se skladují uzavřené a přístroje

pro analýzu aminokyselin se neumisťují na přímé sluneční

světlo.

Kvalitu analýzy aminokyselin určuje úroveň laboratorní

praxe. Přístroje se umístí v málo frekventované části laboratoře.

Laboratoř se udržuje v čistotě. Čištění a kalibrace pipet

se provádí podle předepsaného operačního postupu.

Konce pipet se uchovávají v uzavřené nádobě; analytici se

nesmí dotýkat špiček pipet rukama a používají rukavice

z latexu nebo podobného materiálu, neošetřené zásypem.

Omezí se počet otevírání a zavírání lahviček se zkoušeným

vzorkem, protože prach může vést ke zvýšení hladin glycinu,

serinu a alaninu.

Pro akceptovatelnost výsledků analýzy aminokyselin je nezbytné

udržovat přístroj v dobrém stavu. Používá-li se přístroj

obvyklým způsobem, je nezbytné denně kontrolovat

propustnost, stabilitu detektoru a zdroje a rozlišovací

schopnost kolony pro jednotlivé aminokyseliny. Všechny

filtry a jiné části přístroje se pravidelně čistí nebo vyměňují

podle plánu údržby.

REFERENČNÍ LÁTKY

Standardy aminokyselin vhodné pro analýzu aminokyselin

jsou komerčně dostupné a obvykle je tvoří směs aminokyselin

ve vodě.

Při stanovení složení aminokyselin se standardy bílkovin

nebo peptidů analyzují současně se zkoušeným vzorkem,

aby se prokázala integrita celého procesu. Pro tento účel se

jako standardní bílkovina používá vysoce čištěný albumin

hovězího séra.

KALIBRACE PŘÍSTROJE

Kalibrace přístroje pro analýzu aminokyselin typicky zahrnuje

analýzu aminokyselinového standardu, který obsahuje

Zkušební

metody

2.2

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


ČL 2017 – Dopl. 2020 189


směs aminokyselin v určitém rozmezí koncentrací, aby byl

stanoven odezvový faktor a rozsah analýzy pro každou

aminokyselinu. Koncentrace každé aminokyseliny ve standardu

je známá. Při kalibraci se připraví několik ředění roztoku

aminokyselinového standardu v rozsahu očekávané lineární

závislosti pro použitou metodu analýzy aminokyselin.

Potom lze opakovaně provést analýzu každého připraveného

ředění. Pro každou jednotlivou aminokyselinu se

proti známé koncentraci každé aminokyseliny ve standardním

ředění vynesou do grafu získané plochy píku. Tyto výsledky

umožní stanovit rozmezí koncentrací aminokyseliny,

ve kterém je plocha píku každé aminokyseliny přibližně

lineární funkcí koncentrace aminokyseliny. Je důležité, aby

se vzorky aminokyselin pro analýzu připravily tak, aby byly

v analytických limitech (tzn. v lineárním pracovním rozsahu)

použité metody, aby se získaly přesné a opakovatelné

výsledky.

Pro stanovení odezvového faktoru každé aminokyseliny se

analyzuje čtyři až šest standardních hladin aminokyseliny.

Odezvový faktor se vypočítá jako průměr plochy píku nebo

výšky píku vztažený na koncentraci jednoho nanomolu

aminokyseliny přítomné ve standardu. Pro výpočet koncentrace

každé aminokyseliny ve zkoušeném vzorku se připraví

a používá soubor kalibračních dat obsahující odezvový

faktor každé aminokyseliny. Koncentrace aminokyseliny

v nanomolech se vypočítá z poměru plochy píku odpovídající

aminokyseliny a odezvového faktoru pro tuto kyselinu.

Pro běžnou analýzu může stačit jednobodová kalibrace.

Soubor kalibračních dat se průběžně aktualizuje a ověřuje

se analyzováním kontrolních vzorků, aby se zajistila jejich

integrita.

OPAKOVATELNOST

Trvale vysoká kvalita výsledků analýzy aminokyselin z analytické

laboratoře vyžaduje věnovat pozornost zajištění opakovatelnosti

zkoušky. Při vyhodnocení chromatografické separace

aminokyselin nebo jejich derivátů lze na chromatogramu

pozorovat četné píky, které odpovídají aminokyselinám.

Velké množství píků nutně vyžaduje, aby se použil

takový systém analýzy aminokyselin, který umožní opakovaně

identifikovat píky na základě retenčního času a integrovat

plochy píků pro kvantifikaci. Vyhodnocení opakovatelnosti

typicky zahrnuje přípravu standardního roztoku aminokyselin

a opakované analýzy (např. šest analýz nebo více)

téhož standardního roztoku. Pro retenční čas a integrované

plochy píku každé aminokyseliny se určí relativní směrodatná

odchylka (RSD). Vyhodnocení opakovatelnosti se rozšiřuje

o vícenásobné zkoušky v průběhu několika dnů prováděné

různými analytiky. To zahrnuje přípravu standardních

ředění výchozích látek, aby se stanovila odchylka způsobená

manipulací se vzorkem. Součástí vyhodnocení opakovatelnosti

metody často bývá analýza aminokyselinového složení

standardní bílkoviny (např. albuminu hovězího séra). Vyhodnocením

odchylky mezi výsledky analýz (tj. RSD) může

laboratoř určit analytické limity a prokázat, že má výsledky

analýz pod kontrolou. Je žádoucí stanovit co nejnižší praktické

limity pro odchylku, aby se zajistily nejlepší výsledky.

Pro zajištění nižší variability výsledků analýzy aminokyselin

se pozornost zaměřuje na přípravu vzorku, na vysokou spektrální

interferenci pozadí, kterou ovlivňuje jakost zkoumadel

a/nebo laboratorní postupy, na technické parametry přístrojového

vybavení a jeho údržbu, na analýzu dat a jejich interpretaci

a na výkon a pracovní návyky analytika. Všechny

uvedené parametry se posuzují v rámci validace metody.

PŘÍPRAVA VZORKU

Pro dosažení správných výsledků analýzy aminokyselin

musí být vzorky aminokyselin a peptidů čisté. Složky tlumivých

roztoků (např. soli, močovina, detergenty) mohou

rušit analýzu aminokyselin a před analýzou se ze vzorku

odstraní. Metody, které využívají postkolonovou derivatizaci

aminokyselin, nejsou obvykle ovlivňovány složením

tlumivých roztoků, na rozdíl od předkolonových derivatizačních

metod. Je žádoucí snížit počet manipulací se vzorkem,

aby se omezila potenciální kontaminace pozadí, zlepšila

výtěžnost stanovované látky a snížila pracnost metody.

Obvyklé postupy, které se používají k odstranění složek

tlumivých roztoků ze vzorků bílkovin, jsou následující:

(1) nástřik vzorku bílkoviny do systému HPLC s obrácenými

fázemi, vymytí bílkoviny těkavým rozpouštědlem,

které obsahuje dostatek organické složky a vysušení vzorku

ve vakuové odstředivce; (2) dialýza proti těkavému tlumivému

roztoku nebo vodě; (3) odstředivá ultrafiltrace, pro

náhradu tlumivého roztoku těkavým tlumivým roztokem

nebo vodou; (4) vysrážení bílkoviny z tlumivého roztoku

s využitím organického rozpouštědla (např. acetonu);

(5) gelová filtrace.

VNITŘNÍ STANDARDY

Doporučuje se používat vnitřní standard k monitorování

fyzikálních a chemických ztrát a změn v průběhu analýzy

aminokyselin. Přesně známé množství vnitřního standardu

se může přidat k roztoku bílkoviny před hydrolýzou. Výtěžnost

vnitřního standardu udává celkovou výtěžnost aminokyselin

v roztoku bílkovin. Volné aminokyseliny se však

nechovají v průběhu hydrolýzy stejně jako aminokyseliny

vázané bílkovinnou vazbou, jejichž rychlosti uvolňování

nebo rozkladu jsou proměnlivé. Proto použití vnitřního

standardu ke korekci ztrát během hydrolýzy může poskytovat

nespolehlivé výsledky. Tuto možnost je třeba vzít

v úvahu při interpretaci výsledků. Vnitřní standardy se také

mohou přidat ke směsi aminokyselin po hydrolýze, aby se

tak korigovaly rozdíly v aplikaci vzorků a změny stability

zkoumadel a průtokové rychlosti. Ideální vnitřní standard je

přirozeně se nevyskytující primární aminokyselina, která je

komerčně dostupná a levná. Měla by také být stabilní během

hydrolýzy, její odezvový faktor by měl být ve vztahu

ke koncentraci lineární a musí se eluovat s jedinečným retenčním

časem bez překrývání jiných aminokyselin. Jako

standardy aminokyselin se obvykle používají norleucin, nitrotyrosin

a kyselina α-aminomáselná (2-aminobutanová).

HYDROLÝZA BÍLKOVIN

Před analýzou vzorků bílkovin a peptidů je nutné provést

jejich hydrolýzu. Skleněné nádobí používané pro hydrolýzu

musí být velmi čisté, aby nedocházelo k chybným výsledkům.

Kontaminaci může způsobovat též prášek do rukavic

a otisky prstů na hydrolyzačních zkumavkách. Skleněné

zkumavky pro hydrolýzu se čistí varem 1 h s kyselinou

chlorovodíkovou 1 mol/l nebo namáčením zkumavek

v koncentrované kyselině dusičné nebo ve směsi stejných

objemových dílů koncentrované kyseliny chlorovodíkové

a kyseliny dusičné. Čisté zkumavky pro hydrolýzu se vy-

190 ČL 2017 – Dopl. 2020


pláchnou vysoce čištěnou vodou a následně methanolem

o stupni čistoty pro HPLC, přes noc se suší v sušárně

a uchovávají se zakryté. Kontaminaci zkumavek pro hydrolýzu

lze odstranit také pyrolýzou skleněného nádobí 4 h při

500 °C. Je také možné použít vhodný laboratorní materiál

na jedno použití.

Kyselá hydrolýza je nejpoužívanější metoda pro hydrolýzu

bílkovinných vzorků před analýzou aminokyselin. Provedení

kyselé hydrolýzy může přispět k odchylkám způsobeným

úplným nebo částečným rozkladem některých aminokyselin:

tryptofan se rozkládá, serin a threonin se rozkládají

částečně; methionin může podlehnout oxidaci; cystein se

obvykle získá jako cystin (avšak výtěžnost cystinu je malá,

protože se částečně rozkládá nebo se redukuje na cystein).

Míru oxidačního rozkladu lze snížit použitím dostatečného

vakua (méně než 200 µm rtuťového sloupce nebo 26,7 Pa)

nebo zavedením inertního plynu (argonu) do horního prostoru

reakční nádoby. Peptidické vazby isoleucinu a amidické

vazby valinu ve sloučeninách Ile-Ile, Val-Val, Ile-Val

a Val-Ile se částečně štěpí; asparagin a glutamin se deaminují

za vzniku kyseliny asparagové, respektive kyseliny

glutamové. Ztrátou tryptofanu, asparaginu a glutaminu se

snižuje počet aminokyselin vhodných pro kvantitativní stanovení

za použití kyselé hydrolýzy na sedmnáct aminokyselin.

Některé z dále uvedených hydrolyzačních postupů

eliminují výše popsaná omezení. Některé z postupů hydrolýzy

(Metody 4 až 11) mohou způsobit změny jiných aminokyselin.

Proto je třeba před použitím jiné techniky než

kyselá hydrolýza zvážit výhody a nevýhody daného hydrolyzačního

postupu a před jeho zavedením ho přiměřeně

ověřit.

Časová studie (tj. kyselá hydrolýza aminokyselin v časovém

úseku 24 h, 48 h a 72 h) se často používá pro analýzu

výchozích koncentrací aminokyselin, které se částečně rozkládají

nebo se pomalu štěpí. Jestliže se do grafu vynese

stanovená koncentrace nestálých aminokyselin (např. serinu

a threoninu) proti době hydrolýzy, lze extrapolací stanovit

výchozí koncentraci těchto aminokyselin. Časové studie

hydrolýzy se také používají pro aminokyseliny, které se

pomalu štěpí (např. isoleucin a valin). V časovém průběhu

hydrolýzy se u těchto aminokyselin pozoruje na křivce

ustálený stav. Hodnota výšky v ustáleném stavu určuje

koncentraci aminokyseliny. Jestliže doba hydrolýzy je příliš

dlouhá, koncentrace aminokyseliny se začne snižovat, což

značí rozklad za daných podmínek hydrolýzy.

Vhodná alternativa k časové studii je podrobení kalibračního

standardu aminokyseliny stejným podmínkám hydrolýzy

jako zkoušený vzorek. Volná aminokyselina nemusí zcela

reprezentovat rychlost rozkladu nestálých aminokyselin jako

aminokyselina vázaná v peptidu nebo bílkovině během

hydrolýzy. To platí především pro peptidické vazby, které

se pomalu štěpí (např. vazby Ile-Val). Avšak tato technika

umožňuje zohlednit rozklad některých aminokyselin. Používá

se i mikrovlnná kyselá hydrolýza, která je rychlá, ale

vyžaduje speciální zařízení a zvláštní opatření. Optimální

podmínky pro mikrovlnnou hydrolýzu je třeba nalézt pro

každý jednotlivý bílkovinný/peptidový vzorek. Postup mikrovlnné

hydrolýzy trvá obvykle pouze několik minut, ale

i odchylka jedné minuty může vést k neadekvátním výsledkům

(např. k neúplné hydrolýze nebo k rozkladu nestálých

aminokyselin). Úplná proteolýza směsí proteas, která se také

používá, může být velmi složitá, vyžaduje řádnou kontrolu

a je více využívána pro peptidy než pro bílkoviny.

Při počátečních analýzách neznámé bílkoviny se nejprve

provádějí zkoušky s různými časy hydrolýzy a různými teplotami,

aby byly nalezeny optimální podmínky.

METODA 1

Nejběžnějším postupem při hydrolýze bílkoviny/peptidu je

kyselá hydrolýza za použití kyseliny chlorovodíkové obsahující

fenol, po které následuje analýza aminokyselin. Přidání

fenolu do reakční směsi zabraňuje halogenaci tyrosinu.

Hydrolyzační roztok. Kyselina chlorovodíková (6 mol/l)

obsahující 0,1 % až 1,0 % fenolu.

Postup

Hydrolýza v kapalné fázi. Vzorek bílkoviny nebo peptidu se

vloží do hydrolyzační zkumavky a vysuší se (vzorek se suší,

aby voda ve vzorku neředila kyselinu potřebou pro hydrolýzu).

Na 500 µg lyofilizované bílkoviny se přidá 200 µl

hydrolyzačního roztoku. Zkumavka se vzorkem se zmrazí

v lázni aceton-suchý led a zataví se plamenem ve vakuu.

Vzorky se obvykle hydrolyzují 24 h při 110 °C ve vakuu

nebo v inertní atmosféře, aby se zabránilo oxidaci. Jestliže

se zjistí, že bílkovina není zcela hydrolyzována, použije se

delší doba hydrolýzy (např. 48 h a 72 h).

Hydrolýza v plynné fázi. Je to jeden z nejpoužívanějších

postupů kyselé hydrolýzy a používá se především pro mikroanalýzu,

kdy je dostupné pouze malé množství vzorku.

Hydrolýzou v plynné fázi se také minimalizuje kontaminace

vzorku kyselým činidlem. Lahvičky obsahující vysušené

vzorky se vloží do větší nádobky obsahující příslušné

množství hydrolyzačního roztoku. Hydrolyzační roztok nepřichází

do styku se zkoušeným vzorkem. Inertní atmosféra

nebo vakuum (méně než 200 µm rtuťového sloupce nebo

26,7 Pa) se zavádí do horní části nádobky a zahřívá se 24 h

při asi 110 °C. Páry kyseliny hydrolyzují vysušený vzorek.

Kondenzaci kyseliny v lahvičce se vzorkem je třeba minimalizovat.

Po hydrolýze se zkoušený vzorek vysuší ve vakuu,

aby se odstranily zbytky kyseliny.

METODA 2

Přidáním kyseliny merkaptoethansulfonové jako redukčního

činidla se sníží oxidace tryptofanu během hydrolýzy.

Hydrolyzační roztok. Roztok kyseliny merkaptoethansulfonové

(2,5 mol/l).

Hydrolýza v plynné fázi. V hydrolyzační zkumavce se vysuší

asi 1 µg až 100 µg zkoušené bílkoviny/peptidu. Hydrolyzační

zkumavka se vloží do větší zkumavky s asi 200 µl

hydrolyzačního roztoku. Větší zkumavka se zataví ve vakuu

(asi 50 µm rtuťového sloupce nebo 6,7 Pa), aby se hydrolyzační

roztok převedl do plynné fáze. Hydrolyzační

zkumavka se zahřívá 12,5 min na 170 °C až 185 °C. Po

hydrolýze se hydrolyzační zkumavka suší 15 min ve vakuu,

aby se odstranily zbytky kyseliny.

METODA 3

Přidáním kyseliny thioglykolové (TGA) jako redukčního

činidla se zabrání oxidaci tryptofanu během hydrolýzy.

Hydrolyzační roztok. Kyselina chlorovodíková (7 mol/l)

obsahující 1 % fenolu, 10 % kyseliny trifluoroctové a 20 %

kyseliny thioglykolové.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 191


Hydrolýza v plynné fázi. V hydrolyzační zkumavce se vysuší

10 µg až 50 µg zkoušené bílkoviny/peptidu. Zkumavky

se vzorkem se vloží do větší zkumavky s asi 200 µl hydrolyzačního

roztoku. Větší zkumavka se zataví ve vakuu (asi

50 µm rtuťového sloupce nebo 6,7 Pa), aby se kyselina thioglykolová

převedla do plynné fáze. Zkumavka se vzorkem

se zahřívá 15 min až 30 min na 166 °C. Po hydrolýze se

zkumavka se vzorkem suší 5 min ve vakuu, aby se odstranily

zbytky kyseliny. Výtěžnost tryptofanu tímto postupem

může být závislá na jeho množství ve vzorku.

METODA 4

Před hydrolýzou bílkoviny se provede oxidace cysteinu/cystinu

a methioninu kyselinou permravenčí.

Oxidační roztok. Používá se čerstvě připravená směs objemových

dílů peroxidu vodíku (30%) a kyseliny mravenčí

bezvodé (1 + 9), která se nechá inkubovat 1 h při teplotě

místnosti.

Postup. Vzorek bílkoviny/peptidu se rozpustí ve 20 µl kyseliny

mravenčí bezvodé a zahřívá se 5 min při 50 °C; potom

se přidá 100 µl oxidačního roztoku. Oxidace probíhá

10 min až 30 min. Při této reakci se cystein přeměňuje na

kyselinu cysteovou a methionin na methionin-sulfon. Nadbytek

zkoumadla ve vzorku se odstraní ve vakuové odstředivce.

Oxidovaná bílkovina se potom kysele hydrolyzuje

použitím Metody 1 nebo Metody 2. V přítomnosti halogenidů

může dojít k modifikaci zbytků tyrosinu.

METODA 5

Oxidace cysteinu/cystinu se dosáhne při hydrolýze v kapalné

fázi s azidem sodným.

Hydrolyzační roztok. Ke kyselině chlorovodíkové

(6 mol/l), která obsahuje 0,2 % fenolu, se přidá azid sodný,

aby se dosáhlo koncentrace 2 g/l. Přidání fenolu zabraňuje

halogenaci tyrosinu.

Hydrolýza v kapalné fázi. Hydrolýza bílkoviny/peptidu se

provádí 24 h při asi 110 °C. Při hydrolýze přechází působením

azidu sodného cystein/cystin přítomný ve vzorku na

kyselinu cysteovou. Tento postup poskytuje lepší výtěžnost

tyrosinu než Metoda 4, ale není kvantitativní pro methionin.

Methionin se přeměňuje na směs methioninu a jeho

dvou oxidačních produktů, kterými jsou methionin-sulfoxid

a methionin-sulfon.

METODA 6

Oxidace cysteinu/cystinu se provádí dimethylsulfoxidem

(DMSO).

Hydrolyzační roztok. Ke kyselině chlorovodíkové (6 mol/l),

která obsahuje 0,1 % až 1,0 % fenolu, se přidá dimethylsulfoxid,

aby jeho výsledná koncentrace byla 2 % (V/V).

Hydrolýza v plynné fázi. Hydrolýza bílkoviny/peptidu se

provádí 24 h při asi 110 °C. Při hydrolýze přechází působením

dimethylsulfoxidu cystein/cystin přítomný ve vzorku na

kyselinu cysteovou. K omezení variability, a aby se kompenzoval

částečný rozklad, doporučuje se vyhodnotit výtěžnost

kyseliny cysteové při oxidační hydrolýze standardních

bílkovin, které obsahují 1 mol až 8 molů cysteinu v 1 molu

bílkoviny. Odezvové faktory pro bílkovinné/peptidové hydrolyzáty

jsou asi o 30 % nižší než pro standardy nehydrolyzované

kyseliny cysteové. Tímto postupem nelze získat

kompletní analýzu složení, protože histidin, methionin, tyrosin

a tryptofan také podléhají změnám.

METODA 7

Redukce a alkylace cysteinu/cystinu se dosáhne pyridylethylační

reakcí v plynné fázi.

Redukční roztok. Ve vhodné nádobě se smíchá 83,3 µl pyridinu,

16,7 µl 4-vinylpyridinu, 16,7 µl tributylfosfinu

a 83,3 µl vody.

Postup. Bílkovina/peptid (v množství 1 µg až 100 µg) se

vloží do hydrolyzační zkumavky, která se umístí ve větší

zkumavce. Redukční roztok se převede do větší zkumavky,

zataví se ve vakuu (asi 50 µm rtuťového sloupce nebo

6,7 Pa) a zahřívá se 5 min při asi 100 °C. Potom se vnitřní

hydrolyzační zkumavka vyjme a suší se 15 min ve vakuovém

exsikátoru, aby se odstranily zbytky zkoumadel. Pyridylethylovaný

vzorek se podrobí kyselé hydrolýze za použití

dříve popsaných metod. Současně se pro vyhodnocení

výtěžnosti pyridylethylcysteinu provede pyridylethylační

reakce se vzorkem bílkovinného standardu, který obsahuje

1 mol až 8 molů cysteinu v 1 molu bílkoviny. Delší inkubační

doby pro pyridylethylační reakci mohou způsobit

změny koncové α-aminoskupiny a ε-aminoskupiny lysinu

v bílkovině.

METODA 8

Redukce a alkylace cysteinu/cystinu se dosáhne pyridylethylační

reakcí v kapalné fázi.

Zásobní roztoky. Připraví se a filtrují tři roztoky: roztok

trometamol-hydrochloridu (1 mol/l) o pH 8,5 obsahující dinatrium-edetát

(0,004 mol/l) (zásobní roztok A); roztok guanidin-hydrochloridu

(8 mol/l) (zásobní roztok B) a 10%

roztok 2-merkaptoethanolu (zásobní roztok C).

Redukční roztok. Připraví se směs objemových dílů zásobního

roztoku A a zásobního roztoku B (1 + 3) tak, aby

se získal tlumivý roztok guanidin-hydrochloridu (6 mol/l)

v roztoku trometamol-hydrochloridu (0,25 mol/l).

Postup. 10 µg zkoušeného vzorku se rozpustí v 50 µl redukčního

roztoku a přidá se asi 2,5 µl zásobního roztoku C.

Uchovává se asi 2 h v atmosféře dusíku nebo argonu při

teplotě místnosti a ve tmě. Aby proběhla pyridylethylační

reakce, přidají se k roztoku bílkoviny asi 2 µl 4-vinylpyridinu

a nechá se inkubovat další 2 h při teplotě místnosti ve

tmě. Bílkovina/peptid se odsolí pomocí HPLC s obrácenými

fázemi. Před kyselou hydrolýzou se mohou spojené

chromatografické frakce obsahující bílkovinu/peptid vysušit

ve vakuové odstředivce.

METODA 9

Redukce a alkylace cysteinu/cystinu se dosáhne karboxymethylační

reakcí v kapalné fázi.

Zásobní roztoky. Připraví se tak, jak je uvedeno v Metodě

8.

Karboxymethylační roztok. Připraví se roztok jodacetamidu

v ethanolu 96% (100 g/l).

Tlumivý roztok. Použije se redukční roztok, jehož příprava

je uvedena v Metodě 8.

Postup. Zkoušený vzorek se rozpustí v 50 µl tlumivého

roztoku a přidá se 2,5 µl zásobního roztoku C. Uchovává se

2 h v atmosféře dusíku nebo argonu při teplotě místnosti

192 ČL 2017 – Dopl. 2020


a ve tmě. Přidá se karboxymethylační roztok v poměru odpovídajícím

1,5násobku celkového teoretického obsahu

thiolů a nechá se inkubovat dalších 30 min při teplotě místnosti

a ve tmě. Jestliže je obsah thiolu v bílkovině neznámý,

přidá se 5 µl roztoku jodacetamidu (0,1 mol/l) na každých

20 nmolů přítomné bílkoviny. Reakce se zastaví přidáním

přebytku 2-merkaptoethanolu. Bílkovina/peptid se

odsolí pomocí HPLC s obrácenými fázemi. Před kyselou

hydrolýzou se mohou spojené chromatografické frakce obsahující

bílkovinu/peptid vysušit ve vakuové odstředivce.

Vzniklý S-karboxyamidomethylcystein přechází při kyselé

hydrolýze na S-karboxymethylcystein.

METODA 10

Cystein/cystin reaguje s dithiodiglykolovou kyselinou nebo

dithiodipropionovou kyselinou za vzniku smíšeného disulfidu.

Výběr kyseliny dithiodiglykolové nebo dithiodipropionové

závisí na požadovaném rozlišení metody analýzy

aminokyselin.

Redukční roztok. Roztok kyseliny dithiodiglykolové (nebo

dithiodipropionové) (10 g/l) v roztoku hydroxidu sodného

(0,2 mol/l).

Postup. Do hydrolyzační zkumavky se vloží asi 20 µg

zkoušeného vzorku, přidá se 5 µl redukčního roztoku, 10 µl

propan-2-olu a všechna kapalina obsažená ve vzorku se odstraní

ve vakuové odstředivce. Potom se vzorek hydrolyzuje

za použití Metody 1. Tato metoda má tu výhodu, že se

ostatní aminokyseliny nederivatizují a vzorek se nemusí

před hydrolýzou odsolit.

METODA 11

Asparagin a glutamin při kyselé hydrolýze přecházejí na

kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou. Zbytky asparaginu

a kyseliny asparagové se sčítají a označují se jako

Asx, zatímco zbytky glutaminu a kyseliny glutamové se sčítají

a označují se jako Glx. Bílkoviny/peptidy mohou reagovat

s bis(1,1-trifluoracetoxy)jodbenzenem (BTI) tak, že

asparaginové a glutaminové zbytky se po kyselé hydrolýze

mění na zbytky kyseliny diaminopropionové a kyseliny diaminobutanové.

Touto konverzí se může stanovit obsah

asparaginu a glutaminu v bílkovině/peptidu v přítomnosti

zbytků kyseliny asparagové a kyseliny glutamové.

Redukční roztoky. Připraví a zfiltrují se tři roztoky: roztok

kyseliny trifluoroctové (0,01 mol/l) (roztok A), roztok guanidin-hydrochloridu

(5 mol/l) a kyseliny trifluoroctové

(0,01 mol/l) (roztok B) a čerstvě připravený roztok dimethylformamidu

obsahující bis(1,1-trifluoracetoxy)jodbenzen

(36 mg/ml) (roztok C).

Postup. Do čisté hydrolyzační zkumavky se převede asi

200 µg zkoušeného vzorku, přidají se 2 ml roztoku A nebo

roztoku B a 2 ml roztoku C. Hydrolyzační zkumavka se zataví

ve vakuu. Vzorek se zahřívá 4 h při 60 °C ve tmě. Potom

se vzorek dialyzuje třikrát vodou, aby se odstranil přebytek

zkoumadel. Dialyzovaný vzorek se třikrát extrahuje

stejnými objemy butyl-acetátu a pak se lyofilizuje. Bílkovina

se potom může kysele hydrolyzovat za použití dříve

popsaných metod. Při analýze aminokyselin založené na

iontoměničové chromatografii se obvykle neoddělí kyselina

α,ß-diaminopropionová a kyselina α,γ-diaminobutanová od

lysinu. Použije-li se iontoměničová chromatografie jako

způsob dělení aminokyselin, obsah asparaginu a glutaminu

se získá jako rozdíl v obsahu kyseliny asparagové a glutamové

v hydrolyzátech nederivatizovaných a derivatizovaných

s bis(1,1-trifluoracetoxy)jodbenzenem. Obsah threoninu,

methioninu, cysteinu, tyrosinu a histidinu se může derivatizací

bis(1,1-trifluoracetoxy)jodbenzenem změnit;

jestliže se jedná o stanovení obsahu těchto aminokyselin,

musí se použít hydrolýza bez bis(1,1-trifluoracetoxy)jodbenzenu.

OBECNÉ PRINCIPY METOD ANALÝZY

AMINOKYSELIN

Existuje mnoho technik analýzy aminokyselin a výběr metody

často závisí na požadované citlivosti stanovení. Asi

jedna polovina metod analýzy aminokyselin je založena na

dělení aminokyselin iontoměničovou chromatografií a následné

postkolonové derivatizaci (např. ninhydrinem nebo

ftalaldehydem). Postkolonová derivatizační metoda se může

použít pro vzorky, které obsahují malé množství složek

tlumivých roztoků (jako jsou soli a močovina) a obecně vyžadují

pro analýzu 5 µg až 10 µg vzorku bílkoviny. Zbývající

metody analýzy aminokyselin obvykle zahrnují předkolonovou

derivatizaci volných aminokyselin (např. fenylisothiokyanátem;

6-aminochinolyl-N-hydroxysukcinimidylkarbamátem

nebo ftalaldehydem; (dimethylamino)azobenzensulfonylchloridem;

9-fluorenylmethyl-chlorformiátem

a 7-fluor-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolem), po které následuje

dělení pomocí HPLC s obrácenými fázemi. Metody

předkolonové derivatizace jsou velmi citlivé a 0,5 µg až

1 µg bílkovinného vzorku obvykle dostačuje. Analýza může

však být ovlivněna solemi z tlumivého roztoku ve vzorku.

Předkolonová derivatizační metoda může také poskytovat

více derivátů dané aminokyseliny, což komplikuje interpretaci

výsledku. Postkolonové derivatizační metody

jsou obecně méně ovlivněny změnami v provedení stanovení

než metody předkolonové.

Pro kvantitativní analýzu aminokyselin se mohou použít

dále uvedené metody. Přístroje a zkoumadla pro tyto postupy

jsou komerčně dostupné. Navíc existuje mnoho modifikací

těchto metod s různými způsoby přípravy zkoumadel,

reakčních postupů, chromatografických systémů atd.

Specifické parametry se mohou měnit podle vybavení laboratoře

a používaného postupu. Mnoho pracovišť používá

více než jen jednu metodu analýzy aminokyselin, aby se

využily přednosti každé z nich. V každé z těchto metod je

analogový signál zviditelněn prostředky systému získání

dat a plochy píků se integrují pro kvantitativní účely.

METODA 1 – POSTKOLONOVÁ DERIVATIZACE

NINHYDRINEM

Iontoměničová chromatografie s postkolonovou derivatizací

ninhydrinem je jednou z nejběžnějších metod pro kvantitativní

analýzu aminokyselin. K analýze složitějších fyziologických

vzorků se zpravidla používá systém založený na

iontové výměně kationtu lithia. Rychlejší systém, založený

na výměně kationtu sodíku, se používá pro jednodušší směsi

aminokyselin získané hydrolýzou bílkoviny (obvykle obsahují

sedmnáct aminokyselin). Rozdělení aminokyselin na

iontoměničové koloně se dosáhne kombinací změn pH

a iontové síly. Pro lepší dělení se často využívá teplotní

gradient.

Jestliže aminokyselina reaguje s ninhydrinem, zkoumadlo

se zbarví charakteristicky červenofialově nebo žlutě. Aminokyseliny,

s výjimkou iminokyseliny, dávají červenofialo-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 193


vé zbarvení a vykazují absorpční maximum při 570 nm.

Iminokyseliny, jako je prolin, dávají žluté zbarvení a vykazují

absorpční maximum při 440 nm. Produkt vzniklý postkolonovou

reakcí ninhydrinu s aminokyselinou se eluuje

z kolony a zaznamenává se při 440 nm a 570 nm. Získaný

chromatogram se používá ke stanovení aminokyselinového

složení.

Pro většinu derivátů aminokyselin se za detekční limit považuje

10 pmol, ale pro prolin to je 50 pmol a lineární odezva

je v rozmezí 20 pmol až 500 pmol s korelačními koeficienty

převyšujícími hodnotu 0,999. Dobře hodnotitelné

údaje o složení aminokyselin se získají při použití vzorků,

které mají před hydrolýzou hmotnost větší než 1 µg bílkoviny/peptidu.

METODA 2 – POSTKOLONOVÁ DERIVATIZACE

FTALALDEHYDEM

S primárními aminy reaguje ftalaldehyd (OPA) za přítomnosti

thiolových sloučenin na isoindolové produkty s vysokou

fluorescencí. Tato reakce se využívá pro postkolonovou

derivatizaci k analýze aminokyselin iontoměničovou

chromatografií. Pravidla pro dělení jsou stejná jako

v Metodě 1.

Sekundární aminy (iminokyseliny, jako je prolin) nemohou

reagovat s ftalaldehydem, za vzniku fluoreskujících sloučenin.

Oxidace sekundárních aminů chlornanem sodným nebo

chloraminem T umožní reakci s ftalaldehydem. Postup používá

k oddělení volných aminokyselin kolonu se silně kyselým

katexem, následnou postkolonovou oxidaci chlornanem

sodným nebo chloraminem T a postkolonovou derivatizaci

ftalaldehydem a thiolovou sloučeninou, jako je

N-acetyl-L-cystein nebo 2-merkaptoethanol (2-sulfanyl-

-ethan-1-ol). Derivatizace primárních aminokyselin není

viditelně ovlivněna kontinuálním přidáváním chlornanu

sodného nebo chloraminu T.

Dělení aminokyselin na koloně s iontoměničem využívá

kombinaci změn pH a iontové síly. Po postkolonové derivatizaci

eluovaných aminokyselin ftalaldehydem prochází

zkoumadlo fluorimetrickým detektorem. Intenzita fluorescence

aminokyselin derivatizovaných ftalaldehydem se

monitoruje při excitační vlnové délce 348 nm a emisní vlnové

délce 450 nm.

Pro většinu derivátů aminokyselin derivatizovaných ftalaldehydem

se za detekční limit považuje několik desítek

pikomolů na litr a lineární odezva je v rozmezí několika

pikomolů až několika desítek pikomolů na litr. Dobře hodnotitelné

údaje o složení aminokyselin bílkoviny/peptidu se

získají při použití vzorků, které mají před hydrolýzou hmotnost

větší než 500 ng bílkoviny/peptidu.

METODA 3 – PŘEDKOLONOVÁ DERIVATIZACE

FENYLISOTHIOKYANÁTEM

Fenylisothiokyanát (PITC) reaguje s aminokyselinami a vytváří

fenylthiokarbamylové (PTC) deriváty, které se s vysokou

citlivostí detekují při 254 nm. Předkolonová derivatizace

aminokyselin fenylisothiokyanátem a následné dělení

HPLC s obrácenými fázemi s UV detekcí se používají při

analýze složení aminokyselin.

Po odstranění zkoumadla ve vakuu mohou být derivatizované

aminokyseliny skladovány ve vysušeném a zmrazeném

stavu několik týdnů bez znatelného rozkladu. Jestliže

se roztok pro nástřik udržuje v chladu, nejsou po třech

dnech zaznamenány žádné významné ztráty chromatografické

odezvy.

Dělení fenylthiokarbamylových derivátů aminokyselin

HPLC s obrácenými fázemi s oktadecylsilylovou (ODS)

kolonou se dosáhne kombinací změn koncentrace acetonitrilu

a iontové síly tlumivého roztoku. Fenylthiokarbamylové

deriváty aminokyselin eluované z kolony se detekují

při 254 nm.

Pro většinu fenylthiokarbamylových derivátů aminokyselin

se za detekční limit považuje 1 pmol. Lineární odezva je

v rozmezí 20 pmol až 500 pmol, s korelačními koeficienty

přesahujícími 0,999. Pro získání dobře hodnotitelných údajů

o složení aminokyselin se doporučuje použít vzorky, které

mají před hydrolýzou hmotnost větší než 500 ng bílkoviny/peptidu.


6-AMINOCHINOLYL-N-HYDROXYSUKCINIMIDYL-

-KARBAMÁTEM

Používá se předkolonová derivatizace aminokyselin 6-aminochinolyl-N-hydroxysukcinimidyl-karbamátem

(AQC)

a následné dělení HPLC s obrácenými fázemi a fluorimetrickou

detekcí.

S aminokyselinami reaguje 6-aminochinolyl-N-hydroxysukcinimidyl-karbamát

za vzniku stabilních nesymetrických

fluorescenčních derivátů močoviny (AQC-aminokyseliny),

které se snadno dělí HPLC s obrácenými fázemi.

Pro analýzu složení aminokyselin se používá předkolonová

derivatizace aminokyselin 6-aminochinolyl-N-hydroxysukcinimidyl-karbamátem

a následné dělení HPLC s obrácenými

fázemi s fluorimetrickou detekcí.

Dělení AQC derivátů aminokyselin na HPLC s obrácenými

fázemi s použitím oktadecylsilylované kolony se dosáhne

kombinací změn koncentrace acetonitrilu a iontové síly

tlumivého roztoku. Selektivní fluorescenční detekce těchto

derivátů se provádí při excitační vlnové délce 250 nm

a emisní vlnové délce 395 nm a umožňuje přímý nástřik reakční

směsi bez významných interferencí jediného vedlejšího

produktu, tj. 6-aminochinolinu. Nadbytek zkoumadla

se rychle hydrolyzuje (t1/2 < 15 s) na 6-aminochinolin-N-

-hydroxysukcinimid a oxid uhličitý a po 1 min již neprobíhá

žádná další derivatizace.

Plochy píků pro AQC-aminokyseliny jsou v podstatě neměnné

nejméně 1 týden při teplotě místnosti. AQC-aminokyseliny

jsou více než dostatečně stabilní, aby se mohla

provádět automatizovaná chromatografie přes noc.

Za detekční limit se považuje asi 40 fmol až 320 fmol pro

každou aminokyselinu s výjimkou cysteinu, pro který to je

asi 800 fmol. Lineární odezva je v rozmezí 2,5 µmol až

200 µmol s korelačními koeficienty převyšujícími 0,999.

Dobře hodnotitelné údaje o složení aminokyselin se mohou

získat již při použití vzorků, které mají před hydrolýzou

hmotnost 30 ng bílkoviny/peptidu.


FTALALDEHYDEM

Používá se předkolonová derivatizace aminokyselin ftalaldehydem

(OPA) a následné dělení HPLC s obrácenýmí fázemi

a fluorimetrickou detekcí. Tento postup nelze použít pro

aminokyseliny, které jsou sekundárními aminy (např. prolin).

Ftalaldehyd ve spojení s thiolovými činidly, jako např.

2-merkaptoethanol (2-sulfanylethan-1-ol) nebo kyselina

194 ČL 2017 – Dopl. 2020


3-merkaptopropionová (3-sulfanylpropionová), reaguje

s primární aminoskupinou za vzniku vysoce fluorescenčních

isoindolových produktů. Ftalaldehyd sám nevykazuje

fluorescenci a nevytváří tedy žádné interferenční píky. Navíc

jeho rozpustnost a stabilita ve vodném roztoku, stejně

jako rychlá kinetika reakce, jsou vhodné pro automatizovanou

derivatizaci a analýzu využívající automatický vzorkovač

ke smíchání vzorku se zkoumadlem. Naopak jeho nevýhodou

je nedostatečná reaktivita se sekundárními aminy

(např. prolin). Aby se tato nevýhoda kompenzovala, kombinuje

se tato technika s jinými postupy popsanými v Metodě

7 nebo v Metodě 8.

Po předkolonové derivatizaci aminokyselin ftalaldehydem

následuje dělení HPLC s obrácenými fázemi. Vzhledem

k nestabilitě derivátů aminokyselin s ftalaldehydem se dělení

HPLC a analýza provedou ihned po derivatizaci. Kapalinový

chromatogram je vybaven fluorimetrickým detektorem

pro detekci derivatizovaných aminokyselin. Intenzita

fluorescence aminokyselin derivatizovaných ftalaldehydem

se monitoruje při excitační vlnové délce 348 nm a emisní

vlnové délce 450 nm.

Je popsán detekční limit pro fluorescenci až 50 fmol, praktický

limit analýzy zůstává 1 pmol.


4-(DIMETHYLAMINO)AZOBENZEN-4-SULFONYL-

CHLORIDEM

Používá se předkolonová derivatizace aminokyselin 4-(dimethylamino)azobenzen-4-sulfonylchloridem

(DABS-Cl)

a následné dělení HPLC s obrácenými fázemi s detekcí ve

viditelné části spektra.

4-(Dimethylamino)azobenzen-4-sulfonylchlorid je chromoforní

zkoumadlo používané ke značení aminokyselin. Aminokyseliny

značené 4-(dimethylamino)azobenzen-4-sulfonylchloridem

(DABS-aminokyseliny) jsou vysoce stabilní

a vykazují absorpční maximum při 436 nm.

Deriváty všech přirozených aminokyselin s 4-(dimethylamino)azobenzen-4-sulfonylchloridem

se dělí HPLC

s obrácenými fázemi na oktadecylsilylované koloně, která

využívá gradientových systémů směsí acetonitrilu a vodných

tlumivých roztoků. Rozdělené DABS-aminokyseliny

eluované z kolony se detekují při 436 nm ve viditelné oblasti

spektra.

Touto metodou se mohou analyzovat iminokyseliny, jako je

prolin, společně s ostatními aminokyselinami o stejném

stupni citlivosti. Metoda derivatizace 4-(dimethylamino)-

azobenzen-4-sulfonylchloridem umožňuje současné stanovení

tryptofanových zbytků po předchozí hydrolýze bílkoviny/peptidu

sulfonovými kyselinami, jako je kyselina

merkaptoethansulfonová, kyselina p-toluensulfonová nebo

kyselina methansulfonová. Tento postup je uveden v Metodě

2 části Hydrolýza bílkovin. Ostatní zbytky aminokyselin

nestálé při kyselé hydrolýze, jako je asparagin nebo glutamin,

se mohou analyzovat po předchozí konverzi na kyselinu

diaminopropionovou nebo kyselinu diaminobutanovou

reakcí bílkoviny/peptidu s bis(1,1-trifluoracetoxy)jodbenzenem

(BTI) popsanou v Metodě 11, části Hydrolýza bílkovin.

Pro tuto metodu nelze použít jako vnitřní standard nebílkovinnou

aminokyselinu norleucin, protože se eluuje v oblasti,

kde jsou píky primárních aminokyselin. Lze použít nitrotyrosin,

který se eluuje v chromatograficky prázdné oblasti.

Detekční limit pro aminokyseliny s 4-(dimethylamino)azobenzen-4-sulfonylchloridem

je asi 1 pmol. Spolehlivě se

může kvantitativně analyzovat již množství 2 pmol až

5 pmol a pro každou analýzu je třeba pouze 10 ng až 30 ng

hydrolyzovaného DABS-derivátu bílkoviny.


9-FLUORENYLMETHYL-CHLORFORMIÁTEM

Používá se předkolonová derivatizace aminokyselin 9-fluorenylmethyl-chlorformiátem

(FMOC-Cl) a následné dělení

HPLC s obrácenými fázemi s fluorimetrickou detekcí.

9-Fluorenylmethyl-chlorformiát reaguje s primárními a sekundárními

aminokyselinami za vzniku vysoce fluorescenčních

produktů. Reakce se provádí v mírných podmínkách

ve vodných roztocích a je dokončena za 30 s. Deriváty jsou

stabilní, pouze derivát histidinu se částečně rozkládá.

I když samotný FMOC-Cl vykazuje fluorescenci, nadbytek

zkoumadla a fluoreskující vedlejší produkty mohou být odstraněny

beze ztrát FMOC derivátů aminokyselin.

FMOC-aminokyseliny se oddělují HPLC s obrácenými fázemi

za použití oktadecylsilylované kolony. Dělení se provádí

gradientovou elucí, lineární změnou složení směsi objemových

dílů acetonitrilu, methanolu a tlumivého roztoku

acetátového (10 + 40 + 50) na směs objemových dílů acetonitrilu

a tlumivého roztoku acetátového (50 + 50). Dvacet

derivátů aminokyselin se rozdělí během 20 min. Každý derivát

eluovaný z kolony se monitoruje fluorimetrickým detektorem

při excitační vlnové délce 260 nm a emisní vlnové

délce při 313 nm.

Detekční limit je v nízkém femtomolovém rozsahu. Odezva

je pro většinu aminokyselin lineární v rozmezí 0,1 µmol až

50 µmol.


7-FLUOR-4-NITROBENZO-2-OXA-1,3-DIAZOLEM

Používá se předkolonová derivatizace aminokyselin 7-fluor-

-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolem (NBD-F) a následné dělení

HPLC s obrácenými fázemi s fluorimetrickou detekcí.

NBD-F reaguje s primárními a sekundárními aminokyselinami

za vzniku vysoce fluorescenčních produktů. Aminokyseliny

se derivatizují s NBD-F zahřátím 5 min na 60 °C.

Deriváty aminokyselin 7-fluor-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolem

(NBD-deriváty) se dělí na oktadecylsilylované

HPLC koloně s použitím gradientového elučního systému

obsahujícího směs acetonitrilu a vodného tlumivého roztoku.

Během 35 min se rozdělí sedmnáct derivátů aminokyselin.

Jako vnitřní standard se může použít kyselina ε-aminohexanová,

protože se eluuje v prázdné oblasti chromatogramu.

Každý derivát eluovaný z kolony se monitoruje fluorimetrickým

detektorem při excitační vlnové délce 480 nm

a emisní vlnové délce při 530 nm.

Citlivost této metody je téměř shodná s citlivostí metody

předkolonové derivatizace s ftalaldehydem (Metoda 5)

s výjimkou prolinu, který s ftalaldehydem nereaguje. To

může být výhoda této metody proti metodě s ftalaldehydem.

Detekční limit pro každou aminokyselinu je asi

10 fmol. Analýza profilu se může provést s 1,5 mg hydrolyzované

bílkoviny v předkolonové reakční směsi.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 195


VÝPOČET DAT A ANALÝZA

Při stanovení obsahu aminokyseliny v hydrolyzátu bílkoviny/peptidu

se musí vzít v úvahu, že tryptofan a cystein se

při kyselé hydrolýze rozkládají. Serin a threonin se kyselou

hydrolýzou částečně rozkládají, zatímco peptidové vazby

zbytků isoleucinu a valinu se mohou rozštěpit pouze částečně.

Methionin se může během kyselé hydrolýzy oxidovat

a některé aminokyseliny (např. glycin a serin) jsou běžné

kontaminanty. Při použití přiměřeného vakua (méně než

200 µm rtuťového sloupce nebo 26,7 Pa) nebo při zavedení

inertního plynu (argon) do horního prostoru reakční nádoby

během hydrolýzy v plynné fázi, je možné omezit stupeň

oxidačního rozkladu. Proto výsledky kvantitativního stanovení

cysteinu, tryptofanu, threoninu, isoleucinu, valinu, methioninu,

glycinu a serinu mohou po hydrolýze bílkoviny/peptidu

kolísat, což může vyžadovat další sledování

a posouzení.

Molové procento aminokyselin. Je to číslo, které udává

počet jednotlivých aminokyselinových zbytků na sto aminokyselinových

zbytků v bílkovině. Tento výsledek se může

použít pro vyhodnocení dat analýzy aminokyselin, když

neznáme molekulovou hmotnost analyzované bílkoviny.

Tato informace se může také použít k potvrzení totožnosti

bílkoviny/peptidu a má i jiná použití. Píky získané při každém

postupu je třeba pečlivě integrovat a identifikovat.

Molové procento se vypočítá pro každou aminokyselinu

přítomnou ve zkoušeném vzorku podle vzorce:

v němž značí:

100× r U

,

r

rU – odezvu píku zkoušené aminokyseliny v nanomolech;

r – součet odezev píků pro všechny aminokyseliny ve

zkoušeném vzorku v nanomolech.

Porovnáním molového procenta zkoušených aminokyselin

s údaji známých proteinů se může určit nebo potvrdit totožnost

vzorku bílkoviny.

Vzorek neznámé bílkoviny. Tato metoda analýzy dat se

může použít k určení koncentrace vzorku neznámé bílkoviny

za použití výsledků analýzy aminokyselin. Vypočítá se

hmotnost každé získané aminokyseliny v mikrogramech

podle vzorce:

m× M r

1000

v němž značí:

m – získané množství zkoušené aminokyseliny v nanomolech;

Mr – průměrnou molekulovou hmotnost dané aminokyseliny

korigovanou na molekulovou hmotnost vody, která

se uvolňuje při tvorbě peptidových vazeb.

Ze součtu hmotností jednotlivých získaných aminokyselin

se stanoví celková hmotnost zkoušené bílkoviny po příslušné

korekci na částečný nebo úplný rozklad aminokyselin.

Jestliže je molekulová hmotnost neznámé bílkoviny dostupná

(např. analýzou SDS-PAGE nebo hmotnostní spektroskopií),

může se aminokyselinové složení neznámé bílkoviny

odhadnout. Počet zbytků každé aminokyseliny se vypočítá

podle vzorce:

,

m

,

æ1000

M ö

ç

÷

è M rt ø

v němž značí:

m – získané množství zkoušené aminokyseliny

v nanomolech;

M – celkovou hmotnost bílkoviny v mikrogramech;

Mrt – molekulovou hmotnost neznámé bílkoviny.

Vzorek známé bílkoviny. Tato metoda analýzy dat se může

použít ke zjištění aminokyselinového složení a ke stanovení

koncentrace bílkoviny u vzorku bílkoviny o známé

molekulové hmotnosti a známém aminokyselinovém složení

s využitím údajů získaných z analýzy aminokyselin.

Jestliže je složení zkoušené bílkoviny známé, může se využít

skutečnost, že některé aminokyseliny se získávají

s dobrým výtěžkem, zatímco výtěžek jiných aminokyselin

může být ovlivněn díky úplnému nebo částečnému rozkladu

(např. tryptofan, cystein, threonin, serin, methionin), neúplnému

štěpení vazby (např. isoleucin a valin) a kontaminaci

volnými aminokyselinami (např. glycinem a serinem).

Protože aminokyseliny, které se získávají s nejvyšší výtěžností,

reprezentují bílkovinu, jsou vybírány pro stanovení

množství bílkoviny. Aminokyseliny s dobrou výtěžností

jsou aspartát-asparagin, glutamát-glutamin, alanin, leucin,

fenylalanin, lysin a arginin. Tento výčet aminokyselin se

může měnit na základě zkušeností s vlastním systémem

analýzy. Obsah bílkoviny v nanomolech se vypočítá vydělením

množství každé aminokyseliny s dobrou výtěžností

očekávaným počtem zbytků této aminokyseliny. Vypočítá

se tak průměrný obsah bílkoviny. Hodnota obsahu bílkoviny

stanovená pro každou z těchto aminokyselin by se měla

pohybovat kolem průměru obsahu. Nepočítá se s hodnotami

obsahu bílkoviny pro ty aminokyseliny, které mají nepřijatelné

odchylky od průměrné hodnoty. Obecně se za

nepřijatelné odchylky považují odchylky větší než 5 % od

průměrné hodnoty. Průměrný obsah bílkoviny se přepočítá

s použitím zbývajících hodnot a získá se hodnota obsahu

bílkoviny ve vzorku. Složení aminokyselin analyzovaného

vzorku se získá, když se hodnota obsahu každé aminokyseliny

vydělí vypočítaným průměrným obsahem bílkoviny.

Vypočítá se relativní chyba složení v procentech podle

vzorce:

100×m

,

m S

v němž značí:

m – experimentálně stanovené množství zkoušené aminokyseliny,

v nanomolech na zbytek aminokyseliny;

mS – hodnotu známého zbytku této aminokyseliny.

Průměrná relativní chyba složení je průměr absolutních

hodnot relativních chyb ve složení jednotlivých aminokyselin,

obvykle s vyloučením tryptofanu a cysteinu. Průměrná

relativní chyba složení může poskytovat důležité informace

o stabilitě analýzy v průběhu času. Shoda ve složení

aminokyselin mezi výsledkem analýzy vzorku bílkoviny

a známým složením se může použít k potvrzení totožnosti

a čistoty bílkoviny ve vzorku.

196 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.57 ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM


S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM

6.0:20257

OBECNÝ PRINCIP

Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem

(ICP-AES) je metoda atomové emisní spektrometrie,

která využívá jako excitační zdroj indukčně vázané

plazma (ICP).

ICP je vysoce ionizovaný inertní plyn (většinou argon) se

stejným počtem elektronů a iontů udržovaných radiofrekvenčním

(RF) polem. Vysokou teplotou dosaženou v plazmatu

jsou atomy vzorku postupně desolvatovány, odpařovány,

excitovány [detekce atomovou emisní spektrometrií

(AES)] a ionizovány [detekce hmotnostní spektrometrií

(MS)]. Detekční limity jsou obecně v rozsahu nanogramů

(ICP-MS) až mikrogramů (ICP-AES) v litru.

Plazma se utváří tangenciálním proudem plazmového plynu

procházejícího hlavicí, tj. systémem složeným ze tří soustředných

křemenných trubic. Kovová cívka (indukční cívka)

je nasazena na horní konec hlavice a je připojena k radiofrekvenčnímu

generátoru. Cívkou se přivádí energie

(obvykle 700 W až 1500 W) a vytváří se oscilující magnetické

pole odpovídající frekvenci generátoru (ve většině případů

27 MHz, 40 MHz). Když se plazmový plyn stane vodivým

po jeho vystavení elektrickému výboji, který vytváří

zárodečné elektrony a ionty, vzniká plazma. V indukovaném

magnetickém poli jsou nabité částice (elektrony

a ionty) nuceny pohybovat se po uzavřené prstencové dráze.

Protože se při svém pohybu setkávají s odporem, dochází

k zahřívání, které vyvolá dodatečnou ionizaci. Tento

proces probíhá prakticky okamžitě a plazma tak expanduje

do své plné síly a rozměrů. Radiofrekvenční oscilace ze

zdroje v cívce vyvolává radiofrekvenční elektrické a magnetické

pole lokalizované v oblasti vrcholu hlavice. Při působení

jiskry (pocházející z Teslova generátoru nebo nějakého

jiného zárodečného zařízení) na plazmový plyn proudící

hlavicí jsou některé elektrony vytrženy z atomů plazmového

plynu. Tyto elektrony jsou potom zachycovány

a urychlovány magnetickým polem. Dodání energie elektronům

cívkou je známé jako indukční vazba. Tyto vysokoenergetické

elektrony se srážejí s jinými atomy plazmového

plynu a odtrhují stále více elektronů. Srážková ionizace

plazmového plynu pokračuje v řetězové reakci a přeměňuje

plyn ve fyzikální plazma skládající se z atomů, elektronů

a iontů plazmového plynu. Plazma se pak udržuje uvnitř

hlavice a indukční cívky a jako radiofrekvenční energie se

plynule přivádí pomocí indukční vazby.

ICP je intenzivní, velmi zářivé plazma oválného tvaru. U základny

je plazmový prstenec a tato část se označuje jako indukční

oblast (IR), tj. oblast, ve které dochází k přenosu indukční

energie z indukční cívky do středu plazmatu. Vzorek

se zavádí indukční oblastí do středu plazmatu.

PŘÍSTROJ

Přístroj se obvykle skládá z následujících částí:

– systému zavádění vzorku, který se skládá z peristaltického

čerpadla dodávajícího roztok konstantní průtokovou

rychlostí do rozprašovače;

– radiofrekvenčního (RF) generátoru;

– plazmové hlavice;

– přenosové optiky zaostřující obraz plazmatu na vstupní

štěrbinu spektrometru; radiální zobrazení je lepší pro složité

matrice (alkalické látky, organické látky), zatímco

axiální zobrazení poskytuje více intenzity a lepší detekční

limity v jednoduchých matricích;

– disperzních zařízení skládajících se z difrakčních mřížek,

hranolů, filtrů nebo interferometrů;

– detektorů převádějících zářivou energii na energii elektrickou;

– zařízení pro zpracování údajů.

INTERFERENCE

Interference je cokoliv, co způsobí, že signál stanovované látky

ve vzorku se liší od signálu pro stejnou koncentraci stanovované

látky v kalibračním roztoku. Velmi známá chemická

interference, se kterou se setkáváme v plamenové atomové absorpční

spektrometrii, je obvykle slabá v ICP-AES. V ojedinělých

případech, kdy se interference vyskytuje, může být pro její

odstranění třeba zvýšit příkon RF energie nebo snížit průtok

vnitřního nosného plynu. Interference v ICP-AES může být

spektrálního původu, nebo důsledek vysoké koncentrace určitých

prvků nebo složek matrice. Fyzikální interference (vyvolaná

rozdíly ve viskozitě a v povrchovém napětí vzorku

a kalibračních standardů) se může minimalizovat zředěním

vzorku, úpravou matrice, použitím vnitřních standardů nebo

použitím metody standardních přídavků.

Jiný typ interference, příležitostně se vyskytující v ICP-AES,

je takzvaný „jev snadno ionizovatelných prvků (EIE)“. Jsou

to ty prvky, které se ionizují mnohem snadněji, např. alkalické

kovy a kovy alkalických zemin. Ve vzorcích, které obsahují

vysoké koncentrace EIE (více než 0,1 %), je pravděpodobné,

že dojde k poklesu nebo zvýšení emisních signálů.

Spektrální interference. Může být vyvolána jinými čarami

nebo posuny intenzity pozadí. Tyto čáry mohou odpovídat

argonu (jsou pozorovány nad 300 nm), OH pásům v důsledku

rozkladu vody (při asi 300 nm), NO pásům vyvolaným

interakcí plazmatu se vzduchem z prostředí (mezi

200 nm a 300 nm) a jiným prvkům ve vzorku, především

těm, které jsou přítomné ve vysokých koncentracích. Interference

je možno zařadit do čtyř různých kategorií: jednoduchý

posun pozadí, stoupající posun pozadí, přímý spektrální

překryv a komplexní posun pozadí.

Absorpční interference. Vzniká, jestliže je část emise ze

stanovované látky absorbována dříve, než dosáhne detektoru.

Tento jev se zvláště pozoruje, jestliže koncentrace silně

emitujícího prvku je tak vysoká, že atomy nebo ionty tohoto

prvku, které jsou v nižším energetickém stavu přechodu

absorbují významné množství záření emitovaného příslušnými

excitovanými částicemi. Tento jev, známý jako samoabsorpce,

určuje horní konec lineárního pracovního rozsahu

pro danou emisní čáru.

Vícesložkové spektrální proložení. K odstranění problémů

se spektrálními interferencemi se běžně používá stanovení

při větším počtu emisních čar. Lepší a přesnější metodou

pro provádění korekcí spektrální interference je využití

informací získaných moderním detektorovým systémem za

použití vícesložkového spektrálního proložení. Tento způsob

vyhodnocuje nejen interference, ale také podíl pozadí

z matrice, a vytváří vzorec pro korekci emise. Vícesložkové

spektrální proložení využívá model vícenásobné lineární

regrese založený na analýze čisté stanovované látky, matri-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 197

2.2.58 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM

ce a kontrolního roztoku a vytváří matematický model korigovaný

na interference. Tento způsob umožňuje stanovení

emise stanovované látky ve složené matrici se zlepšeným

detekčním limitem a přesností.

POSTUP

PŘÍPRAVA A ZAVEDENÍ VZORKU

Základním cílem přípravy vzorku je pomocí zředění nebo

předkoncentrace zajistit, aby koncentrace stanovované látky

ležela v rozmezí pracovního rozsahu přístroje a zajistit,

aby roztok obsahující vzorek mohl být rozprašován reprodukovatelným

způsobem.

Mnohé systémy zavádění vzorků tolerují vysoké koncentrace

kyselin, ale použití kyseliny sírové a fosforečné může

přispět ke zvýšení emisního pozadí pozorovaného v ICP

spektru. Proto se upřednostňuje kyselina dusičná a kyselina

chlorovodíková. Dostupnost zaváděcích systémů a hlavic

odolných vůči kyselině fluorovodíkové (např. z perfluoralkoxy-polymeru)

umožňuje také použít kyselinu fluorovodíkovou.

Při volbě způsobu zavádění vzorků je třeba brát

v úvahu požadavek na citlivost, stabilitu, rychlost, velikost

vzorku, odolnost vůči korozi a ucpání. Pro splnění většiny

požadavků je vhodné použít křížový průtokový rozprašovač

společně se sprejovou komorou a hlavicí. Peristaltická čerpadla

používaná v ICP-AES obvykle zavádějí roztoky standardu

a vzorků rychlostí 1 ml/min nebo nižší.

V případě použití organických rozpouštědel se musí pro

zamezení usazování vrstev z organických látek přidávat

kyslík.

VOLBA PRACOVNÍCH PODMÍNEK

Je třeba dodržovat standardní pracovní podmínky předepsané

výrobcem. Obvykle se používají rozdílné pracovní

podmínky pro vodné roztoky a pro organická rozpouštědla.

Musí se správně zvolit vhodné pracovní parametry:

– výběr vlnové délky;

– průtokové rychlosti plazmového plynu (vnější, střední

a vnitřní trubice hlavice);

– příkon RF;

– uspořádání (radiální nebo axiální poloha);

– rychlost čerpadla;

– parametry detektoru (zesílení/napětí pro fotonásobičové

detektory, jiné pro plošné detektory);

– integrační čas (doba odečítání intenzity emise při každé

vlnové délce).

KONTROLA FUNKČNOSTI PŘÍSTROJE

Test způsobilosti

S víceprvkovým kontrolním roztokem se musí provést následující

zkoušky, aby se zajistila správná funkce ICP-AES

systému:

– přenos energie (generátor, hlavice, plazma); může se

použít měření poměru Mg II (280,270 nm)/Mg I

(285,213 nm);

– přenos vzorku ověřením účinnosti a stability rozprašovače;

– rozlišení (optický systém) měřením šířky píku v poloviční

výšce, např. As (189,042 nm), Mn (257,610 nm),

Cu (324,754 nm) nebo Ba (455,403 nm);

– analytické ověření výpočtem detekčních limitů vybraných

prvků v celém rozsahu vlnových délek.

VALIDACE METODY


ověřuje v pravidelných časových intervalech.

LINEARITA





nejmenších čtverců ze všech naměřených údajů kalibrační

zkoušky. Vynese se regresní křivka, průměry, naměřené

údaje a interval spolehlivosti kalibrační křivky.

Pracovní postup je platný, jestliže:





nejnižší a pro nejvyšší kalibrační hodnotu.

Je-li poměr stanovené směrodatné odchylky nejnižší a nejvyšší

kalibrační hodnoty mimo rozmezí 0,5 až 2,0, může se

získat přesnější odhad kalibrační křivky pomocí vážené lineární





PŘESNOST

Přesnost se přednostně ověřuje za použití certifikovaných




90 % až 110 %. Zkouška není platná, jestliže výtěžnost

např. pro stanovení stopového prvku, je mimo rozmezí

80 % až 120 % teoretické hodnoty. Výtěžnost se může určit

pomocí vhodného porovnávacího roztoku (roztoku matrice),

ke kterému se přidá známé množství stanovované látky

(koncentrační rozmezí odpovídá stanovovaným vzorkům).

OPAKOVATELNOST



MEZ STANOVITELNOSTI




S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM

6.0:20258

Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem

(ICP-MS) je metoda hmotnostní spektrometrie, která využívá

indukčně vázané plazma jako ionizační zdroj. Základní

principy tvorby ICP jsou popsány v obecné stati 2.2.57

Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným

plazmatem (ICP-AES).

ICP-MS využívá schopnosti ICP generovat nabité ionty

z prvků ve vzorku. Tyto ionty jsou pak směrovány do

hmotnostního spektrometru, který je rozděluje podle jejich

198 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.58 HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM

poměru hmotnosti a náboje (m/z). Většina hmotnostních

spektrometrů má kvadrupólový systém nebo magnetický

analyzátor. Ionty jsou z plazmatu vedeny dvěma kužely

(vzorkovací a sběrný kužel) tvořícími mezičlánek k iontové

optice. Iontová optika sestává z elektrostatických čoček,

které vnášejí ionty z oblasti atmosférického tlaku do hmotnostního

filtru při vakuu 10 –8 Pa nebo nižším, který je vybaven

turbomolekulárním čerpadlem. Po jejich filtraci jsou

ionty s vybraným poměrem hmotnost/náboj nasměrovány

do detektoru (kanálový elektronásobič, Faradayova čepička,

dynody), kde je proud iontů převeden na elektrické signály.

Prvek se kvantifikuje podle počtu dopadajících iontů

generujících elektrické impulzy za časovou jednotku.

Systém zavádění vzorků a techniky zpracování dat v metodě

ICP-MS jsou analogické jako v metodě ICP-AES.

PŘÍSTROJ

Přístroj se v podstatě sestává z následujících částí:

– systému zavádění vzorku, který se skládá z peristaltického

čerpadla dopravujícího roztok konstantní průtokovou

rychlostí do rozprašovače;

– radiofrekvenčního (RF) generátoru;

– plazmové hlavice;

– mezičlánku zahrnujícího kužely pro transport iontů k iontové

optice;

– hmotnostního spektrometru;

– detektoru;

– zařízení pro zpracování údajů.

INTERFERENCE

Hmotnostní interference je hlavním problémem způsobeným

např. částicemi o stejné hmotnosti (izobarické částice),

které významně překrývají hmotnostní signál sledovaných

iontů, zvláště uprostřed hmotnostního rozsahu (např. 40 až

80 hmotnostních jednotek). Kombinace atomárních iontů

vede k polyatomovým nebo molekulárním interferencím

(tj. 40 Ar 16 O s 56 Fe nebo 40 Ar 40 Ar s 80 Se). U některých stanovovaných

látek se také může vyskytovat matricová interference.

Některé vzorky mají vliv na tvorbu kapek nebo na

ionizační teplotu v plazmatu. Tyto jevy mohou vést k potlačení

signálu stanovované látky. Fyzikální interferenci je

možné se vyhnout za použití metody vnitřní standardizace

nebo metody standardního přídavku. Prvek použitý jako

vnitřní standard závisí na stanovovaném prvku; jako vnitřní

standardy se mohou použít např. 59 Co a 115 In.

Hlavní charakteristikou přístroje pro ICP-MS je jeho

rozlišovací schopnost, tj. účinnost oddělení dvou málo se

lišících hmotností. Z tohoto hlediska jsou kvadrupólové

přístroje horší než spektrometry s magnetickým analyzátorem.

POSTUP

PŘÍPRAVA A ZAVEDENÍ VZORKU

Příprava vzorku zpravidla zahrnuje krok rozkladu matrice

vhodnou metodou, např. za použití mikrovlnné trouby.

Kromě toho je základním cílem přípravy vzorku, zajistit

pomocí zředění nebo předkoncentrace, aby koncentrace

stanovované látky ležela v rozmezí pracovního rozsahu přístroje

a zajistit, aby roztok obsahující vzorek mohl být rozprašován

reprodukovatelným způsobem.

Mnohé systémy zavádění vzorků tolerují vysoké koncentrace

kyselin, ale použití kyseliny sírové a fosforečné může

přispět ke zvýšení emisního pozadí. Proto se upřednostňuje

kyselina dusičná a kyselina chlorovodíková. Dostupnost

zaváděcích systémů a hlavic odolných vůči kyselině fluorovodíkové

(např. z perfluoralkoxy-polymer) umožňuje také

použít kyselinu fluorovodíkovou. Při volbě způsobu zavádění

vzorku je třeba brát v úvahu požadavek na citlivost,

stabilitu, rychlost, velikost vzorku, odolnost vůči korozi

a ucpání. Pro splnění většiny požadavků je vhodné použít

křížový (cross-flow) rozprašovač společně se sprejovou

komorou a hlavicí. Peristaltická čerpadla obvykle zavádějí

roztoky standardu a vzorků rychlostí mezi 20 µl/min

a 1000 µl/min.

V případě použití organických rozpouštědel se musí pro

zamezení usazování organických vrstev přidávat kyslík.

VOLBA PRACOVNÍCH PODMÍNEK

Je třeba dodržovat standardní pracovní podmínky předepsané

výrobcem. Obvykle se používají rozdílné pracovní

podmínky pro vodné roztoky a pro organická rozpouštědla.

Musí se správně zvolit vhodné pracovní parametry:

– výběr kuželů (materiál vzorkovacího a sběrného);

– průtokové rychlosti plazmového plynu (vnější, střední

a vnitřní trubice hlavice);

– příkon RF;

– rychlost čerpadla;

– výběr jednoho izotopu nebo více izotopů měřeného prvku

(hmotnost).

VÝBĚR IZOTOPU

Výběr izotopu se provádí za použití několika kritérií. Pro

získání maximální citlivosti se vybírá izotop, který je v největším

nadbytku. Dále by se měl vybrat izotop s nejmenší

interferencí s jinými prvky v matrici vzorku a s nosným

plynem. Informace o izobarických interferencích a interferencích

polyatomických iontů různých druhů, např. hydridů,

oxidů, chloridů atd., jsou obvykle dostupné v software

výrobců přístrojů pro ICP-MS.

KONTROLA FUNKČNOSTI PŘÍSTROJE

Test způsobilosti

– Ladění přístroje umožňuje sledování a nastavení měření

před začátkem analýzy vzorků. Správnost určené hmotnosti

pomocí ICP-MS se kontroluje nastavovacím roztokem

obsahujícím několik izotopů pokrývajících celý rozsah

hmotností, např. 9 Be, 59 Co, 89 Y, 115 In, 140 Ce a 209 Bi.

– Zaznamená se citlivost a krátkodobá a dlouhodobá stabilita.

Parametry přístroje (parametry plazmatu, iontové optiky

a kvadrupólu) se musí optimalizovat, aby se získal co

nejvyšší počet dopadů.

– Nastaví se takové rozlišení a osa hmotnosti pomocí roztoku

Li, Y a Tl, aby se zajistila odpovídající odezva v širokém

rozsahu hmotností.

– Vyhodnotí se schopnost plazmatu rozkládat oxidy, aby se

minimalizovaly tyto interference. Poměr Ce/CeO a/nebo

Ba/BaO je dobrý indikátor a požaduje se, aby byl tento

poměr menší než asi 3 %.

– Redukce tvorby dvojnásobně nabitých iontů se provádí

za pomoci Ba a Ce. Poměr signálu dvojnásobně nabitých

iontů ke sledovanému prvku má být menší než 2 %.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 199

2.2.59 ANALÝZA GLYKANŮ V GLYKOPROTEINECH

– Dlouhodobá stabilita se kontroluje změřením standardu

na počátku a na konci měření vzorku, kontrolu, zda usazeniny

solí na kuželech neredukovaly signál během měření.

VALIDACE METODY



LINEARITA





nejmenších čtverců ze všech naměřených údajů kalibrační

zkoušky. Vynese se regresní křivka, průměry, naměřené

údaje a interval spolehlivosti kalibrační křivky. Pracovní

postup je platný, jestliže:





nejnižší a pro nejvyšší kalibrační hodnotu.

Je-li poměr určené směrodatné odchylky nejnižší a nejvyšší

kalibrační hodnoty mimo rozmezí 0,5 až 2,0, může se získat

přesnější odhad kalibrační křivky za použití vážené lineární





PŘESNOST

Přesnost se přednostně ověřuje za použití certifikovaných




90 % až 110 %. Zkouška není platná, jestliže výtěžnost

stanovení stopového prvku je mimo rozmezí 80 % až

120 % teoretické hodnoty. Výtěžnost se může určit pomocí

vhodného porovnávacího roztoku matrice, ke kterému se

přidá známé množství stanovované látky (koncentrace

uprostřed kalibračního rozmezí).

OPAKOVATELNOST



MEZ STANOVITELNOSTI



2.2.59 ANALÝZA GLYKANŮ

V GLYKOPROTEINECH

7.0:20259

1 ÚVOD

Analýza glykanů slouží k analýze glykanových podílů glykoproteinů.

Může zahrnovat:

– úplnou analýzu glykoproteinu;

– separaci a detekci různých glykoforem bílkoviny;

– analýzu glykopeptidů získaných po enzymatickém štěpení

glykoproteinu;

– analýzu glykanů uvolněných po chemickém nebo enzymatickém

štěpení glykoproteinu.

Informace získané analýzou glykanů se mohou doplnit analýzou

monosacharidů.

Glykosylace může být rozhodující pro funkční, farmakokinetické,

farmakodynamické, stabilitní a imunogenní vlastnosti

léčivých přípravků biologického původu. Glykosylace,

na rozdíl od transkripce, je enzymatický proces úpravy,

který není určen matricí DNA a jeho výsledkem je heterogenita

glykanů. Na heterogenitu glykanů může mít také vliv

výrobní postup. Analýza glykanů v glykoproteinech může

být tedy důležitá pro identifikaci variací v glykosylaci glykoproteinu

a/nebo pro sledování shodnosti v glykosylačním

profilu během produkce.

Analýza glykanů může být porovnávacím postupem, protože

získané informace porovnáním s podobně upravenou

referenční látkou umožňují potvrdit shodnost produktu.

Tato stať stanoví přístupy použité v glykanové analýze glykoproteinů

a požadavky na použití metod a jejich validaci.

Analýza glykanů není samostatná obecná metoda, ale zahrnuje

použití specifických postupů a vývoj specifických glykanových

map pro každý jednotlivý glykoprotein. Specifické

postupy jsou proto uvedeny v příslušných specifických

lékopisných článcích.

1-1 GLYKOSYLACE BÍLKOVIN

Existují tři hlavní druhy enzymatické glykosylace bílkovin:

– N-glykosylace zahrnující navázání oligosacharidů na dusík

koncové amidoskupiny asparaginu;

– O-glykosylace zahrnující navázání oligosacharidů na

hydroxylové skupiny serinu, threoninu, a/nebo hydroxyprolinu;

– C-glykosylace zahrnující navázání α-mannopyranosy na

C-2 uhlík indolového kruhu tryptofanu.

Neenzymatické adice, také známé jako glykace, se mohou vyskytnout,

pokud se bílkoviny inkubují s redukujícími cukry.

Tato stať popisuje analytické metody pro N- a O-glykosylace,

které se obvykle nejvíce nacházejí v glykoproteinových

léčivých přípravcích.

1-2 HETEROGENITA GLYKOSYLACE BÍLKOVIN

Rozdílné stupně heterogenity glykanu se mohou objevit během

výroby glykoproteinů. Tato nestejnorodost může vyplývat

z odchylek ve:

– stupni navázání (plném, částečném, nenavázaném);

– druhu glykosylace (N- nebo O-glykosylace);

– struktuře oligosacharidů (prodloužení, větvení a vazby).

Z heterogenity glykosylace vyplývá přítomnost skupiny

glykoforem pro jeden specifický glykoprotein. Tyto variace

vznikají, protože na rozdíl od transkripce a translace je glykosylace

posttranslační modifikací, která není určena matricí

DNA. Glykosylační profil daného místa závisí na

mnoha faktorech, které zahrnují faktory buněčně specifické

a/nebo růstově závislou dostupnost glykosyltransferas

a exoglykosidas Golgiho aparátu a endoplazmatického retikula.

Glykosylaci bílkovin také ovlivňuje struktura bílkovi-

200 ČL 2017 – Dopl. 2020


ny, postup výroby, hostitelsko-vektorový značkovací systém

a podmínky buněčné kultury.

2 POSTUPY ANALÝZY GLYKANŮ

Heterogenita glykosylace se může hodnotit čtyřmi odlišnými

a doplňkovými způsoby:

– analýzou intaktního glykoproteinu;

– analýzou glykopeptidů;

– analýzou uvolněných glykanů;

– analýzou monosacharidů.

Tato stať stanoví metody a obecné požadavky použité pro

analýzu glykanů v glykoproteinech obsahujících N- a O-

vázané glykany.

Analýza glykanů je obvykle několikastupňový proces, při

kterém se může použít mnoho metod. Tato mnohotvárnost je

v souladu s různorodostí a složitostí struktur glykanů, dostupností

technologií a detekčních systémů a širokým rozsahem

přístupů v závislosti na úrovni požadované informace.

Obrázek 2.2.59-1 poskytuje přehled analytických postupů

analýzy glykanů, které se mohou použít pro zvolený přístup/přístupy.

V závislosti na strukturách a původu glykanů

je použitelné mnoho variací stejných metod a podmínek.

Izolace a purifikace. Izolace a purifikace jsou nezbytné

pro analýzu nerozplněných léčivých látek nebo lékových

forem obsahujících interferující pomocné látky, a pokud se

požadují, jsou uvedeny v příslušném lékopisném článku.

2-1 ANALÝZA INTAKTNÍHO GLYKOPROTEINU

Analýza intaktního glykoproteinu poskytuje informaci

o celkovém obrazu glykosylace glykoproteinu.

Pokud je molekula velká a obsahuje mnoho glykosylovaných

míst, poskytuje tento přístup omezenou informaci.

Mohou se použít metody jako kapilární elektroforéza (CE)

(2.2.47) a hmotnostní spektrometrie (MS) (2.2.43). Metody

založené na velikosti, jako jsou vylučovací chromatografie

(2.2.30) a gelová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

s natrium-dodecyl-sulfátem (SDS-PAGE) (2.2.31), mohou

poskytnout informace o stavu glykosylace bílkoviny. Pokud

stupeň sialylace významně přispívá k biologické účinnosti

glykoproteinu, může se použít iontoměničová chromatografie

(2.2.46), izoelektrická fokusace (IEF) (2.2.54) nebo kapilární

elektroforéza (CE) (2.2.47). Metody se musí vybrat

vzhledem k jejich schopnosti poskytnout spolehlivé vzájemné

vztahy mezi stupněm sialylace a biologickou účinností

přípravku.

2-2 ANALÝZA GLYKOPEPTIDŮ

Analýza glykopeptidů poskytuje informace o glykosylačních

vlastnostech specifických míst, stupni obsazení a struktuře oligosacharidů.

To vyžaduje proteolytické štěpení glykoproteinu.

Přístupy ke specifických místům štěpení ve struktuře bílkoviny

jsou uvedeny v obecné stati 2.2.55 Mapování peptidů.

Po proteolýze glykoproteinu se mohou vybrat následující

postupy.

Přímá analýza hmotnostním spektrometrem (2.2.43). Měla

by se použít, jestliže signál glykopeptidu není potlačen přítomností

jiných peptidů, kde glykopeptidy představují minoritní

podíl směsi celkových peptidů a kde intenzity signálů

jsou nižší než intenzity signálů neglykosylovaných peptidů.

Rozdělení před analýzou hmotnostním spektrometrem. Tímto

dodatečným krokem se překonají výše uvedené problémy.

Metody obohacení nebo frakcionace se mohou použít

buď současně s přímou analýzou, nebo následně. Vhodnými

separačními metodami jsou kapalinová chromatografie

(LC) (2.2.29) a kapilární elektroforéza CE (2.2.47). Tyto

metody, jsou-li propojeny s hmotnostním spektrometrem,

umožňují on-line měření hmotnostním spektrometrem.

Deglykosylace glykopeptidů. Identifikace různých míst glykosylace

glykoproteinu je možná porovnáním peptidových

map získaných proteolytickým štěpením intaktního glykoproteinu,

který se získá, pokud se glykoprotein předem deglykosyluje

nebo následuje-li proteolytické štěpení. Peptidová

hmotnost poskytuje informaci o místech glykosylace

a vypočítáním hmotnostních rozdílů mezi intaktními glykopeptidy

a deglykosylovanými glykopeptidy se mohou

získat informace o složení a heterogenitě navázaných glykanů.

Postupy deglykosylace bílkovinné struktury jsou

uvedeny v části 2-3-1. Separace se může provést po nebo

před deglykosylací.

2-3 ANALÝZA UVOLNĚNÝCH GLYKANŮ

Analýza uvolněných glykanů je vhodným způsobem k získání

informace o jednotlivých typech glykanů v bílkovině

(bi-, tri- a tetraanténní profil). V tomto stadiu se také může

určit stupeň sialylace. V závislosti na vybrané metodě může

být před detekcí glykanů nutná derivatizace/značkování.

Analýza uvolněných glykanů obvykle zahrnuje izolaci

a purifikaci glykanů z reakční směsi, následovanou značkováním/derivatizací

glykanů, kde je to třeba; glykany mají

pak stanovený profil (frakcionací nebo separací).

2-3-1 Uvolnění glykanů

Výběr použitého postupu pro uvolnění glykanů závisí na

zkoušeném glykoproteinu. Použité štěpicí činidlo se vybere

v závislosti na druhu potřebného štěpení a požadované

úrovni informace. Může se použít enzymatické nebo chemické

štěpení. Tabulka 2.2.59-1 uvádí neúplný seznam enzymatických

štěpicích činidel a jejich specificitu.

Účinnost štěpení obecně závisí na dostupnosti glykanů

v bílkovině, a proto se bílkovina může denaturovat, aby se

maximalizovala expozice glykosylačních míst, pokud však

není třeba rozlišit povrchové a vnořené (skryté uvnitř molekuly)

glykany.

Mohou se použít také chemická štěpicí činidla, např. hydrazin

nebo alkalický tetrahydridoboritan pro β-eliminaci.

2-3-2 Analýza glykanů

Uvolněné glykany se mohou analyzovat nebo se vytvoří jejich

profil chromatografickými, elektroforetickými a hmotnostně

spektrometrickými metodami, obvykle kombinací

těchto metod. Vybrané metody mohou být spojeny vzhledem

k povaze glykanů a úrovni požadovaných informací.

Analýza glykanů poskytuje informace o různých výskytech

glykanů přítomných v bílkovině (s vysokým obsahem mannosy,

hybrid, komplex). Informace o relativních množstvích

rozvětvených struktur se mohou získat analýzou desialylovaných

glykanů.

Může se požadovat separace zahrnující použití kapalinové

chromatografie (2.2.29) a kapilární elektroforézy (2.2.47)

jako mezioperačních metod. Kapalinová chromatografie

(2.2.29) se může předběžně použít s jednotlivými odebranými

frakcemi (obvykle je třeba značkování) nebo se může

přímo spojit s hmotnostní spektrometrií (2.2.43).

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 201


Tab. 2.2.59-1 Příklady enzymatických štěpicích činidel

Činidla

peptid-N 4 -(N-acetyl-β-glukosaminyl)asparaginamidasy

(EC 3.5.1.52)

Uvolnění N-vázaných glykanů

Specificita

hydrolýza N 4 -(acetyl-β-D-glukosaminyl)asparaginového zbytku,

ve kterém glukosaminový zbytek může být dále glykosylován;

to vede k (substituovanému) N-acetyl-β-D-glukosaminylaminu

a peptidu obsahujícímu zbytek aspartátu

– peptid N-glykosidasy F (PNGasa F) uvolňují se N-glykanové řetězce, ale neuvolňují se N-glykanové

řetězce, v nichž je fukosa vázaná (α 1–3 )

– peptid N-glykosidasy A (PNGasa A) uvolňují se N-glykanové řetězce, v nichž je fukosa vázaná (α 1–3 )

mannosyl-glykoprotein-endo-β-N-acetylglukosaminidasa

(EC 3.2.1.96)

– endo-β-N-acetylglukosaminidasa F

(endo F)

– endo-β-N-acetylglukosaminidasa H

(endo H)

glykopeptid α-N-acetylgalaktosaminidasy

(EC 3.2.1.97)*

endohydrolýza N,N′-diacetylchitobiosylové jednotky v glykopeptidech/glykoproteinech

oligomannosového typu mající

strukturu -[Man(GlcNAc)2]Asn

uvolňuje se hybrid a N-laktosaminový komplex oligosacharidů

oligomannosového typu

uvolňuje se hybrid oligosacharidů oligomannosového typu

Uvolnění O-vázaných glykanů

* Tento enzym má, vzhledem ke své vysoké substrátové specificitě, limitované použití.

hydrolýza koncových D-galaktosyl-N-acetyl-α-D-galaktosaminidických

zbytků

2-3-2-1 Analýza neznačkovaných glykanů

Nativní glykany se mohou analyzovat aniontovou iontoměničovou

chromatografií o vysokém pH s pulzní ampérometrickou

detekcí (HPAEC-PAD), porézní grafitovou chromatografií

(PGC) a hmotnostní spektrometrií (2.2.43).

Aniontová iontoměničová chromatografie o vysokém pH

s pulzní ampérometrickou detekcí (HPAEC-PAD) je vysoce

citlivá a může separovat i některá spojení izomerů.

Odezvové faktory různých signálů jsou pro různé struktury

oligosacharidů různé.

Absolutní kvantifikace glykanu není možná, pokud není

v knihovně dostupný referenční oligosacharid. Kvantifikace se

může získat porovnáním s dobře charakterizovaným referenčním

standardem zkoušené látky nebo vztažením plochy píku

každého glykanu k celkové ploše píku všech glykanů v mapě.

Porézní grafitová chromatografie se může také použít k dělení

nativních glykanů, vzhledem k její vysoké selektivitě

ve srovnání s konvenčními nepolárními kolonami. Pro přímou

analýzu glykanů se může použít spojení porézní grafitová

chromatografie-ionizace elektrosprejem-hmotnostní

spektrometrie.

2-3-2-2 Analýza značkovaných glykanů

Značkování glykanů

Způsob derivatizace závisí na metodě použité k detekci

glykanů, UV nebo fluorescenční.

Derivatizace s fluorescenčními značkami je nejběžnější metodou

značkování glykanů na jejich redukujícím konci při

redukční aminaci. Jedna značka se může navázat na každý

jednotlivý mono- a oligosacharid, a tím umožnit stanovení

molárních množství. Tabulka 2.2.59-2 uvádí neúplný seznam

běžně používaných fluorescenčních značkovačů (markerů)

a vhodných analytických metod.

Tab. 2.2.59-2 Příklady fluorescenčních značkovačů (markerů)

a vhodných metod

2-aminobenzamid

2-aminopyridin

Název

kyselina 2-aminobenzoová

2-amino-9(10H)-

akridinon

trinatrium-8-aminopyren-1,3,6-trisulfonát

Zkratka Analytické metody

2-AA

LC (2.2.29),

MS (2.2.43)

2-AB

LC (2.2.29),

MS (2.2.43)

2-AP

LC (2.2.29),

MS (2.2.43)

AMAC

gelová elektroforéza

(2.2.23)

APTS CE (2.2.47)

Může se také použít methylace glykanů, pokud se k detekci

použije pouze hmotnostní spektrometrie (2.2.43). Je založena

na methylaci oligosacharidů.

Analýza značkovaných glykanů

Značkované glykany se mohou analyzovat analytickými

metodami, jako je kapalinová chromatografie (2.2.29), kapilární

elektroforéza (2.2.47) a hmotnostní spektrometrie

(2.2.43).

V závislosti na separačních vlastnostech glykanů, se mohou

glykany profilovat a kvantifikovat některými systémy kapalinové

chromatografie (2.2.29) používajícími vhodné značkování:

kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi

(rozdělení podle hydrofobních vlastností), s normálními fázemi

(rozdělení podle velikosti) a aniontová iontoměničová

kapalinová chromatografie (rozdělení podle náboje).

2-4 ANALÝZA MONOSACHARIDŮ

Analýza monosacharidů poskytuje informaci o složení monosacharidů

v glykoproteinu a provádí se buď kolorimetrickými,

nebo separačními metodami.

202 ČL 2017 – Dopl. 2020


ANALÝZA INTAKTNÍHO GLYKOPROTEINU

MS

IEF

CE

iontoměničová chromatografie

hmotnostní vylučovací chromatografie

SDS-PAGE

Zkušební

metody

2.2

ANALÝZA GLYKOPEPTIDŮ

přímá analýza

GLYKOPROTEIN

proteolýza

separace před přímou analýzou

LC/CE

MS

PŘEDBĚŽNÁ ÚPRAVA

(uvolnění a purifikace),

je-li třeba

deglykosylace

štěpicího produktu

ANALÝZA UVOLNĚNÝCH GLYKANŮ

analýza neznačkovaných glykanů

desialylace

HPAEC-PAD

PGC-MS

MS

uvolněné glykany

O- a/nebo N-vázané

glykany:

enzymy nebo

chemikálie

analýza značkovaných glykanů

značkování

glykanů

použití exoglykosidas

separace

LC/CE

MS

CE

MS

LC

ANALÝZA MONOSACHARIDŮ

kyselá

hydrolýza

značkování

fluoroforem

HPAEC-PAD

PGC-MS

LC

CE

kolorimetrické metody

CE = kapilární elektroforéza

HPAEC-PAD = aniontová iontoměničová chromatografie

o vysoké hodnotě pH s pulzní ampérometrickou detekcí

IEF = izoelektrická fokusace

LC = kapalinová chromatografie

MS = hmotnostní spektrometrie

PGC = porézní grafitová chromatografie

SDS-PAGE = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

s natrium-dodecyl-sulfátem

Obr. 2.2.59-1 Přehled postupů při analýze glykanů

ČL 2017 – Dopl. 2020 203


2-4-1 Kolorimetrické metody

Kolorimetrické metody, které jsou založeny na chemickém

barvení, podávají informace o množství specifických tříd cukrů,

jako jsou kyseliny sialové, neutrální cukry a hexosaminy.

2-4-2 Separační metody

Separační metody podávají kvantitativní informace o celkovém

složení monosacharidů. Tyto metody vyžadují před

analýzou předběžnou úpravu oligosacharidových konců intaktního

glykoproteinu nebo uvolněných glykanů kyselou

hydrolýzou. K izolaci sialových kyselin se používá slabě

kyselá hydrolýza nebo enzymatické štěpení. Hydrolýza je

signifikantním zdrojem variability a může vyžadovat produktově

specifickou validaci.

Metody pro separaci a kvantifikaci monosacharidů zahrnují:

– použití aniontové iontoměničové chromatografie o vysokém

pH s pulzní ampérometrickou detekcí a porézní grafitové

chromatografie s hmotnostní spektrometrií, umožňující

stanovení molárních množství přírodních monosacharidů

(kyseliny sialové, neutrální cukry a polyoly);

– značkování monosacharidů fluoroforem s následujícími

separačními metodami, jako je chromatografie s obrácenými

fázemi, iontoměničová chromatografie nebo kapilární

elektroforéza.

3 HODNOCENÍ A ANALÝZA DAT

Údaje získané analytickými metodami pro analýzu glykanů

se mohou analyzovat a hodnotit třemi různými způsoby:

– porovnáním totožnosti jednotlivých struktur nebo soustav

struktur;

– porovnáním shody zkoušené látky s kvalitativními požadavky;

– porovnáním shody zkoušené látky s kvantitativními požadavky.

Specifická porovnání vztažená k referenčním standardům

a metodě vývoje každé úrovně hodnocení jsou uvedeny

v částech 4 a 5.

3-1 POTVRZENÍ TOTOŽNOSTI JEDNOTLIVÝCH

STRUKTUR NEBO SOUSTAV STRUKTUR

Analytickým cílem metody glykanové analýzy může být

jednotlivý monosacharid (např. kyselina sialová, fukosa),

definovaná struktura oligosacharidu (např. tetrasialylovaný,

tetraanténní glykan) nebo soustava struktur sdílených obecných

analytických úseků (např. tetrasialylované glykany,

trianténní glykany, izoformy glykoproteinu se stejným nábojem).

Potvrzení totožnosti analytického cíle je základním

krokem v analýze a v hodnocení údajů a může se ho zcela

dosáhnout ověřením molekulové struktury nebo porovnáním

s vhodným referenčním standardem.

3-1-1 Absolutní potvrzení totožnosti

Absolutního potvrzení totožnosti glykanových struktur se

běžně dosáhne během vývoje produktu, a proto není nezbytným

cílem běžné analýzy. Totožnost analytického cíle

se určí odkazem na známé vlastnosti molekuly. Taková úplná

identifikace individuálních struktur může vyžadovat vícestupňové

postupy za použití enzymatických a chemických

reakcí, separačních metod a on-line nebo off-line zapojených

detekčních metod; nejčastěji se používá stanovení

poměru náboje ke hmotnosti iontu molekuly určeného za

použití hmotnostního spektrometru jako konečného základu

pro stanovení struktury.

3-1-2 Srovnávací potvrzení totožnosti

Při běžném použití analytické metody se totožnost analytického

cíle může potvrdit porovnáním s postupem nebo testem

způsobilosti referenčních standardů. To se může odvodit ze

známých, dobře charakterizovaných glykoproteinů, které

mohou být ze stejné obecné skupiny jako zkoušená látka

(např. fetuin pro komplex N-glykoproteinů), nebo se může

odvodit od dobře charakterizované šarže zkoušeného produktu,

který byl určen jako referenční standard. Následující úvahy

se týkají srovnávacích převodů strukturních totožností:

– v případě ověřené vysoké reprodukovatelnosti retenčních

časů se pro správný převod mohou použít absolutní retenční

časy;

– alternativně se může glykanový marker nastříknout na začátek

a konec zkoušené sekvence a posoudí se případné

odchylky v retenčních časech; na základě těchto referenčních

chromatogramů lze identifikovat glykany ve

zkoušených přípravcích;

– v případech, kdy standard neumožňuje stanovení všech

glykanových píků ve zkoušeném vzorku, se mohou k monitorování

a označení neidentifikovaných glykanových píků

použít absolutní nebo normalizované retenční časy.

3-2 POTVRZENÍ SHODY ZKOUŠENÉ LÁTKY

S KVALITATIVNÍMI POŽADAVKY

Při této úrovni posouzení se analytické výsledky získané se

zkoušeným produktem posuzují tak, aby se prokázala shoda

se specifikacemi. Typicky se toho dosáhne porovnáním

údajů získaných za souběžného použití referenčního standardu

a zkoušené látky. Při hodnocení údajů je nutné:

– určit, zda analytický výsledek získaný za použití referenčního

standardu je úplně srovnatelný s očekávaným výsledkem,

aby se ověřila způsobilost systému; např. při

mapování glykanů by se toho mohlo dosáhnout porovnáním

se vzorovou mapou referenční látky, získanou během

jejího ustanovení a ověřením shody se všemi stanovenými

kritérii přijatelnosti;

– prokázat podobnost map získaných s referenční látkou

a zkoušenou látkou za použití specifických kritérií shody

uvedených v příslušném lékopisném článku.

3-3 POTVRZENÍ SHODY ZKOUŠENÉ LÁTKY

S KVANTITATIVNÍMI POŽADAVKY

3-3-1 Kvantitativní měření hodnot stanovované látky

a vyjádření výsledků

V některých případech, např. při měření kyseliny sialové

nebo jiných monosacharidů, se údaje mohou vyjádřit tak,

aby se získal molární poměr kyseliny sialové ke glykoproteinu.

Údaje se porovnají s referenčním standardem kyseliny

sialové a s validovanou metodou stanovení bílkoviny.

Může se použít metoda vnitřního nebo vnějšího standardu

(viz 2.2.46 Chromatografické separační metody).

3-3-2 Kvantitativní vyjádření profilu separace

Profily nebo dělení vzorků se může vyjádřit numericky

mnoha způsoby, včetně metody normalizace; obsah každého

analyzovaného cíle v procentech, např. entity glykanu,

se vypočítá určením odezvy entity glykanu jako procenta

z celkové odezvy všech entit, kromě odezvy rozpouštědel

204 ČL 2017 – Dopl. 2020


nebo jakýchkoliv přidaných zkoumadel, které jsou nižší než

limit zanedbatelnosti. Kromě toho se mohou použít numerická

vyjádření, jako je Z-číslo, která jsou specifická pro

danou metodu a produkt, a jsou definována v příslušných


4 REFERENČNÍ STANDARDY

Referenční standardy pro analýzu glykanů mají dvě funkce:

ověření způsobilosti systému (test způsobilosti) a potvrzení,

že zkoušený vzorek vyhovuje specifikovaným požadavkům.

Referenční standardy použité pro test způsobilosti mohou

být:

– referenční látky pro zkoušenou látku;

– glykanové části izolované z plně charakterizovaného referenčního

standardu zkoušené látky;

– dobře charakterizované glykanové části izolované z glykoproteinů

(např. fetuin, IgG);

– glykanové markery charakterizované pro totožnost a čistotu.

Referenčním standardem použitým ve zkoušce pro shodu

glykoproteinu je přípravek zkoušené látky. Zaznamená se,

že postupy analýzy glykanů popsané v příslušných článcích

předepisují použití referenčního standardu pro zkoušenou

látku, pro kterou byl postup analýzy glykanů validován.

5 BODY ZVAŽOVANÉ PŘI VÝVOJI METODY

Tato část uvádí způsoby celkového provedení metody během

vývoje. Rozsah vývoje metody a analytická validace

se vyberou na základě jejich vhodnosti pro daný produkt.

V závislosti na vybraném postupu je třeba analýzu glykanů

provést v několika stupních, např.:

– izolace a purifikace (nebo odsolení) glykoproteinu;

– enzymatické (nebo chemické) štěpení glykoproteinu pro

selektivní uvolnění N- nebo O-vázaných glykanů ze skeletu

bílkoviny;

– izolace a purifikace uvolněných glykanů;

– důkaz uvolněných zbytků kyseliny sialové a monosacharidu;

– značkování uvolněných glykanů chromoforem;

– separace nativních (neznačkovaných) glykanů nebo glykanů

značkovaných fluorescencí;

– identifikace a kvantifikace glykanů (např. určení Z-čísla);

– určení místa obsazení založené na relativních množstvích

glykosylovaných a neglykosylovaných peptidů.

Izolace a purifikace bílkoviny. Izolace a purifikace glykoproteinu

z jeho matrice může být nutná k odstranění všech

interferujících látek (např. pomocné látky, soli) a vyžaduje-

-li se, je specifikována v příslušném lékopisném článku.

Musí se provést reprodukovatelným způsobem, aby se zaručila

kvantitativní výtěžnost bílkoviny.

Uvolnění a izolace oligosacharidů. Vybraný způsob uvolnění

glykanů závisí na zkoušené bílkovině a je založen na

typech glykosylace, tj. N- nebo O-glykosylaci. Neúplné postupy

použitelné k uvolnění glykanů se musí optimalizovat,

aby se zjistil kvantitativní profil všech entit glykanů. Faktory,

které ovlivňují dostatečnost štěpení, jako je poměr koncentrace

enzymu a bílkoviny, teplota, průběh reakce a denaturace

bílkoviny před štěpením, se musí optimalizovat.

Je třeba poznamenat, že enzymatická/chemická reakce nesmí

ovlivnit složení glykanu, např. nesmí štěpit zbytky kyseliny

sialové. Kde je glykosylováno více než jedno místo,

tam by enzymatické štěpení mělo být úměrné uvolnění

všech oligosacharidových částí navázaných na bílkovinu,

nezávisle na jejich struktuře a vlastní poloze v bílkovině.

Musí se potvrdit reprodukovatelnost výtěžků všech glykanových

entit z reakční směsi.

Derivatizace uvolněných glykanů. Derivatizace se obvykle

provádí podle neúplných protokolů.

Proto se musí ověřit reprodukovatelnost derivatizace všech

glykanových entit. Toho se může dosáhnout optimalizací

reakčních podmínek, jako je množství derivatizačního činidla,

reakční teplota a čas. Derivatizační reakce nesmí

změnit složení glykanu, např. nesmí štěpit zbytky kyseliny

sialové.

Separace, identifikace a test způsobilosti. Metody použité

pro analýzu glykanů musí být schopné detekovat a separovat

rozdílné glykanové části, aby se zajistila spolehlivá identifikace

a kvantifikace.

Kritéria přijatelnosti pro způsobilost systému, která zahrnují

také štěpení glykanů, výtěžnost a analýzu, závisí na kritických

parametrech zkoušky ovlivňujících interpretaci výsledků.

Porovnáním glykanové mapy zkoušené látky s glykanovou

mapou referenční látky, které byly získány za stejných podmínek,

je indikátorem hodnocení provedení analytického

postupu. V případě dalších potvrzení získaných výsledků se

mohou analýzy opakovat křížovou metodou. Použití referenčního

standardu (např. referenční látka pro zkoušený

produkt, způsobilost systému glykanového markeru) je základním

ustanovením parametrů testu způsobilosti a validace

analytického postupu.

Reprodukovatelnost kvantitativních vyjádření (např. určení

Z-čísla) profilů glykanu se musí ověřit.

Stanovení obsazení míst založené na relativním množství

glykosylovaných a neglykosylovaných peptidů. Pokud

se obsazení míst stanoví porovnáním glykosylovaných

a neglykosylovaných peptidů z enzymaticky štěpeného

glykoproteinu, musí se prokázat reprodukovatelné štěpení

obou forem peptidu.

6 ROZHODOVACÍ SCHÉMA ANALÝZY GLYKANŮ

Tato část se uvádí pro informaci a netvoří závaznou část lékopisu.

Výběr postupů použitých k analýze glykanů je založen na

míře informací požadovaných k zajištění jakosti glykoproteinu

a nastavuje se během vývoje produktu.

Obrázek 2.2.59-2 poskytuje návod pro výběr metod, které

mají být použity pro analýzu glykanů, pokud je požadována.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 205

2.2.61 CHARAKTERISTIKA KRYSTALICKÝCH PEVNÝCH LÁTEK MIKROKALORIMETRIÍ A ROZPOUŠTĚCÍ ...

ní dlouhého dosahu chybí a zbývají pouze uspořádání

krátkého dosahu dané jeho nejbližšími sousedy. Skutečné

krystaly se vyskytují někde mezi těmito extrémy. Pozice

krystalu na stupnici vymezené těmito dvěma extrémy se

nazývá krystalinita.

Všechny reálné krystaly, dokonce i krystaly v čistém stavu,

mají nějaké nedokonalosti nebo defekty, které zvyšují jak

energii (entalpii za podmínek konstantního atmosférického

tlaku), tak neuspořádanost (vyjádřeno jako entropie) krystalické

mřížky. Krystal s relativně nízkým výskytem nedokonalostí

se nazývá vysoce krystalickým a má vysokou krystalinitu.

Naopak, částice s relativně vysokým výskytem nedokonalostí

se nazývá částečně amorfní a má nízkou krystalinitu.

V ideálním případě, zcela amorfní částici odpovídá

nulová krystalinita. Amorfní částice mohou obsahovat troanalýza

glykanů nutná pro glykoprotein

návrh metod analýzy glykanů

malá bílkovina, omezená

glykosylace a/nebo

jednoduchá struktura

ne

velká molekula, komplex rozvětvených

glykanů a/nebo četná místa glykosylace

ano

analýza intaktního

glykoproteinu (např.

analýza hmotnostním

spektrometrem)

STOP

požaduje se znalost

specifických

míst glykosylace?

ano

analýza specifických

míst glykosylace

stanovení poměru

záporného náboje ke

hmotnosti iontu

molekuly kyseliny

sialové a/nebo stanovení

monosacharidů

ne

ne

požaduje se detailní

analýza glykanů?

ano

proteasové štěpení

a separace glykopeptidů

STOP

STOP

návrh metod pro analýzu štěpených

glykanů (např. anténní profil, identifikace

individuální struktury)

STOP

Obr. 2.2.59-2 Schéma výběru metod, které mají být použity pro analýzu glykanů, pokud je požadována

2.2.61 CHARAKTERISTIKA

KRYSTALICKÝCH PEVNÝCH LÁTEK

MIKROKALORIMETRIÍ

A ROZPOUŠTĚCÍ KALORIMETRIÍ

7.6:20261

Pro účely této stati se krystalický materiál, částečně krystalický

materiál a amorfní materiál považují za pevné látky.

ÚVOD – POJEM KRYSTALINITA

Dokonale uspořádaná krystalová mřížka, ve které každá

molekula zaujímá předpokládanou polohu v krystalové

mřížce, je ideální stav, kterého se vzácně, pokud vůbec,

dosáhne. Dalším extrémem je amorfní stav, v němž pevná

látka sestává z maximálně možných nedokonalostí (defekty

proměnlivých rozměrů) takových, že veškerá uspořádá-

206 ČL 2017 – Dopl. 2020


chu uspořádané oblasti, které mohou sloužit jako centra pro

krystalizaci; takové takzvané amorfní částice mají nízkou,

ale konečnou hodnotu krystalinity.

Schopnost detekovat a kvantifikovat množství amorfního

materiálu ve vysoce krystalické látce je velmi důležitá během

vývoje a později i při výrobě léčivého přípravku.

Ve skutečnosti prášek pravděpodobně obsahuje částice

s různým stupněm krystalinity, právě tak jako může obsahovat

částice různých velikostí a tvarů. Čím nižší je krystalinita

pevné látky, tím vyšší je její entalpie a entropie. Růst

entalpie se ne zcela vyrovnává růstem entropie; proto Gibbsova

volná energie, která odráží rovnováhu mezi nimi, aktuálně

vzrůstá. Tedy, čím nižší je krystalinita materiálu

(prášku), a čím je tedy vyšší jeho amorfní charakter, tím je

vyšší jeho zdánlivá vnitřní rozpustnost a rychlost disoluce,

ale tím nižší je jeho termodynamická stabilita. Pro značnou

důležitost těchto vlastností, je krystalinita důležitá a vyžaduje

také měření vhodnou metodou.

V následující stati se krystalinita nebo obsah amorfních

částí prášku měří kalorimetrickými metodami jako jsou mikrokalorimetrie

nebo rozpouštěcí kalorimetrie, ačkoliv se

mohou použít i jiné metody (například viz 2.9.33 Charakterizace

krystalických a částečně krystalických pevných látek

rentgenovou práškovou difrakcí).

Mnoho látek může krystalizovat ve více než jednom typu

krystalické formy, což je známé jako polymorfie. Pokud je

v mřížce přítomna voda nebo rozpouštědlo, krystaly se nazývají

hydráty nebo solváty. Obvykle vykazují rozdílné fyzikální

vlastnosti z důvodu různého krystalického a/nebo

molekulového uspořádání a různé energie v mřížce. Pro

zjednodušení, zde uvažovaná kalorimetrická měření pro

stanovení stupně krystalinity předpokládají pouze jednu

pevnou krystalickou formu přítomnou ve sledovaném materiálu.

Teorie a experimentální metoda může být snadno

rozšířena na polymorfní systémy s vlastním zřetelem na

rozdíly entalpie mezi polymorfy.

METODA 1 – MIKROKALORIMETRIE (STANOVENÍ

AMORFNÍHO OBSAHU)

Nejvíce chemických, fyzikálních a biologických procesů

je spojeno s výměnou tepla. Mikrokalorimetrie je vysoce

citlivá metoda sloužící k monitorování a ke kvantifikaci

obou změn spojených s takovými procesy, tj. exotermních

(uvolňování tepla) a endotermních (spotřebování

tepla) změn. Metoda umožňuje stanovit rychlost a dosažení

chemických reakcí, fázových přeměn nebo změn

struktury.

Teplotní děje produkující pouze zlomek mikrowattů mohou

být pozorovány za použití mikrokalorimetrie. To

znamená, že musí být detekovatelné změny teplot menší

než 10 –6 K. Mikrokalorimetrie používá princip tepelného

toku (převáděné teplo), kde se teplo uvolněné (nebo spotřebované)

v tepelně definované nádobě odvádí (nebo přivádí)

ve snaze znovu nastavit tepelnou rovnováhu s okolím.

Výjimečné tepelné stability s okolím musí být dosaženo

buď poklesem tepla, nebo elektronickou regulací

okolí.

Tepelná energie ze vzorku v reakční cele je typicky vedena

přes Peltierovy elementy, které pracují jako termoelektrické

generátory využívající Seebeckova jevu. Tepelná energie se

převádí na signál napětí úměrný tepelnému toku.

Výsledky jsou uváděny jako množství tepelné energie

(watt) uvolněné za jednotku času.

PŘÍSTROJ

Mikrokalorimetry jsou typicky navržené jako zdvojené systémy

s měřicí celou a referenční celou. Cely se běžně vyrábějí

ze skla nebo nerezové oceli. Pro určité účely se mohou

použít speciálně navržené cely, které umožňují přidání plynu,

kapaliny nebo pevného materiálu.

KALIBRACE

Obr. 2.2.61–1 Typický záznam mikrokalorimetru prášku

(v μW) v závislosti na čase (v hodinách): amorfní zhroucený

pík (I) a krystalizační pík (II) pro převážně amorfní laktosu

při teplotě 25 °C a 75 % relativní vlhkosti.

Tepelný tok mikrokalorimetru (energie za jednotku času) se

kalibruje za použití kalibrovaného externího nebo interního

elektrického tepelného zdroje nebo vhodné standardní reakce.

CITLIVOST

Citlivost mikrokalorimetrické metody může být určena na

základě vhodného standardního vzorku analyzovaného podle

odpovídající metody společně se stanovením šumu základní

linie přístroje.

POSTUP

Do vhodné nádobky se naváží přiměřené množství zkoušené

látky. Nádobka se pečlivě uzavře, aby se vyloučilo odpařování

rozpouštědel a umístí se do držáku vzorku. Je-li to

vhodné, nádobka se před umístěním do měřicí polohy vytemperuje

na teplotu měření.

Zahájí se analýza a zaznamenává se tepelný tok, na osu

úseček se vynese čas a na osu pořadnic tepelný tok (specifikuje

se, zda se jedná o endotermní nebo o exotermní tepelný

tok).

DETEKCE A KVANTIFIKACE AMORFNÍHO OBSAHU

V PRÁŠCÍCH

Amorfní stav je metastabilní v závislosti na krystalickém

stavu; může se tedy objevit rekrystalizace. Měření rekrystalizačního

tepla umožňuje určit amorfní obsah z plochy

rekrystalizačního píku. Amorfní obsah vzorku je možné

kvantifikovat porovnáním záznamu z mikrokalorimetru pro

vzorek se záznamem pro amorfní standard. Rozsah amorfního

obsahu pokrytého touto metodou závisí na jednotlivé

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 207


zkoušené látce, v příznivých případech může být dosaženo

limitů detekce pod 1 %.

Rekrystalizace může být iniciována vystavením vzorku

vyšší relativní vlhkosti nebo prostředí s organickými výpary.

Vzorek se umístí do ampule, která také může obsahovat

malou zkumavku s nasyceným vodným roztokem soli,

organickým rozpouštědlem, nebo směsí rozpouštědel.

Rekrystalizační teplo se běžně měří za použití fixního

množství vzorku umístěného ve skleněné nebo ocelové nádobce/cele.

Zkumavka obsahující nasycený solný roztok

nebo organické rozpouštědlo by měla být dostatečně dlouhá,

tak aby umožnila plné nasycení prostředí nad vzorkem.

Množství vzorku a druh výparů v prostředí nad vzorkem se

vybere tak, aby se objevila rekrystalizace, při níž se pozoruje

zřetelný pík, který je zřetelně oddělen od píků s počátečními

záznamy teploty způsobenými vložením vzorku.

Podmínky, při kterých nastane přeměna amorfní fáze na

termodynamicky stabilnější krystalický stav, budou mít významný

vliv na dobu rekrystalizace. Zvláště fyzikální směsi

čistě amorfního a čistě krystalického materiálu se chovají

jinak než částečně krystalický materiál. Tyto jevy by měly

být brány v úvahu při vývoji metody.

Typická odezva pro rekrystalizaci převážně amorfního materiálu

je uvedena na obrázku 2.2.61-1. První část křivky zachycuje

několik souběžných procesů, které probíhají nezávisle,

jako je absorpce vodní páry do amorfních částí prášku

a tvorba vodní páry z testovací zkumavky. Po této počáteční

odezvě je velká exotermní odezva způsobená rekrystalizací

amorfního materiálu. Vylučování přebytků vody z rekrystalizujících

částí a jejich kondenzace je rovněž přítomné, ale není

pozorovatelné. Tedy, plocha pod touto exotermní rekrystalizační

odezvou je úměrná rekrystalizačnímu teplu.

METODA 2 – ROZPOUŠTĚCÍ KALORIMETRIE

(STANOVENÍ KRYSTALINITY)

Rozpouštěcí kalorimetrie umožňuje stanovit rozpouštěcí

entalpii roztoku látky (např. rozpouštěcí teplo za konstantního

atmosférického tlaku). Rozpouštěcí entalpie se

definuje jako entalpie látky rozpuštěné na roztok o definované

koncentraci minus entalpie původní látky. Rozpouštědlo

pro disoluci musí být takové, aby se množství

pevné látky rozpustilo v průběhu časového rámce, který

odpovídá časové odezvě kalorimetru, jak je uvedeno dále.

Rozpouštěcí entalpie je úměrná množství pevné látky, která

byla rozpuštěna. Toto množství může být definováno

z kontrolní zkoušky bez přidání pevné látky do rozpouštědla

běžně nezobrazuje rozeznatelné změny ve sklonu křivky

teplota-čas.

Izoperibolické rozpouštěcí kalorimetry mají poměrně rychlou

odezvu, ale musí být provedeny korekce na případnou

ztrátu tepla nebo příjem tepla z lázně, izoperibolické rozpouštěcí

kalorimetry jsou tedy výhodnější než izotermické

rozpouštěcí kalorimetry, jestliže rozpouštění probíhá relativně

rychle. Pro všechna měření rozpouštěcí entalpie, při

kterých se používají izoperibolické rozpouštěcí kalorimetry,

je výběr rozpouštědla kritický. Povaha a množství rozpouštědla

a množství vzorku ovlivňuje celkovou změnu

tepla, odpovídající úplnému rozpuštění pevné látky, kterého

se dosáhne během 5 min za intenzivního míchání při

jako 1 mol pro molární entalpii nebo jako 1 g pro specifickou

entalpii. Pokud má látka odpovídající čistotu (jak

je určeno požadova-ným stupněm přesnosti) a pokud její

molekulová hmotnost je známa, upřednostňuje se použití

molární entalpie, jinak se musí použít specifická entalpie.

Rozpouštěcí entalpie je mírně závislá jak na teplotě, která

je obvykle 25,0 °C, ale i na konečné koncentraci rozpuštěné

látky.

Krystalinita (Pc) látky se obvykle vyjadřuje v procentech.

Tento postup vyžaduje dva referenční standardy, zejména

vzorek o vysoké krystalinitě s předpokladem 100% krystalinity

a s měřenou rozpouštěcí entalpií ( DH c

s

) a amorfní

vzorek s 0% krystalinitou a s měřenou rozpouštěcí entalpii

s

( DH a

). Z těchto hodnot a z entalpie změřené při rozpouštění

látky ( DH s

s

) lze vypočítat krystalinitu látky v procentech

(Pc):

P

c

s s s s

(%)

= 100 ( DH

- DH

)/( DH

- DH

)

s

Krystalinita vyjádřená v procentech zjevně závisí na třech

měřených hodnotách. Naměřené hodnoty rozpouštěcí entalpie

mohou být nahrazeny jinými odpovídajícími fyzikálními

veličinami, které závisí na krystalinitě. Hodnota krystalinity

v procentech ve vzorku tedy závisí nejen pouze na

povaze a metodě přípravy dvou referenčních standardů, ale

také na výběru měřené fyzikální veličiny.

Rozpouštěcí entalpie se měří buď izoperibolickým rozpouštěcím

kalorimetrem s konstantním perimetrem (např. plášťový

kalorimetr), nebo izotermickým rozpouštěcím kalorimetrem

s konstantní teplotou. Obvykle se s každým vzorkem provedou

nejméně tři měření a vypočítá se průměr z těchto hodnot.

Přesné požadavky závisí na schopnostech přístroje a potřebném

stupni přesnosti.

IZOPERIBOLICKÁ ROZPOUŠTĚCÍ KALORIMETRIE

V izoperibolickém rozpouštěcím kalorimetru způsobí změny

tepla během rozpouštění odpovídající změnu teploty

v systému rozpouštědlo-rozpouštěná látka (tj. v roztoku).

Tato změna teploty se měří čidlem teploty, které je připojeno

k elektrickému obvodu tak, aby se zaznamenal elektrický

signál odpovídající změně teploty. Tepelná změna se

v elektronické podobě měří v přesně definovaných časových

intervalech tak, aby se získaly údaje teplota-čas, které

jsou počítačově analyzovány a následně vytištěny. Záznam

konstantní rychlosti otáčení v rozsahu 400 ot/min

až 600 ot/min.

Efektivní tepelná kapacita kalorimetrické cely a jejího obsahu

se stanoví pro každé měření. Toto stanovení se zajistí

elektrickým ohřevem obsahu kalorimetrické cely. Efektivní

tepelná kapacita se stanoví jedním ze dvou způsobů, tj. buď

z jednoho stanovení po rozbití ampule, nebo provedením

jednoho stanovení před rozbitím ampule a druhého stanovení

po rozbití, a následně vypočítáním průměru obou výsledků.

Přesnosti a spolehlivosti elektrického topení se dosáhne

přesností a spolehlivostí výše popsaných chemických

kalibrací.

a

c

a

208 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.63 PŘÍMÁ AMPÉROMETRICKÁ A PULZNÍ ELEKTROCHEMICKÁ DETEKCE

IZOTERMNÍ ROZPOUŠTĚCÍ KALORIMETRIE

V izotermních rozpouštěcích kalorimetrech (za konstantní

teploty) je změna tepla během rozpouštění kompenzována

stejnou, ale opačnou změnou energie, takže teplota soustavy

rozpouštědlo-rozpouštěná látka (tj. roztok) zůstává

v zásadě konstantní. Měří se změna této stejné, ale opačné

energie, a pokud má opačné znaménko, poskytuje rozpouštěcí

entalpii. Izotermní kalorimetry mají poměrně pomalou

odezvu, ale kompenzací se eliminují jevy ztráty tepla nebo

příjmu tepla z lázně. Proto jsou izotermní kalorimetry výhodnější

než izoperibolické, pokud rozpouštění probíhá relativně

pomalu.

KALIBRACE ROZPOUŠTĚCÍHO KALORIMETRU

K dosažení přesnosti kalorimetru, je třeba provést správně

chemickou kalibraci. Pro endotermní rozpouštění se kalibrace

kalorimetru ověřuje měřením tepla spotřebovaného

během rozpouštění chloridu draselného v destilované vodě

při 298,15 K (25,0 °C). Stanovená změna entalpie v tomto

endotermním procesu je 235,5 J/g (17,56 kJ/mol). Pro exotermní

rozpouštění se kalorimetr ověřuje měřením tepla odváděného

během rozpuštění 5 g trometamolu v jednom litru

vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (0,1 mol/l) při

298,15 K (25,0 °C). Stanovené teplo zmíněného procesu je

−246,0 J/g (−29,80 kJ/mol).

ZACHÁZENÍ SE VZORKY

Chemická a fyzikální stabilita pevných látek se může snižovat

se snižující se krystalinitou. Zejména pevné látky

s nízkou krystalinitou, zvláště amorfní látky, mají sklon

k adsorpci vodní páry ze vzduchu, což vede ke krystalizaci

a odpovídající změně výsledného stupně krystalinity.

Pro tyto případy se musí bezvodé vzorky, jejichž krystalinita

byla stanovena, uchovávat při nulové vlhkosti nebo

pod kritickými hodnotami vlhkosti v zabezpečených obalech

obsahujících sušicí látku, a pokud možno i indikátor

její účinnosti. Pokud se provádějí studie závislosti krystalinity

na vlhkosti, vzorek se uchovává v zabezpečeném

obalu obsahujícím nasycený solný roztok poskytující definovanou

relativní vlhkost.

jej mobilní fáze již neobsahuje. Detekce je nejčastěji realizována

oxidací analyzovaných sloučenin. Potenciál měrné

(pracovní) elektrody může sloužit jako parametr selektivity

pro sledovanou sloučeninu. Horní limit rozsahu elektroaktivity

je definován oxidační křivkou mobilní fáze, podpůrným

elektrolytem nebo pracovní elektrodou.

Při přímé ampérometrické detekci se uplatňuje pouze konstantní

potenciál. Proto tato metoda může být doprovázena

adsorpcí uhlíkatých sloučenin, které znečisťují povrch pracovní

elektrody, což může mít vliv na nestabilitu signálu

a pokles odezvy. Tento jev pasivace lze pozorovat zvláště

při detekci cukrů, thiolů a fenolů. Problém znečištění elektrod

může být vyřešen pomocí použití řady pulzů, postupu

obecně známého pod názvem pulzní elektrochemická detekce

(PED).

Nejčastěji používaným způsobem PED je pulzní ampérometrická

detekce (PAD), která zahrnuje třístupňovou řadu

pulzů nebo vln (obrázek 2.2.63-1). Pro obnovení povrchu

pracovní elektrody se k očištění povrchu pracovní elektrody

po detekčním potenciálu (Edet) použije vysoce pozitivní potenciál

(Eoxd) (anodická polarizace) následovaný negativním

potenciálem (Ered) (katodická polarizace). Potom může

být zahájen nový cyklus vln. Po přechodu z potenciálu Ered

na potenciál Edet budou vznikat signály pozadí. Ačkoliv tyto

signály rychle mizí, musí být před správným měřením

signálu zkoušené látky vloženo krátké zpoždění.

Byly vyvinuty i další průběhy vln, které obsahují více než

tři stupně potenciálu.

potenciál

zpoždění integrace

Zkušební

metody

2.2

2.2.63 PŘÍMÁ AMPÉROMETRICKÁ

A PULZNÍ ELEKTROCHEMICKÁ

DETEKCE

9.7:20263

K detekci elektroaktivních látek na základě jejich oxidačně-

-redukčních schopností se používají přímá ampérometrická

detekce a pulzní elektrochemická detekce (PED) ve spojení

se separační metodou, jako je kapalinová chromatografie

(2.2.29). Elektrochemická detekce využívá redoxní potenciál

zkoušených látek a lze ji proto uplatnit pouze pro elektroaktivní

látky.

PRINCIP

Při použití konstantního potenciálu mezi dvěma elektrodami

dochází k oxidaci (nebo redukci) elektroaktivní látky, která

generuje proud úměrný množství zkoušené látky procházejícího

povrchem elektrody. Tato analytická technika vyžaduje

podpůrný elektrolyt, který může být přidán za kolonu, pokud

Edet = detekční potenciál dosažený během doby tdet

Eoxd = oxidační potenciál dosažený během doby toxd

Ered = redukční potenciál dosažený během doby tred

Obr. 2.2.63-1 – Třístupňový průběh potenciálu v čase

(řada pulzů)

Čas

ZAŘÍZENÍ

Elektrochemický detekční systém se skládá ze tří elektrod:

pracovní elektrody (zlaté, platinové nebo skleněné uhlíkové),

srovnávací elektrody (obvykle argentchloridové)

a pomocné elektrody (např. článku z titanu) (obrázek

2.2.63-2).

Volba indikační elektrody závisí na zkoušené látce. Elektrody

jsou spojeny s potenciometrem, který řídí napětí vložené

na pracovní elektrodu, aniž by byla srovnávací elektroda

vystavena proudu, přičemž pomocná elektroda funguje

jako katoda vždy, když pracovní elektroda pracuje jako

anoda a naopak.

ČL 2017 – Dopl. 2020 209

2.2.64 IDENTIFIKACE PEPTIDŮ NUKLEÁRNÍ MAGNETICKOU REZONANČNÍ SPEKTROMETRIÍ

A

výstup mobilní fáze

vstup mobilní fáze

A = srovnávací B = pomocná C = pracovní

elektroda elektroda elektroda

Obr. 2.2.63-2 Elektrochemický detekční systém

B

NASTAVENÍ ZAŘÍZENÍ

Použité potenciály závisejí na zkoušené látce a druhu použitých

elektrod, proto musí být nastavení odpovídajícím

způsobem upraveno.

Doporučuje se, aby všechny elektrody byly v dobrém stavu

a aby byly pravidelně vyměňovány. Při použití detektoru

pro kvantitativní analýzu se doporučuje ověřit lineární rozsah,

citlivost a opakovatelnost detektoru.

Kvalita použitých zkoumadel je nesmírně důležitá. Doporučuje

se používat zkoumadla nejvyšší čistoty.

DODATEČNÉ INFORMACE

Údržba elektrochemického článku

Zvýšením potenciálu se v PED účinně čistí povrch pracovní

elektrody, čas od času však může být nutné pracovní elektrodu

mechanicky očistit zvláště tehdy, kdy dojde ke zvýšení

šumu pozadí a ke snížení citlivosti. Pracovní elektroda

se čistí velmi opatrně, aby nedošlo k jejímu rozbití nebo

poškrábání. Doporučuje se také současně otírat pomocnou

elektrodu, aby se odstranily nanesené látky. Cela vyžaduje

ustálení po nějakou dobu po vyleštění.

Roztok hydroxidu sodného

Detekce může být zvýšena alkalickým médiem (při pH

alespoň 12), jak je tomu v případě aminoglykosidových antibiotik.

Pokud mobilní fáze není dostatečně zásaditá, může

toho být dosaženo přidáním roztoku hydroxidu sodného za

kolonu pro zvýšení pH látky eluující se z kolony. Roztoky

se smíchají ve smyčce, která je spojena s elektrochemickým

článkem. Důležité je, aby délka směšovací smyčky byla dostatečná

pro tvorbu homogenního roztoku, ale s minimálním

roztažením píků. Je důležité vyloučit uhličitany v roztoku

hydroxidu sodného. Aby se zabránilo poruchám na

základní linii, roztok hydroxidu sodného by měl být před

použitím odplyněn, musí být přidán bezpulzně a jeho průtok

musí být mezi měřením konstantní. Části chromatografického

systému, které přicházejí do styku s roztoky obsahujícími

hydroxid sodný, musí být odolné vůči alkalickým

látkám.

C

2.2.64 IDENTIFIKACE PEPTIDŮ

NUKLEÁRNÍ MAGNETICKOU

REZONANČNÍ SPEKTROMETRIÍ

7.2:20264

ÚVOD

Tato obecná stať má být použita ve spojení s obecnou statí

2.2.33 Nukleární magnetická rezonanční spektrometrie.

Jedná se o kvalitativní přístup spočívající v porovnání

NMR spektra zkoušeného vzorku s porovnávacím spektrem

vzorku získaného za stejných podmínek.

Tato obecná stať se týká především použití nukleární magnetické

rezonanční spektrometrie protonů ( 1 H NMR) k potvrzení

totožnosti malých peptidů (přibližně do 15 aminokyselin).

Také je vhodná pro použití 13 C NMR spektrometrie

s některými úpravami. Rozsah použití je omezen na

jednodimenzionální techniky NMR spektrometrie.

OBECNÉ PRINCIPY

Zařízení. Není-li specifikováno jinak, použije se přístroj

s magnetickým polem umožňujícím pracovní frekvenci

protonů nejméně 300 MHz.

Podmínky měření a jejich optimalizace. Po vložení vzorku

do magnetu se nechá vzorek vytemperovat, zejména provádí-

-li se analýza při teplotě významně se lišící od teploty místnosti;

sledování lockovacího signálu je často vhodným vizuálním

vodítkem vývoje tohoto postupu.

Spektrální šířka musí zahrnovat celé spektrum peptidů

s nepokrytou oblastí signálů na každé straně. Obvykle je

vhodná spektrální šířka 12 ppm až 16 ppm.

Následující parametry se mohou optimalizovat, aby se zlepšilo

rozlišení charakteristických signálů: primárně teplota

a/nebo hodnota pH, koncentrace tlumivých roztoků a peptidů.

Doporučuje se regulovat teplotu vzorku, ale není to

nutné; pokud se regulace teploty nepoužije, validuje se vliv

malých změn teploty na vzhled spektra.

Množství datových bodů má být takové, aby byly píky dostatečně

rozlišeny.

Nedoporučuje se potlačení rozpouštědel; pokud se potlačení

rozpouštědel použije, může to ovlivnit intenzity signálů

blízko rozpouštědla a toto se musí při porovnání spekter validovat.

Referencování chemického posunu. Pro vzorky ve vodných

roztocích jsou vhodné natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonát

(DSS), natrium-(3-trimethylsilyl)propanoát

(TSP) nebo deuterované analogy (TSP-d4), chemický

posun methylových signálů se obvykle nastaví na 0 ppm.

Referenční materiál se k deuterované vodě použité pro rozpuštění

konečného vzorku buď přidá v malých množstvích

(vhodné je 10 ppm až 100 ppm), nebo se mohou použít

snadněji rozeznatelné interní rezonance (acetátový anion)

jako sekundární reference. V tomto případě se k definici

chemického posunu sekundárního standardu použije validační

spektrum získané za stejných spektrálních podmínek.

Množství vzorku. Obvykle se použije několik miligramů.

Jestliže jsou množství vzorků rozdílná, validuje se vliv tohoto

rozdílu na vzhled spektra.

210 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.2.65 VOLTAMETRICKÉ TITRACE

Příprava vzorku. Zkoušené a referenční vzorky musí být

porovnatelné z hlediska koncentrace, hodnoty pH a složení

tlumivého roztoku. Obvykle se vzorky v roztocích lyofilizují

a vysušené vzorky se rozpustí v deuterované vodě nebo

v tlumivém roztoku v deuterované vodě. Může být užitečné

lyofilizovat roztok v deuterované vodě jednou nebo vícekrát

(„výměna deuteriem“), což snižuje intenzitu silného

signálu rozpouštědla; těkavé nečistoty, jako je ethanol, budou

také odstraněny. Použitím tlumivého roztoku pro přípravu

konečného vzorku se může snížit agregace a zlepšit

reprodukovatelnost spektra snížením kolísavosti hodnoty

pH od šarže k šarži. Některé vzorky nesnášejí použití vysokých

koncentrací solí, ale iontové síly do 200 mmol chloridu

sodného jsou obvykle snášeny dobře. Vysoké koncentrace

solí mají sklon zvyšovat délku 90° pulzu.

OVĚŘENÍ TOTOŽNOSTI

Určení klíčových spektrálních faktorů. Použití kvalitativního

přístupu neklade přísné požadavky na parametry

spektra (např. se mohou použít rychle se opakující pulzy,

není požadována úplná relaxace). Použití krátkých šířek

pulzů (např. 30° pulzu) a rychle se opakující pulzy nebude

mít negativní vliv na spektrum a umožní rychlejší akvizici

s přijatelným poměrem signálu k šumu. Kolísání šířky pulzu

a akvizičního času v širokém rozmezí neovlivní možnost

porovnat spektra. Počet akumulovaných skenů musí poskytnout

vhodný poměr signálu k šumu pro rezonance

s nízkou intenzitou, a proto je doporučen minimální poměr

signálu k šumu 50 : 1.

Identifikace charakteristických rezonancí. Je možné porovnat

buď kompletní spektrum, nebo jeho část. Porovnáním

spekter relevantních vzorků se ukáží části spektra, které

jsou charakteristické, a porovnání se může omezit jen na

tyto části. Je důležité definovat rezonance nečistot, jako

jsou zbytková rozpouštědla, které mohou být pro jakost

produktů nepodstatné a jejichž intenzita může od šarže

k šarži kolísat.

Porovnání spekter. Viz obecná stať 2.2.33.

2.2.65 VOLTAMETRICKÉ TITRACE

7.6:20265

Při voltametrických titracích se bod ekvivalence stanoví

měřením změn napětí mezi dvěma elektrodami (buď indikační

elektrodou a srovnávací elektrodou, nebo dvěma indikačními

elektrodami) ponořenými do zkoušeného roztoku

a provádí se za konstantního proudu v závislosti na množství

přidávaného odměrného roztoku.

Přístroj. Přístroj má regulovatelný zdroj proudu a voltmetr.

Měřicí systém se obvykle sestává z jedné indikační elektrody

(např. platinové, rotující diskové nebo uhlíkové elektrody)

a druhé elektrody (např. platinové, rotující diskové nebo

uhlíkové elektrody).

Postup. Proud indikační elektrody se nastaví na hodnotu

předepsanou v článku a do grafu se vynese závislost počátečního

napětí a hodnot získaných během titrace v závislosti

na množství přidávaného odměrného roztoku. Odměrný

roztok se přidá v minimálně třech následných množstvích,

jejichž celkový objem se rovná asi 80 % teoretického objemu

odpovídajícího předpokládanému bodu ekvivalence.

Tyto tři hodnoty mají ležet na přímce. Odměrný roztok se

přidává dále za předpokládaný bod ekvivalence v minimálně

třech dalších množstvích. Získané hodnoty mají ležet na

další přímce. Bod ekvivalence se nachází na průsečíku

obou přímek.

V případě voltametrické titrace se dvěma indikačními elektrodami

se zaznamená celá titrační křivka a použije se ke

zjištění bodu ekvivalence.

2.2.66 DETEKCE A MĚŘENÍ

RADIOAKTIVITY

8.0:20266

ÚVOD

Pojmem radioaktivita se pro účely lékopisu označuje jak

jev radioaktivní přeměny, tak fyzikální veličina charakterizující

jeho intenzitu. V článcích jednotlivých radiofarmak

slouží detekce a měření radioaktivního záření k různým

účelům: k ověření vlastností, k identifikaci, ke stanovení

radionuklidové a radiochemické čistoty a také ke stanovení

aktivity látky.

Podle účelu může mít měření charakter kvalitativní, kvantitativní

nebo obojí v závislosti na tom, zda slouží k identifikaci

radionuklidu, nebo ke stanovení jeho aktivity (popř.

poločasu přeměny), případně obou těchto parametrů.

Radioaktivní zářiče mohou emitovat různé druhy záření,

jako např. alfa částice, elektrony, pozitrony, záření gama

a rtg záření podle toho, jaké obsahují radionuklidy.

Každý radionuklid emituje charakteristické záření s určitými

energiemi a relativními intenzitami. Toto záření může

být detekováno díky svým ionizačním vlastnostem

v ionizační komoře, avšak bez podrobnější charakterizace;

pokud je detekováno a analyzováno spektrometricky, získá

se spektrum četnosti emitovaných částic jako funkce energie.

Detailní spektrometrické analýzy se obvykle užívá

k identifikaci radionuklidů přítomných ve vzorku. Spektrometrii

lze také použít ke stanovení aktivity zdrojů tvořených

jedním radionuklidem nebo směsí radionuklidů, případně

aktivity jednotlivých přítomných radionuklidů.

Měření aktivity se obecně provádí měřením četnosti detekovaných

přeměn (emisí záření). Výsledek je proto značně

ovlivněn geometrií a dobou měření. Obecně musí geometrie

měření odpovídat kalibrované geometrii a doba měření

musí být dostatečně dlouhá, aby počet detekovaných impulzů

byl statisticky vyhovující.

Měření aktivity může být provedeno samostatně (např. ionizační

komorou nebo spektrometrem), nebo v kombinaci

se separačními metodami (např. radiochromatografie), které

umožňují určit relativní zastoupení jednotlivých chemických

forem radionuklidu přítomných ve směsi.

MĚŘENÍ AKTIVITY

Přímé měření aktivity daného vzorku v becquerelech (Bq)

je možné jen v případě, že je známo schéma přeměny radionuklidu,

ale v praxi je třeba k dosažení správného výsledku

provést řadu korekcí. Z toho důvodu je obvyklé měření

pomocí primárního standardního zářiče nebo ionizační ko-

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 211

2.2.66 DETEKCE A MĚŘENÍ RADIOAKTIVITY

morou nebo spektrometrem kalibrovaným kalibračními

zdroji záření vhodnými pro příslušné radionuklidy.

Spektrometr se používá ke stanovení aktivity jednotlivých

radionuklidů ve směsi, kdy lze každý radionuklid identifikovat

charakteristickým energiemi emitovaného záření.

Všechna měření aktivity se musí korigovat na ztráty způsobené

mrtvou dobou a na pozadí způsobené radiací pozadí

a šumem vznikajícím v samotném měřicím přístroji.

Aktivita přípravku je vztažena k datu. Pokud je poločas přeměny

kratší než 70 dnů, vyznačí se také čas. Údaj o aktivitě

musí být vztažen k příslušnému časovému pásmu. Aktivita

v jiném čase se může vypočítat z exponenciální rovnice pro

pokles aktivity nebo určit z tabulek.

Obecně je třeba pro správné měření aktivity vzít v úvahu

některé nebo všechny z následujících požadavků:

Korekce na mrtvou dobu. V důsledku konečného časového

rozlišení (mrtvé doby) detektoru a připojeného elektronického

zařízení může být třeba korigovat výsledky na ztrátu

impulzů v důsledku koincidence. Časové rozlišení je nejmenší

časový interval, který potřebuje čítač k rozlišení

dvou po sobě následujících impulzů. Dva impulzy vyvolané

dopadem částic záření v kratším časovém intervalu nemusí

být detekovány vůbec, nebo mohou být detekovány jako

jediný impulz o energii rovné součtu energií obou částic

(vzniká tzv. sumační pík). Tato ztráta se někdy nazývá ztrátou

v důsledku mrtvé doby. Pro detekční systém s daným

časovým rozlišením (mrtvou dobou) t následujícím po každém

detekovaném impulzu se skutečná četnost impulzů za

sekundu vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

N1

,

1-

N1t

N1 – změřenou četnost impulzů za sekundu;

t – mrtvou dobu v sekundách.

Některé měřicí systémy provádějí tuto korekci automaticky.

Korekce četnosti na mrtvou dobu se provádí dříve než korekce

na pozadí.

Korekce na přeměnu během měření. Jestliže není doba

daného měření tm zanedbatelně krátká ve srovnání s poločasem

přeměny T½ daného radionuklidu, musí se výsledek

korigovat na jeho přeměnu během měření. Pokud

je např. doba měření rovna 15 % poločasu přeměny radionuklidu,

je kumulativní ztráta impulzů během měření

rovna 5 %.

Po korekci údaje daného přístroje (četnost, ionizační

proud atd.) na pozadí a, je-li to nutné, také na ztráty způsobené

elektronickým zpracováním signálu, se vypočítá

údaj korigovaný na hodnotu v okamžiku počátku měření

podle vzorce:

R(λ

1-

(e

t m

-λt

m

)

,

)

v němž značí:

R – údaj přístroje před korekcí na přeměnu, avšak již korigovaný

na pozadí atd.;

λ – přeměnovou konstantu radionuklidu (ln 2/T½);

e – základ přirozených logaritmů (Eulerovo číslo);

tm – dobu měření.

Statistika měření aktivity. Výsledky při měření aktivity

kolísají, zejména v důsledku pravděpodobnostní povahy

jaderných přeměn. Údaj získaný na konci měření poskytuje

pouze odhad skutečné četnosti jaderných přeměn. Ke

kompenzaci kolísání počtu přeměn za jednotku času je

třeba zaznamenat dostatečný počet impulzů. V případě

měření aktivity je směrodatná odchylka rovna druhé odmocnině

počtu registrovaných impulzů; je tedy třeba zaznamenat

nejméně 10 000 impulzů, aby relativní směrodatná

odchylka nebyla vyšší než 1 % (interval spolehlivosti:

1 sigma).

Linearita. Linearita přístroje je interval aktivit daného radionuklidu,

v němž účinnost detekce na daném přístroji zůstává

konstantní.

Lineární rozsah pro dané uspořádání při měření aktivity

lze zjistit opakovaným měřením radioaktivního vzorku

v dané geometrii, jehož aktivita se postupně snižuje

z hodnoty nad oblastí linearity. Po korekci na pozadí se

vynese do grafu přirozený logaritmus četnosti impulzů jako

funkce času uplynulého od prvního měření (viz obrázek

2.2.66-1).

Obr. 2.2.66-1 Záznam přirozeného logaritmu četnosti

v impulzech za sekundu (cps) zdroje 99m Tc jako funkce času

a jeho extrapolace; měření četnosti bylo zahájeno v oblasti

nad lineárním rozsahem měřicího zařízení

Výsledkem lineární regresní analýzy střední lineární části

záznamu dat je přímka, jejíž směrnice je rovna přeměnové

konstantě λ, která má pro každý radionuklid charakteristickou

hodnotu:

ln cps = –λt + c,

kde c je přirozený logaritmus četnosti v čase t = 0 dokonale

lineárního záznamu přístroje.

Výsledná regresní rovnice se použije k výpočtu teoretické

četnosti v libovolném čase záznamu dat. Pokud je odchylka

mezi změřenou a teoretickou četností nepřijatelně velká,

pohybujeme se nad oblastí linearity.

Alternativně lze pro stanovení linearity využít řady ředění

zásobního roztoku radionuklidu o známé objemové aktivitě.

Četnost řady naředěných roztoků téhož objemu se pak za-

212 ČL 2017 – Dopl. 2020


znamená na daném přístroji v téže geometrii a při tomtéž

nastavení přístroje. Poměr změřené četnosti každého vzorku

(po korekci na pozadí a přeměnu během měření) a vypočítané

aktivity daného vzorku v okamžiku počátku měření

v Bq udává účinnost detekce. Interval aktivit, ve kterém

je účinnost detekce konstantní, představuje použitelný rozsah

měřicího přístroje pro daný radionuklid a geometrii měření.

Před použitím přístroje k rutinním měřením je rovněž třeba

stanovit mez detekce a mez stanovitelnosti pro daný přístroj

a metodu měření.

Mez detekce (limit of detection, LOD). Pro danou metodu

měření je to nejmenší množství aktivity vzorku, které je

možno detekovat, nikoliv však nutně přesně kvantifikovat.

Stanovuje se v praxi na základě vyhodnocení signálu pozadí

a jeho směrodatné odchylky. Za mez detekce se pak obvykle

považuje trojnásobek směrodatné odchylky signálu

pozadí.

Mez stanovitelnosti (limit of quantification, LOQ). Pro

danou metodu měření je to nejmenší množství aktivity

vzorku, které lze kvantitativně stanovit s přijatelnou přesností

a správností. Mez stanovitelnosti se používá zejména

při stanovení nečistot a/nebo degradačních produktů.

V praxi se za mez stanovitelnosti obvykle pokládá desetinásobek

směrodatné odchylky signálu pozadí.

MĚŘENÍ AKTIVITY IONIZAČNÍMI KOMORAMI

Zařízení. Ionizační komory jsou nejčastějšími přístroji sloužícími

ke stanovení aktivity radiofarmak. Obvykle se jimi

měří aktivity od několika desítek kBq až po stovky GBq.

Skládají se většinou z uzavřené studnové ionizační komory

a vestavěné elektroniky sloužící k převodu signálu detektoru

na údaj o aktivitě.

Komora je naplněna plynem, v němž jsou umístěny dvě

elektrody, mezi nimiž je konstantní napětí. Dojde-li k ionizaci

plynu zářením emitovaným zdrojem, zaznamená se

vzniklý ionizační proud a převede na aktivitu zdroje v ionizační

komoře. Ionizační proud je ovlivněn napětím mezi

elektrodami, energií a intenzitou záření emitovaného měřeným

radionuklidem a povahou a tlakem plynu, jímž je ionizační

komora naplněna. Nastavení přístroje (kalibrační faktor)

lze měnit tak, aby vynásobení ionizačního proudu tímto

faktorem poskytlo přímo údaj o aktivitě daného radionuklidu

pro danou geometrii měření.

Ionizační komora měří pouze proud vzniklý celkovou výslednou

ionizací plynu, nedokáže tedy rozlišit záření emitované

jednotlivými radionuklidy.

Pro správné stanovení aktivity daného radionuklidu musí

být údaj komory korigován na ty příspěvky ionizačního

proudu, jejichž příčinou je přítomnost radionuklidových

nečistot v přípravku.

Interval aktivit, které lze ionizační komorou měřit, je omezen

saturací signálu, rozsahem zesilovače a parametry komory.

Lineární rozsah ionizační komory se stanovuje tak,

jak je popsáno výše v oddílu Linearita.

Ionizační komoru je třeba stínit, aby bylo pozadí sníženo na

přijatelnou úroveň.

Postup. Vzorek se umístí pomocí držáku na definované

místo uvnitř ionizační komory. Po ustálení odezvy komory

se zaznamená údaj o aktivitě. Nejpřesnějších výsledků lze

dosáhnout, pokud se vzorek měří v naprosto stejné geometrii

jako kalibrační zdroj. Pokud je třeba, naředí se měřený

vzorek na tentýž objem, jaký měl použitý kalibrační zdroj.

Kalibrace. Ionizační komora se kalibruje s ohledem na tvar,

rozměry a materiál nádobky, v níž je vzorek umístěn, objem,

složení roztoku a polohu vzorku v komoře a měřený

radionuklid. Povolené meze nejistoty měření lze nalézt

v národních a mezinárodních směrnicích.

Ionizační komora se kalibruje nejméně jednou ročně za použití

kalibračních zdrojů záření navázaných na národní nebo

mezinárodní standardy v odpovídajících nádobkách

(lahvička, stříkačka) s ohledem na geometrii měření. Pro

různé kontfigurace měření aktivity daného radionuklidu se

stanoví a zavedou se pomocné korekční faktory. Kontrola

linearity přístroje se provede v úplném rozsahu energií

a aktivit, k jejichž měření se přístroje používá.

Pro každé nastavení komory a před každým použitím (alespoň

jednou denně) se provede test stability odezvy komory

za použití standardních zdrojů radionuklidů s dlouhým poločasem

přeměny, aby se zjistilo, zda kalibrace stále odpovídá

realitě. Každý den, kdy je komora používána, musí být

provedena kontrola stability odezvy komory za použití referenčního

zdroje, jako je např. 137 Cs, aby se ověřila platnost

kalibrace.

MĚŘENÍ AKTIVITY DETEKTORY V PEVNÉ FÁZI

Detektory v pevné fázi (pevnolátkové detektory) zahrnují

plastické scintilátory, scintilační krystaly a polovodiče. Kromě

jejich použití ve spektrometrii (viz odstavec Spektrometrie)

mohou být tyto detektory použity i k měření aktivity.

Plastické a krystalové scintilátory se mohou použít díky své

vysoké citlivosti zejména k měření nízkých aktivit. U těchto

detektorů je rovněž třeba věnovat dostatečnou pozornost pečlivé

korekci na mrtvou dobu. Polovodičové detektory se užívají

tehdy, pokud je třeba vysoké energetické rozlišení, například

u směsí radionuklidů, nebo emitují-li potenciální radionuklidové

nečistoty záření blízkých energií.

Zařízení. Přístrojové vybavení se skládá ze stíněného detektoru

tvořeného plastickým nebo krystalovým scintilátorem

spojeným s fotonásobičem, nebo polovodičem napojeným

na předzesilovač, dále zesilovače a jednotky zpracování

signálu. Měřicí systém může být vybaven nastavitelným

energetickým oknem, jímž se na základě spektra

radionuklidu volí oblast energií záření vhodná pro jeho detekci.

Přístroje mají různé rozlišení a detekční účinnost v závislosti

na typu detektoru, jeho objemu a geometrii měření.

Nižší účinnost vede k delší době měření.

Měřené vzorky se umisťují před detektor nebo do dutiny

studnového detektoru. Detektory mohou být obklopeny stíněním

a jednotlivé vzorky se vkládají na víčka nebo jiné

systémy zajišťující správnou a reprodukovatelnou polohu

během měření.

Scintilační detektor lze použít k dynamickému měření aktivity,

např. když eluát z kapalinového chromatografu prochází

nad detektorem nebo přímo detektorem, viz odstavec

Detekce a měření aktivity, v kombinaci se separačními metodami.

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 213


Postup. Zajistí se, aby měřená četnost aktivity vzorku byla

v oblasti linearity detekčního systému. Měření se zahájí potom,

co je stínění detektoru ve správné poloze či víko studnového

detektoru vráceno do původní polohy a doba měření

nastavena tak, aby počet impulzů dosáhl statisticky přijatelné

hodnoty.

Kalibrace. Detektor je třeba kalibrovat měřením jeho účinnosti

za použití zdroje obsahujícího daný radionuklid navázaný

na národní nebo mezinárodní standardy. Kalibrace

účinnosti se rovněž provádí za použití zdrojů obsahujících

137

Cs, 60 Co, 133 Ba apod., které pokrývají potřebný interval

energií.

MĚŘENÍ AKTIVITY KAPALNÝMI SCINTILÁTORY

Kapalné scintilátory se běžně používají k měření vzorků

obsahujících beta zářiče, lze je však rovněž úspěšně využít

k měření zářičů alfa. Principy měření aktivity detektory na

bázi kapalných scintilátorů je popsáno dále v odstavci

Spektrometrie záření beta.

Kalibrace. Při měření je třeba vzít v úvahu snížení účinnosti

detekce v důsledku zhášecího efektu. K tomuto účelu

se může použít vnější zdroj, obvykle 133 Ba nebo 152 Eu, který

se umístí v blízkosti nádobky se vzorkem a indukuje

emisi Comptonových elektronů. Tvar výsledného spektra se

automaticky vyhodnotí a vypočítá se zhášecí parametr.

Tento parametr se pak společně s měřením zdrojů známé

aktivity při dané koncentraci zhášecího činidla může použít

k určení účinnosti detekce. Takto získané zhášecí křivky

umožňují stanovit aktivitu neznámého vzorku na základě

změřené četnosti a hodnoty zhášecího parametru.

STANOVENÍ POLOČASU PŘEMĚNY

Poločas přeměny je vlastností radionuklidu, která může

sloužit k jeho identifikaci. Poločas přeměny se vypočítá

z měření postupně klesající aktivity vzorku jako funkce času.

Měření je třeba provádět v lineárním rozsahu kalibrovaného

přístroje.

Zařízení. Poločas přeměny lze změřit pomocí libovolného

detektoru aktivity za předpokladu, že při všech měřeních je

jednak vzorek v téže poloze vůči detektoru, jednak jeho aktivita

je v lineárním rozsahu přístroje.

Pokud přípravek obsahuje radionuklid o krátkém poločasu

přeměny a pokud to uvádí příslušný článek, je jednou ze

zkoušek totožnosti stanovení přibližného poločasu.

Postup.

Poločas. Zkoušený přípravek se použije ke zkoušce bez

úprav nebo zředěný, nebo po vhodném zředění jako odparek

na odpařovací misce. Radioaktivní vzorek se připraví

způsobem, který vylučuje ztrátu materiálu při manipulaci.

Jedná-li se o kapalinu (roztok), hermeticky se uzavře v nádobce

či ampuli. Jde-li o odparek na odpařovací misce,

překryje se přilnavou vrstvou acetátu celulosy nebo jiného

vhodného materiálu.

Aktivita vzorku musí být dostatečně vysoká, aby umožnila

jeho měření po dobu odpovídající odhadu tří poločasů přeměny

příslušného radionuklidu, a zároveň musí být při každém

měření v lineárním rozsahu přístroje. Pokud to je nutné,

uplatní se korekce na mrtvou dobu.

Tentýž vzorek se měří v téže poloze vůči detektoru a v intervalech

rovných alespoň polovině očekávaného poločasu

přeměny. Všechny změřené hodnoty se vynesou do tabulky

proti času počítanému od počátku prvního měření. Aby se

vyloučil vliv přeměny během měření, je doba měření vždy

stejná. Z těchto hodnot se sestrojí graf, kde čas je na ose

úseček a logaritmus odezvy měřicího přístroje (např. četnost)

na ose pořadnic. Poločas přeměny odpovídající každému

měření se pak vypočítá ze směrnice lineární regresní

přímky z naměřených hodnot jako funkce času.

Obr. 2.2.66-2 Porovnání spekter získaných pomocí scintilačního NaI(Tl) detektoru (horní křivka) a polovodičového HPGe

detektoru (dolní křivka). Zdrojem záření gama a rtg záření byla přeměna 131 I.

214 ČL 2017 – Dopl. 2020


Přibližný poločas. Pro účely stanovení přibližného poločasu

je třeba provést nejméně tři měření aktivity v časovém intervalu

rovném alespoň jedné čtvrtině očekávané hodnoty. Měřený

vzorek a použitý měřicí přístroj musí vyhovovat stejným

požadavkům jako v případě stanovení poločasu. Stejným

způsobem se vyhodnotí také získaná data (viz výše).

SPEKTROMETRIE

Radionuklidy lze identifikovat pomocí spektra emitovaného

záření. Každý typ emise (tj. záření alfa, beta, gama, konverzní

elektrony nebo charakteristické rtg záření) vyžaduje

pro záznam spektra zvláštní vybavení. Spektrometry musí

být kalibrovány, aby poskytovaly správné výsledky. Následující

odstavce popisují různé vybavení a podrobnosti

obecných postupů pro spolehlivé měření.

SPEKTROMETRIE ZÁŘENÍ GAMA

Obecné principy. Pokud se v gama spektrometrii používá

scintilační detektor, dochází při absorpci záření gama

a rtg záření v detektoru ke vzniku světelných kvant, která se

pomocí fotonásobiče převádějí na elektrický impulz. Pokud

se použije polovodičový detektor, vede absorpce záření

gama a rtg záření přímo ke vzniku elektrického impulzu.

V obou případech je však amplituda impulzu přímo úměrná

energii absorbovaného záření. Nejčastěji se ve spektrometrii

záření gama a rtg záření používají scintilační detektory

s jodidem sodným aktivovaným thalliem (NaI(Tl)) a polovodičové

detektory s vysoce čistým germaniem (HPGe).

Spektrum záření gama se získá registrací dostatečného počtu

impulzů.

Zařízení. Spektrometr záření gama se obvykle skládá ze

stíněné komory, v níž je umístěn vzorek a detektor, elektronického

řetězce a vícekanálového analyzátoru.

Stínění komory musí snížit signál pozadí na úroveň, která

umožňuje správně zaznamenat spektrum záření gama.

Měřicí komora má pohyblivé víko nebo zásuvku umožňující

vložení vzorku. V komoře může být rovněž držák vzorků,

který zajišťuje reprodukovatelnost geometrie měření.

Doba měření souvisí s aktivitou měřeného radionuklidu

a k docílení vyhovující statistiky měření může být i značně

dlouhá. Ztráty v důsledku mrtvé doby mohou hrát u těchto

typů detektorů značnou roli a je třeba vždy zvážit jejich vliv.

Účinnost detekce NaI(Tl) detektoru je vyšší než účinnost

detekce HPGe detektoru stejných rozměrů. Obecně se píky

ve spektru záření gama měří s nejistotou charakterizovanou

šířkou píku v polovině jeho výšky (tzv. FWHM – Full

Width at Half Maximum). Energetické rozlišení scintilačních

detektorů v pevné fázi je mnohem horší než rozlišení

polovodičových detektorů, takže píky ve spektru získaném

pomocí polovodičového detektoru jsou výrazně užší než

píky ve spektru získaném pomocí scintilačního detektoru.

Na obrázku 2.2.66-2 jsou porovnána spektra téhož zdroje

získaná oběma těmito typy detektorů.

Odlišné vlastnosti NaI(Tl) a HPGe detektorů mohou vést

k omezení jejich použitelnosti pro určité typy spektrometrické

analýzy.

Pro zkoušky totožnosti radionuklidu (radionuklidů) v přípravku

a stanovení radionuklidové čistoty se musí provést

analýza rizik spojená s postupem přípravy radionuklidu

s ohledem na potenciální přítomnost jiných radionuklidů

emitujících fotony v téže oblasti energií (±10 %) jako radionuklid

(radionuklidy) přítomný (přítomné) v radiofarmaku.

Pokud mohou být přítomny radionuklidové nečistoty emitující

záření gama nebo rtg záření v téže oblasti energií jako

fotony emitované radionuklidem v přípravku, postačí

k identifikaci jejich píku, aby se jeho naměřená energie nelišila

o více než ±2 keV nebo ±2 % (podle toho, co je větší)

od energie píku příslušného radionuklidu, jejíž hodnota se

odečte z tabulky (viz 5.7 Tabulku fyzikálních vlastností radionuklidů).

Pokud se přítomnost radionuklidových nečistot neočekává,

ke stanovení totožnosti píku stačí, aby se jeho naměřená

energie nelišila o více než ±10 keV nebo ±6 % (podle toho,

co je větší) od energie píku příslušného radionuklidu (viz

5.7 Tabulku fyzikálních vlastností radionuklidů).

Postup. Ověří se, že četnost impulzů vzorku spadá do lineárního

rozsahu měřicího přístroje. U kapalných vzorků toho

lze docílit vhodným zředěním; u pevných vzorků zvětšením

vzdálenosti mezi vzorkem a detektorem, nebo umístěním

zeslabovacího materiálu mezi vzorek a detektor. Zkoušený

přípravek v nádobce se vloží do komory přístroje a po uzavření

stínění se zaznamená spektrum.

Zajistí se, aby nádobka se vzorkem měla stejný tvar, rozměry,

objem a materiál jako nádobka, v níž byl umístěn

kalibrační standard. Rovněž se zajistí, aby složení roztoku

a poloha nádobky v komoře přístroje byly stejné pro měřený

vzorek i pro kalibrační standard.

Totožnost radionuklidu. Provede se energetická kalibrace

spektrometru. Zkouška totožnosti je platná, jsou-li detekovány

ty píky ve vzorku, jejichž energie odpovídají energiím

předepsaným v příslušném článku.

Radionuklidová čistota. Provede se energetická kalibrace

a kalibrace účinnosti spektrometru. Stanoví se mez stanovitelnosti

a rozlišení přístroje a ověří se, zda lze stanovit limity

příslušných radionuklidů v souladu s daným článkem.

Zaznamená se spektrum přípravku. Radionuklidy přítomné

ve zkoušeném přípravku se identifikují a určí se jejich aktivita

pomocí tabulky 5.7 Tabulka fyzikálních vlastností radionuklidů.

Jelikož obsah radionuklidových nečistot vyjádřený

jako procento celkové aktivity přípravku může

v průběhu času růst nebo klesat, musí být změřená aktivita

každé nečistoty přepočtena na aktivitu během doby použitelnosti

přípravku. Aktivity všech radionuklidových nečistot

musí být sečteny (je třeba vzít v úvahu také jejich meze

stanovitelnosti) a vztaženy k celkové aktivitě přípravku.

Vzorek se umístí do těsné blízkosti detektoru nebo do studnového

detektoru. Zaznamenají se všechny impulzy ve zvoleném

intervalu energií záření a vyjádří buď jako četnosti,

nebo jako kumulované počty impulzů za celou dobu měření.

Pokud je dostatečný rozdíl v energiích fotonů emitovaných

přítomnými radionuklidy, může být pro účely měření

použit NaI(Tl) detektor s vysokou účinností detekce záření.

Pokud je však třeba rozlišit fotony blízkých energií, je třeba

použít HPGe nebo jiný polovodičový detektor.

Kalibrace. Energetická kalibrace se provádí pomocí píků

známých zdrojů záření gama navázaných na národní nebo

mezinárodní standardy, jakými jsou např. 57 Co, 137 Cs, 60 Co

a další pokrývající požadovaný interval energií. Současně

se získá účinnostní kalibrace, takže kromě energetického

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 215


spektra lze určit aktivitu vzorku včetně aktivit radionuklidových

nečistot. Účinnostní kalibraci lze provést pomocí

navázaného radionuklidového zdroje záření gama, jehož

píky pokrývají požadovaný interval energií nebo směsného

navázaného standardu, jehož radionuklidové složky pokrývají

požadovaný interval energií.

Pro získání křivky účinnosti detekce záření gama se měří

odezva detektoru jako funkce energie pro každou geometrii

vzorek/detektor. Pro tyto účely lze provést měření pomocí

primárního standardního zdroje. Pro radionuklidy s krátkým

poločasem přeměny, jakými jsou např. některé pozitronové

zářiče, nemusí být primární standardy dostupné.

Během měření musí být vzorek v nádobce většinou v definované

poloze vůči detektoru. Geometrie vzorek/detektor je

definována polohou vzorku vůči detektoru a vlastnostmi

nádobky a vzorku, např. tvarem, objemem a hustotou. Typická

účinnostní křivka pro zdroj ve válcové nádobce umístěný

na HPGe detektoru je na obrázku 2.2.66-3.

SPEKTROMETRIE ZÁŘENÍ BETA

Ke stanovení distribuce energií beta částic je třeba použít

spektrometr záření beta. Jedná se o analogii spektrometru záření

gama, avšak v případě beta spektrometrů se často používají

kapalné scintilátory, které konvertují energii částic beta

na snadno detekovatelné světelné fotony, které je potom

možné analyzovat. Vzorek se nejčastěji rozpustí nebo suspenduje

v kapalném scintilátoru (ve směsi pro kapalinovou

scintilaci) v průhledných nebo průsvitných nádobkách (ze

skla nebo plastu) a potom se měří elektrické impulzy, které

emitované světlo generuje ve fotonásobiči. Amplituda impulzu

je úměrná energii absorbované částice beta.

Spektrum záření beta se získá zaznamenáním dostatečného

počtu impulzů. Směsi pro kapalinovou scintilaci se volí tak,

aby byly minimalizovány chyby měření v důsledku zhášení,

chemoluminiscence, fosforescence apod. K minimalizaci

impulzů generovaných pozadím, šumem elektroniky

apod. se rovněž používá koincidenční měření na dvou nebo

více fotonásobičích. K rozlišení alfa a beta částic se obvykle

používá tvarová diskriminace impulzů.

Totožnost radionuklidu. Validní zkouškou totožnosti je detekce

beta částic o středních a/nebo maximálních energiích

odpovídajících energiím předepsaným v příslušném článku.

Kalibrace. Obecně se energetická kalibrace provádí nezhášeným

referenčním vzorkem za účelem stanovení maximální

energie beta částic emitovaných příslušným radionuklidem.

SPEKTROMETRIE ZÁŘENÍ ALFA

Ke zkoušce totožnosti a stanovení aktivity zářičů alfa se

nejčastěji používá spektrometrie na bázi kapalinové scintilace,

jejíž princip je popsán v předchozím odstavci o spektrometrii

záření beta.

Ke zkoušce totožnosti a stanovení radionuklidové čistoty

zářičů alfa lze použít spektrometrii s polovodičovými

křemíkovými detektory s povrchovou bariérou. Absorpce

částice alfa v takovém detektoru má za následek okamžitý

vznik elektrického impulzu. Pohyb párů elektrondíra

vytvořených interakcí záření s materiálem polovodiče

se projeví jako elektrický impulz, který se po zesílení

změří.

Zásadní úlohu hraje příprava vzorku. Po chemické separaci

příslušného radionuklidu se vzorek nanese elektrodepozicí na

disk z nerezové oceli ve velmi tenké vrstvě, aby se minimalizovala

samoabsorpce částic alfa. Výtěžek celého procesu lze

přitom stanovit experimentálně přídavkem známého množství

indikátoru (stopovače), čímž se určí úhrnná účinnost

chemické separace, elektrodepozice a detekce.

U obou typů detekce je amplituda elektrických impulzů

úměrná energii absorbované částice alfa. Spektrum záření

alfa se získá zaznamenáním dostatečného počtu impulzů.

Totožnost radionuklidu. Validní zkouškou totožnosti je detekce

těch píků ve vzorku, jejichž energie odpovídají energiím

předepsaným v příslušném článku.

Kalibrace. Spektrometr záření alfa se musí kalibrovat jak

Obr. 2.2.66-3 Typická účinnostní křivka změřená pomocí sady standardních zdrojů v nádobkách téhož tvaru umístěných

na HPGe detektoru

216 ČL 2017 – Dopl. 2020


na energii, tak na účinnost. Kalibrace se provádí pomocí

píků známých zdrojů pokrývající požadovaný rozsah

energií, jakými jsou např. 241 Am nebo 242 Pu. Ne všechny

částice alfa emitované zdrojem povedou ke vzniku impulzu

v měřicím systému. Účinnost detekce závisející na geometrii

měření je určena pravděpodobností, že emitovaná

částice alfa bude interagovat s materiálem detektoru

a vytvoří impulz.

DETEKCE A MĚŘENÍ AKTIVITY V KOMBINACI

SE SEPARAČNÍMI METODAMI

Radioaktivní přípravek může obsahovat radionuklid v různých

chemických formách, které se od žádoucí chemické

formy liší. Je proto třeba separovat různé látky obsahující

daný radionuklid a určit procento jeho aktivity v žádoucí

chemické formě a podíl dalších látek na celkové aktivitě

odpovídajícího radionuklidu. Tomuto účelu slouží přístroje

pro detekci a měření radioaktivity kombinované s fyzikálně-chemickými

separačními metodami. V principu se mohou

použít libovolné separační metody.

Články týkající se jednotlivých radiofarmak mohou kombinovat

měření aktivity s papírovou chromatografií (2.2.26),

tenkovrstvou chromatografií (2.2.27), plynovou chromatografií

(2.2.28), kapalinovou chromatografií (2.2.29), vylučovací

chromatografií (2.2.30) nebo elektroforézou (2.2.31).

Ve všech případech se aktivita každé stanovované látky

měří po provedení separace příslušnou metodou.

Aktivita se může měřit detektory umístěnými v sérii s ostatními

detektory analytického přístroje, jako jsou kapalinové

chromatografy, kdy se stanovované látky detekují

v průběhu separace (in-line), nebo se měří aktivita jednotlivých

frakcí téhož objemu po ukončení separace či distribuce

aktivity na vyvinutých papírových či tenkovrstvých

chromatogramech (off-line).

IN-LINE DETEKCE A MĚŘENÍ AKTIVITY V KOMBINACI

S KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ

Zařízení. Kapalinová chromatografie (2.2.29) se může použít

pro separaci základní radioaktivní látky v radiofarmaku

od radiochemických nečistot nebo degradačních produktů.

Průběžná detekce se obvykle provádí pomocí scintilačního

detektoru spojeného s čítačem impulzů a záznamovým zařízením.

Scintilátor se volí s ohledem na charakter detekovaného

záření, např. plastický scintilátor pro detekci záření

beta nebo krystalový scintilátor pro spektrometrii záření

gama a rtg záření. Přidání směsi pro kapalinovou scintilaci

před tím, než eluát dosáhne polohy detektoru, je další možností

při detekci zářičů beta.

Současné použití detektoru radioaktivity a dalších detektorů

(UV, refraktometrický, konduktometrický apod.) zapojených

do série se může použít ke zkouškám totožnosti přípravku,

např. pomocí retenčního času známého standardu,

nebo ke stanovení množství chemické látky pomocí vhodného

referenčního standardu a k současnému určení aktivity,

která se v této látce vyskytuje. Pokud jsou různé detektory

zapojeny do série, provede se korekce experimentálně

získaného retenčního času na zpoždění záznamu signálu.

U kapalinové chromatografie mohou některé radiochemické

nečistoty, jako jsou např. koloidní nečistoty, zůstat trvale

zadrženy na koloně. V takovém případě je třeba mít k dispozici

nezávislou metodu stanovení obsahu zadržených nečistot

v radiofarmaku a do výpočtu celkové radiochemické

čistoty započítat relativní množství zadržených radiochemických

nečistot.

Jednou z možností, jak vyřešit tyto problémy s trvalým záchytem

látky na koloně při validaci metody je stanovit procento

zadržení na koloně změřením celkové aktivity eluované

z chromatografického systému s kolonou a bez ní.

Postup. Je-li to třeba, zkoušený vzorek se zředí a pak se

v předepsaném objemu a za předepsaných podmínek nanese

na kolonu. Je důležité stanovit před tím mez detekce

a mez stanovitelnosti a ověřit linearitu detektoru v intervalu

měřených aktivit.

Průtokový detektor. Část kapiláry, kterou vytéká eluát z kolony

s radioaktivními látkami, je umístěna před detektorem

nebo eluát přímo protéká. Detekční účinnost lze zvýšit prodloužením

úseku kapiláry (např. zvýšením počtu závitů kapiláry

před nebo v místě detektoru); to však snižuje schopnost

systému rozlišit dva radioaktivní píky s blízkými retenčními

časy.

Pokud zkouška na radiochemickou čistotu předepisuje stanovení

všech radiochemických nečistot nebo je třeba kvantitativního

stanovení jednotlivých nečistot, je důležitá

správná volba nastavení mezí a podmínek vhodných pro integraci

ploch píků. U takových zkoušek je limit zanedbatelnosti,

tj. limit, při němž nebo pod nímž se k píkům nepřihlíží,

závislý na metodě a souvisí s mezí detekce a stanovitelnosti.

Tedy u nastavení mezních hodnot systému sběru

dat odpovídá alespoň polovině hodnoty limitu zanedbatelnosti.

Signály detektorů se zaznamenají jako funkce času.

Identifikace píků v záznamu signálu radiodetektoru (radiochromatogramu)

se provádí na základě retenčního času jednotlivých

zkoušených látek. K tomu účelu mohou sloužit

záznamy signálu z ostatních detektorů.

Stanovení obsahu různých složek v profilu chromatogramu

a radiochromatogramu se provádí za použití ploch

jednotlivých píků. Plochy píků se obvykle získají přímo

integrací signálu detektoru pomocí komerčně dostupného

softwaru.

OFF-LINE DETEKCE A MĚŘENÍ AKTIVITY

Kapalinová chromatografie (2.2.29). Za předpokladu, že retenční

časy různých radiochemických forem jsou reprodukovatelně

stálé, lze postupně jímat eluát vytékající z kolony

do přiměřeně velkých frakcí a po ukončení analýzy stanovit

jejich aktivitu. Aktivita ve frakcích odpovídajících jednotlivým

píkům se pak vyjádří jako procento celkové aktivity ve

všech frakcích, přičemž se zohlední mez stanovitelnosti.

Postup. Vzorek se nanese na kolonu v předepsaném objemu

a za předepsaných podmínek. Frakce se jímají na výstupu

chromatografického systému.

Objem mezi detektorem použitým ke stanovení retenčního

času jednotlivých píků a místem, kde se jímají frakce, se

změří, vypočítá se faktor zpoždění na základě průtokové

rychlosti mobilní fáze a použije se k výpočtu času, v němž

se každý pík v tomto místě objeví. Frakce se jímají buď po

Zkušební

metody

2.2

ČL 2017 – Dopl. 2020 217


konstantních časových intervalech, nebo na základě výpočtu

z retenčního času tak, aby se každý pík jímal v jedné

nebo několika frakcích.

Aktivita každé frakce se pak stanoví kalibrovaným přístrojem,

jako např. ionizační komorou nebo scintilačním detektorem,

přičemž se zohlední mez stanovitelnosti a lineární

rozsah přístroje.

Eluční profil se získá vynesením změřených četností každé

frakce proti elučnímu času nebo objemu. Aktivity frakcí náležejících

ke stejnému píku se mohou sečíst a pro účely

stanovení radiochemické čistoty se vypočítá jeho relativní

procentuální zastoupení.

Tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) a papírová chromatografie

(2.2.26). Za předpokladu, že analytická metoda, jako

je tenkovrstvá chromatografie nebo papírová chromatografie,

byla zvalidována pro separaci jednotlivých složek radiofarmaka,

počet a relativní intenzita jednotlivých skvrn

mohou být detekovány a stanoveny pomocí vhodného detektoru,

který je schopen změřit průběh aktivity v závislosti

na specifické poloze na chromatogramu.

Vhodné metody detekce umožní chemickou identifikaci porovnáním

polohy skvrn (píků) s roztoky stejné (neradioaktivní)

chemické látky.

Zařízení.

Skenovací zařízení. Obecně se skládá z detektoru radioaktivity,

jakým je např. polohově citlivý proporcionální čítač

nebo scintilační detektor opatřený kolimátorem, který je

umístěn v neměnné vzdálenosti od podložky, na níž je

umístěn skenovaný radiochromatogram.

Aktivita vzorku naneseného na chromatografickou desku

nebo papír musí odpovídat takové změřené četnosti, která

spadá do lineárního rozsahu přístroje. Je-li třeba, vzorek se

může před aplikací zředit. Skenovaná plocha se umístí do

definované polohy tak, aby požadovaný úsek kopíroval

dráhu detektoru při skenování. Rychlost snímání se nastaví

tak, aby doba odečtu během měření byla dostatečná.

Detektor nebo podložka chromatogramu se mohou pohybovat

v rovině podél osy x nebo y, takže lze provést skenování

celé plochy naráz.

Detektor je připojen k vhodnému čítači, takže aktivitu lze

kvantifikovat a změřenou četnost přiřadit danému místu

skenovaného povrchu.

Aktivita se automaticky zaznamenává jako funkce vzdálenosti

od startu a její profil definuje píky s plochou přímo

úměrnou počtu impulzů na jednotku délky.

Čítač aktivity. Je-li třeba identifikovat maximálně tři radiochemické

složky, které jsou systémem dokonale odděleny,

radiochromatogram lze rozstříhat na proužky stejné délky,

která není větší než polovina vzdálenosti dvou nejbližších

skvrn na chromatogramu. Každý jednotlivý proužek se

očísluje počínaje startem a proměří se odděleně. U dobře

charakterizovaných systémů lze radiochromatogram rozstříhat

na dvě nebo více různě dlouhých částí, které se

v případě potřeby před měřením přeloží, aby měly přibližně

tutéž velikost a tvar. Pro účely měření lze použít ionizační

komoru nebo čítač vybavený scintilačním detektorem za

předpokladu, že se měřené hodnoty pohybují v lineárním

rozsahu přístroje a nad mezí stanovitelnosti.

Autoradiografie. Tuto metodu lze rovněž použít k zobrazení

distribuce aktivity na radiochromatogramu. V tom případě

však musí být odezva detekčního zařízení, např. exponovaného

filmu nebo skeneru radiochromatogramů („phosphor

imager“), na aktivitu radiochromatogramu lineární.

Systém musí být zkalibrován nebo musí být společně se

zkoušeným vzorkem exponovány referenční radioaktivní

zdroje získané zředěním zásobního roztoku standardu

a pokrývající očekávané rozpětí aktivit, které mohou být na

radiochromatogramu.

Postup. Na start chromatografického papíru nebo tenké

vrstvy se nanese požadované množství vzorku. Je-li třeba

zamezit rozmytí nanesené skvrny, nanesený vzorek se vysuší.

Předepsaným postupem se provede vyvíjení radiochromatogramu.

Pokud to článek předepisuje, může se přidat

nosič.

U papírové a tenkovrstvé chromatografie se dává přednost

nanesení neředěných zkoušených přípravků, ale je třeba

zamezit nanesení takové aktivity, která by vedla ke ztrátám

registrované četnosti v důsledku mrtvé doby detekčního zařízení.

Vyvinutý radiochromatogram se usuší a poloha radioaktivních

skvrn se určí měřením aktivity podél radiochromatogramu za

použití vhodného kolimovaného detektoru, autoradiografie

nebo měřením jednotlivých proužků rozstříhaného radiochromatogramu.

Aktivitu lze měřit integrací s využitím přístroje vybaveného

automatickým zapisovačem nebo pomocí digitálního čítače.

Poměry ploch pod jednotlivými píky udávají relativní poměr

příslušných radiochemických forem v procentech.

Pokud se radiochromatogram stříhá, je poměr příslušných

radiochemických forem určen poměrem změřených aktivit

jednotlivých částí radiochromatogramu.

Kalibrace. Je důležité stanovit mez detekce a mez stanovitelnosti

a lineární rozsah detektoru pro interval měřených

aktivit po celé délce měřeného radiochromatogramu. To lze

provést nanesením vzorků s aktivitou v rozmezí od 0,1 %

do 100 % očekávané celkové nanesené aktivity. Vzorky se

připraví zředěním zásobního roztoku a nanášejí se ve stejném

objemu, je-li třeba, vysuší se. Po stanovení profilu

aktivity při standardním nastavení měřicího zařízení se

porovnají plochy píků jednotlivých skvrn s vypočítaným

množstvím aktivity těchto skvrn. Ověří se, že odezva detektoru

je po celé délce a šířce dráhy detektoru stejná; s polohou

detektoru se však odezva může měnit.

Rozlišovací schopnost je ovlivněna rozměry skvrny, celkovou

aktivitou radionuklidu a detekčním systémem. Lze ji

ověřit nanesením zásobního roztoku o objemu 5 µl tak, aby

vzniklé skvrny byly odděleny postupně rostoucí vzdáleností

od 4 mm až do 20 mm s nárůstem po 2 mm. Přibližné rozlišení

detekčního systému se určí ze změřeného profilu aktivity

na desce nebo proužku papíru jako vzdálenost mezi

dvěma skvrnami, které jsou právě zřetelně odděleny na

úrovni pozadí.

218 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.3.1 ZKOUŠKY TOTOŽNOSTI IONTŮ A FUNKČNÍCH SKUPIN

2.3 ZKOUŠKY TOTOŽNOSTI

2.3.1 ZKOUŠKY TOTOŽNOSTI IONTŮ

A FUNKČNÍCH SKUPIN

6.0:20301

ACETÁTY

a) Zkoušená látka se zahřívá se stejným množstvím kyseliny

šťavelové R. Uvolňují se páry s charakteristickým pachem

kyseliny octové, které dávají kyselou reakci (2.2.4).

b) Asi 30 mg zkoušené látky se rozpustí ve 3 ml vody R

nebo se použijí 3 ml předepsaného roztoku. Přidá se postupně

0,25 ml dusičnanu lanthanitého RS, 0,1 ml jodu

0,05 mol/l RS, 0,05 ml amoniaku zředěného RS2

a zahřívá se opatrně k varu; během několika minut

vznikne modrá sraženina nebo tmavě modré zbarvení.

ACETYL

Do zkumavky délky asi 180 mm a vnějšího průměru

18 mm se převede asi 15 mg nebo předepsané množství

zkoušené látky a 0,15 ml kyseliny fosforečné R. Zkumavka

se uzavře zátkou, kterou prochází malá zkumavka délky asi

100 mm a vnějšího průměru 10 mm obsahující vodu R, která

působí jako chladič. Na povrch malé zkumavky se zavěsí

kapka dusičnanu lanthanitého RS. Kromě látek těžko hydrolyzovatelných

se aparatura postaví do vodní lázně na

5 min, potom se malá zkumavka vyjme a kapka se smíchá

na kapkovací desce s 0,05 ml jodu 0,01 mol/l RS. K okraji

směsi se přidá 0,05 ml amoniaku zředěného RS2; po 1 min

až 2 min vznikne na styku obou kapek modré zbarvení, které

zesílí a po krátkém čase zmizí.

U látek těžko hydrolyzovatelných se směs pomalu zahřívá

k varu nad otevřeným plamenem a potom se postupuje stejně,

jak je uvedeno výše.

ALKALOIDY

Několik miligramů nebo předepsané množství zkoušené

látky se rozpustí v 5 ml vody R a přidává se kyselina chlorovodíková

zředěná RS do vzniku kyselé reakce (2.2.4). Potom

se přidá 1 ml jodobismutitanu draselného RS; ihned se

tvoří oranžová nebo oranžovočervená sraženina.

AMINY, PRIMÁRNÍ AROMATICKÉ

Předepsaný roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou

zředěnou RS a přidá se 0,2 ml dusitanu sodného RS. Po

1 min až 2 min se přidá 1 ml 2-naftolu RS; vznikne intenzivní

oranžové nebo červené zbarvení a obvykle sraženina

stejné barvy.

AMONNÉ SOLI

K předepsanému roztoku se přidá 0,2 g oxidu hořečnatého

R. Směs se probublává proudem vzduchu, který je vyveden

k povrchu směsi obsahující 1 ml kyseliny chlorovodíkové

0,1 mol/l RS a 0,05 ml červeně methylové RS; zbarvení

indikátoru se změní na žluté. Přidá se 1 ml čerstvě připraveného

roztoku hexanitrokobaltitanu sodného R (100 g/l);

vznikne žlutá sraženina.

AMONNÉ SOLI A SOLI TĚKAVÝCH BÁZÍ

Asi 20 mg zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo

se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidají se 2 ml hydroxidu

sodného zředěného RS. Zahříváním se z roztoku

uvolňují páry, které se mohou identifikovat svým pachem

a zásaditou reakcí (2.2.4).

ANTIMON

Asi 10 mg zkoušené látky se rozpustí mírným zahříváním

v 10 ml roztoku obsahujícího 0,5 g kalium-natrium-tartarátu

R a nechá se ochladit. Ke 2 ml tohoto roztoku nebo ke

2 ml předepsaného roztoku se po kapkách přidá sulfid sodný

RS; vznikne oranžovočervená sraženina, která se rozpustí

v přídavku hydroxidu sodného zředěného RS.

ARSEN

5 ml předepsaného roztoku se zahřívá na vodní lázni se

stejným objemem zkoumadla fosfornanového R; vznikne

hnědá sraženina.

BARBITURÁTY NESUBSTITUOVANÉ NA DUSÍKU

Asi 5 mg zkoušené látky se rozpustí ve 3 ml methanolu R,

přidá se 0,1 ml roztoku obsahujícího dusičnan kobaltnatý R

(100 g/l) a chlorid vápenatý R (100 g/l). Promíchá se a za

protřepávání se přidá 0,1 ml hydroxidu sodného zředěného

RS; vznikne fialovomodré zbarvení a sraženina.

BENZOÁTY

a) K 1 ml předepsaného roztoku zkoušené látky se přidá

0,5 ml chloridu železitého RS1; vznikne sytě žlutá sraženina,

dobře rozpustná v etheru R.

b) Jestliže není předepsáno jinak, převede se 0,2 g zkoušené

látky do zkumavky, navlhčí se 0,2 ml až 0,3 ml kyseliny

sírové R a dno zkumavky se mírně zahřívá;

na vnitřní stěně zkumavky se usazuje bílý sublimát.

c) 0,5 g zkoušené látky se rozpustí v 10 ml vody R nebo se

použije 10 ml předepsaného roztoku. Přidá se 0,5 ml kyseliny

chlorovodíkové R; tvoří se sraženina, která po

krystalizaci z teplé vody R a vysušení ve vakuu taje

(2.2.14) při 120 °C až 124 °C.

BISMUT

a) K 0,5 g zkoušené látky se přidá 10 ml kyseliny chlorovodíkové

zředěné RS nebo se použije 10 ml předepsaného

roztoku. Směs se zahřívá 1 min k varu, ochladí se

a v případě potřeby se zfiltruje. K 1 ml takto získaného

roztoku se přidá 20 ml vody R; vznikne bílá nebo světle

žlutá sraženina, která se po přidání 0,05 ml až 0,1 ml

sulfidu sodného RS barví hnědě.

b) K asi 45 mg zkoušené látky se přidá 10 ml kyseliny dusičné

zředěné RS nebo se použije 10 ml předepsaného

roztoku a 1 min se vaří. Nechá se ochladit a v případě

potřeby se zfiltruje. K 5 ml takto získaného roztoku se

přidají 2 ml roztoku thiomočoviny R (100 g/l); vznikne

žlutavě oranžové zbarvení nebo oranžová sraženina.

Přidají se 4 ml roztoku fluoridu sodného R (25 g/l); po

dobu 30 min se roztok neodbarví.

BROMIDY

a) Množství zkoušené látky odpovídající asi 3 mg bromidů

(Br – ) se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného

roztoku. Okyselí se kyselinou dusičnou zředěnou

RS, přidá se 0,4 ml dusičnanu stříbrného RS1 a po

protřepání se nechá stát; vznikne tvarohovitá, světle žlutá

sraženina. Po odstředění se sraženina promyje třikrát

1 ml vody R. Tento postup se provádí rychle za chránění

před přímým světlem. Supernatantní tekutina nemusí být

úplně čirá. Sraženina se suspenduje ve 2 ml vody R a přidá

se 1,5 ml amoniaku R; sraženina se těžce rozpouští.

Zkušební

metody

2.3

ČL 2017 – Dopl. 2020 219


b) Množství zkoušené látky odpovídající asi 5 mg bromidů

(Br – ) nebo její předepsané množství se převede do malé

zkumavky. Přidá se 0,25 ml vody R, asi 75 mg oxidu

olovičitého R, 0,25 ml kyseliny octové R a mírně se protřepe.

Horní vnitřní část zkumavky se vysuší kouskem

filtračního papíru a směs se nechá 5 min stát. Špička

pruhu filtračního papíru vhodné velikosti se impregnuje

namočením špičky do kapky fuchsinu RS a vloží se ihned

do zkumavky. Počínaje špičkou vznikne do 10 s

fialové zbarvení dobře rozlišitelné od červeného zbarvení

fuchsinu, které může být viditelné na malé ploše

horní části papírového pruhu.

CITRÁTY

Množství zkoušené látky odpovídající asi 50 mg kyseliny

citronové se rozpustí v 5 ml vody R nebo se použije 5 ml

předepsaného roztoku. Přidá se 0,5 ml kyseliny sírové R

a 1 ml manganistanu draselného RS a zahřívá se tak dlouho,

dokud barva manganistanu draselného nezmizí. Přidá se

0,5 ml roztoku nitroprussidu sodného R (100 g/l) v kyselině

sírové zředěné RS a 4 g kyseliny amidosírové R. Alkalizuje

se po kapkách amoniakem koncentrovaným R tak dlouho,

až se kyselina amidosírová rozpustí. Přidá se nadbytek

amoniaku koncentrovaného R; vzniká fialové zbarvení, které

se mění na fialovomodré.

DRASLÍK

a) 0,1 g zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se

použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml uhličitanu

sodného RS a zahřívá se; nevznikne sraženina.

K ještě horkému roztoku se přidá 0,05 ml sulfidu sodného

RS; nevznikne sraženina. Po ochlazení ve vodě

s ledem se přidají 2 ml roztoku kyseliny vinné R (150 g/l)

a nechá se stát; vznikne bílá krystalická sraženina.

b) 40 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml vody R nebo se

použije 1 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml kyseliny

octové zředěné RS a 1 ml čerstvě připraveného roztoku

hexanitrokobaltitanu sodného R (100 g/l); ihned

vznikne žlutá nebo oranžovožlutá sraženina.

DUSIČNANY (NITRÁTY)

Ke směsi 0,1 ml nitrobenzenu R a 0,2 ml kyseliny sírové R

se přidá množství zkoušené práškované látky odpovídající

asi 1 mg dusičnanů (NO3 – ) nebo její předepsané množství.

Nechá se stát 5 min, ochladí se ve vodě s ledem a pomalu

za míchání se přidá 5 ml vody R, potom 5 ml hydroxidu

sodného koncentrovaného RS. Po přidání 5 ml acetonu R se

protřepe a nechá stát; horní vrstva se zbarví tmavě fialově.

ESTERY

K asi 30 mg zkoušené látky nebo k jejímu předepsanému

množství se přidá 0,5 ml roztoku hydroxylamin-hydrochloridu

R (70 g/l) v methanolu R a 0,5 ml roztoku hydroxidu

draselného R (100 g/l) v ethanolu 96% R. Zahřívá se

k varu, po ochlazení se okyselí kyselinou chlorovodíkovou

zředěnou RS a přidá se 0,2 ml desetkrát zředěného chloridu

železitého RS1; vznikne modročervené nebo červené

zbarvení.

FOSFOREČNANY, ORTHOFOSFOREČNANY

(FOSFÁTY)

a) 5 ml předepsaného roztoku se v případě potřeby neutralizuje

a přidá se 5 ml dusičnanu stříbrného RS1; vznikne

žlutá sraženina, jejíž barva se varem nezmění a po

přidání amoniaku R se rozpustí.

b) 1 ml předepsaného roztoku se smíchá se 2 ml zkoumadla

molybdenan-vanadičného R; vzniká žluté zbarvení.

HLINÍK


se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidá se asi 0,5 ml

kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a asi 0,5 ml zkoumadla

thioacetamidového R; sraženina nevznikne. Potom se přidává

po kapkách hydroxid sodný zředěný RS; vznikne bílá

gelovitá sraženina, která se dalším přidáváním hydroxidu

sodného zředěného RS rozpouští. Postupně se přidává chlorid

amonný RS; znovu vznikne bílá gelovitá sraženina.

HOŘČÍK


se použijí 2 ml předepsaného roztoku a přidá se 1 ml amoniaku

zředěného RS1; vznikne bílá sraženina, která se rozpustí

po přidání 1 ml chloridu amonného RS. Přidá se 1 ml

hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu RS; vznikne

bílá krystalická sraženina.

CHLORIDY

a) Množství zkoušené látky odpovídající asi 2 mg chloridů

(Cl – ) se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného

roztoku a okyselí se kyselinou dusičnou zředěnou

RS. Přidá se 0,4 ml dusičnanu stříbrného RS1, protřepe

se a nechá stát; vznikne tvarohovitá bílá sraženina.

Po odstředění se sraženina promyje třikrát 1 ml vody R.

Tento postup se provádí rychle za chránění před přímým

světlem. Supernatantní tekutina nemusí být úplně čirá.

Sraženina se suspenduje ve 2 ml vody R a přidá se 1,5 ml

amoniaku R; sraženina se snadno rozpustí, kromě velkých

částic, které se rozpouštějí pomalu.

b) K množství zkoušené látky odpovídajícímu asi 15 mg

chloridů (Cl – ) nebo k předepsanému množství ve zkumavce

se přidá 0,2 g dichromanu draselného R a 1 ml

kyseliny sírové R. Proužek filtračního papíru impregnovaný

0,1 ml difenylkarbazidu RS se barví nad otevřenou

zkumavkou fialovočerveně. Impregnovaný papír nesmí

přijít do styku s dichromanem draselným.

JODIDY

a) Množství zkoušené látky odpovídající asi 4 mg jodidů

(I – ) se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí

2 ml předepsaného roztoku, okyselí se kyselinou dusičnou

zředěnou RS, přidá se 0,4 ml dusičnanu stříbrného

RS1, protřepe se a nechá stát; vznikne tvarohovitá,

světle žlutá sraženina. Po odstředění se sraženina

promyje třikrát 1 ml vody R. Tento postup se

provádí rychle za chránění před přímým světlem. Supernatantní

tekutina nemusí být úplně čirá. Sraženina

se suspenduje ve 2 ml vody R, přidá se 1,5 ml amoniaku

R; sraženina se nerozpustí.

b) K 0,2 ml roztoku zkoušené látky obsahující asi 5 mg jodidů

(I – ) v mililitru nebo k 0,2 ml předepsaného roztoku se

přidá 0,5 ml kyseliny sírové zředěné RS, 0,1 ml dichromanu

draselného RS, 2 ml vody R a 2 ml chloroformu R. Několik

sekund se protřepává, potom se nechá stát; chloroformová

vrstva se barví fialově nebo fialovočerveně.

220 ČL 2017 – Dopl. 2020


KŘEMIČITANY

Předepsané množství zkoušené látky se v olověném nebo

platinovém kelímku pomocí měděného drátku smíchá s asi

10 mg fluoridu sodného R a s několika kapkami kyseliny sírové

R na řídkou kaši. Přikryje se průhlednou plastovou

deskou, na jejíž spodní straně visí kapka vody R. Mírně se

zahřívá a v krátkém čase se vytvoří kolem kapky vody R bílý

prstenec.

LAKTÁTY

Množství zkoušené látky odpovídající asi 5 mg kyseliny

mléčné se rozpustí v 5 ml vody R nebo se použije 5 ml předepsaného

roztoku, přidá se 1 ml bromové vody R a 0,5 ml

kyseliny sírové zředěné RS. Zahřívá se na vodní lázni do

odbarvení za občasného míchání skleněnou tyčinkou. Přidají

se 4 g síranu amonného R a promíchá se. Po kapkách

a bez míchání se přidá 0,2 ml roztoku nitroprussidu sodného

R (100 g/l) v kyselině sírové zředěné RS, potom se bez

míchání přidá 1 ml amoniaku koncentrovaného R a nechá

se 30 min stát; na rozhraní dvou kapalin se objeví tmavozelený

prstenec.

OLOVO

a) 0,1 g zkoušené látky se rozpustí v 1 ml kyseliny octové

R nebo se použije 1 ml předepsaného roztoku a přidají

se 2 ml chromanu draselného RS; vznikne žlutá

sraženina, která se rozpustí po přidání 2 ml hydroxidu

sodného koncentrovaného RS.

b) 50 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml kyseliny octové

R nebo se použije 1 ml předepsaného roztoku,

přidá se 10 ml vody R a 0,2 ml jodidu draselného RS;

vznikne žlutá sraženina, zahřívá se k varu po dobu

1 min až 2 min, sraženina se rozpustí. Po ochlazení

vznikne znovu sraženina v podobě lesklých žlutých

destiček.

RTUŤ

a) 0,1 ml roztoku zkoušené látky se kápne na oškrabaný,

lesklý měděný plíšek. Vznikne tmavošedá skvrna, která

třením zjasní. Plíšek se vysuší a zahřívá ve zkumavce;

skvrna zmizí.

b) K předepsanému roztoku se přidá hydroxid sodný zředěný

RS do silně alkalické reakce (2.2.4); vznikne hustá

žlutá sraženina (rtuťnaté soli).

SALICYLÁTY

a) K 1 ml předepsaného roztoku se přidá 0,5 ml chloridu

železitého RS1; vznikne fialové zbarvení, které se přidáním

0,1 ml kyseliny octové R nezmění.

b) 0,5 g zkoušené látky se rozpustí v 10 ml vody R nebo se

použije 10 ml předepsaného roztoku a přidá se 0,5 ml

kyseliny chlorovodíkové R; vzniklá sraženina po překrystalizování

z horké vody R a vysušení ve vakuu taje

(2.2.14) při 156 °C až 161 °C.

SÍRANY (SULFÁTY)

a) Asi 45 mg zkoušené látky se rozpustí v 5 ml vody R nebo

se použije 5 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml

kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 1 ml chloridu

barnatého RS1; vznikne bílá sraženina.

b) K suspenzi získané ve zkoušce a) se přidá 0,1 ml jodu

0,05 mol/l RS; suspenze zůstává žlutá (rozdíl od siřičitanů

a hydrogensiřičitanů), ale odbarvuje se, jestliže se

po kapkách přidává chlorid cínatý RS (rozdíl od jodičnanů).

Směs se povaří; nevznikne barevná sraženina

(rozdíl od selenanů a wolframanů).

SODÍK

a) Asi 0,1 g zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo

se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidají se 2 ml

roztoku uhličitanu draselného R (150 g/l) a zahřívá se

k varu; sraženina se netvoří. Přidají se 4 ml hexahydroxoantimoničnanu

draselného RS a zahřívá se k varu.

Ochladí se ve vodě s ledem a podle potřeby se tře vnitřní

stěna zkumavky skleněnou tyčinkou; vznikne hustá

bílá sraženina.

b) Množství zkoušené látky odpovídající asi 2 mg sodíku

(Na + ) se rozpustí v 0,5 ml vody R nebo se použije 0,5 ml

předepsaného roztoku, přidá se 1,5 ml zkoumadla methoxyfenyloctového

R a 30 min se chladí ve vodě

s ledem; vznikne objemná bílá krystalická sraženina,

která se převede do vody při 20 °C a po 5 min míchání

se rozpustí. Přidá se 1 ml amoniaku zředěného RS1;

sraženina se zcela rozpustí; přidá se 1 ml uhličitanu

amonného RS ; sraženina znovu nevznikne.

STŘÍBRO

Asi 10 mg zkoušené látky se rozpustí v 10 ml vody R nebo

se použije 10 ml předepsaného roztoku a přidá se 0,3 ml

kyseliny chlorovodíkové R1; vznikne tvarohovitá bílá sraženina,

která se rozpustí po přidání 3 ml amoniaku zředěného

RS1.

UHLIČITANY A HYDROGENUHLIČITANY

0,1 g zkoušené látky se suspenduje ve zkumavce se 2 ml

vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidají

se 3 ml kyseliny octové zředěné RS, zkumavka se rychle

uzavře provrtanou zátkou, ve které je skleněná trubička ohnutá

dvakrát do pravého úhlu. Roztok nebo suspenze šumí

a vyvíjí se plyn bez barvy a pachu. Po mírném zahřátí se

plyn zavádí do 5 ml hydroxidu barnatého RS; vznikne bílá

sraženina, která se rozpouští po přidání nadbytku kyseliny

chlorovodíkové R1.

VÁPNÍK

a) K 0,2 ml neutrálního roztoku zkoušené látky obsahujícího

asi 0,2 mg vápníku (Ca 2+ ) v mililitru nebo k 0,2 ml

předepsaného roztoku se přidá 0,5 ml roztoku glyoxalbishydroxyanilu

R (2 g/l) v ethanolu 96% R, 0,2 ml hydroxidu

sodného zředěného RS a 0,2 ml uhličitanu sodného

RS. Protřepe se s 1 ml až 2 ml chloroformu R

a přidá se 1 ml až 2 ml vody R; chloroformová vrstva se

zbarví červeně.

b) Asi 20 mg zkoušené látky nebo její předepsané množství

se rozpustí v 5 ml kyseliny octové R a přidá se

0,5 ml hexakyanidoželeznatanu draselného RS; roztok

zůstane čirý. Po přidání asi 50 mg chloridu amonného R

vznikne bílá krystalická sraženina.

TARTARÁTY

a) Asi 15 mg zkoušené látky se rozpustí v 5 ml vody R nebo

se použije 5 ml předepsaného roztoku. Přidá se

0,05 ml roztoku síranu železnatého R (10 g/l) a 0,05 ml

peroxidu vodíku zředěného RS; vznikne nestálé žluté

Zkušební

metody

2.3

ČL 2017 – Dopl. 2020 221

2.3.2 TOTOŽNOST MASTNÝCH OLEJŮ TENKOVRSTVOU CHROMATOGRAFIÍ

zbarvení. Po vymizení zbarvení se po kapkách přidává

hydroxid sodný zředěný RS; vznikne fialové nebo purpurové

zbarvení.

b) K 0,1 ml roztoku zkoušené látky obsahujícího asi 15 mg

kyseliny vinné v 1 ml nebo k 0,1 ml předepsaného roztoku

se přidá 0,1 ml roztoku bromidu draselného R

(100 g/l), 0,1 ml roztoku resorcinolu R (20 g/l) a 3 ml

kyseliny sírové R. Zahřívá se na vodní lázni 5 min až

10 min; vzniká tmavě modré zbarvení. Nechá se ochladit

a roztok se nalije do vody R; zbarvení se změní na

červené.

XANTHINY

K několika miligramům zkoušené látky nebo k jejímu předepsanému

množství se přidá 0,1 ml peroxidu vodíku koncentrovaného

R a 0,3 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné

RS. Zahřívá se na vodní lázni do sucha, až se získá žlutočervený

zbytek. Přidá se 0,1 ml amoniaku zředěného

RS2; zbarvení zbytku se změní na fialovočervené.

ZINEK

0,1 g zkoušené látky se rozpustí v 5 ml vody R nebo se použije

5 ml předepsaného roztoku. Přidá se 0,2 ml hydroxidu

sodného koncentrovaného RS; vznikne bílá sraženina, která

se po přidání dalších 2 ml hydroxidu sodného koncentrovaného

RS rozpustí. Přidá se 10 ml chloridu amonného RS;

roztok zůstává čirý. Přidá se 0,1 ml sulfidu sodného RS;

vznikne vločkovitá bílá sraženina.

ŽELEZO

a) Množství zkoušené látky odpovídající asi 10 mg železa

(Fe 2+ ) se rozpustí v 1 ml vody R nebo se použije 1 ml

předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml roztoku hexakyanidoželezitanu

draselného RS; vznikne modrá sraženina,

která se přidáním 5 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné

RS nerozpouští.

b) Množství zkoušené látky odpovídající asi 1 mg železa

(Fe 3+ ) se rozpustí ve 30 ml vody R. Ke 3 ml tohoto roztoku

nebo ke 3 ml předepsaného roztoku se přidá 1 ml

kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 1 ml thiokyanatanu

draselného RS; roztok se zbarví červeně. Z roztoku

se oddělí dvě části, každá o obsahu 1 ml. K první části

se přidá 5 ml isoamylalkoholu R nebo 5 ml etheru R,

protřepe se a nechá se stát; organická vrstva se zbarví

růžově. Ke druhé části roztoku se přidají 2 ml chloridu

rtuťnatého RS; červené zbarvení zmizí.

c) Množství zkoušené látky odpovídající nejméně 1 mg

železa (Fe 3+ ) se rozpustí v 1 ml vody R nebo se použije

1 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml hexakyanidoželeznatanu

draselného RS; vznikne modrá sraženina,

která se přidáním 5 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné

RS nerozpouští.

2.3.2 TOTOŽNOST MASTNÝCH OLEJŮ

TENKOVRSTVOU CHROMATOGRAFIÍ

9.8:20302

METODA A

Tenkovrstvá chromatografie (2.2.27).

Zkoušený roztok. Není-li předepsáno jinak, rozpustí se asi

20 mg (1 kapka) mastného oleje ve 3 ml dichlormethanu R.

Porovnávací roztok. Asi 20 mg (1 kapka) oleje kukuřičného

R se rozpustí ve 3 ml dichlormethanu R.

Stacionární fáze. Deska s vrstvou vhodného oktadecylsilylovaného

silikagelu pro vysokoúčinnou tenkovrstvou chromatografii.

Mobilní fáze:

– mobilní fáze A: ether R;

– mobilní fáze B: směs objemových dílů dichlormethanu R,

kyseliny octové ledové R a acetonu R (20 + 40 + 50).

Nanášení. 1 µl.

Vyvíjení. Mobilní fází A dvakrát po dráze 0,5 cm, potom

mobilní fází B dvakrát po dráze 8 cm.

1 = podzemnicový olej 7 = lněný olej 13 = pupalkový olej

2 = sezamový olej 8 = olivový olej 14 = světlicový olej (typ I)

3 = kukuřičný olej 9 = slunečnicový olej 15 = světlicový olej (typ II)

4 = řepkový olej 10 = mandlový olej 16 = hydrogenovaný podzemnicový olej

5 = sójový olej 11 = olej z pšeničných klíčků

6 = řepkový olej (prostý kyseliny erukové) 12 = brutnákový olej

Obr. 2.3.2-1 Chromatogramy k určení totožnosti mastných olejů (metoda A)

222 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.3.3 TOTOŽNOST FENOTHIAZINOVÝCH DERIVÁTŮ TENKOVRSTVOU CHROMATOGRAFIÍ

Zkušební

metody

2.3

1 = podzemnicový olej 7 = lněný olej 13 = pupalkový olej

2 = sezamový olej 8 = olivový olej 14 = světlicový olej (typ I)

3 = kukuřičný olej 9 = slunečnicový olej 15 = světlicový olej (typ II)

4 = řepkový olej 10 = mandlový olej 16 = hydrogenovaný podzemnicový olej

5 = sójový olej 11 = olej z pšeničných klíčků

6 = řepkový olej (prostý kyseliny erukové) 12 = brutnákový olej

Obr. 2.3.2-2 Chromatogramy k určení totožnosti mastných olejů (metoda B)

Sušení. Na vzduchu.

Detekce. Vrstva se postříká roztokem kyseliny fosfomolybdenové

R (100 g/l) v ethanolu 96% R, zahřívá se asi 3 min

při 120 °C a pozoruje se v denním světle.

Na získaném chromatogramu jsou charakteristické skvrny

srovnatelné se skvrnami na obrázku 2.3.2-1.

METODA B

Tenkovrstvá chromatografie (2.2.27).

Zkoušený roztok. Není-li předepsáno jinak, rozpustí se asi

20 mg (1 kapka) mastného oleje ve 3 ml dichlormethanu R.

Porovnávací roztok. Asi 20 mg (1 kapka) oleje kukuřičného

R se rozpustí ve 3 ml dichlormethanu R.

Stacionární fáze. Deska s vrstvou vhodného oktadecylsilylovaného

silikagelu pro vysokoúčinnou tenkovrstvou chromatografii.

Mobilní fáze. Směs objemových dílů dichlormethanu R,

kyseliny octové ledové R a acetonu R (20 + 40 + 50).

Nanášení. 1 µl do 8mm proužků; může se použít vhodné

automatické zařízení.

Vyvíjení. Po dráze 7 cm.

Sušení. Na vzduchu.

Detekce. Vrstva se postříká roztokem kyseliny fosfomolybdenové

R (100 g/l) v ethanolu 96% R, zahřívá se asi 3 min

při 120 °C a pozoruje se v denním světle.

Na získaném chromatogramu jsou charakteristické skvrny

srovnatelné se skvrnami na obrázku 2.3.2-2.

2.3.3 TOTOŽNOST FENOTHIAZINOVÝCH

DERIVÁTŮ TENKOVRSTVOU

CHROMATOGRAFIÍ

6.0:20303

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití

vrstvy křemeliny G R impregnované takto: Deska s vrstvou

se postaví v uzavřené chromatografické komoře do potřebného

množství impregnační směsi obsahující fenoxyethanol

R 10 % (V/V) a makrogol 300 R (50 g/l) v acetonu R

tak, aby deska s vrstvou byla ponořena asi 5 mm pod povrch

kapaliny. Když impregnační směs dosáhne nejméně

17 cm od dolního okraje vrstvy, deska s vrstvou se vyjme

a ihned se použije. Vyvíjení chromatogramů při zkoušce se

provede ve stejném směru jako impregnace.

Zkoušený roztok. 20 mg zkoušené látky se rozpustí v chloroformu

R a zředí se jím na 10 ml.

Porovnávací roztok. 20 mg odpovídající referenční látky

(CRL) se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 10 ml.

Na vrstvu se nanesou 2 µl každého roztoku a vyvíjí se ve

tmě po dráze 15 cm směsí 10 ml petroletheru R a 1 ml diethylaminu

R nasycenou fenoxyethanolem R (tj. asi 3 ml

až 4 ml fenoxyethanolu R se přidají k výše uvedené směsi

rozpouštědel, protřepe se a po oddělení vrstev se použije

horní vrstva, i když je zakalená). Po vyjmutí z komory se

deska s vrstvou vystaví na několik minut působení ultrafialového

světla při 365 nm a po několika minutách se

hodnotí.

Skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá

polohou, fluorescencí a velikostí skvrně na chromatogramu

porovnávacího roztoku. Vrstva se postříká roztokem kyseliny

sírové R 10% (V/V) v ethanolu 96% R. Skvrna na chromatogramu

zkoušeného roztoku odpovídá zbarvením skvrně

na chromatogramu porovnávacího roztoku. Zbarvení

skvrn je stálé po dobu nejméně 20 min.

2.3.4 PACH

6.0:20304

0,5 g až 2,0 g zkoušené látky se rozetře v tenké vrstvě na

hodinové sklíčko o průměru 6 cm až 8 cm. Po 15 min se

určí pach nebo se ověří jeho nepřítomnost.

ČL 2017 – Dopl. 2020 223

2.4.1 AMONIUM

2.4 LIMITNÍ ZKOUŠKY

2.4.1 AMONIUM

8.0:20401

Pokud není předepsáno jinak, použije se metoda A.

METODA A

Předepsaný roztok se převede do zkumavky nebo se předepsané

množství zkoušené látky rozpustí ve zkumavce ve

14 ml vody R. Je-li třeba, upraví se hodnota pH roztoku

hydroxidem sodným zředěným RS do alkalické reakce, zředí

se vodou R na 15 ml a přidá se 0,3 ml tetrajodidortuťnatanu

draselného alkalického RS. Současně se připraví porovnávací

roztok smícháním 10 ml standardního roztoku amonia

(1 µg NH4/ml) R, 5 ml vody R a 0,3 ml tetrajodidortuťnatanu

draselného alkalického RS. Zkumavky se uzavřou.

Po 5 min není žluté zbarvení zkoušeného roztoku intenzivnější

než zbarvení porovnávacího roztoku.

METODA B

Předepsané množství jemně práškované zkoušené látky se

ve vhodné 25ml skleněné nádobce s polyethylenovým uzávěrem

rozpustí nebo suspenduje v 1 ml vody R a přidá se

0,30 g oxidu hořečnatého těžkého R. Pod uzávěr se umístí

papír se síranem manganatým a dusičnanem stříbrným R

velikosti čtverce o straně 5 mm navlhčený několika kapkami

vody R a ihned se uzavře polyethylenovým uzávěrem.

Opatrně se promíchá krouživým pohybem tak, aby tekutina

nevystříkla, a nechá se 30 min stát při 40 °C. Jestliže se papír

se síranem manganatým a dusičnanem stříbrným R

zbarví šedě, není toto zbarvení intenzivnější než zbarvení

papíru se síranem manganatým a dusičnanem stříbrným R

vzniklé s porovnávacím roztokem, připraveným současně

stejným způsobem za použití předepsaného objemu standardního

roztoku amonia (1 µg NH4/ml) R, 1 ml vody R

a 0,30 g oxidu hořečnatého těžkého R.

2.4.2 ARSEN

9.4:20402

METODA A

Aparatura pro stanovení arsenu (viz obrázek 2.4.2-1) se

skládá ze 100ml kuželové baňky se zabroušenou skleněnou

zátkou, kterou prochází skleněná trubice délky asi 200 mm

a vnitřního průměru asi 5 mm. Dolní část této trubice je zúžena

na vnitřní průměr 1,0 mm a asi 20 mm od jejího konce

je boční otvor o průměru 2 mm až 3 mm. Pokud je trubice

umístěna ve stojanu, boční otvor je nejméně 3 mm pod dolním

okrajem zátky. Druhá skleněná trubice o stejném vnitřním

průměru je spojena s první trubicí. Druhá trubice je

dvakrát ohnutá do pravého úhlu a volný konec trubice je

zúžen na vnitřní průměr 1 mm. Tento konec se umístí do

zkumavky obsahující 3,0 ml argentum-diethyldithiokarbamátu

RS. Je možné použít i jinou vhodnou aparaturu.

Do první trubice se vloží 50 mg až 60 mg mírně smotaného

chomáčku vaty s plumbum(II)-acetátem R nebo malý chomáček

vaty a 50 mg až 60 mg stočeného pruhu papíru

s plumbum(II)-acetátem R.

A = vata/papír s plumbum(II)-acetátem

Obr. 2.4.2-1 Aparatura pro limitní zkoušku A na arsen


Předepsané množství zkoušené látky se v kuželové baňce

rozpustí ve 25 ml vody R nebo se předepsané množství roztoku

zředí vodou R na 25 ml. Přidá se 15 ml kyseliny chlorovodíkové

R, 0,1 ml chloridu cínatého RS a 5 ml jodidu

draselného RS. Po 15min stání se přidá 5 g zinku aktivovaného

R, ihned se obě části přístroje spojí a kuželová baňka

se ponoří do vodní lázně o teplotě, která umožňuje udržovat

stejnoměrný vývoj plynu. Stejným způsobem se připraví

porovnávací roztok za použití 1 ml standardního roztoku

arsenu (1 µg As/ml) R zředěného vodou R na 25 ml.

V případě pěnění, může se do reakční nádoby přidat 1 ml

propan-2-olu R.

Zbarvení získané ve zkumavce se zkoušeným roztokem není

po nejméně 2 h intenzivnější než zbarvení získané s porovnávacím

roztokem.

Test způsobilosti. Roztok získaný ve zkumavce s porovnávacím

roztokem je zbarvený přinejmenším tak, jako 3 ml

směsi 3,0 ml žlutého základního roztoku, 0,6 ml červeného

základního roztoku a 11,40 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové

R (10 g/l HCl) (2.2.2, Metoda I).

METODA B

Do zkumavky se 4 ml kyseliny chlorovodíkové R a asi 5 mg

jodidu draselného R se přidá předepsané množství zkoušené

látky a 3 ml zkoumadla fosfornanového R. Směs se zahřívá

15 min na vodní lázni za občasného protřepání. Stejným

způsobem se připraví porovnávací roztok za použití

0,5 ml standardního roztoku arsenu (10 µg As/ml) R.

224 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.3 VÁPNÍK

Po zahřátí na vodní lázni není zbarvení získané ve zkumavce

se zkoušeným roztokem intenzivnější než zbarvení získané

s porovnávacím roztokem.

2.4.3 VÁPNÍK

8.0:20403

Všechny roztoky použité v této zkoušce se připravují z vody

destilované R.

K 0,2 ml standardního roztoku vápníku (100 µg Ca/ml)

v ethanolu R se přidá 1 ml amonium-oxalátu RS. Po 1 min

se přidá směs 1 ml kyseliny octové zředěné RS a 15 ml předepsaného

roztoku nebo roztoku obsahujícího předepsané

množství zkoušené látky a protřepe se.

Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití

směsi 10 ml vodného standardního roztoku vápníku

(10 µg Ca/ml) R, 1 ml kyseliny octové zředěné RS a 5 ml

vody destilované R.

Po 15 min se zkoušený roztok nezakalí intenzivněji než porovnávací

roztok.

Zkušební

metody

2.4

2.4.4 CHLORIDY

6.0:20404

K 15 ml zkoušeného roztoku se přidá 1 ml kyseliny dusičné

zředěné RS a směs se najednou přelije do zkumavky obsahující

1 ml dusičnanu stříbrného RS2.

Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití

10 ml standardního roztoku chloridů (5 µg Cl/ml) R

a 5 ml vody R. Zkumavky se pozorují ze strany proti černému

matnému pozadí.

Po 5 min stání za chránění před světlem neopalizuje zkoušený

roztok intenzivněji než porovnávací roztok.

2.4.5 FLUORIDY

6.0:20405

Do vnitřní zkumavky přístroje na stanovení fluoridů (viz

obrázek 2.4.5-1) se vpraví předepsané množství zkoušené

látky, 0,1 g kyselinou promytého písku R a 20 ml směsi složené

ze stejných objemových dílů kyseliny sírové R

a vody R. Pak se zahřeje vnější zkumavka obsahující tetrachlorethan

R k varu (146 °C) a při této teplotě se udržuje.

Zahřívá se vyvíječ páry, destiluje se a destilát se zachytává

ve 100ml odměrné baňce obsahující 0,3 ml hydroxidu sodného

0,1 mol/l RS a 0,1 ml fenolftaleinu RS. Během destilace

se ve vnitřní zkumavce udržuje konstantní objem (20 ml)

a v případě potřeby se zajistí přídavkem hydroxidu sodného

0,1 mol/l VS, aby destilát zůstal alkalický. Destilát se zředí

vodou R na 100 ml (zkoušený roztok). Stejným způsobem

se připraví porovnávací roztok za použití 5 ml standardního

roztoku fluoridů (10 µg F/ml) R místo zkoušené látky.

Do dvou skleněných odměrných válců se zabroušenou skleněnou

zátkou se vpraví po 20 ml zkoušeného a porovnávacího

roztoku a po 5 ml zkoumadla aminomethylalizarindioctového

R.

Po 20 min není modré zbarvení zkoušeného roztoku (původně

červené) intenzivnější než zbarvení porovnávacího

roztoku.

Obr. 2.4.5-1 Přístroj pro limitní zkoušku na fluoridy


2.4.6 HOŘČÍK

6.0:20406

K 10 ml předepsaného roztoku se přidá 0,1 g tetraboritanu

sodného R. Je-li třeba, upraví se pH roztoku kyselinou chlorovodíkovou

zředěnou RS nebo hydroxidem sodným zředěným

RS na hodnotu 8,8 až 9,2. Potom se roztok převede do

dělicí nálevky a vytřepává se postupně dvakrát 1 min vždy

s 5 ml roztoku hydroxychinolinu R (1 g/l) v chloroformu R

a nechá se stát. Po oddělení se organická vrstva odstraní

a k vodné vrstvě se přidá 0,4 ml butylaminu R a 0,1 ml

triethanolaminu R. Je-li třeba, upraví se pH roztoku na

hodnotu 10,5 až 11,5. Přidají se 4 ml roztoku hydroxychinolinu

R (1 g/l) v chloroformu R, opět se vytřepává 1 min a

nechá se oddělit. K hodnocení se použije dolní vrstva. Současně

se stejným způsobem připraví porovnávací roztok za

použití 1 ml standardního roztoku hořčíku (10 µg Mg/ml) R

a 9 ml vody R.

Zkoušený roztok se nezbarví intenzivněji než porovnávací

roztok.

ČL 2017 – Dopl. 2020 225

2.4.7 HOŘČÍK A KOVY ALKALICKÝCH ZEMIN

2.4.7 HOŘČÍK A KOVY

ALKALICKÝCH ZEMIN

6.0:20407

Ke 200 ml vody R se přidá 0,1 g hydroxylamin-hydrochloridu

R, 10 ml tlumivého roztoku s chloridem amonným

o pH 10,0 R, 1 ml síranu zinečnatého 0,1 mol/l VS a asi

15 mg černi eriochromové T s chloridem sodným R. Zahřeje

se na asi 40 °C a titruje se dinatrium-edetátem

0,01 mol/l VS do změny fialového zbarvení na jasně modré.

Pak se přidá předepsané množství zkoušené látky rozpuštěné

ve 100 ml vody R nebo předepsaného roztoku. Jestliže se

zbarvení roztoku po přidání zkoušené látky změnilo zpět na

fialové, titruje se dále dinatrium-edetátem 0,01 mol/l VS

opět do modrého zbarvení.

Spotřeba roztoku dinatrium-edetátu 0,01 mol/l VS při druhé

titraci není vyšší, než je předepsáno.

2.4.8 TĚŽKÉ KOVY

6.8:20408

Metody popsané dále používají zkoumadlo thioacetamidové

R. Jako alternativa je obvykle vhodné použití sulfidu

sodného RS1 (0,1 ml). Jestliže se místo zkoumadla thioacetamidového

R, jak je předepsáno v článcích, použije

sulfid sodný RS1, je nezbytné také pro metody A, B a H

zařadit monitorovací roztok připravený z předepsaného

množství zkoušené látky, ke které se přidá stejný objem

standardního roztoku olova předepsaného pro přípravu porovnávacího

roztoku. Zkoušku nelze hodnotit, jestliže monitorovací

roztok není nejméně stejně intenzivní jako porovnávací

roztok.

METODA A

Zkoušený roztok. 12 ml předepsaného vodného roztoku

zkoušené látky.

Porovnávací roztok. Směs 10 ml standarního roztoku olova

(1 µg Pb/ml) R nebo standarního roztoku olova

(2 µg Pb/ml) R, jak je předepsáno, a 2 ml předepsaného

vodného roztoku zkoušené látky.

Kontrolní roztok. Směs 10 ml vody R a 2 ml předepsaného

vodného roztoku zkoušené látky.

Ke každému roztoku se přidají 2 ml tlumivého roztoku

o pH 3,5 R. Promíchá se, přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového

R a ihned se promíchá. Roztoky se hodnotí

po 2 min.

Test způsobilosti. Porovnávací roztok vykazuje světle hnědé

zbarvení ve srovnání s kontrolním roztokem.

Hodnocení. Případné hnědé zbarvení zkoušeného roztoku

není intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

Jestliže nelze posoudit výsledek, zfiltrují se roztoky přes

vhodný membránový filtr (jmenovitá velikost pórů

0,45 μm). Filtrace se provádí pomalu a rovnoměrně mírným

a stálým tlakem na píst. Porovnají se skvrny na filtrech

získaných s jednotlivými roztoky.

METODA B

Zkoušený roztok. 12 ml předepsaného roztoku zkoušené

látky rozpuštěné v organickém rozpouštědle obsahujícím

minimální procento vody (např. dioxan obsahující 15 %

vody nebo aceton obsahující 15 % vody).

Porovnávací roztok. Směs 10 ml standardního roztoku olova

(1 µg Pb/ml nebo 2 µg Pb/ml), jak je předepsáno, a 2 ml

předepsaného roztoku zkoušené látky v organickém rozpouštědle.

Standardní roztok olova (1 µg Pb/ml nebo

2 µg Pb/ml) se připraví zředěním standardního roztoku

olova (100 µg Pb/ml) R rozpouštědlem použitým pro zkoušenou

látku.

Kontrolní roztok. Směs 10 ml rozpouštědla použitého pro

zkoušenou látku a 2 ml předepsaného roztoku zkoušené

látky v organickém rozpouštědle.




po 2 min.

Test způsobilosti. Porovnávací roztok vykazuje světle hnědé

zbarvení ve srovnání s kontrolním roztokem.



Jestliže nelze posoudit výsledek, roztoky se zfiltrují přes



a stálým tlakem na píst. Porovnají se skvrny na filtrech


METODA C

Zkoušený roztok. Předepsané množství zkoušené látky (nejvýše

2 g) se převede do křemenného kelímku se 4 ml roztoku

síranu hořečnatého R (250 g/l) v kyselině sírové zředěné

RS. Směs se promíchá jemnou skleněnou tyčinkou

a opatrně se zahřívá. Jestliže směs je kapalina, opatrně se

odpaří do sucha na vodní lázni. Za stoupající teploty se zahřívá

a žíhá tak dlouho, až je zbytek bílý nebo nejvýše našedlý.

Žíhání se provádí při teplotě nepřevyšující 800 °C.

Nechá se ochladit a zbytek se zvlhčí několika kapkami kyseliny

sírové zředěné RS, odpaří se, znovu se žíhá a nechá

se ochladit. Celková doba žíhání nesmí přesáhnout 2 h.

Zbytek se převede dvakrát 5 ml kyseliny chlorovodíkové

zředěné RS do zkumavky. Přidá se 0,1 ml fenolftaleinu RS

a potom amoniak koncentrovaný R do vzniku růžového

zbarvení. Po ochlazení se přidá kyselina octová ledová R do

odbarvení roztoku a ještě navíc 0,5 ml. Je-li třeba, zfiltruje

se a filtr se promyje. Zředí se vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok. Připraví se stejným způsobem jako

zkoušený roztok za použití předepsaného objemu standardního

roztoku olova (10 µg Pb/ml) R místo zkoušené

látky. K 10 ml takto získaného roztoku se přidají 2 ml

zkoušeného roztoku.

Monitorovací roztok. Připraví se stejným způsobem jako

zkoušený roztok ze stejného množství zkoušené látky

a stejného objemu standardního roztoku olova

(10 µg Pb/ml) R, jak je předepsáno pro přípravu porovnávacího

roztoku. K 10 ml takto získaného roztoku se přidají

2 ml zkoušeného roztoku.

Kontrolní roztok. Směs 10 ml vody R a 2 ml zkoušeného

roztoku.

Ke 12 ml každého roztoku se přidají 2 ml tlumivého roztoku



po 2 min.

226 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.8 TĚŽKÉ KOVY

Test způsobilosti:

– porovnávací roztok vykazuje světle hnědé zbarvení ve

srovnání s kontrolním roztokem;

– monitorovací roztok je nejméně stejně intenzivní jako porovnávací

roztok.






a stálým tlakem na píst. Porovnávají se skvrny na filtrech


METODA D

Zkoušený roztok. Do křemenného kelímku se naváží předepsané

množství zkoušené látky a důkladně se promíchá

s 0,5 g oxidu hořečnatého R1. Žíhá se do slabě červeného

žáru, až vznikne homogenní bílá nebo šedobílá hmota. Jestliže

ještě po 30 min žíhání zůstává směs barevná, nechá se

ochladit, promíchá se jemnou skleněnou tyčinkou a žíhání

se opakuje. Je-li to nutné, postup se opakuje. Žíhá se asi 1 h

při 800 °C. Zbytek se převede dvakrát 5 ml směsi stejných

objemových dílů kyseliny chlorovodíkové R1 a vody R do

zkumavky. Přidá se 0,1 ml fenolftaleinu RS a potom amoniak

koncentrovaný R do vzniku růžového zbarvení. Po

ochlazení se přidá kyselina octová ledová R do odbarvení

roztoku a ještě navíc 0,5 ml. Je-li třeba, zfiltruje se a filtr se

promyje. Zředí se vodou R na 20 ml.



roztoku olova (10 µg Pb/ml) R místo zkoušené látky

a sušeného v sušárně při 100 °C až 105 °C. K 10 ml takto

získaného roztoku se přidají 2 ml zkoušeného roztoku.

Monitorovací roztok. Připraví se stejným způsobem ze stejného

množství zkoušené látky jako zkoušený roztok a stejného

objemu standardního roztoku olova (10 µg Pb/ml) R,

jak je předepsáno pro přípravu porovnávacího roztoku

a sušeného v sušárně při 100 °C až 105 °C. K 10 ml takto

získaného roztoku se přidají 2 ml zkoušeného roztoku.

Kontrolní roztok. Směs 10 ml vody R a 2 ml zkoušeného

roztoku.

Ke 12 ml každého roztoku se přidají 2 ml tlumivého roztoku

o pH 3,5 R. Promíchá se a přidá se 1,2 ml zkoumadla

thioacetamidového R a ihned se promíchá. Roztoky se hodnotí

po 2 min.

Test způsobilosti:

– porovnávací roztok vykazuje světle hnědé zbarvení ve

srovnání s kontrolním roztokem;


roztok.




vhodný membránový filtr (jmenovitá velikost pórů 0,45 μm).

Filtrace se provádí pomalu a rovnoměrně mírným a stálým

tlakem na píst. Porovnají se skvrny na filtrech získaných

s jednotlivými roztoky.

METODA E

Zkoušený roztok. Předepsané množství zkoušené látky se

rozpustí ve 30 ml vody R nebo v předepsaném objemu.

Porovnávací roztok. Pokud není předepsáno jinak, zředí se

předepsaný objem standardního roztoku olova (1 µg Pb/ml) R

na stejný objem jako zkoušený roztok.

Filtrační zařízení se připraví z válce 50ml injekční stříkačky

bez pístu připojením k nástavci, v němž je na rovné ploše

membránový filtr (jmenovitá velikost pórů 3 µm) a na

něm předfiltr (viz obrázek 2.4.8-1).

Zkoušeným roztokem se naplní válec injekční stříkačky,

vloží se píst a jeho stlačením se všechna tekutina zfiltruje.

Po otevření podložky a odejmutí předfiltru se zkontroluje

membránový filtr. Je-li znečištěn, vymění se za nový a postup

se opakuje stejným způsobem.

K předfiltrátu nebo k předepsanému objemu předfiltrátu

se přidají 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 R, promíchá se

a přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R. Ihned se

promíchá, nechá se 10 min stát a znovu se zfiltruje předepsaným

způsobem. Filtry při této filtraci se umístí opačně,

na rovné ploše předfiltr a na něm membránový filtr (viz obrázek

2.4.8-1). Filtrace se musí provést pomalu a rovnoměrně

mírným a stálým tlakem na píst injekční stříkačky.

Po skončení filtrace se podložka otevře, membránový filtr

se vyjme a vysuší pomocí filtračního papíru.

Stejným způsobem se současně postupuje s porovnávacím

roztokem.

Hodnocení. Zbarvení skvrny zkoušeného roztoku není intenzivnější

než zbarvení skvrny porovnávacího roztoku.

METODA F

Zkoušený roztok. Předepsané množství nebo předepsaný

objem zkoušené látky se převede do čisté suché 100ml spalovací

baňky s dlouhým hrdlem (pokud reakce nadměrně

pění, může se použít 300ml baňka) a upevní se tak, aby svírala

úhel 45°. Jestliže je zkoušená látka v pevném stavu,

přidá se takový objem směsi 8 ml kyseliny sírové R a 10 ml

kyseliny dusičné R, aby látka byla dostatečně navlhčena;

jestliže je zkoušená látka kapalina, přidá se několik mililitrů

směsi 8 ml kyseliny sírové R a 10 ml kyseliny dusičné R.

Opatrně se zahřívá do začátku reakce, po jejím ukončení se

postupně přidávají další díly stejné směsi kyselin a po každém

přidání se směs zahřívá. Po přidání celého objemu

18 ml se začne zahřívat intenzivněji až k varu a opatrně se

vaří do ztmavnutí roztoku. Po ochlazení se přidají 2 ml kyseliny

dusičné R a opět se zahřívá do ztmavnutí roztoku.

Pokračuje se v zahřívání a přidává se kyselina dusičná R,

dokud po dalším přídavku kyseliny dusičné R směs již neztmavne,

pak se silně zahřeje, až se tvoří husté bílé dýmy.

Ochladí se a opatrně se přidá 5 ml vody R, mírně se vaří, až

se tvoří bílé husté dýmy a objem se zmenší na 2 ml až 3 ml.

Ochladí se, opatrně se přidá 5 ml vody R a pozoruje se zbarvení

roztoku; jestliže je roztok žlutý, opatrně se přidá 1 ml

peroxidu vodíku koncentrovaného R a znovu se odpařuje,

až se tvoří husté bílé dýmy a objem se zmenší na 2 ml až

3 ml. Jestliže je roztok ještě žlutý, opakuje se přidání 5 ml

vody R a 1 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R do odbarvení

roztoku. Ochladí se, opatrně se zředí vodou R

a převede se do 50ml porovnávací zkumavky; celkový objem

kapaliny je nejvýše 25 ml. Hodnota pH roztoku se

Zkušební

metody

2.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 227

2.4.8 TĚŽKÉ KOVY

Obr. 2.4.8-1 Zařízení pro limitní zkoušku na těžké kovy (rozměry v milimetrech)

upraví amoniakem koncentrovaným R1 na 3,0 až 4,0 (může

se použít amoniak zředěný RS1, jestliže se přiblíží stanovené

rozmezí) za použití indikátorového papírku s malým

rozsahem pH jako vnějšího indikátoru, zředí se vodou R na

40 ml a promíchá se. Přidají se 2 ml tlumivého roztoku

o pH 3,5 R, promíchá se, přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového

R a ihned se promíchá. Zředí se vodou R

na 50 ml a promíchá se.

Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem

za použití předepsaného objemu standardního roztoku

olova (10 µg Pb/ml) R.


zkoušený roztok ze stejného množství zkoušené látky a stejného


jak je předepsáno pro přípravu porovnávacího roztoku.

Kontrolní roztok. Připraví se stejným způsobem jako zkoušený

roztok bez zkoušené látky.

Roztoky se pozorují po 2 min ve svislé poloze proti bílému

pozadí.

Test způsobilosti:

– porovnávací roztok vykazuje hnědé zbarvení ve srovnání

s kontrolním roztokem;


roztok.






a stálým tlakem na píst. Porovnávají se skvrny na filtrech


METODA G

UPOZORNĚNÍ. Při použití vysokotlakých digesčních nádobek

se musí dodržovat bezpečnostní opatření a návody

k obsluze dané výrobcem. Digesční cykly se mají vypracovat

v závislosti na typu použité mikrovlnné trouby (např.

mikrovlnné trouby s kontrolovanou energií, mikrovlnné

trouby s kontrolovanou teplotou nebo vysokotlaké trouby).

Cyklus se musí přizpůsobit pokynům výrobce. Digesční cyklus

je vhodný, jestliže vznikne čirý roztok.

Zkoušený roztok. Předepsané množství zkoušené látky (nejvýše

0,5 g) se převede do vhodné prázdné kádinky. Přidá se

postupně 2,7 ml kyseliny sírové R, 3,3 ml kyseliny dusičné

R, 2,0 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R

a promíchává se pomocí magnetické míchačky. Před přidáním

dalšího zkoumadla se nechá látka reagovat. Směs se

převede do suché vysokému tlaku odolné digesční nádobky

(fluorpolymer nebo křemenné sklo).



roztoku olova (10 µg Pb/ml) R místo zkoušené látky.


zkoušený roztok ze stejného množství zkoušené látky a stejného


jak je předepsáno pro přípravu porovnávacího roztoku.

Kontrolní roztok. Připraví se stejným způsobem jako zkoušený

roztok bez zkoušené látky.

Nádobky se uzavřou a umístí se do laboratorní mikrovlnné

trouby. Digeruje se postupně pomocí dvou odlišných

vhodných programů. Programy se naplánují

v několika krocích, aby se zkontrolovala reakce, sledoval

tlak, teplota nebo energie v závislosti na typu použité

mikrovlnné trouby. Po prvním programu se nechají digesční

nádobky před otevřením ochladit. Přidají se 2,0 ml

peroxidu vodíku koncentrovaného R a digeruje se pomocí

druhého programu. Po druhém programu se nechají

digesční nádobky před otevřením ochladit. Jestliže roztok

není čirý, opakuje se přidání 2,0 ml peroxidu vodíku

koncentrovaného R a druhý digesční program.

Ochladí se, opatrně se zředí vodou R a převede se do baňky,

zajistí se, že celkový objem je nejvýše 25 ml.

Hodnota pH roztoků se upraví amoniakem koncentrovaným

R1 na 3,0 až 4,0 (může se použít amoniak zředěný RS1,

228 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.9 ŽELEZO

pokud se přiblíží stanovené rozmezí) za použití indikátorového

papírku s malým rozsahem pH jako vnějšího indikátoru.

Použije se ledová lázeň a magnetická míchačka, aby se

zabránilo zahřátí roztoků. Zředí se vodou R na 40 ml a promíchá

se. Přidají se 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 R, promíchá

se a přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R

a ihned se promíchá. Zředí se vodou R na 50 ml, promíchá se

a nechá se stát 2 min.

Roztoky se zfiltrují přes vhodný membránový filtr (jmenovitá

velikost pórů 0,45 μm). Filtrace se provádí pomalu

a rovnoměrně mírným a stálým tlakem na píst. Porovnávají

se skvrny na filtrech získaných s jednotlivými roztoky.

Hodnotí se skvrny na filtrech.

Test způsobilosti:

– skvrna porovnávacího roztoku vykazuje hnědé zbarvení

srovnatelné se skvrnou kontrolního roztoku;

– skvrna monitorovacího roztoku je nejméně stejně intenzivní

jako skvrna porovnávacího roztoku.

Hodnocení. Hnědé zbarvení skvrny zkoušeného roztoku

není intenzivnější než zbarvení skvrny porovnávacího roztoku.

METODA H

Zkoušený roztok. Předepsané množství zkoušené látky se

rozpustí ve 20 ml předepsaného rozpouštědla nebo směsi

rozpouštědel.

Porovnávací roztok. Předepsaný objem standardního roztoku

olova (10 µg Pb/ml) R se zředí na 20 ml předepsaným

rozpouštědlem nebo směsí rozpouštědel.

Kontrolní roztok. 20 ml předepsaného rozpouštědla nebo

směsi rozpouštědel.


o pH 3,5 R. Promíchá se (pokud se objeví sraženina, v tom

případě by měl specifický článek předepsat opakované rozpouštění

v definovaném objemu daného rozpouštědla). Přidá

se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R a ihned se

promíchá. Roztoky se hodnotí po 2 min. Roztoky se zfiltrují

přes vhodný membránový filtr (jmenovitá velikost pórů

0,45 μm). Porovnávají se skvrny na filtrech získaných

s jednotlivými roztoky.

Test způsobilosti. Skvrna porovnávacího roztoku vykazuje

světle hnědé zbarvení ve srovnání s kontrolním roztokem.


není intenzivnější než zbarvení porovnávacího

roztoku.

2.4.9 ŽELEZO

6.0:20409

Předepsané množství zkoušené látky se rozpustí ve vodě R

a zředí se jí na 10 ml nebo se použije 10 ml předepsaného

roztoku. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny citronové monohydrátu

R (200 g/l) a 0,1 ml kyseliny thioglykolové R. Promíchá

se, zalkalizuje se amoniakem R a zředí se vodou R

na 20 ml. Současně se stejným způsobem připraví porovnávací

roztok za použití 10 ml standardního roztoku železa

(1 µg Fe/ml) R.

Po 5 min není růžové zbarvení zkoušeného roztoku intenzivnější

než zbarvení porovnávacího roztoku.

2.4.10 OLOVO V CUKRECH

6.0:20410

Stanovení olova se provede atomovou absorpční spektrometrií

(2.2.23, Metoda II).

Zkoušený roztok. 20,0 g zkoušené látky se rozpustí ve směsi

stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody

R a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml. Přidají se 2,0 ml

čirého roztoku amonium-pyrrolidinkarbodithioátu R

(10 g/l) a 10,0 ml isobutyl(methyl)ketonu R a potom se 30 s

protřepává za chránění před přímým světlem. Po oddělení

vrstev se dále použije vrstva isobutyl(methyl)ketonu.

Porovnávací roztoky. Tři porovnávací roztoky se připraví

stejným způsobem jako zkoušený roztok s tím rozdílem, že

se ke 20,0 g zkoušené látky navíc přidá 0,5 ml, 1,0 ml

a 1,5 ml standardního roztoku olova (10 µg Pb/ml) R.

Nulová poloha přístroje se nastaví pomocí isobutyl(methyl)ketonu

R, který byl připraven stejným způsobem jako

zkoušený roztok bez zkoušené látky. Měří se absorbance

roztoků při 283,3 nm za použití olověné lampy s dutou katodou

jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen.

Zkoušená látka obsahuje nejvýše 0,5 µg Pb/g, není-li předepsáno

jinak.

2.4.11 FOSFOREČNANY

6.0:20411

Ke 100 ml zkoušeného roztoku připraveného tak, jak je předepsáno,

je-li třeba zneutralizovaného, se přidají 4 ml

zkoumadla sulfomolybdenanového R3. Protřepe se a přidá se

0,1 ml chloridu cínatého RS1. Současně se stejným způsobem

připraví porovnávací roztok za použití 2 ml standardního roztoku

fosforečnanů (5 µg PO4/ml) R a 98 ml vody R. Po 10 min

se hodnotí zbarvení 20 ml každého roztoku.

Zbarvení zkoušeného roztoku není intenzivnější než zbarvení

porovnávacího roztoku.

2.4.12 DRASLÍK

6.0:20412

K 10 ml předepsaného roztoku se přidají 2 ml čerstvě připraveného

roztoku natrium-tetrafenylborátu R (10 g/l).

Současně se stejným způsobem připraví porovnávací roztok

za použití 5 ml standardního roztoku draslíku

(20 µg K/ml) R a 5 ml vody R.

Po 5 min neopalizuje zkoušený roztok intenzivněji než

porovnávací roztok.

2.4.13 SÍRANY

8.0:20413

Všechny roztoky použité v této zkoušce se musí připravit

z vody destilované R.

Ke 4,5 ml standardního roztoku síranů (10 µg SO4/ml) R1

se přidají 3 ml roztoku chloridu barnatého R (250 g/l). Protřepe

se a nechá se 1 min stát. Ke 2,5 ml této suspenze se

Zkušební

metody

2.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 229

2.4.14 SÍRANOVÝ POPEL

přidá 15 ml předepsaného roztoku a 0,5 ml kyseliny octové

R. Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za

použití 15 ml standardního roztoku síranů

(10 µg SO4/ml) R místo předepsaného roztoku.

Po 5 min neopalizuje zkoušený roztok intenzivněji než porovnávací

roztok.

2.4.14 SÍRANOVÝ POPEL

6.7:20414

Vhodný kelímek (např. křemenný, platinový, porcelánový

nebo z taveného křemene) se žíhá 30 min při teplotě

(600 ±50) °C, nechá se vychladnout v exsikátoru nad silikagelem

nebo jiným vhodným sušidlem a zváží se. Předepsané

množství zkoušené látky se naváží do kelímku, zvlhčí

se malým množstvím kyseliny sírové R (obvykle 1 ml)

a opatrně se zahřívá při co nejnižší teplotě až do úplného

zuhelnatění. Po ochlazení se zbytek zvlhčí malým množstvím

kyseliny sírové R (obvykle 1 ml) a opatrně se zahřívá

do ukončení vyvíjení bílého dýmu a potom se žíhá při teplotě

(600 ±50) °C do úplného spálení. Zajistí se, aby se během

zkoušky neobjevil plamen. Po vychlazení v exsikátoru

nad silikagelem nebo jiným vhodným sušidlem se kelímek

opět zváží a vypočítají se procenta zbytku.

Převyšuje-li množství takto získaného zbytku předepsaný

limit, znovu se zvlhčí malým množstvím kyseliny sírové R

a znovu se žíhá výše uvedeným způsobem ve 30min intervalech,

dokud se dvě následná vážení neliší o více než

0,5 mg nebo dokud zbytek v procentech nevyhovuje předepsanému

limitu.

Množství látky použité ke zkoušce (obvykle 1 g až 2 g) se

zvolí tak, aby se hmotnost zbytku (obvykle asi 1 mg)

v předepsaném limitu mohla zvážit s dostatečnou přesností.

2.4.15 NIKL V POLYOLECH

7.0:20415

Stanovení niklu se provede atomovou absorpční spektrometrií

(2.2.23, Metoda II).

Zkoušený roztok. 20,0 g zkoušené látky se rozpustí ve směsi

stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody

R a touto směsí se zředí na 100,0 ml. Přidá se 2,0 ml nasyceného

roztoku amonium-pyrrolidinkarbodithioátu R

(asi 10 g/l) a 10,0 ml isobutyl(methyl)ketonu R a potom se

30 s protřepává za chránění před přímým světlem. Vrstvy se

nechají oddělit a použije se vrstva isobutyl(methyl)ketonu.

Porovnávací roztoky. Tři porovnávací roztoky se připraví

stejným způsobem jako zkoušený roztok s tím rozdílem,

že se k 20,0 g zkoušené látky navíc přidá 0,5 ml, 1,0 ml

a 1,5 ml standardního roztoku niklu (10 µg Ni/ml) R.

Nulová poloha přístroje se nastaví pomocí isobutyl(methyl)-

ketonu R, připraveného stejným způsobem jako zkoušený

roztok bez zkoušené látky. Měří se absorbance při 232,0 nm

za použití niklové lampy s dutou katodou jako zdroje záření

a plamene vzduch-acetylen.

Zkoušená látka obsahuje nejvýše 1 µg Ni/g, není-li předepsáno

jinak.

1

2.4.16 CELKOVÝ POPEL

6.0:20416

Křemenný nebo platinový kelímek se žíhá 30 min do červeného

žáru, nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží

se. Není-li předepsáno jinak, naváží se do kelímku 1,000 g

zkoušené látky nebo práškované rostlinné drogy. Kelímek

se suší 1 h při 100 °C až 105 °C a potom se žíhá do konstantní

hmotnosti v muflové peci při (600 ±25) °C. Po

každém žíhání se nechá vychladnout v exsikátoru. Během

zkoušky se nemá objevit plamen. Pokud ještě po opakovaném

žíhání obsahuje popel černé částice, přidá se horká

voda, přefiltruje se přes bezpopelný filtrační papír a papír

se zbytkem se spálí a vyžíhá. K popelu se přidá filtrát,

opatrně se odpaří do sucha a vyžíhá se do konstantní

hmotnosti.

2.4.17 HLINÍK

6.0:20417

Předepsaný roztok se v dělicí nálevce protřepe dvakrát

s 20 ml a potom jedenkrát s 10 ml roztoku hydroxychinolinu

R (5 g/l) v chloroformu R. Spojené chloroformové

vrstvy se zředí chloroformem R na 50,0 ml (zkoušený roztok).

Porovnávací roztok se připraví stejným způsobem za použití

předepsaného porovnávacího roztoku.

Kontrolní roztok se získá při slepé zkoušce provedené stejným

způsobem za použití předepsaného roztoku.

Měří se intenzita fluorescence (2.2.21) zkoušeného roztoku

(I1), porovnávacího roztoku (I2) a kontrolního roztoku

(I3) za použití budicího záření o vlnové délce 392 nm

a sekundárního filtru s pásem, jehož střed propustnosti je

při 518 nm, případně se použije monochromátor nastavený

tak, aby propouštěl při této vlnové délce.

Fluorescence (I1 – I3) zkoušeného roztoku není větší než

fluorescence (I2 – I3) porovnávacího roztoku.

2.4.18 VOLNÝ FORMALDEHYD

6.0:20418

Pokud není předepsáno jinak, použije se Metoda A. Metoda

B je vhodná pro vakcíny, ke kterým byl přidán disiřičitan

sodný k neutralizaci nadbytku formaldehydu.

METODA A

Připraví se ředění 1 : 10 zkoušené humánní vakcíny. Připraví

se ředění 1 : 25 zkoušeného veterinárního bakteriálního

toxoidu.

K 1 ml zředěného roztoku se přidají 4 ml vody R a 5 ml acetylacetonu

RS1 a zkumavka s roztokem se ponechá 40 min

ve vodní lázni při 40 °C. Hodnotí se zkumavky ve směru jejich

vertikální osy. Roztok není zbarven intenzivněji než porovnávací

roztok připravený současně stejným způsobem za

použití 1 ml zředěného formaldehydu RS obsahujícího 20 µg

formaldehydu (CH2O) v mililitru místo zředěné vakcíny.

––––––––––––––––––––––––––––––

1


230 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.19 ALKALICKÉ NEČISTOTY V MASTNÝCH OLEJÍCH

METODA B

Zkoušený roztok. Vakcína se zředí vodou R 1 : 200. Jestliže

je vakcína ve formě emulze, připraví se vhodné ředění za

použití vodné fáze získané jedním z dále uvedených postupů.

Jestliže se pro oddělení vodné fáze použije jeden z dále

uvedených postupů, vodná fáze se zředí 1 : 20.

Porovnávací roztoky. Připraví se roztoky obsahující 0,25 g/l,

0,50 g/l, 1,00 g/l a 2,00 g/l CH2O zředěním formaldehydu RS

vodou R. Každý roztok se zředí vodou R 1 : 200.

Do zkumavek se převede 0,5 ml zkoušeného roztoku a po

0,5 ml každého porovnávacího roztoku a přidá se po 5,0 ml

čerstvě připraveného roztoku methylbenzothiazolon-hydrazon-hydrochloridu

R (0,5 g/l). Zkumavky se uzavřou, protřepou

a nechají stát 60 min. Po přidání 1 ml zkoumadla

chlorid železitý-kyselina amidosírová R se nechají stát dalších

15 min. Potom se měří absorbance (2.2.25) všech roztoků

při 628 nm. Obsah formaldehydu ve zkoušené vakcíně

se vypočítá pomocí kalibrační křivky sestavené z naměřených

hodnot porovnávacích roztoků. Zkoušku lze hodnotit,

jestliže korelační koeficient (r) kalibrační křivky není menší

než 0,97.

Emulze. Jestliže zkoušená vakcína je ve formě emulze, je

nutno pro přípravu zkoušeného roztoku oddělit vodnou fázi

jedním z následujících postupů, které byly vybrány jako

vhodné.

a) 1,0 ml vakcíny se přidá k 1,0 ml isopropyl-myristátu R

a promíchá se. Potom se přidá 1,3 ml kyseliny chlorovodíkové

1 mol/l RS, 2,0 ml chloroformu R a 2,7 ml roztoku

chloridu sodného R (9 g/l). Směs se důkladně promíchá

a odstřeďuje se 60 min při 15 000 g. Oddělená vodná fáze

se převede do 10ml odměrné baňky a zředí se vodou R

na 10,0 ml. Jestliže se popsaným postupem vodná vrstva

neoddělí, je nutné k roztoku chloridu sodného přidat roztok

polysorbátu 20 R (100 g/l) a postup opakovat s tím

rozdílem, že se odstřeďuje při 22 500 g.

b) 1,0 ml vakcíny se přidá k 1,0 ml roztoku chloridu sodného

R (100 g/l), promíchá se a odstřeďuje se 15 min

při 1000 g. Oddělená vodná fáze se převede do 10ml

odměrné baňky a zředí se vodou R na 10,0 ml.

c) 1,0 ml vakcíny se přidá ke 2,0 ml roztoku chloridu sodného

R (100 g/l) a 3,0 ml chloroformu R, promíchá se

a odstřeďuje se 5 min při 1000 g. Oddělená vodná fáze

se převede do 10ml odměrné baňky a zředí se vodou R

na 10,0 ml.

2.4.19 ALKALICKÉ NEČISTOTY

V MASTNÝCH OLEJÍCH

6.0:20419

Synonymum. Zásaditě reagující látky v mastných olejích

Ve zkumavce se smíchá 10 ml čerstvě předestilovaného

acetonu R a 0,3 ml vody R a přidá se 0,05 ml roztoku modři

bromfenolové R (0,4 g/l) v ethanolu 96% R. Je-li třeba, roztok

se neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l VS

nebo hydroxidem sodným 0,01 mol/l VS. Přidá se 10 ml

zkoušeného oleje, protřepe se a nechá se stát. Ke změně

zbarvení horní vrstvy na žluté se spotřebuje nejvýše 0,1 ml

kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

2.4.20 STANOVENÍ ELEMENTÁRNÍCH

NEČISTOT

9.6:20420

ÚVOD

Tato stať popisuje obecný přístup ke stanovení elementárních

nečistot v léčivých přípravcích nebo v látkách pro

farmaceutické použití. Protože uvažované vzorky mají různá

chemická složení a přípustné limity pro příslušný prvek

(prvky) se značně liší, není možné uvést všechny vhodné

metody pro přípravu a měření vzorků. Může se tedy použít

jakákoliv metoda, která splňuje dále uvedené požadavky.

Výsledky analýzy jsou přijatelné pouze tehdy, jestliže byla

způsobilost systému prokázána vhodnou zkouškou. Před

prvním použitím metody se musí zajistit, že metoda je

vhodná pro vzorky a použité přístroje. Toho se dosáhne použitím

validačního postupu u metod, které nejsou popsané

v lékopisném článku, nebo testem způsobilosti u metod popsaných

v příslušném článku. Rozhodovací diagramy pro

výběr postupů přípravy a měření vzorku jsou uvedeny na

obrázcích 2.4.20-1 a 2.4.20-2.

POSTUPY

Uživatel je zodpovědný za výběr postupu podle obrázků

2.4.20-1 a 2.4.20-2 (včetně přípravy vzorku, způsobu detekce

a parametrů přístroje), protože referenční postup není

uveden pro každý prvek, matrici a koncentraci.

Pro bližší určení metody přípravy vzorku se použije rozhodovací

diagram na obrázku 2.4.20-1 a pro bližší určení metody

měření rozhodovací diagram na obrázku 2.4.20-2. Metoda

přípravy vzorku by měla poskytovat dostatečné množství

vzorku, aby bylo možné stanovit každý prvek s ohledem

na specifikovaný limit uvedený v příslušném článku

nebo obecné stati.

Pro stanovení elementárních nečistot se mohou použít

všechny vhodné způsoby přípravy vzorků a metody měření

(např. 2.2.22 Atomová emisní spektrometrie (AES), 2.2.23

Atomová absorpční spektrometrie (AAS), 2.2.37 Rentgenová

fluorescenční spektrometrie (XRFS), 2.2.57 Atomová

emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem

(ICP-AES), 2.2.58 Hmotnostní spektrometrie s indukčně

vázaným plazmatem (ICP-MS), 2.4.2 Arsen, 2.4.8 Těžké

kovy, 2.4.9 Železo, 2.4.10 Olovo v cukrech, 2.4.15 Nikl

v polyolech, 2.4.31 Nikl v hydrogenovaných rostlinných

olejích), jestliže byla metoda před prvním použitím ověřena

testem způsobilosti nebo validačním postupem v souladu

s touto statí.

Jestliže není v jednotlivém článku popsána metoda přípravy

a/nebo měření vzorku, musí být vhodná metoda přípravy

a/nebo měření vzorku vyvinuta a validována (viz obrázky

2.4.20-1 a 2.4.20-2).

PŘÍPRAVA VZORKU

Příprava vzorku je pro úspěšnou elementární analýzu rozhodující.

Mnohé metody, které nevyužívají přímé měření,

jsou silně závislé na přenosu vzorku.

Jestliže se používá atomizační systém, vzorky se do něho

zavádějí obvykle rozprašováním roztoku. V tomto případě

musí být pevné vzorky rozpuštěné, aby mohly být do atomizačního

systému vneseny. Vzorky se mohou rozpustit

Zkušební

metody

2.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 231

2.4.20 STANOVENÍ ELEMENTÁRNÍCH NEČISTOT

Obr. 2.4.20-1 Rozhodovací diagram pro stanovení elementárních nečistot: příprava vzorku

232 ČL 2017 – Dopl. 2020


Zkušební

metody

2.4

Obr. 2.4.20-2 Rozhodovací diagram pro stanovení elementárních nečistot: měření

ČL 2017 – Dopl. 2020 233


v jakémkoliv vhodném rozpouštědle. Doporučuje se používat

vodné roztoky nebo roztoky ve zředěné kyselině dusičné

vzhledem k minimálním interferencím ve srovnání s jinými

rozpouštědly. K rozpouštění vzorků lze použít různé

koncentrace kyseliny chlorovodíkové, kyseliny fluorovodíkové,

kyseliny chloristé, kyseliny sírové a peroxidu vodíku.

Pokud se použije kyselina sírová, je třeba vzít v úvahu, že

její viskozita je vyšší a může ovlivnit celkovou tekutost

roztoku.

Výběr rozpouštědel také zahrnuje mimo jiné použití zředěných

zásad, neředěných nebo ředěných organických rozpouštědel,

směsí kyselin nebo zásad a směsí organických

rozpouštědel.

Použité kyseliny, zásady a peroxid vodíku musí mít vysokou

čistotu, zejména při použití hmotnostní spektrometrie

s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS). K přípravě

vodných roztoků se použije voda destilovaná deionizovaná

R. Rozpouštědla použitá při analýze musí být zkontrolována

z hlediska interference. Protože ne vždy je možné získat

organická rozpouštědla prostá elementárních nečistot,

musí se používat organická rozpouštědla o nejvyšší možné

čistotě s ohledem na tyto kontamitanty. Konkrétně u spektrometrie

s indukčně vázaným plazmatem, kde jsou vzorky

zaváděny do plazmatu rozprašováním roztoku, je důležité

vzít v úvahu možné vlivy matrice a interference, které by

mohly být způsobeny rozpouštědlem. Pokud analýzy provedené

atomovou emisní spektrometrií s indukčně vázaným

plazmatem (ICP-AES) a hmotnostní spektrometrií s indukčně

vázaným plazmatem (ICP-MS) nejsou dostatečně

správné a přesné, je třeba použít vhodný vnitřní standard

a/nebo přizpůsobit matrici standardu vzorkům. V každém

případě by se při výběru vhodného vnitřního standardu měl

brát v úvahu prvek (prvky), který je předmětem zájmu,

ionizační energie, vlnové délky nebo hmotnosti a charakter

matrice vzorku.

Pokud se zjistí, že vzorek není rozpustný v žádném vhodném

rozpouštědle, je možné použít různé metody rozkladu

mokrou nebo suchou cestou. Patří mezi ně rozklad na horké

desce, spalování a mikrovlnná mineralizace v otevřených

nebo uzavřených nádobkách.

Rozhodnutí pro použití konkrétní metody rozkladu závisí

na charakteru vzorku a také na prvku (prvcích), který je

předmětem zájmu, a na rozsahu koncentrací stanovovaných

prvků. Pro analýzu těkavých prvků se nedoporučuje rozklad

v otevřených nádobkách. Vhodnost výběru metody

rozkladu v otevřené, nebo uzavřené nádobce by měla být

potvrzena stanovením výtěžnosti za použití obohacených

vzorků, aby bylo s přijatelnou tolerancí ověřeno, že nedochází

ke ztrátě těkavých prvků během přípravy vzorků.

Cyklus rozkladu vyhovuje, pokud se získá čirý roztok.

Při výběru analytického laboratorního vybavení pro elementární

analýzu je důležité vzít v úvahu jeho typ, použitý

materiál, před úpravu a způsob čištění. Materiál musí být

inertní a podle konkrétního použití také odolný vůči žíravinám,

kyselinám a/nebo organickým rozpouštědlům. U některých

analýz se musí věnovat zvýšená pozornost tomu,

aby se předešlo adsorpci elementárních nečistot na povrch

nádob, zejména při ultrastopové analýze. Také kontaminace

zkoušených roztoků elementárními nečistotami s ionty přítomnými

v obalech může vést k nesprávným výsledkům.

Použití odměrného skla, které neodpovídá požadavkům třídy

A příslušné mezinárodní normy vydané Mezinárodní organizací

pro normalizaci (International Organisation for

Standardisation, ISO), je přijatelné, pokud se experimentálně

prokáže validací, nebo testem způsobilosti za použití takového

skla, že metoda je k zamýšlenému účelu vhodná.

UPOZORNĚNÍ. Při použití vysokotlakých digesčních nádob

a mikrovlnného laboratorního zařízení se musí dodržovat

bezpečnostní opatření a pokyny výrobce zařízení.

MĚŘENÍ

Metoda. Výběr metody závisí především na matrici vzorku,

charakteristikách a přípustných limitech příslušného

prvku (prvků). Analýza se provádí podle pokynů výrobce

zařízení týkajících se programu a vlnové délky.

Způsobilost systému. V den analýzy musí být proveden

test způsobilosti, aby bylo zajištěno, že příprava vzorků

a měřicí systém vyhovují.

Kritérium přijatelnosti pro přípravu zkoušeného roztoku.

Postup přípravy vzorku je vhodný, jestliže se získá čirý roztok.

Kritérium přijatelnosti pro měřicí systém. Systém je vhodný,

jestliže se naměřená koncentrace standardního roztoku

prvku o koncentraci v rozsahu použité kalibrační křivky neliší

od skutečné koncentrace o více než 20 %.

Výpočet. Při výpočtu obsahu se musí vzít v úvahu hodnota

kontrolního vzorku rozpouštědla. Po ukončení analýzy se

koncentrace daného prvku ve vzorku vypočítá pomocí

softwaru přístroje z koncentrace prvku ve zkoušeném roztoku.

Pokud není k dispozici výpočetní software ani není

uveden výpočet v obecné stati odpovídající použité metodě,

může se koncentrace daného prvku ve vzorku vypočítat

z koncentrace prvku v roztoku podle vzorce:

V1

V

C = A×

×

m V

v němž značí:

C – koncentraci prvku ve zkoušeném vzorku v mikrogramech

na gram;

A – instrumentálně odečtenou koncentraci prvku ve zkoušeném

roztoku v mikrogramech na mililitr;

m – hmotnost vzorku v počátečním zkoušeném roztoku

v gramech;

V1 – objem počátečního zkoušeného přípravku v mililitrech;

V2 – celkový objem provedeného ředění v mililitrech;

V3 – objem počátečního zkoušeného přípravku použitý pro

ředění v mililitrech.


Některé dále uvedené validační požadavky se mohou lišit

od požadavků stanovených v obecných statích Ph. Eur.

[např. pro 2.2.22 (AES), 2.2.23 (AAS), 2.2.57 (ICP-AES),

2.2.58 (ICP-MS)].

Před prvním použitím vybraného postupu musí být zajištěno,

že metoda přípravy a měření vzorku jsou vhodné pro

prvek (prvky), který je předmětem zájmu, matrici vzorku

2

3

,

234 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.21 CIZÍ OLEJE V MASTNÝCH OLEJÍCH TENKOVRSTVOU CHROMATOGRAFIÍ

a použitý přístroj, a to jeho validací před prvním použitím

a testem způsobilosti v den analýzy.

Validace limitní zkoušky musí v případě elementárních nečistot

zahrnovat specifičnost a mez detekce.

Charakteristiky pro přijatelnost postupů kvantitativní analýzy

jsou definovány dále. Experimentálně musí být vhodným

testem způsobilosti za použití materiálu obohaceného

vhodným referenčním materiálem prokázáno, že takový postup

vyhovuje validačním požadavkům. Zkoušený materiál

musí být obohacen dříve, než se provede některý z kroků

přípravy vzorku. Pokud má být zkoušený materál např.

upraven rozkladem, musí být obohacen před zahájením

rozkladu.

SPECIFIČNOST

Specifičnost je schopnost zajistit, aby analytický postup

použitý pro přípravu a měření vzorku umožnil spolehlivé

stanovení daného prvku (prvků) v látce vedle jiných předvídatelných

složek (např. nosný plyn, nečistoty, matrice).

Kritéria přijatelnosti. Postup musí umožnit jednoznačné

hodnocení každé elementární nečistoty, která má být takto

stanovenav látce vedle jiných předvídatelných složek, včetně

jiných elementárních nečistot, složek matrice a dalších

zdrojů interferencí. Specifičnost se prokáže ověřením, že

postup pro stanovovaný prvek (prvky), vyhovuje požadavku

odstavce Přesnost.

ROZSAH

Kritérium přijatelnosti. Rozsah se prokáže tím, že postup

vyhovuje požadavku odstavce Výtěžnost.

PŘESNOST

Přesnost se ověří za použití certifikovaného referenčního

materiálu nebo provedením zkoušky výtěžnosti. Je možné

použít roztoky elementárních nečistot CRL.

Výtěžnost může být stanovena trojmo u vzorků zkoušené

látky obohacených známým množstvím referenčního standardu

stanovovaného prvku (tři úrovně koncentrace v rozmezí

50 % až 150 % určeného přípustného limitu, i když je

původní koncentrace referenčního standardu specifikována).

Kritérium přijatelnosti. Výtěžnost 70 % až 150 % pro průměr

ze tří stanovení při každé koncentraci.

OPAKOVATELNOST

Zkoušené vzorky. Připraví se buď šest nezávislých vzorků

zkoušené látky obohacených vhodným referenčním standardem

o specifikované koncentraci, nebo se připraví vzorky

trojmo ve třech různých koncentracích.

Kritérium přijatelnosti. Relativní směrodatná odchylka

v obou případech není větší než 20 %.

MEZILEHLÁ PRECIZNOST

Musí se stanovit vliv náhodných událostí (laboratorní variabilita)

na analytickou přesnost metody. Ověření mezilehlé

preciznosti metody je možno provést stanovením opakovatelnosti

v různých dnech, s různým vybavením, nebo různými

analytiky. K ověření se vyžaduje pouze jedna ze tří

uvedených možností.

Kritérium přijatelnosti. Relativní směrodatná odchylka není

větší než 25 %.

MEZ STANOVITELNOSTI

Stanoví se nejnižší koncentrace, která vyhovuje kritériu přijatelnosti.

Použijí se výsledky získané při stanovení přesnosti.

Kritérium přijatelnosti. Mez stanovitelnosti je nižší než

specifikovaný limit.

MEZ DETEKCE (POUŽITELNÉ JEN U LIMITNÍCH

ZKOUŠEK)

Stanoví se nejnižší koncentrace, která dává signál zřetelně

odlišný od signálu získaného s kontrolním roztokem.

Kritérium přijatelnosti. Mez detekce je nejvýše polovina

koncentrace specifikovaného limitu.

2.4.21 CIZÍ OLEJE V MASTNÝCH OLEJÍCH

TENKOVRSTVOU CHROMATOGRAFIÍ

6.0:20421

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití

vrstvy křemeliny G R. Vrstva se impregnuje v chromatografické

komoře vhodným množstvím směsi objemových dílů

parafinu tekutého R a petroletheru R (10 + 90) vyvíjením

po dráze 12 cm od dolního okraje vrstvy, přičemž hladina

směsi sahá 5 mm nad dolní okraj desky. Potom se vrstva

nechá 5 min volně na vzduchu do vytěkání rozpouštědel.

Chromatogram je třeba vyvíjet ve stejném směru jako impregnaci.

Příprava směsi mastných kyselin. 2 g oleje se zahřívají

45 min se 30 ml hydroxidu draselného 0,5 mol/l v ethanolu

R pod zpětným chladičem. Pak se přidá 50 ml vody R,

ochlazená směs se převede do dělicí nálevky a vytřepe se

třikrát 50 ml etheru R. Etherové vrstvy se odstraní, vodné

vrstvy se okyselí kyselinou chlorovodíkovou R a vytřepává

se znovu třikrát 50 ml etheru R. Spojené etherové výtřepky

se promyjí třikrát 10 ml vody R, promývací tekutiny se odstraní,

vysuší se nad síranem sodným bezvodým R a zfiltrují

se. Ether se odpaří na vodní lázni do sucha a odparek se

použije k přípravě roztoku zkoušené látky. Mastné kyseliny

se také mohou získat z roztoku připraveného při stanovení

nezmýdelnitelných látek.

Zkoušený roztok. 40 mg směsi mastných kyselin získané výše

uvedeným postupem se rozpustí ve 4 ml chloroformu R.

Porovnávací roztok. 40 mg směsi mastných kyselin získané

ze směsi objemových dílů kukuřičného oleje R a řepkového

oleje R (19 + 1) se rozpustí ve 4 ml chloroformu R.

Na vrstvu se odděleně nanese po 3 µl každého roztoku

a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R a kyseliny octové

ledové R (10 + 90) po dráze 8 cm. Deska s vrstvou se suší

10 min při 110 °C. Po ochlazení, není-li předepsáno jinak,

se deska s vrstvou vloží do dobře těsnící komory předem

nasycené parami jodu R umístěného na dně komory na odpařovací

misce. Po nějakém čase jsou na vrstvě hnědé nebo

nažloutle hnědé skvrny. Deska s vrstvou se vyjme z komory

a nechá se několik minut stát. Když hnědé zbarvení pozadí

zmizí, postříká se vrstva škrobem RS. Objeví se modré

skvrny, které se mohou změnit na hnědé a po postříkání vodou

R se změní zpět na modré.

Zkušební

metody

2.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 235

2.4.22 PODÍL MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

Na chromatogramu zkoušené látky jsou skvrny o RF asi 0,5

(kyselina olejová) a RF asi 0,65 (kyselina linolová) odpovídající

skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku.

U některých olejů může být na chromatogramu zkoušené

látky ještě skvrna s RF asi 0,75 (kyselina linolenová). Porovnáním

skvrn na chromatogramu zkoušeného roztoku se

skvrnami na chromatogramu porovnávacího roztoku se

ověří nepřítomnost skvrny s hodnotou RF asi 0,25 (kyselina

eruková) na chromatogramu zkoušeného roztoku.

2.4.22 PODÍL MASTNÝCH KYSELIN

PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

8.8:20422

Cizí oleje se stanoví jako methylestery mastných kyselin

přítomných ve zkoušených olejích metodou plynové chromatografie

(2.2.28).

METODA A

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly

mastných kyselin s epoxy-, hydroepoxy-, hydroperoxy-,

cyklopropyl- nebo cyklopropenylovými skupinami nebo

pro oleje s vysokým podílem mastných kyselin s řetězcem

kratším než osm uhlíkových atomů nebo pro oleje s číslem

kyselosti vyšším než 2,0.

Zkoušený roztok. Je-li to v článku předepsáno, zkoušený

olej se před methylací suší. Do 25ml baňky s kulatým dnem

a se zabroušeným hrdlem opatřené zpětným chladičem

a upravené k zavádění plynu se naváží 1,0 g zkoušeného

oleje. Přidá se 10 ml methanolu bezvodého R, 0,2 ml roztoku

hydroxidu draselného R (60 g/l) v methanolu R, protřepe

se a zahřívá se pod zpětným chladičem k varu za současného

probublávání dusíkem R rychlostí asi 50 ml/min. Když

je roztok čirý (obvykle po asi 10 min), pokračuje se v zahřívání

ještě 5 min. Baňka se ochladí pod tekoucí vodou

a obsah se převede do dělicí nálevky. Baňka se vypláchne

5 ml heptanu R, promývací tekutina se také převede do dělicí

nálevky a protřepe se. Přidá se 10 ml roztoku chloridu sodného

R (200 g/l) a důkladně se protřepe. Vrstvy se nechají

oddělit, organická vrstva se převede do nádobky se síranem

sodným bezvodým R, nechá se stát a potom se zfiltruje.

Porovnávací roztok (a). Podle jedné z tabulek 2.4.22 se

připraví 0,50 g směsi kalibračních látek tak, jak je předepsáno

v příslušném článku (není-li v článku uveden určitý

roztok, použije se složení popsané v tabulce 2.4.22-1).

Rozpustí se v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a)

se zředí heptanem R na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (c). Připraví se 0,50 g směsi methylesterů

mastných kyselin, která odpovídá složením směsi

mastných kyselin uvedených v článku zkoušené látky.

Rozpustí se v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml. Mohou

se rovněž použít komerčně dostupné směsi methylesterů

mastných kyselin.

Kolona:

– materiál: tavený křemen, sklo nebo křemen;

– rozměry: délka 10 m až 30 m, vnitřní průměr 0,2 mm až

0,8 mm;

– stacionární fáze: makrogol 20 000 R (tloušťka filmu

0,1 μm až 0,5 μm) nebo jiná vhodná stacionární fáze.

Nosný plyn. Helium pro chromatografii R nebo vodík pro

chromatografii R.

Průtoková rychlost. 1,3 ml/min (pro kolonu o vnitřním

průměru 0,32 mm).

Dělicí poměr. 1 : 100 nebo menší, podle vnitřního průměru

použité kolony (1 : 50 pro kolonu o vnitřním průměru

0,32 mm).

Teplota:

– kolona: při izotermických podmínkách 160 °C až 200 °C

podle délky a typu použité kolony (200 °C pro kolonu

délky 30 m potaženou vrstvou makrogolu 20 000 R); pokud

je nutné použití lineárního teplotního programu, zvyšuje

se teplota kolony např. rychlostí 3 °C/min ze 170 °C

na 230 °C;

– nástřikový prostor: 250 °C;

– detektor: 250 °C.

Detekce. Plamenoionizační detektor.

Nástřik. 1 μl.

Test způsobilosti, použije-li se směs kalibračních látek uvedených

v tabulce 2.4.22-1 nebo v tabulce 2.4.22-3:

– rozlišení: nejméně 1,8 mezi píkem methyl-oleátu a píkem

methyl-stearátu na chromatogramu porovnávacího roztoku

(a);

– poměr signálu k šumu: nejméně 5 pro pík methyl-myristátu

na chromatogramu porovnávacího roztoku (b);

– počet teoretických pater: nejméně 30 000, počítáno pro

pík methyl-stearátu na chromatogramu porovnávacího

roztoku (a).

Test způsobilosti, použije-li se směs kalibračních látek uvedených

v tabulce 2.4.22-2:

– rozlišení: nejméně 4,0 mezi píkem methyl-oktanoátu

a píkem methyl-dekanoátu na chromatogramu porovnávacího

roztoku (a);

– poměr signálu k šumu: nejméně 5 pro pík methyl-hexanoátu

na chromatogramu porovnávacího roztoku (b);

– počet teoretických pater: nejméně 15 000, počítáno pro

pík methyl-dekanoátu na chromatogramu porovnávacího

roztoku (a).

VYHODNOCENÍ CHROMATOGRAMŮ

Je třeba se vyvarovat pracovních podmínek, které umožňují

vznik maskovaných píků (přítomnost složek s malými rozdíly

v retenčních časech, jako např. u kyseliny linolenové

a kyseliny arachidové).

Kvalitativní analýza. Identifikují se píky na chromatogramu

získaném s porovnávacím roztokem (c) (při izotermických

podmínkách nebo při použití lineárního teplotního

programu).

Při použití izotermických podmínek se mohou píky také

identifikovat sestrojením kalibračních křivek za použití

chromatogramu získaného s porovnávacím roztokem (a)

a informací uvedených v tabulkách 2.4.22-1, 2.4.22-2 nebo

2.4.22-3.

236 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.22 PODÍL MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

Tab. 2.4.22-1 Směs kalibračních látek (pro plynovou chromatografii

prováděnou na kapilární koloně s nástřikem za

použití děliče se doporučuje přidávat složku s největší délkou

řetězce ve zkoušené směsi ke kalibrační směsi až po provedení

kvalitativní analýzy za použití kalibračních křivek)

Směs následujících látek Složení (%)

methyl-laurát R 5

methyl-myristát R 5

methyl-palmitát R 10

methyl-stearát R 20

methyl-arachidát R 40

methyl-oleát R 20







methyl-hexanoát R 10

methyl-oktanoát R 10

methyl-dekanoát R 20

methyl-laurát R 20









methyl-palmitát R 10

methyl-stearát R 15

methyl-arachidát R 20

methyl-oleát R 20

methyl-ikosenoát R 10

methyl-behenát R 10

methyl-lignocerát R 10

Měří se redukovaný retenční čas (t’R) každého píku na

chromatogramu porovnávacího roztoku (a), t’R je retenční

čas měřený od času píku rozpouštědla a ne od doby nástřiku.

Vynese se kalibrační přímka:

log (t’R) = f (ekvivalentní délky řetězce).

Logaritmy t’R nenasycených kyselin jsou umístěny na této

přímce v bodech odpovídajících necelým číslům uhlíkových

atomů, která se nazývají „ekvivalentní délky řetězce“;

ekvivalentní délka řetězce je délka teoretického nasyceného

řetězce, který má stejný t’R jako identifikovaná mastná kyselina.

Např. kyselina linolová má stejný t’R jako teoretická

nasycená mastná kyselina s počtem uhlíků 18,8.

Identifikace píků na chromatogramu zkoušeného roztoku se

provádí pomocí kalibrační přímky a redukovaných retenčních

časů. Ekvivalentní délky řetězců jsou uvedeny v tabulce

2.4.22-4.

Tab. 2.4.22-4 Ekvivalentní délky řetězců (tato hodnota,

která byla vypočítána za použití kalibračních křivek, je

uvedena jako příklad pro kolonu s makrogolem 20 000 R)

Mastná kyselina Ekvivalentní délka

řetězce

kyselina hexanová 6,0

kyselina oktanová 8,0

kyselina dekanová 10,0

kyselina laurová 12,0

kyselina myristová 14,0

kyselina palmitová 16,0

kyselina palmitolejová 16,3

kyselina margarová 17,0

kyselina stearová 18,0

kyselina olejová 18,3

kyselina linolová 18,8

kyselina gama-linolenová 19,0

kyselina alfa-linolenová 19,2

kyselina arachidová 20,0

kyselina ikosenová

20,2

(kyselina gondoová)

kyselina arachidonová 21,2

kyselina behenová 22,0

kyselina eruková 22,2

kyselina 12-oxostearová 22,7

kyselina ricinolejová 23,9

kyselina 12-hydroxystearová 23,9

kyselina lignocerová 24,0

kyselina nervonová 24,2

Kvantitativní analýza. Obvykle se používá metoda normalizace,

při které je součet ploch píků na chromatogramu,

kromě píku rozpouštědla, brán jako 100 %. Obsah

složky se vypočítá jako procentuální podíl plochy odpovídajícího

píku z celkového součtu ploch všech píků. Nepřihlíží

se k píkům, jejichž plocha je menší než 0,05 %

celkové plochy.

V některých případech, např. za přítomnosti mastných kyselin

s dvanácti nebo méně uhlíkovými atomy, mohou být

v jednotlivém článku předepsány korekční faktory převodu

ploch píků na procenta.

METODA B


mastných kyselin s epoxy-, hydroepoxy-, hydroperoxy-,

cyklopropyl- nebo cyklopropenylovými skupinami nebo

pro oleje s číslem kyselosti vyšším než 2,0.

Zkoušený roztok. Do 10ml centrifugační zkumavky se šroubovacím

uzávěrem se naváží 0,100 g zkoušené látky. Rozpustí

se v 1 ml heptanu R a 1 ml dimethyl-karbonátu R a intenzivně

se míchá za mírného zahřívání (50 °C až 60 °C).

Ještě za tepla se přidá 1 ml roztoku sodíku R (12 g/l)

v methanolu bezvodém R, který se připraví za nezbytných

bezpečnostních opatření, a intenzivně se míchá asi 5 min.

Přidají se 3 ml vody destilované R a intenzivně se míchá asi

30 s. Odstřeďuje se 15 min při 1500 g. Nastříkne se 1 µl organické

fáze.

Zkušební

metody

2.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 237

2.4.23 STEROLY V MASTNÝCH OLEJÍCH

Porovnávací roztoky a vyhodnocení chromatogramů. Pokud

není v daném článku uvedeno jinak, použije se postup

uvedený v metodě A.

Kolona:

– materiál: tavený křemen;

– rozměry: délka 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm;


0,25 µm).

Nosný plyn. Helium pro chromatografii R.

Průtoková rychlost. 0,9 ml/min.

Dělicí poměr. 1 : 100.

Teplota:

Čas

(min)

kolona 0–15

15–36

36–61

Teplota

(°C)

100

100 ® 225

225

nástřikový prostor 250

detektor 250


Nástřik. 1 μl.

METODA C


mastných kyselin s epoxy-‚ hydroepoxy-, hydroperoxy-,

aldehydovými, ketonovými, cyklopropyl- a cyklopropenylovými

skupinami a konjugované polynenasycené a acetylenové

sloučeniny, protože dochází k částečnému nebo

celkovému rozpadu těchto skupin.

Zkoušený roztok. Ve 25ml kuželové baňce se rozpustí

0,10 g zkoušené látky ve 2 ml roztoku hydroxidu draselného

R (20 g/l) v methanolu R a vaří se 30 min pod zpětným

chladičem. Zpětným chladičem se přidají 2,0 ml fluoridu

boritého v methanolu RS, vaří se 30 min a pak se zpětným

chladičem přidají 4 ml heptanu R a vaří se 5 min. Baňka se

ochladí, přidá se 10,0 ml chloridu sodného nasyceného RS,

třepe se asi 15 s a přidá se takové množství chloridu sodného

nasyceného RS, aby horní vrstva vystoupila k hrdlu baňky.

Z horní vrstvy se odeberou 2 ml, promyjí se třikrát 2 ml

vody R a vysuší se nad síranem sodným bezvodým R.

Porovnávací roztoky, chromatografický postup a vyhodnocení

chromatogramů. Pokud není v článku uvedeno jinak,

použije se postup uvedený v Metodě A.


10.0:20423

Pokud není v článku stanovena metoda, použije se Metoda

A. Jakékoliv změny Metody A na Metodu B se musí

validovat.

METODA A

Separace sterolového podílu (Tenkovrstvá chromatografie)

Připraví se nezmýdelnitelný podíl a potom se izoluje sterolový

podíl mastného oleje tenkovrstvou chromatografií

(2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R

o tloušťce 0,2 mm až 0,5 mm.

Zkoušený roztok (a). Do baňky na 150 ml se zpětným chladičem

se převede příslušný objem roztoku betulinu R (2 g/l)

v dichlormethanu R. Obsah betulinu v tomto roztoku odpovídá

asi 10 % obsahu sterolů ve zkoušeném vzorku (např.

v případě olivového oleje se přidá 500 μl, k ostatním rostlinným

olejům se přidá 1500 μl roztoku betulinu). Jestliže

je v článku uveden požadavek na obsah jednotlivých sterolů

vyjádřený jako procento sterolového podílu, může se

přídavek betulinu vynechat. Roztok se odpaří v proudu dusíku

R do sucha a přidá se 5,00 g zkoušené látky (m). Přidá

se 50 ml hydroxidu draselného 2 mol/l v ethanolu RS a zahřívá

se 1 h na vodní lázni pod zpětným chladičem za častého

protřepávání. Po ochlazení na teplotu nižší než 25 °C

se obsah baňky převede do dělicí nálevky pomocí 100 ml

vody R. Protřepe se opatrně třikrát 100 ml etheru prostého

peroxidických látek R. Spojené etherové výtřepky se v další

dělicí nálevce mírně protřepávají několik minut se 40 ml

vody R. Po oddělení se vodná vrstva odstraní a etherová

vrstva se protřepává několikrát 40 ml vody R tak dlouho, až

vodná vrstva již nereaguje zásaditě na fenolftalein. Etherová

vrstva se převede do předem zvážené baňky, dělicí nálevka

se promyje etherem prostým peroxidických látek R

a promývací tekutina se přidá k roztoku v baňce. Ether se

opatrně oddestiluje, zbytek se smíchá se 6 ml acetonu R,

rozpouštědlo se opatrně odpaří v proudu dusíku R a suší se

při 100 °C až 105 °C do konstantní hmotnosti. Nechá se

ochladit v exsikátoru a zváží se. Zbytek se převede pomocí

dichlormethanu R do malé zkumavky a odpaří se v proudu

dusíku R na objem asi 1 ml. V závislosti na obsahu nezmýdelnitelného

podílu oleje se upraví konečná koncentrace

roztoku na 25 mg/ml až 50 mg/ml.

Zkoušený roztok (b). Použije se 5,00 g oleje řepkového R.

Postupuje se způsobem uvedeným v odstavci Zkoušený

roztok (a) počínaje slovy “Přidá se 50 ml hydroxidu draselného

2 mol/l v ethanolu RS”.

Zkoušený roztok (c). Použije se 5,00 g oleje slunečnicového

R. Postupuje se způsobem uvedeným v odstavci Zkoušený

roztok (a) počínaje slovy “Přidá se 50 ml hydroxidu

draselného 2 mol/l v ethanolu RS”.

Porovnávací roztok. 25 mg cholesterolu R a 10 mg betulinu

R se rozpustí v 1 ml dichlormethanu R.

Pro každý zkoušený roztok se použije samostatná deska. Na

desku se nanese odděleně do proužku 10 mm, 20 mm od

dolního okraje a 10 mm od levého okraje desky 10 μl porovnávacího

roztoku a do proužků 150 mm, 20 mm od dolního

okraje po 0,5 ml zkoušených roztoků (a), (b) nebo (c).

Vyvíjí se směsí objemových dílů etheru R a hexanu R

(35 + 65) po dráze 17 cm. Desky se usuší v proudu dusíku

R, postříkají se roztokem dichlorfluoresceinu R (2 g/l)

v ethanolu bezvodém R a pozorují se v ultrafialovém světle

při 254 nm. Na chromatogramu porovnávacího roztoku

jsou skvrny odpovídající cholesterolu a betulinu. Na chromatogramech

zkoušených roztoků jsou skvrny podobných

hodnot RF, které odpovídají sterolům. Z každého chromatogramu

se vyjme plocha vrstvy odpovídající ploše sterolových

skvrn a, kromě toho i plochy 2 mm až 3 mm nad

a pod těmito skvrnami odpovídajícími skvrnám na chromatogramu

porovnávacího roztoku a převedou se odděleně do

tří 50ml baněk. Do každé baňky se přidá 15 ml dichlorme-

238 ČL 2017 – Dopl. 2020


thanu R a zahřívá se 15 min pod zpětným chladičem za míchání.

Každý roztok se zfiltruje přes filtr ze slinutého

skla (40) (2.1.2) nebo přes vhodný filtrační papír a každý

filtr se promyje třikrát 15 ml dichlormethanu R. Filtráty

a promývací tekutiny z každé filtrace se spojí odděleně ve

třech baňkách a odpaří se v proudu dusíku R na 5 ml až

10 ml. Tyto zbytky se převedou do malých zkumavek

a odpaří se v proudu dusíku R do sucha.

Stanovení sterolů

Plynová chromatografie (2.2.28). Zkouška se provádí za

chránění před vlhkostí a roztoky se připraví těsně před použitím.

Zkoušený roztok. Ke sterolům získaným ze zkoušené látky

separací tenkovrstvou chromatografií se přidá čerstvě připravená

směs 0,04 ml chlortrimethylsilanu R, 0,1 ml hexamethyldisilazanu

R a 0,5 ml pyridinu bezvodého R. Nechá

se stát nejméně 5 min a použije se kapalná fáze.

Porovnávací roztok (a). K 9 dílům sterolů získaných z oleje

řepkového R separací tenkovrstvou chromatografií se přidá

1 díl cholesterolu R. Ke směsi se přidá čerstvě připravená

směs 0,04 ml chlortrimethylsilanu R, 0,1 ml hexamethyldisilazanu

R a 0,5 ml pyridinu bezvodého R. Nechá se stát

nejméně 5 min a použije se kapalná fáze.

Porovnávací roztok (b). Ke sterolům získaným z oleje slunečnicového

R separací tenkovrstvou chromatografií se přidá

čerstvě připravená směs 0,04 ml chlortrimethylsilanu R,

0,1 ml hexamethyldisilazanu R a 0,5 ml pyridinu bezvodého

R. Nechá se 5 min stát a použije se kapalná fáze.

Kolona:


– rozměry: délka 20 m až 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm až

0,32 mm;

– stacionární fáze: poly(difenyl)(dimethyl)siloxan R nebo

poly(fenylkyanpropyl)(14)(methyl)(86)siloxan R (tloušťka

filmu 0,25 μm).

Nosný plyn. Vodík pro chromatografii R nebo helium pro

chromatografii R.

Lineární rychlost. 30 cm/s až 50 cm/s (vodík) nebo 20 cm/s

až 35 cm/s (helium).

Dělicí poměr. 1 : 50 (vodík) nebo 1 : 100 (helium).

Teplota:

– kolona: 260 °C;

– nástřikový prostor: 280 °C;

– detektor: 290 °C.


Nástřik. 1 μl.

Identifikace píků. Na chromatogramu porovnávacího roztoku

(a) jsou čtyři hlavní píky odpovídající cholesterolu,

brassikasterolu, kampesterolu a b-sitosterolu. Na chromatogramu

porovnávacího roztoku (b) jsou čtyři hlavní píky

odpovídající kampesterolu, stigmasterolu, b-sitosterolu

a D 7 -stigmastenolu. Relativní retence sterolů vztažené

k b-sitosterolu (hlavní pík) jsou uvedeny v tabulce 2.4.23-1.

Pík vnitřního standardu (betulin) musí být zřetelně oddělen

od píků stanovovaných sterolů.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku se určí totožnost

píků, obsah jednotlivých sterolů ve sterolovém podílu

zkoušené látky v procentech se vypočítá podle vzorce:

A

×100 ,

S

v němž značí:

A – plochu píku odpovídajícího stanovované složce;

S – součet ploch píků odpovídajících složkám uvedeným

v tabulce 2.4.23-1; nepřihlíží se k píku betulinu.

Zkušební

metody

2.4

Tab. 2.4.23-1 Relativní retence sterolů vztažené k b-sitosterolu na dvou různých kolonách

poly(fenylkyanpropyl)(14)(me-thyl)(86)siloxan

poly(difenyl)(dimethyl)siloxan

cholesterol 0,64 0,63

brassikasterol 0,70 0,71

24-methylencholesterol 0,79 0,80

kampesterol 0,82 0,81

kampestanol 0,83 0,82

stigmasterol 0,87 0,87

D 7 -kampesterol 0,93 0,92

D 5,23 -stigmastadienol 0,95 0,95

klerosterol 0,96 0,96

b-sitosterol 1 1

sitostanol 1,01 1,02

D 5 -avenasterol 1,03 1,03

D 5,24 -stigmastadienol 1,09 1,08

D 7 -stigmastenol * 1,13 1,12

D 7 -avenasterol 1,18 1,16

betulin 1,4 1,4

*Tento pík může být v literatuře označen jako D 7 -stigmasterol.

ČL 2017 – Dopl. 2020 239


Je-li to požadováno v článku, vypočítá se obsah jednotlivých

sterolů v miligramech na 100 g zkoušené látky podle

vzorce:

A× m¢

× 100

,

A¢

× m

v němž značí:

A – plochu píku stanovované složky;

A´ – plochu píku odpovídající betulinu;


m´ – hmotnost přidaného betulinu R v miligramech.

METODA B

Příprava nezmýdelnitelného podílu

Připraví se nezmýdelnitelný podíl způsobem uvedeným ve

zkoušce Nezmýdelnitelný podíl v článku zkoušené látky.

Pokud tato příprava selže, připraví se nezmýdelnitelný podíl

metodou popsanou ve stati Nezmýdelnitelné látky (2.5.7). Po

konečné neutralizaci se odpaří ethanol, přidá se 6 ml acetonu

R a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se suší při 100 °C až

105 °C, není nezbytné dosáhnout konstantní hmotnosti.

Současně se za stejných podmínek připraví nezmýdelnitelný

podíl oleje slunečnicového R. Toto bude zvláště sloužit

k nalezení celkového sterolového podílu.

Izolace sterolového podílu

Kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Zbytek získaný při přípravě nezmýdelnitelného

podílu se převede do 15ml zkumavky třemi 4ml objemy

rozpouštědla použitého k přípravě nezmýdelnitelného

podílu (obvykle etheru R nebo petroletheru R). Odpaří se

do sucha v proudu dusíku R. Zbytek se rozpustí v mobilní

fázi na roztok o koncentraci asi 40 mg/ml. Ke zvýšení rozpustnosti

se přidá několik kapek propan-2-olu R1 (obvykle

k úplnému rozpuštění stačí tři kapky) a zfiltruje se přes

membránový filtr (jmenovitá velikost pórů 0,45 µm).

Porovnávací roztok. Připraví se z oleje slunečnicového R

způsobem popsaným pro zkoušený roztok.

Předkolona:

– rozměry: délka 5 mm, vnitřní průměr 4,6 mm;

– stacionární fáze: silikagel pro chromatografii R (0,5 μm)

s velikostí pórů 6 nm.

Kolona:

– rozměry: délka 0,25 m, vnitřní průměr 4,6 mm;

– stacionární fáze: silikagel pro chromatografii R (0,5 μm)

s velikostí pórů 6 nm.

Mobilní fáze. Směs objemových dílů propan-2-olu R1

a hexanu R (1 + 99).

Průtoková rychlost. 1 ml/min.

Detekce. Spektrofotometrický detektor, 210 nm.

Nástřik. 50 μl.

Identifikace píků sterolů. Sterolový podíl se eluuje na konci

chromatogramu. Pomocí chromatogramu porovnávacího

roztoku, který má dva hlavní píky eluující se v rozmezí

23 min a 32 min, se na detektoru umístěném mimo 15ml

zkumavku se šroubovacím uzávěrem určí daný podíl. Rozpouštědlo

se odstraní v proudu dusíku R.

Stanovení sterolů

Plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok. Ke zbytku získanému se zkoušeným roztokem

předchozí separací kapalinovou chromatografií se

přidá 0,2 ml pyridinu bezvodého R a 0,2 ml směsi objemových

dílů chlortrimethylsilanu R a N,O-bis(trimethylsilyl)-

trifluoracetamidu R (1 + 99). Zkumavka se těsně uzavře

a zahřívá se 20 min při 80 °C. Nechá se ochladit a použije

se kapalná fáze.

Porovnávací roztok. Ke zbytku získanému s porovnávacím

roztokem předchozí separací kapalinovou chromatografií se

přidá 0,2 ml pyridinu bezvodého R a 0,2 ml směsi objemových

dílů chlortrimethylsilanu R a N,O-bis(trimethylsilyl)-

trifluoracetamidu R (1 + 99). Zkumavka se těsně uzavře

a zahřívá se 20 min při 80 °C. Nechá se ochladit a použije

se kapalná fáze.

Standard cholesterolu (cholesterol R) se může použít jako

takový, nebo jako směs se sterolovým podílem slunečnicového

oleje. Derivatizuje se způsobem popsaným pro zkoušený

roztok.

Kolona:



– stacionární fáze: poly(difenyl)(dimethyl)siloxan R

(tloušťka filmu 0,25 μm).




Teplota:

Čas

(min)

kolona 0–38

38–44

44–49

Teplota

(°C)

260

260 ® 290

290


detektor 290


Nástřik. 1 μl až 3 μl (v závislosti na předpokládaném

množství sterolů ve zkoušené látce).

Identifikace píků. Na chromatogramu porovnávacího roztoku

se identifikují píky odpovídající kampesterolu, stigmasterolu,

b-sitosterolu a D 7 -stigmastenolu. Na chromatogramu

zkoušeného roztoku se identifikují píky sterolů za

použití chromatogramu porovnávacího roztoku a relativní

retence vztažené k b-sitosterolu (hlavní pík) jsou uvedené

v tabulce 2.4.23-1.

Test způsobilosti, porovnávací roztok:

– rozlišení: nejméně 4,0 mezi píkem kampesterolu a píkem

stigmasterolu.

Vypočítá se obsah jednotlivých sterolů v podílu sterolů

v procentech zkoušené látky podle vzorce:

A

×100 ,

S

v němž značí:

A – plochu píku odpovídajícího stanovované složce;

S – součet ploch píků odpovídajících složkám uvedeným

v tabulce 2.4.23-1, kromě betulinu.

240 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.24 TOTOŽNOST A KONTROLA ZBYTKOVÝCH ROZPOUŠTĚDEL

2.4.24 TOTOŽNOST A KONTROLA

ZBYTKOVÝCH ROZPOUŠTĚDEL

10.1:20424

Zkušební postupy popsané v této obecné metodě se mohou

použít:

i. pro určení totožnosti většiny zbytkových rozpouštědel

třídy 1 a třídy 2 v léčivých látkách, pomocných látkách

nebo léčivých přípravcích, nejsou-li zbytková rozpouštědla

známa;

ii. jako limitní zkouška pro rozpouštědla třídy 1 a třídy 2,

pokud jsou přítomna v léčivých látkách, pomocných

látkách nebo léčivých přípravcích;

iii. pro kvantifikaci rozpouštědel třídy 2, jsou-li limitní

hodnoty vyšší než 1000 μg/g (0,1 %), nebo pro kvantifikaci

rozpouštědel třídy 3, je-li požadována.

Třídy zbytkových rozpouštědel jsou uvedeny v obecné stati

5.4 Zbytková rozpouštědla.

Jsou popsána tři rozpouštědla pro přípravu vzorku a použité

podmínky pro head-space nástřik plynných vzorků do chromatografického

systému. Jsou předepsány dva chromatografické

systémy, ale přednost je dávána systému A, zatímco

systém B se obvykle používá pro potvrzení totožnosti.

Výběr postupu pro přípravu vzorku závisí na rozpustnosti

zkoušené látky a v některých případech i analyzovaných

zbytkových rozpouštědlech.

Za popsaných podmínek head-space nástřiku nebývají

snadno detekována tato rozpouštědla: formamid, 2-ethoxyethanol,

2-methoxyethanol, ethylenglykol, N-methylpyrrolidon

a sulfolan. Pro kontrolu těchto zbytkových rozpouštědel

by se měly používat jiné vhodné postupy.

Je-li postup zkoušky používán pro kvantitativní stanovení

zbytkových rozpouštědel v látce, musí být validován.

POSTUP

Provede se plynová chromatografie se statickým head-space

nástřikem (2.2.28).

Příprava vzorku 1. Je určena pro kontrolu zbytkových

rozpouštědel v látkách rozpustných ve vodě.

Roztok vzorku (1). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí ve

vodě R a zředí se jí na 20,0 ml.

Příprava vzorku 2. Je určena pro kontrolu zbytkových

rozpouštědel v látkách nerozpustných ve vodě.

Roztok vzorku (2). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí

v dimethylformamidu R (DMF) a zředí se jím na 20,0 ml.

Příprava vzorku 3. Je určena pro kontrolu N,N-dimethylacetamidu

a/nebo N,N-dimethylformamidu, jestliže je známo

nebo jestliže lze předpokládat, že jeden z nich nebo oba

budou přítomny ve zkoušené látce.

Roztok vzorku (3). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v 1,3-

-dimethylimidazolidin-2-onu R (DMI) a zředí se jím na

20,0 ml.

V některých případech není pro přípravu vzorku vhodný

ani jeden z uvedených postupů. V těchto případech se musí

prokázat, že rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku

a podmínky statické head-space analýzy jsou vhodné.

Roztok rozpouštědel (a). K 1,0 ml roztoku zbytkových rozpouštědel

třídy 1 CRL se přidá 9 ml dimethylsulfoxidu R

a zředí vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí

vodou R na 100 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R

na 10,0 ml.

Porovnávací roztoky odpovídají těmto limitům:

– benzen: 2 μg/g;

– tetrachlormethan: 4 μg/g;

– 1,2-dichlorethan: 5 μg/g;

– 1,1-dichlorethen: 8 μg/g;

– 1,1,1-trichlorethan: 10 μg/g.

Roztok rozpouštědel (b). Vhodná množství zbytkových rozpouštědel

třídy 2 se rozpustí v dimethylsulfoxidu R a zředí

se stejným rozpouštědlem na 100,0 ml. Zředí se vodou R

tak, aby koncentrace odpovídala 1/20 limitní hodnoty uvedené

v tabulce 2 (viz 5.4 Zbytková rozpouštědla).

Roztok rozpouštědel (c). 1,00 g rozpouštědla nebo rozpouštědel

přítomných ve zkoušené látce se rozpustí v dimethylsulfoxidu

R nebo ve vodě R, je-li třeba, a zředí se vodou R

na 100,0 ml. Zředí se na koncentraci odpovídající 1/20 limitní

hodnoty uvedené v tabulce 1 nebo 2 (viz 5.4 Zbytková

rozpouštědla).

Kontrolní roztok. Připraví se způsobem popsaným pro roztok

rozpouštědel (c), ale bez přídavku rozpouštědla (rozpouštědel)

(tento roztok se použije k ověření nepřítomnosti

interferujících píků).

Zkoušený roztok. 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml kontrolního

roztoku se převede do lahvičky pro nástřik vzorku.

Porovnávací roztok (a) (třída 1). 1,0 ml roztoku rozpouštědel

(a) a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se převede do lahvičky

pro nástřik vzorku.

Porovnávací roztok (a1) (třída 1). 5,0 ml roztoku vzorku

a 1,0 ml roztoku rozpouštědel (a) se převede do lahvičky


Porovnávací roztok (b) (třída 2). 1,0 ml roztoku rozpouštědel

(b) a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se převede do lahvičky


Porovnávací roztok (c). 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml roztoku

rozpouštědel (c) se převede do lahvičky pro nástřik

vzorku.

Porovnávací roztok (d). 1,0 ml kontrolního roztoku

a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se převede do lahvičky


Lahvičky se vzduchotěsně uzavřou pryžovou zátkou pokrytou

polytetrafluorethylenem a zajistí se hliníkovým uzávěrem.

Roztok se zhomogenizuje protřepáním.

Mohou se použít tyto podmínky statického head-space

nástřiku:

Postup přípravy

vzorku

Pracovní parametry 1 2 3

teplota pro ustavení rovnováhy (°C) 80 105 80

doba ustavování rovnováhy (min) 60 45 45

teplota přechodové kapiláry (°C) 85 110 105

nosný plyn: dusík pro chromatografii R nebo helium pro

chromatografii R při vhodném tlaku

doba tlakování (s) 30 30 30

nastřikovaný objem (ml) 1 1 1

Zkušební

metody

2.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 241


Chromatografický postup se obvykle provádí za použití

systému A:

SYSTÉM A

– křemenná kapilární kolona nebo kolona se širokým průměrem

délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm nebo 0,53 mm

s vnitřní stěnou pokrytou poly[(fenyl)(kyanpropyl)][dimethyl]siloxanem

R (tloušťka filmu 1,8 μm nebo 3 μm);

– dusík pro chromatografii R nebo helium pro chromatografii

R jako nosný plyn při lineární průtokové rychlosti

asi 35 cm/s a dělicím poměru 1 : 5;

– plamenoionizační detektor (může se použít též hmotnostní

spektrometr nebo detektor elektronového záchytu pro

chlorovaná zbytková rozpouštědla třídy 1).

Teplota kolony se udržuje na 40 °C po dobu 20 min, potom

se zvyšuje rychlostí 10 °C/min do 240 °C, při této teplotě se

udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na

140 °C a teplota detektoru na 250 °C.

Dochází-li k interferenci stanovovaných rozpouštědel s matricí,

použije se systém B:

SYSTÉM B

– křemenná kapilární kolona nebo kolona se širokým průměrem

délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm nebo

0,53 mm s vnitřní stěnou pokrytou makrogolem 20 000 R

(tloušťka filmu 0,25 μm);

– dusík pro chromatografii R nebo helium pro chromatografii

R jako nosný plyn při lineární průtokové rychlosti

asi 35 cm/s a dělicím poměru 1 : 5;

– plamenoionizační detektor (může se též použít hmotnostní

spektrometr nebo detektor elektronového záchytu pro

chlorovaná zbytková rozpouštědla třídy 1).

Teplota kolony se udržuje na 50 °C po dobu 20 min, potom

se zvyšuje rychlostí 6 °C/min do 165 °C, při této teplotě se

udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na

140 °C a teplota detektoru na 250 °C.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a) na

kolonu popsanou v systému A a zaznamená se chromatogram

za takových podmínek, aby se mohl stanovit poměr

signálu k šumu pro 1,1,1-trichlorethan. Tento poměr musí

být nejméně 5. Typický chromatogram je uveden na obrázku

2.4.24-1.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a1)

na kolonu popsanou v systému A. Píky odpovídající zbytkovým

rozpouštědlům třídy 1 jsou ještě detekovatelné.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na

kolonu popsanou v systému A a zaznamená se chromatogram

za takových podmínek, aby se mohlo určit rozlišení

mezi píky acetonitrilu a dichlormethanu. Systém je vhodný,

jestliže získaný chromatogram přibližně odpovídá chromatogramu

na obrázku 2.4.24-2 a rozlišení mezi píkem acetonitrilu

a píkem dichlormethanu je nejméně 1,0.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu

popsanou v systému A. Jestliže na získaném chromatogramu

není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových

rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku

(a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům

zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu

zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových


(a) nebo (b), použije se systém B.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a) na

1 = 1,1-dichlorethen 2 = 1,1,1-trichlorethan 3 = tetrachlormethan 4 = benzen 5 = 1,2-dichlorethan

Obr. 2.4.24-1 Typický chromatogram rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro Systém A a Postup 1

(plamenoionizační detektor)

242 ČL 2017 – Dopl. 2020


Zkušební

metody

2.4

1 = methanol 7 = tetrahydrofuran 13 = 1,4-dioxan 19 = směs xylenů

2 = acetonitril 8 = chloroform 14 = pyridin 19a = ethylbenzen

3 = dichlormethan 9 = cyklohexan 15 = methylisobutylketon 19b = p-xylen

4 = hexan 10 = 1,2-dimethoxyethan 16 = toluen 19c = m-xylen

5 = 1,2-dichlorethen 11 = 1,1,2-trichlorethen 17 = methylbutylketon 19d = o-xylen

6 = nitromethan 12 = methylcyklohexan 18 = chlorbenzen 20 = kumen

21 = tetralin

Obr. 2.4.24-2 Chromatogram rozpouštědel třídy 2 (roztok rozpouštědel (b)) za použití podmínek popsaných pro Systém A

a Postup 1 (plamenoionizační detektor)

1 = 1,1-dichlorethen 2 = 1,1,1-trichlorethan 3 = tetrachlormethan 4 = benzen 5 = 1,2-dichlorethan

Obr. 2.4.24-3 Chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro Systém B a Postup 1

(plamenoionizační detektor)

ČL 2017 – Dopl. 2020 243


kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram

za takových podmínek, aby se mohl stanovit poměr

signálu k šumu pro benzen. Tento poměr musí být nejméně

5. Typický chromatogram je uveden na obrázku 2.4.24-3.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a1)

na kolonu popsanou v systému B. Píky odpovídající zbytkovým

rozpouštědlům třídy 1 jsou ještě detekovatelné.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na

kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram

za takových podmínek, aby se mohlo určit rozlišení

mezi píky acetonitrilu a 1,1,2-trichlorethenu. Systém je

vhodný, jestliže získaný chromatogram přibližně odpovídá

chromatogramu na obrázku 2.4.24-4 a rozlišení mezi píkem

acetonitrilu a píkem 1,1,2-trichlorethenu je nejméně 1,0.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu

popsanou v systému B. Jestliže na získaném chromatogramu

není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových

rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího

roztoku (a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům

zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu

zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových


(a) nebo (b) a potvrdí se shoda se zkouškou provedenou

za použití systému A, postupuje se následovně.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na

kolonu popsanou pro systém A nebo systém B. Je-li to nutné,

nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku odpovídajícího

určovanému zbytkovému rozpouštědlu (rozpouštědlům)

byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (d) na

kolonu. Neměly by být pozorovány žádné interferující píky.

Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku a 1 ml

plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na kolonu. Tyto nástřiky

se opakují ještě dvakrát.

Průměrná hodnota plochy píku zbytkového rozpouštědla

(rozpouštědel) na chromatogramu zkoušeného roztoku není

větší než polovina průměrné hodnoty plochy píku odpovídajícího

zbytkového rozpouštědla (rozpouštědel) na chromatogramu

porovnávacího roztoku (c). Zkoušku lze hodnotit,

jestliže relativní směrodatná odchylka rozdílů ploch píků

stanovené látky získaných ze tří párů opakovaných nástřiků

porovnávacího roztoku (c) a zkoušeného roztoku je

nejvýše 15 %.

Průběhový diagram postupu je na obrázku 2.4.24-5.

Jsou-li zbytková rozpouštědla (třída 2 nebo třída 3) přítomna

v koncentracích 0,1 % nebo větších, může se jejich

obsah stanovit metodou standardních přídavků.

1 = methanol 7 = tetrahydrofuran 13 = 1,4-dioxan 19 = směs xylenů

2 = acetonitril 8 = chloroform 14 = pyridin 19a = ethylbenzen

3 = dichlormethan 9 = cyklohexan 15 = methylisobutylketon 19b = p-xylen

4 = hexan 10 = 1,2-dimethoxyethan 16 = toluen 19c = m-xylen

5 = 1,2-dichlorethen 11 = 1,1,2-trichlorethen 17 = methylbutylketon 19d = o-xylen

6 = nitromethan 12 = methylcyklohexan 18 = chlorbenzen 20 = kumen

21 = tetralin (tr = 27 min)

Obr. 2.4.24-4 Typický chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 2 (roztoku rozpouštědel (b)) za použití podmínek popsaných

pro Systém B a Postup 1 (plamenoionizační detektor)

244 ČL 2017 – Dopl. 2020


Zkušební

metody

2.4

Obr. 2.4.24-5 Vývojový diagram pro identifikaci zbytkových rozpouštědel a pro použití limitních zkoušek

ČL 2017 – Dopl. 2020 245

2.4.25 ETHYLENOXID A DIOXAN

2.4.25 ETHYLENOXID A DIOXAN

10.0:20425

Zkouška je určena pro stanovení zbytkového ethylenoxidu

a dioxanu v látkách rozpustných ve vodě nebo v dimethylacetamidu.

Pro látky nerozpustné nebo nedostatečně rozpustné

v těchto rozpouštědlech jsou příprava zkoušeného

roztoku a head-space podmínky uvedeny v jednotlivých


Head-space plynová chromatografie (2.2.28).

A. Pro látky rozpustné nebo mísitelné s vodou lze použít

následující postup.

Zkoušený roztok. Do 10ml lahvičky (může se použít

i jiná velikost, podle podmínek měření) se naváží 1,00 g

(MT) zkoušené látky a přidá se 1,0 ml vody R. Lahvička

se uzavře, obsah se protřepe, aby vznikl homogenní roztok,

a nechá se stát 45 min při 70 °C.

Porovnávací roztok (a). Do 10ml lahvičky stejného

druhu jako u zkoušeného roztoku se naváží 1,00 g (MR)

zkoušené látky, přidá se 0,50 ml dioxanu RS2 a 0,50 ml

ethylenoxidu RS3. Lahvička se uzavře, obsah se protřepe,

aby vznikl homogenní roztok, a nechá se stát 45 min

při 70 °C.

Porovnávací roztok (b). K 0,50 ml ethylenoxidu RS3

v 10ml lahvičce se přidá 0,1 ml čerstvě připraveného

roztoku acetaldehydu R (0,01 g/l) a 0,10 ml dioxanu

RS1. Lahvička se uzavře, obsah se protřepe, aby

vznikl homogenní roztok, a nechá se stát 45 min při

70 °C.

B. Pro látky rozpustné nebo mísitelné s dimethylacetamidem

lze použít následující postup.

Zkoušený roztok. Do 10ml lahvičky (může se použít

i jiná velikost, podle podmínek měření) se naváží 1,00 g

(MT) zkoušené látky a přidá se 0,20 ml vody R a 1,0 ml

dimethylacetamidu R. Lahvička se uzavře, obsah se protřepe,

aby vznikl homogenní roztok, a nechá se stát

45 min při 90 °C.

Porovnávací roztok (a). Do 10ml lahvičky stejného

druhu jako u zkoušeného roztoku se naváží 1,00 g (MR)

zkoušené látky, přidá se 0,10 ml dioxanu RS1, 0,10 ml

ethylenoxidu RS2 a 1,0 ml dimethylacetamidu R. Lahvička

se uzavře, obsah se protřepe, aby vznikl homogenní

roztok, a nechá se stát 45 min při 90 °C.

Porovnávací roztok (b). K 0,10 ml ethylenoxidu RS2

v 10ml lahvičce se přidá 0,1 ml čerstvě připraveného

roztoku acetaldehydu R (0,01 g/l) a 0,10 ml dioxanu

RS1. Lahvička se uzavře, obsah se protřepe, aby

vznikl homogenní roztok, a nechá se stát 45 min při

70 °C.

Kolona:

– materiál: sklo nebo tavený křemen;


– stacionární fáze: polydimethylsiloxan R (tloušťka

filmu 1,0 μm).

Nosný plyn. Helium pro chromatografii R nebo dusík

pro chromatografii R.

Lineární rychlost. 20 cm/s.


Mohou se použít statické head-space podmínky:

– teplota ustavování rovnováhy: 70 °C (90 °C pro

roztoky v dimethylacetamidu);

– doba ustavování rovnováhy: 45 min;

– teplota spojovacího vedení: 75 °C (150 °C pro

roztoky v dimethylacetamidu);

– nosný plyn: helium pro chromatografii R;

– doba tlakování: 1 min;

– doba nástřiku: 12 s.

Teplota:

Čas

(min)

kolona 0–5

5–31

31–32,5

32,5–37,5

nástřikový prostor

Teplota

(°C)

50

50 ® 180

180 ® 230

230

150

detektor 250


Nástřik. Nastříkne se vhodný objem, např. 1,0 ml plynné

fáze zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků

(a) a (b). Celý postup se opakuje dvakrát.

Test způsobilosti, porovnávací roztok (b):

– rozlišení: nejméně 2,0 mezi píkem acetaldehydu

a píkem ethylenoxidu;

– poměr signálu k šumu: nejméně 5 pro pík ethylenoxidu

a pík dioxanu.

Ověření preciznosti

Pro každou dvojici nástřiků se pro ethylenoxid a dioxan

vypočítá rozdíl ploch mezi píky získanými se zkoušeným

roztokem a s porovnávacím roztokem (a). Zkoušku lze

hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka ze tří nástřiků

pro ethylenoxid je nejvýše 15 % a relativní směrodatná

odchylka ze tří nástřiků pro dioxan je nejvýše 15 %.

Jestliže se navážky pro zkoušený roztok a porovnávací roztok

(a) liší u 1,00 g o více než 0,5 %, je nutno použít vhodnou

korekci.

Obsah ethylenoxidu v mikrogramech na gram se vypočítá

podle vzorce:

v němž značí:

( A × M ) - ( A × M )

R

A × C

T

T

AT – plochu píku ethylenoxidu na chromatogramu zkoušeného

roztoku;

AR – plochu píku ethylenoxidu na chromatogramu porovnávacího

roztoku (a);

MT – hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku

v gramech;

MR – hmotnost zkoušené látky v porovnávacím roztoku (a)

v gramech;

C – množství ethylenoxidu přidané k porovnávacímu roztoku

(a) v mikrogramech.

T

R

,

246 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.26 N,N-DIMETHYLANILIN

Obsah dioxanu v mikrogramech na gram se vypočítá podle

vzorce:

DT

× C

,

D × M - D × M

v němž značí:

( ) ( )

DT – plochu píku dioxanu na chromatogramu zkoušeného

roztoku;

DR – plochu píku dioxanu na chromatogramu porovnávacího

roztoku (a);

MT – hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku

v gramech;

MR – hmotnost zkoušené látky v porovnávacím roztoku (a)

v gramech;

C – množství dioxanu přidané k porovnávacímu roztoku

(a) v mikrogramech.

2.4.26 N,N-DIMETHYLANILIN

R

T

10.0:20426

METODA A

Zkouší se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití

N,N-diethylanilinu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 50 mg N,N-diethylanilinu R se

rozpustí ve 4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí

se vodou R na 50 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí vodou

R na 100 ml.

Zkoušený roztok. 0,50 g se rozpustí ve zkumavce se skleněnou

zabroušenou zátkou ve 30,0 ml vody R. Přidá se 1,0 ml

roztoku vnitřního standardu. Teplota roztoku se upraví na

26 °C až 28 °C. Přidá se 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného

RS a míchá se do úplného rozpuštění. Přidají se

2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají

oddělit. Použije se horní vrstva.

Porovnávací roztok. 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se rozpustí

ve 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí

se vodou R na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou

R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R

na 30,0 ml. Přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu

a 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS. Přidají se

2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají

oddělit. Použije se horní vrstva.


– křemenné kapilární kolony délky 25 m a vnitřního průměru

0,32 mm s vnitřní stěnou pokrytou filmem sesíťovaného

polyfenylmethylsiloxanu R (tloušťka filmu 0,52 µm);

– helia pro chromatografii R jako nosného plynu s dělicím

poměrem 1 : 20, vstupním tlakem na koloně 50 kPa

a průtokem na děliči 20 ml/min;

– plamenoionizačního detektoru;

– vstřikovací trubice, která se skládá z kolony dlouhé asi

1 cm naplněné křemelinou pro plynovou chromatografii

R impregnovanou 10 % polydimethylsiloxanu R.

Teplota kolony se udržuje 5 min na 150 °C, pak se zvyšuje

rychlostí 20 °C/min do 275 °C a při této teplotě se udržuje

3 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 220 °C

a teplota detektoru na 300 °C.

Retenční časy jsou: pro N,N-dimethylanilin asi 3,6 min

a pro N,N-diethylanilin asi 5,0 min.

Nastřikuje se 1 µl zkoušeného roztoku a 1 µl porovnávacího

roztoku.

T

R

METODA B

Zkouší se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití naftalenu

R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 50 mg naftalenu R se rozpustí

v cyklohexanu R a zředí se jím na 50 ml. 5 ml tohoto roztoku

se zředí cyklohexanem R na 100 ml.

Zkoušený roztok. K 1,00 g zkoušené látky ve zkumavce se

skleněnou zabroušenou zátkou se přidá 5 ml hydroxidu

sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu.

Zkumavka se uzavře a intenzivně se třepe 1 min. Je-li třeba,

odstředí se. Použije se horní vrstva.

Porovnávací roztok. K 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se

přidají 2 ml kyseliny chlorovodíkové R a 20 ml vody R, třepe

se do rozpuštění a zředí se vodou R na 50,0 ml. 5,0 ml

tohoto roztoku se zředí vodou R na 250,0 ml. K 1,0 ml tohoto

roztoku se ve zkumavce se skleněnou zabroušenou

zátkou přidá 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml

roztoku vnitřního standardu. Zkumavka se uzavře a intenzivně

se třepe 1 min. Je-li třeba, odstředí se. Použije se horní

vrstva.


– skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné

křemelinou silanizovanou pro plynovou chromatografii

R impregnovanou 3 % polyfenylmethylsiloxanu R;

– dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové

rychlosti 30 ml/min;

– plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 120 °C, teplota nástřikového

prostoru a detektoru na 150 °C.

Nastřikuje se 1 µl zkoušeného roztoku a 1 µl porovnávacího

roztoku.

2.4.27 TĚŽKÉ KOVY V ROSTLINNÝCH

DROGÁCH A PŘÍPRAVCÍCH

Z ROSTLINNÝCH DROG

8.2:20427

UPOZORNĚNÍ. Při použití uzavřené vysokotlaké digesční

nádobky a mikrovlnného laboratorního zařízení je třeba

dodržovat bezpečnostní instrukce výrobce a návod k použití.

PŘÍSTROJ

Přístroj se obvykle skládá z těchto částí:

– polytetrafluorethylenové, perfluoralkoxypolymerové,

křemenné nebo skleněné digesční nádobky o objemu

20 ml až 150 ml, opatřené vzduchotěsným uzávěrem,

ventilem umožňujícím nastavení tlaku uvnitř nádobky

a polytetrafluorethylenovou trubicí umožňující vypouštění

plynu;

– systému zajišťujícího vzduchotěsnost nádobek, používajícího

stejnou sílu otočení pro každou z nich;

– programovatelné mikrovlnné pícky (např. s frekvencí

magnetronu 2450 MHz, s nastavitelným výkonem od 0

do 1500 ±70 W při 1% nárůstu), s vnitřním prostorem

pícky pokrytým polytetrafluorethylenem a vybaveným

odsávacím ventilátorem s proměnlivou rychlostí

odsávání, s rotační kruhovou deskou a odsávací trubičkou

k odvodu dýmů;

Zkušební

metody

2.4

ČL 2017 – Dopl. 2020 247

2.4.27 TĚŽKÉ KOVY V ROSTLINNÝCH DROGÁCH A PŘÍPRAVCÍCH Z ROSTLINNÝCH DROG

– atomového absorpčního spektrometru (2.2.23), atomového

emisního spektrometru s indukčně vázaným plazmatem

(2.2.57) nebo hmotnostního spektrometru s indukčně

vázaným plazmatem (2.2.58).

POSTUP

Zkouší se atomovou absorpční spektrometrií (AAS)

(2.2.23), atomovou emisní spektrometrií s indukčně vázaným

plazmatem (ICP-AES) (2.2.57) nebo hmotnostní spektrometrií

s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS)

(2.2.58).

Odchylky od experimentálních parametrů při přípravě vzorku

a dále popsané metodě jsou přijatelné, pokud jsou splněny

validační požadavky a způsobilost systému byla ověřena

v den analýzy.

Příprava vzorku

Veškeré laboratorní sklo a pomůcky se před použitím umyjí

roztokem kyseliny dusičné R (10 g/l).

Zkoušený roztok. Do digesční nádobky se převede předepsané

množství zkoušené látky [asi 0,50 g práškované rostlinné

drogy (1400) (2.9.12)]. Přidají se 4 ml kyseliny chlorovodíkové

prosté těžkých kovů R a 6 ml kyseliny dusičné

prosté těžkých kovů R. Nádobka se vzduchotěsně uzavře.

Digesční nádobky se umístí do mikrovlnné pícky. Digesce

se provádí se sedmi nádobkami obsahujícími zkoušený roztok

ve třech krocích za použití následujících podmínek:

80 % výkonu po dobu 15 min; 100 % výkonu po dobu

5 min; 80 % výkonu po dobu 20 min.

Na konci cyklu se nádobky nechají vychladnout na vzduchu

nebo ve vodě. Po ochlazení se každá digesční nádobka

otevře a získaný čirý, bezbarvý roztok se převede do 50ml

odměrné baňky. Každá digesční nádobka se promyje dvakrát

po 15 ml kyseliny dusičné prosté těžkých kovů zředěné

RS, promývací tekutiny se také převedou do odměrné

baňky a zředí se vodou R na 50,0 ml. Je-li třeba, mohou se

použít modifikátory [např. 1,0 ml roztoku dusičnanu hořečnatého

R (10 g/l) a 1,0 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu

amonného R (100 g/l) v případě AAS s elektrotermickou

atomizační metodou] a stabilizátory.

Kontrolní roztok. 4 ml kyseliny chlorovodíkové prosté těžkých

kovů R a 6 ml kyseliny dusičné prosté těžkých kovů R

se smíchají v digesční nádobce. Digesce se provede stejným

způsobem jako u zkoušeného roztoku.

STANOVENÍ ARSENU, KADMIA, MĚDI, NIKLU A OLOVA

ZA POUŽITÍ AAS (2.2.23) S ELEKTROTERMICKOU

ATOMIZAČNÍ METODOU

Obsah arsenu, kadmia, mědi, niklu a olova se stanoví přímou

kalibrací (2.2.23, Metoda I) nebo metodou standardního

přídavku (2.2.23, Metoda II) za použití porovnávacích

roztoků jednotlivých těžkých kovů a parametrů měření doporučených

v tabulce 2.4.27-1.

Hodnota absorbance kontrolního roztoku se odečte od hodnoty

absorbance zkoušeného roztoku.

STANOVENÍ ARSENU A RTUTI ZA POUŽITÍ AAS

(2.2.23) S METODOU STUDENÝCH PAR NEBO

HYDRIDOVOU METODOU

Obsah arsenu a rtuti se stanoví přímou kalibrací (2.2.23,

Metoda I) nebo metodou standardního přídavku (2.2.23,

Tab. 2.4.27-1 Parametry měření pro AAS s elektrotermickou

atomizační metodou

As Cd Cu Ni Pb

vlnová délka (nm) 193,7 228,8 324,8 232 283,5

šířka štěrbiny (nm) 0,5 0,5 0,5 0,2 0,5

proud lampy (mA) 10 6 7 10 5

teplota

1400 800 800 800 800

pyrolýzy (°C)

teplota

2600 1800 2300 2500 2200

atomizace (°C)

průtok plynu (l/min) 3 3 3 3 3

Metoda II) za použití porovnávacích roztoků arsenu nebo

rtuti a automatického kontinuálně průtokového systému

vyvíjení hydridových par.

Hodnota absorbance kontrolního roztoku se odečte od hodnoty

absorbance zkoušeného roztoku.

Arsen

Roztok vzorku. K 19,0 ml zkoušeného roztoku nebo kontrolního

roztoku, jak je popsáno výše, se přidá 1 ml roztoku jodidu

draselného R (200 g/l). Zkoušený roztok se nechá stát

při teplotě místnosti asi 50 min nebo 4 min při teplotě 70 °C.

Kyselé zkoumadlo. Kyselina chlorovodíková prostá těžkých

kovů R.

Redukční zkoumadlo. Roztok tetrahydridoboritanu sodného

R (6 g/l) v roztoku hydroxidu sodného R (5 g/l).

Mohou být použity doporučené parametry měření popsané

v tabulce 2.4.27-2.

Rtuť

Roztok vzorku. Zkoušený roztok nebo kontrolní roztok, jak

je popsáno výše.

Kyselé zkoumadlo. Roztok kyseliny chlorovodíkové prosté

těžkých kovů R (515 g/l).

Redukční zkoumadlo. Roztok chloridu cínatého R (10 g/l)

v kyselině chlorovodíkové prosté těžkých kovů zředěné RS.

Mohou být použity doporučené parametry měření popsané

v tabulce 2.4.27-2.

Tab. 2.4.27-2 Parametry měření pro AAS s metodou studených

par nebo hydridovou metodou

As Hg

vlnová délka (nm) 193,7 253,7

šířka štěrbiny (nm) 0,2 0,5

proud lampy (mA) 10 4

průtoková rychlost

1,0 1,0

kyselého zkoumadla (ml/min)


1,0 1,0

redukčního zkoumadla (ml/min)


7,0 7,0

roztoku vzorku (ml/min)

absorpční kyveta

křemenná křemenná

(vyhřívaná) (nevyhřívaná)

průtok dusíku (l/min) 0,1 0,1

248 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.27 TĚŽKÉ KOVY V ROSTLINNÝCH DROGÁCH A PŘÍPRAVCÍCH Z ROSTLINNÝCH DROG

Tab. 2.4.27-3 Parametry měření pro ICP-AES

vlnová délka (nm) 193,696

197,197

189,042

As Cd Cu Hg Ni Pb

214,438

226,502

228,802

324,754

327,396

224,700

184,950

253,652

435,835

231,604

231,997

352,454

220,351

283,306

168,215

čára Ar (nm) 430,010 430,010 430,010 430,010 430,010 430,010

energie plazmy (W) 1200 1200 1200 1200 1200 1200

algoritmus píků s korekcí pozadí ano ano ano ano ano ano

Zkušební

metody

2.5

STANOVENÍ ARSENU, KADMIA, MĚDI, RTUTI, NIKLU

A OLOVA ZA POUŽITÍ ICP-AES (2.2.57)

Obsah arsenu, kadmia, mědi, rtuti, niklu a olova se stanoví

přímou kalibrací (2.2.23, Metoda I) za použití porovnávacích

roztoků jednotlivých těžkých kovů nebo směsi všech

měřených kovů o známých koncentracích a parametrů měření

doporučených v tabulce 2.4.27-3.

Hodnota emise kontrolního roztoku se odečte od hodnoty

emise zkoušeného roztoku.

STANOVENÍ ARSENU, KADMIA, MĚDI, RTUTI, NIKLU

A OLOVA ZA POUŽITÍ ICP-MS (2.2.58)

Obsah arsenu, kadmia, mědi, rtuti, niklu a olova se stanoví

přímou kalibrací (2.2.23, Metoda I) za použití porovnávacích

roztoků jednotlivých těžkých kovů o známých koncentracích

a doporučených analytických izotopů a doplňkových

hmotností doporučených v tabulce 2.4.27-4.

Intenzita signálu kontrolního roztoku se odečte od hodnoty

naměřené u zkoušeného roztoku.

Tab. 2.4.27-4 Doporučené analytické izotopy a doplňkové

hmotností pro ICP-AES

Izotop

75

106, 108, 111, 114

63, 65

202

60, 62

206, 207, 208

Hledaný prvek

arsen

kadmium

měď

rtuť

nikl

olovo


V den analýzy musí být proveden test způsobilosti, aby se

zajistilo, že příprava vzorku a měřicí systém jsou vyhovující.

Kritérium přijatelnosti pro přípravu roztoku vzorku. Získá

se čirý roztok.

Kritérium přijatelnosti pro měřicí systém. Naměřená koncentrace

standardního roztoku kovu o koncentraci v rozsahu

použité kalibrační křivky se neliší od skutečné koncentrace

o více než 20 %.


Použité analytické postupy musí být zvalidovány v souladu

s příslušnými obecnými statěmi: AAS (2.2.23), ICP-AES

(2.2.57) a ICP-MS (2.2.58). Musí být splněna dále uvedená

kritéria.

SPECIFIČNOST

Specifičnost je schopnost zajistit, aby analytické postupy

použité pro přípravu a měření vzorků umožnily spolehlivé

stanovení kovu (kovů) v látce vedle jiných předvídatelných

složek (např. nosný plyn, nečistoty, matrice).

Kritéria přijatelnosti. Postup musí umožnit jednoznačné

hodnocení každého těžkého kovu, který má být takto stanoven

v látce vedle jiných předvídatelných složek, včetně reziduí

jiných kovů, složek matrice a dalších zdrojů interferencí;

specifičnost se prokáže ověřením, že postup pro stanovovaný

kov (kovy), vyhovuje požadavku odstavce Přesnost.

ROZSAH

Rozsah kalibrace každého kovu je v rozmezí lineárního

rozsahu metody; zkoušené roztoky obsahující rezidua mimo

rozsah kalibrace mohou být zředěny na koncentraci

v rozsahu kalibrace.

Kritérium přijatelnosti. Rozsah se prokáže tím, že postup

vyhovuje požadavku odstavce Výtěžnost.

PŘESNOST

Přesnost se ověří použitím certifikovaného referenčního

materiálu (CRM), nebo provedením zkoušky výtěžnosti.

Výtěžnost. Výtěžnost může být stanovena trojmo u vzorků

zkoušené látky s přídavkem známého množství referenčního

standardu kovu (tři úrovně koncentrace v rozmezí 50 %

až 150 % určeného přípustného limitu, i když je původní

koncentrace referenčního standardu specifikována).

Kritérium přijatelnosti. Výtěžnost 70 % až 150 % pro průměr

ze tří stanovení při každé koncentraci.

OPAKOVATELNOST

Zkoušené vzorky. Připraví se buď šest nezávislých vzorků

zkoušené látky s přídavkem vhodného referenčního standardu

o specifikované koncentraci, nebo se připraví vzorky

trojmo ve třech různých koncentracích.


v obou případech větší než hodnota uvedená v tabulce

2.4.27-5.

MEZILEHLÁ PRECIZNOST

Musí se stanovit vliv náhodných událostí (laboratorní variabilita)

na analytickou přesnost metody. Ověření mezilehlé

preciznosti metody je možno provést stanovením opakovatelnosti

analýzy v různých dnech nebo s různým vybavením,

nebo různými analytiky. K ověření se vyžaduje pouze

jedna ze tří uvedených možností.


větší než hodnota uvedená v tabulce 2.4.27-5.

MEZ STANOVITELNOSTI

Stanoví se nejnižší koncentrace, která vyhovuje kritériu přijatelnosti.

Použijí se výsledky získané při stanovení přesnosti.

Kritérium přijatelnosti. Mez stanovitelnosti je nižší než

přípustný limit.

ČL 2017 – Dopl. 2020 249

2.4.28 KYSELINA 2-ETHYLHEXANOVÁ

Tab. 2.4.27-5

Rozsah

koncentrace

kovu (mg/kg)

Opakovatelnost

(RSD)

(%)

Mezilehlá

preciznost (RSD)

(%)

0,01–1 20 32

>1 10 16

MEZ DETEKCE (POUŽITELNÉ JEN U LIMITNÍCH

ZKOUŠEK)

Stanoví se nejnižší koncentrace, která dává signál zřetelně

odlišný od signálu získaného s kontrolním roztokem.

Kritérium přijatelnosti. Mez detekce je nejvýše 0,1násobek

koncentrace přípustného limitu.

2.4.28 KYSELINA 2-ETHYLHEXANOVÁ

6.0:20428

Zkouší se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití kyseliny

3-cyklohexylpropionové R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 100 mg kyseliny 3-cyklohexylpropionové

R se rozpustí v cyklohexanu R a zředí se jím na

100 ml.

Zkoušený roztok. K 0,300 g zkoušené látky se přidají 4,0 ml

roztoku kyseliny chlorovodíkové R 33% (V/V) a 1 min se intenzivně

protřepává s 1,0 ml roztoku vnitřního standardu.

Fáze se nechají oddělit (je-li třeba, použije se k lepšímu oddělení

odstřeďování). Použije se horní vrstva.

Porovnávací roztok. 75,0 mg kyseliny 2-ethylhexanové R se

rozpustí v roztoku vnitřního standardu a zředí se jím na

50,0 ml. K 1,0 ml tohoto roztoku se přidají 4,0 ml roztoku

kyseliny chlorovodíkové R 33% (V/V) a 1 min se intenzivně

protřepává. Fáze se nechají oddělit (je-li třeba, použije se

k lepšímu oddělení odstřeďování). Použije se horní vrstva.


– křemenné kapilární kolony se širokým průměrem délky

10 m a vnitřního průměru 0,53 mm s vnitřní stěnou pokrytou

makrogolem 20 000 2-nitrotereftalátem R (tloušťka

vrstvy je 1,0 μm);

– helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové

rychlosti 10 ml/min;

– plamenoionizačního detektoru, s následujícím teplotním

programem:

Čas

(min)

Teplota

(°C)

Rychlost

(°C/min)

Poznámka

kolona 0–2 40 – izotermicky

2–7,3 40 ® 200 30 lineární

gradient

7,3–10,3 200 – izotermicky

nástřikový

200

prostor

detektor 300

Nastříkne se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího

roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem

odpovídajícím kyselině 2-ethylhexanové (první pík) a píkem

odpovídajícím vnitřnímu standardu není menší než 2,0.

Obsah kyseliny 2-ethylhexanové v procentech se vypočítá

podle vzorce:

v němž značí:

AT – plochu píku kyseliny 2-ethylhexanové na chromatogramu

zkoušeného roztoku;

AR – plochu píku kyseliny 2-ethylhexanové na chromatogramu

porovnávacího roztoku;

IT – plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu

IR


– plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu

porovnávacího roztoku;

mT – hmotnost zkoušené látky v gramech ve zkoušeném

roztoku;

mR – hmotnost kyseliny 2-ethylhexanové v gramech v porovnávacím

roztoku.

2.4.29 MASTNÉ KYSELINY V OLEJÍCH

BOHATÝCH NA OMEGA-3-KYSELINY

9.7:20429

Zkouška se může použít pro kvantitativní stanovení obsahu

ethylesterů kyseliny ikosapentaenové (EPA), kyseliny dokosahexaenové

(DHA) a celkových omega-3-kyselin v přípravcích

z rybího oleje, který obsahuje omega-3-kyseliny o různých

koncentracích. Metoda je vhodná pro triacylglyceroly nebo

ethylestery. Ethylestery jsou obsaženy v rybích olejích/olejích

z rybích jater a triacylglyceroly v omega-3-koncentrátech. Výsledky

se vyjadřují jako triacylglyceroly nebo ethylestery.

EPA a DHA

Plynová chromatografie (2.2.28). Zkouška se provádí co

možná nejrychleji, za chránění před aktinickým světlem,

oxidačními činidly, oxidačními katalyzátory (např. měď

a železo) a vzduchem.

Ve zkoušené látce se stanoví methylestery (po derivatizaci

triacylglycerolů, viz dále uvedený krok B) nebo ethylestery

kyseliny all-cis-ikosa-5,8,11,14,17-pentaenové (EPA; 20:5

n-3) a kyseliny all-cis-dokosa-4,7,10,13,16,19-hexaenové

(DHA; 22:6 n-3).

Vnitřní standard. Methyl-trikosanoát R.

Zkoušené roztoky. Všechny zkoušené roztoky se připraví

duplicitně.

Krok A

– Zkoušený roztok (a). Množství zkoušeného vzorku uvedené

v tabulce 2.4.29-1 a 70,0 mg vnitřního standardu se rozpustí

v roztoku butylhydroxytoluenu R (50 mg/ml) v trimethylpentanu

R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml. Vnitřní

standard se rozpustí, je-li třeba mírným zahřátím (do

60 °C). Ethylestery jsou nyní připraveny k analýze. Pro triacylglyceroly

se postupuje podle kroku B.

Tab. 2.4.29-1

Přibližný součet EPA

a DHA

(%)

AT

× I R × mR

× 2

,

A × I × m

R

T

Množství zkoušeného

vzorku (g)

30–50 0,4–0,5

50–70 0,3

70–90 0,25

T

250 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.29 MASTNÉ KYSELINY V OLEJÍCH BOHATÝCH NA OMEGA-3-KYSELINY

– Zkoušený roztok (b). Množství zkoušeného vzorku uvedené

v tabulce 2.4.29-1 se rozpustí v roztoku butylhydroxytoluenu

R (0,05 g/l) v trimethylpentanu R a zředí se stejným roztokem

na 10,0 ml. Ethylestery jsou nyní připraveny k analýze.

Pro triacylglyceroly se postupuje podle kroku B.

Krok B

2,0 ml zkoušených roztoků (a) a (b) získaných v kroku A se

odděleně převedou do křemenných zkumavek a rozpouštědlo

se odpaří mírným proudem dusíku R. Přidá se 1,5 ml

roztoku hydroxidu sodného R (20 g/l) v methanolu R, převrství

se dusíkem R, těsně se uzavře uzávěrem potaženým

polytetrafluorethylenem, promíchá se a zahřívá se 7 min

na vodní lázni. Nechá se ochladit, přidají se 2 ml chloridu

boritého v methanolu RS, převrství se dusíkem R, těsně se

uzavře, promíchá se a zahřívá se 30 min na vodní lázni.

Ochladí se na 40 °C až 50 °C, přidá se 1 ml trimethylpentanu

R, uzavře se a důkladně se třepe nejméně 30 s. Ihned se

přidá 5 ml chloridu sodného nasyceného RS, převrství se

dusíkem R, uzavře se a důkladně se třepe nejméně 15 s.

Horní vrstva se převede do samostatné zkumavky. Methanolová

vrstva se protřepe ještě jednou s 1 ml trimethylpentanu

R. Spojené trimethylpentanové extrakty se promyjí

dvakrát 1 ml vody R a suší se nad síranem sodným bezvodým

R.

Porovnávací roztoky. Porovnávací roztoky (a1) a (a2) se

připraví duplicitně. Porovnávací roztok (c) se připraví pouze

pro triacylglyceroly a jen, když není na chromatogramu

zkoušeného roztoku (a) zřetelně pozorován methylester kyseliny

tetrakos-15-enové.

– Porovnávací roztok (a1). 70,0 mg vnitřního standardu

a 90,0 mg ethylesteru kyseliny ikosapentaenové CRL se

rozpustí v roztoku butylhydroxytoluenu R (0,05 g/l) v trimethylpentanu

R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml.

Vnitřní standard se rozpustí, je-li třeba, mírným zahřátím

(do 60 °C).

– Porovnávací roztok (a2). 60,0 mg ethylesteru kyseliny

dokosahexaenové CRL a 70,0 mg vnitřního standardu se

rozpustí v roztoku butylhydroxytoluenu R (0,05 g/l) v trimethylpentanu

R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml.

Vnitřní standard se rozpustí, je-li třeba, mírným zahřátím

(do 60 °C).

Porovnávací roztok (a1) a porovnávací roztok (a2) jsou připraveny

k analýze vzorků ethylesterů. Pro analýzu triacylglycerolů

se pokračuje krokem B stejným způsobem jako

pro zkoušený roztok (a) a zkoušený roztok (b).

– Porovnávací roztok (b). 0,300 g methyl-arachidátu R,

0,300 g methyl-behenátu R, 0,300 g methyl-palmitátu R

a 0,300 g methyl-stearátu R se převedou do 10ml odměrné

baňky, rozpustí se v roztoku butylhydroxytoluenu R

(0,05 g/l) v trimethylpentanu R a zředí se stejným roztokem

na 10,0 ml.

– Porovnávací roztok (c). V 10ml odměrné baňce se rozpustí

směs obsahující 55,0 mg methylesteru kyseliny dokosahexaenové

R a 5,0 mg methylesteru kyseliny tetrakos-15-enové

R v roztoku butylhydroxytoluenu R

(0,05 g/l) v trimethylpentanu R a zředí se stejným roztokem

na 10,0 ml.

Kolona:


– rozměry: délka nejméně 25 m, vnitřní průměr 0,25 mm;


0,2 µm).

Nosný plyn. Vodík pro chromatografii R nebo helium pro

chromatografii R.


Dělicí poměr. 1 : 200, alternativně bez dělení s řízenou teplotou

[roztoky vzorků musí být před nástřikem naředěny

1 : 200 roztokem butylhydroxytoluenu R (0,05 g/l) v trimethylpentanu

R].

Je-li třeba, upraví se dělicí poměr a/nebo ředění vzorku tak,

aby faktor symetrie byl 0,8 až 1,5 pro methylestery nebo

ethylestery kyseliny ikosapentaenové a kyseliny dokosahexaenové,

pokud se současně u zkoušeného roztoku (b) pozorují

zřetelně oddělené píky esterů kyseliny linolenové

(C18:3 n-3), kyseliny stearidonové (C18:4 n-3), kyseliny

ikosatetraenové (C20:4 n-3), kyseliny henikosapentaenové

(C21:5 n-3) a kyseliny dokosapentaenové (C22:5 n-3). Pokud

oba požadavky nejsou dosažitelné, pak se upřednostňuje

pouhá detekce odpovídajících esterů výše uvedených pro

zkoušený roztok (b).

Je-li třeba, upraví se dělicí poměr a/nebo ředění vzorku tak,

aby faktor symetrie byl 0,8 až 1,5 pro složky porovnávacího

roztoku (b).

Teplota:

Nástřik s dělením

Čas

(min)

Teplota

(ºC)

Nástřik bez dělení

Čas

(min)

Teplota

(ºC)

kolona 0–2 170 0–2 90

2–25,7 170 → 240 2–4,7 90 → 170

25,7–28 240 4,7–28 170 → 240

28–30 240

nástřikový

250 90 → 250*

prostor

detektor 270 270

*90 °C pro přímý nástřik na kolonu.


Nástřik. 1 µl.

Test způsobilosti:

– na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) se plochy

píků methyl-palmitátu, methyl-stearátu, methyl-arachidátu

a methyl-behenátu vynásobí odpovídajícími odezvovými

faktory uvedenými v tabulce 2.4.29-2; u korigovaných

ploch píků methylesterů mastných kyselin se předpokládá,

že součet methylesterů je 100 %; normalizované

procentuální plošné zastoupení každého methylesteru

mastné kyseliny je v mezích ±1,0 procentuální jednotky

odpovídajícího hmotnostního procenta;

– rozlišení:

– ethylestery: nejméně 1,2 mezi píkem methyl-trikosanoátu

a píkem ethylesteru kyseliny henikosapentaenové

na chromatogramu zkoušeného roztoku (a);

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 251

2.4.30 ETHYLENGLYKOL A DIETHYLENGLYKOL V ETHOXYLOVANÝCH LÁTKÁCH

– triacylglyceroly: nejméně 1,2 mezi píkem methylesteru

kyseliny dokosahexaenové a píkem methylesteru

kyseliny tetrakos-15-enové na chromatogramu zkoušeného

roztoku (a) nebo porovnávacího roztoku (c);

– na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) při porovnání

s chromatogramem zkoušeného roztoku (b) jsou

přítomné píky methyl-trikosanoátu a methylesteru kyseliny

henikosapentaenové zřetelně oddělené.

Tab. 2.4.29-2

Methylester mastných

kyselin

Teoretický odezvový

faktor

methyl-palmitát 1,049

methyl-stearát 1,029

methyl-arachidát 1,013

methyl-behenát 1,000

Obsah EPA a DHA v procentech se vypočítá podle vzorce

(do výpočtu se zahrne deklarovaná hodnota pro referenční

látky):

100 ,

v němž značí:

Rf – odezvový faktor pro EPA a DHA daný vzorcem:

Ax

m1 – hmotnost vnitřního standardu ve zkoušeném roztoku

(a) v miligramech;

m2 – hmotnost zkoušeného vzorku ve zkoušeném roztoku

(a) v miligramech;

mx,3 – hmotnost vnitřního standardu v porovnávacím roztoku

(a1) (stanovení EPA) nebo v porovnávacím roztoku

(a2) (stanovení DHA) v miligramech;

mx,r – hmotnost ethylesteru kyseliny ikosapentaenové CRL

v porovnávacím roztoku (a1) nebo ethylesteru kyseliny

dokosahexaenové CRL v porovnávacím roztoku

(a2) v miligramech;

– plochu píku esteru kyseliny ikosapentaenové nebo

esteru kyseliny dokosahexaenové na chromatogramu

zkoušeného roztoku (a);

Ax,r – plochu píku esteru kyseliny ikosapentaenové na chromatogramu

porovnávacího roztoku (a1) nebo esteru

kyseliny dokosahexaenové na chromatogramu porovnávacího

roztoku (a2);

A1

– plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu

zkoušeného roztoku (a);

Ax,3 – plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu

porovnávacího roztoku (a1) (stanovení EPA) nebo

porovnávacího roztoku (a2) (stanovení DHA);

C

A x

× m1 × Rf × C ×

A1

× m2

Ax

,3

× mx,

r

;

Ax

, r

× mx,

3

– přepočítávací faktory mezi ethylesterem a triacylglyceroly:

ethylestery: C = 1,00;

triacylglyceroly: C = 0,954 pro EPA;

C = 0,957 pro DHA.

CELKOVÉ OMEGA-3-KYSELINY

Celkový obsah omega-3-kyselin v procentech se vypočítá

podle vzorce, v němž se použijí hodnoty získané při stanovení

EPA a DHA a jednotlivé píky se identifikují za použití

chromatogramů:

v němž značí:

EPA – obsah EPA v procentech;

DHA – obsah DHA v procentech;

An-3

A

EPA + DHA +

n-3

( EPA + DHA)

– součet ploch píků esterů kyseliny linolenové

(C18:3 n-3), kyseliny stearidonové (C18:4 n-3), kyseliny

ikosatetraenové (C20:4 n-3), kyseliny henikosapentaenové

(C21:5 n-3) a kyseliny dokosapentaenové

(C22:5 n-3) na chromatogramu zkoušeného

roztoku (b);

AEPA – plochu píku esteru EPA na chromatogramu zkoušeného

roztoku (b);

ADHA – plochu píku esteru DHA na chromatogramu zkoušeného

roztoku (b).

2.4.30 ETHYLENGLYKOL

A DIETHYLENGLYKOL

V ETHOXYLOVANÝCH LÁTKÁCH

6.0:20430

Ethoxylované látky mohou obsahovat různá množství ethylenglykolu

a diethylenglykolu jako výsledek procesu výroby.

Následující metoda se může použít ke kvantitativnímu stanovení

těchto látek, obzvláště v případě následujících povrchově

aktivních látek: glyceromakrogol-ricinoleát, glyceromakrogol-hydroxystearát,

makrogol-15-hydroxystearát,

nonoxinol 9 a cetostearomakrogol.


Roztok vnitřního standardu. 30,0 mg pentan-1,2-diolu R se

rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 30,0 ml. 1,0 ml tohoto

roztoku se zředí acetonem R na 20,0 ml.

Zkoušený roztok. 0,500 g zkoušené látky se rozpustí v roztoku

vnitřního standardu a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 30,0 mg ethylenglykolu R se

smíchá s acetonem R a zředí se jím na 100,0 ml. 1,0 ml

tohoto roztoku se zředí roztokem vnitřního standardu na

10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok diethylenglykolu

R o koncentraci odpovídající předepsanému limitu za

použití stejných rozpouštědel jako při přípravě porovnávacího

roztoku (a).

DHA

Kolona:




1 μm).

EPA

+ A




A

,

252 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.4.31 NIKL V HYDROGENOVANÝCH ROSTLINNÝCH OLEJÍCH

Teplota:

Čas

(min)

Teplota

(°C)

kolona 0–40 80 ® 200

40–45 200 ® 230

45–65 230


detektor 250

2.4.31 NIKL V HYDROGENOVANÝCH

ROSTLINNÝCH OLEJÍCH

9.4:20431

Atomová absorpční spektrometrie (2.2.23, Metoda I).

Před použitím musí být zkoumadla dusičnan hořečnatý R

a dihydrogenfosforečnan amonný R zkontrolována na nikl.

Tento aktuální obsah niklu se zahrne do výpočtu obsahu

niklu ve vzorku.

Zkoušený roztok. 0,250 g (m) zkoušené látky se naváží do

vhodné digesční nádobky odolné vůči vysokému tlaku

(fluorpolymer nebo křemenné sklo), přidá se 6,0 ml kyseliny

dusičné prosté niklu R a 2,0 ml peroxidu vodíku koncentrovaného

R. Stejným způsobem se připraví kontrolní roztok.

Uzavřené nádobky se vloží do laboratorní mikrovlnné

trouby a digeruje se pomocí vhodného programu, např.

1000 W po dobu 40 min. Před otevřením se digesční nádobky

nechají ochladit. Přidají se 2,0 ml peroxidu vodíku

koncentrovaného R a digesce se opakuje. Před otevřením se

digesční nádobky nechají ochladit. Obsah nádobek se kvantitativně

převede do odměrných baněk, přidá se 0,5 ml roztoku

dusičnanu hořečnatého R (10 g/l) a 0,5 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu

amonného R (100 g/l), zředí se vodou

pro chromatografii R na 25,0 ml a promíchá se.

Porovnávací roztoky. Do čtyř odměrných baněk se převede

25 µl, 50 µl, 75 µl a 100 µl standardního roztoku niklu

(5 µg Ni/ml) R. Do každé baňky se přidá 0,5 ml roztoku dusičnanu

hořečnatého R (10 g/l), 0,5 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu

amonného R (100 g/l), 6,0 ml kyseliny dusičné

prosté niklu R, zředí se vodou pro chromatografii R na

25,0 ml a promíchá se. Získají se porovnávací roztoky obsahující

5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml a 20 ng/ml niklu.

Nulový roztok. Do odměrné baňky se převede 1,0 ml roztoku

dusičnanu hořečnatého R (10 g/l), 1,0 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu

amonného R (100 g/l), 12,0 ml kyseliny

dusičné prosté niklu R, zředí se vodou pro chromatografii

R na 50,0 ml a promíchá se.

Postup. Stanoví se absorbance každého z roztoků při

232,0 nm za použití vhodného atomového absorpčního

spektrometru s grafitovým atomizérem (GFAA), vybaveného

vhodným systémem kompenzace pozadí, pyrolyticky

potaženou trubičkou a niklovou lampou s dutou katodou.

Optimální teplotní program pro každý přístroj může být

rozdílný, proto se má použít takový program, který je doporučený

výrobcem. Následující teplotní parametry pro analýzu

GFAA jsou uvedeny jako příklad: teplota sušení v peci

se po 5 s nárůstu udržuje 35 s při 120 °C, po 30 s nárůstu se

udržuje 10 s při 1100 °C, po 5 s poklesu se chladicí teplota

udržuje 5 s při 800 °C a atomizační teplota se udržuje 7 s

při 2600 °C. Pomocí nulového roztoku se nastaví nula přístroje.

Za použití kalibrační křivky se z odpovídajících absorbancí

stanoví koncentrace zkoušeného roztoku a kontrolního

roztoku. Je-li třeba, zředí se nulovým roztokem

tak, aby se získala hodnota v kalibrovaném rozsahu absorbance.

Zkušební

metody

2.5


Nástřik. 2 μl.

Relativní retence vztažená k pentan-1,2-diolu (retenční čas

asi 19 min). Ethylenglykol asi 0,7; diethylenglykol asi 1,3.

Obsah niklu v µg/g se vypočítá podle vzorce:

c × f

,

m×

40

v němž značí:

c – změřenou koncentraci niklu v nanogramech v mililitru;

f – zřeďovací faktor zkoušeného roztoku;

m – hmotnost zkoušené látky v gramech.

2.4.32 CELKOVÝ CHOLESTEROL

V OLEJÍCH BOHATÝCH

NA OMEGA-3-KYSELINY

10.0:20432

Tato metoda se může použít pro kvantitativní stanovení

součtu volného a esterifikovaného cholesterolu v produktech

rybích olejů bohatých na omega-3-kyseliny (jako

ethylestery nebo triacylglyceroly).


Zásobní roztok vnitřního standardu. 0,15 g 5a-cholestanu

R se rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml.

Roztok se může uchovávat zmrazený za velmi nízké teploty

až 6 měsíců.

Pracovní roztok vnitřního standardu. Připravuje se těsně

před použitím. 1,0 ml zásobního roztoku vnitřního standardu

se zředí heptanem R na 10,0 ml.

Zásobní roztok cholesterolu. 50,0 mg cholesterolu R se

rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 100,0 ml. Roztok

se může uchovávat zmrazený za velmi nízké teploty až

6 měsíců.

Pracovní roztok cholesterolu. Připravuje se těsně před

použitím. 1,0 ml zásobního roztoku cholesterolu se zředí

heptanem R na 10,0 ml.

Zásobní roztok cholesterolu a a-tokoferolu. 50,0 mg

cholesterolu R a 50,0 mg a-tokoferolu R se rozpustí

v heptanu R a zředí se jím na 100,0 ml. Roztok se může

uchovávat zmrazený za velmi nízké teploty až 3 měsíce.

Porovnávací roztok. Připravuje se v den použití. 1,0 ml

zásobního roztoku cholesterolu a a-tokoferolu se zředí

heptanem R na 100,0 ml.

Kalibrační roztoky. Připravují se v den použití. Každý

roztok, viz tabulku 2.4.32-1, se zředí roztokem ethyl-acetátu

R 10% (V/V) v heptanu R na 20,0 ml.

Ke kalibraci roztoků s vysokým obsahem cholesterolu

(3,0 mg/g až 20 mg/g) se použije všech pět kalibračních

roztoků.

Ke kalibraci roztoků s nízkým obsahem cholesterolu

(0,2 mg/g až 3 mg/g) se použijí následující koncentrace

kalibračních roztoků: 0,2 mg/g, 1,0 mg/g a 3,0 mg/g.

ČL 2017 – Dopl. 2020 253

2.4.32 CELKOVÝ CHOLESTEROL V OLEJÍCH BOHATÝCH NA OMEGA-3-KYSELINY

Tab. 2.4.32-1 Příprava kalibračních roztoků

Koncentrace

cholesterolu

(mg/ml)

Kalibrační roztoky

Koncentrace

cholesterolu

(mg/g)*

Zásobní roztok

cholesterolu

(ml)

Pracovní roztok

cholesterolu

(ml)

0,1 20,0 4,0 1,0

0,05 10,0 2,0 1,0

0,015 3,0 0,60 1,0

0,005 1,0 2,0 1,0

0,001 0,2 0,40 1,0

*Založeno na vzorku o navážce 0,100 g zkoušené látky.

Pracovní roztok

vnitřního standardu

(ml)

Zkoušený roztok. 0,100 g se naváží do 15ml křemenné zkumavky

(pro rybí oleje a oleje z tresky se zkoušený olej intenzivně

třepe ve vhodné nádobě, nechá se stát 10 min až

15 min, pak se nádoba ponechá ve svislé poloze a pro navážení

se vzorek odebere ze střední vrstvy oleje). Přidá se

1,0 ml pracovního roztoku vnitřního standardu. Rozpouštědlo

se odpaří na topném bloku při 50 °C v mírném proudu

dusíku R. Přidá se 0,5 ml roztoku hydroxidu draselného

R (50 %) a 3,0 ml ethanolu 96% R. Zkumavka se naplní

dusíkem R, uzavře se a homogenizuje se. Zahřívá se 1 h na

topném bloku při 100 °C. Chladí se asi 10 min, přidá se

6,0 ml vody destilované R a homogenizuje se. Zkouší se na

20ml koloně pro extrakci na pevné fázi (SPE) obsahující 1 g

silikagelu pro chromatografii oktadecylsilylovaného se stíněnými

silanolovými skupinami R (velikost částic o průměru

55 µm a velikost pórů 7 nm) s 5 ml roztoku ethanolu

96 % R 50% (V/V) ve vodě destilované R. Na SPE kolonu

se převede 5,0 ml zmýdelněného vzorku. Dbá se na to, aby

SPE kolona nevyschla. Kolona se promyje 5,0 ml roztoku

ethanolu 96 % R 50% (V/V) ve vodě destilované R a eluuje

se 20,0 ml roztoku ethyl-acetátu R 10% (V/V) v heptanu R,

eluát se jímá a použije se jako zkoušený roztok.

Kolona:



– stacionární fáze: síťovaný poly(difenyl)(dimethyl)siloxan

R (tloušťka filmu 0,25 μm);


Tlak. 48 kPa (odpovídá průtokové rychlosti asi 0,6 ml/min

při 200 °C a asi 0,4 ml/min při 330 °C).


Teplota:

Čas

(min)

kolona 0–1

1–7,5

7,5–10

Teplota

(°C)

200

200 ® 330

330


detektor 340

Před analýzou se kolona zahřívá nejméně 30 min při

340 °C za použití uvedeného tlaku.


Nástřik. 1 µl.

Retenční časy. 5a-cholestan asi 7,5 min; cholesterol asi

9 min.

Sestrojí se kalibrační křivka. Na osu úseček (x) se vynese jmenovitá

koncentrace cholesterolu v miligramech na gram pro

každý kalibrační roztok ve zkoušené látce. Na osu pořadnic (y)

se vynese poměr plochy píku cholesterolu k ploše píku

5α-cholestanu na chromatogramu každého kalibračního roztoku.

Vypočítá se směrnice (S) a průsečík s osou pořadnic (Y).

Test způsobilosti:

– rozlišení: nejméně 1,5 mezi píkem cholesterolu a píkem

a-tokoferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku;

– korelační koeficient (r 2 ) kalibrační křivky je nejméně

0,995.

Obsah celkového cholesterolu vyjádřený v miligramech

cholesterolu na gram zkoušeného oleje se vypočítá podle

vzorce:

v němž značí:

A1

-Y

A2

× 0,100,

m × S

1

A1 – plochu píku cholesterolu na chromatogramu zkoušeného

roztoku;

A2 – plochu píku 5a-cholestanu na chromatogramu zkoušeného

roztoku;

m1 – hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku

v gramech;

Y – průsečík kalibrační křivky s osou pořadnic (y);

S – směrnici kalibrační křivky v gramech na miligram.

254 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.1 ČÍSLO KYSELOSTI

2.5 STANOVENÍ OBSAHU

2.5.1 ČÍSLO KYSELOSTI

8.6:20501

Číslo kyselosti IA udává množství hydroxidu draselného

v miligramech potřebné k neutralizaci volných kyselin obsažených

v 1 g látky.

10,00 g zkoušené látky, nebo její předepsané množství

(m g), se rozpustí v 50 ml směsi stejných objemových dílů

ethanolu 96% R a petroletheru R3 předem zneutralizované

hydroxidem draselným 0,1 mol/l VS nebo hydroxidem sodným

0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml fenolftaleinu RS1 jako

indikátoru, pokud není uvedeno jinak. Je-li to pro rozpuštění

zkoušené látky třeba, zahřeje se na asi 90 °C. Po rozpuštění

se titruje hydroxidem draselným 0,1 mol/l VS nebo

hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do vzniku růžového zbarvení

stálého po dobu nejméně 15 s (n ml). Pokud bylo potřeba

k rozpuštění zkoušené látky zahřátí na asi 90 °C, udržuje

se tato teplota i během titrace.

Číslo kyselosti (IA) se vypočítá podle vzorce:

2.5.2 ČÍSLO ESTEROVÉ

6.0:20502

Esterové číslo IE udává množství hydroxidu draselného

v miligramech potřebné ke zmýdelnění esterů obsažených

v 1 g látky. Vypočítá se z rozdílu čísla zmýdelnění IS a čísla

kyselosti IA.

2.5.3 ČÍSLO HYDROXYLOVÉ

6.0:20503

Hydroxylové číslo IOH udává množství hydroxidu draselného

v miligramech potřebné k neutralizaci kyseliny vázané

při acetylaci 1 g látky.

METODA A

Pokud není v článku uvedeno jinak, převede se předepsané

množství zkoušené látky uvedené v tabulce 2.5.3-1 (m g)

do 150ml acetylační baňky, přidá se předepsané množství

acetanhydridu RS1 uvedené v tabulce 2.5.3-1 a baňka se

spojí se vzdušným chladičem.

Tab. 2.5.3-1

Předpokládané

číslo IOH

10–100

100–150

150–200

200–250

250–300

300–350

350–700

700–950

5,611n

I

A

= .

m

I = I - I

E

S

A

Množství

zkoušené látky

(g)

2,00

1,50

1,00

0,75

0,60 nebo 1,20

1,00

0,75

0,50

Množství roztoku

acetanhydridu

RS1

(ml)

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0 nebo 10,0

10,0

15,0

15,0

Baňka se zahřívá 1 h ve vodní lázni tak, aby hladina vodní

lázně převyšovala asi o 2,5 cm úroveň hladiny tekutiny

v baňce. Potom se baňka ochladí a přes chladič se přidá

5 ml vody R. Vznikne-li zákal, odstraní se právě potřebným

množstvím pyridinu R a zaznamená se jeho objem. Obsah

baňky se důkladně promíchá a pod zpětným chladičem se

zahřívá ve vodní lázni ještě 10 min. Baňka se ochladí, chladič

a stěny baňky se propláchnou 5 ml ethanolu 96% R předem

zneutralizovaného na fenolftalein RS1. Titruje se hydroxidem

draselným 0,5 mol/l v ethanolu VS za použití

0,2 ml fenolftaleinu RS1 jako indikátoru (n1 ml hydroxidu

draselného 0,5 mol/l v ethanolu VS). Za stejných podmínek

se provede slepá zkouška (n2 ml hydroxidu draselného

0,5 mol/l v ethanolu VS).

Hydroxylové číslo IOH se vypočítá podle vzorce:

( n - n )

28,05

2 1

I

OH

=

+ I

m

v němž značí:

IA – číslo kyselosti zkoušené látky.

METODA B

Odváží se předepsané množství zkoušené látky (m g), kvantitativně

se převede do suché 5ml kuželové baňky se skleněnou

zabroušenou zátkou (nebo zátkou z plastické hmoty)

a přidají se 2,0 ml zkoumadla propananhydridového R,

baňka se uzavře a obsah se opatrně protřepává do rozpuštění

látky. Není-li předepsáno jinak, nechá se stát 2 h. Potom

se odstraní zátka a baňka i s jejím obsahem se převede do

500ml širokohrdlé kuželové baňky obsahující 25,0 ml roztoku

anilinu R (9 g/l) v cyklohexanu R a 30 ml kyseliny octové

ledové R. Obsah baňky se promíchá vířivým pohybem

a nechá se stát 5 min. Potom se přidá 0,05 ml violeti krystalové

RS a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS (n1 ml

kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS); do výsledného smaragdově

zeleného zbarvení. Současně se za stejných podmínek provede

slepá zkouška (n2 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS).

( n n )

5,610

1 -

=

m

2

IOH

Pokud je přítomna voda, provede se korekce zjištěné hodnoty

IOH na její obsah (y %) stanovený semimikrostanovením

vody (2.5.12) následovně:

( I stanovené) 31,1 y .

I korigované =

-

OH

OH

2.5.4 ČÍSLO JODOVÉ

6.0:20504

Číslo jodové II udává množství halogenu (přepočtené na

jod) v gramech, které se za předepsaných podmínek váže

na 100 g látky.

Není-li předepsáno jinak, použije se metoda A. Jakékoliv

změny metody A na metodu B se validují.

METODA A

Pokud není uvedeno jinak, naváží se množství zkoušené

látky uvedené v tabulce 2.5.4-1 stanovené podle předpokládaného

II.

.

A

,

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 255

2.5.5 ČÍSLO PEROXIDOVÉ

Tab. 2.5.4-1

Předpokládané číslo II

méně než 20

20–60

60–100

více než 100

Množství látky (g)

1,00

0,50–0,25

0,25–0,15

0,15–0,10

Předepsané množství zkoušené látky (m g) se převede do

250ml baňky se zabroušenou zátkou předem vysušené nebo

opláchnuté kyselinou octovou ledovou R. Není-li uvedeno

jinak, rozpustí se v 15 ml chloroformu R a opatrně se přidá

25,0 ml bromidu jodného RS. Baňka se uzavře a za častého

promíchávání se ponechá 30 min ve tmě, pokud není uvedeno

jinak. Přidá se 10 ml roztoku jodidu draselného R

(100 g/l) a 100 ml vody R a titruje se thiosíranem sodným

0,1 mol/l VS za intenzivního protřepání do změny žlutého

zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá 5 ml škrobu RS

a pokračuje se v titraci přidáváním thiosíranu sodného

0,1 mol/l VS po kapkách až do odbarvení (n1 ml thiosíranu

sodného 0,1 mol/l VS). Za stejných podmínek se provede

slepá zkouška (n2 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS).

Jodové číslo se vypočítá podle vzorce:

METODA B

Pokud není uvedeno jinak, naváží se množství zkoušené

látky uvedené v tabulce 2.5.4-2.

Tab. 2.5.4-2

Předpokládané

číslo II

< 3

3

5

10

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

I

I

Množství

látky (g)

(odpovídající

nadbytku

150% ICl)

10

8,4613

5,0770

2,5384

0,8461

0,6346

0,4321

0,3173

0,2538

0,2115

0,1813

0,1587

0,1410

0,1269

( n n )

1,269

2 -

=

m

Množství

látky (g)

(odpovídající

nadbytku

100% ICl)

10

10,5760

6,3460

3,1730

1,5865

0,7935

0,5288

0,3966

0,3173

0,2644

0,2266

0,1983

0,1762

0,1586

.

Chlorid jodný

(ml)

25

25

25

20

20

20

20

20

20

20

20

20

20

20

Množství vzorku je takové, aby nadbytek chloridu jodného

RS byl v rozmezí 50 % až 60 % přidaného množství, tj.

100 % až 150 % absorbovaného množství.


250ml baňky se zabroušenou zátkou předem vysušené nebo

opláchnuté kyselinou octovou ledovou R a rozpustí se

1

v 15 ml směsi stejných objemů cyklohexanu R a kyseliny

octové ledové R, pokud není uvedeno jinak.

Pokud je to nutné, látka se před rozpouštěním roztaví (teplota

tání vyšší než 50 °C). Velmi pomalu se přidá objem

chloridu jodného RS stanovený v tabulce 2.5.4-2. Baňka se

uzavře a za častého protřepávání se ponechá 30 min ve tmě,

pokud není uvedeno jinak. Přidá se 10 ml roztoku jodidu

draselného R (100 g/l) a 100 ml vody R a titruje se thiosíranem

sodným 0,1 mol/l VS za intenzivního protřepávání do

změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá

5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci přidáváním thiosíranu

sodného 0,1 mol/l VS po kapkách do odbarvení (n1 ml

thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS). Za stejných podmínek se

provede slepá zkouška (n2 ml thiosíranu sodného

0,1 mol/l VS).

Jodové číslo se vypočítá podle vzorce:

( n2

- n ) .

1,269

1

I

I

=

m

2.5.5 ČÍSLO PEROXIDOVÉ

8.6:20505

Číslo peroxidové IP udává množství aktivního kyslíku v miliekvivalentech

obsažené v peroxidické formě v 1000 g látky.

Stanoví se dále uvedenými metodami.

Není-li metoda v článku specifikována, použije se metoda

A. Jakékoliv změny z metody A na metodu B se validují.

METODA A

5,00 g zkoušené látky (m g) se převede do 250ml kuželové

baňky se zabroušenou zátkou. Přidá se 30 ml směsi objemových

dílů chloroformu R a kyseliny octové ledové R

(2 + 3) a protřepává se do rozpuštění látky. Přidá se 0,5 ml

jodidu draselného nasyceného RS, protřepává se přesně

1 min a pak se přidá 30 ml vody R. Titruje se thiosíranem

sodným 0,01 mol/l VS, který se pomalu přidává za silného

protřepávání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé.

Přidá se 5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci za důkladného

rovnoměrného protřepávání do odbarvení (n1 ml thiosíranu

sodného 0,01 mol/l VS). Za stejných podmínek

se provede slepá zkouška (n2 ml thiosíranu sodného

0,01 mol/l VS), při níž není spotřeba thiosíranu sodného

0,01 mol/l VS vyšší než 0,1 ml.

Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:

( n1

- n ) .

10

2

I

P

=

m

METODA B

Zkouška se provádí za chránění před aktinickým světlem.

50 ml směsi objemových dílů trimethylpentanu R a kyseliny

octové ledové R (2 + 3) se převede do kuželové baňky

a uzavře se zátkou. Baňkou se krouží do rozpuštění zkoušené

látky (množství zkoušené látky je uvedeno v tabulce

2.5.5-1). Vhodnou byretou se přidá 0,5 ml jodidu draselného

nasyceného RS a uzavře se zátkou. Roztok se nechá stát

(60 ±1) s, důkladně rovnoměrně se protřepe a potom se přidá

30 ml vody R.

256 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.6 ČÍSLO ZMÝDELNĚNÍ

Tab. 2.5.5-1

Předpokládané číslo

peroxidové IP

0–12

12–20

20–30

30–50

50–90

Množství zkoušené látky

(g)

5,00–2,00

2,00–1,20

1,20–0,80

0,800–0,500

0,500–0,300

Roztok se titruje thiosíranem sodným 0,01 mol/l VS (V1 ml),

který se postupně přidává za silného protřepávání do změny

žlutého zbarvení jodu na téměř bezbarvé. Přidá se 0,5 ml

škrobu RS1 a pokračuje se v titraci za stálého protřepávání,

zvláště ke konci titrace, aby se uvolnil všechen jod z vrstvy

rozpouštědla. Po kapkách se přidává thiosíran sodný, dokud

se modré zbarvení právě neodbarví.

Podle spotřeby použitého thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS

lze k titraci použít thiosíran sodný 0,1 mol/l VS.

Poznámka. Pro neutralizaci škrobového indikátoru, z důvodu

oddělení horní vrstvy trimethylpentanu od vodné vrstvy,

je pro číslo peroxidové 70 a vyšší doba 15 s až 30 s nutná

k přiměřenému promíchání rozpouštědla a vodné vrstvy

a uvolnění zbytku jodu. Pro číslo peroxidové, jehož hodnota

je vyšší než 150, se doporučuje použít thiosíran sodný

0,1 mol/l VS. Ke zpomalení separace fází a ke snazšímu

uvolňování jodu se může ke směsi přidat malé množství

(0,5 % až 1,0 %) emulgátoru s vysokou hodnotou hydrofilně-lipofilní

rovnováhy (HLB) (např. polysorbát 60).

Provede se slepá zkouška (V0 ml). Je-li spotřeba odměrného

roztoku při slepé zkoušce vyšší než 0,1 ml, opakuje se stanovení

s novými zkoumadly. Číslo peroxidové se vypočítá

podle vzorce:

1000 V1

- V0

c

I

P

=

,

m

v němž značí:

c – koncentraci roztoku thiosíranu sodného v molech na litr.

2.5.6 ČÍSLO ZMÝDELNĚNÍ

6.0:20506

Číslo zmýdelnění IS udává množství hydroxidu draselného

v miligramech potřebné k neutralizaci volných kyselin a ke

zmýdelnění esterů obsažených v 1 g látky.

Není-li uvedeno jinak, pro stanovení se použijí množství

uvedená v tabulce 2.5.6-1.

Tab. 2.5.6-1

Předpokládaná

hodnota IS

< 3

3–10

10–40

40–60

60–100

100–200

200–300

300–400

( )

Množství vzorku (g)

20

12–15

8–12

5–8

3–5

2,5–3

1–2

0,5–1

Předepsané množství zkoušené látky (m g) se převede

do 250ml baňky z borokřemičitého skla a přidá se 25,0 ml

hydroxidu draselného 0,5 mol/l v ethanolu VS a několik

skleněných kuliček. Připojí se zpětný chladič a vaří se

30 min, pokud není předepsáno jinak. Potom se přidá 1 ml

fenolftaleinu RS1 a ihned (ještě horký) se titruje kyselinou

chlorovodíkovou 0,5 mol/l VS (n1 ml kyseliny chlorovodíkové

0,5 mol/l VS). Za stejných podmínek se provede slepá

zkouška (n2 ml kyseliny chlorovodíkové 0,5 mol/l VS).

Číslo zmýdelnění se vypočítá podle vzorce:

28

1

IS

=

m

,05 ( n2

- n ) .

2.5.7 NEZMÝDELNITELNÉ LÁTKY

6.0:20507

Pod pojmem „nezmýdelnitelné látky“ se rozumí látky netěkající

při 100 °C až 105 °C získané ze zkoušené zmýdelněné

látky extrakcí organickým rozpouštědlem. Výsledek

zkoušky se vyjadřuje v procentech.

Používají se odmaštěné skleněné baňky se zabroušenou

zátkou.


250ml baňky, přidá se 50 ml hydroxidu draselného

2 mol/l v ethanolu RS a zahřívá se pod zpětným chladičem

na vodní lázni za častého míchání po dobu 1 h. Po ochlazení

na teplotu pod 25 °C se obsah baňky převede do dělicí

nálevky za použití 100 ml vody R a opatrně se vytřepává

třikrát 100 ml etheru prostého peroxidických látek R.

Etherové výtřepky se spojí v další dělicí nálevce se 40 ml

vody R, několik minut se protřepávají a po oddělení vrstev

se vodná vrstva odstraní. Promytí etherové vrstvy se opakuje

ještě dvakrát se 40 ml vody R. Potom se etherová

vrstva postupně promyje 40 ml roztoku hydroxidu draselného

R (30 g/l) a 40 ml vody R. Tento postup se opakuje

třikrát a etherová vrstva se nakonec několikrát promyje

40 ml vody R, až vodná vrstva nereaguje zásaditě na fenolftalein.

Etherová vrstva se převede do předem zvážené baňky a dělicí

nálevka se promyje etherem prostým peroxidických látek

R, který se přidá do baňky. Ether se opatrně oddestiluje

a ke zbytku se přidá 6 ml acetonu R. Rozpouštědlo se odstraní

proudem vzduchu a zbytek se vysuší při 100 °C až

105 °C do konstantní hmotnosti. Po vychladnutí v exsikátoru

se zváží (a g). Množství nezmýdelnitelných látek vyjádřené

v procentech se vypočítá podle vzorce:

100 a

nezmýdelnitelné látky = .

m

Zbytek se rozpustí ve 20 ml ethanolu 96% R předem zneutralizovaného

na fenolftalein RS a titruje se hydroxidem

sodným 0,1 mol/l v ethanolu VS. Je-li spotřeba hydroxidu

sodného 0,1 mol/l v ethanolu VS vyšší než 0,2 ml, rozdělení

vrstev nebylo úplné, zbytek nelze považovat za nezmýdelnitelné

látky a zkouška se opakuje.

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 257

2.5.8 DUSÍK V PRIMÁRNÍCH AROMATICKÝCH AMINECH

2.5.8 DUSÍK V PRIMÁRNÍCH

AROMATICKÝCH AMINECH

6.0:20508

Předepsané množství zkoušené látky se rozpustí v 50 ml kyseliny

chlorovodíkové zředěné RS nebo v jiném předepsaném

rozpouštědle a přidají se 3 g bromidu draselného R.

Ochladí se ve vodě s ledem a pomalu se titruje dusitanem

sodným 0,1 mol/l VS za stálého míchání.

Indikace bodu ekvivalence se provádí elektrometricky nebo

za použití předepsaného indikátoru.

2.5.9 DUSÍK MINERALIZACÍ

S KYSELINOU SÍROVOU

6.0:20509

SEMIMIKROMETODA

Množství zkoušené látky odpovídající asi 2 mg dusíku se

kvantitativně převede do spalovací baňky, přidají se 4 g

práškované směsi vzniklé smícháním 100 g síranu draselného

R, 5 g síranu měďnatého R a 2,5 g selenu R. Přidají

se tři skleněné kuličky, všechny částečky se z hrdla baňky

spláchnou 5 ml kyseliny sírové R a obsah baňky se promíchá.

Hrdlo baňky se volně uzavře např. skleněnou nálevkou

s krátkým stonkem, aby se zabránilo ztrátám kyseliny

sírové. Baňka se postupně zahřívá, dokud nedojde k varu

a následné kondenzaci kyseliny sírové v hrdle baňky. Je

nutno zabránit přehřátí horní části baňky. Baňka se zahřívá

30 min, pokud není stanoveno jinak. Potom se baňka

ochladí, částice se rozpustí opatrným přidáním 25 ml vody

R, znovu se ochladí a baňka se umístí do přístroje

k destilaci s vodní parou. Přidá se 30 ml hydroxidu sodného

koncentrovaného RS a destiluje se přeháněním vodní

parou. Přibližně 40 ml destilátu se jímá do baňky obsahující

20,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS, k níž

bylo přidáno tolik vody R, aby ústí chladiče bylo ponořeno

pod hladinu. Ke konci destilace se jímací baňka sníží tak,

aby konec chladiče byl nad hladinou kyseliny. Je nutno

zajistit, aby voda z vnějšího povrchu chladiče nestékala

do baňky. Destilát se titruje hydroxidem sodným

0,01 mol/l VS za použití červeně methylové směsného indikátoru

RS.

Za stejných podmínek se provede slepá zkouška za použití

50 mg glukosy R místo zkoušené látky.

Obsah dusíku (x) v procentech se vypočítá podle vzorce:

( n n )

0,01401

2 -

=

m

x

1

v němž značí:


n1 – spotřebu hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS při titraci

v mililitrech;

n2 – spotřebu hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS při slepé

zkoušce v mililitrech.

,

2.5.10 SPALOVÁNÍ ORGANICKÝCH LÁTEK

V KYSLÍKU

6.0:20510

Pokud není uvedeno jinak, použije se nejméně 500ml silnostěnná

kuželová baňka z borokřemičitého skla se zabroušenou

zátkou, v níž je upevněn vhodný nosič vzorku, např.

z platiny nebo platinoiridia.

Předepsané množství jemně rozetřené zkoušené látky se

umístí do středu filtračního papíru o rozměru

30 mm ´ 40 mm opatřeného páskou z filtračního papíru asi

10 mm širokou a 30 mm dlouhou. Pokud je předepsána impregnace

papíru uhličitanem lithným, navlhčí se před použitím

střed papíru nasyceným roztokem uhličitanu lithného

R a vysuší se v sušárně. Zkoušená látka se zabalí do

papíru a umístí se na nosič vzorku. Do baňky se převede

voda R nebo předepsaná tekutina pro absorpci spalných

produktů a vzduch se vytlačí kyslíkem, např. hadicí zavedenou

přímo nad tekutinu. Hrdlo baňky se navlhčí vodou R,

papírová páska se zapálí a baňka se pevně uzavře zátkou se

vzorkem. Po spálení se baňkou silně protřepává, aby spalné

produkty přešly do roztoku. Po ochlazení, pokud není uvedeno

jinak, se baňka nechá 5 min stát, opatrně se otevře

a zátka, stěny baňky a nosič vzorku se opláchnou vodou R.

Roztoky se spojí a dále se postupuje tak, jak je uvedeno

v jednotlivých článcích.

2.5.11 CHELATOMETRICKÉ TITRACE

8.0:20511

BISMUT

Předepsaný roztok se v 500ml kuželové baňce zředí vodou

R na 250 ml. Pokud není uvedeno jinak, přidává se po

kapkách a za třepání amoniak koncentrovaný R, až se začne

tvořit zákal. Přidá se 0,5 ml kyseliny dusičné R a roztok se

zahřeje asi na 70 °C, až zákal úplně zmizí. Potom se přidá

asi 50 mg oranže xylenolové s dusičnanem draselným R

a titruje se dinatrium-edetátem 0,1 mol/l VS do změny růžovofialového

zbarvení na žluté.

1 ml dinatrium-edetátu 0,1 mol/l VS odpovídá 20,90 mg Bi.

HLINÍK

20,0 ml předepsaného roztoku se převede do 500ml kuželové

baňky, přidá se 25,0 ml dinatrium-edetátu 0,1 mol/l VS

a 10 ml směsi stejných objemových dílů roztoku amonium-

-acetátu R (155 g/l) a kyseliny octové zředěné RS a 2 min se

vaří. Po ochlazení se přidá 50 ml ethanolu bezvodého R

a 3 ml čerstvě připraveného roztoku dithizonu R (0,25 g/l)

v ethanolu bezvodém R. Nadbytek dinatrium-edetátu se titruje

síranem zinečnatým 0,1 mol/l VS do změny zelenomodrého

zbarvení na červenofialové.

1 ml dinatrium-edetátu 0,1 mol/l VS odpovídá 2,698 mg Al.

HOŘČÍK


R na 300 ml. Přidá se 10 ml tlumivého roztoku

s chloridem amonným o pH 10,0 R a asi 50 mg černě eriochromové

T s chloridem sodným R. Zahřeje se na asi 40 °C

a při této teplotě se titruje dinatrium-edetátem 0,1 mol/l VS

do změny fialového zbarvení na sytě modré.

1 ml dinatrium-edetátu 0,1 mol/l VS odpovídá

2,431 mg Mg.

OLOVO


R na 200 ml. Přidá se asi 50 mg oranže xylenolové

s dusičnanem draselným R a tolik methenaminu R, až se

258 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.12 SEMIMIKROSTANOVENÍ VODY

roztok zbarví fialovorůžově. Potom se titruje dinatrium-

-edetátem 0,1 mol/l VS do změny fialovorůžového zbarvení

na žluté.

1 ml dinatrium-edetátu 0,1 mol/l VS odpovídá 20,72 mg Pb.

VÁPNÍK

Předepsaný roztok se v 500ml kuželové baňce zředí vodou R

na 300 ml. Přidá se 6,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného

RS a asi 200 mg kyseliny kalkonkarboxylové s chloridem

sodným R a titruje se dinatrium-edetátem 0,1 mol/l VS

do změny fialového zbarvení na sytě modré.


4,008 mg Ca.

ZINEK


R na 200 ml. Přidá se asi 50 mg oranže xylenolové

s dusičnanem draselným R a tolik methenaminu R, až se

roztok zbarví fialovorůžově. Po přidání dalších 2 g methenaminu

R se roztok titruje dinatrium-edetátem 0,1 mol/l VS

do změny fialovorůžového zbarvení na žluté.

1 ml dinatrium-edetátu 0,1 mol/l VS odpovídá 6,54 mg Zn.

2.5.12 SEMIMIKROSTANOVENÍ VODY

9.4:20512

Semimikrostanovení vody je založeno na kvantitativní reakci

vody s oxidem siřičitým a jodem ve vhodném nevodném

prostředí za přítomnosti bazických látek s dostatečnou

tlumivou kapacitou.

ZAŘÍZENÍ

Skládá se z titrační nádobky vybavené:

– dvěma identickými platinovými elektrodami;

– utěsněnými otvory pro přidávání rozpouštědla a odměrného

roztoku;

– otvorem pro odvzdušňovací trubici se sušidlem;

– otvorem pro přidání vzorku opatřeným zátkou nebo septem

(pro přidání kapalin).

Zařízení může být také opatřeno systémem otvorů pro přívod

suchého dusíku nebo pro odsávání rozpouštědel.

Titrace se provádí podle pokynů výrobce přístroje. Po celou

dobu titrace je třeba zabránit vystavení zkoumadel a rozpouštědel

vzdušné vlhkosti. Bod ekvivalence se stanoví za

použití dvou identických indikačních elektrod připojených

k elektrickému zdroji tak, aby byl mezi elektrodami udržován

konstantní proud (2.2.65 Voltametrické titrace) nebo

konstantní napětí (2.2.19 Ampérometrické titrace). Kde se

použije přímá titrace (Metoda A), způsobí přidání odměrného

roztoku buď pokles napětí, je-li udržován konstantní

proud, nebo vzestup proudu, je-li udržováno konstantní napětí,

dokud není dosaženo bodu ekvivalence. Běžně se používají

přístroje vybavené automatickou detekcí bodu ekvivalence.

Kvalifikace přístroje se provádí v souladu se zavedenými

postupy systému jakosti, například za použití

vhodného certifikovaného referenčního materiálu (může

se použít natrium-aminosalicylát dihydrát pro kvalifikaci

přístroje CRL).

STANOVENÍ TITRU

Do titrační nádobky se přidá methanol R, je-li třeba vysušený,

nebo rozpouštědlo doporučené dodavatelem odměrného

roztoku. Kde je to pro použitý přístroj vhodné, odstraní se

z měřicí cely zbytková voda, nebo se provede předtitrace.

Přidá se vhodné množství vody v přijatelné formě (voda R

nebo certifikovaný referenční materiál) a titruje se za míchání

po nezbytnou dobu. Ekvivalent vody je nejméně 80 %

hodnoty uvedené dodavatelem. Stanovení titru se provádí

před prvním použitím a potom ve vhodných intervalech.

Pokud není uvedeno jinak, použije se Metoda A.

METODA A

Do titrační nádobky se přidá methanol R nebo rozpouštědlo

předepsané v příslušném článku, nebo rozpouštědlo doporučené

dodavatelem odměrného roztoku. Kde je to pro použitý

přístroj vhodné, odstraní se z měřicí cely zbytková

voda, nebo se provede předtitrace. Rychle se přidá zkoušená

látka a titruje se za míchání po nezbytně dlouhou dobu.

METODA B

Do titrační nádobky se přidá methanol R, nebo rozpouštědlo

předepsané v příslušném článku, nebo rozpouštědlo

doporučené dodavatelem odměrného roztoku. Kde je to pro

použitý přístroj vhodné, odstraní se z měřicí cely zbytková

voda, nebo se provede předtitrace. Rychle se přidá zkoušená

látka ve vhodném stupni rozmělnění a přesně odměřený

objem odměrného roztoku v nadbytku asi 1 ml, nebo

v předepsaném objemu. Nechá se stát za chránění před

světlem po dobu 1 min, nebo po předepsanou dobu, za

míchání. Nadbytek zkoumadla se retitruje methanolem R,

nebo předepsaným rozpouštědlem, které obsahuje přesné

známé množství vody.

ZPŮSOBILOST

Přesnost stanovení vybraného odměrného roztoku se musí

ověřit pro každou kombinaci zkoušené látky, odměrného roztoku

a rozpouštědla. Následující postup se uvádí jako příklad

a je vhodný pro vzorky obsahující 2,5 mg až 25 mg vody.

Obsah vody ve zkoušené látce se stanoví za použití vybraného

systému zkoumadlo/rozpouštědlo. Potom se do stejné

titrační nádobky přidají postupně a v přijatelné formě (nejméně

pět přídavků) známá množství vody, která odpovídají

50 % až 100 % nalezeného množství vody ve zkoušené látce

a po každém přídavku se stanoví obsah vody. Procento

odezvy (r) po každém přídavku se vypočítá pomocí následujícího

vzorce:

v němž značí:

W

r =100 2

,

W

W1 – množství přidané vody v miligramech;

W2 – množství nalezené vody v miligramech.

Vypočítá se průměrná odezva ( r ) v procentech. Pro systém

zkoumadlo/rozpouštědlo je přijatelná hodnota ( r ) v rozmezí

97,5 % až 102,5 %.

Vypočítá se regresní závislost. Na osu x se vynese kumulativní

přidaná voda, na osu y součet počátečního obsahu vody

stanoveného pro látku (M) a kumulativního obsahu vody

stanoveného po každém přídavku. Vypočítá se směrnice

(b), průsečnice (a) s osou y a průsečnice (d) extrapolované

kalibrační přímky s osou x.

Pomocí následujících vzorců se vypočítají procenta chyb

(e1 a e2):

1

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 259

2.5.13 HLINÍK V ADSORBOVANÝCH VAKCÍNÁCH

a - M

e

,

1

=100

M

d - M

e

,

2

=100

M

v nichž značí:

a – průsečnici s osou y v miligramech vody;

d – průsečnici s osou x v miligramech vody;

M – obsah vody v látce v miligramech vody.

Systém zkoumadlo/rozpouštědlo je přijatelný, pokud:

– e a e nejsou vyšší než 2,5 %;

1

2

– směrnice b je v rozmezí 0,975 až 1,025.

2.5.13 HLINÍK V ADSORBOVANÝCH

VAKCÍNÁCH

6.0:20513

Množství zkoušeného zhomogenizovaného přípravku odpovídající

5 mg až 6 mg hliníku se převede do 50ml spalovací

baňky. Přidá se 1 ml kyseliny sírové R, 0,1 ml kyseliny dusičné

R a několik skleněných kuliček. Směs se zahřívá až do

vývoje bílého hustého dýmu. Jestliže směs obsahuje zuhelnatělé

zbytky, přidá se několik kapek kyseliny dusičné R

a pokračuje se v zahřívání k varu až do odbarvení. Nechá se

ochladit a po několika minutách se opatrně přidá 10 ml vody

R a zahřívá se do získání čirého roztoku. Po ochlazení se

přidá 0,05 ml oranže methylové RS a zneutralizuje se hydroxidem

sodným koncentrovaným RS (6,5 ml až 7 ml). Jestliže

vznikne sraženina, rozpustí se přidáním několika kapek kyseliny

sírové zředěné RS. Roztok se převede do kuželové 250ml

baňky, spalovací baňka se vypláchne 25 ml vody R a promývací

tekutina se přidá do kuželové baňky. Přidá se 25,0 ml dinatrium-edetátu

0,02 mol/l VS, 10 ml tlumivého roztoku acetátového

o pH 4,4 R, několik skleněných kuliček a 3 min se mírně

vaří. Potom se přidá 0,1 ml pyridylazonaftolu RS a horký

roztok se titruje síranem měďnatým 0,02 mol/l VS do změny

zbarvení na fialovohnědé. Provede se slepá zkouška.


0,5396 mg Al.

2.5.14 VÁPNÍK V ADSORBOVANÝCH

VAKCÍNÁCH

6.0:20514

Všechny roztoky použité v této zkoušce se musí připravit

z vody R.

Provede se stanovení vápníku atomovou emisní spektrometrií

(2.2.22, Metoda I).

K 1,0 ml homogenizovaného zkoušeného přípravku se přidá

0,2 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a zředí se

vodou R na 3,0 ml. Měří se absorbance při 620 nm.

2.5.15 FENOL V IMUNOSÉRECH

A VAKCÍNÁCH

6.0:20515

Zkoušený přípravek se zhomogenizuje a zředí vodou R tak,

aby se získal roztok obsahující asi 15 μg fenolu v mililitru.

Připraví se porovnávací roztoky obsahující 5 μg, 10 μg,

15 μg, 20 μg a 30 μg fenolu R v mililitru. K 5 ml zkoušeného

roztoku a k 5 ml každého porovnávacího roztoku se přidá

5 ml tlumivého roztoku o pH 9,0 R, 5 ml aminopyrazolonu

RS a 5 ml hexakyanidoželezitanu draselného RS. Po

10 min se měří intenzita zbarvení roztoků při 546 nm.

Sestrojí se kalibrační křivka a vypočítá se obsah fenolu ve

zkoušeném přípravku.

2.5.16 BÍLKOVINY V POLYSACHA-

RIDOVÝCH VAKCÍNÁCH

6.0:20516

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu,

aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující

asi 5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této

baňky se kvantitativně převede obsah lahvičky (ampule)

přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R. 1 ml tohoto

roztoku se převede do skleněné zkumavky a přidá se

0,15 ml roztoku kyseliny trichloroctové R (400 g/l). Roztok

se protřepe, nechá se 15 min stát, 10 min se odstřeďuje

při 5000 ot/min a supernatantní tekutina se odstraní. Ke

zbytku ve zkumavce se přidá 0,4 ml hydroxidu sodného

0,1 mol/l RS.

Porovnávací roztoky. 0,100 g albuminu hovězího R se rozpustí

ve 100 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS (základní

roztok obsahující 1 g bílkoviny v litru). 1 ml základního

roztoku se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na 20 ml

(zředěný roztok (1) obsahující 50 mg bílkoviny v litru).

1 ml základního roztoku se zředí hydroxidem sodným

0,1 mol/l RS na 4 ml (zředěný roztok (2) obsahující 250 mg

bílkoviny v litru). Do šesti skleněných zkumavek se převede

0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml zředěného roztoku (1)

a 0,15 ml, 0,20 ml, 0,25 ml zředěného roztoku (2). Obsah

každé zkumavky se zředí hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS

na 0,40 ml.

Kontrolní roztok. Použije se 0,40 ml hydroxidu sodného

0,1 mol/l RS.

Do každé zkumavky se přidají 2 ml kuprum(II)-tartarátu RS3,

protřepe se a nechá se 10 min stát. Do každé zkumavky se

dále přidá 0,2 ml směsi stejných objemových dílů zkoumadla

fosfomolybdenan-wolframového R a vody R připravené těsně

před použitím. Zkumavky se uzavřou, promíchají se převracením

a směs se nechá stát 30 min ve tmě. Modré zbarvení je

stálé 60 min. Je-li třeba, odstřeďuje se do získání čirých roztoků.

Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 760 nm

proti kontrolnímu roztoku. Z absorbancí šesti porovnávacích

roztoků a z jejich koncentrací bílkovin se sestrojí kalibrační

křivka, ze které se odečte obsah bílkoviny ve zkoušeném

roztoku.

2.5.17 NUKLEOVÉ KYSELINY V POLYSA-

CHARIDOVÝCH VAKCÍNÁCH

6.0:20517



asi 5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky

se kvantitativně převede obsah jedné lahvičky (ampule)

přípravku a zředí se na potřebný objem vodou R.

260 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.18 FOSFOR V POLYSACHARIDOVÝCH VAKCÍNÁCH

Roztok se podle potřeby dále ředí pro získání vhodné hodnoty

absorbance na použitém přístroji. Měří se absorbance (2.2.25)

při 260 nm za použití vody R jako kontrolní kapaliny.

Hodnota absorbance roztoku nukleové kyseliny (1 g/l) při

260 nm je 20.

2.5.18 FOSFOR V POLYSACHARIDOVÝCH

VAKCÍNÁCH

6.0:20518




se kvantitativně převede obsah lahvičky (ampule) přípravku

a zředí se na potřebný objem vodou R. Roztok se dále zředí

tak, aby 1 ml obsahoval asi 6 µg fosforu. 1,0 ml tohoto roztoku

se převede do 10ml spalovací zkumavky.

Porovnávací roztoky. Rozpuštěním 0,2194 g dihydrogenfosforečnanu

draselného R v 500 ml vody R se připraví roztok

obsahující 0,1 mg fosforu v mililitru. 5,0 ml tohoto roztoku

se zředí vodou R na 100,0 ml. Do tří spalovacích zkumavek

se převede 0,5 ml, 1,0 ml a 2,0 ml tohoto roztoku.

Kontrolní roztok. Získá se provedením slepé zkoušky za

použití 2,0 ml vody R ve spalovací zkumavce.

Do všech zkumavek se přidá 0,2 ml kyseliny sírové R a zahřívá

se v olejové lázni 1 h při 120 °C a dále při 160 °C tak

dlouho, dokud nevznikne bílý dým (asi 1 h). Potom se přidá

0,1 ml kyseliny chloristé R a zahřívá se při 160 °C až do

odbarvení roztoku (asi 90 min). Ochladí se, do každé zkumavky

se přidají 4 ml vody R a 4 ml zkoumadla molybdenan-amonného

R. Zahřívá se 90 min ve vodní lázni při

37 °C, ochladí se a zředí se vodou R na 10,0 ml. Vzniklé

modré zbarvení je stálé několik hodin.


proti kontrolnímu roztoku. Z naměřených hodnot absorbance

tří porovnávacích roztoků v závislosti na jejich obsahu

fosforu se sestrojí kalibrační křivka, ze které se odečte obsah

fosforu ve zkoušeném roztoku.

2.5.19 O-ACETYL V POLYSACHARIDOVÝCH

VAKCÍNÁCH

10.0:20519


aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi

5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky se

kvantitativně převede obsah lahvičky (ampule) přípravku

a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok ředí tak,

aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 30 µg až 600 µg

acetylcholin-chloridu (O-acetyl). Ze zředěného roztoku se do

šesti zkumavek převede dvakrát po 0,3 ml, dvakrát po 0,5 ml

a dvakrát po 1,0 ml (tři reakční roztoky a tři korekční roztoky).

Porovnávací roztoky. 0,150 g acetylcholin-chloridu R se

rozpustí v 10 ml vody R (základní roztok obsahující 15 g acetylcholin-chloridu

v litru). Těsně před použitím se zředí 1 ml

základního roztoku vodou R na 50 ml (pracovní zředěný roztok

1 obsahující 300 µg acetylcholin-chloridu v mililitru).

Těsně před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou

R na 25 ml (pracovní zředěný roztok 2 obsahující 600 µg

acetylcholin-chloridu v mililitru). Do čtyř zkumavek se duplicitně

převede po 0,1 ml a 0,4 ml pracovního zředěného

roztoku 1 (reakční a korekční roztoky) a do jiných čtyř zkumavek

se duplicitně převede po 0,6 ml a 1,0 ml pracovního

zředěného roztoku 2 (reakční a korekční roztoky).

Kontrolní roztok. Použije se 1 ml vody R.

Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 1 ml. Do zkumavek

s korekčními roztoky a do zkumavky s kontrolním

roztokem se přidá 1,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové

(4 mol/l) připraveného z kyseliny chlorovodíkové R. Do

všech zkumavek se pak přidají 2,0 ml hydroxylaminu alkalického

RS. Nechá se reagovat přesně 2 min a pak se do

zkumavek s reakčními roztoky přidá 1,0 ml roztoku kyseliny

chlorovodíkové (4 mol/l). Dále se do všech zkumavek

přidá 1,0 ml roztoku chloridu železitého R (100 g/l) roztoku

kyseliny chlorovodíkové (1 mol/l) připraveného z kyseliny

chlorovodíkové R, zkumavky se uzavřou zátkou a intenzivním

třepáním se odstraní bubliny.

Měří se absorbance (2.2.25) všech roztoků při 540 nm proti

kontrolnímu roztoku. Od hodnot absorbance reakčních roztoků

se odečte absorbance příslušných korekčních roztoků.

Z korigovaných hodnot absorbance čtyř porovnávacích roztoků

se sestrojí kalibrační křivka (závislost korigované absorbance

na obsahu acetylcholin-chloridu) a na základě korigovaných

hodnot absorbance zkoušených roztoků se odečte

obsah acetylcholin-chloridu ve zkoušených roztocích.

Z odečtených tří hodnot se vypočítá průměr.

1 mol acetylcholin-chloridu (181,7 g) odpovídá 1 molu

O-acetylu (43,05 g).

2.5.20 HEXOSAMINY V POLYSACHA-

RIDOVÝCH VAKCÍNÁCH

6.0:20520




se kvantitativně přenese obsah lahvičky (ampule) přípravku

a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok naředí

tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 125 µg

až 500 µg glukosaminu (hexosaminu). 1,0 ml zředěného

roztoku se převede do kalibrované zkumavky.

Porovnávací roztoky. 60 mg glukosamin-hydrochloridu R

se rozpustí ve 100 ml vody R (základní roztok obsahující

0,500 g glukosaminu v litru). Do čtyř kalibrovaných zkumavek

se převede 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml a 1,0 ml základního

roztoku.


Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 1 ml. Do každé

zkumavky se přidá 1 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové R

(292 g/l). Zkumavky se uzavřou zátkou a zahřívají se 1 h ve

vodní lázni. Po vychladnutí na teplotu místnosti se do každé

zkumavky přidá 0,05 ml roztoku thymolftaleinu R (5 g/l)

v ethanolu 96% R a dále se přidává roztok hydroxidu sodného

R (200 g/l) až do vzniku modrého zabarvení. Potom se

přidává do každé zkumavky kyselina chlorovodíková

1 mol/l RS, dokud se roztok neodbarví. Obsah každé zkumavky

se zředí vodou R na 10 ml (neutralizované hydrolyzáty).

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 261

2.5.21 METHYLPENTOSY V POLYSACHARIDOVÝCH VAKCÍNÁCH

Do druhé řady kalibrovaných 10ml zkumavek se přenese

1 ml každého neutralizovaného hydrolyzátu. Přidá se 1 ml

acetylacetonového zkoumadla [čerstvě připravená směs obsahující

1 objemový díl acetylacetonu R a 50 objemových

dílů roztoku uhličitanu sodného bezvodého R (53 g/l)] do

každé zkumavky. Zkumavky se uzavřou zátkou a zahřívají

45 min ve vodní lázni při 90 °C a potom se ochladí na teplotu

místnosti. Do každé zkumavky se přidá 2,5 ml ethanolu

96% R a 1,0 ml roztoku dimethylaminobenzaldehydu

(čerstvě připravený roztok: 0,8 g dimethylaminobenzaldehydu

R se rozpustí v 15 ml ethanolu 96% R a přidá se 15 ml

kyseliny chlorovodíkové R) a obsah každé zkumavky se

zředí ethanolem 96% R na 10 ml. Zkumavky se uzavřou,

obsah se promíchá obracením zkumavek a 90 min se nechá

stát ve tmě. Pak se změří absorbance (2.2.25) každého roztoku

při 530 nm proti kontrolnímu roztoku.

Sestrojí se kalibrační křivka vynesením absorbance čtyř porovnávacích

roztoků proti obsahu hexosaminu, ze které se

odečte množství hexosaminu ve zkoušeném roztoku.

2.5.21 METHYLPENTOSY V POLYSA-


6.0:20521




se kvantitativně převede obsah lahvičky (ampule) přípravku

a zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok zředí

tak, aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 2 µg až

20 µg rhamnosy (methylpentosy). 0,25 ml, 0,50 ml a 1,0 ml

zředěného roztoku se převede do tří zkumavek.

Porovnávací roztoky. 0,100 g rhamnosy R se rozpustí ve

100 ml vody R (základní roztok obsahující 1 g methylpentosy

v litru). Těsně před použitím se 1 ml základního roztoku

zředí vodou R na 50 ml (zředěný roztok obsahující

20 mg methylpentosy v litru). Do pěti zkumavek se převede

0,10 ml, 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml a 1,0 ml zředěného roztoku.


Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 1 ml. Zkumavky

se vloží do lázně s ledovou vodou a postupně se za stálého

míchání po kapkách přidává do každé zkumavky

4,5 ml zchlazené směsi objemových dílů vody R a kyseliny

sírové R (1 + 6). Zkumavky se pak zahřejí na teplotu místnosti

a na několik minut se vloží do vodní lázně a opět se

ochladí na teplotu místnosti. Do každé zkumavky se přidá

0,10 ml čerstvě připraveného roztoku cystein-hydrochloridu

R (30 g/l). Protřepe se a nechá 2 h stát.


a 430 nm proti kontrolnímu roztoku. Pro každý roztok se

vypočítá rozdíl hodnot absorbancí měřených při 396 nm

a 430 nm. Ze zjištěných rozdílů absorbancí pro pět porovnávacích

roztoků se sestrojí kalibrační křivka (závislost

rozdílu absorbancí na obsahu methylpentosy), ze které se

odečte obsah methylpentosy v každém zkoušeném roztoku.

Ze tří získaných hodnot se vypočítá průměr.

2.5.22 KYSELINY URONOVÉ V POLYSA-


6.0:20522


aby bylo možno připravit roztok přípravku obsahující asi

5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky se

kvantitativně převede obsah lahvičky (ampule) přípravku a

zředí se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok zředí tak,

aby objemy použité ke zkoušce obsahovaly 4 µg až 40 µg

kyseliny glukuronové (kyseliny uronové). 0,25 ml, 0,50 ml a

1,0 ml tohoto roztoku se přenese do tří zkumavek.

Porovnávací roztoky. 50 mg natrium-glukuronátu R se rozpustí

ve 100 ml vody R (základní roztok kyseliny glukuronové

0,4 g/l). Těsně před použitím se 5 ml základního roztoku

zředí vodou R na 50 ml (zředěný roztok kyseliny glukuronové

40 mg/l). 0,10 ml, 0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml

a 1,0 ml tohoto roztoku se převede do pěti zkumavek.


Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 1 ml. Zkumavky

se vloží do lázně s ledovou vodou a do každé zkumavky

se přidává po kapkách za stálého míchání 5,0 ml boritanového

roztoku RS. Zkumavky se uzavřou, vloží na 15 min do

vodní lázně a ochladí se na teplotu místnosti. Do každé

zkumavky se přidá 0,20 ml roztoku karbazolu R (1,25 g/l)

v ethanolu bezvodém R. Zkumavky se uzavřou a vloží se na

15 min do vodní lázně a ochladí se na teplotu místnosti. Potom

se měří absorbance (2.2.25) každého roztoku při

530 nm proti kontrolnímu roztoku.

Sestrojí se kalibrační křivka vynesením absorbance pěti porovnávacích

roztoků proti jejich obsahu kyseliny glukuronové

a z křivky se odečte množství kyseliny glukuronové

v každém zředění zkoušeného roztoku. Ze tří získaných

hodnot se vypočítá průměr.

2.5.23 KYSELINA SIALOVÁ V POLYSA-


6.0:20523

Zkoušený roztok. Obsah jedné nebo více lahviček (ampulí)

zkoušeného přípravku se kvantitativně převede do odměrné

baňky vhodného objemu. Zředí se na potřebný objem vodou

R tak, aby vznikl roztok polysacharidu o známé koncentraci

asi 250 µg/ml. Za použití injekční stříkačky se převedou

4,0 ml tohoto roztoku do 10ml ultrafiltrační kyvety vhodné

pro průchod molekul o relativní molekulové hmotnosti menší

než 50 000. Stříkačka se dvakrát promyje vodou R a promývací

tekutina se převede do ultrafiltrační kyvety. Ultrafiltrace

se provádí za stálého míchání pod dusíkem a při tlaku asi

150 kPa. Pokaždé, když objem tekutiny v kyvetě klesne na

1 ml, se kyveta znovu naplní vodou R a pokračuje se, dokud

není zfiltrováno 200 ml a zbytek v kyvetě je asi 2 ml. Zbylá

tekutina se z kyvety převede stříkačkou do 10ml odměrné

baňky. Kyveta se promyje třikrát 2 ml vody R, promývací tekutina

se přidá do odměrné baňky a zředí se vodou R na

10,0 ml (zkoušený roztok). Do každé ze dvou zkumavek se

převedou 2,0 ml zkoušeného roztoku.

Porovnávací roztoky. Použijí se porovnávací roztoky předepsané

v článku. Připraví se dvě řady po třech zkumavkách

a do zkumavek každé řady se převede 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml

262 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.24 OXID UHLIČITÝ V PLYNECH

porovnávacího roztoku odpovídajícího typu zkoušené vakcíny.

Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 2,0 ml.

Kontrolní roztoky. Do každé ze dvou zkumavek se použijí

2,0 ml vody R.

Do všech zkumavek se přidá po 5,0 ml zkoumadla resorcinolového

R, zkumavky se zahřívají 15 min při 105 °C,

ochladí se studenou vodou a přemístí se do lázně s ledovou

vodou. Do každé zkumavky se přidá po 5 ml isoamylalkoholu

R, důkladně se promíchá a zkumavky se ponechají

15 min v lázni s ledovou vodou. Zkumavky se odstředí

a ponechají se v lázni s ledovou vodou do spektrofotometrického

měření. Měří se absorbance (2.2.25) každé supernatantní

tekutiny při 580 nm a 450 nm proti isoamylalkoholu

R. Pro každou vlnovou délku se vypočítá absorbance jako

průměr hodnot naměřených u dvou stejných roztoků

a od těchto hodnot se odečte průměrná hodnota zjištěná

u kontrolního roztoku.

Sestrojí se graf ukazující rozdíl mezi absorbancí porovnávacích

roztoků při 580 nm a 450 nm jako funkce obsahu

kyseliny sialové (kyseliny N-acetylneuraminové) a z grafu

se odečte množství kyseliny sialové ve zkoušeném roztoku.

2.5.24 OXID UHLIČITÝ V PLYNECH

7.0:20524

Plyny absorbují světlo při jedné nebo více určitých vlnových

délkách. Tato vlastnost je široce využívaná při použití

ve vysoce selektivních měřeních jejich koncentrací.

Popis a princip měření. Koncentrace oxidu uhličitého se

stanoví pomocí infračerveného analyzátoru.

Infračervený analyzátor se obvykle skládá ze zdroje emitujícího

širokopásmové infračervené záření, optického zařízení,

kyvety se vzorkem a detektoru. Optické zařízení může

být umístěno buď před, nebo za kyvetou se vzorkem a je

tvořeno jedním nebo několika optickými filtry, jimiž širokopásmové

záření prochází. Optické zařízení je v tomto

případě selektivní pro oxid uhličitý. Měří se paprsek procházející

kyvetou se vzorkem, a může také procházet referenční

kyvetou, pokud to analyzátor umožňuje (některé používají

elektronický systém místo referenční kyvety).

Pokud je oxid uhličitý v kyvetě, bude se absorpční energie

při měření světelného paprsku řídit podle Lambertova-Beerova

zákona a to se projeví ve změně signálu detektoru.

Tento změřený signál se porovná s referenčním signálem

a vygenerovaný výstup je úměrný koncentraci oxidu

uhličitého. Vygenerovaný signál je linearizován, aby se

získala koncentrace oxidu uhličitého. Aby se předešlo znečištění

senzorů částicemi, což by mohlo vyvolat efekt rozptýleného

světla, je zařízení vybaveno vhodným filtrem.

Požadované technické údaje. Pokud se použije k limitní

zkoušce, splňuje infračervený analyzátor následující technické

údaje:

– detekční limit (obvykle je definován jako poměr signálu

k šumu rovný 2): nejvýše 20 % maximální povolené koncentrace;

– opakovatelnost: maximální směrodatná odchylka je 10 %

od maximální povolené koncentrace, stanoví se při šesti

měřeních;

– linearita: nejvýše 10 % maximální povolené koncentrace.

Technické údaje musí být splněny i v přítomnosti jiných

nečistot plynů ve vzorku.

2.5.25 OXID UHELNATÝ V PLYNECH

7.0:20525

METODA I

Zařízení. Zařízení (viz obrázek 2.5.25-1) se skládá z následujících

částí vzájemně sériově spojených:

– U-trubice (U1) obsahující silikagel bezvodý R impregnovaný

oxidem chromovým R;

– promývačky (F1) obsahující 100 ml roztoku hydroxidu

draselného R (400 g/l);

– U-trubice (U2) obsahující hydroxid draselný R v peletách;

– U-trubice (U3) obsahující oxid fosforečný R nanesený na

předem granulovanou tavenou pemzu;

– U-trubice (U4) obsahující 30 g předem při 200 °C vysušeného

překrystalovaného oxidu jodičného R v granulích

a v průběhu zkoušky uchovávaného při 120°C (T); oxid

jodičný se do trubice naplní po 1cm vrstvách oddělených

od sebe vrstvami skleněné vaty stejné délky tak, aby

účinná délka kolony byla 5 cm. Trubice je opatřena termostatem

(T), kterým se při zkoušce udržuje teplota na

120 °C;

– reakční trubice (F2) obsahující 2,0 ml jodidu draselného

RS a 0,15 ml škrobu RS.

Postup. Zařízením se nechá projít 5,0 litrů argonu R a případně

vzniklé modré zbarvení roztoku jodidu se odstraní

přídavkem nejmenšího potřebného množství čerstvě připraveného

thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS. V promývání se

pokračuje tak dlouho, dokud spotřeba thiosíranu sodného

0,002 mol/l VS po průchodu 5,0 litrů argonu R není vyšší

než 0,045 ml. Pak se zařízením nechá procházet zkoušený

plyn z tlakové lahve; objem a průtoková rychlost plynu jsou

předepsány v příslušném článku. Zbytky uvolněného jodu

v reakční trubici se potom vymyjí průchodem 1,0 litru argonu

R zařízením. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným

0,002 mol/l VS. Provede se slepá zkouška za použití

předepsaného objemu argonu R. Spotřeba thiosíranu sodného

0,002 mol/l VS korigovaná spotřebou při slepé zkoušce

není větší, než je předepsaný limit.

METODA II




Popis a princip měření. Koncentrace oxidu uhelnatého

v jiných plynech se stanoví pomocí infračerveného analyzátoru.

Infračervený analyzátor se obvykle skládá ze zdroje emitujícího

širokopásmové infračervené záření, optického zařízení,

kyvety se vzorkem a detektoru. Optické zařízení může být

umístěno buď před, nebo za kyvetou se vzorkem a je tvořeno

jedním nebo několika optickými filtry, jimiž širokopásmové

záření prochází. Optické zařízení je v tomto případě selektivní

pro oxid uhelnatý. Měří se světelný paprsek procházející

kyvetou se vzorkem, který může také procházet referenční


elektronický systém místo referenční kyvety).

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 263

2.5.26 OXID DUSNATÝ A OXID DUSIČITÝ V PLYNECH

Obr. 2.5.25-1 Zařízení pro stanovení oxidu uhelnatého (rozměry v milimetrech)

Pokud je v kyvetě se vzorkem přítomen oxid uhelnatý, bude

se absorpční energie při měření paprsku řídit podle

Lambertova-Beerova zákona, a to se projeví ve změně signálu

detektoru. Tento změřený signál se porovná s referenčním

signálem a vygenerovaný výstup je úměrný koncentraci

oxidu uhelnatého. Vygenerovaný signál je linearizován,

aby se získala koncentrace oxidu uhelnatého. Aby se

předešlo znečištění senzorů částicemi, což by mohlo vyvolat

efekt rozptýleného světla, je zařízení vybaveno vhodným

filtrem.

Požadované technické údaje. Při použití k limitní zkoušce

musí infračervený analyzátor splňovat následující technickou

specifikaci:

– detekční limit (obvykle je definován jako poměr signálu

k šumu rovný 2): nejvýše 20 % maximální povolené koncentrace;

– opakovatelnost: maximální směrodatná odchylka je 10 %

od maximální povolené koncentrace, stanoví se při šesti

měřeních;

– linearita: nejvýše 10 % maximální povolené koncentrace.

Technické údaje musí být splněny i v přítomnosti jiných

nečistot plynů ve vzorku.

2.5.26 OXID DUSNATÝ A OXID DUSIČITÝ

V PLYNECH

6.0:20526

Oxid dusnatý a oxid dusičitý v plynech se stanoví pomocí

chemiluminiscenčního analyzátoru (viz obrázek 2.5.26-1).

Přístroj se skládá z následujících částí:

– zařízení pro filtraci, nastavení a kontrolu průtoku zkoušeného

plynu;

– konvertoru, který redukuje oxid dusičitý na oxid dusnatý

pro stanovení součtu obsahů oxidu dusnatého a oxidu dusičitého;

účinnost konvertoru musí být ověřena před použitím;

– generátoru ozonu s kontrolovanou průtokovou rychlostí

plynu; ozon se vytváří působením elektrických výbojů

mezi dvěma elektrodami s přiloženým vysokým napětím;

do ozonového generátoru se přivádí buď čistý kyslík, nebo

vysušený atmosférický vzduch a koncentrace takto získaného

ozonu musí značně převyšovat maximální koncentraci

detekovatelných oxidů dusíku;

– komůrky, v níž reaguje oxid dusnatý s ozonem;

– systému pro detekci světelného záření emitovaného při

vlnové délce 1,2 µm, sestávajícího ze selektivního optického

filtru a fotonásobiče.

Obr. 2.5.26-1

Chemiluminiscenční

analyzátor

264 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.27 KYSLÍK V PLYNECH

2.5.27 KYSLÍK V PLYNECH

6.3:20527

Kyslík v plynech se stanoví pomocí paramagnetického analyzátoru.

Princip metody je založen na vysoké paramagnetické citlivosti

molekuly kyslíku. Kyslík vykazuje silnou interakci na

magnetická pole, která se měří elektronicky, zesiluje se

a převádí na odečet koncentrace kyslíku. Měření koncentrace

kyslíku závisí na teplotě a tlaku. Jestliže není analyzátor

automaticky kompenzován na změny teploty a tlaku,

musí se těsně před použitím kalibrovat. Protože paramagnetický

vliv kyslíku je lineární, musí mít přístroj vhodný rozsah

s možností odečtu koncentrace na 0,1 % nebo přesnější.

Kalibrace přístroje. Nastavení se provede následujícím

způsobem:

– nula se nastaví při průchodu dusíku R1 přístrojem po dosažení

konstantního odečtu;

– stupnice se nastaví na 100 % při průchodu kyslíku R přístrojem

při stejné průtokové rychlosti jako dusík R1 po

dosažení konstantního odečtu.

Stanovení obsahu. Zkoušený plyn se nechá procházet přístrojem

konstantní průtokovou rychlostí tak dlouho, dokud

se nedosáhne konstantního odečtu. Zaznamená se koncentrace

kyslíku ve zkoušeném plynu.

2.5.28 VODA V PLYNECH

9.0:20528

Voda v plynech se stanoví pomocí dále popsaného elektrolytického

hygrometru.

Měřicí kyvetu tvoří tenký film oxidu fosforečného mezi

dvěma stočenými platinovými dráty, které slouží jako elektrody.

Vodní pára ze zkoušeného plynu je absorbována oxidem

fosforečným za tvorby elektricky vodivé kyseliny fosforečné.

Elektrické napětí přiváděné kontinuálně na elektrody

vyvolává elektrolýzu vody a tím regeneruje oxid fosforečný.

Měří se vznikající elektrický proud, jehož velikost

je úměrná množství vody ve zkoušeném plynu. Systém je

samokalibrační vzhledem k platnosti Faradayova zákona.

Odebere se vzorek zkoušeného plynu a nechá se temperovat

při teplotě místnosti. Měřicí kyveta se kontinuálně čistí, dokud

se nedosáhne stabilního odečtu na stupnici přístroje.

Změří se obsah vody ve zkoušeném plynu a překontroluje se

stálost teploty zařízení umístěného na vstupu do přístroje.

Elektrolytický hygrometr umožňuje dosáhnout přesné průtoky

vzorku díky regulátoru hmotnostního průtoku, který

potřebuje konstantní průtokovou rychlost objemu a který

také umožňuje přesné stanovení množství vody. Kalibrace

regulátoru hmotnostního průtoku se obvykle provádí pomocí

dusíku. Použijí-li se ke kalibraci jiné plyny než dusík,

je třeba řídit se pokyny výrobce týkající se znalostí vhodných

přepočítávacích faktorů a zajistit, aby se zvolila

správná kyveta pro daný typ analyzovaného plynu.

2.5.29 OXID SIŘIČITÝ

7.6:20529

150 ml vody R se převede do baňky (A) (viz obrázek 2.5.29-1)

a celým systémem se nechá 15 min proudit oxid uhličitý R průtokovou

rychlostí 100 ml/min. K 10 ml peroxidu vodíku zředěného

RS se přidá 0,15 ml roztoku modři bromfenolové R

(1 g/l) v ethanolu 20% (V/V) R a přidává se hydroxid sodný

0,1 mol/l VS do fialovomodrého zbarvení bez překročení bodu

ekvivalence. Roztok se převede do zkumavky (D). Bez přerušení

proudu oxidu uhličitého se nálevka (B) vyjme a hrdlem se

pomocí 100 ml vody R převede do baňky (A) 25,0 g zkoušené

látky (m g). Nálevka se vrátí zpět. Kohout nálevky se uzavře

a do nálevky se převede 80 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné

RS. Kohout se otevře a roztok kyseliny chlorovodíkové se

nechá téci do baňky. Dříve, než vyteče několik posledních mililitrů

roztoku kyseliny chlorovodíkové, se kohout uzavře, aby se

zabránilo úniku oxidu siřičitého nálevkou. Vaří se 1 h. Pak se

kohout otevře, ukončí se přívod oxidu uhličitého, zahřívání

a chlazení vodou. Obsah zkumavky se převede pomocí malého

množství vody R do 200ml kuželové širokohrdlé baňky, zahřívá

se 15 min na vodní lázni a ochladí se. Přidá se 0,1 ml roztoku

modři bromfenolové R (1 g/l) v ethanolu 20% (V/V) R a titruje

se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do změny žlutého zbarvení

na fialovomodré (V1 ml). Provede se slepá zkouška (V2 ml).

Obsah oxidu siřičitého (SO2) v µg/g se vypočítá podle vzorce:

( V - V ) × ,

32 030 × 1 2

v němž značí:

n – molární koncentraci hydroxidu sodného použitého

k titraci;


V1 – spotřebu hydroxidu sodného použitého k titraci v mililitrech;

V2 – spotřebu hydroxidu sodného použitého při slepé

zkoušce v mililitrech.

n

m

Zkušební

metody

2.5

Obr. 2.5.29-1 Přístroj na stanovení oxidu siřičitého

ČL 2017 – Dopl. 2020 265

2.5.30 OXIDANTY

2.5.30 OXIDANTY

6.0:20530

4,0 g se převedou do 125ml kuželové baňky se zabroušenou

zátkou, přidá se 50,0 ml vody R, baňka se uzavře

a směs se 5 min míchá. Pak se obsah baňky převede do

50ml centrifugační zkumavky se skleněnou zátkou a odstředí

se. 30,0 ml čiré supernatantní tekutiny se převede do

125ml kuželové baňky se zabroušenou zátkou, přidá se

1 ml kyseliny octové ledové R a 0,5 g až 1,0 g jodidu draselného

R, baňka se uzavře a roztok se důkladně promíchá.

Nechá se stát 25 min až 30 min ve tmě. Pak se přidá 1 ml

škrobu RS a titruje se thiosíranem sodným 0,002 mol/l VS

do odbarvení. Provede se slepá zkouška.

Spotřebuje se nejvýše 1,4 ml thiosíranu sodného

0,002 mol/l VS (0,002 %, počítáno jako H2O2).

1 ml thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS odpovídá 34 µg

oxidantů, počítáno jako peroxid vodíku.

2.5.31 RIBOSA V POLYSACHARIDOVÝCH

VAKCÍNÁCH

6.0:20531

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu

pro přípravu roztoku přípravku obsahujícího asi 5 mg

suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky se kvantitativně

převede obsah lahvičky (ampule) přípravku a zředí

se na potřebný objem vodou R. Dále se roztok zředí tak,

aby objemy použité při zkoušce obsahovaly 2,5 µg až

25 µg ribosy. Zředěný roztok se převede po 0,20 ml do tří

zkumavek a po 0,40 ml do dalších tří zkumavek.

Porovnávací roztoky. 25 mg ribosy R se rozpustí ve vodě R

a zředí se jí na 100,0 ml (základní roztok ribosy 0,25 g/l).

Těsně před použitím se zředí 1 ml základního roztoku

vodou R na 10,0 ml (pracovní zředění ribosy 25 mg/l).

Do šesti zkumavek se převede 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml,

0,60 ml, 0,80 ml a 1,0 ml tohoto roztoku.

Kontrolní roztok. Použijí se 2 ml vody R.

Obsah každé zkumavky se zředí vodou R na 2 ml, protřepe

se a do každé zkumavky se přidají 2 ml roztoku chloridu

železitého R (0,5 g/l) v kyselině chlorovodíkové R. Po protřepání

se přidá 0,2 ml roztoku orcinolu R (100 g/l) v ethanolu

bezvodém R. Zkumavky se vloží na 20 min do vodní

lázně a potom se ochladí v ledové vodě. Měří se absorbance

(2.2.25) každého roztoku při 670 nm proti kontrolnímu roztoku.

Sestrojí se kalibrační křivka ze zjištěných absorbancí

šesti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahů ribosy

a odečte se množství ribosy pro každé zředění zkoušeného

roztoku. Ze tří získaných hodnot se vypočítá průměr.

2.5.32 MIKROSTANOVENÍ VODY

9.8:20532

PRINCIP METODY

Coulometrická titrace vody je založena na kvantitativní reakci

vody s oxidem siřičitým a jodem v bezvodém prostředí

za přítomnosti zásady s dostatečnou tlumivou kapacitou.

Na rozdíl od odměrné metody popsané ve stati (2.5.12 Semimikrostanovení

vody) je jod produkován elektrochemicky

oxidací jodidu v reakční nádobce. Jod generovaný na

anodě reaguje okamžitě s vodou a oxidem siřičitým, které

jsou obsaženy v reakční nádobce. Množství vody v látce je

přímo úměrné množství elektrického náboje (v coulombech)

spotřebovaného do bodu ekvivalence titrace, který

odpovídá intenzitě elektrického proudu (v ampérech) vynásobené

dobou (v sekundách) použitou pro vznik jodu. Když

všechna voda v nádobce (stanovované látce) zreagovala, je

dosaženo bodu ekvivalence a objeví se nadbytek jodu.

1 mol jodu odpovídá 1 molu vody, množství elektrického

náboje 10,71 C odpovídá 1 mg vody.

Vlhkost systému se z reakční nádobky odstraní před titrací,

např. elektrolyt se před začátkem analýzy vzorku titruje do

sucha. Jednotlivá stanovení se mohou provádět po sobě ve

stejném roztoku zkoumadel za následujících podmínek:

– každá složka zkoušené směsi je kompatibilní s dalšími

složkami;

– neprobíhají žádné další reakce;

– objem a vodní kapacita elektrolytového zkoumadla jsou

dostatečné.

Coulometrická titrace je určena pro stanovení malých množství

vody (od 10 µg), avšak z důvodů reprodukovatelnosti se

doporučuje pracovní rozmezí 100 µg až 10 mg vody.

Přesnost a správnost metody jsou podmíněny přípravou

vzorku a především tím, jak účinně lze ze systému vyloučit

atmosférickou vlhkost. Kontrola systému musí být monitorována

měřením velikosti posunu základní linie.

ZAŘÍZENÍ

Zařízení se skládá z reakční nádobky, elektrod a magnetické

míchačky. Reakční nádobku tvoří větší prostor anodový

a menší prostor katodový. V závislosti na tvaru elektrod

mohou být oba prostory odděleny membránou. V každém

prostoru je platinová elektroda. Kapalné nebo rozpuštěné

vzorky se dávkují injekční stříkačkou přes septum. Alternativně

může být použita metoda odpařování, při níž se vzorek

zahřívá v sušárně a voda se odpařuje a do reakční nádobky

se přivádí proudem suchého inertního plynu. Obecně

je třeba se vyhnout zavádění pevných vzorků do reakční

nádobky. Avšak, je-li třeba, provádí se to utěsněným vstupem.

Je třeba učinit vhodná opatření, aby se zabránilo zanesení

vlhkosti ze vzduchu, např. se pracuje v boxu opatřeném

rukavicemi v atmosféře suchého inertního plynu. Postup

analýzy je řízen vhodným elektronickým zařízením,

které také zobrazuje výsledky.

Kvalifikace přístroje se provádí v souladu se zavedenými

postupy systému jakosti, například za použití vhodného

certifikovaného referenčního materiálu. Je-li zkoušená látka

vnesena přímo nebo jako kapalina do reakční nádobky, může

se použít natrium-aminosalicylát dihydrát pro kvalifikaci

přístroje CRL, zatímco při použití metody odpařování se

použije amoxicilin trihydrát pro ověření způsobilosti CRL.

PRACOVNÍ POSTUP

Obě části reakční nádobky se naplní zkoumadlem elektrolytovým

pro mikrostanovení vody R podle návodu výrobce

a provede se coulometrická předtitrace do stabilního bodu

ekvivalence. Předepsané množství zkoušené látky se zavede

do reakční nádobky, nejméně 30 s se míchá, pokud není

v článku uvedeno jinak, a znovu se titruje do stabilního bodu

ekvivalence. V případě, že se použije sušárna, předepsané

množství vzorku se umístí do sušárny a zahřívá se. Po odpa-

266 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.33 CELKOVÉ BÍLKOVINY

ření vody ze vzorku a jejího odvedení do reakční nádobky se

začne titrovat. Alternativně, je rovněž možné ihned titrovat

odpařovanou vlhkost během zahřívání vzorku v sušárně, aby

se při dlouhodobém zahřívání zabránilo ztrátě odpařené vody,

která se již shromáždila v reakčním roztoku.Hodnota se

odečte z výstupu přístroje a vypočítá se, je-li třeba, procentuální

obsah nebo množství vody přítomné ve zkoušené látce.

Pokud je to vhodné, v závislosti na druhu vzorku

a zkoušeném přípravku, se provede slepá zkouška.

OVĚŘENÍ SPRÁVNOSTI

Ve vhodných intervalech (alespoň na začátku a na konci řady

titrací vzorku) se za použití vhodného certifikovaného referenčního

materiálu zavede do nádobky definované množství

vody řádově stejné velikosti, jako je množství vody ve vzorku,

a provede se coulometrická titrace. Výtěžnost se pro přidání

1000 µg H2O pohybuje v rozmezí 97,5 % až 102,5 %

a pro přidání 100 µg H2O v rozmezí 90,0 % až 110,0 %.


6.0:20533

Mnohé metody stanovení obsahu popsané v této stati mohou

být provedeny za použití komerčně dostupných souprav.

METODA 1

Bílkovina v roztocích absorbuje ultrafialové světlo při vlnové

délce 280 nm, což je způsobeno přítomností aromatických

aminokyselin ve struktuře bílkoviny, hlavně tyrosinu

a tryptofanu. Tato vlastnost se může využít pro stanovení

obsahu. Jestliže tlumivý roztok použitý k rozpuštění bílkoviny

má vyšší absorbanci než voda, obsahuje rušící látky.

Toto rušení se může odstranit použitím tlumivého roztoku

jako kontrolní kapaliny, ale přesto mohou být výsledky

ovlivněny, pokud mají rušící látky vysokou absorbanci. Při

nízkých koncentracích může bílkovina adsorbovaná na kyvetu

výrazně snížit obsah bílkoviny v roztoku, což se může

předem vyloučit přípravou vzorků o vyšší koncentraci nebo

použitím neionogenních detergentů při přípravě.

Zkoušený roztok. Vhodné množství zkoušené látky se rozpustí

v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby koncentrace

bílkoviny v získaném roztoku byla v rozmezí 0,2 mg/ml

až 2 mg/ml.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok vhodné referenční

látky pro stanovovanou bílkovinu rozpuštěné ve stejném

tlumivém roztoku a o stejné koncentraci bílkoviny jako ve

zkoušeném roztoku.

Postup. Zkoušený roztok, porovnávací roztok a kontrolní

kapalina se během této zkoušky udržují při stejné teplotě.

Měří se absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku a porovnávacího

roztoku v křemenných kyvetách při 280 nm proti

předepsanému tlumivému roztoku jako kontrolní kapalině.

K získání správných výsledků musí být v rozmezí koncentrací

bílkoviny lineární odezva.

Rozptyl světla. Přesnost stanovení bílkoviny může být snížena

rozptylem světla ve zkoušeném vzorku. Jestliže se bílkoviny

v roztoku vyskytují jako částice velikostí srovnatelné

s vlnovou délkou měřeného světla (250 nm až 300 nm),

rozptyl světelných paprsků vyvolá vzrůst absorbance zkoušeného

vzorku. Pro výpočet absorbance při 280 nm způsobené

rozptylem světla se změří absorbance zkoušeného roztoku

při vlnových délkách 320 nm, 325 nm, 330 nm,

335 nm, 340 nm, 345 nm a 350 nm. Sestrojí se závislost logaritmu

získaných absorbancí na logaritmu vlnových délek

a sestrojí se kalibrační křivka proložením nejvhodnějších

bodů lineární regresí. Křivka se extrapoluje, aby se získal

logaritmus absorbance při 280 nm. Antilogaritmus této

hodnoty je absorbance přisuzovaná rozptylu světla.

K získání hodnoty absorbance bílkoviny v roztoku se získané

hodnoty korigují odečtením absorbance přisuzované

rozptylu světla od hodnoty celkové absorbance při 280 nm.

Ke snížení vlivu rozptylu světla se může použít filtrace filtrem

(0,2 µm), který neadsorbuje bílkoviny, nebo vyčeření

odstředěním, zvláště je-li roztok nápadně zakalený.

Výpočty. Pro výpočet se použijí korigované hodnoty. Koncentrace

bílkoviny ve zkoušeném roztoku (CU) se vypočítá


v němž značí:

C = C

U

( A A )

CS – koncentraci bílkoviny v porovnávacím roztoku;

AU – korigovanou absorbanci zkoušeného roztoku;

AS – korigovanou absorbanci porovnávacího roztoku.

S

METODA 2

Tato metoda (obvykle uváděná jako Lowryho stanovení) je

založena na redukci fosfomolybdenan-wolframového směsného

chromogenu bílkovinou ve zkoumadlu fosfomolybdenan-wolframovém,

který vykazuje absorpční maximum

při 750 nm. Zkoumadlo fosfomolybdenan-wolframové

nejdříve reaguje se zbytky tyrosinu v bílkovině. Intenzita

zbarvení je nejvyšší po 20min až 30min stání při teplotě

místnosti, po této době se intenzita zbarvení postupně ztrácí.

Protože je tato metoda citlivá na rušící látky, může se

použít postup srážení bílkoviny ze zkoušeného vzorku.

Většina rušících látek vyvolává odbarvování, avšak naopak

některé detergenty vyvolávají slabý růst intenzity zbarvení.

Vysoké koncentrace solí mohou vyvolávat tvorbu sraženiny.

Referenční látka a zkoušená bílkovina musí být shodné,

protože různé druhy bílkovin mohou způsobit různou intenzitu

zbarvení. Tam, kde je nutné oddělení rušících látek od

bílkoviny ve zkoušeném vzorku, je třeba před přípravou

vzorku provést oddělení rušících látek dále uvedeným postupem.

Vliv rušících látek se může minimalizovat naředěním

tak, aby koncentrace zkoušené bílkoviny zůstala dostatečná

pro přesné měření.

K přípravě všech tlumivých roztoků a zkoumadel použitých

v této metodě se použije voda destilovaná R.



získaného roztoku byla v rozmezí kalibrační křivky. Vhodný

tlumivý roztok udržuje pH roztoku na hodnotě 10,0 až 10,5.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovení bílkoviny

se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku. Tento

roztok se dále zředí stejným tlumivým roztokem tak, aby se

získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci

bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí mezi

5 µg/ml a 100 µg/ml.

Kontrolní roztok. Použije se tlumivý roztok použitý k přípravě

zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků.

U

S

,

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 267


Zkoumadlo se síranem měďnatým. 100 mg síranu měďnatého

R a 0,2 g natrium-tartarátu R se rozpustí ve vodě destilované

R a zředí se jí na 50 ml. 10 g uhličitanu sodného

bezvodého R se rozpustí ve vodě destilované R a zředí se jí

na 50 ml. Pomalu za míchání se vlije roztok uhličitanu sodného

do roztoku síranu měďnatého. Použije se do 24 h.

Alkalické zkoumadlo s mědí. Směs objemových dílů zkoumadla

se síranem měďnatým, roztoku natrium-dodecyl-sulfátu

R (50 g/l) a roztoku hydroxidu sodného R (32 g/l)

(1 + 2 + 1). Uchovává se při teplotě místnosti a použije se

během 2 týdnů.

Zkoumadlo fosfomolybdenan-wolframové zředěné. Smíchá

se 5 ml zkoumadla fosfomolybdenan-wolframového R

s 55 ml vody destilované R. Uchovává se v hnědé nádobě

při teplotě místnosti.

Postup. K 1,0 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného

roztoku a kontrolního roztoku se přidá po 1,0 ml alkalického

zkoumadla s mědí a promíchá se. Nechá se stát

10 min. Přidá se po 0,5 ml zkoumadla fosfomolybdenan-

-wolframového zředěného, promíchá se a nechá se stát

30 min při teplotě místnosti. Absorbance (2.2.25) roztoků

se měří při 750 nm proti kontrolnímu roztoku.

Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny

je nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých

k přípravě kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se

přímce. Vynesou se absorbance porovnávacích roztoků

proti koncentracím bílkoviny a za použití lineární regrese

se sestrojí kalibrační křivka, z níž se za použití naměřené

absorbance odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném

roztoku.

Rušící látky. V následujícím postupu se před stanovením

přidává ke zkoušenému vzorku deoxycholát a kyselina trichloroctová,

aby se odstranily rušící látky vysrážením bílkovin;

tento postup se může též použít k zahuštění bílkovin

ze zředěných roztoků.

K 1 ml roztoku zkoušené látky se přidá 0,1 ml roztoku natrium-deoxycholátu

R (1,5 g/l). Promíchá se vířivou míchačkou

a nechá se stát 10 min při teplotě místnosti. Přidá se 0,1 ml

roztoku kyseliny trichloroctové R (720 g/l) a promíchá se vířivou

míchačkou. Odstřeďuje se 30 min při 3000 g, tekutina

se dekantuje a zbytek se odstraní pipetou. Sbalená bílkovina

se znovu rozpustí v 1 ml alkalického zkoumadla s mědí.

METODA 3

Tato metoda (obvykle uváděná jako Bradfordovo stanovení)

je založena na absorpčním posunu ze 470 nm na 595 nm,

který se získá, jestliže modř kyselá 90 se naváže na bílkovinu.

Nejzřetelněji se modř kyselá 90 naváže na zbytky argininu

a lysinu v bílkovině, což může vést ke změnám v odezvě

obsahu různých bílkovin. Bílkovina použitá jako referenční

látka musí být proto shodná se stanovovanou bílkovinou.

Existuje relativně málo rušících látek, ale upřednostňuje se

nepoužití detergentů a amfolytů ve zkoušeném vzorku. Silně

alkalické vzorky mohou interferovat s kyselými zkoumadly.




v předepsaném tlumivém roztoku tak, aby absorbance

získaného roztoku byla v rozmezí kalibrační křivky.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovovanou

bílkovinu se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku.

Tento roztok se zředí stejným tlumivým roztokem tak, aby

se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci

bílkoviny rovnoměrně rozložené ve vhodném rozmezí

mezi 0,1 mg/ml a 1 mg/ml.



Zkoumadlo s modří kyselou 90. 0,10 g modři kyselé 90 R se

rozpustí v 50 ml ethanolu 96% R, přidá se 100 ml kyseliny

fosforečné R, zředí se vodou destilovanou R na 1000 ml

a promíchá se. Tento roztok se zfiltruje a uchovává se v hnědé

nádobě při teplotě místnosti. Během skladování se pomalu

vylučuje sraženina. Před použitím se roztok zfiltruje.

Postup. K 0,100 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného

roztoku a kontrolního roztoku se přidá po 5 ml

zkoumadla s modří kyselou 90 a promíchá se převracením.

Je třeba se vyvarovat pěnění, které může ovlivnit reprodukovatelnost.

Absorbance (2.2.25) roztoků se měří při

595 nm proti kontrolnímu roztoku. Nepoužívají se křemenné

kyvety, protože barvivo se na tento materiál váže.

Výpočty. Závislost absorbance na koncentraci bílkoviny je

nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě

kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce.

Vynesou se absorbance porovnávacích roztoků proti koncentracím

bílkoviny a za použití lineární regrese se sestrojí

kalibrační křivka, z níž se za použití absorbance odečte

koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

METODA 4

Tato metoda (obvykle uváděná jako stanovení obsahu kyselinou

bicinchoninovou neboli BCA) je založena na redukci

měďnatých iontů (Cu 2+ ) bílkovinou na měďné (Cu + ). Zkoumadlo

BCA se používá k detekci měďných iontů. Reakci

ruší některé látky. Vliv rušících látek se může snížit zředěním

tak, aby koncentrace zkoušené bílkoviny zůstala dostatečná

pro přesné měření. Alternativně se může k odstranění

rušících látek použít postup srážení bílkoviny uvedený

v metodě 2. Referenční látka a zkoušená bílkovina musí být

stejné, protože různé druhy bílkovin reagují různou barevnou

intenzitou.





roztoku byla v rozmezí koncentrací porovnávacích roztoků.


bílkovinu se rozpustí v předepsaném tlumivém roztoku.

Tento roztok se zředí stejným tlumivým roztokem tak, aby

se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci


mezi 10 µg/ml a 1200 µg/ml.



BCA zkoumadlo. 10 g dinatrium-bicinchoninátu R, 20 g

uhličitanu sodného monohydrátu R, 1,6 g natrium-tartarátu

R, 4 g hydroxidu sodného R a 9,5 g hydrogenuhličitanu

sodného R se rozpustí ve vodě destilované R. Je-li třeba,

upraví se pH roztokem hydroxidu sodného R nebo rozto-

268 ČL 2017 – Dopl. 2020


kem hydrogenuhličitanu sodného R na hodnotu 11,25, zředí

se vodou destilovanou R na 1000 ml a promíchá se.

BCA zkoumadlo s mědí. Smíchá se 1 ml roztoku síranu

měďnatého R (40 g/l) s 50 ml BCA zkoumadla.

Postup. 0,1 ml každého porovnávacího roztoku, zkoušeného

roztoku a kontrolního roztoku se smíchá se 2 ml BCA

zkoumadla s mědí. Roztoky se inkubují 30 min při 37 °C,

zaznamená se čas a směs se ochladí na teplotu místnosti.

Do 60 min od konce inkubace se měří absorbance (2.2.25)

porovnávacích roztoků a zkoušeného roztoku v křemenných

kyvetách při 562 nm proti kontrolnímu roztoku. Po

ochlazení roztoků na teplotu místnosti se intenzita zbarvení

postupně zvyšuje.


nelineární; avšak, je-li rozmezí koncentrací použitých k přípravě

kalibrační křivky dostatečně malé, blíží se přímce.

Vynesou se absorbance porovnávacích roztoků proti koncentracím

bílkoviny a za použití lineární regrese se sestrojí

kalibrační křivka, z níž se za použití naměřené absorbance

odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

METODA 5

Tato metoda (obvykle uváděná jako biuretové stanovení

obsahu) je založena na interakci měďnatých iontů (Cu 2+ )

s bílkovinou v alkalickém roztoku; výsledná absorbance se

měří při 545 nm. Tato zkouška vykazuje minimální rozdíly

mezi ekvivalentem IgG a vzorky albuminu. Přidání hydroxidu

sodného a zkoumadla biuretového jako složeného

zkoumadla, nedostatečné promíchání po přídavku hydroxidu

sodného a nebo delší doba mezi přídavkem hydroxidu

sodného a přídavkem zkoumadla biuretového mohou způsobit

u vzorků IgG vyšší odezvu než u vzorků albuminu.

K minimalizaci vlivu rušících látek na stanovení bílkovin

se může použít metoda kyseliny trichloroctové u zkoušených

vzorků s obsahem bílkoviny nižším než 500 µg/ml.




v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace

roztoku byla v rozmezí koncentrací porovnávacích

roztoků.


bílkovinu se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l).

Tento roztok se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l)

tak, aby se získaly nejméně tři porovnávací roztoky o koncentraci


mezi 0,5 mg/ml a 10 mg/ml.

Kontrolní roztok. Použije se roztok chloridu sodného R (9 g/l).

Zkoumadlo biuretové. 3,46 g síranu měďnatého R se rozpustí

v 10 ml horké vody destilované R a nechá se ochladit

(roztok A). 34,6 g natrium-citrátu R a 20,0 g uhličitanu

sodného R se rozpustí v 80 ml horké vody destilované R

a nechá se ochladit (roztok B). Roztoky A a B se smíchají

a zředí se vodou destilovanou R na 200 ml. Použije se během

6 měsíců. Zkoumadlo nelze použít, jestliže se zakalí

nebo obsahuje-li sraženinu.

Postup. K jednomu objemovému dílu zkoušeného roztoku

se přidá stejný objemový díl roztoku hydroxidu sodného R

(60 g/l) a promíchá se. Ihned se přidá zkoumadlo biuretové

odpovídající 0,4 objemovým dílům zkoušeného roztoku

a rychle se promíchá. Nechá se stát nejméně 15 min při

15 °C až 25 °C. Během 90 min po přidání biuretového

zkoumadla se měří absorbance (2.2.25) porovnávacích roztoků

a zkoušeného roztoku v maximu při 545 nm proti kontrolnímu

roztoku. Pro výpočet obsahu bílkoviny se nepoužije

žádný z roztoků, který měl zákal nebo sraženinu.


téměř lineární v daném rozmezí koncentrací bílkoviny

v porovnávacích roztocích. Vynesou se absorbance porovnávacích

roztoků proti koncentracím bílkoviny a za použití

lineární regrese se sestrojí kalibrační křivka. Vypočítá se

korelační koeficient kalibrační křivky. Vhodný systém je

takový, jehož přímka má korelační koeficient nejméně

0,99. Z kalibrační křivky se za použití naměřené absorbance

odečte koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

Rušící látky. Aby se minimalizoval vliv rušicích látek, může

se bílkovina ze zkoušené látky srážet takto: 0,1 objemového

dílu roztoku kyseliny trichloroctové R (500 g/l) se přidá

k 1 objemovému dílu zkoušeného roztoku, supernatantní

tekutina se odstraní a sraženina se rozpustí v malém množství

hydroxidu sodného 0,5 mol/l RS. Tento roztok se použije

k přípravě zkoušeného roztoku.

METODA 6

Tato fluorimetrická metoda je založena na derivatizaci bílkoviny

s o-ftaldialdehydem, který reaguje s primárními

aminy bílkoviny (N-terminální aminokyseliny a e-aminoskupiny

lysinových zbytků). Citlivost zkoušky se může

zvýšit hydrolýzou bílkoviny provedenou před přídavkem

o-ftaldialdehydu. Hydrolýza umožňuje a-aminoskupinám

obsaženým v aminokyselinách reagovat se zkoumadlem ftaldialdehydovým.

Tato metoda vyžaduje velmi malá množství

bílkoviny. Je nutné se vyhnout primárním aminům, jako jsou

např. trometamol a tlumivé roztoky s aminokyselinami, protože

reagují se zkoumadlem ftaldialdehydovým, nebo je odstranit.

Amoniak při vysoké koncentraci reaguje s ftaldialdehydem.

Reagují-li aminy s ftaldialdehydem, je získaná fluorescence

nestabilní. Použití automatizovaného postupu ke

standardizaci tohoto postupu, může zlepšit správnost a přesnost

zkoušky.




v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace

roztoku byla v rozmezí koncentrací porovnávacích

roztoků. Před přidáním zkoumadla ftaldialdehydového se

upraví pH na hodnotu 8 až 10,5.

Porovnávací roztoky. Referenční látka pro stanovovanou bílkovinu

se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tento

roztok se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak,

aby se získalo nejméně pět porovnávacích roztoků o koncentraci


mezi 10 µg/ml a 200 µg/ml. Před přidáním zkoumadla

ftaldialdehydového se upraví pH na hodnotu 8 až 10,5.

Kontrolní roztok. Použije se roztok chloridu sodného R (9 g/l).

Tlumivý roztok boritanový. 61,83 g kyseliny borité R se rozpustí

ve vodě destilované R, pH se upraví roztokem hydroxidu

draselného R na hodnotu 10,4, zředí se vodou destilovanou

R na 1000 ml a promíchá se.

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 269

2.5.34 KYSELINA OCTOVÁ V SYNTETICKÝCH PEPTIDECH

Ftaldialdehydový zásobní roztok. 1,20 g ftaldialdehydu R se

rozpustí v 1,5 ml methanolu R, přidá se 100 ml tlumivého

roztoku boritanového a promíchá se. Přidá se 0,6 ml roztoku

lauromakrogolu 23 R (300 g/l) a promíchá se. Uchovává

se při teplotě místnosti a použije se během tří týdnů.

Zkoumadlo ftaldialdehydové. K 5 ml ftaldialdehydového zásobního

roztoku se přidá 15 µl 2-merkaptoethanolu R. Připraví

se nejméně 30 min před použitím. Použije se do 24 h.

Postup. 10 µl zkoušeného roztoku a po 10 µl každého z porovnávacích

roztoků se smíchá s 0,1 ml zkoumadla ftaldialdehydového

a nechá se stát 15 min při teplotě místnosti.

Přidají se 3 ml hydroxidu sodného 0,5 mol/l RS a promíchá

se. Měří se intenzity fluorescence (2.2.21) porovnávacích

roztoků a zkoušeného roztoku při excitační vlnové délce

340 nm a emisní vlnové délce v rozmezí 440 nm až

455 nm. Fluorescence daného vzorku se měří jen jednou,

neboť záření snižuje intenzitu fluorescence.

Výpočty. Závislost fluorescence na koncentraci bílkoviny je

lineární. Vynesou se intenzity fluorescence porovnávacích

roztoků proti koncentracím bílkoviny a za použití lineární

regrese se sestrojí kalibrační křivka. Z kalibrační křivky

a z intenzity fluorescence zkoušeného roztoku se stanoví

koncentrace bílkoviny ve zkoušeném roztoku.

METODA 7

Tato metoda je založena na dusíkové analýze jako prostředku

stanovení bílkovin. Rušení způsobené přítomností dalších

látek obsahujících dusík ve zkoušené látce může ovlivnit

stanovení bílkoviny touto metodou. Při stanovení dusíku

se zkoušená látka během analýzy rozkládá, ale metoda není

omezena na přítomnost bílkoviny ve vodných prostředích.

Postup A. Provede se postupem uvedeným ve zkoušce Dusík

mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9) nebo se použije

komerčně dostupné zařízení pro stanovení dusíku podle

Kjeldahla.

Postup B. Komerčně dostupné zařízení lze použít pro dusíkovou

analýzu. Nejpoužívanější instrumentální metodou je

pyrolýza (tj. spalování vzorku v kyslíku při teplotách blížících

se 1000 °C), při které z dusíku přítomného ve zkoušené

látce vzniká oxid dusnatý (NO) a další oxidy dusíku

(NOx). Některá zařízení mění oxidy dusíku na dusík (plyn),

který se stanovuje tepelně vodivostním detektorem. Jiná zařízení

míchají oxid dusnatý (NO) s ozonem (O3) za vzniku

excitovaného oxidu dusičitého (NO2 * ), který při rozpadu

emituje světlo a může se stanovit chemiluminiscenčním detektorem.

Referenční bílkovina, která je relativně čistá

a složením se shoduje se zkoušenými bílkovinami, se používá

k optimalizaci nástřiků a parametrů pyrolýzy a k dosažení

konzistence při analýze.

Výpočty. Koncentrace bílkoviny se vypočítá dělením obsahu

dusíku ve vzorku známým obsahem dusíku v bílkovině.

Známý obsah dusíku v bílkovině se může stanovit z chemického

složení bílkoviny nebo porovnáním s vhodnou referenční

látkou.

2.5.34 KYSELINA OCTOVÁ

V SYNTETICKÝCH PEPTIDECH

6.0:20534

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Připraví se způsobem popsaným v článku.

Koncentrace peptidu v roztoku se může zvolit v závislosti na

očekávaném množství kyseliny octové ve zkoušeném vzorku.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok kyseliny octové ledové

R (0,10 g/l) ve směsi objemových dílů mobilní fáze B

a mobilní fáze A (5 + 95).


– nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru

4,6 mm naplněné silikagelem pro chromatografii oktadecylsilylovaným

R (5 µm);

– mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,2 ml/min:

– mobilní fáze A: 0,7 ml kyseliny fosforečné R se zředí vodou

R na 1000 ml; pH se upraví hydroxidem sodným koncentrovaným

RS na hodnotu 3,0;

– mobilní fáze B: methanol R2;

Čas

(min)

Mobilní fáze A

(% V/V)

Mobilní fáze B

(% V/V)

0–5 95 5

5–10 95 ® 50 5 ® 50

10–20 50 50

20–22 50 ® 95 50 ® 5

22–30 95 5

– spektrofotometrického detektoru, 210 nm.

Nastříkne se 10 µl porovnávacího roztoku a 10 µl zkoušeného

roztoku. Na získaných chromatogramech je retenční

čas kyseliny octové 3 min až 4 min. Základní linie představuje

strmý vzestup po začátku lineárního gradientu, který

odpovídá eluci peptidu z kolony. Stanoví se obsah kyseliny

octové v peptidu.

2.5.35 OXID DUSNÝ V PLYNECH

7.0:20535




Popis a princip měření. Koncentrace oxidu dusného v jiných

plynech se stanoví pomocí infračerveného analyzátoru.

Infračervený analyzátor se obvykle skládá ze zdroje

emitujícího širokopásmové infračervené záření, optického

zařízení, kyvety se vzorkem a detektoru. Optické zařízení

může být umístěno buď před, nebo za kyvetou se vzorkem

a je tvořeno jedním nebo několika optickými filtry, jimiž širokopásmové

záření prochází. Optické zařízení je v tomto

případě selektivní pro oxid dusný. Měří se paprsek procházející

kyvetou se vzorkem, který může také procházet referenční


elektronický systém místo referenční kyvety). Pokud

je v kyvetě přítomen oxid dusný, absorpční energie při

měření paprsku se bude řídit podle Lambertova-Beerova

zákona, a to se projeví ve změně signálu detektoru. Tento

změřený signál se porovná s referenčním signálem a vygenerovaný

výstup je úměrný koncentraci oxidu dusného.

Vygenerovaný signál je linearizován, aby se získala koncentrace

oxidu dusného. Aby se předešlo znečištění senzorů

částicemi, což by mohlo vyvolat efekt rozptýleného světla,

je zařízení vybaveno vhodným filtrem.

270 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.36 ČÍSLO ANISIDINOVÉ

2.5.36 ČÍSLO ANISIDINOVÉ

6.0:20536

Anisidinové číslo je definováno jako 100násobek absorbance

roztoku obsahujícího 1 g zkoušené látky ve 100 ml

směsi rozpouštědel a zkoumadel měřeného při tloušťce

vrstvy 10 mm (viz níže uvedený postup).

Zkouška se provádí co nejrychleji za chránění před aktinickým

světlem.

Zkoušený roztok (a). 0,500 g se rozpustí v trimethylpentanu

R a zředí se jím na 25,0 ml.

Zkoušený roztok (b). K 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) se

přidá 1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 g/l) v kyselině

octové ledové R; roztok se protřepe a nechá se stát za chránění

před světlem.

Porovnávací roztok. K 5,0 ml trimethylpentanu R se přidá

1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 g/l) v kyselině octové ledové

R; roztok se protřepe a nechá se stát za chránění před

světlem.

Měří se absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku (a) při

350 nm za použití trimethylpentanu R jako kontrolní kapaliny.

Přesně 10 min po přípravě se měří absorbance (2.2.25)

zkoušeného roztoku (b) při 350 nm za použití porovnávacího

roztoku jako kontrolní tekutiny.

Anisidinové číslo se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

( 1,2 A - A ) ,

25 ×

2

1

m

A1 – absorbanci zkoušeného roztoku (b) při 350 nm;

A2 – absorbanci zkoušeného roztoku (a) při 350 nm;

m – hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku (a)

v gramech.

2.5.37 STANOVENÍ METHYL-, ETHYL-

A ISOPROPYL-METHANSULFONÁTU

V KYSELINĚ METHANSULFONOVÉ

10.0:20537

Následující obecná stať byla validována pro stanovení methylesterů,

ethylesterů a isopropylesterů kyseliny methansulfonové

o koncentracích 0,5 µg/g až 100 µg/g.

Pokud se tato metoda použije pro stanovení esterů kyseliny

methansulfonové mimo validované rozmezí, např. v začátcích

syntézy před jejich odstraněním, musí se adekvátně

upravit koncentrace zkoušeného roztoku.

Plynová chromatografie (2.2.28) spojená s hmotnostní

spektrometrií (2.2.43).

Roztok vnitřního standardu. 7 µl butyl-methansulfonátu

CRL (BMS) se zředí dichlormethanem R na 10,0 ml.

10 µl tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na

100,0 ml.

Zkoušený roztok. 0,74 g se přidá k 10,0 ml vody R a extrahuje

se s 10,0 ml roztoku vnitřního standardu. Nechá se

oddělit, organická vrstva se převede do lahvičky obsahující

síran sodný bezvodý R, protřepe se a zfiltruje.

Porovnávací roztok (a). Po 50 mg methyl-methansulfonátu

R (MMS), ethyl-methansulfonátu R (EMS) a isopropyl-

-methansulfonátu R (IMS) se rozpustí v roztoku vnitřního

standardu a zředí se jím na 50,0 ml. 74 μl tohoto roztoku

se zředí roztokem vnitřního standardu na 10,0 ml. 100 μl

tohoto roztoku se zředí roztokem vnitřního standardu na

10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 3,0 ml porovnávacího roztoku (a)

se zředí roztokem vnitřního standardu na 10,0 ml.

Kolona:



– stacionární fáze: polydimethylsiloxan R (tloušťka filmu

1 μm).



Dávkovací pulz (bez dělení nastřikovaného množství).

250 kPa po dobu 0,25 min.

Teplota:

Čas

(min)

kolona 0–1

1–9

Teplota

(°C)

55

55 ® 135


detektor: přechodová kapilára 280

iontový zdroj 230

analyzátor 150

Detekce. Hmotnostní spektrometr jak je popsán dále; detektor

se nastaví tak, aby vyhověl kritériím testu způsobilosti:

– kvadrupólový hmotnostní spektrometr vybavený režimem

ionizace nárazem elektronů (70 eV);

– parametry hmotnostního spektrometru pro fragmentometrický

způsob zpracování signálu příslušného iontu (single-ion

monitoring mode; SIM) nastavené následujícím

způsobem:

Látka m/z Doba monitorování

butyl-methansulfonát

(BMS)

methyl-methansulfonát

(MMS)

ethyl-methansulfonát

(EMS)

isopropyl-

-methansulfonát (IMS)

56

80

79

123

tR v rozmezí 7,0 min až

9,0 min


3,5 min


4,7 min


5,5 min

Nástřik. 2 µl.

Relativní retence vztažená k vnitřnímu standardu (butyl-

-methansulfonát) (retenční čas asi 7,6 min). Methyl-methansulfonát

asi 0,3; ethyl-methansulfonát asi 0,5; isopropyl-

-methansulfonát asi 0,6.

Test způsobilosti:

– rozlišení: nejméně 3,0 mezi píkem ethyl-methansulfonátu

a píkem isopropyl-methansulfonátu na chromatogramu

porovnávacího roztoku (a);

Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 271

2.5.38 STANOVENÍ METHYL-, ETHYL- A ISOPROPYL-METHANSULFONÁTU V LÉČIVÝCH LÁTKÁCH

– poměr signálu k šumu: nejméně 10 pro píky methyl-

-methansulfonátu, ethyl-methansulfonátu a isopropyl-

-methansulfonátu na chromatogramu porovnávacího

roztoku (b).

Vypočítá se obsah methyl-methansulfonátu, ethyl-methansulfonátu

a isopropyl-methansulfonátu v mikrogramech na

gram podle vzorce:

A2 × I1

× W1

× C × 0, 148

,

A × I × W

1

2

v němž značí:

A1 – plochu píku methyl-methansulfonátu, ethyl-

-methansulfonátu nebo isopropyl-methansulfonátu

na chromatogramu porovnávacího roztoku (a);

A2 – plochu píku methyl-methansulfonátu, ethyl-

-methansulfonátu nebo isopropyl-methansulfonátu

na chromatogramu zkoušeného roztoku;

C – obsah methyl-methansulfonátu, ethyl-methansulfonátu

nebo isopropyl-methansulfonátu v procentech;

I1 – plochu píku vnitřního standardu na chromatogramu

porovnávacího roztoku (a);



W1 – hmotnost methyl-methansulfonátu, ethyl-methansulfonátu

nebo isopropyl-methansulfonátu použitého

k přípravě porovnávacího roztoku (a) v miligramech;

W2 – hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku

v miligramech;

0,148 – zřeďovací faktor.


A ISOPROPYL-METHANSULFONÁTU

V LÉČIVÝCH LÁTKÁCH

10.0:20538


ethylesterů a isopropylesterů kyseliny methansulfonové

o koncentracích 0,2 µg/g až 5 µg/g v

betahistidin-dimesilátu.

Pokud je zamýšleno použít tuto metodu pro jiné léčivé látky,

zejména takové, které obsahují rozdílné koncentrace

esterů kyseliny methansulfonové, musí být koncentrace

zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku adekvátně

upraveny a metoda musí být vhodně zvalidována.

POSTUP

Head-space plynová chromatografie (2.2.28) spojená

s hmotnostní spektrometrií (2.2.43).

Zkoušený roztok a porovnávací roztoky se připraví těsně

před použitím.

Rozpouštěcí směs. Směs objemových dílů vody R a acetonitrilu

R (20 + 80). Je nezbytné použít acetonitril vhodné

čistoty.

Roztok A. 60,0 g jodidu sodného R a 30 mg thiosíranu sodného

bezvodého R se pomocí ultrazvuku rozpustí ve vodě R

a zředí se jí na 50,0 ml.

2


CRL (BMS) se zředí rozpouštěcí směsí na 10,0 ml. 20 µl

tohoto roztoku se zředí rozpouštěcí směsí na 100,0 ml.

Kontrolní roztok. Do head-space lahvičky se odměří

0,50 ml roztoku A a 0,50 ml roztoku vnitřního standardu

a lahvička se ihned těsně uzavře silikonovou membránou

potaženou polytetrafluorethylenem a hliníkovým uzávěrem.

Zkoušený roztok. 25,0 mg se naváží do 20ml head-space

lahvičky, přidá se 0,50 ml roztoku A a 0,50 ml roztoku

vnitřního standardu. Lahvička se ihned těsně uzavře silikonovou

membránou potaženou polytetrafluorethylenem

a hliníkovým uzávěrem.

Po derivatizaci může být pozorována sraženina, avšak validita

kvantifikace tím není ovlivněna.

Porovnávací roztok (a). 25,0 mg methyl-methansulfonátu R

(MMS), 25,0 mg ethyl-methansulfonátu R (EMS) a 25,0 mg

isopropyl-methansulfonátu R (IMS) se rozpustí v toluenu R

a zředí se jím na 5,0 ml. 50 µl tohoto roztoku se zředí roztokem

vnitřního standardu na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 20 µl porovnávacího roztoku (a) se

zředí roztokem vnitřního standardu na 20,0 ml. 0,50 ml tohoto

roztoku a 0,50 ml roztoku A se odměří do 20ml head-

-space lahvičky. Lahvička se ihned těsně uzavře silikonovou

membránou potaženou polytetrafluorethylenem a hliníkovým

uzávěrem.

Porovnávací roztok (c). 500 µl porovnávacího roztoku (a)

se zředí roztokem vnitřního standardu na 20,0 ml. 0,50 ml

tohoto roztoku a 0,50 ml roztoku A se odměří do 20ml head-space

lahvičky. Lahvička se ihned těsně uzavře silikonovou



Kolona:



– stacionární fáze: makrogol deaktivovaný pro polární

látky R (tloušťka filmu 1 μm).


Použití inertní vstupní kapiláry bez skelné vaty významně

redukuje vliv přechodu mezi nástřiky.




– teplota ustavování rovnováhy: 60 °C;


– teplota přechodové kapiláry: 120 °C.

Teplota:

Čas

(min)

kolona 0–1

1–10

Teplota

(°C)

40

40 ® 130



iontový zdroj 250

analyzátor 200

272 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.39 STANOVENÍ METHANSULFONYLCHLORIDU V KYSELINĚ METHANSULFONOVÉ

Na konci stanovení se teplota kolony zvýší na 240 °C, tato

hodnota se udržuje po dobu 7 min.

Detekce. Hmotnostní spektrometr, jak je popsán dále;

detektor se nastaví tak, aby vyhověl kritériím testu způsobilosti,

alternativně se může použít vhodný detektor

elektronového záchytu:


elektronové ionizace (70 eV);




způsobem:

Látka

Iont ke

kvantifikaci

(m/z)

Iont ke

kvalifikaci

(m/z)

butyljodid (BuI)* 184 127

methyljodid (MeI)* 142 127

ethyljodid (EtI)* 156 127

isopropyljodid (iPrI)* 170 127

*vzniklé při derivatizaci BMS, MMS, EMS a IMS.

Nástřik. 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku, porovnávacích

roztoků (b) a (c) a kontrolního roztoku.

Relativní retence vztažená k vnitřnímu standardu (butyljodid,

retenční čas asi 8,5 min). Methyljodid asi 0,51;

ethyljodid asi 0,63; isopropyljodid asi 0,68.

Test způsobilosti:

– rozlišení: nejméně 1,5 mezi píkem ethyljodidu a píkem

isopropyljodidu na chromatogramu porovnávacího roztoku

(c);

– poměr signálu k šumu: nejméně 10 pro pík každého alkyljodidu

na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Obsah každého alkyl-methansulfonátu v mikrogramech na

gram se vypočítá podle vzorce:

A2 × I1

× W1

× C × 0, 05

,

A × I × W

1

2

v němž značí:

A1 – plochu píku každého alkyljodidu na chromatogramu

porovnávacího roztoku (c);



C – obsah každého esteru v procentech;





W1 – hmotnost každého esteru použitého k přípravě porovnávacího

roztoku (a) v miligramech;


v miligramech;


2

2.5.39 STANOVENÍ

METHANSULFONYLCHLORIDU

V KYSELINĚ METHANSULFONOVÉ

10.0:20539

Následující metoda byla validována pro stanovení methansulfonylchloridu

v kyselině methansulfonové o koncentracích

0,05 µg/g až 50 µg/g.

Plynová chromatografie (2.2.28) spojená s hmotnostní

spektrometrií (2.2.43).


CRL (BMS) se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se

jím na 10,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem

R na 50,0 ml.

Zkoušený roztok. 7,4 g se přidá k 5 ml vody R a pomalu se

promíchá. Po ochlazení se přidá 5,0 ml dichlormethanu R

a 100 µl roztoku vnitřního standardu a protřepe se. Nechá

se oddělit a organická vrstva se převede do lahvičky obsahující

1 g síranu sodného bezvodého R. Extrakce se opakuje

dvakrát s 5,0 ml dichlormethanu R, organické vrstvy se

spojí a zfiltrují se.

Porovnávací roztok (a). 50,0 mg methansulfonylchloridu R

se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 10,0 ml.

1,0 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na

10,0 ml. 300 μl tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R

na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 500 µl porovnávacího roztoku (a)

a 100 µl roztoku vnitřního standardu se zředí dichlormethanem

R na 15,0 ml.


a 100 µl roztoku vnitřního standardu se zředí dichlormethanem

R na 15,0 ml.

Kolona:



– stacionární fáze: polydimethylsiloxan R (tloušťka filmu

1 μm).



Dávkovací pulz. 60 kPa po dobu 0,1 min.

Teplota:

Čas

(min)

kolona 0–4

4–8

Teplota

(°C)

40

40 ® 200



iontový zdroj 230

analyzátor 150


hodnota udržuje se po dobu 8 min.

Detekce. Hmotnostní spektrometr, jak je popsán dále; detektor




Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 273

2.5.40 STANOVENÍ METHYL-, ETHYL- A ISOPROPYL-toluenSULFONÁTU V LÉČIVÝCH LÁTKÁCH


způsob zpracování signálu příslušného iontu

(single-ion monitoring; SIM) nastavené následujícím

způsobem:

Látka m/z Doba monitorování

methansulfonylchlorid 79

butyl-methansulfonát 56


6,0 min


8,0 min

Nástřik. 5 µl; zkoušený roztok, porovnávací roztoky (b)

a (c), roztok vnitřního standardu a dichlormethan R.

Relativní retence vztažená k vnitřnímu standardu (butyl-

-methansulfonát, BMS) (retenční čas asi 7,2 min). Methansulfonylchlorid

asi 0,68.

Test způsobilosti:

– na chromatogramu roztoku vnitřního standardu není pík se

stejným retenčním časem jako má methansulfonylchlorid;

– rozlišení: nejméně 5,0 mezi píkem methansulfonylchloridu

a píkem butyl-methansulfonátu na chromatogramu

porovnávacího roztoku (b);

– poměr signálu k šumu: nejméně 10 pro pík methansulfonylchloridu

na chromatogramu porovnávacího roztoku (c).

Obsah methansulfonylchloridu v mikrogramech na gram se


A

2

× I1

× W1

× C × 1, 5

A × I × W

1

v němž značí:

A1 – plochu píku methansulfonylchloridu na chromatogramu


A2 – plochu píku methansulfonylchloridu na chromatogramu


C – obsah methansulfonylchloridu v procentech;

I1 – plochu píku butyl-methansulfonátu na chromatogramu


I2 – plochu píku butyl-methansulfonátu na chromatogramu


W1 – hmotnost methansulfonylchloridu použitého k přípravě

porovnávacího roztoku (a) v miligramech;


v miligramech;


2


A ISOPROPYL-TOLUENSULFONÁTU


10.0:20540


ethylesterů a isopropylesterů kyseliny toluensulfonové

(o koncentracích 0,2 µg/g až 5 µg/g) v sultamicilin-

-tosilátu dihydrátu.



esterů kyseliny toluensulfonové, musí být koncentrace



2

,

POSTUP




před použitím.


R (20 + 80). Je nezbytné použít acetonitril odpovídající

čistoty.







Kontrolní roztok. Do head-space lahvičky se odměří 0,5 ml

roztoku A a 0,5 ml roztoku vnitřního standardu a lahvička

se ihned těsně uzavře silikonovou membránou potaženou

polytetrafluorethylenem a hliníkovým uzávěrem.






Po derivatizaci může být pozorována sraženina, validita

kvantifikace tím však není ovlivněna.

Porovnávací roztok (a). 25,0 mg methyl-toluensulfonátu R

(MTS), 25,0 mg ethyl-toluensulfonátu R (ETS) a 25,0 mg

isopropyl-toluensulfonátu R (ITS) se rozpustí v toluenu R








uzávěrem.



tohoto roztoku a 0,50 ml roztoku A se odměří do 20ml

head-space lahvičky. Lahvička se ihned těsně uzavře silikonovou



Kolona:



– stacionární fáze: makrogol deaktivovaný pro polární

látky R (tloušťka filmu 1 μm).










274 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.5.41 STANOVENÍ METHYL-, ETHYL- A ISOPROPYL- BENZENSULFONÁTU V LÉČIVÝCH LÁTKÁCH

Teplota:

Čas

(min)

Teplota

(°C)

kolona 0–1 40

1–10 40 ® 130


detektor přechodová kapilára 280

iontový zdroj 250

analyzátor 200










způsobem.

Látka

Iont ke

kvantifikaci

(m/z)

Iont ke

kvalifikaci

(m/z)





*vzniklé při derivatizaci BMS, MTS, ETS a ITS.



Relativní retence vztažená k vnitřnímu standardu (butyljodidu,



Test způsobilosti:



(c);



Obsah každého alkyl-toluensulfonátu v mikrogramech na


A2 × I1

× W1

× C × 0, 05

,

A × I × W

1

V němž značí:








2

2






v miligramech;



A ISOPROPYL- BENZENSULFONÁTU


10.0:20541


ethylesterů a isopropylesterů kyseliny benzensulfonové

(o koncentracích 2,5 µg/g až 40 µg/g) v amlodipin-besilátu.



esterů kyseliny benzensulfonové, musí být koncentrace



Tato metoda není vhodná pro klopidogrel-besilát, protože

tento methyl-benzensulfonát byl pozorován během analýzy

plynovou chromatografií jako produkt degradace.

POSTUP




před použitím.


R (20 + 80). Je nezbytné použít acetonitril vhodné

čistoty.







Kontrolní roztok. Do head-space lahvičky se odměří

0,50 ml roztoku A a 0,50 ml roztoku vnitřního standardu

a lahvička se ihned těsně uzavře silikonovou membránou

potaženou polytetrafluorethylenem a hliníkovým uzávěrem.






Po derivatizaci může být pozorována sraženina, validita

kvantifikace tím však není ovlivněna.

Porovnávací roztok (a). 25,0 mg ethyl-benzensulfonátu R

(EBS), 25,0 mg methyl-benzensulfonátu R (MBS) a 25,0 mg

isopropyl-methansulfonátu R (IMS) se rozpustí v toluenu R






Zkušební

metody

2.5

ČL 2017 – Dopl. 2020 275

2.5.41 STANOVENÍ METHYL-, ETHYL- A ISOPROPYL- BENZENSULFONÁTU V LÉČIVÝCH LÁTKÁCH



uzávěrem.



tohoto roztoku a 0,50 ml roztoku A se odměří do 20ml

head-space lahvičky. Lahvička se ihned těsně uzavře silikonovou



Kolona:



– stacionární fáze: makrogol deaktivovaný pro polární látky

R (tloušťka filmu 1 μm).










Teplota:

Čas

(min)

Teplota

(°C)

kolona 0–1 40

1–10 40 ® 130


detektor přechodová kapilára 280

iontový zdroj 250

analyzátor 200










způsobem:

Látka

Iont ke

kvantifikaci

(m/z)

Iont ke

kvalifikaci

(m/z)





*vzniklé při derivatizaci BMS, MBS, EBS a IMS.



Relativní retence vztažená k vnitřnímu standardu (butyljodid,



Test způsobilosti:



(c);



Obsah každého alkyl-benzensulfonátu v mikrogramech na


A2 × I1

× W1

× C × 0, 05 ,

A × I × W

1

2

V němž značí:













v miligramech;


2

276 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.1 ZKOUŠKA NA STERILITU1

2.6 BIOLOGICKÉ ZKOUŠKY

2.6.1 ZKOUŠKA NA STERILITU 1 7.7:20601

Tato zkouška se používá u látek a přípravků nebo vybavení,

kde je v souladu s lékopisem požadována sterilita. Vyhovující

výsledek však pouze udává, že ve zkoušeném vzorku nebyl

nalezen v podmínkách zkoušky žádný kontaminující mikroorganismus.

OPATŘENÍ PROTI MIKROBIÁLNÍ KONTAMINACI

Zkouška na sterilitu se provádí za aseptických podmínek.

K dosažení takových podmínek je třeba přizpůsobit

prostředí, ve kterém se zkouška provádí, a způsob provedení

zkoušky. Opatření přijatá k zabránění kontaminace

jsou taková, aby nepůsobila na mikroorganismy, které

se mají při zkoušce zjistit. Pracovní podmínky, v nichž

se zkouška provádí, se pravidelně monitorují vhodným

vzorkováním pracovního prostředí a provádějí se vhodné

kontroly.

ŽIVNÉ PŮDY A INKUBAČNÍ TEPLOTY

Živné půdy pro zkoušku se mohou připravit tak, jak je popsáno

dále, nebo se mohou použít rovnocenné komerční

živné půdy za předpokladu, že vyhoví růstové zkoušce.

Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku

na sterilitu. Tekutá thioglykolátová půda je především

určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní zjistit

také aerobní bakterie. Půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu je

určena pro kultivaci jak hub, tak i aerobních bakterií.

Tekutá thioglykolátová půda

L-cystin

agar

chlorid sodný

glukosa monohydrát/glukosa bezvodá

kvasničný výtažek (rozpustný ve vodě)

pankreatický hydrolyzát kaseinu

natrium-thioglykolát

nebo kyselina thioglykolová

roztok sodné soli resazurinu (1 g/l)

čerstvě připravený

voda R

0,5 g

0,75 g

2,5 g

5,5 g/5,0 g

5,0 g

15,0 g

0,5 g

0,3 ml

1,0 ml

1000 ml

Hodnota pH je po sterilizaci 7,1 ±0,2.

Smíchá se L-cystin, agar, chlorid sodný, glukosa, ve vodě

rozpustný kvasničný výtažek a pankreatický hydrolyzát

kaseinu s vodou R a zahřívá se do rozpuštění. Do roztoku se

přidá natrium-thioglykolát nebo kyselina thioglykolová a,

je-li třeba, hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby hodnota pH

po sterilizaci byla 7,1 ±0,2. Je-li třeba filtrace, roztok se zahřeje

téměř až k varu a horký se zfiltruje přes navlhčený filtrační

papír. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu,

promíchá se a rozplní do vhodných nádobek, které zajistí

takový poměr povrchu k výšce sloupce půdy, aby se do

konce inkubační doby pohlcováním kyslíku nezměnilo barevně

víc než horní polovina půdy. Sterilizuje se za použití

validovaného postupu. Skladuje se při teplotě 2 °C až 25 °C

ve sterilních vzduchotěsných obalech. Zbarví-li se do růžova

více než jedna třetina půdy, může se půda obnovit zahřátím

obalu ve vodní lázni nebo v proudu páry, dokud růžové

zbarvení nezmizí, a rychlým ochlazením. Dbá se na

zamezení přístupu nesterilního vzduchu do obalu. Půda se

neskladuje déle než po dobu, pro kterou byla validována.

Thioglykolátová půda se inkubuje při teplotě 30 °C až 35 °C.

Pro výrobky obsahující rtuťové protimikrobní konzervační

látky, které se nemohou zkoušet membránovou filtrací, se může

použít tekutá thioglykolátová půda inkubovaná při 20 °C až

25 °C místo půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu za předpokladu,

že se validuje způsobem uvedeným v růstové zkoušce.

Kde je to předepsáno nebo zdůvodněno a schváleno, může

se použít alternativní thioglykolátová půda. Připraví se

směs stejného složení jako tekutá thioglykolátová půda, ale

vypustí se agar a roztok sodné soli resazurinu a sterilizuje

se, jak je uvedeno výše. Hodnota pH je po sterilizaci

7,1 ±0,2. Před použitím se zahřeje na vodní lázni a inkubuje

se při teplotě 30 °C až 35 °C za anaerobních podmínek.

Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu


papainový hydrolyzát sóji

chlorid sodný

hydrogenfosforečnan draselný

glukosa monohydrát/glukosa bezvodá

voda R

17,0 g

3,0 g

5,0 g

2,5 g

2,5 g/2,3 g

1000 ml

Hodnota pH je po sterilizaci 7,3 ±0,2.

Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě R a roztok

se ochladí na teplotu místnosti. V případě potřeby se

přidá hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby hodnota pH roztoku

po sterilizaci byla 7,3 ±0,2. Je-li třeba, filtruje se do

vyjasnění, rozplní se do vhodných obalů a sterilizuje se validovaným

postupem. Skladuje se při teplotě 2 °C až 25 °C

ve sterilních dobře uzavřených obalech, pokud není určena

k okamžitému použití. Půda se neskladuje déle než po dobu,

pro kterou byla validována.

Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu se inkubuje při 20 °C

až 25 °C.

Použité živné půdy vyhovují následujícím zkouškám provedeným

před nebo současně se zkoušením zkoušeného

produktu.

Sterilita. Části živné půdy se inkubují 14 dnů; není pozorován

růst mikroorganismů.

Růstová zkouška aerobních a anaerobních bakterií

a hub. Zkouší se každá šarže čerstvě připravené půdy i každá

šarže půdy připravené z dehydratované směsi nebo z jednotlivých

složek. Vhodné kmeny mikroorganismů jsou uvedeny

v tabulce 2.6.1-1.

Části thioglykolátové půdy se odděleně inokulují malým

množstvím (nejvýše 100 CFU) následujících mikroorganismů

s použitím oddělené části půdy pro každý druh:

Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus. Části půdy z hydrolyzátů sóji a kaseinu se

odděleně inokulují malými množstvími (nejvýše 100 CFU)

následujících mikroorganismů s použitím oddělené části

Zkušební

metody

2.6

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


ČL 2017 – Dopl. 2020 277


půdy pro každý druh: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis,

Candida albicans. Inkubují se nejdéle 3 dny v případě

bakterií a nejdéle 5 dnů v případě hub.

Použijí se udržovací kultivační metody (využívající systému

jednotné inokulace) tak, aby životaschopné mikroorganismy

použité k inokulaci prošly nejvýše pěti pasážemi

z původního matečného inokula.

Živné půdy jsou vhodné tehdy, objeví-li se jasně viditelný

růst mikroorganismů.

Tab. 2.6.1-1 Kmeny mikroorganismů vhodné pro růstovou

zkoušku a zkoušku způsobilosti metody

Aerobní bakterie

Staphylococcus

aureus

ATCC 6538, CIP 4.83,

NCTC 10788, NCIMB 9518,

NBRC 13276, CCM 4516,

CNCTC 5887

Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62,

NCIMB 8054, NBRC 3134,

CCM 1999, CNCTC 5610

Pseudomonas

aeruginosa

Anaerobní

bakterie

Clostridium

sporogenes

Houby

ATCC 9027, NCIMB 8626,

CIP 82.118, NBRC 13275,


ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532,

ATCC 11437, NBRC 14293,


Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179,

NBRC 1594, CCM 8215,

CNCTC 5361

Aspergillus

brasiliensis

ATCC 16404, IP 1431.83,

IMI 149007, NBRC 9455,

CCM 8222

ZKOUŠKA ZPŮSOBILOSTI METODY

Provede se zkouška popsaná v odstavci Zkouška na sterilitu

zkoušeného produktu za použití přesně stejné metody s následujícími

úpravami.

Membránová filtrace. Po převedení obsahu obalu nebo

obalů zkoušeného produktu na membránu se přidá inokulum

malého množství životaschopných mikroorganismů

(nejvýše 100 CFU) do poslední části sterilního promývacího

roztoku.

Přímá inokulace. Po převedení obsahu obalu nebo obalů

zkoušeného produktu (pro catgut a jiná chirurgická vlákna

pro veterinární použití: vlákna) se do živné půdy přidá inokulum

malého množství životaschopných mikroorganismů

(nejvýše 100 CFU).

V obou případech se použijí stejné mikroorganismy, které

jsou popsány v odstavci Růstová zkouška aerobních a anaerobních

bakterií a hub. Provede se růstová zkouška jako

pozitivní kontrola. Všechny obaly s živnou půdou se inkubují

nejdéle pět dnů.

Dojde-li po inkubaci k jasně viditelnému růstu, vizuálně

srovnatelnému s růstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného

produktu, potom nemá produkt v podmínkách zkoušky

žádný protimikrobní účinek nebo byl takový účinek

uspokojivě odstraněn. Zkouška na sterilitu se pak může provést

bez dalších úprav.

Nedojde-li v přítomnosti zkoušeného produktu k jasně viditelnému

růstu, vizuálně srovnatelnému s růstem v kontrolních

nádobkách bez zkoušeného produktu, má produkt

protimikrobní účinek, který nebyl v podmínkách zkoušky

uspokojivě odstraněn. Podmínky zkoušky se upraví tak, aby

byl protimikrobní účinek odstraněn, a zkouška se opakuje.

Tato zkouška způsobilosti metody se provádí:

a) má-li se na sterilitu zkoušet nový produkt;

b) kdykoliv se změní experimentální podmínky zkoušky.

Zkouška způsobilosti metody se může provést současně se

zkouškou na sterilitu zkoušeného produktu.

ZKOUŠKA NA STERILITU

ZKOUŠENÉHO PRODUKTU

Zkouška se může provést metodou membránové filtrace

nebo přímou inokulací zkoušeného produktu do živné půdy.

Zahrnou se vhodné negativní kontroly. Metoda membránové

filtrace se použije všude tam, kde to povaha produktu

umožní, tj. u filtrovatelných vodných, ethanolových

nebo olejových přípravků a u přípravků mísitelných nebo

rozpustných ve vodných nebo olejových rozpouštědlech, tato

rozpouštědla nemají v podmínkách zkoušky protimikrobní

účinek.

Membránová filtrace. Použijí se membránové filtry se

jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 μm, jejichž účinek

zadržet mikroorganismy byl ověřen. Filtry např. z nitrátu

celulosy se používají pro vodné, olejové a slabé ethanolové

roztoky, filtry např. z acetátu celulosy se používají pro silné

ethanolové roztoky. Pro určité produkty, např. antibiotika,

mohou být nutné speciálně upravené filtry.

Dále popsaná metoda je určena pro membránové filtry

o průměru asi 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru,

měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacího i promývacího

roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se

sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby se

do něho mohl naplnit zkoušený roztok a za aseptických

podmínek filtrovat a aby bylo umožněno aseptické vyjmutí

membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy, nebo

aby bylo možné provést inkubaci po přidání živné půdy do

vlastního přístroje.

Vodné roztoky. Je-li to vhodné, převede se na membránový

filtr v přístroji malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako

např. neutrálního roztoku masového nebo kaseinového peptonu

(1 g/l) o hodnotě pH 7,1 ±0,2, a zfiltruje se. Tekutina

může obsahovat vhodné neutralizační a/nebo vhodné inaktivační

látky, např. v případě antibiotik.

Na membránový filtr nebo filtry se převede obsah obalu

nebo obalů zkoušeného produktu a, je-li třeba, zředí se na

objem použitý při zkoušce způsobilosti metody vybraným

sterilním rozpouštědlem, v každém případě se však použije

nejméně množství zkoušeného produktu předepsané v tabulce

2.6.1-2, a ihned se zfiltruje. Pokud má produkt protimikrobní

vlastnosti, promývá se membránový filtr nejméně

třikrát stejným objemem vybraného sterilního rozpouštědla

po stejnou dobu jako při zkoušce způsobilosti metody. Nepřekročí

se promývací cyklus pětkrát 100 ml, i když zkouš-

278 ČL 2017 – Dopl. 2020


ka způsobilosti metody prokázala, že tento cyklus neodstraňuje

zcela protimikrobní účinky. Celý membránový filtr

se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě

stejné části a každá polovina se převede do jedné ze dvou

vhodných půd. Použije se stejný objem půdy jako při

zkoušce způsobilosti metody. Alternativně je také možné

přenést půdu na membránu v přístroji. Půdy se inkubují

nejméně 14 dnů.

Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije

nejméně množství předepsané v tabulce 2.6.1-2, rozpustí se

ve vhodném rozpouštědle, které je součástí přípravku, ve

vodě pro injekci, ve fyziologickém roztoku nebo v neutrálním

roztoku masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l)

a ve zkoušce se postupuje, jak je popsáno u vodných roztoků

za použití membránového filtru vhodného pro zvolené

rozpouštědlo.

Oleje a olejové roztoky. Na každou živnou půdu se použije

nejméně množství přípravku předepsané v tabulce 2.6.1-2.

Oleje a olejové roztoky s dostatečně nízkou viskozitou se

mohou filtrovat bez ředění přes suchý membránový filtr.

Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním rozpouštědlem,

jako je isopropyl-myristát, u něhož je prokázáno, že

v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinky. Olej se

nechá penetrovat membránovým filtrem vlastní tíhou a pak

se filtruje za použití postupného tlaku nebo sání. Membránový

filtr se promyje nejméně třikrát stejnou rychlostí asi

100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je neutrální roztok

masového nebo kaseinového peptonu (1g/l) obsahujícího

vhodný emulgátor v koncentraci, která se ukázala při

zkoušce způsobilosti metody přiměřená, např. roztok polysorbátu

80 (10 g/l). Membránový filtr nebo filtry se přenesou

do živné půdy nebo živných půd, nebo se k nim půda

přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při

stejných teplotách po stejnou dobu.

Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije nejméně

množství produktu předepsané v tabulce 2.6.1-2. Masti

s hydrofobním základem a emulze typu voda v oleji se mohou

ředit isopropyl-myristátem na koncentraci 1 %, jak je

popsáno výše, a zahřát, pokud je to nutné, na nejvýše 40 °C.

Výjimečně je lze, pokud je to nutné, zahřát až na 44 °C.

Zfiltruje se tak rychle, jak je to jen možné a postupuje se,

jak je popsáno u olejů a olejových roztoků.

Přímá inokulace do živných půd. Do živné půdy se přímo

přenese množství zkoušeného produktu předepsané v tabulce

2.6.1-2 tak, aby objem vzorku nebyl více než 10 %

objemu živné půdy, není-li předepsáno jinak.

Pokud má zkoušený produkt protimikrobní účinek, provede

se zkouška po jeho neutralizaci vhodnou neutralizující látkou

nebo zředěním v dostatečném množství živné půdy. Je-li nutné

použít velký objem produktu, může se přednostně použít

koncentrovaná živná půda připravená tak, že se vezme v úvahu

následné ředění. Kde je to vhodné, může se koncentrovaná

živná půda přidat přímo k přípravku v jeho obalu.

Olejové kapaliny. Použijí se živné půdy, k nimž se přidá

vhodný emulgátor v koncentraci, která se ukázala přiměřená

při zkoušce způsobilosti metody, např. roztok polysorbátu

80 (10 g/l).

Masti a krémy. Připraví se zředění v poměru asi 1 : 10 se

vhodným emulgátorem ve vhodném sterilním rozpouštědle,

jako je neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu

(1 g/l). Zředěný přípravek se inokuluje do živné půdy,

která neobsahuje emulgátor.

Inokulované půdy se inkubují nejméně 14 dnů. V průběhu

inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými

přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však

použije k důkazu anaerobních mikroorganismů tekutá thioglykolátová

půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na

minimum, aby se zachovaly anaerobní podmínky.

Catgut a jiná chirurgická vlákna pro veterinární použití.

Na každou živnou půdu se použije nejméně množství produktu

předepsané v tabulce 2.6.1-2. Zatavené balení se otevře

za aseptických podmínek a pro každou živnou půdu se

vyjmou tři části vlákna. Zkouška se provede ze tří úseků,

každého o délce 30 cm, odstřižených na začátku, uprostřed

a na konci vlákna. Z čerstvě otevřených kazetových balení

se použije celé vlákno. Každý úsek vlákna se přenese do

vybrané živné půdy. Použije se dostatek živné půdy, aby

zkoušený materiál byl náležitě ponořen (20 ml až 150 ml).

Tab. 2.6.1-2 Minimální množství, které se použije pro

každou půdu

Množství v obalu

Minimální množství, které

se použije pro každou

půdu, není-li zdůvodněno

a schváleno jinak

kapaliny

– méně než 1 ml celý obsah každého obalu

– 1 ml až 40 ml polovina obsahu každého

obalu, ale nejméně 1 ml

– více než 40 ml a nejvýše 20 ml

100 ml

– více než 100 ml 10 % obsahu obalu, ale

nejméně 20 ml

antibiotické kapaliny 1 ml

nerozpustné přípravky,

krémy a masti, které se suspendují

nebo emulgují

celý obsah každého obalu

pro získání nejméně

200 mg

pevné látky

– méně než 50 mg celý obsah každého obalu

– 50 mg a více, ale méně

než 300 mg

polovina obsahu každého

obalu, ale nejméně 50 mg

– 300 mg až 5 g 150 mg

– více než 5 g 500 mg

catgut a jiná chirurgická

vlákna pro veterinární

použití

tři úseky vlákna

(každý 30 cm dlouhý)

ODEČÍTÁNÍ A HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

V intervalech v průběhu inkubace a na její závěr se půdy

makroskopicky vyšetří na případný nárůst mikrobů. Jestliže

zkoušený materiál způsobí zakalení živné půdy tak, že nelze

vizuálně určit přítomnost nebo nepřítomnost mikrobiálního

nárůstu, přenese se po 14 dnech od začátku inkubace

část živné půdy (nejméně 1 ml) do nové nádobky s čerstvě

připravenou stejnou živnou půdou. Pokračuje se v inkubaci

původních i nových obalů nejméně 4 dny.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 279

2.6.2 MYKOBAKTERIE

Jestliže se nepozoruje žádný nárůst, zkoušený produkt vyhovuje

zkoušce na sterilitu. Je-li nárůst zjištěn, produkt nevyhovuje

zkoušce na sterilitu, pokud nelze jasně prokázat,

že zkouška byla neplatná z důvodů, které nemají vztah ke

zkoušenému produktu. Zkouška se může považovat za neplatnou

jen tehdy, je-li splněna jedna nebo více z následujících

podmínek:

a) údaje o mikrobiologickém monitorování zařízení, ve

kterém se provedly zkoušky na sterilitu, odhalí chybu;

b) prověření testovacího postupu použitého během předmětné

zkoušky odhalí chybu;

c) mikrobiální nárůst se objeví v negativních kontrolách;

d) po identifikaci mikroorganismů izolovaných zkouškou

může být nárůst tohoto nebo těchto druhů jednoznačně

připsán chybám materiálu a/nebo postupu použitému při

provádění zkoušky na sterilitu.

Tab. 2.6.1-3 Minimální zkoušený počet jednotek

Minimální počet jednotek,

které se použijí

Počet jednotek v šarži* pro každou půdu, není-li

zdůvodněno a schváleno

jinak**

parenterální přípravky

– nejvýše 100 obalů 10 % nebo 4 obaly podle

toho, co je více

– více než 100 obalů, ale 10 obalů

méně než 500 obalů

– více než 500 obalů 2 % nebo 20 obalů

(10 obalů pro velkoobjemové

parenterální přípravky)

podle toho, co je méně

oční přípravky a ostatní

neinjekční přípravky

– nejvýše 200 obalů 5 % nebo 2 obaly podle

toho, co je více

– více než 200 obalů 10 obalů

– je-li přípravek

v jednodávkovém obalu,

postupuje se jako

u parenterálních

přípravků

catgut a jiná chirurgická

vlákna pro veterinární

použití

2 % nebo 5 obalů podle

toho, co je více, nejvýše

celkem 20 obalů

nerozplněné pevné

přípravky

– do 4 obalů každý obal

– více než 4 obaly, ale méně

než 50 obalů toho, co je více

20 % nebo 4 obaly podle

– více než 50 obalů 2 % nebo 10 obalů podle

toho, co je více

*Jestliže není známa velikost šarže, použije se nejvyšší

předepsaný počet jednotek.

**Stačí-li obsah jednoho obalu k inokulaci dvou půd,

pak tento sloupec udává počet obalů potřebných pro

obě půdy dohromady.

Je-li zkouška označena jako neplatná, opakuje se se stejným

množstvím jednotek jako původní zkouška.

Jestliže není při opakování zkoušky pozorován žádný mikrobiální

nárůst, vyhovuje zkoušený produkt zkoušce na

sterilitu. Je-li při opakované zkoušce mikrobiální nárůst

zjištěn, produkt nevyhovuje zkoušce na sterilitu.

POUŽITÍ ZKOUŠKY PRO PARENTERÁLNÍ PŘÍPRAVKY,

OČNÍ PŘÍPRAVKY A JINÉ NEINJEKČNÍ PŘÍPRAVKY,

U KTERÝCH SE POŽADUJE ZKOUŠKA NA STERILITU

Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se,

kdekoliv je to možné, celý obsah obalu, ale nejméně množství

uvedené v tabulce 2.6.1-2. Je-li třeba, zředí se asi na

100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem

masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l).

Použije-li se metoda přímé inokulace do živné půdy, inokuluje

se množství uvedené v tabulce 2.6.1-2, není-li zdůvodněno

a schváleno jinak. Zkoušky na bakteriální a houbovou

sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku.

Pokud objem nebo množství v jednom obalu nestačí

k provedení obou zkoušek, použije se obsah dvou nebo

více obalů k inokulaci různých půd.

MINIMÁLNÍ ZKOUŠENÝ POČET JEDNOTEK

Minimální zkoušený počet jednotek doporučených ke zkoušení

ve vztahu k velikosti šarže je uveden v tabulce 2.6.1-3.

Pokyny k použití zkoušky na sterilitu jsou součástí statě

5.1.9.

2.6.2 MYKOBAKTERIE

6.0:20602

Pokud může být zkoušený vzorek kontaminován jinými

mikroorganismy, než jsou mykobakterie, ošetří se vhodným

dekontaminačním roztokem, jako je např. roztok acetylcysteinu

s hydroxidem sodným nebo roztok natriumlauryl-sulfátu.

Na dvě vhodné pevné půdy (za vhodnou se považuje

Löwensteinova-Jensenova půda a Middlebrookova 7H10

půda) se trojmo inokuluje po 0,2 ml vzorku a dále se do

vhodné tekuté půdy trojmo inokuluje po 0,5 ml vzorku.

Všechny půdy se inkubují 56 dnů při 37 °C.

Růstové vlastnosti živných půd se v přítomnosti zkoušeného

přípravku ověří inokulací vhodného kmene Mycobacterium

sp., jako je např. BCG, je-li třeba, použije se vhodná

neutralizační látka.

Jestliže v prvních osmi dnech inkubace narostou kolonie

kontaminujících mikroorganismů, zkouška se opakuje a zároveň

se provede bakteriologická zkouška na sterilitu.

Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se na konci inkubační

doby nezjistí nárůst mykobakterií v žádné živné půdě použité

ve zkoušce.

2.6.7 MYKOPLAZMATA

6.1:20607

Kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro banku základních

buněk, banku pracovních buněk, pro virové inokulum

nebo pro kontrolní buňky, použije se kultivační metoda

a metoda s indikátorem v buněčné kultuře. Kde je přede-

280 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.7 MYKOPLAZMATA

psána zkouška na mykoplazmata pro virovou sklizeň, pro

várku vakcíny nebo pro šarži, použije se kultivační metoda.

K ověření půd se také může použít, je-li třeba, metoda s indikátorem

v buněčné kultuře.

Techniky amplifikace nukleových kyselin se mohou po

vhodné validaci použít jako alternativní pro jednu nebo obě

metody.

KULTIVAČNÍ METODA

VÝBĚR KULTIVAČNÍCH PŮD

Zkouška se provádí za použití dostatečného počtu jak pevných,

tak tekutých živných půd, aby se za vybraných podmínek

inkubace zajistil růst malých počtů mykoplazmat, která

mohou být přítomna ve zkoušeném produktu. Tekuté živné

půdy musí obsahovat červeň fenolovou. Vybrané druhy

živných půd mají prokazatelně dostatečné živné vlastnosti

nejméně pro dále uvedené mikroorganismy. Živné vlastnosti

každé nové šarže živné půdy jsou ověřovány pro příslušné

mikroorganismy uvedené na seznamu. Pokud se zkouší mykoplazmata

ve zkoušeném produktu, použije se nejméně jeden

z dále uvedených druhů jako pozitivní kontrola:

– Acholeplasma laidlawii (vakcíny pro humánní a veterinární

použití, při jejichž výrobě bylo použito antibiotikum);

– Mycoplasma gallisepticum (kde se při výrobě použil materiál

ptačího původu nebo kde je vakcína určena pro

drůbež);

– Mycoplasma hyorhinis (veterinární vakcíny neurčené pro

ptáky);

– Mycoplasma orale (vakcíny pro humánní a veterinární

použití);

– Mycoplasma pneumoniae (vakcíny pro humánní použití)

nebo jiný vhodný druh fermentující glukosu, jako např.

Mycoplasma fermentans;

– Mycoplasma synoviae (kde se ve výrobě použil materiál

ptačího původu nebo kde je vakcína určena pro drůbež).

Zkušební kmeny jsou izoláty z terénu, které prošly omezeným

počtem subkultivací (nejvýše patnácti) a jsou uchovávány

zmrazené nebo v lyofilizovaném stavu. Po klonování

se kmeny identifikují jako požadované druhy vhodnou metodou,

porovnáním se sbírkovými kulturami, např.:

A. laidlawii: NCTC 10116, CIP 75.27, ATCC 23206;

M. gallisepticum: NCTC 10115, CIP 104967,

ATCC 19610;

M. fermentans: NCTC 10117, CIP 105680, ATCC 19989;

M. hyorhinis: NCTC 10130, CIP 104968, ATCC 17981;

M. orale: NCTC 10112, CIP 104969, ATCC 23714;

M. pneumoniae: NCTC 10119, CIP 103766, ATCC 15531;

M. synoviae: NCTC 10124, CIP 104970, ATCC 25204.

Acholeplasma laidlawii BRP, Mycoplasma fermentans BRP,

Mycoplasma hyorhinis BRP, Mycoplasma orale BRP a Mycoplasma

synoviae BRP jsou vhodné jako referenční kmeny

s nízkým počtem pasáží.

INKUBAČNÍ PODMÍNKY

Tekuté půdy se inkubují v pevně uzavřených nádobách při

35 °C až 38 °C. Pevné půdy se inkubují za mikroaerofilních

podmínek (v dusíku obsahujícím 5 % až 10 % oxidu uhličitého

a při dostatečné vlhkosti, aby se zamezilo vysychání

povrchu půd) při 35 °C až 38 °C.

ŽIVNÉ VLASTNOSTI

U každé nové šarže živné půdy se provede zkouška živných

vlastností. Vybraná živná půda se inokuluje vhodnými zkušebními

mikroorganismy; použije se nejvýše 100 CFU na

misku o průměru 60 mm obsahující 9 ml pevné půdy a pro

nádobku obsahující 100 ml tekuté živné půdy; pro každý

druh mikroorganismu se použije samostatná miska a nádobka.

Živné půdy se inkubují a 0,2 ml tekuté půdy se v určených

intervalech inokuluje na pevné půdy (jak je uvedeno

v odstavci Zkouška na mykoplazmata ve zkoušeném produktu).

Pevná živná půda vyhovuje zkoušce, jestliže je zjištěn

přiměřený růst pro každý zkoušený mikroorganismus

(získaný růst se neliší o více než faktor 5 od hodnoty vypočítané

vzhledem k inokulu). Tekutá živná půda vyhovuje

zkoušce, jestliže se na agarových půdách, které byly inokulovány

z tekutých půd, nalezl růst alespoň z jedné subkultury

pro každý zkoušený mikroorganismus.

INHIBIČNÍ LÁTKY

Zkouška na inhibiční látky se provede pro daný produkt

a opakuje se, kdykoliv je ve výrobní metodě změna, která

může ovlivnit detekci mykoplazmat.

K prokázání nepřítomnosti inhibičních látek se provádí

zkouška živných vlastností v přítomnosti a v nepřítomnosti

zkoušeného produktu. Jestliže se růst zkušebních mikroorganismů

objeví ve více než v jedné subkultuře v nepřítomnosti

zkoušeného produktu nebo jestliže plotny přímo inokulované

zkoušeným produktem mají méně než jednu pětinu

z počtu kolonií, které byly inokulovány bez zkoušeného

produktu, jsou inhibiční látky přítomny a musí se neutralizovat

nebo jinak vyloučit jejich účinek, např. pasážováním

na substrátu, který neobsahuje inhibitory, nebo ředěním ve

větším objemu půdy před zkouškou. Jestliže se použije ředění,

mohou se použít větší objemy nebo se inokulační objem

může rozdělit do několika 100ml nádob. Účinnost neutralizace

nebo jiných postupů se kontroluje opakováním

zkoušky na inhibiční látky po neutralizaci.

ZKOUŠKA NA MYKOPLAZMATA

VE ZKOUŠENÉM PRODUKTU

Inokuluje se 10 ml zkoušeného produktu do 100 ml každé

tekuté živné půdy. Objeví-li se po přidání zkoušeného produktu

jakákoliv významná změna hodnoty pH, původní hodnota

pH tekuté půdy se obnoví přidáním buď roztoku hydroxidu

sodného, nebo roztoku kyseliny chlorovodíkové. Na

každou misku každé živné půdy se inokuluje 0,2 ml zkoušeného

produktu. Tekuté půdy se inkubují 20 dnů až 21 dnů,

pevné půdy se inkubují nejméně 14 dnů s výjimkou těch,

které odpovídají 20denní až 21denní subkultuře, ty se inkubují

7 dnů. Jako negativní kontrola se nechají po stejnou dobu

inkubovat neinokulované části každé tekuté půdy v množství

100 ml a misky s agarovou půdou. Ve 2. až 4. dnu po

inokulaci se inokuluje po 0,2 ml z každé tekuté půdy na nejméně

jednu misku s každou pevnou půdou. Postup se opakuje

mezi 6. až 8. dnem, znovu mezi 13. až 15. dnem a ještě

jednou mezi 19. až 21. dnem zkoušky. Tekuté živné půdy se

prohlížejí každý 2. nebo 3. den a objeví-li se změna zbarvení,

inokulují se znovu. Jestliže jsou tekuté živné půdy kontaminovány

bakteriemi nebo houbami, zkoušku nelze hodnotit.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 281

2.6.7 MYKOPLAZMATA

Zkoušku lze hodnotit, jestliže lze odečíst alespoň jednu misku

každé půdy pro každý den inokulace. Do zkoušky se zařadí

pozitivní kontrola připravená inokulací nejvýše

100 CFU alespoň jednoho zkušebního mikroorganismu na

agarové půdě nebo tekuté půdě. Tam, kde se zkouška na mykoplazmata

provádí pravidelně a kde je to možné, se doporučuje

používat pravidelné střídání zkušebních mikroorganismů.

Jako zkušební se používají mikroorganismy uvedené

v seznamu v odstavci Výběr kultivačních půd.

HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

Na konci předepsané inkubační doby se všechny pevné

inokulované půdy mikroskopicky vyšetří na přítomnost kolonií

mykoplazmat. Produkt vyhovuje zkoušce, nezjistí-li se

růst typických kolonií mykoplazmat. Produkt nevyhovuje

zkoušce, jestliže se objeví růst typických kolonií mykoplazmat

na jakékoliv pevné půdě. Zkoušku nelze hodnotit, pokud

jedna nebo více pozitivních kontrol nevykazuje růst

mykoplazmat. Zkoušku nelze hodnotit, pokud jedna nebo

více negativních kontrol vykazuje růst mykoplazmat. Pokud

se objeví podezřelé kolonie, použije se vhodná validovaná

metoda k určení, zda se jedná o mykoplazmata.

Následující část se uvádí pro informaci.

PŮDY DOPORUČENÉ PRO KULTIVAČNÍ METODU

Doporučují se následující půdy. Mohou se použít i jiné půdy

za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost

podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti a nepřítomnosti

zkoušeného produktu.

HAYFLICKOVY PŮDY (doporučené pro obecnou detekci

mykoplazmat)

Tekutá půda

výtažek z hovězího srdce (1)

koňské sérum (nezahřáté)

roztok kvasničného výtažku (250 g/l)

roztok červeně fenolové (0,6 g/l)

roztok penicilinu (20 000 m. j./ml)

roztok kyseliny deoxyribonukleové (2 g/l)

pH se upraví na hodnotu 7,8.

90,0 ml

20,0 ml

10,0 ml

5,0 ml

0,25 ml

1,2 ml

Pevná půda

Připraví se stejně jako tekutá půda s tím rozdílem, že výtažek

z hovězího srdce obsahuje agar (15 g/l).

FREYOVY PŮDY (doporučené pro detekci M. synoviae)

Tekutá půda


90,0 ml

esenciální vitaminy (2)

0,025 ml

roztok glukosy monohydrátu (500 g/l) 2,0 ml

prasečí sérum (inaktivované 30 min při 56 °C) 12,0 ml

roztok β-nikotinamidadenindinukleotidu (10 g/l) 1,0 ml

roztok cystein-hydrochloridu (10 g/l)

1,0 ml


5,0 ml


0,25 ml

Smíchají se roztoky β-nikotinamidadenindinukleotidu

a cystein-hydrochloridu a po 10 min se přidají k ostatním

složkám; pH se upraví na hodnotu 7,8.

Pevná půda


čištěný agar (3)

90,0 ml

1,4 g

pH se upraví na hodnotu 7,8, sterilizuje se v autoklávu

a pak se přidá:

esenciální vitaminy (2)

0,025 ml

roztok glukosy monohydrátu (500 g/l) 2,0 ml

prasečí sérum (nezahřáté)

12,0 ml

roztok β-nikotinamidadeninudinkleotidu (10 g/l) 1,0 ml

roztok cystein-hydrochloridu (10 g/l)

1,0 ml


5,0 ml


0,25 ml

FRIISOVY PŮDY (doporučené pro detekci neaviárních

mykoplazmat)

Tekutá půda

tlumivý solný roztok podle Hankse

(modifikovaný) (4)

voda destilovaná

výtažek ze srdce a mozku (5)

PPLO tekutá půda (6)

roztok kvasničného výtažku (170 g/l)

bacitracin

meticilin

roztok červeně fenolové (5 g/l)

koňské sérum

prasečí sérum

pH se upraví na hodnotu 7,40 až 7,45.

800 ml

67 ml

135 ml

248 ml

60 ml

250 mg

250 mg

4,5 ml

165 ml

165 ml

Pevná půda

tlumivý solný roztok podle Hankse

(modifikovaný) (4)

200 ml

DEAE-dextran

200 mg

čištěný agar (3)

15,65 g

Dobře se promíchá a sterilizuje se v autoklávu, ochladí se

na 100 °C a přidá se do 1740 ml tekuté půdy popsané výše.

(1) Výtažek z hovězího srdce

hovězí srdce (pro přípravu výtažku)

pepton

chlorid sodný

voda destilovaná

Sterilizuje se v autoklávu.

(2) Esenciální vitaminy

biotin

kalcium-pantothenát

cholin-chlorid

kyselina listová

i-inositol

nikotinamid

pyridoxal-hydrochlorid

riboflavin

thiamin-hydrochlorid

voda destilovaná

500 g

10 g

5 g

do 1000 ml

100 mg

100 mg

100 mg

100 mg

200 mg

100 mg

100 mg

10 mg

100 mg

do 1000 ml

(3) Čištěný agar

Vysoce čištěný agar pro použití v mikrobiologii a imunologii,

připravený iontoměničovým postupem tak, aby výsledkem

byl produkt o vyšší čistotě, čirosti a pevnosti gelu.

Obsahuje asi:

voda 12,2 %

popel 1,5 %

popel nerozpustný v kyselinách 0,2 %

chlor 0

282 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.7 MYKOPLAZMATA

fosforečnany (počítáno jako P2O5) 0,3 %

celkový dusík 0,3 %

měď

8 µg/g

železo

170 µg/g

vápník 0,28 %

hořčík 0,32 %

(4) Tlumivý solný roztok podle Hankse (modifikovaný)

chlorid sodný

6,4 g

chlorid draselný

0,32 g

síran hořečnatý heptahydrát

0,08 g

chlorid hořečnatý hexahydrát

0,08 g

chlorid vápenatý bezvodý

0,112 g

hydrogenfosforečnan sodný dihydrát 0,0596 g

dihydrogenfosforečnan draselný bezvodý 0,048 g

voda destilovaná

do 800 ml

(5) Výtažek ze srdce a mozku

výtažek z telecího mozku

výtažek z hovězího srdce

proteosový pepton

glukosa monohydrát

chlorid sodný

hydrogenfosforečnan sodný bezvodý

voda destilovaná

(6) PPLO tekutá půda

výtažek z hovězího srdce

pepton

chlorid sodný

voda destilovaná

200 g

250 g

10 g

2 g

5 g

2,5 g

do 1000 ml

50 g

10 g

5 g

do 1000 ml

METODA S INDIKÁTOREM V BUNĚČNÉ KULTUŘE

Buněčné kultury se obarví fluorescenčním barvivem,

které se váže na DNA. Mykoplazmata se detekují pomocí

fluorescence jejich charakteristických částic nebo nitkovitých

útvarů na povrchu buněk a, jestliže je kontaminace

silná, i v okolním prostředí. Mitochondrie v cytoplazmě

se mohou obarvit, ale jsou snadno rozlišitelné

od mykoplazmat.

Jestliže pro virové suspenze je vyjádření výsledků ovlivněno

zřetelnými cytopatickými účinky, může se virus neutralizovat

specifickým antisérem, které nemá inhibiční

účinky na mykoplazmata, nebo použitím substrátu buněčné

kultury, který neumožňuje růst virů. V séru se provedou

pozitivní kontrolní zkoušky v přítomnosti a v nepřítomnosti

antiséra, aby se prokázala nepřítomnost inhibičního

účinku.

OVĚŘENÍ SUBSTRÁTU

Použijí se Vero buňky nebo jiná buněčná kultura (např.

produkční buněčná linie), která má odpovídající účinnost

při detekci mykoplazmat. Zkouška účinnosti použitých buněk

se provádí dále uvedeným postupem a inokulací nejvýše

100 CFU nebo koloniím odpovídajících jednotek vhodných

zkušebních kmenů M. hyorhinis a M. orale.

Tyto kmeny byly shledány jako vhodné:

Mycoplasma hyorhinis: ATCC 29052;

Mycoplasma orale: NCTC 10112, CIP 104969, ATCC 23714.

Buňky jsou vhodné, jestliže se detekují oba zkušební kmeny.

Indikátorové buňky se musí před použitím ve zkoušce

inokulovat bez antibiotik.

ZKUŠEBNÍ METODA

1. Připraví se buněčná kultura s indikátorem o vhodné

hustotě (např. 2 · 10 4 až 2 · 10 5 buněk/ml, 4 · 10 3 až

2,5 · 10 4 buněk/cm 2 ), která poskytne splývající nárůst

po 3 dnech růstu. Do nádoby s buněčnou kulturou se

inokuluje 1 ml zkoušeného produktu a inkubuje se při

35 °C až 38 °C.

2. Nejméně po třídenní inkubaci, když buňky vytvoří splývající

nárůst vhodný pro postup zkoušky, se vytvoří

subkultura na povrchu krycího sklíčka ve vhodné nádobě

nebo na nějakém jiném povrchu (např. komůrkového

sklíčka). Buňky o nízké hustotě se inokulují tak, aby se

dosáhlo 50% splynutí po 3 dnech až 5 dnech inkubace.

Musí se zabránit úplnému splynutí buněk, aby nedošlo

ke zhoršení vizualizace mykoplazmat po barvení.

3. Půda se odstraní a indikátorové buňky se promyjí tlumivým

roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným

o pH 7,4 R, potom se přidá vhodný fixační roztok [čerstvě

připravená směs objemových dílů kyseliny octové ledové

R a methanolu R (1 + 3) je vhodná, pokud se pro

barvení použije bisbenzimid R].

4. Fixační roztok se odstraní a buňky se promyjí sterilní

vodou R. Jestliže se budou barvit nejméně o 1 h později,

vysuší se zcela nárůsty na krycím sklíčku (po vysušení

na sklíčku je třeba při barvení zvláštní péče, protože

mohou vznikat artefakty).

5. Přidá se vhodné barvivo DNA a nechá se působit po

vhodnou dobu (pro bisbenzimid pracovní RS je vhodná

doba působení 10 min).

6. Odstraní se barvivo a jednovrstvá buněčná kultura (monolayer)

se promyje vodou R.

7. Každé krycí sklíčko se fixuje, kde je to vhodné (směsí

stejných objemových dílů glycerolu R a tlumivého roztoku

fosforečnan-citrátového o pH 5,5 R). Hodnotí se

fluorescence při 400násobném nebo větším zvětšení

(pro bisbenzimidové barvení je vhodný excitační filtr

při 330 nm/380 nm a clona LP 440 nm).

8. Porovná se mikroskopický vzhled zkoušené kultury

s negativní a pozitivní kontrolou a hodnotí se mimojaderná

fluorescence. Mykoplazmata se jeví jako body

nebo vlákna v cytoplazmě indikátorových buněk. Také

se mohou jevit jako body nebo vlákna v mezibuněčném

prostoru. Počty mikroskopicky vyšetřených polí se stanoví

podle validačního protokolu.


Zkoušený produkt vyhovuje zkoušce, jestliže není prokázána

typická fluorescence mykoplazmat. Zkoušku nelze hodnotit,

jestliže se u pozitivní kontroly neprokáže fluorescence

typická pro mykoplazmata. Zkoušku nelze hodnotit, jestliže

se u negativní kontroly prokáže fluorescence typická

pro mykoplazmata.

TECHNIKY AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

Techniky amplifikace nukleových kyselin (2.6.21) se mohou

použít pro detekci mykoplazmat amplifikací nukleových

kyselin extrahovaných ze zkoušeného vzorku se specifickými

primery, které mohou odhalit přítomnost cílové

nukleové kyseliny. Techniky amplifikace nukleových kyselin

indikují přítomnost jednotlivé sekvence nukleové ky-

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 283

2.6.7 MYKOPLAZMATA

seliny a není nezbytná přítomnost živých mykoplazmat.

K dispozici jsou různé postupy. Tato obecná stať nepředepisuje

metodu pro zkoušku. Použitý postup se musí validovat

tak, jak je předepsáno s ohledem na pokyny uvedené na

konci této stati. Pokud se používají komerční soupravy (kity),

mohou se převzít určité části validace od výrobce, ale

musí se brát zřetel na to, že úplná informace o primerech

nemusí být dostupná a že výroba kitů může být změněna

nebo zastavena.

Techniky amplifikace nukleových kyselin se používají, pokud

jsou předepsány v článku. Také se mohou po vhodné

validaci použít místo kultivační metody a metody s indikátorem

v buněčné kultuře.

Přímé techniky amplifikace nukleových kyselin se mohou

použít v přítomnosti cytotoxického materiálu a tam, kde je

třeba rychlá metoda.

Obohacená buněčná kultura, po které následují techniky

amplifikace nukleových kyselin. Zkoušený vzorek a vhodný

buněčný substrát (jak je popsáno v metodě s indikátorem

v buněčné kultuře) se kultivují společně po vhodnou dobu;

z buněk a supernatantní tekutiny se potom extrahují nukleové

kyseliny, které se použijí pro detekci pomocí technik

amplifikace nukleových kyselin.

VALIDACE

Referenční standardy se požadují v různých fázích validace

a používají se jako kontroly při běžném použití zkoušky.

Referenčními látkami mohou být mykoplazmata nebo nukleové

kyseliny.

Následující druhy tvoří optimální výběr pro validaci limitu

detekce z hlediska četnosti výskytu kontaminantů a fylogenetické

příslušnosti:

– Acholeplasma laidlawii;

– Mycoplasma fermentans;

– Mycoplasma hyorhinis (pokud se používá obohacená

buněčná kultura, zahrne se náročný kmen jako např.

ATCC 29052);

– Mycoplasma orale;

– Mycoplasma pneumoniae nebo Mycoplasma gallisepticum;

– Mycoplasma synoviae (tam, kde se používá materiál ptačího

původu nebo je s ním během výroby ve styku);

– Mycoplasma arginini;

– Spiroplasma citri (tam, kde se používá hmyz nebo rostlinný

materiál nebo je s ním během výroby ve styku).

Prokázání specificity vyžaduje použití vhodného rozsahu

bakteriálních druhů jiných než mykoplazmata. Bakteriální

druhy s úzkým fylogenetickým vztahem k mykoplazmatům

jsou pro tyto validace nejvhodnější; zahrnují rody Clostridium,

Lactobacillus a Streptococcus.

Srovnávací studie pro použití techniky amplifikace nukleových

kyselin jako alternativní metody. Pro každé mykoplazma

je zvláštní zkouška:

– jako alternativa ke kultivační metodě: zkušební systém

technik amplifikace nukleových kyselin musí prokázat

schopnost detekce 10 CFU/ml;

– jako alternativa k metodě s indikátorem v buněčné kultuře:

zkušební systém technik amplifikace nukleových kyselin

musí prokázat schopnost detekce 100 CFU/ml;

nebo ekvivalentní limit detekce, z hlediska počtu kopií mykoplazmatické

nukleové kyseliny ve zkoušeném vzorku

(použijí se vhodné referenční standardy mykoplazmatické

nukleové kyseliny).

KONTROLY

Vnitřní kontroly. Vnitřní kontroly jsou nezbytné pro běžné

ověření nepřítomnosti inhibice. Vnitřní kontrola může

obsahovat vazebné místo pro primer, nebo se může použít

jiná vhodná sekvence. Přednostně se přidá ke zkoušenému

materiálu před izolací nukleové kyseliny a následnými postupy

celkové kontroly (extrakce, reverzní transkripce, amplifikace,

detekce).

Vnější kontroly. Vnější pozitivní kontrola obsahuje definovaný

počet kopií cílových sekvencí nebo jednotek vytvářejících

kolonie z jednoho nebo více vhodných druhů mykoplazmat

vybraných z těch, které byly použity při validaci

zkušebních podmínek. Jedna z pozitivních kontrol se přidá

v množství blízkém pozitivní limitní hodnotě, aby se prokázalo,

že bylo dosaženo očekávané citlivosti. Vnější negativní

kontrola neobsahuje cílovou sekvenci, ale nepředstavuje

nezbytně stejnou matrici jako zkoušený předmět.


Používané primery mohou také amplifikovat nemykoplazmatickou

bakteriální nukleovou kyselinu, což vede k falešně

pozitivním výsledkům. Je-li třeba, stanoví se v době validace

pracovní postupy pro potvrzení pozitivních výsledků.

Následující část je uvedena pro informaci.

Validace metody techniky amplifikace nukleových

kyselin pro určení mykoplazmat: pokyny

1 ÚVOD

Techniky amplifikace nukleových kyselin jsou buď kvantitativní,

nebo kvalitativní zkoušky přítomnosti nukleové kyseliny.

Pro určení kontaminace různých vzorků jako např.

vakcín a buněčných substrátů mykoplazmaty, jsou vhodné

kvalitativní zkoušky a mohou být považovány za zkoušky

limitní.

Tento pokyn popisuje metody validace analytických postupů

stanovení kontaminace mykoplazmaty kvalitativní

amplifikací nukleových kyselin. Ty se mohou použít pro

metodu amplifikace nukleových kyselin v reálném čase,

která se používá jako limitní zkouška pro kontrolu kontaminantů.

Specificita a detekční limit jsou dvě charakteristiky, které

se považují za nejdůležitější pro validaci analytických postupů.

Navíc se má ještě hodnotit robustnost analytických

postupů.

Pro účely tohoto dokumentu se analytický postup definuje

jako úplný postup od extrakce nukleové kyseliny až k detekci

amplifikovaného produktu.

Pokud se pro část postupu nebo pro úplný analytický postup

použijí komerční soupravy (kity), mohou validační

body již dokumentované výrobcem nahradit validaci uživatelem.

Nicméně výkonnost soupravy (kitu) s ohledem

k zamýšlenému použití by měla být uživatelem prokázána

(např. detekční limit, robustnost, křížová detekce jiných tříd

bakterií).

284 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.7 MYKOPLAZMATA

Metody amplifikace nukleových kyselin se mohou použít

jako:

– doplňková zkouška (např. pro cytotoxické virové suspenze)

nebo pro mezioperační kontrolu;

– jako alternativní metoda nahrazující oficiální metodu

(metoda buněčné kultury s indikátorem nebo kultivační

metoda).

Tyto pokyny tak budou rozlišovat tato dvě použití uvedením

základního pokynu pro validaci metody amplifikace

nukleových kyselin a dalšího pokynu pro srovnávací studii

mezi metodou amplifikace nukleových kyselin a lékopisnými

metodami.

2 POKYN PRO VALIDACI METODY AMPLIFIKACE

NUKLEOVÝCH KYSELIN PRO MYKOPLAZMATA

Měly by se hodnotit tři parametry: specificita, detekční limit

a robustnost.

2-1 Specificita. Je to schopnost jednoznačně stanovit nukleovou

kyselinu v přítomnosti složek, jejichž přítomnost je

předvídatelná.

Specificita metody amplifikace nukleových kyselin je závislá

na výběru primerů, výběru sond (pro analýzu konečného

produktu) a přesnosti zkušebních podmínek (pro amplifikační

i detekční kroky).

Schopnost metody amplifikace nukleových kyselin určit

velký rozsah druhů mykoplazmat závisí na výběru primerů,

sond a parametrech metody. Tato schopnost se má prokázat

použitím charakterizovaných referenčních seznamů (např.

referenční kmeny zajišťované EDQM). Protože systémy

amplifikace nukleových kyselin jsou obvykle založeny na

směsi primerů, nedoporučují se teoretické analýzy primerů

a sond porovnáváním s databázemi, neboť interpretace výsledků

může být poměrně složitá a nezohledňuje experimentální

výsledky.

Navíc, protože je pravděpodobné, že primery budou detekovat

jiné bakteriální druhy, měla by se možná křížová detekce

dokumentovat ve validační studii. Bakteriální druhy,

jako jsou grampozitivní bakterie s blízkým fylogenetickým

vztahem k mykoplazmatům, jsou pro validaci nejvhodnější;

zahrnují rody Clostridium, Lactobacillus a Streptococcus.

Nicméně to není vyčerpávající seznam a zkoušené druhy

závisí na teoretické schopnosti (založené na sekvencích

primerů/sond) systému amplifikace nukleových kyselin detekovat

také jiné druhy.

Jestliže je na základě výsledků této validace zjištěn nedostatek

ve specificitě (jako je detekce nemykoplazmatické

bakteriální nukleové kyseliny), musí se navrhnout vhodný

postup validační studie, který umožní vyhodnocení pozitivních

výsledků v běžné praxi. Např. druhá zkouška se může

provést za použití alternativní metody bez tohoto nedostatku

ve specificitě nebo za použití lékopisné metody.

2-2 Detekční limit. Detekční limit jednotlivého analytického

postupu je nejmenší množství cílové nukleové kyseliny

ve vzorku, které se může detekovat, ale není nutné je kvantifikovat

jako přesnou hodnotu.

Pro stanovení detekčního limitu by měla být stanovena pozitivní

limitní hodnota pro analytický postup amplifikace

nukleové kyseliny. Pozitivní limitní hodnota (jak je definována

v obecné stati 2.6.21) je minimální počet kopií cílových

sekvencí v objemu vzorku, který může být detekován

v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní hodnota je ovlivňována

distribucí mykoplazmatických genomů v jednotlivých

zkoušených vzorcích a také faktory, jako je např. enzymatický

účinek, které mohou způsobit rozdíly pozitivních

limitních hodnot v 95 % sérií jednotlivých analytických

zkoušek.

K určení pozitivní limitní hodnoty se použijí charakterizované

a kalibrované ředicí série (buď v jednotkách vytvářejících

kolonie, nebo v kopiích nukleové kyseliny) domácích

pracovních kmenů nebo standardů EDQM, které se mají

zkoušet v různých dnech pro zjištění rozdílů mezi zkoušenými

sériemi.

Pro validaci detekčního limitu se uvádějí následující druhy

tvořící optimální výběr pro stanovení četnosti výskytu kontaminant

a fylogenetické příbuznosti:

– Acheloplasma laidlawii;

– Mycoplasma fermentans;

– Mycoplasma hyorhinis;

– Mycoplasma orale;

– Mycoplasma pneumoniae nebo Mycoplasma gallisepticum;

– Mycoplasma synoviae (kde se během výroby používá materiál

ptačího původu nebo je ve styku s ním);

– Mycoplasma arginini;

– Spiroplasma citri (kde se během výroby používá hmyz

a rostlinný materiál nebo je ve styku s nimi).

Pro každý kmen by se měly zkoušet nejméně tři nezávislé

desetinásobné ředicí série s dostatečným počtem opakování

v každém ředění, aby se pro každé ředění získalo dvacet

čtyři výsledků způsobilých ke statistickému hodnocení.

Laboratoř může např. zkoušet tři ředicí série v různých

dnech v osmi opakováních pro každé ředění, čtyři ředicí série

v různých dnech v šesti opakováních pro každé ředění

nebo šest ředicích sérií v různých dnech ve čtyřech opakováních

pro každé ředění. K udržení počtu ředění na zvládnutelné

úrovni by se měla provést předběžná zkouška, aby

se získal předběžný výsledek pro pozitivní limitní hodnotu

(tj. nejvyšší počet ředění dávající pozitivní signál). Rozsah

ředění se může vybrat kolem předurčené limitní hodnoty.

Koncentrace mykoplazmat (v jednotkách vytvářejících kolonie

nebo v kopiích), které mohou být detekovány v 95 %

zkušebních sérií se může vypočítat vhodným statistickým

posouzením.

Tyto výsledky se také mohou použít k vyhodnocení variability

analytických postupů.

2-3 Robustnost. Robustnost analytického postupu je míra

jeho schopnosti zůstat nedotčen malými, ale záměrnými

odchylkami v parametrech metody a poskytuje údaje o jeho

spolehlivosti při běžném použití.

Hodnocení robustnosti by se mělo zvážit ve vývojové fázi.

Mělo by ukázat spolehlivost analytického postupu s ohledem

na záměrné odchylky v parametrech metody. Pro metody

amplifikace nukleových kyselin mohou být malé odchylky

v parametrech metody rozhodující. Nicméně robustnost

metody se může prokázat při jejím vývoji, kdy se

zkoušejí malé odchylky v koncentraci zkoumadel (např.

MgCl2, primerů nebo deoxyribonukleotidů). Změny extrakčních

souprav (kitů) nebo postupů, stejně jako rozdíly

mezi různými typy termocyklerů, se také mají zohlednit.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 285

2.6.8 ZKOUŠKA NA PYROGENNÍ LÁTKY

Konečně, robustnost metod může být určena mezilaboratorními

studiemi.

3 POKYNY PRO POROVNÁVACÍ STUDII

Metody amplifikace nukleových kyselin se mohou použít

místo lékopisné metody (metody s indikátorem v buněčné

kultuře a/nebo kultivační metody). V tomto případě by se

měla provést porovnávací studie. Ta má především porovnat

příslušné detekční limity alternativní metody a lékopisných

metod. Také by se však měla vzít v úvahu specificita

(nejčastěji se vyskytující kontaminující mykoplazmata, falešně

pozitivní výsledky).

Kritéria přijatelnosti pro detekční limit jsou definována takto:

– jestliže je alternativní metoda navržena k nahrazení kultivační

metody, systém metod amplifikace nukleových kyselin

musí být schopen detekovat 10 CFU/ml pro každý druh

zkoušených mykoplazmat uvedený v odstavci 2-2;

– jestliže je alternativní metoda navržena k nahrazení metody

s indikátorem v buněčné kultuře, systém metod amplifikace

nukleových kyselin musí být schopen detekovat

100 CFU/ml pro každý druh zkoušených mykoplazmat

uvedený v odstavci 2-2.

V obou případech se mohou použít vhodné standardy kalibrované

pro počet kopií nukleové kyseliny a počet jednotek

vytvářejících kolonie pro potvrzení, že bylo dosaženo kritéria

přijatelnosti. Vztah mezi jednotkami vytvářejícími kolonie

a kopiemi nukleové kyseliny pro referenční přípravky

by měl být určen přednostně, aby se porovnalo provedení

alternativní metody amplifikace nukleových kyselin s provedením

lékopisné metody.

Pro provedení porovnávací studie se může použít jeden ze

dvou následujících přístupů:

– provede se alternativní metoda amplifikace nukleových

kyselin souběžně s lékopisnou metodou (metodami)

k souběžnému posouzení detekčního limitu obou metod

za použití stejných vzorků kalibrovaných kmenů;

– porovná se provedení alternativní metody amplifikace

nukleových kyselin za použití dříve získaných údajů

z validace lékopisné metody. V tomto případě by mělo

být pro obě validace pečlivě dokumentováno použití kalibrovaných

standardů, stejně jako jejich stabilita.

Zápis porovnávací studie by měl obsahovat všechny prvky

validace uvedené v části 2 (specificita, detekční limit a variabilita,

stejně jako robustnost), aby se vyhodnotily všechny

výhody a/nebo nevýhody alternativní metody amplifikace

nukleových kyselin ve srovnání s lékopisnými metodami.

2.6.8 ZKOUŠKA NA PYROGENNÍ LÁTKY

10.0:20608

Zkouška spočívá v měření vzestupu tělesné teploty vyvolaného

u králíků intravenózní injekcí sterilního roztoku zkoušené

látky.

Výběr zvířat. Použijí se zdraví dospělí králíci obojího pohlaví,

hmotnosti nejméně 1,5 kg, krmení úplnou a vyváženou

dietou bez antibiotik, kteří v týdnu před zkouškou nevykázali

ztrátu tělesné hmotnosti. Králík se nepoužije ke

zkoušce na pyrogenní látky, jestliže:

a) byl použit v předchozích třech dnech v negativní zkoušce

na pyrogenní látky, nebo

b) byl použit v předchozích třech týdnech ve zkoušce, při

níž zkoušená látka nevyhověla zkoušce na pyrogenní

látky.

Ustájení zvířat. Králíci jsou chováni odděleně v klidném

prostředí se stálou vhodnou teplotou. Odebere se jim potrava

po celou předcházející noc až do dokončení zkoušky

a voda v průběhu zkoušky. Zkouška se provede v klidné

místnosti, kde není nebezpečí vyrušování, jež by zvířata

dráždilo, a kde se teplota neliší o více než 3 °C od teploty

místnosti, v níž byli ustájeni nebo chováni nejméně 18 h

před zkouškou.

Prostředky. Skleněné nádoby, injekční stříkačky a jehly se

pečlivě vymyjí vodou pro injekci a suší v horkovzdušném

sterilizátoru 30 min při 250 °C nebo 1 h při 200 °C.

Klece na měření. Klece pro králíky, jejichž teplota se měří

elektrickým snímačem, jsou zhotoveny tak, že zvířata jsou

držena jen ve volném obojku; zbytek těla zůstává relativně

volný, takže králíci mohou sedět v přirozené poloze. Nejsou

drženi popruhy nebo podobnými prostředky, které mohou

zvířeti ublížit. Zvířata se umístí do klecí nejméně 1 h

před prvním záznamem teploty a setrvají v ní po dobu

zkoušky.

Teploměry. Použije se teploměr nebo elektrický snímač,

který udává teplotu s rozlišením 0,1 °C, králíkovi se vsune

do konečníku asi 5 cm hluboko. Hloubka zasunutí je pro

každého králíka v dané zkoušce konstantní. Použije-li se

elektrický snímač, může být po celou zkoušku ponechán

zasunutý.

Předběžná zkouška. Provede se jeden až tři dny před

zkoušením produktu u vybraných zvířat, která nebyla v předešlých

dvou týdnech použita. Těmto zvířatům se intravenózní

injekcí podá nepyrogenní roztok chloridu sodného

R (9 g/l) ohřátý na asi 38,0 °C v dávce 10 ml na kilogram

tělesné hmotnosti. Teplota zvířat se zaznamená nejméně

90 min před injekcí a v průběhu 3 h po injekci

roztoku. Zvíře, které vykazuje větší změny teploty než

0,6 °C, se ve vlastní zkoušce nepoužije.

Vlastní zkouška. Zkouška se provede na skupině tří

králíků.

Příprava a injekce produktu. Zkoušená tekutina se před podáním

zahřeje na asi 38,0 °C. Zkoušený produkt se může

rozpustit nebo zředit nepyrogenním roztokem chloridu

sodného R (9 g/l) nebo jinou předepsanou tekutinou. Roztok

se podává pomalu do marginální žíly v uchu každého

králíka po dobu nepřesahující 4 min, pokud není v článku

předepsáno jinak. Množství podávaného produktu se liší

podle zkoušeného produktu a je předepsáno v článku. Podaný

objem je nejméně 0,5 ml na kilogram a nejvýše 10 ml

na kilogram tělesné hmotnosti.

Odečet výchozích a nejvyšších teplot. Výchozí teplotou

každého králíka je průměr dvou teplotních odečtů zaznamenaných

u tohoto králíka v 30min intervalu během 40 min

těsně předcházejících podání zkoušeného produktu. Nejvyšší

teplotou každého králíka je nejvyšší zaznamenaná

teplota tohoto králíka během 3 h po podání. Teplota každého

králíka se zaznamenává v intervalech nejvýše 30 min,

počínaje nejméně 90 min před podáním zkoušeného produktu

a 3 h po jeho podání. Rozdíl mezi nejvyšší teplotou

286 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.10 ZKOUŠKA NA PŘÍTOMNOST HISTAMINU

a výchozí teplotou každého králíka se považuje za jeho odpověď.

Je-li rozdíl negativní, výsledek se počítá jako nulová

odpověď.

Králík vykazující teplotní rozdíly větší než 0,2 °C mezi

dvěma následujícími odečty se při stanovení výchozí teploty

vyřadí ze zkoušky. Použijí se pouze ti králíci, jejichž

výchozí teploty se vzájemně neliší o více než 1 °C. Všichni

králíci, kteří mají výchozí teplotu vyšší než 39,8 °C nebo

nižší než 38,0 °C, se vyřadí ze zkoušky.

Vyhodnocení výsledků. Po provedení první zkoušky na

skupině tří králíků, se zkouška, je-li třeba, opakuje na další

skupině tří králíků až do čtyř skupin celkem, v závislosti na

získaných výsledcích. Jestliže celková odpověď první skupiny

nepřesahuje hodnotu uvedenou ve druhém sloupci tabulky

2.6.8-1, látka vyhovuje zkoušce. Jestliže celková odpověď

přesahuje hodnotu uvedenou ve druhém sloupci, ale

nedosahuje hodnotu uvedenou ve třetím sloupci tabulky,

opakuje se zkouška, jak je uvedeno výše. Jestliže celková

odpověď přesahuje hodnotu ve třetím sloupci tabulky, produkt

nevyhovuje zkoušce.

Tab. 2.6.8-1

Počet

králíků

3

6

9

12

Produkt vyhovuje,

nepřesahuje-li

celková odpověď

1,15 °C

2,80 °C

4,45 °C

6,60 °C

Produkt nevyhovuje,

přesahuje-li celková

odpověď

2,65 °C

4,30 °C

5,95 °C

6,60 °C

Králíci použití ve zkoušce na pyrogenní látky, u nichž průměrný

vzestup jejich teploty překročil 1,2 °C, se trvale

vyloučí.

Zkouška musí být provedena v souladu s požadavky Evropské

dohody o ochraně obratlovců používaných pro pokusné

nebo jiné vědecké účely (The European Convention for the

Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and

Other Scientific Purposes) tak, aby se použil co nejmenší počet

pokusných zvířat a způsobila se jim co nejmenší bolest,

utrpení, strach nebo trvalé poškození. Kdekoliv je to možné,

a po produktově specifické validaci, se zkouška na pyrogenní

látky nahradí zkouškou aktivace monocytů (2.6.30).

2.6.10 ZKOUŠKA NA PŘÍTOMNOST

HISTAMINU

6.0:20610

Morče o hmotnosti 250 g až 350 g, které bylo předchozích

24 h ponecháno bez krmiva, se šetrně usmrtí. Po usmrcení se

odejme distální část tenkého střeva v délce 2 cm a vymyje se

šetrně pomocí stříkačky dále popsaným roztokem B. Na oba

konce střevního segmentu se připevní tenká nit a uprostřed

střeva se provede malá příčná incize. Vloží se na dno orgánové

lázně o objemu 10 ml až 20 ml naplněné roztokem B, který se

udržuje při stálé teplotě (34 °C až 36 °C) a probublává se směsí

95 % (V/V) kyslíku a 5 % (V/V) oxidu uhličitého. Jedna nit

se připojí ke dnu orgánové lázně a druhá se napojí na izotonický

snímač kontrakcí, které se registrují pomocí kymografu nebo

jiným vhodným kontinuálním zapisovačem. Při použití páky

má být její délka taková, aby se pohyb orgánu zvětšil asi

dvacetkrát. Napnutí střeva má být asi 9,8 mN (1 g) a mělo by

být upraveno podle citlivosti orgánu. Orgánová lázeň se vypláchne

roztokem B a nechá se 10 min stabilizovat. Po následném

dvoj- až trojnásobném propláchnutí roztokem B se vyvolají

stahy střeva přidáváním roztoku histamin-dihydrochloridu

R v odměřených objemech mezi 0,2 ml až 0,5 ml,

aby se zjistila dávka, která způsobí reprodukovatelnou submaximální

kontrakci. Tato dávka se nazývá „dávka vysoká“.

Před každým přidáním histaminu se lázeň třikrát propláchne

roztokem B (přednostně přelitím bez vyprázdnění lázně).

Dávky se podávají v pravidelných intervalech umožňujících

úplnou relaxaci střevního segmentu (asi 2 min).

Určí se dávka zvaná „nízká“ tím, že se do lázně přidává

roztok histamin-dihydrochloridu R ve větším zředění (ale

ve stejných objemech) tak, aby se dosáhla reprodukovatelná

kontrakce střevního segmentu přibližně poloviční ve

srovnání s dávkou „vysokou“. V dalším postupu se pravidelně

střídá podávání „vysoké“ a „nízké“ dávky roztoku

histaminu s podáním zkoušené látky, jejíž koncentrace se

upravuje tak, aby vyvolaná kontrakce střeva (pokud je vůbec

pozorovatelná) byla menší než stah po „vysoké dávce“

histaminu. Kontrakce střeva po zkoušené látce mají být reprodukovatelné

a odpověď po „vysoké“ i „nízké“ dávce

histaminu má v průběhu sledování zůstat nezměněna.

Účinnost zkoušené látky se vypočítá v mikrogramech báze

histaminu ze zředění stanoveného výše. Tato hodnota nemá

přesáhnout limit uvedený v lékopisném článku.

Jestliže zkoušený roztok nevyvolá žádný stah střeva, připraví

se čerstvý roztok zkoušené látky s přidaným histaminem

v množství, které představuje povolené maximum pro

zkoušenou látku podle lékopisného článku, a pozoruje se,

zda po přidání do lázně odpovídá kontrakce střeva přidanému

histaminu. Jestliže tomu tak není nebo není-li kontrakce

vyvolaná zkoušeným roztokem reprodukovatelná,

nebo jsou-li následné odpovědi na „vysokou“ a „nízkou“

dávku histaminu sníženy, výsledky zkoušky nejsou hodnotitelné

a musí se provést Zkouška na hypotenzivní látky

(2.6.11).

Roztok A: chlorid sodný

chlorid draselný


chlorid hořečnatý

hydrogenfosforečnan sodný

dodekahydrát

voda pro injekci R

Roztok B: roztok A

atropin-sulfát

hydrogenuhličitan sodný

glukosa monohydrát

voda pro injekci R

160,0 g

4,0 g

2,0 g

1,0 g

0,10 g

do 1000 ml

50,0 ml

0,5 mg

1,0 g

0,5 g

do 1000 ml

Roztok B se má připravovat vždy čerstvý pro spotřebu do 24 h.

2.6.11 ZKOUŠKA NA HYPOTENZIVNÍ

LÁTKY

6.0:20611

Zkouška se provádí na kočce o hmotnosti nejméně 2 kg anestezované

chloralosou nebo barbiturátem tak, aby se dosáhlo

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 287

2.6.12 MIKROBIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ NESTERILNÍCH PRODUKTŮ: STANOVENÍ POČTU MIKROORGANISMŮ

udržení stálého krevního tlaku. Zvíře se chrání před poklesem

tělesné teploty a udržuje se tak, aby rektální teplota zůstávala

ve fyziologickém rozmezí. Do průdušnice se zavede

kanyla. Další kanyla, naplněná heparinizovaným roztokem

chloridu sodného (9 g/l), se zavede do arteria carotis

communis a připojí se k zařízení umožňujícímu kontinuálně

zaznamenávat krevní tlak. Do vena femoralis se zavede třetí

kanyla, naplněná také heparinizovaným roztokem chloridu

sodného (9 g/l), kterou se vstřikují roztoky histaminu a zkoušené

látky. Citlivost zvířete na histamin se stanoví v pravidelných

intervalech intravenózním podáním histaminu RS

v dávkách, které odpovídají 0,1 µg a 0,15 µg báze histaminu

na kilogram tělesné hmotnosti. Nižší dávka se opakuje nejméně

třikrát. Druhé a následující podání se uskuteční alespoň

1 min po návratu krevního tlaku na hodnotu, která byla těsně

před předchozím podáním. Zvíře se použije ke zkoušce jedině

tehdy, jestliže se po nižší dávce docílí zřetelně rozeznatelný

pokles krevního tlaku, který je stálý, a jestliže vyšší dávka

vyvolá větší odpovědi. Zkoušená látka se rozpustí v dostatečném

množství roztoku chloridu sodného (9 g/l) na předepsanou

koncentraci. Intravenózně se podá 1,0 ml histaminu

RS na kilogram tělesné hmotnosti a potom postupně dvě

dávky předepsaného množství zkoušeného roztoku a nakonec

opět 1,0 ml histaminu RS. Druhé, třetí a čtvrté podání se

provedou nejméně 1 min po návratu krevního tlaku na hodnotu,

která byla těsně před předchozím podáním. Tyto série

podání se dvakrát opakují a zkouška se ukončí podáním

1,5 ml histaminu RS na kilogram tělesné hmotnosti.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže odpověď na dávku 1,5 ml

histaminu RS na kilogram tělesné hmotnosti je větší než na

dávku 1,0 ml. Zkoušená látka nevyhovuje, jestliže průměr

odpovědí na látku je větší než průměr odpovědí na 1,0 ml

histaminu RS na kilogram tělesné hmotnosti nebo jestliže

některá odpověď na látku vyvolá větší pokles než konečná

dávka roztoku histaminu. Zvíře se nesmí použít k další

zkoušce na hypotenzivní látky, jestliže nastalo druhé kritérium

nebo jestliže odpověď na vyšší dávku histaminu podanou

po zkoušené látky byla nižší než průměr odpovědí na

předchozí nižší dávky histaminu.

2.6.12 MIKROBIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ

NESTERILNÍCH PRODUKTŮ:

STANOVENÍ POČTU

1

MIKROORGANISMŮ

6.8:20612

Synonymum. Mikrobiologické zkoušení nesterilních

výrobků: stanovení počtu mikroorganismů

1 ÚVOD

Dále popsané zkoušky mají umožnit kvantitativní vyjádření

mezofilních bakterií a hub, které mohou růst v aerobních

podmínkách.

Zkoušky jsou navrženy především ke zjištění, zda látka nebo

přípravek vyhovuje stanovené specifikaci mikrobiologické

jakosti. Pokud se zkoušky používají pro takovéto účely, postupuje

se podle následujících pokynů, včetně počtu odebraných

vzorků a dále uvedeného vyhodnocení výsledků.

Tyto metody se nemohou použít pro produkty, které obsahují

životaschopné mikroorganismy jako aktivní složky.

Mohou se použít alternativní mikrobiologické postupy,

včetně automatických metod, za předpokladu, že se prokáže,

že jsou rovnocenné metodám uvedeným v lékopisu.

2 OBECNÉ POSTUPY

Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilou

mikrobiální kontaminaci zkoušeného produktu. Musí se přijmout

taková opatření vylučující kontaminaci, aby nepůsobila

na prokazované mikroorganismy.

Jestliže má zkoušený produkt protimikrobní účinky, odstraní

se, nebo se neutralizují přiměřeným způsobem. Používají-li

se k tomuto účelu inaktivující látky, prokáže se jejich

účinek a také, že nejsou toxické pro mikroorganismy.

Pokud se pro přípravu vzorku používají povrchově aktivní

látky, prokáže se, že nejsou toxické pro mikroorganismy,

a také se musí prokázat jejich kompatibilita s inaktivačními

látkami.

3 METODY PRO STANOVENÍ POČTU

Použije se metoda membránové filtrace, nebo metoda počítání

na pevných půdách, jak je předepsáno. Metoda nejpravděpodobnějšího

počtu (MPN) je obecně nejméně přesná

pro stanovení mikrobiálního počtu, nicméně pro určité

skupiny produktů s velmi nízkou mikrobiologickou zátěží

může být nejvhodnější.

Výběr metody se zakládá na faktorech, jako je povaha produktu

a požadovaný počet mikroorganismů. Zvolená metoda

musí umožnit zkoušení dostatečného množství vzorku

k posouzení shody se specifikací. Musí se prokázat vhodnost

zvolené metody.

4 ZKOUŠKA RŮSTOVÝCH VLASTNOSTÍ PŮD,

VHODNOSTI METODY STANOVENÍ POČTU

A NEGATIVNÍ KONTROLY

4-1 OBECNÁ USTANOVENÍ

Musí se prokázat schopnost zkoušky detekovat mikroorganismy

v přítomnosti zkoušeného produktu.

Jestliže dojde ve zkušebním postupu nebo u produktu ke

změně, která by mohla ovlivnit výsledek uvedené zkoušky,

musí se potvrdit její vhodnost.

4-2 PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍCH KMENŮ

Použije se standardizovaná stabilní suspenze zkušebních

kmenů nebo se připraví, jak je uvedeno dále. Použijí se udržovací

kultivační metody (využívající systému jednotné

inokulace) tak, že životaschopné mikroorganismy použité

k inokulaci neprošly více než pěti pasážemi z původního

matečného inokula. Každý bakteriální kmen a kmen hub se

kultivuje zvlášť, jak je uvedeno v tabulce 2.6.12-1.

K přípravě zkušební suspenze se použije tlumivý roztok

chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo tlumivý roztok

fosforečnanový o pH 7,2; pro přípravu suspenze spór Aspergillus

brasiliensis se k tlumivému roztoku může přidat roztok

polysorbátu 80 (0,05%). Tyto suspenze se použijí do 2 h nebo

do 24 h, pokud jsou uchovávány při 2 °C až 8 °C.

Jako alternativní možnost pro přípravu a následující ředění

čerstvé suspenze vegetativních buněk A. brasiliensis nebo

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


288 ČL 2017 – Dopl. 2020


B. subtilis se může připravit stálá (zásobní) suspenze spór

a následně použít vhodný objem k inokulaci. Stálá (zásobní)

suspenze spór se může uchovávat při 2 °C až 8 °C po

dobu stanovenou validací.

4-3 NEGATIVNÍ KONTROLA

K ověření podmínek zkoušky se místo zkoušeného přípravku

použije jako negativní kontrola zvolené ředidlo. Nesmí

se pozorovat růst mikroorganismů. Negativní kontrola se

také použije, jestliže se provádí zkoušení podle odstavce 5.

Selžou-li negativní kontroly, požaduje se prošetření.

4-4 RŮSTOVÉ VLASTNOSTI PŮD

Zkouší se každá šarže hotových půd a každá šarže půd připravených

buď z dehydratovaného základu, nebo z jednotlivých

předepsaných složek.

Části/misky s tekutou půdou s hydrolyzáty sóji a kaseinu

a agarové půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se inokulují

malým počtem (nejvýše 100 CFU) mikroorganismů uvedených

v tabulce 2.6.12-1 tak, že se použije samostatná

část/miska s živnou půdou pro každý z nich. Misky se Sabouraudovým

glukosovým agarem se inokulují malým počtem

(nejvýše 100 CFU) mikroorganismů uvedených

v tabulce 2.6.12-1 tak, že se použije samostatná miska

s živnou půdou pro každý z nich. Inkubuje se za podmínek

uvedených v tabulce 2.6.12-1.

Růst získaný na pevných půdách se nesmí lišit více než

o faktor 2 od hodnot vypočítaných ze standardizovaného

inokula. Pro čerstvě připravené inokulum je růst mikroorganismů

srovnatelný s výsledky u předchozí zkoušené a schválené

šarže půdy. Tekuté půdy jsou vhodné, jestliže zřetelně

viditelný růst mikroorganismů je srovnatelný s růstem, který

se objevil u dříve zkoušené a schválené šarže půdy.

4-5 VHODNOST METODY STANOVENÍ POČTU

ZA PŘÍTOMNOSTI PRODUKTU

4-5-1 Příprava vzorku. Metoda přípravy vzorku závisí na

fyzikálních vlastnostech zkoušeného produktu. Jestliže žádný

z dále uvedených postupů není prokazatelně dostačující,

musí se vyvinout alternativní postup.

Produkty rozpustné ve vodě. Zkoušený produkt se rozpustí

nebo zředí (obvykle se připraví ředění 1 : 10) v tlumivém

roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0, tlumivém

roztoku fosforečnanovém o pH 7,2, nebo v tekuté půdě

s hydrolyzáty sóji a kaseinu. Pokud je třeba, upraví se pH

na hodnotu 6 až 8. Další ředění, je-li třeba, se připraví za

použití stejného ředidla.

Nelipidické produkty nerozpustné ve vodě. Zkoušený produkt

se suspenduje (obvykle se připraví ředění 1 : 10) v tlumivém

roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0, tlumivém

roztoku fosforečnanovém o pH 7,2, nebo v tekuté

půdě s hydrolyzáty sóji a kaseinu. Může se přidat povrchově

aktivní látka, jako je např. roztok polysorbátu 80 (1 g/l),

pro usnadnění tvorby suspenze špatně smáčivých látek. Pokud

je třeba, upraví se pH na hodnotu 6 až 8. Další ředění,

je-li třeba, se připraví za použití stejného ředidla.

Lipidické produkty. Zkoušený produkt se rozpustí v isopropyl-myristátu

sterilizovaném membránovou filtrací nebo se

smíchá s minimálním množstvím sterilního polysorbátu 80

nebo jiné povrchově aktivní látky, která nemá inhibiční

vlastnosti, v případě potřeby se zahřeje nejvýše na 40 °C,

ve výjimečných případech nejvýše na 45 °C. Opatrně se

promíchá a, je-li třeba, udržuje se při této teplotě ve vodní

lázni. Přidá se dostatek předehřátého zvoleného ředidla, aby

se připravilo ředění původního produktu 1 : 10. Za udržované

teploty a v co nejkratší nezbytné době se opatrně promíchá

tak, aby vznikla emulze. Pro vytvoření dalšího desetinásobného

ředění se může použít zvolené ředidlo obsahující

vhodnou koncentraci sterilního polysorbátu 80 nebo jiné

sterilní povrchově aktivní látky, která nemá inhibiční

vlastnosti.

Tekuté nebo pevné látky ve formě aerosolu. Produkt se

asepticky přenese na zařízení pro membránovou filtraci nebo

do sterilní nádoby pro další vzorkování. Použije se buď

celý obsah nádoby, nebo definovaný počet měřitelných dávek

z každé zkoušené nádoby.

Transdermální náplasti. Odstraní se ochranná krycí fólie

transdermálních náplastí a umístí se lepivou vrstvou nahoru

na sterilní sklo nebo podložku z plastu. Lepivý povrch se

pokryje sterilním porézním materiálem, např. sterilní gázou,

aby nedošlo ke slepení náplastí a přemístí se do vhodného

objemu zvoleného rozpouštědla, které obsahuje inaktivující

látky, jako je polysorbát 80 a/nebo lecithin. Přípravek

se nejméně 30 min silně protřepává.

4-5-2 Inokulace a ředění. Ke vzorku připravenému, jak je

popsáno výše (4-5-1), a ke kontrole (která neobsahuje

zkoušený materiál) se přidá dostatečný objem mikrobiální

suspenze, aby se získalo inokulum, které obsahuje nejvýše

100 CFU. Objem přidané suspenze by neměl překročit 1 %

objemu ředěného produktu.

K potvrzení přijatelného mikrobiálního záchytu z produktu

se musí pro zkoušku použít nejnižší možné ředění. Tam,

kde to není kvůli protimikrobnímu účinku nebo špatné rozpustnosti

možné, musí se vyvinout další vhodné postupy.

Pokud nelze u vzorku odstranit inhibici růstu jinak, může se

přidat odpovídající množství mikrobiální suspenze po neutralizaci,

ředění nebo filtraci.

4-5-3 Neutralizace/odstranění protimikrobních účinků.

Počet mikroorganismů získaných z připraveného vzorku

zředěného podle odstavce 4-5-2 a inkubovaného následujícím

postupem uvedeným v odstavci 4-5-4 se porovná s počtem

mikroorganismů získaných z kontrolního stanovení.

Jestliže je růst inhibován (snížení je vyšší než o faktor 2),

postup pro konkrétní zkoušku se upraví, aby se zajistila validita

výsledků. Úprava postupu může zahrnovat např.

(1) zvětšení objemu ředidla nebo kultivační půdy,

(2) přidání specifikovaných nebo obecných neutralizačních

látek do rozpouštědla,

(3) membránovou filtraci nebo

(4) kombinaci těchto opatření.

Neutralizační činidla. Neutralizační činidla se mohou

použít k neutralizaci protimikrobních látek (viz tabulku

2.6.12-2). Mohou se přidat ke zvolenému ředidlu nebo

k živné půdě, přednostně před sterilizací. Jestliže se použijí,

musí se prokázat jejich účinek a že nejsou toxické pro mikroorganismy

pomocí slepé zkoušky s neutralizačním činidlem

a bez produktu.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 289


Tab. 2.6.12-1 Příprava a použití zkušebních mikroorganismů

Mikroorganismus

Příprava

zkušebního

kmene

Růstové vlastnosti

Celkový počet

aerobních

mikroorganismů

Celkový

počet

kvasinek

a plísní

Vhodnost metody stanovení počtu

v přítomnosti produktu

Celkový počet

aerobních

mikroorganismů

Celkový

počet

kvasinek

a plísní

Staphylococcus aureus,

jako např.

ATCC 6538

NCIMB 9518

CIP 4.83

NBRC 13276

CCM 4516

CNCTC 5887

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu nebo

tekutá půda

s hydrolyzáty sóji

a kaseinu

30 °C až 35 °C

18 h až 24 h

agar s hydrolyzáty


tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu/MPN

tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

Pseudomonas aeruginosa,

jako např.

ATCC 9027

NCIMB 8626

CIP 82.118

NBRC 13275

CCM 1961

CNCTC 5664

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

nebo tekutá půda


a kaseinu

30 °C až 35 °C

18 h až 24 h

agar s hydrolyzáty


tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

agar s hydrolyzáty


tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu/MPN

tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu/MPN

tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

Bacillus subtilis,

jako např.

ATCC 6633

NCIMB 8054

CIP 52.62

NBRC 3134

CCM 1999

CNCTC 5610

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

nebo tekutá půda


a kaseinu

30 °C až 35 °C

18 h až 24 h

–

–

Candida albicans,

jako např.

ATCC 10231

NCPF 3179

IP 48.72

NBRC 1594

CCM 8215

CNCTC 5361

Aspergillus brasiliensis,

jako např.

ATCC 16404

IMI 149007

IP 1431.83

NBRC 9455

CCM 8222

Sabouraudův glukosový

agar nebo

tekutá Sabouraudova

glukosová

půda

20 °C až 25 °C

2 až 3 dny

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

Sabouraudův

glukosový

agar

£ 100 CFU

20 °C až

25 °C

£ 5 dnů

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

MPN nelze použít

Sabouraudův

glukosový

agar

£ 100 CFU

20 °C až

25 °C

£ 5 dnů


agar nebo

bramborovoglukosový

agar

20 °C až 25 °C

5 až 7 dnů nebo až

se dosáhne

sporulace

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

Sabouraudův

glukosový

agar

£ 100 CFU

20 °C až

25 °C

£ 5 dnů

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

MPN nelze použít

Sabouraudův

glukosový

agar

£ 100 CFU

20 °C až

25 °C

£ 5 dnů

Pokud nelze nalézt vhodnou metodu neutralizace, může se

předpokládat, že nezdar izolace inokulovaných organismů

lze přičíst protimikrobnímu účinku produktu. Toto zjištění

ukazuje na skutečnost, že u produktu není pravděpodobná

kontaminace daným druhem mikroorganismu. Je však

možné, že produkt pouze inhibuje některé ze zde uvedených

mikroorganismů, ale neinhibuje jiné, které nejsou zahrnuty

mezi zkoušenými kmeny nebo pro které tento seznam

není reprezentativní. V tom případě se připraví

zkouška s nejvyšším ředěním (ředicím faktorem), které je

slučitelné s mikrobiálním růstem a specifikovanými kritérii

přijatelnosti.

4-5-4 Záchyt mikroorganismů v přítomnosti produktu.

Pro každý z mikroorganismů uvedených v seznamu se provede

samostatná zkouška. Spočítají se pouze mikroorganismy

přidaných zkušebních kmenů.

4-5-4-1 Membránová filtrace. Použijí se membránové filtry

o velikosti pórů nejvýše 0,45 µm. Typ membránového filtru

se zvolí tak, aby jeho účinek zachycení bakterie nebyl ovliv-

290 ČL 2017 – Dopl. 2020


Tab. 2.6.12-2 Obvyklá neutralizační činidla pro interferující

látky

Interferující látka

glutaraldehyd, sloučeniny

rtuti

fenoly, ethanol, aldehydy,

sorbát

aldehydy

kvartérní amoniové

sloučeniny, parabeny,

bisbiguanidy

kvartérní amoniové

sloučeniny, jod, parabeny

sloučeniny rtuti

sloučeniny rtuti, halogeny,

aldehydy

EDTA (kyselina edetová,

edetát)

Možná metoda

neutralizace

hydrogensiřičitan sodný

ředění

glycin

lecithin

polysorbát

thioglykolát

thiosíran

ionty Mg 2+ nebo Ca 2+

něn složkami zkoušeného vzorku. Pro každý mikroorganismus

uvedený v seznamu se použije jeden membránový filtr.

Vhodné množství vzorku připraveného podle odstavců 4-5-1

až 4-5-3 (nejlépe odpovídající 1 g produktu, nebo méně, pokud

se očekávají větší počty jednotek vytvářejících kolonie)

se přenese na membránový filtr, ihned se zfiltruje a membránový

filtr se promyje odpovídajícím objemem ředidla.

Pro určení celkového počtu aerobních mikroorganismů

(TAMC) se membránový filtr přenese na povrch agarové

půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu. Pro zjištění celkového počtu

kvasinek/plísní (TYMC) se membránový filtr přenese na

povrch Sabouraudova glukosového agaru. Plotny se inkubují,

jak je uvedeno v tabulce 2.6.12-1. Spočítají se kolonie.

4-5-4-2 Metoda počítání na pevných půdách. Pro metodu

počítání na pevných půdách se připraví nejméně dvě misky

pro každou živnou půdu a vypočítá se průměr.

4-5-4-2-1 Metoda zalévání do agaru. Použijí se Petriho misky

o průměru 9 cm, do každé se přidá 1 ml vzorku připraveného,

jak je popsáno v odstavcích 4-5-1 až 4-5-3, a 15 ml

až 20 ml agaru s hydrolyzáty sóji a kaseinu nebo Sabouraudova

glukosového agaru, obě živné půdy zahřáté nejvýše na

45 °C. Použijí-li se větší Petriho misky, zvětší se přiměřeně

i objem agarové půdy. Pro každý mikroorganismus uvedený

v tabulce 2.6.12-1 se použijí nejméně dvě Petriho misky.

Inkubují se, jak je stanoveno v tabulce 2.6.12-1. Stanoví se

aritmetický průměr pro každou půdu a vypočítá se počet

jednotek vytvářejících kolonie v původním inokulu.

4-5-4-2-2 Metoda inokulace na povrch agarové půdy. Použijí

se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 15 ml až

20 ml agarové půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu nebo Sabouraudova

glukosového agaru, obě zahřáté asi na 45 °C a nechá

se ztuhnout. Jestliže se použijí větší Petriho misky, zvětší se

přiměřeně i objem agarové půdy. Povrch půd se nechá zaschnout,

např. v laminárním boxu nebo v termostatu. Pro

každý mikroorganismus uvedený v tabulce 2.6.12-1 se použijí

dvě Petriho misky. Odměřený objem, nejméně však

0,1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavcích

4-5-1 až 4-5-3, se rozetře na povrch půdy. Inkubuje se

a výsledky se vypočítají podle odstavce 4-5-4-2-1.

4-5-4-3 Metoda nejpravděpodobnějšího počtu (MPN).

Správnost a přesnost této metody je menší než u metody

membránové filtrace nebo metody počítání na pevných půdách.

Nespolehlivé výsledky se získávají zejména při počítání

plísní. Z těchto důvodů se metoda MPN používá pro

výpočet celkového počtu bakterií (TAMC) v případě, kdy

nelze provést žádnou jinou metodu. Je-li použití této metody

zdůvodněné, postupuje se následujícím způsobem.

Připraví se řada nejméně tří následujících desetinásobných

ředění produktu, jak je popsáno v odstavcích 4-5-1 až 4-5-3.

Z každého ředění se použijí tři stejné dávky, buď 1 g, nebo

1 ml k inokulaci do tří zkumavek s 9 ml až 10 ml tekuté půdy

s hydrolyzáty sóji a kaseinu. Je-li třeba, může se k půdě přidat

povrchově aktivní látka, jako je polysorbát 80 nebo jiná

látka inaktivující protimikrobní účinky. Pokud jsou připraveny

tři stupně ředění, inokuluje se devět zkumavek.

Všechny zkumavky se nejvýše 3 dny inkubují při 30 °C až

35 °C. Jestliže odečítání výsledků je obtížné nebo nejisté

vzhledem k povaze zkoušeného produktu, inokuluje se do

stejné půdy nebo na agar s hydrolyzáty sóji a kaseinu

a inkubuje se 1 den až 2 dny při stejné teplotě; tyto výsledky

se použijí. Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů

v gramu nebo v mililitru zkoušeného produktu se stanoví

z tabulky 2.6.12-3.

4.6 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

Jestliže se ověřuje vhodnost metody membránové filtrace

nebo metody počítání na pevných půdách, nesmí se získaný

průměrný počet žádného zkoušeného mikroorganismu lišit

o faktor větší než 2 od kontrolní hodnoty určené v odstavci

4-5-2 v nepřítomnosti produktu. Pokud se ověřuje vhodnost

metody nejpravděpodobnějšího počtu (MPN), pak vypočítaná

hodnota z inokula musí být v 95% mezích spolehlivosti

výsledku získaného z kontrolní zkoušky.

Pokud není možné splnit výše uvedené požadavky pro jeden

nebo více zkoušených organismů žádnou z uvedených

metod, použije se metoda a podmínky zkoušení produktu

nejbližší těmto požadavkům.

5 ZKOUŠENÍ PRODUKTU

5-1 MNOŽSTVÍ POUŽITÉ KE ZKOUŠCE

Není-li předepsáno jinak, použije se 10 g nebo 10 ml zkoušeného

produktu podle podmínek uvedených výše. Pro kapalné

nebo pevné látky ve formě aerosolu se použije 10 obalů.

Pro zkoušku transdermálních náplastí se použije 10 kusů.

U léčivých látek může být zkoušené množství sníženo za

následujících podmínek: množství na jednotku lékové formy

(např. tableta, tobolka, injekce) je menší nebo rovno

1 mg nebo množství v gramu nebo mililitru (pro přípravky,

které nejsou ve formě dávkových jednotek) je menší než

1 mg. V těchto případech není zkoušené množství menší

než množství deseti dávkových jednotek nebo 10 g nebo

10 ml produktu.

Pro materiály, které se používají jako léčivé látky, kde je

množství vzorku omezeno nebo velikost šarže je výrazně

malá (tj. méně než 1000 ml nebo 1000 g), může být zkoušené

množství rovno 1 % šarže, pokud není předepsáno

nebo zdůvodněno a schváleno menší množství.

Pro produkty, u kterých je celkový počet jednotek (entit)

v šarži menší než 200 (např. vzorky, které se používají

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 291


v klinických zkouškách), může být množství vzorku sníženo

na dvě jednotky, nebo na jednu jednotku, jestliže je velikost

šarže menší než 100.

Vzorky se vybírají náhodně z nerozplněného materiálu nebo

z dostupných obalů přípravků. K získání požadovaného

množství pro vytvoření vzorku se smíchá obsah dostatečného

počtu obalových jednotek.

5-2 ZKOUŠKA PRODUKTU

5-2-1 Membránová filtrace

Použije se filtrační přístroj, který je navržen tak, aby umožnil

přenést filtr na živnou půdu. Vzorek se připraví vhodnou

metodou uvedenou v odstavci 4 a přiměřené množství

se přenese na každý ze dvou membránových filtrů a ihned

se zfiltruje. Každý filtr se vhodným způsobem promyje.

Pro stanovení celkového počtu aerobních mikroorganismů

(TAMC) se přenese jeden z membránových filtrů na povrch

agarové půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu. Pro stanovení

celkového počtu kvasinek a plísní (TYMC) se přenese druhý

membránový filtr na povrch Sabouraudova glukosového

agaru. Misky agarové půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se

inkubují 3 dny až 5 dnů při 30 °C až 35 °C a misky se Sabouraudovým

glukosovým agarem 5 dnů až 7 dnů při 20 °C

až 25 °C. Počet jednotek vytvářejících kolonie se přepočítá

na gram nebo mililitr produktu.

Pokud se zkoušejí transdermální náplasti, zfiltruje se 10 %

objemu výtřepku popsaného v odstavci 4-5-1 odděleně přes

každý ze dvou membránových filtrů. Jeden z membránových

filtrů se přenese na povrch agarové půdy s hydrolyzáty

sóji a kaseinu pro stanovení celkového počtu aerobních

mikroorganismů (TAMC) a druhý membránový filtr na povrch

Sabouraudova glukosového agaru pro stanovení celkového

počtu kvasinek a plísní (TYMC).

5-2-2 Počítání na pevných půdách

5-2-2-1 Metoda zalévání do agaru. Vzorek se připraví

vhodným postupem uvedeným v odstavci 4. Pro každou půdu

se připraví nejméně dvě Petriho misky pro každý stupeň

ředění. Misky s agarovou půdou s hydrolyzáty sóji a kaseinu

se inkubují 3 dny až 5 dnů při 30 °C až 35 °C a misky se

Sabouraudovým glukosovým agarem 5 dnů až 7 dnů při

20 °C až 25 °C. Vyberou se misky odpovídající jednomu

ředění a ukazující nejvyšší počet kolonií, který však nepřesahuje

250 pro stanovení celkového počtu aerobních mikroorganismů

(TAMC) a 50 pro stanovení celkového počtu

kvasinek a plísní (TYMC). Z aritmetického průměru počtů

na živnou půdu se vypočítá množství jednotek vytvářejících

kolonie na gram nebo mililitr produktu.

5-2-2-2 Metoda inokulace na povrch agarové půdy. Vzorek

se připraví vhodným postupem uvedeným v odstavci 4. Pro

každou půdu se připraví nejméně dvě Petriho misky pro

každý stupeň ředění. Inkubace a výpočet jednotek vytvářejících

kolonie se provede postupem uvedeným pro metodu

zalévání do agaru.

5-2-3 Metoda nejpravděpodobnějšího počtu

Vzorek se připraví a zředí vhodným postupem uvedeným

v odstavci 4. Všechny zkumavky se inkubují 3 dny až

5 dnů při 30 °C až 35 °C. Jestliže je nezbytná subkultivace,

provede se vhodným postupem. Pro každý stupeň ředění se

Zjištěná kombinace počtu

zkumavek vykazujících

růst v každé sérii ředění

Množství produktu

v gramech nebo

v mililitrech ve zkumavce

0,1 0,01 0,001

Tab. 2.6.12-3 Hodnoty nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů

Nejpravděpodobnější

počet

v gramu nebo

v mililitru

produktu

95% meze

spolehlivosti

0 0 0 < 3 0–9,4

0 0 1 3 0,1–9,5

0 1 0 3 0,1–10

0 1 1 6,1 1,2–17

0 2 0 6,2 1,2–17

0 3 0 9,4 3,5–35

1 0 0 3,6 0,2–17

1 0 1 7,2 1,2–17

1 0 2 11 4–35

1 1 0 7,4 1,3–20

1 1 1 11 4–35

1 2 0 11 4–35

1 2 1 15 5–38

1 3 0 16 5–38

2 0 0 9,2 1,5–35

2 0 1 14 4–35

2 0 2 20 5–38

2 1 0 15 4–38

2 1 1 20 5–38

2 1 2 27 9–94

2 2 0 21 5–40

2 2 1 28 9–94

2 2 2 35 9–94

2 3 0 29 9–94

2 3 1 36 9–94

3 0 0 23 5–94

3 0 1 38 9–104

3 0 2 64 16–181

3 1 0 43 9–181

3 1 1 75 17–199

3 1 2 120 30–360

3 1 3 160 30–380

3 2 0 93 18–360

3 2 1 150 30–380

3 2 2 210 30–400

3 2 3 290 90–990

3 3 0 240 40–990

3 3 1 460 90–1980

3 3 2 1100 200–4000

3 3 3 > 1100

292 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.13 MIKROBIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ NESTERILNÍCH PRODUKTŮ: ZKOUŠKY NA SPECIFIKOVANÉ MIKROORGANISMY

zaznamená počet zkumavek, které vykazují mikrobiální

růst. Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů v gramu

nebo mililitru zkoušeného produktu se určí z tabulky

2.6.12-3.


Za celkový počet aerobních mikroorganismů (TAMC) se

považuje množství rovné počtu jednotek vytvářejících kolonie

nalezených na agarové půdě s hydrolyzáty sóji a kaseinu;

pokud jsou na této půdě nalezeny kolonie hub, jejich

počet tvoří součást TAMC. Za celkový počet kvasinek/plísní

(TYMC) se považuje počet jednotek vytvářejících kolonie

nalezených na Sabouraudově glukosovém agaru; pokud

jsou na této živné půdě nalezeny bakterie, počítají se

jako součást TYMC. Pokud se předpokládá, že kritéria přijatelnosti

pro TYMC mohou být překročena z důvodu bakteriálního

růstu, může se použít Sabouraudův glukosový

agar s antibiotiky. Jestliže se počet stanovuje metodou nejpravděpodobnějšího

počtu (MPN), vypočítaná hodnota je

TAMC.

Pokud jsou stanovena kritéria přijatelnosti mikrobiologické

jakosti, interpretují se následovně:

– 10 1 CFU: nejvyšší přijatelný počet = 20;


– 10 3 CFU: nejvyšší přijatelný počet = 2000 atd.

Doporučené roztoky a živné půdy jsou popsány v obecné

stati 2.6.13.


NESTERILNÍCH PRODUKTŮ:

ZKOUŠKY NA SPECIFIKOVANÉ

1

MIKROORGANISMY

6.7:20613

Synonymum: Mikrobiologické zkoušení nesterilních

výrobků: zkoušky na specifikované mikroorganismy

1 ÚVOD

Dále popsané zkoušky umožní určit nepřítomnost nebo limitovaný

výskyt specifikovaných mikroorganismů, které se

mohou za daných podmínek detekovat.

Zkoušky se navrhují především tak, aby se určilo, zda látka

nebo přípravek odpovídá stanovené specifikaci mikrobiologické

jakosti. Pokud se použijí k těmto účelům, postupuje

se podle dále uvedených instrukcí, včetně počtu odebíraných

vzorků a vyhodnocení výsledků.

Mohou se použít alternativní mikrobiologické postupy včetně

automatických metod za předpokladu, že se prokáže jejich

srovnatelnost s lékopisnou metodou.

2 OBECNÉ POSTUPY

Příprava vzorků se provádí tak, jak je popsáno v obecné

stati 2.6.12.

Jestliže má zkoušený produkt protimikrobní účinky, odstraní

se nebo se neutralizují, jak je popsáno v obecné stati 2.6.12.

Pokud se pro přípravu vzorku použijí povrchově aktivní

látky, musí se prokázat jejich neškodnost pro mikroorganismy

a jejich slučitelnost s použitými inaktivátory, a to

způsobem popsaným v obecné stati 2.6.12.

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


3 RŮSTOVÉ A INHIBIČNÍ VLASTNOSTI

ŽIVNÝCH PŮD, VHODNOST ZKOUŠKY


Musí se stanovit schopnost zkoušky detekovat mikroorganismy

v přítomnosti zkoušeného produktu. Jestliže dojde

ve zkušebním postupu nebo u produktu ke změně, která

by mohla ovlivnit výsledek zkoušky, musí se potvrdit její

vhodnost.



kmenů nebo se připraví tak, jak je uvedeno dále. Použijí se

udržovací kultivační metody (využívající systému jednotné



matečného inokula.

3-1-1 Aerobní mikroorganismy. Každý zkušební bakteriální

kmen se kultivuje samostatně v tekuté půdě s hydrolyzáty

sóji a kaseinu nebo na agarové půdě s hydrolyzáty sóji

a kaseinu 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C. Candida albicans

se kultivuje samostatně na Sabouraudově glukosovém

agaru a nebo v tekuté Sabouraudově glukosové půdě 2 dny

až 3 dny při 20 °C až 25 °C.

– Staphylococcus aureus, jako např. ATCC 6538,

NCIMB 9518, CIP 4.83 nebo NBRC 13276, CCM 4516,

CNCTC 5887;

– Pseudomonas aeruginosa, jako např. ATCC 9027,

NCIMB 8626, CIP 82.118 nebo NBRC 13275,

CCM 1961, CNCTC 5664;

– Escherichia coli, jako např. ATCC 8739, NCIMB 8545,

CIP 53.126 nebo NBRC 3972, CCM 4517.

– Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium,

jako např. ATCC 14028, nebo alternativní Salmonella

enterica ssp. enterica sérovar Abony, jako např.

NBRC 100797, NCTC 6017 nebo CIP 80.39, CCM 4518;

– Candida albicans, jako např. ATCC 10231, NCPF 3179,

IP 48.72 nebo NBRC 1594, CCM 8215, CNCTC 5361.

K přípravě suspenzí se použije tlumivý roztok chloridu

sodného s peptonem o pH 7,0 nebo tlumivý roztok fosforečnanový

o pH 7,2. Suspenze se použijí do 2 h nebo do

24 h, jsou-li uchovávány při 2 °C až 8 °C.

3-1-2 Klostridie. Použije se Clostridium sporogenes, jako

např. ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343,

CIP 100651) nebo ATCC 19404 (NCTC 532 nebo

CIP 79.03, CCM 4409, CNCTC 6194) nebo NBRC 14293.

Zkušební kmen klostridií se kultivuje za anaerobních podmínek

v obohacené půdě pro klostridie 24 h až 48 h při

30 °C až 35 °C. Jako alternativní možnost pro přípravu

a následující ředění čerstvé suspenze vegetativních buněk

Clostridium sporogenes se může připravit stabilní suspenze

spór a následně použít inokulaci. Stabilní suspenze spór se

může uchovávat validovanou dobu při 2 °C až 8 °C.



použije jako negativní kontrola zvolené ředidlo. Nesmí

být pozorován růst mikroorganismů. Negativní kontrola se

také použije při zkoušce přípravku podle části 4. Selžou-li

negativní kontroly, požaduje se prošetření.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 293


3-3 RŮSTOVÉ A INHIBIČNÍ VLASTNOSTI

ŽIVNÝCH PŮD

Zkouší se každá šarže hotových půd a každá šarže půd připravovaných


složek.

Vhodné vlastnosti příslušné živné půdy se ověří tak, jak je

uvedeno v tabulce 2.6.13-1.

Zkouška růstových vlastností pro tekuté živné půdy. Vhodná

část živné půdy se inokuluje malým množstvím (ne více

než 100 CFU) vhodného mikroorganismu. Inkubuje se při

určené teplotě ne déle, než je nejkratší doba stanovená pro

zkoušku. Zřetelně viditelný růst mikroorganismů je srovnatelný

s růstem, který se objevil u dříve zkoušené a schválené

šarže živné půdy.

Zkouška růstových vlastností pro pevné půdy. Použije se

metoda inokulace na povrch agarové půdy, každá plotna se

inokuluje malým množstvím (ne více než 100 CFU) vhodného

mikroorganismu. Inkubuje se při určené teplotě ne déle,

než je nejkratší doba stanovená pro zkoušku. Jasně viditelný

růst mikroorganismů je srovnatelný s růstem, který

se objevil u dříve zkoušené a schválené šarže živné půdy.

Zkouška inhibičních vlastností tekuté nebo pevné půdy. Příslušná

živná půdy se inokuluje nejméně 100 CFU vhodného

mikroorganismu. Inkubuje se při určené teplotě po dobu

ne kratší, než je nejdelší doba stanovená pro zkoušku. Nepozoruje

se žádný růst zkoušeného mikroorganismu.

Zkouška selektivních vlastností. Použije se metoda inokulace

na povrch agarové půdy, inokuluje se každá miska malým

množstvím (ne více než 100 CFU) příslušného mikroorganismu.

Inkubuje se při specifikované teplotě po dobu

stanovenou pro zkoušku. Vzhled kolonií a selektivní vlastnosti

jsou srovnatelné s výsledky získanými u dříve zkoušené

a schválené šarže půdy.

3-4 VHODNOST ZKUŠEBNÍ METODY

Pro každý zkoušený produkt se připraví vzorek podle popisu

v odpovídajícím odstavci v části 4. V průběhu míchání

vzorku se přidá každý zkušební kmen v předepsané živné

půdě. Inokuluje se jednotlivě každým zkušebním kmenem.

Použije se počet mikroorganismů odpovídající nejvýše

100 CFU v inokulovaném zkoušeném přípravku. Zkouška

se provede, jak je popsáno v odpovídajícím odstavci v části

4, a použije se nejkratší uvedená inkubační doba.

Specifikované mikroorganismy se musí detekovat selektivními

reakcemi popsanými v části 4.

Tab. 2.6.13-1 Růstové, inhibiční a selektivní vlastnosti živných půd

zkouška na gramnegativní

bakterie tolerující žluč

zkouška na Escherichia coli

zkouška na Salmonella sp.

zkouška na Pseudomonas

aeruginosa

zkouška na Staphylococcus

aureus

zkouška na Clostridia sp.

zkouška na Candida

albicans

Půda Vlastnosti Zkušební kmeny

Mosselova obohacená

tekutá půda pro

enterobakterie

žlučový agar s glukosou,

violetí krystalovou a červení

neutrální

tekutá MacConkeyova půda

růst podporující

inhibiční

růst podporující a selektivní

růst podporující

inhibiční

E. coli

P. aeruginosa

S. aureus

E. coli

P. aeruginosa

E. coli

S. aureus

MacConkeyův agar růst podporující a selektivní E. coli

Rappaportova-Vassiliadisova

obohacená tekutá půda pro

salmonely

deoxycholátový agar

s xylosou a lysinem

cetrimidový agar

mannitolový agar se solí

obohacená půda pro

klostridie

růst podporující

inhibiční


růst podporující

inhibiční


inhibiční

růst podporující

Salmonella enterica ssp. enterica

sérovar Typhimurium

nebo Salmonella enterica

ssp. enterica sérovar Abony

S. aureus

Salmonella enterica ssp. enterica

sérovar Typhimurium

nebo Salmonella enterica

ssp. enterica sérovar Abony

P. aeruginosa

E. coli

S. aureus

E. coli

Cl. sporogenes

Columbia agar růst podporující Cl. sporogenes

Sabouraudova glukosová

tekutá půda


agar

růst podporující


C. albicans

C. albicans

294 ČL 2017 – Dopl. 2020


Jakékoliv protimikrobní účinky produktu vyžadují úpravu

zkušební metody (viz část 4-5-3 obecné stati 2.6.12).

Pokud se nemohou protimikrobní vlastnosti daného produktu

neutralizovat s ohledem na mikroorganismus, pro

který je zkouška předepsána, potom lze předpokládat, že

inhibovaný mikroorganismus nebude v produktu přítomen.

4 ZKOUŠENÍ PRODUKTU

4-1 GRAMNEGATIVNÍ BAKTERIE TOLERUJÍCÍ ŽLUČ

4-1-1 Příprava vzorku a předinkubace. Připraví se vzorek

v ředění 1 : 10 za použití nejméně 1 g zkoušeného produktu,

jak je popsáno v obecné stati 2.6.12, ale jako ředicí

roztok se použije tekutá půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu,

promíchá se a inkubuje se při 20 °C až 25 °C po dobu postačující

k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich kultivaci

(obvykle 2 h, ale nejvýše 5 h).

4-1-2 Zkouška nepřítomnosti. Není-li předepsáno jinak,

použije se objem odpovídající 1 g produktu připraveného

podle odstavce 4-1-1 pro inokulaci Mosselovy obohacené

tekuté půdy pro enterobakterie. Inkubuje se 24 h až 48 h při

30 °C až 35 °C. Inokuluje se na misky se žlučovým agarem

s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální. Inkubuje

se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C. Produkt vyhovuje

zkoušce, jestliže se nepozoruje růst žádných kolonií.

4-2-2 Výběr a subkultivace. Nádoba se protřepe, 1 ml tekuté

půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se přenese do 100 ml

MacConkeyovy tekuté půdy a inkubuje se 24 h až 48 h při

42 °C až 44 °C. Inokuluje se na misky s MacConkeyovou

agarovou půdou a inkubuje se 18 h až 72 h při 30 °C až

35 °C.

4-2-3 Vyhodnocení. Růst kolonií znamená možnou přítomnost

E. coli. To se potvrzuje identifikačními zkouškami.

Produkt vyhovuje zkoušce, jestliže nejsou přítomny žádné

kolonie nebo identifikační zkoušky jsou negativní.

4-3 SALMONELLA

4-3-1 Příprava vzorku a předinkubace. Zkoušený produkt

se připraví, jak je popsáno v obecné stati 2.6.12 a použije

se množství odpovídající nejméně 10 g nebo 10 ml

k inokulaci vhodného množství (určeného podle odstavce

3-4) tekuté půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu, promíchá se

a inkubuje se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

4-3-2 Výběr a subkultivace. 0,1 ml tekuté půdy s hydrolyzáty

sóji a kaseinu se přenese do 10 ml Rappaportovy-

-Vassiliadisovy obohacené tekuté půdy pro salmonely a inkubuje

se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C. Inokuluje se na

misky s deoxycholátovým agarem s xylosou a lysinem. Inkubuje

se 18 h až 48 h při 30 °C až 35 °C.

Zkušební

metody

2.6

4-1-3 Kvantitativní stanovení

4-1-3-1 Výběr a subkultivace. Inokuluje se vhodné množství

Mosselovy obohacené tekuté půdy pro enterobakterie přípravkem

podle popisu v odstavci 4-1-1 a/nebo ředěním přípravku,

které obsahuje 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g (nebo 0,1 ml, 0,01 ml

a 0,001 ml) zkoušeného produktu. Inkubuje se 24 h až 48 h

při 30 °C až 35 °C. Každá kultura se inokuluje na misky se

žlučovým agarem s glukosou, violetí krystalovou a červení

neutrální. Inkubuje se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

4-1-3-2 Vyhodnocení. Růst kolonií znamená pozitivní výsledek.

Zaznamená se nejmenší množství produktu, které

dává pozitivní výsledek a největší množství, které dává negativní

výsledek. Z tabulky 2.6.13-2 se určí pravděpodobný

počet bakterií.

Tab. 2.6.13-2 Vyhodnocení výsledků

Výsledky pro uvedené množství

produktu

0,1 g

nebo

0,1 ml

0,01 g

nebo

0,01 ml

0,001 g

nebo

0,001 ml

Pravděpodobný

počet bakterií

v gramu nebo

mililitru

produktu

+ + + > 10 3

+ + – < 10 3 a > 10 2

+ – – < 10 2 a > 10

– – – < 10

4-2 ESCHERICHIA COLI



jak je popsáno v obecné stati 2.6.12 a použije se

10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml produktu




4-3-3 Vyhodnocení. Růst dobře vyvinutých červených kolonií

s nebo bez černého středu znamená možnou přítomnost

Salmonella. To se potvrzuje identifikačními zkouškami.

Produkt vyhovuje zkoušce, jestliže nejsou přítomny kolonie

popsaného typu nebo jestliže ověřující identifikační zkoušky

jsou negativní.

4-4 PSEUDOMONAS AERUGINOSA


v ředění 1 : 10 za použití nejméně 1 g zkoušeného produktu

tak, jak je popsáno v obecné stati 2.6.12 a použije se



3-4) tekuté půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu a promíchá se.

Pro zkoušku transdermálních náplastí se filtruje objem

vzorku odpovídající jedné náplasti přípravku, jak je popsáno

v odstavci 4-5-1 obecné stati 2.6.12 přes sterilní membránový

filtr a přenese se do 100 ml tekuté půdy s hydrolyzáty

sóji a kaseinu. Inkubuje se 18 h až 48 h při 30 °C až

35 °C.

4-4-2 Výběr a subkultivace. Inokuluje se na misky s cetrimidovým

agarem a inkubuje se 18 h až 72 h při 30 °C až

35 °C.

4-4-3 Vyhodnocení. Růst kolonií znamená možnou přítomnost

P. aeruginosa. To se potvrzuje identifikačními

zkouškami.


kolonie nebo jestliže ověřující identifikační zkoušky jsou

negativní.

4-5 STAPHYLOCOCCUS AUREUS


v ředění 1 : 10, použije se nejméně 1 g zkoušeného produktu

tak, jak je popsáno v obecné stati 2.6.12 a použije se


ČL 2017 – Dopl. 2020 295




Pro zkoušku transdermálních náplastí se filtruje objem

vzorku odpovídající jedné náplasti, jak je popsáno v odstavci

4-5-1 obecné stati 2.6.12, přes sterilní membránový

filtr a přenese se do 100 ml tekuté půdy s hydrolyzáty sóji

a kaseinu. Inkubuje se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

4-5-2 Výběr a subkultivace. Inokuluje se na misky s mannitolovým

agarem se solí a inkubuje se 18 h až 72 h při

30 °C až 35 °C.

4-5-3 Vyhodnocení. Růst žlutých/bílých kolonií obklopených

žlutou zónou indikuje možnou přítomnost S. aureus.

To se potvrzuje identifikačními zkouškami.



jsou negativní.

4-6 CLOSTRIDIA

4-6-1 Příprava vzorku a zahřívání. Zkoušený produkt

v ředění 1 : 10 (nejméně 20 ml) se za použití nejméně 2 g

nebo 2 ml zkoušeného produktu připraví tak, jak je popsáno

v obecné stati 2.6.12. Vzorek se rozdělí na dvě stejné dávky

po nejméně 10 ml. Jedna dávka se zahřívá 10 min při 80 °C

a rychle se ochladí. Druhá dávka se nezahřívá.

4-6-2 Výběr a subkultivace. Po 10 ml každé dávky nebo

množství odpovídající nejméně 1 g nebo 1 ml zkoušeného

produktu se inokuluje ve dvou dávkách do vhodného

množství (určeného v odstavci 3-4) obohacené půdy pro

klostridie. Inkubuje se za anaerobních podmínek 48 h při

30 °C až 35 °C. Po inkubaci se z každé nádoby inokuluje

na Columbia agar a inkubuje se za anaerobních podmínek

48 h až 72 h při 30 °C až 35 °C.

4-6-3 Vyhodnocení. Výskyt anaerobně rostoucích tyčinek

(s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí

indikuje přítomnost Clostridia sp. To se potvrzuje

identifikačními zkouškami.



jsou negativní.

4-7 CANDIDA ALBICANS

4-7-1 Příprava vzorku a předinkubace. Vzorek se připraví

tak, jak je popsáno v obecné stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo

množství odpovídající nejméně 1 g nebo 1 ml produktu

k inokulaci 100 ml Sabouraudovy tekuté glukosové půdy a promíchá

se. Inkubuje se při 30 °C až 35 °C po 3 dny až 5 dnů.

4-7-2 Výběr a subkultivace. Inokuluje se na misky se Sabouraudovým

glukosovým agarem a inkubuje se 24 h až

48 h při 30 °C až 35 °C.

4-7-3 Vyhodnocení. Růst bílých kolonií může indikovat přítomnost

C. albicans. To se ověřuje identifikačními zkouškami.



jsou negativní.

Následují část je uvedena pro informaci.

5 DOPORUČENÉ ROZTOKY A ŽIVNÉ PŮDY

Následující roztoky a živné půdy byly shledány vyhovujícími

pro účely, pro které jsou v lékopisu předepsány pro

zkoušku na mikrobiální kontaminaci. Mohou se použít

i jiné půdy, jestliže se může prokázat jejich vhodnost.

Zásobní tlumivý roztok. 34 g dihydrogenfosforečnanu draselného

se převede do odměrné nádoby o objemu 1000 ml,

rozpustí se v 500 ml vody čištěné, pH se upraví hydroxidem

sodným na hodnotu 7,2 ±0,2, objem se doplní vodou

čištěnou do 1000,0 ml a promíchá se. Rozplní se do nádob

a sterilizuje se. Uchovává se při teplotě 2 °C až 8 °C.

Tlumivý roztok fosforečnanový o pH 7,2. Připraví se směs

objemových dílů zásobního tlumivého roztoku a čištěné

vody (1 + 800) a sterilizuje se.

Tlumivý roztok chloridu sodného s peptonem o pH 7,0

dihydrogenfosforečnan draselný

3,6 g

hydrogenfosforečnan sodný dihydrát

7,2 g

(odpovídá 0,067 mol/l fosforečnanu)

chlorid sodný

4,3 g

pepton (z masa nebo kaseinu)

1,0 g

voda čištěná

1000 ml

Sterilizuje se v autoklávu za použití validovaného postupu.

Tekutá půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu


17,0 g


3,0 g

chlorid sodný

5,0 g


2,5 g

glukosa monohydrát

2,5 g

voda čištěná

1000 ml

Hodnota pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,3 ±0,2

při 25 °C. Sterilizuje se v autoklávu za použití validovaného

postupu.

Agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu


15,0 g


5,0 g

chlorid sodný

5,0 g

agar

15,0 g

voda čištěná

1000 ml



postupu.

Sabouraudův glukosový agar

glukosa

40,0 g

směs peptických hydrolyzátů živočišného původu

a pankreatického hydrolyzátu kaseinu (1 : 1) 10,0 g

agar

15,0 g

voda čištěná

1000 ml



postupu.

Bramborovo-glukosový agar

nálev z brambor

200 g

glukosa

20,0 g

agar

15,0 g

voda čištěná

1000 ml



postupu.

296 ČL 2017 – Dopl. 2020


Sabouraudova glukosová tekutá půda

glukosa

20,0 g

směs peptických hydrolyzátů živočišného původu

a pankreatického hydrolyzátu kaseinu (1 : 1) 10,0 g

voda čištěná

1000 ml



postupu.

Mosselova obohacená tekutá půda pro enterobakterie

pankreatický hydrolyzát želatiny

10,0 g

glukosa monohydrát

5,0 g

sušená hovězí žluč

20,0 g


2,0 g

hydrogenfosforečnan sodný dihydrát

8,0 g

zeleň brilantní

15 mg

voda čištěná

1000 ml


při 25 °C. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.

Žlučový agar s glukosou, violetí krystalovou

a červení neutrální

kvasničný výtažek

3,0 g


7,0 g

žlučové soli

1,5 g

chlorid sodný

5,0 g

glukosa monohydrát

10,0 g

agar

15,0 g

červeň neutrální

30 mg

violeť krystalová

2 mg

voda čištěná

1000 ml

Hodnota pH se upraví tak, aby po zahřátí byla 7,4 ±0,2 při

25 °C. Zahřívá se k varu, nelze zahřívat v autoklávu.

Tekutá MacConkeyova půda


20,0 g

laktosa monohydrát

10,0 g

sušená hovězí žluč

5,0 g

červeň bromkresolová

10 mg

voda čištěná

1000 ml



postupu.

Rappaportova-Vassiliadisova obohacená tekutá půda

pro salmonely

pepton ze sóji

4,5 g

chlorid hořečnatý hexahydrát

29,0 g

chlorid sodný

8,0 g

fosforečnan draselný

0,4 g


0,6 g

zeleň malachitová

0,036 g

voda čištěná

1000 ml

Rozpustí se a krátce povaří.

Sterilizuje se v autoklávu za použití validovaného postupu

při teplotě nepřesahující 115 °C. Hodnota pH se upraví tak,

aby po zahřátí v autoklávu byla 5,2 ±0,2 při 25 °C.

Deoxycholátový agar s xylosou a lysinem

xylosa

3,5 g

L-lysin

5,0 g

laktosa monohydrát

7,5 g

sacharosa

7,5 g

chlorid sodný

5,0 g


3,0 g

červeň fenolová

80 mg

agar

13,5 g

natrium-deoxycholát

2,5 g

thiosíran sodný

6,8 g

amonium-ferrum(III)-citrát

0,8 g

voda čištěná

1000 ml

Hodnota pH se upraví tak, aby po zahřátí byla 7,4 ±0,2 při

25 °C. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do

Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.

Cetrimidový agar


20,0 g

chlorid hořečnatý

1,4 g

síran draselný

10,0 g

cetrimid

0,3 g

agar

13,6 g

voda čištěná

1000 ml

glycerol

10,0 ml

Za stálého třepání se zahřeje k varu a 1 min se povaří. Hodnota

pH se upraví tak, aby po sterilizaci byla 7,2 ±0,2 při

25 °C. Sterilizuje se v autoklávu za použití validovaného

postupu.

Zkušební

metody

2.6

MacConkeyův agar


17,0 g

peptony (z masa a kaseinu)

3,0 g

laktosa monohydrát

10,0 g

chlorid sodný

5,0 g

žlučové soli

1,5 g

agar

13,5 g

červeň neutrální

30 mg

violeť krystalová

1 mg

voda čištěná

1000 ml


při 25 °C. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje

v autoklávu za použití validovaného postupu.

Mannitolový agar se solí


5,0 g

peptický hydrolyzát živočišného původu

5,0 g

hovězí výtažek

1,0 g

D-mannitol

10,0 g

chlorid sodný

75,0 g

agar

15,0 g

červeň fenolová

0,025 g

voda čištěná

1000 ml

Za stálého míchání se zahřeje k varu a 1 min se povaří.



postupu.

ČL 2017 – Dopl. 2020 297

2.6.14 BAKTERIÁLNÍ ENDOTOXINY

Obohacená půda pro klostridie

hovězí výtažek

10,0 g

pepton

10,0 g


3,0 g

rozpustný škrob

1,0 g

glukosa monohydrát

5,0 g

cystein-hydrochlorid

0,5 g

chlorid sodný

5,0 g

natrium-acetát

3,0 g

agar

0,5 g

voda čištěná

1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za

stálého míchání. Pokud je třeba, upraví se hodnota pH tak,

aby po sterilizaci byla 6,8 ±0,2 při 25 °C. Sterilizuje se

v autoklávu za použití validovaného postupu.

Columbia agar


10,0 g

peptický hydrolyzát masa

5,0 g

pankreatický hydrolyzát srdce

3,0 g


5,0 g

kukuřičný škrob

1,0 g

chlorid sodný

5,0 g

agar podle schopnosti tvořit gel

10,0 g až 15,0 g

voda čištěná

1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za

stálého míchání. Pokud je třeba, upraví se hodnota pH tak,

aby po sterilizaci byla 7,3 ±0,2 při 25 °C. Sterilizuje se

v autoklávu za použití validovaného postupu. Nechá se

ochladit na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamicinsulfát

v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu

a rozplní se do Petriho misek.


9.3:20614

Zkouška na bakteriální endotoxiny (BET) se používá k detekci

nebo kvantitativnímu stanovení endotoxinů pocházejících

z gramnegativních bakterií za použití lyzátu z amebocytů

ostrorepa (Limulus polyphemus nebo Tachypleus tridentatus).

Ke zkoušce se používají tři metody: gelová, která

je založena na tvorbě gelu; turbidimetrická, založená na

vývoji zákalu po vazbě endogenního substrátu; chromogenní,

založená na vývoji zbarvení po vazbě se syntetickým

peptidochromogenním komplexem.

V této stati je popsáno šest následujících metod:

– Metoda A. Gelová metoda: limitní zkouška.

– Metoda B. Gelová metoda: kvantitativní zkouška.

– Metoda C. Turbidimetrická kinetická metoda.

– Metoda D. Chromogenní kinetická metoda.

– Metoda E. Chromogenní metoda konečného bodu (end-

-point).

– Metoda F. Turbidimetrická metoda konečného bodu (end-

-point).

Zkouška se provede jakoukoliv ze šesti metod. V případě

nejistého nebo sporného výsledku, není-li v článku uvedeno

1

jinak, přijme se konečné rozhodnutí podle metody A.

Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje kontaminaci

endotoxinem.

1 ZAŘÍZENÍ

Z veškerého skla a ostatního tepelně odolného zařízení se

endotoxin odstraní validovaným postupem v horkovzdušném

sterilizátoru. Obvykle používaný minimální čas a teplota

jsou 30 min a 250 °C. Používají-li se zařízení z plastu,

jako např. mikrotitrační destičky a pipetovací špičky k automatickým

pipetám, použije se materiál, který je prokazatelně

prostý detekovatelného endotoxinu a který neinterferuje

se zkouškou.

Poznámka. V této stati jsou označením zkumavka míněny

všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky.

2 ZKOUMADLA, ZKOUŠENÉ ROZTOKY

(1) Lyzát z amebocytů

Je to lyofilizovaný přípravek, který se získává z amebocytů

ostrorepů (Limulus polyphemus nebo Tachypleus tridentatus).

Toto zkoumadlo se vztahuje pouze na přípravky vyrobené

v souladu s nařízeními oprávněné autority.

Poznámka. Lyzát z amebocytů reaguje po přidání endotoxinu

s některými b-glukany. Dostupné jsou též lyzáty,

které nereagují s glukany; jsou připraveny odstraněním

faktoru G reagujícího s glukany nebo inhibicí reakčního

místa faktoru G v amebocytovém systému. Tyto přípravky

se mohou použít ve zkoušce na endotoxin v přítomnosti

glukanů.

(2) Roztok lyzátu

Lyzát z amebocytů se opatrným mícháním rozpustí ve vodě

pro BET nebo v tlumivém roztoku, podle doporučení výrobce

lyzátu. Rekonstituovaný lyzát se skladuje v lednici

nebo zmrazený podle návodu výrobce.

(3) Voda pro BET (voda pro zkoušku na bakteriální

endotoxiny)

Voda pro injekci R nebo voda připravená jinými postupy,

která nedává reakci s lyzátem použitým k detekci limitu

zkoumadla.

3 PŘÍPRAVA ZÁSOBNÍHO ROZTOKU

STANDARDNÍHO ENDOTOXINU

Připravuje se z referenčního endotoxinu, který byl kalibrován

proti mezinárodnímu standardu, např. endotoxin BRP.

Účinnost endotoxinu se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách.

Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních

jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Poznámka. Jedna mezinárodní jednotka (m. j.) endotoxinu

se rovná jedné endotoxinové jednotce (e. j.).

Příprava a skladování zásobního roztoku standardního endotoxinu

se provádí postupem uvedeným v příbalové informaci

a v označení na obalu.

4 PŘÍPRAVA ROZTOKŮ STANDARDNÍHO

ENDOTOXINU

Zásobní roztok standardního endotoxinu se silně protřepe a připraví

se z něho odpovídající sériová ředění ve vodě pro BET.

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

1


298 ČL 2017 – Dopl. 2020


Ředění se použijí co nejdříve, aby se zabránilo poklesu

účinnosti způsobenému adsorpcí.

5 PŘÍPRAVA ZKOUŠENÝCH ROZTOKŮ

Zkoušené roztoky se připraví rozpuštěním nebo naředěním

léčivých látek nebo léčivých přípravků ve vodě pro BET.

Některé látky nebo přípravky je vhodnější rozpouštět nebo

ředit v jiných vodných roztocích. Je-li třeba, upraví se pH

zkoušeného roztoku nebo jeho ředění tak, aby hodnota pH

směsi lyzátu a zkoušeného roztoku byla v rozmezí stanoveném

výrobcem lyzátu, obvykle v rozsahu pH 6,0 až 8,0.

Hodnotu pH je možno upravit kyselinou, zásadou nebo

vhodným tlumivým roztokem podle doporučení výrobce

lyzátu. Kyseliny a zásady se mohou připravit z koncentrátů

nebo z pevných látek a vody pro BET v obalech prostých

detekovatelného endotoxinu. Tlumivé roztoky se musí validovat,

aby neobsahovaly detekovatelný endotoxin ani interferující

faktory.

6 STANOVENÍ NEJVYŠŠÍHO ÚČINNÉHO ŘEDĚNÍ

Nejvyšší účinné ředění (MVD) je nejvyšší přípustné ředění

vzorku, ve kterém ještě lze stanovit limitní koncentraci endotoxinu;

vypočítá se podle vzorce:

limitní koncentrace endotoxinu ´ koncentrace zkoušeného roztoku

MVD =

λ

v němž značí:

l – deklarovanou citlivost lyzátu naměřenou gelovou metodou

(m. j./ml) nebo nejnižší koncentraci endotoxinu

použitou při přípravě standardní křivky turbidimetrickou

nebo chromogenní metodou.

Limitní koncentrace endotoxinu. Pro léčivé látky k parenterálnímu

podání se limitní koncentrace endotoxinu vypočítá

na základě dávky podle vzorce:

K

M

v němž značí:

K – prahovou pyrogenní dávku endotoxinu na kilogram tělesné

hmotnosti;

M – nejvyšší doporučenou celkovou dávku přípravku na kilogram

tělesné hmotnosti.

Pokud se přípravek podává injekčně v častých intervalech

nebo kontinuální infuzí, je M nejvyšší celková dávka podaná

za hodinu.

Limitní koncentrace endotoxinu se u léčivých látek určených

pro parenterální podání uvádí v článcích v jednotkách,

jako jsou m. j./ml, m. j./mg, m. j./j. biologické účinnosti.

Koncentrace zkoušeného roztoku:

– mg/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je vztažena

na hmotnost (m. j./mg);

– j./ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je vztažena

na jednotku biologické účinnosti (m. j./j.);

– ml/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je vztažena

na objem (m. j./ml).

,

,

7 GELOVÁ METODA (METODY A a B)

Gelová metoda umožňuje detekci nebo kvantitativní stanovení

endotoxinů a spočívá ve vysrážení lyzátu v přítomnosti

endotoxinů. Nejnižší koncentrace endotoxinů, která způsobí

vysrážení lyzátu za standardních podmínek, je deklarovaná

citlivost lyzátu. Pro ověření přesnosti a validity

zkoušky se ověří deklarovaná citlivost lyzátu a provede se

zkouška na interferující faktory, jak je popsáno v části 1

Předběžné zkoušení.

1 PŘEDBĚŽNÉ ZKOUŠENÍ

(i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu

Před použitím ve zkoušce se deklarovaná citlivost roztoku

lyzátu λ, vyjádřená v m. j./ml, ověří na čtyřech vzorcích.

Ověření citlivosti lyzátu se provede v případě, že se použije

nová várka lyzátu nebo dojde-li k jakékoliv změně podmínek

zkoušky, která by mohla ovlivnit její výsledek.

Naředěním zásobního roztoku standardního endotoxinu vodou

pro BET se připraví nejméně čtyři koncentrace referenčních

roztoků odpovídající 2l, l, 0,5l a 0,25l.

Jeden objem roztoku lyzátu se smíchá se stejným objemem

jednoho z referenčních roztoků (např. objemy 0,1 ml)

v každé zkumavce. Jestliže se použijí lahvičky nebo ampule

s obsahem lyofilizovaného lyzátu pro jednu zkoušku, přidají

se referenční roztoky přímo do lahvičky nebo do ampule.

Směs se inkubuje za konstantních podmínek doporučených

výrobcem lyzátu [obvykle (60 ±2) min při (37 ±1) °C] za

vyloučení vibrací. Ověří se celistvost gelu ve zkumavkách:

každá zkumavka se po řadě vyjme z termostatu a otočí se

plynulým pohybem vzhůru o 180°. Jestliže se vytvořil pevný

gel, který po otočení zkumavky zůstane na místě, hodnotí

se výsledek jako pozitivní. Výsledek je negativní, jestliže

nevznikne celistvý gel.

Zkoušku lze považovat za platnou, jestliže nejnižší koncentrace

referenčních roztoků poskytuje ve všech zkumavkách

negativní výsledek.

Konečný bod (end-point) je nejnižší koncentrace v sérii

klesajících ředění referenčního endotoxinu, která ještě vysráží

lyzát. Určí se geometrický průměr konečných koncentrací

výpočtem průměrné hodnoty logaritmu koncentrací

konečného bodu ve čtyřech sériích ředění a použije se antilogaritmus

této hodnoty, jak je uvedeno v následujícím

vzorci:

geometrický průměr koncentrace konečného bodu

åe

= antilog ,

f

v němž značí:

∑e – součet logaritmů koncentrací konečného bodu použitých

řad ředění;

f – počet zkumavek.

Geometrický průměr koncentrací konečných bodů je naměřená

citlivost roztoku lyzátu (m. j./ml). Jestliže je výsledek

v rozmezí 0,5λ až 2λ, je deklarovaná citlivost potvrzena

a používá se ve zkouškách s tímto lyzátem.

(ii) Zkouška na interferující faktory

Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-1

a použijí se zkoušené roztoky v ředění nižším než MVD,

aby neobsahovaly detekovatelné množství endotoxinů

a provede se zkouška postupem uvedeným v části 1 Předběžné

zkoušení, (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.

Geometrický průměr koncentrací konečných bodů roztoků B

a C se stanoví za použití vztahů uvedených v části 1 Předběžné


Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 299


Tab. 2.6.14-1

Roztok

Koncentrace endotoxinu/ Roztok,

k němuž se přidá endotoxin

Ředidlo Ředicí faktor Koncentrace

endotoxinu

Počet

zkumavek

A žádná/zkoušený roztok – – – 4

B 2λ/zkoušený roztok zkoušený roztok

C 2λ/voda pro BET voda pro BET 1

2

4

8

1

2

4

8

2λ

1λ

0,5λ

0,25λ

2λ

1λ

0,5λ

0,25λ

D žádná/voda pro BET – – – 2

Roztok A = roztok zkoušeného přípravku, který je prostý detekovatelných endotoxinů

Roztok B = zkouška na interferující faktory

Roztok C = kontrola deklarované citlivosti lyzátu

Roztok D = negativní kontrola (voda pro BET)

4

4

4

4

2

2

2

2

Zkouška na interferující faktory se musí opakovat, jestliže

nastaly nějaké změny v experimentálních podmínkách, které

pravděpodobně ovlivní výsledek zkoušky.

Zkoušku lze považovat za platnou, jestliže v žádné zkumavce

roztoků A a D nedojde k reakci a výsledek v roztoku

C potvrdí deklarovanou citlivost lyzátu.

Jestliže citlivost lyzátu stanovená v roztoku B není nižší

než 0,5λ a není vyšší než 2λ, neobsahuje zkoušený roztok

v daných podmínkách interferující faktory. Jinak zkoušený

roztok interferuje se zkouškou.

Jestliže zkoušený přípravek interferuje v podmínkách

zkoušky a jeho ředění je nižší než MVD, zkouška na přítomnost

interferujících látek se opakuje s vyšším ředěním,

které však nepřesahuje MVD. Použití lyzátu o vyšší citlivosti

umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku, a to

může přispět k vyloučení interference.

Interference se může odstranit vhodným validovaným postupem,

jako je filtrace, neutralizace, dialýza nebo zahřátí.

Opakovanou zkouškou na interferující faktory s tím, že se

ke zkoušenému přípravku přidá standardní endotoxin, se

prokáže, že zvoleným postupem byly účinně odstraněny interferující

faktory bez ztráty endotoxinů, a pak se provede

zvolený postup.

2 LIMITNÍ ZKOUŠKA (METODA A)

(i) Postup


a zkouška se provede postupem uvedeným v části 1 Předběžné


Tab. 2.6.14-2

Roztok

Koncentrace endotoxinu/Roztok

s přidaným endotoxinem

Počet

zkumavek

A žádný/ředěný zkoušený roztok 2

B 2λ/ředěný zkoušený roztok 2

C 2λ/voda pro BET 2

D žádný/voda pro BET 2

Připraví se roztoky A a B (pozitivní kontrola vzorku) v ředění

nepřesahujícím MVD a použijí se postupy uvedené

v části 1 Předběžné zkoušení, (ii) Zkouška na interferující

faktory. Roztoky B a C (pozitivní kontroly) obsahují standardní

endotoxin v koncentraci odpovídající dvojnásobku

deklarované citlivosti lyzátu. Roztok D (negativní kontrola)

obsahuje vodu pro BET.

(ii) Hodnocení

Zkoušku lze považovat za platnou, je-li ve všech zkumavkách

roztoků B a C pozitivní výsledek a v roztoku D je výsledek

negativní.

Zkoušený přípravek vyhovuje podmínkám zkoušky, je-li

v obou zkumavkách roztoku A negativní výsledek.

Je-li v obou zkumavkách roztoku A výsledek negativní, pak

zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce.

Je-li v obou zkumavkách roztoku A výsledek pozitivní, pak

zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce.

Zkouška se opakuje, jestliže je v jedné ze zkumavek roztoku

A zjištěn pozitivní výsledek a ve druhé zkumavce výsledek

negativní. Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, je-li

při opakování v obou zkumavkách roztoku A negativní výsledek.

Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, je-li při opakování

v obou zkumavkách roztoku A pozitivní výsledek.

Nicméně, jestliže nevyhovuje zkoušce zkoušený přípravek

naředěný na koncentraci nižší, než je MVD, zkouška se

může opakovat za použití zkoušeného přípravku naředěného

na koncentraci vyšší, ale nepřesahující MVD.

3 KVANTITATIVNÍ ZKOUŠKA (METODA B)

(i) Postup

Ve zkoušce se stanoví množství bakteriálních endotoxinů ve

zkoušeném roztoku titrací do konečného bodu (end-point).


a zkouška se provede postupem uvedeným v části 1 Předběžné

zkoušení (i) Ověření deklarované citlivosti lyzátu.

(ii) Výpočet a hodnocení

Zkoušku lze považovat za platnou, jestliže jsou splněny následující

tři podmínky:

300 ČL 2017 – Dopl. 2020


Tab. 2.6.14-3

Roztok

Koncentrace endotoxinu/Roztok,

ke kterému byl přidán endotoxin

A žádná/zkoušený roztok voda pro BET 1

2

4

8

Ředidlo Ředicí faktor Koncentrace

endotoxinu

Počet

zkumavek

2

2

2

2

B 2λ/zkoušený roztok 1 2λ 2

C 2λ/voda pro BET voda pro BET 1

2

4

8

–

–

–

–

2λ

1λ

0,5λ

0,25λ

D žádná/voda pro BET – – – 2

Roztok A = zkoušený roztok v ředění nepřevyšujícím MVD, se kterým byla provedena zkouška na interferující faktory;

další ředění zkoušeného roztoku nesmí přesáhnout MVD; použije se voda pro BET a připraví se řady ředění zkoušeného

roztoku po čtyřech zkumavkách v koncentracích 1, 1/2, 1/4 a 1/8 ve vztahu k ředění použitému ke zkoušce na interferující

faktory; je-li to vhodné, mohou se použít další ředění až do MVD

Roztok B = roztok A obsahující standardní endotoxin v koncentraci 2λ (pozitivní kontrola přípravku)

Roztok C = řady ředění po čtyřech zkumavkách s vodou pro BET obsahující standardní endotoxin v koncentraci 2λ, 1λ,

0,5λ a 0,25λ

Roztok D = voda pro BET (negativní kontrola)

2

2

2

2

Zkušební

metody

2.6

(a) obě zkumavky roztoku D (negativní kontrola) jsou negativní;

(b) obě zkumavky roztoku B (pozitivní kontrola) jsou pozitivní;

(c) geometrický průměr koncentrace roztoku C v konečném

bodu je v rozmezí 0,5λ až 2λ.

Pro stanovení koncentrace endotoxinu v roztoku A se vypočítá

koncentrace konečného bodu v každé zkumavce vynásobením

každého konečného ředění faktorem λ (deklarovaná

citlivost lyzátu).

Koncentrace endotoxinu ve zkoušeném roztoku je koncentrací

konečného bodu ve zkumavkách. Jestliže byla zkouška

provedena se zředěným zkoušeným roztokem, vypočítá se

koncentrace endotoxinu v původním roztoku vynásobením

výsledku ředicím faktorem.

Nedává-li žádné ředění zkoušeného roztoku pozitivní výsledek

ve validační zkoušce, uvede se koncentrace endotoxinu

jako nižší než λ (nebo, byl-li zkoušen ředěný vzorek,

uvede se koncentrace endotoxinu nižší než nejnižší ředicí

faktor vzorku ´ λ). Jsou-li všechna ředění pozitivní, koncentrace

endotoxinu se uvede jako rovná nebo vyšší než

nejvyšší ředicí faktor ´ λ (např. podle tabulky 2.6.14-3,

počáteční ředicí faktor ´ 8 ´ λ).

Přípravek vyhovuje požadavkům zkoušky, jestliže koncentrace

endotoxinu v obou zkumavkách je nižší než koncentrace

uvedená v článku.

8 FOTOMETRICKÉ KVANTITATIVNÍ

METODY (METODY C, D, E a F)

1 TURBIDIMETRICKÉ METODY (METODY C a F)

U těchto metod se fotometricky měří vzestup zákalu. Podle

použitého principu se tyto metody mohou označit buď jako

turbidimetrická zkouška konečného bodu, nebo turbidimetrická

kinetická zkouška.

Turbidimetrická zkouška konečného bodu (Metoda F) je

založena na kvantitativním poměru mezi koncentrací endotoxinu

a zákalem (absorbance nebo transmitance) reakční

směsi na konci inkubační doby.

Turbidimetrická kinetická zkouška (Metoda C) měří buď

čas (počáteční čas) potřebný k tomu, aby reakční směs dosáhla

předem stanovené absorbance nebo transmitance, nebo

rychlost vývoje zákalu.

Zkouška se provádí při teplotě inkubace doporučené výrobcem

lyzátu, obvykle (37 ±1) °C.

2 CHROMOGENNÍ METODY (METODY D a E)

U těchto metod se měří chromofor uvolněný z vhodného

chromogenního peptidu při reakci endotoxinů s lyzátem.

Podle použitého principu se tyto metody mohou označit

buď jako chromogenní zkouška konečného bodu, nebo

chromogenní kinetická zkouška.

Chromogenní zkouška konečného bodu (Metoda E) je založena

na kvantitativním poměru mezi koncentrací endotoxinu

a množstvím uvolněného chromoforu na konci inkubační

doby.

Chromogenní kinetická zkouška (Metoda D) měří buď čas

(počáteční čas) potřebný k tomu, aby reakční směs dosáhla

předem stanovené absorbance, nebo rychlost vývoje zbarvení.

Zkouška se provádí při teplotě inkubace doporučené výrobcem

lyzátu, obvykle (37 ±1) °C.


K zajištění přesnosti nebo platnosti turbidimetrických

a chromogenních zkoušek se provádějí předběžná zkoušení,

aby se prokázalo, že kritéria pro standardní křivku jsou

vhodná a že zkoušený roztok ve zkoušce neinterferuje.

Validace zkušebních metod se požaduje při jakékoliv změně

experimentálních podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek

zkoušky.

(i) Zajištění kritérií pro standardní křivku

Zkouška se musí provádět pro každou várku lyzátu.

ČL 2017 – Dopl. 2020 301


K přípravě nejméně tří koncentrací pro standardní křivku se

použije roztok standardního endotoxinu v rozmezí určeném

výrobcem lyzátu. Zkouška se provede nejméně ve třech

zkumavkách každého ředění standardního endotoxinu podle

doporučení výrobce lyzátu (poměry objemu, inkubační doba,

teplota, pH atd.)

Jestliže se v kinetické metodě požaduje rozmezí vyšší než

2 log, musí se doplnit další standardy k podpoře logaritmického

zvýšení v průběhu standardní křivky.

Absolutní hodnota korelačního koeficientu | r | musí být

vyšší nebo rovna 0,980 pro nastavené rozmezí koncentrací

endotoxinu.

(ii) Zkouška na interferující faktory

Zvolí se koncentrace endotoxinu ve středu nebo v blízkosti

střední hodnoty endotoxinové standardní křivky.

Připraví se roztoky A, B, C a D podle tabulky 2.6.14-4.

Zkouška se provede nejméně na dvojici zkumavek těch roztoků,

které doporučuje výrobce lyzátu (objem zkoušeného

roztoku a roztoku lyzátu, vzájemný poměr objemu zkoušeného

roztoku a roztoku lyzátu, inkubační čas atd.).

Zkoušku lze považovat za platnou, jestliže jsou splněny následující

podmínky:

– absolutní hodnota korelačního koeficientu standardní

křivky vytvořené za použití roztoku C je větší nebo rovna

0,980;

– výsledek získaný s roztokem D nepřesáhne limit hodnoty

naměřené u slepého vzorku požadovaného pro charakteristiku

použitého lyzátového zkoumadla, nebo je menší než limit

detekce endotoxinů u použitého lyzátového zkoumadla.

Odečtením průměrné koncentrace endotoxinu (byla-li naměřena)

v roztoku (roztok A, tabulka 2.6.14-4) od koncentrace

endotoxinu v roztoku, ke kterému byl endotoxin přidán,

se vypočítá průměrná hodnota záchytu přidaného endotoxinu

(roztok B, tabulka 2.6.14-4).

Zkoušený roztok se považuje za prostý interferujících faktorů,

jestliže v podmínkách zkoušky je naměřená koncentrace

endotoxinu přidaného ke zkoušenému roztoku po

odečtení jakéhokoliv množství endotoxinu detekovaného

v roztoku, ke kterému nebyl přidán endotoxin, v rozmezí

50 % až 200 % známé koncentrace přidaného endotoxinu.

Je-li záchyt endotoxinu mimo vymezený rozsah, předpokládá

se, že ve zkoušeném roztoku jsou obsaženy interferující

faktory. Zkouška se opakuje za použití vyššího ředění,

které nepřesáhne MVD. Navíc, se interference zkoušeného

roztoku nebo zředěného zkoušeného roztoku nepřesahujícího

MVD může odstranit vhodnou validovanou metodou,

jako je filtrace, neutralizace, dialýza nebo zahřátí. K ověření,

že vybraná metoda efektivně odstraňuje interferenci bez

ztráty endotoxinů, se zkouška na interferující faktory opakuje

s tím, že ke zkoušenému přípravku se přidá referenční

endotoxin a použije se vybraná metoda k odstranění interference.

4 ZKOUŠENÍ

(i) Postup

Postupuje se, jak je uvedeno v části 3 Předběžné zkoušení,

(ii) Zkouška na interferující faktory.

(ii) Výpočet

Vypočítá se koncentrace endotoxinu pro každou zkumavku

roztoku A pomocí standardní křivky sestrojené z pozitivní

kontroly s roztokem C.

Zkoušku lze považovat za platnou, jestliže jsou splněny tři

následující podmínky:

(1) výsledky získané s roztokem C vyhovují požadavkům

pro validaci, které jsou uvedeny v části 3 Předběžné

zkoušení, (i) Zajištění kritérií pro standardní křivku;

(2) záchyt endotoxinu, vypočítaný z koncentrace endotoxinu

nalezené v roztoku B po odečtení koncentrace endotoxinu

nalezené v roztoku A, je v rozmezí 50 % až

200 %;

(3) výsledek získaný s roztokem D (negativní kontrola) nepřesahuje

limit hodnoty naměřené u slepého vzorku požadovaného

pro charakteristiku použitého lyzátového

zkoumadla, nebo je menší než limit detekce endotoxinů

u použitého lyzátového zkoumadla.

(iii) Hodnocení

Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže průměrná

koncentrace endotoxinu ve zkumavkách roztoku A po korekci

naředění a koncentrace je nižší než limit endotoxinu

pro přípravek.

Pokyny pro zkoušku na bakteriální endotoxiny jsou uvedeny

v obecné stati 5.1.10.

Tab. 2.6.14-4

Roztok Koncentrace endotoxinu Roztok, k němuž byl

Počet zkumavek

přidán endotoxin

A žádná zkoušený roztok nejméně 2

B střední koncentrace standardní křivky zkoušený roztok nejméně 2

C nejméně tři koncentrace (nejnižší koncentrace

voda pro BET každá koncentrace nejméně 2

je označena l)

D žádná voda pro BET nejméně 2

Roztok A = zkoušený roztok ředěný nejvýše na MVD

Roztok B = zkoušený přípravek ve stejném ředění jako roztok A, obsahuje přidaný endotoxin, jehož koncentrace se rovná

nebo se blíží střední hodnotě standardní křivky

Roztok C = roztok standardního endotoxinu v koncentraci, která byla použita při validaci metody postupem uvedeným

v části 3 Předběžné zkoušení, (i) Zajištění kritérií pro standardní křivku (pozitivní kontroly)

Roztok D = voda pro BET (negativní kontrola)

302 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.15 AKTIVÁTOR PREKALIKREINU

2.6.15 AKTIVÁTOR PREKALIKREINU

8.7:20615

Aktivátor prekalikreinu (PKA) aktivuje prekalikrein na kalikrein

a může se stanovit pomocí jeho schopnosti štěpit

chromofor syntetického peptidového substrátu tak, že se

rychlost štěpení měří spektrofotometricky a koncentrace

aktivátoru prekalikreinu se vypočítá porovnáním s referenčním

přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je aktivita obsažená v určitém množství

mezinárodního standardu, který je tvořen lyofilizovaným

aktivátorem prekalikreinu. Hodnotu aktivity mezinárodního

standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje

Světová zdravotnická organizace.

ZKOUMADLA

Aktivátor prekalikreinu v albuminu BRP je kalibrován

v mezinárodních jednotkách srovnáním s mezinárodním

standardem.

Tlumivý roztok A. 6,055 g trometamolu R, 1,17 g chloridu

sodného R, 50 mg hexadimethrinium-dibromidu R a 0,100 g

azidu sodného R se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví

kyselinou chlorovodíkovou 2 mol/l RS na hodnotu 8,0 a zředí

se vodou R na 1000 ml.

Tlumivý roztok B. 6,055 g trometamolu R a 8,77 g chloridu

sodného R se rozpustí ve vodě R, pH roztoku se upraví kyselinou

chlorovodíkovou 2 mol/l RS na hodnotu 8,0 a zředí

se vodou R na 1000 ml.

PŘÍPRAVA SUBSTRÁTU PREKALIKREINU

Aby se zabránilo aktivaci srážení, může krev nebo plazma

pro přípravu prekalikreinu přijít do styku pouze s plastem

nebo se sklem, jehož povrch je silikonovaný.

Devět objemových dílů lidské krve se smíchá s jedním objemovým

dílem antikoagulačního roztoku [ACD, CPD nebo

roztoku natrium-citrátu R (38 g/l)], do kterého se přidá

1 mg hexadimethrinium-dibromidu R na 1 ml. Po odstředění

směsi při 3600 g po dobu 5 min se oddělí plazma, která

se znovu 20 min odstřeďuje při 6000 g, aby sedimentovaly

trombocyty. Po oddělení se plazma chudá na trombocyty

20 h dialyzuje proti desetinásobnému objemu tlumivého

roztoku A. Dialyzovaná plazma se převede na chromatografickou

kolonu obsahující agarosu-DEAE pro iontoměničovou

chromatografii R. Agarosa se nejprve uvede do rovnováhy

tlumivým roztokem A. Objem nabobtnalého gelu je

dvakrát větší než objem plazmy. Eluuje se z kolony tlumivým

roztokem A rychlostí 20 ml/cm 2 /h, eluát se shromažďuje

do frakcí a zaznamenává se jejich absorbance při

280 nm (2.2.25). Zachycené frakce, které obsahují bílkovinu

zobrazenou na záznamu jako první pík tak, že jejich

objem je asi 1,2krát větší než objem plazmy chudé na

trombocyty, se spojí.

Spojený objem substrátu se zkouší na nepřítomnost aktivity

kalikreinu tak, že se jeden objemový díl smíchá s dvaceti

objemovými díly předehřátého roztoku chromogenního

substrátu, který se použije při stanovení, a směs se inkubuje

2 min při 37 °C. Substrát je vhodný, jestliže vzrůst absorbance

za minutu je menší než 0,001. Ke spojenému substrátu

se přidá roztok chloridu sodného R (7 g/l) a filtruje se

přes membránový filtr (jmenovitá velikost pórů 0,45 µm).

Filtrát se rozdělí na části, které se zmrazí a skladují se při

–25 °C. Substrát se může před skladováním lyofilizovat.

Postup od začátku chromatografie po zmrazení po částech

se provede v průběhu jednoho pracovního dne.

POSTUP STANOVENÍ

Stanovení se může provádět na automatickém enzymovém

analyzátoru nebo na vhodném systému mikrotitračních destiček

umožňujícím kinetická měření a opatřeném vhodným

počítačovým systémem pro výpočet výsledků. Porovnávací

roztoky, zkoušené roztoky a substrát prekalikreinu se mohou,

je-li to nutné, ředit tlumivým roztokem B.

Zředěné porovnávací roztoky nebo zkoušené roztoky se

10 min inkubují se substrátem prekalikreinu tak, aby objem

nezředěného vzorku nebyl vyšší než 1/10 celkového objemu

inkubační směsi. Tím se vyloučí chyby způsobené změnami

iontové síly a hodnot pH inkubační směsi. Směs nebo

její část se inkubuje s nejméně stejným objemem roztoku

vhodného syntetického chromogenního substrátu, o kterém

je známo, že je specifický pro kalikrein (např. N-benzoyl-L-

-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-nitroanilid-acetát R nebo

D-prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-4-nitroanilid-dihydrochlorid

R), rozpuštěného v tlumivém roztoku B. Zaznamená

se rychlost změny absorbance za minutu po 2 min až

10 min, při vlnové délce specifické pro použitý substrát.

Pro každou směs zkoušeného nebo referenčního přípravku

se připraví kontrolní roztok, který místo substrátu prekalikreinu

obsahuje tlumivý roztok B.

V závislosti na použité metodě se zjištěné změny absorbance

za minutu (∆A/min) musí korigovat odečtením hodnoty

získané s kontrolním roztokem bez substrátu kalikreinu.

Výsledky se mohou vypočítat za použití kalibrační křivky,

modelu rovnoběžnosti nebo modelu poměru sklonů či jinými

vhodnými statistickými metodami. Vynese se kalibrační

křivka za použití hodnot získaných s referenčním přípravkem

v závislosti na koncentracích. Tato křivka se použije

pro stanovení aktivity prekalikreinového aktivátoru ve

zkoušeném přípravku. Během validace metody se pokusy

s příměsí musí prokázat, že matrice vzorku neovlivňuje výsledky.

Vysoké hodnoty při slepé zkoušce mohou ovlivnit

validitu zkoušky a měly by být vhodně prozkoumány.

2.6.16 ZKOUŠKA NA CIZÍ AGENS

V HUMÁNNÍCH VIROVÝCH

VAKCÍNÁCH

10.2:20616

ÚVOD

Strategie zkoušení cizích agens v humánních virových vakcínách

se musí odvíjet od posouzení rizika vycházejícího

z posouzení rizika virové kontaminace podrobněji uvedené

ve stati 5.1.7 Virová bezpečnost. Tato strategie zahrnuje

všechny vhodné zkoušky schopné detekovat různé skupiny

cizích agens, které mohou infikovat zdroje virových

kmenů, včetně buněčných substrátů a surovin živočišného

nebo rostlinného původu. Také je třeba vzít v úvahu

schopnost výrobního postupu odstranit nebo inaktivovat

viry. Přehled zkoušek uvedený v tabulce 2.6.16-1 se musí

upravit v závislosti na cizím agens, které je potenciálním

kontaminantem produktu: pro in vitro zkoušky musí po-

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 303

2.6.16 ZKOUŠKA NA CIZÍ AGENS V HUMÁNNÍCH VIROVÝCH VAKCÍNÁCH

Tab. 2.6.16-1 Vhodné zkoušky na cizí agens v různých fázích produkce

Virové

inokulum

Sklizeň

viru

Produkce kultivačních substrátů

Kontrolní buňky Kontrolní vejce

bakteriální a houbová kontaminace + + – –

mykoplazmata + + – –

spiroplazmata 1 + – – –

mykobakterie + + – –

zkouška na sajících myších 2 + – – –

ptačí viry 3 + + – –

zkouška na cizí agens v buněčných kulturách 4 + + + +

hmyzí viry 5 + + – –

zkouška na kontrolních buňkách

– – + –

(mikroskopické posouzení)

hemadsorbující viry – – + –

zkouška na kontrolních vejcích

– – – +

(hemaglutinační agens)

viry ptačí leukózy 6 – – + +

zkouška na specifické viry zkouškou NAT 7 + + – –

zkouška na viry za použití molekulárních

metod se širokou detekční kapacitou 8 + + – –

1

Pokud byly použity hmyzí buňky nebo výchozí materiály rostlinného původu.

2

Pokud posouzení rizika ukazuje, že provedení těchto zkoušek snižuje riziko, je třeba vzít v úvahu jejich provedení.

3

Pokud byly viry kultivovány na ptačích nebo původně ptačích tkáních. Pokud posouzení rizika ukazuje, že provedení těchto zkoušek

snižuje riziko, je třeba vzít v úvahu jejich provedení.

4

Zkoušky se provedou na vhodných vnímavých buněčných kulturách na základě posouzení rizika.

5

Pokud byly viry kultivovány na hmyzích tkáních.

6

Pokud byly viry kultivovány na původně ptačích tkáních nebo na vejcích.

7

Na základě posouzení rizika.

8

Tyto metody se mohou použít buď jako alternativní k in vivo zkouškám a specifickým NAT zkouškám, nebo jako doplňkové/alternativní

k in vitro kultivačním zkouškám na základě posouzení rizika a se souhlasem oprávněné autority.

souzení rizika umožnit (se souhlasem oprávněné autority)

ve výrobním postupu použití dalších vnímavých buněčných

linií nebo metod molekulární biologie v závislosti na výrobním

procesu a inkubační teplotě pro růst daných virů.

Jestliže jsou k detekci některých virů vhodnější in vivo

zkoušky (např. sající myši pro viry vesikulární stomatitidy

a fertilizovaná vejce z SPF chovů pro chřipkové viry), musí

být rozhodnutí provést nebo zavést in vivo posouzení do

strategie testování zdůvodněno posouzením rizika.

Jsou dostupné nové, citlivé molekulární metody se širokou detekční

kapacitou. Tyto nové přístupy zahrnují metody vysoce

výkonného sekvenování (HTS), metody amplifikace nukleových

kyselin (NAT) [např. stanovení polymerasovou řetězovou

reakcí (PCR), polymerasovou řetězovou reakcí s reverzní

transkriptasou (RT-PCR) a stanovení obsahu produktu zvýšeného

reverzní transkriptasou (PERT)] pro celou skupinu virů

nebo náhodně primující metody (spojené se sekvenováním

nebo ne), hybridizace nukleotidových řad a hmotnostní spektrometrie

se širokým spektrem PCR. Tyto metody se mohou se

souhlasem oprávněné autority a na základě posouzení rizika

použít buď jako alternativní k in vivo zkouškám a specifikacím

amplifikace nukleových kyselin (NAT), nebo jako doplněk/alternativa

k in vitro kultivačním zkouškám.

Ve zkouškách, které vyžadují nejprve neutralizaci viru, se

používají specifické protilátky, které nejsou humánního ani

opičího původu; jestliže byl virus kultivován na tkáni ptačího

původu, nesmějí to být ani protilátky ptačího původu.

K přípravě antiséra se používá imunizační antigen připravený

na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura

užívaná pro produkci vakcíny, a prosté cizích agens. Jestliže

je předepsáno použití SPF vajec, získávají se tato vejce

z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

METODY ZKOUŠENÍ

Vhodné zkoušky na cizí agens, které se provádějí v různých

fázích produkce, jsou uvedeny v tabulce 2.6.16-1; použijí

se dále uvedené metody založené na posouzení rizika.

Vzorky se odebírají v čase sklizně a, pokud nejsou ihned

využity ke zkoušení, udržují se při teplotě nižší než –40 °C.

Bakteriální a houbová kontaminace. Každé virové inokulum

a každá sklizeň viru vyhovují zkoušce na sterilitu

(2.6.1).

Mykoplazmata (2.6.7). Každé virové inokulum a každá

sklizeň viru vyhovují zkoušce na mykoplazmata.

Spiroplazmata. Spiroplazmata mohou být do virového

inokula zavlečena kontaminovanými surovinami rostlinného

původu nebo, když jsou pro kultivaci viru použity hmyzí

buněční linie. Kde je to vhodné, validovanou metodou

schválenou oprávněnou autoritou se prokáže virové inokulum

jako prosté spiroplazmat. Metody amplifikace nukleových

kyselin pro detekci mykoplazmat (2.6.7) se po validaci

a schválení oprávněnou autoritou mohou použít pro detekci

spiroplazmat.

304 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.16 ZKOUŠKA NA CIZÍ AGENS V HUMÁNNÍCH VIROVÝCH VAKCÍNÁCH

Mykobakterie (2.6.2). 2,7 ml vzorku každého virového

inokula a každé sklizně viru se zkouší na přítomnost

Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za

citlivé pro detekci těchto organismů. Jako alternativní se

mohou použít metody amplifikace nukleových kyselin prováděné

tak, že každé stanovení je validováno a porovnáno s

kultivační metodou.

Zkouška na sajících myších. Každé virové inokulum se

zkouší na sajících myších, pokud posouzení rizika ukazuje,

že provedení těchto zkoušek snižuje riziko, je třeba vzít

v úvahu jejich provedení v celém rozsahu. Každé z nejméně

dvaceti sajících myší mladších 24 h se podá intracerebrálně

0,01 ml a intraperitoneálně nejméně 0,1 ml virového

inokula. Myši se pozorují denně nejméně 4 týdny.

U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h nebo

u těch, které při přímém makroskopickém pozorování vykazují

příznaky onemocnění, se provede pitva. Virové inokulum

vyhovuje zkoušce, jestliže žádná sající myš nevykazuje

známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně

80 % původně inokulovaných sajících myší.

Ptačí viry. Každé virové inokulum kultivované na ptačích

tkáních a každá sklizeň viru kultivovaná na primárních ptačích

tkáních se zkouší na ptačí viry, pokud posouzení rizika

ukazuje, že provedení této zkoušky snižuje riziko vzhledem

ke všem zkouškám. Neutralizuje se množství vzorku odpovídající

buď 100 lidským dávkám vakcíny, nebo 10 ml,

podle toho, co je více. Na jedno vejce se použije 0,5 ml;

skupina fertilizovaných SPF vajec 9 až 11 dnů starých

se inokuluje do alantoidní dutiny a druhá skupina, 5 až

7 dnů starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dnů.

Virové inokulum nebo sklizeň viru vyhovují, jestliže alantoidní

tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují

známky přítomnosti hemaglutinujícího agens, a jestliže

všechna embrya a chorioalantoidní membrány makroskopicky

vyšetřené jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže

nejméně 80 % embryí přežije 7 dnů.

Zkoušky na cizí agens na buněčných kulturách. Pro

každé virové inokulum, každou sklizeň viru a každou produkční

buněčnou kulturu (kontrolní buňky nebo kontrolní

vejce) se musí na základě posouzení rizika provést zkoušky

na cizí agens. Při výběru vhodných buněk je třeba vzít

v úvahu původ buněčného substrátu a kmene viru, stejně

jako možná cizí agens, která mohou být zavlečena během

produkčních postupů, nebo použitím surovin živočišného

nebo rostlinného původu.

Pro každé virové inokulum a každou sklizeň viru se použije

množství zneutralizovaného vzorku (není-li předepsáno jinak),

které odpovídá 500 lidským dávkám nebo 50 ml vakcíny,

podle toho, co je více, a zkouší se na přítomnost cizích

agens inokulací do kultur buněk kontinuální linie opičích

nebo lidských buněk. Jestliže se virus kultivoval na

opičích nebo lidských buňkách, zkouší se zneutralizovaný

sklizený virus také na oddělené kultuře těchto buněk. Jestliže

se virus kultivoval v buněčném systému savčího nebo

ptačího původu, jiném než opičím nebo lidském, inokulují

se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. Buňky se

inkubují při (36 ±1) °C a pozorují po dobu 14 dní. Jestliže

se produkční buněčná kultura udržuje při teplotě jiné než

(36 ±1) °C, provede se doplňující zkouška na cizí agens také

při produkční teplotě se stejným typem buněk, které byly

použity ke kultivaci viru. Subkultura se pozoruje 14 dnů

a potom se podrobí zkoušce na hemadsorbující agens. Virové

inokulum nebo sklizeň viru vyhovují zkoušce, jestliže

žádná z buněčných kultur nevykazuje po 14 a 28 dnech inkubace

známky přítomnosti hemadsorbujících agens.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % buněčných

kultur zůstane životaschopných.

Hmyzí viry. Každé virové inokulum a každá sklizeň viru

kultivovaného na hmyzích buňkách se zkouší na hmyzí

viry. Není-li předepsáno jinak, zneutralizované množství

vzorku odpovídající 500 lidským dávkám vakcíny nebo

50 ml, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích

agens inokulací do nejméně jedné buněčné kultury odlišné

od kultury použité k produkci a vnímavé pro hmyzí viry,

která rovněž umožňuje detekci lidských arbovirů (např.

BHK-21). Výběr buněk schvaluje oprávněná autorita, přičemž

se bere v úvahu původ produkčních buněk a možné

kontaminanty, které mohou být detekovány na vybraných

buňkách. Buňky se inkubují při vhodné teplotě a pozorují

se 14 dnů. Subkultura se pozoruje 14 dnů a potom se podrobí

zkoušce na hemadsorbující agens. Virové inokulum

nebo sklizeň viru vyhovují zkoušce, jestliže žádná

z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti cizích

agens po inkubaci 14 dnů a 28 dnů; nevykazuje známky

přítomnosti hemadsorbujících agens po inkubaci 28 dnů.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % buněčných

kultur zůstane životaschopných.

Zkouška na kontrolních buňkách. Jestliže jsou buněčné

kultury použity pro produkci viru, hodnotí se mikroskopicky

kontrolní buňky na nepřítomnost jakéhokoliv viru způsobujícího

cytopatickou degeneraci během inkubace inokulovaných

produkčních buněčných kultur nebo nejméně po

dobu 14 dnů od inokulace produkčních nádob, podle toho,

co je více. Zkoušku lze hodnotit, jestliže do konce pozorování

přežije nejméně 80 % kontrolních buněčných kultur.

Po 14 dnech nebo v čase poslední virové sklizně, podle toho,

co je více, se shromáždí supernatantní tekutina z kontrolních

buněk a po 14 dnech se hodnotí na přítomnost

cizích agens (jak je popsáno výše pro virové inokulum

a sklizeň viru) inokulací vhodné buněčné kultury, v závislosti

na typu buněk použitých k růstu viru.

Zkouška na hemadsorpční viry. Jestliže jsou buněčné


kontrolní buňky, jak je popsáno výše ve zkoušce na

cizí agens v buněčných kulturách. Po 14 dnech nebo v čase

poslední virové sklizně, podle toho, co je více, se nejméně

25 % kontrolních kultur zkouší na přítomnost hemadsorpčních

virů přidáním morčecích erytrocytů. Jestliže není

možné provést zkoušku na hemadsorpční viry, provede se

zkouška na hemaglutinující viry. Jestliže jsou morčecí

erytrocyty skladovány, mají se nejdéle 7 dnů udržovat při

(5 ±3) °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace

při (5 ±3) °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C

až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorpčních agens.

Zkouška na kontrolních vejcích. Jestliže jsou vejce

použita pro produkci viru, 0,25 ml alantoidní tekutiny

z každého kontrolního vejce se zkouší na přítomnost

hemaglutinujících agens přímým smícháním s kuřecími

erytrocyty. Po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto:

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 305

2.6.17 ZKOUŠKA ANTIKOMPLEMENTÁRNÍ AKTIVITY IMUNOGLOBULINU

5 ml vzorku spojených amniových tekutin z kontrolních

vajec se inokuluje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do

amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují,

jestliže se v žádné z obou zkoušek nezjistí známky

přítomnosti hemaglutinujících agens.

Navíc se inokuluje 5 ml vzorku spojených amniových tekutin

z kontrolních vajec do vhodných vnímavých buněk,

včetně lidských, opičích a ptačích buněk. Buňky se pozorují

14 dnů při vhodné inkubační teplotě. Kontrolní vejce vyhovují,

jestliže se zkouškou neprokáží žádné známky přítomnosti

cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže do

konce doby pozorování přežije nejméně 80 % inokulovaných

kultur.

Viry ptačí leukózy. Pro každý virus kultivovaný v primárních

ptačích buněčných tkáních, nebo na vejcích se produkční

buněčná kultura (kontrolní buňky nebo kontrolní

vejce) zkouší na viry ptačí leukózy. Jestliže jsou buněčné


kontrolní buňky, jak je popsáno výše ve zkoušce na cizí

agens v buněčných kulturách, ještě před zkouškou na viry

ptačí leukózy. Za 14 dnů nebo v čase virové sklizně, podle

toho, které období je delší, se provede zkouška na viry ptačí

leukózy na DF-1 buňkách nebo na buněčných kulturách kuřecích

embryí prostých leukózy. Provede se pět pasáží, použije

se nejméně 5 ml supernatantní tekutiny z kontrolních

vajec nebo nejméně 10 ml vzorku směsné amniové tekutiny

z kontrolních vajec. Pro detekci exogenních ptačích retrovirů

(včetně viru ptačí leukózy) se může použít zkouška

PERT v konečném bodu (end-point) po DF-1 amplifikaci.

Pro specifické detekce viru ptačí leukózy se může použít

několik různých metod stanovení konečného bodu, jako je

imunobarvení, enzymově imunosorbentové stanovení

(ELISA) nebo zkouška vazby komplementu na ptačí leukózu

(COFAL). Kontrolní buňky nebo kontrolní vejce vyhovují,

jestliže se zkouškou neprokáží žádné známky přítomnosti

virů ptačí leukózy.

Zkouška na specifické viry zkouškou amplifikace nukleových

kyselin. Na základě posouzení rizika ve vztahu

k výrobnímu postupu, každé virové inokulum a každá virová

sklizeň mohou být zkoušeny metodami

amplifikace nukleových kyselin (2.6.21) na specifické viry,

které nejsou detekovatelné běžnými in vivo zkouškami

nebo stanoveními na buněčných kulturách.

Zkouška na viry za použití molekulárních metod se

širokou detekční kapacitou. Se souhlasem oprávněné autority

a na základě posouzení rizika se mohou použít molekulární

metody se širokou detekční kapacitou (např. HTS),

buď jako alternativní k in vivo zkouškám a specifickým

zkouškám amplifikace nukleových kyselin, nebo jako doplňkové/alternativní

k in vitro kultivačním zkouškám.

Obojí zkoušky, jak amplifikace nukleových kyselin

(2.6.21), tak i molekulární metody se širokou detekční kapacitou

se provádějí buď s, nebo bez předchozí amplifikace

na vhodných vybraných buňkách. V případě pozitivních

výsledků buď s molekulárními metodami se širokou detekční

kapacitou, nebo metodami amplifikace nukleových

kyselin, musí následující posuzování určit, zda je detekování

nukleových kyselin důsledkem přítomnosti infekčních

cizích agens a/nebo zda může znamenat riziko pro lidské

zdraví.

2.6.17 ZKOUŠKA ANTIKOMPLEMENTÁRNÍ

AKTIVITY IMUNOGLOBULINU

9.3:20617

Pro měření antikomplementární aktivity (ACA) imunoglobulinu

se inkubuje definované množství zkoušeného materiálu

(10 mg imunoglobulinu) s definovaným množstvím

morčecího komplementu (20 CH50) a zbývající komplement

se stanoví titrací. Antikomplementární aktivita se vyjadřuje

jako procentuální spotřeba komplementu vztažená

na kontrolu komplementu, která je 100 %.

Hemolytická jednotka aktivity komplementu (CH50) je

množství komplementu, které za daných podmínek reakce

způsobí lýzu 2,5 · 10 8 z celkových 5 · 10 8 optimálně senzibilizovaných

erytrocytů.

Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého

R a 5,083 g chloridu hořečnatého R se rozpustí ve

vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného

R a 25,48 g barbitalu sodné soli R se rozpustí ve

4000 ml vody R a pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou

1 mol/l RS na hodnotu 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního

roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml.

Zfiltruje se přes membránový filtr (jmenovitá velikost pórů

0,22 µm) a skladuje se ve skleněných obalech při 4 °C.

Roztok želatiny. 12,5 g želatiny R se rozpustí v asi 800 ml

vody R a zahřeje se ve vodní lázni k varu. Ochladí se na

20 °C a zředí se vodou R na 10 litrů. Zfiltruje se přes membránový

filtr (jmenovitá velikost pórů 0,22 µm). Skladuje

se při 4 °C. Použije se jen čirý roztok.

Citrátový roztok. 8,0 g natrium-citrátu R, 4,2 g chloridu

sodného R a 20,5 g glukosy R se rozpustí v 750 ml vody R;

pH se upraví roztokem kyseliny citronové monohydrátu R

(100 g/l) na hodnotu 6,1 a zředí se vodou R na 1000 ml.

Tlumivý roztok želatino-barbitalový. 4 objemové díly roztoku

želatiny se přidají k 1 objemovému dílu zásobního

tlumivého roztoku barbitalového a promíchá se. Je-li třeba,

upraví se pH hydroxidem sodným 1 mol/l RS nebo kyselinou

chlorovodíkovou 1 mol/l RS na hodnotu 7,3. Udržuje se při

4 °C. Denně se připravuje čerstvý roztok.

Stabilizovaná ovčí krev. Odebere se 1 objemový díl ovčí

krve do 1 objemového dílu citrátového roztoku a promíchá

se. Skladuje se při 4 °C nejméně 7 dnů a nejvýše 28 dnů.

(Stabilizovaná ovčí krev a ovčí erytrocyty jsou dostupné od

řady výrobců.)

Hemolyzin. Antisérum proti ovčím erytrocytům připravené

na králících. (Takováto antiséra jsou dostupná od řady výrobců.)

Morčecí komplement. Připraví se směs sér z krve nejméně

deseti morčat. Z koagulované krve se sérum oddělí odstředěním

při asi 4 °C. Sérum se skladuje v malých objemech

při teplotě nižší než –70 °C.

METODA

Příprava standardizované 5% suspenze ovčích erytrocytů.

Erytrocyty se odstředěním oddělí z přiměřeného objemu

stabilizované ovčí krve; buňky se nejméně třikrát promyjí

tlumivým roztokem želatino-barbitalovým a připraví se suspenze

5% (V/V) v tomto roztoku. Měření koncentrace buněk

v suspenzi se provádí takto: 0,2 ml se převede do 2,8 ml vo-

306 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.17 ZKOUŠKA ANTIKOMPLEMENTÁRNÍ AKTIVITY IMUNOGLOBULINU

dy R a lyzovaný roztok se odstřeďuje 5 min při 1000 g. Koncentrace

buněk vyhovuje, jestliže absorbance (2.2.25) supernatantní

tekutiny měřená při 541 nm je 0,62 ±0,01. Úprava

koncentrace buněk se provádí přidáním tlumivého roztoku

želatino-barbitalového podle vzorce:

v němž značí:

Vi

× A

= ,

0,62

Vf – konečný upravený objem;

Vi – počáteční objem;

A – absorbanci původní suspenze při 541 nm.

Upravená suspenze obsahuje asi 1 · 10 9 buněk v 1 ml.

Titrace hemolyzinu. Schéma přípravy ředění hemolyzinu

je uvedeno v tabulce 2.6.17-1.

Do každé zkumavky, počínaje ředěním 1 : 75, se přidá

1,0 ml 5% suspenze ovčích erytrocytů a promíchá se. Inkubuje

se 30 min při 37 °C. Z každé zkumavky takto inkubované

směsi se odebere 0,2 ml do nové zkumavky, přidá se

1,10 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového a 0,2 ml

ředěného morčecího komplementu (např. 1 : 150). Provádí

se dvojmo.

Jako nehemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři zkumavky

s 1,4 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového

a 0,1 ml 5% suspenze ovčích erytrocytů.

Jako plně hemolyzovaná buněčná kontrola se připraví tři

zkumavky s 1,4 ml vody R a 0,1 ml 5% suspenze ovčích

erytrocytů.

Všechny zkumavky se inkubují 60 min při 37 °C a odstřeďují

se 5 min při 1000 g. Změří se absorbance (2.2.25) horních

vrstev při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy

v každé zkumavce v procentech podle vzorce:

v němž značí:

V

f

A - A

a

b

× 100 ,

Aa – absorbanci zkumavek s ředěným hemolyzinem;

Ab – průměr absorbancí tří zkumavek s plnou hemolýzou;

A1 – průměr absorbancí tří zkumavek bez hemolýzy.

1

A - A

1

Sestrojí se lineární graf; na ordinátu se vynese procentuální

stupeň hemolýzy, na abscisu odpovídající převrácená hodnota

ředění hemolyzinu. Z grafu se určí optimální ředění

hemolyzinu. Vybere se to ředění, kde již další vzestup obsahu

hemolyzinu nezpůsobuje patrné změny ve stupni hemolýzy.

Toto ředění je definované jako jedna minimální

hemolytická jednotka (1 MHU) v 1,0 ml. Optimální hemolytické

ředění hemolyzinu pro přípravu senzibilizovaných

ovčích erytrocytů obsahuje 2 MHU/ml.

Titraci hemolyzinu lze hodnotit, jestliže maximum hemolýzy

je v rozmezí 50 % až 70 %. Není-li maximum v tomto

rozmezí, je nutno titraci opakovat s více nebo méně ředěným

roztokem komplementu.

Příprava optimálně senzibilizovaných ovčích erytrocytů

(hemolytický systém). Připraví se vhodný objem ředěného

hemolyzinu, který obsahuje 2 MHU v mililitru, a stejný objem

standardizované 5% suspenze ovčích erytrocytů. Ke

standardizované buněčné suspenzi se přidá ředěný hemolyzin

a promíchá se. Inkubuje se 15 min při 37 °C, udržuje se

při 2 °C až 8 °C a použije se do 6 h.

Titrace komplementu. Připraví se vhodné ředění komplementu

(např. 1 : 250) tlumivým roztokem želatino-barbitalovým

a provede se dvojmo titrace podle tabulky 2.6.17-2.

Tab. 2.6.17-1

Požadované

ředění

hemolyzinu

7,5

10

75

100

150

200

300

400

600

800

1200

1600

2400

3200 *

4800 *

K přípravě se použije

tlumivý roztok

želatino-barbitalový

objem

(ml)

0,65

0,90

1,80

1,80

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

* odstraní se 1,0 ml směsi.

Tab. 2.6.17-2

Číslo zkumavky

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

tři zkumavky

s 0% hemolýzou

jako buněčná

kontrola

tři zkumavky se

100% hemolýzou

ředění

neředěno

neředěno

1 : 7,5

1 : 10

1 : 75

1 : 100

1 : 150

1 : 200

1 : 300

1 : 400

1 : 600

1 : 800

1 : 1200

1 : 1600

1 : 2400

Objem ředěného

komplementu

(např. 1 : 250)

(ml)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

hemolyzin

objem

(ml)

0,1

0,1

0,2

0,2

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Objem tlumivého

roztoku želatino-

-barbitalového

(ml)

1,2

1,1

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

– 1,3

– 1,3 ml vody

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 307

2.6.18 ZKOUŠKA NEUROVIRULENCE ŽIVÝCH VIROVÝCH VAKCÍN

Do každé zkumavky se přidá 0,2 ml senzibilizovaných ovčích

erytrocytů, dobře se promíchá a inkubuje se 60 min při

37 °C. Zkumavky se ochladí v lázni s ledem a odstřeďují se

5 min při 1000 g. Změří se absorbance supernatantní tekutiny

při 541 nm a vypočítá se stupeň hemolýzy (Y) podle

vzorce:

v němž značí:

Ac – absorbanci zkumavek 1 až 12;

Ab – průměr absorbancí zkumavek se 100% hemolýzou;

A1 – průměr absorbancí buněčných kontrol s 0% hemolýzou.

Na logaritmický papír se vynese Y/(1 – Y) jako abscisa proti

obsahu ředěného komplementu v mililitru jako ordináta. Body

se co nejlépe proloží křivka a určí se ordináta pro 50% hemolytickou

dávku komplementu, kde Y/(1 – Y) = 1,0. Vypočítá

se aktivita v hemolytických jednotkách (CH50/ml) podle

vzorce:

v němž značí:

Cd – převrácenou hodnotu ředění komplementu;

Ca – objem ředěného komplementu, kde došlo k 50% hemolýze,

v mililitrech;

5 – přepočítací faktor v souvislosti s počtem erytrocytů.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže spojnice mezi 15% a 85%

hemolýzou je přímkou, jejíž sklon je 0,15 až 0,40, a přednostně

0,18 až 0,30.

Zkouška antikomplementární aktivity. Připraví se ředění

komplementu o 100 CH50/ml zředěním vytitrovaného morčecího

komplementu tlumivým roztokem želatino-barbitalovým.

V závislosti na zkoušeném imunoglobulinu a na validačních

údajích se upraví pH zkoušeného imunoglobulinu na

hodnotu 7, je-li třeba. Pro imunoglobulin o obsahu 50 mg/ml

se připraví směs k inkubaci podle následující tabulky.

Tab. 2.6.17-3

imunoglobulin

(50 mg/ml)

tlumivý roztok

želatino-barbitalový

komplement

Ac

- A1

,

A - A

b

Zkoušený

imunoglobulin

0,2 ml

0,6 ml

0,2 ml

Kontrola

komplementu

(dvojmo)

–

0,8 ml

0,2 ml

Současně se zkoušeným imunoglobulinem se provede

zkouška s imunoglobulinem lidským pro antikomplementární

aktivitu BRP, jak je doporučeno v příbalové informaci

referenčního přípravku pro negativní a pozitivní kontrolu

antikomplementární aktivity. Jestliže koncentrace zkoušeného

imunoglobulinu kolísá kolem 50 mg/ml, přidá se větší

nebo menší objem vzorku a tlumivého roztoku želatino-

-barbitalového, např. 0,47 ml tlumivého roztoku želatino-

-barbitalového se přidá k 0,33 ml imunoglobulinu o obsahu

30 mg/ml, aby se dosáhlo objemu 0,8 ml. Zkumavky se

1

Cd

,

C × 5

a

uzavřou a inkubují se 60 min při 37 °C. 0,2 ml z každé inkubované

směsi se přidá k 9,8 ml tlumivého roztoku želatino-barbitalového,

aby se zředil komplement. Provede se titrace

komplementu v každé zkumavce tak, jak je popsáno

výše, aby se určila zbytková aktivita komplementu (viz tabulku

2.6.17-2). Antikomplementární aktivita zkoušeného

přípravku, vztaženo na kontrolu komplementu, která je

uvažována jako 100%, se vypočítá podle vzorce:

a - b

× 100

a

v němž značí:

a – průměr aktivity kontrolního komplementu (CH50/ml);

b – aktivitu komplementu (CH50/ml) zkoušeného přípravku.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

– antikomplementární aktivity nalezené pro negativní a pozitivní

kontrolu jsou v limitech stanovených v příbalové

informaci referenčního přípravku;

– průměr aktivity kontrolního komplementu (a) je v rozmezí

80 CH50 až 120 CH50 v mililitru.

2.6.18 ZKOUŠKA NEUROVIRULENCE

ŽIVÝCH VIROVÝCH VAKCÍN

6.0:20118

Pro každou zkoušku se použije nejméně deset opic séronegativních

na zkoušený virus. Každé opici se podá nejvýše

0,5 ml zkoušeného přípravku do thalamické oblasti každé

hemisféry, pokud není uvedeno jinak. Celkové množství viru

inokulovaného každé opici nesmí být nižší než množství

obsažené v jedné doporučené lidské dávce vakcíny. Jako

kontrola proti zavlečení divokého neurovirulentního viru se

chová skupina nejméně čtyř kontrolních opic ve druhé části

klece nebo v těsném sousedství naočkovaných zvířat. Očkované

opice se pozorují 17 dnů až 21 dnů, sledují se příznaky

ochrnutí nebo jiné známky neurologického poškození;

kontrolní opice se pozorují stejně dlouhou dobu a navíc

ještě 10 dnů. Zvířata, která uhynou do 48 h po injekci, se

vyřadí jako úhyn z nespecifických příčin a mohou se nahradit.

Zkoušku nelze hodnotit, jestliže více než 20 % naočkovaných

zvířat uhyne z nespecifických příčin nebo jestliže

se ve vzorcích séra odebraných od kontrolních opic

v době očkování zkoušených zvířat a také 10 dnů po šetrném

usmrcení zkoušených zvířat prokáže infekce divokým

virem typu zkoušeného viru nebo viru spalniček. Na závěr

pozorování se provede pitva a histopatologické vyšetření

odpovídajících oblastí mozku prokazujících poškození centrálního

nervového systému. Zkoušený přípravek vyhovuje

zkoušce, jestliže zvířata nevykazují žádné neočekávané klinické

příznaky nebo histopatologické důkazy poškození

centrálního nervového systému, které by se mohlo přisuzovat

inokulovanému viru.

2.6.20 HEMAGLUTININY ANTI-A A ANTI-B

9.8:20620

METODA A: NEPŘÍMÁ METODA

Připraví se dvě stejné řady zkoušeného přípravku postupně

ředěného roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému

,

308 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.20 HEMAGLUTININY ANTI-A A ANTI-B

ředění první řady se přidá stejný objem 5% (V/V) suspenze

erytrocytů krevní skupiny A1 předem třikrát promytých roztokem

chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění

ostatních řad se přidá stejný objem 5% (V/V) suspenze erytrocytů

skupiny B předem třikrát promytých roztokem

chloridu sodného R (9 g/l). Tyto suspenze se inkubují

30 min při 37 °C a pak se erytrocyty třikrát promyjí roztokem

chloridu sodného R (9 g/l). Erytrocyty se ponechají

30 min v kontaktu s polyvalentním sérem proti lidským

globulinům. Bez odstředění se každá suspenze mikroskopicky

vyšetří na aglutinaci.

METODA B: PŘÍMÁ METODA

MATERIÁL

Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným (PBS

roztok). 8,0 g chloridu sodného R, 0,76 g hydrogenfosforečnanu

sodného bezvodého R, 0,2 g chloridu draselného R

a 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve

vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Má-li se roztok uchovávat

několik dnů, může se přidat 0,2 g azidu sodného R, aby se

zabránilo mikrobiální kontaminaci.

Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným obsahující

albumin hovězí (PBS-BSA roztok). PBS roztok obsahující

albumin hovězí R (2 g/l) (Cohnova frakce V, pro

ELISA). Roztok se udržuje při 2 °C až 8 °C, ale před použitím

se může zvýšit na 19 °C až 25 °C.

Roztok papainu. Použije se komerčně dostupný papain jakosti

pro sérologii, jehož aktivita byla validována.

Erytrocyty. Použije se směs D-negativních erytrocytů od

přednostně tří dárců skupiny A1 (A1rr), B (Brr) a 0 (0rr).

Pokud se použije imunoglobulin pro zkoušku na protilátky

anti-A a anti-B limitní zkouška BRP, měli by se použít tři

dárci. Nedoporučuje se použití erytrocytů skupiny A2,

vzhledem k jejich slabé reakci.

Buňky se promyjí PBS roztokem čtyřikrát nebo se promývají

tak dlouho, až je supernatantní tekutina čirá. Každé

promytí znamená suspendovat buňky v nejméně dvou objemových

dílech PBS roztoku, buňky se odstřeďují 5 min

při 1800 g, aby se vytvořil shluk buněk a supernatantní tekutina

se odstraní. Sedimentované buňky se ošetří roztokem

papainu podle pokynů výrobce a čtyřikrát se promyjí

PBS roztokem.

Erytrocyty se mohou uchovávat v konzervačním roztoku

nejdéle jeden týden při 2 °C až 8 °C. Je vhodné použít následující

složení:

natrium-citrát

8 g/l

D-glukosa

20 g/l

kyselina citronová monohydrát

0,5 g/l

chlorid sodný

4,2 g/l

inosin

0,938 g/l

adenosin-trifosfát (ATP)

0,4 g/l

chloramfenikol

0,34 g/l

neomycin-sulfát

0,1 g/l

Pokud se použijí buňky uchovávané v konzervačním roztoku,

promyjí se PBS roztokem nejméně dvakrát nebo tak

dlouho, až je supernatantní tekutina čirá.

Mikrotitrační destičky. Použijí se pevné mikrotitrační destičky

s jamkami ve tvaru V.

Referenční standardy. Jako referenční přípravek je vhodné

pro pozitivní kontrolu použít imunoglobulin pro zkoušku na

protilátky anti-A a anti-B pozitivní kontrola BRP a pro negativní

kontrolu imunoglobulin pro zkoušku na protilátky

anti-A a anti-B negativní kontrola BRP; přípravky se mají

použít podle pokynů výrobce a jsou určeny pro přímou metodu

stanovení hemaglutininů anti-A a anti-B.

Imunoglobulin pro zkoušku na protilátky anti-A a anti-B

limitní zkouška BRP definuje doporučené maximální limity

povolené pro šarže lidského imunoglobulinu a musí se použít

pouze pro porovnání se šaržemi lidského imunoglobulinu,

který má vyšší titry než pozitivní kontrola.

POSTUP

Zkouška popsaná v této stati se provádí při teplotě místnosti

s roztoky pozitivní kontroly, roztoky negativní kontroly

a se zkoušenými roztoky současně a za stejných podmínek.

Kdykoliv je třeba, provede se další zkouška s imunoglobulinem

pro zkoušku na protilátky anti-A a anti-B limitní

zkouška BRP.

Porovnávací roztoky. Pozitivní kontroly a negativní kontroly

se rekonstituují podle návodu. Každý z rekonstituovaných

přípravků má koncentraci imunoglobulinu G (IgG)

(50 g/l). Připraví se dvojnásobná ředění každého rekonstituovaného

přípravku PBS-BSA roztokem na koncentraci

imunoglobulinu G (25 g/l). Připraví se dalších sedm sériových

dvojnásobných ředění každého přípravku za použití

PBS-BSA roztoku, aby se rozsah ředění rozšířil do 1/256

(0,195 g/l imunoglobulinu G). Na mikrotitrační destičku se

nanese trojmo po 20 µl každého ředění každého přípravku.

Zkoušené roztoky. Zkoušený přípravek se zředí PBS-BSA

roztokem na počáteční koncentraci imunoglobulinu G

(25 g/l). Přípravek o koncentraci imunoglobulinu G (50 g/l)

se zředí dvojnásobně; pro přípravky o koncentraci imunoglobulinu

G jinou než 50 g/l se ředicí faktor upraví tak, aby

počáteční koncentrace pro zkoušku byla 25 g/l. Této koncentraci

se přiřadí jmenovitý dvojnásobný ředicí faktor pro

porovnání s porovnávacími roztoky, i když to neodpovídá

skutečnému ředicímu faktoru použitému k dosažení koncentrace

25 g/l. Připraví se sedm dalších sériových dvojnásobných

ředění každého přípravku za použití PBS-BSA

roztoku, aby se rozsah ředění rozšířil do 1/256 (0,195 g/l

imunoglobulinu G) pro porovnání s porovnávacími roztoky

o stejném rozsahu koncentrace imunoglobulinu G. Na mikrotitrační

destičku se nanese trojmo po 20 μl každého ředění

přípravku.

Pro přípravky s koncentrací imunoglobulinu G nižší než

25 g/l se naředí počáteční koncentrace, která odpovídá nejnižší

koncentraci porovnávacích roztoků. Tomuto roztoku

se přidělí stejný jmenovitý ředicí faktor, jako odpovídajícímu

porovnávacímu roztoku o stejné koncentraci imunoglobulinu

G. Při přípravě dvojnásobných ředění přípravku

se postupuje, jak je uvedeno výše.

Připraví se 3% (V/V) suspenze papainem ošetřených D-negativních

erytrocytů skupiny A1, B a 0 v PBS-BSA roztoku.

K první, druhé a třetí řadě ředění zkoušeného přípravku,

pozitivní a negativní kontroly se přidá po 20 μl D-negativních

A1, B a 0 erytrocytů. Obsah jamek se promíchá 10 s na

třepačce (nebo dokud buňky nejsou resuspendovány).

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 309

2.6.21 TECHNIKY AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

Destička se 1 min odstřeďuje při 80 g při teplotě místnosti,

aby se vytvořil shluk buněk, a umístí se pod úhlem přibližně

70°. Odečítá se po 4 min až 5 min nebo až stečou buňky

v jamkách s negativní kontrolou (D-negativní 0 erytrocyty

a negativní kontrolní roztok). Shluk buněk na dně jamky

značí pozitivní výsledek, stékající buňky značí negativní

výsledek.

Zaznamená se konečný bod titru jako převrácená hodnota

nejvyššího ředění, které poskytuje pozitivní výsledek.

Pozitivní kontrola má jmenovitý anti-A a anti-B titr 32 (rozmezí

32 až 64 pro anti-A a rozmezí 16 až 32 pro anti-B)

a negativní kontroly (D-negativní 0 erytrocyty a negativní

kontrolní roztok) nesmí vykázat aglutinaci při počátečním

ředění 1 : 2. Uživatelé musí své vlastní podmínky zkoušek

validovat a provést prověření použitých zkoumadel a podmínek

zkoušky v případě, že výsledky zkoušení se významně

liší od těchto očekávaných hodnot. Selhání negativní reakce

s negativními kontrolami může např. znamenat, že neuplynula

dostatečně dlouhá doba pro stékání buněk nebo že byla

použita zkoumadla přímo z chlazeného skladu.

Jestliže jmenovitý anti-A a anti-B titr zkoušeného přípravku

je vyšší než titr pozitivní kontroly, měl by se zkoušený přípravek

porovnat s imunoglobulinem pro zkoušku na protilátky

anti-A a anti-B limitní zkouška BRP.

Nejvyšší povolený titr je 64.

2.6.21 TECHNIKY AMPLIFIKACE

NUKLEOVÝCH KYSELIN

8.2:20621

1 ÚVOD

Techniky amplifikace nukleových kyselin jsou založeny na

dvou rozdílných přístupech:

1. amplifikaci cílové sekvence nukleové kyseliny používající

např. polymerasovou řetězovou reakci (PCR), ligasovou

řetězovou reakci (LCR) nebo izotermální amplifikaci

ribonukleové kyseliny (RNA);

2. amplifikaci hybridizačního signálu používající např. pro

kyselinu deoxyribonukleovou metodu tzv. větvené

DNA (bDNA); v tomto případě se amplifikace signálu

docílí bez vystavení nukleové kyseliny opakovaným

amplifikačním cyklům.

V této obecné stati se jako referenční technika popisuje metoda

polymerasové řetězové reakce. Mohou se používat alternativní

metody, pokud splňují dále popsané požadavky

na jakost.

2 ROZSAH PŮSOBNOSTI

Tato stať zavádí požadavky na přípravu vzorku, na amplifikaci

sekvencí DNA in vitro a na detekci specifického produktu

polymerasové řetězové reakce. Za pomoci polymerasové

řetězové reakce se mohou detekovat definované sekvence

DNA. Rovněž sekvence RNA se mohou detekovat

po reverzní transkripci RNA na komplementární DNA

(cDNA) a následné amplifikaci.

3 PRINCIP METODY

Polymerasová řetězová reakce je postup umožňující in vitro

specifickou amplifikaci segmentů DNA nebo segmentů

RNA po jejich reverzní transkripci na cDNA.

Po denaturaci dvouřetězcové DNA na jednořetězcovou

DNA se dva syntetické oligonukleotidové primery opačné

polarity přihybridizují k odpovídajícím komplementárním

sekvencím DNA, která se má amplifikovat. Krátké dvouřetězcové

úseky, které jsou výsledkem specifického párování

mezi primery a komplementární sekvencí DNA, ohraničují

segment DNA, který se bude amplifikovat, a slouží jako

výchozí body pro syntézu DNA in vitro pomocí tepelně

stabilní DNA polymerasy.

Amplifikace DNA probíhá v cyklech, které tvoří:

– tepelná denaturace nukleové kyseliny (cílové sekvence)

na dva jednoduché řetězce;

– specifické přihybridizování primerů k cílové sekvenci za

vhodných reakčních podmínek;

– prodloužení primerů, které jsou navázány na oba jednoduché

řetězce, DNA polymerasou při vhodné teplotě

(syntéza DNA).

Opakované cykly tepelné denaturace, přihybridizování

primerů a syntézy DNA vedou k exponenciální amplifikaci

segmentu DNA vymezeného primery.

Specifický produkt polymerasové řetězové reakce, známý

jako amplikon, může být detekován různými metodami

vhodné specificity a citlivosti.

V několikanásobných zkouškách polymerasové řetězové

reakce se využívá několika párů primerů navržených pro

souběžnou amplifikaci různých cílů v jedné reakci.

4 ZKOUŠENÝ MATERIÁL

Z důvodu vysoké citlivosti metody polymerasové řetězové

reakce se musí vzorky chránit před vnější kontaminací cílovými

sekvencemi. Vzorkování, skladování a doprava

zkoušeného materiálu se provádějí za podmínek minimalizujících

degradaci cílové sekvence. Pro cílové sekvence

RNA je třeba zvláštní opatrnosti, neboť RNA je vysoce citlivá

na degradaci ribonukleasami. Je třeba věnovat pozornost

i tomu, že některé přidávané látky, jako antikoagulancia

nebo protimikrobní konzervační látky, mohou narušovat

průběh zkoušky.

5 ZKUŠEBNÍ METODA

5.1 Zamezení kontaminaci

Riziko kontaminace vyžaduje přísné oddělení prostor podle

zpracovávaného materiálu a používané technologie. Faktory,

které je třeba zvážit, jsou pohyb personálu, pracovní

oděv, pohyb materiálu, větrání a dekontaminační postupy.

Systém by se měl rozdělit do několika oddělených prostorů,

jako jsou:

– prostor pro přípravu reakční směsi (master-mix) (prostor,

kde se zachází výhradně s materiály neobsahujícími matrice,

jako jsou např. primery, tlumivé roztoky atd.);

– prostor pro práci před polymerasovou řetězovou reakcí

(prostor, kde se zachází se zkoumadly, vzorky a kontrolami);

– prostor pro amplifikace polymerasovou řetězovou reakcí

(s amplifikovaným materiálem se zachází v uzavřeném

systému);

– prostor pro detekci po polymerasové řetězové reakci (jediný

prostor, kde se zachází s amplifikovaným materiálem

v otevřeném systému).

310 ČL 2017 – Dopl. 2020


Jestliže se zkoušky provádí v uzavřeném systému, přísné

oddělení prostor se nevyžaduje.

5.2 Příprava vzorku

Při přípravě vzorku se cílová sekvence pro amplifikaci extrahuje

nebo uvolňuje ze zkoušeného materiálu opakovatelným

způsobem tak, aby bylo možné provést amplifikaci za

zvolených reakčních podmínek. Mohou se použít různé

způsoby fyzikálně-chemické extrakce a/nebo obohacovací

metody.

Přísady přítomné ve zkoušeném materiálu mohou zasahovat

do polymerasové řetězové reakce. Pro kontrolu nepřítomnosti

inhibitorů pocházejících ze zkoušeného materiálu

se musí použít postupy uvedené v odstavci 7.3.2.

V případě matric RNA se musí přijmout opatření, aby se

zabránilo působení ribonukleasy.

5.3 Amplifikace

Amplifikace cílové sekvence metodou polymerasové řetězové

reakce se provádí opakovanými cykly v definovaných

podmínkách (teplotní profil pro denaturaci dvouřetězcové

DNA, přihybridizování primerů a jejich prodlužování, inkubační

časy při zvolených teplotách, rychlost nabíhání

zvolených teplot). Tyto podmínky závisí na různých parametrech,

jako jsou:

– délka a složení bází primerů a cílových sekvencí;

– typ DNA polymerasy, složení tlumivého roztoku

a reakční objemy použité pro amplifikaci;

– typ použitého termocykleru a koeficient teplotní vodivosti

mezi přístrojem, reakční zkumavkou a reagující tekutinou.

5.4 Detekce

Amplikon vytvořený metodou polymerasové řetězové reakce

se může identifikovat velikostí, sekvencí, chemickou

modifikací nebo kombinací těchto parametrů. Detekce

a charakterizace na základě velikosti se může dosáhnout

gelovou elektroforézou (použije se vrstva agarosového nebo

polyakrylamidového gelu nebo kapilární elektroforéza)

nebo chromatografií na koloně (např. kapalinová chromatografie).

Detekce a charakterizace na základě složení sekvencí

se může provést specifickou hybridizací vzorků, které

mají sekvence komplementární k cílové sekvenci, nebo štěpením

amplifikovaného materiálu restrikčním enzymem ve

specifických místech pro cílovou sekvenci. Detekce a charakterizace

chemickou modifikací se může provést např.

inkorporací fluoroforu do amplikonů a následnou detekcí

fluorescence po excitaci.

Detekce amplikonů se také může provést za použití značených

sond umožňujících následnou chemiluminiscenční,

radioizotopovou nebo imunoenzymatickou detekci.

6 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Výsledky jsou platné pouze tehdy, jsou-li pozitivní kontroly

jednoznačně pozitivní a negativní kontroly jednoznačně

negativní. Vysoká citlivost metody polymerasové řetězové

reakce a potenciální riziko kontaminace vyžadují potvrzení

pozitivních výsledků dvojím opakováním celého zkušebního

postupu, pokud možno s novým množstvím vzorku.

Vzorek se považuje za pozitivní, jestliže alespoň jedna

z opakovaných zkoušek je pozitivní. Jakmile je definována

prahová měřitelnost cíle, požaduje se kvantitativní systém

zkoušek.

7 JIŠTĚNÍ JAKOSTI

7.1 Validace systému zkoušky

polymerasové řetězové reakce

Validační program musí zahrnovat validaci přístrojů a validaci

použitých metod polymerasové řetězové reakce. Doporučení

jsou obsažena v ICH Pokynu Q2(R1) Validace analytických

metod: texty a metodologie.

Vhodné oficiální pracovní referenční přípravky nebo vlastní

pracovní referenční přípravky kalibrované proti mezinárodnímu

standardu na cílové sekvence se použijí pro validaci

zkoušky polymerasové řetězové reakce, pokud jsou dostupné.

7.1.1 Stanovení pozitivní limitní hodnoty

Při validaci kvalitativní zkoušky se musí stanovit pozitivní

limitní hodnota. Pozitivní limitní hodnota je definována jako

minimální počet cílových sekvencí v objemu vzorku,

které mohou být detekovány v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní

limitní hodnota závisí na vzájemně souvisejících faktorech,

jako jsou objem extrahovaného vzorku a účinnost

extrakční metody, přepis cílové RNA na cDNA, amplifikační

postup a detekce.

Pro stanovení meze detekce zkušebního systému se musí

uvést odkaz na pozitivní limitní hodnotu pro každou cílovou

sekvenci a provedení zkoušky nad a pod tímto bodem.

7.1.2 Kvantitativní zkouška

Pro kvantitativní zkoušku se během validace stanoví následující

parametry: správnost, přesnost, specificita, mez stanovitelnosti,

linearita, rozsah a robustnost.

7.2 Kontrola jakosti zkoumadel

Všechna zkoumadla potřebná pro metodu se musí před běžným

použitím kontrolovat. Jejich přijatelnost/nepřijatelnost

je dána předem definovanými kritérii jakosti.

Primery jsou klíčovou složkou zkoušky polymerasové řetězové

reakce a je nutné věnovat pečlivou pozornost jejich

složení, čistotě a validaci jejich použití ve zkoušce polymerasové

řetězové reakce. Primery se mohou modifikovat

(např. konjugací s fluoroforem nebo antigenem), aby se

umožnilo použití specifické metody detekce amplikonu,

a to za předpokladu, že tyto modifikace neinhibují přesnou

a účinnou amplifikaci cílové sekvence.

7.3 Průběžná kontrola

7.3.1 Vnější kontroly

K minimalizaci rizika kontaminace a zajištění dostatečné

citlivosti jsou do každé zkoušky polymerasové řetězové reakce

zařazeny následující vnější kontroly:

– pozitivní kontrola: obsahuje definovaný počet kopií cílových

sekvencí, počet je dán pozitivní limitní hodnotou, je

stanoven zvlášť pro každý zkušební systém a určen jako

násobek pozitivní limitní hodnoty zkušebního systému;

– negativní kontrola: vzorek vhodné matrice prokazatelně

neobsahující cílové sekvence.

7.3.2 Vnitřní kontroly

Vnitřní kontroly jsou definované sekvence nukleových kyselin

obsahující, není-li předepsáno jinak, vazebná místa

pro primery. Vnitřní kontroly se musí amplifikovat s definovaným

účinkem a amplikony musí být jasně rozpoznatelné.

Vnitřní kontroly musí být téhož typu nukleové kyseliny

(DNA/RNA) jako zkoušený materiál. Vnitřní kontrola

se přednostně přidává ke zkoušenému materiálu před izola-

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 311


cí nukleové kyseliny a slouží proto jako celková kontrola

(extrakce, reverzní transkripce, amplifikace, detekce).

7.3.3 Prahové kontroly

Prahové kontroly pro kvantitativní zkoušky tvoří zkoušený

vzorek se stanovovanou látkou v koncentraci, která je definována

jako nepřekročitelný práh. Obsahuje stanovovanou

látku vhodně kalibrovanou v mezinárodních jednotkách

a analyzuje se souběžně v každém zkušebním cyklu.

7.4 Vnější hodnocení jakosti

Účast v programech vnějšího hodnocení jakosti je důležitým

postupem jištění jakosti polymerasové řetězové reakce

pro každou laboratoř a každého pracovníka.

Následující části jsou uvedeny pro informaci.

Validace metod amplifikace nukleových kyselin

(NAT) pro detekci RNA viru hepatitidy C (HCV)

ve směsích plazmy: pokyny

1 ÚVOD

Většinu analytických postupů amplifikace nukleových kyselin

tvoří kvalitativní (kvantální) zkoušky na přítomnost nukleových

kyselin spolu s některými kvantitativními zkouškami

(buď vlastními, nebo komerčními), jež jsou dostupné. Pro

detekci kontaminace RNA HCV ve směsích plazmy jsou dostačující

kvalitativní zkoušky a mohou se považovat za limitní

zkoušku pro kontrolu nečistot, jak je popsáno v Technických

pokynech pro vypracování článků (Pharmeuropa,

prosinec 1999), kapitola III „Validace analytických postupů“.

Tyto pokyny popisují metody validace pouze kvalitativních

analytických postupů amplifikace nukleových kyselin

pro hodnocení kontaminace RNA HCV ve směsích plazmy.

Proto jsou pro validaci analytické metody považovány za

nejzávažnější dvě charakteristiky: specificita a mez detekce.

Navíc je možné hodnotit robustnost metody.

Nicméně se tento dokument může použít jako obecný základ

pro validaci amplifikace nukleových kyselin.

Pro účel tohoto dokumentu se analytický postup definuje

jako úplný postup od extrakce nukleové kyseliny až po detekci

amplifikovaných produktů.



charakteristiky dokumentované výrobcem tohoto kitu nahradit

validaci uživatelem. Účinnost kitu s ohledem k zamýšlenému

použití by však měla být uživatelem prokázána

(např. mez detekce, robustnost, křížová kontaminace).

2 SPECIFICITA

Specificita je schopnost jednoznačně stanovit nukleovou

kyselinu v přítomnosti složek, jejichž přítomnost je předvídatelná.

Specificita analytického postupu amplifikace nukleových

kyselin je závislá na výběru primerů, výběru vzorků (pro

analýzu konečného produktu) a přísnosti zkušebních podmínek

(pro amplifikační i detekční kroky).

Při navrhování primerů a vzorků by se jejich specificita

k detekci pouze RNA HCV měla ověřovat srovnáním vybraných

sekvencí se sekvencemi v publikovaných databankách.

Pro HCV se budou primery (a vzorky) obvykle vybírat

z oblasti 5´ nekódující části HCV genomu, která je pro

všechny genotypy vysoce konzervativní.

Amplifikovaný produkt by měl být jednoznačně určen za

použití některé z metod, jako jsou amplifikace vlastními

primery, restrikční enzymová analýza, sekvenování nebo

hybridizace se specifickým vzorkem.

K validaci specificity analytických postupů se zkouší nejméně

sto směsí plazmy RNA HCV negativních, směsi by měly

být nereaktivní. Vhodné vzorky nereaktivních směsí jsou dostupné

v Evropském direktorátu pro jakost léčiv (EDQM).

Schopnost analytických postupů detekovat všechny HCV

genotypy závisí opět na výběru primerů, vzorků a parametrech

metody. Tato schopnost by se měla prokázat za

použití charakterizovaných referenčních panelů. Když je

obtížné získat vzorky některých genotypů (např. genotypu

6), měly by se na příslušné úrovni detekovat nejvíce

převládající genotypy (např. v Evropě genotypy 1 a 3).

3 MEZ DETEKCE

Mez detekce jednotlivého analytického postupu je nejnižší

množství nukleové kyseliny ve vzorku, které se může detekovat,

ale není nutné je kvantifikovat jako přesnou hodnotu.

Analytický postup amplifikace nukleové kyseliny použitý

pro detekci RNA HCV ve směsích plazmy obvykle poskytuje

kvalitativní výsledky. Počet možných výsledků je

omezen na dva, buď pozitivní, nebo negativní. Přestože se

doporučuje stanovení meze detekce, měla by se pro praktické

účely analytického postupu amplifikace nukleových

kyselin stanovit pozitivní limitní hodnota. Pozitivní limitní

hodnota [jak je definována v této obecné stati (2.6.21)] je

minimální počet cílových sekvencí na objem vzorku, který

se může detekovat v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní

hodnota je ovlivňována distribucí virových genomů

v jednotlivých zkoušených vzorcích a také faktory, jako je

enzymový účinek, které mohou způsobit rozdíly pozitivních

limitních hodnot v 95 % jednotlivých sérií analytických

zkoušek.

K určení pozitivní limitní hodnoty se používají ředicí série

pracovních zkoumadel nebo viru hepatitidy C BRP, který

byl kalibrován proti mezinárodnímu standardu WHO HCV

a měl by se zkoušet v různých dnech, aby se postihly rozdíly

mezi zkušebními sériemi. Zkouší se nejméně tři nezávislé

ředicí série s dostatečným počtem opakování v každém

ředění, aby se pro každé ředění získalo dvacet čtyři výsledků

způsobilých ke statistickému hodnocení.

Laboratoř může např. zkoušet tři ředicí série v různých

dnech v osmi opakováních pro každé ředění, čtyři ředicí série

v různých dnech se šesti opakováními pro každé ředění

nebo šest ředicích sérií v různých dnech ve čtyřech opakováních

pro každé ředění. K udržení počtu ředění na zvládnutelné

úrovni by se měla provést předběžná zkouška (např.

za použití logaritmického ředění vzorku směsi plazmy), aby

se získal předběžný výsledek pro pozitivní limitní hodnotu

(tj. nejvyšší ředění poskytující pozitivní signál). Rozsah ředění

se může vybrat kolem předurčené limitní hodnoty

(např. za použití ředicího faktoru 0,5 log nebo méně, a negativní

směsi plazmy pro ředicí matrici). Koncentrace RNA

HCV, která byla detekovaná v 95 % zkušebních sérií, se

může vypočítat vhodným statistickým vyhodnocením.

Tyto výsledky mohou sloužit rovněž k prokázání odchylek

uvnitř zkoušky a každodenních odchylek analytického postupu.

312 ČL 2017 – Dopl. 2020


4 ROBUSTNOST

Robustnost analytického postupu je míra jeho kapacity zůstat

nedotčen malými, ale záměrnými odchylkami v parametrech

metody a poskytuje údaje o jeho spolehlivosti při

běžném použití.

Vyhodnocení robustnosti by se mělo zvážit během vývojové

fáze. Mělo by ukázat spolehlivost analytického postupu

s ohledem na záměrné odchylky v parametrech metody. Pro

metody amplifikace nukleových kyselin mohou být malé

odchylky v parametrech metody rozhodující. Robustnost

metody se může prokázat při jejím vývoji, kdy se zkoušejí

malé odchylky v koncentraci zkoumadel (např. chloridu hořečnatého,

primerů nebo dNTP). K důkazu robustnosti se

použije nejméně dvacet směsí plazmy negativních na RNA

HCV (náhodně vybraných), záměrně kontaminovaných

RNA HCV do konečné koncentrace trojnásobku dříve stanovených

95 % pozitivních limitních hodnot. Výsledek

zkoušky by měl být pozitivní.

Problémy s robustností mohou také vzniknout u metod, které

používají jako úvodní krok před extrakcí virové RNA

ultracentrifugaci. Proto se k prokázání robustnosti takových

metod zkouší nejméně dvacet směsí plazmy obsahujících

různá množství RNA HCV, ale bez HCV specifických protilátek,

a výsledek by měl být pozitivní.

Prevence křížové kontaminace by se měla prokázat přesnou

detekcí panelu o nejméně dvaceti vzorcích, sestávajícího

střídavě ze vzorků obsahujících negativní směsi plazmy a negativní

směsi plazmy záměrně kontaminované vysokými

koncentracemi HCV (nejméně stonásobek 95 % pozitivní

limitní hodnoty nebo nejméně 10 4 m. j./ml).


V biologických zkouškách, jako je amplifikace nukleových

kyselin, mohou vzniknout specifické problémy, které mohou

ovlivnit validaci a interpretaci výsledků. Zkušební metody

se musí přesně popsat formou standardních operačních

postupů (SOP), které by měly zahrnovat:

– způsob vzorkování (typ obalu atd.);

– přípravu minisměsí (kde je to vhodné);

– podmínky skladování před analýzou;

– přesný popis zkušebních podmínek, včetně opatření, jak

zabránit křížové kontaminaci nebo destrukci virové RNA,

použitých zkoumadel a referenčních přípravků;

– přesný popis použitého přístroje;

– podrobné vzorce pro výpočet výsledků, včetně statistického

hodnocení.

Použití vhodné kontroly ve zkušební sérii (např. vhodné ředění

viru hepatitidy C BRP, nebo plazmy záměrně kontaminované

vzorkem HCV kalibrovaným proti mezinárodnímu

standardu WHO HCV) je považováno za uspokojivý

systém vhodné kontroly a zajišťuje, že spolehlivost analytického

postupu je zaručena, ať se provádí kdykoliv.

Technická kvalifikace. Je třeba, aby pro každou kritickou

část použitého zařízení byla provedena vhodná instalace

a aby byl vypracován operační kvalifikační program. Potvrzení

o provedení analytického postupu po změně kritického

zařízení (např. termocykleru) by se mělo dokumentovat

provedením paralelní zkoušky s osmi vzorky směsí

plazmy záměrně kontaminovaných RNA HCV do konečné

koncentrace trojnásobku předem stanovené 95% limitní

hodnoty. Všechny výsledky by měly být pozitivní.

Kvalifikace operátora. Měl by být vypracován vhodný program

kvalifikace pro každého operátora, který provádí

zkoušení.

Validace metod amplifikace nukleových kyselin

(NAT) pro kvantitativní zkoušky DNA viru B19

(B19V) ve směsích plazmy: pokyny

1 ÚVOD

Evropský lékopis požaduje, aby plazmatické směsi použité

pro výrobu některých přípravků byly zkoušeny na přítomnost

DNA viru B19 (B19V) s prahovými koncentracemi,

které nesmí být překročeny. Aby byly tyto požadavky splněny,

upřednostňuje se použití kvantitativních zkoušek amplifikace

nukleových kyselin. Nejzávažnějšími charakteristikami

pro validaci kvantitativních zkoušek amplifikace

nukleových kyselin jsou správnost, přesnost, specificita,

mez stanovitelnosti, linearita a rozsah. Dále by se měla

hodnotit robustnost metody.

Tento pokyn popisuje metody validace analytických postupů

amplifikace nukleových kyselin pro stanovení kontaminace

DNA B19V ve směsích plazmy a vychází z ICH pokynů.

Tento dokument se však může použít i jako obecný

základ pro validaci amplifikace nukleových kyselin.

Pro účel tohoto dokumentu se analytický postup definuje

jako úplný postup od extrakce nukleové kyseliny až po detekci

amplifikovaných produktů.



charakteristiky dokumentované výrobcem tohoto kitu nahradit

validaci uživatelem. Přesto by účinnost kitu

s ohledem na zamýšlené použití měla být uživatelem prokázána

(např. správnost, přesnost, rozsah, robustnost).

2 SPRÁVNOST

Správnost vyjadřuje těsnost souhlasu mezi dohodnutou

hodnotou, která je buď přijatá jako konvenční skutečná

hodnota, nebo přijatou referenční hodnotou a hodnotou nalezenou.

Správnost závisí na kalibraci stanovení a na odchylce

jednotlivých kroků stanovení. Přestože je doporučeno

stanovit správnost v celém specifikovaném rozsahu analytické

zkoušky, nejdůležitější je určení správnosti v rozsahu

prahových koncentrací. V případě stanovení DNA B19V

ve směsích plazmy se doporučuje určit správnost kalibrovaného

stanovení posouzením nejméně pěti koncentrací (ředicí

faktor 0,5 log) DNA viru B19 pro zkoušku NAT BRP nebo jiného

vhodného materiálu kalibrovaného v mezinárodních

jednotkách na mezinárodní standard WHO DNA B19, který

zahrnuje rozsah aktuálně doporučené prahové koncentrace

10,0 m. j./µl DNA B19V (např. 10 5 m. j./ml, 10 4,5 m. j./ml,

10 4 m. j./ml, 10 3,5 m. j./ml a 10 3 m. j./ml) v nejméně třech

replikách pro každé ředění. Správnost by se pro různé koncentrace

měla vyjádřit v procentech porovnáním se známým

množstvím DNA B19V. Příslušná stanovení by měla odrážet

úroveň použité technologie, což by také mělo být definováno

např. v mezilaboratorních studiích.

3 PŘESNOST

Přesnost vyjadřuje těsnost shody mezi řadou měření více

navážek stejného homogenního vzorku. Definuje se ve

třech úrovních:

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 313


– opakovatelnost vyjadřuje přesnost měření za stejných

podmínek v krátkém časovém odstupu (vnitřní přesnost);

hodnotí se jedním stanovením ve třech replikách příslušného

ředění vzorků obsahujících DNA B19V, které jsou

kalibrovány v mezinárodních jednotkách a zahrnují celý

rozsah kvantitativní zkoušky; vypočítá se variační koeficient

jednotlivých vzorků;

– střední přesnost vyjadřuje přesnost metody v rámci laboratoře

(střední přesnost); stanovuje se v replikách (běžně používaných

při tomto stanovení) příslušného ředění vzorků

obsahujících DNA B19V, které jsou kalibrovány v mezinárodních

jednotkách a zahrnují celý rozsah kvantitativní

zkoušky v různých situacích (např. v různých dnech, různými

analytiky, různými přístroji a různými zkoumadly);

vypočítá se variační koeficient jednotlivých vzorků;

– opakovatelnost vyjadřuje přesnost mezi různými laboratořemi

(mezilaboratorní přesnost); stanovuje se účastí

v mezilaboratorních kvantifikačních studiích stanovení

DNA B19V, např. podle odborného zkušebního schématu

(PTS), včetně porovnávací analýzy získaných výsledků,

kde je to vhodné.

4 SPECIFICITA

Je to schopnost jednoznačně stanovit nukleovou kyselinu

v přítomnosti složek, jejichž přítomnost je předvídatelná.

Specificita analytického postupu amplifikace nukleových

kyselin je závislá na výběru primerů, výběru vzorků (pro

analýzu konečného produktu) a přísnosti zkušebních podmínek

(pro amplifikační i detekční kroky).

Při navrhování primerů a vzorků by se jejich specificita detekovat

pouze DNA B19V měla ověřovat porovnáním vybraných

sekvencí se sekvencemi v publikovaných databankách.

Neměla by být nalezena významná homologie pro

sekvence, které se nevztahují k B19V.

Amplifikovaný produkt by měl být jednoznačně určen použitím

jedné z metod, jako je amplifikace vlastními primery,

restrikční enzymová analýza, sekvenování nebo hybridizace

se specifickým vzorkem.

K validaci specificity analytických postupů se zkouší nejméně

dvacet směsí plazmy DNA B19V negativních, směsi

by měly být nereaktivní.

B19 genotypy parvoviru. Mezinárodní výbor pro taxonomii

virů (ICTV) klasifikoval reprezentanty tří genotypů jako

kmeny lidského parvoviru B19.

Genotyp 1 reprezentuje prototyp viru B19V, genotyp 2 reprezentuje

sekvence virů jako A6 a genotyp 3 sekvence podobné

V9. Vyjádřením sekvencí řazení s ohledem na genotyp

viru B19V dostupný v databázích sekvencí nukleových

kyselin primerů a vzorků by měla být navržena schopnost

analytických postupů důsledně detekovat a kvantifikovat

odlišné genotypy lidského parvoviru B19. Tato schopnost

by se měla prokázat za použití charakterizovaných referenčních

materiálů. Protože může být obtížné získat referenční

přípravky s některými genotypy, mohou se jako cílový

zdroj sekvencí použít příslušné přípravky plazmidů

nebo syntetických nukleových kyselin, ty se však nemohou

použít k validaci extrakčního postupu.

5 MEZ STANOVITELNOSTI

Je to nejnižší množství nukleové kyseliny ve vzorku, které

může být detekováno s vhodnou přesností a správností.

Mez stanovitelnosti DNA B19V postupů amplifikace nukleových

kyselin se hodnotí limitním ředěním během studií

opakovatelnosti a střední přesnosti. Nejnižší koncentrace

cílových nukleových kyselin, která se stanoví s vhodnou

přesností a správností, je definována.

6 LINEARITA

Je to schopnost získat v daném rozsahu výsledky, které jsou

lineární funkcí koncentrace nukleových kyselin. Linearita

DNA B19V postupů amplifikace nukleových kyselin se

hodnotí replikami příslušného ředění vzorků v koncentraci

zahrnující celý rozsah kvantitativní zkoušky během studií

opakovatelnosti a střední přesnosti. Je definován interval

mezi nejvyšší a nejnižší koncentrací cílových nukleových

kyselin, při kterém jsou výsledky zkoušky přímo úměrné

koncentraci.

7 ROZSAH

Je to interval mezi nejvyšší a nejnižší koncentrací nukleových

kyselin ve vzorku, pro který bylo prokázáno, že metoda

splňuje kritéria přesnosti, správnosti a linearity. Rozsah

stanovení DNA B19V postupy amplifikace nukleových kyselin

se hodnotí během studií opakovatelnosti a střední

přesnosti s replikami příslušného ředění vzorků. Je definován

interval mezi nejvyšší a nejnižší koncentrací, který má

vyhovující stupeň přesnosti a správnosti.

8 ROBUSTNOST

Robustnost analytického postupu je míra jeho kapacity zůstat

nedotčen malými, ale záměrnými odchylkami v parametrech

metody a poskytuje údaje o jeho spolehlivosti při běžném

použití. Vyhodnocení robustnosti by se mělo zvážit ve vývojové

fázi. Mělo by ukázat spolehlivost analytického postupu

s ohledem na záměrné odchylky v parametrech metody. Pro

metody amplifikace nukleových kyselin mohou být malé odchylky

v parametrech metody rozhodující. Robustnost postupů

amplifikace nukleových kyselin se může prokázat při

vývoji metody, kdy se zkoušejí malé odchylky v koncentraci

zkoumadel (např. chloridu hořečnatého, primerů nebo

dNTP). K důkazu robustnosti se použije nejméně dvacet

směsí plazmy negativních na DNA B19V, záměrně kontaminovaných

DNA B19V na prahovou koncentraci; výsledkem

zkoušky by měly být přijatelné hodnoty koncentrace.

Prevence křížové kontaminace by se měla prokázat přesnou

detekcí panelu o nejméně dvaceti vzorcích, sestávajícího střídavě

ze vzorků směsné plazmy neobsahujících DNA B19V

nebo obsahujících DNA B19V pod prahovou koncentrací

(deset vzorků) a vzorků směsné plazmy obohacených DNA

B19V ve vysoké koncentraci (nejméně 10 2 prahové koncentrace,

deset vzorků).


V biologických zkouškách, jako je amplifikace nukleových

kyselin, mohou vzniknout specifické problémy, které mohou

ovlivnit validaci a interpretaci výsledků. Zkušební metody

se musí přesně popsat formou standardních operačních

postupů (SOP), které by měly zahrnovat:

– způsob vzorkování (typ obalu, atd.);

– přípravu minisměsí výrobci (kde je to vhodné);

– podmínky skladování před analýzou;

– přesný popis zkušebních podmínek, včetně opatření, jak

zabránit křížové kontaminaci nebo destrukci virových

nukleových kyselin, použitých zkoumadel a referenčních

přípravků;

314 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.22 AKTIVOVANÉ KOAGULAČNÍ FAKTORY

– přesný popis použitého přístroje;

– podrobné vzorce pro výpočet výsledků, včetně statistického

hodnocení.

Zahrnutí kontroly přiměřené prahové hodnoty (např. plazmy

záměrně kontaminovanou DNA B19V vzorkem vhodně

kalibrovaným v mezinárodních jednotkách, jako je DNA viru

B19 pro zkoušku NAT BRP) se považuje za uspokojivý

systém vhodné kontroly a zajišťuje, že spolehlivost analytického

postupu je zaručena, ať se provádí kdykoliv.

Technická kvalifikace. Je třeba, aby pro každou kritickou

část použitého zařízení byla provedena vhodná instalace

a aby byl vypracován operační kvalifikační program. Potvrzení

o provedení analytického postupu po změně kritického

zařízení (např. termocykleru) by se mělo dokumentovat

provedením paralelní zkoušky s osmi vzorky směsí

plazmy záměrně kontaminovaných DNA B19V v koncentraci

kolem prahové hodnoty. Všechny výsledky by měly

být pozitivní a měly by odrážet zvláštnosti stanovení, jichž

bylo dosaženo během validace.

Kvalifikace operátora. Měl by být vypracován vhodný program

kvalifikace pro každého operátora, který provádí

zkoušení.

2.6.22 AKTIVOVANÉ KOAGULAČNÍ

FAKTORY

6.0:20622

Stanoví se obsah přítomného heparinu (2.7.12), kde je to

vhodné, a heparin se neutralizuje např. přidáním protamin-

-sulfátu R (10 μg protamin-sulfátu neutralizuje 1 m. j. heparinu).

Připraví se ředění zkoušeného přípravku 1 : 10

a 1 : 100 tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5 R.

Polystyrenové zkumavky se umístí do vodní lázně o teplotě

37 °C, do každé zkumavky se přidá 0,1 ml plazmy chudé na

trombocyty R a 0,1 ml vhodného ředění přípravku fosfolipidu

jako náhrada trombocytů a nechá se stát 60 s. Do

každé zkumavky se přidá buď 0,1 ml jednoho z ředění přípravku,

nebo 0,1 ml tlumivého roztoku (kontrolní zkumavka).

Do každé zkumavky se ihned přidá 0,1 ml roztoku

chloridu vápenatého R (3,7 g/l) předem ohřátého na 37 °C

a do 30 min od přípravy původního ředění se měří čas, který

uplyne mezi přidáním roztoku chloridu vápenatého

a tvorbou koagula. Zkoušku nelze hodnotit, pokud koagulační

čas změřený pro kontrolní zkumavku není v rozmezí

200 s až 350 s.

2.6.26 ZKOUŠKA NA PROTILÁTKY ANTI-D

V IMUNOGLOBULINU LIDSKÉM

7.2:20626

MATERIÁL

Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným (PBS).

8,0 g chloridu sodného R, 0,76 g hydrogenfosforečnanu

sodného bezvodého R, 0,2 g chloridu draselného R a 0,2 g

dihydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve vodě

R a zředí se jí na 1000 ml. Má-li se roztok uchovávat

několik dnů, může se přidat 0,2 g azidu sodného R, aby se

zabránilo mikrobiální kontaminaci.

Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným obsahující

albumin hovězí (PBS-BSA). Tlumivý roztok fosforečnanový

s chloridem sodným obsahující albumin hovězí

R (2 g/l) (Cohnova frakce V, pro ELISA). Roztok se udržuje

při 2 °C až 8 °C, ale před použitím se může zvýšit na

19 °C až 25 °C.

Roztok papainu. Použije se komerčně dostupný papain jakosti

pro sérologii, jehož aktivita byla validována.

Erytrocyty. Použije se směs D-pozitivních erytrocytů od

nejméně tří dárců přednostně skupiny 0R2R2. D-pozitivní

erytrocyty se také mohou získat od dárců skupin 0R1R1 nebo

0R1R2. Směs fenotypů nebyla zkoušena, proto se nedoporučuje.

Použije se směs D-negativních erytrocytů přednostně od tří

dárců skupiny 0rr. Pokud je dostupný pouze jeden dárce

skupiny 0rr, mohou se použít D-negativní erytrocyty od

jednoho dárce.

Krvinky se promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným čtyřikrát nebo se promývají tak dlouho,

až je supernatantní tekutina čirá. Každé promytí znamená

suspendovat buňky v nejméně 2 objemových dílech

tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným,

buňky se odstředí 5 min při 1800 g, aby se vytvořil shluk

buněk, a supernatantní tekutina se odstraní. Sedimentované

krvinky se ošetří roztokem papainu podle pokynů výrobce

a čtyřikrát se promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným.

Erytrocyty se mohou uchovávat v konzervačním roztoku

nejdéle jeden týden při 2 °C až 8 °C. Je vhodné použít přípravek

následujícího složení:

natrium-citrát

8 g/l

D-glukosa

20 g/l

kyselina citronová monohydrát

0,5 g/l

chlorid sodný

4,2 g/l

inosin

0,938 g/l

adenosin-trifosfát (ATP)

0,4 g/l

chloramfenikol

0,34 g/l

neomycin-sulfát

0,1 g/l

Pokud se použijí krvinky uchovávané v konzervačním roztoku,

promyjí se před použitím nejméně dvakrát tlumivým

roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným nebo tak

dlouho, až je supernatantní tekutina čirá.

Mikrotitrační destičky. Použijí se pevné mikrotitrační destičky

s jamkami ve tvaru V.

Referenční standardy. Jako referenční přípravek je vhodné

pro pozitivní kontrolu použít imunoglobulin pro zkoušku na

protilátky anti-D BRP a pro negativní kontrolu imunoglobulin

pro zkoušku na protilátky anti-D negativní kontrola BRP.

POSTUP

Zkouška popsaná v této stati se provádí při teplotě místnosti

roztoky pozitivní kontroly a roztoky negativní kontroly současně

a za stejných podmínek.

Porovnávací roztoky. Pozitivní kontrola a negativní kontrola

se rekonstituují podle návodu. Každý z rekonstituovaných

přípravků má koncentraci imunoglobulinu G (IgG)

(50 g/l). Připraví se dvojnásobné ředění každého rekonstituovaného

přípravku tlumivým roztokem fosforečnanovým

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 315

2.6.27 MIKROBIOLOGICKÁ KONTROLA BUNĚČNÝCH PŘÍPRAVKŮ

s chloridem sodným obsahujícím albumin hovězí na koncentraci

imunoglobulinu G (25 g/l). Připraví se dalších

sedm sériových dvojnásobných ředění každého přípravku

za použití tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem

sodným obsahujícím albumin hovězí, aby se rozsah ředění

rozšířil do 1/256 (0,195 g/l imunoglobulinu G). Na mikrotitrační

destičku se nanese dvojmo po 20 µl každého ředění

každého přípravku.

Zkoušené roztoky. Zkoušený přípravek se zředí tlumivým

roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným obsahujícím

albumin hovězí na počáteční koncentraci imunoglobulinu G

(25 g/l). Při koncentraci přípravků (50 g/l) je to dvojnásobné

ředění a při koncentraci jiné než (50 g/l) se ředicí faktor

upraví tak, aby počáteční koncentrace pro zkoušku byla

(25 g/l). Těmto ředěním roztoků (25 g/l) se přiřadí jmenovitý

dvojnásobný ředicí faktor pro porovnání s referenčními přípravky,

i když to neodpovídá skutečnému ředicímu faktoru

použitému k dosažení koncentrace 25 g/l. Připraví se sedm

dalších sériových dvojnásobných ředění přípravku za použití

tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným

obsahujícího albumin hovězí, aby se rozsah ředění rozšířil do

1/256 (0,195 g/l imunoglobulinu G) pro porovnání s referenčními

přípravky o stejném rozsahu koncentrace imunoglobulinu

G. Na mikrotitrační destičku se nanese dvojmo po

20 μl každého ředění.

Připraví se suspenze papainem ošetřených D-pozitivních

(přednostně 0R2R2, ale mohou se použít i 0R1R1 nebo 0R1R2)

a D-negativních (0rr) erytrocytů 3% (V/V) v tlumivém roztoku

fosforečnanovém s chloridem sodným obsahujícím albumin

hovězí. K první řadě ředění každého zkoušeného přípravku,

pozitivní kontroly a negativní kontroly se přidá 20 μl

D-pozitivních buněk a k dalším ředěním se přidá 20 μl D-negativních

krevních buněk. Obsah jamek se promíchá 10 s na

třepačce (nebo dokud buňky nejsou resuspendovány).

Destička se 1 min odstřeďuje při 80 g při teplotě místnosti,

aby se vytvořil shluk buněk, a umístí se pod úhlem přibližně

70°. Odečítá se po 4 min až 5 min nebo až stečou buňky

v jamkách s negativní kontrolou (D-negativní 0 krevní buňky

a negativní kontrolní roztok). Shluk buněk na dně jamky

značí pozitivní výsledek, stékající buňky značí negativní

výsledek.

Zaznamená se konečný bod titru jako převrácená hodnota

nejvyššího ředění, které poskytuje pozitivní výsledek.

Pozitivní kontrola má jmenovitý titr 8 a negativní kontroly

(D-negativní 0 krevní buňky a negativní kontrolní roztok)

nesmí vykázat aglutinaci při počátečním ředění 1 : 2. Uživatelé

musí své vlastní podmínky zkoušek validovat a provést

prověření použitých zkoumadel a podmínek zkoušky

v případě, že výsledky zkoušení se významně liší od těchto

očekávaných hodnot. Selhání negativní reakce s negativními

kontrolami může znamenat, že např. neuplynul dostatečné

dlouhý čas pro stékání buněk nebo že byla použita

zkoumadla přímo z chlazeného skladu.

Titr zkoušeného přípravku nesmí být vyšší než titr pozitivní

kontroly, jsou-li oba přípravky titrovány od koncentrace

25 g/l.

2.6.27 MIKROBIOLOGICKÁ KONTROLA

BUNĚČNÝCH PŘÍPRAVKŮ

9.2:20627

Synonymum. Mikrobiologická kontrola buněčných

produktů

Tato stať se netýká zkoušení lidské krve a krevních složek,

což je zahrnuto ve Směrnici 2002/98/EC Evropského parlamentu

a Rady ze dne 27. ledna 2003 a směrnice Komise

2004/33/ES ze dne 22. března 2004, kterou se provádí

směrnice 2002/98/ES (Commission Directive 2004/33/EC

of 22 March 2004 implementing Directive 2002/98/EC of

the European Parliament and of the Council).

1 ÚVOD

Přístupy k mikrobiologickému zkoušení buněčných přípravků

popsané v této obecné stati berou v úvahu charakteristiky

a omezení těchto přípravků, zejména dobu použitelnosti,

která ne vždy umožní úplné dokončení běžné mikrobiologické

zkoušky před podáním pacientovi, stejně jako

množství dostupné pro zkoušení a vzorkování.

Tyto přístupy mohou být použity, pokud je požadována

zkouška na sterilitu, popsaná ve stati 2.6.1 Zkouška na

sterilitu, ale není možné ji provést z technických důvodů,

nebo z důvodů charakteristik specifických buněčných přípravků.

1-1 DOBA POUŽITELNOSTI

Doba použitelnosti buněčných přípravků závisí na buněčných

charakteristikách a na podmínkách konzervace. Pro

nelyofilizované buněčné přípravky nepřesahuje obvykle

doba použitelnosti 3 až 4 dny a někdy ne více než několik

hodin. V těchto případech nelze před podáním pacientovi

určit mikrobiologický stav konečných přípravků podle stati

2.6.1.

1-2 SLOŽENÍ VZORKU

Mikrobiální kontaminanty mohou být nalezeny uvnitř nebo

na povrchu buněk nebo jiných složek buněčných přípravků

a nemusí být zjištěny, pokud se zkouší pouze supernatantní

tekutiny, jako jsou kultivační nebo transportní média.

Zkoušený vzorek musí reprezentovat všechny složky buněčného

přípravku, pokud nebylo schváleno jinak.

1-3 VELIKOST VZORKU

Vzhledem k omezením souvisejícím s použitím jediného

dárce nebo omezenou výrobní kapacitou, může být objem

vzorku dostupný pro zkoušení na konci produkčního procesu

omezen. Nicméně s ohledem na chyby vzorkování, které

mohou vést k nezjištěné mikrobiální kontaminaci, musí velikost

vzorku dostatečně zajistit vhodnou citlivost a specificitu

vybrané metody zkoušení.

1-4 ZDŮVODNĚNÍ VÝBĚRU METODY

Výběr metody musí být založen na charakteristikách konečného

přípravku a na výrobním postupu. Aby se zajistila

bezpečnost pro zamýšlené použití, měl by být výběr metody

nebo kombinace metod podpořen analýzou rizika možného

vystavení mikrobiálním kontaminantům, charakteristikám

a zamýšlenému použití buněčného přípravku. Média

a doby inkubace použité v těchto metodách musí být vybí-

316 ČL 2017 – Dopl. 2020


rány s ohledem na vlastnosti zdrojového materiálu a podmínky

výrobního procesu, jež mohou podpořit růst specifických

mikroorganismů (např. psychrofilních, termofilních

a jinak náročných bakterií nebo plísní). Složení buněčných

přípravků může z fyzikálních důvodů, jako je počáteční zákal

kultivačních médií po přidání zkoušeného vzorku, bránit

některým zkouškám.

Mohou se použít následující přístupy mikrobiologického

zkoušení:

– automatizované metody založené na růstu;

– kombinace předkultivace a detekce alternativními metodami

(5.1.6);

– přímá detekce alternativními metodami (5.1.6);

– metody založené na zkoušce na sterilitu předepsané ve

stati 2.6.1.

2 OBECNÉ ÚVAHY

2-1 OBECNÁ OPATŘENÍ

Zkouška se provádí za aseptických podmínek podle platných

předpisů pro potenciálně infekční materiál. Opatření

přijatá proti kontaminaci jsou taková, aby nepůsobila na

prokazované mikroorganismy. Zkouška se provádí v pracovních

podmínkách, které se pravidelně monitorují vhodným

vzorkováním pracovního prostředí a prováděním

vhodných kontrol. Při zkoušení se berou v úvahu případné

inhibiční látky ve vzorku, které mohou ovlivnit výsledek

zkoušky.

2-2 OMEZENÍ

2-2-1 Doba použitelnosti

Aktuálně negativní (negative-to-date) je chápáno jako průběžné

odečítání zkušební metody (2.6.1 nebo automatizované

metody založené na růstu), která ještě nebyla dokončena.

Mají-li buněčné přípravky omezenou dobu použitelnosti,

mohou se použít aktuálně negativní výsledky, pokud

je to schváleno. Na základě analýzy rizik charakteristik

a zamýšleného použití buněčného přípravku mohou být

v čase použití potřebné výsledky dalších mikrobiologických

mezioperačních zkoušek.

2-2-2 Vzorkování

Zkoušený vzorek musí být reprezentativní včetně všech

složek buněčného přípravku a musí se odebrat z konečného

přípravku. Pokud to není možné, provede se náhradní zkoušení,

např. tekutin, se kterými byly zpracovávané buňky

naposledy v kontaktu.

3 METODY PRO MIKROBIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ

BUNĚČNÝCH PŘÍPRAVKŮ

3-1 AUTOMATIZOVANÉ METODY ZALOŽENÉ NA

RŮSTU

3-1-1 Zkouška růstových vlastností

Tato část popisuje podmínky pro potvrzení vhodnosti kultivačního

média použitého pro mikrobiologické zkoušení.

Použijí se nejméně dvě vhodná kultivačního média určená

pro detekci hub a aerobních a anaerobních bakterií. Každá

šarže sterilního média se zkouší na růstové vlastnosti inokulací

dvou nádob od každého média s ne více než

100 CFU každého kmene uvedeného v tabulce 2.6.27-1

a inkubací po dobu nejvýše 7 dnů pro detekci mikrobiálního

růstu při teplotě definované pro zkoušení (viz tabulku

2.6.27-3). Zkušební médium vyhovuje, pokud ve všech

inokulovaných nádobách dojde během inkubační doby

k jasně viditelnému růstu.

Tab. 2.6.27-1 Mikroorganismy používané pro zkoušku růstových

vlastností

Aerobní médium

Staphylococcus

aureus

např. ATCC 6538, CIP 4.83,

NCTC 10788, NCIMB 9518,


Bacillus subtilis např. ATCC 6633, CIP 52.62,

NCIMB 8054, CCM 1999,

CNCTC 5610

Pseudomonas

aeruginosa

např. ATCC 9027, NCIMB

8626, CIP 82.118, CCM 1961,

CNCTC 5664

Candida albicans např. ATCC 10231, IP 48.72,

NCPF 3179, CCM 8215,

CNCTC 5361

Aspergillus

brasiliensis

Anaerobní médium

Clostridium

sporogenes

např. ATCC 16404, IP 1431.83,

IMI 149007, CCM 8222


NCTC 532 nebo ATCC 19404,


Bacteroides fragilis např. ATCC 25285, CIP 77.16,

NCTC 9343, CCM 4712

3-1-2 Vhodnost metody

Zkušební systém se validuje s ohledem na specificitu (nepřítomnost

falešně pozitivních výsledků), citlivost (limit

detekce), reprodukovatelnost a robustnost. Vhodnost metody

se potvrdí, bez ohledu na typ buněčného přípravku, výrobní

postup, objem použitého inokula nebo typ zkoušky,

v přítomnosti specifického složení vzorku. Během potvrzování

vhodnosti metody zejména z hlediska citlivosti se

zkouška provádí za použití mikroorganismů uvedených

v tabulce 2.6.27-2. Citlivost je míněna jako schopnost detekovat

100 CFU nebo méně. Ne více než 100 CFU mikroorganismů

se inokuluje do média v přítomnosti zkoušeného

přípravku za použití nejméně tří opakování. Kontrola mikrobiální

suspenze použité pro inokulaci se provede rozetřením

vhodného vzorku na agaru. Jestliže se v průběhu

zkoušky detekuje 1 CFU až 100 CFU každého kmene, metoda

je validovaná pro dané složení vzorku.

Může být nezbytné upravit seznam mikroorganismů uvedených

v tabulce 2.6.27-2 v závislosti na původu buněk

a mikroorganismech dříve nalezených nebo spojených

s daným typem buněk.

V některých případech mohou buněčné přípravky jako takové

inaktivovat kontaminující mikroorganismy. Musí se

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 317


přijmout taková opatření, aby se zajistila vhodnost jakéhokoliv

přidaného kmene mikroorganismů použitého

k validaci.

Tab. 2.6.27-2 Mikroorganismy používané pro zkoušku

vhodnosti metody

Aerobní médium

Aspergillus

brasiliensis

Bacillus subtilis

např. ATCC 16404, IP 1431.83,

IMI 149007, CCM 8222


NCIMB 8054, CCM 1999,

CNCTC 5610

Candida albicans např. ATCC 10231, IP 48.72,

NCPF 3179, CCM 8215,

CNCTC 5361

Pseudomonas

aeruginosa

Staphylococcus

aureus

Streptococcus

pyogenes

např. ATCC 9027, NCIMB

8626, CIP 82.118, CCM 1961,

CNCTC 5664


NCTC 10788, NCIMB 9518,


např. ATCC 19615,

CIP 1042.26, NCIMB 13285,

CCM 7418

Micrococcus sp. např. ATCC 700405,

NCTC 7567, CCM 2432

Anaerobní médium

Clostridium

sporogenes

Propionibacterium

acnes


NCTC 532 nebo ATCC 19404,


např. ATCC 11827, CCM 7417

3-1-3 Zkoušení zkoušeného přípravku

Vzorek. Zkouší se vzorek s reprezentativními charakteristikami

buněčného přípravku. Vzorek se přidá ke kultivačnímu

médiu co nejdříve po odběru. Pokud je třeba vzorky

skladovat, posoudí se dopad skladování na případné kontaminanty.

Pro buněčné přípravky, jejichž celkový objem (V ml)

v jednodávkovém obalu je v rozmezí 1 ml až 1000 ml, je

minimální množství inokulovaného objemu použité pro

zkoušku, uvedené v následující tabulce.

Celkový objem

přípravku (ml)

Celkový objem inokula (rozděleně

mezi aerobní a anaerobní lahve)

10 £ V £ 1000 1 % z celkového objemu zkoušeného

přípravku

1 £ V < 10 100 µl

V < 1

nelze použít

Pro ostatní objemy nebo pro vícedávkové obaly by se měly

použít alternativní přístupy, které musí být zdůvodněny (viz

odstavec 2-2-2). Zvětšení celkového objemu pomocí ředění

může zajistit kompletní inokulaci vzorku o objemu 100 µl.

Pro přípravky, jejichž objem je menší než 1 ml, kde není

možné konečné vzorkování, by se mělo použít náhradní

zkoušení, zkoušení během procesu nebo jiné vhodné zkoušení,

které musí být zdůvodněno.

Zkoušení. Vzorky se inokulují do nádob s kultivačním médiem

co nejdříve po odběru a inkubují se nejméně po dobu

7 dnů. V závislosti na výsledcích získaných během zkoušky

vhodnosti metody a s ohledem na relevantní mikroorganismy,

může být inkubační doba prodloužena na 14 dnů.

Výběr teploty inkubace by měl umožnit detekci široké škály

mikroorganismů. Typicky se pohybuje v rozsahu 30 °C

až 37 °C, avšak pro buněčné přípravky s velmi krátkou dobou

použitelnosti je k získání příslušných aktuálně negativních

výsledků zkoušky vhodnější teplota urychlující růst

nejméně 35 °C. Navíc pro přípravky s významným rizikem

kontaminace z okolního prostředí se použijí dva teplotní

rozsahy, např. 20 °C až 25 °C (pro aerobní mikroorganismy)

a 30 °C až 37 °C (pro anaerobní mikroorganismy), aby

byly pokryty mikroorganismy z okolního prostředí i mikroorganismy

klinické.

Tabulka 2.6.27-3 uvádí seznam alternativních přístupů výběru

teploty inkubace. Vhodná teplota a doba trvání inkubace

jsou založeny na výsledcích studie pro specifické buněčné

přípravky.

Tab. 2.6.27-3 Možné nastavení teploty v automatizovaném

kultivačním systému používaném samostatně nebo

v kombinaci s vizuálním zkoušením

Aerobní inkubace Anaerobní inkubace

způsob 1 20 °C–25 °C

(automatizovaný

systém), je-li třeba

30 °C–35 °C

(automatizovaný

systém)

30 °C–35 °C (automatizovaný

systém)

způsob 2 35 °C–37 °C (automatizovaný

systém), 35 °C–37 °C (automatizovaný

systém)

v případě potřeby

další inkubace při

nižší teplotě (vizuální

metoda)*


systém)


systém)


systém)


systém)

*Kde je to vhodné, inkubuje se navíc při teplotě 20 °C až

30 °C. Inkubace se může provést za použití komerčně dostupných

mikrobiologických médií, buď aerobních určených

pro automatizovaný systém, nebo tekuté půdy

s hydrolyzáty sóji a kaseinu.

318 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.30 ZKOUŠKA AKTIVACE MONOCYTŮ

3-1-4 Odečtení a vyhodnocení výsledků

Zkušební média se nejméně denně a na konci hodnoceného

období hodnotí vizuálně nebo pomocí automatizovaných

systémů na mikrobiální růst. Pokud se během hodnoceného

období nebo na jeho konci nezjistí žádný růst, je produkt

„kultivačně negativní“. Pokud se zjistí růst při platné

zkoušce, je produkt „kultivačně pozitivní“.

Pokud se inokulované lahve skladují déle než 12 h před

umístěním do automatizovaného kultivačního systému, část

z každé inkubované lahve je kontrolována na falešně negativní

výsledek. V určitých případech, kdy mikroorganismy

jsou rychle rostoucí a mají optimální podmínky, mohou tyto

mikroorganismy začít proliferovat již během skladování.

Důsledkem toho nemusí být zaznamenán vzrůst měřených

parametrů během zkoušky a mikrobiální kontaminanty nemusí

být systémem rozeznány (falešně negativní výsledek).

3-2 ALTERNATIVNÍ METODY

3-2-1 Kombinace předkultivace a detekce alternativními

metodami

Zkoušené vzorky se inkubují v tekutých kultivačních médiích

pro aerobní a anaerobní růst nebo v ekvivalentních pevných

půdách po krátkou dobu (např. 12 h až 24 h, v závislosti

na citlivosti použitého alternativního přístupu). Pak se

použije alternativní metoda vhodná pro rychlou detekci mikroorganismů

(např. 2.6.21 Metody amplifikace nukleových

kyselin, 2.7.24 Průtoková cytometrie, 5.1.6 bioluminiscenční

metody).

3-2-2 Přímá detekce alternativními metodami

Pokud má buněčný přípravek velmi krátkou dobu použitelnosti

(např. několik hodin) nebo, kde standardní metody

nepřináší uspokojivou detekci mikroorganismů, mohou být

pro mikrobiologické zkoušení použity přímé detekční metody

nezaložené na růstu mikroorganismů (např. 2.6.21 Metody

amplifikace nukleových kyselin, 2.7.24 Průtoková cytometrie,

5.1.6 bioluminiscenční metody).

Tento postup umožňuje získat výsledky ve velmi krátkém

čase, i když na úkor citlivosti oproti metodám založeným

na růstu. V závislosti na použitém přístupu tak mohou být

detekovány jak životaschopné tak i neživotaschopné mikroorganismy.

3-2-3 Validace metody

Validace se provádí podle obecných doporučení uvedených

v obecné stati 5.1.6 a podle specifických doporučení pro

buněčné přípravky uvedených v odstavci 3-1-2 pro automatizované

metody založené na růstu. Citlivost těchto přístupů

se musí validovat, v úvahu se vezme zdvojnásobení času

preinkubace možných kontaminujících mikroorganismů.


9.2:20630

1 ÚVOD

Zkouška aktivace monocytů (MAT) se používá k detekci

nebo kvantitativnímu stanovení látek, které aktivují lidské

monocyty nebo monocytární buňky k uvolňování endogenních

mediátorů, jako jsou prozánětlivé cytokiny, např. tumorový

nekrotický faktor alfa (TNFα), interleukin-1-beta

(IL-1β) a interleukin-6 (IL-6). Tyto cytokiny se uplatňují

v patogenezi horečky a zkouška aktivace monocytů bude

proto detekovat přítomnost pyrogenních látek ve zkoušeném

vzorku. Zkoušku aktivace monocytů je možné použít

jako náhradu zkoušky na pyrogenní látky na králících po

validaci pro jednotlivý přípravek.

Farmaceutické přípravky, které obsahují neendotoxinové

nebo prozánětlivé kontaminanty, často vykazují velmi strmé

nebo nelineární křivky závislosti odpovědi na dávce

v porovnání s křivkami závislosti odpovědi na dávce

u endotoxinů. Přípravky obsahující neendotoxinové kontaminanty

se musí zkoušet v rozsahu, který zahrnuje minimální

ředění.

V této stati jsou popsány tři následující metody:

Metoda A Kvantitativní zkouška

Metoda B Semikvantitativní zkouška

Metoda C Porovnávací zkouška s referenční šarží

Kromě toho je možné nalézt další užitečné informace

k praktické stránce zkoušení v části Poznámky k pokynu

na konci této stati.

Zkouška se provádí postupem, který vylučuje kontaminaci

pyrogenními látkami.

2 DEFINICE

Nejvyšší účinné ředění (MVD) je nejvyšší přípustné ředění

vzorku, ve kterém ještě lze stanovit kontaminantu. Výpočet

MVD je založen na endotoxinovém referenčním standardu.

MVD se vypočítá za použití následujícího vzorce:

CLC × C

LOD

v němž značí:

CLC – limitní koncentraci kontaminantu;

C – koncentraci zkoušeného roztoku;

LOD – limit detekce.

Protože LOD není vždy dostupný předem může být pro výpočet

MVD použit odhad LOD založený na vývojových datech.

Kritériem přijatelnosti pro přijetí/vyloučení je limitní koncentrace

kontaminantu (CLC) vyjádřená jako ekvivalentní

hodnota endotoxinu na miligram nebo na mililitr, nebo na

jednotku biologické aktivity zkoušeného přípravku.

Limitní koncentrace kontaminantu se vypočítá podle následujícího

vzorce:

K

M

v němž značí:

K – prahovou pyrogenní dávku na kilogram tělesné hmotnosti;

M – nejvyšší doporučenou celkovou dávku (bolus) přípravku


Pokud se přípravek podává injekčně v častých intervalech

nebo kontinuální infuzí, je M nejvyšší celková dávka podaná

během jedné hodiny.

Pokud byla pro přípravek stanovena limitní koncentrace

endotoxinu (ELC), má limitní koncentraci kontaminantu

stejnou hodnotu jako limitní koncentrace endotoxinu, není-

,

,

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 319


-li předepsáno jinak. V tomto případě se koncentrace zkoušeného

roztoku vyjadřuje v:

– mg/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je vztažena

na hmotnost (m. j./mg);

– j./ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je vztažena

na jednotku biologické účinnosti (m. j./j.);

– ml/ml, jestliže limitní koncentrace endotoxinu je vztažena

na objem (m. j./ml).

Ekvivalentní hodnoty endotoxinu jsou hodnoty koncentrace

kontaminantu odečtené z křivky závislosti odpovědi na dávce

endotoxinů (Metoda A) nebo odhadnuté porovnáním

s odpovědí na standardní endotoxinové roztoky (Metoda B).

Standardní endotoxinový zásobní roztok se připraví z referenčního

standardu endotoxinu, který byl kalibrován proti

mezinárodnímu standardu, např. standardu endotoxinu BRP.

Limit detekce (LOD) se stanoví za použití standardní křivky

endotoxinu. Limit detekce je koncentrace endotoxinu,

která odpovídá limitní hodnotě. Pro účely této zkoušky se

limit detekce vyjadřuje v ekvivalentním množství endotoxinu

v mililitru. Limitní hodnota se vyjádří v jednotkách

vhodných k odečítání (např. pro zkoušku ELISA se použije

optická hustota).

Limitní hodnota se může vypočítat podle vzorce:

v němž značí:

x

x + 3s

– průměr odpovědí na kontrolní roztok ze čtyř souběžných

stanovení (R0);

s – směrodatnou odchylku odpovědí na kontrolní roztok

ze čtyř souběžných stanovení (R0).

3 OBECNÝ POSTUP

Roztok zkoušeného přípravku se inkubuje s lidskými monocyty

nebo s lidskými monocytárními buňkami, např.

z lidské heparinizované periferní krve, která není přednostně

starší než 4 h, nebo z frakce této krve obsahující monocyty,

jako jsou mononukleární buňky izolované z lidské periferní

krve (PBMC), např. odstřeďováním v hustotním

gradientu, nebo z buněčné linie lidských monocytárních

buněk. Lidská heparinizovaná periferní krev se obvykle ředí

kultivačním médiem nebo fyziologickým roztokem,

např. 2% (V/V) až 50% (V/V) (konečná koncentrace). Buňky

izolované z lidské periferní krve nebo z linie monocytárních

buněk se obvykle používají v kultivačním médiu

buď s vlastní plazmou dárce, nebo s AB sérem v konečné

hustotě buněk 0,1 ∙ 10 6 až 1,0 ∙ 10 6 na jamku, zkumavku

nebo jinou nádobku. Pro linie monocytárních buněk se může

AB sérum nahradit tepelně inaktivovaným fetálním bovinním

sérem. Buněčné kultury se inkubují při (37 ±1) °C

v atmosféře vhodné pro kultivační médium, např. 5% CO2

ve zvlhčeném vzduchu. Doba kultivace je dostačující, aby

umožnila přírůstek sledovaného odečtu. Odpovědi získané

pro sledovaný odečet (např. prozánětlivé nebo pyrogenní

cytokiny) s roztokem zkoušeného přípravku se porovnávají

s odpověďmi získanými se standardním endotoxinem nebo

s referenční šarží zkoušeného přípravku.

4 ZAŘÍZENÍ

Z veškerého skla a ostatního tepelně odolného zařízení se

pyrogenní látky odstraní validovaným postupem v horkovzdušném

sterilizátoru. Obvykle používaný minimální čas

,

a teplota jsou 30 min a 250 °C. Pokud je vybavení z plastu,

jako např. mikrotitrační destičky a pipetovací špičky k automatickým

pipetám, použije se takové, které prokáže, že je

prosté detekovatelných pyrogenních látek, a které neinterferuje

se zkouškou.

5 ZDROJE BUNĚK A KVALIFIKACE

5-1 PLNÁ KREV

Plná krev se získá od jednotlivých dárců nebo ze spojené

plné krve, která je kvalifikovaná podle požadavků popsaných

v odstavcích 5-3, 5-4, 5-5 a 6-3, kde je to vhodné.

5-2 MONONUKLEÁRNÍ BUŇKY Z PERIFERNÍ KRVE

(PBMC)

Mononukleární buňky se získávají od jednotlivých dárců

nebo ze spojené plné krve, která je kvalifikovaná podle požadavků

popsaných v odstavcích 5-3, 5-4, 5-5 a 6-3, kde je

to vhodné.

5-3 KVALIFIKACE DÁRCŮ KRVE

Dárci krve mají splňovat následující hodnotící kritéria společně

s ostatními platnými požadavky, které odpovídají

zdravotním, bezpečnostním a etickým požadavkům.

Dárci krve mají sami o sobě sdělit, že jsou v dobrém zdravotním

stavu, že nejsou pod vlivem žádné bakteriální nebo

virové infekce a že neměli příznaky takovýchto infekcí

v období alespoň jednoho týdne předcházejícího darování

krve. Dárci krve nemají užívat 48 h před odběrem nesteroidní

protizánětlivé léky a 7 dnů před odběrem steroidní protizánětlivé

léky. Jedinci, kterým byla předepsána imunosupresiva

nebo jiné léky, o nichž je známo, že ovlivňují

produkci sledovaných odečtů, nemohou sloužit jako dárci

krve. Darovaná krev se zkouší na infekční markery podle

národních požadavků pro transfuze.

5-4 KVALIFIKACE BUNĚK SPOJENÝCH OD VÍCE

DÁRCŮ

Směsi (plné krve nebo krevních frakcí, např. mononukleárních

buněk izolovaných z lidské periferní krve) musí sestávat

z darované krve od nejméně čtyř jednotlivých dárců, ale

přednostně od osmi nebo více dárců, kde je to možné, odebraných

při každém darování v přibližně stejných objemech

krve nebo buněk získaných z přibližně stejných objemů krve.

Při kvalifikaci spojených buněk se postupuje následovně:

do čtyř hodin od odběru krve se sestrojí křivky závislosti

dávka-odpověď ze směsi používající standardní endotoxin

s nejméně čtyřmi geometrickými ředěními koncentrací

endotoxinu, např. v rozsahu 0,01 m. j./ml až 4 m. j./ml.

Křivky dávka-odpověď splňují dvě kritéria pro standardní

křivku endotoxinu popsanou v odstavci 6-1. Použijí-li se

spojené buňky pro detekci neendotoxinových kontaminantů,

spojení se mají kvalifikovat, jak je popsáno v části 6-3.

Kde jsou buňky spojeny, posoudí se pro přijetí/vyloučení

daného produktu průměrný efekt/účinek.

5-5 KVALIFIKACE ZMRAZENÝCH BUNĚK

Zdroje buněk určených pro použití ve zkoušce aktivace monocytů,

např. lidská plná krev, krevní frakce, jako jsou mononukleární

buňky izolované z lidské periferní krve nebo

z buněčných linií monocytů, se mohou ošetřit zmrazením.

Směsi zmrazených buněk se získají spojením před zmrazením

nebo spojením jednotlivě zmrazených buněk těsně po

rozmrazení. Kvalifikace zmrazených buněk nebo krve se

320 ČL 2017 – Dopl. 2020


provádí ihned po rozmrazení (a po spojení, je-li třeba).

Křivky dávka-odpověď získané ze spojených zmrazených

buněk nebo krve splňují dvě kritéria pro standardní křivku

endotoxinu popsanou v odstavci 6-1. Kvalifikace zmrazených

buněk nebo krve se provádí podle odstavce 6-3, pokud

je zamýšlené použití pro detekci neendotoxinových

kontaminantů.

5-6 KONTINUÁLNÍ BUNĚČNÉ LINIE MONOCYTŮ

Buněčné linie monocytů jsou pro detekci bakteriálních endotoxinů

vhodné, ale jejich použití pro detekci neendotoxinových

pyrogenů je omezené.

Lidské buněčné linie monocytů se kultivují, aby mohly být

zaručeny dostatečné dodávky pro zkoušku aktivace monocytů.

K optimalizaci metody se mohou použít klony odvozené

od buněčných linií.

Buňky se musí udržovat v aseptických podmínkách a pravidelně

zkoušet na přítomnost kontaminace mykoplazmaty.

Navíc se musí u buněk pravidelně ověřovat totožnost (např.

doba zdvojnásobení, morfologie a funkce) a stabilita. Funkční

stabilita buněčné linie se hodnotí monitorováním jejích

vlastností ve vztahu k počtu pasáží v průběhu rutinního

zkoušení. Mají se stanovit kritéria pro funkční stabilitu,

mohou zahrnovat podmínky růstu, maximální signál získaný

při zkoušce, šum pozadí a exprese receptoru. Exprese

receptoru se může zkoušet se specifickými ligandy, např.

lipopolysacharidy (LPS) pro TLR4 (toll-like receptor 4), lipoteichoovou

kyselinu (LTA) pro TLR2 (toll-like receptor

2), syntetický bakteriální lipoprotein pro TLR2-TLR1,

syntetický bakteriální lipoprotein pro TLR2-TLR6 nebo

flagellin.

Křivky dávka-odpověď splňují dvě kritéria pro standardní

křivku endotoxinu popsanou v odstavci 6-1. Použijí-li se

buňky pro detekci neendotoxinových kontaminantů, mají

být kvalifikovány, jak je popsáno v části 6-3.


K zajištění jak přesnosti, tak platnosti zkoušky se provedou

předběžné zkoušky, aby se ověřilo, že kritéria pro standardní

endotoxinovou křivku jsou postačující, že ředění neinterferují

se zkouškou, že zkouška umožňuje detekovat

endotoxiny a neendotoxické kontaminanty a že roztok neinterferuje

s detekčním systémem.

Zkouška na interferující faktory se provádí, když se v experimentálních

podmínkách udělají jakékoliv změny, které by

mohly mít vliv na výsledek zkoušky.

6-1 ZAJIŠTĚNÍ KRITÉRIÍ PRO STANDARDNÍ

ENDOTOXINOVOU KŘIVKU

Připraví se nejméně čtyři koncentrace endotoxinu za použití

standardního roztoku endotoxinu, aby se sestrojila standardní

křivka. Připraví se nejméně čtyři souběžná stanovení

každé koncentrace standardního endotoxinu.

Bazální uvolňování sledovaných odečtů (slepá zkouška)

bez přítomnosti přidaného standardního endotoxinu se má

optimalizovat, aby bylo co nejnižší (např. pro zkoušku

ELISA by optická hustota měla být nižší než 0,1).

Pro standardní křivku existují dvě kritéria přijatelnosti:

– regrese odpovědí (vhodně upravené, je-li třeba) na log

dávky by měla být statisticky signifikantní (p < 0,01);

– regrese odpovědí na log dávky se nesmí signifikantně odklonit

od linearity (p > 0,05) (viz 5.3 Statistická analýza).

6-2 ZKOUŠKA NA INTERFERUJÍCÍ FAKTORY

K zajištění platnosti zkoušky se provádějí předběžné zkoušky,

aby se prokázalo, že zkoušený přípravek ve zkoušce neinterferuje.

Za použití vhodného ředidla se připraví ředění

zkoušeného přípravku v geometrických krocích tak, aby žádné

ředění nepřesáhlo maximální validní ředění. Připraví se

stejná ředění zkoušeného přípravku a přidá se endotoxin ve

zdůvodněné koncentraci. Alternativně se použije rozpouštědlo

obsahující přidaný endotoxin ve zdůvodněné koncentraci.

V obou případech o koncentraci obvykle rovné středu nebo

v blízkosti odhadovaného středu standardní křivky endotoxinu

(Metoda A) nebo rovnající se dvojnásobku odhadovaného

limitu detekce (Metoda B). Tyto série ředění se zkouší

souběžně ve stejném pokusu. Za použití standardní křivky

endotoxinu se vypočítá koncentrace ekvivalentního množství

endotoxinu pro každý roztok. Odečtením průměrné koncentrace

endotoxinu (byla-li naměřena) v roztoku od koncentrace

endotoxinu v roztoku, ke kterému byl endotoxin přidán, se

vypočítá průměrná hodnota záchytu přidaného endotoxinu.

Zkoušený roztok se považuje za prostý interferujících faktorů,

jestliže v podmínkách zkoušky je naměřená koncentrace

endotoxinu přidaného ke zkoušenému roztoku po odečtení

jakéhokoliv množství endotoxinu detekovaného v roztoku,

ke kterému nebyl přidán endotoxin, v rozmezí 50 % až

200 % známé koncentrace přidaného endotoxinu. Pokud toto

kritérium není splněno, upřednostňuje se Metoda C před Metodami

A a B.

V Metodě C závisí ředění zkoušené a porovnávací šarže na

typu analýzy použité k jejich vzájemnému porovnání. Typ

analýzy se musí zdůvodnit a validovat pro každý přípravek

a má zahrnovat kritéria validity zkoušky. Např. roztok

zkoušeného přípravku se připraví ve třech ředěních: nejvyšší

koncentrace (nejnižší ředění), která stimuluje uvolnění

největšího množství sledovaného odečtu, a dvojnásobná

ředění těsně nad a pod vybraným ředěním. Protože koncentrace,

která stimuluje největší uvolnění sledovaného odečtu,

může být závislá na dárci a stejně tak na šarži, validace

specifického přípravku se provádí nejméně třemi nezávislými

zkouškami, každá používající buňky od různých dárců.

Nejvyšší koncentrace (nejnižší ředění), která stimuluje

největší uvolnění sledovaného odečtu u většiny dárců,

a dvojnásobná ředění těsně nad a pod vybraným ředěním se

považují za zvalidované pro další zkoušení. Jestliže neředěný

zkoušený roztok stimuluje největší uvolnění sledovaného

odečtu, provedou se další zkoušky za použití neředěného

zkoušeného roztoku a také zkoušeného roztoku zředěného

v poměru 1 : 2 a 1 : 4 před jeho přidáním k monocytárním

buňkám. Ředicí faktory pro tyto tři roztoky se

označují f1, f2 a f3.

Pokud je obsah pyrogenů ve své podstatě vysoký, může být

mnohem vhodnější provést např. model rovnoběžnosti křivek

závislosti dávka-odpověď pro zkoušenou a porovnávací šarži.

V tom případě se roztoky přípravků zkouší ve třech nebo

více ředěních, které pokrývají rozsah dávka-odpověď použitou

při validované analýze (viz 5.3 Statistická analýza).

6-3 METODA VALIDACE PRO NEENDOTOXINOVÉ

KONTAMINANTY AKTIVUJÍCÍ MONOCYTY

Předběžné zkoušení také ukazuje, že vybraný systém zkoušek

detekuje navíc k bakteriálním endotoxinům i neendotoxinové

prozánětlivé kontaminanty nebo pyrogenní kontaminanty.

Musí se ověřit vhodnost pro specifický produkt.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 321


Toho se může dosáhnout za použití vývojových záznamů

o šaržích, které byly kontaminovány neendotoxinovými

kontaminanty, které způsobily pozitivní odpověď u zkoušek

na pyrogenní látky na králících nebo nežádoucí účinky

u člověka. Pokud nejsou takovéto šarže dostupné, má předběžné

zkoušení zahrnout i validaci za použití nejméně dvou

neendotoxinových ligandů pro toll-like receptory, např.

peptidoglykany, lipoteichoové kyseliny, syntetické bakteriální

lipoproteiny, flagellin a hrubý celobuněčný extrakt

bakterií, z nichž nejméně jeden se přidá do zkoušeného přípravku.

Výběr použitých neendotoxinových pyrogenů by

měl odrážet nejznámější kontaminanty přípravku, který je

zkoušen.

6-4 INTERFERENCE V DETEKČNÍM SYSTÉMU

Jakmile se identifikuje optimální ředění roztoku zkoušeného

přípravku pro další zkoušky, zkouší se toto ředění na interferenci

v detekčním systému (např. ELISA) pro sledované

odečty. Shoda mezi sériovými ředěními standardů pro

sledované odečty je v přítomnosti i nepřítomnosti přípravku,

který se zkouší, v rozmezí např. ±20 % optické hustoty.

7 METODY

7-1 METODA A: KVANTITATIVNÍ ZKOUŠKA

Metoda A zahrnuje porovnání zkoušeného přípravku se

standardní endotoxinovou křivkou závislosti dávka-odpověď.

Koncentrace kontaminantu ve zkoušeném přípravku

má být menší než CLC, aby zkoušený přípravek vyhověl

zkoušce.

Tab. 2.6.30-1

Roztok Roztok Přidaný endotoxin

(m. j./ml)

7-1-1 Postup zkoušky

Za použití validované metody zkoušky se připraví roztoky

podle tabulky 2.6.30-1 a kultivují se čtyři souběžná stanovení

od každého roztoku s kvalifikovanými buňkami.

7-1-2 Výpočet a hodnocení

Veškeré údaje zahrnuté do analýzy dat jsou vztaženy k buňkám,

pro které vyhovují dvě kritéria pro standardní endotoxinovou

křivku. Pro každý odlišný zdroj buněk, např. jednotlivý

odběr, směs odběrů, nebo buněčnou linii se k výpočtu

koncentrace ekvivalentů endotoxinu použije standardní

endotoxinová křivka R1 až R4 pro každé souběžné

stanovení roztoků A, B a C a roztoků AS, BS a CS. Výtěžnost

endotoxinových ekvivalentů vypočítaná z endotoxinové

výtěžnosti nalezené u roztoků AS, BS a CS po odečtení

výtěžnosti endotoxinových ekvivalentů nalezených u roztoků

A, B a C, je v rozmezí 50 % až 200 %. Ředění, která nesplňují

předpoklad obohacené výtěžnosti nejsou platná

a jsou proto z dalšího posuzování vyřazena. Zkoušený přípravek

vyhovuje požadavkům zkoušky pro dané zdroje buněk,

jestliže všechny průměrné koncentrace ekvivalentů

endotoxinu naměřené při souběžném stanovení roztoků A,

B a C jsou po korekci na ředění a koncentraci menší než

limitní koncentrace kontaminantu specifikované pro zkoušený

přípravek. Minimálním požadavkem platné zkoušky je

jedno validní ředění.

7-1-3 Kritéria pro vyhovující/nevyhovující přípravek

Pokud se použijí buňky od jednotlivých dárců, požaduje

se pro zkoušený přípravek, aby vyhověl zkoušce

s buňkami od každého ze čtyř různých dárců. Pokud pří-

Počet souběžných

stanovení

A zkoušený roztok/f žádný 4

B zkoušený roztok/2 × f žádný 4

C zkoušený roztok/4 × f žádný 4

AS zkoušený roztok/f střední dávka ze standardní

endotoxinové křivky (R3)

BS zkoušený roztok/2 × f střední dávka ze standardní


CS zkoušený roztok/4 × f střední dávka ze standardní


R0

R1–R4

fyziologický roztok prostý pyrogenů nebo

ředidlo pro zkoušku



žádný (negativní kontrola) 4

4 koncentrace standardního

endotoxinu

4

4

4

4 od každé koncentrace

Roztok A = roztok zkoušeného přípravku v ředění zde označeném f, při kterém byla provedena zkouška na interferující faktory,

tj. nejvyšší koncentrace (nejnižší ředění), pro které je záchyt endotoxinu v rozmezí 50 % až 200 %.

Roztok B = dvojnásobné ředění roztoku A, které nepřesahuje nejvyšší účinné ředění.

Roztok C = dvojnásobné ředění roztoku B, které nepřesahuje nejvyšší účinné ředění.

Roztok AS = roztok A obohacený standardním endotoxinem v koncentraci odpovídající střední dávce ze standardní endotoxinové

křivky (R 3).

Roztok BS = roztok B obohacený standardním endotoxinem v koncentraci odpovídající střední dávce ze standardní endotoxinové

křivky (R 3).

Roztok CS = roztok C obohacený standardním endotoxinem v koncentraci odpovídající střední dávce ze standardní endotoxinové

křivky (R 3).

Roztok R 0 = negativní kontrola.

Roztoky R 1–R 4 = roztoky standardního endotoxinu v koncentracích použitých ve zkoušce na interferující faktory.

322 ČL 2017 – Dopl. 2020


pravek vyhověl zkoušce od tří ze čtyř dárců, pokračuje

zkouška s buňkami dalších čtyř dárců, buňky žádného

z nich nebyly použity v první zkoušce. Zkoušený přípravek

se považuje za vyhovující zkoušce, jestliže vyhověl

s buňkami od sedmi z osmi různých dárců (tj. je povolena

nejvýše jedna pozitivní reakce s osmi dárci). Pokud se

zdroj monocytů sestává ze směsi buněk od více jednotlivých

dárců, požaduje se pro zkoušený přípravek, aby vyhověl

zkoušce s jednou směsí buněk. Pokud se ke zkoušce

použije buněčná linie lidských monocytů, požaduje se pro

zkoušený přípravek, aby vyhověl zkoušce s jednou kvalifikovanou

pasáží buněk.

7-2 METODA B: SEMIKVANTITATIVNÍ ZKOUŠKA

Metoda B zahrnuje porovnání zkoušeného přípravku se

standardním endotoxinem. Koncentrace kontaminující látky

ve zkoušeném přípravku má být menší než limitní koncentrace

kontaminantu, aby zkoušený přípravek vyhověl

zkoušce. Není-li zdůvodněno a schváleno jinak, musí se pro

vydání rozhodnutí použít roztok A.





Zkušební

metody

2.6

Tab. 2.6.30-2

Roztok Roztok Přidaný endotoxin

(m. j./ml)

Počet souběžných

stanovení

A zkoušený roztok/f žádný 4

B zkoušený roztok/f1 žádný 4

C zkoušený roztok/f2 žádný 4

AS zkoušený roztok/f standardní endotoxin při

2 × odhadovaném limitu detekce

pro systém zkoušky

BS zkoušený roztok/f1 standardní endotoxin při



CS zkoušený roztok/f2 standardní endotoxin při



R0

R1

R2

R3

R4











žádný (negativní kontrola) 4

standardní endotoxin při

0,5 × odhadovaném limitu detekce











Roztok A = roztok zkoušeného přípravku v ředění zde označeném f, při kterém byla provedena zkouška na interferující faktory.

Roztok B = roztok zkoušeného přípravku v ředění zde označeném f 1, které nepřesahuje nejvyšší účinné ředění, vybraný na základě

údajů z validace specifického přípravku, např. 1 : 2 × nejvyšší účinné ředění (tj. dvojnásobně nižší ředění než nejvyšší

účinné ředění).

Roztok C = roztok zkoušeného přípravku v ředění zde označeném f 2, které nepřesahuje nejvyšší účinné ředění, vybraný na základě

údajů z validace specifického přípravku, např. nejvyšší účinné ředění.

Roztok AS = roztok A obohacený standardním endotoxinem při 2 × odhadovaném limitu detekce pro systém zkoušky (jak je určeno

při předběžném zkoušení).

Roztok BS = roztok B obohacený standardním endotoxinem při 2 × odhadovaném limitu detekce pro systém zkoušky.

Roztok CS = roztok C obohacený standardním endotoxinem při 2 × odhadovaném limitu detekce pro systém zkoušky.

Roztok R 0 = negativní kontrola.

Roztok R 1 = standardní endotoxin při 0,5 × odhadovaném limitu detekce pro systém zkoušky.

Roztok R 2 = standardní endotoxin při 1 × odhadovaném limitu detekce pro systém zkoušky.



4

4

4

4

4

4

4

ČL 2017 – Dopl. 2020 323



Veškeré údaje zahrnuté do analýzy dat jsou vztaženy k buňkám,

pro které progresivně rostou průměrné odpovědi na

roztoky R0 až R4. Průměrná odpověď na R0 může být rovna

průměrné odpovědi na R1. Pro každý odlišný zdroj buněk

má být průměrná odpověď na roztok R2 větší než pozitivní

limitní hodnota. Údaje pod limitní hodnotou jsou považovány

za negativní. Pokud je průměrná odpověď na roztok

R1 nebo R2 větší než limitní hodnota, musí být odpověď

roztoku vybraného pro posouzení (zda vyhoví nebo nevyhoví

zkoušce) negativní, tj. vyhoví. Pro každý negativní

roztok zkoušeného přípravku (A, B a C) se průměrná odpověď

na odpovídající obohacený roztok (AS, BS a CS) porovnává

s průměrnou odpovědí na roztok R3, aby se určila

procenta záchytu přidané kontaminující látky. Koncentrace

kontaminující látky ve zkoušeném přípravku je menší než

CLC pro daný zdroj buněk, jestliže roztok zkoušeného přípravku

vybraný pro posouzení (zda vyhoví nebo nevyhoví

zkoušce) a všechna jeho nižší ředění poskytují negativní

výsledky v rozmezí 50 % až 200 %.


Kritéria jsou stejná jako pro metodu A (viz odstavec 7-1-3).

7-3 METODA C: POROVNÁVACÍ ZKOUŠKA

S REFERENČNÍ ŠARŽÍ

Metoda C zahrnuje porovnání zkoušeného přípravku s validovanou

referenční šarží tohoto přípravku. Typ analýzy

vybraný pro porovnání má být zdůvodněn a validován pro

každý přípravek a má zahrnovat kritéria validity zkoušky.

Referenční šarže se také vybírá podle zdůvodněných

a schválených kritérií. Zkouška je určena k provedení

v případech, kdy zkoušený přípravek vykazuje známky interference,

ale nemůže se zředit na nejvyšší účinné ředění

k jejímu překonání, protože obsahuje nebo se předpokládá,

že obsahuje neendotoxinové kontaminanty. Odpovědi na

neendotoxinové kontaminanty se mohou zeslabit mnohem

rychleji než odpovědi na endotoxin, proto je nutné provádět

zkoušky v rozsahu ředění, které zahrnuje minimální naředění.

Postup zkoušky je uveden dále a zahrnuje i příklad

typu analýzy použité pro porovnání zkoušeného přípravku

s referenční šarží.





Tab. 2.6.30-3

Roztok Roztok/ředicí faktor Počet

souběžných

stanovení

A roztok referenční šarže/f1 4

B roztok referenční šarže/f2 4

C roztok referenčního šarže/f3 4

D roztok zkoušeného přípravku/f1 4

E roztok zkoušeného přípravku/f2 4

F roztok zkoušeného přípravku/f3 4

G

pozitivní kontrola

(standardní endotoxin)

R0 ředidlo (negativní kontrola) 4

Roztoky A, B a C = roztoky referenční šarže zředěné podle ředicích

faktorů f 1, f 2 a f 3 určených ve zkoušce

na interferující faktory.

Roztoky D, E a F = roztoky zkoušeného přípravku zředěné

podle ředicích faktorů f 1, f 2 a f 3 určených ve

zkoušce na interferující faktory.

Roztok G = pozitivní kontrola zkoušky životaschopnosti

buněk, je to koncentrace standardního

endotoxinu, která poskytuje jasnou pozitivní

odpověď.

Roztok R 0 = ředidlo použité k ředění zkoušeného přípravku

a slouží jako kontrolní roztok.


Veškeré údaje zahrnuté do analýzy dat jsou vztaženy

k buňkám, pro které roztok G a alespoň jeden z roztoků

A, B a C poskytují odpověď, která je větší než základní

potvrzení sledovaného odečtu (roztok R0). Pro každý

odlišný zdroj buněk, např. jednotlivý odběr, směs více

odběrů nebo buněčná linie, se použije standardní křivka

k odečtení (kalibrační křivka souběžných stanovení

s kontrolním roztokem a nejméně čtyřmi geometrickými

ředěními koncentrací standardu pro sledovaný odečet)

a vypočítá se průměr odpovědí souběžných stanovení roztoků

A až F, součet průměru odpovědí roztoků A, B a C

a součet průměru odpovědí roztoků D, E a F. Součet průměru

odpovědí roztoků D, E a F se dělí součtem průměru

odpovědí roztoků A, B a C.

Zkoušený přípravek vyhovuje požadavkům zkoušky pro

dané zdroje buněk, jestliže výsledné hodnoty vyhovují definovaným

kritériím přijatelnosti nepřesahujícím zdůvodněnou

hodnotu, např. 2,5.


Kritéria jsou stejná jako pro metodu A (viz odstavec 7-1-3).

K podrobnější kvantifikaci úrovně kontaminace se mohou

metody A, B a C provést za použití dalších ředění roztoků

zkoušeného přípravku, které nepřesahují nejvyšší účinné

ředění.

Následující část je uvedena pouze pro informaci

Poznámky k pokynu

1 ÚVOD

Zkouška aktivace monocytů (MAT) je přednostně určena

k použití jako metoda nahrazující zkoušku na pyrogenní

látky na králících. Zkouška aktivace monocytů se používá

k detekci pyrogenních látek a prozánětlivých kontaminantů,

včetně endotoxinů z gramnegativních bakterií a neendotoxinových

kontaminantů, včetně patogenně sdružených molekulárních

typů (pathogen-associated molercular patterns;

PAMPs) odvozených od grampozitivních a gramnegativních

bakterií, virů a hub, a chemických nebo biologických

entit vztahujících se k přípravku a postupu.

Protože neendotoxinové kontaminanty jsou fyzikálně-

-chemicky různorodé třídy molekul a obvykle je původ

kontaminantů v přípravku neznámý, vyjadřuje se úroveň

kontaminace buď v jednotkách vztažených k endotoxinu

4

324 ČL 2017 – Dopl. 2020


odvozených porovnáním odpovědi na standardní endotoxin,

nebo porovnáním s referenční šarží zkoušeného přípravku.

Ve zkoušce aktivace monocytů se odpovědi na standardní

endotoxin obvykle zeslabí přibližně kolem 1 log a odpovědi

na přípravky kontaminované neendotoxinovými kontaminanty

(samotnými nebo v kombinaci s endotoxiny) často

při ověřování jejich schopnosti stimulovat monocyty vykazují

velmi strmé křivky dávka-odpověď, obvykle ve skocích

přes jedno nebo dvě ředění.

Často se největší odpověď na takto kontaminované produkty

získá s neředěnými roztoky zkoušených přípravků nebo

s jejich malými ředěními. Z toho důvodu se musí roztoky

zkoušených přípravků, které obsahují nebo mohou obsahovat

neendotoxinové kontaminující látky, zkoušet v rozsahu

ředění, které zahrnuje minimální ředění.

2 METODY

2-1 INFORMACE TÝKAJÍCÍ SE VÝBĚRU METODY

Metody A, B a C nejsou běžně použitelné, když má zkoušený

přípravek vnitřní aktivitu stimulující uvolnění sledovaného

výstupu, nebo když je zkoušený přípravek kontaminován

sledovaným výstupem. V obou případech je proto

třeba přistoupit k úpravě a validaci vybrané metody. Od validace

na specifický přípravek vybranou metodou se očekává

určení četnosti nulové odpovědi na kombinaci daného

přípravku s kontaminentem/kontaminanty a určení postupů,

které se na to zaměří, tj. výběr dárců, navýšení počtu dárců

ve zkoušce, nastavení vyhovujících/nevyhovujících kritérií

vhodnou přísnosti k maximalizaci pravděpodobnosti detekce

kontaminovaných šarží. Metoda A není vhodná, jestliže

výsledky rozdílných ředění (ekvivalent endotoxinu v ml)

ukazují, že křivka dávka-odpověď není rovnoběžná s křivkou

standardního endotoxinu. Metoda B je semikvantitativní

zkouška, která se také může použít, když odpovědi na

ředění zkoušeného přípravku nejsou rovnoběžné s odpověďmi

na ředění standardního endotoxinu.

Metoda C, porovnávací zkouška s referenční šarží, byla vyvinuta

pro extrémní variabilitu dárců v odpovědích na dané

kombinace daného přípravku s kontaminující látkou (látkami).

V tomto případě by se mělo zaznamenat, zda jsou

odpovědi monocytů na bakteriální endotoxiny od většiny

dárců přibližně stejné. Odpovědi monocytů na bakteriální

endotoxiny od různých dárců se mohou významně lišit,

takže je možné to určit jako nulovou odpověď společně

s nízkými a vysokými odpověďmi na kombinace daného

přípravku s kontaminentem/kontaminanty.

2-2 VÝPOČET LIMITNÍ KONCENTRACE

KONTAMINANTU

Kritériem přijatelnosti pro přijetí/nepřijetí rozhodnutí je

limitní koncentrace kontaminantu (CLC), která se vyjadřuje

jako ekvivalentní hodnota endotoxinu na miligram

nebo mililitr, nebo v jednotkách biologické účinnosti

zkoušeného přípravku. Pokud byla pro přípravek specifikovaná

limitní koncentrace endotoxinu (ELC), má limitní

koncentrace kontaminující látky stejnou hodnotu, není-li

předepsáno jinak.

Limitní koncentrace kontaminantu (CLC) vyjádřená

v ekvivalentních hodnotách endotoxinu se vypočítá podle

následujícího vzorce:

v němž značí:

K – prahovou pyrogenní dávku na kilogram tělesné hmotnosti;

M – nejvyšší doporučenou celkovou dávku (bolus) přípravku


Pokud se má přípravek podávat injekčně v častých intervalech

nebo kontinuální infuzí, je M nejvyšší celková dávka

podaná během jedné hodiny.

Limitní koncentrace kontaminující látky závisí na přípravku

a jeho způsobu podání a je uvedena v některých článcích.

Hodnoty pro K jsou uvedeny v tabulce 2.6.30-4.

Tab. 2.6.30-4

Způsob podání

intravenózně

intravenózně pro

radiofarmaka

intratekálně

parenterální formulace

podávané na m 2 tělesné

plochy

K

M

,

Hodnota K

5,0 m. j. endotoxinu/kg tělesné

hmotnosti


hmotnosti


hmotnosti

100 m. j./m 2

2-3 INFORMACE TÝKAJÍCÍ SE KRYOPROTEKTANTŮ

Má se vzít v úvahu vliv kryoprotektantů, např. dimethylsulfoxidu

(DMSO), a jejich reziduí v rozmrazených buňkách:

dimethylsulfoxid je toxický pro buňky v kultuře a, i když se

buňky pečlivě promyjí, kryoprotektanty mohou pozměnit

vlastnosti buněk, např. prostupnost buněčné membrány.

2-4 ZKOUŠKY INTERFERENCE

Kde je to možné, provedou se zkoušky interference na nejméně

třech rozdílných šaržích zkoušeného přípravku.

Zkoušené přípravky, které vykazují příznaky proměnlivosti

šarži od šarže a tak účinně poskytují jedinečnost každé šarži

pro účely zkoušek interference, jsou předmětem zkoušení

interference v rámci každé jednotlivé zkoušky, tj. doprovodné

validace.

Zkoušení interference se přednostně provádí na šaržích

zkoušeného přípravku, které jsou prosté volných endotoxinů

a jiných pyrogenních látek/prozánětlivých kontaminantů

a, kde to není možné, na šaržích, z nichž žádná nemá být

silně kontaminovaná. Pokud je dostupná pouze jedna šarže,

má se validace provést na této šarži třemi nezávislými zkouškami.

Mají se splnit přesné parametry opakovatelnosti,

např. ±50 %.

2-5 KŘÍŽOVÁ VALIDACE

Ve stati 5.1.10 Pokyny pro použití zkoušky na bakteriální

endotoxiny je uvedeno, že zkouška aktivace monocytů

(MAT) by se měla provádět u produktů, u kterých nemůže

být vyloučena přítomnost neendotoxinových pyrogenních

látek. Proto je doporučeno provést testy křížové validace

zkoušky aktivace monocytů společně s validačními testy

zkoušky na bakteriální endotoxiny, za použití nejméně tří

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 325

2.6.31 MIKROBIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ ROSTLINNÝCH LÉČIVÝCH PRODUKTŮ PRO PERORÁLNÍ POUŽITÍ...

šarží. Křížová validace by se měla opakovat na třech šaržích,

jestliže se změnily důležité parametry procesu, což

může vést k tomu, že nelze vyloučit kontaminaci neendotoxinovými

pyrogenními látkami.

Pyrogenní zkouška na králících (viz 2.6.8 Zkouška na pyrogenní

látky) musí být provedena pro křížovou validaci,

jestliže žádná z metod zkoušky aktivace monocytů (A, B

nebo C) nemůže být pro daný přípravek validována.

3 NÁHRADA ZKOUŠKY NA PYROGENNÍ LÁTKY

NA KRÁLÍCÍCH ZKOUŠKOU AKTIVACE

MONOCYTŮ

Jak bylo zmíněno výše, je zkouška aktivace monocytů

(MAT) přednostně určená k použití jako náhrada zkoušky

na pyrogenní látky na králících. Články farmaceutických

přípravků pro parenterální podání mohou obsahovat požadavky

na pyrogenní kontaminanty buď formou zkoušky

na bakteriální endotoxiny, nebo zkoušky aktivace monocytů.

Obecné zásady jsou:

– v jednotlivých článcích, kde se požaduje zkouška, je zařazena

pouze jedna zkouška, buď na bakteriální endotoxiny,

nebo na aktivaci monocytů. Před zařazením

zkoušky aktivace monocytů do článků se požaduje prokázání,

že je možné u daného přípravku úspěšně použít

jednu ze tří metod zkoušky aktivace monocytů;

– tyto nezbytné informace se požadují od výrobců. Společnosti

se vyzývají k uvedení validačních údajů, které

se týkají použitelnosti zkoušky aktivace monocytů

u látek a přípravků, které jsou předmětem zájmu. Tyto

údaje zahrnují podrobnosti o přípravě vzorků a všech

postupech nezbytných k odstranění interferujících faktorů.

Navíc se mají poskytnout jakékoliv dostupné souběžné

údaje pro zkoušku na pyrogenní látky na králících,

které by mohly přispět k ujištění, že nahrazení

zkoušky na pyrogenní látky na králících zkouškou aktivace

monocytů je vhodné.

4 VALIDACE ALTERNATIVNÍCH METOD

Nahrazení zkoušky na pyrogenní látky na králících nebo

nahrazení metody detekce prozánětlivých/pyrogenních kontaminantů

jakoukoliv jinou metodou se považuje za použití

alternativní metody nahrazující lékopisnou zkoušku, jak je

popsáno ve Všeobecných zásadách.

Následující postupy jsou doporučené pro validaci metod

zkoušky aktivace monocytů jiných, než jsou uvedené

v článku:

– postup a materiály a zkoumadla, které se používají v metodě,

by se měly validovat, jak je popsáno pro příslušnou

zkoušku;

– přítomnost interferujících faktorů (a, je-li třeba, postupů

pro jejich odstranění) se mají zkoušet na vzorcích z nejméně

tří výrobních šarží.

Zkouška aktivace monocytů se může použít pro všechny

nové produkty určené pro parenterální podání, které se mají

podle lékopisných požadavků zkoušet na přítomnost neendotoxinových

pyrogenních látek.


ROSTLINNÝCH LÉČIVÝCH

PRODUKTŮ PRO PERORÁLNÍ POUŽITÍ

A EXTRAKTŮ PRO JEJICH PŘÍPRAVU

8.0:20631

1 ZKOUŠKY NA STANOVENÍ POČTU

MIKROORGANISMŮ

Celkový počet aerobních mikroorganismů (TAMC).

Provede se tak, jak je popsáno ve stati 2.6.12.

Celkový počet kvasinek/plísní (TYMC). Provede se tak,

jak je popsáno ve stati 2.6.12. Vzhledem k vysoké přirozené

bakteriální zátěži produktů, popsané ve stati 5.1.8, je

vhodné použít Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky.

2 ZKOUŠKA NA SPECIFIKOVANÉ

MIKROORGANISMY

2-1 ÚVOD


výskyt specifikovaných mikroorganismů, které

mohou být za daných podmínek detekovány.

Zkoušky se navrhují především tak, aby se určilo, zda výrobek,

látka nebo přípravek (dále jen produkt) odpovídají stanovené

specifikaci mikrobiologické jakosti. Pokud se použijí

k těmto účelům, postupuje se podle dále uvedených pokynů,

včetně počtu odebíraných vzorků a vyhodnocení výsledků.

Mohou se použít alternativní mikrobiologické postupy

včetně automatických metod za předpokladu, že se prokáže

jejich srovnatelnost s lékopisnou metodou.

2-2 OBECNÉ POSTUPY

Příprava vzorků se provádí tak, jak je popsáno v obecné

stati 2.6.12.

Jestliže má zkoušený produkt protimikrobní účinky, podle

možností se odstraní nebo neutralizují, jak je popsáno

v obecné stati 2.6.12.


látky, musí se prokázat jejich neškodnost pro mikroorganismy

a jejich slučitelnost s použitými inaktivátory, jak je

popsáno v obecné stati 2.6.12.

2-3 RŮSTOVÉ A INHIBIČNÍ VLASTNOSTI ŽIVNÝCH

PŮD, VHODNOST ZKOUŠKY A NEGATIVNÍ

KONTROLY

Musí se stanovit schopnost zkoušky detekovat mikroorganismy

v přítomnosti zkoušeného produktu. Jestliže ve zkušebním

postupu nebo u produktu dojde ke změně, která by mohla

ovlivnit výsledek zkoušky, musí se potvrdit její vhodnost.

2-3-1 PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍCH KMENŮ







2-3-1-1 Aerobní mikroorganismy. Každý zkušební bakteriální

kmen se kultivuje samostatně v tekuté půdě s hydro-

326 ČL 2017 – Dopl. 2020


lyzáty sóji a kaseinu nebo na agarové půdě s hydrolyzáty

sóji a kaseinu 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.


NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276, CCM 4516 nebo

CNCTC 5887;


NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275, CCM 1961

nebo CNCTC 5664;


CIP 53.126, NBRC 3972 nebo CCM 4517;


jako např. ATCC 14028, nebo alternativní Salmonella

enterica ssp. enterica sérovar Abony, jako např.

NBRC 100797, NCTC 6017, CIP 80.39 nebo CCM 4518;

– Bacillus subtilis, jako např. ATCC 6633, NCIMB 8054,

CIP 52.62, NBRC 3134, CCM 1999 nebo CNCTC 5610.

K přípravě suspenzí se použije tlumivý roztok chloridu sodného

s peptonem o pH 7,0 nebo tlumivý roztok fosforečnanový

o pH 7,2. Suspenze se použijí do 2 h nebo, jsou-li

uchovávány při 2 °C až 8 °C, do 24 h. Jako alternativní

možnost pro přípravu a následující ředění čerstvé suspenze

vegetativních buněk Bacillus subtilis se může připravit stabilní

suspenze spór a následně použít vhodný objem pro

inokulaci. Stabilní suspenze spór se může uchovávat validovanou

dobu při 2 °C až 8 °C.

2-3-2 NEGATIVNÍ KONTROLA

K ověření podmínek zkoušení se místo zkoušeného přípravku

použije jako negativní kontrola zvolené ředidlo. Nesmí se

v něm pozorovat růst mikroorganismů. Negativní kontrola se

také použije při zkoušení produktů, jak je popsáno v části 2-

4. Selžou-li negativní kontroly, požaduje se prošetření.

2-3-3 RŮSTOVÉ A INHIBIČNÍ VLASTNOSTI ŽIVNÝCH PŮD

Zkouší se každá šarže hotových půd a každá šarže půd připravovaných


složek.



Zkouška růstových vlastností pro tekuté živné půdy.

Vhodná část živné půdy se inokuluje malým množstvím (ne

více než 100 CFU) vhodného mikroorganismu. Inkubuje se

při určené teplotě ne déle, než je nejkratší doba stanovená

pro zkoušku. Tekutá půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu se

inkubuje nejvýše 3 dny při 30 °C až 35 °C. Zřetelně viditelný

růst mikroorganismů je srovnatelný s růstem, který se

objevil u dříve zkoušené a schválené šarže živné půdy.

Zkouška růstových vlastností pro pevné půdy. Použije se

metoda inokulace na povrch agarové půdy, každá plotna se

inokuluje malým množstvím (ne více než 100 CFU) vhodného

mikroorganismu. Inkubuje se při určené teplotě ne

déle, než je nejkratší doba stanovená pro zkoušku. Jasně viditelný

růst mikroorganismů je srovnatelný s růstem, který

se objevil u dříve zkoušené a schválené šarže živné půdy.

Zkouška inhibičních vlastností pro tekuté nebo pevné

půdy. Příslušná živná půdy se inokuluje nejméně 100 CFU

vhodného mikroorganismu. Inkubuje se při určené teplotě po

dobu ne kratší, než je nejdelší doba stanovená pro zkoušku.

Nepozoruje se žádný růst zkoušeného mikroorganismu.

Zkušební

metody

2.6

Tab. 2.6.31-1 Růstové, inhibiční a selektivní vlastnosti živných půd



zkouška na Escherichia coli

zkouška na Salmonella sp.


tekutá půda s hydrolyzáty růst podporující

S. aureus

sóji a kaseinu

P. aeruginosa

B. subtilis

Mosselova obohacená růst podporující

E. coli

tekutá půda pro

P. aeruginosa

enterobakterie

inhibiční

S. aureus


violetí krystalovou a červení

neutrální

tekutá půda s hydrolyzáty

sóji a kaseinu


růst podporující

E. coli

P. aeruginosa

S. aureus

P. aeruginosa

B. subtilis

tekutá MacConkeyova půda růst podporující E. coli

inhibiční

S. aureus

MacConkeyův agar růst podporující a selektivní E. coli



salmonely


s xylosou a lysinem

růst podporující

inhibiční


S. enterica ssp. enterica

sérovar Typhimurium nebo


sérovar Abony

S. aureus


sérovar Typhimurium nebo


sérovar Abony

ČL 2017 – Dopl. 2020 327


Zkouška selektivních vlastností. Použije se metoda inokulace

na povrch agarové půdy, inokuluje se každá miska malým

množstvím (ne více než 100 CFU) příslušného mikroorganismu.

Inkubuje se při určené teplotě po dobu stanovenou

pro zkoušku. Vzhled kolonií a selektivní vlastnosti jsou

srovnatelné s výsledky získanými u dříve zkoušené a schválené

šarže půdy.

2-3-4 VHODNOST ZKUŠEBNÍ METODY

Pro každý zkoušený produkt se připraví vzorek podle popisu

v odpovídajícím odstavci v části 2-4. V průběhu míchání

se přidá každý zkušební kmen v předepsané živné půdě (tekutá

půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu nebo tlumivý roztok

s peptonem). Pro metody stanovení počtu gramnegativních

bakterií tolerujících žluč se inokuluje jednotlivě E. coli

a P. aeruginosa. Pro zkoušku na E. coli a Salmonella sp.

se jednotlivě inokulují specifikované mikroorganismy.

Jakékoliv protimikrobní účinky produktu vyžadují úpravu

zkušební metody (viz část 4-5-3 obecné stati 2.6.12).

Pokud se nemohou protimikrobní účinky daného produktu

neutralizovat s ohledem na mikroorganismus, pro který je

zkouška předepsána, potom lze předpokládat, že inhibovaný

mikroorganismus nebude v produktu přítomen.

2-3-4-1 Zkouška nepřítomnosti. Použije se počet mikroorganismů

odpovídající nejvýše 100 CFU v inokulovaném

zkoušeném přípravku. Zkouška se provede, jak je popsáno

v odpovídajícím odstavci v části 2-4 za použití nejkratší

uvedené inkubační doby. Specifikované mikroorganismy se

musí detekovat selektivními reakcemi popsanými v části 2-4.

2-3-4-2 Kvantitativní stanovení. Semikvantitativní

zkouška (metoda pravděpodobného počtu).

Použije se počet mikroorganismů odpovídající nejvýše

100 CFU v gramu nebo v mililitru zkoušeného produktu.

Zkouška se provede, jak je popsáno v odpovídajícím odstavci

v části 2-4 za použití nejkratší uvedené inkubační

doby. Ředění odpovídající 0,1 g nebo 0,1 ml produktu musí

mít pozitivní výsledek.

2-4 ZKOUŠENÍ PRODUKTŮ

2-4-1 GRAMNEGATIVNÍ BAKTERIE TOLERUJÍCÍ ŽLUČ



2-4-1-1-1 Příprava vzorku a předinkubace. Připraví se

vzorek v ředění 1 : 10 za použití nejméně 1 g zkoušeného

produktu, jak je popsáno v obecné stati 2.6.12, ale jako vybrané

ředidlo se použije tekutá půda s hydrolyzáty sóji

a kaseinu. Promíchá se a inkubuje se při 20 °C až 25 °C po

dobu potřebnou k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich

kultivaci (obvykle 2 h až 3 h).

2-4-1-1-2 Výběr a subkultivace. Inokuluje se vhodné

množství Mosselovy obohacené tekuté půdy pro enterobakterie

výše popsaným přípravkem a/nebo, v závislosti na limitu

pro daný produkt, třemi ze čtyř ředění přípravku, které

obsahuje 0,1 g, 0,01 g, 0,001 g a 0,0001 g (nebo 0,1 ml,

0,01 ml, 0,001 ml a 0,0001 ml) zkoušeného produktu. Inkubuje

se 24 h až 48 h při 30 °C až 35 °C. Každá kultura se

inokuluje na misky se žlučovým agarem s glukosou, violetí

krystalovou a červení neutrální. Inkubuje se 18 h až 24 h

při 30 °C až 35 °C.

2-4-1-1-3 Vyhodnocení. Růst kolonií znamená pozitivní

výsledek. Zaznamená se nejmenší množství produktu, které

poskytuje pozitivní výsledek a největší množství, které poskytuje

negativní výsledek. Z tabulky 2.6.31-2 se určí pravděpodobný

počet bakterií.



produktu

0,1 g

nebo

0,1 ml

0,01 g

nebo

0,01 ml

0,001 g

nebo

0,001 ml

0,0001 g

nebo

0,0001 ml

Pravděpodobný

počet

bakterií

v gramu nebo

v ml produktu

+ + + + > 10 4

+ + + – < 10 4 a > 10 3

+ + – – < 10 3 a > 10 2

+ – – – < 10 2 a > 10

– – – – < 10

2-4-2 ESCHERICHIA COLI

2-4-2-1 Zkouška nepřítomnosti

2-4-2-1-1 Příprava vzorku a předinkubace. Připraví se

vzorek v ředění 1 : 10 za použití nejméně 1 g produktu, jak

je popsáno v obecné stati 2.6.12 a použije se 10 ml nebo

množství odpovídající 1 g nebo 1 ml produktu k inokulaci

vhodného množství (určeného podle odstavce 2-3-4) tekuté

půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu, promíchá se a inkubuje

se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

2-4-2-1-2 Výběr a subkultivace. Nádoba se protřepe, 1 ml

tekuté půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se převede do

100 ml MacConkeyovy tekuté půdy a inkubuje se 24 h až

48 h při 42 °C až 44 °C. Inokuluje se na misky s MacConkeyovou

agarovou půdou a inkubuje se 18 h až 72 h při

30 °C až 35 °C.

2-4-2-1-3 Vyhodnocení. Růst kolonií znamená možnou přítomnost



kolonie nebo identifikační zkoušky jsou negativní.



2-4-2-2-1 Příprava vzorku a předinkubace. Připraví se vzorek


jak je popsáno v obecné stati 2.6.12 a použije se

množství odpovídající 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g (nebo 0,1 ml,

0,01 ml a 0,001 ml) produktu k inokulaci vhodného množství

(určeného podle odstavce 2-3-4) tekuté půdy s hydrolyzáty

sóji a kaseinu, promíchá se a inkubuje se 18 h až

24 h při 30 °C až 35 °C.

2-4-2-2-2 Výběr a subkultivace. Nádoba se protřepe, 1 ml

tekuté půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se převede do

100 ml MacConkeyovy tekuté půdy a inkubuje se 24 h až

48 h při 42 °C až 44 °C. Inokuluje se na misky s MacConkeyovou

agarovou půdou a inkubuje se 18 h až 72 h při

30 °C až 35 °C.

328 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.33 ZBYTKOVÝ PERTUSOVÝ TOXIN

2-4-2-2-3 Vyhodnocení. Růst kolonií znamená možnou přítomnost


Zaznamená se nejmenší množství produktu, které poskytuje

pozitivní výsledek a největší množství, které poskytuje negativní

výsledek. Z tabulky 2.6.31-3 se určí pravděpodobný

počet bakterií.



produktu

0,1 g

nebo

0,1 ml

0,01 g

nebo

0,01 ml

0,001 g

nebo

0,001 ml

Pravděpodobný

počet bakterií

v g nebo v ml

produktu

+ + + > 10 3

+ + – < 10 3 a > 10 2

+ – – < 10 2 a > 10

– – – < 10

2-4-3 SALMONELLA

2-4-3-1 Zkouška nepřítomnosti

2-4-3-1-1 Příprava vzorku a předinkubace. Použije se 25 g

nebo 25 ml zkoušeného produktu k inokulaci 225 ml tlumivého

roztoku s peptonem, promíchá se (např. homogenizací

ve filtračních sáčcích v krokovém homogenizátoru)


2-4-3-1-2 Výběr a subkultivace. 0,1 ml tlumivého roztoku

s peptonem se převede do 10 ml Rappaportovy-Vassiliadisovy

obohacené tekuté půdy pro salmonely a inkubuje se

18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C. Inokuluje se na misky s deoxycholátovým

agarem s xylosou a lysinem. Inkubuje se

18 h až 48 h při 30 °C až 35 °C.

2-4-3-1-3 Vyhodnocení. Růst dobře vyvinutých červených

kolonií s nebo bez černého středu znamená možnou přítomnost

Salmonella sp. To se potvrzuje identifikačními zkouškami.



jsou negativní.


DOPORUČENÉ ROZTOKY A ŽIVNÉ PŮDY

Roztoky a živné půdy uvedené v této obecné stati jsou

popsány v obecné stati 2.6.13. Dále uvedený tlumivý roztok

s peptonem byl shledán vhodným pro účely předepsané

v této stati. Mohou se použít i jiná média, pokud se prokáže,

že jsou vhodná.

Tlumivý roztok s peptonem


hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát

chlorid sodný

pepton

voda čištěná

1,5 g

9,0 g

5,0 g

10,0 g

1000 ml

Upraví se hodnota pH tak, aby po sterilizaci byla 7,0 ±0,2


postupu.


10.0:20633

Synonymum. Zbytkový pertusový toxin a nevratnost

pertusového toxoidu

Zkouška na zbytkový pertusový toxin se provádí in vitro

v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) a je určena

pro stanovení obsahu neadsorbovaných purifikovaných

pertusových složek.

Pertusový toxin BRP je vhodné použít jako referenční

přípravek.

Zkouška shlukování ovariálních buněk čínského křečka

(CHO stanovení) je založena na vzniku shluků v čerstvých

kulturách ovariálních buněk čínského křečka působením

aktivního pertusového toxinu. Kultury jsou pak hodnoceny

pod mikroskopem a případné shluky jsou spočítány. Zkouška

může být použita jako kvantitativní zkouška nebo jako

limitní zkouška s citlivostí určenou v každém stanovení za

použití ředění referenčního přípravku pertusového toxinu.

Citlivost CHO stanovení k pertusovému toxinu se ověřuje

pertusovým toxinem BRP nebo vhodným referenčním přípravkem

kalibrovaným v mezinárodních jednotkách za použití

vhodného CHO stanovení. Citlivost stanovení je definována

jako nejnižší koncentrace v řadě ředění referenčního

přípravku vedoucí k pozitivní odpovědi, např. nejméně

10 shluků CHO buněk. Vhodné stanovení má citlivost nejméně

0,005 m. j./ml.

Následující metoda je uvedena jako příklad.

Zkoumadla a vybavení

– Pertusový toxin BRP.

– CHO-K1 buněčné linie (ATCC No. CCL-61 nebo

ECACC No. 85051005).

– Kaighnovo modifikované Hamovo F-12K kultivační médium.

Mohou se použít i média, která mají trochu jiné složení,

než je uvedeno v tabulce 2.6.33-1. Prolin je esenciální

složkou média. Je-li třeba, pH se upraví na hodnotu

7,2 ±0,2.

– CHO buněčné médium. Kaighnovo modifikované Hamovo

F-12K médium se doplní fetálním bovinním sérem

na výslednou koncentraci 10 % (V/V). Přidá se dostatečné

množství roztoku L-glutaminu (0,2 mol/l) na výslednou

koncentraci 1 % (V/V). Podle potřeby se může přidat antibioticko/antimykotický

roztok. Je-li třeba, upraví se pH

na hodnotu 7,2 ±0,2. Uchovává se při (5 ±3) °C po dobu

n ejvýše 3 týdny, chráněno před světlem.

– Roztok dinatrium-edetátu s trypsinem (trypsin 0,25%).

–Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným

o pH 7,4 (PBS) bez vápenatých nebo hořečnatých solí.

9,0 g chloridu sodného R, 0,144 g dihydrogenfosforečnanu

draselného R a 0,795 g hydrogenfosforečnanu sodného

heptahydrátu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na

1000,0 ml. Je-li třeba, upraví se pH.

– 24jamkové kultivační destičky s rovným dnem s víčkem.

– Kultivační lahve pro tkáňové kultury 75 cm 2 .

– Polypropylenové mikrozkumavky s nízkou schopností vázat

bílkoviny.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 329


Tab. 2.6.33-1 – Kaighnovo modifikované Hamovo F-12K

kultivační médium

Aminokyseliny

L-alanin

L-arginin-hydrochlorid

L-asparagin monohydrát

L-cystein-hydrochlorid monohydrát

L-fenylalanin

L-glutamin

glycin

L-histidin-hydrochlorid monohydrát

L-isoleucin

kyselina L-asparagová

kyselina L-glutamová

L-leucin

L-lysin-hydrochlorid

L-methionin

L-prolin

L-serin

L-threonin

L-tryptofan

L-tyrosin disodná sůl dihydrát

L-valin

Vitaminy

biotin

cholin-chlorid

inositol

D-kalcium-pantothenát

kyselina listová

nikotinamid

pyridoxin-hydrochlorid

riboflavin

thiamin-hydrochlorid

vitamin B12

Anorganické soli

hydrogenfosforečnan sodný bezvodý

hydrogenuhličitan sodný

chlorid draselný

chlorid hořečnatý bezvodý

chlorid sodný


síran hořečnatý bezvodý

síran měďnatý pentahydrát

síran zinečnatý heptahydrát

síran železitý heptahydrát

Další složky

červeň fenolová

D-glukosa

hypoxanthin sodná sůl

kyselina lipoová

natrium-pyruvát

putrescin-dihydrochlorid

thymidin

voda

18,0 mg

0,4220 g

30,0 mg

70,0 mg

9,92 mg

0,2920 g

15,0 mg

45,8 mg

7,88 mg

26,6 mg

29,0 mg

26,2 mg

73,0 mg

8,96 mg

69,0 mg

21,0 mg

23,0 mg

4,1 mg

13,5 mg

23,0 mg

70 μg

14,0 mg

18,0 mg

0,5 mg

1,3 mg

37 μg

60 μg

40 μg

0,3 mg

1,4 mg

0,1155 g

2,5000 g

0,2850 g

49,7 mg

7,5300 g

0,1020 g

0,1920 g

2 μg

0,144 mg

0,8 mg

3,0 mg

1,2600 g

4,0 mg

0,21 mg

0,2200 g

0,32 mg

0,7 mg

do 1000 ml

Kultury buněk ovaria čínského křečka (CHO buněčné

kultury)

Buňky se získají z buněčné banky a používají se v rozmezí

definovaného počtu pasáží. CHO buňky se kultivují v lahvích

pro tkáňové kultury obsahujících 20 ml CHO buněčného

média v inkubátoru se zvlhčovačem udržovaném při

37 °C a 5 % CO2. Buňky se pasážují v poměru 1 : 5 až

1 : 20, podle rychlosti souvislého nárůstu.

Před použitím se všechna zkoumadla nechají vytemperovat

na teplotu místnosti nebo se zahřejí na 37 °C.

Při pasážování buněk se odstraní CHO buněčné médium,

buněčná vrstva se opatrně dvakrát až třikrát promyje tlumivým

roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným, ten

se odstraní a buněčná vrstva se překryje 2 ml roztoku dinatrium-edetátu

s trypsinem, ponechá se 20 s. Roztok dinatrium-edetátu

s trypsinem se odsaje a kultura se ihned hodnotí

mikroskopicky ve fázovém kontrastu. Pokud se buňky začínají

shlukovat, boční strana kultivační lahve se silněji poklepe,

aby se buňky odloučily. Když většina buněk volně

plave, přidá se 10 ml CHO buněčného média, aby se zastavilo

štěpení trypsinem. Trypsinizace pro odloučení buněk

musí být opatrně řízena, aby se zabránilo zvýšené digesci

buněk, která vede ke štěpení receptorů pertusového toxinu

nebo membránových bílkovin, nebo obojímu.

Stanoví se koncentrace a životaschopnost buněk za použití

barvení trypanovou modří nebo jinou vhodnou metodou.

K pokračování zkoušky musí být životaschopnost buněk

vyšší než 95 %. Dostatečný objem buněčné suspenze se

převede do nové lahve v poměru pasáží 1 : 5 až 1 : 20

a přidá se CHO buněčné médium do objemu 20 ml. Buňky

se inkubují v inkubátoru se zvlhčovačem při 37 °C a 5 %

CO2 nejméně 48 h před použitím pro stanovení.

Hustota inokula pro stanovení. Připraví se suspenze CHO

buněk za použití výše uvedeného postupu trypsinizace.

Stanoví se počet buněk a suspenze se zředí tak, aby byl počet

buněk v rozsahu 4 × 10 4 až 8 × 10 4 CHO buněk na mililitr

CHO buněčného média. Vybraná koncentrace buněk

musí umožnit identifikaci shluků na konci doby stimulace.

Do každé jamky 24jamkové destičky se nanese 250 μl

buněčné suspenze. Inokulované destičky se uchovávají

v inkubátoru se zvlhčovačem při 37 °C a 5 % CO2 po dobu

přípravy zkoušeného a referenčního přípravku.

Příprava referenčního pertusového toxinu. Pertusový

toxin BRP se rekonstituuje podle návodu dodaného s referenčním

přípravkem. Připraví se sedm sérií dvojnásobných

ředění v CHO médiu tak, aby konečný bod byl uprostřed

série ředění. Ředění se připraví v polypropylenových mikrozkumavkách

s nízkou schopností vázat bílkoviny. Na

každou zkušební destičku připadá jedna série ředění referenčního

přípravku.

Příprava vzorků neadsorbovaných purifikovaných pertusových

složek. Zkoušený vzorek se zředí v CHO buněčném

médiu na nejvyšší koncentraci zkoušeného vzorku,

která významně nezředí živiny v médiu, s cílem maximalizovat

citlivost stanovení. Připraví se série ředění, jak je

popsáno u referenčního přípravku.

Stimulace CHO buněk. 250 μl z každé zkumavky sériového

ředění referenčního přípravku se nanese do označených ja-

330 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.34 STANOVENÍ BÍLKOVIN HOSTITELSKÝCH BUNĚK

mek zkušebních destiček s CHO buňkami. Podobně se nanese

250 μl každého ředění zkušebního vzorku do označené

jamky (jamek). Do negativních kontrolních jamek se nanese

250 μl CHO média. Zkušební destičky se vrátí zpět do inkubátoru

se zvlhčovačem při 37 °C a 5 % CO2 na 48 h.

Skóre a vyhodnocení výsledků. Buněčné kultury se pozorují

mikroskopem s fázovým kontrastem při čtyřnásobném

nebo desetinásobném zvětšení. Ve všech jamkách nesmí

buněčné kultury splynout a musí mít dostatečný prostor pro

růst, aby se všechny shluky mohly spočítat. Skóre se označí

jako pozitivní, pokud je v jedné jamce zřetelně zaznamenáno

deset nebo více formací buněčných shluků. Skóre se

označí jako negativní, pokud jamky obsahují méně než deset

shluků. Koncentrace v konečném bodu je nejnižší koncentrace,

při které je skóre pozitivní.

Platnost stanovení

Zkoušku lze hodnotit, pokud:

– jamky negativní kontroly nevykazují shlukování;

– jamky obsahující přípravek referenčního toxinu o koncentraci

vyšší nebo rovnou 0,005 m. j./ml vykazují pozitivní

odpověď (tj. deset nebo více buněčných shluků);

– pro referenční přípravek je pozorován zřetelný konečný

bod ředění;

– hodnoty replik v konečném bodu referenčního přípravku

se neliší o více než jedno dvojnásobné ředění pro jedno

stanovení.

Výpočet

Zbytková aktivita pertusového toxinu ve zkoušeném vzorku

v m. j./ml, vztažená k referenčnímu přípravku se vypočítá

podle vzorce:

GM ( kon.

bodu)

GM ( kon.

bodu)

v němž značí:

GM (kon. bodu)S – geometrický průměr reciprokých ředění

v konečném bodu (poslední ředění,

při kterém je pozitivní skóre) pro

zkoušený vzorek;

GM (kon. bodu)R – geometrický průměr reciprokých ředění

v konečném bodu (poslední ředění,

při kterém je pozitivní skóre) pro

referenční přípravek;

AR

– aktivitu referenčního přípravku (základní

roztok) v mezinárodních jednotkách

na mililitr.

Příklad

Série sedmi dvojnásobných ředění se připraví pro referenční

přípravek a pro zkoušený vzorek. V tomto případě, referenční

základní roztok má aktivitu 1000 m. j./ml. Získaná

skóre pro každé ředění referenčního přípravku a zkoušeného

vzorku, reciproká ředění v konečném bodu a geometrické

průměry reciprokých ředění v konečném bodu jsou uvedeny

v tabulkách 2.6.33-2 a 2.6.33-3.

S

R

× A

R

,

Tab. 2.6.33-2 Ředění referenčního přípravku a skóre

Ředění referenčního

přípravku

Skóre

Rep. 1 Rep. 2

1 : 100 000 + +

1 : 200 000 + +

1 : 400 000 + +

1 : 800 000 + –

1 : 1 600 000 – –

1 : 3 200 000 – –

1 : 6 400 000 – –

Ředení v konečném bodu 1 : 800 000 1 : 400 000

Reciproké ředění

800 000 400 000

v konečném bodu

GM(konečného bodu)R 565 685

Tab. 2.6.33-3 Ředění zkoušeného vzorku a skóre

Ředění zkoušeného vzorku

Skóre

Rep. 1 Rep. 2

1 : 100 + +

1 : 200 + +

1 : 400 + +

1 : 800 + +

1 : 1600 + –

1 : 3200 – –

1 : 6400 – –

Ředení v konečném bodu 1 : 1600 1 : 800

Reciproké ředění v konečném bodu 1600 800

GM(konečného bodu)S 1131

Aktivita zbytkového pertusového toxinu ve zkoušeném

vzorku může být určena takto:

(1131/565685) · 1000 = 2 m. j./ml.

2.6.34 STANOVENÍ BÍLKOVIN

HOSTITELSKÝCH BUNĚK

9.1:20634

Tato obecná stať přináší pokyny k vývoji a validaci stanovení

bílkovin hostitelských buněk (HCP) použitých ve zkoušení

produktů získaných rekombinantní DNA technologií.

Nevylučuje použití alternativních přístupů, které jsou přijatelné

pro oprávněnou autoritu.

ÚVOD

Bílkoviny hostitelských buněk (HCP) jsou nečistoty vznikající

během procesu a pocházející z hostitelských mikroorganismů

použitých pro produkci léčivých přípravků rekombinantní

DNA technologií. Aby se zmírnily jejich

možné vedlejší účinky (např. imunogenita), snižuje se obsah

bílkovin hostitelských buněk na nejnižší možnou míru.

Odstranění bílkovin hostitelských buněk během purifikačního

procesu musí být posouzeno a jejich obsah stanoven

zhodnoceným a zvalidovaným stanovením pro daný produkt.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 331


Limit přijatelnosti obsahu bílkovin hostitelských buněk,

obvykle vyjádřený v nanogramech na miligram léčivé látky,

musí být zdůvodněn, pokud jde o schopnost purifikačního

procesu odstranit bílkoviny hostitelských buněk a potenciální

dopad zbytkových bílkovin hostitelských buněk

na pacienty. V úvahu se bere případný nejhorší možný obsah

bílkovin hostitelských buněk, který by mohl být v daném

produktu podán.

Bílkoviny hostitelských buněk se obecně stanovují za použití

imunoanalýzy, kde se jako činidla používají přípravky

antigenů bílkovin hostitelských buněk nebo jejich referenční

standardy a odpovídající polyklonální protilátky (antiséra).

Antiséra musí pokrýt široké spektrum bílkovin hostitelských

buněk, které se vztahují k produktu.

Nejčastěji používanými kvantitativními stanoveními hladin

bílkovin hostitelských buněk jsou enzymově imunosorbentová

stanovení (ELISA) sendvičového typu. Je třeba poznamenat,

že obsah bílkovin hostitelských buněk stanovený

enzymově imunosorbentovým stanovením (ELISA) není

absolutním stanovením obsažených bílkovin hostitelských

buněk. Citlivost je výsledkem zjištěných kumulativních odpovědí

mnoha jednotlivých bílkovin hostitelských buněk

v porovnání s odpovědí na referenční standardy bílkovin

hostitelských buněk. K charakterizaci různých bílkovin

hostitelských buněk v přípravcích a pro podporu vývoje

a výběru metody stanovení se doporučuje použít doplňující

analytické metody (např. elektroforézu, HPLC, metodu

western blot, hmotnostní spektrometrii).

VÝBĚR STANOVENÍ

Je dostupných několik typů stanovení, při jejichž výběru se

zohledňuje několik faktorů, mezi něž patří stupeň vývoje

přípravku, povaha hostitelských buněk a imunogenita bílkovin,

způsob exprese, výrobní postup a předchozí znalosti.

Při výběru a vývoji stanovení se také musí zvážit jeho životní

cyklus (např. zásoba zkoumadel, shodnost stanovení

a jeho validace, změny postupu).

TYPY STANOVENÍ

Procesně specifická stanovení

Procesně specifická stanovení bílkovin hostitelských buněk

(také nazývané produktově specifická stanovení) se vyvíjejí

a validují s ohledem na specifika produkčního postupu

a využívají stejné hostitelské organismy použité k expresi

rekombinantního přípravku.

Antigeny bílkovin hostitelských buněk se získávají ze simulačního

běhu výrobního postupu aktivní látky (nebo jeho

reprezentativního postupu) až ke kroku schopnému generovat

široké spektrum bílkovin hostitelských buněk v dostatečném

množství.

Získaná antiséra musí pokrýt široký rozsah bílkovin hostitelských

buněk kvůli detekci mnoha možných rozličných

bílkovin hostitelských buněk a také vyhovovat při změnách

procesu.

Platformová stanovení

Platformová stanovení jsou vyvíjena jednotlivými výrobci

a upravena podle potřeb procesů a hostitelského organismu

používaného výrobcem pro produkci. Stejná sestava referenčních

standardů a zkoumadel se může použít pro monitorování

bílkovin hostitelských buněk v různých přípravcích

vyráběných se stejnými hostitelskými organismy za předpokladu,

že kultivační fáze výroby (nebo i purifikační fáze výroby,

pokud je to vhodné) jsou pro tyto přípravky dostatečně

podobné. Vhodnost antiséra by se měla posoudit, jak je

popsáno v odstavci Procesně specifická stanovení.

Obecná stanovení

Komerčně dostupné testovací soupravy pro stanovení bílkovin

hostitelských buněk se běžně označují jako obecná

HCP stanovení. Kity jsou určeny k použití u širokého

spektra podobných expresních hostitelů. Podrobné informace

o přípravě zkoumadel nemusí být výrobcem uvedeny.

Např. antigeny bílkovin hostitelských buněk mohou být

získány z kombinace kmenů expresních hostitelských druhů

a použitý postup nemusí odrážet postup použitý pro přípravek,

který je předmětem zájmu. Vhodnost antiséra by se

měla posoudit, jak je popsáno v odstavci Procesně specifická

stanovení.

KRITÉRIA PRO VÝBĚR STANOVENÍ

Posouzení rizika, které podpoří výběr obecného, platformového

nebo procesně specifického stanovení, se provede

se zřetelem na potenciální otázky bezpečnosti spojené se

zbytkovým obsahem bílkovin hostitelských buněk v léčivé

látce a s ohledem na fázi vývoje přípravku.

Pro časné stadium vývoje se může použít obecné nebo platformové

stanovení. Pro pozdější vývojové fáze se musí

zvážit použití procesně specifického stanovení, které je

obecně doporučováno jako lepší, zejména v porovnání

s obecným stanovením. Je to proto, že procesně specifická

stanovení vykazují mnohem pravděpodobněji imunoreaktivitu

proti reprezentativním bílkovinám hostitelských buněk.

Platformové nebo obecné stanovení je možné použít za

předpokladu, že stanovení je vhodně charakterizováno

a validováno na procesně specifické bílkoviny hostitelských

buněk.

PRODUKCE A ZKOUŠENÍ PŘÍPRAVKU ANTIGENŮ

BÍLKOVIN HOSTITELSKÝCH BUNĚK

Zkoumadla pro stanovení bílkovin hostitelských buněk (antigeny

bílkovin hostitelských buněk a protilátky proti bílkovinám

hostitelských buněk) jsou produkována způsobem,

který umožní zopakování produkce, bude-li jejich doplnění

pro stanovení HCP nutné.

Antigeny bílkovin hostitelských buněk se použijí k přípravě

polyklonální protilátky pro imunologické stanovení bílkovin

hostitelských buněk imunizací jednoho nebo více vhodných

zvířecích druhů. Navíc slouží jako referenční standard

při stanovení bílkovin hostitelských buněk.

Pokud je to možné, antigeny bílkovin hostitelských buněk

musí pokrýt příslušnou populaci bílkovin hostitelských buněk,

jejíž výskyt se očekává z výrobního procesu příslušné

bílkoviny, která je předmětem zájmu.

Populace bílkovin hostitelských buněk musí také být dostatečně

široká, aby pokryla nejhorší možné případy purifikačních

scénářů a poskytla dostatečnou robustnost při případných

změnách ve výrobním procesu během životního

cyklu přípravku.

332 ČL 2017 – Dopl. 2020


PROCESNĚ SPECIFICKÁ STANOVENÍ

Nultá buněčná linie

Vývoj procesně specifického stanovení zahrnuje výběr nulté

buněčné linie, která neobsahuje expresní gen pro daný přípravek

a je odvozena od stejné buněčné linie, která byla použita

k založení produkční buněčné linie. Tato nultá buněčná

linie může být netransfekována nebo mock-transfekována.

Mock-transfekované buněčné linie se vytvoří transfekcí matečné

buněčné linie s prázdnými plazmidy, tj. plazmidy použitými

k vytvoření produkční buněčné linie, ale bez genů kódujících

danou bílkovinu, která je předmětem zájmu.

Mock model produkčního procesu

Kultivační fáze postupu (Upstream)

Antigeny produkované pro procesně specifické stanovení

se získávají mock modelovým produkčním procesem, který

imituje zamýšlený výrobní proces, za použití nulté buněčné

linie a stejných operačních podmínek, kde je to možné.

Pro některé mock modelové produkce představuje použitý

proces přibližně zamýšlený výrobní proces a vede k rozdílům

(např. rozdílné měřítko výroby, operační parametry, interakce

produktu atd.). Nicméně dopad těchto rozdílů se

musí pečlivě zvážit, protože může ovlivnit složení populace

bílkovin hostitelských buněk. Např. mock modelová fermentace

u výrobního procesu inkluzního tělíska nemusí

vést k požadovanému inkluznímu tělísku, pokud není přítomen

přípravek. Proto se v závislosti na použité nulté buněčné

linii (tj. mock-transfekované nebo ne) mohou být antigeny

rozdílně izolovány ve srovnání se zamýšleným výrobním

procesem.

V některých situacích mohou být operační parametry pro

mock modelovou přípravu upraveny tak, aby pokryly nejhorší

možné scénáře (např. k poskytnutí antigenů pokrývajících

široké spektrum různých druhů bílkovin hostitelských buněk).

Např. supernatantní tekutina buněčné kultury obsahující

antigen může být sklizena za minimální úrovní životaschopnosti

buněk, aby bylo zahrnuto více cytosolických bílkovin,

které jsou uvolňovány při další buněčné lýze.

Purifikační fáze postupu (Downstream)

Antigeny bílkovin hostitelských buněk vzniklé při kultivační

fázi postupu jsou obvykle minimálně zpracovávány

(filtrace, koncentrování), aby se získalo reprezentativní

spektrum bílkovin hostitelských buněk. Další purifikace se

obecně nedoporučuje vzhledem k velkému riziku ztráty bílkovin

hostitelských buněk.

Ovšem v případě, kdy antigeny nejsou reprezentativní

(např. vedoucí k nízkému pokrytí), se může zvážit smíchání

mock modelových materiálů z různých kroků produkce.

Může se také dosáhnout obohacení spojením materiálů

z mock modelové fermentace nebo purifikačních cyklů, při

kterých byly použity rozličné operační podmínky, nebo

z vybraných purifikačních cyklů (např. k redukci velkého

množství několika imunodominantních bílkovin hostitelských

buněk).

Zkřížená kontaminace bílkovinou, která je předmětem

zájmu

Antigeny bílkovin hostitelských buněk se musí produkovat

způsobem, který zabrání kontaminaci dokonce i nepatrnými

stopami přípravku, aby se vyloučila zkřížená reaktivita

s polyklonálními protilátkami.

Aby se dosáhlo tohoto cíle, používají se, kdekoliv je to

možné, vyhrazená nebo jednorázová zařízení. Pokud se použije

zařízení víceúčelové, musí se dostatečně vyčistit. Navíc

se musí posoudit riziko kontaminace při plnění nebo zacházení

s antigeny v laboratorním prostředí.

Charakterizace a zkoušení

Před použitím antigenů bílkovin hostitelských buněk pro

imunizaci se vyhodnotí obsah bílkovin (celkový obsah bílkovin)

a ověří se nepřítomnost bílkoviny, která je předmětem

zájmu.

Provede se porovnání populace bílkovin hostitelských

buněk z mock modelové přípravy a zamýšlené přípravy,

obvykle elektroforézou v polyakrylamidovém gelu s natrium-dodecyl-sulfátem

(SDS-PAGE) a/nebo zónovou

(2D) elektroforézou s vysoce citlivým barvením. Cílem

tohoto porovnání je ukázat, že antigeny bílkovin hostitelských

buněk vzešlé z mock modelového produkčního procesu

obsáhnou většinu reprezentativních bílkovin hostitelských

buněk druhů ze zamýšleného výrobního procesu.

Kde je to třeba, může se získat doplňující informace pomocí

doplňujících analytických metod (např. hmotnostní

spektrometrií).

PLATFORMOVÁ STANOVENÍ

Nultá buněčná linie

Vývoj platformového stanovení zahrnuje nultou buněčnou

linii, která neobsahuje expresní gen pro produkt, který je

předmětem zájmu, a používá stejné hostitelské druhy. Tato

nultá buněčná linie může být netransfekovaná nebo mocktransfekovaná

a může být použita pro přípravky z dané výrobní

platformy společnosti.

Mock model produkčního procesu

Kultivační fáze postupu (Upstream)

Antigeny bílkovin hostitelských buněk produkované pro

platformové stanovení se získávají mock modelovým produkčním

procesem, který imituje platformovou kultivační

fázi postupu používanou pro několik produktů a který obvykle

používá stejné složky média. Jako pro všechny mock

modelové produkce, představuje použitý proces přibližně

zamýšlený výrobní proces a může mít dopad na složení bílkovin

hostitelských buněk (viz odstavec Procesně specifická

stanovení).

Purifikační fáze postupu (Downstream)

Stejně jako pro ostatní stanovení, jsou antigeny bílkovin

hostitelských buněk vzniklé při kultivační fázi postupu obvykle

minimálně zpracovány (např. omezený nebo žádný

počet purifikačních kroků), aby se získalo široké spektrum

bílkovin hostitelských buněk, i když se mohou použít strategie

míchání a spojování, aby se rozšířilo spektrum druhů

bílkovin hostitelských buněk.


Stejně jako pro procesně specifická stanovení, zkouší se jak

obsah bílkovin, tak i nepřítomnost bílkoviny, která je předmětem

zájmu. Provede se porovnání populace bílkovin hos-

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 333


titelských buněk z mock modelové přípravy a zamýšlené

přípravy.

OBECNÁ STANOVENÍ

Obecná stanovení jsou komerčně dostupná a jsou vyvinuta

výrobcem.

Podrobné informace k přípravě zkoumadel nemusí být výrobcem

uvedeny. Např. nultá buněčná linie může pocházet

z kombinace kmenů expresních hostitelských druhů a použitý

postup nemusí odrážet postup použitý pro daný produkt,

který je předmětem zájmu.

Nicméně, stanovení obsahu musí být vybráno s přihlédnutím

k zamýšlenému výrobnímu procesu (např. vhodné buněčné

linii) a být vhodně validováno na produkt, který je

předmětem zájmu, a vývojovou fázi. V důsledku toho se

doporučuje, je-li obecné stanovení použito v pozdějším stadiu

vývoje nebo během komerční výroby, validovat stanovení

a kontrolovat shodnost zkoumadel šarži od šarže za

použití buď vhodných kultivačních frakcí z produkčního

procesu, nebo mock modelového přípravku vytvořeného za

použití nulté buněčné linie.

PRODUKCE A CHARAKTERIZACE ZKOUMADLA

PROTILÁTKA PROTI BÍLKOVINÁM


PROCESNĚ SPECIFICKÁ STANOVENÍ

A PLATFORMOVÁ STANOVENÍ

Imunizace

Jednou z výzev imunizačního kroku je generování polyklonálních

protilátek, které jsou vysoce specifické a citlivé na

každou z antigenních bílkovin v komplexní směsi bílkovin

hostitelských buněk použitých jako imunogen. Zvířecí

imunitní odpověď musí být stimulována jak silnějšími, tak

slabšími antigeny.

Vyberou se hostitelská zvířata, která mají výtěžky imunoglobulinu

G (IgG) specifického vůči bílkovinám hostitelských

buněk v dostatečném množství a různorodosti.

Pokud polyklonální vychytávací i detekční protilátky pocházejí

ze stejného zdroje, lze předpokládat, že rozeznají

rozličné epitopy stejných bílkovin hostitelských buněk ve

stanovení. Alternativně se mohou použít polyklonální protilátky

proti bílkovinám hostitelských buněk z různých živočišných

druhů. Při použití několika zvířat daného druhu

může být snížen dopad individuálních rozdílů v imunitní

schopnosti a zajištěna další různorodost odpovědi vedoucí

k maximalizaci pokrytí protilátek proti antigenům bílkovin

hostitelských buněk.

Imunitní odpověď na limitovaný počet antigenů bílkovin

hostitelských buněk se může získat rychle, zejména když se

k povzbuzení imunitní odpovědi použijí adjuvans. Avšak

v komplexní směsi může být třeba diferencovaně posílit

imunitní odpovědi vůči slabším antigenům nebo vůči těm

o nižší koncentraci.

Obvykle je třeba několik imunizací, aby se dosáhlo maximální

imunitní odpovědi, a v závislosti na frekvenci imunizací

může ukončení celého procesu trvat 3 až 6 měsíců.

Imunitní odpověď proti antigenům bílkovin hostitelských

buněk pro dané imunizační schéma se musí monitorovat za

použití stanovení titru protilátek, např. ELISA testem, a porovnáním

výsledků jednorozměrné nebo dvourozměrné

elektroforézy následující po barvení a metodě Western blotu,

kde jsou polyklonální protilátky bílkovin hostitelských buněk

použity jako primární protilátka. V praxi nemusí být některé

minoritní bílkoviny, které vyvolají silnou imunitní odpověď,

viditelné při barvení bílkovin na gelu a některé slabé antigenní

bílkoviny, které jsou detekovatelné barvením bílkovin,

nemusí vyvolat detekovatelnou imunitní odpověď. Aby se

dosáhlo linearity ředění vzorku v komplexu mnoha stanovovaných

látek při imunostanovení, je nezbytné, aby zkoumadla

současně a specificky rozeznala tolik jednotlivých stanovovaných

látek, kolik jich je ve stanovovaném vzorku možných,

a také, aby rozeznala, zda jsou ve stechiometrickém

nadbytku. Z těchto důvodů má být pomocí ELISA testu

zkoušena série ředění vzorků z různých kroků procesu za

použití purifikovaných protilátek z krevních odběrů proti bílkovinám

hostitelských buněk, které byly shledány vhodnými

při použití na western blotu.

Na základě výsledků výše popsaných zkoušek se antiséra

od různých zvířat spojí, znovu se otestují a purifikují se.

Purifikace a příprava

Protilátky proti bílkovinám hostitelských buněk se musí

před stanovením obsahu purifikovat.

Obvykle se toho dosáhne pomocí protein A- nebo protein

G-chromatografie a/nebo afinitní chromatografií s antigeny

bílkovin hostitelských buněk. V případě afinitní

chromatografie s antigeny bílkovin hostitelských buněk se

antigeny použité k imunizaci imobilizují na chromatografické

koloně a specifické protilátky se pak zachytí po aplikaci

antiséra na kolonu.

Mohou být požadovány další purifikace gelovou chromatografií,

aby se odstranily možné agregáty.

Pro zkoušení ELISA testem je část purifikovaných protilátek

proti bílkovinám hostitelských buněk konjugována

s látkou, která napomůže detekci (např. biotin nebo křenová

peroxidasa).

Purifikované protilátky proti bílkovinám hostitelských buněk

a séra se musí skladovat při teplotě, která zaručí jejich

stabilitu.


Vhodnost získaného zkoumadla pro stanovení obsahu bílkovin

hostitelských buněk se posoudí prokázáním pokrytí

bílkovin hostitelských buněk odpovídajících výrobnímu

procesu pomocí protilátek proti bílkovinám hostitelských

buněk.

K tomuto účelu se provede dvourozměrná elektroforéza

antigenů bílkovin hostitelských buněk. Porovnají se profily

bílkovin barvené imunobarvením s profily bílkovin

barvených celkovým barvením. Protilátky proti bílkovinám

hostitelských buněk musí rozpoznat široký rozsah

bílkovin hostitelských buněk v celém rozsahu náboje

a molekulární velikosti. Mohou se zvážit i jiné metody

používající přirozené podmínky.

OBECNÁ STANOVENÍ

Imunizace, purifikace a příprava zkoumadel protilátek proti

bílkovinám hostitelských buněk jsou provedeny výrobcem

a detaily nemusí být dostupné.

334 ČL 2017 – Dopl. 2020


Tab. 2.6.34-1 Koncept doporučení pro charakterizaci zkoumadla a posouzení validity imunostanovení jako důsledek

spotřebování zkoumadel pro stanovení nebo změn procesu

charakterizace

zkoumadla

zkoušení

zkoumadel

pro stanovení

obsahu HCP

posouzení

validačního

stavu

HCP referenční standard

Koncentrace bílkovin nového

referenčního standardu je především

určena pomocí stejných

metod použitých pro

platný referenční standard,

aby se zajistilo, že koncentrace

bílkovin je srovnatelná.

Použijí se vhodné metody

(např. 1D/2D-PAGE*,

2D-DIGE**) porovnání podobnosti

složení bílkovin mezi

novým a dosavadním referenčním

HCP standardem.

Nový referenční standard se

kvantitativně zkouší proti dosud

používanému referenčnímu

standardu na výtěžnost

obohacení při různých koncentracích

pokrývajících validovaný

rozsah stanovení.

Standardní křivka se získá

s novým i stávajícím referenčním

standardem a posoudí

se shodnost.

Pokud charakteristika zkoumadel

a test ELISA prokáží

vhodnost nového referenčního

standardu, může být stávající

standard nahrazen. Nepožaduje

se revalidace zkušební metody.

Pokud se nový referenční

standard signifikantně liší ve

složení bílkoviny a/nebo provedení

stanovení obsahu od

stávajícího standardu, požaduje

se revalidace.

*PAGE: elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

**DIGE: diferenciální gelová elektroforéza

Spotřebované zkoumadlo

protilátka proti HCP

Určí se celková koncentrace bílkovin

nové protilátky. Konečná koncentrace

se musí titrovat pro novou šarži,

aby se dosáhlo podobné standardní

křivky jako pro dosud používanou

šarži.

Pro detekční protilátky/detekční značení

se kontroluje stechiometrie bílkoviny,

aby se zajistila podobnost

s dosud používanou šarží.

Imunoreaktivita nových protilátek se

kvalitativně (vizuálně) nebo semikvantitativně

(určení pokrytí) porovná

s dosud používanou šarží vhodnou

metodou (např. 1D nebo 2D Western

blot). V důsledku variability metody

je zvláště doporučeno provést tyto

charakteristiky souběžně také pro dosud

používanou šarži protilátek.

Porovnají se standardní křivky získané

s novou a stávající protilátkou.

Provede se přemosťovací studie

zkoušením příslušných vzorků

z procesu (např. purifikační kroky ze

sklizně ke konečné aktivní látce).

V souběžném pokusu se musí novými

protilátkami detekovat hladina HCP

v různých krocích procesu shodně,

nebo v lepším kvantifikačním limitu.

Pokud charakteristika zkoumadel

a test ELISA prokáží, že nová protilátka

je vhodná, může být stávající

protilátka nahrazena. Nepožaduje se

revalidace zkušební metody.

Pokud se nová protilátka signifikantně

liší ve stanovení imunoreaktivity

Western blotem nebo v citlivosti

a/nebo provedení stanovení obsahu

ve srovnání se stávající protilátkou,

požaduje se revalidace.

Změny v procesu

Efekt změn procesu, které mají potenciální dopad

na složení HCP jsou analyzovány vhodnými

metodami (např. 1D/2D-PAGE, Western

blot, stanovení obsahu HCP).

Pokud změny procesu nevedou k podstatným

změnám ve složení HCP, jsou stávající HCP

zkoumadla vhodná také pro nový proces.

Pokud změny procesu vedou k podstatným

změnám ve složení HCP, ale vhodnost stávajících

zkoumadel byla prokázána, jsou stávající

HCP zkoumadla vhodná také pro nový proces.

Pokud změny procesu vedou k podstatným

změnám ve složení HCP, ale byla prokázána

nevhodnost stávajících HCP zkoumadel, musí

se vyvinout nové stanovení obsahu včetně

mock modelové fermentace podle nového procesu

a nové imunizace.

Zkouší se mock modelová sklizeň z nového

procesu na výtěžnost obohacení za použití stávajícího

stanovení obsahu HCP.

Vzorky odpovídající procesu (např. purifikační

kroky od sklizně po konečnou aktivní látku)

připravené novou a dosud používanou metodou

se zkouší souběžně.

Pokud protilátky vykazují pro nový proces podobnou

nebo vyšší imunoreaktivitu ve srovnání

s předchozím procesem a HCP stanovení vykazuje

dostatečnou výtěžnost z mock modelové

fermentace nového procesu a také stejnou nebo

vyšší citlivost u vzorků z odpovídajícího kroku

procesu, potom stávající stanovení obsahu a

zkoumadla jsou vhodná pro nový postup. Nepožaduje

se revalidace zkušební metody.

Pokud jsou zkoumadla vhodná pro detekci obsahu

HCP z nového procesu, ale test ELISA vykazuje

signifikantní rozdíly při výtěžnosti mock

modelového vzorku, nebo HCP hladin odpovídajících

kroků postupu, požaduje se revalidace.

Změny v procesu mohou také mít vliv na linearitu

ředění testovaných vzorků z určitých kroků postupu;

jsou-li tyto kroky z hlediska stanovení strategie

kontroly HCP zásadní, může se požadovat revalidace

nebo dokonce příprava nových protilátek.

V případě větších změn ve složení HCP u nového

postupu, vedoucích k neshodě složení bílkovin

ve srovnání se stávajícím standardem, ke

snížení imunoreaktivity protilátek nebo k signifikantnímu

poklesu citlivosti imunostanovení,

potom se připraví nová zkoumadla a zvaliduje

se stanovení obsahu HCP s nimi.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 335


Charakterizace a zkoušení protilátek proti bílkovinám hostitelských

buněk se provede jako u ostatních stanovení. Obvykle

je limitována kontrola shodnosti zkoumadla šarže od

šarže. Proto je požadováno vhodné porovnávací testování

šarží.

VALIDACE STANOVENÍ OBSAHU BÍLKOVIN


Stanovení obsahu bílkovin hostitelských buněk testem

ELISA bylo vyvinuto, aby heterogenní směsi antigenů

o různých koncentracích byly detekovány a kvantifikovány

pomocí zkoumadel s obsahem protilátek, které nejsou

v poměru jedna ku jedné. Odstavec uvedený dále je určen

k zacílení specifik ve vývoji a validaci tohoto typu testu

ELISA.

Zkoušení obsahu bílkovin hostitelských buněk testem, jako

je ELISA, se validuje s ohledem na správnost, specificitu,

přesnost, kvantifikační a detekční limity, linearitu, rozsah

a robustnost.

Během životního cyklu produktu se může požadovat plná

nebo částečná revalidace stanovení, např. když se zavedou

změny ve výrobním postupu, které mají dopad na vhodnost

zkoumadel pro bílkoviny hostitelských buněk.

Správnost

Správnost se prokáže pomocí analýzy výtěžnosti obohacením

vzorku referenčního standardu pro bílkoviny hostitelských

buněk na pozadí příslušné matrice (např. aktivní

látky nebo vzorku z příslušného purifikačního kroku).

Specificita

Specificita se prokáže nepřítomností interference na pozadí

příslušné matrice (včetně aktivní látky). Např. údaje ze studie

správnosti se mohou použít k vyhodnocení specificity.

Přesnost

Jako pro jiná kvantitativní stanovení je vhodné hodnotit opakovatelnost,

mezilehlou preciznost a reprodukovatelnost.

Kvantifikační a detekční limity

Citlivost je obvykle v rozsahu µg/ml (ppm) a obvykle se

popisuje jako kvantifikační limit (QL), který se zpravidla

stanoví studií výtěžnosti obohacením bílkovin hostitelských

buněk v aktivní látce nebo ve vhodné matrici, a vypočítá se

z minimálního obohacení za předpokladu odpovědi s předdefinovanou

správností a přesností opakovaných analýz.

Detekční limit (DL) se často nestanoví (nepovinný validační

ukazatel).

Linearita

Linearita stanovení obsahu bílkovin hostitelských buněk se

prokáže sérií ředění standardu bílkovin hostitelských buněk

a zkouškou výtěžnosti obohacením vzorků (studií správnosti).

Navíc, vzhledem k povaze stanovení obsahu bílkovin hostitelských

buněk, násobným analytům hostitelských bílkovinných

buněk a polyklonálním protilátkám proti bílkovinám

hostitelských buněk, může být pozorována nelinearita

ředění vzorků, t.j. zpětně počítané výsledky zvyšující se

s rostoucím ředěním vzorků, což v mnoha případech souvisí

s nadbytkem jedné nebo více jednotlivých bílkovin hostitelských

buněk ve vzorku v porovnání s dostupnými protilátkami

v imunologickém stanovení bílkovin hostitelských

buněk. V důsledku toho musí být linearita ředění náležitě

posouzena pro příslušný výrobní krok porovnáním cílových

a naměřených koncentrací bílkovin hostitelských buněk

v různých ředěních vzorku. Linearita ředění se prokáže,

když jsou kritéria přijatelnosti pro odchylky stanovení

shodná pro různá ředění vzorků. Studie prokazující linearitu

ředění by měly být provedeny buď během vývoje, nebo

nejpozději během validace.

Pokud vzorky vykazují nelinearitu, připraví se násobná ředění

vzorku mimo rozsah, kde bylo nelineární chování pozorováno.

Konečná hodnota obsahu bílkovin hostitelských buněk se

zpravidla udává jako průměrná koncentrace bílkovin hostitelských

buněk získaná nejméně se dvěma ředěními v lineárním

rozsahu. Pokud je to zdůvodněno, může být dostačující

jedno ředění.

Rozmezí

Rozmezí stanovení obsahu je obvykle definováno koncentracemi

bílkovin hostitelských buněk, u kterých byla prokázána

vhodná hladina správnosti, přesnosti a linearity.

Robustnost

Posouzení robustnosti se provádí během vývojové fáze.

ZMĚNY VE STANOVENÍ BÍLKOVIN

HOSTITELSKÝCH BUNĚK A/NEBO ZKOUMADLA

Množství antigenu a protilátek musí být dostatečné, aby

pokrylo stanovení obsahu bílkovin hostitelských buněk po

několik let. Proto dodávka, jakost a shodnost zkoumadel

musí být adekvátně zajištěna na celou dobu životního cyklu

stanovení.

Pro obecná stanovení bílkovin hostitelských buněk může

být k zajištění shodnosti a jakosti zkoumadel požadována

opakovaná charakterizace nebo revalidace stanovení pro

každou novou šarži zkoumadla, jehož jakost se může šarže

od šarže měnit.

Pro procesně specifická a platformová stanovení nastávají

obvykle dvě situace, kdy mohou být požadována nová zkoumadla

pro stanovení obsahu bílkovin hostitelských buněk:

– referenční standard a/nebo protilátky pro stanovení bílkovin

hostitelských buněk jsou spotřebovány; protilátky se

potom mohou purifikovat ze zmrazené zásoby séra, nebo

je vyžadována nová imunizace;

– změna výrobního postupu může mít dopad na složení bílkovin

hostitelských buněk pro purifikované meziprodukty

nebo pro konečný produkt; zkoumadlo pro stanovení nemusí

být přiměřeně vhodné k detekci a kvantifikaci modifikovaných

bílkovin hostitelských buněk; změny výrobního

postupu mohou proto učinit zkoumadlo nevhodným

pro použití při stanovení.

Nově připravovaná zkoumadla musí být pečlivě charakterizována

[např. dvourozměrnou elektroforézou v polyakrylamidovém

gelu s natrium-dodecyl-sulfátem (SDS-PAGE) s Western

blotem, dvourozměrnou elektroforézou v polyakrylamidovém

gelu s natrium-dodecyl-sulfátem (SDS-PAGE) s diferenciální

gelovou elektroforézou (DIGE) a identifikací hmotnostní

spektrometrií]. Potom musí být posouzen stav validace stanovení

s novým zkoumadlem. Doporučuje se souběžné provedení

těchto experimentů se současnými zkoumadly.

336 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.35 KVANTIFIKACE A CHARAKTERIZACE ZBYTKOVÉ DNA HOSTITELSKÝCH BUNĚK

2.6.35 KVANTIFIKACE

A CHARAKTERIZACE ZBYTKOVÉ

DNA HOSTITELSKÝCH BUNĚK

10.0:20635

Tato obecná stať popisuje analytické metody, které mohou

být použity ke stanovení obsahu a k určení velikosti zbytkové

DNA hostitelských buněk v biologických produktech,

produkovaných na buněčných substrátech. Nevylučuje se

použití alternativních přístupů, které jsou přijatelné pro

oprávněnou autoritu.

ÚVOD

Pro kvantifikaci (stanovení obsahu) zbytkové DNA hostitelských

buněk existuje několik citlivých analytických

metod, včetně kvantitativní polymerasové řetězové reakce

v reálném čase (quantitative real-time PCR, qPCR) (Metoda

A) a imunoenzymatická metoda (Metoda B).

Kvantitativní polymerasová řetězová reakce v reálném čase

(qPCR) může být použita také ke stanovení distribuce velikosti

zbytkové DNA hostitelských buněk jako charakterizační

test v závislosti na typu buněčného substrátu (např.

u kontinuálních buněčných linií) a na množství zbytkové

DNA hostitelských buněk.

Vhodná metoda je vybrána v závislosti na povaze zkoušeného

biologického produktu a s ohledem na charakteristiky a omezení

každé metody, jež jsou shrnuty v Tabulce 2.6.35-1.

PŘÍPRAVA VZORKU

Koncentrace zbytkové DNA hostitelských buněk se může

lišit v závislosti na typu biologického produktu a na schopnosti

výrobního procesu odstranit DNA.

K zajištění vhodné výtěžnosti zbytkové DNA hostitelských

buněk může být nutná předúprava vzorku v závislosti na

vzorku matrice.

Při analýze vzorků vysoce purifikovaných bílkovin jako

jsou rekombinantní bílkoviny nebo monoklonální protilátky

může být k získání zbytkové DNA hostitelských buněk

dostačující jednoduché štěpení proteasou nebo afinitní

chromatografie. Pro komplexnější matrice, jako jsou virové

vakcíny nebo virové vektory, může být k uvolnění zbytkové

DNA hostitelských buněk z virových částic nutný dodatečný

krok lýzy viru.

Imunoenzymatická metoda je citlivá zejména k ovlivnění

bílkovinami. Tomu lze zamezit provedením počáteční

předúpravy vzorku, která může zahrnovat štěpení proteasou

K a natrium-dodecyl-sulfátem (SDS). Tento krok může

postačovat k získání zbytkové DNA hostitelských buněk.

Ovšem v jiných případech může být zbytková DNA hostitelských

buněk vázána na složky vzorku a/nebo mohou být

přítomny rozpustné interferující látky, a v tomto případě

může být nutná extrakce zbytkové DNA hostitelských buněk

ze vzorku.

DNA může být získána s využitím extrakčních protokolů,

jež při studiích prokázaly uspokojivý stupeň výtěžnosti při

obohacení vzorku. Existuje několik vhodných metod, včetně

precipitace DNA nebo DNA-specifické vazby na matrici

(např. magnetické kuličky nebo kolony s nosičem na bázi

oxidu křemičitého). K extrakci vzorků zbytkové DNA hostitelských

buněk mohou být využity komerčně dostupné

soupravy (kity). Některé z těchto souprav využívají chaotropní

sůl (jodid sodný) a detergent (natrium-lauroylsarkosinát)

k narušení spojení mezi zbytkovou DNA hostitelských

buněk a složkami vzorku. Zbytková DNA hostitelských

buněk ve vzorku je následně získána koprecipitací

s nosnou molekulou jako je glykogen za přítomnosti ethanolu

nebo propan-2-olu. Může být potřeba provést několik

nezávislých extrakčních procedur v závislosti na reprodukovatelnosti

výtěžnosti při obohacení. V každé extrakční

proceduře musí být zahrnuta negativní kontrola.

V některých případech může být doporučeno naředění

vzorku za účelem snížení vlivu matrice. Zároveň je možné

s ohledem na úroveň výtěžnosti obohacených vzorků využít

korekční faktor.

Zkušební

metody

2.6

Tabulka 2.6.35-1 – Porovnání charakteristik metody qPCR a imunoenzymatické metody

Charakteristika

Může být použita k určení distribuce

velikosti DNA

Limit kvantifikace

(může se lišit v závislosti na matrici,

metodě a interferujících látkách)

Metoda qPCR

(Metoda A)

Ano

Ne

0,01 – 10 pg/ml 2 – 10 pg/ml

Imunoenzymatická metoda

(Metoda B)

Specificita

(celková DNA × specifická DNA)

Specifická DNA Celková DNA

Interferující látky Bílkoviny Detergenty/bílkoviny/rozpouštědla/RNA

Omezení

Fragmenty menší

než produkt PCR

nemusí být

detekovány

a kvantifikovány.

Není použitelná pro produkty založené na DNA.

Obsah DNA je podhodnocen pro fragmenty menší než

1000 párů bází (bp).

Detekovatelnost závisí na velikosti DNA.

Nedetekovatelné krátké fragmenty DNA (pod 80 nukleotidů)

mohou ovlivňovat kvantifikaci zvýšenou spotřebou činidel.

Produkty musí být prosté bakteriální DNA.

Úzký kvantifikační rozsah: 5 – 150 pg/jamku.

ČL 2017 – Dopl. 2020 337

2.6.35 KVANTIFIKACE A CHARAKTERIZACE ZBYTKOVÉ DNA HOSTITELSKÝCH BUNĚK

METODA A – KVANTITATIVNÍ POLYMERASOVÁ

ŘETĚZOVÁ REAKCE V REÁLNÉM ČASE (qPCR)

Tato metoda může být využita ke kvantifikaci cílové sekvence

buněčné DNA z různých vzorků. Pro zvýšení citlivosti

zkoušky lze pro kvantifikaci zbytkové DNA hostitelských

buněk využít qPCR cílenou buď na stabilní sekvenci

uvnitř vysoce chráněné oblasti hostitelských buněk, nebo

na opakující se elementy. Jestliže je cíleno na opakující se

elementy, může být obtížné odstranit možný vliv pozadí

kvůli DNA z prostředí (např. při použití lidských Alu sekvencí).

Specificita metody qPCR musí být stanovena

v průběhu validačních studií, aby se prokázala absence křížové

reaktivity s nesouvisejícími sekvencemi.

Případně mohou být použity digitální PCR metody.

qPCR amplifikace

Detekce a kvantifikace zbytkové DNA hostitelských buněk

pomocí qPCR může zahrnovat použití buď nespecifického

fluorescenčního barviva, které se vmezeří do jakékoli dvouvláknové

DNA, nebo sondy specifické k určité sekvenci.

Principy qPCR popsané v obecné stati 2.6.21 Amplifikační

techniky nukleových kyselin jsou použitelné.

Počet cyklů potřebných pro fluorescenční měření překračující

hraniční hodnotu (Ct nebo Cp) odpovídá počátečnímu

množství zbytkové DNA hostitelských buněk ve vzorku.

Jestliže je provedeno několik extrakcí, musí být výsledné

vzorky analyzovány v odpovídajícím ředění.

Použijí se negativní kontroly PCR.

Standardní křivka se získá za použití sériového ředění genomové

DNA hostitelských buněk, což umožní stanovení

hladiny zbytkové DNA hostitelských buněk v biologickém

produktu na základě jejich Ct nebo Cp hodnot. Pro přípravu

standardu se doporučuje použít pečlivě charakterizované

reprezentativní genomové DNA extrahované z buněk použitých

pro produkci biologického produktu.

Stejná metodika se použije pro hodnocení velikosti zbytkové

DNA hostitelských buněk. K amplifikaci překryvných

fragmentů různých velikostí v cílové sekvenci mají být navrženy

alespoň dvě sady primerů.


Kontrolní vzorky. Pro kontrolu rizika kontaminace a k zajištění

dostačující citlivosti zahrnuje každé PCR stanovení

obsahu DNA následující kontroly:

– negativní kontrola pro qPCR a negativní kontrola pro extrakci

tvořená vzorkem o vhodné matrici s již prokázanou

absencí cílové sekvence (sekvencí);

– pozitivní kontrola pro qPCR, která obsahuje definovaný

počet kopií cílové sekvence nebo definovanou koncentraci

DNA, jež je určována individuálně pro každý systém

stanovení obsahu DNA;

– kontrola pro extrakci. Typicky se ke zkoušenému materiálu

přidá jako vnitřní kontrola definovaná koncentrace

nebo počet kopií cílové sekvence. V tomto případě musí

být amplikony jasně rozpoznatelné a mohou být detekovány

v samostatné qPCR. Případně lze použít externí

kontrolu tvořenou zkoušeným vzorkem obohaceným

o dobře charakterizovanou hladinu genomové DNA.

Výtěžnost extrakce musí splnit přednastavené hodnoty založené

na stanovení provedeném během validace stanovení.

Standardní křivka genomové DNA. Standardní křivka je ve

vybraném rozsahu lineární.

Koeficient determinace R 2 pro standardní křivku musí být

větší nebo roven 0,98. Účinnost PCR splňuje přednastavené

limity.

Variační koeficient pro různé extrakty a opakování není

vyšší než předdefinované kritérium.

Výpočet

Je-li provedeno několik extrakcí, každý extrahovaný vzorek

se analyzuje samostatně. Obsah zbytkové DNA hostitelských

buněk se vypočítá ze standardní křivky genomové

DNA jako průměr hodnot získaných pro různé extrakce

a replikace (opakování). Pro kvantifikaci celkové DNA ve

vzorku se může také použít korekční faktor s ohledem na

stupeň výtěžnosti.

K určení velikosti zbytkové DNA hostitelských buněk se

vypočítá distribuce překryvných fragmentů různých velikostí

jako poměr počtu kopií pro každou velikost amplikonu

k počtu kopií nejmenší velikosti amplikonu.

METODA B – IMUNOENZYMATICKÁ METODA

Imunoenzymatická metoda je nespecifická technika pro

kvantifikaci zbytkové DNA hostitelských buněk (bez ohledu

na jejich původ). Je to tedy zároveň stanovení obsahu

celkové DNA, a proto je zásadní vyhnout se nejen kontaminaci

DNA z prostředí, ale zároveň musí být všechny použité

materiály a činidla prostá DNA. Zkoušené vzorky

musí být bez mikrobiální kontaminace a všechny vzorky,

kontroly a standardy musí být až k denaturačnímu kroku

zpracovávány za kontrolovaných podmínek.

Podstatou metody je detekce jednovláknové DNA.

Princip

Toto stanovení obsahu celkové DNA se skládá ze čtyř kroků:

– denaturace a tvorba komplexů, kde je DNA zahřátím

vzorku denaturována na jednovláknovou DNA. Denaturovaná

DNA se smíchá s činidlem, které obsahuje protein

vázající se na jednovláknovou DNA, konjugovaný se

streptavidinem a monoklonální anti-DNA protilátku konjugovanou

s ureasou. Protein vázající se na DNA a monoklonální

protilátka jsou specifické k jednovláknové

DNA, ale nejsou sekvenčně specifické. Tekutá fáze za

přítomnosti streptavidinu umožňuje tvorbu komplexů

s jednovláknovou DNA ze vzorku;

– filtrace, kde je komplex filtrován přes biotinylovanou nitrocelulosovou

membránu. Biotin v membráně zachytí

komplexy vazbou na streptavidin. Promytím membrány

se odstraní nenavázaná činidla. Nespecifickým vazbám se

zamezí použitím nitrocelulosové membrány potažené albuminem;

– detekce, kde je membrána umístěna do čtecího zařízení,

které obsahuje roztok močoviny reagující s ureasou

v DNA komplexu a dochází k produkci amoniaku.

Související změna pH se měří potenciometrickým senzorem

v µV/s a je přímo úměrná množství DNA ve vzorku;

– analýza, kde jsou analyzována primární data ze vzorku

a ze standardní křivky za použití softwaru vhodného

k určení obsahu zbytkové DNA hostitelských buněk ve

vzorku.

338 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.36 MIKROBIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ ŽIVÝCH BIOLOGICKÝCH LÉČIVÝCH PŘÍPRAVKŮ: STANOVENÍ...

Všechny vzorky a negativní kontroly jsou zkoušeny obohacené

a neobohacené. Obohacující roztok (1000 pg/ml) se

připraví ředěním koncentrovaného standardu (DNA z telecího

brzlíku) o koncentraci 5000 pg/ml.


Kontrola vzorků

- množství DNA v pozitivní kontrole je v rozmezí uvedeném

na certifikátu šarže, poskytovaným dodavatelem;

- výtěžnost obohacení u negativní kontroly je v rozmezí

80 % až 120 %.

Vzorky

- při analýze několika replikací (opakování) není variační

koeficient pro různá opakování vyšší než předdefinované

kritérium;

- výtěžnost obohacení je mezi 80 % až 120 %.

Výpočet

Obsah zbytkové DNA hostitelských buněk se vypočítá

v pikogramech na mililitr podle vzorce:

( C A) ,

ID × -

V

v němž značí:

ID – poměr ředění a vzorkování;

C – výchozí průměrnou hodnotu (v pikogramech na zkumavku)

pro zkumavky obsahující zředěný vzorek;

A – výchozí průměrnou hodnotu (v pikogramech na zkumavku)

pro zkumavky obsahující negativní kontrolu;

V – objem ve zkoušené zkumavce v mililitrech (obvykle

0,5 ml na zkumavku).

Je-li to nutné, může být tento výsledek upraven extrakční

výtěžností (např. průměrnou výtěžností pro daný produkt).


ŽIVÝCH BIOLOGICKÝCH LÉČIVÝCH

PŘÍPRAVKŮ: STANOVENÍ POČTU

MIKROBIÁLNÍCH KONTAMINANTŮ

9.7:20636

1 ÚVOD

Dále popsané zkoušky umožní určit počet kontaminantů:

mezofilních bakterií a kvasinek/plísní, které mohou růst za

aerobních podmínek u živých biologických léčivých přípravků,

dále jen LBP (Live Biotherapeutic Products).

Zkoušky jsou koncipovány především tak, aby se určilo,

zda LBP (substance nebo přípravek) vyhovuje stanoveným

specifikacím mikrobiální kontaminace.


(5.1.6) včetně automatických metod za předpokladu, že

jsou rovnocenné metodám uvedeným v lékopisu.

2 OBECNÉ POSTUPY

Stanovení se provádí za podmínek navržených tak, aby se

zabránilo vnější mikrobiální kontaminaci zkoušeného LBP.

Musí se přijmout taková opatření zabraňující kontaminaci,

která nemají vliv na kontaminující mikroorganismy prokazované

ve zkoušce.

Pokud zkoušený LBP brání stanovení počtu kontaminujících

mikroorganismů, použije se rozhodovací diagram na

obrázku 2.6.36-1.

Pokud složky zkoušených LBP jiné než účinná látka (tj.

mikroorganismy) projevují inhibiční aktivitu, je třeba je odstranit

nebo neutralizovat, jak je popsáno v obecné stati

2.6.12. Pokud se pro tyto účely použijí inaktivátory, musí

se prokázat jejich účinnost a neškodnost pro cílové kontaminující

mikroorganismy.


látky, musí se prokázat jejich neškodnost pro cílové kontaminující

mikroorganismy a jejich slučitelnost s použitými

inaktivátory.

3 METODY STANOVENÍ POČTU

Použije se metoda počítání na pevných půdách nebo metoda

nejpravděpodobnějšího počtu (MPN). Metoda nejpravděpodobnějšího

počtu je obecně nejméně přesná metoda

stanovení počtu mikroorganismů.

Výběr metody je založen na faktorech, jako jsou podstata

LBP a požadovaný limit mikrobiální kontaminace. Vybraná

metoda musí umožnit zkoušení vzorků dostatečné velikosti

k posouzení shody se specifikací. Musí být prokázána

vhodnost vybrané metody.

4 ZKOUŠKA RŮSTOVÝCH VLASTNOSTÍ ŽIVNÝCH

PŮD, VHODNOSTI METODY STANOVENÍ POČTU


4-1 OBECNÁ USTANOVENÍ

Musí se prokázat schopnost zkoušky detekovat mikrobiální

kontaminaci za přítomnosti daného LBP.

Jestliže dojde ve zkušebním postupu nebo u LBP ke změně,

která by mohla ovlivnit výsledek zkoušky, musí se potvrdit

její vhodnost.


Použijí se standardizované stabilní suspenze zkušebních





matečného inokula. Každý zkušební bakteriální kmen

a kmen hub se kultivuje samostatně, jak je uvedeno

v tabulce 2.6.36-1.

K přípravě zkušebních suspenzí se použije tlumivý roztok

chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo tlumivý roztok

fosforečnanový o pH 7,2; k přípravě suspenzí spor

A. brasiliensis se může k tlumivému roztoku přidat 0,05 %

polysorbátu 80. Suspenze se použijí do 2 h nebo do 24 h,

jsou-li uchovávány při 2 °C až 8 °C. Jako alternativní možnost

k přípravě a ředění čerstvé suspenze vegetativních buněk

A. brasiliensis nebo B. subtilis je možné připravit stabilní

suspenzi spor, jejíž vhodný objem se použije k inokulaci.

Stabilní suspenze spor se mohou uchovávat při 2 °C až

8 °C po zvalidovanou dobu.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 339


ne

Úprava této metody může zahrnovat:

– zvýšení objemu ředidla nebo kultivační půdy;

– zařazení neutralizačního agens, povrchově

aktivní látky nebo solubilizačního agens do

ředidla nebo kultivační půdy;

– kombinaci obou výše uvedených opatření.

Je metoda stanovení počtu

kontaminantů (průměrný počet

jakéhokoliv zkoušeného organismu

se nesmí lišit o faktor větší

než 2 od kontrolní hodnoty)

popsaná v této obecné stati

vhodná pro LBP?

ano

Ověření vhodnosti metody za přítomnosti LBP.

ano

Je růst stále inhibován

(snížení o faktor

větší než 2)?

ne

Úprava tohoto postupu může

zahrnovat:

– úpravu růstových podmínek

(teplota, doba, pH, atd.);

– použití inhibitorů růstu

mikroorganismu;

– použití jiné vhodné půdy;

– kombinace výše uvedených

opatření.

Příklady* postupů

jsou uvedeny

v odstavci 6.

Validace zkoušky ověřením vhodných parametrů

v závislosti na rozsahu úprav zajišťující, že úpravy

nesnižují AMCC nebo YMCC.

ne

Jsou validační

požadavky

splněny?

ano

Provede se zkouška upravenou metodou

a pokračuje se, jak je popsáno v odstavci 5.

Provede se zkouška validovanou metodou.

Postupuje se

podle částí

3, 4 a 5.

*Tuto část je třeba chápat jako informativní. Je možné použít jiné postupy, pokud jsou zdůvodněny.

Obr. 2.6.36-1 Rozhodovací diagram pro metody stanovení počtu mikrobiálních kontaminantů

340 ČL 2017 – Dopl. 2020




použije jako negativní kontrola zvolené ředidlo. Nesmí být

pozorován růst mikroorganismů. Negativní kontrola se také

použije, jestliže se provádí zkoušení LBP popsané v odstavci

5. Selžou-li negativní kontroly, požaduje se prošetření.

4-4 RŮSTOVÉ VLASTNOSTI ŽIVNÝCH PŮD

Zkouší se každá šarže hotových půd a každá šarže půd připravených

buď z dehydratovaného základu, nebo z předepsaných

složek.

Vhodné obaly/misky s tekutou půdou s hydrolyzáty sóji

a kaseinu a agarové půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se

inokulují malým množstvím (ne více než 100 CFU) mikroorganismů

uvedených v tabulce 2.6.36-1 za použití samostatného

obalu/samostatné misky živné půdy pro každý

kmen. Misky se Sabouraudovým glukosovým agarem se

inokulují malým množstvím (ne více než 100 CFU) mikroorganismů

uvedených v tabulce 2.6.36-1 za použití samostatné

misky živné půdy pro každý kmen. Inkubuje se za

podmínek uvedených v tabulce 2.6.36-1.

Pro pevné půdy se nesmí růst lišit o faktor větší než 2 od

hodnoty spočítané pro standardizované inokulum. Pro čerstvě

připravené inokulum je růst mikroorganismů srovnatelný

s předchozím růstem u dříve zkoušené a schválené šarže

půdy. Tekuté půdy jsou vhodné, pokud je jasně viditelný

růst mikroorganismů srovnatelný s předchozím růstem

u dříve zkoušené a schválené šarže půdy.

4-5 VHODNOST METODY STANOVENÍ POČTU ZA

PŘÍTOMNOSTI ZKOUŠENÉHO ŽIVÉHO

BIOLOGICKÉHO PŘÍPRAVKU

4-5-1 Příprava vzorku. Metoda přípravy vzorku závisí na

fyzikálních charakteristikách zkoušeného LBP. Jestliže se

nemůže u žádné z dále popsaných metod prokázat, že je

vhodná, musí se vyvinout alternativní postup.

Připraví se homogenní suspenze zkoušeného LBP (obvykle

v ředění 1 : 10) v tlumivém roztoku chloridu sodného

s peptonem o pH 7,0, tlumivém roztoku fosforečnanovém

o pH 7,2 nebo tekuté půdě s hydrolyzáty sóji a kaseinu. Pro

usnadnění přípravy suspenze obtížně smáčivých substancí

se mohou přidat povrchově aktivní látky, jako je roztok polysorbátu

80 (1 g/l). Je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 6

až 8. Jsou-li třeba další ředění, použije se stejné ředidlo.

4-5-2 Inokulace a ředění. Ke vzorku připravenému, jak je

popsáno výše (odstavec 4-5-1), a ke kontrole (která neobsahuje

zkoušený materiál) se přidá dostatečný objem mikrobiální

suspenze, aby se získalo inokulum, které obsahuje

nejvýše 100 CFU. Objem přidané suspenze by neměl překročit

1 % objemu ředěného LBP.

K potvrzení přijatelného oživení zkoušeného mikroorganismu

z LBP se musí pro přípravu vzorku použít nejnižší

možné ředění. Tam, kde to není kvůli inhibiční aktivitě

LBP možné, musí se vyvinout další vhodné postupy (viz

rozhodovací diagram na obrázku 2.6.36-1). Pokud nelze

u vzorku odstranit inhibici růstu jinak, může se přidat odpovídající

množství mikrobiální suspenze po neutralizaci

nebo ředění.

Inhibiční aktivita. Počet zkušebních mikroorganismů získaný

ze zředěného vzorku, připraveného, jak je popsáno v odstavci

4-5-2, a inkubovaného metodou popsanou dále v odstavci

4-5-3, je srovnatelný s počtem zkušebních mikroorganismů

získaným z připravených kontrol. Jestliže je růst

inhibován (snížení o faktor větší než 2), použije se rozhodovací

diagram na obrázku 2.6.36-1 a postup se pro daný

počet upraví, aby se zajistila platnost výsledků.

Úprava postupu může zahrnovat např. (1) zvětšení objemu

ředidla nebo kultivační půdy, (2) přidání specifikovaných

nebo obecných neutralizačních látek do ředidla, (3) membránovou

filtraci nebo (4) kombinaci těchto opatření.

Je-li růst stále inhibován (snížení o faktor větší než 2), postupuje

se podle rozhodovacího diagramu na obrázku 2.6.36-1.

Nové postupy je třeba validovat ověřením vhodných parametrů

vzhledem k rozsahu modifikace a zajistit, že modifikace

nesnižují AMCC nebo YMCC.

4-5-3 Záchyt mikroorganismů v přítomnosti živého biologického

léčivého přípravku. Pro každý zkušební mikroorganismus

uvedený v seznamu se provede samostatná

zkouška. Spočítají se pouze mikroorganismy přidaného

zkušebního kmene.

4-5-3-1 Metoda počítání na pevných půdách. Pro metodu

počítání na pevných půdách se připraví nejméně dvě misky

pro každou živnou půdu a vypočítá se průměr.

4-5-3-1-1 Metoda zalévání do agaru.

Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá

1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavcích

4-5-1 a 4-5-2, a 15 ml až 20 ml agaru s hydrolyzáty sóji

a kaseinu nebo Sabouraudova glukosového agaru, obě živné

půdy zahřáté nejvýše na 45 °C. Použijí-li se větší Petriho

misky, zvětší se přiměřeně i objem agarové půdy. Pro každý

mikroorganismus uvedený v tabulce 2.6.36-1 se použijí

nejméně dvě Petriho misky. Inkubují se, jak je stanoveno

v tabulce 2.6.36-1. Stanoví se aritmetický průměr pro každou

půdu a vypočítá se počet jednotek vytvářejících kolonie

(CFU) v původním inokulu.

4-5-3-1-2 Metoda inokulace na povrch agarové půdy.

Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá

15 ml až 20 ml agarové půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu

nebo Sabouraudova glukosového agaru, obě zahřáté asi na

45 °C a nechá se ztuhnout. Jestliže se použijí větší Petriho

misky, zvětší se přiměřeně i objem agarové půdy. Povrch

půd se nechá zaschnout, např. v laminárním boxu nebo

v inkubátoru. Pro každý mikroorganismus uvedený v tabulce

2.6.36-1 se použijí nejméně dvě Petriho misky. Odměřený

objem, nejméně však 0,1 ml vzorku připraveného,

jak je popsáno v odstavcích 4-5-1 a 4-5-2, se rozetře na povrch

půdy. Inkubuje se a výsledky se vypočítají podle odstavce

4-5-3-1-1.

4-5-3-2 Metoda nejpravděpodobnějšího počtu (MPN). Preciznost

a přesnost této metody je menší než u metody počítání

na pevných půdách. Nespolehlivé výsledky se získávají

zejména při počítání plísní. Z těchto důvodů se metoda nejpravděpodobnějšího

počtu používá pro výpočet počtu kontaminujících

bakterií (AMCC) v případě, že nelze použít

žádnou jinou metodu. Je-li použití této metody zdůvodněné,

postupuje se následujícím způsobem.

Připraví se řada nejméně tří následujících desetinásobných

ředění LBP, jak je popsáno v odstavcích 4-5-1 a 4-5-2.

Z každého ředění se použijí tři stejné dávky, buď 1 g, nebo

1 ml k inokulaci do tří zkumavek s 9 ml až 10 ml tekuté

půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu. Je-li třeba, může se

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 341


Tab. 2.6.36-1 Příprava a použití zkušebních mikroorganismů

Mikroorganismus

Příprava

zkušebního

kmene

Počet

kontaminujících

aerobních

mikroorganismů

(AMCC)

Růstové vlastnosti

Počet

kontaminujících

kvasinek a plísní

(YMCC)

Vhodnost metody stanovení počtu

v přítomnosti LBP

Počet

kontaminujících

aerobních

mikroorganismů

(AMCC)

Počet

kontaminujících

kvasinek a plísní

(YMCC)

Staphylococcus

aureus,

jako např.

ATCC 6538

NCIMB 9518

CIP 4.83

NBRC 13276

CCM 4516

CNCTC 5887

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

nebo tekutá půda

s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

30 °C až 35 °C

18 h až 24 h

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

a tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu/MPN

tekutá

půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

Pseudomonas

aeruginosa,

jako např.

ATCC 9027

NCIMB 8626

CIP 82.118

NBRC 13275

CCM 1961

CNCTC 5664

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

nebo tekutá půda

s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

30 °C až 35 °C

18 h až 24 h

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

a tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu/MPN

tekutá

půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

Bacillus subtilis,

jako např.

ATCC 6633

NCIMB 8054

CIP 52.62

NBRC 3134

CCM 1999

CNCTC 5610

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

nebo tekutá půda

s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

30 °C až 35 °C

18 h až 24 h

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

a tekutá půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu/MPN

tekutá

půda


a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 3 dny

–

Candida albicans,

jako např.

ATCC 10231

NCPF 3179

IP 48.72

NBRC 1594

CCM 8215

CNCTC 5361

Sabouraudův

glukosový agar

nebo tekutá

Sabouraudova

glukosová půda

20 °C až 25 °C

2 až 3 dny

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

Sabouraudův

glukosový agar

£ 100 CFU

20 °C až 25 °C

£ 5 dnů

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

MPN nelze použít

Sabouraudův

glukosový agar

£ 100 CFU

20 °C až 25 °C

£ 5 dnů

Aspergillus brasiliensis,

jako např.

ATCC 16404

IMI 149007

IP 1431.83

NBRC 9455

CCM 8222

Sabouraudův

glukosový agar

nebo bramborovo-glukosový

agar

20 °C až 25 °C

5 až 7 dnů nebo

do dosažení dobré

sporulace

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

Sabouraudův

glukosový agar

£ 100 CFU

20 °C až 25 °C

£ 5 dnů

agar s hydrolyzáty

sóji a kaseinu

£ 100 CFU

30 °C až 35 °C

£ 5 dnů

MPN nelze použít

Sabouraudův

glukosový agar

£ 100 CFU

20 °C až 25 °C

£ 5 dnů

342 ČL 2017 – Dopl. 2020


k půdě přidat povrchově aktivní látka, jako je polysorbát

80. Tedy jestliže jsou připraveny tři stupně ředění, inokuluje

se devět zkumavek.

Všechny zkumavky se nejvýše 3 dny inkubují při 30 °C až

35 °C. Jestliže odečítání výsledků je obtížné nebo nejisté

vzhledem k povaze zkoušeného LBP, inokuluje se do stejné

půdy nebo na agar s hydrolyzáty sóji a kaseinu a inkubuje se

1 až 2 dny při stejné teplotě; tyto výsledky se použijí. Nejpravděpodobnější

počet mikroorganismů v gramu nebo v mililitru

zkoušeného produktu se stanoví z tabulky 2.6.36-2.


Jestliže se ověřuje vhodnost metody počítání na pevných

půdách, nesmí se získaný průměrný počet žádného zkoušeného

mikroorganismu lišit o faktor větší než 2 od kontrolní

hodnoty určené v odstavci 4-5-2 v nepřítomnosti LBP.

Pokud se ověřuje vhodnost metody nejpravděpodobnějšího

počtu (MPN), pak spočítaná hodnota z inokula musí být

v 95% mezích spolehlivosti výsledků získaných z kontrolní

zkoušky.

Pokud není možné splnit výše uvedená kritéria, postupuje

se podle rozhodovacího diagramu na obrázku 2.6.36-1

a postup se upraví pro danou zkoušku, aby se zajistila

platnost výsledků.

5 ZKOUŠENÍ ŽIVÝCH BIOLOGICKÝCH LÉČIVÝCH

PŘÍPRAVKŮ

5-1 MNOŽSTVÍ POUŽITÉ KE ZKOUŠCE

Není-li předepsáno jinak, použije se 10 g nebo 10 ml zkoušeného

LBP podle podmínek uvedených výše.

Pro LBP, u kterých je celkový počet jednotek v šarži menší

než 200 (např. vzorky, které se používají v klinických

zkouškách), může být množství vzorku sníženo na dvě jednotky,

nebo na jednu jednotku, jestliže je velikost šarže

menší než 100.

Vzorek (vzorky) se vybírají náhodně z nerozplněného materiálu

nebo z dostupných obalů přípravků. K získání požadovaného

množství pro vytvoření vzorku se smíchá obsah

dostatečného počtu obalů.

5-2 ZKOUŠKA ŽIVÝCH BIOLOGICKÝCH LÉČIVÝCH

PŘÍPRAVKŮ

5-2-1 Počítání na pevných půdách

5-2-1-1 Metoda zalévání do agaru. Vzorek se připraví vhodným

postupem uvedeným v odstavci 4. Pro každou půdu se

připraví nejméně dvě Petriho misky pro každý stupeň ředění.

Misky s agarovou půdou s hydrolyzáty sóji a kaseinu se inkubují

3 až 5 dnů při 30 °C až 35 °C a misky se Sabouraudovým

glukosovým agarem 5 až 7 dnů při 20 °C až 25 °C. Vyberou

se misky odpovídající jednomu ředění a ukazující nejvyšší

počet kontaminujících kolonií, který však nepřesahuje

250 pro stanovení počtu kontaminujících aerobních mikroorganismů

(AMCC) a 50 pro stanovení počtu kontaminujících

kvasinek a plísní (YMCC). Z aritmetického průměru počtů

na živnou půdu se vypočítá množství jednotek vytvářejících

kolonie (CFU) na gram nebo mililitr LBP.

5-2-1-2 Metoda inokulace na povrch agarové půdy. Vzorek

se připraví vhodným postupem uvedeným v odstavci 4. Pro

každou půdu se připraví nejméně dvě Petriho misky pro každý

stupeň ředění. Inkubace a výpočet jednotek vytvářejících

kolonie se provede postupem uvedeným pro metodu zalévání

do agaru.

5-2-2 Metoda nejpravděpodobnějšího počtu. Vzorek se

připraví a zředí vhodným postupem uvedeným v odstavci 4.

Všechny zkumavky se inkubují 3 dny až 5 dnů při 30 °C až

35 °C. Jestliže je nezbytná subkultivace, provede se vhodným

postupem. Pro každý stupeň ředění se zaznamená počet

zkumavek, které vykazují mikrobiální růst. Nejpravděpodobnější

počet mikroorganismů v gramu nebo mililitru

zkoušeného LBP se určí z tabulky 2.6.36-2.


Za počet kontaminujících aerobních mikroorganismů

(AMCC) je považováno množství rovné počtu jednotek vytvářejících

kolonie (CFU) nalezených na agarové půdě

s hydrolyzáty sóji a kaseinu; pokud jsou na této půdě nalezeny

kolonie kvasinek/plísní, jejich počet tvoří součást

AMCC. Za kombinovaný počet kontaminujících kvasinek/plísní

(YMCC) je považován počet jednotek vytvářejících

kolonie nalezených na Sabouraudově glukosovém agaru;

pokud jsou na této živné půdě nalezeny kolonie bakterií,

nejsou počítány jako součást YMCC. Pokud se předpokládá,

že kritéria přijatelnosti pro YMCC mohou být překročena

z důvodu bakteriálního růstu, může se použít Sabouraudův

glukosový agar s antibiotiky (viz rozhodovací diagram

na obrázku 2.6.36-1). Jestliže je počet stanoven metodou

nejpravděpodobnějšího počtu (MPN), vypočítaná

hodnota je AMCC.

Pokud jsou předepsána kritéria přijatelnosti mikrobiální

kontaminace, interpretují se následovně:



– 10 3 CFU: nejvyšší přijatelný počet = 2000.

Doporučené roztoky a živné půdy jsou popsány v obecné

stati 2.6.13.

6 POSTUPY STANOVENÍ POČTU MIKROBIÁLNÍCH

KONTAMINANTŮ ZA PŘÍTOMNOSTI INHIBICE

ZPŮSOBENÉ ŽIVÝM BIOLOGICKÝM LÉČIVÝM

PŘÍPRAVKEM

Tato část by měla být považována za informativní. Je možné

použít i jiné postupy, jsou-li schváleny. Příklady postupů

ke stanovení počtu mikrobiálních kontaminantů LBP, které

způsobují jejich inhibici, jsou uvedeny dále.

Každý postup je třeba validovat za použití vhodných parametrů

závisejících na rozsahu úprav, musí být zajištěno, že

úpravy nesníží počet kontaminujících aerobních mikroorganismů

(AMCC) ani počet kontaminujících kvasinek/plísní

(YMCC).

Použijí se zkušební kmeny uvedené v tabulce 2.6.36-1. Příprava

zkušebních kmenů se provede podle odstavce 4-2, negativní

kontroly podle odstavce 4-3. Zkouška na růstové

vlastnosti a vhodnost vybraných nových kultivačních půd se

provede inokulací každé šarže půdy malým počtem mikroorganismů

(ne více než 100 CFU). Získaný růst se neliší o faktor

větší než 2 od hodnoty pro standardizované inokulum spočítané

na agarové půdě s hydrolyzáty sóji a kaseinu (AMCC)

nebo na Sabouraudově glukosovém agaru (YMCC).

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 343

2.6.37 PRINCIPY DETEKCE CIZÍCH VIRŮ V IMUNOLOGICKÝCH VETERINÁRNÍCH LÉČIVÝCH PŘÍPRAVCÍCH...

Tab. 2.6.36-2 Hodnoty nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů

Zjištěná kombinace počtu

zkumavek vykazujících

růst v každé sérii ředění

Množství LBP v gramech

nebo v mililitrech

ve zkumavce

0,1 0,01 0,001

MPN v gramu

nebo

v mililitru

LBP

95% mez

spolehlivosti

0 0 0 < 3 0–9,4

0 0 1 3 0,1–9,5

0 1 0 3 0,1–10

0 1 1 6,1 1,2–17

0 2 0 6,2 1,2–17

0 3 0 9,4 3,5–35

1 0 0 3,6 0,2–17

1 0 1 7,2 1,2–17

1 0 2 11 4–35

1 1 0 7,4 1,3–20

1 1 1 11 4–35

1 2 0 11 4–35

1 2 1 15 5–38

1 3 0 16 5–38

2 0 0 9,2 1,5–35

2 0 1 14 4–35

2 0 2 20 5–38

2 1 0 15 4–38

2 1 1 20 5–38

2 1 2 27 9–94

2 2 0 21 5–40

2 2 1 28 9–94

2 2 2 35 9–94

2 3 0 29 9–94

2 3 1 36 9–94

3 0 0 23 5–94

3 0 1 38 9–104

3 0 2 64 16–181

3 1 0 43 9–181

3 1 1 75 17–199

3 1 2 120 30–360

3 1 3 160 30–380

3 2 0 93 18–360

3 2 1 150 30–380

3 2 2 210 30–400

3 2 3 290 90–990

3 3 0 240 40–990

3 3 1 460 90–1980

3 3 2 1100 200–4000

3 3 3 > 1100

6-1 STANOVENÍ POČTU AEROBNÍCH

MIKROBIÁLNÍCH KONTAMINANTŮ

Živé biologické léčivé přípravky obsahující laktobacily se mohou

na aerobní mikrobiální kontaminaci zkoušet na miskách

s agarem bez cukru, inkubovaným za aerobních podmínek při

30 °C až 35 °C po dobu 72 h. Laktobacily rostou pomalu jako

drobné tečkovité kolonie, zatímco kontaminanty mohou být

snáze detekovány jako větší rychleji rostoucí kolonie.

Alternativně mohou být aerobní kontaminanty zkoušeny na

miskách s agarovou půdou s hydrolyzáty sóji a kaseinu

obohacenou 5 % ovčí krve při 30 °C až 35 °C po dobu 44 h

až 48 h. Přídavek krve zvýrazní růst kontaminantů a formování

typické morfologie kolonií, které se v přítomnosti

lactobacilů snadněji odlišují.

Pro LBP obsahující spory Bacillus clausii může být mikrobiální

kontaminace spočítána na agaru podporujícím sporulaci.

Půda podporující sporulaci Bacillus claussii tlumí vegetativní

růst mikroorganismů LBP a umožňuje detekci kontaminantů.

Misky se inkubují při 33 °C až 37 °C po dobu 48 h.

Živé biologické léčivé přípravky obsahující Saccharomyces

cerevisiae var. boulardii se mohou na aerobní mikrobiální

kontaminaci zkoušet na miskách s agarovou půdou

s hydrolyzáty sóji a kaseinu obsahující cykloheximid,

vhodný inhibitor Saccharomyces spp. Misky se inkubují při

30 °C až 35 °C po 3 až 5 dnů.

Pro LBP, pro které nejsou dostupné vhodné půdy a vhodné

podmínky růstu pro stanovení mikrobiální kontaminace, se

ověří jen nepřítomnost specifikovaných kontaminantů

(Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella spp. a žluč tolerujících gramnegativních

bakterií) za použití metod popsaných v obecné stati

2.6.38 a zkoušky na ostatní kontaminanty se provedou posouzením

rizika (např. specifické kontaminanty z prostředí).

6-2 STANOVENÍ POČTU KVASINKOVÝCH

A PLÍSŇOVÝCH KONTAMINANTŮ

Pro LBP obsahující bakterie se může provést zkouška na

Sabouraudově glukosovém agaru obsahujícím protimikrobní

látky (např. chloramfenikol) inkubovaném při 20 °C až

25 °C po dobu 5 až 7 dnů.

Živé biologické léčivé přípravky obsahující Saccharomyces

cerevisiae var. boulardii se mohou zkoušet na kvasinky

a plísně na různých půdách (Sabouraudově glukosovém

agaru obohaceném chloramfenikolem a cykloheximidem,

Czapkově-Doxově agaru, bramborovo-glukosovém agaru).

2.6.37 PRINCIPY DETEKCE CIZÍCH VIRŮ

V IMUNOLOGICKÝCH

VETERINÁRNÍCH LÉČIVÝCH

PŘÍPRAVCÍCH KULTIVAČNÍMI

METODAMI

10.2:20637

Tato obecná stať popisuje obecné principy použité při kultivačních

metodách k izolaci a detekci cizích virů ve všech

materiálech použitých během výroby imunologických veterinárních

léčivých přípravků (IVLP), ve všech stupních

procesu včetně konečného přípravku.

344 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.6.38 MIKROBIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ ŽIVÝCH BIOLOGICKÝCH LÉČIVÝCH PŘÍPRAVKŮ: ZKOUŠKY…

OBECNÁ USTANOVENÍ

a) Buněčné kultury použité pro zkoušku na cizí viry jsou

prokazatelně vhodné k detekci cílových kontaminantů.

b) Kuřecí materiál použitý ke zkoušce na cizí viry, jako

jsou embryonovaná vejce a primární buňky, by měl být

získáván z chovů kuřat prostých specifikovaných patogenů

(SPF) (5.2.2).

c) Pokud bude mít zkoušený materiál (např. virové matečné

inokulum) potenciál interferovat s průběhem

a citlivostí zkoušky na cizí viry, může být ošetřen minimálním

množstvím monoklonální nebo polyklonální

protilátky tak, aby byl interferující virus neutralizován,

co nejvíce je to možné, nebo aby byl odstraněn. Přípravky

monoklonálních nebo polyklonálních protilátek,

obsahující vysoké hladiny neutralizační protilátky proti

viru inokula, se připravují po šaržích. Antigenní přípravek

použitý k produkci polyklonálních protilátek nepochází

z žádné úrovně pasáže izolátu viru, z níž bylo připraveno

matečné virové inokulum. Každá šarže séra je

po 30 min udržována při 56 ºC, aby se inaktivoval

komplement. Pokud není možné takové sérum získat,

použijí se k odstranění nebo neutralizaci viru inokula

jiné metody.

d) Za použití vhodných zkoušek se musí prokázat, že antisérum

(nebo jiná metoda použitá k odstranění nebo neutralizaci

virového inokula) nemá vedlejší účinek na detekci

cizích virů. Zvláště antisérum, použité pro buněčnou

kulturu, nebo k jinému účelu v některé z těchto

zkoušek, je prosté protilátek proti detekovaným organismům

a nevykazuje žádné jiné inhibiční účinky na

tyto organismy.

e) Pro kultivační techniky může být použita buněčná kultura

nebo embryonovaná vejce. Kultury se inkubují za

vhodných podmínek (např. teplota, vlhkost, atmosféra,

doba inkubace). Počet replik a objemy k inokulaci jsou

vybrány tak, aby byla zajištěna vysoká citlivost zkoušky.

Pozitivní kontroly a neinokulované kontrolní kultury

jsou zařazovány souběžně. Slepá pasáž vzorků se

provádí, aby byla optimalizována detekce nízkého titru

a/nebo pomalu rostoucích cizích virů.

BUNĚČNÁ KULTURA

Buněčná kultura použitá k detekci cizích virů je vhodná

a dostatečně citlivá a je prokázáno, že podporuje růst viru.

Podmínky zkoušky (např. inkubační teplota, doba inkubace,

typ buněčného kultivačního média), stejně jako celý postup

zkoušky [např. typ inkubace, specializované metody, počet

pasáží, intervaly mezi pasážemi, plochy inokulované jednovrstvé

buněčné kultury (monolayeru)] závisí na vlastnostech

buněčné kultury a viru.

Následující buňky se obvykle používají k izolaci a detekci

virů:

– buňky citlivé na viry, které jsou infekční pro druh, který

je zdrojem materiálu;

– buňky citlivé na viry, které jsou infekční pro cílový druh.

Metody detekce závisejí na vlastnostech viru. Viry mohou

být detekovány mikroskopicky, např. typickými příznaky

cytopatického účinku (CPE), jako je tvorba syncytií, oddělování

buněk, zakulacení buněk, intranukleární inkluze,

granulace cytoplazmy a tvorba plaků. Může být nezbytné

potvrdit přítomnost viru za použití dalších adekvátních citlivých

metod (např. pokud CPE nejsou detekovatelné), jako

jsou klasické barvicí metody, imunobarvení (např. imunofluorescenční

zkoušky, nepřímá imunoperoxidasová zkouška),

enzymově imunosorbentové stanovení (ELISA) pro detekci

antigenu, zkoušky neutralizace viru, hemaglutinační

zkoušky, hemadsorpce, molekulární metody [např. metody

amplifikace nukleových kyselin (NAT), jako je polymerasová

řetězová reakce (PCR), polymerasová řetězová reakce

s reverzní transkriptasou (RT-PCR), stanovení obsahu produktu

zvýšeného reverzní transkriptasou (PERT), polymorfismus

délky restrikčních fragmentů (RFLP), sekvenování,

imunoblot, hybridizace oligonukleotidových řad

a hmotnostní spektrometrie], elektronová mikroskopie nebo

jiné vhodné zkoušky.

Zkoušku nelze hodnotit, pokud jsou jakékoliv známky cizího

viru v neinokulovaných kontrolních kulturách nebo pokud

neinokulované kontroly nepřežijí danou pasáž.

EMBRYONOVANÁ VEJCE

Pokud se k detekci cizích virů použijí embryonovaná vejce,

zkušební podmínky (např. inkubační teplota, vlhkost, doba

inkubace), stejně jako celý postup zkoušky (např. způsob

inokulace, stáří inokulovaných embryonovaných vajec, počet

pasáží na embryích, vhodný materiál k inokulaci během pasážování)

závisí na vlastnostech viru. K materiálu, který je

zkoušen na cizí viry, mohou být přidána vhodná antibiotika.

Zvláštní péče musí být věnována tomu, aby se zabránilo

nespecifickým úhynům embryí. Všechna embrya, která

přežijí inkubační dobu nebo uhynou více než 24 h po inokulaci,

se hodnotí na přítomnost cizích virů.

Přítomnost cizích virů se potvrdí makroskopicky (např. detekcí

abnormalit ve vejcích, embryích a na chorioalantoidních

membránách) nebo dalším vyšetřením (např. alantoidních

tekutin), během kterého se může potvrdit jejich přítomnost

a totožnost dostatečně citlivými metodami, jako

jsou molekulární metody [např. metody amplifikace nukleových

kyselin (NAT), jako je polymerasová řetězová reakce

(PCR), polymerasová řetězová reakce s reverzní transkriptasou

(RT-PCR), metoda stanovení obsahu produktu

zvýšeného reverzní transkriptasou (PERT), polymorfismus

délky restrikčních fragmentů (RFLP), sekvenování, imunoblot,

hybridizace nukleotidových řad a hmotnostní spektrometrie],

hemaglutinace (za použití erytrocytů různých

druhů, jak je vhodné), detekce antigenu ELISA zkouškami

nebo jinými vhodnými zkouškami.


ŽIVÝCH BIOLOGICKÝCH LÉČIVÝCH

PŘÍPRAVKŮ: ZKOUŠKY NA

SPECIFIKOVANÉ MIKROORGANISMY

9.7:20638

1 ÚVOD


počet specifikovaných mikroorganismů, které

mohou být za popsaných podmínek detekovány.

Zkoušky jsou koncipovány především tak, aby se určilo,

zda živé biologické léčivé přípravky (dále jen LBP) vyhovují

stanoveným specifikacím pro mikrobiologickou jakost.

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 345



včetně automatických metod za předpokladu, že jsou rovnocenné

metodám uvedeným v lékopisu.

2 OBECNÉ POSTUPY

Příprava vzorků se provádí, jak je popsáno v obecné stati

2.6.36. Pokud zkoušený LBP brání stanovení počtu specifikovaných

mikroorganismů, použije se rozhodovací diagram

na obrázku 2.6.38-1.

Pokud složky zkoušených LBP jiné než účinná látka (tj.

mikroorganismy) projevují inhibiční aktivitu proti cílovým

kontaminujícím mikroorganismům, je třeba je odstranit nebo

neutralizovat, jak je popsáno v obecné stati 2.6.36.


látky, musí se prokázat jejich neškodnost pro cílové kontaminující

mikroorganismy a jejich slučitelnost s použitými

inaktivátory, jak je popsáno v obecné stati 2.6.36.

3 RŮSTOVÉ A INHIBIČNÍ VLASTNOSTI ŽIVNÝCH

PŮD, VHODNOST ZKOUŠKY A NEGATIVNÍ

KONTROLY

Musí se stanovit schopnost zkoušky detekovat cílové mikroorganismy

v přítomnosti zkoušeného LBP. Jestliže dojde

ve zkušebním postupu nebo u LBP ke změně, která by

mohla ovlivnit výsledek zkoušky, musí se potvrdit její

vhodnost.


Použijí se standardizované stabilní suspenze zkušebních






3-1-1 Aerobní mikroorganismy. Každý zkušební bakteriální

kmen se kultivuje samostatně v tekuté půdě s hydrolyzáty

sóji a kaseinu nebo na agarové půdě s hydrolyzáty

sóji a kaseinu 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C. Candida albicans

se kultivuje samostatně na Sabouraudově glukosovém

agaru a nebo v tekuté Sabouraudově glukosové půdě

2 až 3 dny při 20 °C až 25 °C.


NCIMB 9518, CIP 4.83 nebo NBRC 13276, CCM 4516,

CNCTC 5887;


NCIMB 8626, CIP 82.118 nebo NBRC 13275,

CCM 1961, CNCTC 5664;


CIP 53.126 nebo NBRC 3972, CCM 4517;


jako např. ATCC 14028, nebo alternativní Salmonella enterica

ssp. enterica sérovar Abony, jako např. NBRC

100797, NCTC 6017 nebo CIP 80.39, CCM 4518;

– Candida albicans, jako např. ATCC 10231, NCPF 3179,

IP 48.72 nebo NBRC 1594, CCM 8215, CNCTC 5361.

K přípravě suspenzí se použije tlumivý roztok chloridu

sodného s peptonem o pH 7,0 nebo tlumivý roztok fosforečnanový

o pH 7,2. Suspenze se použijí do 2 h nebo do

24 h, jsou-li uchovávány při 2 °C až 8 °C.

3-1-2 Anaerobní mikroorganismy

Klostridie. Použije se kmen Clostridia sporogenes, jako

např. ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP

100651) nebo ATCC 19404 (NCTC 532 nebo CIP 79.03,

CCM 4409, CNCTC 6194) nebo NBRC 14293.

Zkušební kmen klostridií se kultivuje za anaerobních podmínek

v obohacené půdě pro klostridie 24 h až 48 h při

30 °C až 35 °C. Jako alternativní možnost pro přípravu

a následující ředění čerstvé suspenze vegetativních buněk

C. sporogenes se může připravit stabilní suspenze spor

a následně použít inokulaci. Stabilní suspenze spor se může

uchovávat validovanou dobu při 2 °C až 8 °C.



použije jako negativní kontrola zvolené ředidlo. Nesmí být

pozorován růst mikroorganismů. Negativní kontrola se také

použije, jestliže se provádí zkoušení LBP podle odstavce 4.

Selžou-li negativní kontroly, požaduje se prošetření.

3-3 RŮSTOVÉ A INHIBIČNÍ VLASTNOSTI ŽIVNÝCH PŮD

Zkouší se každá šarže hotových živných půd a každá šarže

živných půd připravovaných buď z dehydratovaného základu,

nebo z jednotlivých složek.



3-3-1 Zkouška růst podporujících vlastností pro tekuté

živné půdy. Část vhodné půdy o objemu odpovídajícímu objemu

použitému ve zkoušce (viz odstavce 3-4 a 4) se inokuluje

malým množstvím (ne více než 100 CFU) vhodného

mikroorganismu. Inkubuje se při určené teplotě ne déle, než

je nejkratší doba stanovená pro zkoušku. Zřetelně viditelný

růst mikroorganismů je srovnatelný s růstem, který se objevil

u dříve zkoušené a schválené šarže živné půdy.

3-3-2 Zkouška růst podporujících vlastností pro pevné

živné půdy. Použije se metoda inokulace na povrch agarové

půdy, každá plotna se inokuluje malým množstvím (ne

více než 100 CFU) vhodného mikroorganismu. Inkubuje se

při určené teplotě ne déle, než je nejkratší doba stanovená

pro zkoušku. Jasně viditelný růst mikroorganismů je srovnatelný

s růstem, který se objevil u dříve zkoušené

a schválené šarže půdy a neliší se o více než o faktor 2.

3-3-3 Zkouška inhibičních vlastností tekuté nebo pevné

živné půdy. Příslušná půda se inokuluje nejméně 100 CFU

vhodného mikroorganismu. Inkubuje se při určené teplotě po

dobu ne kratší, než je nejdelší doba stanovená pro zkoušku.

Nepozoruje se žádný růst zkoušeného mikroorganismu.

3-3-4 Zkouška selektivních vlastností. Použije se metoda

inokulace na povrch agarové půdy, každá miska se inokuluje

malým množstvím (ne více než 100 CFU) příslušného

mikroorganismu. Inkubuje se při určené teplotě ne déle, než

je nejkratší doba stanovená pro zkoušku. Vzhled kolonií

a selektivní vlastnosti jsou srovnatelné s výsledky získanými

u dříve zkoušené a schválené šarže živné půdy.

3-4 VHODNOST ZKUŠEBNÍ METODY

Pro každý zkoušený LBP se připraví vzorek, jak je popsáno

v odpovídající části odstavce 4. Každý zkušební kmen se

346 ČL 2017 – Dopl. 2020


ne

Úprava této metody může zahrnovat:

– zvýšení objemu ředidla nebo kultivační

půdy;

– zařazení neutralizačního agens, povrchově

aktivní látky nebo solubilizačního

agens do ředidla nebo kultivační půdy;

– membránovou filtraci;

– kombinace výše uvedených opatření.

Je metoda detekce

specifikovaných mikroorganismů

popsaná v této

obecné stati vhodná

pro LBP?

ano

Zkušební

metody

2.6

Ověření vhodnosti metody za přítomnosti LBP.

ano

Je růst stále

inhibován?

ne

Úprava tohoto postupu může

zahrnovat:

– úpravu růstových podmínek (teplota,

doba, pH, atd.);

– použití inhibitorů růstu

mikroorganismu;

– použití jiné vhodné půdy;

– kombinace výše uvedených

opatření.

Příklady*

postupů

jsou uvedeny

v odstavci 5.

Validace zkoušky ověřením vhodných

parametrů v závislosti na rozsahu úprav

zajišťující, že se dosáhne stejných výsledků

(přítomnost/nepřítomnost)

pro specifikované mikroorganismy.

ne

Jsou validační

požadavky

splněny?

ano

Provede se zkouška na nepřítomnost

upravenou metodou a postupuje se, jak

je popsáno v obecné stati.

Provede se zkouška validovanou

metodou.

Provede se zkouška

na nepřítomnost,

jak je popsáno

v obecné stati.

*Tuto část je třeba chápat jako informativní. Je možné použít jiné postupy, pokud jsou zdůvodněny.

Obr. 2.6.38-1 Rozhodovací diagram pro zkoušku na specifikované mikroorganismy

ČL 2017 – Dopl. 2020 347


Tab. 2.6.38-1 Růst podporující, inhibiční a selektivní vlastnosti živných půd



zkouška na Escherichia

coli

zkouška na

Salmonella sp.

zkouška na Pseudomonas

aeruginosa

zkouška na

Staphylococcus aureus

zkouška na Clostridia sp.

zkouška na Candida

albicans

Mosselova obohacená

tekutá půda pro

enterobakterie


violetí krystalovou

a červení neutrální


růst podporující

inhibiční

růst podporující + selektivní

E. coli

P. aeruginosa

S. aureus

E. coli

P. aeruginosa

tekutá MacConkeyova růst podporující

E. coli

půda

inhibiční

S. aureus

MacConkeyův agar růst podporující + selektivní E. coli



salmonely


s xylosou a lysinem

cetrimidový agar

mannitolový agar se solí

obohacená půda pro

klostridie

růst podporující

inhibiční


růst podporující

inhibiční


inhibiční

růst podporující

Salmonella enterica ssp.

enterica sérovar Typhimurium

nebo Salmonella enterica ssp.

enterica sérovar Abony

S. aureus

Salmonella enterica ssp.

enterica sérovar Typhimurium

nebo Salmonella enterica ssp.

enterica sérovar Abony

P. aeruginosa

E. coli

S. aureus

E. coli

Cl. sporogenes

Columbia agar růst podporující Cl. sporogenes

Sabouraudova glukosová

tekutá půda

růst podporující

C. albicans

Sabouraudův glukosový agar růst podporující + selektivní C. albicans

inokuluje zvlášť. Zkušební kmen se přidá v průběhu míchání

vzorku do předepsané půdy. Použije se počet mikroorganismů

odpovídající nejvýše 100 CFU v inokulovaném

zkoušeném přípravku. Inokulum by nemělo přesáhnout 1 %

objemu půdy.

Zkouška se provede, jak je popsáno v odpovídající části odstavce

4, pro každý krok se použije nejkratší uvedená inkubační

doba.

Specifikované mikroorganismy se musí detekovat vzhledem

a selektivními reakcemi popsanými v odstavci 4. Pokud

se neobjeví charakteristické kolonie a reakce, metoda

může být stále vhodná, pokud se zkouškou identifikují

všechny typy kolonií.

Jakékoliv inhibiční účinky LBP proti cílovým mikroorganismům

vyžadují úpravu zkušební metody (viz rozhodovací

diagram na obrázku 2.6.38-1) a vhodnost úprav musí být

pro daný LBP potvrzena.

4 ZKOUŠENÍ ŽIVÝCH BIOLOGICKÝCH LÉČIVÝCH

PŘÍPRAVKŮ

4-1 GRAMNEGATIVNÍ BAKTERIE TOLERUJÍCÍ ŽLUČ


v ředění 1 : 10 za použití nejméně 1 g nebo 1 ml zkoušeného

LBP, jak je popsáno v obecné stati 2.6.36, ale jako

ředidlo se použije tekutá půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu,

promíchá se a inkubuje se při 20 °C až 25 °C po dobu postačující

k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení

(obvykle 2 h, ale nejvýše 5 h).

4-1-2 Zkouška nepřítomnosti. Není-li předepsáno jinak,

použije se objem odpovídající 1 g LBP připraveného podle

odstavce 4-1-1 pro inokulaci Mosselovy obohacené tekuté

půdy pro enterobakterie. Inkubuje se 24 h až 48 h při 30 °C

až 35 °C. Inokuluje se na misky se žlučovým agarem

s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální. Inkubuje

se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

Živý biologický léčivý přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže

se nepozoruje růst žádných kolonií.

4-2 ESCHERICHIA COLI



LBP, jak je popsáno v obecné stati 2.6.36 a použije

se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml přípravku

k inokulaci vhodného množství (určeného podle

odstavce 3-4) tekuté půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu,

promíchá se a inkubuje se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

4-2-2 Výběr a subkultivace. Nádoba se protřepe, 1 ml tekuté

půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se přenese do 100 ml

MacConkeyovy tekuté půdy a inkubuje se 24 h až 48 h při

42 °C až 44 °C. Inokuluje se na misky s MacConkeyovou

348 ČL 2017 – Dopl. 2020


agarovou půdou a inkubuje se 18 h až 72 h při 30 °C až

35 °C.

4-2-3 Vyhodnocení. Růst kolonií indikuje možnou přítomnost



nejsou přítomny žádné kolonie nebo identifikační zkoušky

jsou negativní.

4-3 SALMONELLA

4-3-1 Příprava vzorku a předinkubace. Zkoušený LBP se

připraví, jak je popsáno v obecné stati 2.6.36 a použije se

množství odpovídající nejméně 10 g nebo 10 ml přípravku




4-3-2 Výběr a subkultivace. 0,1 ml tekuté půdy s hydrolyzáty

sóji a kaseinu se přenese do 10 ml Rappaportovy-Vassiliadisovy

obohacené tekuté půdy pro salmonely a inkubuje

se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C. Inokuluje se na

misky s deoxycholátovým agarem s xylosou a lysinem.

Inkubuje se 18 h až 48 h při 30 °C až 35 °C.

4-3-3 Vyhodnocení. Růst dobře vyvinutých červených kolonií

s nebo bez černého středu indikuje možnou přítomnost

Salmonella sp. To se potvrzuje identifikačními zkouškami.


nejsou přítomny kolonie popsaného typu nebo jestliže ověřující

identifikační zkoušky jsou negativní.

4-4 PSEUDOMONAS AERUGINOSA





k inokulaci vhodného množství (určeného podle

odstavce 3-4) tekuté půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu

a promíchá se. Inkubuje se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

4-4-2 Výběr a subkultivace. Inokuluje se na misky s cetrimidovým

agarem a inkubuje se 18 h až 72 h při 30 °C až

35 °C.

4-4-3 Vyhodnocení. Růst kolonií indikuje možnou přítomnost

P. aeruginosa. To se potvrzuje identifikačními zkouškami.


nejsou přítomny žádné kolonie nebo jestliže ověřující identifikační

zkoušky jsou negativní.

4-5 STAPHYLOCOCCUS AUREUS


v ředění 1 : 10, použije se nejméně 1 g nebo 1 ml zkoušeného





Inkubuje se 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C.

4-5-2 Výběr a subkultivace. Inokuluje se na misky s mannitolovým

agarem se solí a inkubuje se 18 h až 72 h při

30 °C až 35 °C.

4-5-3 Vyhodnocení. Růst žlutých/bílých kolonií obklopených

žlutou zónou indikuje možnou přítomnost S. aureus.

To se potvrzuje identifikačními zkouškami.




4-6 CLOSTRIDIA

4-6-1 Příprava vzorku a zahřívání. Připraví se vzorek

v ředění 1 : 10 (nejméně 20 ml) za použití nejméně 2 g nebo

2 ml zkoušeného LBP tak, jak je popsáno v obecné stati

2.6.36. Vzorek se rozdělí na dvě stejné dávky po nejméně

10 ml. Jedna dávka se zahřívá 10 min při 80 °C a rychle se

ochladí. Druhá dávka se nezahřívá.

4-6-2 Výběr a subkultivace. Po 10 ml každé dávky nebo

množství odpovídající nejméně 1 g nebo 1 ml zkoušeného

LBP se inokuluje ve dvou dávkách do vhodného množství

(určeného v odstavci 3-4) obohacené půdy pro klostridie.

Inkubuje se za anaerobních podmínek 48 h při 30 °C až

35 °C. Po inkubaci se z každé nádoby inokuluje na Columbia

agar a inkubuje se za anaerobních podmínek 48 h až

72 h při 30 °C až 35 °C.

4-6-3 Vyhodnocení. Výskyt anaerobně rostoucích tyčinek

(s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí

indikuje přítomnost Clostridia sp. To se potvrzuje

identifikačními zkouškami.




4-7 CANDIDA ALBICANS

4-7-1 Příprava vzorku a předinkubace. Připraví se zkoušený

LBP, jak je popsáno v obecné stati 2.6.36 a použije se

10 ml nebo množství odpovídající nejméně 1 g nebo 1 ml

přípravku k inokulaci 100 ml Sabouraudovy tekuté glukosové

půdy a promíchá se. Inkubuje se při 30 °C až 35 °C po

3 dny až 5 dnů.

4-7-2 Výběr a subkultivace. Inokuluje se na misky se Sabouraudovým

glukosovým agarem a inkubuje se 24 h až

48 h při 30 °C až 35 °C.

4-7-3 Vyhodnocení. Růst bílých kolonií může indikovat

přítomnost C. albicans. To se ověřuje identifikačními

zkouškami.




5 POSTUPY STANOVENÍ SPECIFIKOVANÝCH

MIKROORGANISMŮ A DODATEČNÉ ZKOUŠENÍ

Tato část by měla být považována za informativní. Je možné

použít i jiné postupy, jsou-li schváleny.

Pokud je detekce specifikovaných mikroorganismů inhibována

živým biologickým léčivým přípravkem, provede se

detekce za podmínek, které neutralizují inhibici nebo limitují

růst mikroorganismů LBP. Upravené zkoušky na specifikované

mikroorganismy se validují za použití vhodných

parametrů závisejících na rozsahu úprav tak, aby bylo pro

specifikované mikroorganismy dosaženo stejných výsledků

(přítomnosti/nepřítomnosti).

Zkušební

metody

2.6

ČL 2017 – Dopl. 2020 349

2.7.1 IMUNOCHEMICKÉ METODY

K inhibici LBP se použijí vhodné kombinace antibiotik

a detekují se specifikované mikroorganismy. Např. pro

LBP obsahující S. cerevisiae var. boulardii se mohou pro

zkoušku na přítomnost C. albicans použít předem obohacené

a selektivní půdy (Sabouraudův glukosový agar nebo tekutá

půda) s chloramfenikolem a cykloheximidem.

Alternativně se mohou použít předem obohacené roztoky

(např. tlumivý roztok s peptonem pro salmonely – viz

obecnou stať 2.6.31), půdy a zkušební růstové podmínky

pro podporu růstu cílových mikroorganismů při současném

omezení růstu mikroorganismů LBP. Živý biologický léčivý

přípravek obsahující spory Bacillus clausii se zkouší na

kontaminující Bacillus cereus na miskách se selektivní

chromogenní agarovou půdou. Inkubační doba a teplota závisí

na dané půdě.

Navrhovaný postup detekce Bacillus cereus je popsán dále.

Připraví se vzorek v ředění 1 : 10 za použití nejméně 1 g

nebo 1 ml zkoušeného LBP a k inokulaci na vhodné množství

tekuté půdy s hydrolyzáty sóji a kaseinu se použije

10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml, promíchá

se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Subkultivuje

se na selektivní půdě (např. Mosselova půda pro B. cereus).

Pro každý zkoušený LBP se validuje inkubační doba

a teplota. Vzhled kolonií B. cereus závisí na použité půdě.


nejsou přítomny kolonie B. cereus.

Pro LBP obsahující E. coli se použijí jako mikrobiální

indikátory fekální kontaminace Enterococcus faecalis

a Enterococcus faecium k nahrazení zkoušky na nepřítomnost

E. coli. Použijí se selektivní a diagnostické

chromogenní půdy a pro každý zkoušený LBP se validuje

inkubační doba a teplota. Živý biologický léčivý přípravek

vyhovuje zkoušce, jestliže není pozorován růst

Enterococcus spp.

Vhodnými metodami založenými na posouzení rizika se

může provést vyhledávání patogenních kmenů E. coli

(např. molekulárními metodami detekce genu stx nebo eae).

6 DOPORUČENÉ ROZTOKY A KULTIVAČNÍ PŮDY

Roztoky a kultivační půdy zmíněné v této obecné stati

a popsané ve stati 2.6.13 byly shledány jako vyhovující pro

gramnegativní žluč tolerující bakterie, E. coli, Ps. aeruginosa,

S. aureus, Clostridia sp., Salmonella sp. a C. albicans.

Mohou se použít další půdy, u kterých se prokáže jejich

vhodnost, a analytické metody, které jsou k tomu použity,

jsou validovány s přiměřenými validačními parametry.

2.7 METODY STANOVENÍ ÚČINNOSTI


6.0:20701

Imunochemické metody jsou založeny na selektivní, reverzibilní

a nekovalentní vazbě antigenů s protilátkami. Tyto

metody se používají k detekci nebo ke stanovení antigenů

nebo protilátek. Vznik komplexu antigen-protilátka může

být detekován a množství vytvořeného komplexu lze stanovit

různými metodami. Ustanovení této obecné stati se vztahují

na imunochemické metody používající podle potřeby

buď značená, nebo neznačená zkoumadla.

Výsledky imunochemických metod závisí na experimentálních

podmínkách a povaze a jakosti použitých zkoumadel.

Proto je nezbytné standardizovat složky imunochemických

stanovení a použít k tomu, kdekoliv je to možné, mezinárodní

referenční přípravky pro ně určené.

Zkoumadla potřebná pro mnoho imunochemických metod

jsou dostupná jako komerční zkušební soupravy (kity), to

jsou sady obsahující zkoumadla (hlavně antigen nebo protilátku)

a látky určené ke stanovení specifikované substance

in vitro, včetně návodu na jejich správné použití. Kity se

používají podle návodu výrobce; důležité je ověřit, zda jsou

vhodné pro analýzu zkoušené látky, se zvláštním zřetelem

na jejich selektivitu a citlivost. Pokyny k soupravám pro

imunochemická stanovení připravila Světová zdravotnická

organizace (Technical Report Series 658; 1981).

METODY POUŽÍVAJÍCÍ ZNAČENÝ ANTIGEN NEBO

ZNAČENOU PROTILÁTKU

Metody používající značené látky mohou využívat vhodná

značení, jako jsou enzymy, fluorofory, luminofory a radioizotopy.

Je-li ke značení použit radioizotop, metoda se nazývá

„radioimunoanalýza“. Doporučení pro měření radioaktivity

uvedená v článku Radiofarmaca (0125) lze použít

při imunologických stanoveních spojených s radioizotopy.

Veškerá práce s radioaktivním materiálem se provádí ve

shodě s národní legislativou a mezinárodně přijatými pravidly

o ochraně před radioaktivním zářením.

METODY POUŽÍVAJÍCÍ NEZNAČENÝ ANTIGEN

NEBO NEZNAČENOU PROTILÁTKU

Imunoprecipitační metody

Imunoprecipitační metody zahrnují flokulaci a precipitační

reakce. Je-li roztok antigenu smíchán za vhodných podmínek

s odpovídající protilátkou, reagující složky vytvoří flokulační

nebo precipitační agregáty. Poměr reagujících složek,

při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace

nejvýraznější, se nazývá optimální poměr a je obvykle tvořen

ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky. Imunoprecipitace

se může stanovit vizuálně nebo metodami

rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení).

Použitím částic (např. latex) pokrytých antigenem

nebo protilátkou se může dosáhnout zvýšení citlivosti.

Ve flokulačních metodách se obvykle používá postupné ředění

jedné z reagujících složek, zatímco v imunodifuzních

metodách (ID) se ředění dosahuje difuzí do prostředí gelu:

získají se koncentrační gradienty jedné nebo obou reagujících

složek a v prostředí gelu se tak vytvoří zóny, kde

poměr složek podporuje precipitaci. Zatímco flokulační

metody se provádějí ve zkumavkách, v metodách imunodifuze

se používají různé pomůcky, jako jsou zkumavky, destičky,

sklíčka nebo komůrky.

Je-li imunoprecipitační systém složen z jednoho antigenu,

který se váže na odpovídající protilátku, označuje se jako

systém jednoduchý. Zahrnuje-li příbuzné, ale sérologicky

350 ČL 2017 – Dopl. 2020


neidentické reagující složky, je to systém komplexní, a obsahuje-li

několik sérologicky nepříbuzných složek, je to

systém složený.

V jednoduchých difuzních metodách se koncentrační gradient

ustaví pouze pro jednu z reagujících složek, která difunduje

z vnějšího zdroje do prostředí gelu obsahujícího

odpovídající druhou složku v relativně nízké koncentraci.

Jednoduchá radiální imunodifuze (SRID) je jednoduchá

kvantitativní imunodifuzní metoda. Když je dosaženo rovnováhy

mezi vnější a vnitřní reagující složkou, vytvářejí se

kruhové precipitační plochy kolem bodu s vnější složkou.

Plochy jsou přímo úměrné koncentraci antigenu v gelu a nepřímo

úměrné koncentraci protilátky v gelu.

V metodách dvojité difuze se koncentrační gradienty ustavují

pro obě reagující složky. Antigen i protilátka difundují z oddělených

míst do původně imunologicky neutrálního gelu.

Komparativní metody dvojité imunodifuze se používají pro

kvalitativní porovnávání různých antigenů reakcí s vhodnou

protilátkou nebo naopak. Srovnávání je založeno na

přítomnosti nebo nepřítomnosti vzájemného působení mezi

precipitačními liniemi. Mohou se rozlišovat reakce totožnosti,

rozdílnosti nebo částečné totožnosti mezi antigeny

nebo protilátkami.

Imunoelektroforetické metody

Imunoelektroforéza (IE) je kvalitativní metoda spojující

dvě metody: gelovou elektroforézu následovanou imunodifuzí.

Dvojrozměrná imunoelektroforéza je modifikace imunoelektroforetické

metody. Je vhodná pro kvalitativní i kvantitativní

analýzy. První část postupu je normální gelová

elektroforéza, po které jsou z gelu vyříznuty podélné pásky

obsahující rozdělené určované frakce a jsou přeneseny na

jinou desku. Elektroforéza ve druhém směru se provádí

v úhlu 90° k předcházející elektroforéze v gelu, který obsahuje

poměrně nízkou koncentraci protilátek odpovídajících

antigenům. Pro danou koncentraci protilátky a tloušťku gelu

je lineární vztah mezi plochou příslušných precipitačních

píků a množstvím odpovídajícího antigenu.

Elektroimunoanalýza, často označovaná jako raketová imunoelektroforéza,

je rychlá kvantitativní metoda pro stanovení

antigenů s nábojem odlišným od náboje protilátek

nebo naopak. Elektroforéza stanovovaného antigenu se provádí

v gelu, který obsahuje poměrně nízkou koncentraci odpovídající

protilátky. Zkoušený materiál a roztoky standardního

antigenu použité pro kalibraci jsou naneseny do

odlišných jamek v gelu. V průběhu elektroforézy se vytvářejí

pohyblivé precipitační zóny ve tvaru ostrých píků (raketek),

které začínají u jamek. Čelo precipitátu se zastaví,

není-li již antigen v přebytku. Pro danou koncentraci protilátky

platí lineární vztah mezi migrační vzdáleností precipitátu

a množstvím použitého antigenu.

Protisměrná imunoelektroforéza je rychlá kvantitativní metoda,

která umožňuje, aby se v elektrickém poli ustavil koncentrační

gradient vnějšího antigenu a vnější protilátky

v závislosti na odlišných nábojích. Naředěné roztoky standardů

pro kalibraci a ředění zkoušené látky se nanesou do

řady jamek v gelu a stálé množství odpovídající reagující

složky se nanese do protilehlé řady jamek. Titr zkoušené

látky se může určit jako nejvyšší ředění, při kterém se tvoří

precipitační linie.

Existuje mnoho modifikací dvourozměrné a raketkové imunoelektroforézy.

Jiné metody spojují dělení antigenů podle velikosti molekuly

a sérologických vlastností.

Vizualizace a charakterizace imunoprecipitačních linií

Může se provádět selektivním nebo neselektivním barvením,

fluorescencí, značením enzymy nebo izotopy, nebo jinou

vhodnou metodou. Metody selektivního barvení se obvykle

používají pro charakterizaci nebílkovinných látek

v precipitátech.

V průsvitných gelech, jako jsou gely agaru nebo agarosy,

jsou precipitační linie v gelu jasně viditelné, pokud je vhodná

koncentrace reagujících složek.

VALIDACE METOD

Validační kritéria

Kvantitativní imunochemickou metodu lze hodnotit, jestliže:

1. protilátka nebo antigen nerozlišuje významně mezi

zkouškou a standardem; v případě značených reagujících

složek odpovídající složka nerozlišuje významně

mezi značenou a neznačenou látkou;

2. metoda není ovlivněna zkoušenou matricí, to je žádnou

složkou zkoušeného vzorku nebo jeho pomocnými látkami,

které mohou být u vzorků proměnlivé; to může zahrnovat

vysoké koncentrace jiných bílkovin, solí a konzervačních

látek nebo kontaminující proteolytické aktivity;

3. limit kvantitativního vyjádření je nižší než kritéria přijatelnosti

uvedená v jednotlivém článku;

4. přesnost metody je taková, že odchylky výsledků vyhovují

požadavkům uvedeným v jednotlivých článcích;

5. při postupu v provedení zkoušky nevznikají systematické

chyby.

Validační metody

Ke splnění těchto požadavků obsahuje validační plán následující

prvky:

1. stanovení se provede nejméně třikrát;

2. stanovení se provede nejméně se třemi různými ředěními

standardu a třemi ředěními vzorku, které mají předpokládanou

podobnou účinnost jako ředění standardu;

3. plán stanovení má náhodné uspořádání;

4. je-li zkoušená látka ve formě séra nebo smíchána s dalšími

látkami, je standard rovněž připraven stejným způsobem;

5. zkouška zahrnuje měření nespecifické vazby značené

reagující složky;

6. pro vytěsňovací imunologické stanovení:

a) je určena maximální vazba (nulové vytěsnění);

b) ředění zasahují úplnou reakční řadu od hodnot blízkých

nespecifické vazbě až po maximální vazbu, přednostně

jak pro standard, tak i pro zkoušené přípravky.

STATISTICKÉ VÝPOČTY

K vyhodnocení výsledků se mohou analyzovat reakční

křivky pro vzorek a standard metodami popsanými ve stati

Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek (5.3).

Významná nerovnoběžnost ukazuje, že protilátka nebo antigen

rozlišují mezi vzorkem a standardem a výsledky nelze

hodnotit.

Ve vytěsňovacích imunologických stanoveních nejsou hodnoty

nespecifické vazby a maximálního vytěsnění při vysokých

koncentracích vzorku nebo standardu významně roz-

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 351

2.7.2 MIKROBIOLOGICKÉ STANOVENÍ ÚČINNOSTI ANTIBIOTIK

dílné. Rozdíly mohou ukazovat na vliv matrice, která způsobí

buď inhibici vazby, nebo degradaci značení.

2.7.2 MIKROBIOLOGICKÉ STANOVENÍ

ÚČINNOSTI ANTIBIOTIK

10.0:20702

Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu

citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi

zkoušeného antibiotika a referenční látky.

Referenční látky použité ke stanovení jsou látky, jejichž

účinnost byla přesně stanovena ve vztahu k odpovídajícímu

mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu

přípravku.

Plán stanovení se musí navrhnout tak, aby umožnil ověřit

validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání

účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžnosti, dvě logaritmické

přímky dávky a odpovědi (nebo transformované

odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku

musí být rovnoběžné a musí být lineární v intervalu dávek

použitých k výpočtu. Tyto podmínky se musí pro danou hladinu

pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05, ověřit validací.

Mohou se použít také jiné matematické modely, jako je model

poměru sklonů, jestliže se prokáže validita zkoušky.

Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti

(P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené

účinnosti.

Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.

A. DIFUZNÍ METODA

Živná půda vhodná pro stanovení se rozehřeje a při vhodné

teplotě, např. pro vegetativní formy 48 °C až 50 °C, se inokuluje

suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum

v takovém množství, které vytváří zřetelně

ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci

zkoušeného antibiotika. Inokulovaná půda se ihned

nalije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek

(ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá

vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda se může též nalít ve

dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní se inokuluje.

Takto připravené misky se skladují tak, aby před použitím

nedošlo k viditelnému nárůstu mikroorganismů nebo k jejich

usmrcení a aby povrch půd byl v čas použití suchý.

Pro přípravu roztoků předpokládaných stejných účinností

a známých koncentrací zkoušeného antibiotika a referenční

látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené

v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy,

např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezové oceli,

případně z jiného vhodného materiálu, nebo do otvorů vyříznutých

v agaru. Do každého cylindříku nebo otvoru se

musí přidat stejný objem roztoků. Je také možné použít sterilní

disky z absorbujícího papíru vhodné jakosti, které se

před položením na povrch agaru napustí roztoky referenční

látky nebo zkoušeného antibiotika.

K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné

dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného

antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako

dávky referenční látky. Doporučuje se používat geometrickou

řadu dávek. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán

lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových

stanovení, a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita,

může stačit i dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných

případech se však musí použít metoda třídávková, jak

je předepsáno výše.

Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou

roztoky podle statisticky vhodného plánu, s výjimkou malých

Petriho misek, které nepojmou více než šest roztoků,

kde se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika

a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších

roztoků.

Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační

difuze, obvykle 1 h až 4 h, při teplotě místnosti nebo při

asi 4 °C, jak je vhodné, se může použít k potlačení účinku

časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tím ke zlepšení

regresní křivky.

Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností

0,1 mm nebo jejich plochy s přesností 0,01 mm 2 a účinnost

zkoušeného antibiotika se vypočítá vhodnými statistickými

metodami.

V každé zkoušce se použije takový počet replikací na dávku,

aby se zajistila požadovaná přesnost a preciznost. Stanovení

účinnosti se může opakovat a výsledky statisticky

sloučit, aby se dosáhlo požadované přesnosti a preciznosti

stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika

není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

Antibiotikum

Referenční látka

Rozpouštědlo

k přípravě

základního

roztoku

Tlumivý

roztok (pH) Mikroorganismus

Půda

a konečné

pH (±0,1 pH

jednotek)

Inkubační

teplota

(°C)

Amphotericinum B

amfotericin B pro

mikrobiologické stanovení

účinnosti CRL

dimethylsulfoxid

R

pH 10,5

(0,2 mol/l)

Saccharomyces

cerevisiae

ATCC 9763

IP 1432-83

CCM 8191

Micrococcus luteus

NCTC 7743

CIP 53.160

ATCC 10240

CCM 732

CNCTC 5540

F;

pH 6,1

35–37

Bacitracinum

zincum

bacitracin zinečnatý

komplex CRL

kyselina chlorovodíková

0,01 mol/l RS

pH 7,0

(0,05 mol/l)

A;

pH 7,0

35–39

352 ČL 2017 – Dopl. 2020


Antibiotikum

Bleomycini sulfas

Colistimethatum

natricum

Colistini sulfas

Framycetini sulfas

Gentamicini sulfas

Referenční látka

bleomycin-

-sulfát CRL

kolistimethát sodná

sůl CRL

kolistin-sulfát pro


účinnosti CRL

framycetin-

-sulfát CRL

gentamicin-

-sulfát CRL

Rozpouštědlo

k přípravě

základního

roztoku

voda R

voda R

voda R

voda R

voda R

Tlumivý


pH 6,8

(0,1 mol/l)

pH 6,0

(0,05 mol/l)

pH 6,0

(0,05 mol/l)

pH 8,0

(0,05 mol/l)

pH 8,0

(0,05 mol/l)

Mycobacterium

smegmatis

ATCC 607

CCM 4622

Bordetella

bronchiseptica

NCTC 8344

CIP 53.157

ATCC 4617

CCM 4416

CNCTC 6262

Escherichia coli

NCIMB 8879

CIP 54.127

ATCC 10536

CCM 3988

CNCTC 6243

Bordetella

bronchiseptica

NCTC 8344

CIP 53.157

ATCC 4617

CCM 4416

CNCTC 6262

Escherichia coli

NCIMB 8879

CIP 54.127

ATCC 10536

CCM 3988

CNCTC 6243

Bacillus subtilis

NCTC 10400

CIP 52.62

ATCC 6633

CCM 1999

CNCTC 5610

Bacillus pumilus

NCTC 8241

CIP 76.18

CCM 2218

CNCTC 6214

Bacillus pumilus

NCTC 8241

CIP 76.18

CCM 2218

CNCTC 6214

Staphylococcus

epidermidis

NCIMB 8853

CIP 68.21

ATCC 12228

CCM 4418

CNCTC 5212

Půda

a konečné

pH (±0,1 pH

jednotek)

G;

pH 7,0

B;

pH 7,3

B;

pH 7,3

B;

pH 7,3

B;

pH 7,3

E;

pH 7,9

E;

pH 7,9

A;

pH 7,9

A;

pH 7,9

Inkubační

teplota

(°C)

35–37

35–39

35–39

35–39

35–39

30–37

30–37

35–39

35–39

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 353


Antibiotikum

Josamycinum

Josamycini

propionas

Kanamycini

monosulfas

monohydricus

Kanamycini sulfas

acidus

Neomycini sulfas

Referenční látka

josamycin CRL

josamycin-propionát

CRL

kanamycin-monosulfát

monohydrát

CRL

neomycin-sulfát pro


účinnosti CRL

Rozpouštědlo

k přípravě

základního

roztoku

methanol R

(viz článek)

methanol R

(viz článek)

voda R

voda R

Tlumivý


pH 5,6

pH 5,6

pH 8,0

(0,05 mol/l)

pH 8,0

(0,05 mol/l)

Netilmicini sulfas netilmicin-sulfát CRL voda R pH 8,0 ±0,1

Nystatinum

nystatin CRL

dimethylformamid

R

pH 6,0

(0,05 mol/l)

obsahující

5% (V/V)

dimethylformamid

R

Bacillus subtilis

CIP 52.62

ATCC 6633

NCTC 10400

CCM 1999

CNCTC 5610

Bacillus subtilis

CIP 52.62

ATCC 6633

NCTC 10400

CCM 1999

CNCTC 5610

Bacillus subtilis

NCTC 10400

CIP 52.62

ATCC 6633

CCM 1999

CNCTC 5610

Staphylococcus

aureus

NCTC 7447

CIP 53.156

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Bacillus pumilus

NCTC 8241

CIP 76.18

CCM 2218

CNCTC 6214

Bacillus subtilis

NCTC 10400

CIP 52.62

ATCC 6633

CCM 1999

CNCTC 5610

Staphylococcus

aureus

ATCC 6538 P

CIP 53.156

CCM 2022

CNCTC 5479

Candida tropicalis

CIP 1433-83

NCYC 1393

CCM 8223

Saccharomyces

cerevisiae

NCYC 87

CIP 1432-83

ATCC 9763

CCM 8191

Půda

a konečné

pH (±0,1 pH

jednotek)

A;

pH 6,6

A;

pH 6,6

A;

pH 7,9

A;

pH 7,9

E;

pH 7,9

E;

pH 7,9

A;

pH 7,9

F;

pH 6,0

F;

pH 6,0

Inkubační

teplota

(°C)

35–37

35–37

30–37

35–39

30–37

30–37

32–35

30–37

30–32

354 ČL 2017 – Dopl. 2020


Antibiotikum

Polymyxini B sulfas

Rifamycinum

natricum

Referenční látka

polymyxin-B-sulfát

pro mikrobiologické

stanovení

účinnosti CRL

rifamycin sodná

sůl CRL

Rozpouštědlo

k přípravě

základního

roztoku

voda R

methanol R

Spiramycinum spiramycin CRL methanol R

Streptomycini sulfas

Teicoplaninum

Tylosinum ad

usum veterinarium

Tylosini phosphas

ad usum veterinarium

Tylosini tartras ad

usum veterinarium

Vancomycini

hydrochloridum

streptomycin-

-sulfát CRL

teikoplanin CRL

tylosin CRL

vankomycin-hydrochlorid

CRL

voda R

pH 6,0

(0,05 mol/l)

roztok methanolu

R

2,5% (V/V)

v tlumivém

roztoku fosforečnanovém

o pH 7,0

(0,1 mol/l) R

Tlumivý


pH 6,0

(0,05 mol/l)

pH 7,0

(0,05 mol/l)

pH 8,0

(0,05 mol/l)

pH 8,0

(0,05 mol/l)

pH 6,0

(0,05 mol/l)

směs objemových

dílů

methanolu R

a tlumivého

roztoku

fosforečnanového

o pH 8,0

(0,1 mol/l) R

(40 + 60)

voda R pH 8,0

Bordetella bronchiseptica

NCTC 8344

CIP 53.157

ATCC 4617

CCM 4416

CNCTC 6262

Micrococcus luteus

NCTC 8340

CIP 53.45

ATCC 9341

CCM 552

CNCTC 5039

Bacillus subtilis

NCTC 10400

CIP 52.62

ATCC 6633

CCM 1999

CNCTC 5610

Bacillus subtilis

NCTC 8236

CIP 1.83

CCM 2217

CNCTC 6217

Bacillus subtilis

NCTC 10400

CIP 52.62

ATCC 6633

CCM 1999

CNCTC 5610

Bacillus subtilis

NCTC 10400

CIP 52.62

ATCC 6633

CCM 1999

CNCTC 5610

Micrococcus luteus

NCTC 8340

CIP 53.45

ATCC 9341

CCM 552

CNCTC 5039

Bacillus subtilis

NCTC 10400

CIP 52.62

ATCC 6633

CCM 1999

CNCTC 5610

Půda

a konečné

pH (±0,1 pH

jednotek)

B;

pH 7,3

A;

pH 6,6

A;

pH 7,9

A;

pH 7,9

A;

pH 7,9

H;

pH 7,8–8,0

A;

pH 8,0

A;

pH 8,0

Inkubační

teplota

(°C)

35–39

35–39

30–32

30–37

30–37

35–37

32–35

37–39

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 355


B. TURBIDIMETRICKÁ METODA

Vhodná živná půda se inokuluje suspenzí vybraného mikroorganismu,

který je citlivý na zkoušené antibiotikum

tak, aby se v podmínkách zkoušky docílilo vhodně rozsáhlého

potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé

množství suspenze vybrané tak, aby po asi čtyřhodinové

inkubaci byl dobře měřitelný zákal.

Inokulovaná půda se použije ihned po inokulaci.

Pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného

antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá

stejná účinnost, se použije rozpouštědlo a tlumivý

roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2.

K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky

referenční látky a tři dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou

stejnou účinností jako dávky referenční látky.

Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení

požadované linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu

tři po sobě následující dávky, za použití odpovídajících dávek

referenční látky a zkoušeného antibiotika.

Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede

stejný objem jednoho z roztoků a stejný objem inokulované

živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy). Pro

stanovení tyrothricinu se k 9,9 ml inokulované živné půdy

přidá 0,1 ml roztoku.

Současně se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika

s inokulovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá

0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky se použijí ke standardizaci

optického přístroje použitého k měření růstu.

Zkumavky se umístí náhodně nebo podle latinského čtverce

nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného

přístroje, umožňujícího přivést rychle všechny zkumavky

na vhodnou inkubační teplotu. Udržují se při této teplotě

3 h až 4 h a zajistí se stejná teplota a stejná doba inkubace.

Po inkubaci se ve všech zkumavkách zastaví růst mikroorganismů

přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím

a za použití vhodného optického přístroje se změří zákal

s přesností na tři místa. Alternativně lze použít jiný postup,

který umožňuje měřit zákal každé zkumavky po přesně

stejné době inkubace.

Vhodnými statistickými metodami se vypočítá účinnost.

Linearita vztahu dávka – odpověď, transformovaná nebo

netransformovaná, se často získá pouze ve velmi omezeném

intervalu; tento interval se musí použít pro výpočet

účinnosti a musí zahrnovat nejméně tři po sobě následující

dávky, aby se ověřila linearita. Při běžných stanoveních,

u nichž byl prokázán lineární průběh systému, pokud byla

provedena na přiměřeném počtu třídávkových stanovení

a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může stačit

dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se

však musí použít třídávková metoda.

V každé zkoušce se použije takový počet replikací na dávku,

aby se zajistila požadovaná přesnost a preciznost. Stanovení

účinnosti se může opakovat a výsledky statisticky

sloučit, aby se dosáhlo požadované přesnosti a preciznosti

stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika

není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

Antibiotikum

Colistimethatum

natricum

Colistini sulfas

Framycetini sulfas

Referenční látka

kolistimethát sodná

sůl CRL

Rozpouštědlo

k přípravě

základního

roztoku

voda R pH 7,0

Tlumivý


Escherichia coli

NCIMB 8666

CIP 2.83

ATCC 9637

CCM 2024

CNCTC 6236


účinnosti CRL voda R pH 7,0 CIP 2.83

ATCC 9637

kolistin-sulfát pro

Escherichia coli

NCIMB 8666

CCM 2024

CNCTC 6236

framycetin-

-sulfát CRL

voda R pH 8,0

Staphylococcus

aureus

NCTC 7447

CIP 53.156

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Půda

a konečné

pH (±0,1)

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

Inkubační

teplota

(°C)

35–37

35–37

35–37

356 ČL 2017 – Dopl. 2020


Antibiotikum

Gentamicini sulfas

Gramicidinum

Josamycinum

Josamycini

propionas

Kanamycini

monosulfas

monohydricus

Kanamycini

sulfas acidus

Neomycini sulfas

Rifamycinum

natricum

Referenční látka

gentamicin-

-sulfát CRL

Rozpouštědlo

k přípravě

základního

roztoku

voda R pH 7,0

gramicidin CRL methanol R pH 7,0 *

Tlumivý


Staphylococcus

aureus

NCTC 7447

CIP 53.156

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Enterococcus hirae

CIP 58.55

ATCC 10541

CCM 4533

CNCTC 5651

Staphylococcus

aureus

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Půda

a konečné

pH (±0,1)

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

Inkubační

teplota

(°C)

35–37

35–37

* K zamezení ztrát způsobených adsorpcí v průběhu ředění může být nutná přísada detergentu, např.

polysorbátu 80 R (0,1 mg/ml).

josamycin CRL

josamycin-

-propionát CRL

kanamycin-monosulfát

monohydrát

CRL

neomycin-sulfát pro

mikrobiologické

stanovení

účinnosti CRL

rifamycin sodná

sůl CRL

methanol R

(viz článek)

methanol R

(viz článek)

pH 5,6

pH 5,6

voda R pH 8,0

voda R pH 8,0

methanol R pH 7,0

Staphylococcus

aureus

CIP 53.156

ATCC 6538 P

NCTC 7447

CCM 2022

CNCTC 5479

Staphylococcus

aureus

CIP 53.156

ATCC 6538 P

NCTC 7447

CCM 2022

CNCTC 5479

Staphylococcus

aureus

NCTC 7447

CIP 53.156

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Staphylococcus

aureus

NCTC 7447

CIP 53.156

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Escherichia coli

NCIMB 8879

CIP 54.127

ATCC 10536

CCM 3988

CNCTC 6243

C;

pH 8,0

C;

pH 8,0

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

35–37

35–37

35–37

35–37

35–37

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 357


Antibiotikum

Referenční látka

Rozpouštědlo

k přípravě

základního

roztoku

Spiramycinum spiramycin CRL methanol R pH 7,0

Streptomycini sulfas

Tylosinum ad

usum veterinarium

Tylosini tartras

ad usum

veterinarium

streptomycin-

-sulfát CRL

tylosin CRL

voda R pH 8,0

roztok methanolu

R

2,5% (V/V)

v tlumivém

roztoku fosforečnanovém

o pH 7,0

(0,1 mol/l) R

Tyrothricinum gramicidin CRL ethanol 96% R

Vancomycini

hydrochloridum

vankomycin-hydrochlorid

CRL

Tlumivý


pH 7,0

ethanol

96% R

voda R pH 8,0

Staphylococcus

aureus

NCTC 7447

CIP 53.156

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Klebsiella

pneumoniae

NCTC 7427

CIP 53.153

ATCC 10031

CCM 4415

CNCTC 6119

Staphylococcus

aureus

NCTC 6571

ATCC 9144

CIP 53.154

CCM 2107

CNCTC 5923

Enterococcus hirae

ATCC 10541

CCM 4533

CNCTC 5651

Staphylococcus

aureus

CIP 53.156

ATCC 6538 P

CCM 2022

CNCTC 5479

Půda

a konečné

pH (±0,1)

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

C;

pH 7,0

Inkubační

teplota

(°C)

35–37

35–37

37

37

37–39


Doporučené mikroorganismy

Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky

jejich použití. Mohou se použít i jiné mikroorganismy,

pokud mají prokazatelně stejnou citlivost na zkoušené

antibiotikum a použijí se ve vhodné živné půdě a za vhodných

podmínek teploty a pH. Výběr koncentrací

roztoků se má provést tak, aby zaručil, že v podmínkách

zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky

a odpovědi.

Příprava inokula. Bacillus cereus var. mycoides; Bacillus

subtilis; Bacillus pumilus. Suspenze spor mikroorganismu

použitého k inokulaci se připraví takto:

Mikroorganismy se kultivují 7 dnů při 35 °C až 37 °C na

vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R

(1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se propláchne

sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá při 70 °C

a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle

10 ∙ 10 6 až 100 ∙ 10 6 v mililitru. Suspenze spor se mohou

uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.

Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů

v půdě C při 26 °C po dobu 4 až 6 dnů. Potom

se asepticky přidá dostatečné množství síranu manganatého

R, aby se dosáhlo koncentrace 1 mg/l a inkubuje

se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda

proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %) a suspenze se

odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R na

koncentraci spor 10 ∙ 10 6 až 100 ∙ 10 6 v mililitru a potom se

zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě

nepřevyšující 4 °C.

Bordetella bronchiseptica. Zkušební mikroorganismus se

kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst

se propláchne sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.

Staphylococcus aureus; Klebsiella pneumoniae;

Escherichia coli; Micrococcus luteus; Staphylococcus epidermidis.

Připraví se, jak je popsáno v odstavci Bordetella

bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový

zákal, který při turbidimetrickém stanovení prokazatelně

poskytuje uspokojující vztah dávky a odpovědi, nebo při difuzním

stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny

dostatečného průměru, podle toho, co je vhodné.

358 ČL 2017 – Dopl. 2020


Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis. Zkušební

mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až

37 °C. Nárůst se propláchne sterilním roztokem chloridu

sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.

Tlumivé roztoky. Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8

až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu

draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného

0,2 mol/l RS, uvedeným v tabulce 2.7.2-3, a zředěním

čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.

Tab. 2.7.2-3

Hodnota pH

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

Hydroxid sodný

0,2 mol/l RS (ml)

3,72

5,70

8,60

12,60

17,80

23,65

29,63

35,00

39,50

42,80

45,20

46,80

Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické

zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou bleomycin-sulfátu

a amfotericinu B.

Pro bleomycin-sulfát se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví

takto: 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g

hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu R se rozpustí

ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml.

Pro amfotericin B se tlumivý roztok o pH 10,5 (0,2 mol/l)

připraví takto: 35 g hydrogenfosforečnanu draselného R se

rozpustí v 900 ml vody R, přidá se 20 ml hydroxidu sodného

1 mol/l RS a zředí se vodou R na 1000,0 ml.

Živné půdy. Mohou se použít následující půdy nebo půdy

jim rovnocenné.

Půda A

pepton


hovězí výtažek


glukosa monohydrát

agar

voda

Půda B



chlorid sodný


glukosa monohydrát

agar

polysorbát 80

voda

6 g

4 g

1,5 g

3 g

1 g

15 g

do 1000 ml

17 g

3 g

5 g

2,5 g

2,5 g

15 g

10 g

do 1000 ml

Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek

po jejich rozvaření, těsně před upravením objemu.

Půda C

pepton

hovězí výtažek


chlorid sodný

glukosa monohydrát



voda

Půda D

výtažek ze srdce


pepton z kaseinu

glukosa monohydrát

chlorid sodný



dusičnan draselný

voda

6 g

1,5 g

3 g

3,5 g

1 g

3,68 g

1,32 g

do 1000 ml

1,5 g

1,5 g

5 g

1 g

3,5 g

3,68 g

l,32 g

2 g

do 1000 ml

Půda E

pepton

5 g

masový výtažek

3 g

hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát 26,9 g

agar

10 g

voda

do 1000 ml

Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát se přidá jako

sterilní roztok po sterilizaci půdy.

Půda F

pepton


hovězí výtažek

chlorid sodný

glukosa monohydrát

agar

voda

Půda G

glycerol

pepton

masový výtažek

chlorid sodný

agar

voda

pH má po sterilizaci hodnotu 7,0 ±0,1.

9,4 g

4,7 g

2,4 g

10,0 g

10,0 g

23,5 g

do 1000 ml

10 g

10 g

10 g

3 g

15 g

do 1000 ml

Půda H

pepton

5,0 g

agar

15,0 g

hovězí výtažek prášek

3,0 g

voda

do 1000 ml

pH se upraví hydroxidem sodným 0,1 mol/l RS na hodnotu

7,8 až 8,0.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 359

2.7.4 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO KOAGULAČNÍHO FAKTORU VIII

2.7.4 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO

KOAGULAČNÍHO FAKTORU VIII

8.2:20704

Při stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VIII se

využívá jeho biologického účinku jako kofaktoru aktivace

faktoru X aktivovaným faktorem IX (faktor IXa) v přítomnosti

iontů vápníku a fosfolipidu. Účinnosti faktoru VIII se

měří v přípravcích z plazmy a v terapeutických koncentrátech

(odvozených z plazmy a připravených rekombinantní

technologií). Účinnost přípravku faktoru VIII se stanoví porovnáním

množství potřebného k dosažení určité rychlosti

tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky, které

se účastní aktivace faktoru X, s množstvím mezinárodního

standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného

v mezinárodních jednotkách, které je potřebné k dosažení

stejné rychlosti tvorby faktoru Xa.

Kvantitativní vyjádření účinnosti faktoru VIII v přípravcích

z plazmy se udává v mezinárodních jednotkách, definovaných

mezinárodním standardem krevního koagulačního

faktoru VIII v plazmě, jako referenční přípravek je vhodné

použít faktory V, VIII, XI a XIII koagulační v plazmě BRP.

Kvantitativní vyjádření účinnosti faktoru VIII v terapeutických

koncentrátech se udává v mezinárodních jednotkách,

definovaných mezinárodním standardem koncentrátu krevního

koagulačního faktoru VIII, jako referenční přípravek

je vhodné použít faktor VIII koagulační lidský koncentrát

BRP.

Chromogenní způsob stanovení se skládá ze dvou následných

kroků: z aktivace faktoru X v reakční směsi koagulačních

faktorů složené z purifikovaných složek, která závisí

na obsahu přítomného faktoru VIII, a z enzymatického štěpení

chromogenního substrátu faktoru Xa, které je provázeno

vznikem chromoforu, jehož množství se může stanovit

kvantitativně spektrofotometricky. Za vhodných podmínek

stanovení je závislost rychlosti tvorby faktoru Xa na

koncentraci faktoru VIII lineární. Stanovení se dá shrnout

do následujícího schématu:

krok 1:

( )

aktivovaný faktor VIII

faktor X

faktor Xa

2

faktor IXa,fosfolipid,Ca +

®

krok 2:

faktor Xa

chromogenní substrát ¾¾ ¾¾¾ ® peptid + chromofor

Pro oba kroky se používají zkoumadla, která lze komerčně

zajistit z různých zdrojů. I když se složení jednotlivých

zkoumadel může lišit, jejich nezbytné vlastnosti jsou

popsány v následující specifikaci. Odchylky od tohoto popisu

jsou přípustné, pokud se prokáže, že výsledky získané

za použití vhodného mezinárodního standardu pro lidský

krevní koagulační faktor VIII se významně neliší.

Je důležité prokázat validací, že použitá souprava (kit) je

vhodná, zejména se ověří časový průběh tvorby faktoru Xa,

aby se stanovil čas potřebný k dosažení 50 % maximální

tvorby faktoru Xa.

ZKOUMADLA

Zkoumadlo koagulačního faktoru zahrnuje purifikované

bílkoviny lidského nebo hovězího původu. Jsou to faktor X,

faktor IXa a aktivátor faktoru VIII, obvykle trombin. Tyto

bílkoviny jsou částečně purifikované, nejlépe alespoň na

50 %, a neobsahují nečistoty, které zasahují do aktivace

faktoru VIII nebo faktoru X. Trombin může být přítomen

ve formě svého prekurzoru protrombinu za předpokladu, že

jeho aktivace ve zkoumadle je dostatečně rychlá, aby při

stanovení docházelo téměř okamžitě k aktivaci faktoru

VIII. Fosfolipid může pocházet z přírodních zdrojů nebo

se může připravit synteticky a musí obsahovat dostatečné

množství fosfatidylserinu. Složky úplného zkoumadla se

obvykle rozdělí do dvou oddělených zkoumadel, každé samostatně

nemá schopnost tvořit faktor Xa. Jedno ze zkoumadel

obsahuje ionty vápníku. Po rekonstituci se zkoumadla

mohou spojit za předpokladu, že se v nepřítomnosti faktoru

VIII netvoří významné množství faktoru Xa.

V konečné inkubační směsi musí být faktor VIII jedinou

složkou limitující rychlost.

Ve druhém kroku se určí množství vytvořeného faktoru Xa

za použití chromogenního substrátu specifického pro faktor

Xa. Tím je obvykle derivát krátkého peptidu tvořený

třemi až pěti aminokyselinami s připojenou chromoforovou

skupinou. Při odštěpení této skupiny z peptidového substrátu

se vlastnosti tohoto chromoforu posunou do vlnové délky

umožňující spektrofotometrické stanovení jejího množství.

Substrát také musí obsahovat vhodné inhibitory pro

zastavení další tvorby faktoru Xa, např. chelatotvorné činidlo,

a pro potlačení aktivity trombinu.

POSTUP STANOVENÍ ÚČINNOSTI

Pro stanovení účinnosti v terapeutických koncentrátech se

referenční přípravek a zkoušený přípravek předem zředí

vhodným ředidlem na roztoky obsahující 0,5 m. j./ml až

2,0 m. j./ml. K ředění se použije hemofilická plazma A,

nebo uměle připravené zkoumadlo obsahující dostatek

von Willebrandova faktoru, které poskytuje výsledky významně

se nelišící od výsledků stanovení za použití hemofilické

plazmy. Zředěné materiály musí být stabilní po dobu

potřebnou pro stanovení. Pro stanovení účinnosti faktoru

VIII v přípravcích z plazmy se k ředění nepožaduje hemofilická

plazma A.

Připraví se ředění již předem ředěného terapeutického koncentrátu

referenčního a zkoušeného přípravku (nebo referenčního

a zkoušeného přípravku z plazmy) za použití

vhodného tlumivého roztoku bez chelatotvorných složek,

např. tlumivého roztoku trometamolového nebo imidazolového,

s obsahem 1 % albuminu lidského nebo albuminu

hovězího. Připraví se nejméně dvě série tří dalších ředění

každého materiálu. Ředění se připravují tak, aby konečná

koncentrace faktoru VIII v reakční směsi byla během kroku,

kdy dochází k tvorbě faktoru Xa, přednostně nižší než

0,01 m. j./ml.

Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky,

kromě faktoru VIII.

Všechna ředění se připraví ve zkumavkách z plastu a ihned

se použijí.

Krok 1. Předehřátá ředění referenčního přípravku faktoru

VIII i zkoušeného přípravku se smíchají s odpovídajícím

objemem předehřátého zkoumadla koagulačního faktoru

nebo jeho složek a směs se inkubuje ve zkumavkách z plastu

nebo v jamkách mikrotitrační destičky při 37 °C. Aktiva-

360 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.5 STANOVENÍ ÚČINNOSTI HEPARINU

ce faktoru X se nechá probíhat vhodnou dobu postačující

k ukončení reakce (krok 2) až koncentrace faktoru Xa dosáhne

přibližně 50 % maximální úrovně (plató). Vhodné

doby aktivace jsou obvykle 2 min až 5 min.

Krok 2. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla

obsahujícího chromogenní substrát. Kvantitativně se

stanoví rychlost štěpení substrátu, která musí lineárně záviset

na koncentraci vzniklého faktoru Xa, měřením změny

absorbance při vhodné vlnové délce za použití spektrofotometru.

Absorbance se sleduje buď kontinuálně, což

umožňuje vypočítat počáteční rychlost štěpení substrátu,

nebo se po vhodné době ukončí hydrolytická reakce snížením

pH po přidání vhodného zkoumadla, jako je roztok kyseliny

octové 50% (V/V), nebo tlumivý roztok citrátový

o pH 3 (1 mol/l). Doba hydrolýzy se nastaví tak, aby se dosáhlo

lineární tvorby chromoforu v závislosti na čase.

Vhodná doba hydrolýzy je obvykle 3 min až 15 min, jsou

ale přípustné odchylky, pokud se tím dosáhne lepší lineární

závislosti odpovědi na dávce.

Účinnost zkoušeného přípravku se vypočítá obvyklými statistickými

metodami (např. 5.3).


9.1:20705

Antikoagulační účinnost heparinu se stanoví in vitro změřením

jeho schopnosti urychlovat inhibici trombinu, faktoru

IIa (stanovení aktivity proti faktoru IIa), antitrombinem.

Mezinárodní jednotka heparinu odpovídá aktivitě obsažené

v deklarovaném množství mezinárodního standardu nefrakcionovaného

heparinu. Jako referenční přípravek se použije

heparin sodná sůl BRP, která se kalibruje v mezinárodních

jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem pomocí

některé ze dvou dále uvedených metod stanovení.

Stanovení aktivity proti faktoru Xa se určí stanovením poměru

aktivity proti faktoru Xa k aktivitě proti faktoru IIa.

Pro stanovení aktivity proti faktoru IIa a proti faktoru Xa se

změří absorbance (metoda konečného bodu) nebo změna

absorbance za minutu (kinetická metoda).

AKTIVITA PROTI FAKTORU IIa

Porovnávací a zkoušené roztoky

Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi ředěními zkoušené

látky a heparinu sodné soli BRP v tlumivém roztoku

trometamolovém s dinatrium-edetátem o pH 8,4 R1; rozmezí

koncentrací je vhodné 0,005 m. j. až 0,03 m. j.

v mililitru. Vybraná ředění musí při vynesení absorbance

proti logaritmu koncentrace vytvořit lineární závislost.

Postup

Označí se šestnáct zkumavek pro ředění zkoušené látky

a šestnáct zkumavek pro ředění referenčního přípravku: T1,

T2, T3 a T4 pro každou ze čtyř sérií ředění zkoušené látky

a S1, S2, S3 a S4 pro každou ze čtyř sérií ředění referenčního

přípravku. Do každé ze 32 zkumavek se přidá 100 μl antitrombinu

III RS5 a 50 μl příslušného ředění zkoušené látky

nebo referenčního přípravku. Po každém přidání se promíchá

tak, aby nevznikly bubliny. Zkumavky se uspořádají do

dvou následných sérií v pořadí S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4,

T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3 a S4, ponechají se nejméně 1 min

ustálit při 37 °C (ve vodní lázni nebo tepelném bloku) a do

každé zkumavky se přidá 25 μl trombinu lidského RS2.

Inkubuje se přesně 1 min a přidá se 50 μl chromogenního

substrátu specifického pro faktor IIa o koncentraci vhodné

pro stanovení (např. D-fenylalanyl-L-pipekolyl-L-arginin-4-

-nitroanilid-dihydrochlorid se rozpustí ve vodě R na koncentraci

1,25 mmol/l).

Při kinetické metodě se přenesou směsi do semimikrokyvet

a změří se změna absorbance za minutu (2.2.25) při

405 nm, za použití vhodného vyhodnocovacího zařízení.

Při metodě konečného bodu se reakce zastaví po přesně 4 min

přidáním 50 μl roztoku kyseliny octové ledové R 20% (V/V).

Vyhodnotí se, zda inkubace s chromogenním substrátem trvající

přesně 4 min vede k optimálnímu změření absorbance a,

je-li třeba, upraví se doba inkubace, aby se dosáhlo nejlepší

lineární závislosti odpovědi na dávce. Pak se směsi přenesou

do semimikrokyvet a změří se absorbance (2.2.25) při

405 nm za použití vhodného vyhodnocovacího zařízení.

Slepé stanovení amidolytické aktivity se provede na začátku

a na konci měření stejným způsobem, pouze místo porovnávacího

a zkoušeného roztoku se použije tlumivý roztok

trometamolový s dinatrium-edetátem o pH 8,4 R1; naměřené

hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší.

Provede se regresní analýza závislosti absorbance na logaritmech

koncentrací roztoků zkoušené látky a heparinu

sodné soli BRP a vypočítá se účinnost zkoušené látky

v mezinárodních jednotkách v mililitru pomocí obvyklých

statistických metod pro model rovnoběžnosti (5.3).

AKTIVITA PROTI FAKTORU Xa

Porovnávací a zkoušené roztoky

Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi ředěními zkoušené

látky a heparinu sodné soli BRP v tlumivém roztoku

trometamolovém s dinatrium-edetátem o pH 8,4 R1; rozmezí

koncentrací je vhodné 0,03 m. j. až 0,375 m. j. v mililitru.

Vybraná ředění musí při vynesení absorbance proti

logaritmu koncentrace vytvořit lineární závislost.

Postup

Označí se šestnáct zkumavek pro ředění zkoušené látky

a šestnáct zkumavek pro ředění referenčního přípravku: T1,

T2, T3 a T4 pro každou ze čtyř sérií ředění zkoušené látky

a S1, S2, S3 a S4 pro každou ze čtyř sérií ředění referenčního

přípravku. Do každé ze 32 zkumavek se přidá 50 μl antitrombinu

III RS6 a 50 μl příslušného ředění zkoušené látky

nebo referenčního přípravku. Po každém přidání se promíchá

tak, aby nevznikly bubliny. Zkumavky se uspořádají do

dvou následných sérií v pořadí S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4,

T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3 a S4, ponechají se nejméně 1 min

ustálit při 37 °C (ve vodní lázni nebo tepelném bloku) a do

každé zkumavky se přidá 100 μl faktoru Xa hovězího RS2.

Inkubuje se přesně 2 min a přidá se 100 μl chromogenního

substrátu specifického pro faktor Xa o koncentraci vhodné

pro stanovení (například N-α-benzyloxykarbonyl-D-arginyl-

-L-glycyl-L-arginin-4-nitroanilid-dihydrochlorid se rozpustí

ve vodě R na koncentraci 1 mmol/l).

Při kinetické metodě se přenesou směsi do semimikrokyvet

a změří se změna absorbance za minutu (2.2.25) při 405 nm

za použití vhodného vyhodnocovacího zařízení.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 361

2.7.6 STANOVENÍ ÚČINNOSTI ADSORBOVANÉ VAKCÍNY PROTI ZÁŠKRTU

Při metodě konečného bodu se reakce zastaví přesně po 4 min

přidáním 50 μl roztoku kyseliny octové ledové R 20% (V/V).

Vyhodnotí se, zda inkubace s chromogenním substrátem trvající

přesně 4 min vede k optimálnímu změření absorbance

a, je-li třeba, upraví se doba inkubace, aby se dosáhlo

nejlepší lineární závislosti odpovědi na dávce. Pak se směsi

přenesou do semimikrokyvet a změří se absorbance

(2.2.25) při 405 nm za použití vhodného vyhodnocovacího

zařízení.

Slepé stanovení amidolytické aktivity se provede na začátku

a na konci měření stejným způsobem, pouze místo porovnávacího

a zkoušeného roztoku se použije tlumivý roztok

trometamolový s dinatrium-edetátem o pH 8,4 R1; naměřené

hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší.

Provede se regresní analýza závislosti absorbance na logaritmech

koncentrací roztoků zkoušené látky a heparinu

sodné soli BRP a vypočítá se účinnost zkoušené látky

v mezinárodních jednotkách v mililitru pomocí obvyklých

statistických metod pro model rovnoběžnosti (5.3).

2.7.6 STANOVENÍ ÚČINNOSTI

ADSORBOVANÉ VAKCÍNY

PROTI ZÁŠKRTU

6.0:20706

Účinnost adsorbované vakcíny proti záškrtu se stanoví podáním

vakcíny morčatům následované buď čelenží difterickým

toxinem (metoda A nebo B), nebo stanovením titru

protilátek proti difterickému toxinu nebo toxoidu v séru

morčat (metoda C). V obou případech se účinnost vakcíny

vypočítá porovnáním s referenčním přípravkem kalibrovaným

v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném

množství mezinárodního standardu. Tento standard sestává

z určitého množství difterického toxoidu adsorbovaného na

hydroxid hlinitý. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu

v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická

organizace.

Vakcína proti záškrtu adsorbovaná BRP je vhodná pro použití

jako referenční přípravek.

Výběr metody stanovení účinnosti adsorbované vakcíny

proti záškrtu závisí na tom, pro jaký účel je určena. Metoda

A nebo metoda B se používají:

1. při vývoji vakcíny ke stanovení účinnosti šarží vakcíny

vyrobených k validaci výroby;

2. kdekoliv je nutná nová validace v důsledku významných

změn výrobního postupu.

Metody A nebo B se mohou také použít pro běžné stanovení

účinnosti šarží vakcíny, ale vzhledem k ochraně zvířat se

doporučuje použití metody C, kdekoliv je to možné.

Metoda C se může použít, kromě případů uvedených v bodech

1 a 2, po prokázání vhodnosti použití této metody pro

přípravek. Pro tento účel se ověří metodou C a metodou A

nebo B vhodný počet šarží (obvykle tři). Když se z difterického

toxoidu stejného původu připravují různé vakcíny

(monovalentní nebo složené) se srovnatelnými hladinami

stejného difterického toxoidu (vyjádřenými v Lf/ml), pak

lze prokázání vhodnosti metody u vakcíny s nejvyšším počtem

složek přijmout jako platný i pro vakcíny s menším

množstvím složek nebo pro monovalentní vakcíny. Složené

vakcíny obsahující celobuněčnou pertusovu složku nebo

složku hemofilovou typu b konjugovanou ve vakcíně s difterickým

toxoidem nebo s difterickou bílkovinou CRM 197

jako nosičem ve stejné ampulce se musí vždy hodnotit samostatně.

Pro kombinace obsahující difterickou a tetanickou složku

se může sérologické stanovení účinnosti (metoda C) provádět

se stejnou skupinou zvířat, která se použila pro sérologické

stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti tetanu

(2.7.8), pokud se prokáže, že podmínky imunizace společné

pro difterickou a tetanickou složku (např. dávka, trvání)

jsou platné pro složené vakcíny.

V dále popsaném plánu stanovení účinnosti se používají

mnohonásobná ředění zkoušeného a referenčního přípravku.

Pouze analytik, který má dostatečné zkušenosti s touto

metodou pro danou vakcínu, může použít zjednodušený

model jediného ředění zkoušeného přípravku a referenčního

přípravku. Takový model umožňuje analytikovi stanovit,

zda je účinnost zkoušeného přípravku významně vyšší

než nejnižší požadovaná, ale neposkytuje informaci o linearitě,

rovnoběžnosti a křivce závislosti odpovědi na dávce.

Zjednodušený model vede ke značnému snížení počtu potřebných

pokusných zvířat a jeho použití musí být zvažováno

každým analytikem v souladu s požadavky Evropské


a jiné vědecké účely (The European Convention for the

Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental

and Other Scientific Purposes).

Kde se používá stanovení s jediným ředěním, sleduje se trvale

shodnost výroby monitorováním vhodných ukazatelů a pravidelně,

např. jednou za dva roky, se zařadí stanovení účinnosti

s vícenásobným ředěním. Pro sérologické stanovení účinnosti

jsou vhodnými ukazateli monitorování shodnosti:

– průměrná a směrodatná odchylka relativního titru protilátek

nebo bodové hodnoty (skóre) naměřené ve vzorcích

séra získaných po podání pevně stanovené dávky referenčního

přípravku;

– titry protilátek nebo bodové hodnoty (skóre) naměřené

u kontrol (vzorků pozitivních a negativních sér);

– poměr titrů protilátek nebo bodových hodnot (skóre) pozitivních

kontrolních sér a vzorků sér odpovídajících referenční

vakcíně.

METODA A: ZKOUŠKA INTRADERMÁLNÍ ČELENŽE

NA MORČATECH

VÝBĚR A ROZDĚLENÍ POKUSNÝCH ZVÍŘAT

Ke zkoušce se použijí zdravá bílá morčata z jednoho chovu

a takové velikosti, která umožní předepsaný počet injekčních

podání. Rozdíl v hmotnosti mezi nejtěžším a nejlehčím

zvířetem nepřesahuje 100 g. Morčata jsou stejného pohlaví,

nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin. Zvířata

se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet

zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny

dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není

prokázána stabilita čelenžního toxinu nebo tento toxin

není dostatečně standardizován, přibere se pět morčat jako

nevakcinované kontroly.

362 ČL 2017 – Dopl. 2020


VÝBĚR ČELENŽNÍHO TOXINU

Difterický toxin, který se použije ke zkoušce, obsahuje 67

až 133 Lr/100 v 1 Lf a 25 000 až 50 000 nejmenších dávek

reagujících v kůži morčat v 1 Lf. Pokud je prokázána stabilita

čelenžního toxinu, není třeba ověřovat jeho účinnost při

každém stanovení.

PŘÍPRAVA ROZTOKU ČELENŽNÍHO TOXINU

Toxin se těsně před použitím zředí vhodným ředidlem tak,

aby 0,2 ml obsahovalo asi 0,0512 Lf. Z něho se připraví řada

pěti čtyřnásobných ředění obsahujících asi 0,0128 Lf,

0,0032 Lf, 0,0008 Lf, 0,0002 Lf a 0,00005 Lf v 0,2 ml.

ŘEDĚNÍ ZKOUŠENÉHO A REFERENČNÍHO

PŘÍPRAVKU

Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem

chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění

byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění

při subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) umožnilo

po podání toxinu vznik intradermální reakce zvířat asi

u tří ředění toxinu.

IMUNIZACE A ČELENŽ

Každé ředění se přiřadí jedné skupině morčat a všem morčatům

ve skupině se subkutánně podá po 1,0 ml příslušného

ředění. Po 28 dnech se všem morčatům oholí oba boky

a každému zvířeti se intradermálně podá 0,2 ml každého

z šesti ředění toxinu na šest různých míst tak, aby vzájemné

působení sousedících míst bylo co nejmenší.

STANOVENÍ ÚČINNOSTI ČELENŽNÍHO TOXINU

Je-li třeba, podají se nevakcinovaným kontrolním zvířatům

roztoky obsahující 80, 40, 20, 10 a 5 · 10 –6 Lf čelenžního

toxinu.


48 h po podání toxinu se vyšetří všechna místa podání

a u každého zvířete se formou poměru zaznamená počet

míst se specifickým difterickým erytémem a počet míst

bez této reakce. Hodnoty těchto poměrů (skóre) pro všechna

zvířata, jimž bylo podáno stejné ředění vakcíny, se sloučí

a zaznamenají do tabulky. Tyto údaje se vhodnou transformací,

jako např. (skóre) 2 nebo arcsin ((skóre/6) 2 ), použijí

k získání odhadu relativní účinnosti každé zkoušené

vakcíny pomocí kvantitativního hodnocení rovnoběžných

přímek.

POŽADAVKY VALIDITY ZKOUŠKY STANOVENÍ

ÚČINNOSTI


– zkoušená vakcína a referenční přípravek vykazují průměrný

počet reakcí (skóre) při nejnižší dávce nižší než 3

a při nejvyšší dávce vyšší než 3;

– kde je to možné, vyvolá ředění toxinu obsahující

40 · 10 –6 Lf dávky pozitivní erytémovou reakci u nejméně

80 % kontrolních morčat a ředění obsahující 20 · 10 –6 Lf

dávky vyvolá pozitivní erytémovou reakci u méně než

80 % kontrolních zvířat (nejsou-li splněna tato kritéria,

vybere se jiný toxin);

– interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až

200 % stanovené účinnosti;

– statistické hodnocení nevykazuje odchylku od linearity

a rovnoběžnosti.

Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více než

jedno stanovení, výsledky všech platných stanovení se musí

pro odhad účinnosti sloučit.

METODA B: SLEDOVÁNÍ ÚHYNU MORČAT


Ke zkoušce se použijí zdravá morčata o hmotnosti 250 g až

350 g pocházející z jednoho chovu. Morčata jsou stejného

pohlaví, nebo se samci a samice rozdělí rovnoměrně do

skupin. Morčata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých

skupin. Použije se počet zvířat ve skupině, který postačuje

k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na

platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita čelenžního

toxinu nebo není-li tento toxin dostatečně standardizován,

přiberou se další čtyři skupiny po pěti morčatech jako

nevakcinované kontroly.


Vybere se takový difterický toxin, který v 1 ml obsahuje

nejméně 100 LD50. Pokud je prokázána stabilita tohoto čelenžního

toxinu, není třeba ověřovat jeho střední smrtelnou

dávku při každém stanovení.


Těsně před použitím se čelenžní toxin zředí vhodným ředidlem

tak, aby se získal roztok toxinu obsahující v 1 ml asi

100 LD50. Je-li třeba, zředí se dále části roztoku čelenžního

toxinu stejným ředidlem v poměrech 1 : 32, 1 : 100 a 1 : 320.

ŘEDĚNÍ ZKOUŠENÉHO A REFERENČNÍHO PŘÍPRAVKU

Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem

chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění

byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění

po subkutánním podání v dávce 1,0 ml na morče ochránilo

přibližně 50 % zvířat před smrtelným účinkem předepsané

dávky difterického toxinu podaného subkutánně.




ředění. Po 28 dnech se všem zvířatům subkutánně podá

1,0 ml roztoku čelenžního toxinu (100 LD50).


Je-li třeba, připraví se na podání roztoku čelenžního toxinu

a jeho tří ředění čtyři skupiny po pěti morčatech. Každému

zvířeti ve skupině se subkutánně podá 1,0 ml příslušného

ředění čelenžního toxinu.


Za 4 dny od podání čelenžního toxinu se odečte počet přežívajících

morčat. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí

porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě

poměru počtu přežívajících zvířat v každé skupině vakcinovaných

morčat za použití obvyklých statistických metod

(např. 5.3).

POŽADAVKY VALIDITY ZKOUŠKY

STANOVENÍ ÚČINNOSTI


– 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku

je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou přípravků podaných

morčatům;

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 363


– kde je to třeba, ukázal počet uhynulých zvířat ve čtyřech

skupinách po pěti morčatech, kterým se podal roztok čelenžního

toxinu a jeho tři ředění, že použitá dávka toxinu

byla přibližně 100 LD50;




a rovnoběžnosti.

Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení,

výsledky všech platných stanovení se musí pro odhad

účinnosti sloučit.

METODA C: STANOVENÍ PROTILÁTEK U MORČAT


Ke zkoušce se použijí zdravá morčata o hmotnosti 250 g až

350 g pocházející z jednoho chovu. Morčata jsou stejného

pohlaví, nebo se samci a samice rozdělí rovnoměrně do skupin.

Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin.

Použije se počet zvířat ve skupině, který stačí k tomu,

aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost

zkoušky. Další skupina nevakcinovaných morčat pocházející

ze stejného chovu se použije pro přípravu negativního kontrolního

séra. Je-li prokázána shodnost zkoušení, může se jako

kontrola použít referenční negativní sérum.

REFERENČNÍ PŘÍPRAVEK

Použije se vhodný referenční přípravek, jako např. vakcína

proti záškrtu adsorbovaná BRP, nebo šarže vakcíny, která

byla ověřena v klinických studiích, nebo reprezentativní

šarže, která byla kalibrovaná v mezinárodních jednotkách

porovnáním s referenční vakcínou proti záškrtu adsorbovanou

BRP nebo s mezinárodním standardním difterickým

toxoidem (adsorbovaným).


PŘÍPRAVKU

Zkoušená vakcína a referenční přípravek se zředí roztokem

chloridu sodného R (9 g/l). Vhodná jsou jednotlivá ředění

odstupňovaná 2,5násobně až 5násobně. Použijí se nejméně

tři ředění v rozsahu např. 0,5 m. j./ml až 16 m. j./ml pro referenční

přípravek a ředění v rozsahu např. 1 : 2 až 1 : 125

pro zkoušenou vakcínu. Imunizace se přednostně provede

do jedné hodiny od naředění. Připravená ředění se přiřadí

jednotlivým skupinám morčat.

IMUNIZACE

Každému morčeti se podá subkutánně 1,0 ml ředění, které

bylo přiřazeno jeho skupině.

ODBĚR KRVE

Za 35 dnů až 42 dnů po imunizaci se vhodným postupem

odeberou všem imunizovaným i kontrolním morčatům

vzorky krve.

PŘÍPRAVA VZORKŮ SÉR

Séra se nemají často zmrazovat a rozmrazovat. Aby se zabránilo

mikrobiální kontaminaci, je vhodné provádět práci

v laminárním boxu.

STANOVENÍ TITRU PROTILÁTEK

Relativní titr protilátek nebo hodnota titru každého vzorku

séra se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Jako vhodné byly shledány dále uvedené metody [enzymově

imunosorbentové stanovení (ELISA) a stanovení na Vero

buňkách].


Účinnost zkoušené vakcíny v porovnání s referenčním přípravkem

v mezinárodních jednotkách se vypočítá za použití

obvyklých statistických metod (např. 5.3).




– interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí

50 % až 200 % stanovené účinnosti;

– při statistickém hodnocení vykazuje křivka závislosti odpovědi

na dávce významný sklon a nevykazuje odchylku

od linearity a rovnoběžnosti (jsou-li zjištěny významné

odchylky, ve stati 5.3 jsou uvedeny možné alternativní

postupy).


výsledky všech platných stanovení se musí pro odhad

účinnosti sloučit.


Stanovení účinnosti adsorbované

vakcíny proti záškrtu: pokyny

METODA C: STANOVENÍ PROTILÁTEK U MORČAT


Pro přípravu vzorků sér je vhodný následující postup. Zkumavky

se vzorky krve se šestkrát obrátí a nechají stát 2 h

při 37 °C a potom 2 h při 4 °C. Odstřeďují se 20 min při

teplotě místnosti při 800 g. Séra se převedou do sterilních

zkumavek a skladují se při teplotě -20 °C. Tímto postupem

se získá nejméně 40 % séra.


Stanovení ELISA a stanovení na Vero buňkách jsou uvedena

jako příklady vhodných imunochemických metod pro

stanovení titru protilátek.

Stanovení titru protilátek v morčecích sérech enzymově

imunosorbentovou zkouškou (ELISA). Ředění zkoušeného

a referenčního séra se nakapou na ELISA destičky

s navázaným difterickým toxoidem. Pro sledování přesnosti

provedení zkoušky se na každou destičku zařadí morčecí

pozitivní a morčecí negativní sérum. Přidá se králičí nebo

kozí protimorčecí-IgG konjugovaný s peroxidasou a potom

peroxidasový substrát. Změří se optická hustota a relativní

titr protilátek se vypočítá obvyklými statistickými metodami

(např. 5.3).

Zkoumadla a přístroje

– ELISA destičky. 96 jamek, sloupce 1–12, řady A–H.

– Antisérum proti záškrtu morčecí pro vakcíny pro humánní

použití (pozitivní kontrolní sérum) získané imunizací

morčat za použití vakcíny proti záškrtu adsorbované

BRP.

– Peroxidasový konjugát. Králičí nebo kozí protimorčecí

IgG konjugovaný s peroxidasou.

– Difterický toxoid.

– Tlumivý ochranný roztok uhličitanový o pH 9,6. 1,59 g

uhličitanu sodného bezvodého R a 2,93 g hydrogenuhliči-

364 ČL 2017 – Dopl. 2020


tanu sodného R se rozpustí v 1000 ml vody R. Rozplní se

do lahviček o objemu 150 ml a sterilizuje se 15 min

v autoklávu při 121 °C.

– Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným

o pH 7,4 (PBS). Za stálého míchání se rozpustí 80,0 g

chloridu sodného R, 2,0 g dihydrogenfosforečnanu draselného

R, 14,3 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu

R a 2,0 g chloridu draselného R v 1000 ml vody R.

Skladuje se při teplotě místnosti, aby se předešlo krystalizaci.

Před použitím se desetkrát zředí vodou R.

– Roztok kyseliny citronové. 10,51 g kyseliny citronové monohydrátu

R se rozpustí v 1000 ml vody R a pH se upraví

roztokem hydroxidu sodného R (400 g/l) na hodnotu 4,0.

– Promývací tlumivý roztok. Tlumivý roztok fosforečnanový

s chloridem sodným (PBS) obsahující polysorbát 20 R

(0,5 g/l).

– Blokační tlumivý roztok. Tlumivý roztok fosforečnanový


(0,5 g/l) a sušené odstředěné mléko (25 g/l).

– Peroxidasový substrát. Krátce před použitím se rozpustí

10 mg diamonium-2,2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-

-sulfonát) R (ABTS) ve 20 ml roztoku kyseliny citronové.

Těsně před použitím se přidá 5 µl peroxidu vodíku koncentrovaného

R.

Postup

Dále uvedený popis je příkladem vhodného rozvržení destičky,

ale mohou se použít i jiná rozvržení. Jamky 1A až H

jsou určeny pro negativní kontrolní sérum a jamky 2A až H

a 12A až H pro pozitivní kontrolní sérum pro monitorování

zkoušky. Jamky 3 až 11A až H jsou určeny pro zkoušené

vzorky.

Na povrch každé jamky ELISA destičky se naváže 100 µl

roztoku difterického toxoidu (0,5 Lf/ml v tlumivém ochranném

uhličitanovém roztoku o pH 9,6). Ponechá se přes noc

ve vlhké atmosféře při teplotě 4 °C. Aby se zabránilo interferenci

způsobené vzestupem teploty, ukládají se nejvýše

čtyři destičky na sebe. Následující den se jamky důkladně

opláchnou promývacím tlumivým roztokem a blokují se

přidáním 100 µl blokačního tlumivého roztoku do každé

jamky. Inkubuje se 1 h ve vlhké atmosféře při teplotě

37 °C. Jamky se důkladně opláchnou promývacím tlumivým

roztokem. Do každé jamky, kromě jamek v řadě A, se

přidá 100 µl blokačního roztoku. Připraví se vhodná ředění

negativního kontrolního séra, pozitivního kontrolního séra

(od přibližně 0,01 m. j./ml) a zkoušených sér. Negativní

kontrolní sérum se umístí do sloupce 1, pozitivní kontrolní

sérum do sloupců 2 a 12 a zkoušená séra do sloupců 3 až

11. Séra se nakapou v množství 100 µl do prvních dvou jamek

sloupce, pro který jsou určena. Vícekanálovou mikropipetou

se připraví dvojnásobná sériová ředění od řady B

postupně k řadě H přenášením 100 µl do následující jamky.

100 µl z poslední řady se odstraní, všechny jamky obsahují

100 µl. Inkubuje se 2 h při 37 °C, pak se destičky důkladně

opláchnou promývacím tlumivým roztokem. Připraví se

vhodné ředění (1 : 2000 bylo shledáno vhodným) peroxidasového

konjugátu v blokačním tlumivém roztoku a do každé

jamky se nakape 100 µl. Inkubuje se 1 h ve vlhké atmosféře

při teplotě 37 °C. Destičky se důkladně opláchnou

promývacím tlumivým roztokem a do každé jamky se přidá

100 µl peroxidasového substrátu. Nechá se při teplotě místnosti

za chránění před světlem 30 min. Destičky se odečítají

při 405 nm ve stejném pořadí, v jakém byl přidáván

substrát.

Stanovení titru protilátek v morčecích sérech stanovením

na Vero buňkách. Použitá metoda je založena na stanovení

koncového bodu (end-point) metabolickou inhibicí

(metoda 1) nebo na principu cytotoxicity (metoda 2) buď

mikroskopií (morfologie buněk), nebo vizuálním (barevné)

hodnocením buněk.

Limit detekce je pro každý antigen specifický a obvykle je

v rozmezí 0,015 m. j./ml (metoda 1) a 0,05 m. j./ml (metoda

2).

Za koncový bod (end-point) se pokládá nejvyšší ředění séra

schopné ochránit před účinkem difterického toxinu. Antitoxinová

aktivita se vypočítá porovnáním s morčecím referenčním

standardem nebo s referenčním standardem vyhlášeným

Světovou zdravotnickou organizací a vyjádří se



– Destičky pro tkáňové kultury s jamkami s rovným dnem:

96 jamek, sloupce 1 až 12, řady A až H.

– Lahve pro tkáňové kultury 75 cm 2 .

– Difterický toxin.

– Antisérum proti záškrtu morčecí pro vakcíny pro humánní

použití (pozitivní kontrolní sérum) získané imunizací

morčat vakcínou proti záškrtu adsorbovanou BRP.

– Vero buňky (ledvinové buňky kočkodana zeleného). Je

vhodné použít buněčné pasáže od P2 do P15.

Metoda 1. Difterický toxin způsobí na Vero buňkách cytopatický

účinek vedoucí k buněčné lýze. Protilátky vytvořené

proti difterickému toxinu mohou tento cytopatický účinek

inhibovat. V důsledku toho se může účinnost difterické

vakcíny stanovit nepřímo pomocí těchto buněčných systémů,

pokud se rozdílná ředění sér imunizovaných zvířat kultivují

s konstantní koncentrací toxinu. Při stanovení na Vero

buňkách se živé buňky zobrazují žlutě a mrtvé buňky

červeně. Pokud je mrtvá pouze část buněk, je zbarvení

oranžové.


– Modifikované minimální esenciální médium. Minimální

esenciální médium (MEM) s Earlovými solemi bez

L-glutaminu a hydrogenuhličitanu sodného.

– Modifikované médium 199. Médium 199 s Hanksovým roztokem

a L-glutaminem bez hydrogenuhličitanu sodného.

– Fetální bovinní sérum.

– Roztok hydrogenuhličitanu sodného (7,5%).

– Roztok trypsinu. Roztok trypsinu (2,5%).

– Roztok kyseliny edetové. Roztok kyseliny edetové

(0,02%) (Versenův roztok 1 : 5000).

– Dulbeccův modifikovaný tlumivý roztok fosforečnanový

(D-PBS). Dulbeccův tlumivý roztok fosforečnanový bez

vápníku nebo hořčíku.

– Roztok L-glutaminu (200 mmol/l).

– Penicilin-streptomycinový roztok.

– Primární kultivační médium. K 50 ml modifikovaného

minimálního esenciálního média se přidá 440 ml vody R,

5 ml roztoku L-glutaminu (200 mmol/l) a 10 ml roztoku

hydrogenuhličitanu sodného (7,5%). Ke 25 ml tohoto média

se přidá 1,25 ml fetálního bovinního séra.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 365


– Udržovací kultivační médium. Připraví se stejným postupem

jako primární kultivační médium, ale ke 20 ml obohaceného

minimálním esenciálním médiem se místo

1,25 ml přidá 0,5 ml fetálního bovinního séra.

– Médium A. K 50,0 ml modifikovaného média 199 se přidá

440,0 ml vody R, 5,0 ml roztoku L-glutaminu

(200 mmol/l) a 10,0 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného

(7,5%).

– Médium B. Ke 150,0 ml média A se přidají 3,0 ml fetálního

bovinního séra a 0,3 ml penicilin-streptomycinového

roztoku.

– Médium C. Ke 22,0 ml média A se přidá 0,44 ml fetálního

bovinního séra a 0,44 ml penicilin-streptomycinového

roztoku.

Vero buňky se kultivují v lahvích pro tkáňové kultury

(např. 75 cm 2 /250 ml) v inkubátoru při (36 ±1) °C, atmosféře

5% CO2 a 90% relativní vlhkosti. Vero buňky nejprve

rostou v primárním kultivačním médiu, po 2 až 3 dnech

růstu se primární kultivační médium nahradí udržovacím

kultivačním médiem. Když se získá souvislá jednovrstvá

buněčná kultura (monolayer), odstraní se kultivační supernatantní

tekutina a buněčná vrstva se opatrně promyje Dulbeccovým

modifikovaným tlumivým roztokem fosforečnanovým.

Do kultivační lahve se přidá směs objemových

dílů roztoku trypsinu a roztoku kyseliny edetové (1 + 1).

S lahví se šetrně rychlým pohybem zakrouží a nechá se

3 min inkubovat v CO2 inkubátoru, dokud se buňky nezačnou

z jednovrstvé buněčné kultury (monolayeru) odlamovat.

Stěna lahve se rychle opláchne, aby se buňky odloučily.

Buňky se resuspendují v 5 ml až 6 ml čerstvého

média C na homogenní suspenzi obsahující přibližně

1 · 10 5 buněk/ml.

Do všech jamek, s výjimkou jamek sloupce 1, se nakape

25 µl média B, 25 µl antiséra proti záškrtu morčecího pro

vakcíny pro humánní použití (pozitivní kontrolní sérum,

pracovní ředění v médiu B 0,40 m. j./ml) se převede do jamek

A1, A2 a A11. 25 µl vzorků morčecího séra se nakape

do jamek B až G sloupce 1, 2 a 11. 25 µl negativního kontrolního

séra se převede do řady H sloupce 1, 2 a 11. Vícekanálovou

mikropipetou se připraví dvojnásobná sériová

ředění po celé destičce (pro řady A až G od sloupce 2 do

sloupce 10, pro řadu H do sloupce 8). Z jamek sloupce 10

řady A až G a z jamky H8 se odstraní po 25 µl.

Difterický toxin se rekonstituuje v roztoku chloridu sodného

na roztok o koncentraci 50 m. j./ml. Připraví se padesátinásobné

ředění tohoto roztoku difterického toxinu v médiu

B a získá se pracovní roztok o koncentraci 1,0 m. j./ml.

25 µl tohoto pracovního roztoku se převede do jamek A12

a B12 (kontrolní toxin). Připraví se dvojnásobná sériová ředění

převedením 25 µl z jedné jamky do jamky následující

od jamky B12 do jamky H12. Mezi jednotlivými ředěními

se vymění špička. Z jamky H12 se odstraní 25 µl. Do jamek

B12 až H12 se doplní po 25 µl média B. Potom se do

každé jamky řady A až H sloupců 1 až 10 nakape 25 µl pracovního

ředění difterického toxinu (1,0 m. j./ml) s výjimkou

jamek H9 a H10 (pouze buňky bez séra a toxinu).

Destička se zakryje víčkem nebo lepicí fólií a opatrně se

protřepe. Inkubuje se nejméně 2 h při 37 °C ve vlhké atmosféře

v CO2 inkubátoru. Do všech jamek se přidá po

200 µl buněčné suspenze obsahující 1 × 10 5 buněk/ml. Destičky

se zakryjí lepicí fólií a inkubují se 5 dnů při 37 °C.

Mikroskopicky se ověří mikrobiální kontaminace.

Žluté jamky se zaznamenají jako negativní a červené jamky,

které indikují mrtvé buňky, se zaznamenají jako pozitivní.

Zbarvení mezi žlutou a červenou indikuje směs živých

a mrtvých buněk a zaznamená se jako pozitivní/negativní.

Výsledky založené na změně zbarvení se mohou

potvrdit mikroskopickým odečtem živých a mrtvých buněk.

Účinnost vzorků morčecího antiséra se získá porovnáním

poslední jamky se standardním přípravkem vykazujícím

úplnou neutralizaci toxinu s poslední jamkou se vzorkem

vykazujícím stejný výsledek. Pro výpočet účinnosti se musí

mít na paměti, že koncový bod (end-point) může být mezi

negativní jamkou a pozitivní/negativní jamkou.

Metoda 2. Modř thiazolylová MTT se dehydrogenasou mitochondrií

živých buněk redukuje na modrý/černý formazan

a ten slouží ke kvantitativnímu změření přítomnosti

živých buněk, ukazujících, kde byl toxin zneutralizován antitoxinem.

Bílé nebo bezbarvé jamky indikují nepřítomnost

živých buněk, což je důsledkem neschopnosti antitoxinu

neutralizovat toxin.


– Minimální esenciální médium (MEM).

– Sérum novorozených telat.

– Roztok antibiotik (obsahuje 10 000 jednotek penicilinu,

10 mg streptomycinu a 25 µg amfotericinu B v 1 ml).

– Roztok L-glutaminu (200 mmol/l).

– Roztok trypsinu a kyseliny edetové.

– Modř thiazolylová MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-

-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid].

– Tlumivý roztok HEPES o pH 8,1 (1 mol/l). 18,75 g HE-

PES se rozpustí v 82,5 ml vody R a 30,0 ml hydroxidu

sodného 2 mol/l RS.

– Roztok glukosy (10%).

– Úplné kultivační médium. Smíchá se 200 ml minimálního

esenciálního média s 10 ml séra novorozených telat,

3,0 ml tlumivého roztoku HEPES o pH 8,1 (1 mol/l),

2,0 ml roztoku glukosy (10 %), 2,0 ml roztoku antibiotik

a 2,0 ml roztoku L-glutaminu (200 mmol/l).



chloridu sodného R, 0,75 g chloridu draselného R, 1,44 g

hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu R

a 0,125 g dihydrogenfosforečnanu draselného R ve vodě

R a zředí se jí na 1000,0 ml. Je-li třeba, upraví se pH

(2.2.3) a sterilizuje se 15 min v autoklávu při 120 °C.

– Roztok modři thiazolylové MTT. Rozpustí se 0,1 g modři

thiazolylové MTT ve 20 ml tlumivého roztoku fosforečnanového

s chloridem sodným o pH 7,4 a sterilizuje se

filtrací (0,2 µm). Skladuje se v tmavých lahvích.

– Roztok upravující hodnotu pH. Smíchá se 40 ml kyseliny

octové R a 1,25 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l VS

a 8,75 ml vody R.

– Extrakční tlumivý roztok o pH 4,7. 10 g natrium-lauryl-

-sulfátu R se rozpustí ve vodě R, přidá se 50 ml dimethylformamidu

R a zředí se vodou R na 100 ml. Hodnota pH

(2.2.3) se upraví vhodným objemem roztoku upravujícího

hodnotu pH.

366 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.7 STANOVENÍ ÚČINNOSTI VAKCÍNY PROTI DÁVIVÉMU KAŠLI (CELOBUNĚČNÉ)

Vero buňky se kultivují v lahvích pro tkáňové kultury

(např. 75 cm 2 /250 ml) v inkubátoru při (36 ±1) °C, atmosféře

5% CO2 a 90% relativní vlhkosti. Vero buňky nejprve

rostou v úplném kultivačním médiu, po 6 dnech až 7 dnech

růstu, když se získá souvislá jednovrstvá buněčná kultura

(monolayer), pipetou se jemně odstraní kultivační supernatantní

tekutina, buněčná vrstva se třikrát promyje roztokem

trypsinu a kyseliny edetové a přidá se 0,5 ml až 1 ml roztoku

trypsinu a kyseliny edetové. S lahví se zakrouží a odstraní

se trypsin. Postup se dvakrát opakuje, při třetím opakování

se umístí lahev do inkubátoru a nechá se 5 min inkubovat,

dokud se buňky nezačnou z jednovrstvé buněčné

kultury (monolayeru) odlamovat. Silně se poklepe na stěnu

lahve, aby se buňky odloučily od povrchu. Buňky se resuspendují

v 6 ml až 25 ml čerstvě připraveného úplného kultivačního

média, aby se získala homogenní suspenze obsahující

přibližně 4 × 10 5 buněk/ml.

Do všech jamek, s výjimkou jamek sloupce 1, se nakape

50 μl úplného kultivačního média, 100 µl antiséra proti záškrtu

morčecího pro vakcíny pro humánní použití (pozitivní

kontrolní sérum, pracovní ředění v úplném kultivačním médiu

0,12 m. j./ml) se převede do jamky A1 a 50 µl do jamky

A11. 100 µl vzorků zkoušeného morčecího séra, je-li

třeba zředěného, se nakape do jamek B1 až G1. Do jamek

B11 až G11 v odpovídající řadě se přidá po 50 µl stejného

vzorku. 100 µl negativního kontrolního séra se převede

do jamky H1 a 50 µl do jamky H11. Vícekanálovou mikropipetou

se připraví dvojnásobná sériová ředění převedením

50 µl z jedné jamky do jamky následující po celé

destičce (pro řady A až G od sloupce 1 do sloupce 10, pro

řadu H od sloupce 1 do sloupce 8).

Difterický toxin o známé aktivitě a obsahu Lf se zředí úplným

kultivačním médiem na vhodný pracovní zásobní roztok

obsahující nejméně čtyři cytopatické dávky. Do každé

jamky, kromě H9 a H10 (buněčná kontrola), A11 až H11

(sérová kontrola) a A12 až H12 (toxinová kontrola), se přidá

50 µl zředěného toxinu. 100 µl zředěného toxinu se převede

do jamky A12 a připraví se dvojnásobná sériová ředění

převedením 50 µl z jedné jamky do jamky následující

(od jamky A12 do jamky H12). Z jamky H12 se odstraní

50 µl. Přidá se po 50 µl úplného kultivačního média do jamek

H9 a H10.

Destičky se zakryjí víčkem nebo lepicí fólií a ponechají se

1 h při teplotě místnosti, aby mohlo dojít k neutralizaci toxinu.

Do všech jamek se přidá po 50 µl buněčné suspenze

obsahující přibližně 4 × 10 5 buněk/ml. Destičky se zakryjí

lepicí fólií a inkubují se 6 dnů při 37 °C. Mikroskopicky se

ověří mikrobiální kontaminace. Do každé jamky se přidá

10 µl roztoku modři thiazolylové MTT. Destičky se inkubují

další 2 h až 4 h při 37 °C, potom se médium odstraní

a do každé jamky se přidá po 100 µl extrakčního tlumivého

roztoku o pH 4,7. Destičky se inkubují při 37 °C a ponechají

se přes noc, aby proběhla extrakce. Jakmile je extrakce

a solubilizace ukončena, hodnotí se destičky vizuálně

nebo se odečtou při 570 nm.

Modré/černé jamky se zaznamenají jako negativní (všechny

buňky jsou živé, toxin zneutralizován antitoxinem) a bílé

nebo bezbarvé jamky indikují přítomnost mrtvých buněk

(toxin není zneutralizován) a zaznamenají se jako pozitivní.

Účinnost zkoušeného antitoxinu se získá porovnáním poslední

jamky s referenčním antitoxinovým přípravkem vykazujícím

úplnou neutralizaci toxinu s poslední jamkou se

vzorkem vykazujícím stejný výsledek. Titr neutralizačních

protilátek zkoušeného vzorku se může vypočítat vynásobením

ředicího faktoru celkovým počtem mezinárodních jednotek

v mililitru referenčního přípravku zaznamenaných

v koncovém bodě (end-point). Zkoušku lze hodnotit, jestliže

buňky toxinové kontroly jsou mrtvé a referenční antitoxin

neutralizuje alespoň v prvních dvou zkoušených ředěních.

2.7.7 STANOVENÍ ÚČINNOSTI VAKCÍNY

PROTI DÁVIVÉMU KAŠLI

(CELOBUNĚČNÉ)

7.2:20707

Účinnost vakcíny proti dávivému kašli (celobuněčné) se

stanoví porovnáním dávky potřebné na ochranu myší před

účinkem intracerebrálně podané letální dávky bakterie Bordetella

pertussis s dávkou referenčního přípravku vyjádřenou

v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou

ochranu.


množství mezinárodního standardu, kterým je určité množství

sušené vakcíny proti dávivému kašli. Hodnotu účinnosti

mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách

vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí

zdravé myši, nejvýše 5 týdnů staré, vhodného kmene,

pocházející z jednoho chovu. Rozdíl hmotnosti mezi nejtěžší

a nejlehčí myší nepřesahuje 5 g. Vytvoří se šest skupin

po nejméně šestnácti myších a čtyři skupiny po deseti myších.

Myši jsou stejného pohlaví, nebo se samci a samice

rovnoměrně rozdělí do skupin.

Výběr čelenžního kmene a příprava čelenžní suspenze.

Vybere se vhodný kmen B. pertussis, který je schopen

způsobit po intracerebrální injekci úhyn myší v průběhu

14 dnů. Kmen není vhodný, jestliže do 48 h po podání

uhyne více než 20 % myší. Připraví se subkultura kmene

a sklizené bakterie B. pertussis se suspendují v roztoku obsahujícím

hydrolyzát kaseinu R (10 g/l) a chlorid sodný R

(6 g/l) s hodnotou pH v rozmezí 7,0 až 7,2 nebo v jiném

vhodném roztoku. Změří se zákal suspenze a ve stejném

roztoku se připraví série ředění. Každému ředění se přiřadí

skupina deseti myší, kterým se intracerebrálně podá po

0,02 ml nebo 0,03 ml příslušného ředění. Po 14 dnech se

v každé skupině odečtou přežívající myši a z výsledků se

vypočítá očekávaný zákal suspenze, která bude obsahovat

100 LD50 v každé infekční dávce.

Pro zkoušení vakcíny se připraví čerstvá subkultura téhož

kmene B. pertussis a z ní suspenze bakterií se zákalem odpovídajícím

přibližně 100 LD50 v každé čelenžní dávce.

Z této suspenze se připraví tři ředění.

Stanovení účinnosti. Připraví se tři odstupňovaná ředění

zkoušené vakcíny a tři podobná ředění referenčního přípravku

tak, aby se mohlo očekávat, že střední ředění uchrání

asi 50 % myší před letálním účinkem čelenžní dávky

B. pertussis. Doporučené dávky jsou 1/8, 1/40 a 1/200 lidské

dávky zkoušené vakcíny a 0,5 m. j., 0,1 m. j. a 0,02 m. j.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 367

2.7.8 STANOVENÍ ÚČINNOSTI ADSORBOVANÉ VAKCÍNY PROTI TETANU

referenčního přípravku, tato množství jsou obsažena v objemu

nepřesahujícím 0,5 ml. Každým z těchto šesti ředění se

přiřadí jedna skupina myší o nejméně šestnácti zvířatech;

každé myši se podá intraperitoneálně jedna dávka příslušného

ředění. Za 14 až 17 dnů se všem myším podá intracerebrálně

jedna dávka čelenžní suspenze. Stejná dávka čelenžní

suspenze a z ní připravená tři ředění se intracerebrálně podá

čtyřem skupinám po deseti myších. Z hodnocení se vyloučí

všechny myši uhynulé v průběhu 48 h po čelenži. Po

14 dnech se v každé skupině odečtou přežívající myši. Na

základě počtů přežívajících zvířat v jednotlivých skupinách

(po nejméně šestnácti zvířatech) se vyhodnotí účinnost zkoušené

vakcíny v porovnání s účinností referenčního přípravku.



je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myším;

– počet myší uhynulých ve čtyřech skupinách po deseti zvířatech

po podání čelenžní suspenze a jejích ředění udává,

že čelenžní dávka byla přibližně 100 LD50;

– statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity nebo

rovnoběžnosti.


výsledky všech platných stanovení se musí sloučit.


ADSORBOVANÉ VAKCÍNY

PROTI TETANU

10.0:20708

Účinnost adsorbované vakcíny proti tetanu se stanoví po

podání vakcíny laboratorním zvířatům (morčatům nebo

myším) a následné čelenži buď tetanickým toxinem (metoda

A nebo metoda B), nebo stanovením titru protilátek proti

tetanickému toxoidu v séru morčat (metoda C). V obou případech

se účinnost vakcíny stanoví porovnáním s referenční

vakcínou kalibrovanou v mezinárodních jednotkách.

V zemích, kde není povinná metoda s paralýzou, je možno

použít pro metodu A a metodu B určení střední smrtelné

dávky (LD50). Pro ni je počet zvířat a postup totožný

s popsanou metodou paralýzy, avšak zkouška se místo podle

příznaků tetanické paralýzy hodnotí podle úhynu zvířat.

Mezinárodní jednotka je účinnost tetanického toxoidu obsažená

v deklarovaném množství mezinárodního standardu

(adsorbovaného). Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu


organizace.

Vakcína proti tetanu adsorbovaná BRP je kalibrovaná

v mezinárodních jednotkách porovnáním s mezinárodním

standardem.

Výběr metody zkoušky účinnosti adsorbované vakcíny

proti tetanu je závislý na tom, pro jaký účel je určena.

Metody A a B se používají:

1. při vývoji vakcíny ke stanovení účinnosti šarží vakcíny

vyrobených k validaci produkce;

2. kdykoliv je nutná nová validace v důsledku významných

změn výrobního postupu.

Metody A nebo B se mohou také použít pro běžné stanovení

účinnosti šarží vakcíny, ale vzhledem k ochraně

zvířat se ve všech případech, kdy je to možné, používá

metoda C.

Metoda C se může použít, kromě případů uvedených v bodech

1 a 2, po prokázání vhodnosti použití této metody pro

přípravek. Z toho důvodu se vhodný počet šarží (obvykle

tři) zkouší metodou C a metodou A nebo B.

Když se z tetanického toxoidu stejného původu připravují

různé vakcíny (monovalentní nebo složené) se srovnatelnými

hladinami stejného tetanického toxoidu (vyjádřenými

v Lf/ml), pak lze prokázání vhodnosti metody u vakcíny

s nejvyšším počtem složek přijmout jako platný i pro vakcíny

s menším množstvím složek a pro monovalentní vakcíny.

Složené vakcíny obsahující celobuněčnou pertusovu

složku nebo složku hemofilovou typu b konjugovanou ve

vakcíně s tetanickým toxoidem jako nosičem ve stejné ampulce

se musí vždy hodnotit samostatně.

Pro kombinace obsahující difterickou a tetanickou složku

se může sérologické stanovení účinnosti (metoda C) provádět

se stejnou skupinou zvířat, která se použila pro sérologické

stanovení účinnosti vakcíny proti záškrtu (2.7.6), pokud

se prokáže, že podmínky imunizace společné pro difterickou

a tetanickou složku (např. dávka, trvání) jsou platné

pro složené vakcíny.

V dále popsaném plánu stanovení účinnosti se používají

mnohonásobná ředění zkoušeného a referenčního přípravku.

Na základě výsledků zkoušky účinnosti s mnohonásobným

ředěním se může snížit potřebný počet zvířat a získat

statisticky významný výsledek použitím zjednodušeného

modelu jediného ředění zkoušeného přípravku a referenčního

přípravku. Takový model umožňuje analytikovi stanovit,

zda je účinnost zkoušeného přípravku významně

vyšší než nejnižší požadovaná, ale neposkytuje informaci

o linearitě, rovnoběžnosti a významnosti sklonu křivek závislosti

odpovědi na dávce. Zjednodušený model může vést

ke značnému snížení počtu potřebných pokusných zvířat

a jeho použití musí být v souladu s požadavky Evropské


a jiné vědecké účely (The European Convention for the

Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental

and Other Scientific Purposes).

Kde se používá stanovení s jediným ředěním, monitoruje se

trvale shodnost produkce zkoušením vhodných ukazatelů

a pravidelně, např. jednou za dva roky, se zařadí zkoušky

účinnosti s vícenásobným ředěním. Pro sérologické stanovení

účinnosti jsou vhodnými ukazateli sledování shodnosti:

– průměrná a směrodatná odchylka relativního titru protilátky

nebo bodové hodnoty (skóre) naměřené ve vzorcích

séra získaných po podání pevně stanovené dávky referenčního

přípravku;

– titry protilátek nebo bodové hodnoty (skóre) naměřené

u kontrol (vzorků pozitivních a negativních sér);

– poměr titrů protilátek nebo bodových hodnot (skóre) pozitivních

kontrolních sér a vzorků sér odpovídajících referenční

vakcíně.

METODA A. ČELENŽNÍ ZKOUŠKA NA MORČATECH


Ke zkoušce se použijí zdravá morčata z jednoho chovu, jejichž

hmotnost je v rozmezí 250 g až 350 g. Morčata jsou

stejného pohlaví, nebo se samci a samice rovnoměrně roz-

368 ČL 2017 – Dopl. 2020


dělí do skupin. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně

velkých skupin. Použije se počet zvířat ve skupině, který

stačí k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky

na platnost zkoušky. Pokud je třeba prokázat účinnost čelenžního

toxinu, přiberou se další tři skupiny po pěti morčatech

jako nevakcinované kontroly.


Zvolí se tetanický toxin obsahující v 1 ml nejméně padesátinásobek

50% paralyzující dávky. Pokud je prokázána stabilita

tohoto čelenžního toxinu, není třeba ověřovat paralyzující

dávku při každém stanovení.


Čelenžní toxin se těsně před použitím zředí vhodným ředidlem

(např. tlumivým roztokem peptonu s chloridem sodným

o pH 7,4) tak, aby se získal stabilní roztok čelenžního

toxinu obsahující v 1 ml asi padesátinásobek 50% paralyzující

dávky. Je-li třeba stanovit účinnost toxinu, zředí se

dále část roztoku čelenžního toxinu stejným ředidlem

v poměru 1 : 16, 1 : 50 a 1 : 160.


PŘÍPRAVKU


chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla

odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění při

subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) ochránilo

přibližně 50 % zvířat před paralyzujícím účinkem předepsané

dávky tetanického toxinu podaného subkutánně.




ředění. Po 28 dnech se každému zvířeti subkutánně podá

1,0 ml roztoku čelenžního toxinu (padesátinásobek 50%

paralyzující dávky).


Je-li třeba, vyberou se tři ředění čelenžního toxinu a každé

ředění se podá subkutánně po 1,0 ml každému z pěti morčat

ve skupině přiřazené příslušnému ředění toxinu. Účinnost

a stabilita čelenžního toxinu se stanoví na základě vhodného

počtu ukazatelů pro 50% paralyzující dávku. Pak není

třeba ověřovat paralyzující dávku při každém stanovení.


Zvířata se vyšetřují dvakrát denně, přičemž se vyřadí

všechna zvířata se zřetelnými příznaky tetanické paralýzy

a šetrně se utratí. Pět dnů po podání roztoku čelenžního toxinu

se spočítají zvířata bez příznaků paralýzy. Účinnost

zkoušené vakcíny se vypočítá za použití obvyklých statistických

metod (např. 5.3) porovnáním s účinností referenčního

přípravku na základě poměru počtu čelenžovaných

morčat bez příznaků paralýzy v každé skupině.





je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou morčatům;

– kde je to možné, ukázal počet paralyzovaných zvířat ve

třech skupinách s nejméně pěti zvířaty, kterým bylo

podáno ředění čelenžního toxinu, že čelenžní dávka

toxinu byla přibližně padesátinásobkem 50% paralyzující

dávky;



– statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity

a rovnoběžnosti (jsou-li zjištěny významné odchylky,

jsou ve stati 5.3 uvedeny možné alternativní postupy).


jedno stanovení, výsledky všech platných stanovení se

sloučí.

METODA B. ČELENŽNÍ ZKOUŠKA NA MYŠÍCH


Ke zkoušce se použijí zdravé myši z jednoho chovu, stáří

přibližně 5 týdnů a prokazatelně vhodného kmene. Myši

jsou stejného pohlaví, nebo se samci a samice rovnoměrně

rozdělí do skupin. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně



na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita čelenžního

toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován,

přiberou se další tři skupiny nejméně po pěti myších

jako nevakcinované kontroly.


Zvolí se tetanický toxin obsahující v 1 ml nejméně stonásobek

50% paralyzující dávky. Pokud je prokázána stabilita

čelenžního toxinu, není třeba ověřovat paralytickou dávku

při každém stanovení.


Toxin se těsně před použitím zředí vhodným ředidlem

(např. tlumivým roztokem peptonu s chloridem sodným

o pH 7,4) tak, aby se získal stabilní roztok čelenžního toxinu,

obsahující v 0,5 ml asi padesátinásobek 50% paralyzující

dávky. Je-li třeba stanovit účinnost toxinu, zředí se

dále část roztoku toxinu stejným ředidlem v poměru 1 : 16,

1 : 50 a 1 : 160.


PŘÍPRAVKU


chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla

odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění při

subkutánním podání (v dávce 0,5 ml na myš) ochránilo přibližně

50 % zvířat před paralyzujícím účinkem předepsané

dávky tetanického toxinu podaného subkutánně.


Každému ředění se přiřadí jedna skupina myší a všem myším


ředění. Po 28 dnech se každému zvířeti subkutánně podá

0,5 ml roztoku čelenžního toxinu (padesátinásobek 50%

paralyzující dávky).


Je-li třeba, vyberou se tři ředění čelenžního toxinu a každé

ředění se podá subkutánně po 0,5 ml každé z pěti myší ve

skupině přiřazené příslušnému ředění toxinu.


Zvířata se vyšetřují dvakrát denně, přičemž se vyřadí

všechna zvířata se zřetelnými příznaky tetanické paralýzy

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 369


a šetrně se utratí. Čtyři dny po podání roztoku čelenžního

toxinu se spočítají zvířata bez příznaků paralýzy. Účinnost

zkoušené vakcíny se vypočítá za použití obvyklých statistických

metod (např. 5.3) porovnáním s účinností referenčního

přípravku na základě poměru počtu čelenžovaných

zvířat bez příznaků paralýzy v každé skupině.





je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou přípravků

podaných myším;

– kde je to možné, ukázal počet paralyzovaných zvířat ve

třech skupinách po nejméně pěti myších, kterým bylo podáno

ředění čelenžního toxinu, že čelenžní dávka toxinu

byla přibližně padesátinásobkem 50% paralyzující dávky;




a rovnoběžnosti (jsou-li zjištěny významné odchylky,

jsou ve stati 5.3 uvedeny možné alternativní postupy).


jedno stanovení, výsledky všech platných stanovení se musí

sloučit.

METODA C. STANOVENÍ PROTILÁTEK U MORČAT


Ke zkoušce se použijí zdravá morčata z jednoho chovu, jejichž

hmotnost je v rozmezí 250 g až 350 g. Použijí se zvířata

stejného pohlaví, nebo se samci a samice rovnoměrně

rozdělí do skupin. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně



na platnost zkoušky. Další skupina nevakcinovaných morčat

ze stejného chovu se použije pro přípravu negativního

kontrolního séra. Je-li prokázána shodnost zkoušení, může

se jako kontrola použít referenční negativní sérum.

REFERENČNÍ PŘÍPRAVEK

Použije se vhodná referenční vakcína, jako např. vakcína

proti tetanu adsorbovaná BRP, nebo šarže vakcíny, která

byla ověřena v klinických studiích, nebo reprezentativní

šarže, která byla kalibrovaná v mezinárodních jednotkách

porovnáním s referenční vakcínou proti tetanu adsorbovanou

BRP nebo s mezinárodním standardním tetanickým

toxoidem (adsorbovaným).


PŘÍPRAVKU


chloridu sodného R (9 g/l). Vhodná jsou jednotlivá ředění

odstupňovaná 2,5násobně až 5násobně. Použijí se nejméně

tři ředění v rozsahu např. 0,5 m. j./ml až 16 m. j./ml pro

každou řadu. Imunizace se přednostně provede do jedné

hodiny od naředění. Připravená ředění se přiřadí jednotlivým

skupinám morčat.

IMUNIZACE

Každému morčeti se podá subkutánně 1,0 ml ředění, které

bylo přiřazeno jeho skupině.

ODBĚR KRVE

Za 35 až 42 dnů po imunizaci se vhodným postupem odeberou

všem imunizovaným i kontrolním morčatům vzorky

krve.


Séra se nemají často zmrazovat a rozmrazovat. Aby se zabránilo

mikrobiální kontaminaci, je vhodné provádět práci

v laminárním boxu.


Relativní titr protilátek nebo hodnota titru každého vzorku

séra se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Jako vhodné byly shledány dále uvedené metody enzymově

imunosorbentové stanovení (ELISA) a metoda inhibice

vazby toxinu (ToBi).


Vypočítá se účinnost zkoušené vakcíny v mezinárodních

jednotkách porovnáním s referenčním přípravkem za použití

obvyklých statistických metod (např. 5.3).




– interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí

50 % až 200 % stanovené účinnosti;

– při statistickém hodnocení vykazuje křivka závislosti odpovědi

na dávce významný sklon a nevykazuje odchylku

od linearity a rovnoběžnosti (jsou-li zjištěny významné

odchylky, ve stati 5.3 jsou uvedeny možné alternativní

postupy).


jedno stanovení, výsledky všech platných zkoušek se musí

sloučit.


STANOVENÍ ÚČINNOSTI VAKCÍNY PROTI

TETANU ADSORBOVANÉ: POKYNY

METODA A. ZKOUŠKA NA MORČATECH


Aby se zmírnilo utrpení pokusných zvířat, doporučuje se

zaznamenávat stupeň paralýzy na dále uvedené stupnici.

Ta udává typické příznaky v případě, že injekce čelenžního

toxinu byla podána subkutánně na přední stranu těsně za

prsní kostí jehlou vedenou směrem ke krku morčete. Stupeň

T3 se považuje za konečný bod (end-point), avšak na

základě zkušenosti může být nahrazen stupněm T2. Tetanický

toxin vyvolá alespoň v jedné horní končetině částečné

ochrnutí, po kterém následuje celková paralýza, kterou

lze v časném stadiu rozpoznat. Příznaky tetanu u morčat

jsou charakterizovány takto:

– T1: lehká ztuhlost jedné horní končetiny, nesnadno rozeznatelná;

– T2: ochrnutí jedné horní končetiny s dosud zachovanou

funkcí;

– T3: paralýza jedné horní končetiny, zvíře se pohybuje

s obtížemi, tělo je často zakřiveno do tvaru banánu následkem

skoliózy;

370 ČL 2017 – Dopl. 2020


– T4: končetina je zcela strnulá a prsty jsou nepohyblivé;

stažení svalů je velmi výrazné a zpravidla je pozorována

skolióza;

– T5: záchvat tetanu, trvalá svalová křeč;

– D: úhyn.

METODA B. ZKOUŠKA NA MYŠÍCH


Aby se zmírnilo utrpení pokusných zvířat, doporučuje se

zaznamenávat stupeň paralýzy na dále uvedené stupnici. Ta

udává typické příznaky v případě, že injekce čelenžního toxinu

byla podána do zádové oblasti v blízkosti jedné zadní

končetiny.

Stupeň T3 se považuje za konečný bod (end-point), avšak

na základě zkušenosti může být nahrazen stupněm T2.

Tetanický toxin vyvolá v dolní končetině, do které byl

vstříknut, částečné ochrnutí, po kterém následuje celková

paralýza, kterou lze v časném stadiu rozpoznat. Příznaky

tetanu u myší jsou charakterizovány takto:

– T1: lehká ztuhlost jedné končetiny, do které byl vstříknut

toxin, rozeznatelná, pouze je-li myš zvednutá za ocas;

– T2: ochrnutí končetiny, do které byl vstříknut toxin, s dosud

zachovanou schopností pohybu;

– T3: paralýza zadní končetiny, do které byl vstříknut toxin,

neschopnost pohybu;

– T4: končetina je zcela strnulá a prsty jsou nepohyblivé;

– T5: záchvat tetanu, trvalá svalová křeč;

– D: úhyn.

METODA C. STANOVENÍ PROTILÁTEK U MORČAT


Pro přípravu vzorků sér je vhodný následující postup. Zkumavky

se vzorky krve se šestkrát obrátí a nechají stát 2 h

při 37 °C a potom 2 h při 4 °C. Odstřeďují se 20 min při

teplotě místnosti při 800 g. Séra se převedou do sterilních

zkumavek a skladují se při teplotě -20 °C. Tímto postupem

se získá nejméně 40 % séra.


Stanovení ELISA a stanovení ToBi jsou uvedena jako příklady

vhodných imunochemických metod pro stanovení titru

protilátek.

Stanovení titru protilátek v morčecích sérech enzymově

imunosorbentovou zkouškou (ELISA). Ředění zkoušeného

a referenčního séra se nakapou do ELISA destiček

s navázaným tetanickým toxoidem. Pro sledování přesnosti

provedení zkoušky se na každou destičku zařadí morčecí

pozitivní a morčecí negativní sérum. Přidá se králičí nebo

kozí protimorčecí-IgG konjugovaný s peroxidasou a peroxidasový

substrát. Změří se optická hustota a relativní titr

protilátek se vypočítá obvyklými statistickými metodami

(např. 5.3).



– Antisérum proti Clostridium tetani morčecí pro vakcíny

pro humánní použití BRP (pozitivní kontrolní sérum).

– Peroxidasový konjugát. Králičí nebo kozí protimorčecí

IgG konjugovaný s peroxidasou.

– Tetanický toxoid.

– Tlumivý ochranný roztok uhličitanový o pH 9,6. Připraví

se rozpuštěním 1,59 g uhličitanu sodného bezvodého R

a 2,93 g hydrogenuhličitanu sodného R v 1000 ml vody

R. Rozplní se do lahviček o objemu 150 ml a sterilizuje

se 15 min v autoklávu při 121 °C.




R, 14,3 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu

R a 2,0 g chloridu draselného R v 1000 ml vody R.



– Roztok kyseliny citronové. Rozpustí se 10,51 g kyseliny

citronové monohydrátu R v 1000 ml vody R a pH se

upraví na hodnotu 4,0 roztokem hydroxidu sodného R

(400 g/l).



(0,5 g/l).



(0,5 g/l) a sušené odstředěné mléko (25 g/l).



-sulfonátu) R (ABTS) ve 20 ml roztoku kyseliny citronové.

Těsně před použitím se přidá 5 µl peroxidu vodíku

koncentrovaného R.

Postup

Dále uvedený popis je příkladem vhodného rozvržení destičky,

mohou se použít i jiná rozvržení. Jamky 1A až 1H

jsou určeny pro negativní kontrolní sérum a jamky 2A až

2H a 12A až 12H pro pozitivní kontrolní sérum sloužící ke

sledování zkoušky. Jamky sloupců 3 až 11 řad A až H jsou

určeny pro zkoušené vzorky.

Na povrch každé jamky ELISA destičky se naváže 100 µl

roztoku tetanického toxoidu (0,5 Lf/ml v tlumivém ochranném

roztoku uhličitanovém o pH 9,6). Nechá se stát přes

noc ve vlhké atmosféře při teplotě 4 °C. Aby se zabránilo

interferenci způsobené vzestupem teploty, neukládají se více

než čtyři destičky na sebe. Následující den se jamky důkladně

opláchnou promývacím tlumivým roztokem a blokují

se přidáním 100 µl blokačního tlumivého roztoku do

každé jamky. Inkubuje se 1 h ve vlhké atmosféře při teplotě

37 °C. Jamky se opláchnou promývacím tlumivým roztokem.

Do každé jamky, kromě jamek řady A, se přidá po

100 µl blokačního roztoku. Připraví se vhodná ředění negativního

kontrolního séra, pozitivního kontrolního séra (od

přibližně 0,01 m. j./ml) a zkoušených sér. Negativní kontrolní

sérum se umístí do sloupce 1, pozitivní kontrolní sérum

do sloupců 2 a 12 a zkoušená séra do sloupců 3 až 11.

Séra se nakapou po 100 µl do prvních dvou jamek sloupce,

pro který jsou určena. Vícekanálovou mikropipetou se připraví

dvojnásobná sériová ředění od řady B postupně

k řadě H přenášením 100 µl do následující jamky. 100 µl

z poslední řady se odstraní, všechny jamky obsahují 100 µl.

Inkubuje se 2 h při 37 °C, pak se destičky důkladně opláchnou

promývacím tlumivým roztokem. Připraví se vhodné

ředění (1 : 2000 bylo shledáno vhodným) peroxidasového

konjugátu v blokačním tlumivém roztoku a do každé jamky

se přidá po 100 µl. Inkubuje se 1 h ve vlhké atmosféře při

teplotě 37 °C. Destičky se důkladně opláchnou promývacím

tlumivým roztokem a do každé jamky se přidá po

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 371

2.7.9 ZKOUŠKA NA Fc FUNKCI IMUNOGLOBULINU

100 µl peroxidasového substrátu. Nechá se stát při teplotě

místnosti za chránění před světlem 30 min. Destičky se

odečtou při 405 nm ve stejném pořadí, v jakém byl přidáván

substrát.

Stanovení titru protilátek v morčecích sérech vazebnou

inhibicí toxinu nebo toxoidu (ToBi). Tetanický toxin nebo

toxoid se přidá k sériovým ředěním zkoušeného a referenčního

séra; směsi séra/antigenu se inkubují přes noc. Pro stanovení

nenavázaného toxinu nebo toxoidu se směsi převedou

na ELISA destičky s navázaným tetanickým antitoxinem.

Přidá se koňský antitetanický IgG konjugovaný s peroxidasou

a potom peroxidasový substrát. Změří se optická

hustota a titr protilátek se vypočítá obvyklými statistickými

metodami (např. 5.3). Pozitivní kontrolní sérum a negativní

kontrolní sérum se přidávají na každou destičku ke sledování

přesnosti provedení zkoušky.


– Mikrotitrační destičky z tvrzeného polystyrenu s jamkami

s kulatým dnem.

– ELISA destičky s jamkami s rovným dnem.

– Tetanický toxin nebo toxoid.

– Antisérum proti Clostridium tetani morčecí pro vakcíny

pro humánní použití BRP (pozitivní kontrolní sérum).

– Koňský antitetanický IgG.

– Koňský antitetanický IgG konjugovaný s peroxidasou.

– Tlumivý roztok uhličitanový o pH 9,6. Rozpustí se 1,5 g

uhličitanu sodného bezvodého R, 2,39 g hydrogenuhličitanu

sodného R a 0,2 g azidu sodného R v 1000 ml vody

R, pH se upraví na hodnotu 9,6 a sterilizuje se 20 min


– Tlumivý roztok acetátový o pH 5,5. Rozpustí se 90,2 g natrium-acetátu

bezvodého R v 900 ml vody R, pH se upraví

na hodnotu 5,5 nasyceným roztokem kyseliny citronové

monohydrátu R a zředí se vodou R na 1000 ml.


o pH 7,2 (PBS). Rozpustí se 135,0 g chloridu sodného R,

20,55 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu R

a 4,80 g dihydrogenfosforečnanu sodného monohydrátu R

ve vodě R a zředí se jí na 15 litrů. Sterilizuje se 60 min


– Ředicí tlumivý roztok. Tlumivý roztok fosforečnanový

s chloridem sodným (PBS) obsahující albumin hovězí R

(5 g/l) a polysorbát 80 R (0,5 g/l).


s chloridem sodným (PBS) obsahující albumin hovězí R

(5 g/l).

– Roztok tetramethylbenzidinu. Roztok tetramethylbenzidinu

R (6 g/l) v ethanolu 96% R. Látka se rozpouští při teplotě

místnosti do 30 min až 40 min.

– Peroxidasový substrát. Smíchá se 90 ml vody R a 10 ml

tlumivého roztoku acetátového o pH 5,5, 1,67 ml roztoku

tetramethylbenzidinu a 20 μl peroxidu vodíku koncentrovaného

R.

– Promývací roztok. Voda obsahující polysorbát 80 R

(0,5 g/l).

Postup

Polystyrenové mikrotitrační destičky s jamkami s kulatým

dnem se blokují blokačním tlumivým roztokem. Do každé

jamky se nakape po 150 µl. Destičky se zakryjí víčkem

nebo lepicí fólií a inkubují se 1 h ve vlhké atmosféře při

37 °C. Destičky se důkladně opláchnou promývacím roztokem.

Do každé jamky se nakape po 100 µl tlumivého

roztoku fosforečnanového s chloridem sodným (PBS). Do

první jamky první řady se nakape 100 µl referenčního morčecího

séra proti tetanu a do prvních jamek odpovídajícího

počtu řad se nakape po 100 µl neředěných zkoušených sér.

Vícekanálovou mikropipetou se připraví dvojnásobná sériová

ředění přenášením objemu 100 µl (až do sloupce 10).

100 µl z poslední jamky se odstraní, takže všechny jamky

obsahují 100 µl. Připraví se roztok tetanického toxinu nebo

toxoidu (0,1 Lf/ml) v tlumivém roztoku fosforečnanovém

s chloridem sodným (PBS) a po 40 µl tohoto roztoku se

přidá do všech jamek kromě jamek sloupce 12. Jamky

sloupce 11 jsou určeny pro pozitivní kontrolu. Do jamek ve

sloupci 12 se nakape po 40 µl tlumivého roztoku fosforečnanového

s chloridem sodným (PBS) (negativní kontrola).

Destičky se opatrně protřepou a zakryjí víčkem.

Navázání ELISA destiček: těsně před použitím se připraví

vhodné ředění koňského antitetanického IgG v tlumivém

roztoku uhličitanovém o pH 9,6 a přidá se po 100 µl do

všech jamek. Dvě série destiček se inkubují přes noc ve

vlhké atmosféře při 37 °C. Aby se zabránilo interferenci

způsobené vzestupem teploty, neukládají se více než čtyři

destičky na sebe. Všechny destičky se zakryjí víčkem. Následující

den se ELISA destičky důkladně opláchnou promývacím

roztokem a blokují se blokačním tlumivým roztokem,

do každé jamky se nakape po 125 µl. Inkubuje se

1 h ve vlhké atmosféře při 37 °C. Destičky se důkladně

opláchnou promývacím roztokem a do odpovídajících jamek

ELISA destiček se převede 100 µl předinkubované

směsi z polystyrenových destiček, nejprve se nakape sloupec

12, potom sloupce 1 až 11. Destičky se zakryjí víčkem

a inkubují se 2 h ve vlhké atmosféře při teplotě 37 °C. Destičky

ELISA se důkladně opláchnou promývacím roztokem.

Připraví se vhodné ředění (jako vhodné bylo shledáno

ředění 1 : 4000) koňského antitetanického IgG konjugovaného

s peroxidasou v ředicím tlumivém roztoku. Do každé

jamky se přidá po 100 µl naředěného roztoku, destičky se

zakryjí víčkem a inkubují se 1,5 h ve vlhké atmosféře při

teplotě 37 °C. Destičky ELISA se důkladně opláchnou promývacím

roztokem, potom se přidá do každé jamky po

100 µl peroxidasového substrátu, vytvoří se modré zbarvení.

Destičky se inkubují při teplotě místnosti. Ve stanoveném

čase (do 10 min) se reakce zastaví přidáním 100 µl

roztoku kyseliny sírové (2 mol/l), připravené z kyseliny sírové

R, do každé jamky ve stejném pořadí, v jakém se přidával

substrát; modré zbarvení se změní na žluté. Měří se

absorbance při 450 nm ihned po přidání kyseliny sírové

nebo se destičky uchovávají v temnu do odečtení.

2.7.9 ZKOUŠKA NA Fc FUNKCI

IMUNOGLOBULINU

9.3:20709

Zkouška se provádí za použití metody A nebo B. Metoda B

je metoda A přizpůsobená k měření hemolýzy účinkem komplementu

za použití mikrotitračních destiček. Rozdíly v postupech

mezi metodami A a B jsou uvedeny ve zkoušce.

372 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.9 ZKOUŠKA NA Fc FUNKCI IMUNOGLOBULINU

ZKOUMADLA

Stabilizovaná lidská krev. Lidská krev skupiny 0 se odebere

do antikoagulačního roztoku ACD. Stabilizovaná krev se

uchovává při 4 °C nejdéle 3 týdny.

Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným o pH 7,2.

1,022 g hydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R,

0,336 g dihydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R

a 8,766 g chloridu sodného R se rozpustí v 800 ml vody R

a zředí se jí na 1000 ml.

Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého

R a 5,083 g chloridu hořečnatého R se rozpustí ve

vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného

R a 25,48 g barbitalu sodné soli R se rozpustí ve

4000 ml vody R a pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou

1 mol/l RS na hodnotu 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku

hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Roztok

se skladuje v průhledných obalech při 4 °C.

Tlumivý roztok barbitalový s albuminem. 0,150 g albuminu

hovězího R se rozpustí ve 20 ml zásobního tlumivého roztoku

barbitalového a zředí se vodou R na 100 ml. Připraví

se těsně před použitím.

Roztok taninu. 10 mg taninu R se rozpustí ve 100 ml tlumivého

roztoku fosforečnanového s chloridem sodným

o pH 7,2. Připraví se těsně před použitím.

Morčecí komplement. Z krve nejméně deseti morčat se připraví

směsné sérum. Oddělí se od sražené krve odstředěním

při asi 4 °C. Sérum se skladuje v malých množstvích při

teplotě nižší než –70 °C. Těsně před zahájením hemolýzy

účinkem komplementu se sérum naředí tlumivým roztokem

barbitalovým s albuminem na 125 až 200 CH50 v mililitru

a po dobu zkoušky se uchovává v lázni s ledem.

Antigen zarděnek. Zvolí se antigen zarděnek, který je vhodný

na stanovení titru v hemaglutinačně inhibičním testu (titru

HIT). Titr je větší než 256 HA jednotek.

Příprava taninovaných lidských erytrocytů. Z dostatečného

objemu stabilizované lidské krve se odstředěním oddělí

lidské erytrocyty. Nejméně třikrát se promyjí tlumivým

roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,2

a připraví se 2% (V/V) suspenze v tlumivém roztoku fosforečnanovém

s chloridem sodným o pH 7,2. Ke 14,8 ml tlumivého

roztoku fosforečnanového s chloridem sodným

o pH 7,2 se přidá 0,2 ml roztoku taninu. Smíchá se 1 objemový

díl čerstvě připraveného roztoku taninu s 1 objemovým

dílem suspenze lidských erytrocytů a směs se inkubuje

10 min při 37 °C. Erytrocyty se oddělí odstředěním

(10 min při 800 g), supernatantní tekutina se odstraní, erytrocyty

se jednou promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným o pH 7,2 a taninované erytrocyty

se resuspendují v tlumivém roztoku fosforečnanovém

s chloridem sodným o pH 7,2 na koncentraci 1% (V/V).

Taninované lidské erytrocyty s antigenem. Potřebný objem

(Vs) taninovaných erytrocytů se smíchá s antigenem zarděnek

v poměru 0,2 ml antigenu na 1,0 ml suspenze taninovaných

krvinek a inkubuje se 30 min při 37 °C. Erytrocyty

se oddělí odstředěním (10 min při 800 g). Supernatantní

tekutina se odstraní a nahradí se stejným objemem

tlumivého roztoku barbitalového s albuminem. Erytrocyty

se resuspendují, oddělí se popsaným způsobem a promývací

postup se opakuje. Resuspenduje se v tlumivém roztoku

barbitalovém s albuminem za použití objemu odpovídajícího

3/4 objemu Vs. Pro tento objem se zavede označení počáteční

objem (Vi). Z něho se odebere 100 µl a zbylý objem

se označí (Vr). K odebranému vzorku 100 µl se přidá 900 µl

tlumivého roztoku barbitalového s albuminem a stanoví se

počáteční absorbance při 541 nm (A). Při naředění objemu

(Vr) tlumivým roztokem barbitalovým s albuminem na

A-násobnou hodnotu podle vzorce Vf = Vr A se získá konečný

nastavený objem senzibilizovaných lidských erytrocytů

(Vf) a hodnota A se nastaví na 1,0 ±0,1 pro desetinásobné

ředění.

Vazba protilátky na taninované lidské erytrocyty s antigenem.

Následující roztoky se připravují postupně a dvojmo.

Pro každý roztok se používá samostatná semimikrokyveta

(např. na jedno použití) nebo zkumavka.

1. Zkoušené roztoky. Je-li třeba, upraví se pH zkoušeného

přípravku na hodnotu 7.

Kde se provádí metoda A, zředí se objem zkoušeného

přípravku tlumivým roztokem barbitalovým s albuminem

tak, aby obsahoval 30 mg a 40 mg imunoglobulinu

a objem se upraví tlumivým roztokem barbitalovým

s albuminem na 900 µl.

Kde se provádí metoda B, zředí se objem zkoušeného

přípravku tlumivým roztokem barbitalovým s albuminem

tak, aby obsahoval 15 mg a 30 mg imunoglobulinu

a objem se upraví tlumivým roztokem barbitalovým

s albuminem na 1200 µl.

2. Porovnávací roztoky. Připraví se stejným způsobem jako

zkoušené roztoky za použití imunoglobulinu lidského

pro Fc funkci BRP.

3. Kontrola komplementu. Používá se tlumivý roztok barbitalový

s albuminem.

Kde se provádí metoda A, přidá se do každé kyvety/zkumavky

100 µl suspenze senzibilizovaných lidských erytrocytů.

Obsah se dobře promíchá. Nechá se stát 15 min, přidá se

1000 µl tlumivého roztoku barbitalového s albuminem

a erytrocyty se oddělí odstředěním kyvet/zkumavek (10 min

při 1000 g). Odstraní se 1900 µl supernatantní tekutiny

a nahradí se 1900 µl tlumivého roztoku barbitalového

s albuminem. Celý promývací postup se opakuje. Supernatantní

tekutina se opět odstraní a nakonec se ponechá objem

200 µl. Zkoušené vzorky se mohou uchovávat v dobře uzavřených

kyvetách/zkumavkách při 4 °C nejvýše 24 h.

Kde se provádí metoda B, přidá se do každé zkumavky

300 µl suspenze senzibilizovaných lidských erytrocytů.

Obsah se dobře promíchá (konečná koncentrace imunoglobulinu

je v rozmezí 10 mg/ml až 20 mg/ml). Nechá se stát

15 min, přidá se 1500 µl tlumivého roztoku barbitalového

s albuminem a zhomogenizuje se mírným mícháním. Erytrocyty

se oddělí odstředěním zkumavek (10 min při

1000 g), odstraní se supernatantní tekutina a přidají se asi

3 ml tlumivého roztoku barbitalového s albuminem. Celý

promývací postup se opakuje čtyřikrát, nakonec se ponechá

objem 300 µl. Zkoušené vzorky se mohou uchovávat

v dobře uzavřených zkumavkách při 4 °C nejvýše 24 h.

Hemolýza vyvolaná komplementem. Kde se provádí metoda

A, přidá se ke zkoušenému vzorku 600 µl tlumivého

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 373

2.7.10 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO KOAGULAČNÍHO FAKTORU VII

roztoku barbitalového s albuminem předehřátým na 37 °C.

Buňky se pečlivě resuspendují opakovaným pipetováním

(nejméně pětkrát) a kyveta se umístí do nosiče spektrofotometru

vybaveného termostatem. Po 2 min se přidá 200 µl

zředěného morčecího komplementu (125 až 200 CH50/ml).

Obsah se důkladně promíchá dvojnásobným pipetováním.

Po druhém pipetování se okamžitě zahájí zaznamenávání

absorbance při 541 nm v závislosti na čase. Tlumivý roztok

barbitalový s albuminem se použije jako kontrolní tekutina.

Měření se zastaví, když časová závislost absorbance jasně

překročí inflexní bod.

Kde se provádí metoda B, přidá se ke každé zkumavce se

zkoušeným vzorkem 900 µl tlumivého roztoku barbitalového

s albuminem předehřátého na 37 °C. Buňky se pečlivě

resuspendují opakovaným pipetováním (nejméně pětkrát).

Mikrotitrační destička se musí před zahájením zkoušky

předehřát na 37 °C. Do čtyř jamek mikrotitrační destičky se

převede po 240 µl každého roztoku a inkubuje se 6 min při

37 °C, každých 10 s se mírně promíchá. Do každé jamky

mikrotitrační destičky se přidá 60 µl zředěného morčecího

komplementu (150 CH50/ml), míchá se 10 s a okamžitě se

zahájí zaznamenávání absorbance při 541 nm při 37 °C,

měří se každých 20 s. Měření se zastaví, když časová závislost

absorbance jasně překročí inflexní bod.

Hodnocení. Pro každou kyvetu/zkumavku/jamku destičky

se stanoví strmost (S) křivky hemolýzy přibližně v inflexním

bodě rozdělením nejstrmější části na vhodné časové intervaly

(například Dt = 1 min) a vypočítá se S přiléhajících

bodů průniku vyjádřená jako změny absorbance DA za minutu.

Největší hodnota S je hledaná strmost v inflexním

bodě (Sexp). Stanoví se ještě absorbance na počátku měření

(As) extrapolací křivky, která je v prvních několika minutách

téměř lineární a rovnoběžná s časovou osou. Strmost

(Sexp) se koriguje pomocí vzorce:

Vypočítá se aritmetický průměr korigovaných hodnot strmosti

(S’) pro každý přípravek (zkoušený a porovnávací

roztok). Pro funkci Fc se vypočítá index (IFc) podle vzorce:

v němž značí:

S '

' S s

' S c

I

Fc

S

S ' =

A

100 ×

' '

ç

æ S - Sc

÷

ö

=

è ø ,

S

'

- S

'

– aritmetický průměr korigované strmosti pro zkoušený

přípravek;

– aritmetický průměr korigované strmosti pro referenční

přípravek;

– aritmetický průměr korigované strmosti pro kontrolu

komplementu.

Vypočítá se index Fc funkce zkoušeného přípravku: hodnota

není menší než hodnota uvedená v příbalové informaci

referenčního přípravku.

s

exp

s

.

c


KOAGULAČNÍHO FAKTORU VII

6.0:20710

Při stanovení účinnosti koagulačního faktoru VII se využívá

jeho biologické aktivity v komplexu faktor VIIa-tkáňový

faktor při aktivaci faktoru X za přítomnosti vápenatých iontů

a fosfolipidů. Účinnost faktoru VII se stanoví porovnáním

množství přípravku potřebného k dosažení určité rychlosti

tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky

účastnící se aktivace faktoru X s množstvím mezinárodního

standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních

jednotkách, které je třeba k dosažení stejné

rychlosti tvorby faktoru Xa.

Mezinárodní jednotka faktoru VII je aktivita deklarovaného

množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná

plazma. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních


Lidský koagulační faktor VII koncentrát BRP je kalibrován


standardem.

Chromogenní stanovení účinnosti se skládá ze dvou následujících

kroků: z aktivace faktoru X reakční směsi, která

obsahuje tkáňový faktor, fosfolipidy a vápenaté ionty a závisí

na faktoru VII, a z následného enzymatického štěpení chromogenního

substrátu faktoru Xa na chromofor, jehož množství

se může stanovit spektrofotometricky. Za vhodných podmínek

stanovení účinnosti je závislost mezi rychlostí tvorby

faktoru Xa a koncentrací faktoru VII lineární. Stanovení

účinnosti se dá shrnout do následujícího schématu:

krok 1:

a) faktor VII

b) faktor X

krok 2:

chromogenní substrát

tkáňový faktor, Ca 2+

tkáňový faktor, Ca 2+

tkáňový faktor/fosfolipid

faktor Xa

faktor VIIa

faktor Xa

peptid + chromofor

Oba kroky používají zkoumadla, která lze komerčně získat

z různých zdrojů. I když se složení jednotlivých zkoumadel

může lišit, jejich nezbytné vlastnosti jsou popsány v následující

specifikaci.

ZKOUMADLA

Zkoumadlo koagulačního faktoru zahrnuje purifikované bílkoviny

lidského nebo hovězího původu. Zahrnuje faktor X

a tromboplastinový tkáňový faktor/fosfolipid jako aktivátor

faktoru VII. Tyto bílkoviny jsou částečně purifikované a neobsahují

nečistoty, které zasahují do aktivace faktoru VII nebo

faktoru X. Faktor X je přítomen v množství, které během

prvního kroku stanovení poskytuje konečnou koncentraci

10 nmol/l až 350 nmol/l, přednostně 14 nmol/l až 70 nmol/l.

Jako tkáňový faktor/fosfolipid se mohou používat tromboplastin

přírodního původu (hovězí nebo králičí mozek) nebo

syntetické přípravky. Tromboplastin vhodný ke stanovení

protrombinového času se ředí 1 : 5 až 1 : 50 tlumivým roztokem

na konečnou koncentraci vápenatých iontů 15 mmol/l

374 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.11 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO KOAGULAČNÍHO FAKTORU IX

až 25 mmol/l. Konečná tvorba faktoru Xa probíhá v roztoku,

který obsahuje lidský nebo hovězí albumin v takové koncentraci,

že nedochází k adsorpčním ztrátám, a jehož pH bylo

vhodně upraveno na hodnotu 7,3 až 8,0. V konečné inkubační

směsi musí být faktor VII jedinou složkou limitující rychlost

tvorby faktoru Xa a žádná složka zkoumadla nesmí mít

vlastní schopnost tvořit faktor Xa.

Ve druhém kroku se určí množství vytvořeného faktoru Xa

za použití chromogenního substrátu specifického pro faktor

Xa. Obvykle je tvořen krátkým peptidem o třech až pěti

aminokyselinách, vázaným na chromoforovou skupinu. Při

odštěpení této skupiny z peptidového substrátu se její absorpční

maximum posune k vlnové délce umožňující spektrofotometrické

stanovení jejího množství. Substrát se obvykle

rozpustí ve vodě R a používá se ve výsledné koncentraci

0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může také obsahovat

vhodné inhibitory k zastavení další tvorby faktoru Xa (přidání

edetátu).

POSTUP STANOVENÍ ÚČINNOSTI

Rekonstituuje se celý obsah jedné ampule referenčního přípravku

a zkoušeného přípravku přidáním vhodného množství

vody R; použijí se během 1 h. Rekonstituované přípravky

se dále zředí na roztoky obsahující 0,5 m. j. až 2,0 m. j.

faktoru VII v mililitru.

Připraví se další ředění referenčního a zkoušeného přípravku

za použití izotonického tlumivého roztoku bez chelatotvorných

látek, s obsahem 1 % hovězího nebo lidského albuminu

a hodnotou pH přednostně 7,3 až 8,0. Připraví se

nejméně dvě série tří oddělených nezávislých ředění pro

každý materiál. Ředění se připraví tak, aby konečná koncentrace

faktoru VII byla nižší než 0,005 m. j. v mililitru.

Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky

kromě faktoru VII.

Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastů a použijí

se během 1 h.

Krok 1. Ředění referenčního přípravku faktoru VII a zkoušeného

přípravku se smíchají se vhodným objemem předehřátého

zkoumadla koagulačního faktoru nebo s kombinací

jeho jednotlivých složek a směs se inkubuje ve zkumavkách

z plastu nebo v jamkách mikrotitrační destičky při 37 °C.

Koncentrace různých složek během tvorby faktoru Xa musí

odpovídat specifikaci uvedené výše v popisu zkoumadla.

Aktivace faktoru X se nechá probíhat po vhodnou dobu.

Obvykle se reakce ukončí předtím, než koncentrace faktoru

Xa dosáhne své maximální hladiny, aby se docílila uspokojivá

lineární závislost mezi dávkou a odpovědí. Doba aktivace

se volí také tak, aby tvorba faktoru Xa byla lineárně

závislá na čase. Vhodné doby aktivace jsou obvykle 2 min

a 5 min, ale odchylky jsou přípustné, pokud se tím dosáhne

přijatelné linearity vztahu mezi dávkou a odpovědí.

Krok 2. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla

obsahujícího chromogenní substrát. Kvantitativně se stanoví

rychlost štěpení substrátu, která musí v lineárním vztahu

záviset na koncentraci vzniklého faktoru Xa, měřením změny

absorbance při vhodné vlnové délce za použití spektrofotometru.

Absorbance se sleduje buď kontinuálně, což umožňuje

vypočítat počáteční rychlost štěpení substrátu, nebo se po

vhodné době ukončí hydrolýza snížením pH přidáním vhodného

zkoumadla, jako je kyselina octová (500 g/l C2H4O2)

nebo roztok citrátu (1 mol/l) na hodnotu pH 3. Doba hydrolýzy

se nastaví tak, aby se dosáhlo lineární tvorby chromoforu

v závislosti na čase. Vhodná doba hydrolýzy je obvykle

3 min až 15 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud se tím

dosáhne lepší lineární závislosti odpovědi na dávce.

Zkontroluje se validita stanovení a vypočítá se účinnost

zkoušeného přípravku obvyklými statistickými metodami

(např. 5.3).


KOAGULAČNÍHO FAKTORU IX

6.0:20711

Podstatou stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru

IX je schopnost zkrátit čas srážení plazmy zbavené faktoru

IX přípravkem faktoru IX. Reakce se urychlí přidáním

zkoumadla obsahujícího fosfolipid a aktivátor kontaktu,

např. kaolin, oxid křemičitý, kyselinu elagovou. Účinnost

se hodnotí porovnáním křivky závislosti odpovědi na dávce

pro zkoušený přípravek a pro referenční přípravek kalibrovaný


Mezinárodní jednotka je aktivita deklarovaného množství

mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncentrát

lidského koagulačního faktoru IX. Hodnotu účinnosti

mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje


Faktor IX koagulační lidský koncentrát BRP je kalibrován


standardem.

Zkoušený přípravek a referenční přípravek se odděleně rekonstituují

podle návodu uvedeného v označení na obalu

a ihned se použijí. Kde je to vhodné, stanoví se množství

přítomného heparinu (2.7.12) a heparin se neutralizuje

např. přidáním protamin-sulfátu R (10 μg protamin-sulfátu

neutralizuje 1 m. j. heparinu). Zkoušený přípravek a referenční

přípravek se zředí plazmou prostou faktoru IX (např.

plazma substrát R2) na roztoky obsahující 0,5 m. j./ml až

2,0 m. j./ml. Připraví se nejméně dvě série tří dalších ředění

každého zředěného přípravku za použití vhodného tlumivého

roztoku (např. tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 R)

s obsahem albuminu hovězího (10 g/l) nebo albuminu lidského

(10 g/l) a ihned se použijí.

Použije se přístroj vhodný pro měření času koagulace nebo

se stanovení provede v inkubačních zkumavkách ve vodní

lázni při 37 °C. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml plazmy

prosté faktoru IX (např. plazma substrátu R2) a 0,1 ml jednoho

z ředění referenčního nebo zkoušeného přípravku. Do

každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného zkoumadla pro

Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) obsahujícího

fosfolipid a aktivátor kontaktu a směs se inkubuje

doporučenou dobu při 37 °C. Do každé zkumavky se přidá

0,1 ml roztoku chloridu vápenatého R (3,7 g/l) předem zahřátého

na 37 °C. Pomocí stopek se změří čas koagulace,

tj. interval mezi přidáním chloridu vápenatého a prvními

známkami tvorby fibrinu. Výše uvedené objemy se mohou

přizpůsobit podle zkoumadla pro Aktivovaný parciální

tromboplastinový čas a podle použitého přístroje.

Účinnost se vypočítá za použití obvyklých statistických

metod (např. 5.3).

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 375

2.7.12

STANOVENÍ ÚČINNOSTI HEPARINU V KOAGULAČNÍCH FAKTORECH


V KOAGULAČNÍCH FAKTORECH

6.0:20712

Heparin se stanoví jako komplex s antitrombinem III (AT)

jeho inhibicí účinnosti koagulačního faktoru Xa (anti Xa

účinnost). Přebytek antitrombinu III se v reakční směsi udržuje

k zajištění stálé koncentrace komplexu antitrombinu

III s heparinem. Faktor Xa se neutralizuje komplexem

antitrombinu III s heparinem a zbylý faktor Xa hydrolyzuje

specifický chromogenní peptidový substrát, čímž uvolňuje

chromofor. Množství chromoforu je nepřímo úměrné účinnosti

heparinu.

Chromogenní substrát faktoru Xa. Specifický chromogenní

substrát pro faktor Xa, jako je N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginin-4-nitroanilid-hydrochlorid.

Rekonstituuje

se podle pokynů výrobce.

Ředicí tlumivý roztok. Roztok trometamolu R (6,05 g/l).

Je-li třeba, upraví se pH kyselinou chlorovodíkovou R na

hodnotu 8,4.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí ředicím tlumivým

roztokem na roztok obsahující asi 0,1 m. j. heparinu

v mililitru.

Porovnávací roztok. Referenční přípravek heparinu se zředí

ředicím tlumivým roztokem na koncentraci 0,1 m. j. heparinu

v mililitru.

Následující pracovní podmínky jsou uvedeny pro mikrotitrační

destičky. Provádí-li se stanovení ve zkumavkách,

upraví se objemy tak, aby se poměry ve směsi nezměnily.

Všechny roztoky se krátce před zkouškou ohřejí ve vodní

lázni na 37 °C.

Do sérií jamek se napipetuje po 20 μl normální lidské plazmy

a 20 μl antitrombinu III RS1. Do jamek se přidají série

objemů (20 μl, 60 μl, 100 μl a 140 μl) zkoušeného roztoku

nebo porovnávacího roztoku a objem v každé jamce se doplní

ředicím tlumivým roztokem na 200 μl (konečná reakční

směs obsahuje 0,02 m. j. až 0,08 m. j. heparinu v mililitru).

Metoda konečného bodu (end-point). Z každé jamky se přenese

po 40 μl do druhé série jamek, přidá se 20 μl faktoru

koagulačního hovězího Xa RS a 30 s se inkubuje při 37 °C.

Přidá se 40 μl roztoku chromogenního substrátu pro faktor

Xa (1 mmol/l) a inkubuje se 3 min při 37 °C. Reakce se

ukončí snížením pH vhodným zkoumadlem, jako je roztok

kyseliny octové ledové R 20% (V/V), a měří se absorbance při

405 nm (2.2.25). Vhodné reakční časy jsou obvykle v rozmezí

3 min až 15 min, ale jsou povoleny odchylky, pokud se tak

dosáhne lepší lineární závislosti odpovědi na dávce.

Kinetická metoda. Z každé jamky se přenese 40 μl do druhé

série jamek, přidá se 20 μl faktoru koagulačního hovězího

Xa RS a 30 s se inkubuje při 37 °C. Přidá se 40 μl roztoku

chromogenního substrátu pro faktor Xa (2 mmol/l), inkubuje

se při 37 °C a stanoví se rychlost štěpení substrátu

kontinuálním měřením změn absorbance při 405 nm

(2.2.25) tak, aby bylo možno vypočítat počáteční rychlost

štěpení substrátu. Tato rychlost musí být lineární ve vztahu

ke koncentraci zbylého faktoru Xa.

Obvyklými statistickými metodami pro stanovení poměru

sklonů (např. 5.3) se zkontroluje platnost stanovení a vypočítá

se účinnost heparinu zkoušeného přípravku.


IMUNOGLOBULINU ANTI-D

7.5:20713

METODA A

Účinnost lidského imunoglobulinu anti-D se stanoví porovnáním

množství, které je třeba k aglutinaci D-pozitivních

erytrocytů, s množstvím referenčního přípravku kalibrovaného

v mezinárodních jednotkách, které je třeba k dosažení

stejného účinku.


množství mezinárodního referenčního přípravku. Hodnotu

účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních


Imunoglobulin anti-D lidský BRP je kalibrován v mezinárodních

jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem

a je určen pro stanovení účinnosti lidského imunoglobulinu

anti-D.

Použije se směs D-pozitivních erytrocytů, ne starších než

7 dnů, vhodně skladovaných a získaných od nejméně čtyř

dárců krve s krevní skupinou 0 R1R1. Ke vhodnému objemu

krvinek třikrát předem promytých roztokem chloridu sodného

R (9 g/l) se přidá stejný objem bromelinů RS, nechá se

10 min stát při 37 °C, odstředí se, supernatantní tekutina se

odstraní a krvinky se třikrát promyjí roztokem chloridu

sodného R (9 g/l). 20 objemových dílů erytrocytů se suspenduje

ve směsi 15 objemových dílů inertního séra,

20 objemových dílů roztoku albuminu hovězího R (300 g/l)

a 45 objemových dílů roztoku chloridu sodného R (9 g/l).

Vzniklá suspenze se vloží do vodní lázně s ledem a stále se

promíchává.

Použitím automatického kalibrovaného dilutoru se připraví

vhodná ředění zkoušeného a referenčního přípravku. K ředění

se použije roztok albuminu hovězího R (5 g/l) v roztoku

chloridu sodného R (9 g/l).

Použije se vhodný přístroj pro automatickou kontinuální

analýzu. Pro analýzu se obvykle použije trubice, jejíž teplota,

kromě inkubačních spirál, se udržuje na 15,0 °C. Do

trubice přístroje se vpraví suspenze erytrocytů rychlostí

0,1 ml/min a roztok methylcelulosy 450 R (3 g/l) rychlostí

0,05 ml/min. Ředění zkoušeného a referenčního přípravku

se přivádějí rychlostí 0,1 ml/min po dobu 2 min a po každém

z nich se před zavedením dalšího ředění provede

opláchnutí ředicím roztokem rychlostí 0,1 ml/min po dobu

4 min.

Vzduch se přivádí rychlostí 0,6 ml/min. Inkubuje se 18 min

při 37 °C a potom se shluk rozptýlí přivedením roztoku chloridu

sodného R (9 g/l) obsahujícího vhodné smáčedlo (např.

polysorbát 20 R v konečné koncentraci 0,2 g/l), rychlostí

1,6 ml/min, aby se zabránilo porušení bublinové struktury.

Aglutináty se nechají sedimentovat a dvakrát se promyjí,

nejprve při rychlosti 0,4 ml/min a potom při 0,6 ml/min. Neaglutinované

erytrocyty se lyzují roztokem, který obsahuje

oktoxinol 10 R (5 g/l), hexakyanidoželezitan draselný R

(0,2 g/l), hydrogenuhličitan sodný R (1 g/l) a kyanid draselný

R (0,05 g/l), přiváděným rychlostí 2,5 ml/min. Aby se

umožnila konverze hemoglobinu, zavede se desetiminutová

prodlévající spirála. Průběžně se zaznamenává absorbance

(2.2.25) hemolyzátu při vlnové délce 540 nm až 550 nm.

376 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.13 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO IMUNOGLOBULINU ANTI-D

Stanoví se rozmezí koncentrací protilátky, v němž je lineární

závislost mezi koncentrací a výslednou změnou absorbance

(DA). Z výsledků se sestrojí standardní křivka

a její lineární část se použije ke stanovení účinnosti zkoušeného

přípravku.

Vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku za použití obvyklých

statistických metod (5.3).

METODA B

Účinnost lidského imunoglobulinu anti-D se stanoví srovnávací

enzymovou imunoanalýzou na mikrotitračních destičkách

potažených erytrocyty. Metoda je založena na kompetitivní

vazbě mezi polyklonálním imunoglobulinovým

anti-D přípravkem a biotinylovanou monoklonální protilátkou

anti-D zaměřenou proti specifickému epitopu u D-antigenu.

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním

s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních

jednotkách.








anti-D.

MATERIÁLY

Nespecifikovaná zkoumadla mají analytický stupeň jakosti.

Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným. 8,0 g

chloridu sodného R, 0,76 g hydrogenfosforečnanu sodného

bezvodého R, 0,2 g chloridu draselného R, 0,2 g dihydrogenfosforečnanu

draselného R a 0,2 g azidu sodného R se

rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml.

Tlumivý roztok trometamolový s chloridem sodným. 8,0 g

chloridu sodného R a 0,6 g trometamolu R se rozpustí ve vodě

R, pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou (1 mol/l) RS

na hodnotu 7,2 a zředí se vodou R na 1000 ml.

Roztok papainu. Připraví se roztok mícháním 1 g papainu R

v 10 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 5,4

(0,067 mol/l) R po dobu 30 min při 37 °C, odstředěním

5 min při 10 000 g a zfiltrováním membránovým filtrem

(jmenovitá velikost pórů 0,22 µm). K aktivaci se smíchá

1 ml filtrátu s 1 ml roztoku L-cysteinu R (48,44 g/l) a 1 ml

roztoku dinatrium-edetátu R (3,72 g/l) a zředí se tlumivým

roztokem fosforečnanovým o pH 5,4 (0,067 mol/l) R na

10 ml. Rozplněný se zamrazí při teplotě –20 °C nebo nižší.

Erytrocyty. Použije se směs D-pozitivních erytrocytů, získaná

od nejméně tří dárců skupiny 0 R2R2. Krvinky se

promyjí čtyřikrát tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným a odstřeďují se 5 min při 1800 g.

Vhodný objem předehřátého buněčného sedimentu se smíchá

s vhodným objemem předehřátého papainového roztoku

(vhodný poměr je 2 : 1) a inkubuje se 10 min při 37 °C.

Krvinky se promyjí čtyřikrát tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným a uchovávají se ve vhodném

stabilizátoru až 1 týden při 4 °C.

Biotinylovaný Brad-5. Použije se podle návodu výrobce.

Alkalická fosfatasa konjugovaná se zkoumadlem avidin/ streptavidinovým.

Přednostně se použije kombinace vysoce specifické

účinnosti s nízkou nespecifickou vazbou. Použije se podle

návodu výrobce.

Roztok substrátu. Použije se para-nitrofenylfosfát podle

návodu výrobce.

Tlumivý roztok pro fixaci krvinek. 18,02 g glukosy R, 4,09 g

chloridu sodného R, 1,24 g kyseliny borité R, 10,29 g natrium-citrátu

R a 0,74 g dinatrium-edetátu R se rozpustí ve

vodě R, pH se upraví na hodnotu 7,2 až 7,3 za použití hydroxidu

sodného 1 mol/l RS nebo kyseliny chlorovodíkové

1 mol/l RS a zředí se vodou R na 1000 ml. Skladuje se

při 4 °C a přímo se použije.

Roztok glutaraldehydu. Těsně před použitím se přidá 750 µl

roztoku glutaraldehydu R (250 g/l) k 50 ml chladného tlumivého

roztoku fosforečnanového s chloridem sodným.

Mikrotitrační destičky. Destičky k potažení erytrocyty jsou

polystyrenové destičky s plochým dnem s povrchovými

vlastnostmi optimalizovanými pro enzymové imunologické

stanovení obsahu a s vysokou kapacitou bílkovinové vazby.

Destičky používané k přípravě imunoglobulinových ředění

jsou polystyrenové nebo polyvinylchloridové destičky

s jamkami tvaru U nebo V.

POSTUP

Připraví se suspenze 0,1% (V/V) erytrocytů ošetřených papainem

v chladném fixačním roztoku. Do každé jamky mikrotitrační

destičky s plochým dnem se pipetuje 50 µl.

Destička se odstřeďuje 3 min při 350 g, přednostně při

4 °C. Supernatantní tekutina se neodstraňuje, do každé jamky

se opatrně přidá po 100 µl roztoku glutaraldehydu a nechá

se stát 10 min.

Jamky se vylijí rychlým převrácením destičky a promyjí se

třikrát 250 µl až 300 µl tlumivého roztoku fosforečnanového

s chloridem sodným. To se může provést ručně nebo za

použití vhodné automatické promývačky. Buď se provede

dále popsané stanovení, nebo se destička po vylití tlumivého

roztoku fosforečnanového s chloridem sodným a po přidání

100 µl tlumivého roztoku pro fixaci buněk do každé

jamky a překrytí plastovou fólií uchová. Destičky se mohou

uchovávat nejdéle měsíc při teplotě 4 °C.

Zkoušené roztoky. Lyofilizované přípravky se rekonstituují

podle údaje uvedeného v označení na obalu. Připraví se

čtyři nezávislé vzorky pěti sérií dvojnásobných ředění, počínaje

30 m. j./ml v tlumivém roztoku fosforečnanovém

s chloridem sodným obsahujícím albumin hovězí R (10 g/l).

Pokud je to nutné, nastaví se počáteční ředění tak, aby se

získaly odpovědi spadající do lineární části křivky dávka-

-odpověď.

Porovnávací roztoky. Lyofilizovaný referenční přípravek se

rekonstituuje podle návodu. Připraví se čtyři nezávislé vzorky

pěti sérií dvojnásobných ředění, počínaje 30 m. j./ml

v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným

obsahujícím albumin hovězí R (10 g/l).

Do jamek mikrotitrační destičky ve tvaru U nebo V se

vpraví 35 µl každého ředění zkoušeného roztoku nebo porovnávacího

roztoku. Do každé jamky se přidá po 35 µl

biotinylovaného Brad-5 roztoku v koncentraci 250 ng/ml.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 377

2.7.13 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO IMUNOGLOBULINU ANTI-D

Jamky destičky potažené erytrocyty se vyprázdní převrácením

na papírovou utěrku a odsátím. Přidá se 250 µl tlumivého

roztoku fosforečnanového s chloridem sodným obsahujícího

albumin hovězí R (20 g/l) a ponechá se 30 min při

teplotě místnosti.

Jamky destičky potažené erytrocyty se opět vyprázdní převrácením

a odsátím do papírové utěrky a převede se do

nich 50 µl ředění zkoušeného roztoku nebo porovnávacího

roztoku obsahujícího biotinylovaný Brad-5. Jako negativní

kontrola se použije 50 µl tlumivého roztoku fosforečnanového

s chloridem sodným obsahujícího albumin hovězí R

(10 g/l). Destička se uzavře plastovou fólií a inkubuje se

1 h při teplotě místnosti.

Z jamek destičky potažené erytrocyty se odstraní tekutina

a promyjí se třikrát 250 µl až 300 µl tlumivého roztoku trometamolového

s chloridem sodným.

Do každé jamky se přidá po 50 µl alkalické fosfatasy konjugované

se zkoumadlem avidin/streptavidinovým v tlumivém

roztoku trometamolovém s chloridem sodným obsahujícím

albumin hovězí R (10 g/l) a inkubuje se 30 min při

teplotě místnosti.

Z jamek destičky k potažení erytrocyty se odstraní tekutina

a promyjí se třikrát 250 µl až 300 µl tlumivého roztoku

trometamolového s chloridem sodným.

Do každé jamky se přidá po 100 µl roztoku substrátu a inkubuje

se 10 min při teplotě místnosti, ve tmě. Pro zastavení

reakce se do každé jamky přidá po 50 µl roztoku hydroxidu

sodného R (3 mol/l).

Měří se absorbance při 405 nm a odečte se hodnota získaná

s negativní kontrolou. Ke stanovení účinnosti přípravku se

použijí hodnoty absorbance z lineární části křivky za použití

obvyklých statistických metod (5.3).

METODA C

Účinnost lidského imunoglobulinu anti-D se stanoví průtokovým

cytometrem na mikrotitrační destičce. Metoda je založena

na specifické vazbě imunoglobulinu anti-D a D-pozitivních

erytrocytů. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví

porovnáním s referenčním přípravkem kalibrovaným









anti-D.

MATERIÁLY

Nespecifikovaná zkoumadla mají analytický stupeň jakosti.


chloridu sodného R a 0,76 g hydrogenfosforečnanu sodného

dodekahydrátu R, 0,2 g chloridu draselného R a 0,2 g

dihydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve vodě

R a zředí se jí na 1000 ml.

Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným a albuminem

hovězím. Je to tlumivý roztok fosforečnanový

s chloridem sodným obsahující albumin hovězí R (10 g/l).

Erytrocyty. Použijí se D-pozitivní erytrocyty získané od

dárců skupiny 0 R1R1, do dvou týdnů po odběru. Skladují

se, je-li třeba, za použití vhodného stabilizátoru při 4 °C.

Krvinky se promyjí nejméně dvakrát tlumivým roztokem

fosforečnanovým s chloridem sodným obsahujícím albumin

hovězí a připraví se suspenze obsahující 1 · 10 4 až 5 · 10 4

krvinek v mikrolitru v tlumivém roztoku fosforečnanovém

s chloridem sodným a albuminem hovězím.

Použijí se D-negativní erytrocyty získané od dárců skupiny

0rr připravené stejným způsobem.

Sekundární protilátky. Použije se vhodné fluorescenční barvivo

konjugované na anti-Ig protilátkový fragment specifický

pro lidský IgG nebo jeho části. Skladují a používají se

podle návodu výrobce.

Mikrotitrační destičky. Použijí se destičky s plochým dnem

bez povrchové úpravy pro enzymovou imunoanalýzu.

POSTUP

Zkoušené roztoky. Lyofilizované přípravky se rekonstituují

podle údaje uvedeného v označení na obalu. Připraví se nejméně

tři nezávislé vzorky nejméně tří sérií 1,5 nebo dvojnásobných

ředění, počínaje koncentrací v rozmezí 1,2 m. j./ml

až 0,15 m. j./ml v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem

sodným a albuminem hovězím. Pokud je to nutné, nastaví

se počáteční ředění tak, aby se získaly odpovědi spadající

do lineární části křivky dávka–odpověď.

Porovnávací roztoky. Referenční přípravek se rekonstituuje

podle návodu. Připraví se nejméně tři nezávislé vzorky

nejméně tří sérií 1,5 nebo dvojnásobných ředění, počínaje

koncentrací v rozmezí 1,2 m. j./ml až 0,15 m. j./ml v tlumivém

roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným a albuminem

hovězím. Pokud je to nutné, nastaví se počáteční

ředění tak, aby se získaly odpovědi spadající do lineární

části křivky dávka–odpověď.

Do každé jamky na mikrotitrační destičce se převede 50 µl

D-pozitivních erytrocytů a přidá se 50 µl ředění zkoušeného

roztoku nebo porovnávacího roztoku. Jako negativní

kontrola se použije 50 µl tlumivého roztoku fosforečnanového

s chloridem sodným a albuminem hovězím. Do čtyř

jamek na stejné mikrotitrační destičce se převede po 50 µl

D-negativních erytrocytů a přidá se po 50 µl nejnižšího ředění

zkoušeného přípravku. Pro monitorování nespecifické

reakce se do čtyř jamek téže destičky převede po 50 µl

D-pozitivních erytrocytů a k nim se přidá po 50 µl tlumivého

roztoku fosforečnanového s chloridem sodným a albuminem

hovězím. Uzavře se plastovou fólií a inkubuje

40 min při 37 °C.

Destičky se odstřeďují 3 min při 50 g, supernatantní tekutina

se odstraní a krvinky se promyjí 200 µl až 250 µl tlumivého


hovězím. Tento postup se opakuje ještě nejméně

jednou.

Destičky se odstřeďují 3 min při 50 g, supernatantní tekutina

se odstraní a přidá se 50 µl sekundárních protilátek zředěných

tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem

sodným a albuminem hovězím na vhodnou koncentraci bílkovin.

Uzavře se plastovou fólií a inkubuje se 20 min při

teplotě místnosti za chránění před světlem.

Destičky se odstřeďují 3 min při 50 g, odstraní se supernatantní

tekutina a krvinky se promyjí 200 µl až 250 µl tlumi-

378 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.14 STANOVENÍ ÚČINNOSTI VAKCÍNY PROTI HEPATITIDĚ A

vého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným a albuminem

hovězím. Opakuje se ještě nejméně jednou.

Destičky se odstřeďují 3 min při 50 g. Krvinky se resuspendují

v 200 µl až 250 µl tlumivého roztoku fosforečnanového

s chloridem sodným. Buněčná suspenze se převede

do zkumavek vhodných pro průtokový cytometr a dále se

zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem

sodným tak, aby se dosáhlo vhodné průtokové rychlosti.

Ihned se měří v oblasti střední fluorescenční intenzity průtokového

cytometru. Zaznamená se nejméně 10 000 bodů,

bez použití rozlišovacího okna („gating“), ale s vyloučením

buněčných zbytků.

Ke stanovení účinnosti zkoušeného přípravku se použijí

hodnoty z lineární části křivky dosažené při střední fluorescenční

intenzitě za použití obvyklých statistických

metod (5.3).


PROTI HEPATITIDĚ A

9.7:20714

Stanovení účinnosti vakcíny proti hepatitidě A se provádí

buď in vitro imunochemickým stanovením obsahu antigenu

(metoda A), nebo in vivo porovnáním schopnosti přípravku

vyvolat v daných podmínkách u myší tvorbu specifických

protilátek se stejnou schopností referenčního přípravku

(metoda B).

METODA A – ZKOUŠKA IN VITRO

Stanovení obsahu antigenu hepatitidy A se provede vhodnou

imunochemickou metodou (2.7.1), jako je enzymově

imunosorbentové stanovení (ELISA).

Vakcína proti hepatitidě A inaktivovaná neadsorbovaná

BRP je vhodná pro použití jako referenční přípravek.

Následující metoda je uvedena jako příklad imunochemické

metody, která byla shledána vhodnou. Pro stanovení obsahu

antigenu hepatitidy A se provede stanovení ELISA za použití

monoklonálních protilátek specifických pro detekci epitopu

hepatitidy A, který indukuje neutralizující protilátky.

Zkoumadla a vybavení

– Mikrotitrační destičky ELISA. 96 jamek.

– Vazební antigen viru hepatitidy A pro stanovení metodou

ELISA BRR.

– Soubor detekčních protilátek pro stanovení hepatitidy A

ve vakcíně metodou ELISA BRR složený z primární detekční

protilátky proti viru hepatitidy A BRR a konjugované

sekundární detekční protilátky BRR.

– Vakcína proti hepatitidě A inaktivovaná neadsorbovaná

BRP.

– Tlumivý ochranný roztok uhličitanový o pH 9,6 (0,05 mol/l).

Roztok 1: 2,1 g hydrogenuhličitanu sodného R se rozpustí

v 500 ml vody pro injekci R. Roztok 2: 7,16 g uhličitanu

sodného R se rozpustí v 500 ml vody pro injekci R. Smíchá

se 70 ml roztoku 1 a asi 30 ml roztoku 2, je-li třeba,

roztokem 2 se upraví hodnota pH. Zfiltruje se přes membránový

filtr (jmenovitá velikost pórů 0,22 µm) a vhodné

množství se převede do sterilních zkumavek. Skladuje se

při 2 °C až 8 °C nejvýše 5 měsíců.

– Blokační tlumivý roztok. Roztok 1: 4,2 g hydrogenuhličitanu

sodného R se rozpustí v 1000 ml vody pro injekci R.

Roztok 2: 5,3 g uhličitanu sodného R se rozpustí

v 1000 ml vody pro injekci R. Smíchá se 630 ml roztoku

1 a 270 ml roztoku 2, přidá se 50 g sacharosy R

a míchá se do úplného rozpuštění. Přidají se 3 g albuminu

hovězího R (po malých dávkách, aby se zabránilo vzniku

hrudek) a míchá se do úplného rozpuštění tak, aby nedošlo

k napěnění. Roztokem 2 se opatrně upraví pH na hodnotu

9,6 a vhodné množství se převede do sterilních

zkumavek. Skladuje se při –20 °C nejvýše 5 měsíců.


o pH 7,5 ±0,3 (PBS). Rozpustí se 0,2 g dihydrogenfosforečnanu

draselného R, 0,2 g chloridu draselného R, 8,0 g

chloridu sodného R a 1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného

dodekahydrátu R v 1000 ml vody pro injekci R.

Skladuje se při 2 °C až 8 °C nejvýše 1 měsíc.

– Roztok polysorbátu 20. 5 ml polysorbátu 20 R se zředí

vodou pro injekci R na 100 ml. Skladuje se při 2 °C až

8 °C nejvýše 1 měsíc.


a polysorbátem 20 (PBS-T). Těsně před použitím se 1 ml

roztoku polysorbátu 20 přidá k 1000 ml tlumivého roztoku

fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,5 ±0,3

(PBS).


a albuminem hovězím (PBS-B-T). 2,5 g albuminu hovězího

R se rozpustí ve 400 ml tlumivého roztoku fosforečnanového

s chloridem sodným a polysorbátem 20 (PBS-T)

(po malých dávkách, aby se zabránilo vzniku hrudek)

a míchá se do úplného rozpuštění tak, aby nedošlo k napěnění;

pH se roztokem hydroxidu sodného R (4 mol/l)

upraví na hodnotu 7,25 a zředí se tlumivým roztokem

fosforečnanovým s chloridem sodným a polysorbátem 20

(PBS-T) na 500 ml. Vhodné množství se převede do

sterilních zkumavek a skladuje se při –20 °C nejvýše

5 měsíců.

– Chromogenní substrát. Krátce před použitím se při teplotě

místnosti rozpustí diamonium-2,2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonát)

R (ABTS) podle pokynů výrobce.

– Roztok pro zastavení reakce. 1 g natrium-dodecyl-sulfátu

R se rozpustí ve vodě pro injekci R a zředí se jí na

100 ml. Skladuje se za chránění před světlem při teplotě

místnosti nejvýše 1 měsíc.

Postup. Odpovídající množství vazebního antigenu viru

hepatitidy A pro stanovení metodou ELISA BRR se rozpustí

v tlumivém roztoku uhličitanovém o pH 9,6 (0,05 mol/l)

a do každé jamky mikrotitračních destiček se převede po

100 µl. Destičky se zakryjí a inkubují se 3 h ±5 min při

(37 ±2) °C ve vlhké atmosféře. Přes noc se udržují při

(5 ±3) °C ve vlhké atmosféře. Následující den se destičky

vyprázdní převrácením na savý papír a do každé jamky se

převede po 200 µl blokačního tlumivého roztoku. Inkubuje

se (45 ±5) min při (37 ±2) °C ve vlhké atmosféře. Destičky

se vyprázdní převrácením na savý papír. Destičky se zakryjí

a skladují se při –20 °C nejvýše 1 měsíc.

Adsorbované vakcíny je třeba před zkoušením předběžně

ošetřit nebo desorbovat. Za předběžné ošetření je považo-

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 379

2.7.15 STANOVENÍ ÚČINNOSTI VAKCÍNY PROTI HEPATITIDĚ B (rDNA)

váno předředění. Pro každý zkoušený vzorek a pro referenční

přípravek se připraví dvě nezávislé série ředění

v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným

a albuminem hovězím (PBS-B-T). Jako vhodné byly shledány

dvojnásobné série ředění. Pro stanovení účinnosti se

rozmrazí odpovídající počet potažených mikrotitračních destiček,

destičky se třikrát opláchnou tlumivým roztokem

fosforečnanovým s chloridem sodným a polysorbátem 20

(PBS-T), opatrně se převrátí na savý papír a nechají se vykapat.

Do každé jamky se převede po 100 µl každého zkoušeného

vzorku a referenčního přípravku (vždy předem zředěného

a série ředění) podle příslušného rozvržení destičky.

Pro kontroly se do každé kontrolní jamky převede po

100 µl tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem

sodným a albuminem hovězím (PBS-B-T). Destičky se zakryjí

a inkubují se (90 ±5) min při (37 ±2) °C ve vlhké atmosféře.

Inkubační směs se odstraní, destičky se třikrát

opláchnou tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem

sodným a polysorbátem 20 (PBS-T) a nechají se vykapat

opatrným převrácením na savý papír.

Těsně před použitím se zředí primární detekční protilátka

proti viru hepatitidy A BRR vhodným objemem tlumivého


hovězím (PBS-B-T) a do každé jamky se převede po

100 µl. Destičky se zakryjí a inkubují se (60 ±3) min při

(37 ±2) °C ve vlhké atmosféře. Inkubační směs se odstraní,

destičky se třikrát opláchnou tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným a polysorbátem 20 (PBS-T)

a nechají se vykapat opatrným převrácením na savý papír.

Těsně před použitím se zředí konjugovaná sekundární detekční

protilátka BRR vhodným objemem tlumivého roztoku

fosforečnanového s chloridem sodným a albuminem hovězím

(PBS-B-T) a převede se po 100 µl do každé jamky.

Destičky se zakryjí a inkubují se (60 ±3) min při (37 ±2) °C

ve vlhké atmosféře. Inkubační směs se odstraní, destičky se

třikrát opláchnou tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným a polysorbátem 20 (PBS-T) a nechají

se vykapat opatrným převrácením na savý papír.

Do každé jamky se přidá po 100 µl chromogenního substrátu,

destičky se zakryjí a inkubují se (30 ±2) min při (37 ±2) °C ve

vlhké atmosféře. Reakce se zastaví přidáním 50 µl roztoku pro

zastavení reakce do každé jamky. Ihned se odečítá absorbance

při 405 nm.

Výpočty. Běžnými statistickými metodami (5.3) se vypočítá

účinnost zkoušené vakcíny vztažená k vakcíně proti hepatitidě

A inaktivované neadsorbované BRP.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit jestliže:

– statistické hodnocení vykazuje signifikantní křivku závislosti

odpovědi na dávce a nevykazuje žádnou významnou

odchylku od linearity a rovnoběžnosti;


125 % stanovené účinnosti.

METODA B – ZKOUŠKA IN VIVO

Pro danou vakcínu je vhodná zkouška na myších, která je

dále uvedená jako příklad, ale lze použít i jiné validované

metody.

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Použijí se zdravé

myši z jednoho chovu, asi 5 týdnů staré a z prokazatelně

vhodného kmene. Používají se zvířata stejného pohlaví.

Rozdělí se do nejméně sedmi stejných skupin o počtu

vhodném pro požadavky stanovení.

Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku. K ředění

přípravku se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující

hliníkové adjuvans použité ve vakcíně. Připraví se

nejméně tři ředění zkoušeného přípravku a odpovídající ředění

referenčního přípravku. Každé ze skupin zvířat se přiřadí

jedno ředění a každému zvířeti ve skupině se subkutánně

podá nejvýše 1,0 ml ředění určeného pro danou skupinu.

Jedna skupina zvířat se ponechá jako nevakcinovaná

kontrola, podá se jí subkutánně pouze stejný objem ředicího

roztoku. Po 28 až 32 dnech se všechna zvířata v anestezii

vykrvácejí a odděleně se získají jednotlivá séra. V těchto

sérech se vhodnou imunochemickou metodou stanoví obsahy

specifických protilátek proti hepatitidě A (2.7.1).

Výpočty. Výpočty se provedou běžnými statistickými metodami

pro kvantální zkoušky (5.3).

Z rozložení reakčních hodnot naměřených ve všech sérech

nevakcinované skupiny se stanoví nejvyšší reakční hodnota,

kterou lze při této zkoušce očekávat u nevakcinovaných

zvířat. Všechny odpovědi u vakcinovaných zvířat, které

převyšují tuto hodnotu, se označí za sérokonverzi.

Určité procento zvířat vykazujících sérokonverzi v každé

skupině se vhodně transformuje (např. probitovou transformací)

a použije se model rovnoběžnosti křivek závislosti

log dávky a odpovědi. Stanoví se účinnost zkoušeného přípravku

vztažená k referenčnímu přípravku.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

– ED50 pro zkoušený a referenční přípravek je mezi nejnižší

a nejvyšší dávkou podanou zvířatům;

– statistické hodnocení nevykazuje žádnou významnou

odchylku od linearity ani rovnoběžnosti;



Požadavek na účinnost. Horní mez spolehlivosti (P = 0,95)

stanovené relativní účinnosti je nejméně 1,0.


PROTI HEPATITIDĚ B (rDNA)

7.3:20715

Stanovení účinnosti vakcíny proti hepatitidě B se provádí

buď in vivo porovnáním schopnosti přípravku vyvolat v daných

podmínkách u myší nebo morčat tvorbu specifických

protilátek proti povrchovému antigenu hepatitidy B

(HBsAg) se stejnou schopností referenčního přípravku, nebo

in vitro imunochemickým stanovením obsahu antigenu.

ZKOUŠKA IN VIVO

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Použijí se zdravé

myši z jednoho chovu, asi 5 týdnů staré. Použitý kmen myší

pro tuto zkoušku musí dávat výraznou odpověď v křivce

závislosti odpovědi na dávce antigenu; vhodné jsou myši

s haplotypem H-2 q nebo H-2 d . Také jsou vhodná zdravá

380 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.16 STANOVENÍ ÚČINNOSTI BEZBUNĚČNÉ VAKCÍNY PROTI DÁVIVÉMU KAŠLI

morčata hmotnosti 300 g až 350 g (asi 7 týdnů stará) z jednoho

chovu. Používají se zvířata stejného pohlaví. Rozdělí

se do nejméně sedmi stejných skupin o počtu vhodném pro

požadavky stanovení.

Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku. K ředění přípravku

se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující

hliníkové adjuvans použité ve vakcíně nebo jiné

vhodné rozpouštědlo. Připraví se nejméně tři ředění zkoušeného

přípravku a odpovídající ředění referenčního přípravku.

Každé ze skupin se přiřadí jedno ředění a každému

zvířeti ve skupině se intraperitoneálně podá nejvýše 1,0 ml

ředění určeného pro skupinu. Jedna skupina zvířat se ponechá

jako nevakcinovaná kontrola, podá se jí intraperitoneálně

pouze stejný objem ředicího roztoku. Ve vhodném časovém

intervalu (např. 4 až 6 týdnů) se zvířata v anestezii

vykrvácejí a odděleně se získají jednotlivá séra. V těchto

sérech se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) stanoví

obsah specifických protilátek proti povrchovému antigenu

hepatitidy B.

Výpočty. Výpočty se provedou běžnými statistickými metodami

pro kvantální zkoušky (5.3).

Z rozložení reakčních hodnot naměřených ve všech sérech

nevakcinované skupiny se stanoví nejvyšší reakční hodnota,

kterou lze při této zkoušce očekávat u nevakcinovaných

zvířat. Všechny odpovědi u vakcinovaných zvířat, které

převyšují tuto hodnotu, se označí za sérokonverzi.

Procento zvířat vykazujících sérokonverzi v každé skupině

se vhodně transformuje (např. probitovou transformací)

a použije se model rovnoběžnosti křivek závislosti log dávky

a odpovědi. Stanoví se účinnost zkoušeného přípravku

vztažená k referenčnímu přípravku.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

– ED50 pro zkoušený a referenční přípravek je mezi nejnižší


– statistické hodnocení nevykazuje žádnou významnou odchylku

od linearity ani rovnoběžnosti;



Požadavek na účinnost. Horní mez spolehlivosti

(P = 0,95) stanovené relativní účinnosti je nejméně 1,0.

ZKOUŠKA IN VITRO

Provede se imunochemické stanovení (2.7.1) obsahu antigenu,

které odpovídá kritériím přijatelnosti validovaným při

zkoušce in vivo.

Prokazatelně vhodná jsou enzymově imunosorbentová stanovení

(ELISA) a radioimunoanalýza (RIA) s použitím monoklonálních

protilátek specifických pro ochranu indukující

epitopy HBsAg. K analýze údajů, jež se mohou vhodně

transformovat, se použijí vhodné počty ředění zkoušené

vakcíny a referenčního přípravku a model rovnoběžnosti.

Soupravy (kity) ke stanovení HBsAg in vitro jsou běžně dostupné

a jejich zkušební postupy se mohou přizpůsobit ke

stanovení účinnosti vakcíny in vitro.

Kritéria přijatelnosti pro daný referenční přípravek schvaluje

na základě validačních údajů oprávněná autorita.


BEZBUNĚČNÉ VAKCÍNY PROTI

DÁVIVÉMU KAŠLI

9.8:20716

Účinnost bezbuněčné vakcíny proti dávivému kašli se měří

její schopností vyvolat tvorbu specifických protilátek u myší

nebo morčat. Titr protilátek se pro každý antigen stanoví

vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), jako je enzymově

imunosorbentové stanovení (ELISA).

Výsledky stanovení účinnosti se mohou vyjádřit:

– buď jako poměr geometrického průměru titru (GMT) protilátek

produkovaných po podání zkoušené vakcíny ke

geometrickému průměru titru protilátek produkovaných

po současném podání referenční vakcíny (stanovení relativní

účinnosti);

– nebo přímo, jako geometrický průměr titru protilátek indukovaných

zkoušenou vakcínou (přímé stanovení účinnosti

- GMU).

Pro složené vakcíny obsahující pertusové složky společně

se složkou difterickou a tetanickou se sérologická zkouška

na morčatech může provádět se stejnou skupinou zvířat,

která byla použita pro sérologické stanovení účinnosti adsorbované

vakcíny proti záškrtu (2.7.6) a adsorbované

vakcíny proti tetanu (2.7.8), pokud se prokáže, že podmínky

imunizace společné pro všechny složky (např. dávka,

trvání) jsou platné pro složenou vakcínu. Modelová

zkouška na morčatech umožňuje další snížení počtu požadovaných

zvířat a musí být každým analytikem zvažována

v souvislosti s požadavky Evropské dohody o ochraně obratlovců

používaných pro pokusné a jiné vědecké účely

(The European Convention for the Protection of Vertebrate

Animals Used for Experimental and Other Scientific

Purposes).

Metody A a B popsané dále jsou vyvinuty pro mnohonásobná

ředění zkoušené vakcíny a referenční vakcíny nebo

vnitřní kontroly (viz Poznámky), aby se určilo, které ředění

je vhodné. Jakmile bylo pro danou vakcínu potvrzeno jedno

z vhodných ředění, pak je v souladu s principy 3R (Replacement,

Reduction, Refinement, tj.náhrada, snížení, zlepšení)

doporučeno použít zjednodušený model, jako je stanovení

s jediným ředěním, jak u zkoušené vakcíny, tak i referenční

vakcíny nebo vnitřní kontroly. Takový model umožňuje

analytikovi stanovit, zda je imunogenita zkoušené

vakcíny dostatečná.

Vhodnými ukazateli monitorování provádění sérologického

stanovení (jediné nebo násobné ředění) jsou:

– geometrický průměr a geometrická směrodatná odchylka

titrů protilátek ve vzorcích séra získaných po podání pevně

stanovené dávky referenční vakcíny nebo vnitřní kontroly;

– titry protilátek naměřené u kontrol (pozitivní kontroly

a negativní vzorky sér).

Může být nutné opětovné potvrzení vhodnosti vybraného

ředění stanovením účinnosti s vícenásobným ředěním, např.

po velkých změnách v postupu nebo z důvodů vyšetření.

METODA A. SÉROLOGICKÁ ZKOUŠKA NA MYŠÍCH

Následující modelová zkouška je příkladem stanovení účinnosti

s vícenásobným ředěním, která může být základem pro

ustavení jediného ředění pro stanovení účinnosti.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 381


Výběr a rozdělení zkušebních zvířat. Použijí se zdravé

myši (např. kmene CD1 z jednoho chovu více než 5 týdnů

staré) a rozdělí se do nejméně šesti stejných skupin; použijí

se skupiny obsahující počty zvířat splňující předdefinovaná

kritéria variability protilátkových odpovědí předepsaná

v odstavci Výpočty a kritéria validity. Použijí se sériová ředění

zkoušené vakcíny a referenční vakcíny nebo vnitřní

kontroly a každému ředění se přiřadí jedna skupina myší.

Během validačních studií se jako negativní kontrola může

použít další skupina myší, které se podá pouze ředidlo.

Imunizace. Každé myši se intraperitoneálně nebo subkutánně

podá 0,5 ml ředění přiděleného její skupině.

Příprava vzorků sér. Za 4 až 5 týdnů po vakcinaci se myši

v anestezii jednotlivě vykrvácejí. Séra se uchovávají při

–20 °C až do použití ke stanovení protilátek. Zabrání se

častému zmrazování a rozmrazování vzorků.

Referenční antisérum. Ve zkoušce se použije referenční

antisérum o známé účinnosti, které slouží jako základ pro

výpočet hladin protilátek ve zkoušených sérech. Jako referenční

antisérum je vhodné použít Antisérum proti Bordetella

pertussis myší BRP.

Stanovení protilátek. Obsah specifických protilátek v jednotlivých

sérech proti každému bezbuněčnému pertusovému

antigenu se stanoví validovanou metodou, jako je dále

uvedené stanovení ELISA.

Stanovení ELISA. Na povrch mikrotitrační destičky (z polyvinylchloridu

nebo polystyrenu, jak je vhodné pro specifický

antigen) se naváže purifikovaný antigen v koncentraci

100 ng na jamku. Po opláchnutí se nenavázaná místa blokují

inkubací destiček s roztokem bovinního sérového albuminu

a potom se opět opláchnou. V destičkách se připraví

dvojnásobná ředění sér jednotlivých myší imunizovaných

zkoušenou nebo referenční vakcínou, nebo vnitřní

kontrolou; referenční antisérum se zařadí na každou destičku.

Destičky se inkubují 1 h při 22 °C až 25 °C a potom se

opláchnou. Do každé jamky se přidá vhodný roztok enzymaticky

konjugované antimyší IgG protilátky a destička se

inkubuje 1 h při 22 °C až 25 °C. Po opláchnutí se přidá

chromogenní substrát, ze kterého vázaný enzymový konjugát

uvolňuje chromofor, jehož množství se kvantitativně

stanoví změřením absorbance (2.2.25).

METODA B. SÉROLOGICKÁ ZKOUŠKA NA

MORČATECH

Následující modelová zkouška je příkladem stanovení účinnosti

s vícenásobným ředěním, která může být základem pro

ustavení jediného ředění pro stanovení účinnosti.

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Použijí se zdravá

morčata pocházející z jednoho chovu, každé o hmotnosti

250 g až 350 g. Morčata jsou stejného pohlaví, nebo se

samci a samice rozdělí rovnoměrně do skupin. Zvířata se

rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Použije se

počet zvířat ve skupině, který stačí k tomu, aby byla splněna

předem definovaná kritéria variability protilátkových

odpovědí předepsaná v odstavci Výpočty a kritéria validity.

Během validačních studií se jako negativní kontrola může

použít další skupina morčat, které se podá pouze ředidlo.

Ředění zkoušeného a referenčního přípravku. Zkoušená

vakcína a referenční vakcína nebo vnitřní kontrola se zředí

roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění

byla odstupňována 2,5násobně až pětinásobně. Použijí

se nejméně tři ředění v rozmezí, které bylo shledáno vhodným

pro všechny složky zkoušené vakcíny. Ředění se použijí

k imunizaci pokud možno do 1 h od naředění a každému

ředění se přiřadí jedna skupina zvířat.

Imunizace. Každému morčeti ve skupině se subkutánně

podá po 1,0 ml ředění přiřazeného dané skupině.

Příprava vzorků sér. 5 až 6 týdnů po imunizaci se vhodným

způsobem odeberou vzorky krve všem vakcinovaným

morčatům a negativním kontrolám. Séra se uchovávají při

–20 °C až do použití ke stanovení protilátek. Zabrání se

častému zmrazování a rozmrazování vzorků sér.

Referenční antisérum. Použije se interní porovnávací

morčecí antisérum o známé účinnosti, které slouží jako základ

pro výpočet hladin protilátek ve zkoušených sérech.

Stanovení protilátek. Obsah specifických protilátek v jednotlivých

sérech proti každému bezbuněčnému pertusovému

antigenu se stanoví validovanou metodou, jako je dále

uvedené stanovení ELISA.

Stanovení ELISA. Na povrch mikrotitrační destičky

o 96 jamkách se naváží purifikované antigeny [např. pertusový

toxin (PT), pertaktin (PRN), filamentózní hemaglutinin

(FHA) a/nebo fimbrální aglutinogeny (Fim-2/3)] reprezentující

složky složené vakcíny v koncentraci 200 ng až

400 ng na jamku. Po opláchnutí se nenavázaná místa blokují

inkubací destiček vhodným blokačním tlumivým roztokem

a potom se opět opláchnou. V destičkách se připraví

dvojnásobná ředění sér jednotlivých morčat imunizovaných

zkoušenou nebo referenční vakcínou, nebo vnitřní kontrolou,

referenční antisérum se zařadí na každou destičku. Destičky

se inkubují 1 h při 37 °C a potom se opláchnou. Do

každé jamky se přidá vhodný roztok enzymaticky konjugované

antimorčecí IgG protilátky a destička se inkubuje 1 h

při 37 °C. Po opláchnutí se přidá chromogenní substrát, ze

kterého vázaný enzymový konjugát uvolňuje chromofor,

jehož množství se kvantitativně stanoví změřením absorbance

(2.2.25).

VÝPOČTY A KRITÉRIA VALIDITY

Stanovení relativní účinnosti. Stanoví se titry protilátek

v sérech myší nebo morčat imunizovaných zkoušenou

a referenční vakcínou pro každý bezbuněčný pertusový antigen

za použití referenčního antiséra. Ze získaných hodnot se

pro každý antigen vypočítá poměr geometrického průměru

titru (GMT) protilátek produkovaných po podání zkoušené

vakcíny ke geometrickému průměru titru protilátek produkovaných

po současném podání referenční vakcíny.


– počet odpovídajících zvířat po podání zkoušené a referenční

vakcíny splňuje předem definovaná kritéria;

– geometrický průměr titru protilátek (GMT) je v rozmezí

limitů kontrol;

– variabilita protilátkových odpovědí splňuje předem definovaná

kritéria.

382 ČL 2017 – Dopl. 2020


Přímé stanovení účinnosti (GMU). Titry protilátek v sérech

myší nebo morčat imunizovaných vnitřní kontrolou a zkoušenou

vakcínou se stanoví pro každý bezbuněčný pertusový

antigen za použití referenčního antiséra a pro každý antigen

se vypočítá geometrický průměr titru protilátek.


– počet odpovídajících zvířat po podání zkoušené vakcíny

a vnitřní kontroly splňuje předem definovaná kritéria;

– geometrický průměr titru protilátek (GMT) je v rozmezí

limitů kontrol;

– variabilita protilátkových odpovědí splňuje předem definovaná

kritéria.

POZNÁMKY

Vnitřní kontrola pro stanovení GMU. Šarže vakcíny, která

byla shledána jako reprezentativní pro probíhající výrobní

postup a u níž byly dostatečně změřeny odpovědi u myší

nebo morčat. Stabilita vnitřní kontroly má být monitorována

a zdokumentována.

Referenční vakcína pro stanovení relativní účinnosti.

Šarže vakcíny, jejíž účinnost byla prokázána při klinických

zkouškách, nebo reprezentativní šarže. Stabilita referenční

šarže má být monitorována a zdokumentována.

Odpovídající zvířata. Imunizovaná zvířata produkující

protilátky s titrem větším než meze definované během vývoje

a validace metody.


Stanovení účinnosti bezbuněčné vakcíny proti

dávivému kašli: pokyny

METODA B. STANOVENÍ PROTILÁTEK U MORČAT

Stanovení ELISA je uvedeno jako příklad vhodné imunochemické

metody pro stanovení titru protilátek.

Stanovení titru protilátek metodou ELISA pro pertusový

toxin (PT), filamentózní hemaglutinin (FHA), fimbrální

aglutinogeny (Fim-2/3) a pertaktin (PRN). Na

ELISA destičkách potažených acelulárními pertusovými

antigeny (PT, PRN, FHA nebo Fim-2/3) se připraví dvojnásobná

ředění séra ze zkoušené a referenční vakcíny, nebo

vnitřní kontroly. Porovnávací morčecí antisérum a negativní

morčecí sérum se nanesou na každou destičku. Přidá se

králičí nebo kozí protilátka proti morčecí IgG konjugovaná

s peroxidasou a potom peroxidasový substrát.

Zkoumadla a vybavení:


– Porovnávací antisérum (morčecí).

– Peroxidasový konjugát. Králičí nebo kozí protilátka proti

morčecí IgG konjugovaná s peroxidasou.

– Bordetella pertussis antigeny (PRN, PT, FHA nebo

Fim-2/3).

– Tlumivý ochranný roztok uhličitanový o pH 9,6. 1,59 g

uhličitanu sodného bezvodého R a 2,93 g hydrogenuhličitanu

sodného R se rozpustí v 1000 ml vody R. Rozplní se

do lahviček o objemu 150 ml a sterilizuje se 15 min





R, 14,3 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátuR

a 2,0 g chloridu draselného R v 1000 ml vody R.



– Roztok kyseliny citronové. 10,51 g kyseliny citronové monohydrátu

R se rozpustí v 1000 ml vody R a pH se upraví

roztokem hydroxidu sodného R (400 g/l) na hodnotu 4,0.


s chloridem sodným o pH 7,4 (PBS) obsahující polysorbát

20 R (0,5 g/l).


s chloridem sodným o pH 7,4 (PBS) obsahující polysorbát

20 R (0,5 g/l) a sušené odstředěné mléko (25 g/l).



-sulfonátu) R (ABTS) ve 20 ml roztoku kyseliny citronové.

Těsně před použitím se přidá 5 µl peroxidu vodíku

koncentrovaného R.

Postup. Dále uvedený popis je příkladem vhodného rozvržení

destičky; mohou se použít i jiná rozvržení. Jamky 1A

až 1H jsou určeny pro negativní kontrolní sérum, jamky 2A

až 12H pro kontrolní morčecí antisérum (obvykle dvě pozice)

a séra jednotlivých morčat imunizovaných buď zkoušenou,

nebo referenční vakcínou nebo vnitřní kontrolou.

Na povrch každé jamky ELISA destičky se přidá 100 µl

vhodného antigenního roztoku (PT, FHA nebo Fim-2/3

o koncentraci 2 μg/ml a PRN o koncentraci 4 μg/ml,

v tlumivém ochranném roztoku uhličitanovém o pH 9,6).

Nechá se přes noc stát ve vlhké atmosféře při teplotě 4 °C.

Aby se zabránilo interferenci způsobené vzestupem teploty,

ukládají se nejvýše čtyři destičky na sebe. Následující den

se jamky důkladně opláchnou promývacím tlumivým roztokem

a blokují se přidáním 150 µl blokačního tlumivého

roztoku do každé jamky. Inkubuje se 1 h ve vlhké atmosféře

při teplotě 37 °C. Jamky se důkladně opláchnou promývacím

tlumivým roztokem. Do každé jamky, kromě jamek

v řadě A, se přidá po 100 µl blokačního roztoku. Připraví se

vhodná ředění sér jednotlivých vzorků od zkoušené a referenční

vakcíny nebo vnitřní kontroly, porovnávacího antiséra

a negativního kontrolního séra. Negativní kontrolní sérum

se umístí do sloupce 1, porovnávací antisérum do nejméně

dvou dalších sloupců a jednotlivá séra zkoušené

a referenční vakcíny nebo vnitřní kontroly do zbývajících

sloupců. Séra se nakapou v množství 100 µl do prvních

dvou jamek sloupce, pro který jsou určena. Vícekanálovou

mikropipetou se připraví dvojnásobná sériová ředění

od řady B postupně k řadě H přenášením 100 µl do následující

jamky. 100 µl z poslední řady se odstraní, takže

všechny jamky obsahují 100 µl. Inkubuje se 2 h při 37 °C,

pak se destičky důkladně opláchnou promývacím tlumivým

roztokem. Připraví se vhodné ředění peroxidasového

konjugátu v blokačním tlumivém roztoku a do každé jamky

se nakape 100 µl. Inkubuje se 1 h ve vlhké atmosféře

při teplotě 37 °C. Destičky se důkladně opláchnou

promývacím tlumivým roztokem a do každé jamky se přidá

100 µl peroxidasového substrátu. Nechá se stát 30 min

při teplotě místnosti a za chránění před světlem. Destičky

se odečítají při 405 nm ve stejném pořadí, v jakém byl

přidáván substrát.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 383

2.7.17 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO ANTITROMBINU III


ANTITROMBINU III

6.0:20717

Obsah antitrombinu III ve zkoušeném přípravku se stanoví

porovnáním jeho schopnosti inaktivovat trombin v přítomnosti

nadbytku heparinu se stejnou schopností referenčního

přípravku koncentrátu lidského antitrombinu III kalibrovaného

v mezinárodních jednotkách. Různá množství zkoušeného

přípravku se smíchají s daným množstvím trombinu

a zbývající účinnost trombinu se stanoví za použití vhodného

chromogenního substrátu.


množství mezinárodního standardu, kterým je koncentrát

lidského antitrombinu III. Hodnotu účinnosti mezinárodního

standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová

zdravotnická organizace.

Postup stanovení. Připraví se dvě nezávislé série tří nebo

čtyř ředění zkoušeného a referenčního přípravku v rozsahu

1/75 až 1/200 z 1 m. j./ml za použití tlumivého roztoku trometamolového

s dinatrium-edetátem a albuminem o pH 8,4 R

obsahujícího 15 m. j. heparinu v mililitru.

200 µl každého ředění se 1 min až 2 min zahřívá při 37 °C.

Ke každému ředění se přidá 200 µl roztoku trombinu hovězího

R v tlumivém roztoku trometamolovém s dinatrium-

-edetátem a albuminem o pH 8,4 R (2 m. j./ml.). Míchá se

a udržuje při 37 °C přesně 1 min. Přidá se 500 µl vhodného

chromogenního substrátu (např. D-fenylalanyl-L-pipekolyl-

-L-arginin-4-nitroanilid rozpuštěný ve vodě R na roztok obsahující

4 mmol/l a dále ředěný na koncentraci vhodnou pro

stanovení za použití tlumivého roztoku trometamolového

s dinatrium-edetátem a albuminem o pH 8,4 R bez albuminu).

Okamžitě se začne měřit změna absorbance při 405 nm

(2.2.25) a v měření se pokračuje alespoň 30 s. Vypočítá se

rychlost změny absorbance (DA/min). (Alternativně se může

použít stanovení konečného bodu změřením absorbance

při 405 nm po zastavení reakce kyselinou octovou.)

Rychlost změny absorbance (DA/min) je nepřímo úměrná

účinnosti antitrombinu III.

Zkontroluje se platnost stanovení a vypočítá se účinnost

zkoušeného přípravku obvyklými statistickými metodami

(např. 5.3).


KOAGULAČNÍHO FAKTORU II

8.5:20718

Účinnost lidského koagulačního faktoru II se stanoví po

specifické aktivaci na faktor IIa. Faktor IIa se stanoví porovnáním

jeho účinnosti štěpit specifický chromogenní

peptidový substrát se stejnou účinností mezinárodního

standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného


Mezinárodní jednotka je účinnost faktoru II obsažená v deklarovaném

množství mezinárodního standardu, kterým je

lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního faktoru II.



Metoda chromogenního stanovení účinnosti se skládá ze

dvou kroků: z aktivace faktoru II hadím jedem a z následného

enzymatického štěpení chromogenního substrátu faktorem

IIa za tvorby chromoforu, který může být kvantitativně

stanoven spektrofotometricky. Za vhodných podmínek

stanovení je vztah mezi účinností faktoru IIa a štěpením

chromogenního substrátu lineární.

ZKOUMADLA

Specifický aktivátor faktoru II ze zmijího jedu (ecarin). Bílkovina

pocházející z jedu zmije druhu Echis carinatus, který

specificky aktivuje faktor II. Rekonstituuje se podle pokynů

výrobce. Rekonstituovaný přípravek se skladuje při

4 °C a použije se během 1 měsíce.

Chromogenní substrát faktoru IIa. Specifický chromogenní

substrát faktoru IIa, jako je např. H-D-fenylalanyl-L-pipekolyl-L-arginin-4-nitroanilid-dihydrochlorid,

4-toluensulfonyl-glycyl-prolyl-L-arginin-4-nitroanilid,

H-D-cyklohexylglycyl-a-aminobutyryl-L-arginin-4-nitroanilid,

D-cyklohexylglycyl-L-alanyl-L-arginin-4-nitroanilid-diacetát.

Rekonstituuje


Ředicí tlumivý roztok. Roztok obsahující trometamol R

(6,06 g/l), chlorid sodný R (17,53 g/l) a albumin hovězí R

nebo albumin lidský R (1 g/l). Je-li třeba, pH se upraví kyselinou

chlorovodíkovou R na hodnotu 8,4.

POSTUP STANOVENÍ


roztokem na roztok obsahující 0,015 m. j. faktoru II

v mililitru. Připraví se nejméně tři další ředění v ředicím

tlumivém roztoku.

Porovnávací roztok. Referenční přípravek se zředí ředicím

tlumivým roztokem na roztok obsahující 0,015 m. j. faktoru

II v mililitru. Připraví se nejméně tři další ředění v ředicím

tlumivém roztoku.

Všechny roztoky se krátce před zkouškou zahřejí ve vodní

lázni na 37 °C.

Následující pracovní podmínky se použijí pro mikrotitrační

destičky. Provádí-li se stanovení ve zkumavkách, přizpůsobí

se objemy, poměry ve směsi se zachovají.

Použije se mikrotitrační destička udržovaná při 37 °C a do

každé ze série jamek se přidá 25 µl každého ředění zkoušeného

nebo porovnávacího roztoku. Do každé jamky se přidá

po 125 µl ředicího tlumivého roztoku, pak 25 µl ecarinu

a inkubuje se přesně 2 min. Do každé jamky se přidá 25 µl

chromogenního substrátu faktoru IIa.

Kontinuálně se odečítá rychlost změny absorbance

(2.2.25) při 405 nm po dobu 3 min a získá se průměrná

rychlost změny absorbance (DA/min). Není-li možné kontinuální

monitorování, odečítá se absorbance při 405 nm

ve vhodných za sebou jdoucích intervalech, např. 40 s,

vynese se lineární závislost absorbance na čase a vypočítá

se DA/min jako směrnice přímky. Z hodnot DA/min každého

jednotlivého ředění porovnávacího a zkoušeného

přípravku se vypočítá účinnost zkoušeného přípravku

a zkontroluje se platnost stanovení obvyklými statistickými

metodami (5.3).

384 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.19 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO KOAGULAČNÍHO FAKTORU X


KOAGULAČNÍHO FAKTORU X

6.0:20719

Účinnost lidského koagulačního faktoru X se stanoví po

specifické aktivaci na faktor Xa. Faktor Xa se stanoví porovnáním

jeho účinnosti štěpit specifický chromogenní peptidový

substrát se stejnou účinností mezinárodního standardu

nebo referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních

jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost faktoru X obsažená

v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým

je lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního

faktoru X. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu


organizace.

Metoda chromogenního stanovení účinnosti se skládá ze

dvou kroků: z aktivace faktoru X hadím jedem a z následného

enzymatického štěpení chromogenního substrátu faktorem

Xa za tvorby chromoforu, který může být kvantitativně

stanoven spektrofotometricky. Za vhodných podmínek

stanovení je vztah mezi účinností faktoru Xa a štěpením

chromogenního substrátu lineární.

ZKOUMADLA

Specifický aktivátor faktoru X z jedu zmije. Bílkovina pocházející

z jedu zmije druhu Vipera russelli, který specificky

aktivuje faktor X. Rekonstituuje se podle pokynů výrobce.

Rekonstituovaný přípravek se skladuje při 4 °C a použije

se během 1 měsíce.

Chromogenní substrát faktoru Xa. Specifický chromogenní

substrát faktoru Xa, jako je např. N-a-benzyloxykarbonyl-

-D-arginyl-L-glycyl-L-arginin-4-nitroanilid-dihydrochlorid,

N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginin-4-nitroanilid-hydrochlorid,

methansulfonyl-D-leucyl-glycyl-L-

-arginin-4-nitroanilid, metoxykarbonyl-D-cyklohexylalanylglycyl-L-arginin-4-nitroanilid-acetát.

Rekonstituuje se podle

pokynů výrobce.

Ředicí tlumivý roztok. Roztok obsahující trometamol R

(3,7 g/l), chlorid sodný R (18,0 g/l), imidazol R (2,1 g/l),

hexadimethrinium-dibromid R (0,02 g/l) a albumin hovězí R

nebo albumin lidský R (1 g/l). Je-li třeba, pH se upraví kyselinou

chlorovodíkovou R na hodnotu 8,4.

POSTUP


roztokem na roztok obsahující 0,18 m. j. faktoru X

v mililitru. Připraví se nejméně tři další ředění v ředicím

tlumivém roztoku.

Porovnávací roztok. Referenční přípravek se zředí ředicím

tlumivým roztokem na roztok obsahující 0,18 m. j. faktoru

X v mililitru. Připraví se nejméně tři další ředění v ředicím

tlumivém roztoku.

Všechny roztoky se krátce před zkouškou zahřejí ve vodní

lázni na 37 °C.

Následující pracovní podmínky se použijí pro mikrotitrační

destičky. Provádí-li se stanovení ve zkumavkách, přizpůsobí

se objemy, poměry ve směsi se zachovají.

Použije se mikrotitrační destička udržovaná při 37 °C a do

každé ze série jamek se přidá 12,5 µl každého ředění zkoušeného

nebo porovnávacího roztoku. Do každé jamky se

přidá 25 µl specifického aktivátoru faktoru X z jedu zmije

a inkubuje se přesně 90 s. Do každé jamky se přidá 150 µl

chromogenního substrátu faktoru Xa zředěného ředicím

tlumivým roztokem v poměru 1 : 6.

Kontinuálně se odečítá rychlost změny absorbance

(2.2.25) při 405 nm po dobu 3 min a získá se průměrná

rychlost změny absorbance (DA/min). Není-li možné kontinuální

monitorování, odečítá se absorbance při 405 nm

ve vhodných za sebou jdoucích intervalech, např. 40 s,

vynese se lineární závislost absorbance na čase a vypočítá

se DA/min jako směrnice přímky. Z hodnot DA/min každého

jednotlivého ředění porovnávacího a zkoušeného

přípravku se vypočítá účinnost zkoušeného přípravku

a zkontroluje se platnost stanovení obvyklými statistickými

metodami (5.3).


INAKTIVOVANÉ VAKCÍNY PROTI

POLIOMYELITIDĚ (IN VIVO)

6.0:20720

Schopnost vakcíny vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek

se stanoví in vivo jednou z následujících metod.

ZKOUŠKA NA KUŘATECH NEBO MORČATECH

Připraví se vhodné série nejméně tří ředění zkoušené vakcíny

ve vhodném tlumivém roztoku s chloridem sodným. Morčata

o hmotnosti 250 g až 350 g nebo tři týdny stará kuřata se

rozdělí do skupin po deseti a každé skupině se přiřadí jedno

ředění vakcíny. Každému zvířeti se intramuskulárně podá

0,5 ml ředění určeného pro jeho skupinu. Pátý nebo šestý den

se zvířata vykrvácejí a oddělí se séra. Séra v ředění 1 : 4 se

zkoušejí na přítomnost neutralizačních protilátek proti lidskému

polioviru typu 1, typu 2 a typu 3. Směsi 100 CCID50

viru a ředěného séra se inkubují 4,5 h až 6 h při 37 °C a ponechají

se po dobu 12 h až 18 h při teplotě (5 ±3) °C, pokud

je to nezbytné pro shodnost výsledků. Směsi se inokulují

na buněčné kultury a za 7 dnů po inokulaci se zjišťuje přítomnost

nezneutralizovaného viru. Pro každou skupinu zvířat

se zaznamená počet sér s neutralizačními protilátkami a vypočítá

se ředění vakcíny dávající protilátkovou odpověď

u 50 % zvířat. Souběžně se provede kontrolní zkouška

s vhodným referenčním přípravkem. Vakcína vyhovuje

zkoušce, jestliže ředění 1 : 100 nebo vyšší vyvolá protilátkovou

odpověď pro každý ze tří typů viru u více než 50 % zvířat.

ZKOUŠKA NA POTKANECH

Vhodná in vivo metoda stanovení imunogenity je založena

na intramuskulárním podání nejméně tří ředění zkoušené

a referenční vakcíny do zadní končetiny (končetin). Pro

každé ředění se použije skupina deseti potkanů vhodného

kmene prostého specifikovaných patogenů. Pro získání

platných výsledků je pro všechny tři sérotypy nutné použití

nejméně čtyř ředění. Počet zvířat ve skupině musí být přiměřený,

aby se získaly výsledky splňující validační kritéria;

obvykle se používají skupiny o deseti potkanech, třebaže

platné výsledky se dají získat i s menším počtem zvířat ve

skupině. Pokud se použijí zvířata rozdílného pohlaví, rozdělí

se samci a samice rovnoměrně do všech skupin. Rozmezí

hmotnosti jednotlivých zvířat je vhodné mezi 175 g až

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 385

2.7.20 STANOVENÍ ÚČINNOSTI INAKTIVOVANÉ VAKCÍNY PROTI POLIOMYELITIDĚ (IN VIVO)

250 g. Na jednoho potkana se použije inokulum 0,5 ml.

Rozmezí dávek se vybere tak, aby se získala odpověď pro

všechny tři typy polioviru. Zvířata se vykrvácejí po 20 až

22 dnech. Neutralizační titry proti všem třem typům polioviru

se stanoví odděleně; jako čelenžní viry se použije po

100 CCID50 Sabinových kmenů, jako indikátorové buňky

Vero buňky nebo Hep2 buňky a neutralizační podmínky

jsou 3 h při 35 °C až 37 °C a, pokud je to nutné pro shodnost

výsledků, ještě 18 h při 2 °C až 8 °C. Po sedmidenní

inkubaci při 35 °C, fixaci a barvení se odečtou výsledky.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže titr protilátek každého čelenžního

viru je v rozmezí 10 CCID50 až 1000 CCID50 a titr

neutralizačních protilátek kontrolního séra je v dvojnásobných

ředěních geometrického průměru titru séra. Účinnost

se vypočítá porovnáním vztahu odpovědi zkoušené vakcíny

k referenční vakcíně probitovou metodou nebo po validaci

použitím modelu rovnoběžnosti. Pro probitovou metodu je

nutné stanovit pozitivní limitní hodnoty titru neutralizačních

protilátek pro každý typ polioviru, aby se definovala

odpověď. Vzhledem k mezilaboratorní variabilitě není

možné definovat pozitivní limitní hodnoty tak, aby byly

použitelné v každé laboratoři. Pozitivní limitní hodnoty se

stanoví zvlášť pro každou laboratoř na základě výsledků

minimálně tří zkoušek referenční vakcíny. Střední bod na

stupnici log 2 minimálních a maximálních geometrických

průměrů titrů ze série tří nebo více zkoušek se použije jako

pozitivní limitní hodnota. Pro každý ze tří typů polioviru

není účinnost vakcíny významně nižší než účinnost referenčního

přípravku.


– pro zkoušenou i referenční vakcínu je ED50 mezi nejnižší


– statistické hodnocení nevykazuje významnou odchylku

od linearity a rovnoběžnosti;

– interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 %

a 400 % stanovené účinnosti.


Pokyny k upuštění od Stanovení účinnosti

inaktivované vakcíny proti poliomyelitidě

(in vivo) a jejích kombinací

Tento pokyn se používá u vakcín odvozených z divokých

kmenů poliovirů. Popsaná validace by se měla provést pro

každý produkt před upuštěním od stanovení účinnosti a měla

by se opakovat vždy, když ve výrobním postupu dojde

k podstatným změnám, které by mohly ovlivnit in vitro nebo

in vivo stanovení účinnosti.

Podle požadavků Evropské dohody o ochraně obratlovců

používaných pro pokusné a jiné vědecké účely (The European

Convention for the Protection of Vertebrate Animals

Used for Experimental and Other Scientific Purposes)

by se zkoušky na zvířatech neměly provádět, jestliže

je prakticky dostupná a vědecky uspokojivá vhodná alternativa.

Cílem tohoto pokynu je tedy podpořit upuštění

od stanovení účinnosti in vivo, kdekoliv se může pro daný

výrobek použít stanovení in vitro (stanovení D-antigenu)

s dostatečným zajištěním přijatelné účinnosti pro běžné

kontroly šarží.

Pro stanovení účinnosti in vivo se bere v úvahu zkouška

na potkanech jako metoda výběru. Pro vakcíny, u kterých

bylo provedeno stanovení účinnosti na kuřatech nebo na

morčatech a u kterých jsou záznamy o vývoji výroby, se

může stanovení účinnosti in vivo na potkanech vypustit,

jestliže se stanovení účinnosti na potkanech použilo také

u šarží, které byly zahrnuty do dále popsané validační

studie. Pro vakcíny, které dosud nebyly schváleny, by měly

být výsledky stanovení účinnosti na potkanech zařazeny

mezi údaje vytvořené pro prokázání shodnosti výroby

předtím, než se od tohoto stanovení účinnosti in vivo

upustí.

Jakmile se již od stanovení účinnosti in vivo upustí, šarže

vakcíny se budou propouštět na základě stanovení in vitro

a stanovení in vivo by se nemělo používat jako alternativa

propouštění šarže, u které nebude in vitro stanovení vyhovovat.

Opakování in vivo stanovení se může provést na základě

schváleného postupu.

POSTUP

Následující podmínky by měly být splněny před provedením

validační studie:

– příslušné zkušenosti se stanovením účinnosti na potkanech;

– úplná validace stanovení D-antigenu (linearita, opakovatelnost,

střední míra přesnosti, přesnost a kvantifikační

limity);

– stanovení kritéria přijatelnosti pro stanovení D-antigenu

založené na vhodném počtu po sobě následujících šarží;

– stanovení shodnosti výroby posledních konečných várek

za použití průběžně schvalovaného stanovení účinnosti in

vivo; poslední konečné várky by měly odpovídat šaržím

použitým pro stanovení kritérií přijatelnosti pro stanovení

D-antigenu a měly by představovat rozdílné inaktivované

sklizně každého ze tří typů polioviru.

Validační zkouška by se měla provést:

– v konečné várce/šarži, která reprezentuje stávající výrobní

postup;

– u dvou subpotentních šarží připravených např. tepelným

ošetřením normální vakcíny nebo smícháním s vakcínou,

která byla tepelně ošetřena; subpotentní šarže by měly

mít očekávaný titr rovnající se asi polovině titru reprezentativní

konečné várky/šarže.

U těchto šarží se použije jako referenční standard homologní

výrobní šarže a provede se:

– zkouška účinnosti in vivo aktuálně schváleným testem;

– zkouška na potkanech v případě, že to není aktuálně

schválená zkouška účinnosti in vivo;

– stanovení D-antigenu.

Vynechání zkoušky účinnosti in vivo je přijatelné, jestliže

konečná várka/šarže vyhovuje ve zkoušce účinnosti in vivo

a in vitro a subpotentní šarže nevyhovují. Jestliže subpotentní

šarže nevyhovuje stanovení D-antigenu, ale vyhovuje

ve zkoušce účinnosti in vivo, může se in vivo stanovení

opakovat.

386 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.21 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO VON WILLEBRANDOVA FAKTORU


VON WILLEBRANDOVA FAKTORU

6.0:20721

Lidský von Willebrandův faktor má různé biologické funkce.

V současné době se pro stanovení jeho účinnosti může

použít stanovení ristocetinového kofaktoru a stanovení při

vazbě na kolagen. Účinnost lidského von Willebrandova

faktoru se stanoví za daných podmínek porovnáním jeho

účinnosti se stejnou účinností referenčního přípravku kalibrovaného

proti mezinárodnímu standardu. Uvádí se

v mezinárodních jednotkách, kde je to vhodné.

Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství

mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný lidský

koncentrát von Willebrandova faktoru. Hodnotu účinnosti



STANOVENÍ RISTOCETINOVÉHO KOFAKTORU

Účinnost von Willebrandova faktoru stanovením ristocetinového

kofaktoru se měří aglutinací suspenze trombocytů

za přítomnosti ristocetinu. Může se provést kvantitativní

stanovení za použití automatických přístrojů nebo semikvantitativní

stanovení vizuálním posouzením posledního

záchytu aglutinace v sérii ředění. Přednost se dává kvantitativnímu

stanovení.

ZKOUMADLA

Suspenze trombocytů. Použijí se standardní přípravky čerstvě

izolovaných promytých lidských trombocytů upravených

např. formaldehydem nebo paraformaldehydem. Tato

suspenze se také může lyofilizovat. Přidá se vhodné množství

ristocetinu A, je-li to třeba. Některá zkoumadla trombocytů

již ristocetin A obsahují.

Referenční přípravek. Mezinárodní standard pro koncentrát

von Willebrandova faktoru.

POSTUP

Semikvantitativní stanovení. Připraví se vhodná ředění

zkoušeného přípravku a referenčního přípravku za použití

ředicího roztoku obsahujícího chlorid sodný R (9 g/l) a albumin

lidský R (10 g/l až 50 g/l). Ke každému ředění se přidá

vhodné množství suspenze trombocytů a, je-li třeba, ristocetinu

A. Míchá se na povrchu sklíčka 1 min jemným

krouživým pohybem. Nechá se stát další 1 min a výsledek

se odečte při bočním osvětlení proti tmavému pozadí. Titrem

ristocetinového kofaktoru vzorku je poslední ředění,

které jasně ukazuje viditelnou aglutinaci. Ředicí roztok se

použije jako negativní kontrola.

Kvantitativní stanovení. Rekonstituuje se celý obsah jedné

ampule referenčního a zkoušeného přípravku přidáním

vhodného množství doporučeného ředidla (např. vody R)

a ihned se použije. Rekonstituované přípravky se zředí na

roztoky s obsahem 0,5 m. j./ml až 2,0 m. j./ml izotonickým

trometamolovým nebo imidazolovým tlumivým roztokem

bez chelatotvorných složek, který obsahuje např. 1 % až

5 % albuminu lidského nebo albuminu hovězího.

Zkouška se provádí podle pokynů výrobce s nejméně dvěma

sériemi ředění. Použije se tolik ředění, kolik je třeba

k získání alespoň tří různých koncentrací z lineárního rozsahu

stanovení.

Ověří se platnost stanovení a vypočítá se účinnost zkoušeného

přípravku obvyklými statistickými metodami (např. 5.3).

STANOVENÍ VAZBY NA KOLAGEN

Účinnost von Willebrandova faktoru stanovením vazby na

kolagen se provádí enzymově imunosorbentovou metodou

na mikrotitračních destičkách potažených kolagenem. Metoda

je založena na specifické vazbě von Willebrandova

faktoru k fibrilám kolagenu a následné vazbě polyklonální

protilátky proti von Willebrandovu faktoru konjugované

s enzymem, který po přidání chromogenního substrátu vytvoří

produkt kvantitativně stanovitelný spektrofotometricky.

Závislost mezi von Willebrandovým faktorem vázaným

na kolagen a absorbancí je za vhodných podmínek lineární.

ZKOUMADLA

Kolagen. Použijí se nativní fibrily koňského nebo lidského

kolagenu typu I nebo III. Pro usnadnění manipulace se mohou

použít roztoky kolagenu.

Ředicí roztok pro kolagen. Rozpustí se 50 g glukosy R ve

vodě R, pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS

na hodnotu 2,7 až 2,9 a zředí se vodou R na 1000 ml.


chloridu sodného R, 1,05 g hydrogenfosforečnanu sodného

dihydrátu R, 0,2 g dihydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu

R a 0,2 g chloridu draselného R se rozpustí ve vodě R.

Hydroxidem sodným 1 mol/l RS nebo kyselinou chlorovodíkovou

1 mol/l RS se upraví pH na hodnotu 7,2 a zředí se

vodou R na 1000 ml.

Promývací tlumivý roztok. Tlumivý roztok fosforečnanový

s chloridem sodným obsahující polysorbát 20 R (1 g/l).

Zkoumadlo blokační. Tlumivý roztok fosforečnanový

s chloridem sodným obsahující polysorbát 20 R (1 g/l)

a sérový albumin hovězí R (10 g/l).

Ředicí tlumivý roztok. Tlumivý roztok fosforečnanový

s chloridem sodným obsahující polysorbát 20 R (1 g/l)

a sérový albumin hovězí R (50 g/l).

Konjugát. Konjugát králičího séra proti lidskému von Willebrandovu

faktoru a křenové peroxidasy. Použije se podle

pokynů výrobce.

Roztok substrátu. Tableta o-fenylendiamin-dihydrochloridu

a tableta močoviny s peroxidem vodíku se těsně před použitím

rozpustí ve 20 ml vody R nebo se použije vhodný objem

peroxidu vodíku. Chrání se před světlem.

Mikrotitrační destičky. Polystyrenové destičky s plochým

dnem, s povrchovými vlastnostmi optimálními pro enzymově

imunosorbentové stanovení a s vysokou vazebnou kapacitou

k bílkovinám.

POSTUP

Zkoušené roztoky. Zkoušený přípravek se rekonstituuje

způsobem uvedeným v označení na obalu. Zředí se ředicím

tlumivým roztokem na roztok obsahující přibližně 1 m. j.

von Willebrandova faktoru. Za použití ředicího tlumivého

roztoku se připraví dvě samostatné série alespoň tří dalších

ředění.

Porovnávací roztoky. Referenční přípravek se rekonstituuje

předepsaným způsobem. Zředí se ředicím tlumivým roztokem

na roztok obsahující přibližně 1 m. j. von Willebran-

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 387

2.7.22 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO KOAGULAČNÍHO FAKTORU XI

dova faktoru. Za použití ředicího tlumivého roztoku se připraví

dvě samostatné série alespoň tří dalších ředění.

Roztok kolagenu se nechá zahřát na teplotu místnosti. Zředí

se ředicím roztokem pro kolagen na roztok obsahující

30 μg až 75 μg kolagenu/ml a mírně se míchá, aby se vytvořila

rovnoměrná suspenze kolagenových fibril. Do každé

jamky mikrotitrační destičky se pipetuje 100 μl. Destička se

zakryje plastovou folií a inkubuje se přes noc při 37 °C.

Jamky destičky potažené kolagenem se vyprázdní obrácením

a vykapáním na papírovou utěrku. Přidá se 250 μl

promývacího tlumivého roztoku. Jamky destičky se opět

vyprázdní obrácením a vykapáním na papírovou utěrku.

Tento postup se opakuje třikrát. Do každé jamky se přidá

250 μl zkoumadla blokačního. Destička se zakryje plastovou

fólií a inkubuje se 1 h při 37 °C. Jamky destičky se

vyprázdní obrácením a vykapáním na papírovou utěrku.

Přidá se 250 μl promývacího tlumivého roztoku. Jamky destičky

se opět vyprázdní obrácením a vykapáním na papírovou

utěrku. Tento postup se opakuje třikrát.

Do jamek se přidá 100 μl každého ze zkoušených roztoků

nebo porovnávacích roztoků. Do série jamek použitých jako

negativní kontrola se přidá 100 μl ředicího tlumivého

roztoku. Destička se zakryje plastovou fólií a inkubuje se

2 h při 37 °C. Jamky destičky se vyprázdní obrácením a vykapáním

na papírovou utěrku. Přidá se 250 μl promývacího

tlumivého roztoku. Jamky destičky se opět vyprázdní obrácením

a vykapáním na papírovou utěrku. Tento postup se

opakuje třikrát.

Připraví se vhodné ředění (např. s ředicím faktorem 1 až

4000) konjugátu tlumivým roztokem fosforečnanovým

s chloridem sodným obsahujícím sérový albumin hovězí R

(5 g/l). Do každé jamky se přidá 100 μl. Destička se zakryje

plastovou fólií a inkubuje se 2 h při 37 °C. Jamky destičky

se vyprázdní obrácením a vykapáním na papírovou utěrku.

Přidá se 250 μl promývacího tlumivého roztoku. Jamky destičky

se opět vyprázdní obrácením a vykapáním na papírovou

utěrku. Tento postup se opakuje třikrát.

Do každé jamky se přidá 100 μl roztoku substrátu a inkubuje

se 20 min při teplotě místnosti ve tmě. Pak se do každé

jamky přidá 100 μl kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS.

Měří se absorbance při 492 nm. Hodnoty absorbance se použijí

k výpočtu stanovení účinnosti zkoušeného přípravku

obvyklými statistickými metodami (např. 5.3).

Zkoušku nelze hodnotit, jsou-li naměřené absorbance negativních

kontrol vyšší než 0,05.


KOAGULAČNÍHO FAKTORU XI

8.2:20722

Podstatou stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru

XI je schopnost zkrátit prodloužený čas koagulace plazmy

s deficitem faktoru XI přípravkem faktoru XI. Reakce

se urychlí přidáním zkoumadla obsahujícího fosfolipid

a aktivátor kontaktu, např. kaolin, oxid křemičitý, kyselina

ellagová. Účinnost se hodnotí porovnáním křivky závislosti

odpovědi na dávce pro zkoušený přípravek a pro referenční

plazmu kalibrovanou proti mezinárodnímu standardu lidského

koagulačního faktoru XI v plazmě.

Zkoušený a referenční přípravek se odděleně rekonstituují

podle návodu uvedeného v označení na obalu a ihned se

použijí. Jako referenční přípravek je vhodné použít faktory

V, VIII, XI a XIII koagulační v plazmě BRP. Kde je to

vhodné, stanoví se množství heparinu (2.7.12) a heparin se

neutralizuje např. přidáním protamin-sulfátu R (10 μg protamin-sulfátu

neutralizuje 1 m. j. heparinu). Zkoušený přípravek

a referenční přípravek se předem zředí plazmou

s deficitem faktoru XI (např. plazma substrátem R3) na roztoky

obsahující 0,5 až 2,0 jednotky/ml. Připraví se nejméně

dvě série tří dalších ředění každého předem zředěného přípravku

za použití vhodného tlumivého roztoku (např. tlumivého

roztoku imidazolového o pH 7,3 R) s obsahem albuminu

hovězího (10 g/l) nebo albuminu lidského (10 g/l)

a ihned se použijí.

Použije se přístroj vhodný pro měření času srážení nebo se

stanovení provede v inkubačních zkumavkách ve vodní

lázni při 37 °C. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml plazmy

s deficitem faktoru XI (např. plazma substrátu R3) a 0,1 ml

jednoho z ředění referenčního nebo zkoušeného přípravku.

Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného zkoumadla

pro stanovení aktivovaného parciálního tromboplastinového

času (APTT) obsahujícího fosfolipid a aktivátor kontaktu

a směs se inkubuje doporučenou dobu při 37 °C. Do

každé zkumavky se přidá 0,1 ml roztoku chloridu vápenatého

R (3,7 g/l) předem zahřátého na 37 °C. Pomocí stopek

se změří čas koagulace, tj. interval mezi přidáním chloridu

vápenatého a prvními známkami tvorby fibrinu. Výše uvedené

objemy se mohou přizpůsobit podle zkoumadla pro

aktivovaný parciální tromboplastinový čas a podle použitého

přístroje. Účinnost se vypočítá za použití obvyklých statistických

metod (např. 5.3)

2.7.23 STANOVENÍ POČTU BUNĚK

CD34/CD45+ V PŘÍPRAVCÍCH

PRO KRVETVORBU

10.0:20723

Tato stať popisuje imunologické značení a analýzu metodou

průtokové cytometrie (2.7.24) za účelem stanovení

počtu buněk CD34/CD45+ obsažených v přípravcích pro

krvetvorbu. Stanovení se provádí jednostupňovou metodou

za použití kalibrovaných částic označených fluorochromem

po lýze erytrocytů ve vzorku, kde je to nutné.

Tato metoda se používá pro všechny typy přípravků a pro

plnou krev. Vzhledem k charakteristikám této metody je

zvláště vhodná pro přípravky s velmi nízkým procentuálním

zastoupením buněk CD34/CD45+.

Posouzení jakosti štěpu stanovením

počtu buněk CD34/CD45+

Řada studií ukázala, že 1 % až 3 % buněk v kostní dřeni,

které nesou povrchový antigen CD34, je schopno po myeloablativní

léčbě rekonstituovat dlouhodobou krvetvorbu

v mnoha liniích. Buňky CD34/CD45+ se také nacházejí

v periferním oběhu normálních jedinců, ale jsou mimořádně

vzácné (0,01 % až 0,1 %). Buňky CD34/CD45+ však

mohou být ve větším počtu také mobilizovány z kostní dřeně

do periferního oběhu hematopoetickými cytokiny, jako

je faktor stimulující granulocytové kolonie, a/nebo chemoterapií.

388 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.23 STANOVENÍ POČTU BUNĚK CD34/CD45+ V PŘÍPRAVCÍCH PRO KRVETVORBU

Metoda používaná pro stanovení počtu buněk CD34/CD45+

musí splňovat následující požadavky:

– vysokou citlivost, protože krvetvorné buňky se vyskytují

vzácně;

– přesnost, aby výsledky byly klinicky významné;

– reprodukovatelnost, aby výsledky byly klinicky spolehlivé;

– rychlost, aby se analýza zajistila v reálném čase.

Výběr parametrů

Metoda průtokové cytometrie používá komerčně dostupné

přímo konjugované monoklonální protilátky značené fluorochromem,

běžné postupy barvení a lýzy plné krve, a strategii

vytvoření zón (gating strategy) používající rozptyl

světla a analýzu imunofluorescence za použití kombinace

monoklonálních protilátek pan-CD45/CD34.

Je možné stanovit životaschopnost buněk CD34/CD45+

vhodným barvením nukleových kyselin barvivem, které nepřechází

přes intaktní buněčnou membránu (např. 7-aminoaktinomycin

D).

Výběr monoklonálních protilátek

Protilátky CD34. Použijí se protilátky CD34 třídy III, které

detekují všechny glykosylované varianty molekuly (např.

klon 8G12 nebo 581). K detekci vzácných případů se použije

protilátka konjugovaná s nejjasnějším fluorochromem

excitovatelným argonovým laserem průtokového cytometru,

např. fykoerythrin (PE).

Protilátky CD45. Požadují se protilátky pan-CD45, které

detekují všechny izoformy a všechny glykoformy této

struktury. Obvykle se používá protilátka CD45 konjugovaná

s fluorochromem fluorescein-isothiokyanátem (FITC)

(např. J33, HLe1, 2D1).

Izotypové nebo izoklonální kontroly. Použije se negativní

kontrola k detekci jakéhokoliv nespecifického signálu v oblasti

fluorescence fykoerythrinu. Pokud se použije izotypová

kontrola (monoklonální protilátka proti irelevantnímu

antigenu stejného izotypu, jako je použitá protilátka CD34),

kombinuje se izotyp konjugovaný s fykoerythrinem

s CD45-fluorescein-isothiokyanátem (nebo PerCP). Pokud

se použije izoklonální kontrola, kombinuje se nekonjugovaná

protilátka (v nadbytku) a fykoerythrin-konjugovaná

identická monoklonální protilátka CD34 s konjugovaným

CD45. Mohou se použít i alternativní kombinace.

Absolutní počet buněk CD34/CD45+

Kalibrované částice značené fluorochromem. V závislosti

na použité metodě jsou vnitřním standardem buď kalibrované

částice v suspenzi, nebo je vnitřní standard dodaný

přímo výrobcem (v přiložených zkumavkách).

Absolutní počet buněk CD34/CD45+ v mikrolitru se vypočítá

podle vzorce:

A × C ,

B

v němž značí:

A – stanovený počet buněk CD34/CD45+;

B – stanovený počet jednotlivých částic značených fluorochromem;

C – známou koncentraci částic značených fluorochromem.

Strategie vytvoření zón (gating strategy)

Účelem postupného vytvoření zón je výběr sledované populace

a zároveň minimalizace interference způsobené

zbytky buněk a zralými buňkami, na které se mohou protilátky

vázat nespecificky. Pokud se použije komerční souprava

(kit), použije se strategie vytvoření zón doporučená

výrobcem. Pokud se použije metoda vypracovaná vlastní

laboratoří, použije se přednostně běžně doporučovaná strategie.

Strategie vytvoření zón, která používá parametry rozptylu

světla a fluorescenci CD34/CD45, pomůže k přesné

identifikaci a vyčíslení buněk CD34/CD45+.

Analyzovaný počet buněk

Pro dosažení přijatelné přesnosti a preciznosti se analyzuje

dostatečný počet buněk, např. nejméně výskyt 100 buněk

CD34+ a nejméně výskyt 60 000 buněk CD45+; celkový

počet analyzovaných buněk může být vyšší, jestliže zastoupení

buněk CD34 je 0,1 % nebo méně.

Odběr vzorků

Při postupech aferézy se používá antikoagulační roztok

kyselina-citrát-glukosa (ACD), složení A. Tento antikoagulační

roztok umožňuje provést ze stejného vzorku automatizované

stanovení počtu leukocytů i hodnocení na průtokovém

cytometru. Kyselina edetová (EDTA) je vhodná

jako antikoagulans při odběru vzorků periferní krve.

Transport vzorků

Transportní podmínky (fyzikální a tepelné) zajišťují

bezpečnost vzorků.

Neporušenost vzorků a uchovávání

Je možné použít čerstvé (do 24 h od odběru) přípravky

z aferézy, vzorky plné krve, vzorky pupečníkové krve nebo

vzorky kostní dřeně. Staré vzorky (více než 24 h po odběru)

a vzorky, které byly zmrazeny a rozmrazeny, se barví vitálním

barvením na stanovení životaschopnosti. Při přijetí se

ověří teplota uvnitř zásilky.

POSTUP

Příprava vzorku

Před přidáním monoklonálních protilátek se zajistí vhodná

koncentrace leukocytů. Kde je to nutné, naředí se vzorek

médiem, které je slučitelné se zkoušeným vzorkem a systémem

pro lýzu. Faktor ředění se zaznamená. Doporučuje se

provést zkoušku s negativní kontrolou.

Analýza průtokovou cytometrií

Autostandardizace

Pro analýzu buněk značených komerčně dostupnou soupravou

(kitem) se mohou pro nastavení průtokového cytometru

využít kontrolní prostředky vyvinuté výrobci. Tato nastavení

se potom automaticky přenesou do protokolu o analýze

vzorků. K nastavení fotonásobiče na cílové hodnoty se

použijí specifické částice značené fluorochromem, nastaví

se kompenzace a systém se zkontroluje za použití kontrolního

přípravku.

Nastavení systému:

– diskriminátor/práh šumu: práh rozptylu světla ve směru

paprsku se nastaví tak, aby se z grafického vyjádření rozptylu

světla vyloučily zbytky buněk (nízký čelní rozptyl),

ale ne malé lymfocyty;

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 389

2.7.24 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE

– nastavení vysokého napětí fotonásobiče: musí odpovídat

analýze povrchových markerů buňky a musí se stanovit

pro každou laboratoř tak, aby bylo možné rozlišit negativní

a pozitivní buněčné populace se střední hustotou

antigenů; napětí fotonásobiče se pravidelně reviduje

a pravidelně se nastavuje podle standardizovaných postupů

laboratoře;

– kompenzace: musí odpovídat přesahu barevných spekter

(např. FITC/PE), který se vyskytuje při analýze povrchových

markerů buněk; kompenzace zbarvení se analyzuje

a nastavuje se podle standardizovaných postupů laboratoře;

– rychlost průtoku: musí odpovídat běžné analýze povrchových

markerů buněk;

– zónované oblasti: zóny vytvořené pro vzorky

CD34/CD45 se pro analýzu negativní oblasti nemění.

Výpočet absolutního počtu buněk CD34/CD45+

Absolutní počet buněk CD34/CD45+ se vypočítá podle

vzorce:

n × D × V ,

v němž značí:

n – celkový počet buněk CD34/CD45+ na mikrolitr;

D – faktor ředění;

V – objem zkoušeného přípravku v mikrolitrech.

Výsledky se vyjadřují jako procentuální zastoupení buněk

CD34/CD45+ i jako jejich absolutní počet v mikrolitru.

Mohou se také vyjádřit jako absolutní počet na kilogram

tělesné hmotnosti příjemce, kde je to možné.


6.0:20724

Je to analýza mnoha parametrů založená na optických vlastnostech

jednotlivých částic v průtokovém systému.

Buňky nebo částice v suspenzi se jednotlivě řadí do lineárního

uspořádání (proud) a protékají detekčním zařízením.

Pevné tkáně se musí pro analýzu rozmělnit na suspenzi jednotlivých

buněk.

Parametry měřitelné průtokovou cytometrií zahrnují objem

a morfologickou složitost buněk nebo buňkám podobných

struktur, buněčné pigmenty, obsah DNA, obsah RNA, bílkoviny,

markery buněčného povrchu, nitrobuněčné markery,

aktivitu enzymů, hodnotu pH, stav membrány a její fluiditu.

Pro jednotlivou buňku lze změřit dva morfologické parametry

a jeden nebo více fluorescenčních signálů. Analýza

mnoha parametrů umožňuje definovat buněčné populace na

základě jejich fenotypu.

PŘÍSTROJ

Zaostřování, zvětšování a výběr světelného zdroje se optimalizují

tak, aby umožnily automatickou detekci a měření morfologických

rozdílů a charakteristik barvení. Průtokovou cytofluorometrickou

analýzu ovlivní následující kritéria:

– výběr světelného zdroje v závislosti na parametrech, které

mají být analyzovány;

– úprava nastavení přístroje v závislosti na typu buněk, které

mají být analyzovány (např. buněčné kultury, leukocyty,

trombocyty, bakterie, spermie, kvasinky), a na analýze,

která má být provedena (např. fenotypizace, buněčný

cyklus, apoptóza, cytokiny, fluidita membrány, fluorescenční

bílkovina).

Pro průtokovou cytometrii je charakteristické automatické

vyhodnocování souboru parametrů u vysokého počtu jednotlivých

buněk při každém měření. Např. během 1 min se

analyzuje 100 000 částic jedna po druhé nebo i více (prakticky

neomezeně). Dolní hranice detekce je sto fluorescenčních

molekul na buňku.

Průtokový cytometr má pět hlavních součástí:

– fluidní systém a průtokovou celu;

– zdroj světla;

– systém pro detekci a převod analogového signálu na digitální;

– amplifikační systém;

– počítač vybavený softwarem pro analýzu signálů.

FLUIDNÍ SYSTÉM A PRŮTOKOVÁ CELA

V průtokové komoře se jednotlivá buňka vystaví zdroji světla

a detekuje se. Fluidní systém unáší buňky suspenze jednotlivě

ze zkumavky se vzorkem k místu průsečíku s laserovým

paprskem. Za tím účelem se proud vzorku v průtokové komoře

unášený nosnou tekutinou velmi ztenčí (hydrodynamická

fokusace). Světelný paprsek se zaostří dvěma konfokálními

čočkami do eliptického tvaru do průtokové cely, kterou

procházejí buňky. Rychlost průtoku musí být při běžné

analýze povrchových markerů konstantní a musí zajistit

vhodné rozestupy mezi buňkami umožňující počítání buněk.

ZDROJE SVĚTLA

Obvykle používané zdroje světla jsou:

– lampy (rtuťová, xenonová);

– vysokovýkonné lasery chlazené vodou (argonový, kryptonový,

barvivový laser);

– nízkovýkonné lasery chlazené vzduchem [argonový

(488 nm), červený helium-neonový (633 nm), zelený

helium-neonový, helium-kadmiový (UV)];

– diodové lasery (modrý, zelený, červený, fialový).

DETEKCE SIGNÁLU

Když částice prochází paprskem světla, rozptýlí část světla

do všech směrů. Jestliže se k analyzované částici přidají

fluorescenční barviva, vydávají své vlastní světlo (fluorescenci),

které také vyzařuje do všech směrů. Mohou tedy

vzniknout dva typy signálů:

– rozptyl světla;

– fluorescenční emise.

Detektory světla v přístroji zachycují část tohoto rozptýleného

a fluorescenčního světla a vytvářejí elektronické signály

úměrné množství zachyceného světla.

Rozptyl. Měří se dva parametry rozptýleného světla:

– množství rozptýlené hlavně ve směru světelného paprsku

(čelní rozptyl),

– množství rozptýlené v úhlu 90° od směru světelného paprsku

(boční rozptyl).

Čelní rozptyl koreluje s objemem buňky, zatímco boční

rozptyl je ovlivněn parametry, jako je tvar jádra, množství

a typ granulí cytoplazmy nebo cytoplazmatické výběžky

membrány, a koreluje s morfologickou složitostí buňky,

takže čím vyšší je intenzita bočního rozptylu, tím je buňka

složitější. Signály rozptylu vznikají během průtokové ana-

390 ČL 2017 – Dopl. 2020


lýzy vždy jako funkce morfologických vlastností buněk;

definují se jako vnitřní parametry buňky.

Fluorescence. Při průchodu měřicí oblastí emituje buňka

fluorescenční světlo v závislosti na typu a počtu světelných

zdrojů. Fluorescenční signály se vytvářejí z fluorescenčních

barviv přirozeně přítomných v buňkách (např. koenzymy,

chlorofyl, pigmenty mořských řas) a/nebo z fluorescenčních

sond (fluorescent probes) převzatých buňkami při jejich

barvení pro analýzu specifických vlastností buněk

(např. fluorescenční protilátky, barviva nukleových kyselin,

indikátory pH a indikátory vápníku, fluorescenční bílkoviny).

V současné době je k dispozici velký počet a široká

škála různých typů fluorescenčních sond. Optické filtry se

musí adaptovat na použité fluorochromy a musí se vyměnit,

pokud je to nutné. Každá fluorescenční sonda se charakterizuje

svým excitačním a svým emisním spektrem. Fluorescenční

sonda se volí v závislosti na excitačním zdroji

a detekčním systému a podle specifického účelu analýzy.

ŘÍZENÍ SIGNÁLU A JEHO KONVERZE

Z ANALOGOVÉHO NA DIGITÁLNÍ

Signály rozptylu a fluorescence, emitované buňkami při jejich

průchodu paprskem laseru, se optickými filtry třídí

a usměrňují k příslušným detektorům. Detektory jsou snímače

(fotonásobiče), které mění světelné signály vyzařované

buňkami na napěťové impulzy.

Metoda počítání každého impulzu v příslušném kanálu je

známá jako konverze signálu z analogového na digitální.

Konečným výsledkem celého postupu je frekvenční histogram.

Amplifikace. Pro optimální vizualizaci je třeba napěťové

impulzy amplifikovat. Metoda amplifikace zdůrazňuje rozdíly

mezi signály buněk a následně zvyšuje rozlišení mezi

buněčnými populacemi s různými charakteristikami (např.

rozlišení mezi životaschopnými buňkami a buňkami, které

nejsou životaschopné, nebo mezi nespecifickou a specifickou

fluorescencí antigenu po barvení fluorescenční monoklonální

protilátkou).

Existují dvě metody amplifikace: lineární nebo logaritmická;

výběr mezi těmito dvěma typy se provádí pro

každý jednotlivý signál podle morfologických charakteristik

buněk a použitých barvicích zkoumadel (např. fluorescenční

monoklonální protilátky, barviva nukleových

kyselin).

Lineární amplifikace, která zvyšuje rozdíly mezi silnými

impulzy, se používá u těch parametrů, které vytvářejí signály

o vysoké intenzitě, např.:

– u rozptylu buňkami;

– u fluorescence barviv nukleových kyselin pro studium

buněčného cyklu.

Logaritmická amplifikace se naproti tomu používá pro slabé

impulzy a parametry nebo za takových podmínek, kdy

mohou vzniknout slabé i silné impulzy, např. u:

– buněčných antigenů;

– rozptylu trombocyty, bakteriemi, kvasinkami;

– fluorescence barviv nukleových kyselin při studiu apoptózy.

Kompenzace signálů fluorescence. Každé fluorescenční

barvivo má absorpční spektrum při určité vlnové délce

a emisní spektrum při vyšší vlnové délce. Pokud se použijí

pro barvení buněk zároveň dvě nebo více fluorescenčních

sond (např. čtyřbarevná imunofluorescence), mohou se

emisní světla fluorochromů překrývat. V důsledku toho bude

každý detektor fluorescence zachycovat fluorescenční

světlo pro něj specifické a různé množství světla emitovaného

dalšími fluorescenčními sondami. Výsledkem je přesah

signálu a špatné oddělení buněčných populací.

Řešením je použití elektronické matice, která umožňuje selektivní

odečtení interferujících signálů od každého fluorescenčního

signálu po zachycení detektorem (kompenzace

fluorescence).

Pro kompenzaci fluorescence je třeba použít kalibrátory

fluorescence. Jsou to přednostně pozitivní vzorky buněk

značené sledovanými fluorochromy kombinovanými obdobným

způsobem jako v případě protilátek použitých při

analýze.

ZÁZNAM SIGNÁLU A JEHO ZOBRAZENÍ

Po amplifikaci a kompenzaci se signály zaznamenají dvojrozměrně

nebo trojrozměrně. Histogramy ukazují intenzitu

signálů ve vztahu k počtu buněk pro daný parametr. Cytogramy,

na kterých každý bod reprezentuje buňku, vznikají

jako kombinace intenzit dvou signálů (dvouparametrová

bodová grafická znázornění). Typ a počet grafických znázornění

a kombinace signálů se vyberou podle vzorků a použitých

barviv. Při analýze získaných údajů může software

cytometru vytvořit také jiné typy grafů (jako jsou překryvy,

tomogramy a grafická znázornění plošná, obrysová, hustotní

a překryvná). Mohou se použít také statistické údaje, jako

jsou průměrné intenzity fluorescence (a jejich posuny

v čase nebo jejich závislost na funkci buňky).

ANALÝZA ÚDAJŮ

V buněčných suspenzích, které se mají analyzovat, mohou

být přítomny různé typy buněčných populací, z nichž některé

jsou nechtěné (např. mrtvé buňky, buněčné zbytky

nebo makroagregáty) nebo jsou pro analýzu prostě nevýznamné

(např. granulocyty při studiu lymfocytů). Závisí to

na typu buněčného vzorku (plná krev, kostní dřeň, buněčné

kultury, biologické tekutiny, suspenze buněk z pevných

tkání) a na postupech použitých při zacházení s nimi (např.

metody barvení, buněčná lýza, fixace, kryokonzervace,

rozmrazení, příprava tkání zalitých v parafinu).

V důsledku toho ne všechny signály vzniklé během analýzy

na průtokovém cytometru patří buňkám, které se mají studovat.

K vyloučení nechtěných a irelevantních buněčných

signálů existují dvě strategie.

První se používá během získávání údajů. Na jeden významný

parametr (nebo více významných parametrů) se

použije práh šumu nastavený tak, aby se měřily jen buňky

s intenzitou signálu vyšší, než je předem definovaná hodnota

rozlišení pro tento parametr. Nejčastěji se jako tento parametr

volí čelní rozptyl vzhledem k jeho charakteristicky

silnému signálu s nízkým stupněm interference.

Druhá strategie se uplatňuje během analýzy údajů. Spočívá

v použití vytvořených zón (gating regions), aby se analýza

omezila pouze na signály z těch populací, které splňují dané

morfologické charakteristiky a charakteristiky profilu

exprese. Běžně se používají dva typy logického vytvoření

zón. Prvním typem je použití zóny vytvořené na základě

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 391

2.7.25 STANOVENÍ ÚČINNOSTI INHIBITORU LIDSKÉHO PLAZMINU

morfologie buněk. Buněčné populace se identifikují na základě

svých morfologických signálů (čelní rozptyl a boční

rozptyl). Vytvořená zóna se vyznačí kolem sledované populace

(např. lymfocyty, životaschopné buňky) a fluorescenční

grafické znázornění se zobrazí jen z této vybrané

oblasti. Druhým typem je vytvoření zón vycházející

z fluorescence. Sledovaná buněčná populace se identifikuje

na základě intenzity exprese antigenu nebo barviva

a vytvoří se zóna okolo ní. Následně se fluorescenční grafická

znázornění zobrazí jen z této vybrané oblasti.

Software analýzy umožňuje vytvoření vícenásobných zón

řazených postupně v logickém sledu. Tato možnost je

zvláště výhodná při studiu vzácných buněčných populací

nebo pro účely třídění.

KONTROLY

Vnitřní kontrola. Před měřením se musí optické nastavení

systému validovat za použití adaptovaných částic značených

fluorochromem a kontroluje se optimální stabilita průtoku.

Získané údaje se zaznamenávají a umožňují pravidelné přezkoumávání

kontrolních hodnot ve vztahu k průměrné hodnotě.

Je velmi vhodné používat pozitivní kontrolu, aby se

potvrdilo, že protilátka používaná ve zkoušce je funkční,

a umožnilo se správné nastavení průtokového cytometru. Pozitivní

kontrola musí zahrnovat vzorky, o nichž je známo, že

jsou pozitivní při vyšetření sledovaného markeru.

Vnější kontrola. Pro zajištění správnosti získaných údajů nebo

pro kontrolu reprodukovatelnosti výsledků mezi laboratořemi

se doporučuje účast ve studiích ověření způsobilosti.

2.7.25 STANOVENÍ ÚČINNOSTI INHIBITORU

LIDSKÉHO PLAZMINU

6.5:20725

Inhibitor lidského plazminu, také nazývaný a2-antiplazmin,

je plazmatická bílkovina, která inhibuje plazminovou (serin

proteasa) cestu fibrinolýzy rychlým vytvořením komplexu

s volným plazminem. Kromě toho je inhibitor lidského

plazminu při krevní koagulaci sesíťován faktorem XIII

s fibrinovými vlákny a interferuje s vazbou proenzymu

plazminogenu na fibrin.

Účinnost inhibitoru lidského plazminu se stanoví porovnáním

schopnosti zkoušeného přípravku inhibovat štěpení

specifického chromogenního substrátu plazminem se stejnou

schopností referenčního standardu inhibitoru lidského

plazminu. Štěpení chromogenního substrátu plazminem poskytuje

chromofor, který se může kvantitativně stanovit

spektrofotometricky.

Jednotlivá zkoumadla pro stanovení účinnosti se mohou

získat samostatně nebo v komerčních soupravách (kitech).

Je dostupná metoda kinetická i metoda konečného bodu

(end-point). Postupy a zkoumadla z různých kitů se mohou

lišit, proto je třeba postupovat podle pokynů výrobce. Základní

rysy postupu jsou popsány v následujícím příkladu

mikrotitrační destičkové kinetické metody.

ZKOUMADLA

Ředicí tlumivý roztok o pH 7,5. Použije se vhodný tlumivý

roztok podle pokynů výrobce. Je-li třeba, upraví se hodnota

pH.

Plazmin. Použije se přípravek lidského plazminu, který pokud

možno neobsahuje významné množství dalších proteas.

Rekonstituuje se a uchovává podle pokynů výrobce.

Chromogenní substrát plazminu. Jako vhodný chromogenní

substrát specifický pro plazmin se použije H-D-cyklohexylalanyl-norvalyl-lysyl-p-nitroanilin-hydrochlorid

(H-D-

-CHA-Nva-Lys-pNA.HCl) nebo L-pyroglutamyl-L-fenylalanyl-L-lysin-p-nitroanilin-hydrochlorid

(Glp-Phe-Lys-

-pNA.HCl). Rekonstituuje se ve vodě R na vhodnou koncentraci

podle pokynů výrobce.

POSTUP

Různá množství zkoušeného přípravku se promíchají s daným

množstvím plazminu a zbytková aktivita plazminu se

stanoví za použití vhodného chromogenního substrátu.

Zkoušený přípravek se rekonstituuje nebo rozmrazí podle

pokynů výrobce. Zředí se ředicím tlumivým roztokem

o pH 7,5 a připraví se nejméně dvě nezávislé série tří nebo

čtyř ředění zkoušeného přípravku a referenčního standardu.

0,020 ml každého ředění se promíchá s 0,020 ml ředicího

tlumivého roztoku o pH 7,5 a zahřeje se na 37 °C. Přidá se

0,040 ml roztoku plazminu (zkoušená koncentrace v rozmezí

0,2 nkat/ml až 1,6 nkat/ml) předem zahřátého na

37 °C a ponechá se 1 min při 37 °C. Ke každé směsi se přidá

0,020 ml roztoku chromogenního substrátu předem zahřátého

na 37 °C.

Ihned se zahájí měření změny absorbance při 405 nm

(2.2.25) za použití čtecího zařízení pro mikrotitrační destičky.

Vypočítá se rychlost změny absorbance (ΔA/min). Alternativně

se může použít stanovení konečného bodu (endpoint)

ukončením reakce kyselinou octovou a změřením absorbance

při 405 nm.

V obou případech by se měla doba štěpení chromogenního

substrátu vybrat tak, aby při 405 nm došlo k lineárnímu

vzestupu absorbance před tím, než je spotřebování substrátu

signifikantní. Objemy zkoumadel se proporcionálně mění,

provádí-li se stanovení ve zkumavkách nebo kyvetách

za použití spektrofotometrické metody.

Odečte se optická hustota kontrolního roztoku (připraví se

s ředicím tlumivým roztokem o pH 7,5) od optické hustoty

zkoušeného přípravku. Ověří se validita stanovení účinnosti

a vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými

statistickými metodami (5.3).

2.7.27 FLOKULAČNÍ HODNOTA (Lf)

DIFTERICKÉHO A TETANICKÉHO

TOXINU A TOXOIDU

(RAMONOVO STANOVENÍ)

6.0:20727

Obsah toxinu nebo toxoidu ve vzorku se může vyjádřit jako

flokulační hodnota (Lf) za použití Ramonova stanovení.

V tomto stanovení se přidává antitoxin ve vzestupných koncentracích

k sérii zkumavek obsahujících konstantní množství

toxinu nebo toxoidu. V ekvivalenčním bodě nastane ve

směsi toxinu/toxoidu a antitoxinu flokulace v jedné nebo ve

více zkumavkách. První zkumavka, ve které se flokulace objeví,

se použije ke stanovení Lf hodnoty vzorku.

Lf hodnota toxinu nebo toxoidu se určí jako počet jednotek

antitoxinu, který po smíchání se vzorkem vytvoří optimální

flokulační směs (Ramonovo stanovení).

392 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.28 STANOVENÍ BUNĚK TVOŘÍCÍCH KOLONIE U LIDSKÝCH KRVETVORNÝCH PROGENITOROVÝCH BUNĚK

Praktické zkušenosti ukazují, že výsledky kalibrace antitoxinů

v mezinárodních jednotkách, např. porovnáním s mezinárodními

antitoxinovými standardy, závisí na použitých

imunochemických metodách. Z tohoto důvodu se antitoxiny

použité pro Ramonovo stanovení musí kalibrovat přímo proti

mezinárodnímu biologickému referenčnímu zkoumadlu pro

difterický nebo tetanický toxoid pro flokulační zkoušku za

použití dále popsaných principů. Koncentrace takto určená se

může uvádět v Lf-ekvivalentech v mililitru (Lf-ekv./ml).

Dohodou je stanoveno, že 1 Lf je množství toxinu nebo toxoidu,

které flokuluje v nejkratším čase s 1 Lf-ekv. specifického

antitoxinu.

Rozsah objemů referenčního standardu antitoxinu upraveného

na koncentraci 100 Lf-ekv./ml se rozdělí do sérií flokulačních

zkumavek o rozměrech např. 7 cm × 1 cm. Do

každé zkumavky se přidá dostatečné množství roztoku chloridu

sodného R (9 g/l), aby se získal konstantní objem, např.

1 ml. Zkoušený vzorek se zředí, aby se získala očekávaná

koncentrace, přibližně 50 Lf/ml a poměrné množství, např.

1 ml, se přenese do zkumavek obsahujících antitoxin. Zkumavky

se důkladně promíchají protřepáním, umístí se do

vodní lázně o konstantní teplotě v rozmezí 30 °C až 52 °C

a pozorují se v pravidelných intervalech do prvního objevení

flokulace. Doporučuje se použít lupu a silné osvětlení.

Zaznamená se první a druhá směs, u které se objevila flokulace,

stejně jako čas, za který ke flokulaci došlo. Flokulace

může nastat ve dvou zkumavkách současně.

První zkumavka, ve které je flokulace, je ta, která obsahuje

množství antitoxinu nejbližší shodnému množství antigenu

ve vzorku. Obsah antitoxinu v této zkumavce se může použít

k vypočítání hodnoty Lf vzorku. Pokud je ve stejný čas

flokulace ve dvou zkumavkách, vypočítá se průměr.

Doba potřebná k flokulaci v první zkumavce (Kf) je vhodným

indikátorem jakosti antigenu. Pokud je za dané teploty

a koncentrace hodnota Kf vyšší než obvykle, znamená to,

že antigen byl poškozen. Hodnota Kf se také může měnit

v závislosti na jakosti použitého antitoxinu.

Příklad

Zkumavka A B C D E F

přidaný antitoxin 40 45 50 55 60 65

(Lf-ekv.)

přidaný antitoxin 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65

(ml)

přidaný roztok 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35

chloridu sodného

(ml)

přidaný zředěný

vzorek (ml)

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Na tomto příkladu je první zkumavka, která flokuluje, zkumavka

C a hodnota Lf zředěného vzorku je tedy 50 Lf/ml.

Nastane-li první flokulace ve zkumavce A nebo F, nepoukazuje

to na shodnost v této koncentraci. Bylo by nezbytné

provést opakovanou zkoušku za použití buď odlišného ředění

zkoušeného vzorku, nebo vybrat odlišný rozsah dávek

referenčního antitoxinu.

Větší přesnosti se může dosáhnout posunem flokulace za

první zkumavku. To by v uvedeném příkladu bylo, kdyby

druhá zkumavka, která flokuluje, byla zkumavka D, konečná

hodnota zředěného vzorku by byla 52, pokud by druhou

zkumavkou, která flokuluje, byla zkumavka B, konečná

hodnota zředěného vzorku by byla 48. Zkouška se může

provádět zdvojeně, s mírně odlišným ředěním zkoušeného

vzorku.

Jestliže nejsou známy očekávané hodnoty Lf dostupného

vzorku, doporučuje se získat hrubý odhad za použití širšího

rozpětí obsahu antitoxinu ve zkumavkách před zahájením

konečného zkoušení.

Příklad

Zkumavka A B C D E F

přidaný antitoxin 20 30 45 70 100 150

(Lf-ekv.)

Úroveň koncentrace toxinu nebo toxoidu a antitoxinu může

být proměnlivá, ale bude výrazně ovlivněna flokulačním časem,

takže při velmi nízké úrovni bude zkouška trvat příliš

dlouho, zatímco při vysoké úrovni bude tak rychlá, že bude

obtížné rozlišit první a druhou zkumavku, která flokuluje.

Stanovení obsahu nízkých koncentrací

směsnou flokulací

Pro velmi nízké koncentrace se přednostně měří obsah toxinu

nebo toxoidu směsnou flokulací. Ta zahrnuje porovnání

hodnoty Lf známého toxinu nebo toxoidu a jeho hodnoty

ve směsi se vzorkem.

Když toxin nebo toxoid o známé hodnotě Lf a toxin nebo

toxoid o neznámé hodnotě Lf tvoří při flokulaci homogenní

směs, pak výsledná hodnota flokulace je součtem jejich

hodnot Lf. Jestliže se smíchají nehomogenní toxiny nebo

toxoidy, vznikne nesourodý vzorek se dvěma flokulačními

maximy.

2.7.28 STANOVENÍ BUNĚK TVOŘÍCÍCH

KOLONIE U LIDSKÝCH

KRVETVORNÝCH

PROGENITOROVÝCH BUNĚK

6.0:20728

Systém krvetvorby reprezentuje kontinuitu buněk, jejichž

fenotyp a vlastností se mění při tom, jak se vyvíjejí od kmenových

buněk na diferencované buňky.

Krvetvorné progenitorové buňky jsou schopné vytvářet kolonie

nebo „shluky buněk“ v kulturách rostoucích v polotuhých

médiích, říká se, že jsou „klonogenní“. Stanovení

počtu buněk tvořících kolonie (colony forming cells; CFC)

obsažených v buněčném přípravku se používá jako indikátor

funkční kapacity progenitorových buněk a jako ukazatel

obnovení krvetvorby. Naměřený počet buněk tvořících kolonie

koreluje s minimálním počtem progenitorových buněk

přítomných ve vzorku.

POVRCHOVÉ MARKERY BUŇKY

Schopnost buněk tvořících kolonie vytvořit kolonie krvetvorných

buněk in vitro a/nebo obnovit krvetvorný systém

koreluje s expresí specifických povrchových antigenů buněk.

Exprese membránového antigenu CD34 je akceptovaným

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 393

2.7.28 STANOVENÍ BUNĚK TVOŘÍCÍCH KOLONIE U LIDSKÝCH KRVETVORNÝCH PROGENITOROVÝCH BUNĚK

markerem pro většinu krvetvorných progenitorů a kmenových

buněk.

SPECIFICITA STANOVENÍ KOLONIÍ

Buňky tvořící kolonie jsou označovány pomocí nomenklatury

založené na liniích zralých buněk přítomných v koloniích

(např. CFU-Mix, CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G,

CFU-M, BFU-E, CFU-E, CFU-Meg) a jsou populací progenitorů

schopných vytvořit kolonie obsahující jednu nebo

více linií krvetvorných buněk. Této populaci lidských krvetvorných

progenitorových buněk se připisuje nulová nebo

nízká schopnost sebeobnovy, ve srovnání s nejméně zralými

kmenovými buňkami.

Množství a typ růstových faktorů dodávaných v průběhu

tvorby ovlivňují typ a velikost kolonií, které se vytvoří.

Větší specificitu vypovídající o typu krvetvorných progenitorových

buněk a o jejich relativním proliferačním potenciálu

poskytuje doba potřebná k diferenciaci na zralé buňky

in vitro. Doba potřebná k tomu, aby postnatální buňky tvořící

kolonie vytvořily kolonie zralých buněk in vitro je

10 dnů až 14 dnů.

JIŠTĚNÍ JAKOSTI PRO STANOVENÍ BUNĚK

TVOŘÍCÍCH KOLONIE

Nejdůležitější pro celkovou jakost stanovení buněk tvořících

kolonie je uplatnění přísně standardizovaného přístupu. Proto

se doporučuje provést validaci uvnitř laboratoře a validaci

mezilaboratorní. Identifikuje se zdroj materiálů, včetně

zkoumadel, růstových faktorů a spotřebních materiálů.

Hlavní faktory ovlivňující variabilitu stanovení buněk tvořících

kolonie jsou počty nanesených buněk a identifikace

kolonií. Pro stejnou zkoušku je možné pozorovat variabilitu

uvnitř laboratoře až 15 %. Je-li nutné vyhodnotit počet buněk

tvořících kolonie v purifikované buněčné populaci, je

možné použít postup limitního ředění, kdy je počet jamek

s pozitivní buněčnou proliferací měřen automatizovaným

systémem.

Další hlavní zdroj variability pochází z použití nedefinovaných

materiálů (např. fetálního bovinního séra nebo bovinního

sérumalbuminu) při stanovení buněk tvořících kolonie.

Tyto produkty pocházejí ze směsi výchozích materiálů

a způsobují nespecifickou stimulaci buněčné proliferace.

Není však neobvyklý výskyt šarží se zvláštními vlastnostmi,

které způsobují selektivní stimulaci proliferace specifických

krvetvorných linií.

Konečně, nízká hladina endotoxinů (méně než 0,01 m. j./ml

nebo méně než 0,01 m. j./mg) ve všech materiálech použitých

pro klonogenní stanovení je vhodná, zatímco vyšší

hladiny vedou k postupnému poklesu exprese krvetvorných

linií v kulturách a poté k širší inhibici proliferace buněk

a klonogeneze.

STANOVENÍ BUNĚK TVOŘÍCÍCH KOLONIE

Je založeno na schopnosti progenitorových buněk nanesených

do polotuhého média nebo gelu tvořit v přítomnosti

specifických růstových faktorů kolonie. Mohou se použít

různé typy polotuhých médií (např. methylcelulosa, kolagen,

agar a koagulum plazmy) v závislosti na požadovaném

výstupu. Komerčně dostupná média dávají zpravidla lépe

reprodukovatelné výsledky.

MATERIÁLY

Validace se provádí minimálně pro dále uvedené kritické

materiály.

Růstové faktory. Aby se z buněčné suspenze obsahující

smíšenou populaci krvetvorných progenitorových buněk

získal co nejvyšší počet kolonií, jsou třeba růstové faktory

pro více linií [jako jsou Kit-ligand nebo faktor kmenových

buněk (SCF), interleukin-3, faktor stimulující růst kolonií

granulocytů a makrofágů (GM-CSF)] a růstové faktory

specifické pro jednu linii [erytropoetin, faktor stimulující

růst kolonií granulocytů (G-CSF)].

Ostatní složky média. Média se mohou doplnit sérem

(zejména fetálním bovinním sérem) a/nebo albuminem.

BUNĚČNÁ KULTURA

Buňky. Vzorek použitý v kultuře musí být reprezentativním

vzorkem podaného buněčného přípravku. Pro toto stanovení

jsou třeba buněčné suspenze. V případě nasátí kostní

dřeně se takové suspenze mohou získat protlačením kostní

dřeně sítem nebo jehlami o postupně se zmenšujícím

průměru. Opakované průchody jehlou rozměru 21 G jsou

obvykle postačující k tomu, aby shluky buněk dispergovaly

na buněčnou suspenzi.

NANÁŠENÍ A ODEČÍTÁNÍ

Buňky v kultivačním médiu se promíchají s polotuhým médiem.

Obvykle se použije 1 ml směsi na neošetřenou sterilní

Petriho misku (o průměru 35 mm).

Vzhledem k viskozitě média se nemůže roztok nanášet pomocí

výtlakových vzduchových pipet. Je třeba stříkačka se

širokými jehlami rozměru £ 18 G.

Počet nanášených buněk závisí na koncentraci krvetvorných

progenitorových buněk ve zkoušeném vzorku. Počet

nanesených buněk musí umožnit počítání 40 až 80 kolonií

na misku (o průměru 35 mm), aby žádná kolonie nepocházela

od dvou různých krvetvorných progenitorových buněk.

„Cílový“ počet kolonií na misku se může získat buď z procenta

CD34+ (nebo z koncentrace CD34+ buněk v mililitru)

stanoveného průtokovou cytometrií (2.7.24), nebo

z různých ředění suspenze buněk (obvykle se testují dvě

koncentrace).

Misky se inkubují 10 až 14 dnů za aerobních podmínek při

5% koncentraci oxidu uhličitého, při teplotě 37 °C, ve vlhké

(nasycené) atmosféře a počet kolonií se odečítá mikroskopem

s invertovanou optikou. Je třeba věnovat péči manipulaci

s miskami obsahujícími kolonie, protože médium

na bázi methylcelulosy je viskózní, ale netvoří gel. Na nakloněných

miskách se mohou vytvořit pomíchané kolonie

a kolonie podobné „kometám“ a výsledky odečítání nemusí

být správné.

IDENTIFIKACE KOLONIÍ

Velikost a struktura kolonií závisí na typu zralých buněk,

které je tvoří. Za minimum se obvykle považuje padesát

buněk v kolonii. Přítomnost hemoglobinizovaných buněk

identifikuje progenitory erytroidní linie. Protože množství

zralých buněk pro každou linii velmi závisí na růstových

faktorech dodávaných do kultur, nedoporučuje se používat

diferenciální počet, pokud to není předepsáno.

394 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.29 STANOVENÍ POČTU JADERNÝCH BUNĚK A ŽIVOTASCHOPNOSTI

VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Hodnocení kultur buněk tvořících kolonie se obvykle vyjadřuje

aritmetickým průměrem počtu kolonií odečtených na

nejméně třech miskách ze zkoušky. Průměrný počet kolonií

se potom vztahuje na 10 4 nebo 10 5 životaschopných jaderných

buněk v kultuře.

2.7.29 STANOVENÍ POČTU JADERNÝCH

BUNĚK A ŽIVOTASCHOPNOSTI

6.0:20729

Ke stanovení jakosti buněčné suspenze se požaduje přesné

měření jak koncentrace buněk, tak procenta životaschopných

buněk. Tyto údaje jsou nezbytné k rozhodování o postupu

přípravy buněčných produktů a k udržení optimálních

podmínek kultury. Počet buněk se může vyjádřit jako počet

buněk v objemu buněčné suspenze a životaschopnost buněk

jako počet životaschopných buněk v objemu buněčné suspenze.

Stanovení počtu buněk se může provádět manuálně

(hemocytometrem) nebo za použití automatického zařízení

(např. počítač částic, průtokový cytometr). Kromě dále

uvedených metod se mohou použít i jiné metody.

POČET BUNĚK

MANUÁLNÍ POČÍTÁNÍ

Popis přístroje a princip zkoušky. Používají se následující

zařízení:

– hemocytometr: speciální počítací komůrka dostupná

v různých provedeních pro počítání pod mikroskopem;

skládá se ze silné destičky a krycího sklíčka nasazeného

tak, aby vymezovalo komůrku o specifickém objemu pro

každé provedení; silná destička různých hemocytometrů

sestává z počítacích komůrek oddělených hlubokými rýhami,

aby se zabránilo jejich křížovému plnění; počítací

komůrka je vyleptaná do skla a obsahuje mřížku specifickou

pro každý typ;

– světelný mikroskop s malým zvětšením (10´ až 40´);

– pipety s vhodným rozsahem objemu.

Hemocytometr se používá ke kvantifikaci počtu buněk

v daných roztocích výpočtem jejich koncentrace v mililitru

za použití následujícího vzorce:

MANUÁLNÍ METODA VYLOUČENÍ BARVIVA

(„dye-exclusion method“)

Princip zkoušky. Tato zkouška spočívá v tom, že životaschopné

buňky nepřijmou barvivo, zatímco mrtvé nebo poškozené

buňky barvivo absorbují a zbarví se. Přináší informace

o integritě cytoplazmatické membrány, ale výsledky

zkoušky nezbytně nesvědčí o funkčnosti buňky. Životaschopné

buňky nedávno ošetřené trypsinem nebo rozmrazené

mohou mít propustné membrány, což způsobí absorpci

barviva.

Barvivo. Modř trypanová je barvivo nejobvykleji používané

k rozlišení mezi životaschopnými buňkami a buňkami, které

nejsou životaschopné, ale mohou se použít i jiná vhodná

barviva, jako je erythrosin B nebo nigrosin. Je to kyselé

barvivo (Mr 961), anion se čtyřmi sulfonátovými skupina-

a ×10 n × d ,

v němž značí:

a – spočítaný počet buněk;

d – ředicí faktor (kde je to vhodné);

n – faktor měnící se s objemem komůrky hemocytometru.

Je možné rozlišit smíšené buněčné populace (např. leukocyty

a erytrocyty) pomocí rozdílů ve velikosti nebo zbarvení.

Příprava počítací komůrky a analýza. Krycí sklíčko (slabě

navlhčené na okrajích) se přiloží na destičku komůrky.

Krycím sklíčkem se pohne tam a zpět na destičce za lehkého

přitlačení na okraje. Připraví se vhodné ředění buněčné

suspenze v izotonickém tlumivém roztoku nebo v hemolytickém

tlumivém roztoku.

Do počítačové komůrky se přidá vhodný objem ředění. Tekutina

se přidá ke hraně krycího sklíčka, do nitra komůrky

se dostane kapilární vzlínavostí. Počítací komůrka se opatrně

umístí pod mikroskop a zaostří se. Počítají se buňky

v části vymezené mřížkou. Vypočítá se koncentrace ve zředěném

a v původním vzorku.

Ke zlepšení přesnosti měření je důležité dodržovat následující

základní pokyny:

– použít pouze vhodnou tloušťku krycího sklíčka;

– kdekoliv je to možné, spočítat více než sto buněk (je-li

třeba, počítá se ve více oblastech);

– pokud se pozoruje shlukování buněk (tj. buněčnou suspenzi

netvoří jednotlivé buňky), resuspendují se buňky

před odběrem vzorku a počítá se znovu;

– zabrání se nedoplnění nebo přeplnění komůrky, jinak nebude

objem přesný.

AUTOMATICKÉ POČÍTACÍ METODY

Počítače částic založené na změně konduktivity. Elektronické

zařízení na počítání částic měří velikost a počet částic

v roztoku. Počítače částic se před použitím kalibrují roztokem

s částicemi o známé koncentraci a velikosti. Aby se

umožnilo počítání větších částic, jsou k dispozici trubice

opatřené kalibrovanými otvory. Tyto přístroje neumožňují

rozlišení mrtvých a živých buněk. Protože také zbytky buněk

mohou generovat pulzy a mohou způsobit chyby, jsou

počítače často také vybaveny prahovou kontrolou umožňující

počítání pouze velkých částic. Přístroj se pro počítání

buněčných přípravků musí kvalifikovat (na linearitu, přesnost

atd.).

Počítače částic založené na průtokové cytometrii (2.7.24).

Průtokový cytometr se kalibruje referenčními částicemi

o známé koncentraci a velikosti, aby se získal absolutní počet

buněk v objemu. Kalibrační roztok však již není potřeba

u přístrojů používajících dvě elektrody vložené ve vzorkovací

komůrce, kde fixní velikost této komůrky a vzdálenost

mezi elektrodami umožňuje měření obsahu fixního objemu.

Tento typ přístroje zřídka potřebuje kalibraci po počátečním

nastavení.

ŽIVOTASCHOPNOST

Tato část se použije pro barvení buněk buněčné suspenze

barvivy na životaschopnost a pro manuální a automatickou

analýzu za použití světelného mikroskopu a průtokové

cytometrie, a to za účelem stanovení procenta životaschopných

buněk.

Výsledky se mohou lišit v závislosti na typu buněk a použitých

metodách.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 395

2.7.30 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO PROTEINU C

mi, které se snadno váže na bílkoviny; proto musí být koncentrace

bílkoviny ve zkoušeném přípravku co nejnižší.

Podmínky zkoušky. Fixace barviva silně závisí na hodnotě

pH v rozmezí 6,6 až 7,6, fixace je optimální při hodnotě pH

7,5. Ostatní podmínky, jako je koncentrace barviva a doba

barvení, se validují.

Podmínky skladování barviva. Používá se roztok modři trypanové

(0,4% nebo 0,5%) ve sterilním tlumivém roztoku

fosforečnanovém s chloridem sodným. Skladuje se za chránění

před světlem a vzduchem.

Příprava vzorku a analýza. Buněčná suspenze vhodné koncentrace

(obvykle v tlumivém roztoku fosforečnanovém

s chloridem sodným) se obarví např. roztokem modři trypanové,

který má konečnou koncentraci 0,1 % až 0,2 %. Jemně

se promíchá, inkubuje se nejvýše 2 min až 4 min při teplotě

místnosti, opět se jemně promíchá a vhodný objem se

přenese do počítací komůrky. Ihned se spočítá.

Světelným mikroskopem se stanoví procento životaschopných

buněk z poměru počtu neobarvených buněk k celkovému

počtu buněk; všechny obarvené buňky jsou považovány

za mrtvé. Životaschopnost (V) v procentech se vypočítá


n

N

×100,

v němž značí:

n – počet neobarvených (životaschopných) buněk;

N – celkový počet buněk (obarvených i neobarvených).

Je nezbytné, aby doba inkubace nepřesáhla 4 min, protože

později se počet obarvených buněk může významně zvýšit.

Proto pro každé nové stanovení může být nutné připravit

novou zkoušku.

AUTOMATICKÉ METODY

Průtoková cytometrie

Princip zkoušky. Tato zkouška je založena na schopnosti

některých barviv procházet poškozenou membránou a navázat

se na DNA vmezeřením mezi báze, takže mrtvé buňky

mohou fluoreskovat a být zjištěny průtokovou cytometrií

(2.7.24). Buňky, které nejsou životaschopné, se vyhodnotí

a odliší jako pozitivně barvené, zatímco životaschopné

buňky zůstávají neobarvené. Tato analýza se obvykle provádí

se 7-aminoaktinomycinem D nebo propidium-jodidem,

ale mohou se použít i jiná vhodná barviva.

Barvivo. 7-aminoaktinomycin D a propidium-jodid jsou

uvedeny jako příklady látek neprocházejících membránou,

které se mohou použít jako barviva pro rozlišení životaschopnosti.

7-aminoaktinomycin D je analogem aktinomycinu D, který

obsahuje substituovanou aminoskupinu v poloze 7 chromoforu.

Vmezeří se mezi báze DNA cytosin a guanin. Spektrální

vlastnosti 7-aminoaktinomycinu D způsobují, že tato

molekula je obzvláště vhodná pro analýzu průtokovou cytometrií.

Maximum absorpce komplexu DNA/7-aminoaktinomycinu

D se nachází v zelené části spektra a je proto

vhodné pro cytometr vybavený argonovým laserem (excitační

vlnová délka 488 nm). Fluorescenční emise barviva

7-aminoaktinomycinu D na stanovení životaschopnosti

v červené oblasti o větších vlnových délkách (635 nm až

675 nm) usnadňuje použití vzorku v kombinaci s protilátkami

konjugovanými s fluorescein-isothiokyanátem (FITC)

a fykoerythrinem (PE), protože na rozdíl od propidium-jodidu,

komplex DNA/7-aminoaktinomycinu D vykazuje minimální

překrytí s fluorescein-isothiokyanátem a fykoerythrinem.

Propidium-jodid se váže na dvouvláknovou DNA vmezeřením

mezi báze s malou sekvenční preferencí nebo bez sekvenční

preference a se stechiometrií jedna molekula barviva

na čtyři až pět párů bází DNA. Jakmile se barvivo naváže

na nukleové kyseliny, jeho fluorescence se dvacetkrát až

třicetkrát zvýší, excitační maximum fluorescence se posune

asi o 30 nm až 40 nm směrem k červené a emisní maximum

fluorescence (615 nm) se posune asi o 15 nm směrem

k modré. Přestože je jeho absorpční kapacita dosti nízká,

vykazuje propidium-jodid dostatečně velký Stokesův posun,

který umožní současnou detekci nukleových kyselin

a protilátek označených fluoresceinem, pokud se použijí

vhodné optické filtry.

Podmínky skladování roztoku barviva pro nukleové kyseliny.

5 ±3 °C.

Příprava zkoušky a analýza. V případě krvetvorných buněk

se může barvivo přidat po označení CD45, aby došlo k lepšímu

oddělení buněk od buněčných zbytků a trombocytů za

použití bočního rozptylu (SS)/CD45+ vytvořené zóny (gating

region). Podmínky inkubace buněčné suspenze s barvivem

se předem validují. Inkubace se provádí při teplotě

místnosti za chránění před světlem. Kde je to třeba, provede

se lýza erytrocytů, např. chloridem amonným. Není-li třeba,

přidá se jen tlumivý roztok.

Procenta životaschopných buněk jsou přímo dána průtokovým

cytometrem a jsou odvozena z analýzy pozitivních buněk

(mrtvé buňky) v cytogramu (bodové znázornění) bočního

rozptylu (SS)/7-aminoaktinomycin D nebo bočního rozptylu

(SS)/propidium-jodid.

Pozitivní kontroly mohou sestávat ze stabilizovaných buněk

(mrtvé buňky) smíchaných s čerstvými životaschopnými

buňkami v cílové hodnotě.

Digitální znázornění barvených buněk. Digitální znázornění

umožňuje automatizaci metody vyloučení barviva. Buněčná

suspenze a roztok barviva na životaschopnost se smíchají

přímo v přístroji. Systém, který umožňuje nasátí vzorku,

zacházení se zkoumadly a následné čištění zařízení, je

plně automatizován. Jakmile se buněčná suspenze nasaje

a promíchá s roztokem barviva, napumpuje se do průtokové

cely k zobrazení. Suspenze barvených buněk se nasaje přes

celu, ve které stroboskopické světlo umožní, aby kamera

fotografovala tekoucí buňky. Obrazy se digitalizují a počet

mrtvých a živých buněk se vypočítá pomocí softwaru.


PROTEINU C

7.0:20730

1. CHROMOGENNÍ STANOVENÍ ÚČINNOSTI

Lidský protein C je plazmatická bílkovina závislá na vitaminu

K, která aktivací na aktivovaný protein C (APC) může

inhibovat koagulaci krve prostřednictvím proteolytického štěpení

faktoru Va a faktoru VIIIa. Aktivita lidského proteinu C

se stanoví ve dvou krocích: v prvním kroku se přípravek lid-

396 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.30 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO PROTEINU C

ského proteinu C aktivuje specifickým aktivátorem z hadího

jedu; ve druhém kroku se aktivovaný protein C štěpí specifickým

chromogenním substrátem, za tvorby chromoforu, který

se může kvantifikovat spektrofotometricky.

Krok 1:

aktivátor lidského proteinu C

lidský protein C ¾¾ ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®

APC

Krok 2:

APC

chromogenn í substrát ¾¾ ¾ ® peptid + chromofor

Účinnosti lidského proteinu C se stanoví porovnáním

schopnosti zkoušeného přípravku štěpit chromogenní substrát

se stejnou schopností referenčního standardu lidského

proteinu C kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je aktivita daného množství mezinárodního

standardu lidského proteinu C. Hodnotu účinnosti




získat samostatně nebo jako komerční kity. Je dostupná metoda

kinetická i metoda konečného bodu (end-point). Postupy

a zkoumadla z různých souprav (kitů) se mohou lišit,

proto je třeba postupovat podle pokynů výrobce. Základní

charakteristiky postupu jsou popsány v následujícím příkladu

mikrotitrační destičkové metody konečného bodu

(end-point).

ZKOUMADLA

Ředicí tlumivý roztok o pH 8,4. 6,055 g trometamolu R

a 16,84 g chloridu cesného R se rozpustí ve vodě R a,

je-li třeba, upraví se hodnota pH. Zředí se vodou R na

1000,0 ml.

Aktivátor lidského proteinu C. Bílkovina se izoluje z jedu

zmije druhu Agkistrodon contortrix contortrix, který specificky

aktivuje lidský protein C. Rekonstituuje a uchovává

se podle pokynů výrobce. Těsně před použitím ve stanovení

účinnosti se zředí vodou R na koncentraci 0,25 j./ml.

Chromogenní substrát aktivovaného proteinu C. Specifický

chromogenní substrát pro aktivovaný protein C, např. L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-arginyl-p-nitroanilin-hydrochlorid

(pyroGlu-Pro-Arg-pNA.HCl), se rekonstituuje ve vodě R na

koncentraci 4,5 mmol/l. Ředicím tlumivým roztokem

o pH 8,4 se před použitím ve stanovení účinnosti zředí na

koncentraci 1,1 mmol/l.

POSTUP


pokynů výrobce. Zředí se vodou R a pro každý přípravek se

připraví nejméně tři oddělená ředění v rozmezí koncentrací

0,050 m. j./ml až 0,200 m. j./ml, pokud možno dvakrát.

Krok 1. 0,025 ml každého ředění se promíchá s 0,050 ml

aktivátoru lidského proteinu C (oba roztoky se předem zahřejí

na 37 °C) a nechá se přesně 10 min při 37 °C. Pro každé

ředění se stejným způsobem připraví kontrolní roztok za

použití vody R místo aktivátoru lidského proteinu C.

Krok 2. Ke každé směsi se přidá 0,150 ml zředěného chromogenního

substrátu předem zahřátého na 37 °C a nechá se

přesně 10 min při 37 °C. Je-li třeba, musí se inkubační doba

nastavit tak, aby se zajistila lineární závislost vzniku chromoforu

na čase. Reakce se ukončí přidáním 0,050 ml roztoku

kyseliny octové ledové R 50% (V/V).

Štěpení chromogenního substrátu aktivovaným proteinem

C způsobuje uvolnění chromoforu p-nitroanilinu

úměrně koncentraci lidského proteinu C v přípravku. Měří

se optická hustota při vlnové délce 405 nm. Odečte se optická

hustota kontrolního roztoku od optické hustoty zkoušeného

vzorku. Ověří se validita stanovení účinnosti a vypočítá

se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými statistickými

metodami (5.3).

2. KOAGULAČNÍ STANOVENÍ ÚČINNOSTI

Aktivita lidského proteinu C se stanoví po štěpení na aktivovaný

protein C specifickým aktivátorem získaným z jedu

zmije druhu Agkistrodon contortrix contortrix. Výsledný

aktivovaný protein C inaktivuje faktor Va a faktor VIIIa

a tak prodlužuje aktivovaný parciální tromboplastinový čas

(APTT) systému, ve kterém jsou přítomné všechny koagulační

faktory, konstantně a v nadbytku, kromě lidského proteinu

C, který pochází ze zkoušeného přípravku. Prodloužení

koagulačního času je úměrné koncentraci lidského proteinu

C v přípravku.

Účinnost lidského proteinu C se stanoví porovnáním schopnosti

zkoušeného přípravku prodloužit koagulační čas se

stejnou schopností referenčního standardu lidského proteinu

C kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Mezinárodní

jednotka je aktivita daného množství mezinárodního

standardu lidského proteinu C. Hodnotu účinnosti mezinárodního




získat samostatně nebo jako komerčních kity. Postupy

a zkoumadla z různých kitů se mohou lišit, proto je třeba

postupovat podle pokynů výrobce. Základní charakteristiky

postupu jsou popsány v následujícím příkladu.

ZKOUMADLA

Ředicí tlumivý roztok o pH 7,4. Izotonický tlumivý roztok

bez chelatotvorných látek.

Plazma prostá lidského proteinu C. Lidská plazma citrátová

s neměřitelným obsahem lidského proteinu C. Rekonstituuje

se a uchovává podle pokynů výrobce.

Aktivátor lidského proteinu C. Bílkovina izolovaná z jedu

zmije druhu Agkistrodon contortrix contortrix, který specificky

aktivuje lidský protein C. Rekonstituuje a uchovává


Koagulační aktivátor. Může se použít vhodné zkoumadlo

pro aktivovaný parciální tromboplastinový čas obsahující

fosfolipidy a kontaktní aktivátor. Může se kombinovat

s aktivátorem lidského proteinu C.

POSTUP


pokynů výrobce. Zředí se ředicím tlumivým roztokem

o pH 7,4 a pro každý přípravek se připraví nejméně tři

oddělená ředění v rozmezí koncentrací 0,010 m. j./ml až

0,150 m. j./ml, pokud možno dvakrát.

Smíchá se jeden objemový díl každého ředění s jedním objemovým

dílem plazmy prosté lidského proteinu C a jeden

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 397

2.7.31 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO PROTEINU S

objemový díl aktivátoru lidského proteinu C (kombinovaného

se zkoumadlem pro aktivovaný parciální tromboplastinový

čas, kde je to vhodné); všechny roztoky se předem

zahřejí na 37 °C. Přidá se jeden objemový díl chloridu vápenatého

0,025 mol/l RS předem zahřátého na 37 °C

a zaznamená se koagulační čas.

Koagulační čas je úměrný koncentraci lidského proteinu C

v každém ředění. Ověří se validita stanovení účinnosti a vypočítá

se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými statistickými

metodami (5.3)


PROTEINU S

6.2:20731

Lidský protein S je plazmatická bílkovina závislá na vitaminu

K, která působí jako kofaktor antikoagulačních funkcí

aktivovaného proteinu C (APC). Aktivita lidského proteinu

S se může stanovit dále popsaným koagulačním stanovením

účinnosti, které je citlivé na schopnost lidského proteinu

S urychlovat inaktivaci faktoru Va aktivovaným proteinem

C. V praxi znamená toto stanovení účinnosti přidání

lidského proteinu S k reakční směsi obsahující aktivovaný

protein C, faktor Va a plazmu prostou proteinu S. Prodloužení

koagulačního času je úměrné koncentraci lidského proteinu

S v přípravku. Dává se přednost metodám, při kterých

se aktivovaný protein C přidává přímo jako zkoumadlo, proti

metodám, ve kterých se aktivovaný protein C vytváří v průběhu

stanovení účinnosti přidáním specifického aktivátoru

lidského proteinu C purifikovaného z hadího jedu. Aktivace

koagulace se spouští přidáním aktivačního zkoumadla, jako

je tromboplastin nebo aktivovaný faktor X, společně s fosfolipidy

a chloridem vápenatým. V průběhu stanovení účinnosti

se po aktivaci koagulace vytváří v plazmě prosté proteinu

S faktor Va z faktoru V. Postup stanovení účinnosti musí

zaručit, že jediným limitujícím faktorem je lidský protein S.

Účinnosti lidského proteinu S se stanoví porovnáním

schopnosti zkoušeného přípravku prodloužit koagulační čas

se stejnou schopností referenčního standardu lidského proteinu

S kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Mezinárodní

jednotka je aktivita daného množství mezinárodního

standardu lidského proteinu S. Hodnotu účinnosti mezinárodního




získat samostatně nebo jako komerční kity. Postupy a zkoumadla

z různých kitů se mohou lišit, proto je třeba postupovat

podle instrukcí výrobce. Základní charakteristiky postupu

jsou popsány v následujícím příkladu.

ZKOUMADLA

Ředicí tlumivý roztok o pH 7,4. Izotonický tlumivý roztok

bez chelatotvorných látek připravený takto: 6,08 g trometamolu

R a 8,77 g chloridu sodného R se rozpustí ve vodě R

a, je-li třeba, upraví se hodnota pH; přidá se 10 g albuminu

hovězího R a zředí se vodou R na 1000,0 ml.

Plazma prostá proteinu S. Lidská plazma citrátová s neměřitelným

obsahem lidského proteinu S, pokud možno také

bez C4b vázajícího proteinu.

Koagulační aktivátor. Toto zkoumadlo se používá ke spuštění

koagulace v plazmě prosté proteinu S a tím také zajistí

zdroj aktivovaného faktoru V. Aktivátor se může skládat

z tkáňového faktoru, aktivovaného faktoru X nebo z agens,

které může být purifikováno z jedu Russellovy zmije druhu

Vipera russelli a je schopné přímo aktivovat faktor X.

Zkoumadlo také obsahuje aktivovaný protein C, fosfolipidy

a chlorid vápenatý R, nebo se chlorid vápenatý může alternativně

přidat samostatně po odměřené době aktivace.

POSTUP


instrukcí výrobce. Zředí se ředicím tlumivým roztokem

o pH 7,4 a pro každý přípravek se připraví nejméně tři oddělená

ředění v rozmezí koncentrací 0,020 m. j./ml až

0,100 m. j./ml, pokud možno dvojmo.

Smíchá se jeden objemový díl každého ředění s jedním objemovým

dílem plazmy prosté lidského proteinu S; oba

roztoky se předem zahřejí na 37 °C. Přidají se dva objemové

díly koagulačního aktivátoru předem zahřátého na 37 °C

a zaznamená se koagulační čas.

Alternativní postupy mohou použít koagulační aktivátor

bez chloridu vápenatého a požadovat přesně odměřenou

dobu aktivace před přidáním chloridu vápenatého a změřením

koagulačního času.

Koagulační čas je úměrný koncentraci lidského proteinu S

v jednotlivých ředěních. Ověří se validita stanovení účinnosti

a vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými

statistickými metodami (5.3).


INHIBITORU ALFA-1-PROTEINASY

Synonymum. Stanovení účinnosti inhibitoru lidské

alfa-1-proteinasy

6.2:20732

Obsah lidského inhibitoru a-1-proteinasy (také známého

jako a-1-antitrypsin nebo a-1-antiproteinasa) se stanoví

porovnáním schopnosti zkoušeného přípravku inaktivovat

proteasu elastasu serinu (prasečí pankreatickou elastasu nebo

lidskou neutrofilní elastasu) se stejnou schopností referenčního

standardu lidského inhibitoru a-1-proteinasy kalibrovaného

v miligramech aktivního (funkčního) inhibitoru

a-1-proteinasy. Různá množství zkoušeného přípravku se

smíchají s daným množstvím elastasy a zbytková aktivita

elastasy se stanoví za použití vhodného chromogenního substrátu.

Postup popsaný dále je uveden jako příklad.

ZKOUMADLA

Tlumivý roztok trometamol-albuminový. 24,23 g trometamolu

R se rozpustí ve vodě R, pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou

R1 na hodnotu 8,0 ±0,3 a zředí se vodou R na

1000 ml. Ke 100 ml tohoto roztoku se přidá 0,5 ml roztoku

albuminu lidského R (20 %) nebo albuminu hovězího R

(20 %). Tlumivý roztok obsahující albumin lidský nebo albumin

hovězí musí být připraven v den použití čerstvý nebo

se může konzervovat sterilní filtrací (0,2 µm) a uchovávat

při 2 °C až 8 °C až 2 týdny.

POSTUP

Za použití tlumivého roztoku trometamol-albuminového se

připraví dvě série čtyř nebo pěti ředění zkoušeného a refe-

398 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.7.34 STANOVENÍ ÚČINNOSTI LIDSKÉHO INHIBITORU C1-ESTERASY

renčního přípravku, v rozmezí vhodných koncentrací inhibitoru

a-1-proteinasy.

Do jamek mikrotitrační destičky se převede po 50 µl ředění

referenčního roztoku a do každé jamky se přidá po 150 µl

roztoku prasečí pankreatické elastasy zředěné na vhodnou

koncentraci tlumivým roztokem trometamol-albuminovým.

Inkubuje se po stanovenou dobu, 3 min až 10 min, při teplotě

místnosti. Protože se aktivita roztoků různých prasečích

pankreatických elastas může lišit, může se nastavit

koncentrace elastasy vyhodnocením kontrolního roztoku

obsahujícího elastasu, ale ne lidský inhibitor a-1-proteinasy

tak, aby se projevila vhodná změna absorbance při 405 nm

za aktuálních podmínek zkoušky.

Do každé jamky se přidá po 100 µl roztoku chromogenního

substrátu N-sukcinyl-tri-L-alanyl-4-p-nitroanilinu (Suc-Ala-

-Ala-Ala-pNa) rekonstituovaného v dimetylsulfoxidu R na

koncentraci 4,5 mg/ml a potom dále zředěného tlumivým roztokem

trometamol-albuminovým na koncentraci 0,45 mg/ml.

Ihned se zahájí měření změn absorbance (2.2.25) při 405 nm

za použití čtecího zařízení mikrotitrační destičky; měří se

nejméně 5 min. Vypočítá se rychlost změny absorbance

(∆A/min). Alternativně se může použít stanovení konečného

bodu (end-point) zastavením reakce kyselinou octovou

a změřením absorbance při 405 nm. Pokud se stanovení provádí

ve zkumavkách za použití spektrofotometru pro monitorování

změny absorbance při 405 nm, musí se přiměřeně

změnit objemy roztoků zkoumadel.

Rychlost změny absorbance (∆A/min) je nepřímo úměrná

aktivitě lidského inhibitoru a-1-proteinasy.

Ověří se validita stanovení a vypočítá se účinnost zkoušeného

přípravku obvyklými statistickými metodami (5.3).


INHIBITORU C 1-ESTERASY

8.7:20734

Obsah lidského inhibitoru C1-esterasy ve zkoušeném přípravku

se stanoví porovnáním jeho schopnosti inhibovat

C1-esterasu se stejnou schopností referenčního přípravku kalibrovaného

v mezinárodních jednotkách. Mezinárodní jednotka

je aktivita udaného množství mezinárodního standardu

koncentrátu inhibitoru C1-esterasy získaného z lidské plazmy.



Rozdílná množství zkoušeného přípravku se promíchají

s přebytkem C1-esterasy a zbývající aktivita C1-esterasy se

stanoví za použití vhodného chromogenního substrátu.

Jednotlivá zkoumadla se mohou získat samostatně nebo jako

komerční soupravy (kity). Postup a zkoumadla z různých

souprav (kitů) se mohou lišit, proto je třeba postupovat

podle pokynů výrobce. Základní charakteristiky postupu

jsou popsány v následujícím příkladu kinetické metody

na mikrotitrační destičce.

Přípravek se rekonstituuje, jak je uvedeno v označení na

obalu. Připraví se vhodné série nejméně tří ředění zkoušeného

i referenčního přípravku od 1 m. j./ml inhibitoru

C1-esterasy za použití vhodného tlumivého roztoku

o pH 7,4 obsahujícího chlorid sodný R (9 g/l) a albumin

lidský R (10 g/l), nebo albumin hovězí R (10 g/l). Všechny

roztoky se zahřejí na 37 °C. Do jamek mikrotitrační destičky

se přidá vhodné množství jednoho ředění referenčního

přípravku nebo zkoušeného přípravku a inkubuje se při

37 °C. Do každé jamky se přidá vhodné množství roztoku

C1-esterasy a inkubuje se 5 min při 37 °C. Přidá se odpovídající

množství vhodného specifického chromogenního

substrátu, jako je methoxykarbonyl-L-lysyl(ε-benzyloxykarbonyl)-glycyl-L-arginin-4-nitroanilid.

Odečte se rychlost

zvýšení absorbance (DA/min) při 405 nm. Jako pozitivní

kontrola se místo inhibitoru C1-esterasy použije tlumivý

roztok o pH 7,4. Pro přípravky, které mohou vykazovat

proteolytickou aktivitu, se provede slepá zkouška s kontrolním

roztokem složeným ze zkoušeného přípravku, tlumivého

roztoku o pH 7,4 a chromogenního substrátu.

Obsah inhibitoru C1-esterasy se vypočítá za použití běžných

statistických metod, např. poměrem sklonů (5.3).

2.7.35 STANOVENÍ ÚČINNOSTI/OBSAHU

SLOŽEK VAKCÍNY

NEFELOMETRICKY

10.0:20735

OBECNÝ PRINCIP

Obecný princip nefelometrie je popsán v obecné stati 2.2.1

Čirost a stupeň opalescence tekutin. Imunonefelometrie

měří zákal, který se vytvoří zejména v důsledku vzniku

imunokomplexů při reakci antigenu s protilátkou. I když se

imunonefelometrie používá pro kvantifikaci jak antigenů,

tak i protilátek, popisuje tato obecná stať jen kvantifikaci

antigenů jako složek vakcíny.

PŘÍSTROJ

Použitý nefelometr je popsán v obecné stati 2.2.1 Čirost

a stupeň opalescence tekutin. Ovšem měření se může provádět

pod nenulovým úhlem lišícím se od 90°.

POSTUP

Obecně se může postup reakce měřené rozptylem světla

popsat ve třech krocích.

Nejprve se detekuje základní linie rozptylu světla způsobená

reakcí média. Po přidání první reagující složky (antigenu)

se pozoruje vzestup signálu s dosažením první úrovně

(plató). Po přidání druhé složky (protilátky) se pozoruje

druhý vzestup signálu a druhá úroveň s následujícím konečným

vzestupem intenzity signálu, který pokračuje, dokud

není dosaženo třetí úrovně. Měření zóny začíná přídavkem

druhého zkoumadla, dokud není dosaženo vyšší intenzity

rozptylu světla (třetí úrovně) v závislosti na koncentracích

složky, která je hodnocena.

Mohou se použít následující metody kvantifikace imunokomplexů

vzniklých během tohoto typu reakce.

NEFELOMETRICKÝ KONEČNÝ BOD

Rozptyl světla se měří po vytvoření imunokomplexu, tj. asi

po 60 min. Hodnota konečného bodu (end-point) je v tomto

případě přímo úměrná obsahu měřené složky při nadbytku

protilátek. Provedení slepé zkoušky je nezbytné, aby byla

odečtena hodnota nespecifického rozptylu vzniklého reakcí

směsi a reakční/měřicí zkumavky.

Zkušební

metody

2.7

ČL 2017 – Dopl. 2020 399

2.7.35 STANOVENÍ ÚČINNOSTI/OBSAHU SLOŽEK VAKCÍNY NEFELOMETRICKY

RYCHLOST NEFELOMETRIE

Rychlost nefelometrie je založena na rychlosti vytvoření

imunokomplexu (rychlosti vzestupu rozptylu světla), což

je úměrné koncentraci měřené složky.

Existují dva typy rychlosti nefelometrie.

Rychlost nefelometrie ve fixním čase. První měření rozptylu

světla se provede několik sekund po přidání posledního

zkoumadla. Druhé měření proběhne ve fixním časovém intervalu

stanoveném během vývoje metody. Rozdíl mezi těmito

dvěma hodnotami je úměrný množství měřené složky.

Rychlost nefelometrie využívající pík první derivace.

Tvorba imunokomplexu je popsána křivkou první derivace

odchylky rozptylu světla v čase (dΘD/dt). Dva po sobě následující

píky jsou pozorovány v důsledku přídavku prvního

a druhého zkoumadla.

Výška třetího píku první derivace je úměrná množství měřené

složky v reakčním médiu. Po sobě následující měření

se provedou během několika sekund po přídavku druhého

zkoumadla.

V tomto případě nemá rozptyl světla v důsledku reakce

média, složky a zkoumadla vliv na původní hodnotu derivace

signálu.

OPERAČNÍ PODMÍNKY

ZKOUMADLA A REFERENČNÍ STANDARDY

Zkoumadla, rozpouštědla a zkoušené vzorky musí být čiré

a prosté suspendovaných částic. Toho může být dosaženo

předběžnou filtrací nebo odstředěním.

Antiséra nebo protilátky se vyberou na základě jejich specifity,

schopnosti srážení a jejich avidity s antigenem. Ve

skutečnosti vede vysoká avidita rychle k jasně detekovatelným

rychle generovaným signálům, což zvyšuje kvalitu výsledků.

Navíc je důležité definovat rozmezí koncentrací stanovovaného

antigenu v nadbytku protilátek a ověřit nepřítomnost

zónového efektu v tomto rozmezí.

Doporučuje se zajistit, aby profily odpovědí byly podobné

jako u vhodných referenčních standardů.

PŘEDPŘÍPRAVA ZKOUŠENÝCH VZORKŮ

Měla by se provést vhodná předběžná příprava, aby se odstranilo

adjuvans nebo další interferující látky.

STANOVENÍ ÚČINNOSTI/OBSAHU

Zajistí se, že všechna zkoumadla mají vhodnou teplotu, aby

se optimalizovala reakce.

Ke vzorkům zředěným vhodným médiem se v reakční měřicí

zkumavce přidá fixní množství protilátek. Se zkoušeným

ředěním se provede několik stanovení.

V některých případech se může postup reakce zlepšit přidáním

dalších látek do reakčního média (např. polyethylenglykolu).

S referenčními látkami a se vzorky se musí zacházet stejným

způsobem.

PROVEDENÍ SLEPÉ ZKOUŠKY

Aby se zajistilo, že stanovení účinnosti/obsahu je specifické,

musí se měřit pouze rozptyl způsobený imunokomplexy.

Ostatní částice, matrice vzorku, zkoumadla nebo reakční

měřicí zkumavka/cela mohou interferovat. V tomto

případě a, je-li použita metoda konečného bodu (end-point),

je třeba provést slepou zkoušku, aby se zamezilo započítání

nespecifického rozptylu.

KALIBRACE

Kalibrační křivka se získá přípravou řady ředění referenčního

standardu. Koncentrace se vyberou tak, aby pokrývaly

pracovní rozsah.

METODY VÝPOČTŮ

Výsledky se mohou vypočítat za použití metody rovnoběžnosti

(viz obecnou stať 5.3), nebo za použití kalibrační

křivky.

VALIDITA ZKOUŠEK

VALIDITA KALIBRAČNÍCH KŘIVEK

Mohou se použít pouze kalibrační křivky, které vyhoví

validačním kritériím.

Následující parametry jsou příklady, které mohou být využity

pro definování validačních kritérií:

– minimum jednotek rozptylu světla (LSU) získaných

v bodě kalibrační křivky odpovídajícímu nejnižší koncentraci;

– koeficient variace pro jednotky rozptylu světla (LSU)

měřený pro každý bod křivky;

– koeficienty regrese nebo korelace kalibrační křivky;

– sklon kalibrační křivky a průsečík kalibrační křivky

s osou souřadnic.

VALIDITA VÝSLEDKŮ

Dále jsou uvedeny příklady validačních kritérií zkoušeného

vzorku:

– koeficient variace rozmezí hodnot pro stanovení prováděná

se vzorkem;

– obsah domácího referenčního standardu s monitorováním

trendu nebo kontrolní graf.

400 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.8.1 POPEL NEROZPUSTNÝ V KYSELINĚ CHLOROVODÍKOVÉ

2.8 FARMAKOGNOSTICKÉ METODY

2.8.1 POPEL NEROZPUSTNÝ V KYSELINĚ

CHLOROVODÍKOVÉ

6.0:20801

Je to zbytek získaný po extrakci síranového popela nebo

celkového popela kyselinou chlorovodíkovou, přepočítaný

na 100 g drogy.

Do kelímku obsahujícího zbytek po stanovení síranového

popela nebo celkového popela se přidá 15 ml vody R a 10 ml

kyseliny chlorovodíkové R, kelímek se přikryje hodinovým

sklem, mírně se 10 min zahřívá a nechá se ochladit. Zfiltruje

se přes bezpopelný filtr a zbytek se promyje horkou vodou R

až do neutrální reakce filtrátu, zbytek se vysuší, vyžíhá se do

červeného žáru, nechá se ochladit v exsikátoru a zváží se.

Opakovaně se žíhá, dokud rozdíl mezi dvěma po sobě následujícími

váženími není nejvýše 1 mg.

2.8.2 CIZÍ PŘÍMĚSI

8.1:20802

Rostlinné drogy by měly být prosté plísní, hmyzu a jiných

živočišných kontaminantů.

Cizí příměsi jsou materiály popsané v jednom nebo obou

dále uvedených odstavcích:

1) jiné části matečné rostliny: části matečné rostliny, které

nejsou uvedeny v popisu drogy;

2) cizí látky: látky rostlinného nebo minerálního původu,

které nepocházejí z matečné rostliny.

SUŠENÉ ROSTLINY

Vzorkování a příprava vzorku. Postupuje se podle stati

2.8.20 Rostlinné drogy: vzorkování a příprava vzorku.

Stanovení cizích příměsí. Odváží se 100 g až 500 g vzorku

nebo nejmenší množství předepsané v jednotlivém článku

a rozprostře se do tenké vrstvy. Cizí příměsi se identifikují

prostým okem nebo s použitím lupy (zvětšení šestkrát).

Cizí příměsi se oddělí, zváží a vypočítá se jejich množství

v procentech.

ČERSTVÉ ROSTLINY

Pokud nelze postupovat podle stati 2.8.20 Rostlinné drogy:

vzorkování a příprava vzorku, použije se některá z následujících

metod, podle toho, co je vhodné. Zkouška podle metody

A se může provést na celé šarži, metoda B se použije,

když se zkouška nemůže provést na celé šarži.

METODA A

Vzorkování a příprava vzorku. Provede se zkouška na

celé šarži.

Stanovení cizích příměsí. Šarže se rozprostře do tenké

vrstvy a cizí příměsi se identifikují prostým okem nebo

s použitím lupy (zvětšení šestkrát). Cizí příměsi se oddělí,

zváží a vypočítá se jejich množství v procentech.

METODA B

Vzorkování a příprava vzorku. Pokud není možné provést

zkoušku na celé šarži, postupuje se následujícím způsobem.

Nerozplněný vzorek. Způsobem popsaným ve stati 2.8.20

Rostlinné drogy: vzorkování a příprava vzorku se připraví

nerozplněný vzorek.

Zkoušený vzorek. Použije se nerozplněný vzorek, nebo pokud

je nerozplněný vzorek větší než 1 kg, zmenší se na

500 g až 1 000 g vhodným způsobem, který zachová reprezentativní

povahu nerozplněného vzorku.

Stanovení cizích příměsí. Použije se vzorek nebo nejmenší

množství předepsané v jednotlivém článku a rozprostře

se do tenké vrstvy. Cizí příměsi se identifikují

prostým okem nebo s použitím lupy (zvětšení šestkrát).

Cizí příměsi se oddělí, zváží a vypočítá se jejich množství

v procentech.

2.8.3 STOMATA (PRŮDUCHY)

A STOMATÁLNÍ INDEX

6.0:20803

STOMATA (PRŮDUCHY)

Existuje několik typů průduchů (viz obrázek 2.8.3-1), které

se rozlišují podle tvaru a uspořádání okolních buněk:

(1) typ anomocytický: průduch je obklopen proměnlivým

počtem buněk, které se tvarem a velikostí neliší od běžných

buněk pokožky,

(2) typ anizocytický: průduch je obvykle obklopen třemi

podpůrnými buňkami, z nichž jedna je výrazně menší

než druhé dvě,

(3) typ diacytický: průduch je obklopen dvěma podpůrnými

buňkami, jejichž společná stěna je v pravých úhlech ke

svěracím buňkám,

(4) typ paracytický: průduch je na každé straně obklopen

jednou nebo více podpůrnými buňkami, jejichž podélná

osa je rovnoběžná se svěrací štěrbinou a svěracími buňkami.

Obr. 2.8.3-1

Zkušební

metody

2.8

ČL 2017 – Dopl. 2020 401

2.8.4 ČÍSLO BOBTNAVOSTI

STOMATÁLNÍ INDEX

Stomatální index se vypočítá podle vzorce:

100 × S ,

E + S

v němž značí:

S – počet průduchů na dané ploše listu;

E – počet pokožkových buněk (včetně chlupů) na téže listové

ploše.

Stanovení se provádí pro každý vzorek listu nejméně desetkrát

a vypočítá se průměrná hodnota.

2.8.4 ČÍSLO BOBTNAVOSTI

6.0:20804

Je to objem v mililitrech, který zaujme 1 gram drogy spolu

s ulpívajícím slizem po nabobtnání ve vodné tekutině po

dobu 4 h.

1,0 g drogy, celé nebo rozdrobněné podle požadavků uvedených

v jednotlivých článcích, se převede do 25ml odměrného

válce se zabroušenou zátkou o výšce 125 ±5 mm

a děleném po 0,5 ml. Není-li předepsáno jinak, navlhčí se

droga 1,0 ml ethanolu 96% R, přidá se 25 ml vody R a válec

se uzavře. Během první hodiny se intenzivně protřepává

vždy po 10 min, pak se nechá 3 h stát. Po 90 min od začátku

zkoušky je již většina kapaliny vázána na drogu. Částice

drogy ulpívající na hladině se odstraní mírným vertikálním

krouživým pohybem válce. Odečte se objem, který zaujímá

droga spolu s ulpívajícím slizem. Provádějí se tři paralelní

stanovení.

Číslo bobtnavosti je vyjádřeno průměrem ze tří paralelních

stanovení.

2.8.5 VODA V SILICÍCH

6.0:20805

10 kapek silice se smíchá s 1 ml sirouhlíku R; roztok zůstane

čirý.

2.8.6 CIZÍ ESTERY V SILICÍCH

6.0:20806

1 ml silice se smíchá se 3,0 ml čerstvě připraveného roztoku

hydroxidu draselného R (100 g/l) v ethanolu 96% R

a zahřívá se 2 min na vodní lázni; do 30 min ani po ochlazení

nevznikají krystaly.

2.8.7 MASTNÉ OLEJE A ZPRYSKYŘIČNA-

TĚLÉ SILICE V SILICÍCH

6.0:20807

Kapka silice se kápne na filtrační papír a nechá se 24 h volně

na vzduchu odpařit; na filtračním papíru nezůstane průsvitná

nebo mastná skvrna.

2.8.8 PACH A CHUŤ SILIC

6.0:20808

Tři kapky silice se smíchají s 5 ml ethanolu 90% (V/V) R

a směs se rozetře s 10 g práškové sacharosy R. Pach i chuť

jsou podobné jako u matečné rostliny nebo jejích částí,

z nichž byla silice získána.

2.8.9 ZBYTEK PO ODPAŘENÍ SILIC

10.0:20809

Je to procento hmotnosti silice, které zbývá po odpaření na

vodní lázni za dále uvedených podmínek.

Zařízení (viz obrázek 2.8.9-1) se skládá z:

– vodní lázně s víkem s otvory o průměru 70 mm;

– odpařovací misky z tepelně odolného inertního skla;

– exsikátoru.

Obr. 2.8.9-1 (rozměry v milimetrech)

Postup. Odpařovací miska se zahřívá 1 h na vodní lázni

a po vychlazení v exsikátoru se zváží. Do takto vysušené

odpařovací misky se převede 5,00 g silice, není-li předepsáno

jinak. Silice se odpaří zahříváním na vodní lázni po

předepsanou dobu v prostředí bez proudícího vzduchu; nechá

se ochladit v exsikátoru a zváží se.

Během zkoušky se hladina vody ve vodní lázni udržuje asi

50 mm pod úrovní víka.

2.8.10 ROZPUSTNOST SILIC V ETHANOLU

6.0:20810

Do odměrného válce se zabroušenou zátkou na 25 ml nebo

30 ml se převede 1,0 ml silice; provádí se v termostatu při

(20 ±0,2) °C. Z byrety o objemu nejméně 20 ml se po 0,1 ml

přidává do válce ethanol o koncentraci předepsané v článku

až do úplného rozpuštění silice a pak za častého intenzivního

protřepávání po 0,5 ml až do 20 ml. Objem spotřebovaného

ethanolu se zaznamená v okamžiku, kdy vznikne čirý roztok.

Pokud roztok zůstane zakalený nebo opalizující při spotřebě

nižší než 20 ml ethanolu, zaznamená se spotřeba v okamžiku,

kdy vznikne zákal nebo opalescence, a je-li to možné,

když zákal nebo opalescence vymizí.

Nevznikne-li čirý roztok po přidání ethanolu předepsané

koncentrace ani při 20 ml, provede se stanovení s následující

vyšší koncentrací ethanolu.

402 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.8.11 STANOVENÍ CINEOLU V SILICÍCH

Silice je hodnocena jako „rozpustná v n nebo více objemových

dílech ethanolu předepsané koncentrace t“, jestliže čirý

roztok v n objemových dílech po přidání ethanolu až do

20 ml zůstane beze změny v porovnání s neředěnou silicí.

Silice je hodnocena jako „rozpustná v n objemových dílech

ethanolu předepsané koncentrace t, dalším ředěním se roztok

kalí“, jestliže se čirý roztok v n objemových dílech kalí

při n1 objemových dílech (n1 je méně než 20) a zůstává zakalen

i po dalším přidání ethanolu téže koncentrace až do

20 ml.

Silice je hodnocena jako „rozpustná v n objemových dílech

ethanolu předepsané koncentrace t se zákalem vznikajícím

mezi objemy n1 a n2“, jestliže čirý roztok v n objemových

dílech se kalí při n1 objemových dílech (n1 je méně než 20)

a zůstává zakalen i po dalším přidání objemových dílů ethanolu

téže koncentrace až do celkového objemu n2 (n2 je méně

než 20). Po dalším přidání ethanolu do 20 ml vznikne čirý

roztok.

Silice je hodnocena jako „rozpustná, roztok opalizuje“,

jestliže ethanolový roztok silice je namodralý tak jako

čerstvě připravený porovnávací roztok.

Porovnávací roztok. 0,5 ml dusičnanu stříbrného RS2 se

smíchá s 0,05 ml kyseliny dusičné R a přidá se 50 ml roztoku

chloridu sodného R (12 mg/l); promíchá se a nechá se

stát 5 min za chránění před světlem.

2.8.11 STANOVENÍ CINEOLU V SILICÍCH

6.0:20811

3,00 g silice čerstvě vysušené síranem sodným bezvodým R

se odváží do suché zkumavky a přidá se 2,10 g kresolu R

taveného. Zkumavka se upevní do přístroje na stanovení

teploty tuhnutí (2.2.18) a nechá se chladit za stálého míchání.

V průběhu krystalizace dochází k pomalému vzestupu

teploty. Zaznamená se nejvyšší dosažená teplota (t1).

Směs se znovu roztaví na vodní lázni při teplotě nepřevyšující

teplotu t1 o více než 5 °C a zkumavka se umístí do

přístroje nastaveného na teplotu o 5 °C nižší než t1. Když

začne probíhat krystalizace, nebo je-li teplota směsi nižší

o 3 °C než t1, zahájí se stálé míchání. Zaznamená se nejvyšší

teplota, při níž směs krystalizuje (t2).

Tento postup se opakuje tak dlouho, až rozdíl mezi dvěma

hodnotami t2 je nejvýše 0,2 °C. Dojde-li k přechlazení, vyvolá

se krystalizace přidáním malého krystalku směsi složené

ze 3,00 g cineolu R a 2,10 g kresolu R taveného. Jestliže

je t2 nižší než 27,4 °C, opakuje se stanovení s 5,10 g

směsi.

Obsah cineolu odpovídající nejvyšší nalezené teplotě (t2) je

uveden v tabulce 2.8.11-1.

Jestliže bylo použito 5,10 g směsi, vypočítá se obsah cineolu

v procentech podle vzorce:

2 ( A - 50) ,

v němž značí:

A – hodnotu nalezenou v tabulce.

Je-li třeba, vypočítá se obsah cineolu odpovídající nejvyšší

nalezené teplotě (t2) interpolací.

Tab. 2.8.11-1

t2

(°C)

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

Cineol

(%)

45,5

47,0

48,5

49,5

50,5

52,0

53,5

54,5

56,0

57,0

58,5

60,0

61,0

62,5

63,5

65,0

t2

(°C)

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

Cineol

(%)

67,0

68,5

70,0

72,5

74,0

76,0

78,0

80,0

82,0

84,0

86,0

88,5

91,0

93,5

96,0

99,0

2.8.12 SILICE V ROSTLINNÝCH DROGÁCH

9.8:20812

PRINCIP

Stanovení obsahu silic v rostlinných drogách se provádí destilací

s vodní párou na speciálním přístroji za dále uvedených

podmínek. Destilát se jímá v kalibrované trubici,

silice se zachycuje v rozpouštědle předepsaném v jednotlivém

článku (obvykle xylen R, trimethylpentan R nebo

1,2,4-trimethylbenzen R); vodná fáze se automaticky vrací

zpět do destilační baňky.

ZAŘÍZENÍ


– vhodné destilační baňky s kulatým dnem a krátkým zabroušeným

hrdlem o vnitřním průměru na širším konci

asi 29 mm;

– kondenzační části (viz obrázek 2.8.12-1), která těsně přiléhá

k destilační baňce zábrusem tak, že spolu tvoří jednolitý

celek a je vyrobena ze skla s nízkým koeficientem

roztažnosti:

– odvětrávací zátka (K´) s odvětrávacím otvorem o průměru

asi 1 mm; širší konec trubice (K) o vnitřním průměru

10 mm je vyroben ze zabroušeného skla;

– hruškovitě rozšířená část (J) o objemu 3 ml;

– trubice (JL) dělená po 0,01 ml;

– kulovitá část (L) o objemu asi 2 ml;

– trojcestný kohout (M);

– ústí trubice B je o 20 mm výše než horní značka dělení

na trubici JL;

– vhodného tepelného zdroje umožňujícího přesné nastavení

teploty;

– svislého stojanu s vodorovným kruhem pokrytým izolačním

materiálem.

POSTUP

Použije se důkladně vyčištěný přístroj. Stanovení se provádí

podle charakteru zkoušené rostlinné drogy. Do destilační

baňky se převede předepsané množství destilační kapaliny,

Zkušební

metody

2.8

ČL 2017 – Dopl. 2020 403

2.8.13 ZBYTKY PESTICIDŮ

přidá se několik kousků porézního porcelánu a připojí se

kondenzační část. Nálevkou (N) se vlije do přístroje voda R

tak, aby její hladina dosáhla bodu B. Vyjme se zátka (K´)

a pipetou, jejíž konec se dotýká spodní části trubice K, se

přidá předepsané množství rozpouštědla předepsaného

v článku. Zátka (K´) se uzavře a zajistí se, aby průtok nic

neomezovalo. Kapalina v baňce se zahřeje k varu a, není-li

předepsáno jinak, destiluje se rychlostí 2 ml/min až

3 ml/min.

Upraví se zahřívání tak, aby se dosáhlo požadované destilační

rychlosti. Jestliže destilační rychlost není stále v požadovaném

rozmezí, postup se opakuje. Jestliže se destilační

podmínky nemění, je vhodné stanovovat destilační rychlost

v pravidelných intervalech raději než před každou

zkouškou.

Stanovení objemu rozpouštědla po kontrolní destilaci.

Při použití xylenu R nebo trimethylpentanu R se destiluje

30 min. Zajistí se, aby trubice BM a JM byly během destilace

propojeny trojcestným ventilem M. Zahřívání se ukončí

a objem rozpouštědla v dělené trubici se odečte nejdříve

za 10 min.

Při použití 1,2,4-trimethylbenzenu R není tento krok nezbytný.

Zahřívání se ukončí po nastavení destilační rychlosti

a objem rozpouštědla v dělené trubici se odečte nejdříve

za 10 min.

Stanovení silice v rostlinné droze. Do baňky se převede

předepsané množství rostlinné drogy a pokračuje se

v destilaci výše uvedeným způsobem po předepsanou dobu

a předepsanou rychlostí. Zahřívání se ukončí a po 10 min se

odečte objem kapaliny v dělené trubici, od něhož se odečte

dříve zaznamenaný objem rozpouštědla. Rozdíl vyjadřuje

obsah silice ve zkoušené droze. Výsledek se přepočítá na

obsah mililitrů v 1 kg rostlinné drogy.

Zpětné získání směsi rozpouštědla a silice. Má-li se silice

použít pro další analytické účely, oddělí se bezvodá směs

rozpouštědla a silice následujícím způsobem. Vyjme se zátka

(K´) a přidá se 0,1 ml roztoku fluoresceinu sodné soli R

(1 g/l) a 0,5 ml vody R. Otevřením trojcestného kohoutu M

se vypustí směs rozpouštědla a silice do kulovité části (L)

a nechá se 5 min stát. Vypouští se pomalu, dokud hladina

neklesne na úroveň kohoutu M. Kohoutem se otočí ve směru

hodinových ručiček tak, aby vytekla voda ze spojovací trubice

(BM). Pomocí nálevky (N) se trubice promyje acetonem

R. Kohoutem se otočí proti směru hodinových ručiček,

aby se směs rozpouštědla a silice vypustila do vhodné baňky.

Obr. 2.8.12-1 Přístroj na stanovení silic v rostlinných

drogách (rozměry v milimetrech)

Obr. 2.8.12-2

Stanovení destilační rychlosti. Během destilace se určí

destilační rychlost snížením hladiny vody pomocí trojcestného

kohoutu M tak, aby odpovídala polohou dolní značce

(a) (viz obrázek 2.8.12-2). Kohout se uzavře a změří se

čas potřebný k tomu, aby hladina dosáhla horní značky (b).


9.6:20813

Definice. Pro lékopisné účely je pesticid jakákoliv látka nebo

směs látek určených k ochraně rostlin, likvidaci nebo regulaci

jakýchkoliv škůdců, nežádoucích druhů rostlin nebo živočichů

působících škody nebo jinak rušících při výrobě, zpracování,

skladování, dopravě nebo prodeji rostlinných drog.

Tato skupina zahrnuje látky používané jako regulátory růstu,

defolianty nebo desikanty a jakékoliv látky aplikované na

rostliny před nebo po sklizni, aby se zajistila ochrana zboží

před znehodnocením během skladování a dopravy. Zbytky

pesticidů mohou být přítomny a kontrolují se v rostlinných

drogách a v přípravcích z rostlinných drog.

Limity. Není-li v článku uvedeno jinak, zkoušená rostlinná

droga přinejmenším vyhovuje limitům uvedeným v tabulce

2.8.13-1. Limity pro pesticidy, které nejsou uvedeny v tabulce

2.8.13-1 a jejichž přítomnost lze z jakéhokoliv důvodu

předpokládat, se shodují s limity (hodnotami) určenými

nařízením (ES) č. 396/2005, včetně doplňků a následných

změn. Limity pro pesticidy, které nejsou uvedeny v tabulce

2.8.13-1 ani v textech EU, se vypočítají podle vzorce:

404 ČL 2017 – Dopl. 2020


ADI × M

,

MDDHD ×100

v němž značí:

ADI – povolenou denní dávku, jak je uvedena ve

FAO-WHO, v miligramech na kilogram tělesné

hmotnosti;

M – tělesnou hmotnost v kilogramech (60 kg);

MDDHD – denní dávku rostlinné drogy v kilogramech.

Limity pro pesticidy v přípravcích z rostlinných drog se

vypočítají podle vzorců:

je-li DER £ 10: MRLHD × DER ,

ADI × M

je-li DER > 10: ,

MDDHP × 100

v nichž značí:

MRLHD – nejvyšší limit zbytků pesticidu v rostlinné droze

uvedený v tabulce 2.8.13-1 nebo v EU textech, nebo

vypočítaný za použití výše uvedeného vzorce;

DER – poměr droga/extrakt, tj. poměr mezi množstvím

rostlinné drogy použité ve výrobě přípravku

z rostlinné drogy a množstvím získaného přípravku

z rostlinné drogy;

MDDHP – denní dávku přípravku z rostlinné drogy v kilogramech.

Tab. 2.8.13-1

Látka

Limit (mg/kg)

acefát 0,1

alachlor 0,05

aldrin a dieldrin (součet) 0,05

azinfos-ethyl 0,1

azinfos-methyl 1

bromofos-ethyl 0,05

bromofos-methyl 0,05

brompropylát 3

cyfluthrin (součet) 0,1

l-cyhalothrin 1

cypermethrin a izomery (součet) 1

DDT (součet o,p'-DDE, p,p'-DDE,

1

o,p'-DDT, p,p'-DDT, o,p'-TDE

a p,p'-TDE)

deltamethrin 0,5

diazinon 0,5

dichlofluanid 0,1

dichlorvos 1

dikofol 0,5

dimethoát a omethoát (součet) 0,1

dithiokarbamáty (vyjádřeno jako CS2) 2

endosulfan (součet izomerů

3

a endosulfan-sulfátu)

endrin 0,05

ethion 2

etrimfos 0,05

fenchlorfos (součet fenchlorfosu

0,1

a fenchlorfos-oxonu)

Látka

Limit (mg/kg)

fenitrothion 0,5

fenpropathrin 0,03

fensulfothion (součet fensulfothionu, 0,05

fensulfothion-oxonu, fensulfothion-

-oxon-sulfonu a fensulfothion-sulfonu)

fenthion (součet fenthionu, fenthion- 0,05

-oxonu, fenthion-oxon-sulfonu,

fenthion-oxon-sulfoxidu, fenthionsulfonu

a fenthion-sulfoxidu)

fenvalerát 1,5

flucytrinát 0,05

t-fluvalinát 0,05

fonofos 0,05

fosalon 0,1

fosmet 0,05

heptachlor (součet heptachloru,

0,05

cis-heptachlorepoxidu

a trans-heptachlorepoxidu)

hexachlorbenzen 0,1

hexachlorcyklohexan (součet izomerů 0,3

a-, b-, d- a e-)

chinalfos 0,05

chintozen (součet chintozenu,

1

pentachloranilinu a methyl-

-pentachlorfenyl-sulfidu)

chlordan (součet cis-, trans-

0,05

a oxychlordanu)

chlorfenvinfos 0,5

chlorpyrifos-ethyl 0,2

chlorpyrifos-methyl 0,1

chlorthal-dimethyl 0,01

lindan (g-hexachlorcyklohexan) 0,6

malathion a malaoxon (součet) 1

mekarbam 0,05

methakrifos 0,05

methamidofos 0,05

methidathion 0,2

methoxychlor 0,05

mirex 0,01

monokrotofos 0,1

parathion-ethyl a paraoxon-ethyl (součet) 0,5

parathion-methyl a paraoxon-methyl 0,2

(součet)

pendimethalin 0,5

pentachloranisol 0,01

permethrin a izomery (součet) 1

piperonyl-butoxid 3

pirimifos-ethyl 0,05

pirimifos-methyl (součet pirimifos-methylu

4

a

N-desethyl-pirimifos-methylu)

procymidon 0,1

Zkušební

metody

2.8

ČL 2017 – Dopl. 2020 405

2.8.14 TŘÍSLOVINY V ROSTLINNÝCH DROGÁCH

Látka

Limit (mg/kg)

profenofos 0,1

prothiofos 0,05

pyrethriny (součet cinerinu I, cinerinu II, 3

jasmolinu I, jasmolinu II, pyrethrinu I

a pyrethrinu II)

S-421 0,02

teknazen 0,05

tetradifon 0,3

vinklozolin 0,4

Oprávněná autorita může připustit úplné nebo částečné vypuštění

zkoušky, jestliže je přesně znám celý postup ošetřování

každé šarže (druh a množství použitých pesticidů,

data každého použití v průběhu pěstování a po sklizni)

a může být přesně kontrolován podle správné zemědělské

a sběrové praxe (GACP).

Odběr vzorků rostlinných drog. Postupuje se podle obecné

stati 2.8.20 Rostlinné drogy: vzorkování a příprava

vzorku.

Kvalitativní a kvantitativní analýza zbytků pesticidů.

Použité analytické postupy se validují (např. podle předpisu

č. SANCO/10232/2006 nebo pozdějších revizí tohoto dokumentu).

Splňují zejména následující požadavky:

– zvolený postup, zvláště purifikační kroky, je vhodný pro

kombinaci zbytek pesticidu/zkoušená látka a není citlivý

k rušivým vlivům současně extrahovaných látek;

– přirozený výskyt některých složek se bere v úvahu při interpretaci

výsledků (např. disulfidy z Cruciferaceae);

– koncentrace zkoušeného a porovnávacího roztoku a nastavení

přístroje jsou takové, aby odezvy použité pro

kvantifikaci zbytků pesticidů byly v mezích dynamického

rozsahu detektoru; zkoušené roztoky obsahující zbytky

pesticidů v množství mimo dynamický rozsah se mohou

zředit v mezích kalibračního rozsahu; předpokládá se, že

koncentrace matrice v roztoku je upravena v případě,

když kalibrační roztoky musí být přizpůsobeny matrici;

– je nalezeno 70 % až 110 % každého pesticidu;

– opakovatelnost metody: relativní směrodatná odchylka

(RSD) není větší než hodnoty uvedené v tabulce 2.8.13-2;

– reprodukovatelnost metody: relativní směrodatná odchylka

(RSD) není větší než hodnoty uvedené v tabulce

2.8.13-2.

Tab. 2.8.13-2

Rozmezí koncentrace

pesticidu

(mg/kg)

0,001–0,01

> 0,01–0,1

> 0,1–1

> 1

Opakovatelnost

(RSD)

(%)

30

20

15

10

Reprodukovatelnost

(RSD)

(%)

60

40

30

20

2.8.14 TŘÍSLOVINY V ROSTLINNÝCH

DROGÁCH

6.0:20814

Všechny extrakční a ředicí postupy se provádějí za chránění

před světlem.

Pro stanovení v rostlinných drogách nebo suchých extraktech

se smíchá předepsané množství práškované drogy

(180) (2.9.12) nebo extraktu v 250ml baňce s kulatým

dnem se 150 ml vody R a zahřívá se 30 min na vodní lázni.

Ochladí se pod tekoucí vodou a směs se kvantitativně převede

do 250ml odměrné baňky. Baňka s kulatým dnem se

promyje vodou R, promývací tekutina se přidá do odměrné

baňky a zředí se vodou R na 250,0 ml. Po usazení pevných

látek se tekutina zfiltruje přes filtrační papír o průměru

125 mm. Prvních 50 ml filtrátu se odstraní.

Pro stanovení v tekutých extraktech nebo tinkturách se zředí

předepsané množství tekutého extraktu nebo tinktury vodou

R na 250,0 ml. Směs se zfiltruje přes filtrační papír

o průměru 125 mm. Prvních 50 ml filtrátu se odstraní.

Celkové polyfenoly. 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R na

25,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se smíchají s 1,0 ml zkoumadla

fosfomolybdenan-wolframového R a 10,0 ml vody R

a zředí se roztokem uhličitanu sodného R (290 g/l) na

25,0 ml. 30 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance

(2.2.25) při 760 nm (A1) za použití vody R jako


Polyfenoly neadsorbovatelné na kožní prášek. K 10,0 ml filtrátu

se přidá 0,10 g kožního prášku CRL a intenzivně se protřepává

60 min. Zfiltruje se a 5,0 ml filtrátu se zředí vodou R

na 25,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se smíchají s 1,0 ml zkoumadla

fosfomolybdenan-wolframového R a 10,0 ml vody R

a zředí se roztokem uhličitanu sodného R (290 g/l) na

25,0 ml. 30 min po přidání posledního roztoku se měří absorbance

(2.2.25) při 760 nm (A2) za použití vody R jako


Porovnávací roztok. 50,0 mg pyrogallolu R se těsně před

použitím rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml.

5,0 ml roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto

roztoku se smíchají s 1,0 ml zkoumadla fosfomolybdenanwolframového

R a 10,0 ml vody R a zředí se roztokem uhličitanu

sodného R (290 g/l) na 25,0 ml. 30 min po přidání

posledního roztoku se měří absorbance (2.2.25) při 760 nm

(A3) za použití vody R jako kontrolní kapaliny.

Obsah tříslovin v procentech vyjádřený jako pyrogallol se


v němž značí:

62,5 ×

( A - A )

m1 – hmotnost zkoušené látky v gramech;

m2 – hmotnost pyrogallolu v gramech.

A

3

1

× m

2.8.15 ČÍSLO HOŘKOSTI

6.0:20815

Číslo hořkosti je definováno jako reciproká hodnota zředění

sloučeniny, tekutiny nebo extraktu, které chutná ještě hořce.

Stanoví se porovnáním s chinin-hydrochloridem, jehož

číslo hořkosti je 200 000.

1

2

× m

2

,

406 ČL 2017 – Dopl. 2020

2.8.16 ZBYTEK PO VYSUŠENÍ U EXTRAKTŮ

Stanovení korekčního faktoru

Je vhodné, aby zkoušku prováděla skupina nejméně šesti

osob. Před ochutnáváním si musí vypláchnout ústa vodou

R.

Je třeba stanovit korekční faktor pro každého člena skupiny

tak, aby byly odstraněny individuální rozdíly vnímání hořké

chuti.

Základní roztok. 0,100 g chinin-hydrochloridu R se rozpustí

ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku

se zředí vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se řada porovnávacích roztoků

tak, že v první zkumavce je 3,6 ml základního roztoku

a v každé následující zkumavce se objem tohoto roztoku

zvyšuje o 0,2 ml až do konečného objemu 5,8 ml. Objem

každé zkumavky se zředí vodou R na 10,0 ml.

Určí se roztok s nejnižší koncentrací, který chutná ještě

hořce. 10,0 ml tohoto roztoku se převaluje v ústech 30 s

tak, aby roztok přišel do styku s kořenem jazyka; jestliže

roztok nechutná hořce vyplivne se a po 1 min se ústa vypláchnou

vodou R. Po 10 min se zkouší stejným způsobem

roztok následující vyšší koncentrace.

Korekční faktor k se vypočítá pro každého člena skupiny

podle vzorce:

k =

n

5,00

,

Za použití roztoku D se připraví řada roztoků s následujícím

postupným zředěním:

Roztok D (ml) 1,2 1,5 2,0 3,0 6,0 8,0

Voda R (ml) 8,8 8,5 8,0 7,0 4,0 2,0

Určí se objem roztoku D v mililitrech, který po zředění vodou

R na 10,0 ml chutná ještě hořce (X).

Vypočítá se číslo hořkosti pro každou ze zkoušejících osob

podle vzorce:

Y × k

.

X × 0,1

Číslo hořkosti zkoušené látky se vyjádří jako průměrná

hodnota zjištěná všemi zkoušejícími osobami.

2.8.16 ZBYTEK PO VYSUŠENÍ U EXTRAKTŮ

6.0:20816

2,00 g nebo 2,0 ml zkoušeného extraktu se rychle převedou

do misky s plochým dnem o průměru asi 50 mm a hloubce

asi 30 mm. Odpaří se do sucha na vodní lázni a zbytek se

suší 3 h v sušárně při 100 °C až 105 °C. Nechá se ochladit

v exsikátoru nad oxidem fosforečným R nebo silikagelem

bezvodým R a zváží se. Vypočítá se výsledek v procentech

nebo v gramech na litr.

Zkušební

metody

2.8

v němž značí:

n – počet mililitrů základního roztoku o nejnižší koncentraci,

který chutnal ještě hořce.

Osoba, které porovnávací roztok připravený z 5,8 ml základního

roztoku nechutná hořce, je ze zkoušení vyloučena.

Příprava vzorku

Je-li třeba, vzorek se upráškuje (710) (2.9.12). K 1,0 g se

přidá 100 ml vroucí vody R a za nepřetržitého míchání se

zahřívá 30 min na vodní lázni. Nechá se ochladit a zředí se

vodou R na 100 ml. Důkladně se promíchá a zfiltruje se,

první 2 ml filtrátu se odstraní. Filtrát se označí C-1 a jeho

zřeďovací faktor (DF) je 100.

Stanovuje-li se číslo hořkosti tekutin, 1 ml zkoušené tekutiny

se zředí vhodným rozpouštědlem na 100 ml a označí

se C-1.

Stanovení čísla hořkosti

Zkoušené roztoky:

10,0 ml roztoku C-1 se zředí (DF = 1000)

vodou R na 100 ml: C-2

10,0 ml roztoku C-2 se zředí (DF = 10 000)



vodou R na 100 ml: C-3A



Každý zkoušející hodnotí nejprve roztok C-4 a pokračuje

tak dlouho, dokud některý z roztoků neshledá hořkým. Tento

roztok se označí D. Zřeďovací faktor (DF) roztoku D se

označí jako Y.

2.8.17 ZTRÁTA SUŠENÍM U EXTRAKTŮ

6.0:20817

Do misky s plochým dnem o průměru asi 50 mm a hloubce

asi 30 mm se rychle odváží 0,50 g zkoušeného jemně práškovaného

extraktu. Extrakt se suší 3 h v sušárně při 100 °C

až 105 °C. Nechá se ochladit v exsikátoru nad oxidem fosforečným

R nebo silikagelem bezvodým R a zváží se. Vypočítá

se výsledek v procentech.

2.8.18 STANOVENÍ OBSAHU AFLATOXINU B 1

V ROSTLINNÝCH DROGÁCH

6.0:20818

UPOZORNĚNÍ: Aflatoxiny jsou velmi toxické a karcinogenní.

Je-li to možné, provádí se manipulace s nimi v digestoři

s odtahem. Jsou-li toxiny v suché formě, je třeba vzhledem

k jejich elektrostatickým vlastnostem a jejich tendenci

k rozptylu po pracovních plochách učinit mimořádná opatření,

jako je použití izolátoru. Dekontaminační postupy pro

zacházení s laboratorním odpadem aflatoxinů byly vypracovány

Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny [International

Agency for Research on Cancer (IARC)].

Aflatoxiny jsou přirozeně se vyskytující mykotoxiny produkované

zejména druhy Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus.

Tyto plísně jsou běžné a jsou v přírodě hojně rozšířené.

Nejčastěji se vyskytují na nezralých zrnech za nepříznivých

podmínek, jako je období sucha. Plísně se vyskytují

v půdě, zahnívající vegetaci, senu a obilí, vyvolávají mikrobiální

kontaminaci a napadají všechny typy organických substrátů

kdykoliv a kdekoliv jsou vhodné podmínky pro jejich

růst. Optimálními podmínkami jsou vysoký obsah vlhkosti

i vysoká teplota. V přírodě je produkováno více než třináct

ČL 2017 – Dopl. 2020 407

2.8.18 STANOVENÍ OBSAHU AFLATOXINU B 1 V ROSTLINNÝCH DROGÁCH

různých druhů aflatoxinů a u většiny z nich je známo, že jsou

velmi toxické a karcinogenní. Za nejtoxičtější se považuje

aflatoxin B1. Rostlinné drogy, které jsou kontaminované aflatoxiny,

se hodnotí validovanou metodou.

Není-li v článku uvedeno jinak, rostlinné drogy obsahují

nejvýše 2 μg/kg aflatoxinu B1.

Oprávněná autorita může též požadovat dodržení limitu

4 µg/kg pro celkový obsah aflatoxinů B1, B2, G1 a G2.

Dále popsaný postup se uvádí jako příklad metody, která se

ukázala jako vhodná pro hodnocení těchto rostlinných drog:

harpagofytového kořene (Harpagophyti radix), zázvorového

oddenku (Zingiberis rhizoma) a plodu kassie (Sennae

fructus). Vhodnost metody pro jiné rostlinné drogy se musí

prokázat, nebo se musí použít jiná validovaná metoda.

POSTUP

Kapalinová chromatografie (2.2.29).

Aflatoxiny jsou látky, které se rozkládají vlivem světla. Stanovení

se proto provádí za chránění před denním světlem

za použití fólie absorbující ultrafialové záření umístěné na

oknech v kombinaci s tlumeným světlem nebo záclonami,

nebo žaluziemi v kombinaci s umělým osvětlením (přípustné

jsou fluorescenční zářivky). Roztoky obsahující aflatoxiny

se musí chránit před denním světlem.

Skleněné nádobí se před použitím vypláchne roztokem kyseliny

sírové R 10% (V/V) a pak pečlivě vodou destilovanou

R do vymizení kyselé reakce.

Zkoušený roztok. Použije se imunoafinitní kolona obsahující

protilátky proti aflatoxinu B1 s kapacitou nejméně

100 ng aflatoxinu B1 a návratností nejméně 80 % při použití

roztoku 5 ng aflatoxinu B1 ve směsi 12,5 ml methanolu R

a 87,5 ml vody R. Imunoafinitní kolona se nechá vytemperovat

na teplotu místnosti. K 5,00 g práškované drogy (500)

(2.9.12) se přidá 100 ml směsi objemových dílů vody R

a methanolu R (30 + 70) a extrahuje se 30 min v ultrazvukové

lázni. Zfiltruje se přes skládaný papírový filtr, 10,0 ml

čirého filtrátu se převede pipetou do 150ml kuželové baňky

a přidá se 70 ml vody R. 40 ml tohoto roztoku se nechá protékat

imunoafinitní kolonou průtokovou rychlostí 3 ml/min

(ne více než 5 ml/min). Kolona se promyje dvakrát 10 ml

vody R při průtokové rychlosti nejvýše 5 ml/min a pak se

suší 5 s až 10 s za použití mírného vakua nebo 10 s pomocí

vzduchu z injekční stříkačky procházejícího přímo kolonou.

Na kolonu se převede 0,5 ml methanolu R a nechá se volně

protéct. Eluát se jímá do 5ml odměrné baňky. Po 1 min se

převede na kolonu druhá dávka 0,5 ml methanolu R. Po

další 1 min se převede třetí dávka 0,5 ml methanolu R.

Většina eluční tekutiny se získá buď za použití stlačeného

vzduchu, nebo vakua v koloně. Zředí se vodou R na 5 ml

a dobře se protřepe. Jestliže je roztok čirý, lze jej použít

přímo k analýze. V opačném případě je třeba jej zfiltrovat

před nástřikem přes jednorázový filtr. Použije se jednorázový

filtr (např. polytetrafluorethylenový filtr o velikosti

pórů 0,45 μm) tak, aby během retence nedošlo ke ztrátě

aflatoxinu.

Primární základní roztok aflatoxinu B1. Aflatoxin B1 R se

rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a toluenu

R (2 + 98) na výslednou koncentraci 10 μg/ml. Ke stanovení

přesné koncentrace aflatoxinu B1 v primárním základním

roztoku se zaznamená absorpční křivka (2.2.25)

při 330 nm až 370 nm v křemenných kyvetách.

Hmotnostní koncentrace aflatoxinu B1 v mikrogramech na

mililitr se vypočítá podle vzorce:

A×

M × 100

,

e × l

v němž značí:

A – absorbanci odečtenou v maximu absorpční křivky;

M – molární hmotnost aflatoxinu B1 (312 g/mol);

ε – molární absorptivitu aflatoxinu B1 ve směsi toluenu

a acetonitrilu (1930 m 2 /mol);

l – tloušťku vrstvy měřeného roztoku (1 cm).

Sekundární základní roztok aflatoxinu B1. Sekundární základní

roztok obsahující 100 ng/ml aflatoxinu B1 se připraví

zředěním primárního základního roztoku aflatoxinu B1

směsí objemových dílů acetonitrilu R a toluenu R (2 + 98).

Odměrná baňka se těsně obalí hliníkovou fólií a uchovává

se při teplotě nepřesahující 4 °C. Před použitím se hliníková

fólie ponechá na baňce, dokud roztok nedosáhne teploty

místnosti. Jestliže se roztok uchovává delší dobu (např. jeden

měsíc), baňka se zváží a zaznamená se jakákoli změna

hmotnosti před a po každém použití roztoku.

Standardní roztoky aflatoxinu B1. Do 250ml odměrných

baněk se odděleně převedou objemy sekundárního základního

roztoku aflatoxinu v množství uvedeném v tabulce

2.8.18-1 a odpaří se proudem dusíku při teplotě místnosti

do sucha. Do každé baňky se přidá 75 ml methanolu R,

aflatoxin B1 se nechá v jednotlivých baňkách rozpustit

a zředí se vodou R na 250 ml.

Tab. 2.8.18-1 Standardní roztoky aflatoxinu B1

Standardní

roztok

1

2

3

4

5

Objem

sekundárního

základního

roztoku

(μl)

125

250

500

750

1000

Výsledná

koncentrace

standardního

roztoku

(ng/ml)

0,05

0,1

0,2

0,3

0,4

Kalibrační křivka. Kalibrační křivka se sestrojí za použití

standardních roztoků aflatoxinu B1 označených 1 až 5, které

pokrývají rozsah odpovídající 1 µg/kg až 8 µg/kg aflatoxinu

B1 v rostlinné droze. Prověří se linearita křivky. Jestliže

je obsah aflatoxinu B1 ve zkoušeném roztoku mimo rozsah

kalibrační křivky, musí se zkoušený roztok vhodným

způsobem zředit na obsah aflatoxinu, který je pro kalibrační

křivku vhodný.

Kolona:

– rozměry: délka 0,25 m, vnitřní průměr 4,6 mm;

– stacionární fáze: silikagel pro chromatografii oktadecylsilylovaný

R (5 μm).

Mobilní fáze:

– mobilní fáze A (pro derivatizaci za kolonou fotochemickou

reakcí nebo s pyridinium-tribromidem): směs objemových

dílů acetonitrilu R, methanolu R a vody R

(2 + 3 + 6);

– mobilní fáze B (pro derivatizaci za kolonou s elektrochemicky

generovaným bromem): přidá se 0,12 g bromidu

draselného R a 350 μl kyseliny dusičné zředěné RS1 na

litr mobilní fáze A.

408 ČL 2017 – Dopl. 2020

111222333

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?