CamSep 4 1
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Uniwersytet Przyrodniczo‐Humanistyczny w Siedlcach<br />
Instytut Chemii<br />
Camera Separatoria<br />
Volume 4, Number 1 / June 2012<br />
Siedlce 2012
Editors (reviewers):<br />
Tadeusz Dzido – Lublin, Bronisław K. Głód – Siedlce, Marian Kamiński – Gdańsk,<br />
Piotr M. Słomkiewicz – Kielce, Piotr Stepnowski – Gdańsk, Andrzej Stołyhwo –<br />
Warszawa, Monika E. Waksmundzka-Hajnos – Lublin, Paweł K. Zarzycki – Koszalin<br />
Co-Editors-in-Chief:<br />
Bronisław K. Głód (Siedlce) and Marian Kamiński (Gdańsk)<br />
Technical Editors:<br />
Paweł Piszcz, Paweł M. Wantusiak<br />
tel. (25) 64310 41<br />
e-mail: psc1@onet.eu<br />
URL: http://dach.ich.uph.edu.pl/camera_separatoria.html<br />
ISSN 2083-6392<br />
Publishing House<br />
Siedlce University of Natural Sciences and Humanities<br />
08-110 Siedlce, ul. Bema 1<br />
phone: 48 25 643 15 20<br />
e-mail: wydawnictwo@uph.edu.pl<br />
www.wydawnictwo.uph.edu.pl
SPIS TREŚCI<br />
(CONTENTS)<br />
Prace przeglądowe / Review papers<br />
Jolanta Kumirska, Marta Potrykus, Natalia Migowska, Ewa Mulkiewicz<br />
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania<br />
wybranych estrogenów w próbkach środowi-skowych ................................... 7<br />
Natalia Migowska, Jolanta Kumirska<br />
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji i/lub<br />
wzbogacania pozostałości wybranych farmaceutyków w próbkach<br />
środowiskowych ............................................................................................ 37<br />
Magda Caban, Anna Michalak, Jolanta Kumirska<br />
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów<br />
w próbkach środowiskowych ........................................................................ 61<br />
Prace oryginalne / Original papers<br />
Monika Waksmundzka-Hajnos, Anna Oniszczuk, Rafał Podgórski<br />
Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji<br />
na wydajność izolacji wybranych furanokumaryn<br />
z owoców gorysza wyniosłego (Peucedanum verticillare) ............................ 83<br />
Bronisław K. Głód, Ewa Szafraniuk, Justyna Pijanowska<br />
Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów ............................ 93<br />
Instrukcje dla autorów ................................................................................. 105<br />
Instructions for Authors and Editorial Policy ............................................... 109
Camera Separatoria<br />
PRACE PRZEGLĄDOWE<br />
(REVIEW PAPERS)
CAMERA SEPARATORIA<br />
Volume 4, Number 1 / January 2012, 7-36<br />
Jolanta KUMIRSKA*, Marta POTRYKUS, Natalia MIGOWSKA,<br />
Ewa MULKIEWICZ<br />
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii,<br />
Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka,<br />
Zakład Analizy Środowiska,<br />
ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,<br />
*e-mail: kumirska@chem.univ.gda.pl<br />
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i<br />
oznaczania wybranych estrogenów w próbkach środowiskowych<br />
Streszczenie: Estrogeny to związki hormonalne, których obecność w środowisku - nawet w<br />
bardzo niskich stężeniach (poniżej 1 ng/L) - może wywierać negatywny wpływ na reprodukcje i<br />
rozwój organizmów żywych. Opracowywanie odpowiednio czułych metodyk przygotowania<br />
próbki, rozdzielania i oznaczania tych związków w próbkach środowiskowych stało się zatem<br />
jednym z ważniejszych zadań z zakresu chemii analitycznej oraz ochrony środowiska. W pracy<br />
przedstawiono przegląd metodyk przygotowania próbki, rozdzielania i oznaczania wybranych<br />
substancji estrogenowych (estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynyloestradiolu, dietylostilbestrolu)<br />
w różnych komponentach środowiska techniką GC-MS (ang. gas chromatography coupled<br />
with mass spectrometry).<br />
Słowa kluczowe: związki estrogenowe, matryce środowiskowe, chromatografia gazowa,<br />
spektrometria mas, przygotowanie próbki<br />
Application of gas chromatography for separation and<br />
determination of selected estrogenic compounds in the<br />
environmental samples<br />
Abstract: Estrogens are hormonal active compounds, which presence in the environment - also<br />
in very low concentrations (less than 1 ng/L) – could have a negative influence on reproduction<br />
and growth of the living organisms. Development of the sensitive methods for determination of<br />
these compounds in the environmental samples has been found as one of the most important<br />
tasks of analytical chemistry and environmental protection. In this work, a review of methods for<br />
determination of selected estrogenic compounds (estrone, 17β-estradiol, estriol, 17α-ethinylestradiol<br />
and diethylstilbestrol) in environmental compartments using GC-MS (ang. gas chromatography<br />
coupled with mass spectrometry) technique is presented.<br />
Key words: estrogenic compounds, environmental matrices, gas chromatography, mass<br />
spectrometry, sample preparation
8 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
1. Wstęp<br />
(Introduction)<br />
Estrogeny wraz z gestagenami stanowią żeńskie hormony płciowe,<br />
które między innymi zapewniają prawidłowy rozwój i funkcjonowanie narządów<br />
rodnych [1-3]. Ilość wydalanych estrogenów naturalnych (17β-estradiolu<br />
- E2, estronu – E1, estriolu - E3 oraz estetrolu - E4) zależy od wieku,<br />
diety, pory roku, stanu zdrowia [4]. Związki te od zawsze były obecne w środowisku,<br />
ale pierwsze doniesienia o ich wykryciu w wodach powierzchniowych<br />
pojawiły się w roku 1980 [5]. Obecnie obserwowany jest wzrost stężeń<br />
środowiskowych ich syntetycznych odpowiedników (17α-etynyloestradiolu -<br />
EE2, dietylostilbestrolu - DES czy mestranolu - MES) [6]. Tłumaczy się to<br />
przede wszystkim stosowaniem doustnych środków antykoncepcyjnych w<br />
postaci jedno- lub dwuskładnikowej. Zawierają one hormon estrogenowy i<br />
progestagenowy w różnych proporcjach, zależnych od fazy środka antykoncepcyjnego<br />
[7].<br />
W medycynie, estrogeny wykorzystuje się w hormonalnej terapii zastępczej<br />
(HTZ), której celem jest uzupełnienie niedoboru estrogenów, występującym<br />
w okresie około menopauzalnym. Zaleca się tę metodę w łagodzeniu<br />
objawów naczynioruchowych, w zaburzeniach układu kostnego<br />
(osteoporoza), w suchości pochwy i atrofii układu moczowo-płciowego oraz<br />
chorobach układu krążenia [8]. U mężczyzn stosowane są wspomagająco w<br />
leczeniu raka gruczołu krokowego [7].<br />
W hodowli zwierząt, hormony estrogenowe podawane są jako dodatki<br />
do pasz (tzw. promotory wzrostu), w celu przyspieszenie wzrostu i zwiększenia<br />
masy mięsnej bydła, drobiu, trzody chlewnej [9].<br />
Metabolity leków wydalane są w formie wolnej oraz związanej i wraz<br />
ze ściekami trafiają do środowiska. Badania przeprowadzone w ostatnich<br />
latach wykazały występowanie śladowych ilości hormonów estrogenowych<br />
nie tylko w ściekach [10] i wodach powierzchniowych [11], ale także w wodzie<br />
gruntowej [12] i co jest szczególnie niepokojące - w wodzie pitnej [13].<br />
Jedną z głównych przyczyn są nieefektywne metody usuwania tych związków<br />
podczas konwencjonalnych metod oczyszczania ścieków [4].<br />
Estrogeny wykazują duży potencjał aktywności biologicznej, wpływając<br />
w istotny sposób na prawidłowy rozwój płciowy organizmów żywych [1,<br />
13, 14]. Po przeniknięciu do środowiska mogą zakłócać prawidłowe funkcjonowanie<br />
układów hormonalnych, stąd zaliczane są do związków zakłócających<br />
działanie endokrynne, w skrócie EDC (ang. Endocrine-Disrupting Compounds).<br />
Wpływają na czynniki warunkujące utrzymanie homeostazy, zachowanie<br />
gatunku i jego reprodukcję [13]. Po raz pierwszy negatywne oddziaływanie<br />
EDC na środowisko zaobserwowano 30 lat temu [14]. Były to<br />
nieprawidłowości w procesach rozrodczych u organizmów wodnych, zwłaszcza<br />
ryb [14], polegające na feminizacji osobników męskich. Związki te wpływają<br />
na indukcję witellogeniny, obniżają produkcję jaj, indeks gonadosomatyczny<br />
samców (GSI), wywołują obupłciowość, zmniejszają zachowania<br />
seksualne samców [15-18]. Zaburzenia rozrodczości i rozwoju organizmów<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
9<br />
spowodowane ekspozycją na estrogeny objawiają się także zmniejszoną<br />
płodnością, dystocją (tzw „ciężkimi” porodami), przedwczesnymi porodami,<br />
skróconym okresem ciąży, poronieniami, zakłóceniami owulacji [19-24]. Należy<br />
podkreślić, iż w przypadku EE2 zjawiska te obserwuje się już przy stężeniach<br />
oznaczanych w środowisku na poziomie 0,05-10 ng/L. Według wielu<br />
autorów istnieje możliwość bioakumulacji tych związków w organizmach<br />
wodnych, a tym samym dotarcia poprzez łańcuch pokarmowy do organizmów<br />
wyższych [23].<br />
W celu oszacowania ryzyka ekotoksykologicznego konieczne było<br />
opracowanie bardzo czułych i selektywnych technik analitycznych, które<br />
pozwalałyby na rozdzielenie i oznaczanie związków z grupy estrogenów w<br />
złożonych próbkach środowiskowych.<br />
2. Struktura oraz właściwości wybranych estrogenów<br />
(Structures and properties of selected estrogens)<br />
Estrogeny należą do hormonów steroidowych, których struktura wywodzi<br />
się od cyklopentenoperhydrofenantrenu (steranu) (Rys. 1). Pierścień<br />
A ma charakter aromatyczny, natomiast obecność grupy fenolowej w pozycji<br />
C-3 pozwala na odróżnienie hormonów steroidowych od pozostałych związków<br />
steroidowych [2, 25].<br />
Rys. 1 Struktura steranu<br />
Fig. 1 Structure of sterane<br />
Struktury chemiczne oraz właściwości fizykochemiczne wybranych związków<br />
o działaniu estrogenowym przedstawiono w Tabeli 1.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
10 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
Tabela 1. Budowa chemiczna oraz właściwości fizykochemiczne wybranych<br />
związków o działaniu estrogenowym (M - masa cząsteczkowa,<br />
log K ow - współczynnik podziału n-oktanol/woda, S H2O -<br />
rozpuszczalność w wodzie [26-31]<br />
Table 1. Chemical structures and physicochemical properties of selected<br />
estrogenic compounds (M – molecular weight, log K ow - partition<br />
coefficient of n-octanol / water, S H2O – solubility in water) [26-31]<br />
Związek<br />
Wzór sumaryczny<br />
Numer CAS<br />
Compound<br />
Chemical formula<br />
CAS number<br />
Estron (E1)<br />
Estrone (E1)<br />
C 18 H 22 O 2<br />
[57-16-7]<br />
(naturalny estrogen)<br />
(natural estrogen)<br />
Struktura chemiczna<br />
Chemical structure<br />
Wybrane właściwości<br />
fizykochemiczne<br />
Selected<br />
physicochemical<br />
properties<br />
M = 270,4 g/mol<br />
Log K OW = 3,43<br />
S H2O = 13,0 mg/L<br />
17β-estradiol<br />
(Estradiol) (E2)<br />
Estradiol (E2)<br />
C 18 H 24 O 2<br />
[50-28-2]<br />
(naturalny estrogen)<br />
(natural estrogen)<br />
Estriol (E3)<br />
Estriole (E3)<br />
C 18 H 24 O 3<br />
[50-27-1]<br />
(naturalny estrogen)<br />
(natural estrogen)<br />
M = 272,4 g/mol<br />
Log K OW = 3,94<br />
S H2O = 13,9 mg/L<br />
M = 288,4 g/mol<br />
Log K OW = 3,84<br />
S H2O = 13,2 mg/L<br />
Estetrol (E4)<br />
C 18 H 24 O 4<br />
[15183-37-6]<br />
(naturalny estrogen)<br />
(natural estrogen)<br />
M = 304,38 g/mol<br />
Log K OW brak danych<br />
(bd)<br />
S H2O = bd<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
11<br />
17α-<br />
Etynyloestradiol<br />
(EE2)<br />
Ethinylestradiol<br />
(EE2)<br />
C 20 H 24 O 2<br />
[57-63-6]<br />
(syntetyczny<br />
estrogen)<br />
(synthetic estrogen)<br />
M = 296,4 g/mol<br />
Log K OW = 4,15<br />
S H2O = 4,8 mg/L<br />
Dietylostilbestrol<br />
(DES)<br />
Diethylstilbestrol<br />
(DES)<br />
C 18 H 20 O 2<br />
[56-53-1]<br />
(niesteroidowy<br />
syntetyczny<br />
estrogen)<br />
(non-steroid<br />
synthetic estrogen)<br />
M = 268,4 g/mol<br />
Log K OW = 5,07<br />
S H2O = 12,5 mg/L<br />
Estradiol (E2), będący najważniejszym naturalnym estrogenem (Tabela<br />
1), występuje w postaci dwóch izomerów: 17α-estradiolu i 17β-estradiolu,<br />
spośród których 17α-estradiol nie jest syntezowany w organizmie<br />
człowieka [2, 3, 32]. Estriol (E3) charakteryzuje się najsłabszym działaniem<br />
biologicznym spośród wymienionych naturalnych hormonów żeńskich [3],<br />
zaś 17α-etynyloestradiol (EE2) będący półsyntetyczną pochodną estradiolu,<br />
posiada dodatkową grupę etinylową w pozycji C-17α, której obecność warunkuje<br />
15-20 razy silniejsze działanie niż E2 [33]. Najwięcej grup hydroksylowych<br />
występuje w estetrolu (E4) (Tabela 1), który syntezowany jest wyłącznie<br />
w trakcie ciąży. Z uwagi na fakt, że do oznaczania tego estrogenu w<br />
środowisku nie stosuje się techniki chromatografii gazowej, nie będzie on<br />
omawiany w dalszej części pracy.<br />
Wydalanie estrogenów następuje w dużej mierze z moczem, w mniejszym<br />
stopniu z kałem. Estrogeny usuwane z moczem występują głównie w<br />
formie koniugatów, najczęściej w postaci siarczanów i glukuronianów, podczas<br />
gdy ze stolcem eliminowane są w formie wolnej [4]. Usuwanie estrogenów<br />
z organizmu kobiet zależne jest od fazy cyklu: w I fazie – 10-25<br />
µg/dobę, a w II fazie - 30-50 µg/dobę [3]. Ilość/stężenie estrogenów wydalanych<br />
u kobiet w ciąży są wielokrotnie większe niż u kobiet w okresie cyklu<br />
menstruacyjnego. Szczególnie ilość wydalanego estriolu, często nazywanego<br />
hormonem ciążowym, jest nawet tysiąckrotnie większa. Pod koniec<br />
ciąży zawartość tego hormonu stanowi ponad 90% wszystkich estrogenów<br />
stwierdzanych w moczu [3].<br />
90% wszystkich wydalanych przez bydło hormonów żeńskich stanowią:<br />
estron, 17β-estradiol i 17α-estradiol w formie koniugatów i wolnej. W<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
12 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
przypadku trzody chlewnej i drobiu wydalany jest 17β-E2, E1 i E3 oraz ich<br />
siarczany i glukuroniany, rzadziej zaś 17α-estradiol. U bydła 58% całkowitej<br />
ilości estrogenów usuwane jest z kałem, natomiast u trzody chlewnej (96%) i<br />
drobiu (69%) wydalanie hormonów następuje głównie z moczem [4, 34].<br />
Estrogeny naturalne (E1, E2 i E3) mają wyższą rozpuszczalność w<br />
wodzie, niż ich syntetyczne odpowiedniki (EE2) (Tabela 1), choć dla DES<br />
jest ona porównywalna. Wartości log K OW świadczą możliwości wbudowywania<br />
się do struktury koloidów organicznych i makrocząsteczek występujących<br />
w środowisku wodnym, a także informuje o hydrofobowości tych związków.<br />
3. Rozdzielenie i analityka pozostałości estrogenów w<br />
próbkach środowiskowych techniką GC<br />
(Separation and analytics of estrogenic compounds<br />
residues in the environmental samples using GC<br />
technique)<br />
Analiza pozostałości estrogenów i ich syntetycznych odpowiedników<br />
w środowisku nie jest zadaniem łatwym z dwóch zasadniczych powodów:<br />
złożoności matryc środowiskowych oraz bardzo niskich stężeń oznaczanych<br />
związków (rzędu pg – ng/L). Metody analityczne muszą charakteryzować się<br />
zatem niezwykle wysoką czułością oraz selektywnością. Jest to możliwe w<br />
przypadku zastosowania odpowiednich sposobów pobierania i przechowywania<br />
próbki oraz czaso- i pracochłonnych procedur przygotowania do analizy<br />
właściwej [35, 36]. Dotychczas, najczęściej wybieraną techniką analityczną<br />
stosowaną do śladowej analityki pozostałości estrogenów jest chromatografia<br />
cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) lub tandemową<br />
spektrometrią mas (LC-MS/MS) [35. 36]. Mimo dogodności jaką daje<br />
ta metoda analityczna, głównie w zakresie znacznego uproszczenia etapu<br />
przygotowania próbek do analizy, ma ona szereg ograniczeń [37], do których<br />
należą m.in. interferencje analitów ze składem matrycy wpływające bezpośrednio<br />
na granice oznaczalności i wykrywalności, znaczący wpływ rodzaju<br />
fazy ruchomej na proces jonizacji i fragmentacji związków, problemy z powtarzalnością<br />
i odtwarzalnością wyników, wąski zakres liniowości odpowiedzi<br />
ilościowej detektora mas, konieczność optymalizacji parametrów pracy<br />
spektrometru mas praktycznie dla każdego analizowanego związku by<br />
zwiększyć czułość i selektywność metody, brak biblioteki widm mas czy wysoki<br />
koszt analizy. Z kolei słabością techniki chromatografii cieczowej z detekcją<br />
spektrofotometryczną (UV) lub fluorescencyjną jest zbyt niska wiarygodność<br />
identyfikacji substancji, bazująca jedynie na czasie retencji (zgodnie<br />
z najnowszymi dyrektywami identyfikacja ksenobiotyków (w tym farmaceutyków)<br />
w środowisku powinna opierać się na przynajmniej 4 punktach<br />
identyfikacyjnych, przy czym czas retencji dostarcza tylko jednego [38]).<br />
Interesującą alternatywą jest zastosowanie chromatografii gazowej połączonej<br />
ze spektrometrią mas, szczególnie w tych przypadkach, gdy badane leki<br />
występują na bardzo niskim poziomie stężeń, a skład matrycy zakłóca pra-<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
13<br />
widłową detekcję tych związków techniką LC-MS/MS. Niższe koszty analizy<br />
oraz mniejsze zużycie rozpuszczalników także przemawiają na korzyść tego<br />
rozwiązania. Z uwagi na fakt, iż związki estrogenowe mają charakter średnio<br />
polarny, wymagane jest jednak przeprowadzenie ich w postać odpowiednich,<br />
lotnych pochodnych, które dodatkowo zwiększą ich stabilność termiczną.<br />
3.1. Pobieranie i przechowywanie próbek<br />
(Collection and sample storage)<br />
Jak już wspomniano, estrogeny wydalane są z organizmu głównie w<br />
formie koniugatów (przeważnie siarczanów i glukuronianów), co podnosi ich<br />
charakter polarny. Sprawia to, że związki estrogenowe w środowisku kumulują<br />
się przede wszystkim w układzie wodnym. Z tego powodu analizie poddawane<br />
są głównie ścieki, wody powierzchniowe, wody gruntowe oraz woda<br />
pitna. Ilość próbki, którą należy pobrać zależy od spodziewanego stężenia<br />
oraz czułości metody analitycznej i waha się od 200 ml do nawet 80 litrów<br />
[36]. Objętość próbki nie powinna przekraczać jednak 5 litrów, gdyż zawarte<br />
w niej kwasy humusowe mogą przeszkadzać w dalszej analizie. Z reguły<br />
wynosi ona od 250 ml do 1000 ml.<br />
Najlepszą metodą przechowywania próbki jest przepuszczenie jej<br />
przez złoże Carbograph-4, przemycie metanolem i przechowywanie metanolowych<br />
roztworów analitów w temperaturze -18°C [39]. Stwierdzono bowiem,<br />
że w takich warunkach związki estrogenowe są stabilne przez minimum<br />
60 dni. Alternatywą może być konserwacja próbki 1% roztworem formaldehydu<br />
i przechowywanie jej w butelkach z ciemnego szkła bursztynowego<br />
w temperaturze 4°C [40]. Wprowadzenie formaldehydu zapobiega<br />
rozwojowi mikroorganizmów, dzięki czemu może być ona stabilna w ciągu<br />
24 dni [41]. Do konserwacji próbki stosuje się także metanol [42], chlorek<br />
rtęci [43] oraz kwas siarkowy [44].<br />
Próbki wód ściekowych przechowywane są z reguły przez 24 godziny<br />
w temperaturze 4°C bez stosowania zabiegów konserwujących. W niektórych<br />
badaniach okres ten przedłuża się do tygodnia [45], albo są one zamrażane<br />
i trzymane do czasu analizy w temp. -20°C [46].<br />
Alternatywną metodą pobierania próbek jest zastosowanie technik<br />
pasywnych, tj. adsorpcji analitów na specjalnych, półprzepuszczalnych<br />
membranach, umieszczonych przez okres od 1 do 10 tygodni w analizowanych<br />
próbkach wody. Zaadsorbowane na nich estrogeny ekstrahuje się następnie<br />
dichlorometanem (100 ml CH 2 Cl 2 na 900 ml wody) i poddaje dalszej<br />
procedurze oczyszczania [47-49]. Zhang i Hibbered testowali membrany<br />
polieterosulfonowe i polisulfonowe do izolacji estrogenów i uznali, iż te<br />
pierwsze są bardziej efektywne [50].<br />
W przypadku badania osadów dennych suszy się je na powietrzu,<br />
przepuszcza przez sita o wielkości porów 0,5 mm i przechowuje do czasu<br />
analizy w temperaturze 0°C (mniej niż 15 godzin) [51]. Inna metoda polega<br />
homogenizacji pobranych osadów, przeniesieniu ich do skrzynek wykona-<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
14 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
nych ze stali nierdzewnej, szczelnym zamknięciu i przechowywaniu w temp.<br />
4°C do czasu analizy [52].<br />
Próbki gleby pobiera się z głębokości 40 cm wycinając 5 cm segmenty,<br />
które następnie łączy się i miesza uzyskując uśrednioną próbkę [53].<br />
Innym rodzajem próbek stałych analizowanych pod kątem obecności<br />
związków estrogenowych są organizmy wodne. I tak na przykład małże płucze<br />
się pod bieżącą wodą przez 10 godzin, wydziela się z nich tkankę<br />
miękką, łączy ją, homogenizuje, a następnie przechowuje w temp. - 20°C<br />
[44].<br />
3.2. Przygotowanie próbki<br />
(Sample preparation)<br />
3.2.1. Filtracja<br />
(Filtration)<br />
Filtracja jest zwykle pierwszym etapem przygotowania próbek wodnych,<br />
szczególnie wtedy gdy izolacja analitów odbywa się za pomocą ekstrakcji<br />
do fazy stałej (SPE, ang. Solid-Phase Extraction). Dzięki temu usuwane<br />
są cząstki stałe, które mogą zapychać złoże. Rodzaj stosowanego<br />
filtra (sączek, włókno szklane, itp.) oraz jego rozmiar zależą od rodzaju oraz<br />
ilości analizowanej próbki. Najczęściej wykorzystuje się filtry szklane o rozmiarach<br />
porów pomiędzy 0,22 a 1,20 μm [35, 36, 52]. Aby uniknąć strat analitów<br />
niektórzy przemywają filtry metanolem (3 - 10 ml), a uzyskany ekstrakt<br />
dołączają do próbki [37, 54]. Czasami usuwanie zawiesin odbywa się poprzez<br />
odwirowanie próbki [55].<br />
3.2.2. Ekstrakcja - wzbogacanie<br />
(Extraction)<br />
Ekstrakcja naturalnych oraz syntetycznych związków estrogenowych z<br />
wodnych próbek środowiskowych odbywa się najczęściej za pomocą SPE.<br />
Ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz (LLE, ang. Liquid-Liquid Extraction) jest<br />
stosowana sporadycznie [35, 36], tak samo jak technika mikroekstrakcji do<br />
fazy stałej (SPME, ang. Solid Phase Microextraction) [11, 31, 44, 56-71]<br />
(patrz Tabela 4). Izolacja estrogenów z próbek stałych przeprowadzana jest<br />
najczęściej z zastosowaniem ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika wspomaganej<br />
ultradźwiękami (UAE, ang. Ultrasound-Assisted Extraction) [46, 70,<br />
72], ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika wspomaganej promieniowaniem<br />
mikrofalowym (MAE, ang. Microwave Assisted Extraction) [69] czy przyspieszonej<br />
ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika (ASE, ang. Accelerated<br />
Solvent Extraction) [73].<br />
Z uwagi na dominujące znaczenie techniki SPE w ekstrakcji estrogenów<br />
z próbek środowiskowych zostanie ona omówiona nieco szerzej.<br />
Do wzbogacania i izolacji analitów wykorzystuje się zarówno kolumienki,<br />
jak i krążki ekstrakcyjne (Tabela 4). Początkowo jako złoże stoso-<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
15<br />
wano krzemionkę modyfikowaną ugrupowaniami oktadecylowymi (C18) [36].<br />
Sorbent ten jest wciąż używany [31, 44, 62, 66, 68], ale coraz częściej zastępuje<br />
się go złożem kopolimerowym polistyrenu i diwinylobenzenu (SDB),<br />
dostępnym jako kolumienki Isolut ENV+ [42, 54] lub jako krążki ekstrakcyjne<br />
SDB-XC [11, 63] oraz złożem kopolimerowym polistyrenu i diwinylobenzenu<br />
modyfikowanym winylopirolidonu (kolumienki Oasis HLB, firmy Waters) [10,<br />
60, 64, 69-71]. Czasami, aby zwiększyć selektywność, stosuje się kombinację<br />
dwóch kolumienek, np. LiChrolut RP18 z LiChlorut EN [65] czy Oasis<br />
HLB z krzemionką lub tlenkiem glinu [70]. Procedura postępowania zależy<br />
od rodzaju analitów i zastosowanego wypełnienia. Doskonałe porównanie<br />
skuteczności ekstrakcji naturalnych oraz syntetycznych związków estrogenowych<br />
z próbek środowiskowych z zastosowaniem różnych złóż i procedur<br />
ekstrakcji SPE przedstawili Lopez de Alba i Balcero [74] oraz Hájková i inni<br />
[72].<br />
Przykładowe procedury ekstrakcji techniką SPE estronu, 17β-estradiolu,<br />
estriolu, 17α-etynylestradiolu i dietylstilbestrolu z wodnych próbek środowiskowych<br />
oraz uzyskane odzyski analitów przedstawiono w Tabeli 2.<br />
Tabela 2. Przykładowe procedury wzbogacania i ekstrakcji za pomocą SPE<br />
oraz uzyskane odzyski estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynylestradiolu<br />
i dietylstilbestrolu z wodnych próbek środowiskowych<br />
Table 2. Examples of SPE extraction procedures and obtained recoveries<br />
of estrone, 17β-estradiol, estriol, 17α-ethynylestradiol, diethylstilbestrol<br />
from environmental water samples<br />
Procedura<br />
ekstrakcji<br />
Extraction<br />
procedure<br />
Kondycjonowa<br />
nie<br />
Conditioning<br />
step<br />
Nanoszenie<br />
próbki<br />
Loading step<br />
Isolute<br />
ENV<br />
[74]<br />
7 ml MeOH<br />
5 ml ACN<br />
5 ml H 2 O<br />
5 ml /min<br />
v = 200 ml<br />
woda<br />
rzeczna<br />
Rodzaj kolumienki Type of SPE cartridges<br />
C18 Oasis<br />
(Honeyw HLB<br />
ell [69]<br />
LiChrolut LiChrolut Burdick<br />
EN RP-18 &<br />
[74] [74] Jackson,<br />
MI,<br />
USA)<br />
[76]<br />
7 ml<br />
MeOH<br />
5 ml ACN<br />
5 ml H 2 O<br />
5 ml /min<br />
v = 200<br />
ml<br />
woda<br />
rzeczna<br />
7 ml<br />
MeOH<br />
5 ml ACN<br />
5 ml H 2 O<br />
5 ml /min<br />
v = 200 ml<br />
woda<br />
rzeczna<br />
3 ml<br />
ACN<br />
3 ml<br />
H 2 O<br />
5 ml/min<br />
v = 200<br />
ml<br />
ścieki<br />
3 ml EtAC<br />
3 ml<br />
MeOH<br />
3 ml H 2 O<br />
(pH<br />
próbki)<br />
15 – 20<br />
ml /min<br />
v = 2000<br />
ml<br />
woda<br />
rzeczna<br />
Oasis HLB<br />
[75]<br />
5 ml<br />
CH 2 Cl 2<br />
5 ml<br />
MTBE (eter<br />
t-butylowometylowy)<br />
5 ml MeOH<br />
5 ml H 2 O<br />
15 ml/min<br />
pH = 2<br />
v = 1000<br />
ml<br />
ścieki<br />
Przemywanie 5 ml H 2 O 5 ml H 2 O 5 ml H 2 O Brak tylko 5 ml H 2 O<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
16 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
Flushing step suszenie Suszenie suszenie danych suszenie Suszenie<br />
5 ml MeOH<br />
5 ml<br />
Wymywanie 2 x 4 ml 2 x 4 ml 2 x 4 ml 3 x 1 ml<br />
3 ml ACN MeOH/MT<br />
Elution step ACN ACN ACN ACN<br />
BE (10/90;<br />
v/v)<br />
Odzysk<br />
Recovery<br />
E1 98<br />
E2 83<br />
E3 38<br />
EE2 89<br />
DES 68<br />
E1 100<br />
E2 90<br />
E3 39<br />
EE2 90<br />
DES 59<br />
E1 100<br />
E2 87<br />
E3 88<br />
EE2 79<br />
DES 58<br />
E1 102<br />
E2 106<br />
E3 106<br />
EE2 106<br />
E1 104<br />
E2 96<br />
E3 97<br />
EE2 87<br />
DES 101<br />
E1 90<br />
E2 92<br />
E3 101<br />
EE2 92<br />
Do elucji analitów stosuje się najczęściej acetonitryl, metanol, bądź<br />
kombinację tych rozpuszczalników z innymi rozpuszczalnikami. Odzysk analizowanych<br />
związków (poza E3 na złożu Isolute ENV i LiChlorut EN) kształtują<br />
się na zadawalającym poziomie tzn. w zakresie 58-104%.<br />
Pomimo, iż w literaturze dostępnych jest szereg procedur wydzielania<br />
i wzbogacania związków estrogenowych techniką SPE często należy dostosować<br />
je do potrzeb aktualnie analizowanych próbek. Dotyczy to w szczególności<br />
konieczności modyfikacji sposobu oczyszczania i elucji analitów.<br />
Jednym ze sposobów optymalizacji procesu SPE jest zastosowanie metody<br />
krzywych przebicia, przy czym należy zaznaczyć iż procedura ta jest bardzo<br />
pracochłonna i wymaga użycia znacznych ilości substancji wzorcowych,<br />
które z reguły nie są tanie (77,78). Doboru odpowiednich warunków oczyszczania<br />
można dokonać także metodami obliczeniowymi, w oparciu o wybrane<br />
parametry fizykochemiczne rozpuszczalników i analitów [79] lub poprzez<br />
badanie odzysku analitów, przy ustalonej arbitralnie (na podstawie<br />
polarności analizowanych związków oraz układu faz SPE) objętości i składu<br />
cieczy czyszczącej matrycę i wymywającej anality [80, 81, 82].<br />
Jedną z nowszych propozycji ekstrakcji naturalnych i syntetycznych<br />
estrogenów z próbek środowiskowych jest zastosowanie techniki mikroekstrakcji<br />
na upakowanym sorbencie (MEPS, ang. Microextraction by Packed<br />
Sorbents) oraz polimerów z nadrukiem molekularnym (MIP, ang. Molecularly<br />
Imprinted Polimer) [83]. Użycie w pełni zautomatyzowanego połączenia<br />
MEPS z dozownikiem zestawu GC-MS, pozwalającym na wprowadzanie<br />
dużych objętości próbki i in-port upochodnienie (system on-line) sprawiło, że<br />
można oznaczać estrogeny w zakresie stężeń ng/L do μg/L dysponując jedynie<br />
800 μL próbki [83].<br />
3.2.2.1. Oczyszczanie ekstraktów<br />
(Extracts purification)<br />
Ekstrakty uzyskane z silnie zanieczyszczonych ścieków, osadów, gleb<br />
czy tkanek ryb bądź skorupiaków, przed analizą właściwą muszą być często<br />
poddane dodatkowemu procesowi oczyszczania. Może być ono przeprowadzone<br />
za pomocą ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz [75], ekstrakcji do fazy<br />
stałej (w kolumience C18 [44, 52, 64], Oasis HLB [76]), chromatografii kolumnowej<br />
ze złożem krzemionkowym [84], chromatografii wykluczania / że-<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
17<br />
lowej stosując wypełnienie CO785 [52], wysokosprawnej chromatografii cieczowej<br />
[85, 86], czy dowolnej kombinacji wymienionych wyżej technik [36].<br />
3.2.3. Hydroliza koniugatów<br />
(Conjugates hydrolysis)<br />
Jak wspomniano, część estrogenów usuwanych z organizmu występują<br />
w formie koniugatów, najczęściej w postaci siarczanów i glukuronianów<br />
[4]. Aby oznaczyć je w środowisku techniką chromatografii gazowej niezbędne<br />
jest przeprowadzenie hydrolizy enzymatycznej tych związków do<br />
postaci wolnych hormonów. Najczęściej posługujemy się enzymem zwanym<br />
glukuronidazą. Zawartość koniugatów w próbce wyznacza się na podstawie<br />
różnicy zawartości estrogenów przed i po hydrolizie [40, 46]. Należy przy<br />
tym pamiętać, że o ile konwersja glukuronianu estradiolu do E2 zachodzi ze<br />
100% wydajnością, to siarczanu estradiolu do E2 jedynie z 30% [40]. Inną<br />
skuteczną metodą uwolnienia estrogenów z koniugatów jest zastosowanie<br />
hydrolizy kwasowej. Porównanie tych dwóch podejść znajduje się m.in. w<br />
publikacji Carignana i Lodgetych’ego [87].<br />
3.2.4. Derywatyzacja<br />
(Derivatization)<br />
Z uwagi na to, że estrogeny mają charakter średnio polarny oraz cechują<br />
się niewielką lotnością, ich bezpośrednia analiza za pomocą chromatografii<br />
gazowej jest rzadko stosowana [10, 68]. Derywatyzację związków<br />
estrogenowych przeprowadza się zatem by zwiększyć lotność i stabilność<br />
termiczną analitów, a tym samym poprawić czułość, selektywność i sprawność<br />
układu chromatograficznego. Najczęściej stosowanymi metodami konwersji<br />
związków estrogenowych w lotne pochodne jest: sililowanie, acylowanie<br />
i alkilowanie (Tabela 4). Na Rys. 2 przedstawiono przykładowe reakcje<br />
upochodnienia 17β-estradiolu.<br />
A)<br />
MSTFA 17β-E2 pochodna trimetylosililowa 17β-E2<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
18 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
B)<br />
C)<br />
PFPA 17β-E2 pochodna acylowa 17β-E2<br />
PFBBr 17β-E2 pochodna alkilowa 17β-E2<br />
Rys. 2. Schemat reakcji upochodnienia 17β-estradiolu odczynnikiem: A) MSTFA (N,O<br />
bis(trimetylosililo)trifluoroacetamid) – sililowanie; B) PFPA (bezwodnik<br />
pentafluoropropionowy) – acylowanie; C) PFBBr (bromek pentafluorobenzylowy) –<br />
alkilowanie.<br />
Fig. 2. Derivatization schematic of 17β-estradiol using: A) MSTFA (N,O<br />
bis(trimethylsilil)trifluoroacetamide) – silylation; B) PFPA (pentafluoropropionic<br />
anhydrate) – acylation; C) PFBBr (pentafluorobenzyl bromide) –alkylation.<br />
Do upochadniania grup hydroksylowych obecnych w strukturze tych związków<br />
stosuje się następujące odczynniki derywatyzujące:<br />
- sililujące: MSTFA [31, 57, 58, 69, 61, 63, 65, 66, 89], mieszaninę 99 %<br />
BSTFA (N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid)+ 1 % TMCS (trimetylochlorosilan)<br />
[10, 44, 60, 62, 64, 70, 71], TMSI (N-trimetylosililoimidazol) [31, 56,<br />
61, 62, 65, 66], MTBSTFA (N-metylo-N-(tert-butylodimetylosilylo)trifluoroacetamid)<br />
[90],<br />
- acylujące: PFPA (bezwodnik pentafluoropropionowy) [88], TFAA (bezwodnik<br />
trifluorooctowy) [57] i HFBI (heptafluorobutyryloimidazol) [59],<br />
- alkilujące: PFBBr (bromek pentafluorobenzylowy) [56].<br />
Różnią się one między sobą reaktywnością względem grup hydroksylowych<br />
przyłączonych do układu aromatycznego i alifatycznego związków estrogenowych<br />
(Tabela 1) oraz stabilnością tworzących się pochodnych. Pochodne<br />
tert-butylodimetylosililowe (t-BDMS) oraz pentafluoropropylowe (PFP), chociaż<br />
tworzą się szybciej i są mniej wrażliwe na hydrolizę niż pochodne trimetylosililowe<br />
(TMS), prowadzą do powstawania monopodstawionych, mniej<br />
lotnych pochodnych, co prowadzi do obniżenia czułości metodyki analitycznej<br />
[91 ,92].<br />
Ważnymi etapami procesu optymalizacji reakcji spochadniania jest:<br />
wybór odczynnika derywatyzującego, jego ilości, czasu reakcji, temperatury,<br />
dodatku katalizatora, czy rodzaju zastosowanego rozpuszczalnika. Przykładowe<br />
procedury upochodnienia hormonów estrogenowych przedstawiono w<br />
Tabeli 3.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
19<br />
Tabela 3. Wybrane procedury konwersji chemicznej związków<br />
estrogenowych do postaci lotnych pochodnych<br />
Table 3. Selected procedures for chemical conversion of estrogen<br />
compounds to volatile derivatives form<br />
Odczynnik<br />
Derivatizin<br />
g agent<br />
Przebieg procedury<br />
Procedure<br />
Literatura<br />
Literature<br />
MSTFA 50 µl MSTFA; 120 min; temp. 60 °C [89]<br />
MSTFA 50 µl MSTFA; 50 µl pirydyny; 30 min; temp. 50 °C [93]<br />
99% BSTFA<br />
+ 1% TMCS<br />
50 µl BSTFA + 1% TMCS; 50 µl pirydyny; 30 min; temp. 50 °C [62]<br />
TMSI 50 µl TMSI; 50 µl pirydyny; 30 min; temp. 50 °C [62]<br />
PFPA<br />
100 µl PFPA; 120 min; temp. 60 °C; - oddmuchanie w<br />
strumieniu azotu; 100 µl n-heksanu<br />
[88]<br />
HFBI<br />
250 µl mieszaniny n-heksan:eter diizopropylowy (1:1, v/v); 20<br />
µl HFBI; 45 min; temp.55 °C<br />
[59]<br />
TFAA 150 µl toluenu; 6 µl TFAA; 5 min; temp. pokojowa [59]<br />
Porównanie różnych metod derywatyzacji związków estrogenowych przedstawiono<br />
w pracy [93]. Najwyższą skutecznością spochadniania związków<br />
estrogenowych zaobserwowano przy użyciu mieszaniny 99 % BSTFA + 1%<br />
TMCS i pirydyny (1:1, v/v) w temperaturze 60 °C przez 30 min. Wykazano<br />
także wysoką efektywność działania mieszaniny MSTFA i pirydyny (1:1, v/v)<br />
przy tym samym czasie reakcji i przy temperaturze 50 °C.<br />
3.3. Rozdzielanie i analiza chromatograficzna<br />
(Chromatographic analysis)<br />
Technika chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas<br />
jest najczęściej wykorzystywana do rozdzielania i analizy związków estrogenowych,<br />
pomimo iż wymagana jest wcześniejsza derywatyzacja analitów<br />
(Tabela 4). Szczególnie układ GC-MS z rejestracją wybranych jonów (SIM,<br />
ang. Single Ion Monitoring) jest powszechnie stosowany [10, 31, 56, 58, 60,<br />
63, 64, 65]. Dzieje się tak dlatego, ponieważ metody immunochemiczne [94-<br />
97] charakteryzują się niższą selektywnością i co za tym idzie kłopotami z<br />
poprawną identyfikacją estrogenów. Podczas rozdzielania I analityki LC-MS<br />
(ang. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) i LC-MS/MS (ang. Liquid<br />
Chromatography-tandem Mass Spectrometry) [98-104], szczególnie gdy<br />
jonizacja próbki odbywa się techniką elektrorozpraszania (ESI, ang. Electrospray<br />
Ionization) obecność wielu substancji w złożonych próbkach środowiskowych<br />
może znacząco modyfikować wyniki [46, 105]. Spowodowane jest<br />
to wpływem substancji interferujących na odpowiedź detektora (jej zmniejszaniem<br />
poprzez supresję jonów, bądź zwiększaniem z powodu nakładania<br />
się sygnałów). W efekcie pojawiają się problemy z powtarzalnością i dokładnością<br />
metodyk (tzw. efekty matrycy). Takie zjawiska są znacznie rzadziej<br />
obserwowane gdy używana jest technika GC-MS. Na korzyść stosowania<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
20 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
układu GC-MS w porównaniu z LC-MS/MS przemawia dodatkowo stosunkowo<br />
łatwa optymalizacja procedury oraz niższy koszt analizy.<br />
3.3.1. Warunki pracy aparatu chromatograficznego<br />
(Operating conditions of chromatographic system)<br />
Do rozdzielenia estrogenów za pomocą GC wykorzystuje się najczęściej<br />
kolumny kapilarne średnio polarne (DB-5, HP-5, BP-5, XTI-5), w której<br />
fazą stacjonarną jest kopolimer 5% fenylu i 95% metylopolisiloksanu (Tabela<br />
4). Niskie granice wykrywalności i oznaczalności analitów techniką GC uzyskuje<br />
się poprzez wprowadzanie do kolumny od 1 do 4 μl próbki bez dzielenia<br />
strumienia (tryb splitless). Jako gaz nośny stosuje się najczęściej hel, a<br />
program temperaturowy, w zależności od rodzaju analitów, mieści się w zakresie<br />
od 50 do 300°C.<br />
3.3.2. Warunki pracy spektrometru mas<br />
(Mass spectrometer operating conditions)<br />
Jonizację próbki przeprowadza się zwykle za pomocą bombardowania<br />
wiązką elektronów o energii 70 eV (EI, ang. Electron Impact Ionization),<br />
chemicznej jonizacji (CI, ang. Chemical Ionization) czasami techniką elektrorozpraszania<br />
(ESI) lub z wykorzystaniem jonizacji chemicznej pod ciśnieniem<br />
atmosferycznym (APCI, ang. Atmospheric Pressure Chemical Ionization)<br />
[35, 36] (Tabela 4). Detekcję można prowadzić w trybie rejestracji jonów<br />
dodatnich (PI, ang. Positive Ions), jonów ujemnych (NI, ang. Negative<br />
Ions), z zastosowaniem zapisu całkowitego prądu jonowego (ang. full scan),<br />
bądź monitorowania wybranych jonów (SIM). Wprowadzenie do układu<br />
detekcyjnego tandemowej spektrometrii mas (układ GC-MS/MS) pozwala na<br />
znaczne obniżenie granic wykrywalności i oznaczalności analizowanych<br />
związków, a także poprawia parametry analizy jakościowej (m.in. poprzez<br />
używanie trybu monitorowania wybranych reakcji fragmentacji (MRM, ang.<br />
Multiple Reaction Monitoring). Gazem kolizyjnym jest wówczas argon o<br />
ciśnieniu 1 x 10 -4 mbar, a energia kolizji dla wszystkich przejść (tranzycji)<br />
wynosi 12 V [np. 106]. Najczęściej stosowanymi układem detekcyjnym jest<br />
potrójny kwadrupol (QqQ), kwadrupol połączony z analizatorem czasu przelotu<br />
(QTof) oraz pułapka jonowa (IT, ang. Ion Trap). Porównując metodę<br />
GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS i LC-MS/MS stwierdzono, iż czułość oznaczeń<br />
wzrasta w kolejności LC-ESI(NI)MS < GC-(EI)MS < GC-(EI)MS/MS ≤ LC-<br />
ESI(NI)MS/MS [94].<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
21<br />
3.4. Wybrane metody oznaczania wybranych związków<br />
estrogenowych w próbkach środowiskowych z wykorzystaniem<br />
techniki GC<br />
(Selected methods for the determination of selected estrogen<br />
compounds in environmental samples using GC)<br />
Zestawienie metodyk oznaczania wybranych substancji estrogenowych<br />
(estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynyloestradiolu, dietylostilbestrolu)<br />
w próbkach środowiskowych wykorzystujących technikę GC przedstawiono<br />
w Tabeli 4.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
Tabela 4. Wybrane metody oznaczania wybranych związków estrogenowych w próbkach środowiskowych wykorzystujących<br />
technikę GC<br />
Table 4. Selected methods for the determination of selected estrogen compounds in environmental samples using<br />
GC technique<br />
Estrogeny naturalne<br />
i syntetyczne<br />
Natural and<br />
synthetic estrogens<br />
E1, 17α-E2,<br />
17β-E2, E3,<br />
EE2<br />
E1, 17β-E2,<br />
EE2, DES<br />
Matryca<br />
Matrix<br />
woda<br />
rzeczna<br />
mięśnie,<br />
ścieki,<br />
woda<br />
morska<br />
Derywatyzacja<br />
Derivatization<br />
Ekstrakcja<br />
Extraction<br />
SPE<br />
(Excelpak<br />
SPE-<br />
ENV/124)<br />
SPE (C18<br />
ENVI-18)<br />
5% PFBBr<br />
(1 h 60 °C)<br />
+ TMSI (30<br />
min, temp.<br />
pokojowa)<br />
BSTFA +<br />
1% TMCS<br />
(1 h, 60 C)<br />
Kolumna<br />
GC<br />
GC column<br />
HP-5MS (30<br />
m x 0,25<br />
mm, 0,25<br />
µm)<br />
DB-5 (30m x<br />
0,32 mm,<br />
0,25 µm)<br />
Metoda detekcji<br />
Type of detection<br />
GC-<br />
(NICI)MS<br />
(SIM)<br />
GC-<br />
(IT)MS/MS<br />
Granica oznaczalności<br />
[ng/L<br />
próbki ciekłe,<br />
ng/g próbki<br />
stałe]<br />
Limit of quantification<br />
[ng/L<br />
liquid samples,<br />
ng/g solid<br />
samples<br />
0,10-0,28 dla<br />
wszystkich<br />
związków<br />
mięśnie: 100-<br />
1000<br />
próbki wodne:<br />
0,5-1,2<br />
Oznaczone<br />
stężenie [ng/L<br />
próbki ciekłe,<br />
ng/g próbki<br />
stałe]<br />
Determined<br />
concentraction<br />
[ng/L liquid<br />
samples, ng/g<br />
solid samples<br />
bd<br />
w mięśniach: <<br />
LOD<br />
w próbkach<br />
wodnych:<br />
1,5 (E1)<br />
1,8 (17β-E2)<br />
< LOD (DES,<br />
EE2)<br />
Literatura<br />
Literature<br />
[56]<br />
[44]<br />
22 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
E1, 17β-E2,<br />
EE2 (+ inne<br />
EDC)<br />
E1, 17β-E2,<br />
EE2, DES, MES<br />
E1, 17β-E2, E3,<br />
EE2, DES, MES<br />
E1, 17β-E2,<br />
17α-E2, E3,<br />
EE2, DES, DIE<br />
ścieki<br />
ścieki<br />
woda<br />
rzeczna<br />
ścieki<br />
wprowadz<br />
ane<br />
i oczyszc<br />
zone<br />
woda<br />
powierzch<br />
niowa,<br />
ścieki<br />
SPE<br />
(Oasis<br />
HLB)<br />
SPME<br />
(85 µm<br />
włókno<br />
poliakryla<br />
nowe)<br />
SPE<br />
(Oasis<br />
HLB)<br />
SPE<br />
BSTFA +<br />
pirydyna (<br />
25 min, 65<br />
°C)<br />
bez<br />
derywatyzac<br />
ji<br />
MSTFA (30<br />
min, 60 °C)<br />
MSTFA (100<br />
min, 85 °C)<br />
HFBA( 5<br />
min, temp.<br />
pokoj.),<br />
TFAA (5<br />
min, temp.<br />
pokoj.)<br />
HP-5MS (30<br />
m x 0,25<br />
mm, 0,25<br />
µm)<br />
BP-5 (30 m<br />
x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
BP-5 (30 m<br />
x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
BP-5 (30 m<br />
x 0,32 mm,<br />
0,17 µm)<br />
DB-XLB (30<br />
m x 0,25<br />
mm, 0,25<br />
µm)<br />
GC-(IT)MS<br />
(SIM)<br />
GC-MS/MS<br />
GC-MS/MS<br />
GC-(EI)MS<br />
GC-<br />
(EI)MS/MS<br />
GC-<br />
(NICI)MS<br />
8,5 (E1)<br />
17,0 (17β-E2)<br />
4,0 (EE2)<br />
7,5 (E1)<br />
27,5 (17β-E2)<br />
17,5 (EE2)<br />
0,2-3,0 dla<br />
wszystkich<br />
związków<br />
2,0 – 6,0 dla<br />
wszystkich<br />
związków<br />
1,0-3,0 dla<br />
wszystkich<br />
związków<br />
wody<br />
powierzchniowe:<br />
0,05-1,0<br />
ścieki płynne:<br />
0,1-1,0<br />
94,7 (E1)<br />
55,0 (17β-E2)<br />
< LOD (EE2)<br />
86,9 (E1)<br />
49,4 (17β-E2)<br />
< LOD (EE2)<br />
bd<br />
30,0 (E1)<br />
3,0 (E2)<br />
< LOD (E3)<br />
30-33 (E1)<br />
3-13 (E2)<br />
< 62 (E3)<br />
bd<br />
[10]<br />
[57]<br />
[69]<br />
[59]<br />
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
23<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
E1, 17β-E2,<br />
EE2 (+inne<br />
EDC)<br />
E1, 17β-E2,<br />
EE2, MES<br />
E1, 17β-E2,<br />
17α-E2, EE2,<br />
E1, EE2<br />
E1, 17β-E2, E3,<br />
EE2<br />
woda<br />
rzeczna,<br />
woda<br />
morska<br />
ścieki<br />
woda<br />
powierzch<br />
niowa,<br />
ścieki<br />
woda<br />
rzeczna<br />
(ujście<br />
rzeki)<br />
woda<br />
rzeczna<br />
SPE<br />
(Oasis<br />
HLB)<br />
UAE<br />
(metanol+<br />
aceton)<br />
krążki<br />
ekstrakcyj<br />
ne SDB-X<br />
SPE<br />
(C18)<br />
krążki<br />
ekstrakcyj<br />
ne SPE<br />
SDB-XC<br />
BSTFA +<br />
1% TMCS<br />
(30 min, 60 -<br />
70 °C)<br />
MSTFA+<br />
TMSI+ DTE<br />
DMDCS (60<br />
min, 60 °C)<br />
BSTFA +<br />
1% TMCS +<br />
pirydyna (30<br />
min, 50 °C)<br />
PFPCl (180<br />
min, 80 °C)<br />
ZB-5 (30 m<br />
x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
XTI-5 (30 m<br />
x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
DB-5MS (30<br />
m x 0,25<br />
mm, 0,25<br />
µm)<br />
DB-5 (30 m<br />
x 0,32 mm,<br />
0,25 µm)<br />
HP-5MS (15<br />
m x 0,25<br />
mm, 0,25<br />
µm)<br />
GC-(IT)MS<br />
(SIM)<br />
GC-<br />
(IT)MS/MS<br />
GC-MS/MS<br />
GC-(EI)MS<br />
GC-<br />
(NICI)MS<br />
(SIM)<br />
1,7 (E1)<br />
3,4 (17β-E2)<br />
0,8 (EE2)<br />
2,0 - 4,0 dla<br />
wszystkich<br />
związków<br />
wody<br />
powierzchniowe:<br />
0,2-0,3 (E1)<br />
0,3-0,6 (17β-E2)<br />
0,1-0,3 (17α-E2)<br />
0,1-0,3(EE2)<br />
ścieki:<br />
0,3-1,0 (E1)<br />
0,5-2,4 (17β-E2)<br />
0,1-1,2 (17α-E2)<br />
0,3-1,8(EE2)<br />
0,05-0,2 (E1)<br />
0,05 (EE2)<br />
0,2 (E1)<br />
0,03 (17β-E2)<br />
0,06 (E3)<br />
0,05(EE2)<br />
5,6 (E1)<br />
11,2 (17β-E2)<br />
2,6 (EE2)<br />
16-37 (E1)<br />
5-49(17β-E2)<br />
2 -17(EE2)<br />
< LOD (MES)<br />
bd<br />
bd<br />
0,2-17 (E1)<br />
0,5-7 (17β-E2)<br />
1,2-3,1 (E3)<br />
[60]<br />
[61]<br />
[11]<br />
[62]<br />
[63]<br />
24 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
E1, 17β-E2, E3,<br />
EE2 (+inne EDC)<br />
E1, 17β-E2, E3,<br />
EE2<br />
E1, 17β-E2<br />
E1, 17β-E2, EE2<br />
E1, 17β-E2 (+<br />
inne EDC)<br />
woda<br />
powierzchn<br />
iowa i<br />
ścieki<br />
woda<br />
rzeczna<br />
i jeziorna,<br />
ścieki<br />
oczyszczon<br />
e<br />
ścieki<br />
wprowadza<br />
ne i<br />
oczyszczon<br />
e<br />
woda<br />
rzeczna<br />
ścieki<br />
SPE (Oasis<br />
HLB)<br />
SPE<br />
(LiChrolut<br />
RP18+<br />
LiChlorut<br />
EN)<br />
SPE (C18)<br />
SPE (C18)<br />
krążki<br />
ekstrakcyjn<br />
e C18 SPE<br />
BSTFA ( 15<br />
min., 60 °C)<br />
MSTFA+<br />
TMSI+ DTE<br />
(1000:2:2,<br />
v:v:w)<br />
MSTFA+TMSI<br />
+<br />
DTE<br />
MSTFA+TMSI<br />
+<br />
DTE<br />
(1000:4:2,<br />
v/v/w)<br />
HFBA ( 90<br />
min., 55 °C)<br />
CP-Sil 8 CB<br />
(30 m x 0,25<br />
mm, 0,25<br />
µm), BPX-5<br />
(30 m x 0,25<br />
mm, 0,25 µm)<br />
XTI-5 (30 m x<br />
0,25 mm, 0,25<br />
µm)<br />
JW DB-5 (60<br />
m x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
CP-Sil 8 (30<br />
m x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
MDN-5S (30<br />
m x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
GC-(EI)MS<br />
(SIM), GC-<br />
MS/MS<br />
GC-(EI)MS<br />
(SIM)<br />
GC-HRMS<br />
GC-(IT)MS<br />
(SIM)<br />
GC-MS/MS<br />
wody<br />
powierzchniowe:<br />
2-10<br />
ścieki: 2-20<br />
0,1-1 (E1)<br />
0,3-0,9 (17β-E2)<br />
0,3-1,5 (E3)<br />
0,2-1 (EE2)<br />
0,7 (E1)<br />
0,8 (17β-E2)<br />
0,5-1,0 dla<br />
wszystkich<br />
związków<br />
12 (E1)<br />
4 (17β-E2)<br />
bd<br />
< 51 (E1)<br />
< 6 (17β-E2)<br />
< 2 (EE2)<br />
ścieki<br />
wprowadzane<br />
19-78 (E1)<br />
2,4-26 (17β-E2)<br />
ścieki<br />
oczyszczone<br />
1-96 (E1)<br />
0,2-14,7 (17β-E2)<br />
1,1,-1,3 (E1)<br />
1,3 (17β-E2)<br />
< LOD (EE2)<br />
0,2 (E1)<br />
0,1 (17β-E2)<br />
[64]<br />
[65]<br />
[66]<br />
[31]<br />
[67]<br />
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
25<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
26 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
UAE +SPE<br />
(Oasis HLB<br />
+kolumienk<br />
a z<br />
krzemionką<br />
lub Al2O3<br />
E1, E2, EE2<br />
E1, E2, EE2<br />
E1, E2, E3, EE2<br />
E1, E2, EE2<br />
woda<br />
powierzchn<br />
iowa,<br />
ścieki<br />
woda<br />
powierzchnio<br />
wa,<br />
ścieki<br />
osad<br />
czynny<br />
woda, osad<br />
SPE (C18)<br />
SPME<br />
SPE (Oasis<br />
HLB) (woda)<br />
MAE<br />
(osad)<br />
bd<br />
MSTFA<br />
BSTFA + 1%<br />
TMCS +<br />
pirydyna<br />
BSTFA +1%<br />
TMCS +<br />
pirydyna<br />
DB-5MS (30<br />
m x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
VF-1 (30 m x<br />
0,32 mm, 0,25<br />
µm)<br />
HP-5MS (30<br />
m x 0,25 mm,<br />
0,25 µm)<br />
Agilent HP-5<br />
30 m x 0,25<br />
mm, 0,25 µm)<br />
GC-<br />
(EI)MS(SIM)<br />
GC-MS(SIM)<br />
GC-(EI)MS<br />
GC-MS/MS<br />
0,041 (E1)<br />
0,046 (E2)<br />
0,031 (EE2)<br />
12 (E1)<br />
5,5 (E2)<br />
30 (EE2)<br />
1,2 (E1)<br />
0,8 (E2)<br />
2,3 (E3)<br />
4,0 (EE2)<br />
0,01-0,49 woda<br />
0,05-0,14 osad<br />
bd<br />
bd<br />
bd<br />
bd<br />
[68]<br />
[58]<br />
[70]<br />
[71]<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
27<br />
4. Podsumowanie<br />
Pomimo, iż do analityki związków estrogenowych w próbkach środowiskowych<br />
stosuje się zarówno metody immunochemiczne jak i bazujące na<br />
chromatografii cieczowej, technika chromatografii gazowej wykorzystywana<br />
jest najczęściej. Dzieje się tak, ponieważ metody immunochemiczne charakteryzują<br />
się niższą selektywnością, natomiast analizy LC-MS i LC-MS/MS<br />
kłopotami z powtarzalnością i dokładnością metody z powodu silnych efektów<br />
matrycy. Takie zjawiska są znacznie rzadziej obserwowane, gdy do<br />
rozdzielania i oznaczania używana jest technika GC-MS z upochodnieniem<br />
przed-kolumnowym i z jonizacją próbki za pomocą wiązki elektronów oraz<br />
detekcją w trybie monitorowania wybranych jonów SIM. Na korzyść stosowania<br />
układu GC-MS w porównaniu z LC-MS/MS przemawia dodatkowo<br />
niższy koszt analizy oraz prostota obsługi aparatury. Wprowadzenie do<br />
układu detekcyjnego tandemowej spektrometrii mas (układ GC-MS/MS)<br />
pozwala na znaczne obniżenie granic wykrywalności (LOD) i oznaczalności<br />
(LOQ) analizowanych związków, a także poprawia parametry analizy jakościowej<br />
(identyfikacji) m.in. poprzez używanie trybu monitorowania wybranych<br />
reakcji fragmentacji (MRM). Najczęściej stosowanymi układami analizatorów<br />
w tandemowej spektrometrii mas jest potrójny kwadrupol (QqQ)<br />
oraz kwadrupol połączony z analizatorem czasu przelotu (QTof). Z uwagi na<br />
średnio polarny charakter analitów oraz ich niską lotność konieczna jest<br />
jednak derywatyzacja analitów. Ponieważ poprawność oznaczeń w dużym<br />
stopniu zależy od sposobu pobierania i przechowywania próbki oraz przygotowania<br />
jej do analizy właściwej, także te etapy procedury analitycznej<br />
muszą być poddane optymalizacji. W pracy przedstawiono najważniejsze<br />
informacje dotyczące metodyk przygotowania próbki, rozdzielania i oznaczania<br />
naturalnych i syntetycznych estrogenów w próbkach środowiskowych<br />
z wykorzystaniem techniki GC, ze szczególnym uwzględnieniem analizy<br />
estronu, 17β-estradiolu, estriolu, 17α-etynyloestradiolu i dietylostilbestrolu.<br />
Summary<br />
Although for the analysis of estrogen compounds in environmental<br />
samples are used both immunochemical methods and based on liquid<br />
chromatography, gas chromatography is used the most often. This is because<br />
the immunochemical methods are characterized by a lower selectivity,<br />
while the analysis of LC-MS and LC-MS/MS by troubles with repeatability<br />
and accuracy of the method because of strong matrix effects. These phenomena<br />
are much less frequently observed when for the separation and<br />
identification GC-MS technique is used with pre-column derivatization and<br />
the ionization of the sample using an electron impact and detection in selected<br />
SIM ion monitoring mode. In favour of the usage of GC-MS in comparison<br />
with LC-MS/MS also speak a lower cost of analysis and ease of<br />
using the apparatus. Introduction to the detection of tandem mass spectrometry<br />
(GC-MS/MS system) enables a significant reduction in the limit of de-<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
28 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
tection (LOD) and quantification (LOQ) of the analysed compounds and also<br />
improves the qualitative analysis (identification), inter alia by using monitoring<br />
mode of selected fragmentation reactions (MRM). The most commonly<br />
used systems of analyzers in tandem mass spectrometry is a triple quadrupole<br />
(QQQ) and quadrupole connected to the analyser of the time of flight<br />
(QTof). Due to the medium polar nature of the analytes and their low volatility<br />
however, derivatization of analytes is required. Since the correctness of<br />
determination to a large extent depends on method of collecting sample, its<br />
storage and preparing it for proper analysis, also those steps of the analytical<br />
procedure must be subjected to optimization. The paper presents key<br />
information about the methodology of sample preparation, separation and<br />
identification of natural and synthetic estrogens in environmental samples<br />
using GC technique, with particular emphasis on the analysis of estrone,<br />
17ß -estradiol, estriole, 17α-ethinylestradiol and diethylstillbestrol.<br />
Podziękowania<br />
(Acknowledgements)<br />
Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego w<br />
ramach projektu badawczego numer N N204 260237 (2009-2012) oraz<br />
funduszu DS 8110-4-0085-1.<br />
Financial support was provided by the Polish Ministry of Research and<br />
Higher Education under grants N N204 260237 (2009-2012) and DS 8110-4-<br />
0085-1.<br />
Literatura<br />
(References)<br />
1. W. Kostowski, Z.S. Herman, „Farmakologia. Podstawy farmakoterapii”<br />
(polish), Pharmacology. Grounds for pharmacotheraphy Tom 1,<br />
Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2003.<br />
2. A. Zejc, M. Gorczyca, „Chemia leków”, Drugs chemistry Wydawnictwo<br />
Lekarskie PZWL, Warszawa 2002.<br />
3. M. Pawlikowski, „Leczenie hormonami i pochodnymi hormonów”,<br />
Treatment with hormones and hormone derivatives Wydawnictwo<br />
Lekarskie PZWL, Warszawa 1996.<br />
4. D.S. Aga, Fate of Pharmaceuticals in the Environment and in Water<br />
Treatment Systems, CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton<br />
2008.<br />
5. V. Gabet, C. Miege, P. Bados, M. Coquery, Analysis of estrogens in<br />
environmental matrices. Trends Anal. Chem., 26(2007)1113.<br />
6. J. Carpinteiro, J.B. Quintana, I. Rodriguez, A.M. Carro, R.A. Lorenzo, R.<br />
Cela, Applicability of solid-phase microextraction followed by on-fiber<br />
silylation for the determination of estrogens in water samples by gas<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
29<br />
chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A,<br />
1056(2004)179.<br />
7. G. Rajtar-Cynke, „Farmakologia. Podręcznik dla studentów i<br />
absolwentów wydziału pielęgniarstwa i nauk o zdrowiu akademii<br />
medycznych”, Pharmacology. Textbook for students and graduates of<br />
the department of nursing and health sciences academy of medical<br />
Wydawnictwo Czelej, Lublin 2002.<br />
8. W. Jańca, „Kompendium farmakologii”, Compendium of pharmacology,<br />
Wyd. 2, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2006.<br />
9. S.J. Khan, D.J. Roser, C.M. Davies, G.M. Peters, R.M. Stuetz, R.<br />
Tucker, N.J. Ashbolt, Chemical contaminants in feedlot wastes:<br />
Concentrations, effects and attenuation, Environ. Int., 34(2008)839.<br />
10. M.D. Hernando, M. Mezcua, M.J. Gómez, O. Malato, A. Aguera, A.R.<br />
Fernandez-Alba, Comparative study of analytical methods involving gas<br />
chromatography-mass spectrometry after derivatization and gas<br />
chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of<br />
selected endocrine disrupting compounds in wastewaters, J.<br />
Chromatogr. A, 1047(2004)129.<br />
11. A.C. Belfroid, A. Van der Horst, A.D. Vethaak, A.J. Schafer, G.B.J. Rijs,<br />
J. Wegener, W.P. Cofino, Analysis of estrogenic hormones and their<br />
glucuronides in surface water and waste water in The Netherlands, Sci.<br />
Total Environ., 225(1999)101.<br />
12. E. Vulliet, L. Wiest, R. Baudot, M.-F. Grenier-Loustalot, Multi-residue<br />
analysis of steroids at sub-ng/L levels in surface and ground-waters<br />
using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, J.<br />
Chromatogr. A, 1210(2008)84.<br />
13. K. Kozłowska-Tylingo, J. Namieśnik, Hormony płciowe w środowisku,<br />
zagrożenia, jakie niosą ze sobą, Sex hormones in the environment,<br />
threats posed by them, Analityka, 1(2009)52.<br />
14. T. Hintemann, C. Schneider, H.F. Scholer, R.J. Schneider, Field study<br />
using two immunoassays for determination of estradiol and<br />
ethinylestradiol in the aquatic environment, Water Res., 40(2006)2287.<br />
15. H. Segner, K. Caroll, M. Fenske, C.R. Janssen, G. Maack, D. Pascoe,<br />
C. Schafers, G.F. Vandenbergh, M. Watts, A. Wenzel, Identification of<br />
endocrine-disrupting effects in aquatic vertebrates and invertebrates:<br />
report from the European IDEA project. Ecotoxicol. Environ. Safety,<br />
54(2003)302.<br />
16. J.L. Parrott, B.R. Blunt, Life-cycle exposure of fathead minnows<br />
(Pimephales promelas) to an ethinylestradiol concentration below 1<br />
ng/L reduces egg fertilization success and desmasculinizes males,<br />
Environ. Toxicol., 20(2005)131.<br />
17. S. Orn, H. Holbech, T.H. Madsen, L. Norrgren, G.I. Petersen, Gonad<br />
development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio)<br />
exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone, Aquat. Toxicol.,<br />
65(2003)397.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
30 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
18. L.J. Mills, C. Chichester, Review of evidence: Are endocrine-disrupting<br />
chemicals in the aquatic environment impacting fish populations?, Sci.<br />
Total Environ., 343(2005)1.<br />
19. H. Xu, J. Yang, Y. Wang, Q. Jiang, H. Chen, H. Song, Exposure to 17-<br />
ethynylestradiol impairs reproductive functions of both male and female<br />
zebrafish (Danio rerio), Aquat. Toxicol., 88(2008)1.<br />
20. Y. Jin, R. Chen, W. Liu, Z. Fu, Effect of endocrine disrupting chemicals<br />
on the transcription of genes related to the innate immune system in the<br />
early developmental stage of zebrafish (Danio rerio), Fish Shellfish<br />
Immunol., 28(2010)854.<br />
21. E.F. Orlando, L.J. Guillette, Sexual dimorphic responses in wildlife<br />
exposed to endocrine disrupting chemicals, Environ. Res.,<br />
104(2007)163.<br />
22. J.A. Jukosky, M.C. Watzin, J.C. Leiter, Elevated concentrations of<br />
ethinylestradiol, 17-estradiol, and m edroxyprogesterone have little<br />
effect on reproduction and survival of Ceriodaphnia dubia, Environ.<br />
Contam. Toxicol., 81(2008)230.<br />
23. D.G.J. Larsson, M. Adolfsson-Erici, J. Parkkonen, M. Pettersson, A.H.<br />
Berg, P.-E. Olsson, L. Forlin, Ethinylestradiol—an undesired fish<br />
contraceptive? Aquat. Toxicol., 45(1999)91.<br />
24. G.P. Daston, J.W. Gooch, W.J. Breslin. D.L. Shuey, A.I. Nikiforov, T.A.<br />
Fico, J.W. Gorsuch, Environmental estrogens and reproductive health:<br />
a discussion of the human and environmental data, Reprod. Toxicol.,<br />
11(1997)465<br />
25. U. Wrzeciono, L. Zaprutko, „Chemia związków naturalnych”, Chemistry<br />
of natural compounds, AM Poznań, Poznań 2001.<br />
26. M. Dudziak, M. Bodzek, Removal of Estrogens by Nanofiltration,<br />
Ochrona Środowiska, 27(2005)9.<br />
27. U.S. Department of Health and Human Services, Report on<br />
Carcinogens, Eleventh Edition, Public Health Service, National<br />
Toxicology Program, Washington 2005.<br />
28. http://www.drugbank.ca<br />
29. http://toxnet.nlm.nih.gov<br />
30. www.OSHA.gov<br />
31. M. Dudziak, K. Luks-Betlej, Ocena obecności estrogenów -<br />
steroidowych hormonów płciowych - w wybranych wodach rzecznych w<br />
Polsce, Assessment of estrogen - steroid hormones - in selected waters<br />
of the river in Poland, Ochrona Środowiska, 26(2004)21.<br />
32. J. McMurry, „Chemia organiczna”, Organic Chemistry, Tom 3,<br />
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005.<br />
33. J.K. Podlewski, A. Chwalibogowska-Podlewska, „Leki współczesnej<br />
terapii. Encyklopedia dla Lekarzy i Farmaceutów”, Medication therapy<br />
today. Encyclopedia for Physicians and Pharmacists, Wyd. 19, Medical<br />
Tribune Polska, Warszawa 2009.<br />
34. M. Petrović, D. Barceló, Analysis, fate and removal of pharmaceuticals<br />
in the water cycle, Wilson&Wilson’s, Amsterdam, Boston, Heidelberg,<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
31<br />
Londyn, Nowy Jork, Oxford, Paryż, San Diego, San Francisco,<br />
Singapur, Sydney, Tokio 2007.<br />
35. R.D. Briciu, A. Kot-Wasik, J. Namieśnik, Analytical Challenges and<br />
Recent Advances in the Determination of Estrogens in Water<br />
Environments, J. Chromatogr. Sci., 47(2009)127.<br />
36. M.J. López de Alda, D. Barceló, Review of analytical methods for the<br />
determination of estrogens and progestogens in waste waters,<br />
Fresenius J. Anal. Chem., 371(2001)437.<br />
37. T. Reemtsma, The use of liquid chromatography-atmospheric pressure<br />
ionization-mass spectrometry in water analysis - Part II: Obstacles<br />
Trends Anal. Chem., 20(2001)533.<br />
38. Commision Decision 2002/657/EC implementing Council Directive<br />
96/23/EC concerning the performance of analytical methods and<br />
interpretation of results, European Union, Brussels, 2002, pp. 66<br />
(available at http://europe.eu.int).<br />
39. C. Baronti, R. Curini, G. D’Ascenzo , A. Di Corcia, D. Centili, R.<br />
Samperi, Monitoring natural and synthetic estrogen at activated sludge<br />
treatment plants and in receiving river water, Environ. Sci. Technol.,<br />
34(2000)5059.<br />
40. C.-H. Huang, , D.L. Sedlak, Analysis of estrogenic hormones in<br />
municipal wastewater effluent and surface water using enzyme-linked<br />
immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass<br />
spectrometry, Environ. Toxicol. Chem., 20(2001)133.<br />
41. J. Hu, H. Zhang, and H. Chang, Improved method for analyzing<br />
estrogens in water by liquid chromatography–electrospray mass<br />
spectrometry. J. Chromatogr. A ,1070(2005)221.<br />
42. C. Desbrow, E.J. Routledge, G.C.Brighty, J.P. Sumpter, M. Waldock,<br />
Identification of Estrogenic Chemicals in STW Effluent. 1. Chemical<br />
Fractionation and in Vitro Biological Screening, Environ. Sci. Technol.,<br />
32(1998)1549.<br />
43. R. Siegener, R.F. Chen, Detection of pharmaceuticals entering Boston<br />
Harbor. In Analysis of Environmental Endocrine Disruptors, ACS Symp.<br />
Ser., 747(2000)125.<br />
44. G. Saravanabhavan, R. Helleur, J.Hellou, GC–MS/MS measurement of<br />
natural and synthetic estrogens in receiving waters and mussels close<br />
to a raw sewage ocean outfall, Chemosphere, 76(2009)1156.<br />
45. H.M. Kuch, K. Ballschmiter, Determination of endogenous and<br />
exogenous estrogens in effluents from sewage treatment plants at the<br />
ng/L-level, Fresenius J. Anal. Chem. 366(2000)392.<br />
46. G.G.J. Larsson, M. Adolfsson-Erici, J. Parkkonen, M. Pettersson, A.H.<br />
Berg, P.-E. Olsson, L. Förlin, Ethinyloestradiol — an undesired fish<br />
contraceptive?, Aquat. Toxicol., 45(1999)91.<br />
47. D.A. Alvarez, J.D. Petty, J.N. Huckins, T.L. Jones-Lepp, D.T. Getting,<br />
J.P. Goddard. Development of a passive, in situ, integrative sampler for<br />
hydrophilic organic contaminants in aquatic environments, Environ.<br />
Toxicol. Chem., 23(2004)1640.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
32 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
48. D.A. Alvarez, P.E. Stackelberg, J.D. Petty, J.N. Huckins, E.T. Furlong,<br />
S.D. Zaugg, Comparison of a novel passive sampler to standard watercolumn<br />
sampling for organic contaminants associated with wastewater<br />
effluents entering a New Jersey stream, Chemosphere, 61(2005)610.<br />
49. A. Arditsoglou, D. Voutsa, Passive sampling of selected endocrine<br />
disrupting compounds using polar organic chemical integrative<br />
samplers, Environ. Poll., 156(2008)316.<br />
50. Z. Zhang, A. Hibberd, J.L. Zhou, Analysis of emerging contaminants in<br />
sewage effluent and river water: Comparison between spot and passive<br />
sampling, Anal. Chim. Acta, 607(2008)37.<br />
51. Y. Yu, L. Wu, Analysis of endocrine disrupting compounds,<br />
pharmaceuticals and personal care products in sewage sludge by gas<br />
chromatography–mass spectrometry, Talanta (2011),<br />
doi:10.1016/j.talanta.2011.12.023.<br />
52. B. Lei, S. Huang, Y. Zhou, D. Wang, Z. Wang, Levels of six estrogens<br />
in water and sediment from three rivers in Tianjin area, China,<br />
Chemosphere, 76(2009)36.<br />
53. J. Xu, L. Wu, W. Chen and A. C. Chang, Simultaneous determination of<br />
pharmaceuticals, endocrine disrupting compounds and hormone in soils<br />
by gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A,<br />
1202(2008)189.<br />
54. A.C. Johnson, A. Belfroid, A. Di Corcia, Estimating steroid oestrogen<br />
inputs to activated sludge treatment works and observations on their<br />
removal from the effluent, Sci. Total Environ., 256(2000)163.<br />
55. L.S. Shore, M. Gurevitz, M. Shemesh, Estrogen as an environmental<br />
pollutants. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 51(1993)361.<br />
56. S. Rodriguez-Mozaz, M-P. Marco, M.J. Lopez de Alda, D. Barcelo,<br />
Biosensors for environmental monitoring of endocrine disruptors: a<br />
review article, Anal. Bioanal. Chem., 378(2004)588.<br />
57. J. Carpinteiro, J.B. Quintana, I. Rodriguez, A.M. Carro, R.A. Lorenzo, R.<br />
Cela, Applicability of solid-phase microextraction followed by on-fiber<br />
silylation for the determination of estrogens in water samples by gas<br />
chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A,<br />
1056(2004)179.<br />
58. S. Zorita, P. Hallgren, L. Mathiasson, Steroid hormone determination in<br />
water using an environmentally friendly membrane based extraction<br />
technique, J. Chromatogr. A, 1192(2008)1.<br />
59. O. Lerch, P. Zinn, Derivatisation and gas chromatography-chemical<br />
ionization mass spectrometry of selected synthetic and natural<br />
endocrine disruptive chemicals, J. Chromatogr. A, 991(2003)77.<br />
60. R. Liu, J.L. Zhou, AS. Wilding, Simultaneous determination of endocrine<br />
disrupting phenolic compounds and steroids in water by solid-phase<br />
extraction-gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A,<br />
1022(2004)179.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
33<br />
61. T. Ternes, H. Andersen, D. Gilberg, M. Bonerz, Determination of<br />
estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS,<br />
Anal. Chem., 74(2002)3498.<br />
62. K. Zhang, Y Zuo, Pitfalls and solution for simultaneous determination of<br />
estrone and 17α-ethinyloestradiol by gas chromatography-mass<br />
spectrometry after derivatization with N,Obis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,<br />
Anal. Chim. Acta, 554(2005)190.<br />
63. X-Y. Xia, D.V. McCalley, J. McEvoy, Analysis of estrogens in river water<br />
and effluents using solid-phase extraction and gas-chromatography –<br />
negative chemical ionization mass spectrometry of the<br />
pentafluorobenzoyl derivatives, J. Chromatogr. A, 923(2001)195.<br />
64. R. Jeannot, H. Sabik, E. Sauvard, T. Dagnac, K. Dohrendorf,<br />
Determination of endocrine-disrupting compounds in environmental<br />
samples using gas and liquid chromatography with mass spectrometry,<br />
J. Chromatogr. A, 974(2002)143.<br />
65. H.-R. Aerni, B. Kobler, B.V. Rutishauser, F.E. Wettstein, R. Fisher, W.<br />
Giger, A. Hungerbuhler, M.D. Marazuela, A. Peter, R. Schonenberger,<br />
A.C. Vogeli, M.J.-F. Suter, R.I.L. Eggen, Combined biological and<br />
chemical assessment of estrogenic activities in wastewater treatment<br />
plants effluents, Anal. Bioanal. Chem., 378(2004)688.<br />
66. M.R. Servos, D.T. Bennie, B.K. Burnison, A. Jurkovic, R. McInnis, T.<br />
Neheli, A. Schnell, P. Seto, S.A. Smyth, T.A. Ternes, Distribution of<br />
estrogens, 17β-estradiol and estrone, in Canadian municipal<br />
wastewater treatment plants, Sci. Total Environ., 336(2005)155.<br />
67. E.P. Kolodziej, J.L. Gray, D.L. Sedlak, Quantification of steroid<br />
hormones with pheromonal properties In municipal wastewater effluent,<br />
Environ. Toxicol. Chem., 22(2003)2622.<br />
68. R. Hu, L. Zhang, Z. Yang, Picogram determination of estrogens in water<br />
using large volume injection gas chromatography–mass spectrometry,<br />
Anal. Bioanal. Chem., 390(2008)349.<br />
69. J.B. Quintana, J. Carpinteiro, I. Rodriguez , R.A. Lorenzo, A.M. Carro,<br />
R. Cela, Determination of natural and synthetic estrogens in water by<br />
gas chromatography with mass spectrometric detection, J. Chromatogr.<br />
A, 1024(2004)177.<br />
70. Y. Nie, Z. Qiang, H. Zhang, C. Adams, Determination of endocrinedisrupting<br />
chemicals in the liquid and solid phases of activated sludge<br />
by solid phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry,<br />
J. Chromatogr. A, 1216(2009)7071.<br />
71. . A. Hibberd, K. Maskaoui, Z. Zhang, J.L. Zhou, An improved method for<br />
the simultaneous analysis of phenolic and steroidal estrogens in water<br />
and sediment, Talanta, 77(2009)1315.<br />
72. K. Hájková, J. Pulkrabová, J. Schůrek, J. Hajšlová, J. Poustka, M.<br />
Nápravníková, V. Kocourek, Novel approaches to the analysis of steroid<br />
estrogens in river sediments, Anal. Bioanal. Chem., 387(2007)1351.<br />
73. S. Combalbert, M.L. Pype, N. Bernet ,G.Hernandez-Raquet, Enhanced<br />
methods for conditioning, storage, and extraction of liquid and solid<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
34 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
samples of manure for determination of steroid hormones by solidphase<br />
extraction and gas chromatography–mass spectrometry, Anal.<br />
Bioanal. Chem., 398(2010)973.<br />
74. M.J. Lopez de Alda, D. Barcelo, Use of solid-phase extraction in various<br />
of its modalities for sample preparation in the determination of<br />
estrogens and progestogens in sediment and water, J. Chromatogr. A,<br />
938(2001)145.<br />
75. R.A. Trenholm, B.J. Vanderford, J.C. Holady, D.J. Rexing, S. A. Snyder,<br />
Broad range analysis of endocrine disruptors and pharmaceuticals<br />
using gas chromatography and liquid chromatography tandem mass<br />
spectrometry, Chemosphere, 65(2006)1990.<br />
76. A. Karnjanapiboonwong, J.G. Suski, A.A. Shah, Qi. Cai, A.N. Morse,<br />
T.A. Anderson, Occurrence of PPCPs at a Wastewater Treatment Plant<br />
and in Soil and Groundwater at a Land Application Site, Water Air Soil<br />
Pollut., 216(2011)257.<br />
77. Zarzycki P.K., Kulhanek K.M., Smith R., Clifton V.L., Determination of<br />
steroids in human plasma using temperature-dependent inclusion<br />
chromatography for metabolomic investigations, J. Chromatogr. A,<br />
1104(2006)203.<br />
78. Zarzycki P.K., Simple horizontal chamber for thermostated microthinlayer<br />
chromatography, J. Chromatogr. A, 1187(2008)250.<br />
79. Zarzycki P.K, Włodarczyk E., Zarzycka M.B., Głód B.K., Optimization of<br />
a solid-phase extraction protocol for fractionation of selected steroids<br />
using retention data from micro thin-layer chromatography, Anal. Sci.,<br />
25(2009)935.<br />
80. Zarzycki P.K., Wybrane elementy teorii i praktyki chromatografii<br />
cieczowej, Monografia Wydziału Budownictwa i Inżynierii Środowiska,<br />
Nr 26, Wydawnictwo Uczelniane Politechniki Koszalińskiej, Koszalin<br />
2006.<br />
81. M.B. Zarzycka, Wykorzystanie danych retencyjnych uzyskanych przy<br />
pomocy techniki mikro-TLC w doborze warunków procesu ekstrakcji do<br />
fazy stałej (SPE) prowadzonej z użyciem faz odwróconych (Application<br />
of retention data derived from micro-TLC plates for optimization of a<br />
reversed phase solid-phase extraction protocol), Camera Separatoria,<br />
3(2011)129,<br />
82. P.K. Zarzycki, M.M. Ślączka, M.B. Zarzycka, M.A. Bartoszuk, E.<br />
Włodarczyk, M.J. Baran, Temperature-controlled micro-TLC: A versatile<br />
green chemistry and fast analytical tool for separation and preliminary<br />
screening of steroids fraction from biological and environmental samples,<br />
J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 127(2011) 418.<br />
83. A. Prieto, A. Vallejo, O. Zuloaga, A. Paschke, B. Sellergen, E. Schillinger,<br />
S. Schrader, M. Möder, Selective determination of estrogenic compounds<br />
in water by microextraction by packed sorbents and a molecularly<br />
imprinted polymer coupled with large volume injection-in-port-derivatization<br />
gas chromatography–mass spectrometry, Anal. Chim. Acta,<br />
703(2011)41.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych…<br />
35<br />
84. H.M. Kuch, K. Ballschmiter, Determination of endogenous and exogenous<br />
estrogens in effluents from sewage treatment plants at the ng/Llevel,<br />
Fresenius J. Anal. Chem., 366(2000)392.<br />
84. T.P. Rodgers-Gray, S. Jobling, S. Morris, C. Kelly, S. Kirby, A. Janbakhsh,<br />
J.E. Harries, M.J. Waldock, J.P. Sumpter, C.R. Tyler, Longterm<br />
temporal changes in the estrogenic composition of treated sewage<br />
effluent and its biological effects on fish, Environ. Sci. Technol.,<br />
34(2000)1521.<br />
86. S.A. Snyder, T.L. Keith, D.A. Verbrugge, E.M. Snyder, T.S. Gross, K.<br />
Kannan, J.P. Giesy, Analytical methods for detection of selected estrogenic<br />
compounds in aqueous mixtures, Environ. Sci. Technol.,<br />
33(1999)2814.<br />
87. G. Carignan, B.A. Lodge, Comparison of acidic and enzymatic hydrolysis<br />
procedures for identification of natural estrogens in pharmaceutical<br />
preparations, J. Pharmac. Sci. 69(1980) 1453–1454.<br />
88 X. Peng, Z. Wang, C. Yang, C. Fanrong, B. Mai, Simultaneous<br />
determination of endocrine-disrupting phenols and steroid estrogens in<br />
sediment by gas chromatography mass spectrometry, J. Chromatogr.<br />
A, 1116(2006)51.<br />
89. J. Beck, K.U. Totsche, I. Kogel-Knabner, A rapid and efficient<br />
determination of natural estrogens in soils by pressuried liquid extraction<br />
and gas chromatography-mass spectrometry, Chemosphere,<br />
71(2008)954.<br />
90. A. Shareef, C.J. Parnis, M.J. Angove, J.D. Wells, B.B. Johnson.<br />
Suitability of N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide and N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide<br />
as derivatization reagents for<br />
the determination of the estrogens estrone and 17 -ethinylestradiol by<br />
gas chromatography-mass spectrometry, J Chromatogr A,<br />
1026(2004)295.<br />
91. H.G.J. Mol, S. Sunarto, O.M. Steijger, Determination of endocrine<br />
disruptors in water after derivatization with N-methyl-N-(tertbutyldimethyltrifluoroacetamide)<br />
using gas chromatography with mass spectrometric<br />
detection, J. Chromatogr. A; 879(2000)97.<br />
92. H.B. Lee, T.E. Peart, Determination of 17β-estradiol and its metabolites<br />
in sewage effluent by solid-phase extraction and gas chromatography/mass<br />
spectrometry, J. AOAC Int., 81(1998)1209.<br />
93. J. Kumirska, N. Migowska, M. Caban, A. Plenis, P.Stepnowski, Chemometric<br />
analysis for optimizing derivatization in GC-based procedures, J.<br />
Chemometrics, 25(2011)636.<br />
94. C. Bicchib, T. Schiliròa, C. Pignataa, E. Feaa, C. Corderob, F. Canaleb,<br />
G. Gillia, Analysis of environmental endocrine disrupting chemicals using<br />
the E-screen method and stir bar sorptive extraction in wastewater<br />
treatment plant effluents, Sci. Total Environ., 407(2009)1842.<br />
95. H.M. Coleman, M. Troester, S.J. Khan, J.A. McDonald, G. Watkins,<br />
R.M. Stuetz, Assessment of trace organic chemical removal by mem-<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
36 J. Kumirska, M. Potrykus, N. Migowska, E. Mulkiewicz<br />
brane bioreactor using gas chromatography/mass spectrometry and<br />
yeast screen bioassay, Environ. Toxicol. Chem., 28(2009)2537.<br />
96. G.H. Lu, W.T. Song, C. Wang, Z.H. Yan, Assessment of in vivo estrogenic<br />
response and the identification of environmental estrogens in the<br />
Yangtze River (Nanjing section), Chemosphere, 80(2010)982.<br />
97. M. Avberšek, B. Žegura, M. Filipič, E. Heath, Integration of GC-MSD<br />
and ER-Calux® assay into a single protocol for determining steroid estrogens<br />
in environmental samples, Sci. Total Environ., 409(2011)5069.<br />
98. S. Kinani, S. Bouchonnet, N. Creusot, S. Bourcier, P. Balaguer, J.-M.<br />
Porcher, S. Aït-Aïssa, Bioanalytical characterisation of multiple endocrine-<br />
and dioxin-like activities in sediments from reference and impacted<br />
small rivers, Environ. Pollution., 158(2010)74.<br />
99. S. Kinani, S. Bouchonnet, N. Creusot, S. Bourcier, P. Balaguer, J.-M.<br />
Porcher, S. Aït-Aïssa, Bioanalytical characterisation of multiple endocrine-<br />
and dioxin-like activities in sediments from reference and impacted<br />
small rivers, Environ. Pollution., 158(2010)74.<br />
100. H. Noppe, K. Arijs, K. De Wasch, S. Van Cruchten, S. Poelmans, D.<br />
Courtheyn, E. Cobbaert, W. Gillis, P. Vanthemsche, H.De Brabander,<br />
C. Janssen, N. Van Hoof, Biological and Chemical Approaches for the<br />
Detection and Identification of Illegal Estrogens in Water-based Solutions,<br />
Veter. Res. Commun., 30(2006)577.<br />
101. L. Viganò, E. Benfenati, A. van Cauwenberge, J.K. Eidem, C. Erratico,<br />
A. Goksøyr, W. Kloas, S. Maggioni, A. Mandich, R. Urbatzka, Estrogenicity<br />
profile and estrogenic compounds determined in river sediments<br />
by chemical analysis, ELISA and yeast assays, Chemosphere,<br />
73(2008)1078.<br />
102. R. Jeannota, H. Sabik, E.Sauvard, T. Dagnac, K. Dohrendorf,<br />
Determination of endocrine-disrupting compounds in environmental<br />
samples using gas and liquid chromatography with mass spectrometry,<br />
J. Chromatogr. A, 974(2002)143.<br />
103. M.S. Díaz-Cruz, M.J. López de Alda, R. López, D. Barceló, Determination<br />
of estrogens and progestogens by mass spectrometric techniques<br />
(GC/MS, LC/MS and LC/MS/MS), J. Mass Spectrom., 38(2003)917.<br />
104. J.B. Gadd, L.A. Tremblay, G.L. Northcott, Steroid estrogens, conjugated<br />
estrogens and estrogenic activity in farm dairy shed effluents, Environ.<br />
Pollut., 158(2010)730.<br />
105. E. Heath, T. Kosjek, H.R. Andersen, H.-C. Holten Lützhøft, M. Adolfson<br />
Erici, M. Coquery, R.-A. Düring, O. Gans, C. Guignard, P. Karlsson, F.<br />
Manciot, Z. Moldovan, D. Patureau, L. Cruceru, F. Sacherm, A. Ledin,<br />
Inter-laboratory exercise on steroid estrogens in aqueous samples, Environ.<br />
Pollution, 158(2010)658.<br />
106. K.A. Fenlon, A.C. Johnson, C.R. Tyler, E.M. Hill, Gas–liquid<br />
chromatography–tandem mass spectrometry methodology for the<br />
quantitation of estrogenic contaminants in bile of fish exposed to<br />
wastewater treatment works effluents and from wild populations, J.<br />
Chromatogr.A,1217(2010)112<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
CAMERA SEPARATORIA<br />
Volume 4, Number 1 / January 2012, 37-59<br />
Natalia MIGOWSKA*, Jolanta KUMIRSKA<br />
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii,<br />
Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka, Zakład Analizy Środowiska,<br />
ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk<br />
e-mail: natalia@chem.univ.gda.pl<br />
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących<br />
do izolacji i/lub wzbogacania pozostałości wybranych<br />
farmaceutyków w próbkach środowiskowych<br />
Streszczenie: Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w próbkach środowiskowych jest<br />
zadaniem trudnym, ze względu na fakt, iż często stężenie zanieczyszczeń w próbce znacznie<br />
przewyższa stężenie szukanych związków. Postęp w dziedzinie technik izolacji i wzbogacania<br />
analitów, który nastąpił w przeciągu kilkunastu lat, sprawił, iż obecnie analityka dysponuje<br />
szeregiem technik, które mogą być wykorzystane do ekstrakcji wybranych związków. W pracy<br />
dokonano przeglądu zastosowań innowacyjnych metod ekstrakcji takich jak ekstrakcja<br />
z wykorzystaniem polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym, mikroekstrakcja do fazy<br />
stacjonarnej, ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego oraz mikroekstrakcja<br />
poprzez membranę do fazy ciekłej do oznaczania pozostałości farmaceutyków w próbkach<br />
środowiskowych.<br />
Słowa kluczowe: pozostałości farmaceutyków, próbki środowiskowe, techniki izolacji<br />
i wzbogacania, ekstrakcja z wykorzystaniem polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym,<br />
mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej, ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego,<br />
mikroekstrakcja poprzez membranę do fazy ciekłej<br />
Application of some innovative techniques for the isolation<br />
and enrichment of selected pharmaceutical residues in<br />
environmental samples<br />
Abstract: This paper focuses on the application of novel extraction techniques such as<br />
Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction, Solid-Phase Microextraction, Stir Bar Sorptive<br />
Extraction and Hollow-Fiber Liquid-Phase Microextraction used for isolation and enrichment of<br />
pharmaceutical residues in environmental samples. Determination of pharmaceutical residues<br />
in such complex matrix is a difficult task, due to the fact that the concentration of the matrix<br />
impurities are much higher than analytes. A great progress in extraction approaches, which has<br />
occurred within a few years, means that the analysts have a number of techniques that can be<br />
used for the extraction of selected compounds.<br />
Key words: pharmaceutical residues, environmental samples, Molecularly Imprinted Solid-<br />
Phase Extraction, Solid-Phase Microextraction, Stir Bar Sorptive Extraction and Hollow-Fiber<br />
Liquid-Phase Microextraction
38 N. Migowska, J. Kumirska<br />
1. Wstęp<br />
(Introduction)<br />
Przemysł farmaceutyczny - mało podatny na wahania i kryzysy gospodarcze<br />
- jest jedną z najlepiej rozwijających się gałęzi gospodarki. Czynniki,<br />
które wpływają na wzrost produkcji farmaceutycznej to między innymi<br />
starzenie się społeczeństwa, bogacenie się ludności, postęp<br />
w diagnozowaniu i leczeniu chorób, dostępność leków bez recepty i ich<br />
promowanie w reklamach. W krajach Unii Europejskiej na rynku znajduje się<br />
ponad 3000 substancji farmaceutycznych [1]. Farmaceutyki przenikają do<br />
środowiska wieloma drogami, np. wraz ze ściekami szpitalnymi i domowymi,<br />
poprzez nieodpowiednią utylizację przeterminowanych lub niezużytych leków,<br />
bądź też poprzez złą gospodarkę ściekową zakładów farmaceutycznych.<br />
Oczyszczalnie ścieków nie są w stanie całkowicie usunąć tego typu<br />
zanieczyszczeń, przez co dostają się one do wód powierzchniowych, a nawet<br />
pitnych. Badania naukowe potwierdziły obecność ponad 160 różnych<br />
farmaceutyków w wodach wypływających z oczyszczalni ścieków [2]. Biorąc<br />
pod uwagę liczbę leków dostępnych na rynku, można się spodziewać, że ich<br />
obecność w środowisku jest z pewnością większa, a uwaga badaczy skupia<br />
się jedynie na tych najbardziej popularnych.<br />
Stwierdzenie obecności pozostałości leków w środowisku nie jest zjawiskiem<br />
nowym, gdyż pierwsza praca na ten temat ukazała się w latach<br />
siedemdziesiątych w Stanach Zjednoczonych i dotyczyła wykrycia kwasu<br />
klofibrowego w ściekach oczyszczonych [3]. Brak odpowiednich narzędzi<br />
analitycznych, w tym odpowiednich technik przygotowania próbki, sprawił, iż<br />
dopiero 20 lat później nastąpił gwałtowny rozwój tej tematyki. Stało się tak<br />
po opublikowaniu kilku przełomowych prac stwierdzających obecność pozostałości<br />
farmaceutyków w wodach powierzchniowych, m.in wyników badań<br />
Daughtona i Ternesa w 1999, które wykazały obecność 20 farmaceutyków i<br />
4 metabolitów w wodach niemieckich rzek [4]. Aktualnie problem obecności<br />
aktywnych związków farmaceutycznych w różnych komponentach środowiska<br />
jest jednym z najważniejszych z zakresu chemii środowiska.<br />
Przygotowanie próbek do analizy pozostałości leków jest zadaniem<br />
trudnym. Wynika to nie tylko z niskiej zawartości farmaceutyków w badanych<br />
próbkach, ale także ze złożoności matryc środowiskowych, zawierających<br />
szereg związków przeszkadzających w ich oznaczaniu. Wymaga to zastosowania<br />
złożonych operacji i procesów, które mogą być przyczyną strat<br />
analitów i stać się źródłem dodatkowych zanieczyszczeń. Najczęściej wykorzystywanymi<br />
technikami oznaczenia końcowego pozostałości farmaceutyków<br />
są techniki chromatograficzne, zarówno chromatografia cieczowa, jak<br />
również chromatografia gazowa połączone ze spektrometrią mas. Przed<br />
analizą chromatograficzną konieczne jest przeprowadzenie etapu<br />
izolacji i wzbogacania analitów za pomocą odpowiedniej techniki<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
39<br />
ekstrakcji. Aktualne tendencje analityczne wcielają koncepcję "zielonej chemii"<br />
skupiając się na redukcji zużycia rozpuszczalników oraz na oznaczaniu<br />
szerokiej gamy analitów występujących na niskich poziomach stężeń przy<br />
zastosowaniu jednej procedury analitycznej. Niniejsza praca przedstawia<br />
zastosowanie wybranych, innowacyjnych technik ekstrakcji do izolacji i/lub<br />
wzbogacania pozostałości farmaceutyków w próbkach środowiskowych.<br />
2. Ekstrakcja z wykorzystaniem polimerów z nadrukiem<br />
molekularnym<br />
(Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction)<br />
Podstawowym problemem z jakim zmagają się chemicy-analitycy<br />
podczas oznaczania pozostałości farmaceutyków jest ilościowe wyodrębnianie<br />
bardzo małej ilości analitu, z próbki, w której stężenia zanieczyszczeń<br />
znacznie przewyższają stężenia szukanych związków. Obecnie najczęściej<br />
stosowaną techniką izolacji pozostałości farmaceutyków z próbek wodnych<br />
jest ekstrakcja do fazy stałej (Solid-Phase Extraction - SPE). Zasada ekstrakcji<br />
ciecz–ciało stałe opiera się na wykorzystaniu zjawiska podziału<br />
związków między dwie fazy: stałą i ciekłą. Najczęściej wykorzystywanymi<br />
złożami są żel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi (C18)<br />
oraz sorbenty polimerowe na bazie polistyrenu i diwinylobenzenu, takie jak<br />
np. Oasis HLB i Strata X [5]. Wadą tradycyjnych sorbentów może być ich<br />
mała selektywność w stosunku do analitów, powodująca, że oprócz związków<br />
oznaczanych zatrzymaniu mogą ulec również składniki towarzyszące.<br />
Problem ten może być rozwiązany przez wytworzenie bardziej selektywnych<br />
sorbentów takich jak np. polimery z nadrukiem molekularnym (Molecularly<br />
Imprinted Polymers - MIPs).<br />
Synteza polimerów MIP polega na obudowaniu cząsteczki wzorca<br />
analitu monomerami funkcyjnymi zdolnymi do polimeryzacji. Monomer posiada<br />
odpowiednie grupy funkcyjne, które wiążą się z molekułą wzorcową<br />
wiązaniem kowalencyjnym, bądź też oddziaływaniem elektrostatycznym,<br />
wodorowym lub hydrofobowym. W wyniku tego powstaje kompleks monomer-cząsteczka,<br />
który ulega właściwej polimeryzacji, najczęściej<br />
w obecności odczynnika sieciującego. Po syntezie polimeru, następuje usunięciu<br />
molekuły wzorca. Powstały polimer posiada wnęki (nadruki molekularne),<br />
które wielkością i kształtem odpowiadają analitom [6]. Retencja substancji<br />
oznaczanych na tych sorbentach zachodzi głównie na zasadzie rozpoznawania<br />
kształtu, ale udział biorą także wiązania chemiczne<br />
i oddziaływania międzycząsteczkowe. Wobec tego odciski cząsteczkowe<br />
wykazują powinowactwo do jednego rodzaju struktury [7].<br />
Wykorzystanie polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym, jako<br />
sorbentu w technice ekstrakcji do fazy stałej (Molecularly Imprinted Solid-<br />
Phase Extraction - MIP-SPE or MISPE) zwiększa selektywność wyodrębniania<br />
analitów nawet z bardzo skomplikowanych matryc środowiskowych.<br />
Wzrost selektywności w stosunku do innych sorbentów powoduje także<br />
wzrost czułości, ponieważ większa ilość analitu może zostać wyekstraho-<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
40 N. Migowska, J. Kumirska<br />
wana [7]. W rezultacie zastosowanie MISPE prowadzi do obniżenia granic<br />
oznaczalności analitów, uzyskania czystych ekstraktów, a tym samym wyeliminowania<br />
problemu efektów matrycy, które powstają podczas oznaczenia<br />
końcowego przy wykorzystania techniki chromatografii cieczowej połączonej<br />
z tandemową spektrometrią mas LC-MS/MS. Polimery z nadrukiem<br />
cząsteczkowym nazywane są często sztucznymi przeciwciałami, gdyż<br />
swoimi selektywnymi właściwościami przypominają immunosorbenty. Dzięki<br />
produkcji bazującej na syntezie chemicznej są tańsze i łatwiejsze do ponownego<br />
przygotowania niż immunosorbenty [8]. Ponadto wykazują wyższą<br />
stabilność w rozpuszczalnikach wodnych i organicznych.<br />
Technika MISPE nie jest jednak pozbawiona wad. W związku z silnym<br />
oddziaływaniem sorbentu z analitem desorpcja analitów może okazać się<br />
skomplikowana. Kolejnym problemem może być niekompletne usunięcie<br />
molekuły wzorcowej z polimeru, co powoduje wymywanie tej pozostałości<br />
podczas analizy. Aby temu zapobiec należy dokładnie oczyścić sorbent<br />
przed analizą. Ponadto należy pamiętać, iż zdolność zatrzymania analitu na<br />
sorbencie jest ograniczona przez konkretną liczbę nadruków molekularnych<br />
oraz zależy od matrycy próbki (może nastąpić blokowanie miejsc aktywnych<br />
poprzez inne składniki próbki). Z tego powodu, jak również poprzez możliwość<br />
pojawienia się równocześnie zachodzących różnych mechanizmów<br />
retencji składników próbki z sorbentem, sprawność takiego układu może<br />
ulec drastycznemu obniżeniu [9].<br />
Proces optymalizacji procedury MISPE jest analogiczny do optymalizacji<br />
ekstrakcji tradycyjną techniką SPE. Etap nanoszenia próbki jest poprzedzony<br />
etapem kondycjonowania złoża umieszczonego w kolumience<br />
ekstrakcyjnej. Kondycjonowanie sorbentu polega na przepłukaniu złoża rozpuszczalnikiem<br />
organicznym, najczęściej metanolem, a następnie wodą.<br />
Następny etap to nanoszenie próbki. Ważnym parametrem podczas wprowadzania<br />
próbki jest prędkość jej przepływu. Oczywiście im mniejsza prędkość<br />
przepływu, tym najwyższe prawdopodobieństwo wzajemnego oddziaływania<br />
analitu z nadrukiem molekularnym. Najczęściej naniesienie próbki w<br />
technice MISPE odbywa się metodą grawitacyjną, bez stosowania pomp<br />
próżniowych [9]. Ważnym parametrem jest pH nanoszonej próbki, które<br />
powinno być dostosowane do pK a analitów. W celu uzyskania właściwego<br />
oddziaływania analitu z hydrofobową strukturą polimeru anality nie powinny<br />
posiadać ładunku i być w formie zdysocjowanej. Zorita S. i inni [10] podczas<br />
swoich badań nad optymalizacją ekstrakcji ibuprofenu, naproksenu, diklofenaku<br />
i kwasu klofibrowego z zastosowaniem MISPE, zauważyli że podczas<br />
testowania różnego pH nanoszonej próbki wynoszącego 3, 5, 7, 9 dla trzech<br />
pierwszych analitów najlepsze rezultaty zostały osiągnięte przy pH 3-5, a dla<br />
kwasu klofibrowego jedynie przy pH 3. Wartość pK a kwasu klofibrowego<br />
wynosi 3,2 wobec tego przy wartości pH 5 występował on w formie zdysocjowanej<br />
i nie wiązał się całkowicie ze złożem sorbentu.<br />
Jak już wspomniano ilość nadruków molekularnych w polimerze jest<br />
ograniczona, w związku z tym ważnym krokiem jest wyznaczenie pojemności<br />
złoża. González-Mariňo i inni [9] w ramach badań nad optymalizacją<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
41<br />
procedury oznaczania amfetaminy i jej pochodnych w ściekach, przeprowadzili<br />
eksperymenty, podczas których na złoże kolumienki wprowadzili ultra<br />
czystą wodę oraz ścieki surowe w objętości 10, 20, 50 i 100 ml, do których<br />
uprzednio dodali po 100 ng każdego z analitów. Porównanie odzysków uzyskanych<br />
po ekstrakcji wykazało, że w przypadku ultra czystej wody wprowadzenie<br />
nawet 100 ml próbki nie wpłynęło znacząco na obniżenie odzysków,<br />
podczas gdy dla ścieków surowych naniesienie 100 ml próbki spowodowało<br />
wyraźny spadek odzysków wszystkich analitów. Optymalna objętość przepuszczanych<br />
ścieków surowych wynosiła 50 ml. Przegląd danych literaturowych<br />
wskazuje, że w większości wykonywanych badań optymalna objętość<br />
nanoszonej próbki wynosiła 25-50 ml [9, 11-12].<br />
W technice MISPE etap oczyszczania jest bardzo ważny. W związku<br />
z tym, iż oznaczane związki wykazują silnie powinowactwo do odcisku cząsteczkowego,<br />
właściwie wykonane oczyszczanie pozwala usunąć zanieczyszczenia,<br />
bez wymywania analitów. Aby pozbyć się wszelkich interferentów<br />
najczęściej stosuje się przemywanie polarnym, a następnie niepolarnym<br />
rozpuszczalnikiem lub mieszaninami rozpuszczalników. Etap ten należy<br />
dokładnie zoptymalizować, aby nie dopuścić do elucji analitów zatrzymanych<br />
przez kolumienki MISPE. Gros M. i współpracownicy [11] wykazali, że zastosowanie<br />
mieszaniny ACN/H 2 O w stosunku (60/40, v/v) powodowało elucję<br />
znacznej ilości β-blokerów, natomiast zastosowanie wody, osuszenie<br />
złoża, a następnie użycie czystego acetonitrylu nie powodowało takich strat<br />
González-Mariňo i współpracownicy [9] zbadali użyteczność sorbentów<br />
MIP, kolumienek OASIS HLB oraz OASIS MCX do izolacji, wzbogacania<br />
oraz oznaczania pochodnych amfetaminy w próbkach wody. Z badań wynika,<br />
że nieznacznie lepsze odzyski otrzymuje się przy użyciu kolumienek<br />
MIP (91 -114 %) w porównaniu z odzyskami uzyskanymi przy wykorzystaniu<br />
kolumienek Oasis MCX (101-137 %). Ponadto współczynnik zmienności<br />
wyników przy wykorzystaniu kolumienek MIP jest niższy (1,5-4,9 %), niż<br />
przy zastosowaniu kolumienek Oasis MCX (2,0-11,9 %). Co więcej granica<br />
wykrywalności jest 2 razy niższa stosując kolumienki MIP, niż kolumienki<br />
Oasis MCX. Jako wadę wykorzystania kolumienek MIP autorzy podali dłuższy<br />
czas przeprowadzania ekstrakcji ze względu na grawitacyjny sposób<br />
przepuszczanie próbki (trwające 50 min) w porównaniu z 10 minutowym<br />
przepuszczaniem próbki przez kolumienki Oasis MCX oraz mniejszą pojemność<br />
złoża w porównaniu z kolumienkami Oasis MCX.<br />
"Inteligentne polimery" z odciskiem cząsteczkowym, stanowią obiecującą<br />
alternatywę, która na razie wykorzystywana jest do ekstrakcji niewielkiej<br />
liczby leków. Aby upowszechnić użycie polimerów MIP do oznaczania<br />
farmaceutyków z próbek środowiskowych należy stworzyć szereg polimerów<br />
posiadających wnęki (nadruki molekularne), które wielkością i kształtem<br />
będą odpowiadały większej liczbie związków z grupy analitów.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
42 N. Migowska, J. Kumirska<br />
3. Mikroekstrakcja<br />
(Microextraction)<br />
Opracowanie przez Pawliszyna i współpracowników [13] w 1990 roku<br />
techniki mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (ang. Solid-Phase Microextraction,<br />
SPME) zapoczątkowało zainteresowanie technikami mikroekstrakcji w<br />
chemii analitycznej. W 1999 roku Baltussen i współpracownicy [14] zaprezentowali<br />
ekstrakcję z zastosowaniem wirującego elementu sorpcyjnego<br />
(ang. Stir bar sorptive extraction, SBSE), w tym samym roku Pedersen-Bjergaard<br />
i Rasmussen [15] wprowadzili technikę mikroekstrakcję poprzez<br />
membranę do fazy ciekłej (ang. Hollow-fiber liquid-phase microextraction,<br />
HF-LPME). Zgodnie z ideą "zielonej chemii analitycznej" techniki te minimalizują<br />
zużycie toksycznych rozpuszczalników i są przyjazne dla środowiska,<br />
ponadto są mniej praco- i czasochłonne, niż „klasyczne” techniki ekstrakcyjne.<br />
4. Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej<br />
(Solid phase microextraction)<br />
W 1993 roku firma Supelco wprowadziła na rynek włókno pokryte sorbentem<br />
przymocowane do tłoka mikrostrzykawki, służące do przeprowadzenia<br />
mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej [16]. Od tej pory, technika ta, cieszy<br />
się dużym zainteresowaniem gdyż służy do izolacji szerokiej gamy analitów<br />
lotnych lub średniolotnych z próbek ciekłych, gazowych lub stałych, w tym z<br />
próbek o skomplikowanej matrycy.<br />
W analizie metodą SPME wyróżnia się dwa etapy:<br />
1 etap - podziału związków pomiędzy pokryciem włókna a matrycą próbki,<br />
2 etap - desorpcji zaadsorbowanych na włóknie analitów oraz ich oznaczanie.<br />
W pierwszym etapie włókno eksponowane jest albo bezpośrednio<br />
w próbce (Direct immersion - solid-phase microextraction, DI-SPME) albo<br />
w fazie nadpowierzchniowej próbki (Head space - solid-phase microextraction,<br />
HS-SPME). Następuje wówczas podział analitu pomiędzy matrycą<br />
próbki a fazą stacjonarną umieszczoną na włóknie bądź też pomiędzy<br />
próbką, jej fazą nadpowierzchniową, a włóknem SPME. Na wydajność i<br />
czułość ekstrakcji wpływ mają takie parametry jak: temperatura, siła jonowa,<br />
polarność i objętość próbki, a w przypadku ekstrakcji HS-SPME również<br />
objętość fazy nadpowierzchniowej oraz rodzaj i grubość fazy stacjonarnej<br />
użytego włókna. Czas ekstrakcji jest zależny od temperatury i intensywności<br />
mieszania próbki. Wszystkie te parametry powinny być uwzględnione w procesie<br />
optymalizacji [17].<br />
Etap desorpcji uzależniony jest od rodzaju zastosowanej techniki<br />
oznaczenia końcowego. W przypadku chromatografii cieczowej niezbędne<br />
jest zastosowanie specjalnej przystawki SPME/HPLC do desorpcji analitów<br />
cieczą, natomiast w przypadku chromatografii gazowej desorpcja odbywa<br />
się bezpośrednio w dozowniku chromatografu gazowego [5]. Jeżeli ozna-<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
43<br />
czenie wybranych związków wymaga przeprowadzenia ich w pochodne<br />
możliwe jest wprowadzenie etapu upochodnienia. Proces derywatyzacji<br />
można przeprowadzić bezpośrednio w matrycy „in situ” i uzyskane pochodne<br />
ekstrahować za pomocą SPME, bądź też przekształcenie analitów<br />
w pochodne może zachodzić na włóknie lub też w komorze dozownika<br />
chromatografu – ex situ [19].<br />
SPME bardzo dobrze sprawdza się w połączeniu z metodami chromatograficznymi,<br />
zarówno z chromatografią gazową, jak i cieczową. Różnorodność<br />
włókien dostępnych komercyjnie umożliwiło wykorzystanie tej techniki<br />
do ekstrakcji szerokiej gamy analitów między innymi do oznaczeń farmaceutyków<br />
w próbkach wodnych Przykłady zastosowań podano w Tabeli<br />
1.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
44 N. Migowska, J. Kumirska<br />
o<br />
C<br />
- desorpcja 280 o C, 5<br />
Tabela 1. Przegląd metod wykorzystania SPME do oznaczania wybranych farmaceutyków w próbkach<br />
środowiskowych<br />
Table 1. Survey of SPME methods for the extraction of the pharmaceuticals from environmental samples<br />
Anality<br />
Analytes<br />
Dietylostilbestr<br />
ol (DES)<br />
Estron (E1)<br />
17 β-Estradiol<br />
(E2)<br />
17 α-<br />
Etynyloestradi<br />
ol (EE2)<br />
Ibuprofen<br />
Naproksen<br />
Ketoprofen<br />
Diklofenak<br />
Ibuprofen<br />
Paracetamol<br />
Naproksen<br />
Indometacyna<br />
Matryca<br />
Sample type<br />
Woda<br />
wodociągowa<br />
Ścieki<br />
Woda<br />
kranowa<br />
Rodzaj włókna<br />
SPME<br />
SPME fiber type<br />
PA<br />
PDMS<br />
PDMS/DVB<br />
PA<br />
PDMS<br />
PDMS/DVB<br />
CAR/PDMS<br />
CW/DVB<br />
PA<br />
PDMS/DVB<br />
CW/DVB<br />
Procedura<br />
Sample preparation<br />
procedure<br />
- pH = 2, NaCl C = 30 %<br />
- ekstrakcja 160 min<br />
temp. pokojowa,<br />
mieszanie 105 rad/s,<br />
- derywatyzacja 100 µl<br />
MSTFA 30 min temp. 60<br />
min<br />
- pH = 3<br />
- ekstrakcja 40 min temp.<br />
pokojowa,<br />
- derywatyzacja 50 µl<br />
MTBSTFA 20 min temp.<br />
40 o C<br />
- desorpcja 280 o C, 3 min<br />
- pH = 2, NaCl 1 g/4 ml<br />
- ekstrakcja 30 min temp.<br />
pokojowa, mieszanie 1000<br />
rpm,<br />
- derywatyzacja BSTFA 60<br />
min temp. 40 o C<br />
- desorpcja 280 o C, 2<br />
min<br />
Metoda<br />
rozdzielania i<br />
detekcji<br />
Separation<br />
and<br />
detection<br />
technique<br />
GC-MS (SIM)<br />
GC-MS<br />
GC-MS<br />
Odzysk [%]<br />
Recovery [%]<br />
- DES 99 ± 2<br />
- E1 102 ± 3<br />
- E2 100 ± 2<br />
- EE2 104 ± 5<br />
b.d.<br />
b.d.<br />
Granica<br />
wykrywalnoś<br />
ci [ng L -1 ]<br />
Limit of<br />
detection [ng<br />
L -1 ]<br />
- Des 18,3<br />
- E1 8<br />
-E2 2,7<br />
- EE2 11<br />
- Ibuprofen 18<br />
- Naproksen 15<br />
- Ketoprofen 40<br />
- Diklofenak 20<br />
b.d.<br />
Litera<br />
tura<br />
Refer<br />
ences<br />
[19]<br />
[20]<br />
[21]<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
45<br />
- pH = 6, Na2SO4<br />
o<br />
C<br />
- desorpcja 280 o C, 5<br />
o<br />
C<br />
- desorpcja 290 o C, 5<br />
Ibuprofen<br />
Naproksen<br />
Ibuprofen,<br />
Fenoprofen,<br />
Naproksen,<br />
Ketoprofen,<br />
Flurbiprofen,<br />
Fluoksetyna,<br />
Estron,<br />
17 β-Estradiol<br />
Simwastatyna<br />
Dietylostilbestr<br />
ol<br />
Estron<br />
17 β-Estradiol<br />
17 α-<br />
Etynyloestradi<br />
ol<br />
Dietylostilbestr<br />
ol<br />
Estron<br />
17 β-Estradiol<br />
Woda<br />
kranowa,<br />
ścieki<br />
Ścieki<br />
Woda<br />
rzeczna i<br />
ścieki<br />
Woda<br />
rzeczna<br />
PA<br />
PDMS-DVB<br />
PA<br />
PDMS<br />
PDMS/DVB<br />
CAR/PDMS<br />
PA<br />
2,88 g/6 ml,<br />
- ekstrakcja i<br />
derywatyzacja<br />
15 µl DMS, 70 o C, 45<br />
min, mieszanie 500 rpm<br />
- desorpcja 250 o C,<br />
3 min<br />
- pH 10, derywatyzacja<br />
„in situ” 0,16 mL<br />
chloromrówczanu etylu<br />
0,3 mlL etanol/pirydyna<br />
(3:2)<br />
- ekstrakcja 70 °C 60<br />
min<br />
- desorpcja 250 °C 10<br />
mi<br />
- pH=6, NaCl 30 mg/ml<br />
- ekstrakcja 60 min<br />
temp. pokojowa,<br />
mieszanie 400rpm<br />
- derywatyzacja 50 µl<br />
MSTFA 30 min temp. 60<br />
min<br />
- pH=2, NaCl 100 g/l<br />
- ekstrakcja 90 min<br />
temp.45 o C,<br />
- derywatyzacja 100 µl<br />
BSTFA 60 min temp. 60<br />
min<br />
GC-MS<br />
(SIM)<br />
GC-MS (SIM)<br />
GC-MS/MS<br />
(ITD)<br />
GC-MS (SIM)<br />
- Ibuprofen<br />
94,3<br />
- Naproksen<br />
102,7<br />
b.d.<br />
b.d.<br />
b.d.<br />
- Ibuprofen 1<br />
- Naproksen 9<br />
500<br />
- DES 0,2<br />
- E1 1<br />
- E2 0,7<br />
- EE2 3<br />
- DES 5<br />
- E1 57<br />
- E2 22<br />
[22]<br />
[23]<br />
[24]<br />
[25]<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
Sulfaguanidyn<br />
a<br />
Sulfacetamid<br />
Sulfadiazyna<br />
Sulfatiazyna<br />
Sulfapirydyna<br />
Sulfamerazyn<br />
a<br />
Sulfametazyna<br />
Sulfametoksaz<br />
ol<br />
Sulfadimetoks<br />
yna<br />
Sulfasalazyna<br />
Ścieki<br />
oczyszczone<br />
i<br />
nieoczyszczo<br />
ne<br />
CW/DVB<br />
- pH = 4,5, 10% m/o KCl<br />
- ekstrakcja 20 min<br />
- statyczna desorpcja<br />
MeOH przez 30 min<br />
LC-MS<br />
Sulfaguanidyn<br />
a 112 ± 20<br />
Sulfacetamid<br />
107 ± 23,5<br />
Sulfadiazyna<br />
97,7 ± 17,2<br />
Sulfatiazol<br />
29,0 ± 18,1<br />
Sulfapirydyna<br />
97,7 ± 20,1<br />
Sulfamerazyn<br />
a 92,1 ± 20,1<br />
Sulfametazyna<br />
39,8 ± 18,9<br />
Sulfametoksaz<br />
ol 59,2 ± 15,8<br />
Sulfadimetoks<br />
yna 74,2 ±<br />
17,6<br />
Sulfasalazyna<br />
229 ± 11,1<br />
Sulfaguanidyn<br />
a 1370<br />
Sulfacetamid<br />
47500<br />
Sulfadiazyna<br />
9040<br />
Sulfatiazol<br />
26300<br />
Sulfapirydyna<br />
35400<br />
Sulfamerazyn<br />
a 55300<br />
Sulfametazyna<br />
16200<br />
Sulfametoksaz<br />
ol 14000<br />
Sulfadimetoks<br />
yna 12400<br />
Sulfasalazyna<br />
229 ± 11,1<br />
[26]<br />
46 N. Migowska, J. Kumirska<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
47<br />
Jedną z ważniejszych zalet zastosowania techniki mikroesktrakcji do fazy<br />
stacjonarnej jest wyeliminowanie dużej ilości rozpuszczalników z etapu<br />
przygotowania próbki. Ponadto czas ekstrakcji metodą SPME jest krótszy<br />
niż przy zastosowaniu metody ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub metody<br />
ekstrakcji ciecz-ciecz (ang. Liquid-Liquid Extraction – LLE). Technika SPME<br />
jest prosta i łatwa do automatyzacji. Jeśli wykonywana jest ekstrakcja analitów<br />
z fazy nadpowierzchniowej, wówczas cząsteczki stałe obecne w próbce<br />
nie mają wpływu na przebieg procesu. Kolejną zaletą SPME jest liniowość<br />
odpowiedzi detektora w szerokim zakresie stężeń.<br />
Główną wadą tej techniki jest stosunkowo wysoki koszt włókna<br />
i ograniczony czas jego użytkowania, związany z częściową degradacją<br />
włókna w wysokiej temperaturze jak również z zanieczyszczeniem włókna<br />
podczas ekstrakcji oraz mechanicznymi uszkodzeniami [17]. Może obniżać<br />
to dokładność i precyzję analizy oraz podnosić koszt analizy wywołany degradacją<br />
włókna podczas procesu ekstrakcji.<br />
5. Ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego<br />
(Stir bar sorptive extraction)<br />
Ekstrakcja za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego wykorzystuje<br />
jako medium ekstrakcyjne mieszadełko pokryte polidimetylosiloksanem<br />
(PDMS), które dostępne jest pod nazwą handlową Twister® (GERSTEL<br />
GmbH & Co.). Procedura ekstrakcji składa się z trzech głównych etapów:<br />
ekstrakcji, czyli ekspozycji wirującego mieszadełka w próbce wody przez<br />
określony czas; przemycia, czyli usunięcia resztek matrycy; oraz uwolnienia<br />
zaadsorbowanych analitów przez desorpcję termiczną lub ekstrakcję rozpuszczalnikiem.<br />
Desorpcja termiczna odbywa się z użyciem automatycznych<br />
desorberów zintegrowanych z układem chromatograficznym. SBSE podobnie<br />
jak SPME jest bezrozpuszczalnikową metodą przygotowania próbki opierającą<br />
się na ekstrakcji sorpcyjnej. Ilość fazy PDMS pokrywająca mieszadełko<br />
magnetyczne w technice SBSE jest 50-250 razy większa, co pozwala<br />
na efektywniejszą ekstrakcję analitu w porównaniu z techniką SPME.<br />
Główną wadą tej techniki jest fakt, iż na rynku dostępne są przeważnie mieszadełka<br />
magnetyczne pokryte polidimetylosiloksanem. Uniemożliwia to<br />
ekstrakcję związków polarnych, które słabo ekstrahują do fazy PDMS. Aby<br />
ocenić, czy osiągnie się wystarczającą wydajność ekstrakcji danego analitu<br />
techniką SBSE z wykorzystaniem fazy PDMS, można posłużyć się stałą<br />
podziału oktanol – woda K OW . Przyjmuje się, że związki, których log K OW jest<br />
mniejszy od jedności, charakteryzowane są jako hydrofilowe, więc nie będą<br />
się rozpuszczały w niepolarnej fazie PDMS. Związki, dla których log K OW<br />
mieści się między wartością 1 a 3, charakteryzują się średnim charakterem<br />
hydrofilowym (lub średnim charakterem hydrofobowym) i mogą<br />
w ograniczonym stopniu rozpuszczać się w fazie PDMS. Natomiast związki,<br />
których log K OW osiąga wartość powyżej 3, charakteryzowane są jako hydrofobowe<br />
i będą dobrze rozpuszczały się w niepolarnej fazie PDMS [27].<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
48 N. Migowska, J. Kumirska<br />
Kawaguchi i współpracownicy [28] zastosowali ekstrakcję SBSE do<br />
oznaczenia naturalnych i syntetycznych hormonów takich jak, estron, 17βestradiol<br />
oraz 17α-etynyloestradiol w próbkach wody. Anality przeprowadzili<br />
w pochodne za pomocą bezwodnika octowego i uzyskali granice wykrywalności<br />
(LOD) na poziomie ng/L. Ci sami autorzy podczas wykonywania następnych<br />
badań [30] zastosowali metodę podwójnej derywatyzacji do oznaczania<br />
17β-estradiolu w próbkach wody rzecznej. 17β-Estradiol w swojej<br />
strukturze posiada ugrupowanie hydroksylowe oraz fenolowe. W pierwszym<br />
etapie upochodnienia „in situ” przeprowadzeniu w pochodną uległo ugrupowanie<br />
fenolowe, co zwiększyło zdolność analitu do rozpuszczenia się w fazie<br />
PDMS. Następnie analit zdesorbowali termicznie i poddali reakcji z odczynnikiem<br />
BSTFA (N,O-bis(trimetylsililo)trifluoroacetamid). Przeprowadzenie<br />
w pochodną trimetylosiliową miało na celu zwiększenie lotności analitu<br />
i poprawę czułości przy oznaczeniu za pomocą GC-MS. Uzyskane w ten<br />
sposób wartości LOD były bardzo zbliżone do wyników poprzednich badań.<br />
Wprowadzenie automatycznego urządzenia, służącego do desorpcji<br />
analitów z wirującego elementu sorpcyjnego, znacznie ułatwiło, przyspieszyło,<br />
a przede wszystkim uczyniło z niej bardziej ekonomiczną technikę<br />
ekstrakcji. Największym ograniczeniem tej techniki jest dostępność na rynku<br />
jedynie mieszadełek pokrytych fazą PDMS, jednak w niektórych ośrodkach<br />
naukowych, prowadzone są prace nad wykorzystaniem innych faz stacjonarnych<br />
niż polidimetylosiloksanowa. Przykładowe prace zestawiono w Tabeli<br />
2.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Tabela 2. Wykorzystanie nowych faz stacjonarnych w ekstrakcji SBSE do izolacji i/lub wzbogacenia oraz. oznaczania<br />
pozostałości leków w próbkach środowiskowych<br />
Table 2. Use of new phases in SBSE extraction for determination of pharmaceutical residues in environmental.<br />
samples<br />
Anality<br />
Analytes<br />
Farmaceutyki:<br />
Paracetamol (PAR)<br />
Antypiryna (ANT)<br />
Propanolol (PRO)<br />
Karbamezepina<br />
(CAR)<br />
Diklofenak (DIC)<br />
Ibuprofen (IBU)<br />
oraz środki higieny<br />
osobistej<br />
Matryca<br />
Sample type<br />
Woda rzeczna,<br />
ścieki<br />
Rodzaj<br />
mieszadełka SBSE<br />
Stir bar sorbent<br />
VPD-DVB<br />
(kopolimer<br />
winylopirolidonu z<br />
diwinylobenzenem)<br />
Technika<br />
rozdzielania<br />
i oznaczenia<br />
końcowego<br />
Separation and<br />
detection<br />
technique<br />
LC-MS/MS<br />
Odzysk [%]<br />
Recoveries [%]<br />
Woda rzeczna<br />
PAR 8<br />
ANT 34<br />
PRO 56<br />
CAR 99<br />
DIC 75<br />
IBU 70<br />
Ścieki oczyszczone<br />
PAR 8<br />
ANT 35<br />
PRO 64<br />
CAR 85<br />
DIC 74<br />
IBU 73<br />
Ścieki<br />
nieoczyszczone<br />
PAR<br />
ANT -<br />
PRO 29<br />
CAR 74<br />
DIC 67<br />
IBU -<br />
Granica<br />
oznaczalnoś<br />
ci<br />
Limit of<br />
detection<br />
20-100 ng L -1<br />
Literatura<br />
References<br />
[30]<br />
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
49<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
Estron (E1),<br />
17β-Estradiol (E2),<br />
Estriol (E3)<br />
17 α-<br />
Etynyloestradiol<br />
Kwas<br />
acetylosalicylowy<br />
(ACA),<br />
Ibuprofen (IBU),<br />
Diklofenak (DIC),<br />
Naproksen (NAP),<br />
Kwas<br />
mefenamowy<br />
(MEF),<br />
Gemfibrozyl (GEM)<br />
Woda rzeczna i<br />
jeziorna<br />
Woda<br />
dejonizowana,<br />
PDMS/β-CD<br />
polydimethylsiloksa<br />
n/-cyklodekstryna<br />
Porównanie włókna<br />
PDMS z PU<br />
(poliuretanowym)<br />
HPLC – UV<br />
HPLC-DAD<br />
Woda rzeczna<br />
E3 84,6 ± 9,3<br />
E2 108,5 ± 2,0<br />
EE2 118,8 ± 5,7<br />
E1 124,1 ± 2,7<br />
Woda jeziorna<br />
E3 87,1 ± 8,0<br />
E2 110,6 ± 4,7<br />
EE2 123,5 ± 5,8<br />
E1 117,9 ± 5,7<br />
PDMS<br />
ACA < 1,0<br />
NAP 9,8 ± 1,6<br />
DIC 34,6 ± 6,9<br />
IBU 43,4 ± 5,4<br />
MEF 71,3 ± 5,8<br />
GEM 73,4 ± 5,0<br />
PU<br />
ACA 45,3 ± 9,0<br />
NAP 78,3 ± 3,4<br />
DIC 77,7 ± 2,7<br />
IBU 90,6 ± 7,2<br />
MEF 48,4 ± 8,4<br />
GEM 84,0 ± 9,0<br />
Granica<br />
wykrywalności:<br />
E3 0,04 µg L -1<br />
E2 0,09 µg L -1<br />
EE2 0,09 µg L -1<br />
E1 0,11 µg L -1<br />
PDMS<br />
ACA -<br />
NAP 3,2 µg L -1<br />
DIC 5,4 µg L -1<br />
IBU 5,5 µg L -1<br />
MEF 5,1 µg L -1<br />
GEM 5,8 µg L -1<br />
PU<br />
ACA 2,7 µg L -1<br />
NAP 1,5 µg L -1<br />
DIC 2,4 µg L -1<br />
IBU 3,6 µg L -1<br />
MEF 4,2 µg L -1<br />
GEM 2,5 µg L -1<br />
[31]<br />
[32]<br />
50 N. Migowska, J. Kumirska<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
51<br />
6. Mikroekstrakcja poprzez membranę do fazy ciekłej<br />
(Hollow-fiber liquid-phase microextraction)<br />
W technice mikroekstrakcji poprzez membranę do fazy ciekłej rozpuszczalnik<br />
organiczny unieruchomiony jest w przestrzeniach porowatej<br />
membrany zanurzonej w próbce. Małe pory włókna utrzymują ciecz ekstrahującą<br />
oraz uniemożliwiają przedostania się do niej dużych molekuł. Technika<br />
ta może mieć szerokie zastosowanie, dzięki możliwości doboru odpowiedniej<br />
cieczy ekstrahującej oraz rodzaju porowatego włókna. Istnieją dwa<br />
typy ekstrakcji: dwufazowe HF-LPME oraz trójfazowe HF-LPME.<br />
W dwufazowym HF-LPME anality ekstrahowane są na drodze biernej ekstrakcji<br />
z próbki do hydrofobowego rozpuszczalnika organicznego, natomiast<br />
w trójfazowym HF-LPME anality ekstrahowane są z próbki przez rozpuszczalnik<br />
organiczny unieruchomiony w membranie, a następnie przenikają do<br />
fazy wodnej [34]. Basheer i współpracownicy [35] zastosowali dwufazowe<br />
HF-LPME do wydzielenia naturalnych i syntetycznych hormonów takich jak<br />
estron, 17β-estradiol, dietylostilbestrol oraz 17α-etynyloestradiol z próbek<br />
wodnych. Użyli oni membrany, w której przestrzeniach znajdował się dihydroksylowany<br />
polimetakrylan (DHPMM) służący jako ekstrahent. Dla porównania<br />
przeprowadzono ekstrakcję tych związków z wykorzystaniem techniki<br />
SPME. Polimer DHPMM w porównaniu z poliakrylanowym (PA) włóknem<br />
SPME posiada dużo więcej ugrupowań hydroksylowych (-OH), dlatego też<br />
był bardziej odpowiedni do ekstrakcji związków polarnych jakimi są estrogeny.<br />
Metoda HF-LPME w połączeniu z techniką GC-MS pozwoliła na obniżenie<br />
granic oznaczalności związków przeprowadzonych uprzednio w trimetylosillilowe<br />
pochodne za pomocą odczynnika MSTFA (N-Metyl-N-<br />
(trimetylsilyl)trifluoroacetamid) do poziomu 0,03 do 0,08 ng/L oraz odzysków<br />
wynoszących odpowiednio 87 do 108 % z wody wodociągowej oraz 86 do<br />
110 % z wody powierzchniowej.<br />
Trójfazowe HF-LPME wykorzystywane jest najczęściej do ekstrakcji<br />
związków posiadających właściwości kwasowe lub zasadowe. Quintana<br />
i współpracownicy [36] podczas swoich badań nad optymalizacją izolacji<br />
i wzbogacania ibuprofenu, piroksykamu, kwasu klofibrowego, bezafibratu,<br />
diklofenaku oraz indometacyny techniką HF-LPME testowali takie parametry<br />
jak: pH próbki, dodatek soli, objętość próbki, stężenie buforu i dodatek metanolu<br />
do fazy akceptorowej. Ponieważ wybrane do analizy związki posiadały<br />
właściwości kwasowe proces ich ekstrakcji w trójfazowym HF-LPME polegał<br />
na zakwaszeniu próbki, w której znajdowały się anality do pH 2, wskutek<br />
czego anality znajdowały się w formie niezdysocjowanej. Dzięki temu, miały<br />
one możliwość przeniknięcia przez rozpuszczalnik organiczny (1-oktanol) i<br />
przedostania do akceptora zasadowego (buforu węglanowego o stężeniu 10<br />
mM) znajdującego się wewnątrz membrany. W buforze anality uległy jonizacji<br />
(deprotonacji) ze względu na wysokie pH, wskutek czego zostały uwięzione<br />
wewnątrz membrany i nie mogły dyfundować z powrotem przez rozpuszczalnik<br />
do próbki. Podczas badań kinetyki ekstrakcji przy stałej prędkości<br />
mieszania autorzy stwierdzili, że równowaga procesu ekstrakcji osią-<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
52 N. Migowska, J. Kumirska<br />
gnięta została w czasie 45 minut. Czas ten był porównywalny lub krótszy z<br />
czasem niezbędnym do przeprowadzenia ekstrakcji SPE. Średni odzysk<br />
analitów po zastosowaniu optymalnej procedury ekstrakcji wynosił 93 ±<br />
35 % dla ścieków oczyszczonych oraz 125 ± 45 % dla ścieków surowych,<br />
przy czym przed wykonaniem ekstrakcji konieczne było przefiltrowanie<br />
próbki. Stosunkowo słaba precyzja oznaczeń spowodowana była małą objętością<br />
próbki.<br />
Zaletą zastosowania tej techniki jest jej wysoka selektywność, która<br />
przejawiła się brakiem efektów matrycy podczas oznaczeń<br />
z wykorzystaniem techniki LC-ESI-MS 2 . W literaturze można znaleźć wiele<br />
przykładów stosowania techniki HF-LPME do ekstrakcji farmaceutyków<br />
z próbek wodnych (woda kranowa, powierzchniowa, ścieki) [35-46], natomiast<br />
istnieje niewiele procedur wykorzystujących ją do ekstrakcji leków z<br />
próbek stałych (osadów ściekowych, gleby) [47-48].<br />
Technika HF-LPME w porównaniu z tradycyjną ekstrakcją ciecz-ciecz<br />
lub popularną ekstrakcją SPE zapewnia porównywalną i zadowalającą czułość<br />
oznaczeń, lepsze wzbogacanie analitów, a zużycie rozpuszczalników<br />
jest znacznie zredukowane (nawet o kilkaset lub kilka tysięcy razy). Ponadto<br />
jest prosta, szybka i niedroga. Ze względu na małą objętość rozpuszczalnika<br />
ekstrahującego, wyodrębnione ekstrakty nie wymagają dodatkowego wzbogacania<br />
przed oznaczeniem końcowym, a tym samym całkowity czas analizy<br />
znacznie zmniejsza się w porównaniu z tradycyjną procedurą LLE. Z<br />
uwagi na możliwość pracy w szerokim zakresie pH, może być stosowana w<br />
sytuacjach, w których wykorzystanie ekstrakcji do fazy stałej (SPE) lub mikroekstrakcji<br />
do fazy stacjonarnej (SPME) byłoby niemożliwe. W niektórych<br />
technikach ekstrakcyjnych, np. w SPME, istnieje „efekt pamięci złoża”, w<br />
związku z czym istnieje konieczność kondycjonowania włókna. W przypadku<br />
HF-LPME problem ten jest wyeliminowany, gdyż wykorzystywane membrany<br />
są niedrogie i są jednokrotnego użytku.<br />
Podsumowanie<br />
Ważnym etapem oznaczenia pozostałości farmaceutyków w próbkach<br />
środowiskowych jest wybór odpowiedniej metody ekstrakcji, w celu izolacji<br />
oraz wzbogacenia analitów. Tradycyjne metody przygotowania próbek, takie<br />
jak LLE lub SPE, posiadają wiele wad, między innymi: zużycie dużej objętości<br />
próbek i toksycznych rozpuszczalników, są praco- i czasochłonne, drogie,<br />
mało selektywne oraz niebezpieczne dla środowiska. Współczesne<br />
tendencje w rozwoju metod przygotowania próbek doprowadziły z jednej<br />
strony do opracowywania selektywnych metod ekstrakcji, takich jak np. ekstrakcja<br />
z wykorzystaniem polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym<br />
(MIP-SPE), z drugiej umożliwiły miniaturyzację aparatury do prowadzenia<br />
procesów przygotowania próbki, które ze względu na minimalne zużycie<br />
rozpuszczalników są przyjazne dla środowiska. Przykładem tego typu rozwiązań<br />
jest technika mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej SPME, ekstrakcja<br />
za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego SBSE czy mikroekstrakcja<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
53<br />
poprzez membranę do fazy ciekłej HF-LPME. Eliminacja lub redukcja ilości<br />
rozpuszczalników używanych podczas etapu przygotowania próbki niesie ze<br />
sobą wiele korzyści, między innymi: oszczędności ekonomiczne związane z<br />
zakupem i utylizacją rozpuszczalników, mniejsze obciążenie środowiska<br />
toksycznymi rozpuszczalnikami oraz zmniejszenie ekspozycji pracowników<br />
laboratoryjnych na kontakt z trującymi substancjami. Omówione w niniejszej<br />
pracy techniki ekstrakcyjne posiadają rozwiązania technologiczne umożliwiające<br />
ich automatyzację, łącznie z techniką HF-LPME, której automatyzacji<br />
sprostał zespół badawczy pod kierownictwem prof. Pawliszyna [49].<br />
Techniki te pozwalają także na oznaczanie szerokiej gamy analitów występujących<br />
na niskich poziomach stężeń przy zastosowaniu jednej procedury<br />
analitycznej. W pracy przedstawiono podstawowe informacje, dotyczące<br />
zastosowania technik ekstrakcji MIP-SPE, SPME, SBSE i HF-LPME do<br />
oznaczania pozostałości farmaceutyków w próbkach środowiskowych. Ze<br />
względu na aspekt ekotoksykologiczny i ekonomiczny techniki te stanowią<br />
interesującą alternatywę dla tradycyjnych metod ekstrakcji.<br />
Summary<br />
An important step in determination of pharmaceutical residues in environmental<br />
samples is the selection of a suitable extraction method in order<br />
to isolate and enrich analytes. Traditional methods of sample preparation,<br />
such as LLE or SPE, have many drawbacks including: using large volumes<br />
of samples and toxic solvents, being labor- and time-consuming, expensive<br />
and environmentally hazardous. Recent improvements in the sample preparation<br />
methods not only led to the development of selective extraction methods<br />
like Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction (MIP-SPE), but also<br />
enabled the miniaturization of the apparatus for conducting the sample<br />
preparation process which due to minimal solvent consumption are environmentally<br />
friendly. An example of such solutions is the technique of Solid-<br />
Phase Microextraction, Stir Bar Sorptive Extraction or Hollow-Fiber Liquid<br />
Phase Microextraction. Elimination or reduction of the usage of solvents<br />
brings many benefits including: the economic savings associated with the<br />
purchase and disposal of solvents, reduced pollution with toxic solvents and<br />
exposure of laboratory and diminished exposure of laboratory workers to<br />
poisonous substances. Extraction techniques discussed in this paper are<br />
easy to automate, including HF-LPME, automation of which met the research<br />
team led by prof. Pawliszyn [49]. These techniques also allow the<br />
determination of a wide range of analytes presented at low concentration<br />
levels using a single analytical procedure. The paper presents basic information<br />
on the application of MIP-SPE, SPME, SBSE and HF-LPME extraction<br />
techniques for the determination of pharmaceutical residues in environmental<br />
samples. Due to the economic and ecotoxicological aspects these<br />
techniques are an interesting alternative to conventional extraction methods.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
54 N. Migowska, J. Kumirska<br />
Podziękowania<br />
(Acknowledgements)<br />
Badania finansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego,<br />
projekt badawczy numer N N204 260237 (2009-2012).<br />
Financial support was provided by the Polish Ministry of Research and<br />
Higher Education under grant N N204 260237 (2009-2012).<br />
Praca naukowa współfinansowana ze środków Europejskiego Funduszu<br />
Społecznego, w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytetu<br />
IV, projekt pt. „Program wdrożenia nowoczesnych elementów kształcenia<br />
w Uniwersytecie Gdańskim”, Zadanie „Stypendia naukowe dla doktorantów<br />
szansą na rozwój gospodarki”.<br />
The publication is financed from European Social Fund in as a part of the<br />
project " Educators for the elite - integrated training program for PhD<br />
students, post-docs and professors as academic teachers at University of<br />
Gdansk" within the framework of Human Capital Operational Programme,<br />
Action 4.1.1, Improving the quality of educational offer of tertiary education<br />
institutions.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
55<br />
Literatura<br />
(References)<br />
1. E. Touraud, B. Roig, J.P. Sumpter, C. Coetsier, Drug residues and<br />
endocrine disruptors in drinking water: Risk for humans?, Int. J. Hyg.<br />
Envir. Heal. 214(2009)437.<br />
2. K. Kümmerer., The presence of pharmaceuticals in the environment<br />
due to human use – present knowledge and future challenges, J.<br />
Environ. Manag. 90(2009)2354.<br />
3. A.W. Garrison, J.D. Pope, F.R. Allen, 1976 – Identification and Analysis<br />
of Organic Pollutants In Water. Keith Ch (ed) Ann Arbor Science<br />
Publisher Inc, Ann. Arbor., s. 517.<br />
4. T.A. Ternes, Occurrence of drugs in German sewage treatment plants<br />
and rivers, Water Research, 32(1998)3245.<br />
5. D.M. Pavlović, S. Babić, A.J.M. Horvat, M. Kaštelan-Macan, Sample<br />
preparation in analysis of pharmaceutical, Trend. Anal. Chem.<br />
26(2007)1062<br />
6. P. Luliński, Polimery ze śladem molekularnym w naukach<br />
farmaceutycznych Moleculary imprinted polymers in pharmaceutical<br />
sciences, Polimery 55(2005)799.<br />
7. S. Mitra, Sample preparation techniques in analytical chemistry, John<br />
Wiley & Sons, New Jersey 2003.<br />
8. B. Sellergren (Ed.), Mollecularly Imprinted Polymers: Man-made Mimics<br />
of Antibodies and their Application in Analytical Chemistry, Elsevier,<br />
Amsterdam, 2001.<br />
9. I. González-Mariño, J.B. Quintana, I. Rodríguez, R. Rodil, J. González-<br />
Peñas, R. Cela, Comparison of molecularly imprinted, mixed-mode and<br />
hydrophilic balance sorbents performance in the solid-phase extraction<br />
of amphetamine drugs from wastewater samples for liquid<br />
chromatography–tandem mass spectrometry determination, J.<br />
Chromatogr. A 1216(2009)8435.<br />
10. S. Zorita, B. Boydb, S. Jönssonb, E. Yilmaz, C. Svenssona, L.<br />
Mathiassona, S. Bergström, Selective determination of acidic<br />
pharmaceuticals in wastewater using molecularly imprinted solid-phase<br />
extraction, Anal. Chim. Acta 626(2008)147.<br />
11. M. Gros, T-M. Pizzolato, M. Petrović, M.J. López de Alda, D. Barceló,<br />
Trace level determination of β-blockers in waste waters by highly<br />
selective molecularly imprinted polymers extraction followed by liquid<br />
chromatography–quadrupole-linear ion trap mass spectrometry, J.<br />
Chromatogr. A 1189(2008)347.<br />
12. K. Demeestere, M. Petrović, M. Gros, J. Dewulf, H. Van Langenhove,<br />
D. Barceló, Trace analysis of antidepressants in environmental waters<br />
by molecularly imprinted polymer-based solid-phase extraction followed<br />
by ultra-performance liquid chromatography coupled to triple<br />
quadrupole mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem. 396(2010)825.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
56 N. Migowska, J. Kumirska<br />
13. C.L. Arthur, J. Pawliszyn, Solid phase microextraction with thermal<br />
desorption using fused silica optical fiber, Anal. Chem. 62(1990)2145.<br />
14. E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers, Stir Bar Sorptive<br />
Extraction (SBSE), a Novel Extraction Technique for Aqueous Samples:<br />
Theory and Principles, J. Microcolumn. Sep. 11(1999)737.<br />
15. S. Pedersen-Bjergaard, K. E. Rasmussen, Liquid-liquid-liquid<br />
microextraction for sample preparation of biological fluids prior to<br />
capillary electrophoresis, Anal. Chem. 71(1999)2650.<br />
16. P. Popp and A. Paschke, Solid phase microextraction of volatile organic<br />
compounds using carboxen-polydimethylsiloxane fibers,<br />
Chromatographia 46(1997)419.<br />
17. A. Banel, B. Zygmunt, Zastosowanie połączenia mikroekstrakcji do fazy<br />
stacjonarnej i chromatografii gazowej do oznaczania lotnych kwasów<br />
tłuszczowych w próbkach środowiskowych i pokrewnych Application of<br />
combination of solid phase microextraction and gas chromatography for<br />
determination of volatile fatty AIDS in environmental and releted<br />
samples, Ecol. Chem. Eng. S 5(2008)1.<br />
18. C.D. Stalikas, Y.C. Fiamegos, Microextraction combined with<br />
derivatization, Trend. Anal. Chem. 27(2008)6.<br />
19. C. Basheer, A. Jayaraman, M.K. Kee., S. Valiyaveettil, H.K. Lee,<br />
Polymer-coated hollow-fiber microextraction of estrogens in water<br />
samples with analysis by gas chromatography–mass spektrometry, J.<br />
Chromatogr. A 1100(2005)137.<br />
20. I. Rodrıguez, J. Carpinteiro, J. B. Quintana, A M. Carro, R.A. Lorenzo,<br />
R. Cela, Solid-phase microextraction with on-fiber derivatization for the<br />
analysis of anti-inflammatory drugs in water samples, J. Chromatogr. A<br />
1024(2004)1.<br />
21. M. Moedera, S. Schrader, M. Winkler, P. Popp, Solid-phase<br />
microextraction–gas chromatography–mass spectrometry of biologically<br />
active substances in water samples, J. Chromatogr. A 873(2000)95.<br />
22. L. Araujo, J. Wild, N. Villa, N. Camargo, D. Cubillan, A. Prieto,<br />
Determination of anti-inflammatory drugs in water samples, by in situ<br />
derivatization, solid phase microextraction and gas chromatography–<br />
mass spektrometry, Talanta 75(2008)111.<br />
23. P.C. Feitosa de Lima Gomes, J.Y. Barletta, C.E.D. Nazario, A´.l.J.<br />
Santos-Neto, M.A. Von Wolff, C.M. R. Coneglian, G.A. Umbuzeiro, F.<br />
M. Lancas, Optimization of in situ derivatization SPME by experimental<br />
design for GC-MS multiresidue analysis of pharmaceutical drugs in<br />
wastewater, J. Sep. Sci. 34(2011)436.<br />
24. J. Carpinteiro, J.B. Quintana, I. Rodriguez, A.M. Carro, R.A. Lorenzo, R.<br />
Cela, Applicability of solid-phase microextraction followed by on-fiber<br />
silylation for the determination of estrogens in water samples by gas<br />
chromatography–tandem mass spektrometry, J. Chromatogr. A<br />
1056(2004)179.<br />
25. L. Yang, T. Luan, C. Lan, Solid-phase microextraction with on-fiber<br />
silylation for simultaneous determinations of endocrine disrupting<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
57<br />
chemicals and steroid hormones by gas chromatography–mass<br />
spectrometry, J. Chromatogr. A 1104(2006)23.<br />
26. V.K. Balakrishnan, K.A. Terry, J. Toito, Determination of sulfonamide<br />
antibiotics in wastewater: A comparison of solid phase microextraction<br />
and solid phase extraction methods, J. Chromatogr. A 1131(2006)1.<br />
27. P. Stepnowski, E. Synak, B. Szafranek, Z. Kaczyński, Techniki<br />
Separacyjne Separation Techniques, Wydawnictwo Uniwersytetu<br />
Gdańskiego, ISBN 978-83-7326-712-1, Gdańsk 2010.<br />
28. M. Kawaguchi, Y. Ishii, N. Sakui, N. Okanouchi, R. Ito, K. Inoue, K.<br />
Saito, H. Nakazawa, Stir bar sorptive extraction with in situ<br />
derivatization and thermal desorption-gas chromatography-mass<br />
spectrometry in the multi-shot mode for determination of estrogens in<br />
river water samples, J. Chromatogr. A 1049(2004)1.<br />
29. M. Kawaguchi, R. Ito, N. Sakui, N. Okanouchi, K. Saito, H. Nakazawa,<br />
Dual derivatization–stir bar sorptive extraction–thermal desorption–gas<br />
chromatography–mass spectrometry for determination of 17β-estradiol<br />
in water sample, J. Chromatogr. A 1105(2006)140.<br />
30. D. Bratkowska, R.M. Marcé, P.A.G. Cormack, F. Borrull, N. Fontanals,<br />
Development and application of a polar coating for stir bar sorptive<br />
extraction of emerging pollutants from environmental water samples<br />
Anal. Chim. Acta 706(2011)135.<br />
31. Y. Hu, Y. Zheng, F. Zhu, G. Li, Sol–gel coated polydimethylsiloxane/ β-<br />
cyclodextrin as novel stationary phase for stir bar sorptive extraction<br />
and its application to analysis of estrogens and bisphenol A, J.<br />
Chromatogr. A 1148(2007)16.<br />
32. A.R.M. Silva, F.C.M. Portugal, J.M.F. Nogueira, Advances in stir bar<br />
sorptive extraction for the determination of acidic pharmaceuticals in<br />
environmental water matrices. Comparison between polyurethane and<br />
polydimethylsiloxane polymeric phases, J. Chromatogr. A<br />
1209(2008)10.<br />
33. M. Ramos-Payán, M.Á. Bello López, R. Fernández-Torres, J.L. Pérez<br />
Bernal, M.C. Mochón, HPLC determination of ibuprofen, diclofenac and<br />
salicylic acid using hollow fiber-based liquid phase microextraction (HF-<br />
LPME); Anal Chim Acta 653(2009)184.<br />
34. C. Basheer, A. Jayaraman, M.K. Kee, S. Valiyaveettil, H.K. Lee,<br />
Polymer-coated hollow-fiber microextraction of estrogens in water<br />
samples with analysis by gas chromatography–mass spectrometry, J.<br />
Chromatogr. A 1100(2005)137.<br />
35. J.B. Quintana, R. Rodil, T. Reemtsma, Suitability of hollow fibre liquidphase<br />
microextraction for the determination of acidic pharmaceuticals in<br />
wastewater by liquid chromatography–electrospray tandem mass<br />
spectrometry without matrix effects, J. Chromatogr. A 1061(2004)19.<br />
36. J. Zhang, H.K. Lee, Application of dynamic liquid-phase microextraction<br />
and injection port derivatization combined with gas chromatography–<br />
mass spectrometry to the determination of acidic pharmaceutically<br />
active compounds in water samples, J. Chromatogr. A 1216(2009)7527.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
58 N. Migowska, J. Kumirska<br />
37. Z. Es´haghi, Determination of widely used non-steroidal antiinflammatory<br />
drugs in water samples by in situ derivatization,<br />
continuous hollow fiber liquid-phase microextraction and gas<br />
chromatography-flame ionization detector, Anal. Chim. Acta<br />
641(2009)83.<br />
38. M. Ramos Payán, M.A. Bello López, R. Fernández-Torres, M. Callejón<br />
Mochón, J.L. Gómez Ariza, Application of hollow fiber-based liquidphase<br />
microextraction (HF-LPME) for the determination of acidic<br />
pharmaceuticals in wastewaters, Talanta 82(2010)854.<br />
39. C. Basheer, J. Lee, S. Pedersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, H.K. Lee,<br />
Simultaneous extraction of acidic and basic drugs at neutral sample pH:<br />
A novel electro-mediated microextraction approach, J. Chromatogr. A<br />
1217(2010)6661.<br />
40. Y. Wu, B. Hu, Simultaneous determination of several phytohormones in<br />
natural coconut juice by hollow fiber-based liquid–liquid–liquid<br />
microextraction-high performance liquid chromatography, J.<br />
Chromatogr. A 1216(2009)7657.<br />
41. S. Zorita, T. Barri, L. Mathiasson, A novel hollow-fibre microporous<br />
membrane liquid–liquid extraction for determination of free 4-<br />
isobutylacetophenone concentration at ultra trace level in environmental<br />
aqueous samples, J. Chromatogr. A 1157(2007)30.<br />
42. Y. Tao, J.-F. Liu, X.-L. Hu, H.-C. Li, T. Wang, G.-B. Jiang, Hollow fiber<br />
supported ionic liquid membrane microextraction for determination of<br />
sulfonamides in environmental water samples by high-performance<br />
liquid chromatography, J. Chromatogr. A 1216(2009)6259.<br />
43. A. Esrafili, Y. Yamini, S. Shariati, Hollow fiber-based liquid phase<br />
microextraction combined with high-performance liquid chromatography<br />
for extraction and determination of some antidepressant drugs in<br />
biological fluids, Anal. Chim. Acta 604(2007)127.<br />
44. T.S. Ho, T. Vasskog, T. Anderssen, E. Jensen, K.E. Rasmussen, S.<br />
Pedersen-Bjergaard, 25,000-fold pre-concentration in a single step with<br />
liquid-phase microextraction, Anal. Chim. Acta 592(2007)1.<br />
45. S. Zorita, P. Hallgren, L. Mathiasson, Steroid hormone determination in<br />
water using an environmentally friendly membrane based extraction<br />
technique, J. Chromatogr. A 1192(2008)1.<br />
46. M. Ramos Payan, M. A. Bello López, R. Fernandez-Torres, M. Villar<br />
Navarro, M. Callejon Mochon, Hollow fiber-based liquid phase<br />
microextraction (HF-LPME) for a highly sensitive HPLC determination of<br />
sulfonamides and their main metabolites, J. Chromatogr. B<br />
879(2011)197-204.<br />
47. E. Sagristá , E. Larsson, M. Ezoddin, M. Hidalgo, V. Salvadó , J. Å.<br />
Jönsson, Determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs in<br />
sewage sludge by direct hollow fiber supported liquid membrane<br />
extraction and liquid chromatography–mass spectrometry, J.<br />
Chromatogr. A 1217(2010)6153.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji…<br />
59<br />
48. A. Saleh, E. Larsson, Y. Yamini, JÅ. Jönsson, Hollow fiber liquid phase<br />
microextraction as a preconcentration and clean-up step after<br />
pressurized hot water extraction for the determination of non-steroidal<br />
anti-inflammatory drugs in sewage sludge, J. Chromatogr. A<br />
1218(2011)1331.<br />
49. G. Ouyang, W. Zhao, J. Pawliszyn, Automation and optimization of<br />
liquid-phase microextraction by gas chromatography, J. Chromatogr. A<br />
1138(2007)47.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
xxx
CAMERA SEPARATORIA<br />
Volume 4, Number 1 / January 2012, 61-79<br />
Magda CABAN*, Anna MICHALAK, Jolanta KUMIRSKA<br />
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii,<br />
Instytut Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka,<br />
Zakład Analizy Środowiska,<br />
ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,<br />
e-mail: magdac@chem.univ.gda.pl<br />
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i<br />
β-agonistów w próbkach środowiskowych<br />
Streszczenie: Duża konsumpcja leków z grup β-blokerów i β-agonistów, niepełny metabolizm<br />
oraz niecałkowite usuwanie w oczyszczalniach ścieków sprawiają, że pozostałości tych farmaceutyków<br />
są często wykrywane w próbkach środowiskowych, szczególnie w ekosystemach<br />
wodnych. Pomimo, iż stężenia tych związków nie są wysokie, stanowią one realne zagrożenie<br />
dla ekosystemu wodnego oraz zdrowia człowieka. Do oszacowania stopnia zanieczyszczenia<br />
środowiska tymi farmaceutykami oraz do oceny ryzyka ekotoksykologicznego wykorzystywane<br />
są metody chromatografii cieczowej i gazowej z detekcją masową. Obie te techniki wymagają<br />
wstępnej izolacji z próbek środowiskowych oraz wzbogacenia analitów powyżej granicy oznaczalności<br />
użytej metody analitycznej. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu ekstrakcję do<br />
fazy stałe. Trwają również prace na wykorzystaniem technik mikroekstrakcji. Poniższa praca<br />
przedstawia metody oznaczania β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych.<br />
Słowa kluczowe: β-blokery, β-agoniści, chromatografia gazowa, chromatografia cieczowa,<br />
spektrometria mas, analiza pozostałości farmaceutyków w środowisku, ekstrakcja do fazy stałej<br />
Methods of separation and determination of β-blockers and<br />
β-agonist residues in environmental samples<br />
Abstract: High consumption of β-blockers and β-agonists drugs, exhaustive metabolism and<br />
incomplete removal in wastewater treatment plants make these pharmaceutical most frequently<br />
detected in environmental samples, especially in the water ecosystem. Although the concentrations<br />
of these compounds are not high, they represent a real risk to the aquatic ecosystem and<br />
human health. To estimate the degree of pollution and ecotoxicological risk assessment, gas<br />
and liquid chromatography with mass detection methods are used. Both<br />
of these techniques require the isolation and pre-concentrate of analytes from environmental<br />
matrices. Most commonly used is solid-phase extraction, although microextraction techniques<br />
are tested and adapted. The presented work provides a summary of methods for determining<br />
β-blockers and β-agonists in environmental samples.<br />
Key words: β-blockers and β-agonists, gas chromatography, liquid chromatography, mass<br />
spectrometry, analysis of residues of pharmaceuticals, solid-phase extraction
62 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
1. Farmaceutyki jako zanieczyszczenia środowiska<br />
(Pharmaceuticals as environmental pollution)<br />
Farmaceutyki to stosunkowo nowe zanieczyszczenia środowiska, których<br />
obecność, szczególnie w ekosystemach wodnych, jest coraz częściej<br />
notowana. Pomimo iż ich poziomy stężeń tych związków nie są wysokie<br />
(rzędu ng/l do μg/l), mogą one stanowić realne zagrożenie dla organizmów<br />
wodnym i glebowych. Fakt ten potwierdzają badania modelowe QSAR (ang.<br />
Quantitative Structure – Activity Relationship models), które wykazują efekt<br />
toksykologiczny farmaceutyków na niektóre organizmy (m.in. Daphnia<br />
magna, Synechococcus leopoliensis) w stężeniach oznaczanych w środowisku<br />
[1]. Istnieje niewiele danych na temat toksyczności długoterminowej<br />
farmaceutyków, stąd badania takie muszą być nadal kontynuowane [2].<br />
Obecność tych substancji w wodzie pitnej sprawia, że stanowią one realne<br />
zagrożenie także dla zdrowia człowieka. Należy podkreślić, że metabolity<br />
leków oraz produkty ich rozkładu, powstające w procesach oczyszczania<br />
ścieków lub podczas uzdatniania wody pitnej mogą potencjalnie zwiększać<br />
ich właściwości toksykologiczne [3].<br />
Doniesienia literaturowe wskazują, że farmaceutyki oznaczane są<br />
głównie w ściekach, wodach odprowadzanych z oczyszczalni ścieków (zarówno<br />
miejskich jaki i przemysłowych), wodach powierzchniowych, gruntowych<br />
oraz odciekach ze składowisk odpadów [4]. Monitorować należy zarówno<br />
miejsca przedostawania się farmaceutyków do środowiska jak i ich<br />
drogi rozprzestrzeniania się w ekosystemie. Ważnym aspektem badań naukowych<br />
jest analiza losów środowiskowych farmaceutyków, m.in. podatność<br />
na rozkład pod wpływem mikroorganizmów, światła, wody, uleganie<br />
procesom sorpcji do gleb czy osadów. Zgodnie z dyrektywą Unii Europejskiej<br />
(Dyrektywa 2001/83/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 6<br />
listopada 2001 r. w sprawie wspólnotowego kodeksu odnoszącego się do<br />
produktów leczniczych stosowanych u ludzi, Dz. U. L 311 z 28.11.2001)<br />
badania te są wymagane dla leków wprowadzanych dopiero do użytku [5].<br />
Przepisy te zalecają przeprowadzenie takiej oceny także dla farmaceutyków<br />
obecnych już na rynku, szczególnie, gdy ich produkcja i zużycie jest bardzo<br />
wysokie. Taką właśnie grupę leków stanowią β-blokery i β-agoniści.<br />
2. Charakterystyka β-blokerów i β-agonistów oraz ich losy<br />
środowiskowe<br />
(Characteristics of β-blockers and β-agonists and their<br />
environmental fate)<br />
β-blokery i β-agoniści będące tematem niniejszej pracy (Tabela 1),<br />
należą do grupy leków nie tylko często przepisywanych pacjentom, ale także<br />
powszechnie wykrywanych w środowisku. Stosowane są do leczenia chorób<br />
cywilizacyjnych, których częstość występowania (także w Polsce) stale<br />
wzrasta. β-blokery są stosowane w kardiologii, m.in. do leczenia choroby<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
63<br />
niedokrwiennej serca, arytmii, nadciśnienia tętniczego oraz guza<br />
chromochłonnego rdzenia nadnerczego [6, 7]. Wykorzystywane są także<br />
w terapii stanów lękowych, drżeń, jaskry, bólów migrenowych oraz nadczynności<br />
tarczycy [8]. β-blokery wykazują właściwości dopingujące [9]. Pomimo,<br />
iż widnieją na liście substancji zabronionych często stosowane są przez<br />
sportowców jako środki wspomagające [9, 10].<br />
Pierwszym lekiem należącym do grupy β-blokerów (β-adrenolityków)<br />
wprowadzonym do lecznictwa w połowie lat 60 XX wieku był propranolol<br />
(Tabela 1) [6, 7]. Obecnie stosowanych jest ponad 20 β-blokerów<br />
o podobnej strukturze oraz właściwościach fizykochemicznych. Należy podkreślić,<br />
iż β-blokery charakteryzują się zróżnicowaną polarnością.<br />
Na Rysunku 1 przedstawiono wybrane leki z omawianej grupy, uszeregowane<br />
według wzrastającej lipofilowości.<br />
Lipofilowość<br />
Lipophilicity<br />
atenolol, nadolol, acebutolol, metoprolol, pindolol, propranolol<br />
Rys 1. Uszeregowanie wybranych β-blokerów względem lipofilowości.<br />
Fig 1. The order of selected β-blockers against to lipophilicity.<br />
Leki z grupy β-agonistów (β-adrenomimetyczne) od bardzo dawna<br />
wykorzystywane są do leczenia astmy oskrzelowej. Jako pierwsza - w 1903<br />
roku - do lecznictwa wprowadzona została epinefryna (adrenalina) [11].<br />
Obecnie na 75%-ach recept przepisywanych pacjentom chorującym na to<br />
schorzenie widnieją leki β-adrenomimetyczne. Najczęściej podaje się<br />
je w postaci inhalacji. Salbutamol i terbutalina (Tabela 1) podobnie jak leki<br />
β-adrenolityczne wykazują działanie dopingujące [12].<br />
Tabela 1. Charakterystyka wybranych β-blokerów i β-agonistów<br />
Table 1. Characteristics of selected β-blockers and β-agonists<br />
Związek<br />
Compound<br />
Wzór strukturalny<br />
Związek<br />
Structure<br />
Compound<br />
β-blokery<br />
β-blocers<br />
Wzór strukturalny<br />
Structure<br />
Acebutolol<br />
336,43 g/mol<br />
pK a 9,2<br />
Nadolol<br />
309,40 g/mol<br />
pK a 9,7<br />
Atenolol<br />
266,34 g/mol<br />
pK a 9,6<br />
Pindolol<br />
248,32 g/mol<br />
pK a 9,7<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
64 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
Metoprolol<br />
267,36 g/mol<br />
pK a 9,7<br />
Propranolol<br />
259,34 g/mol<br />
pK a 9,5<br />
β-agoniści<br />
β-agonists<br />
Salbutamol<br />
239,31 g/mol<br />
pK a 10,3<br />
Terbutalina<br />
225,28g/mol<br />
pK a 10,1<br />
W latach 1999-2001 odnotowano 50% wzrost przepisywania omawianych<br />
leków przez francuskich lekarzy. Na przykład w 1999 roku we Francji<br />
zużyto 35 ton propranololu [13]; podaż tego farmaceutyku wciąż rośnie.<br />
Szacuje się, że łączne spożycie atenololu i metoprololu w krajach europejskich<br />
przekracza 80% ogólnej ich konsumpcji.<br />
Skuteczność usuwania β-blokerów i β-adrenomimetyków w procesach<br />
oczyszczania ścieków nie jest zadowalająca. Przykładem jest acebutolol,<br />
którego usunięcie możliwe jest w 64%. Atenolol usuwany jest w 76%, natomiast<br />
metoprolol jedynie w 10% [14]. W oczyszczonych ściekach stwierdza<br />
się powszechnie obecność także propranololu i nadololu (0,117±0,318 μg/l i<br />
0,074±0,204 μg/l) [15]. Najlepsze metody usuwania tych związków to ozonowanie<br />
oraz zaawansowane procesy utleniania (UV/H 2 O 2, O 3 /H 2 O 2, UV/O 3 )<br />
[19]. Warto dodać, że żadna metoda eliminacji nie jest skuteczna w 100%.<br />
Analizy wód gruntowych wykazują obecność metoprololu, sotalolu<br />
i bisoprololu (od 10 do 560 ng/l) [16]. W wodach powierzchniowych najczęściej<br />
wykrywany jest: metoprolol, propranolol, nadolol, atenolol, sotalol oraz<br />
betaxolol. Do tej pory istnieje niewiele danych dotyczących oceny stopnia<br />
zanieczyszczenia lekami nasercowymi i przeciwastmatycznymi obszaru<br />
Polski. Analiza wody rzeki Warty wykazała obecność atenololu<br />
i metoprololu w stężeniu ppt [17], podczas gdy ilość propranololu była<br />
poniżej granicy wykrywalności (IDL, ang. Instrumental Detection Limit, 0,05<br />
μg/l).<br />
β-blokery i β-adrenomimetyki są związkami biologicznie aktywnymi<br />
w środowisku. W wyniku procesu fotodegradacji, biotransformacji oraz<br />
sorpcji ulegają przemianie i rozkładowi [18]. Głównym czynnikiem<br />
wpływającym na fotodegradację β-blokerów i β-adrenomimetyków jest<br />
intensywność promieniowania słonecznego związana z porą roku oraz<br />
szerokością geograficzną [19]. Badania przeprowadzane z użyciem<br />
wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej (HPLC) (ang. High-<br />
Performance Liquid Chromatography) z detektorem UV-VIS dowiodły,<br />
że β-blokery i β-adrenomimetyki najszybciej ulegają degradacji latem, zaś<br />
najwolniej zimą. Według danych literaturowych czas potrzebny na<br />
fototransformację propranololu w okresie letnim wynosi 1,3 dnia, zaś zimą -<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
65<br />
16,8 dnia. Stwierdzono również, że rozkład hydrolityczny propranalolu<br />
zachodzi stosunkowo szybko, gdyż czas połowicznego rozpadu jest równy<br />
16 godzin [20]. Dla atenololu i metoprololu czas ten jest o wiele dłuższy i<br />
wynosi odpowiednio 350 i 630 godzin [20].<br />
Leki nasercowe i przeciwastmatyczne w środowisku naturalnym ulegają<br />
również degradacji pod wpływem mikroorganizmów [21]. Proces ten<br />
zachodzi dłużej niż fotodegradacja, gdyż propranolol ulega biodegradacji<br />
w ciągu 6 - 26 dni, zaś atenolol w ciągu 14 - 120 dni [18]. Omawiane związki<br />
są optycznie czynne. Nie wpływa to na ich działanie farmakologiczne, ale<br />
może mieć istotny wpływ na ich losy środowiskowe.<br />
3. Metody oznaczania pozostałości β-blokerów<br />
i β-agonistów w próbkach środowiskowych<br />
(Methods for determining of β-blockers and β-agonists<br />
residues in environmental samples)<br />
Spośród wszystkich metod analitycznych stosowanych do oznaczania<br />
β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych najważniejszą rolę<br />
odgrywają techniki chromatograficzne [22]. Do niedawna wykorzystywano<br />
głównie chromatografię cieczową połączoną ze spektrometrią mas lub tandemową<br />
spektrometrią mas [15-18, 21, 26-31, 36-38]. W chwili obecnej coraz<br />
częściej pomiary wykonuje się za pomocą techniki GC/MS [22-23, 25,<br />
31,33-35]. W związku z podobną strukturą oraz zbliżonymi właściwościami<br />
chemicznymi bardzo często obie te grupy leków oznaczane są jednocześnie<br />
[17, 26, 29, 31]. Przed oznaczeniem wymagane jest jednak wstępne przygotowanie<br />
próbki.<br />
3.1. Techniki izolacji i wzbogacania<br />
(Isolation and concentration techniques)<br />
W skład próbek środowiskowych wchodzą zarówno związki organiczne<br />
jak i nieorganiczne, zróżnicowane pod względem polarności.<br />
Ze względu na bardzo niskie stężenia omawianych związków w środowisku,<br />
przed przystąpieniem do oznaczenia konieczna jest ich izolacja<br />
z matrycy pierwotnej oraz wzbogacanie w celu osiągnięcia odpowiedniej<br />
granicy wykrywalności i oznaczalności [34]. Chociaż stężenia tych leków<br />
w ściekach są znacznie wyższe (rzędu μg/l) niż w wodach powierzchniowych<br />
(około ng/l) analizy ekstraktów z takich matryc są znacznie trudniejsze<br />
(bardziej czaso- i pracochłonna procedura optymalizacji warunków ekstrakcji<br />
i wzbogacania). Z kolei podczas oznaczania farmaceutyków w wodach powierzchniowych<br />
proces ekstrakcji jest stosunkowo prosty, ale niskie stężenia<br />
analitów wymagają stosowania efektywnych procesów wzbogacania.<br />
Najczęściej wykorzystywaną techniką ekstrakcji β-blokerów<br />
i β-agonistów z wodnych próbek środowiskowych jest ekstrakcja do fazy<br />
stałej (SPE) (ang. Solid-Phase Extraction) [26, 28-30, 34-41]. Trwają także<br />
prace nad wykorzystaniem SPE w trybie on-line (ekstrakcja przeprowadzana<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
66 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
jest w układzie przepływowym tuż przed analizą końcową) [21, 42, 43]. W<br />
tym celu stosuje się modyfikację dozownika typu zaworu z pętlą. Izolację<br />
wykonuje się również stosując ekstrakcję w skali mikro [44, 46] w tym<br />
mikroekstrakcję do fazy stałej (SPME) (ang. Solid Phase Microextraction)<br />
[46]. Ekstrakcję z próbek stałych przeprowadza się także przy pomocy techniki<br />
ciecz-ciecz (LLE) (ang Liquid-Liquid Extraction) [23].<br />
3.1.1. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)<br />
(Solid-phase extraction (SPE))<br />
Pierwotnie jako złoże do ekstrakcji β-blokerów i β-agonistów stosowana<br />
była krzemionka zmodyfikowana ugrupowaniami oktadecylowymi [39].<br />
Jednak szybko została ona zastąpiona przez adsorbenty<br />
z kopolimeru polistyrenu i diwinylobenzenu (PS-DVB) [40], które są stabilne<br />
w większym zakresie pH oraz bardziej odporne mechanicznie. Złoże takie<br />
charakteryzuje się znacznie lepszymi właściwościami sorpcyjnymi dla polarnych<br />
analitów, jakimi są β-blokery i β-agoniści. W celu zwiększenia selektywności<br />
może być ono dodatkowo zmodyfikowane, na przykład grupami<br />
jonowymiennymi. W ten sposób tworzy się układ mieszany, gdzie proces<br />
adsorpcji jest wynikiem działania oddziaływań jonowych i niejonowych. Kolumienką<br />
ekstrakcyjną działającą na zasadzie złoża kationowymiennego jest<br />
złoże Strata-X-C (firmy Phenomenex) oraz Oasis-MCX (firmy Waters). Gdy<br />
w trakcie produkcji do złoża PS-DVB dodawany jest monomer o właściwościach<br />
polarnych można zwiększyć siłę wiązania związków polarnych. Przykładem<br />
takiej modyfikacji jest wprowadzenie winylopirolidonu do kopolimeru<br />
polistyrenu i diwinylobenzenu, w wyniku czego powstaje złoże Strata-X<br />
(firmy Phenomenex) oraz Oasis HLB (firmy Waters). Kolumienki Oasis HLB<br />
są obecnie powszechnie stosowane do jednoczesnej ekstrakcji wielu grup<br />
leków, w tym β-blokerów i β-agonistów [27, 29-30, 41]. Z kolei złoża Oasis<br />
MCX są używane do selektywnej ekstrakcji farmaceutyków o właściwościach<br />
zasadowych [32, 37-38].<br />
W Tabeli 2 przedstawiono przykładowe procedury ekstrakcji omawianych<br />
leków z wodnych próbek środowiskowych. Izolację leków<br />
z użyciem kolumienki Oasis HLB wykonywano przy różnym pH próbki (od 3<br />
do 10,5) [13-14, 18, 44]. Anality występowały wówczas zarówno w formie<br />
zjonizowanej (gdy pH próbki było poniżej punktu pK a analitów, Tabela 1) jak<br />
i obojętnej (pH próbki powyżej punktu pK a analitów). Przy pH 3 zaobserwowano<br />
niewielki odzyski dla metoprololu i propranololu (odpowiednio 42% i<br />
57%). Najwyższą skuteczność ekstrakcji β-blokerów uzyskano przy pH od 7<br />
do 10,5, co świadczy o tym, że wartość pH próbki nie musi przekraczać<br />
wartości pK a β-blokerów, aby osiągnąć wysoką efektywność procesu ekstrakcji<br />
do fazy stałej [13-14, 44].<br />
Izolacja analitów za pomocą złoża Oasis MCX wymaga, aby występowały<br />
one w formie zjonizowanej. Ponieważ omawiane związki należą do<br />
grupy słabych zasad, pH próbki należy doprowadzić do pH poniżej punktu<br />
pKa analitów, (Tabela 1). Najczęściej pH doprowadzane jest do wartości<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
67<br />
poniżej 3 [18, 28, 30]. Z kolei do wymywania analitów należy użyć roztworu<br />
zasady w rozpuszczalniku organicznym (stosuje się głównie 5% roztwór<br />
NH 4 OH w MeOH).Odzysk analitów mieści się w przedziale 40 - 95% (z wyłączeniem<br />
pindololu, dla którego wynosi poniżej 10 %) [17, 27, 30]. Sytuacja<br />
wygląda podobnie w przypadku zastosowania kolumienek Oasis HLB.<br />
Tabela 2. Przykładowe etapy ekstrakcji na wybranych kolumienkach SPE<br />
Table 2. Examples of extraction steps on selected SPE cartridges<br />
Etap ekstrakcji<br />
Extraction step<br />
Kondycjonowanie<br />
Conditioning<br />
Nanoszenie próbki<br />
Sample loading<br />
Przemywanie<br />
Flushing<br />
Wymywanie<br />
Elution<br />
C18 – EC<br />
[31]<br />
3 x 2 ml heksan<br />
3 x 2 ml MeOH<br />
1 ml H 2 O<br />
o pH = 7,5<br />
pH = 7,5<br />
V = 1000 ml<br />
ścieki<br />
oczyszczone<br />
treated<br />
wastewater<br />
Brak<br />
4 x 1 ml MeOH<br />
Rodzaj kolumienki<br />
Type of cartidges<br />
Oasis HLB Oasis HLB<br />
[14]<br />
[32]<br />
2 ml heksan,<br />
2 ml aceton, Brak<br />
10 ml metanol, no step<br />
10 ml wody<br />
pH = 10<br />
woda gruntowa<br />
ground water<br />
2 ml 5% MeOH<br />
4 ml MeOH<br />
pH = 8<br />
V = 500 ml<br />
ścieki<br />
nieoczyszczo<br />
-ne<br />
raw<br />
wastewater<br />
Brak<br />
no step<br />
5 ml MeOH<br />
Oasis MCX<br />
[17]<br />
2 ml MeOH<br />
2 ml H 2 O<br />
o pH = 2,1<br />
pH = 3<br />
V= 1000 ml<br />
woda<br />
powierzchniowa<br />
surface water<br />
2 ml 2%<br />
HCOOH w<br />
H 2 O<br />
1 ml MeOH,<br />
2 ml 5%<br />
NH 4 OH w<br />
MeOH<br />
Odzyski bezwzględne i względne (względem dodanego wzorca) β-blokerów<br />
uzyskane podczas ekstrakcji próbek ścieków nieoczyszczonych<br />
i oczyszczonych z zastosowaniem kolumienek Oasis MCX zamieszczono<br />
w Tabeli 3. Wartości odzysków bezwzględnych są niewielkie w porównaniu<br />
z wartościami względnymi, szczególnie w przypadku analizy ścieków nieoczyszczonych.<br />
Spowodowane jest to negatywnym wpływem składników<br />
matrycy na wydajność ekstrakcji, a także problemami z analizą ilościową<br />
techniką LC-MS, wynikającą z supresji jonów w źródle, która może sięgać<br />
nawet 80%.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
68 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
Tabela 3. Wartości odzysków bezwzględnych i względnych β-blokerów<br />
z próbek ścieków nieoczyszczonych i oczyszczonych (SD -<br />
odchylenie standardowe) [28]<br />
Table 3. Absolute and relative recoveries of β-blockers from raw and<br />
treated wastewater (SD - standard deviation) [28]<br />
Związek<br />
Compound<br />
Ścieki nieoczyszczone<br />
Raw wastewater<br />
Odzysk Odzysk<br />
bezwzględny względny<br />
Absolute Relative<br />
recovery recovery<br />
% (SD) % (SD)<br />
Ścieki oczyszczone<br />
Treated wastewater<br />
Odzysk<br />
bezwzględny<br />
Absolute<br />
recovery<br />
% (SD)<br />
Odzysk<br />
względny<br />
Relative<br />
recovery<br />
% (SD)<br />
Atenolol 20 (2) 111 (4) 40 (1) 99 (3)<br />
Metoprolol 16 (1) 82 (4) 64 (2) 83 (6)<br />
Nadolol 43 (2) 94 (5) 59 (1) 77 (8)<br />
Propranolol 20 (2) 104 (4) 76 (5) 99 (2)<br />
3.1.2. Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME)<br />
(Solid phase microextraction (SPME))<br />
Ilość prac dotyczących izolacji i wzbogacania β-blokerów techniką<br />
mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME) jest bardzo ograniczona [46, 47], a dla<br />
β-adrenomimetyków brakuje ich zupełnie. Badania przeprowadzone m. in.<br />
dla atenololu, pindololu i propranololu dowiodły, że włókno MIP (ang.<br />
Molecularly Imprinted Polymer) jest efektywniejsze niż NIP (ang. Non-<br />
Imprinted Polymer) (Rys. 1) [46], gdyż na pierwszym z nich ilość zaabsorbowanego<br />
analitu była dwukrotnie wyższa. Podczas przeprowadzonych badań<br />
testowano również włókna PA (poliakrylan), PDMS (polidimetylosiloksan)<br />
i PDMS/DVB (kopolimer polidimetylsiloksanu z diwinylobenzenem) [46],<br />
jednak uzyskane wydajności ekstrakcji były dużo niższe, co eliminuje możliwość<br />
zastosowania tego typu włókna do wydzielania β-blokerów.<br />
3.2. Metody oznaczeń końcowych<br />
(Final determination methods)<br />
3.2.1. Chromatografia cieczowa<br />
(Liquid chromatography)<br />
Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas jest jedną<br />
z najpopularniejszych metod oznaczania ilościowego i jakościowego leków<br />
nasercowych i przeciwastmatycznych [14, 18, 21, 26-31]. Analizy z użyciem<br />
innych detektorów, takich jak spektrofotometryczny UV lub fluorescencyjny<br />
charakteryzują się wyższymi granicami oznaczalności (LOQ, ang. Limit of<br />
Quantification), z tego względu są rzadko stosowane [47]. Rozdzielenie analitów<br />
zachodzi na kolumnach działających w odwróconym układzie faz, najczęściej<br />
na złożu C18 [26, 28-30, 48] z elucją gradientową, podczas której<br />
zmienia się ilościowy stosunek fazy ruchomej A do fazy ruchomej B. Detek-<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
69<br />
cja analitów prowadzona jest w trybie SIM (ang. Selective Ion Monitoring),<br />
MRM (ang. Multiple Reaction Monitoring) lub SRM (ang. Selected Reaction<br />
Monitoring). Do jonizacji związków wykorzystuje się technikę elektrorozpraszania<br />
(ESI, ang. Electrospray Ionization). Nową techniką oznaczania tych<br />
leków jest ultraszybka chromatografia cieczowa (UPLC) (ang. Ultra Performance<br />
Liquid Chromatography) z detekcją masową [18], z tym, że ze<br />
względu na wysoki koszt aparatury oraz problemy z uzyskaniem prawidłowych<br />
kształtów sygnałów chromatograficznych wynikających z niekontrolowanych<br />
efektów termicznych związanych z tarciem fazy ruchomej o ziarna<br />
wypełnienia kolumny (lub strukturę porowatą w przypadku kolumn monolitycznych),<br />
jest niezbyt często stosowana. Granice oznaczalności są porównywalne<br />
do uzyskiwanych z wykorzystaniem standardowej chromatografii<br />
cieczowej, jednak po zoptymalizowaniu warunków rozdzielenia chromatograficznego<br />
analiza staje się szybsza i zużywane są mniejsze ilości organicznych<br />
rozpuszczalników.<br />
3.2.2. Chromatografia gazowa<br />
(Gas chromatography)<br />
Chromatografia gazowa (GC, ang. Gas Chromatography) to technika<br />
rozdzielania, która ze względu na niższe koszty oraz korzystniejsze parametry<br />
rozdzieleń chromatograficznych jest coraz częściej wykorzystywana<br />
do analizy β-blokerów i β-agonistów. Polarny charakter analitów sprawia, że<br />
przed analizą GC niezbędne jest przeprowadzenie analizowanych związków<br />
w postać lotnych pochodnych. Pochodne omawianych leków tworzą się<br />
szybko i są stabilne termicznie. Ze względu na podobną budowę chemiczną<br />
β-blokerów i β-adrenomimetyków z powodzeniem mogą być równocześnie<br />
przeprowadzane w lotne pochodne [31].<br />
Rozdzielenie leków nasercowych i przeciwastmatycznych przeprowadza<br />
się głównie na fazach stacjonarnych średniopolarnych, które składają<br />
się z 5% fenylu i 95% metylopolisiloksanu (kolumny: HP5ms, DB5ms, XTI-5)<br />
[31, 44, 49-53]. Sporadycznie analizy wykonuje się na fazie niepolarnej zawierającej<br />
metylopolisiloksan (kolumna HP-ULTRA-1) [33]. Aby osiągnąć<br />
niskie granice wykrywalności i oznaczalności próbki wprowadza się do dozownika<br />
ogrzanego do temperatury od 230–280°C najczęściej bez dzielenia<br />
strumienia (tryb splitless). Rozdział przeprowadza się stosując program<br />
temperaturowy, przy czym początkowa temperatura mieści się w zakresie<br />
50–150°C, natomiast końcowa w przedziale 280–320°C.<br />
Do oznaczania β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych<br />
stosowany jest prawie wyłącznie detektor masowy. Jak dotąd brakuje doniesień<br />
naukowych o zastosowaniu detektorów bardziej selektywnych – fosforowo-azotowego<br />
(NPD) (ang. Nitrogen Phosphorus Detector) oraz wychwytu<br />
elektronów (ECD) (ang. Electron Capture Detector). Drugi z wymienionych<br />
detektorów mógłby być stosowany po przeprowadzeniu analitów w pochodne<br />
z bezwodnikami kwasów perfluorowanych.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
70 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
3.2.2.1. Derywatyzacja<br />
(Derivatization)<br />
Spośród wszystkich metod derywatyzacji najczęściej korzysta się z<br />
trimetylosililowania za pomocą MSTFA (N-metylo-N-trimetylosililo-trifluoroacetamid)<br />
[49, 51-52] lub BSTFA (N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid)<br />
[44]. Reakcję prowadzi się najczęściej w temperaturze 60°C w czasie 30 min<br />
w obecności katalizatora – 33% TMCS (trimetylochlorosilanu). Przykładową<br />
reakcję metoprololu z odczynnikiem sililującym BSTFA przedstawiono na<br />
Rysunku 2. Produktem jest lotna pochodna zawierająca w grupie hydroksylowej<br />
zamiast atomu wodoru grupę trimetylosililową (TMS) (metoprolol O-<br />
TMS). Dla innych przedstawicieli β-blokerów i β-agonistów tworzą się podobnie,<br />
podstawione przy atomie tlenu pochodne O-TMS. Jedynie w nielicznych<br />
przypadkach (jak dla pindololu) możliwe jest tworzenie się pochodnych,<br />
w których grupa TMS przyłącza się do atomu azotu (pochodne N-TMS) [53].<br />
Rys. 2. Schemat reakcji sililowania metoprololu z zastosowaniem odczynnika BSTFA.<br />
Fig. 2. Metoprolol silylation reaction scheme using BSTFA.<br />
Można także przeprowadzić sililowanie przy pomocy MTBSTFA (Ntert-butylodimetylosililo-N-metylotrifluoroacetamidu).<br />
Uzyskuje się wówczas<br />
pochodne tert-butylodimetylosililowe (pochodne O- i N-TBDMS) [50]. Otrzymywanie<br />
acetylowych pochodnych leków nasercowych i przeciwastmatycznych<br />
ogranicza się do zastosowania jako reagenta PFPA (bezwodnika<br />
kwasu pentafluoropropionowego) w obecności octanu etylu (PFPA: octan<br />
etylu, 1:1, v/v) [34]. Wykorzystywana jest także derywatyzację sekwencyjną<br />
z użyciem MSTFA i MBTFA (N-metylo-bis(trifluoroacetamidu) [31]. Pierwszy<br />
etap tej procedury przebiega z odczynnikiem sililującym. Następnie próbkę<br />
schładza się, dodaje odczynnik acylujący i ponownie inkubuje.<br />
Do derywatyzacji β-blokerów i β-agonistów stosowane są także innego<br />
rodzaju odczynniki spochadniające (np. HMDS, TMSI, TFAA). Porównania<br />
metod derywatyzacji tych dwóch grup leków dokonano w publikacji<br />
[53].<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Tabela 4. Oznaczania β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych z wykorzysta-..<br />
niem techniki GC-MS oraz LC-MS<br />
Table 4. Determination of β-blockers and β-agonists in environmental samples by GC-MS..<br />
and LC-MS technique<br />
Związki<br />
Compound<br />
Metoprolol<br />
Nadolol<br />
Propranolol<br />
Salbutamol<br />
Terbutalina<br />
Acebutolol<br />
Metoprolol<br />
Nadolol<br />
Pindolol<br />
Propranolol<br />
Salbutamol<br />
Terbutalina<br />
Matryca / Kolumna SPE<br />
Matrix / SPE cartridge<br />
Ścieki oczyszczone<br />
Treated wastewater<br />
C18-EC<br />
Ścieki oczyszczone<br />
Treated wastewater<br />
Oasis MCX<br />
Oznaczenie końcowe<br />
Final determination<br />
Derywatyzacja:<br />
MSTFA/MBTFA; GC/MS<br />
Kolumna: XTI – 5 (30 m x<br />
0,25 mm x 25 µm)<br />
Temp. dozownika: 230°C w<br />
trybie splitless<br />
Program temp: 2 min w<br />
50°C, 16°C/min do 180°C,<br />
4°C/min do 290°C, 7 min w<br />
temp. 290°C<br />
LC-MS/MS (SRM)<br />
Kolumna: SB-C8 (125 mm x<br />
2,1 mm x 5 µm)<br />
Faza A: H2O: ACN: HCOOH (<br />
94,5:5:0,5, v/v),<br />
Faza B: ACN: HCOOH<br />
(99,5:0,5, v/v/v)<br />
Przepływ: 200 µl/min<br />
Odzysk<br />
Recovery<br />
[%]<br />
98<br />
125<br />
97<br />
42<br />
30<br />
95<br />
91<br />
88<br />
< 5<br />
91<br />
87<br />
81<br />
LOD/LO<br />
Q [ng/l]<br />
25/bd<br />
25/bd<br />
25/bd<br />
25/bd<br />
50/bd<br />
9/bd<br />
8/bd<br />
9/bd<br />
bd<br />
10/bd<br />
6/bd<br />
Bd<br />
Lit.<br />
31<br />
27<br />
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
71<br />
3.3. Przykładowe metody oznaczania β-blokerów i β-agonistów w<br />
próbkach środowiskowych<br />
(Exemplary methods of the β-blockers and β-agonists<br />
determination in environmental samples)<br />
Informacje dotyczące metod oznaczania β-blokerów i β-agonistów w<br />
próbkach środowiskowych technikami GC-MS oraz LC-MS przedstawiono w<br />
Tabeli 4.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
Atenolol<br />
Metoprolol<br />
Propranolol<br />
Atenolol<br />
Metoprolol<br />
Propranolol<br />
Salbutamol<br />
Atenolol<br />
Acebutolol<br />
Metoprolol<br />
Nadolol<br />
Pindolol<br />
Propranolol<br />
Atenolol<br />
Metoprolol<br />
Nadolol<br />
Salbutamol<br />
Terbutalina<br />
Ścieki oczyszczone<br />
Treated wastewater<br />
Oasis HLB<br />
Woda powierzchniowa<br />
Surface water<br />
Oasis MCX<br />
Ścieki nieczyszczone<br />
Raw wastewater<br />
Oasis MCX<br />
Woda powierzchniowa<br />
Surface water<br />
C18-EC<br />
LC/MS<br />
Kolumna: RP-C18 (250 mm x<br />
2 mm x 5 µm)<br />
Faza A: 20 mmol NH3 w 900<br />
ml wody zakwaszony kwasem<br />
octowym do pH = 5,7 i 100 ml<br />
ACN, Faza B: 40% eluentu A i<br />
60% ACN<br />
Przepływ: 300 µl/min<br />
UPLC/MS<br />
Kolumna: RP-C18 (100 mm x<br />
1 mm x 1,7 µm)<br />
Faza A : H2O, MeOH,<br />
CH3COOH (94,5: 5: 0,5,<br />
v/v/v),<br />
Faza B: MeOH, CH3COOH<br />
(99,5: 0,5, v/v)<br />
Przepływ: 70 µl/min<br />
LC/MS/MS<br />
Kolumna: RP-C18 (250 mm x<br />
4,6 mm x 5 µm)<br />
Faza A: H2O, bufor<br />
HCOONH4 o pH= 3,8, Faza B:<br />
ACN<br />
Przepływ: 300 µl/min<br />
LC/MS<br />
Kolumna: RP-C18 (125 mm x<br />
3 mm x 5 µm)<br />
Faza A: H2O, ACN<br />
zawierający 5 mmoli NH4OAc<br />
o pH = 7,5<br />
i 10 % ACN, Faza B: 40%<br />
fazy A i 60% ACN<br />
Przepływ: 400 µl/min<br />
112<br />
42<br />
57<br />
90<br />
55,4<br />
40<br />
88,2<br />
68<br />
68<br />
62<br />
60<br />
10<br />
66<br />
98<br />
98<br />
114<br />
61<br />
22<br />
bd/10 – 20<br />
bd/10 – 20<br />
bd/10 – 20<br />
0,2/1<br />
0,1/0,5<br />
0,1/0,5<br />
0,1/0,5<br />
0,3/bd<br />
0,4/bd<br />
0,5/bd<br />
0,3/bd<br />
0,3/bd<br />
0,2/bd<br />
bd/5<br />
bd/5<br />
bd/5<br />
bd/5<br />
bd/10<br />
18<br />
17<br />
30<br />
26<br />
72 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
73<br />
4. Podsumowanie<br />
Analityka farmaceutyków w próbkach środowiskowych rozwija się w<br />
szybkim tempie. Dzięki temu coraz więcej leków (w tym β-blokerów i β-agonistów)<br />
występujących w środowisku na niskich poziomach stężeń może<br />
zostać wykryta i oznaczona. Spowodowane jest to z jednej strony znaczącym<br />
postępem w opracowaniu efektywnych technik ekstrakcji farmaceutyków,<br />
z drugiej - rozwojem metod analitycznych, szczególnie chromatografii<br />
cieczowej i chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrem mas<br />
(układy LC-MS; LC-MS/MS; GC-MS i GC-MS/MS). Zwiększona niezawodność<br />
oznaczeń wynika przede wszystkim z możliwości zastosowania trybu<br />
MRM, zwłaszcza podczas analizy próbek wieloskładnikowych. Dzięki temu<br />
analityka β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych na poziomach<br />
stężeń ng/l, nie jest kłopotliwa, pod warunkiem, że anality zostały właściwie<br />
wyizolowane, oczyszczone i wzbogacone.<br />
Najpopularniejszą techniką izolacji β-blokerów i β-agonistów z wodnych<br />
próbek środowiskowych jest ekstrakcja do fazy stałej (SPE). β-Blokery i<br />
β-agoniści są związkami o charakterze zasadowym, zatem mogą być selektywnie<br />
wychwytywane za pomocą złóż kationowymiennych (np. Strata-X-C,<br />
Oasis MCX), bądź łącznie z innymi polarnymi związkami z użyciem uniwersalnych<br />
sorbentów kopolimerycznych (m.in. Strata-X, Oasis HLB). Odzysk β-<br />
blokerów i β-agonistów z użyciem obu rodzajów złóż jest zadowalający,<br />
także podczas analizy próbek ścieków. Należy podkreślić, że w literaturze<br />
prezentowany jest najczęściej odzysk względny, podczas gdy wartość odzysku<br />
bezwzględnego, szczególnie w przypadku ścieków nieoczyszczonych,<br />
może być znacznie niższa.<br />
Duża wartość odzysku nie musi się łączyć z wystarczającym stopniem<br />
oczyszczenia próbki, stąd mogą pojawić się problemy z analizą ilościową i<br />
jakościową β-blokerów i β-agonistów w uzyskanych ekstraktach. Negatywne<br />
efekty matrycowe ujawniają się znacznie częściej w przypadku stosowania<br />
chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem mas wyposażonym<br />
w źródło jonów ESI, niż przy użyciu techniki GC-MS lub GC-MS/MS.<br />
W związku z tym, zainteresowanie analityków środowiskowych kieruje<br />
się w stronę chromatografii gazowej z detekcją masową, ponieważ w źródle<br />
jonów EI efekt supresji jonów praktycznie nie występuje. Ponadto kolumny<br />
analityczne stosowane w chromatografii gazowej charakteryzują się większymi<br />
zdolnościami rozdzielczymi niż używane w technice HPLC, a chromatograf<br />
gazowy może być wyposażony w bardziej czułe i selektywne detektory,<br />
np. ECD i NPD. Dodatkową korzyścią jest ograniczenie ilości zużywanych<br />
rozpuszczalników organicznych.<br />
Zastosowanie chromatografii gazowej wiąże się jednak z koniecznością<br />
derywatyzacji polarnych analitów. Podczas analizy β-blokerów i β-agonistów<br />
nie stanowi to jednak problemu gdyż powszechnie dostępny odczynnik<br />
sililujący BSTFA efektywnie przekształca anality w lotne pochodne, także<br />
w próbkach środowiskowych.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
74 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
Stosując technikę GC-MS oraz LC-MS do oznaczania β-blokerów i β-<br />
agonistów wykazano ich powszechną obecność w wielu komponentach środowiska.<br />
Informacje te służą do badania dróg rozprzestrzeniania się tych<br />
farmaceutyków w ekosystemie, ich stężeń w poszczególnych jego komponentach<br />
oraz do oceny ryzyka ekotoksykologicznego. W Polsce prowadzone<br />
są także prace mające na celu usprawnienie analityki tych polarnych zanieczyszczeń<br />
środowiska oraz oszacowanie ryzyka środowiskowego.<br />
Summary<br />
Analytics of pharmaceuticals in environmental samples is developing<br />
quickly. Thus more drugs (including ß-blockers and ß-agonists) occurring in<br />
the environment at low concentration levels can be detected and identified.<br />
This is due to significant progress in developing efficient extraction<br />
techniques for pharmaceutical as well as the development of analytical<br />
methods, especially liquid chromatography and gas chromatography with<br />
mass spectrometer (LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS and GC-MS/MS).<br />
Increased reliability of determinations results mainly from the possibility to<br />
use the MRM mode, especially when complex samples are analysed. In this<br />
way determination of ß-blockers and ß-agonist in environmental at<br />
concentration levels of ng/L is not troublesome, but analytes have to be<br />
properly isolated, purified and enriched.<br />
The most popular technique for isolation of ß-blockers and ß-agonists<br />
from aqueous environmental samples is solid-phase extraction (SPE). These<br />
drugs can be selectively trapped by cation-exchange sorbents because of<br />
their basic character (e.g. Strata-XC, Oasis MCX) or together with other<br />
polar compounds using the universal copolymer sorbents (including Strata-<br />
X, Oasis HLB). Recoveries of ß-blockers and ß-agonists with usage of both<br />
types of sorbents are satisfactory, also for wastewater samples. It should be<br />
emphasized that recovery is usually presented in relative way. Absolute<br />
recovery, especially obtained for raw sewage, may be much lower.<br />
High level of recovery does not have to be associated with sufficient<br />
sample purification, so there may be problems with quantitative and<br />
qualitative ß-blockers and ß-agonists analysis. Negative matrix effects show<br />
up more often in cases of using liquid chromatography coupled with mass<br />
spectrometer equipped with an ESI ion source, than with usage of GC-MS or<br />
GC-MS/MS techniques.<br />
Therefore, environmental analysts’ interest is directed toward the gas<br />
chromatography with mass detection, because in the EI ion source ion<br />
suppression practically does not occur. In addition, analytical columns used<br />
in gas chromatography are characterized by larger separation ability than<br />
those used in HPLC. Further gas chromatograph can be equipped with more<br />
sensitive and selective detectors such as ECD and NPD. An additional<br />
benefit is reduced amount of organic solvent.<br />
Although gas chromatography involves the necessity of derivatization<br />
of polar analytes, derivatization of ß-blockers and ß-agonists analysis is not<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
75<br />
a problem. Commonly available silylating reagent BSTFA effectively<br />
converts the analytes into volatile derivatives, also in environmental<br />
samples.<br />
Using the GC-MS and LC-MS techniques for ß-blockers and ß-<br />
agonists determination can demonstrate common presence of these<br />
pharmaceuticals in various components of the environment. This knowledge<br />
can be useful in studying the spread of these pharmaceuticals in the<br />
ecosystem and accessing the ecotoxicological risk. Also in Poland we are<br />
working on improving the analysis of polar environmental pollution and<br />
estimating the risk caused by them.<br />
Podziękowania<br />
(Acknowledgements)<br />
Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego<br />
w ramach projektu badawczego numer N N204 260237 (2009-2012) oraz<br />
DS 8110-4-0085-1.<br />
Literatura<br />
(References)<br />
1. B.I. Escher, N. Brama, M. Richter, J. Lineret, Comparative<br />
ecotoxicological hazard assessment of beta-blockers and their human<br />
metabolites using a mode-of-action-based test battery and QSAR<br />
approach, Environ. Sci. Technol., 40(2006)7402-7408.<br />
2. L.H.M.L.M. Santos, A.N. Araújo, A. Fachini, A. Pena, C. Delerue-Matos,<br />
M.C.B.S.M. Montenegro, Ecotoxicological aspects related to the<br />
presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. J. Hazard.<br />
Mater., 175(2010)45-95.<br />
3. B.I. Escher, K. Fenner, Recent Advances in Environmental Risk<br />
Assessment of Transformation Products, Environ. Sci. Technol.,<br />
45(2011)3835–3847.<br />
4. D. Fatta-Kassinos, S. Meric, A. Nikolaou, Pharmaceutical residues in<br />
environmental waters and wastewater: current state of knowledge and<br />
future research., Anal. Bioanal. Chem., 399(2011)251–275.<br />
5. C. Carlsson, A.K. Johansson, G. Alvan, K. Bergman, T. Kühler, Are<br />
pharmaceuticals potent environmental pollutants? Part II:<br />
Environmental risk assessments of selected pharmaceutical excipients.,<br />
Sci. Total Environ., 364(2006)67-87.<br />
6. H. Byrtus, G. Chłoń, M. Gorczyca, B. Łucka-Sobstel, B. Malawska,<br />
J. Obniska, M. Pawłowski, A. Zejc, “Chemia leków dla studentów<br />
farmacji i farmaceutów”, Chemistry of drugs for pharmacy students and<br />
pharmacists, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2002.<br />
7. A. Danysz, R. Gryglewski, pod red., „Farmakologia podręcznik dla<br />
studentów medycyny”, Pharmacology handbook for medical students,<br />
Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa, 1977.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
76 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
8. W. Kostowski, S.Z. Herman, pod red., „Farmakologia: podstawy<br />
farmakologii podręcznik dla studentów medycyny i lekarzy”,<br />
Pharmacology: Basic pharmacology handbook for students of medicine<br />
and doctor, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2008.<br />
9. www.antydoping.pl/plik/2009/File/2009/01/lista_zabroniona_wada_2010<br />
_pl.pdf<br />
10. W. Buczko, T.F. Krzemiński, S.J. Czuczwar, „Farmakologia Goodmana<br />
& Gilmana”, Farmacology of Goldman & Gilman, tom I, Czelej, Lublin,<br />
2007.<br />
11. J.K. Podlewski, A. Chwalibogowska-Podlewska, „Leki współczesnej<br />
terapii, Encyklopedia dla lekarzy i farmaceutów”, Drugs of contemporary<br />
treatment, Encyclopedia for doctors and pharmacists, wydanie XX, tom<br />
I i II, Medical Tribune Polska, Warszawa, 2010.<br />
12. C. Jiménez, R. Ventura, X. de la Torre, J. Segura, Strategies for internal<br />
quality control in antidoping analyses, Anal. Chim. Acta, 460(2002)389-<br />
307.<br />
13. C. Miège, M. Favier, C. Brosse, J. Canler, M. Coquery, Occurence of<br />
betablockers In effluents of wastewater treatment plants from the Lyone<br />
area (France) and risk assessment for the downstream rivers, Talanta,<br />
70(2006)739-744.<br />
14. N.M. Vieno, T. Tuhkanen, L. Kronberg, Analysis of neutral and basic<br />
pharmaceuticals in sewage treatment plants and in recipient rivers<br />
using solid phase extraction and liquid chromatography–tandem mass<br />
spectrometry detection, J. Chromatogr. A, 1134(2006)101–111.<br />
15. D.B. Huggett, I.A. Khan, C.M. Foran, D. Schlenk, Determination of betaadrenergic<br />
receptor blocking pharmaceutical in United States<br />
wastewater effluent, Environ. Poll., 121(2003)199–205.<br />
16. F. Sacher, F.T. Lange, H. Brauch, I. Blankenhorn, Pharmaceuticals in<br />
groundwaters: Analytical methods and results of a monitoring program<br />
in Baden-Württemberg, Germany, J. Chromatogr. A, 938(2001)199–<br />
210.<br />
17. B. Kasprzyk-Hordern, R.M. Dinsdale, A.J. Guwy, Multi-residue method<br />
for the determination of basic/neutral pharmaceuticals and illicit drugs in<br />
surface water by solid-phase extraction and ultra performance liquid<br />
chromatography–positive electrospray ionisation tandem mass<br />
spectrometry, J. Chromatogr. A, 1161(2007)132–145.<br />
18. A.C. Alder, C. Schaffner, M. Majewsky, J. Klasmeier, K. Fenner, Fate of<br />
β-blocker human pharmaceuticals in surface water: Comparison of<br />
measured and simulated concentrations in the Glatt Valley Watershed,<br />
Switzerland, Water Res., 44(2010)936-948.<br />
19. R. Andreozzi, M. Raffaele, P. Nicklas, Pharmaceuticals in STP effluents<br />
and their solar photodegradation in aquatic environment, Chemosphere,<br />
50(2003)1319–1330.<br />
20. Q.T. Liu, H. Williams, Kinetics and degradation products for direct<br />
photolysis of β-blockers in water, Environ. Sci. Technol., 41(2007)803-<br />
810.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
77<br />
21. R.A. Trenholm, B.J. Vanderford, S.A. Snyder, On-line solid phase<br />
extraction LC-MS/MS analysis of pharmaceuticals indicator in water:<br />
A green alternative to conventional methods, Talanta, 79(2009)1425-<br />
1432.<br />
22. S. Weigel, R. Kallenborn, H. Hühnerfuss, Simultaneous solid-phase<br />
extraction of acidic, neutral and basic pharmaceuticals from aqueous<br />
samples at ambient (neutral) pH and their determination by gas<br />
chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1023(2004)183-<br />
195.<br />
23. E. Pujos, C. Cren-Olivé, O. Paisse, M.M. Flament-Waton, M.F. Grenier-<br />
Loustalot, Comparison of the analysis of β-blockers by different<br />
techniques, J. Chromatogr. B, 877(2009)4007–4014.<br />
24. R. Andreozzi, M. Raffaele, P. Nicklas, Pharmaceuticals in STP effluents<br />
and their solar photodegradation in aquatic environment, Chemosphere,<br />
50(2003)1319–1330.<br />
25. T.A. Ternes, Analytical methods for the determination of<br />
pharmaceuticals in aqueous environmental samples, Trends Anal.<br />
Chem., 8(2001)419-434.<br />
26. H. Lee, K. Sarafin, T.E. Peart, Determination of β-blockers and β 2 -<br />
agonists in sewage by solid-phase extraction and liquid<br />
chromatography–tandem mass spectrometry, J. Chromatogr.<br />
A, 1148(2007)158–167.<br />
27. M.D. Hernando, M. Petrovic, A.R. Fernández-Alba, D. Barceló, Analysis<br />
by liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass<br />
spectrometry and acute toxicity evaluation for β-blockers and lipidregulating<br />
agents in wastewater samples, J. Chromatogr.<br />
A, 1046(2004)133–140.<br />
28. M. Scheurer, M. Ramil, C.D. Metcalfe, S. Groh, T.A. Ternes, The<br />
challenge of analyzing beta-blocker drugs in sludge and wastewater,<br />
Anal. Bioanal. Chem., 396(2009)845-856.<br />
29. A. Piram, A. Salvador, J. Gauvrit, P. Lanteri, R. Faure, Development<br />
and optimisation of a single extraction procedure for the LC/MS/MS<br />
analysis of two pharmaceutical classes residues in sewage treatment<br />
plant, Talanta, 74(2008)1463–1475.<br />
30. T.A. Ternes, R. Hirsch, J. Mueller, K. Haberer, Methods for the<br />
determination of neutral drugs as well as betablockers and β 2 -<br />
sympathomimetics in aqueous matrices using GC/MS and LC/MS/MS,<br />
J. Anal. Chem., 362(1998)329-340.<br />
31. S.L. MacLeod, P. Sudhir, C.S. Wong, Stereoisomer analysis of<br />
wastewater-derived β-blockers, selective serotonin re-uptake inhibitors,<br />
and salbutamol by high-performance liquid chromatography–tandem<br />
mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1170(2007)23–33.<br />
32. J. Namieśnik, Z. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres, „Przygotowanie<br />
próbek środowiskowych do analizy”, Preparation of environmental<br />
samples for analysis, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa,<br />
2000.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
78 M. Caban, A. Michalak, J. Kumirska<br />
33. M.K. Angier, R.J. Lewis, A.K. Chaturvedi, D.V. Canfield, Gas<br />
Chromatographic/Mass Spectrometric Differentiation of Atenolol,<br />
Metoprolol, Propranolol, and an Interfering Metabolite Product of<br />
Metoprolol, J. Anal. Toxicol., 29(2005)517–521.<br />
34. M. Kostopoulou, A. Nikolaou, Analytical problems and the need for<br />
sample preparation in the determination of pharmaceuticals and their<br />
metabolites in aqueous environmental matrices, Trends Anal. Chem.,<br />
27(2008)1023-1035.<br />
35. D. Fatta, A. Nikolaou, A. Achilleos, S. Meriç, Analytical methods for<br />
tracing pharmaceutical residues in water and wastewater, Trends Anal.<br />
Chem., 26(2007)515-533.<br />
36. D.B. Huggett, I.A. Khan, C.M. Foran, D. Schlenk, Determination of betaadrenergic<br />
receptor blocking pharmaceutical in United States<br />
wastewater effluent, Environ. Poll., 121(2003)199–205.<br />
37. J. Stevens-Garmon, J.E. Drewes, S.T. Khan, J.A. McDonald, E.R.V.<br />
Dickenson, Sorption of emerging trace organic compounds onto<br />
wastewater sludge solids, Water Res., 45(2011)3417-3426.<br />
38. K.J. Bisceglia, J.T. Yu, M. Coelhan, E.J. Bouwer, A.L. Roberts, Trace<br />
determination of pharmaceuticals and other wastewater-derived<br />
micropollutants by solid phase extraction and gas<br />
chromatography/mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 217(2010)558–<br />
564.<br />
39. M. Gros, T.M. Pizzolato, M. Petrović, M.J.L. de Alda, D. Barceló, Trace<br />
level determination of β-blockers in waste waters by highly selective<br />
molecularly imprinted polymers extraction followed by liquid<br />
chromatography-quadrupole-linear ion trap mass spectrometry,<br />
J. Chromatogr. A, 1189(2008)374-384.<br />
40. S. Castiglioni, R. Bagnati, D. Calamari, R. Fanelli, E. Zuccato,<br />
A multiresidue analytical method using solid-phase extraction and highpressure<br />
liquid chromatography tandem mass spectrometry to measure<br />
pharmaceuticals of different therapeutic classes in urban wastewaters,<br />
J. Chromatogr. A, 1092(2005)206-215.<br />
41. R. Rodil, J.B. Quintana, P. López-Mahía, S. Muniategiu-Lorenzo,<br />
D. Prada-Rodríguez, Multi-residue analytical method for the<br />
determination of emerging pollutants in water by solid-phase extraction<br />
and liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr.<br />
A, 1216(2009)2958-2969.<br />
42. J. Bones, K. Thomas, P.N. Nesterenko. B. Paull, Dual gradient LC<br />
method for the determination of pharmaceutical residues in<br />
environmental samples using a monolithic silica reversed phase<br />
column, Talanta, 70(2006)1117-1128.<br />
43. R.S. Kadam, U.B. Kompella, Cassette analysis of eight beta-blockers in<br />
bovine eye sclera, choroid-RPE, retina and vitreous by liquid<br />
chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr.<br />
B, 877(2009)253-260.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów…<br />
79<br />
44. C. Basheer, J. Lee, S. Petersen-Bjergaard, K.E. Rasmussen, H.K. Lee,<br />
Simultaneous extraction of acidic and basic drugs at neutral sample pH:<br />
a novel electro-mediated microextraction approach, J. Chromatogr.<br />
A, 1217(2010)6661-6667.<br />
45. M. Moeder, S. Schrader, M. Winkler, P. Popp, Solid-phase<br />
microextraction–gas chromatography–mass spectrometry of biologically<br />
active substances in water samples, J. Chromatogr. A, 873(2000)95-<br />
105.<br />
46. X. Hu, J. Pan, Y. Hu, G. Li, Preparation and evaluation of propranolol<br />
molecularly imprinted solid-phase microextraction fiber for trace<br />
analysis of β-blockers in urine and plasma samples, J. Chromatogr.<br />
A, 1216(2009)190-197.<br />
47. V. Ranta, E. Toropainen, A. Talvitie, S. Auriola, A. Urtti, Simultaneous<br />
determination of eight β-blockers by gradient high-performance liquid<br />
chromatography with combined ultraviolet and fluorescence detection in<br />
corneal permeability studies in vitro, J. Chromatogr. B, 772(2002)81-87.<br />
48. B. Yilmaz, S. Arslan, V. Akba, Gas chromatography–mass spectrometry<br />
method for determination of metoprolol in the patients with<br />
hypertension, Talanta, 80(2009)346–351.<br />
49. M.J. Paik, D.T. Nguyen, K.R. Kim, GC and MS Properties of β-Blockers<br />
as tert-Butyldimethylsilyl Derivatives and as Ethoxyxarbonyl/<br />
Trimethylsilyl Derivatives, Chromatogr., 64(2006)673-679.<br />
50. L. Damasceno, R. Ventura, J. Ortuño, J. Segura, Derivatization<br />
procedures for the detection of β 2 -agonists by gas<br />
chromatographic/mass spectrometric analysis, J. Mass Spectrom.,<br />
35(2000)1285–1294.<br />
51. G. Forsdahl , T. Geisendorfer, G. Gnneiner, Identification of isopropyl<br />
substituted β-blocking agents in human urine by gas chromatography<br />
and tandem mass spectrometry, Chromatogr., 57(2003)519-524.<br />
52. W. Liu, L. Zhang, Z. Wei, S. Chen, G. Chen, Analysis of β-agonists and<br />
β-blockers in urine using hollow fibre-protected liquid-phase<br />
microextraction with in situ derivatization followed by gas chromatography/mass<br />
spectrometry, J. Chromatogr. A,1216(2009)5340–5346.<br />
53. M. Caban, P. Stepnowski, M. Kwiatkowski, N. Migowska, J. Kumirska,<br />
Determination of β-blockers and β-agonists using gas chromatography<br />
and gas chromatography-mass spectrometry- a comparative study of<br />
the derivatization step, J. Chromatogr. A, 1218(2011)8110-8122.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
Camera Separatoria<br />
PRACE ORYGINALNE<br />
(ORIGINAL PAPERS)
CAMERA SEPARATORIA<br />
Volume 4, Number 1 / January 2012, 83-91<br />
Monika Waksmundzka-Hajnos, Anna Oniszczuk*, Rafał Podgórski<br />
Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny,<br />
Katedra Chemii, Zakład Chemii Nieorganicznej,<br />
ul. Chodźki 4A, 20-093 Lublin,<br />
*e-mail: aoniszczuk@o2.pl<br />
Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji na wydajność<br />
izolacji wybranych furanokumaryn z owoców gorysza<br />
wyniosłego (Peucedanum verticillare)<br />
Streszczenie: Analiza materiału roślinnego jest ważnym zadaniem w poszukiwaniu roślin o<br />
działaniu farmakologicznym a także w standaryzacji leków roślinnych. Celem każdego procesu<br />
ekstrakcji jest szybka i skuteczna izolacja związków z matrycy przy użyciu minimalnej ilości<br />
rozpuszczalnika. Celem przedstawionej pracy był wybór optymalnych warunków do analizy<br />
materiału roślinnego oraz zbadanie wpływu metody ekstrakcji na wydajność izolacji niektórych<br />
furanokumaryn z owoców gorysza wyniosłego. Furanokumaryny mają istotne zastosowanie w<br />
lecznictwie. Są między innymi wykorzystywane w terapii bielactwa i łuszczycy oraz leczeniu<br />
skórnego T-komórkowego chłoniaka z erytmodermią.<br />
Zastosowano następujące metody ekstrakcyjne: wyczerpująca ekstrakcja w aparacie Soxhleta,<br />
ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w temperaturze 20 i 60 ◦ C oraz ekstrakcja wspomagana<br />
mikrofalami w układzie otwartym i zamkniętym. Analiza została przeprowadzona metodą wysokosprawnej<br />
chromatografii cieczowej z detektorem UV/VIS. Wyniki wskazują, że najwyższą<br />
wydajność imperatoryny uzyskano w wyniku ekstrakcji ultradźwiękowej 60 ◦ C, natomiast metodą<br />
najskuteczniejszą do izolacji umbeliferonu okazała się ekstrakcja mikrofalowa w układzie zamkniętym.<br />
Słowa kluczowe: furanokumaryny, gorysz wyniosły, ekstrakcja ciało stałe – ciecz,<br />
wysokosprawna chromatografia cieczowa<br />
Influence of the extraction type on the yield of some<br />
furanocoumarins from Peucedanum verticillare fruits<br />
Abstract: Analysis of plant material is an important task in chemotaxonomical investigations,<br />
particularly, in search of plants with pharmacological activity or in standardisation of plant drugs.<br />
The goal of every extraction process is rapid and effective isolation of compounds from a matrix<br />
by use of minimum amount of solvent. The aim of this paper was the choice of optimal conditions<br />
for the analysis of plant material and effect of extraction method on the yield of some<br />
furanocoumarins from Peucedanum verticillare fruits. Furanocoumarins have important uses in<br />
human medicine and exhibit toxicity against a wide range of organisms. This group of compounds<br />
reveal pharmacological activity. They are important drugs in vitiligo and psoriaris therapy<br />
and are also used in therapy erythrodermic variants of cutaneous T-cell lymphoma and<br />
chronic graft-versus-host disease.<br />
The following extraction methods were used in our experiments: exhaustive extraction in Soxhlet<br />
apparatus, ultrasound- assisted solvent extraction (USAE) at 20 and 60 ◦ C as well as microwave-assisted<br />
solvent extraction in open and closed system (MASE). Target compounds analysis<br />
was performed by high performance liquid chromatography with UV/VIS detector. The results<br />
indicated that, the highest yield of imperatorin can be obtained by ultrasonification at 60 ◦ C,<br />
while microwave-assisted solvent extraction in closed system is very efficient in the extraction of<br />
umbelliferone.<br />
Keywords: furanocoumarins, peucedanum verticillare, solid-liquid extraction, high performance<br />
liquid chromatograph
84 M. Waksmundzka-Hajnos, A. Oniszczuk, R. Podgórski<br />
1. Wstęp<br />
(Introduction)<br />
W całym toku analizy wstępna obróbka surowców jest jednym z bardziej<br />
czasochłonnych procesów, a szczególnie dotyczy to próbek stałych [1].<br />
Techniki ekstrakcyjne nie są bezpośrednio metodami analizy ilościowej,<br />
ale mają duże znaczenie jako metody przygotowania próbek do analizy.<br />
Ekstrakcja rozpuszczalnikiem stałej próbki, powszechnie znana jako ekstrakcja<br />
ciało stałe - ciecz (LSE liquid - solid extraction) lub ługowanie jest<br />
procesem, jakiemu poddaje się na początku analizowany materiał. Celem<br />
każdej techniki ekstrakcyjnej jest szybkie i efektywne wyizolowanie pożądanych<br />
substancji z matrycy, przy użyciu jak najmniejszej ilości rozpuszczalników<br />
[2].<br />
Przedmiotem niniejszych badań były wybrane furanokumaryny pochodzące<br />
z owoców gorysza wyniosłego (Peucedanum verticillare). Związki kumarynowe<br />
stanowią rozpowszechnioną w świecie roślinnym grupę metabolitów<br />
wtórnych, szeroko stosowanych w lecznictwie. Ważne właściwości lecznicze<br />
posiadają zwłaszcza furanokumaryny. Jest to tzw. działanie fotosensybilizujące,<br />
wykorzystywane w leczeniu bielactwa nabytego skóry (vitiligo), znane<br />
już przed setkami lat przez Egipcjan i Indian [3]. Poza działaniem fotouczulającym<br />
kumaryny posiadają zdolność hamowania syntezy DNA, co w skojarzeniu<br />
z promieniowaniem UV (324–400 nm i 232–325 nm) wykorzystuje się<br />
w leczeniu łuszczycy (psoriasis). Spora grupa furanokumaryn wykazuje aktywność<br />
przeciwgrzybiczną oraz bakteriostatyczną [4, 5].<br />
Aktywność biologiczna i farmakologiczna kumaryn jest bardzo zróżnicowana<br />
i uzależniona od ich struktury chemicznej. W leczeniu chorób układu krążenia<br />
wykorzystuje się działanie rozkurczające naczynia wieńcowe, obniżające<br />
ciśnienie krwi oraz stężenie cholesterolu i lipidów we krwi, tonizujące naczynia<br />
włosowate. Niektóre kumaryny posiadają właściwości blokowania kanałów<br />
wapniowych w mięśniu sercowym oraz w naczyniach obwodowych<br />
[4-7].<br />
Właściwości spazmolityczne opisywanej grupy związków są wykorzystywane<br />
w schorzeniach dróg żółciowych. Działają one ponadto żółciopędnie<br />
i żółciotwórczo. Niektóre z nich posiadają aktywność przeciwbólową,<br />
przeciwzapalną, przeciwobrzękową i przeciwgorączkową, co związane jest z<br />
hamującym wpływem na cyklooksygenazę.<br />
Badania prowadzone w ostatnich latach ujawniły immunosupresyjne,<br />
diuretyczne [4, 8] oraz ochronne na wątrobę działanie kumaryn. Znane jest<br />
również działanie kumaryn na OUN. Niektóre z nich (np. 4-metylo-7-hydroksy-8-piperydyno-metylokumaryna)<br />
działają pobudzająco na ośrodkowy<br />
układ nerwowy, inne (angelicyna) wykazują działanie sedatywne i hipnotyczne<br />
[4, 6, 9].<br />
Należy również wspomnieć, iż związki te, a zwłaszcza furanokumaryny i<br />
piranokumaryny, pełnią funkcję ochronną dla roślin [6].<br />
W procesie ekstrakcji/ługowania metabolitów wtórnych z materiału<br />
roślinnego stosowanych jest wiele technik tradycyjnych jak: perkolacja, eks-<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji na wydajność izolacji wybranych…<br />
85<br />
trakcja w aparacie Soxhleta, ekstrakcja metodą ogrzewania na łaźni wodnej<br />
pod chłodnicą zwrotną. Obecnie coraz częściej spotykane są prace z wykorzystaniem<br />
do tego celu technik nowoczesnych takich jak: ekstrakcja wspomagana<br />
mikrofalami (MASE), ultradźwiękami (USAE), technika z wymuszonym<br />
przepływem rozpuszczalnika (ASE lub PLE) czy też ekstrakcja cieczą w<br />
stanie nadkrytycznym (SFE) oraz ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika<br />
próbki zmieszanej z wypełniaczem (MSPD) [10-12].<br />
Celem niniejszej pracy było porównanie metod ekstrakcyjnych takich<br />
jak: ekstrakcja w aparacie Soxhleta, ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami<br />
w temperaturze 20 C i 60 C oraz ekstrakcja wspomagana mikrofalami w<br />
układzie otwartym i zamkniętym w odniesieniu do wybranych furanokumaryn<br />
pochodzących z owoców gorysza wyniosłego pod kątem wydajności ekstrakcji,<br />
powtarzalności wyników, czasu i zużycia rozpuszczalników.<br />
2. Część eksperymentalna<br />
(The experimental part)<br />
2.1. Materiały i odczynniki<br />
(Materials and reagents)<br />
Dojrzałe owoce gorysza wyniosłego zebrano w Ogrodzie Farmakognostycznym<br />
UM w Lublinie. Wzorce kumaryn: umbeliferon i imperatorynę<br />
zakupiono w firmie Fluka, Buchs, Szwajcaria. Eter naftowy oraz metanol do<br />
przeprowadzenia ekstrakcji (cz.d.a) pochodziły z firmy POCh, Gliwice,<br />
Polska, metanol do chromatografii z firmy E. Merck, Darmstadt, Niemcy.<br />
2.2. Metodyka<br />
(Methodology)<br />
2.2.1. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta<br />
(Soxhlet extraction)<br />
Odważono 10 g surowca, umieszczono w gilzie z bibuły filtracyjnej i<br />
poddano wyczerpującej ekstrakcji eterem naftowym w aparacie Soxhleta w<br />
czasie 15 godzin, a następnie wyczerpującej ekstrakcji metanolem (tę samą<br />
porcję surowca) również w czasie 15 godzin.<br />
Uzyskane eterowe i metanolowe ekstrakty odparowano do sucha na<br />
wyparce próżniowej, a następnie rozpuszczono w metanolu i przeniesiono<br />
do kolbek miarowych o pojemności 100 ml i poddano analizie HPLC.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
86 M. Waksmundzka-Hajnos, A. Oniszczuk, R. Podgórski<br />
2.2.2. Ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w temperaturze<br />
pokojowej / w temperaturze 60 C.<br />
(Ultrasound assisted extraction at room temperature / at 60 C)<br />
Odważono 5 g surowca, umieszczono w kolbie stożkowej ze szlifem,<br />
zalano 100 ml eteru naftowego i umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na 30<br />
min; po tym czasie ekstrakt odsączono. Ekstrakcję powtórzono jeszcze dwa<br />
razy, zalewając surowiec takimi samymi, świeżymi porcjami eteru naftowego.<br />
Uzyskane eterowe i metanolowe ekstrakty przefiltrowano, odparowano<br />
do sucha na wyparce próżniowej, a następnie rozpuszczono w metanolu<br />
i przeniesiono do kolbek miarowych o pojemności 100 ml i poddano<br />
analizie HPLC.<br />
2.2.3. Ekstrakcja wspomagana mikrofalami (mikrofale otwarte)<br />
(Microwave assisted extraction- open microwave)<br />
Odważono 2 g surowca, umieszczono w naczyniu ekstrakcyjnym i<br />
zalano 20 ml 80% metanolu w wodzie. Ekstrakcję prowadzono w trzech<br />
etapach w aparacie Plasmotronika, Uni Clever, BMZ – 1 (Wrocław) o mocy<br />
600 W:<br />
- etap pierwszy obejmował ekstrakcję przy 40% mocy generatora, pod<br />
ciśnieniem atmosferycznym, w ciągu 1 minuty,<br />
- etap drugi obejmował ekstrakcję przy 60% mocy generatora, pod<br />
ciśnieniem atmosferycznym, w ciągu 30 minut,<br />
- etap trzeci to 10 minut oczekiwania.<br />
Ekstrakt przefiltrowano i uzupełniono metanolem w kolbce miarowej do<br />
objętości 50 ml i poddano analizie HPLC.<br />
2.2.4. Ekstrakcja wspomagana mikrofalami (mikrofale zamknięte)<br />
(Microwave assisted extraction- closed microwave)<br />
Odważono 2 g surowca, umieszczono w naczyniu ekstrakcyjnym i<br />
zalano 20 ml 80% metanolu. Ekstrakcję prowadzono w trzech etapach:<br />
- etap pierwszy obejmował ekstrakcję przy 40% mocy generatora, pod<br />
ciśnieniem 17–20 atm, w ciągu 1 minuty,<br />
- etap drugi obejmował ekstrakcję przy 60% mocy generatora, pod<br />
ciśnieniem 27–30 atm, w ciągu 30 minut,<br />
- etap trzeci to 10 minut oczekiwania.<br />
Ekstrakt przefiltrowano i uzupełniono metanolem w kolbce miarowej do<br />
objętości 50 ml i poddano analizie HPLC.<br />
2.2.5. Chromatografia analityczna<br />
(Chromatographic analysis)<br />
Wysokosprawną chromatografię cieczową stosowano w celu kontroli<br />
składu izolowanych frakcji (analiza jakościowa) jak też w celu analizy ilo-<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji na wydajność izolacji wybranych…<br />
87<br />
ściowej wybranych kumaryn w ekstraktach roslinnych. Stosowano odwrócone<br />
układy faz RP-18 / metanol + woda, w systemie gradientowym oraz<br />
metodę wzorca zewnętrznego [13].<br />
Rodzielenie chromatograficzne kumaryn przeprowadzono w temperaturze<br />
25 C przy użyciu chromatografu Shimadzu LC-10 AT VP HPLC z detektorem<br />
UV/VIS i dozownikiem próbki Rheodyne 20 μm, na kolumnie Suprelcosil<br />
TM LC-18 – 150 x 4.6mm, d p = 5 μm. Zastosowano gradient fazy<br />
ruchomej (woda + metanol: 0-10 min – 45% MeOH, 10-20 min – 45-55%<br />
MeOH, 20-30 min – 55-70% MeOH, 30-40 min – 70% MeOH) oraz metodę<br />
wzorca zewnętrznego stosując wzorce substancji oznaczanych – umbeliferonu<br />
i imperatoryny i wyznaczając krzywe kalibracyjne. Identyfikacja i pomiar<br />
pików przebiegały przy długości fali λ = 254 nm. Oznaczanie jakościowe<br />
przeprowadzono chromatograficznie oraz poprzez porównanie widm UV z<br />
widmami wzorców. Widma dla poszczególnych kumaryn były uzyskiwane<br />
metodą „stop-flow” w trakcie trwania analizy.<br />
Współczynniki regresji R 2 wszystkich krzywych kalibracyjnych wzorców były<br />
większe niż 0,999 (R 2 > 0,9990). Zakresy stężeń krzywych wzorcowych wynosiły:<br />
dla umbeliferonu 0,0001 mg/ml - 0,01 mg/ml, dla imperatoryny 0,01<br />
mg/ml - 1 mg/ml.<br />
Dokładność zastosowanych metod ekstrakcyjnych była sprawdzona za pomocą<br />
odzysków badanych substancji. Do próbek przed analizą dodano<br />
znane ilości roztworów wzorcowych (3 stężenia), a następnie przeprowadzono<br />
takie same czynności jak przy ekstrakcji próbek nie fortyfikowanych<br />
roztworami wzorców. Wykonano 3 powtórzenia dla każdego stężenia<br />
wzorca. Odzyski dla zastosowanych metod ekstrakcyjnych były w granicach<br />
95.34 - 102.00% i 92.67% - 95.65% odpowiednio dla umbeliferonu i imperatoryny.<br />
3. Wyniki i dyskusja<br />
(Results and discussion)<br />
Do izolacji furanokumaryn z owoców gorysza wyniosłego zastosowano<br />
następujące metody ekstrakcyjne: ekstrakcja w aparacie Soxhleta,<br />
ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w temperaturze 20 C i 60 C oraz<br />
ekstrakcja wspomagana mikrofalami w układzie otwartym i zamkniętym.<br />
Wyniki, zebrane w tabeli 1 wskazują, iż dobre rezultaty daje ekstrakcja ultradźwiękowa<br />
w 60 C – metoda prosta i możliwa do zastosowania w wielu laboratoriach.<br />
Najwięcej imperatoryny wyizolowano właśnie przy zastosowaniu<br />
ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami w podwyższonej temperaturze<br />
(60 C), najmniej natomiast podczas ekstrakcji wyczerpującej w aparacie<br />
Soxhleta.<br />
Z zastosowanych metod największy stopień odzysku umbeliferonu<br />
dawała ekstrakcja wspomagana mikrofalami w układzie zamkniętym, następnie<br />
USAE w 60 C, ekstrakcja w aparacie Soxhleta, USAE w 20 C i na<br />
końcu MASE w układzie otwartym.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
88 M. Waksmundzka-Hajnos, A. Oniszczuk, R. Podgórski<br />
Dla gorysza obserwujemy opisany już wcześniej przy pasternaku i<br />
arcydzięglu efekt działania mikrofal w układzie zamkniętym [10, 11]. W<br />
pierwszym etapie przeprowadzonego eksperymentu zastosowano dwie<br />
opcje ekstrakcji wspomaganej mikrofalami, a mianowicie MASE w układzie<br />
zamkniętym i w układzie otwartym. Wydajność ekstrakcji w układzie otwartym<br />
była dla imperatoryny wyższa niż w układzie zamkniętym. Możliwe jest,<br />
że podczas ekstrakcji mikrofalowej w układzie zamkniętym niektóre furanokumaryny<br />
(w przypadku ekstraktów uzyskanych arcydzięgla i pasternaku -<br />
prawdopodobnie imperatoryna lub felopteryna) podlegają rozkładowi lub<br />
izomeryzacji pod wpływem mikrofal i wysokiego ciśnienia [10, 11]. Przykładowy<br />
chromatogram kumaryn wyizolowanych z owoców gorysza przedstawia<br />
rysunek 1.<br />
Rys. 1.<br />
Fig. 1.<br />
Przykładowy chromatogram HPLC furanokumaryn wyizolowanych z owoców gorysza<br />
wyniosłego; metoda izolacji – ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w<br />
podwyższonej temperaturze (60 C). Pik o czasie retencji t R = 16,56 –<br />
niezidentyfikowany.<br />
Example of HPLC chromatogram of furanocoumarins isolated from Peucedarium<br />
verticilare fruits; isolation method – ultrasound assisted extraction at elevated<br />
temperature (60 C). Peak of t R = 16,56 – unidentified. Applied gradient mobile phase<br />
(water + methanol: 0-10 min - 45% MeOH, 10-20 min - 45-55% MeOH, 20-30 min -<br />
55-70% MeOH, 30-40 min - 70% MeOH and the internal standard method. Temp.<br />
25°C, wavelength λ= 254.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji na wydajność izolacji wybranych…<br />
89<br />
Tabela 1. Zależność wydajności ekstrakcji (mg/g SD) eterem naftowym i<br />
metanolem kumaryn z owoców gorysza wyniosłego od techniki<br />
ekstrakcyjnej<br />
Table 1. Effect of the extraction type on cumarins isolation efficiency<br />
(mg/g SD) from Peucedanum verticillare fruits using petroleum<br />
ether and methanol<br />
Metoda<br />
ekstrakcji/ługowania<br />
(Extraction/leaching<br />
technique)<br />
Extrahent<br />
(Extractant)<br />
Umbeliferon<br />
(Umbeliferone)<br />
(mg/g)<br />
Imperatoryna<br />
(Imperatorin)<br />
(mg/g)<br />
Eter naftowy<br />
(Petroleum ether)<br />
- 1.790 0.009<br />
Soxhlet<br />
MeOH 1.231 0.123 -<br />
Suma<br />
(Total)<br />
1.231 1.790<br />
Eter naftowy<br />
(Petroleum ether)<br />
- 1.890 0.246<br />
MeOH<br />
USAE 20 C<br />
1.189 0.123 0.161 0.005<br />
Suma<br />
1.189 2.051<br />
(Total)<br />
Eter naftowy<br />
(Petroleum ether)<br />
- 6.678 0.136<br />
USAE 60 o C<br />
MeOH 1.793 0.056 -<br />
Suma<br />
(Total)<br />
1.793 6.678<br />
MASE o 80% MeOH 0.987 0.059 3.599 0.480<br />
MASE p 80% MeOH 3.478 0.719 2.018 0.846<br />
4. Wnioski<br />
(Conclusions)<br />
Najskuteczniejszą techniką izolacji imperatoryny z owoców gorysza<br />
wyniosłego była ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami w podwyższonej<br />
temperaturze (60 C), najmniej skuteczną – ekstrakcja w aparacie Soxhleta.<br />
Największy stopień odzysku umbeliferonu z gorysza daje ekstrakcja wspomagana<br />
mikrofalami w układzie zamkniętym, najniższy - MASE w układzie<br />
otwartym. W przypadku owoców gorysza, podobnie jak w przypadku opublikowanych<br />
już badań nad owocami arcydzięgla i pasternakiu efekt działania<br />
mikrofal w układzie zamkniętym powoduje spadek zawartości imperatoryny<br />
w porównaniu z ekstrakcją w układzie otwartym. Ekstrakcja mikrofalowa z<br />
wysokim ciśnieniem nie jest, więc odpowiednią metodą ekstrakcji imperatoryny<br />
z owocu gorysza.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
90 M. Waksmundzka-Hajnos, A. Oniszczuk, R. Podgórski<br />
Literatura<br />
(References)<br />
1. M.D. Luque de Castro, M.P. Da Silvia, Strategies for solid sample<br />
treatment, Trends in Analytical Chemistry, 16(1997)16-24.<br />
2. N. Saim, J.R. Dean, M.P. Abdullah, Z. Zakiria, Extraction of polycyclic<br />
aromatic hydrocarbons from contaminated soil using Soxhlet extraction,<br />
pressurized and atmospheric microwave – assisted extraction,<br />
supercritical fluid extraction and accelerated solvent extraction, J.<br />
Chromatogr. A, 791(1997)361-366.<br />
3. P.B. McClelland, P. Morgan, E.E. Leach, J. Shelk, Psoralen<br />
photochemotherapy, Dermatol. Nurs., 9(1997)403-415.<br />
4. W. Cisowski, Biologiczne właściwości kumaryn. Cz. I. Działanie na<br />
rośliny oraz właściwości farmakologiczne i przeciwbakteryjne, The<br />
biological properties of coumarins. Part I. Effects on plants and<br />
pharmacological and antibacterial properties, Herba Pol., 24(1983)301-<br />
314.<br />
5. F. Hadaček, C. Müller, A. Werner, H. Greger, P. Proksh, Analysis,<br />
isolation and insectidal activity of linear furanocoumarins and other<br />
coumarin derivatives from Peucedanum (Apiaceae: Apiodeae), Journal<br />
of Chemical Ecology, 20(8)(1994)2035-2054.<br />
6. S. Kohlmünzer, Farmakognozja, Pharmacognosy, PZWL, Warszawa<br />
1993.<br />
7. G. Zgórka, T. Dragan, K. Głowniak, E. Basiura, Determination of<br />
furanochromones and pyranocoumarins in drugs and Ammi visnage<br />
fruits by combined solid – phase extraction – high perfomance liguid<br />
chromatography and thin – layer chromatography – high perfomance<br />
liguid chromatography, J. Chromatogr. A, 797(1998)305-309.<br />
8. H.C. Huang, S.H. Chus, P.D. Chao, Vasorelaxants from Chinese herbs,<br />
emodin and scoparone, possess immunosuppressive properties, Eur. J.<br />
Pharmacol., 198(1991)211-213.<br />
9. M. Królikowska, Analiza fitochemiczna roślinnych surowców<br />
leczniczych, Phytochemical analysis of medical plants, AM, Łódź 1988.<br />
10. M.E. Waksmundzka-Hajnos, A. Petruczynik, A. Dragan (Oniszczuk), D.<br />
Wianowska, A.L. Dawidowicz, I. Sowa, Influence of the extraction mode<br />
on the yield of some furanocoumarins from Pastinaca sativa fruits, J.<br />
Chromatogr. B, 800(2004)181-187.<br />
11. M.E. Waksmundzka-Hajnos, A. Petruczynik, A. Dragan, D. Wianowska,<br />
A.L. Dawidowicz, Effect of extraction method on the yield of<br />
furanocoumarins from fruits of Archangelica officinalis Hoffm,<br />
Phytochem. Anal., 15(2004)313-319.<br />
12. G. Romanik, E. Gilgenast, A. Przyjazny, M. Kamiński, Techniques of<br />
preparing plant material for chromatographic separation and analysis,<br />
Anal. Bioanal Chem., J. Biochem. Biophys. Methods, 70(2007)253–261.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Wpływ rodzaju i parametrów ekstrakcji na wydajność izolacji wybranych…<br />
91<br />
13. M. A. Hawrył, E. Soczewiński, T. H. Dzido, Separation of coumarins<br />
from Archangelica officinalis in high-performance liquid chromatography<br />
and thin-layer chromatography systems, J. Chromatogr. A,<br />
886(2000)75-81.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
CAMERA SEPARATORIA<br />
Volume 4, Number 1 / January 2012, 93-103<br />
Bronisław K. GŁÓD, Ewa SZAFRANIUK, Justyna PIJANOWSKA<br />
Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny<br />
w Siedlcach<br />
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce,<br />
e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.uph.siedlce.pl<br />
Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów<br />
Streszczenie: Ditiokarbaminiany (DTC) należą do najważniejszych fungicydów, o niskiej<br />
toksyczności. W pracy opisano chromatograficzne oznaczanie mieszaniny DTC (disiarczków<br />
bis(dimetylotiokarbamoilu) i bis(dietylotiokarbamoilu), dimetyloditiokarbaminian sodu oraz<br />
dietyloditiokarbaminian sodu). Przeanalizowano zarówno warunki chromatograficznego ich<br />
rozdzielenia jak i różnej detekcji. Okazało się, że sole łatwo utleniają się do disiarczków.<br />
Natomiast disiarczki są nietrwałe, dlatego w mieszaninie dochodzi do wymiany ich ligandów.<br />
Otrzymane wyniki wskazują na przydatność wysokosprawnej chromatografii cieczowej z<br />
detekcją spektrofotometryczną oraz elektrochemiczną w badaniach analitycznych i<br />
fizykochemicznych DTC.<br />
Słowa kluczowe: ditiokarbaminiany, ED/UV-HPLC, di siarczki, fungicydy<br />
Application of HPLC to the separation of dithiocarbamates<br />
Abstract: Dithiocarbamates (DTCs) are the most important fungicides, characterized by low<br />
toxicity. This paper describes the chromatographic determination of a mixture of DTCs<br />
(disulfides of bis(dimethylthiocarbamoil) and bis(diethylthiocarbamoil), sodium<br />
dimethyldithiocarbamate and sodium diethyldithiocarbamate). We analyzed both, the<br />
chromatographic separation as well as various detection systems. It turned out that salts were<br />
readily oxidized to disulfides. From the other side, disulfides are unstable. Therefore, their<br />
mixtures exchanged ligands. The obtained results indicated usefulness of HPLC in analytical<br />
and physicochemical investigations of DTCs.<br />
Key Words: dithiocarbamates, ED/UV-HPLC, disulfides, fungicides
94 B. K. Głód, E. Szafraniuk, J. Pijanowska<br />
1. WSTĘP<br />
(Introduction)<br />
Grupy tiolowe (–SH) zaliczają się do reaktywnych wśród tych,<br />
występujących w organizmach żywych, np. mięsie [1-3]. Charakteryzują się<br />
właściwościami antyoksydacyjnymi. Ich redukcja prowadzi do powstawania<br />
rodników tiolowych i/lub disiarczków. Są słabymi kwasami. Kompleksują jony<br />
metali. Ditiokarbaminiany (DTC), Rys. 1., należą do najważniejszych<br />
fungicydów [4, 5]. Charakteryzują się niską toksycznością. Zagrożenie<br />
człowieka wynika raczej z niewłaściwego ich stosowania. Powodują<br />
miejscowe podrażnienia i reakcje uczuleniowe, blokują grupy -SH enzymów i<br />
białek. Znajdują zastosowanie w przemyśle gumowym, rolnictwie,<br />
medycynie i kosmetologii.<br />
Do grupy ditiokarbaminianów zaliczamy m.in.: disiarczek<br />
bis(dietylotiokarbamoilu) (disulfiram, DSF), który jest składnikiem leków<br />
(Esperal, Antabus) stosowanych w leczeniu alkoholizmu [6]. Zaburza on<br />
metabolizm alkoholu w organizmie, przez co hamuje działanie enzymu –<br />
dehydrogenazy aldehydowej (ALDH). Spowalnia to proces utleniania<br />
aldehydu octowego do mniej szkodliwego kwasu octowego. Blokada ALDH<br />
powoduje akumulację aldehydu octowego po spożyciu alkoholu, co prowadzi<br />
do serii nieprzyjemnych reakcji fizycznych (tzw. reakcja disulfiramowa), m.in.<br />
duszności, nudności, wymiotów, pulsującego bólu głowy oraz zaburzeń<br />
psychicznych, skutecznie odstraszających przed spożyciem alkoholu. DSF<br />
jest inhibitorem β-hydroksylazy, a przez to jest potencjalnym lekiem<br />
uzależnienia od kokainy. Ponadto okazało się, że obniża on w mózgu<br />
stosunku noradrenaliny do dopaminy [6-8] i zwiększa stres oksydacyjny oraz<br />
peroksydację lipidów i białek w komórkach [9].<br />
Disiarczek bis(dimetylotiokarbamoilu) (tiuram; TMTD) jest fungicydem<br />
stosowanym do ochrony upraw przed chorobami pochodzenia grzybowego<br />
[10], środkiem przeciwgrzybicznym stosowanym w kosmetologii, lekiem<br />
przeciwświerzbowym i chomosterylatem w opatrunkach i plastikowych<br />
urządzeniach medycznych, filtrem przeciwsłoneczny, składnikiem mydeł i<br />
aerozoli oraz ultra-przyspieszaczem w przetwórstwie gumowym [4, 5, 11].<br />
Cechuje się niską toksycznością oraz silnym działaniem teratogennym,<br />
gonadotoksycznym i rakotwórczym. Wywołuje alergie skóry i oczu na skutek<br />
bezpośredniego kontaktu lub w wyniku narażenia inhalacyjnego. Jest<br />
metylowym analogiem disulfiramu, który blokuje metabolizm alkoholu<br />
etylowego, wywołując „szok disulfiramowy”. Wskutek tego uszkadza nerki,<br />
wątrobę i trzustkę oraz układ nerwowy. Łatwo się wchłania przez układ<br />
pokarmowy i oddechowy. Szybko ulega metabolizmowi i wydalany jest z<br />
wydychanym powietrzem i moczem. Organizm metabolizuje TMTD do<br />
kwasu dimetyloditiokarbaminowego i disiarczku węgla. Toksyczny<br />
mechanizm działania TMTD może wynikać ze zdolności do chelatowania<br />
metali i inhibicji niektórych enzymów. Zaburza metabolizm węglowodanów i<br />
alkoholi oraz gospodarki wapniowej organizmu. Niszczy struktury błon<br />
komórkowych hepatocytów i wpływa na aktywność cytochromu P-450.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów<br />
95<br />
Ponadto tiuram reaguje z niebiałkowymi i białkowymi grupami tiolowymi.<br />
Jego cytotoksyczność wynika ze zmian poziomu zredukowanego glutationu,<br />
indukcji stresu oksydacyjnego w komórkach oraz zaburzeń równowagi stanu<br />
oksydoredukcyjnego.<br />
Sole DTC łatwo się utleniają do disiarczków (2RS - -2e→ RSSR),<br />
odpowiednio do disulfiramu i tiuramu [12]. Utleniane są nawet przez<br />
stosunkowo słabe utleniacze, jak roztwór jodu czy nadtlenku wodoru. Pod<br />
względem elektrochemicznym są to reakcje odwracalne [13] (RSSR<br />
redukuje się do nietrwałego RSSR - , który następnie rozkłada się do RS . i RS -<br />
[14, 15]). Wykorzystuje się je w produkcji pestycydów tiokarbaminianowych<br />
oraz jako syntetyczny lek immunomodulujący. Stosuje się je również do<br />
strącania jonów metali ciężkich z wody, np. w kolektorach do usuwania<br />
jonów metali ciężkich z ścieków przemysłowych. Przy ich użyciu można<br />
także usunąć metale z tkanek zwierzęcych, w tym ludzkich, oraz leczyć ostre<br />
zatrucia arszenikiem. Dlatego wykorzystuje się je również w maściach<br />
stosowanych w stanach zapalnych [16-18]. Dimetyloditiokarbaminian sodu<br />
(SDMC) jest inhibitorem wolnych rodników, środkiem biobójczym, stosowany<br />
jest do garbowanie skór i produkcji papieru [3, 19-21]. W medycynie<br />
wykorzystywane są jako syntetyczne immunomodulatory, a w lecznictwie<br />
weterynaryjnym jako leki poprawiające kondycję zwierząt narażonych na<br />
immunosupresyjne wpływy środowiska.<br />
Ditiokarbaminiany tworzą również kompleksy stosowane w smarach<br />
oraz w przetwórstwie gumy i kauczuku. Zwłaszcza kompleksy cynku z<br />
aminami, jako aktywne przyspieszacze, wykorzystuje się w wulkanizacji<br />
siarką W medycynie niektóre kompleksy wykazują właściwości<br />
przeciwnowotworowe np.: blokują grupy tiolowe enzymów i białek [10, 22,<br />
23].<br />
Celem pracy było opracowanie warunków chromatograficznego<br />
rozdzielenia mieszaniny DTC. Przebadano różne fazy ruchome, do<br />
monitorowania związków zastosowano detektor amperometryczny oraz<br />
spektrofotometryczny.<br />
R<br />
S<br />
R<br />
S<br />
R<br />
N<br />
S<br />
N<br />
Na +<br />
S<br />
S<br />
R<br />
N<br />
R<br />
R<br />
S<br />
R: -CH 3 ; -C 2 H 5<br />
Rys. 1. Wzory strukturalne badanych ditiokarbaminianów, (A) – disiarczków<br />
bis(dialkilotiokarbamoilu), (B) – soli dialkiloditiokarbaminianów.<br />
Fig. 1. Structures of the investigated dithiocarbamates, (A) - bis(dialkylothiocarbomyl)<br />
disulfides, (B) – dialkylodithiocarbamate salts.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
96 B. K. Głód, E. Szafraniuk, J. Pijanowska<br />
2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA<br />
(Experimental)<br />
2.1. Aparatura<br />
(Apparatus)<br />
W badaniach wykorzystano wysokosprawny chromatograf cieczowy<br />
(Knauer, Berlin, Niemcy) składający się z butli z eluentami, modułu Smartline<br />
Manager 5000, pompy dwutłokowej Smartline 1000 (regulacja przepływu<br />
fazy ruchomej 0,001-50 ml/min), mieszadła magnetycznego fazy ruchomej,<br />
dozownika pętlicowego D-14163 (objętość pętli 20 μl), termostatu kolumn<br />
Smartline 4000 z zakresem temperatur 5 ÷ 85 ºC, kolumny analitycznej<br />
Cosmosil RP-18 AR II (4,6 x 50 mm), detektora spektrofotometrycznego UV<br />
Smartline PDA 2800 z matrycą diodową DAD (zakres pracy lampy 190-1020<br />
nm), detektora elektrochemicznego EC3000 (Recipe Chemicals, Munich,<br />
Niemcy) (elektroda pracująca - węgiel szklisty, elektroda odniesienia -<br />
Ag/AgCl, elektroda pomocnicza - Pt), programu Clarity Chrom wersja 2.6.2.<br />
oraz zbiornika eluatu.<br />
2.2. Odczynniki<br />
(Reagents)<br />
W badaniach zastosowano nadchloran tetraetyloamonu (TEAP),<br />
nadchloran tetrabutyloamonu (TBAP) i metanol czysty do HPLC (Sigma-<br />
Aldrich, Niemcy), kwas siarkowy(VI) 95% (Polskie Odczynniki Chemiczne,<br />
Gliwice, Polska) oraz jodek tetrabutyloamonu, TBAI (Chemapol,<br />
Czechosłowacja).<br />
2.3. Procedury<br />
(Procedures)<br />
Pomiary chromatograficzne mieszaniny DTC przeprowadzono w<br />
układzie faz odwróconych (RP–C18), w temperaturze 20°C, przy przepływie<br />
fazy ruchomej 1,0 ml/min. Przed przystąpieniem do analizy<br />
chromatograficznej kolumnę chromatograficzną stabilizowano w temp. 20 o C<br />
przez 1 h. W pomiarach zastosowano fazy ruchome przedstawione w<br />
Tab. 1.<br />
Mieszaninę DTC przygotowano przez zmieszanie 1 mM roztworów<br />
TMTD, DSF, SDMC i SDEC o objętości 200 ml. Objętość próbki,<br />
wstrzykiwanej na kolumnę, wynosiła 20 µl. W pomiarach zastosowano dwa<br />
typy detektorów: fotometryczny (długość fali 205 i 254 nm) oraz<br />
elektrochemiczny (w zakresie potencjału -2 V ÷ +1,5 V). Na kolumnę<br />
nastrzykiwano świeżo przygotowane roztwory. W celu identyfikacji pików i<br />
przypisania im odpowiednich ditiokarbaminianów, na kolumnę<br />
chromatograficzną nastrzykiwano związki osobno. Identyfikację<br />
przeprowadzano w oparciu o czasy retencji i spektrogramy RSSR i RS - .<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów<br />
97<br />
Tabela 1. Układy faz ruchomych do rozdziału mieszaniny DTC<br />
Table 1. Mobile phases used for the separation of DTCs<br />
Faza ruchoma<br />
Lp Skład Stosunek v/v<br />
1 MeOH/H 2 O 80:20<br />
2 MeOH/H 2 O 90:10<br />
3 MeOH:1mM/H 2 SO 4 80:20<br />
4 1 mM TBAI/H 2 O 90:10<br />
5 1 mM TEAP/H 2 O 90:10<br />
6 5 mM TEAP/H 2 O 90:10<br />
7 6,5 mM TEAP/H 2 O 90:10<br />
8 50 mM TEAP/H 2 O 90:10<br />
9 80 mM TEAP/H 2 O 90:10<br />
10 100 mM TEAP/H 2 O 90:10<br />
Rodzaj detektora<br />
Spektrofotometryczny<br />
(UV)<br />
Elektrochemiczny<br />
(ED)<br />
Każdy pomiar powtarzano trójkrotnie, a średnia z otrzymanych<br />
wyników wyznaczała wynik końcowy. Niepewność pomiaru uzyskano testem<br />
t-Studenta zmiennych zależnych, dla poziomu ufności p
Sygnał [mAU]<br />
R[mAU]<br />
R[mAU]<br />
98 B. K. Głód, E. Szafraniuk, J. Pijanowska<br />
400<br />
300<br />
200<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
3<br />
1<br />
0<br />
200 250 300 350 400<br />
[nm]<br />
2<br />
1;3<br />
4<br />
100<br />
1000<br />
500<br />
4<br />
0<br />
200 250 300 350 400<br />
[nm]<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5 6 7<br />
t r<br />
[min]<br />
Rys. 2. Chromatogram mieszaniny DTC: 1 – SDMC, 2 – TMTD, 3 – SDEC oraz 4 – DSF.<br />
Warunki chromatograficzne: kolumna – Cosmosil RP-18 AR II (4,6x150mm); faza<br />
ruchoma – MeOH/H 2 O 80/20 v/v; detektor UV – 205 nm, szybkość przepływu – 1.0<br />
ml/min; nastrzyk – 20µl. W lewym, górnym rogu przedstawione są widma UV<br />
zarejestrowane w maksimach odpowiednich pików.<br />
Fig. 2. The HPLC chromatogram of mixture of DTCs: 1 - SDMC, 2 - TMTD, 3 – SDEC and 4<br />
- DSF. Chromatographic conditions: column - Cosmosil RP-18 AR II (4,6 x 150 mm<br />
I.D.), mobile phase - MeOH/H 2 O 80/20 v/v, detector UV - 205 nm, flow rate - 1.0 ml /<br />
min, injection volume - 20μl. In the upper left corner the UV spectra recorded in the<br />
peak maxima are presented.<br />
Sole, obdarzone ładunkiem w roztworach polarnych, wymywane były<br />
w pobliżu objętości martwych (Rys. 2). Zmniejszenie ich polarności można<br />
uzyskać za pomocą związków (jonów tetraalkiloamoniowych) tworzących<br />
tzw. pary jonowe. Okazało się, że (i) jony czteroalkiloamoniowe zwiększały<br />
retencję soli, nie wpływając na retencję disiarczków, (ii) wzrost retencji<br />
proporcjonalny był do długości łańcucha alifatycznego jonu<br />
czteroalkiloamoniowego i jego stężenia (Rys. 3), (iii) niektóre aniony (np.<br />
nadchlorany) utleniają badane związki. Przy niskim stężeniu jonów<br />
tetretyloamoniowych nie zachodzi rozdział soli. Przy stężeniu 6,5 mM TEAP<br />
zachodzi nieznaczny rozdział poszczególnych składników mieszaniny (Rys.<br />
4).<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Sygnał [mAU]<br />
R[mAU]<br />
R[mAU]<br />
Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów<br />
99<br />
Rys. 3.<br />
Fig. 3.<br />
Wykres zależności czasu retencji DTC: SDMC (■), SDEC (●), TMTD () oraz DSF<br />
() od stężenia TEAP w układzie metanol/woda 90/10% v/v. Warunki<br />
chromatograficzne jak na Rys. 2.<br />
A dependence of the retention time of DTCs: SDMC (■), SDEC (●), TMTD () and<br />
DSF () on the concentration of TEAP in methanol/water 90/10% v/v.<br />
Chromatographic conditions as on Fig. 2.<br />
700<br />
200<br />
600<br />
500<br />
150<br />
100<br />
50<br />
1<br />
3<br />
2<br />
4<br />
400<br />
0<br />
200 250 300 350<br />
[nm]<br />
300<br />
2500<br />
2000<br />
2<br />
200<br />
100<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
4<br />
0<br />
200 250 300 350<br />
[nm]<br />
1<br />
3<br />
0<br />
0 1 2 3 4<br />
t r<br />
[min]<br />
Rys. 4.<br />
Fig. 4.<br />
Chromatogram DTC, 1 - SDMC, 2 - TMTD, 3 – SDEC oraz 4 - DSF. Warunki<br />
chromatograficzne jak na Rys. 2, za wyjątkiem 6,5 mM TBAI w mieszaninie<br />
metanol/H 2 O 90/10 v/v zastosowanej jako faza ruchoma. W lewym, górnym rogu<br />
przedstawione są widma UV zarejestrowane w maksimach odpowiednich pików.<br />
The change of the peaks areas of SDMC and TMTD (A) and SDEC and DSF (B) in<br />
time. The samples were exposed to the atmospheric oxygen. Chromatographic<br />
conditions as on Fig. 4.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
A[mAU*min]<br />
A[mAU*min]<br />
100 B. K. Głód, E. Szafraniuk, J. Pijanowska<br />
Grupa tiolowa nadaje ditiokarbaminianom właściwości redukujące<br />
[12]. Sole DTC utleniają się do disiarczków [24]. Reakcje te przebiegają<br />
nawet pod wpływem tlenu atmosferycznego. Dlatego po nastrzyku nawet<br />
czystych soli obserwowaliśmy na chromatografie piki od disiarczków. Na<br />
Rys. 5 przedstawiono zmiany pól powierzchni pików soli i odpowiadających<br />
im disiarczków od czasu wystawione próbek na działanie tlenu<br />
atmosferycznego. Okazało się, że również niektóre składniki fazy ruchomej<br />
utleniały sole. W szczególności, bardzo silny efekt zaobserwowano dla<br />
nadchloranu.<br />
200<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 20 40 60<br />
t[min]<br />
80 100<br />
SDMC TMTD<br />
200<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 20 40 60 80 100<br />
t[min]<br />
SDEC DSF<br />
Rys. 5.<br />
Fig. 5.<br />
Zmiana pól powierzchni pików SDMC i TMTD (A) i SDEC i DSF (B) w czasie. Próbki<br />
wystawione były na oddziaływanie tlenu atmosferycznego. Warunki<br />
chromatograficzne jak na Rys. 4.<br />
The change of the peaks areas of SDMC and TMTD (A) and SDEC and DSF (B) in<br />
time. The samples were exposed to the atmospheric oxygen. Chromatographic<br />
conditions as on Fig. 4.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
h[nA]<br />
Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów<br />
101<br />
Łatwość utleniania soli bitiokarbaminianów do disiarczków można<br />
praktycznie wykorzystać do ich detekcji. Na Rys. 6 pokazano dynamicznie<br />
uzyskane woltamogramy SDMC i TMTD za pomocą detektora<br />
elektrochemicznego. Odczytać z niego można, że pierwszy ze związków<br />
utlenia się przy potencjale ok. 0,85 V. Oznacza to, że do jego analizy można<br />
zastosować detektor amperometryczny. Drugi ze związków nie ulega<br />
utlenianiu w badanych warunkach. Obserwowany na Rys. 6 sygnał pochodzi<br />
od utleniania rozpuszczalnika. Niewielki sygnał obserwowany jest w tym<br />
przypadku dla redukcji.<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
-2 -1 0 1 2<br />
E[V]<br />
Rys. 6.<br />
Fig. 6.<br />
Wykres zależności zmiany wysokości sygnału pochodzącego od SDMC (●) i TMTD<br />
(■), od potencjału. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 4. Faza ruchoma - 0,5 mM<br />
TEAP w metanol/woda 90/10 v/v. Zakres potencjałów detektora elektrochemicznego –<br />
-2 ÷ +1,5 V vs Ag/AgCl.<br />
A plot of the SDMC (●) and TMTD (■) currents in the function of potential.<br />
Chromatographic conditions as on Fig. 4. Mobile phase - 0.5 mM TEAP in<br />
methanol/water 90/10 v/v. Electrochemical detector potential range - 2 to 1.5 V vs Ag /<br />
AgCl.<br />
Również disiarczki nie są trwałymi związkami. W roztworach ulegają<br />
rozpadowi na odpowiednie sole. Dlatego po kilkunastu godzinach w<br />
mieszaninie disiarczków obserwowaliśmy ich mieszane formy [25]. Na<br />
przykład. z (disiarczków bis(dimetylotiokarbamoilu) i bis(dietylotiokarbamoilu)<br />
powstawał disiarczek N,N-dietylo-N',N'-dimetylotiuramu.<br />
4. WNIOSKI<br />
(Conclusions)<br />
Badane DTC (disulfiram, tiuram, dimetyloditiokarbaminian sodu oraz<br />
dietyloditiokarbaminian sodu) mogą być rozdzielane za pomocą<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
102 B. K. Głód, E. Szafraniuk, J. Pijanowska<br />
wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych. Sole<br />
DTC łatwo są utleniane tlenem atmosferycznym lub składnikami fazy<br />
ruchomej. Dlatego faza ruchoma powinna się charakteryzować<br />
właściwościami redukcyjnymi. Do ich można zastosować detekcję<br />
elektrochemiczną. W mieszaninie disiarczków zaobserwowano wymianę ich<br />
alkilowych podstawników. Jony tetraalkiloamoniowe zwiększają retencję soli<br />
DTC, nie powodując zmiany retencji disiarczków.<br />
LITERATURA<br />
(References)<br />
1. B. Bukowska, Funkcje glutationu oraz czynniki zmniejszające jego<br />
stężenie, Glutathione functions and factors decreasing its<br />
concentration, Med. Pracy, 56(2005)69–80.<br />
2. K. Karolczak, B. Olas, J. Kołodziejczyk, Rola tioli w aktywacji płytek<br />
krwi, The role of thiols In blood platelet activation, Postępy Biol.<br />
Komórki, 36(2009)101–120.<br />
3. A. Bilska, A. Kryczyk, L. Włodek, Różne oblicza biologicznej roli<br />
glutationu, The different aspects of the biological role of glutatione,<br />
Postepy Hig. Med. Dośw., 61(2007)438–453.<br />
4. D. Kurpios-Piec, E. Grosicka-Maciąg, H. Czeczot, M. Szumiło, T.<br />
Grzela, I. Rahden-Staroń, Ochronny wpływ N-acetylocysteiny na pro<br />
oksydacyjne i proapoptotyczne działanie tiuramu w komórkach V79<br />
chomika chińskiego, Bromat. Chem. Toksykol., 43(2010)354–361.<br />
5. P. Struciński, Tiuram – pył. Dokumentacja dopuszczalnego narażenia<br />
zawodowego, Principl. Methods Assess Walk Environ., 213(2006)145–<br />
180.<br />
6. G.A. Kenna, J.E. McGeary, R.M. Swift, Pharmacotherapy,<br />
pharmacogenomics and the future of alcohol dependence therapy,<br />
American Journal of Health-System Pharmacy, 61(21)(2004)2272–<br />
2279.<br />
7. S.E. Manahan, Toksykologia środowiska, PWN, Warszawa 2006.<br />
8. P. Devoto, G. Flore, P. Saba, R. Cadeddu, G.L. Gessa, Disulfiram<br />
stimulates dopamine release from noradrenergic terminals and<br />
potentiates cocaine-induced dopamine release in the prefrontal cortex.<br />
(70 refs.), Psychopharmacology, 219(4)(2012)1153–1164.<br />
9. E. Grosicka, H. Czeczot, M. Skrzycki, M. Szumiło, M. Podsiad, I.<br />
Rahden-Staron, Wpływ tiuramu i disulfiramu na stran redox w<br />
komórkach fibroblastów płuca chomika chińskiego, Bromat. Chem.<br />
Toksykol., 39(2006)383–390.<br />
10. B. Łozowicka, P. Kaczyński, Pozostałości ditiokarbaminianów w<br />
żywności oraz potencjalne ryzyko narażenia konsumentów, Bromat.<br />
Chem. Toksykol., 42(2009)1155–1160.<br />
11. S.A. Jatinder, A.K. Malik, R.K. Mahajan, Solid phase microextractionhigh<br />
pressure liquid chromatographic determination of nabam, thiram<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Zastosowanie HPLC do rozdzielania ditiokarbaminianów<br />
103<br />
and azamethiphos in water samples with UV detection. Preliminary<br />
data, Talanta, 66(2005)266–270.<br />
12. S.J. Visco, C.C. Mailhe, L.C. De Jonghe, M. Armand, A Novel Class of<br />
Organosulfur Electrodes for Energy Storage, J. Electrochem. Soc.,<br />
136(1989)661.<br />
13. M. Liu, S.J. Visco, L.C. De Jonghe, Electrochemical Properties of<br />
Organic Disulfide/Thiolate Redox Couples, J. Electrochem. Soc.,<br />
136(1989)2570.<br />
14. M. Liu, S.J. Visco, L.C. De Jonghe, Electrode Kinetics of Organosulfur<br />
Cathodes for Storage Batteries, J. Electrochem. Soc., 137(1990)750.<br />
15. E. Potteau, L. Nicolle, E. Levillain, J.P. Lelieur, Electrochemical<br />
behaviour of RSSR thiuram disulfides, Electrochem. Comm.,<br />
8(1999)360–364.<br />
16. E. Kucharczak, J. Dębowy, Z. Jope, Rozmieszczenie „endogennego”<br />
żelaza w tkankach królików po dożylnym podaniu<br />
dietyloditiokarbaminianu sodowego, Medicina Veterinaria,<br />
1(2)(2002)59–65.<br />
17. K.A. Streltsov, D.V. Abryutin, Investigation of regularities of ion flotation<br />
of copper with the use of sodium diethyldithiocarbamate, Russian<br />
Journal of Non-Ferrous Metals, 51(2)(2010)85–88.<br />
18. A.R. Rasnl, J. McC Howell, Further observations on the response of the<br />
peripheral and central nervous system of the rabbit to sodium<br />
diethyldithiocarbamate, Acta Neuropath., 24(1973)161–173.<br />
19. A. Kaars Sijpesteijn, M.J. Janssen, G.J.M. van der Kerk, Investigations<br />
on organic fungicides. XI. The Role of metals and chelating agents in<br />
the fungitoxic action of sodium dimethyldithiocarbamate (NaDDC),<br />
Biochimica et Biophysica Acta, 23(1957)550–557.<br />
20. H.H. Kamerbeek, A.G. Rauws, M. ten Ham, A.N.P. van Heijst, Prussian<br />
blue in therapy of thallotoxicosis, an experimental and clinical<br />
investigation, Acta Medica Scandinavica, 189(1971)321–324.<br />
21. A. LeHuray, American Chemistry Council, CAS, 128(2003)3–23.<br />
22. A. Kropidłowska, Związki kompleksowe o rdzeniu bogatym w siarkę<br />
zawierające dwa różne ligandy S-donorowe - potencjalne prekursory<br />
siarczków metali, Rozprawa doktorska, Politechnika Gdańska, 2008.<br />
23. A. Bielański, Podstawy chemii nieorganicznej, PWN, Warszawa 2007.<br />
24. D. Atanassova, V. Stefanova, E. Russeva, Co-precipitative preconcentration<br />
with sodium diethyldithiocarbamate and ICP-AES<br />
determination of Se, Cu, Pb, Zn, Fe, Co, Ni, Mn, Cr and Cd in water,<br />
Talanta, 47(1998)1237–1243.<br />
25. R.M. Smith, R.L. Morarji, W.G. Salt, Determination of dit hiocarbama tes<br />
by liquid chromatography using transition-metal salts as "ion-pair"<br />
reagents, The Analyst (London), 106(1981)129–134.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
Camera Separatoria<br />
INSTRUKCJE DLA AUTORÓW<br />
W Camera Separatoria wydawane są artykuły oryginalne (nie<br />
publikowane wcześniej) oraz przeglądowe poświęcone różnym działom<br />
nauki, techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane będą listy<br />
do redakcji, informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek,<br />
reklamy, materiały firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o<br />
konferencjach.<br />
Artykuł do <strong>CamSep</strong> przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003<br />
lub nowszym (w formacie .doc lub .docx) zgodnie z przedstawionym poniżej<br />
opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres e-mail:<br />
psc1@onet.eu. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu.<br />
* * *<br />
Jan KOWALSKI 1 , Anna KOWALSKA 2* (Arial 10 pkt., bold)<br />
1<br />
Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii,<br />
Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce,<br />
e-mail: psc1@onet.eu<br />
2<br />
Uniwersytet … (Afiliacja – Arial 8 pkt., normal bez boldu)<br />
Tytuł artykułu w języku polskim – 12 pkt. Arial bold<br />
Streszczenie: (Arial 8 pkt. normal bold). Treść streszczenia – Arial 8 pkt. kursywa bez boldu.<br />
Streszczenie polskojęzyczne powinno zawierać około 500 – 700 znaków (ze spacjami). Należy<br />
w nim krótko wskazać czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie<br />
wniosków.<br />
Słowa kluczowe: Arial 8 pkt., bez boldu, kursywą<br />
Tytuł artykułu w języku angielskim – 12 pkt. Arial bold -<br />
kursywa
106 Instrukcje dla autorów<br />
Abstract: (Arial 8 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne – Arial 8 pkt. kursywa bez<br />
boldu, powinno być rozszerzone, o objętości około 1000 – 1200 znaków (ze spacjami). Powinno<br />
zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie<br />
wniosków.<br />
Key words: Arial 8 pkt., bez boldu, kursywą<br />
* autor do korespondencji<br />
Podtytuły – Arial 11 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna, Wyniki i<br />
dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) – wersja polska -<br />
normal i (angielska - kursywą),<br />
śródtytuły – Arial 10 pkt., bold, wersja polska - normal i (angielska -<br />
kursywą)<br />
Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany – Arial<br />
10 pkt., odstępy między wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden<br />
sposób podziałów wierszy. Marginesy dostosować tak, aby wysokość<br />
kolumny tekstowej miała 19 cm (bez nr stron), a szerokość 12 cm - zgodnie<br />
z wymogami zamieszczonymi na stronie:<br />
http://www.uph.edu.pl/index.php/druki-firmowe/dokumenty-wydawnictwa-ap.html<br />
http://dach.ich.uph.edu.pl/pl/_cs.html<br />
http://dach.ich.uph.edu.pl/download/cam_sep/<strong>CamSep</strong>_ww.pdf<br />
Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane<br />
przenoszone z tekstem. Wzory napisane w edytorze równań należy<br />
traktować jako element zdania np.:<br />
V<br />
t<br />
F<br />
R R<br />
(1)<br />
gdzie:<br />
V R – objętość retencji,<br />
t R – czas retencji [min.],<br />
F – przepływ gazu nośnego [cm 3 /s].<br />
Symbole użyte we wzorach powinny mieć rozmiar zgodny z<br />
rozmiarem czcionki tekstu rozdziału. Wzory należy numerować kolejno w<br />
całym tekście artykułu. Numery wzorów powinny być wyrównane do prawej.<br />
Oznaczenia stosowane na rysunkach i w tabelach muszą być czytelne i<br />
zgodne z oznaczeniami używanymi we wzorach i w tekście artykułu. Nazwy<br />
związków chemicznych stosować zgodnie z nomenklaturą IUPAC, jednostki<br />
z układu SI.<br />
W odpowiednie miejsca w tekście należy wstawić rysunki i tabele wraz<br />
z tytułami. Powinny one znajdować się w miejscach, w których po raz<br />
pierwszy są do nich odwołania w tekście artykułu. Rysunki i zdjęcia<br />
zamieszczone w artykule muszą być czytelne i kontrastowe oraz zapisane<br />
jako czarno-białe lub w skali odcieni szarości.<br />
Rysunki i tabele należy numerować kolejno w całym tekście artykułu<br />
(Rys. i Tab. nr arabskie).<br />
Tytuły rysunków i tabel należy podać w języku polskim i angielskim<br />
(kursywą) jak na przykładzie przedstawionym poniżej:<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Instrukcje dla autorów<br />
107<br />
Tabela 1. Całkowita emisja metali z obszaru Polski według rodzajów<br />
działalności. Arial 10 pkt.<br />
Table 1. Total emission of heavy metals in the area of Poland kinds of<br />
activities. Arial 10 pkt.<br />
Ogółem<br />
(Total)<br />
Elektrociepłownie, elektrownie,<br />
ciepłownie<br />
(Heat and power plants, power<br />
stations)<br />
Cd Pb Cu Zn Ni<br />
tony<br />
66,1 555,0 390,9 2345,1 295,8<br />
1,9 19,9 12,8 59,2 72,2<br />
Tabele w pionie nie mogą przekraczać szerokości 12 cm, a w poziomie – 18<br />
cm. Czcionka wewnątrz tabeli – Arial 8 pkt.<br />
Rysunek, wykres, czy inna forma materiału ilustracyjnego nie może<br />
przekraczać w pionie – szerokości 12 cm, wysokości 18 cm; w poziomie –<br />
szer. – 18 cm, wysokości – 9÷10 cm (na stronie musi zmieścić się jeszcze<br />
podpis do rysunku). Materiał ilustracyjny powinien być zapisany z<br />
rozszerzeniem JPG i przesłany dodatkowo w oddzielnych plikach<br />
podpisanych, jako Rys.1., Rys. 2. itd.<br />
Rys. 1. Tytuł rysunku w języku polskim, Arial 8 pkt.<br />
Fig. 1. Tytuł rysunku w języku angielskim, Arial 8 pkt.<br />
Literatura<br />
(w tekście numerujemy w kolejności cytowania [1], [2, 3], [4-8] itd., - Arial 10<br />
pkt.):<br />
1. L.E. Green, J.C. Worman, Research of separation…, Anal. Chem.,<br />
37(1965)1620.<br />
Oprócz danych bibliograficznych należy zamieścić tytuł, w tym także<br />
publikacji, materiału z internetu, opisu patentowego itp. Tytuł w j.<br />
polskim, lub innym, niż język polskim jest pisany zwykłym drukiem w<br />
cudzysłowie, tytuł w języku angielskim – kursywą.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
108 Instrukcje dla autorów<br />
2. T. Paryjczak, „Chromatografia gazowa…”, tłumaczenie tytułu na j.<br />
angielski kursywą, PWN, Warszawa 1986.<br />
(w przypadku, gdy tytuł pracy jest w innym języku, niż po angielsku, należy<br />
tytuł oryginalny napisać w języku oryginału, a następnie jego tłumaczenie na<br />
język angielski - kursywą)<br />
Wszystkie materiały:<br />
artykuł (w formacie .doc lub .rtf),<br />
dodatkowo zdjęcia i rysunki (w formacie JPG),<br />
prosimy przesyłać w formie plików, w jednej wiadomości na adres e-mail:<br />
psc1@onet.eu<br />
* * *<br />
Przesłany artykuł do <strong>CamSep</strong> podlega wstępnej ocenie przez Edytora,<br />
następnie przekazywany jest dwóm recenzentom do oceny. Recenzenci<br />
pozostają anonimowi.<br />
O przyjęciu artykułu do druku decyduje redakcja, w oparciu o<br />
przygotowaną recenzję. Jeśli w jej wyniku zachodzi konieczność<br />
poprawienia artykułu przez autora, to powinno to nastąpić w okresie nie<br />
dłuższym niż trzy tygodnie. Po tym terminie uważa się, że autor rezygnuje z<br />
publikacji lub gdy artykuł zostanie przesłany do redakcji podlegać on będzie<br />
ponownej ocenie.<br />
Po opublikowaniu autorzy bezpłatnie otrzymują elektroniczna wersję<br />
artykułu i właściwy nr <strong>CamSep</strong> jako egzemplarz autorski.<br />
Ogłoszenia/reklamy mogą być publikowane za odpowiednią,<br />
wcześniej ustaloną, opłatą.<br />
Przepisy etyczne<br />
Ważne jest, aby uzgodnić standardy etycznych zachowań dla<br />
wszystkich zaangażowanych w działania publikacji: autora, redaktora<br />
czasopisma, recenzenta, wydawcy i społeczeństwa czasopism. Redaktorzy i<br />
recenzent są zobowiązani do zapewnienia, że reklama, przedruk lub inny<br />
przychód komercyjny, nie ma wpływu na decyzje redakcyjne. Nie mogą oni<br />
ujawniać żadnych informacji na temat przedstawionego rękopisu do<br />
kogokolwiek innego niż autora artykułu. Niepublikowane materiały,<br />
ujawnione w przedstawionej pracy, nie mogą być używane przez<br />
redaktorów/recenzentów, jako część własnych badań bez pisemnej zgody<br />
autora. Powielanie lub adaptacja opublikowany wcześniej tabel, rycin,<br />
ilustracji lub obszernych cytatów z innych źródeł, akceptowana jest tylko za<br />
posiadaniem odpowiedniej pisemnej zgody autora.<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Instrukcje dla autorów<br />
109<br />
Instructions for Authors and Editorial Policy<br />
Camera Separatoria is a scholarly and peer-reviewed journal (print<br />
and online) published 2 times per year which was founded in 2009. It is a<br />
continuation of the journal Postępy Chromatografii (Progress in<br />
Chromatography) devoted to the science, technique and technology of<br />
separation. It provides a medium for the publication of theoretical and<br />
experimental studies and reviews related to separation science:<br />
chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, exctraction,<br />
electroseparation etc.<br />
Camera Separatoria publishes original (not published previously and<br />
are not currently under consideration by another journal except in the form of<br />
an abstract or as part of a published lecture, review, or thesis) and review<br />
papers from all branches of separation science, technique and technology.<br />
Additionally letters to the editor; expert opinions; information on<br />
instrumentation, book reviews and information about conferences as well as<br />
advertisements are also published. The journal welcomes contributions<br />
which promote the exchange of ideas and rational discourse between<br />
practicing educators and material researchers all over the world.<br />
The manuscript can be submitted to any editor, together with the<br />
cover letter, using e-mail. No limitation of the articles lengths are provided.<br />
The manuscript should be original, has not been published previously and<br />
should not be currently being considered by another journal.<br />
The manuscript can be submitted to any editor, together with the<br />
cover letter, using e-mail. No limitation of the articles lengths are provided.<br />
Manuscript should be prepared using MS-Word editor in the<br />
.doc/.docx format. Detailed rules are presented on<br />
http://www.uph.edu.pl/index.php/druki-firmowe/dokumenty-wydawnictwa-ap.html. It<br />
should be typed in single-spaced lines using Arial 10p. font with the overall<br />
page numbering (at the center of bottom margins). Tables (Arabic<br />
numeration, title in Polish and English, Arial 10p.), figures and figure<br />
captions (Arabic numeration, in Polish and English, Arial 8p.) and<br />
references can be placed directly to the text. The main heading appears in<br />
the following order:<br />
- list of Authors by first, middle names, surname (capital letters); the<br />
Corresponding Author’s name should be accompanied by an asterisk (*); if<br />
Authors are from more than one affiliation, use superscript numbers to link<br />
the Authors’ names and their affiliations,<br />
- list of affiliations and complete mailing addresses of the authors (including<br />
zip code, city, street, and number; for universities, the faculty or<br />
department should be given),<br />
- the title (should not exceed 20 words) of the article in Polish as well as<br />
English, (in all capital letters, Arial 12p.),<br />
- if there is more than one affiliation, use asterisks to indicate the institute<br />
with which each author is affiliated,<br />
as it is presented below:<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria
110 Instrukcje dla autorów<br />
Jan K. KOWALSKI, Karol ROBERT*<br />
Department of Separation Science, Institute of Chemistry<br />
ul. 1 Maja 3, 00-000 Warszawa<br />
*e-mail: camera@separatoria.eu<br />
I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne<br />
1 st Podlasie’s Chromatographic Meeting<br />
Body text…<br />
In the subsequent text, the following parts are is desirable: abstract (in<br />
Polish and English, Arial 8p.), keywords (about five, in Polish and English,<br />
Arial 8p.), introduction (review of literature and formulation the aim of the<br />
paper), experimental (reagents, apparatus, protocols, data analysis), results<br />
and discussion, conclusions, acknowledgments and literature. The SI units<br />
and nomenclature recommended by IUPAC should be used. References<br />
should be typed in the forms:<br />
1. J.K. Kowalski, K. Robert, Research of separation…, J. Sep. Sci.,<br />
44(2000)666.<br />
2. A. Adzik, in Fundamentals of Separation Science, K. Karol, ed., PTNoR,<br />
Reymontówka 2000.<br />
3. Polish standard PN – EN ISO 17993, text…<br />
4. S. Separator, Proceedings of 2 nd Podlachia’s Chromatographic Meeting,<br />
Kotuń-Chlewiska, Sep. 12-18, 1987.<br />
in a list at the end of article and numbered in the order of appearance.<br />
Citation in the text should be denoted by number in square brackets.<br />
One of the Editor first evaluates the manuscript. Exceptionally it can<br />
be accepted at this stage. Those rejected at this stage are passed on to 2<br />
experts for review. Acceptance for publication is subject to positive<br />
recommendation from the referees. The referees remains anonymous<br />
throughout the process. Reviewers are not supposed to contact the authors<br />
or to otherwise make their identity known. The referees are asked to<br />
evaluate the manuscript according to the below rules within 3 weeks.<br />
Authors have three months to correct the article after the reviewing process.<br />
After this time, the returned article is considered as newly received. The<br />
authors receive the electronic version of their paper and the proper volume<br />
of Camera Separatoria free of charge.<br />
Advertisements may be published according to the prescribed rates.<br />
Ethical guidelines<br />
* * *<br />
It is crucial to agree upon standards of expected ethical behavior for<br />
all involved in the act of publishing: author, editor, reviewer, publisher and<br />
Camera Separatoria Vol. 4, No 1/2012
Instrukcje dla autorów<br />
111<br />
society. Editors and reviewer are committed to ensuring that advertising,<br />
reprint or other commercial revenue has no impact or influence on editorial<br />
decisions. They must not disclose any information about a submitted<br />
manuscript to anyone other than the corresponding author. The unpublished<br />
materials disclosed in a submitted manuscript must not be used in an<br />
editor's/referee’s own research without the express written consent of the<br />
author. The reproduction or adaptation of previously published tables,<br />
figures, illustrations, or extensive quotations from other sources must obtain<br />
appropriate written permission.<br />
Vol. 4, No 1/2012<br />
Camera Separatoria