Cam Sep Lect 1 Chromatografia Bronislaw K. Glod

Wysokosprawna 

Chromatografia Cieczowa 

Bronisław K. Głód 

Akademia Podlaska, Instytut Chemii, Zakład Chemii Analitycznej 

ul. 3 Maja, 08-110 Siedlce, Poland

Nauka o rozdzielaniu

Rozdzielanie 

Adsorpcja Analiza sitowa Chromatografia 

Dekantacja Destylacja Ekstrakcja 

Elektroforeza Elutriacja (sed. Płynów) Filtracja (mikro-, ultra-, nano-) 

Flokulacja (koloidów) Flotacja Frakcjonowana dest 

Frak. wymrażanie Krystalizacja Nebulizacja 

Odparowanie Odwiewanie Odwrócona osmoza 

Osuszanie Rekrystalizacja Rozdział magnetycz 

Sedymentacja Strefowe rozdziel. Sublimacja 

Suszenie Wirowanie (cyklonowe) Wytrącanie 

Zatężanie

Związek parametru fizycznego 

z metodą rozdzielania

Rozdzielanie

Friedlieb Runge (1794-1867) 

Used unglazed paper 

and pieces of cloths 

for spot testing dye 

mixtures and plant 

extracts

Michaił Sjemjonowicz Cwiet




Pierwsze chromatografy cieczowe



Podział złoża na strefy

Historia chromatografii 

1903 – Cwiet – początek chromatografii, rozdział chlorofili 

1905 – Ramsey – rozdział par i gazów 

1914 – Palmer – zastosowania 

1931 – Kuhn i Lederer – zastosowania 

1938 – Izmaiłow i Schraiber – chromatografia cienkowarstwowa 

1938 – Reichstein – pomiary ciągłe 

1941 – Martin i Synge – chromatografia podziałowa 

1947 – Martin i Synge – teoria chromatografii 

1948 – Tiselius – nagroda Nobla za prace nad elektroforezą 

1950 – Horward i Martin – chromatografia faz odwróconych 

1951 – Martin i Synge – chromatografia gazowa (nagroda Nobla) 

1952 – Alma – gradient elucji 

1953 – Wheaton i Bauman – chromatografia jonowo-wykluczająca 

1955 – Kemula – detekcja elektrochemiczna 

1958 – Stahl – monografia o chromatografii cienkowarstwowej 

1958 – Stein i Moore – automatyczna analiza aminokwasów 

1958 – Hjerten – elektroforeza 

1959 – Porath i Flodin – zastosowanie miękkich żeli polidekstranowych 

1962 – Moore – sztywne żywice polistyrenowe 

1964 – Giddings – dwie klasyczne książki o teorii chromatografii cieczowej 

1967 – Huber i Hulman – szybka chromatografia podziałowa (HPLC) 

1969 – – Journal of Chromatography 

1973 – Stein i Moore – nagroda Nobla za prace nad chromatografią cieczową 

1981 – Small – chromatografia jonowa 

1981 – Jorgenson i Lukacs – elektroforeza kapilarna

Techniki rozdzielania i ekstrakcji 

- Chromatografia, 

- Rozdzielanie w polu sił - FFF (ang. Field Flow Fractionation), 

- Analiza wstrzykowo-przepływowa - FIA (ang. Flow Injection Analysis), 

- Analiza w ciągłym przepływie - CFA (ang. Continuous Flow Analysis), 

- Hydrochromatografia, 

- Spektrometria mas (MS), 

- Spektrometria ruchliwości jonów (TOF), 

- Chromatografia w przeciwprądzie (CCC), 

- Elektrochromatografia (El-Chr), 

- Elektroforeza żelowa (GE) i kapilarna (CE), 

- Izotachoforeza (ITF), 

- Elektroogniskowanie (El-F), 

- Chromatografia elektrokinetyczna (Ec-Chr).

Techniki rozdzielania i ekstrakcji


• Techniki izolacji z próbek stałych 

• Ekstrakcja za pomocą strumienia gazu 

• Ekstrakcja za pomocą cieczy 

• Ekstrakcja za pomocą płynu w stanie nadkrytycznym (SFE) 

• Techniki destylacyjne 

• Piroliza 

• Techniki destylacji zawiesiny, 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta, 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomagana ultradźwiękami (UAE), 

• Przyspieszona ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika (ASE), 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomaganą promieniowaniem 

mikrofalowym (MAE), 

• Ekstrakcja do wiszącej kropli (HDE), 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z 

wypełniaczem (MSPD).


Warianty technik ekstrakcji za pomocą cieczy 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomagana 

ultradźwiękami (UAE) 

• Przyspieszona ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika (ASE) 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomagana 

promieniowaniem mikrofalowym (MAE) 

• Ekstrakcja za pomocą płynu w stanie nadkrytycznym (SFE) 

• Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z 

wypełniaczem (MSPD)

Elektroanaliza 

Do technik rozdzielania zalicza się również niektóre metody 

elektrochemiczne, w których reakcja elektrodowa przebiega przy 

niezerowym prądzie Faraday’a, czyli z przyłożonym do elektrod napięciem z 

zewnętrznego źródła prądu: 

- Kulometria, elektrograwimetria – elektroliza w całej masie roztworu, 

- Polarografia stałoprądowa, zmiennoprądowa, pulsowa, różnicowa, 

- Woltamperometria, woltamperometria cykliczna, z zatężaniem, 

- Amperometria, 

- Elektrodyka z niestacjonarnym procesem elektrodowym 

(chronoamperometria, chronopotencjometria, polarografia, woltametria), 

- Ze stacjonarnym procesem elektrodowym (wolametria w warunkach 

kontrolowanej konwekcji, miareczkowanie amperometryczne z dwiema 

elektrodami wskaźnikowymi, potencjometria z elektrodą polaryzowaną 

prądem stałym).

Spektrometr mas 

Nobel Prizes in Mass Spectrometry 

1906 - J.J. Thomson- m/z of electron 

1911- W. Wien- anode rays have positive charge 

1922 - F. Aston- isotopes (first MS with velocity focusing) 

1989 - H. Dehmelt, W. Paul- quadrupole ion trap 

1992 - R.A. Marcus- RRKM theory of unimolecular dissociation 

1996 - Curl, Kroto, and Smalley- fullerenes (used MS) 

2002 - J. Fenn- electrospray ionization of biomolecules 

K. Tanaka- laser desorption ionization of biomolecules

Spektrometr mas 

Cztery etapy związane z eksperymentem spektrometrii mas: 

1. generowanie cząsteczek w fazie gazowej z próbki (ciecz, roztwór, c. 

stałe, itd.) 

2. jonizacja tych cząsteczek 

3. rozdzielanie jonów na podstawie ich masy 

4. detekcja strumienia jonów

8. Chromatografia wykluczania sterycznego 


1. Ekstrakcja, Ekstrakcja na ciele stałym 

2. Chromatografia gazowa 

3. Cieczowa chromatografia planarna 

4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa 

(HPLC) 

5. Chromatografia jonowa 

6. Elektroforeza 

7. Chromatografia płynowa

Podział Chromatografii 

Wszystkie techniki chromatograficzne można podzielić ze względu na: 

Stosowaną fazę ruchomą, na: 

- chromatografię gazową (GC), 

- chromatografię cieczową (LC) oraz 

- chromatografię płynową (w stanie nadkrytycznym) (SFC).


Wszystkie techniki chromatograficzne można podzielić ze względu na: 

Skalę procesu: 

- chromatografia analityczna, 

- chromatografia preparatywna i 

- chromatografia przemysłowa. 

- chromatografię analityczną, w tym, z kolumnami klasycznymi (dc 2 mm ÷ 4,6 

mm), mikro-pakowanymi (dc = 2 ÷ 0,5 mm) i pakowanymi albo 

niepakowanymi kolumnami kapilarnymi (dc = 0,53, 0,32 i 0,25 mm), 

- chromatografię w skali semi-preparatywnej i preparatywnej (kolumny o 

średnicy w zakresie dc od 6 mm do ok. 25 mm), 

- chromatografię w skali procesowej (przemysłowej), kolumny w zakresie od 25 

mm do nawet 5 m).


Technikę wprowadzania analizowanej próbki: 

- Analiza czołowa. W tej technice próbkę dodaje się do fazy ruchomej 

stosowanej następnie do rozwijania chromatogramu. W wyniku tego sygnały 

poszczególnych składników próbki dodają się do siebie i otrzymujemy 

chromatogram w postaci charakterystycznej wznoszącej się krzywej 

schodkowej. 

- Analiza elucyjna. Próbka o małej objętości wprowadzana jest do kolumny i 

przemywana fazą ruchomą. Obecnie jest to najczęściej stosowana technika 

wprowadzania próbki. 

- Rugowanie próbki. W technice tej skład fazy ruchomej przed i za próbką jest 

różny. Faza ruchoma za próbką zawiera składnik mający duże powinowactwo 

do fazy stacjonarnej i przyśpieszający przez to wymywanie próbki.

Podział Chromatografii



Elucja

Rugowanie

Elektroforeza 

1. Elektroforeza planarna 

2. Elektroforeza tubularna 

3. Wyznaczanie mas (SDS-PAGE) 

4. Izotachoforeza 

5. Ogniskowanie izoelektryczne 

6. Bloty 

7. Elektroforeza kapilarna 

- Kapilarna elektroforeza strefowa (CZE) 

- Micelarna chromatografia elektrokinetyczna (MEKC) 

- Elektrochromatografia kapilarna (CEC)

Ekstrakcja do ciała 

stałego

S P M E

Podział Chromatografii Cieczowej 

1. Ze względu na postać fazy stacjonarnej: 

- kolumnowa, 

- planarna: bibułowa (w tym krążkowa) lub cienkowarstwowa (TLC) (w tym 

dwuwymiarowa (2D-TLC) i nadciśnieniowa (OVP-TLC, lub OP-TLC)). 

2. Sposób analizowania próbki: 

- ługowanie rozdzielonych składników z części złoża kolumny, albo z części 

cienkiej warstwy umieszczonej w oddzielnej kolumnience, 

- zbieranie eluatu (fazy ruchomej opuszczającej kolumnę) do oddzielnych 

pojemników i poddawanie ich osobnej analizie chemicznej, 

- detekcja ciągła (detektor przyłączony jest bezpośrednio do wylotu 

kolumny). 

3. Stosunek polarności fazy ruchomej do stacjonarnej: 

- układ faz normalnych (prostych) (NP, HILIC), 

- układ faz odwróconych (RP).


Porównanie chromatogramów uzyskanych metodą chromatografii cienkowarstwowej (A) i kolumnowej 

(B) [1]. Kolumna: Micro-Pak SI-10, 2,1x15 cm. Faza ruchoma: 10% chlorku metylu w heksanie. 

Szybkość przepływu: 132 ml/h.


Mechanizm retencji, podział na chromatografię: 

- adsorpcyjną (w tym, z hydrofobową fazą stacjonarną), 

- podziałową, 

- jonowymienną (jonitową, jonową), 

- wykluczania sterycznego (filtracyjną, sitową, ekskluzywną, permeacyjną, 

żelową), 

- jonowo-wykluczającą, 

- jonowo-asocjacyjną (par jonowych), 

- z zastosowaniem związków kompleksowych, chelatowych, inkluzyjnych, 

- powinowactwa, 

- micelarna, 

- immunochromatografia, 

- elektrochromatografia, 

- wymiany ligandu (m.in. sorpcja na związanych metalach), 

- ekstrakcyjna (podziałowa faz odwróconych), 

- solubilizacyjna.

Podział Kolumnowej Chromatografii Cieczowej 

1. Stosowane ciśnienie: 

- niskociśnieniowa (z grawitacyjnym przepływem cieczy lub nadciśnieniem do 

ok. 2 bar), 

- średniociśnieniowa (ok. 25 – 150 bar), 

- wysokociśnieniowa (wysokosprawna 400 – 1000 bar). 

2. Parametr kontrolujący przepływ fazy ruchomej: 

- ciśnienie, 

- szybkość przepływu. 

3. Stan skupienia fazy stacjonarnej, chromatografia w układzie: 

- ciecz – ciało stałe, 

- ciecz – ciecz, 

- ciecz – żel. 

- gaz – ciało stałe (G – S), 

- gaz – ciecz (G – L), 

- ciecz w stanie nadkrytycznym – ciało stałe (SF – S), 

- ciecz w stanie nadkrytycznym – ciecz (SF – L).


4. Średnica kolumn: 

- kapilarna (otwartokolumnowa i pakowana, dc 500 mm), 

- mikrokolumnowa (dc = 0.5 1 mm), 

- minikolumnowa (dc = 1 4 mm), 

- klasyczna (dc = 4 6 mm), 

- semipreparatywna (kilka do kilkunastu milimetrów), 

- preparatywna (o średnicy od kilku do kilkudziesięciu 

centymetrów), 

- przemysłowa (o średnicy powyżej metra).


AC 

IEC 

CEC 

HPLC

Podział Kolumnowej Chromatografii Cieczowej




c1, c2 

0,6 

DWIE SUBSTANCJE 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.01 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

46

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.05 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

47

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.10 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

48

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.15 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

49

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.20 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

50

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.25 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

51

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.30 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

52

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.35 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

53

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.40 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

54

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.45 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

55

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.50 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

56

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.55 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

57

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.60 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

58

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.65 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

59

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.70 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

60

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.75 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

61

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.80 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

62

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.85 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

63

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.90 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

64

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 0.95 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

65

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.00 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

66

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.05 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

67

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.10 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

68

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.15 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

69

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.20 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

70

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.25 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

71

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.30 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

72

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.35 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

73

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.40 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

74

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.45 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

75

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.50 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

76

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.55 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

77

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.60 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

78

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.65 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

79

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.70 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

80

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.75 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

81

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.80 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

82

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.85 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

83

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.90 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

84

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 1.95 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

85

c1, c2 

0,6 


0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

Pik 1 

Pik 2 

c1 inj = 0.2; k1 = 2.3 

c2 inj = 0.5; k2 = 5.0 

V inj = 2.00 

0,1 

0 

V/V0 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 

86

Chromatografia gazowa 

Chromatografia cieczowo-gazowa (kolumnowa technika chromatografii 

podziałowej stosowana do rozdziału i analizy gazów, niskowrzących cieczy, lub 

łatwo lotnych substancji stałych): 

- faza ruchoma – gaz, stacjonarna – wysokowrząca ciecz (olej, smar, glikol 

polietylenowy) osadzona na obojętnym nośniku (np. długa kapilara szklana) 

- GC wykonuje się zwykle w wysokich temperaturach, 

- detekcja – katarometr (zmiana przewodnictwa w obecności związku 

opuszczającego kolumnę), spektrometr mas (GC MS) 

- związki opuszczają kolumnę przy określonych, dobrze odtwarzalnych czasach 

retencji 

- GC to dobre narzędzie analityczne, można też używać GC do celów 

preparatywnych 

- GC pozwala na oznaczanie ilościowe (pomiar powierzchni pod pikiem) 

- zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów 

- przeprowadzenie w lotne pochodne umożliwia analizę związków nielotnych, np. 

kwasów karboksylowych jako estrów trimetylosililowych, aminokwasów jako 

pochodnych dabsylowych (jako amidy kwasu 4-(dimetyloamino)-azobenzeno-4’- 

sulfonowego)

Chromatografia gazowa

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy - dozownik

Chromatograf gazowy - dozownik

Chromatograf gazowy - kolumny

Chromatograf gazowy - temperatura

GC – detektor przewodnictwa ciepła

GC – detektor płomieniowo-jonizacyjny



GC – detektor wychwytu elektronów

GC – OES

Chromatografia bibułowa 

Chromatografia cieczowo-cieczowa (cienkowarstwowa technika 

chromatografii podziałowej stosowana głównie do rozdziału aminokwasów, 

peptydów, sacharydów, nukleotydów): 

- faza ruchoma – homogenna mieszanina rozpuszczalników zawierająca 

wodę, stacjonarna – woda zaadsorbowana na bibule 

- wykonanie techniką wstępującą (rozpuszczalnik migruje od dolnego 

końca bibuły zanurzonego w eluencie) lub zstępujacą (spływową; 

rozpuszczalnik migruje od górnego końca bibuły zanurzonego w eluencie) 

- detekcja – próba ninhydrynowa na aminokwasy i peptydy, UV na 

nukleotydy 

- Rf nie są dobrze odtwarzalne

Chromatografia cienkowarstwowa 

Faza ruchoma – ciecz, faza stacjonarna - stałe złoże lub ciecz zaadsorbowana na 

złożu 

nałożonym na płytkę 

- technika analityczna, niekiedy preparatywna 

- stosowana głównie do sprawdzania czystości związków, kontroli reakcji, analizy 

wycieków 

z kolumny chromatograficznej 

- zalety: krótki czas rozwijania, proste metody kontroli, zużycie małych ilości 

związki (ng) 

Rf = (odległość od startu do centrum plamki)/(odległość od startu do czoła 

rozpuszczalnika) 

Rf nie jest dobrze odtwarzalnym parametrem 

Dobór układu rozwijającego: tak, aby była wyraźna różnica pomiędzy Rf 

analizowanych związków, i aby związki nie zostawały na miejscu nałożenia 

plamki, oraz aby nie migrowały z czołem rozpuszczalnika

Chromatografia cienkowarstwowa 

1. Przygotowanie płytki: warstwa sorbentu 0.2mm grubości, nanoszenie na odtłuszczoną 

płytkę, suszenie 

2. Nanoszenie próbki: odparowanie rozpuszczalnika, możliwie mała plamka 

3. Rozwijanie płytki w szczelnej kamerze chromatograficznej, stosuje się paski bibuły 

celem szybszego nasycenia komory parami rozpuszczalnika 

4. Wywołanie chromatogramu: UV, pary jodu (układy nienasycone), ogrzewanie po 

zwilżeniu stężonym H2SO4 lub 2% KMnO4, ninhydryna (aminy i aminokwasy) 

Techniki: 

- kilkukrotne rozwijanie w przypadku niskich Rf 

- chromatografia dwukierunkowa (rozwijanie chromatogramu w drugim kierunku w 

innym układzie rozpuszczalników) w przypadku podobnych Rf 

- klinowa (początkowa część chromatogramu zawęża się ku dołowi) celem zwężenia plamki 

- krążkowa (nakraplanie eluentu na środek plamki) celem określenia przydatności układu 

do rozdziału)

Cieczowa chromatografia cienkowarstwowa




Cieczowa chromatografia cienkowarstwowa 

0% 20% 50% 70% 100% 

Stężenie izopropanolu





Plaque : Silica Gel Merck 60 (20x10 cm) 

Plaque de Silica Gel Merck 60 

(20x10 cm) 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

Extraction : DMF (diméthylformamide) 

Elution 1: Chlorobenzène, Acétate d’éthyle (5:1) 

Elution 2: Acétate d’éthyle, Ethanol, Eau (70:35:30) 

Extraction: DMF (diméthylformamide) 

Elution: Acétate d’éthyle, Isopropanol, Acide 

acétique, Eau (30:15:1:10)




1 - płytka 

przykrywająca 

zbiornik eluentu, 2 - 

zbiorniki eluentu, 3 - 

płytka 

chromatograficzna, 4 - 

teflonowy korpus 

komory, 5 - płytka 

przykrywająca 

komorę, 6 - płytki 

przykrywające 

korytka, 7 - korytka, 8 

- eluent (kolor 

niebieski), 9 - 

dozownik eluentu






Chromatografia kolumnowa 

Faza ruchoma – ciecz, faza stacjonarna – złoże stałe lub ciecz zaadsorbowana na złożu 

wypełniającym kolumnę 

Kolumnę wypełnia się zawiesiną złoża (wysokość złoża powinna być co najmniej 10 razy większa od 

średnicy kolumny; minimum 25 razy więcej złoża od próbki w chromatografii adsorpcyjnej, 100 

razy w chromatografii podziałowej), nanosi próbkę od góry i eluuje układem rozwijającym zbierając 

frakcje; związki we frakcjach wykrywa się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej 

Dobieranie eluentu dla chromatografii adsorpcyjnej: próby za pomocą chromatografii 

cienkowarstwowej – różnica Rf rozdzielanych związków powinna być większa niż 0.3, a jedna z 

substancji nie powinna mieć Rf wyższego od 0.2 

Typowe błędy podczas rozdziału: 

- zbyt szeroka kolumna – zbyt duża dyfuzja, nierówny przepływ 

- zbyt wąska kolumna lub za małe ziarna lub zbyt mało polarny eluent – za wolny przepływ, dyfuzja 

- za mało nośnika lub za grube ziarna – zły rozdział 

- mokry eluent, kolumna, nośnik – utrata aktywności nośnika, zły rozdział 

- zbyt mało aktywny nośnik – zły rozdział 

- złe upakowanie kolumny lub nierówne nałożenie próbki – nierówny rozdział 

- zbyt polarny eluent – brak rozdziału 

- zbyt szybki przepływ – brak rozdziału, nie ustalają się równowagi międzyfazowe 

- zbieranie zbyt dużych frakcji – złe rozdzielenie substancji 

Faza ruchoma – ciecz, faza stacjonarna – złoże stałe lub ciecz zaadsorbowana na złożu 

wypełniającym kolumnę

Kolumnowy chromatograf cieczowy

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga 

1000 1000 

900 100 

100 900 

0 900 0 100 

100 0 900 0 

90 810 90 10 

10 90 810 90 

0 90 810 0 90 10 

10 90 0 810 90 0 

9 162 729 81 18 1 

1 18 81 729 162 9 

0 9 162 729 0 81 18 1 

1 18 81 0 729 162 9 0 

0.9 24.3 218.7 656.1 72.9 24.3 2.7 0.1 

0.1 2.7 24.3 72.9 656.1 218.7 24.3 0.9 

0 0.9 24.3 218.7 656.1 0 72.9 24.3 2.7 0.1 

0.1 2.7 24.3 72.9 0 656.1 218.7 24.3 0.9 0 

0.09 3.24 43.74 262.44 590.49 65.61 28.16 4.86 0.36 0.01 

0.01 0.36 4.86 28.16 65.61 590.49 262.44 43.74 3.24 0.09

Model Craiga 

1000 

900 

800 

700 

600 

500 

400 

300 

Serie6 

200 

100 

Serie5 

Serie4 

Serie3 

0 

1 

2 

3 

4 

5 

Serie2 

Serie1

Model Craiga 

1000 

900 

800 

700 

600 

500 

400 

300 

200 

Serie6 

Serie5 

Serie4 

100 

Serie3 

0 

1 

2 

3 

4 

5 

Serie2 

Serie1

Model Craiga 

600 

500 

400 

300 

200 

100 

0 

1 

2 

3 

4 

5 

Serie1 

Serie4

Model Craiga 

p + q = 1 

(p+q) r = 1 

s 2 (x - ) 2 = - 2 = rpq

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

Model Craiga

The Craig model 

In the Craig method, column is divided into N cells. 

Assumptions: 

1. Ions R - and acid molecules HR do not adsorb on the resin; 

2. Concentrations of the acid in mobile phase and in the resin pores are equal 

to one another. 

Mass balance for the i-th cell:


The Craig model can be expressed in an equivalent form: 

and coupled with the equilibrium conditions for the ion and the acid 

molecules in mobile phase: 

and in the resin:


To solve the ED or the Craig model, porosities ε have to be calculated: 

on the basis of the measured dead times t 0,IEC and t 0,ADS.. 

The dead time t 0,IEC was assumed as equal to the retention time of nitric 

acid, C inlet =0.5mM, and the time t 0,ADS was assumed as equal to the retention 

time of formic acid in water with the 30mM sulphuric acid. 

e = 0.242 

t = 0.679 

Retention time of formic acid vs. the sulphuric acid concentration.

Basic definitions 

V m 

: the volume of mobile phase 

V S 

: the volume of the liquid inside the resin in the column 

V a 

: the volume of the adsorbent 

V k 

: the geometrical column volume 

ε e 

= V m 

/V k 

external porosity; ε p 

= V S 

/V a 

particle porosity 

ε t 

= (V m 

+V S 

)/V k 

= ε e 

+ (1 − ε e 

)ε p 

total porosity 

COLUMN 

RESIN

The Craig model

The Craig model

IEC of fatty acids, mobile phase: water

IEC of fatty acids, mobile phase: 1 mM H 2 SO 4

Krzywa rozmieszczenia próbki w kolumnie 

po „przemyciu” jej 100 krokami

Profil szybkości strumienia w rurze dla 

laminarnego przepływu lepkiego

Wypadkowa krzywa rozmycia próbki 

zajmującej początkowo trzy celki

Rozdział dwu substancji na kolumnie 

chromatograficznej w zależności od przebytej drogi

Rozkład stężenia próbki w fazie ruchomej i stacjonarnej 

w stanie równowagi i przy przepływie cieczy

Equilibrium in chromatography

Equilibrium in chromatography

Laboratoryjny zestaw do destylacji 

frakcjonowanej

Teoria półki chromatograficznej 

- podział próbki między fazy jest natychmiastowy. W praktyce 

oznacza to, że powinien on być dużo szybszy od przepływu tak, 

aby móc pominąć wpływ efektów kinetycznych, 

- pomija się dyfuzję na półce i między półkami, 

- zmiany stężenia próbki wzdłuż kolumny następują skokowo, 

- zakłada się liniową izotermę podziału, 

- brak wpływu innych składników próbki na współczynnik 

podziału, 

- pomija się efekty temperaturowe procesu, 

- w teorii nie uwzględnia się wpływu wielkości cząsteczek złoża na 

proces. 

N = 2ph2tR2/S, 

s = (HL) 1/2 , 

L = HN.

Równanie bilansu masy 

Przepływ 

Dyfuzja 

r i = M i c i , 

c z-dz udt 

c z udt 

DA(dc z-dz /dz)dt 

DA(dc z /dz)dt

Równanie bilansu masy


Dm konw. = dzA(c t+dt - c t ) konw. 

Dm konw . = Jdt(c z-dz - c z ) konw. 

dzA(c t+dt - c t ) = Jdt(c z-dz - c z )


c z-dz = c z - (c/z) z dz 

c t+dt = c t + (c/t) t dt. 

(c/t) konw. = -J/A(c/z) = -u(c/z) 

dm = - DA(c/z)dt


(c/t) dyf. = D( 2 c/z 2 ) 

(c/t) przen. masy = -1/F(s/t)

Równanie bilansu masy


s = M(s/c), 

c(z,v) = f{v - z[a + M(s/c)]}.

Opis empiryczny 

H = A + B/u +Cu 

H = C s u + C m u + (1/A + 1/C m u) -1 

h = an 1/3 +b/n + cn, h = H/d p , n = ud p /D 

W równaniu van Deemtera na rozmycie próbki mają wpływ trzy główne efekty: 

A - hydrodynamiczny - dyfuzja wirowa (niezależna od szybkości przepływu). Ten sam 

składnik próbki przebywa różną drogę na kolumnie. Spowodowane jest to tym, że czasami 

cząsteczki próbki mogą przejść na wylot przez ziarenka złoża, w innym przypadku muszą je 

omijać. Różnice te zwiększają się gdy ziarna złoża różnią się znacznie wymiarami, są 

zaglomerowane lub gdy w kolumnie występują puste przestrzenie. 

B - dyfuzyjny - dyfuzja molekularna zmniejszająca się ze wzrostem szybkości przepływu 

(większa szybkość oznacza krótszy czas przebywania próbki na półce). Dyfuzja nie wpływa na 

retencję analizowanego związku. Wpływa jednak na jego szerokość. 

C - przenoszenia masy - rośnie on ze wzrostem szybkości przepływu gdyż ustalanie się 

równowagi nie nadąża za przepływem. Jego miarą jest rozsunięcie maksimów pików w obu 

fazach.


Zależność wysokości równoważnej półce teoretycznej od szybkości 

przepływu fazy ruchomej dla chromatografii gazowej (a) i cieczowej (b).


Schemat rozmycia próbki wywołanego dyfuzją wirową


Rozmycie próbki wywołane dyfuzją molekularną


Schemat rozmycia próbki 

wywołanego przenoszeniem 

masy: a - fazy ruchomej, b - 

w unieruchomionej fazie 

ruchomej i c - w fazie 

stacjonarnej


Eksperymentalnie uzyskana zależność wysokości równoważnej półce teoretycznej, 

H, od objętościowej szybkości przepływu fazy ruchomej, J. Kolumna: LiChrosorb 

RP-18, 5mm, 1 x 250 mm.


Logarytmiczna zależność zredukowanej wysokości półki, h, od zredukowanej 

liniowej szybkości przepływu, n


A: 

Dyfuzja wirowa: 

H DW = 2ld p 

gdzie l - stała zależna od charakteru wypełnienia, zwykle przyjmuje się l = 0,5. 

Konwekcja poprzeczna (równanie Giddingsa): 

.


B: 

Dyfuzja molekularna w fazie ruchomej (równanie Einsteina): 

H DM = 2Dt m /L = 2gD


C: 

Przenoszenie masy w fazie stacjonarnej: 

H PM = 2ut d k/(1 + k), 

t d = d 2 /2D s , 

H PM = d 2 uk/D s (1 + k) 2 

Dyfuzja radialna przez warstwy laminarne (równanie Giddingsa): 

Dyfuzja w stojącej fazie ruchomej (równanie Giddingsa):


H = H DW + H KP + H DM + H PM +H DR + H SR 

A B C

Opis empiryczny

Szybkość przepływu FR




Wpływ szybkości przepływu fazy ruchomej, u, na wysokość półki 

teoretycznej, H, czas analizy, t R , i spadek ciśnienia na kolumnie

Izotermy podziału 

Różne kształty izoterm adsorpcji/podziału i odpowiadające im kształty pików 

chromatograficznych

Różna szybkość propagacji składników próbki

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji


D Y F U Z J A 

Zależność wysokości równoważnej półce teoretycznej od szybkości 

przepływu fazy ruchomej dla chromatografii i cieczowej

B: 


D Y F U Z J A 

Dyfuzja molekularna w fazie ruchomej (równanie Einsteina): 

H DM = 2Dt m /L = 2gD 

C: 

Przenoszenie masy w fazie stacjonarnej: 

H PM = d 2 uk/D s (1 + k) 2 

Dyfuzja radialna przez warstwy laminarne (równanie Giddingsa): 

Dyfuzja w stojącej fazie ruchomej (równanie Giddingsa):

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji 

Wpływ pojemności układu na jego efektywną sprawność na jednostkę czasu

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Parametry retencji

Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) 

Wpływ średnicy cząsteczki na czas analizy (h i v – wielkości zredukowane)

Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)




Detekcja

Detekcja

Detekcja

Detekcja

Detekcja

Pozakolumnowe rozmycie próbki

Pozakolumnowe rozmycie próbki 

d c [mm] 

V M [ml] 

J 

[ml/min.] 

k = 1 N = 15 000 

t R [k = 1] 

W tang [s] dla ExCol= 

0 ml 15 ml 

4,6 1,5 2,00 1,5 2,9 3,0 14665 1 % 

2,1 0,31 0,42 1,5 2,9 3,6 9723 19 % 

1,0 0,071 0.095 1,5 2,9 10 1298 71 % 

N 

Strata 

R S

Pozakolumnowe rozmycie próbki 

d c [mm] 

k = 2 k = 5 k = 10 

N Strata R S N Strata R S N Strata R S 

4,6 14844 1 % 14961 0 % 14988 0 % 

2,1 12085 10 % 14147 3 % 14736 1 % 

1,0 2636 58 % 6904 32 % 11120 14 %






Detekcja



Wpływ szybkości przepływu fazy ruchomej, u, na wysokość półki 

teoretycznej, H, czas analizy, t R , i spadek ciśnienia na kolumnie

Opis empiryczny

Parametry retencji

Parametry retencji



Kolumnowy chromatograf cieczowy 

Pierwszy polski ciśnieniowy chromatograf cieczowy zbudowany w latach 

1962-1964


Pompa membranowa


Bezpompowy chromatograf cieczowy SP-20


Wysokosprawny chromatograf cieczowy T-302


Mikrokolumnowy chromatograf cieczowy T-310



9060 Polychrom 

(Diode Array) Detector 

Computer 

Workstation 

HPLC Solvent 

Reservoirs 

9010 Solvent 

Delivery System 

9050 Variable 

UV/Vis Detector 

Rheodyne 

Injector 

HPLC 

Column

%A %B %C Flow Rate Pressure 

{H 2 O} {MeOH} (mL/min) (atmos.) 

to column 

load 

Ready 

inject 

Delivery System 

to injector 

Rheodyne 

Injector 

through pump 

through 

pulse 

dampener 

A 

B 

C 

Column 

Ternary Pump 

from solvent 

reservoir 

to 

detector

ABS. 

ABS. 

Ready 

UV Spectrum 

UV Spectrum 

{shows full UV abs.} 

Reset 

Chromatogram 

UV max 

UV max 

Wavelength 

R t 

R t 

Time 

Chromatogram 

{shows peaks, R t }




Chromatograf jonowy

Chromatograf jonowy

Chromatograf jonowy

Chromatograf jonowy - elektrosupresor

Odgazowanie próbki

Zbiornik eluentu

Przygotowanie fazy ruchomej

Pompa nurnikowa

Pompa nurnikowa

Pompa nurnikowa

Pompa nurnikowa

Pompa nurnikowa

Pompa nurnikowa

Tłumiki ciśnienia

Dozownik

Dozownik

Dozownik

Dozownik

Kolumna chromatograficzna

Prekolumny





Detektor drutowy

Detektor dyskowy

Rozczepienie światła

Widmo fal elektromagnetycznych

Widmo fal elektromagnetycznych

Widma 

ciągłe 

liniowe emisyjne 

liniowe absorpcyjne 

widmo emisyjne azotu

Adsorpcja 

•s s* and s p* transitions: high-energy, accessible in vacuum UV (l max 

Prawo Lamberta-Beera

Źródła promieniowania ultrafioletowego 

Długość fali 

Energia kwantu 

0, 1100mm 

51000eV 

Jedna z metod wytwarzania promieniowania 

ultrafioletowego polega na rozpadzie wzbudzonej 

molekuły deuteru na 2 atomy deuteru w czego 

reakcji powstaje kwant promieniowania UV z 

zakresu 160 – 375 nm 

Promieniowanie UV emitowane jest również w lampach halogenowych, w których 

elektrony emitowane z katody zderzają się z elektronami atomów gazu tj. pary rtęci, argon 

lub krypton, wzbudzając je. Stan o wyższej energii jest niestabilny i elektron powraca do 

na niższą orbitę emitując kwant promieniowania.

Widmo emisyjne niskociśnieniowej lampy rtęciowej

Widmo światła słonecznego

Źródła promieniowania widzialnego 

Długość fali 

ok. 

100 m 

Energia kwantu 

15eV 

Jest wiele sposobów emisji promieniowania 

widzialnego. 

Jednym z nich jest fluorescencja, wykorzystana w 

lampach fluorescencyjnych które działają jak lampy 

ultrafioletowe tylko ich powierzchnia pokryta jest 

luminoforem, który po uderzeniu weń fotonu UV 

przekształca go na promieniowanie 

w zakresie widzialnym. 

Źródło: Precision Graphics

Źródła promieniowania widzialnego 

Najpopularniejszym sposobem emisji światłą 

widzialnego są lampy żarowe, w których podgrzany 

do wysokiej temperatury żarnik (najczęściej 

wolframowy ze względu na wysoką temperaturę 

topnienia) emituje promieniowanie cieplne. 

Przeważnie jest on umieszczony w bańce 

wypełnionej argonem bądź azotem, co ma zmniejszyć 

prędkość parowanie wolframu. 

Źródło: Precision Graphics

Widmo 100 W lampy wolframowej

Widmo lampy deuterowej

Widmo fotodiody

Fotodiody

Detektor UV-Vis

Detektor UV-Vis

Detektor UV-Vis

Detektor UV-Vis

Chromofory

Chromofory

Detektor DAD

Detektor DAD

Chromatogram chlorofili z igieł sosny

Detektor fluorescencyjny




Detektor spektrofluorescencyjny

HPLC chromatogram 16-WWA z listy US-EPA 

1 – nieanalizowane, niskocząs-teczkowe WWA, 2 - B[a]A, 3 - Ch, 4 - B[b]F, 5 - B[k]F, 6 - B[a]P, 7 - IP, 8 - dBA, 9 - BP 

and 10 - B[b]Ch. 

Warunki chromatograficzne: Hypersil Green PAH column with guard column, 5 mm, 250x3 mm I.D.; faza ruchoma: - 

gradient aceto-nirylu i wody; detector fluore-scencyjny; temperatura – 25 ºC, szybkość przepływu – 0.8 

ml/min., objętość próbki – 20 ml.

Trójwymiarowe stop-flow (sygnał vs. długość fal 

wzbudzenia i emisji) widmo fluorescencyjne B[a]P

Porównanie długości fali wzbudzenia (emisji) widma 

standardu B[a]P z widmem piku chromatograficznego 

oleju rzepakowego o tym samym czasie retencji

Współczynnik dopasowania

Detektor RI

Detektor RI

Detektor RI

Detektor RI

Detektor elektrochemiczny







Detektor elektrochemiczny 

Hydrodynamic voltammogram for mobile phase alone (A) and solute in mobile phase 

(B). The waveform for the solute is characterized by the half-wave potential E1/2.


E zakres pracy ... 

Ograniczony przez reacje fazy ruchomej


• wysoki E: max. sygnał, wiekszy szum 

• niski E: mniejsza interferencja 

• najlepszy stosunek S/N - kompromis


Niezbędne przy analizie śladowej: 

pompa bez pulsacji 

system chromatofgraficzny niemetalowy 

Elektrostatycznie obojętny (klatka Faraday’a) 

EC czysta faza ruchoma, odgazowany eluent 

w trybie redukcyjnym: usunięty O2


pomiar prądu przy ustalonych trzech potecjałach (E1, E2, E3) 

E1: krok pracy 

E2: krok utleniania 

E3: krok kondycjonowania 

regenerowana elektroda pracująca


x: analit 

y: pik matrycy 

niższy E mniejsze interferencje

Detektor konduktometryczny





Constant current conductometric detector

Constant current conductometric detector

Detektor MS

Detektor MS

Spektrometr mas

LC/MS

Spektrometr mas ESI

Spektrometr mas ESI

Spektrometr mas ESI

Spektrometr mas APCI

Spektrometr mas PIS (photo ion spray)

Spektrometr mas FAB (strumień szybkich atomów)

Spektrometr mas FAB (strumień szybkich atomów)

Spektrometr mas

Spektrometr mas – pułapka jonowa

Spektrometr mas – pułapka jonowa

Spektrometr mas - analizator kwadrupolowy

Spektrometr mas

Spektrometr mas

Spektrometr mas


Potentiometric detector

Potentiometric detector

Electrokinetic detector




Detektor rozpraszania światła

Detektor rozpraszania światła

Detekcja pośrednia

Detekcja pośrednia

Changes in the Concentration of the Background Electrolyte 

Indirect detection is based on measurement of changes of the concentration of the background 

(probe) electrolyte, the electric charge of which should be the same as that of the solute. This means that for 

acid analysis the background electrolyte should also be acid – a dilute solution of a strong, completely 

dissociated acid is usually used. Optimum conditions for detection are not always optimum for 

separation, however. Changes in the concentration of the background electrolyte can be calculated from a 

knowledge of the dissociation constant and the mass-conservation equation. For dilute solutes we can assume 

that the concentration of hydrogen ions is constant throughout the column, i.e. [H + ] = const. Under these 

conditions, outside the region of the solute (chromatographic peak) the electrical neutrality condition can be 

expressed in the form: 

[H + ] = [B – ] (1) 

Injection of the test acidic solute, HR, onto the chromatographic column reduces the concentration 

of the dissociated form of background electrolyte. In accordance with the electrical neutrality condition at the 

peak maximum in the mobile phase: 

[H + ] = [B – ] max + [R – ] (2) 

where B – and R – denote the dissociated forms of the background electrolyte and solute, respectively. 

Eqs (1) and (2) can be easily transformed to: 

[R – ] = [B – ] – [B – ] max (3)

Indirect Detection in IEC 

Conductometric Detection 

G = kA/l. 

l m = k/c i . 

l m = l m0 – const. c I 

1/2 

. 

assumption: small concentration of the solute. 

G = (n + c + z + l + + n - c - z - l - )A/l. 

G b = (l B- [B - ] + l H+ [H + ])A/l 

G max = (l B- [B - ] max + l H+ [H + ] + l R- [R - ])A/l 

DG = (l B- [B - ] max + l R- [R - ] - l B- [B - ])A/l =(l R- [R - ] - l B- [R - ])A/l 

[B - ] max – [B - ] = -[R - ] max 

DG = (l R- - l B- ) [R - ]A/l

Conductometric Detection 

The conductivity, G, of the dilute electrolyte is a function of its limiting ionic conductivities, λ i 

, the 

stoichiometric coefficients, ν i 

, the valence, z i 

, the surface area of the electrodes, A, and the distance between 

them, l: 

G = (ν + 

c + 

z + 

λ + 

+ ν – 

c – 

z – 

λ – 

)A/l (4) 

For a monovalent–monovalent acid eq. (4) can be rewritten: 

G b 

= (λ B– 

[B – ] + λ H+ 

[H + ])A/l (5) 

At the peak maximum this conductivity depends also on the solute concentration: 

G max = (λ B– 

[B – ] max + λ H+ 

[H + ] + λ R– 

[R – ])A/l (6) 

The chromatographic peak height can be calculated as the difference between the conductivities obtained by 

use of eqs (5) and (6): 

ΔG = (λ B– 

[B – ] max + λ R– 

[R – ] – λ B– 

[B – ])A/l = (λ R– 

[R – ] – λ B– 

[R – ])A/l (7) 

From eqs (3) and (7) we finally obtain: 

ΔG = (λ R– 

– λ B– 

)[R – ]A/l (8) 

From eq. (8) it is apparent that the height of the chromatographic peak should be directly 

proportional to the concentration of dissociated form of the analysed acid. It should also be possible to record 

results from both direct and indirect conductometric detection on one chromatogram. Peak direction depends 

on the relative limiting ionic conductivity of the solute compared with that of the background electrolyte.


Photometric Detection 

. A b = l B- [B - ] + l HB [HB] 

. A max = l B- [B - ] max + l HB [HB] max 

. DA = l B- [B - ] max + l HB [HB] max - l B- [B - ] - l HB [HB] 

. K b = [B - ][H + ]/[HB] = [B - ] max [H + ]/[HB] max 

. DA = ([B - ] max - [B - ]) l B- + ([B - ] max - [B - ]) l HB [H + ]/K b 

. DA = ( l B- + l HB [H + ]/K b )([B - ] max - [B - ]) 

. DA = -( l B- + l HB [H + ]/K b )[R - ] 

. assumption: strong acid used as buffer or [HB] max = [HB] 

. DA = - l B- [R - ]

Photometric Detection 

According to the Lambert–Beer law, the background absorbance, A b 

, of the acid, HB, used 

as buffer can be expressed as: 

A b 

= lε B– 

[B – ] + lε HB 

[HB] (9) 

where l denotes the length of detector cell and ε B– 

and ε HB 

are, respectively, the molar absorption 

coefficients of the dissociated and undissociated forms of acid. Absorption at the peak 

maximum, on the basis of eqs (1) and (9) is described by: 

A max = lε B– 

[B – ] max + lε HB 

[HB] max (10) 

The height of the chromatographic peak can be obtained from eqs (9) and (10): 

ΔA = ε B– 

[B – ] max + lε HB 

[HB] max – lε B– 

[B – ] – lε HB 

[HB] (11) 

By combining eq. (11) with eq. (3), using the definition of the dissociation constant, and assuming 

that the concentration of the undissociated form of the solute acid is constant throughout the 

chromatographic peak 

([HB] max = [HB]), we obtain: 

ΔA = –lε B– 

[R – ] (12)


Estimation of [R - ] and [H + ] 

K a = [R - ][H + ]/[HR] 

c i V i = ([R - ] + [HR])V P 

c i V i = ([R - ] +[R - ][H + ]/K a )V P 

[R - ] = c i V i /V P (1 + [H + ]/K a ) = c i V i K a /V P (K a + [H + ]) 

c b = [B - ] + [HB] 

[B - ] = [H + ] 

K b = [H + ] 2 /[HB] 

c b = [H + ] + [HB] = [H + ] + [H + ] 2 / K b 

[H + ] 2 + K b [H + ] – K b c b = 0

Estimation of [R – ] 

The mass conservation equation for the solute acid can be given as: 

c i 

V i 

= ([R – ] + [HR])V P 

(13) 

where V P 

(= c i 

V i 

/c max ) denotes the volume of the peak maximum. From eq. (13) and the definition of the dissociation 

constant we obtain: 

[R – ] = c i 

V i 

/V P 

(1 + [H + ]/K a 

) = c i 

V i 

K a 

/V P 

(K a 

+ [H + ]) (14) 

After equilibration of the column the mass balance of the background electrolyte can be presented in the form: 

c b 

= [B – ] + [HB] (15) 

Because the concentration of the solute is usually small, and because the buffer suppresses its dissociation, it 

can be assumed that the concen-tration of hydrogen ions is constant throughout the column. Outside the chromatographic 

peak the concentration of the dissociated form of the background electrolyte is equal to the concentration of hydrogen 

ions, as described by eq. (1). After resolving the quadratic equation obtained from eqs (13)–(15) we finally obtain: 

(16) 

where the peak volume is described by: 

V P 

= V R 

(2π/N) 1/2 (17) 

Eqs (8), (12) and (17) can be used to predict results from indirect conductometric and photometric detection. 

Chromatographic peak height should be directly proportional to the amount of the solute acid and should increase 

asymptotically with increasing dissociation constant. The largest peaks should be obtained for completely dissociated acids 

(anions). Peak height, on the other hand, decreases with increasing buffered acid disso-ciation constant and concentration.


Final solution 

[ R 

 

] 

= 

V 

P 

(2 

cV K 

i 

2 

i 

a 

K K 4K 

c K ) 

a b b b b 

where V P = V R (2p/N) 1/2 

c b 0 [R - ] = c i V i /V P 

DG = (l R- - l B- )Ac i V i /V P l 

DA = - l B- c i V i /V P


Volatile Fatty Acids

Indirect detection 

in IEC 

Ion-exclusion chromatograms obtained 

from (1) oxalic, (2) malonic, (3) 

formic, and (7) acetic acids with 

conductometric (A) and UV-300 nm (B) 

detection. The mobile phase was 1 mm 

phthalic acid, the flow rate 0.5 mL 

min –1 , and the volume injected 20 μL.

Indirect detection in IEC 

Phthalic acid (mM)

Indirect detection in IEC

Indirect detection in IEC

Obróbka danych

Obróbka danych

Obróbka danych

Obróbka danych

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Niepewność

Chromatografia adsorbcyjna 

O rozdziale decyduje konkurencja substancji i rozpuszczalnika z fazy ruchomej (ciecz lub – 

rzadko, dla rozdziału substancji lotnych – gaz) o wiązanie się do adsorbenta z fazy stacjonarnej 

(ciało stałe) 

Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, HPLC 

Adsorbent powinien: 

- mieć jak najsilniej rozwiniętą powierzchnię 

- składać się z odpowiednio wielkich ziaren (im mniejsze, tym szybciej ustala się równowaga, ale tym 

wolniejszy przepływ rozpuszczalnika) o jednorodnej wielkości 

- być bierny chemicznie wobec rozpuszczalnika i substancji rozdzielanych 

- być selektywny 

Rodzaje adsorbentów: 

- polarne, dobrze wiążące związki polarne, aktywność maleje z zawilgoceniem; głównie tlenki i sole 

- niepolarne, niezwilżalne, dobrze wiążące związki niepolarne; np. węgiel aktywny 

Szereg aktywności adsorbentów pod względem wiązania związków organicznych: 

celuloza < skrobia < sacharoza < CaSO4 < silikażel < MgO < Al2O3 < węgiel aktywny 

Szereg eluotropowy rozpuszczalników: 

heksan < CCl4 < benzen < CHCl3 < (C2H5)2O < CH3COOC2H5 < aceton < C2H5OH < CH3OH < 

H2O < CH3COOH < pirydyna 

Na ogół stosuje się mieszaniny rozpuszczalników; większa polarność substancji rozwijanej 

wymaga większej polarności stosowanego układu na adsorbencie polarnym. Na adsorbencie 

niepolarnym szereg eluotropowy należy stosować w odwrotnej kolejności, tzn. im silniejsze wiązanie 

substancji ze złożem, tym mniej polarny układ rozwijający należy stosować

Chromatografia podziałowa 

O rozdziale decyduje podział substancji pomiędzy dwie niemieszające się ciecze 2 

warianty: chrom. cieczowo-gazowa (gazowa, GC), lub cieczowo-cieczowa (np. 

bibułowa) 

Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, GC, HPLC 

Chromatografia cieczowo-cieczowa: 

- układ z normalnymi fazami: faza ruchoma – ciecz organiczna, faza stacjonarna – 

ciecz osadzona na nośniku stałym (np. woda na celulozie); metoda dobra do 

rozdziału substancji polarnych, np,. aminokwasy, peptydy, sacharydy, nukleotydy - 

układ z odwróconymi fazami: faza ruchoma – woda, faza stacjonarna – 

rozpuszczalnik organiczny zaadsorbowany na nośniku; metoda stosowana w 

rozdziale związków niepolarnych (podobnie, jak chromatografia adsorpcyjna) 

Nośnik powinien: 

- być obojętny wobec rozpuszczalników i rozdzielanych substancji 

- nie wykazywać własności adsorpcyjnych i jonowymiennych 

- być zwilżany fazą ruchomą 

- składać się z jednorodnych ziaren o odpowiedniej wielkości (im mniejsze, tym 

lepszy rozdział, ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika) Najczęstsze złoża: 

silikażel, celuloza, skrobia, ziemia okrzemkowa, acetyloceluloza

Rozpuszczalniki 

Maksimum lepkości fazy ruchomej: 

1. 40 – 50 % zawartość 

metanolu w wodzie; 

2. 10 – 30 % zawartość 

acetonitrylu w wodzie; 

3. 30 – 50 % zawartość 

tetrahydrofuranu w wodzie.

Oczyszczanie wody 

odwrócona osmoza

Faza Ruchoma 

Solvent 

Cutoff [nm] 

hexane 195 

n-butyl chloride 220 

methylene chloride 233 

chloroform 245 

methyl-t-butyl ether 210 

tetrahydrofuran 212 

ethyl acetate 256 

acetonitrile 190 

methanol 205 

water 190

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma 

- szereg miksotropowy Macek'a i Prochazki, 

bezwymiarowy, według polarności, 1940 Trappe,1942 

Strain eluotropowy tłuszczy, Jacques i Mathieu - moc 

rozpuszczalnika proporcjonalna do stałej 

dielektrycznej. 

- Równanie Soczewińskiego-Snydera: 

lnk' = A - Blnc moderator .

Faza Ruchoma 

Moc elucyjna rozpuszczalnika w chromatografii 

adsorbcyjnej, o . 

Funkcja mocy rozpuszczalnika = energia adsorbcji 

rozpuszczalnika na jednostkę powierzchnni o aktywności 

standardowej: 

log K = log V a + E a (S o - A S o ) 

V a - objętość powierzchni adsorbentu (0,00035 x pole 

powierzchni), E a - funkcja aktywności 

adsorbentu, proporcjonalna do jego średniej energii 

powierzchniowej, S o - energia adsorbcji substancji, A S - 

powierzchnia zajmowana przez zaadsorbowaną substancję.

Faza Ruchoma 

log K 1 /K 2 = Ea( o 2 - o 2) 

Jest to ilościowe ujęcie terminu polarności. Umownie przyjęto, 

że wynosi 0 dla tlenku glinu gdy rozpuszczalnikiem jest n- 

pentan. Wartości na żelu krzemionkowym wynoszą 0,77 tych na 

tlenku glinu. Szeregi są mniej zmnienne (róznice wynikają z 

konkurencyjnej adsorbcji fazy ruchomej). W uproszczeniu 

energia adsorbcji próbki nie zależy od rozpuszczalnika i na 

odwrót. Wyznaczone są dla tlenku glinu, silikażelu, węgli. Nie 

zmienia się on liniowo w przypadku mieszanin gdyż mocny 

rozpuszczalnik ma tendencję do gromadzenia się w formie 

zaadsorbowanej.

Faza Ruchoma 

Indeks polarności P' (Snyder) - chromatografia podziałowa. 

Do oszacowania stałych rozpuszczalności k'' (wyrażających 

nadmiarową retencję związku w porównaniu z retencją n-alkanu 

o równej objętości molowej) zastosowano ich współczynniki 

podziału w układzie gaz-ciecz. 

P' = lg(k") EtOH + lg(k") dioksan + lg(k") nitrometan 

Parametry selektywności - udziały odpowiedzialne za oddziaływania 

rozpuszczalnika z EtOH, dioksanem, nitrometanem 

x EtOH = lg(k") EtOH /P' - odziaływania protono-akceptorowe 

x dioksan = lg(k") dioksan /P' - odziaływania protono-donorowe 

x nitrometan = lg(k") nitrometan /P' - odziaływania dipolowe

Faza Ruchoma 

Na podstawie powyższych parametrów rozpuszczalniki podzielono 

na 8 klas. Trójkąty rozpuszczalności – 3 rozp. z 3 daleko 

położonych od siebie klas. Zmiana P' o 2 zmienia 

dziesięciokrotnie k'. 

k'(P'2)/k'(P'1) = 10(P'1 - P'2)/2 fazy normalne 

k'(P'2)/k'(P'1) = 10(P'2 - P'1)/2 fazy odwrócone 

mieszniny: P' = f 1 P‘ 1 + f 2 P‘ 2 

izoeluotropowa: 

f C = f B (P' B /P' C ) dla faz normalnych, gdzie dla 

rozpuszczalnika P'A = 0 

f C = f B (S' B /S' C ) dla faz odwróconych, gdzie moc 

rozpuszczalnika Si = P'w - P'i

Faza Ruchoma 

W chromatografii podziałowej parametry rozpuszczalności 

Hildebranda (obliczony z temperatur wrzenia). 

E - energia kohezji (transport mola substancji z idealnej fazy 

gazowej do jej fazy ciekłej) energia parowania do stanu 

gazowego przy p = 0, V M - objętość molowa cieczy. 

d, waha się w granicach od ok. 6 cal 1/2 cm -3/2 dla 

fluoropochodnych węglowodorów do 25 dla wody.

Faza Ruchoma 

Podział próbki X określony jest przez parametry jej i obu faz 

oraz objętość molową próbki, V X : 

log[X S ]/[X M ] = V X [(d X - d M ) 2 - (d S - d M ) 2 ]/2,303RT 

Współczynnik podziału próbki jest więc proporcjonalny do 

różnicy jej energii oddziaływania z fazą nieruchomą i ruchomą. 

Tę energię tworzą oddziaływania dyspersyjne, dipolowe, dipoli 

indukowanych, donorowo-akceptorowe, wiązania wodorowe.

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma 

Stąd d można rozbić na składowe: 

d d - dyspersyjne, d o - dipolowe, 

d a - akceptor protonów wiązania wodorowego, 

d a-b - kwasowo-zasodowe, 

d h - donor wodorów. 

Poprzez dobór rozpuszczalnika o różnym ich stosunku można 

sterować selektywnością. Dla różnych klas związków można 

stosować różne parametry, szeregi oparte na różnych 

oddziaływaniach mają różną kolejność. Aby uzyskać stopniowe 

zmiany wygodnie jest mieszanie rozpuszczalników. Pary 

rozpuszczalników pokrywających znaczny zakres mocy : 

metanol - woda (12,9-21), DMSO-woda (12,8-21), pentan - 

dioksan (7,1-9,8), octan metylu - metanol (9,8-12,9). 

d 2 = d d2 + d o2 + 2d ind d d + d a d b

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma 

dla mieszaniny 

d m = Sj i d i 

j i - ułamek objętościowy 

np. woda - MeOH: 

d m = (1 - j MeOH )d w + j MeOH d MeOH 

gdy metanol chcemy zastąpić ACN utrzymując tę samą 

moc elucyjną (mieszaniny izoeluotropowe): 

j ACN = j MeOH (d MeOH - d HOH )/(d ACN - d HOH ) = 0,78j MeOH 

Wyjątek - eter dwuetylowy, który mimo, że polarniejszy od 

heksanu to ma podobny parametr.

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma

Faza Ruchoma

Rozpuszczalnik organiczny



pH

pH

pH

pH

pH

pH

pH

Wpływ stężenia NaOH 

na retencję amin aromatycznych 

1 pyridine 

2 2-picoline 

3 4-picoline 

4 3 picoline 

5 2,6-lutidine 




9 3,5-lutidine

Wpływ rozpuszczalnika na pK a 

HA − A - + H + ACN DMSO H 2 O 

p-toluenosulfonowy 8,5 0,9 mocny 

2,4-dinitrofenol 16,66 5,1 3,9 

benzoesowy 21,51 11,1 4,2 

octowy 23,51 12,64 4,756 

fenol 29,14 18,0 9,99 

BH + B + H + ACN DMSO H 2 O 

pyrolidyna 19,56 10,8 11,4 

trietyloamina 18,82 9,0 10,72 

proton 18,62 7,5 12,1 

pirydyna 12,53 3,4 5,2 

anilina 10,62 3,69 9,4

Gradient elucji

Gradient elucji

Gradient elucji

Gradient elucji

Gradient elucji

Ciecze jonowe

Ciecze jonowe - właściwości 

rozpuszczalniki aprotyczne, polarne 

stabilne termicznie i elektrochemicznie 

bardzo dobra przewodność cieplna i elektryczna 

możliwość modyfikowania mieszalności z innymi 

rozpuszczalnikami poprzez modyfikację kationu lub 

anionu 

dobrze rozpuszczają związki organiczne i organometaliczne 

mogą być nierozpuszczalne w węglowodorach lub w wodzie, 

co daje możliwość tworzenia układów wielofazowych 

mogą dobrze rozpuszczać gazy takie jak CO, O 2 , CO 2 

niepalne

Ciecze perfuorowane 

Ciecze perfluorowane to pochodne ciekłych 

węglowodorów, rzadziej innych związków 

organicznych (aminy, etery), w których każdy 

atom wodoru związany z atomem węgla 

zastąpiony jest atomem fluoru. 

perfluorodekalina 

bromek perfluorooktylu

Ciecze perfuorowane 

bezbarwne, bezwonne, niepolarne ciecze 

nietoksyczne, niepalne 

chemicznie obojętne, wykazują brak reakcji 

rozpuszczalnikowej 

stabilne termicznie 

stosunkowo niskie ciepło parowania, niskie napięcie 

powierzchniowe i niska temperatura wrzenia przy dużych 

gęstościach i masach molowych (ok. 1,8 g/mol) 

świetnie mieszalne z nadkrytycznym CO 2 , niemieszalne z 

wodą i węglowodorami 

mieszalność z rozpuszczalnikami organicznymi zależna od 

temperatury

Złoża sferyczne i nieregularne

Średnica cząsteczek złoża

Średnica cząsteczek złoża

70% porosity; S = 300 m2/g 

Pory 

Nominal pore size is 10 nm 

50% porosity; S = 150 m2/g

Średnica porów złoża

Średnica porów złoża

Ziarno porowate i powierzchniowo-porowate

Silica-gel

Silica-gel

Silica-gel

Silica-gel

Silica-gel

Silica-gel

Żywica

Resin

Typy złóż 

1. Si-OR - "szczotkopodobne" typu estru (Halasz 1969). 

Powstaje z reakcji silikażelu z pierwszorzędowym 

alkoholem, mało stabilne, reagują z wieloma 

rozpuszczalnikami, nieodporne na temperaturę, w 

wodzie hydrolizują. 

2. Si-NR 2 - bardziej stabilne na wodę 

Si-OH + SOCl 2 Si-Cl + R 2 NH lub RNH 2 Si-NR 2 

3. Si-CR 3 , powstają z reakcji Si-Cl z pochodnymi 

Grignarda lub związkami metaloorganicznymi. 

4. Si-O-Si-CR 3 Siloksany. 

Si-OH + Cl-SiX1(X2)-R Si-O-SiX1(X2)-R + HCl 

5. Si-O-SiR 2 -O-SiR 2 -Cl Polimerowe

RP-18

Faza stacjonarna 

Silica Gel 

Derivatized Silica Gel 

O O O 

| | | 

OSiOSiOSiOH 

| | | 

O O O 

| | | 

OSiOSiOSiOH 

| | | 

O O O 

O O O 

| | | 

OSiOSiOSiOR 

| | | 

O O O 

| | | 

OSiOSiOSiOR 

| | | 

O O O 

Where R = C 18 H 37 

hydrocarbon chain 

(octadecylsilyl deriv. 

silica or ―C18‖) 

bulk (SiO 2 ) x 

surface 

bulk (SiO 2 ) x 

surface 

relatively polar surface 

―normal phase‖ 

relatively nonpolar surface 

―reversed phase‖

RP-18

RP-18

RP-18 

Bulky isobutyl groups 

protect siloxane bonds 

from hydrolysis at low pH

RP-18 

Bidentate C18 stationary phase stable in the pH range 2-11.5

RP-18

RP-18

RP-18

RP-18

Fazy stacjonarne

Fazy stacjonarne

Fazy stacjonarne

Fazy stacjonarne

Fazy stacjonarne

Fazy stacjonarne

Wymieniacze jonowe

Faza stacjonarna 

imitująca błonę biologiczną

Odcisk molekularny 

An ―artificial antibody‖ can be constructed by synthesizing a polymer in the 

presence of a template molecule. When the template is removed, the polymer is 

―imprinted‖ with the shape of the template and with complementary functional 

groups that can bind to the template. The imprinted polymer can be used as a 

stationary phase in affinity chromatography.

Odcisk molekularny

Odcisk molekularny

Odcisk molekularny 

Schemat wdrukowania kowalencyjnego fenylo-α-Dmannozydu 

z użyciem kwasu winylofenyloborowego

Molecular Imprinting

Kolumny monolityczne

Kolumny monolityczne 

Structure of Monolithic Rod: 2μm Pores

Kolumny monolityczne 

Structure of Monolithic Rod: 2μm Pores



Temperatura

Temperatura 

HPLC chromatogram of chrysene, 5-methylchrysene and benzo[j]fluoranthene recorded at 

different temperatures. Chromatographic conditions: Hypersil Green PAH column with guard 

column, 5 mm, 250x3 mm I.D.; mobile phase - gradient of acetonitrile and water, fluorescence 

detector, flow rate – 0.8 ml/min., injection volume – 20 ml.

Temperatura

Temperatura

Temperatura 

EC chromatogram (1) – ascorbic, (2) – 0.1 mM uric acids, (3) – MDA and (3’) - 25 mM 

MDATBA. Chromatographic conditions: column – 300x7.8 mm I.D. TSK-GEL 

SCH(H+) (TosoHaas); mobile phase: (A) - 3 mN H2SO4, 3 mM TBABr, 5% CAN, temp. 

– 40C; (B) – 1 mN H2SO4, 15% ACN, temp. – 20C; detector UV-267/535.

Próbka

Próbka

Próbka

Próbka

Próbka

Analiza ilościowa 

Kalibracja standardem zewnętrznym 

Dodatek standardu wewnętrznego 

(eliminacja tła, błędu systematycznego) 

Dodatek wzorca wewnętrznego 

(przygotowanie próbki, wiele związków)

Kolumna 

Liczba i wysokość półki teoretycznej - miara względnego 

poszerzenia pasma. Wielkości efektywne i zredukowane: 

h = H/d p = (1/5,54)(L/d p (w 1/2 /t R ) 2 

dla dobrej kolumny h = 2-3, gdy > 10 złe upakowanie lub złoże 

Indeks sprawności 

P = (N/t R )(N/DP) = 5.54 2 t R3 /DPw 1/2 

4 

oznacza liczbę półek na jednostkę czasu do liczby półek 

generowanych przez jednostkowy spadek ciśnienia. 

Gdy czas w sec, ciśnienie w barach to zawiera się w granicach 

1 000 - 100 000.

Kolumna 

Przepuszczalność kolumny. 

Wzrost v oprócz sprawności zwiększa też ciśnienie opisane przepuszczalnością kolumny: 

K o = vhL tot /DP DP = vhL tot /K o dla kolumny regularnie upakowanej i dc/dp > 10 

Rówanie Kozeny-Carmana: Ko = dp 2 3 /180(1 - ) 2 

- porowatość międzyziarnowa (= tot - dla kulek szklanych, dla regularnie pakowanych 

porowatych 0,5 tot = 0,42) Ko = dp2/1000 

Gdy tak obliczony spadek ciśnienia różni się o więcej niż 20% od rzeczywistego 

oznacza to, że w układzie istnieje przeciek lub zatkanie. 

t R = hL 2 tot (1 + k')/DPKo = 1000h tot L2(1 + k')/dp2DP 

czasami: K = vhL/DP u = L/tM K = vhL2/DPtM Þ tR = hL2(1 + k')/DPK 

Oznacza to, że im większa przepuszczalność tym krótszy czas analizy. Przy 

zadanym czasie analizy oznacza dłuższą kolumnę, większą sprawność i pojemność. 

Przepuszczalność rośnie ze średnicą ziarna jednakżę wtedy zwiększa się też H. dc/dp < 5 

rośnie przepuszczalność i maleje H. Wzrost L/dp zwiększ N ale i czas analizy i/lub 

ciśnienie. Ziarna kuliste, gęsto upakowane, o małej rozpiętości średnic ziaren dają lepsze 

sprawności poprzez większe mieszanie poprzeczne i braki zmian wzdłuż kolumny. 

DP = vhL/Ko » dp2/1000 (dc/dp > 10) 

DP = 1000vhL/dp2 = 1000vhHN/dp2 

H jest proporcjonalne do dp2; Ko jest proporcjonalne do średnicy najmniejszej cząsteczki 

złoża, H do największej, stąd należy dążyć do ich najmniejszej różnicy.

Kolumna 

Parametr oporu kolumny. 

F= d p2 /K = (d p /L)2(DPt i /h) = DPt M /l2h - l = L/d p - 

zredukowana długość kolumny 

Opisuje opór fazy ruchomej, zależy od L, d p , h. 

Impedancja rozdziału. Określa sprawność kinetyczną kolumny (im niższa 

E tym lepsza sprawność). Indeks sprawności maleje z lepkością i czasem 

retencji (dla stałego N). 

E = H2/K = h2F = l/ph(1 + k') = (1/5,54)(DPt M /h)(w1/2/t R )4 

Iloraz Knoxa-Parchera 

I = dc 2 /dpL 

Objętość martwa V M = pdc2L tot /4 

Rozcienczenie pasma: c i /c p = V R /v i (2p/N) 1/2 

Stężenie w maksimum piku 

c max. = civi(2p/N) 1/2 /V R

Kolumna 

Całkowita porowatość kolumny - część objętości zajmowana przez fazę ruchomę. 

tot = V M /V całk. = 4V R /dc2L(1 + k') = 4V M /dc2L 

tot (rzeczywista) = (pdc2L - 4ms/rs)/pdc2L ms/rs - masa/gęstość sorbentu 

Dla żelu krzemionkowego wynosi ok. 0,75, dla porowatych 0,4. Gdy > 1 - 

źle wyznaczona objętość martwa. Gdy mniejsza od podanych wartości - 

substancja nie penetruje porów złoża (wykluczanie). 

Równanie Knoxa. a >2, b < 4, c < 0,2, dla dobrych kolumn a 0,5, b 2, c 0,05 

 

h = 2/n + n 1/3 +0,1n 

Dla dobrej kolumny h < 5, minimum lgh = f(lgn) < 3 (małe a), h < 10 dla n = 100 

(dobry transport masy, małe c i dobre upakowanie, małe a). Zbyt stromy wzrost 

oznacza złe przenoszenie(duże c), wysokie i płaskie minimum - złe upakowanie 

(duże a). 

Pojemność względem pików oznacza (gdy N nie zależy od k', i RS = 1) liczbę 

pików możliwych do oznaczenia w jednostce czasu: 

f= 1 + 0,6N 1/2 log(1 + k'ostatniego piku) 

Wzrost sprawności zwiększa pojemność. Szczególnie niska jest ona dla 

chromatografii wykluczających. Poprawia ją gradient elucji.

NP-HPLC 

Fazy stacjonarne typu 

NP-HPLC / NP-TLC: 

1. żel krzemionkowy; 

2. tlenek glinu; 

3. di-tlenek tytanu; 

4. di-tlenek cyrkonu; 

5. hydroksy-apatyt; 

6. krzemian magnezu (Fluorisil) 

7. inne 

Fazy stacjonarne związane typu 

NP-HPLC/ NP-TLC 

1. Aminowa (NH 2 ) 

2. Nitrowa (NO 2 ) 

3. Typu DIOL 

4. Typu CN 

5. Amidowa 

6. SCX / SAX 

7. modyfikacje jonami metalu, solami, 

amoniakiem, aminami, amiami itp..

NP-HPLC 

Kolejność elucji 

1. Węglowodory alifatyczne i cykliczne 

2. Alkeny, węglowodory aromatyczne 

3. Etery, nitryle, związki nitrowe i większość związków 

karbonylowych 

4. Alkohole, fenole, aminy, amidy, imidy, sulfotlenki, kwasy 

karboksylowe

Chromatografia 

faz prostych

RP-HPLC

Adsorpcja - Podział

Adsorpcja - Podział

HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography 

HILIC – wersja chromatografii cieczowej w 

układzie faz odwróconych (Andrew Alpert, 1990r. 

– mechanizm chromatografii podziałowej cieczciecz). 

Rozdzielanie na nie-zmodyfikowanym 

silikażelu. Fazą ruchomą są rozpuszczalniki 

wodno-organiczne. Retencja odwrotna w stosunku 

do faz odwróconych. Związki słabo rozdzielane w 

RP-HPLC są dobrze rozdzielane w HILIC.

HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography






RP-HPLC

RP-HPLC

RP-HPLC


faz 

odwróconych


faz 

odwróconych


faz 

prostych/ 

odwróconych

Oddziaływania 

wielokrotne

HIC Hydrophobic Interaction Chromatography 

•Hydrofobowe oddziaływania fazy 

stacjonarnej z hydrofobowym 

regionem próbki, np. białka; 

•Białka mogą zawierać zarówno część 

hydrofilową, przez co są 

rozpuszczalne w wodzie, jaki i 

hydrofobową, zdolną do 

oddziaływań hydrofobowych; 

•Białka są adsorbowane na 

hydrofobowej fazie stacjonarnej gdy 

faza ruchoma zawiera duże stężenie 

soli; 

•Moc elucyjna rośnie ze wzrostem 

stężenia soli.

Chromatografia jonowa

IC


jonowa


jonowa



Historia wymiany jonowej 

- Pierwsze wzmianki w Biblii – Mojżesz wykorzystuje proces, 

który działa na zasadzie wymiany jonowej do przygotowania 

wody pitnej z wody słonej; 

- Arystoteles, a następnie ludzie starożytni wykorzystują 

proces wymiany jonowej do przygotowania wody do picia; 

- Początek XX wieku – niemiecki naukowiec dr Gans 

wykorzystuje wymianę jonową na skalę przemysłową; 

- 1935r – Adams i Holmes wykorzystują do tego procesu jonity 

granulowane; 

- Wykorzystanie wymiany jonowej w USA do zmiękczania 

wody – miało to ogromne znaczenie dla rozwoju procesu 

wymiany jonowej.

Zastosowanie wymiany jonowej 

-Uzdatnianie wody do celów przemysłowych – zmiękczanie i 

demineralizacja wody; 

-Uzdatnianie wody do celów konsumpcyjnych; 

-Oczyszczanie powietrza z zanieczyszczeń kwaśnych i 

zasadowych.

Reakcje wymiany jonowej 

-Dla wymiany kationitów: 

RX n- + nAY ↔ RXAn + nY - 

-Dla wymiany anionitów: 

RX n+ + mBZ ↔ RXZm + mB + 

gdzie: 

R- szkielet polimeryczny, 

X- trwale związane ze szkieletem 

grupy jonoczynne, 

A, B- ruchliwe kationy, 

Y, Z- ruchliwe aniony, 

n, m- odpowiednie wartości kationitu i 

anionitu

Chromatografia jonowa 

Błękit tymolowy w środowisku 

silnie kwasowym jest 

czerwony, w środowisku słabo 

kwasowym i neutralnym jest 

żółty, a w zasadowym - 

niebieski. Po do-daniu do 

roztworu zawierające-go nieco 

NaOH (kolor: niebieski), 

nadmiaru kationitu sulfonowego, 

niebieski roztwór w 

pobliżu ziaren kationitu stopniowo 

zmienia barwę na 

żółtą, którą w końcu przybiera 

cały roztwór. 

Ä-SO 3– H + + Na + OH – 

= Ä-SO 3– Na + + H 2 O 

Tomasz Pluciński


Reakcja wymiany kationów zachodzi ze związkami o charakterze 

neutralnym (ale o budowie jonowej). Próbkę zawiesiny kationitu 

w formie kwasowej (z dodatkiem wskaźnika) posypać solą 

kuchenną. W pobliżu ziaren powstaje natychmiast zabarwienie 

czerwone. Wynik jest paradoksalny: dodanie neutralnej substancji 

do neutralnego roztworu powoduje zakwaszenie, podczas gdy 

dodatek kwasu (kationitu) nie zmienia neutralnego odczynu... 

Ä-SO 3– H + + Na + Cl – Ä-SO 3– Na + + H + Cl – 

Ponieważ jednak tym razem nie powstaje jakakolwiek źle 

zdysocjowana substancja, ten proces jest typową reakcją 

równowagową i zachodzi jedynie w niewielkim stopniu. Decyduje 

o tym tzw. „szereg powinowactwa jonów”. Jest to oczywiście 

niekorzystne, ponieważ reakcja nie zachodzi do końca, i to 

pomimo mieszania roztworu. Można jednak użyć prostego 

wybiegu, aby mimo to doprowadzić taki proces wymiany 

praktycznie do końca. Reakcję wymiany prowadzi się nie w zlewce 

z mieszadłem, ale przesączając roztwór reagenta przez wysoką 

wąską kolumnę napełnioną zawiesiną kationitu dokładnie 

przemytego wodą destylowaną. Roztwór substratu powoli wkrapla 

się od góry. Podczas kontaktu z ziarnami kationitu ustala się stan 

równowagi. Roztwór przesączający się w niższe partie kolumny 

styka się ze świeżymi porcjami kationitu, co prowadzi do 

stopniowego dalszego przereagowywania. 

Tomasz Pluciński


Reakcja Landolta 

IO 3– + 3 HSO 

– 

3 = I – + 3 SO 

2– 

4 + 3 H + (powoli) 

5 I – + IO 3– + 6 H + = 3 I 2 + 3 H 2 O (szybko) 

I 2 + HSO 3– + H 2 O = 2 I – + SO 

2– 

4 + 3 H + (bardzo szybko) 

Tomasz Pluciński




jonowa



jonowa




jonowa


jonowa


jonowa

Mechanizm wykluczania jonowego

Wpływ pKa na retencję

Wpływ pKa na retencję 

Effect of the acid pKa value on its 

retention volume, VR. Bio-Rad Aminex 

ion-exclusion HPX-87H. M.P.: 0.5 mM 

H2SO4. Solute acids: - separated by 

pure ion-exclusion effect 

(perchloric, nitric, sulphosalicylic, chlo 

roacetic, formic, acetic and 

methanol), D - screening effect 

(oxalic, maleic, tartaric, fumaric, citric, 

lactic and ascorbic), - long chain 

aliphatic acids (propionic, butyric and 

valeric) and ¢ - aromatic acids 

(phthalic, isophthalic, terephthalic, o- 

, m- and p- 

nitrobenzoic, benzoic, salicylic, m- 

nitrophenol, o-chlorophenol, o-, m- and 

p- toluic, anisic, p-chlorobenzoic and

IEC – mechanizm retencji



Struktura pochodnych etyloaminy

Objętości retencji kwasów sulfonowych

IEC kwasów tłuszczowych

IEC – kwasów tłuszczowych

IEC – mechanizm retencji 

Acid pK a N c V R [ml] 

Acetic 4.76 2 9.4 

Oxalic 1.27 2 3.5 

Propionic 4.87 3 11.1 

Malonic 2.86 3 4.1 

Butyric 4.84 4 14.5 

Succinic 4.22 4 7.5

Objętości kwasów karboksylowych 

Kolumna: Bio-Rad HPX-87H. Faza ruchoma: 1 mM H 2 SO 4 

Acid formula pKa VR [ml] 

tartaric HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH 3.035 4.1 

citric HOOC-CH2-COH(COOH)-CH2COOH 3.1 4.4 

fumaric HOOC-CH=CH-COOH 3.053 5.0 

chloracetic Cl-CH2-COOH 2.87 6.1

Hydrofobowa adsorpcja 

1 pyridine 

2 2-picoline 

3 4-picoline 

4 3 picoline 





9 3,5-lutidine


aliphatic amines 

ion pairs 

aliphatic 

acids


Kolumna: Bio-Rad HPX-87H, Faza ruchoma: 1 mM H 2 SO 4 

Kwas pK a N C V R [ml] 

mrówkowy 3.74 1 7.16 

octowy 4.76 2 8.55 

propionowy 4.87 3 10.25 

masłowy 4.85 4 12.86 

walerianowy 4.84 5 16.20 

benzoesowy 4.21 7 72.00


Kolumna: Bio-Rad HPX-72O. Faza ruchoma 1 mM NaOH. 

Amine N C pK b V R [ml] 

NH4+ 0 4.75 4.0 

methylamine 1 3.34 3.4 

ethylamine 2 3.30 4.1 

propylamine 3 3.40 5.0 

butylamine 4 3.37 7.1 

pentylamine 5 3.37 11.2 

heksylamine 6 3.36 16.5 

pyridine 5 8.76 22.4 

aniline 6 9.39 114 

p-toluidine 7 8.89 201 

o-toluidine 7 9.56 207 

m-toluidine 7 8.30 223 

4,6 xylidine 8 9.11 394 

3,5 xylidine 8 9.11 456


Separation of p - (1) and m - (2) aminobenzoic acids. Column: Bio-Rad HPX- 

87H, detector: UV-254 nm, mobile phase: water (A) and 1 mM H2SO4 (B).

IEC kwasów o-, p- i m- nitrobenzoesowych. 

Faza ruchomase: a - woda, b - 0.5 mM TBABr

IEC kwasów organicznych

IEC cukrów

IEC kwasów fenylooctowych 

Ion exclusion 

chroma-togram of 

1 mM p- 

hydroxybenzoic 

(1), o- 

bromophenylacetic 

(2), 4- 

phenylbutyric 

(3), m- 


(4) and p- 


(5) acids. 

Chromatographic 

conditions: 

column - 300x7.8 

mm I.D. TSK- 

GEL SCX (H+) 

(TosoHaas); 

mobile phase - 1 

mM H2SO4, 1 

mM KCl, 0.125 

mM EDTA, 20 % 

ACN; temp. - 

20C, flow rate – 

0.9 

ml/min, detector 

- UV 210 nm.

IEC chromatogram Fanty

IEC kwasu benzoesowego w musztardzie

IEC wina białego

IEC mechanizm 

= 

i 

M 

i 

i 

S 

m i m 

 

 

 

 

= F 

z 

c 

RT 

RT 

i 

i 

i 

i 

i 

n 

c 

i 

c 

T 

P 

n 

c 

i 

c 

T 

P 

n 

c 

i 

c 

T 

P 

ln 

ln ) 

..... 

, 

, 

( 

) 

..... 

, 

, 

( 

) 

..... 

, 

, 

( 

0 

g 

m 

m 

M 

M 

S 

S 

 

 

 

 

 

= 

 

m 

m 

m 

m

IEC mechanizm 

 

(1) [ HR] 

S 

[ 

R ] 

S 

K 

‘definition of the partition coefficient 

d 

= 

 

[ HR] 

[ 

R ] 

 

(2) 

[ R ][ H ] 

‘definition of the dissociation constant 

(3) K 1 = [HR] S /[HR] M ‘adsorption constant of undissociated acid 

(4) K 2 = [R-] S /[R-] M ‘adsorption constant of dissociated acid 

(5) [H + ] M = c b + [R - ] M ‘mobile phase electroneutrality 

(6) 

i 

K a 

c v 

i 

= 

[ HR] 

= ([ R 

 

M 

M 

[ 

HR] 

M 

) V 

M 

V 

M 

M 

VP 

V 

S 

([ R 

(7) 

2p 

‘Gaussian peak volume 

V = 

P 

V R 

N 

] 

(8) V R = V M + K d V S ‘correlation partition coefficient with chromatographic data 

 

] 

S 

[ 

HR] 

S 

) V 

S 

V 

M 

VP 

V 

S

IEC mechanizm 

K 

d 

= 

= 

( V 

( K 

M 

2 

 

K 

1 

)[ 

(1 )[ 

( c 

( c 

civi 

( VM 

VS 

) 

K V )( V K V 

d 

S 

M 

1 

S 

b 

) 

b 

 

 

N 

2p 

K 

K 

a 

a 

) 

) 

2 

2 

4K 

( c 

4K 

( c 

a 

a 

b 

b 

 

 

K 

K 

a 

a 

)] 

)] 

= 

ln(K 1 ) = ln(K 1 

aq 

) – s 1 f ln(K 2 ) = ln(K 2 

aq 

) – s 2 f c b = pH(1-c MeOH /100) 

V 

V 

M 

M 

2K 

 

2 

 

 

K2V 

K V 

1 

S 

1 

S 

Equivalent equation can be obtained from eqs (14): 

K 

d 

K 

H 

] 

 

K 

K 

 

M a 

= 1[ 

2 

 

[ H ] 

M 

Ka 

[ H 

 

] 

M 

= 

c 

b 

 

( c 

b 

 

K 

a 

) 

2 

 

4K 

2 

( c 

a 

b 

 

K 

a 

)

1 

2 

2 

4 

2 

1 

4 

2 

1 

K 

K 

c 

K 

K 

K 

K 

c 

K 

K 

K 

K 

b 

b 

b 

b 

M 

a 

f 

S 

F 

S 

H 

f 

f 

f 

S 

F 

S 

H 

S 

a 

d 

 

 

 

 

 

 

= 

 

 

 

 

g 

g 

g 

g 

IEC mechanizm

IEC mechanizm 

Buforowana faza 

ruchoma 

K 

K 

d 

d 

K 

H 

] 

 

K 

K 

 

M a 

= 1[ 

2 

 

[ H ] 

M 

Ka 

= 

1 

1 

K 

K 

S 

a 

M 

a 

/[ H 

/[ H 

 

 

] 

] 

[H + ] S = c f [H + ] M = c b . 

S 

M 

K 

1 

Woda 

K 

d 

K c 

= 

1 b a 2 

c 

b 

 

 

K 

K 

a 

K

Describing IEC system with not buffered mobile phase 

Solution 

[HR] S and [R - ] S from eqs (3) and (4) are putted in eqs (1) 

and (6). In these equations we have only two unknowns: 

[HR] M and [R - ] M . Both sides of eq. (6) are multiplied by 

(V M + V S )/V P , so we obtain: 

(9) [HR] M = - [R - ] M . 

From the other side [H + ] from eq. (5) can be putted into 

(2): 

(10) K a [HR] M = c b [R - ] M +[R - ] M2 . 

From eqs (9) and (10) one can obtain: 

(11) [R - ] M2 + (c b + K a )[R - ] M – K a =0. 

After resolving quadratic eq. (11) we obtain value of [R - ] M 

and [HR] M from (9). Finally we can put them into (1).

Model Craiga

K D = f(c i )

K D = f(v i )

K D = f(c b )

Napięcie powierzchniowe 

i stała dielektryczna 

ln 

K = A 

P 

pK S = 100 

a 

C 

 

HOH 

MeOH 

78.38 32.66 

g [mN/m] 71.99 22.07

Wpływ mocy jonowej 

na objętość martwą 

lg( 

g 

) 

= 

0.51z 

1 

2 

m 

305 

m 

d 

1000N 

e 

2 

= 

A 

kT 

0 

2 

 

i 

m 

i

Elektrostatyczna Chromatografia 

Jonowa 

RP-18 

SiO 2 

Si - O - Si 

N + — SO 3 

-

Chromatografia Elektrostatyczna

IEC na silikażelu 

Br - J - SCN -

Rozdzielanie kwasów alifatycznych na 

kolumnie LiChrosorb Si 100 

Mobile phase: 

A - H 2 O 

B - 1 mM H 2 SO 4 

Analyzed acids: 

1 - formic 

2 - propionic 

3 - valeric

Rozdzielanie kwasów alifatycznych na 

kolumnie H+Mordenite 70x6.8 mm 

NO - 2 

11.9 min. 

NO - 3 

2.66 min.

Chromatografia par jonowych

Chromatografia par jonowych 

Cl - 

N 

+ 

CH 3 

CH 3 

CH 3 

benzyltrimethylammonium chloride 

Cl - 

N 

+ CH 2 

CH 3 

CH 2 

CH CH 3 2 

CH 3 

benzyltriethylammonium chloride 

Cl - 

N + 

benzyltributylammonium chloride


Wpływ stężenia TEAP na 

retencję kwasów alifatycznych

Influence of TBAB concentration 

on retention of nitrobenzoic acids


Chromatografia micelarna

Chromatografia wykluczania sterycznego


wykluczania 

sterycznego







Oznaczanie białka

Oznaczanie białka

Oznaczanie białka

Chromatografia powinowactwa




Cyclodekstryny

Wymiary cząsteczkowe cyklodekstryn

Wymiary cząsteczkowe cyklodekstryn 

α β γ 

ilość jednostek glukozy 6 7 8 

masa molowa 973 1135 1297 

średnica wewnętrzna wnęki I.D. [nm] ~ 0,5 ~ 0,6 ~ 0,8 

średnica zewnętrzna wnęki E.D. [nm] ~ 1,5 ~ 1,5 ~ 1,8 

wysokość wnęki H [nm] 0,8 0,8 0,8 

objętość wnęki [nm 3 ] 0,18 0,35 0,51 

przykładowe cząsteczki kompleksowane 

benzen, fenol 

naftalen, bifenyl, 

brom 

antracen, etery 

koronowe 

rozpuszczalność w wodzie w 25°C 14,5 2 23,2

Cyklodekstryny

Chemia supramolekularna

Cyklodekstryny

Cyclodekstryny

Cyclodekstryny







Cyclodextrines

Cyclodextrines 

Dependence of the retention volume of 

solutes: phenol (▲, ∆ ), nicotinic acid (■, □) 

and 2,5-dimethylphenol (●, o) on the CD 

concentration in the mobile phase. 

Conditions: Aminex HPX-87H Organic Acids 

Column. Mobile phase: CD and 1 mM 

sulphuric acid in methanol - water (30+70) v/v. 

Flow rate - 0.7 ml/min.. Solute injection 

volume - 20 ml. Solute concentration - 1 mM. 

Detector: UV-210 nm. Open symbols referee 

to 25 oC, closed to 50 oC.

Cyklodekstryny


Retention volume dependence on 

temperature for: phenol 

(▲, ∆), nicotinic acid (■, □) and 2,5- 

dimethylphenol (●, o) on the column 

temperature. Open symbols denote 

the mobile phase without CD, closed 

ones with 6 mM CD solution.

Cyclodextrines

Cyklodekstryny 

DH o and DS o values for the investigated solutes 

Conditions: Aminex HPX-87H Organic Acids Column. Mobile phase: CD and 1 mM sulphuric acid in 

methanol - water (30+70) v/v. Flow rate - 0.7 ml/min.. Solute injection volume - 20 ml. Solute concentration - 1 

mM. Detector: UV-210 nm. 

The enthalpy and entropy units are kJ/mol and J/mol K, respectively. 

Subscripts h and c refers to adsorption and inclusion, respectively. 

Solute DH o h DS o h R 2 DH o c DS o c R 2 

phenol -36.1 -11.6 0.992 -9.9 2.0 0.967 

nicotinic acid -15.6 -2.5 0.991 -9.9 1.1 0.997 

dimethylphenol -10.7 -0.1 0.991 -9.2 0.3 0.992


Chromatogram of a mixture of α,β,γ-CD. PGC column 150×4,6mm, mobile 

phase ethanol-water (15:85, v/v). Flow rate: 0.9 ml/min.


Chromatogram of DM--CD, TM--CD. PGC column 150×4,6mm, mobile 

phase dioksan-IPA (20:80, v/v). Flow rate: 0.5 ml/min.

Izomeria 

konstytucyjna 

(strukturalna) 

przestrzenna 

(stereoizomeria) 

-izomery różnią się kolejnością i sposobem 

powiązania atomów w cząsteczce 

-izomery, mając tą samą konstytucję, różnią 

się rozmieszczeniem atomów w przestrzeni 

łańcuchowa 

(szkieletowa) 

położenia 

funkcyjna 

(metameria) 

diastereoizomeria 

optyczna 

(enancjomeria) 

podstawnika 

(podstawienia) 

wiązania 

wielokrotnego 

geometryczna 

(cis-trans) 

inne

Enancjomery

Enancjomery

Enancjomery 

chiralne 

achiralne

Enancjomery

Enancjomery

Enancjomery 

Cząsteczka jest chiralna tylko wtedy, jeśli posiada przynajmniej jedno 

centrum chiralności (warunek konieczny, ale niewystarczający, forma mezo). 

Najważniejszym centrum chiralności jest asymetryczny atom węgla (C*) – 

węgiel tetraedryczny, połączony z czterema różnymi podstawnikami, np.: 

lustro

Enancjomery 

Para izomerów optycznych (enancjomerów) różni się 

konfiguracją (czyli rozmieszczeniem podstawników) wokół 

każdego atomu C* np.: 

Aby zmienić 

konfigurację wystarczy 

zamienić miejscami dwa 

podstawniki. 

To są enancjomery – są lustrzanymi 

odbiciami (różnią się konfiguracjami 

obu centrów asymetrii). 

Ta cząsteczka nie jest lustrzanym 

odbiciem żadnej z nich (różni się 

konfiguracją tylko jednego 

centrum).

Enancjomery 

Kwas L-(+)-winowy Kwas D-(-)-winowy Kwas mezo-winowy 

enancjomery 

diastereoizomery 

diastereoizomery 

Diastereoizomery – stereoizomery nie będące swoimi lustrzanymi odbiciami 

(różnią się konfiguracją nie wszystkich centrów asymetrii). 

Ostatnia cząsteczka posiada płaszczyznę symetrii. Pomimo obecności asymetrycznych 

atomów węgla (aż dwóch) jest achiralna. Taki izomer nazywamy formą mezo.

Enancjomery

Enancjomery

Enancjomery

Enancjomery 

Właściwości fizyczne 

enancjomerów są takie same z wyjątkiem oddziaływania ze światłem spolaryzowanym. 

światło niespolaryzowane 

(drgania (drgania we we wszystkich wszystkich 

płaszczyznach) 

płaszczyznach) 

światło światło spolaryzowane 

(drgania (drgania tylko tylko w jednej w jednej 

płaszczyżnie) 

płaszczyżnie) 

Enancjomery skręcają płaszczyznę polaryzacji 

przeciwnych kierunkach!) – są optycznie czynne. 

(o ten sam kąt ale w 

Enancjomer prawoskrętny (+) Enancjomer lewoskrętny (-) 

Uwaga! Równomolowa mieszanina obu enancjomerów – tzw. mieszanina racemiczna (racemat) () 

jest oczywiście optycznie nieczynna, podobnie jak substancje achiralne (skręcalność obydwu 

enancjomerów jest wzajemnnie równoważona).

Polarymetria

Enancjomery

Enancjomery

Konfiguracja D i L 

Wzorzec 

aldehyd L-(-)-glicerynowy 

(łac. laevus – lewy; grupa –OH po 

lewej stronie atomu węgla) 

aldehyd D-(+)-glicerynowy 

(łac. dexter – prawy; grupa –OH po 

prawej stronie atomu węgla) 

Jeśli jakiś enancjomer można przekształcić w aldehyd L-glicerynowy 

lub z niego otrzymać, to przypisujemy mu symbol L (analogicznie D).

Enancjomery

Enantiomers

Model tójpunktowego oddziaływania







Selektory chiralne

Selektory chiralne

Selektory chiralne

Selektory chiralne

Selektory chiralne

Selektory chiralne

Selektory chiralne

Selektory chiralne

The three-point interaction model

Ion-exclusion Chromatography (IEC) 

Injected sample 

Mobile phase 

Pump 

Mixture of analytes 

Water 

Separation column 

Conductimetric 

detector 

Injected sample: 

1=Oxalic acid, 2=Formic acid, 3=Acetic acid, 4=Propionic 

acid, 5=Butyric acid, 6=Valeric acid. 

Waste 

K. Tanaka et 

al.,

Vacancy Ion-exclusion Chromatography (VIEC) 

Injected sample 

Mobile phase 

Pump 

Mixture of analytes 

Separation column 

Conductimetric 

detector 

Mixture of analytes (= Mobile phase): 

1=Oxalic acid, 2=Formic acid, 3=Acetic 

acid, 4=Propionic acid, 5=Butyric acid, 6=Valeric acid. 

Waste

Vacancy IEC - Background 

K. Tanak et. al

Retention behaviors of aliphatic acids eluted as mobile phase 

Column: Strongly acidic cation-exchange resin (Tosoh TSKgel SCX) 

• Vacant peaks are detected depending on the number of analytes in the 

mobile phase. 

• The retention order is the degrees of their ion-exclusion/penetrationeffects 

on the resin-phase. 

K. Tanak et. al

Decreasing pH value 

pH 3.07 

Adding tartaric 

acid 

pH 2.65 

Elution condition: 5 mM tartaric acid mixed to the 0.05 mM acid mobile phase 

Injection sample: water; peaks: 1=H 2 SO 4 , 2=HCl, 3=H 3 PO 4 and 4=HNO 3

vIEC 

1. oxalic acid (8), 2. formic acid (8), 3. acetic acid (40), 4. propionic acid (40), 5. butyric 

acid (92), 6. valeric acid (120). Injection volume : 100 µL. 

K. Tanaka et al., J. Chromatogr. A, 956 (2002) 209

VIEC of aliphatic carboxylic acids 

Mobile phase (0.5 mM each) 

pH: 2.9 

1. (COOH) 2 , 2. HCOOH, 3. 

CH 3 COOH, 4. C 2 H 5 COOH, 5. 

C 3 H 7 COOH, 6. C 5 H 9 COOH 

Injected sample: water 

Flow rate: 0.6 ml/min. 

Equilibration time: 40 min. 

Column: TSKgel SCX 

K. Tanaka et. al. 

• Peak height and area is dependent 

on the total concentration of 

acids, and the volume of each acid 

penetrated on the resin surface.

Influence of acidic concentration of mobile phase 

(Aliphatic carboxylic acids) 

The influences of their concentrations 

are low. 

Order of retention volume 

1. The pK a value of analyte acids 

2. Degree of hydrophobic adsorption 

to the resin surface 

3. Solubility to water

Relationship between retention volumes and their first 

association constants for analytes on TSKgel Super IC-A/C 

Conventional IEC 

vacancy IEC

IEC – acetic acid 

Acetic acid 

[mM] 

t r 

(exp) 

t r 

(theor) 

0.5 5.124 5.07 

1 5.324 5.26 

2.5 5.764 5.53 

5 6.044 5.68 

16 6.254 5.87 

32 6.334 5.93 

N = 1500

v-IEC – acetic acid 

Acetic acid 

[mM] 

t r 

(exp) 

t r 

(theor) 

0.5 5.934 5.69 

1 6.034 5.82 

2.5 6.134 5.92 

5 6.174 5.97 

8 6.194 5.99 

16 6.204 6.04 

32 6.204 6.05 

N = 1500

v-RP-HPLC

RP-HPLC 

Experimentally obtained peaks of different acids in water used as a mobile phase. Chromatographic 

conditions:column with precolumn - Hibar RP-18 5 mm, 250x4 mm ID (Knauer), temp. - 30°C, flow rate - 1 

ml/min., mobile phase – water, volume injected 20mL, detector – UV 210/254 nm. Analyzed acids: nitric – 

black, oxalic – orange, formic – blue, salicylic – green and benzoic – red.

vRP-HPLC 

Experimentally obtained peaks of different acids in water used as a mobile phasein vacant RP- 

HPLC. Chromatographic conditions:column with precolumn - Hibar RP-18 5 mm, 250x4 mm ID 

(Knauer), temp. - 30°C, flow rate - 1 ml/min., mobile phase – water, volume injected 

20mL, detector – UV 210/254 nm. Analyzed acids: oxalic – orange, formic – blue and acetic – 

pink.

vRP-HPLC

vIC 

The mixture contained uracil, hypoxanthine, 

guanine and cytosine, each present in the mobile 

phase at a concentration of 14 mg/l. The column 

employed was 1m long, 1.5 mm I.D., packed with 

a pellicular cation exchange resin and operated at a 

flow rate of 0.3 ml/min. The mobile phase was a 

0.14 M potassium phosphate buffer solution 

adjusted to pH 4.0.

Chromatografia zwrotna

Najważniejsze płyny nadkrytyczne: 

CO2 

H2O 

CHF3 

Chromatografia płynowa



Chromatografia płynowa 

Otrzymywanie 

nadkrytycznego 

dwutlenku węgla



właściwość gaz SCF ciecz 

gęstość [g/mol] 10 -3 0,4 1 

lepkość [Pa/s] 10 -5 10 -4 10 -3 

współczynnik dyfuzji [cm 2 /s] 0,1 10 -3 10 -5 /10 -6 

gazy 

ściśliwe 

SKF 

ciecze 

mają zdolność 

rozpuszczania 

ciał stałych i cieczy


Capillary SFC of 

aromatic compounds 

with CO2, using 

density gradient 

elution at 140 °C

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Agaroza

Poliakrylamid

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza

Elektroforeza kapilarna




Multipleks CE

Celka detektora UV

CE/MS

CE/detekcja elektrochemiczna

CE/detekcja elektrochemiczna

Detekcja pośrednia

Detekcja pośrednia w CZE

Indirect Detection in CZE

Elektroforeza kapilarna 

Volume = 

DP d 4 t 

128 h L 

DP = pressure difference (mbar) 

d = capillary diameter (um)

CE

Elektroforeza

Elekroforeza/Elektroosmoza

Elekroforeza 

Na cząstkęo ładunku elektrycznym q znajdującąsięw polu elektrycznym o 

natężeniu E działa siła F e = q E. Siła ta powoduje ruch cząstki (jednostajnie 

przyspieszony, zgodnie z II zasadądynamiki Newtona). Ruchowi cząstki 

przeciwdziała siła oporu lepkiego, która w przypadku cząstki kulistej 

opisana jest wzorem Stokesa: 

F = 6πrvη 

Cząstka zaczyna poruszać się ruchem jednostajnym z prędkością 

v =qE/6πrη. 

Ruchliwość elektroforetyczna określana jest jako stosunek szybkości 

poruszania się: 

U = v/E = q/6πrη

Elekroforeza

Elekroforeza/Elektroosmoza

Elektroforeza kapilarna 

Anode 

EOF 

Cathode




Elektroosmoza

Elektroosmoza

Elektroosmoza




Elektroforeza kapilarna – wpływ pH

Micelarna chromatografia elektrokinetyczna

Micelarna chromatografia elektrokinetyczna

Mikroemulsyjna chromatografia 

elektrokinetyczna 

Na + Na + 

WATER 

SO 3 

- 

OH 

SO 3 

- 

OH 

WATER 

SO 3 

- 

OH 

Oil droplet 

OH

Inkluzyjna chromatografia elektrokinetyczna

Izotachoforeza

Izotachoforeza

Izotachoforeza

Chromatografia Jonowa

Elektroforeza Kapilarna



CZE vs IC

CZE vs IC

Elektrochromatografia

Wysokosprawna 

Chromatografia Cieczowa 

Bronisław K. Głód 

Akademia Podlaska, Instytut Chemii, Zakład Chemii Analitycznej 

ul. 3 Maja, 08-110 Siedlce, Poland

Phenylalanine

COOH 

Spin trap of hydroxyl 

OCOCH 

3 

radicals by salicylic 

acid 

aspirin 

hydrolysis 

COOH 

COC H 6 O9 

6 

OH 

COOH 

OH 

salicylic acid 

OH 

OH 

2,3-DHBA 

OH 

COOH 

CO 2 

CO 2 

COOH 

OH 

OC H 6 O9 

6 

CONHCH CO H 2 2 

OH 

OH 

OH 

HO 

2,5-DHBA 

o-catechol

IEC chromatogram of 

p-HBA and 3,4-DHBA 

IEC chromatograms (3,4-DHBA) of 

(A) slices of rat cortex, 

(B) slices incubated one hour at 37C 

in presence of 1 mM p-HBA and 

(C) with NMDA or 

(D) NMDA and MK-801. 

In the upper left corner, changes of 

chromatographic peak heights in 

contrary to not incubated slices are 

shown.

Phenylalanine

Phenylalanine

Spin trap of hydroxyl 

radicals by p-hydroxybenzoic acid 

pHBA + OH· = 3,4 DHBA 

COOH 

COOH 

? 

OH 

OH 

OH 

OH

Electrochemical Reaction 

Oxidation - Reduction Reactions 

Oxidation 

AReduction 

B + e 

OH OH 

+ 2H 

OH 

O 

O 

+ 2H + + 2e

Hydrodynamic voltammograms 

of 10 mM 3,4- dihydroxy-benzoic, 

10 mM and 1 mM p-hydroxybenzoic acid 

3,4-DHBA 10 -5 M 

p-HBA 10 -5 M 

p-HBA 10 -3 M 

100 

80 

60 

40 

20 

1000 

800 

600 

400 

200 

0 

0.0 0.4 0.8 1.2 

0

D L [pmole] 

Effect of the potential on the detection 

limit of 3,4- dihydroxybenzoic acid 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0.4 0.8 1.2 

DF [mV]

On-line HPLC

On-line HPLC

Total Antioxidant Potential 

Free radical homeostasis 

Antioxidative potential assays 

Metabolism 

Generation 

Free radicals 

Free radicals 

Scavenging 

Damage 

of proteins 

nucleic acids 

lipids 

Scavenging 

by sample 

Detection 

(chromatographic 

or spectrophotometric)

H P L C 

Generation and detection 

of hydroxyl radicals 

Fe 2+ + H 2 O 2 

ADP 

OH • 

p-HBA + OH • 

3,4-DHBA 

Chromatographic 

assay 

Hydroxyl radicals were generated 

through Fenton reaction by 1 min 

incubation of 0.5 mmol L-1 Fe2+, 2 

mmol L-1 ADP, and 2 mmol L-1 

H2O2 in 50 mmol L-1 phosphate 

buffer (pH 7.4) in the presence of 1 

mmol L-1 p-hydroxybenzoic acid 

and analyzed sample at 37 ºC. The 

reaction was stopped by 2 mmol L-1 

DMSO and 0.1 g/mL Desferal, and 

the reaction mixture was immediately 

analyzed by HPLC. Reaction 

product (3,4-dihydroxybenzoic acid) 

was assayed using ion-exclusion 

chromatography. The control sample 

contained no analyte, therefore the 

height of the reaction product with 

the detector substance was 100%.

Concentration 

H P L C 

3,4-DHBA concentrations as the measure of OH• free radical trapping 

blank 

OH • trapping capacity 

sample 

R • 

K D 

K S 

Detector 

(DHBA) 

Sample

hydroxyl radical trapped [% of control] 

H P L C 

Antioxidant capacity of methanol, ethanol and dimethyl sulfoxide 

100 

50 

0 

control 0,1% MeOH 0,1% EtOH 0,1% DMSO

Hydroxyl radical trapped [% of control] 

H P L C 

Antioxidant capacity of biogenic polyamines 

120 

100 

80 

60 

40 

*** 

20 

0 

control AGM PUT SPD SPE

H P L C 

TAP of 1 mg/ml herbal extracts

H P L C 

Parkinson’s disease patients treated by l-dopa

Monitoring Środowiska 

1. Ochrona środowiska 

- Powietrze 

- Woda 

- Gleba 

2. Analiza śladowa 

3. Organizmy żywe, budowa komórki 

4. Normy Europejskie i metody walidacji 

5. Analiza głównych zanieczyszczeń środowiska 

- Metale ciężkie (ołów, rtęć, cynk i kadm) 

- Związki metaloorganiczne 

- DDT i jego pochodne 

- Dioksyny 

- PCB 

- WWA 

- Pestycydy 

- Pozostałości leków 

- Reaktywne formy tlenu i antyoksydanty

Odkrycie WWA 

• W 1775 roku Pott w artykule „The Cancer of the Scrotum‖ 

wysunął hipotezę, że w sadzach kominowych występują 

związki chemiczne powodujące występowanie zwiększonej 

zapadalności na nowotwory moszny u kominiarzy 

angielskich. 

• Obecnie znanych jest ponad 600 WWA. Ponadto występuje 

kilkadziesiąt pochodnych metylowych, dwumetylowych, 

etylowych, nitrowych i innych.

Benzo[a]piren 

Benzo(a)piren (BaP) jest jednym z najlepiej poznanych WWA. 

Już w latach 30-tych znane były jego właściwości 

rakotwórcze i mutagenne. Od wielu lat BaP traktowany był 

jako wskaźnik skażenia środowiska i żywności WWA

„Lekkie” WWA 

Naftalen Acenaftylen Fluoren 

Antracen 

Fenantren 

Fluoranten 

Piren

„Ciężkie” WWA 

Benzo[a]antracen Chryzen Benzo[b]fluoranten 

Benzo[k]fluoranten Benzo[a]piren Indeno[1,2,3-c,d]piren 

Dibenzo[a,h]antracen 

Benzo[g,h,i]perylen

Rozpuszczalność w wodzie [mg/l] 

Naftalen 31,7 

Fluoren 1,98 

Piren 135 

Chryzen 2 

B[a]P 3,8 

B[a]A 14 

Perylen 0,4 

WWA – właściwości fizyczne 

WWA zawierają co najmniej 2 skondensowane pierścienie aromatyczne. 

Cząsteczka jest płaska i zawiera chmurę zdelokalizowanych elektronów p. 

Znanych jest ok. 660 występujących w środowisku człowieka. 

WWA są ciałami stałymi o małej lotności. 

Łatwo się adsorbują na cząsteczkach pyłów. 

Słabo rozpuszczają się w wodzie. 

Dają charakterystyczne widma UV-Vis, fluorescencyjne i fosforescencyjne.

WWA – właściwości chemiczne 

WWA łatwo się utleniają, szczególnie 

ciężkie i w obecności światła. 

Jako zwiazki aromatyczne ulegają 

substytucji elektrofilowej.

WWA – toksyczność 

DL 50 niektórych WWA (Toxological Profile ...., 1995)

Względna siła działania rakotwórczego 

i mutagennego WWA (IARC 1983)

WWA - pochodzenie i występowanie 

• Naturalne 

– pożary 

– wybuchy wulkanów 

• Antropogeniczne 

– przemysłowa emisja 

dymów 

– motoryzacja 

– indywidualne 

ogrzewanie piecowe

WWA - drogi poboru przez człowieka 

wziewną z powietrzem 

przez skórę 

drogą pokarmową 

Pobranie w mg/kg/dzień 

Źródło Benzo(a)piren Suma WWA 

Powietrze 0,010-0,044 0,207 

Woda 0,001 0,027 

Żywność 0,16 - 1,6 1,6 – 16 

Wg. Santodonato, 1980 (USA)

Furton i Pantzke, 1992 

WWA - procentowy udział w pobraniu

WWA - zawartość w papierosach

Udział poszczególnych grup produktów w spożyciu 

16 WWA w dziennej racji żywnościowej 

Czekolada 

Mleko i produkty 

Napoje 

% pobrania 16 WWA (Polska) 

% pobrania 16 WWA (Włochy) 

Warzywa 

Owoce / cukier 

Oleje i tłuszcze 

Ryby 

Mięso i produkty 

Zbożowe 

0 10 20 30 40 50 60 

Lodovici, 1995; Jankowski 2004

Oszacowanie zawartości benzo[a]pirenu w 

przeciętnych racjach pokarmowych

WWA – przenikanie do żywności 

WWA są lipofilne, słabo rozpuszczają się w wodzie i nie kumulują w 

tkankach roślin z wysoką zawartością wody. 

Gromadzą się w tkance tłuszczowej zwierząt i roślin. 

Łączą się z frakcją organiczną gleby, a przez to nie są pobierane przez system 

korzeniowy. 

Gromadzą się na powierzchniach woskowych roślin i owoców. 

Półokres trwania WWA na powietrzu wynosi od kilku godzin do kilku dni, w 

glebie nawet do kilku lat. 

Tworzą się podczas topienia 

tłuszczu, wedzenia, suszenia, pieczenia, smażenia, grilowania.

WWA – regulacje prawne 

Rozporządzenie Komisji WE 208/2005 z dnia 4 lutego 2005r. 

Zalecenie Komisji Nauki z dnia 4 lutego 2005r.

SEC HPLC 

rapeseed 

olive oil 

Chromatographic conditions: Plgel column - 5 mm, 50 Å, 600x-7.8 mm I.D.; mobile phase – 

dichloromethane, UV detector - 254 nm; temperature - ambient, flow rate – 1 ml/min., injection 

volume – 400 ml.

SEC chromatogram oleju rzepakowego 

Warunki chromatograficzne: 

Plgel 

column - 5 mm, 50 

Å, 600x-7.8 mm 

I.D.; faza ruchoma 

– dichlorometan, 

UV detector - 254 

nm; temperatur - 

pokojowa, szybkość 

przepływu – 1 

ml/min., objętość 

próbki – 400 ml.

SEC chromatogram wędzonych szprotek 


Plgel 


Å, 600x-7.8 mm 








próbki – 400 ml.

SEC chromatogram oleju palmowego 


Plgel 


Å, 600x-7.8 mm 


– 

dichlorometan, UV 

detector - 254 nm; 

temperatur - 




próbki – 400 ml.

SEC chromatogram oleju słonecznikowego 


Plgel 


Å, 600x-7.8 mm 








próbki – 400 ml.

Analytical HPLC 

Mobile phase gradient 

Time [min.] Water [%] ACN [%] 

0 50 50 

20 0 100 

35 0 100 

40 50 50 

45 50 50

HPLC analityczny 

Długości fal wzbudzenia i emisji 

Czas [min.] WWA l ex. 

[nm] l em. 

[nm] 

0.0 niskocząsteczkowe 248 375 

13.9 B[a]A, Ch 270 385 

19.0 B[b]F 256 446 

20.8 B[k]F, B[a]P, dBA, BP 295 410 

25.7 IP 274 507 

27.0 B[b]Ch 295 410

Trójwymiarowy chromatogram (sygnał vs. długość 

fali wzbudzenia i czas retencji) B[a]P

Trójwymiarowy chromatogram (sygnał vs. długość 

fali emisji i czas retencji) B[a]P


wzbudzenia i emisji) widmo fluorescencyjne B[a]A


wzbudzenia i emisji) widmo fluorescencyjne B[a]P

HPLC chromatogram of chrysene, 5-methylchrysene and benzo[j]fluoranthene recorded 

At different temperatures. Chromatographic conditions: Hypersil Green PAH column 

with guard column, 5 mm, 250x3 mm I.D.; mobile phase - gradient of acetonitrile and 

water, fluorescence detector, flow rate – 0.8 ml/min., injection volume – 20 ml.

Influence of temperature on the retention times, 

resolution and selectivity of 5-methylchrysene 

and benzo[j]fluoranthene

Calculations 

Solute, c i , concentration in the sample has been calculated from equation: 

where: 

S b – surface area of the solute compound in the certified material (SRM 1647d), 

S b – surface area of benzo[b]chrysene added to certified material (SRM 1647d), 

c b – concentration of the solute compound in the certified material (SRM 1647d) [mg/l], 

c s – concentration of benzo[b]chrysene added to certified material (SRM 1647d) [mg/l], 

A b – solute surface area in the sample, 

A s - benzo[b]chrysene surface area in the sample, 

c st – concentration of benzo[b]chrysene added to sample, 

V st – volume of benzo[b]chrysene added to sample, 

m – mass of the sample [kg].

HPLC chromatogram Ex 16-WWA z listy US-EPA 

1 – nieanalizowane, niskocząsteczkowe 

WWA, 2 - B[a]A, 3 - 

Ch, 4 - B[b]F, 5 - B[k]F, 6 - 

B[a]P, 7 - IP, 8 - dBA, 9 - BP 



Hypersil Green PAH column 

with guard column, 5 mm, 

250x3 mm I.D.; faza 

ruchoma: - gradient acetonirylu 

i wody; detector fluorescencyjny; 

temperatura – 25 

ºC, szybkość przepływu – 0.8 

ml/min., objętość próbki – 20 

ml.

HPLC chromatogram Em 16-WWA z listy US-EPA 


WWA, 2 - B[a]A, 3 - 

Ch, 4 - B[b]F, 5 - B[k]F, 6 - 

B[a]P, 7 - IP, 8 - dBA, 9 - BP 




with guard column, 5 

mm, 250x3 mm I.D.; faza 






ml.

HPLC chromatogram 16-WWA z listy US-EPA 


WWA, 2 - B[a]A, 3 - 

Ch, 4 - B[b]F, 5 - B[k]F, 6 - 

B[a]P, 7 - IP, 8 - dBA, 9 - BP 




with guard column, 5 

mm, 250x3 mm I.D.; faza 






ml.

Charakterystyka metody chromatograficznej 

WWA t R 

[min.] D L 

[mg/kg] 

B[a]A 17.1 0.06 

Ch 17.8 0.08 

B[b]F 20.2 0.1 

B[k]F 21.3 0.04 

B[a]P 22.4 0.08 

dBA 23.7 0.1 

BP 25.2 0.2 

IP 25.9 4.8 

t R 

– czas retencji, D L 

– wykrywalność

Walidacja metody 

Materiał referencyjny [mg/kg] 

CRM 458 

B[a]A Ch B[b]F B[k]F B[a]P BP 

W. certyfikowana 4.9±0.4 1.97±0.2 0.93±0.09 0.97±0.1 

Olej palmowy 

SRM 2978 

Tkanka małży 

Wynik pomiaru 5.83 2.16 1.03 0.96 

W. certyfikowana 25±7 59±10 58±15 24.1±3.4 7±3 19.7±4.4 

Wynik pomiaru 26.96 57.65 52.71 24.01 7.85 23.15

Walidacja metody 

Materiał referencyjny [mg/kg] B[a]A Ch B[b]F B[a]P BP 

FAPAS 0615 

Oliwa 


Wynik pomiaru 22.05 3.79 

2.23 

2.14 

FAPAS 0618 

Oliwa 

W. certyfikowana 38.75±1.9 24.90±1.8 18.66±0.9 17.83±96 

Wynik pomiaru 

35.21 

21.84 20.73 16.36 

FAPAS 0621 

Oliwa 


Wynik pomiaru 40.07 27.47 25.59 16.87

Linearity of the assay 

45 

30 

ci [ppb] 

15 

B[a]P 

y = 0,9709x 

R 2 = 0,9954 

B[a]A 

y = 0,9628x 

R 2 = 0,9945 

0 

c ref [ppb] 

0 15 30 45

Porównanie długości fali wzbudzenia widma standardu B[a]P z widmem 

piku chromatograficznego oleju rzepakowego o tym samym czasie retencji

Porównanie długości fal emisji widm standardu B[a]P z widmem piku 

chromatograficznego oleju rzepakowego o tym samym czasie retencji

HPLC chromatogram of PAH in 

whale oil (A) and smoked sausage (B)

HPLC chromatogram of PAH in 

milk (A) and rapeseed (B)

HPLC chromatogram WWA zawartego w oleju 

palmowym (A) i rzepakowym (B) 

A 

B

Summary of contributions to measurement uncertainty of B[a]A 

Reference value 0 25 38.75 43.2 

Uncertainty of reference value 7 1.92 1.88 

Mean 0.07 26.04 36.64 41.80 

Repeatability [SD] 0.04 1.931 0.662 1.358 

Limit of repeatability [2.8 SD] 0.10 5.41 1.86 3.80 

Variable coefficient [% SD] 50.2 7.41 1.81 3.25 

Reproducibility [SD] 0.04 1.93 2.27 2.77 

Limit of reproducibility [2.8 SD] 0.10 5.41 6.35 7.77 

Variable coefficient [% SD] 50.2 7.41 6.19 6.64 

Robustness 0.07 1.04 -2.11 -1.40 

Uncertainty of robustness 0.04 7.21 2.93 3.17 

Recovery 104.2 94.55 96.75 

Uncertainty of recovery 28.81 7.81 7.49 

Combined uncertainty 0.08 3.9 2.7 3.1 

Expanded uncertainty 0.16 7.8 5.4 6.1

Summary of contributions to measurement uncertainty of B[a]P 

Reference value 0 0.93 2.36 7.0 18.66 28.2 

Uncertainty of reference value 0.09 0.15 3.0 0.96 1.03 

Mean 0.07 0.97 2.49 7.26 19.32 26.11 

Repeatability [SD] 0.01 0.07 0.13 0.79 1.50 0.70 

Limit of repeatability [2.8 SD] 0.03 0.19 0.36 2.20 4.20 1.96 

Variable coefficient [% SD] 13.6 6.93 5.12 10.8 7.77 2.69 

Reproducibility [SD] 0.01 0.11 0.36 0.78 2.04 2.06 

Limit of reproducibility [2.8 SD] 0.03 0.30 0.99 2.20 5.70 5.76 

Variable coefficient [% SD] 14.2 10.9 14.3 10.8 10.5 7.88 

Robustness 0.07 0.04 0.13 0.26 0.65 -2.09 

Uncertainty of robustness 0.01 0.14 0.42 3.06 2.12 2.49 

Recovery 104.5 105.6 103.7 103.5 92.6 

Uncertainty of recovery 14.28 16.92 43.65 11.05 9.41 

Combined uncertainty 0.07 0.12 0.41 1.7 2.1 2.4 

Expanded uncertainty 0.15 0.24 0.81 3.3 4.1 4.7

Performance Tests 

The calibration curves showed a good linearity for all PAH in the concentration range 0.1÷100 ppb. 

The repeatability (RSD, n =6) of different PAH ranged from 0.5 to 5%. The analysis of standard 

reference material of the National Institute of Standards & Technology (mussel tissue, SRM 

2978), Community Bureau of Reference (coconut oil, CRM 458) and Central Science Laboratory 

(olive oils, FAPAS 0615, 0618 and 0621) resulted in a good accordance between measured and 

certified concentrations. 

Detection limit, quantification limit, and recovery obtained for benzo[a]pyrene are equal 0.1 

mg/kg, 0.3 mg/kg and 93÷106% and for benzo[a]antracene 0.2 mg/kg, 0.5 mg/kg and 

94÷104%, respectively. 

Obtained detection limit (< 0.3 mg/kg), quantification limit (< 0.9 mg/kg) and recovery (50 ÷ 120 %) 

fulfill the performance test, according to the EU directive 10/2005 from Feb 04 2005. 

No repulsed values have been found using statistical Mandel’s, Cochran’s and Grubss tests (used 

according to ISO 5725:1994; PN-EN ISO/IEC 17025; The Fitness for Purpose of Analytical Methods. 

A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics, Eurachem and Quantifying Uncertainty 

in Analytical Measurement, Eurachem).

Statistical Mandel’s Tests

Stężenia WWA [mg/kg] w różnych olejach 

Próbka [mg/kg] B[a]A Ch B[b]F B[k]F B[a]P dBA BP 

Surowy olej palmowy 62.6 105.3 55.1 12.1 40.6 nd 15.8 

Oczyszczony olej palmowy nd nd nd 0.09 0.10 nd nd 

Rzepakowy (na zimno tłoczony) 4.70 5.57 5.56 2.17 4.35 0.46 4.05 

Uniwersalny (rzepak. oczyszcz.) 0.16 0.61 0.48 0.22 0.24 0.15 1.35 

Oliwa 0.49 1.97 0.97 0.40 0.69 0.08 1.42 

Słonecznikowy nd 0.44 0.22 0.15 0.27 nd 0.60 

Sojowy 0.60 2.10 0.91 0.56 0.98 0.20 nd 

Winogronowy 0.35 1.69 0.35 0.26 0.51 nd 1.09 

Lniany 0.62 0.87 0.56 0.20 0.45 nd 1.09 

Z dyni 0.11 0.82 0.57 0.16 0.46 nd 1.02 

Arachidowy 5.05 5.20 3.97 1.59 3.11 0.30 2.46 

Sezamowy 5.53 6.14 3.83 1.47 3.06 0.29 2.35 

Tran nd nd nd nd 0.09 nd nd

Stężenia WWA [mg/kg] 

w stałych próbkach żywności

Comparison between performances 

obtained and required by EU 

Parameter Performance required Performance obtained Reference 

Detection limit < 0.3 mg/kg B[a]P – 0.1; B[a]A – 0.2 mg/kg Directive 2005/10/EC 

Quantification limit < 0.9 mg/kg B[a]P – 0.3; B[a]A – 0.5 mg/kg Directive 2005/10/EC 

Recovery 50÷120% B[a]P 93÷106; B[a]A 94÷104% Directive 2005/10/EC 

Maximum level of 

B[a]P in oils and fats 

Maximum level of 

B[a]A in liquid smokes 

2 mg/kg D L = 0.1 mg/kg Regulation 208/2005/EC 

10 mg/kg D L = 0.3 mg/kg Regulation2065/2003/EC 

Statistical rejection 

Mandel’s, Grubbs’s and 

Cochrana’s tests 

passed ISO 5725:1994

PAH’s concentrations in edible oils

GC/MS TIC

GC/MS TIC

GC/MS 

Parametr przebiegu 

Wartość lub zastosowane rozwiązanie 

I 

Chromatograf gazowy 

1 Kolumna BPX 35 długość 30m., średnica 25μm 

2 Temperatura dozownika 315ºC 

3 Temperatura kolumny Izoterma 70ºC-1 min, przyrost I: 20ºC/min do 120ºC;120ºC izoterma 0,5 min; 

przyrost II 4ºC/min do 320ºC; izoterma końcowa 320ºC 

4 Temperatura linii transferowej 280ºC 

5 Temperatura źródła jonów 280ºC/250ºC* 

6 Temperatura quadropool 100ºC 

7 Gaz nośny Hel 

8 Przepływ 0,8 ml/min 

9 Ciśnienie na kolumnie 150 psi/ stały przepływ 1 ml/min* 

II 

Detekcja MS 

1 Wyselekcjonowane iony 128, 152,154, 166, 178, 202, 228, 252, 276, 278 m/e 

2 Ciśnienie w źródle jonów 1,1-1,5 x10 -5 torra przy 60ºC pieca chromatografu 

3 Czas analizy 60 min 

4 Rozpuszczalnik do próbki Cykloheksan 

* - Dane odnoszą się do aparatu MS Polaris

23 WWA GC/MS 

GC/MS chromatogram of 23-PAHs listed in the US-EPA and 

SC-UE (1 – naphthalene, 2 - acenaphthene, 3 - 

acenaphthylene, 4 -phenantrene, 5 -fluorene, 6 - anthracene, 

7 - fluoranthene, 8 -pyrene, 9 - cyclopenta[cd]pyrene, 10 - 

benzo[a]anthracene, 11 - chrysene, 12 - 5-methylchrysene, 

13 - benzo[b]fluoranthene, 14 - benzo[j]fluoranthene, 15 - 

benzo[k]fluoranthene, 16 - benzo[a]pyrene, 17 - 

indeno[1,2,3-cd]pyrene, 18 - benzo[ghi]perylene, 19 - 

dibenzo[a,h]anthracene, 20 - dibenzo[a,l]pyrene, 21 – 

dibenzo[a,e]pyrene, 22 - dibenzo[a,i]pyrene, 23 - 

dibenzo[a,h]pyrene).

7 WWA GC/MS 

GC/MS chromatogram of 7-PAHs added by SC-UE to the US-EPA list

Produkty tłuszczowe 

Zawartość benzo[a]pirenu

Correlation between concentration of B[a]P and total 

concentration of PAH’s in different oils

Produkty tłuszczowe - mlemiksy 

Korelacje między benzo[a]pirenem, 16 WWA a fenantrenem

Cam Sep Lect 1 Chromatografia Bronislaw K. Glod

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?