METODA PO GREEN-U Princip metode: nitriti reaguju sa Griess ...

METODA PO GREEN-U
Princip metode: nitriti reaguju sa Griess-ovim reagensom, pri čemu se dobija ljubičasta azo boja.
Intenzitet boje zavisi od koncentracije nitrita. Ovom metodom se mogu određivati i nitrati.
GRIESS-OV REAGENS
• sulfanilamid (SA) Mw=172.2
1g / 100ml 5% H3PO4
• naftaletilendiamin (NEDA) Mw=259.2
0.1g / 100ml dH2O
Rastvore spojiti u razmeri 1:1 i mešati na magnetnoj mešalici u mraku na 4°C – 30 minuta.

STANDARDNA KRIVA
• standard NaNO2 Mw=69
0.138g / 10ml dH2O 200mM
1000xR ↪ 10µl + 9.99ml dH2O 2 x 100µM
1ml STD (2 x 100µM ) + 1 ml M199 100 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 50 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 25 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 12.5 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 6.25 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 3.125 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 1.56 µM

2xR↪1ml STD + 1 ml M199 0.78 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 0.39 µM
2xR↪1ml STD + 1 ml M199 0.195 µM
SLEPA PROBA: 100µl M199 + 100µl Griess-a
UZORCI: 100µl uzorka + 100µl Griess-a
STANDARDI: 100µl standarda + 100µl Griess-a
INKUBACIJA: 10 minuta na sobnoj temperaturi
MERENJE APSORBANCE NA FOTOMETRU: λ= 546nm
REDOSLED DODAVANJA U MIKROTITAR PLOČU
• Oznaka well-a Šta dodajemo???
• 2A (slepa proba) 100µl M199 + 100µl Griess reagensa
• 3A,4A 100µl M199 + 100µl Griess
• 5A,6A 100µl (STD 0,195 µM) + 100µl Griess
• 7A,8A 100µl (STD 0,39 µM) + 100µl Griess

• 9A,10A 100µl (STD 0,78 µM) + 100µl Griess
• 11A,12A 100µl (STD 1,56 µM) + 100µl Griess
• 1B,2B 100µl (STD 3,125 µM) + 100µl Griess
• 3B,4B 100µl (STD 6,25 µM) + 100µl Griess
• 5B,6B 100µl (STD 12,5 µM) + 100µl Griess
• 7B,8B 100µl (STD 25 µM) + 100µl Griess
• 9B,10B 100µl (STD 50 µM) + 100µl Griess
• 11B,12B 100µl (STD 100 µM) + 100µl Griess
• 1C,2C 100µl Uzorak 1 + 100µl Griess
• 3C,4C 100µl Uzorak 2 + 100µl Griess