CamSep 3 2

Uniwersytet Przyrodniczo‐Humanistyczny w Siedlcach 

Instytut Chemii 

CAMERA SEPARATORIA 

previously 

POSTĘPY CHROMATOGRAFII 

Volume 3, Number 2 / December 2011 

Siedlce 2011

Co-Editors-in-Chief: 

Bronisław K. Głód (Siedlce) and Marian Kamiński (Gdańsk) 

Editors (reviewers): 

Tadeusz Dzido – Lublin, Bronisław K. Głód – Siedlce, Marian Kamiński – Gdańsk, 

Piotr M. Słomkiewicz – Kielce, Piotr Stepnowski – Gdańsk, Andrzej Stołyhwo 

– Warszawa, Monika E. Waksmundzka-Hajnos – Lublin, Paweł K. Zarzycki 

– Koszalin 

Technical Editors: 

Paweł Piszcz, Paweł M. Wantusiak 

URL: http://dach.ich.uph.edu.pl/pl/_cs.html 

Adres Redakcji / Editorial office’s address: 

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach 

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce 

tel. (25) 64310 41 

e-mail: psc1@onet.eu 

Komitet Wydawniczy / Editorial Committee: 

Zofia Chyra-Rolicz (przewodnicząca), Stanisław Jaczyński, Mirosław Jakubiak, 

Iwona Kiersztyn, Marek Kucharski, Cezary Mitrus, Ryszard Mojak, Ryszard Rosa, 

Janina Skrzyczyńska, Stanisław Socha, Janusz Toruński, Izabela Trzpil, Hanna 

Wadas-Woźny, Andrzej Wiśniewski, Krystyna Wojtczuk, Kazimierz Żegnałek 

© Copyright by Siedlce University of Natural Sciences and Humanities, 

Siedlce 2012 

ISSN 2083-6392 

Publishing House 

Siedlce University of Natural Sciences and Humanities 

08-110 Siedlce, ul. Bema 1 

phone: 48 25 643 15 20 

e-mail: wydawnictwo@uph.edu.pl 

www.wydawnictwo.uph.edu.pl 

Typesetting and text makeup: Zofia Chudek (Publishing House of Siedlce University) 

Print: EXPOL, Włocławek

SPIS TREŚCI 

(CONTENTS) 

Bronisław K. Głód, Iwona Kiersztyn, Anna Lamert, 

Paweł Piszcz, Paweł M. Wantusiak 

III Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne ............................................... 243 

Prace przeglądowe / Review papers 

Anita Skrzypczak, Mariusz Jaszczołt, Aleksandra Królicka, 

Marian Kamiński 

Techniki i metody chromatografii cieczowej w rozdzielaniu, 

oznaczaniu oraz izolowaniu naftochinonów i flawonoidów z roślin............ 253 

Prace oryginalne / Original papers 

Grzegorz Boczkaj, Mariusz Jaszczołt, Marian Kamiński 

Badania emisji lotnych związków organicznych z asfaltów drogowych 

z wykorzystaniem techniki dynamicznej analizy fazy nadpowierzchniowej 

i chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas 

(DHS – GC – MS)....................................................................................... 273 

Mariusz Jaszczołt, Grzegorz Boczkaj, Aleksander Lewandowski, 

Anita Skrzypczak, Aleksandra Królicka, Marian Kamiński 

Opracowanie optymalnych warunków rozdzielania 

i identyfikacji metabolitów roślin z rodzaju droseraceae, 

z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej..... 283 

Paweł M. Wantusiak, Paweł Piszcz, 

Monika Skwarek, Bronisław K. Głód 

Właściwości antyoksydacyjne miodów wyznaczone 

metodami chromatograficznymi ................................................................. 297 

Anita Skrzypczak, Marian Kamiński 

Nowa metoda rozdzielania składników oraz oznaczania kumaryny 

w napojach alkoholowych i w maceratach z turówki wonnej 

(hierochloe odorata) z wykorzystaniem RP-HPLC i przepływu 

zwrotnego eluentu w kolumnie ................................................................... 319 

Kamil Czech, Piotr M. Słomkiewicz 

Zastosowanie pakietów oprogramowania komputerowego 

do wyznaczania izoterm adsorpcji metodą inwersyjnej 

hromatografii gazowej ................................................................................ 329 

Instrukcje dla autorów ................................................................................ 343 

Instruction for Autors ................................................................................. 347

242 

Camera Separatoria Vol. 3, No 2/2011

CAMERA SEPARATORIA previously POSTĘPY CHROMATOGRAFII 

Volume 3, Number 2 / December 2011, 243-250 

Bronisław K. GŁÓD, Iwona KIERSZTYN, Anna LAMERT, 

Paweł PISZCZ, Paweł M. WANTUSIAK 

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny 

w Siedlcach, 


e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.uph.edu.pl 

III Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne 

3 rd Podlasie’s Chromatographic Meeting 

W dniach 25-28 września 2011 r. odbyło się III Podlaskie Spotkanie 

Chromatograficzne w dworku Reymontówka w Clewiskach. Zorganizowane 

zostało pod opieką Komitetu Naukowego (Tadeusz Dzido – Lublin; Bronisław 

K. Głód – Siedlce; Marian Kamiński – Gdańsk; Piotr Słomkiewicz – 

Kielce; Andrzej Stołyhwo – Warszawa; Monika E. Waksmundzka-Hajnos – 

Lublin; Paweł Zarzycki – Koszalin) oraz przez Komitet Organizacyjny w składzie 

Bronisław K. Głód; Iwona Kiersztyn; Anna Lamert; Paweł Piszcz i Paweł 

Wantusiak. 

W Spotkaniu wzięło udział około 50 osób. Wygłoszone zostały następujące 

wykłady: 

1. Chromatografia cienkowarstwowa z biodetekcją w badaniu ekstraktów 

roślinnych na obecność związków o potencjalnej aktywności farmakologicznej 

Monika E. Waksmundzka-Hajnos, Łukasz Cieśla

244 

B.K. Głód, I. Kiersztyn, A. Lamert, P. Piszcz, P.M. Wantasiuk 

2. Procedura rozdzielania i otrzymywania stafylokokcyny T z zastosowaniem 

wysokosprawnej chromatografii cieczowej 

Michał Laskowski, Beata Furmanek-Blaszk, Daniel Jastrzębski, Marian 

Kamiński 

3. Immuno-chromatografia - przegląd zastosowań, stosowanych immunosorbentów 

i metod immobilizacji 

Krystyna Grygoryshyn, Marcin M. Kamiński, Grzegorz Boczkaj, Mariusz 

Jaszczołt, Marian Kamiński 

4. Extraction study of spirulina and herb dyes from selected pharmaceutical 

formulations and food products 

Magdalena B. Zarzycka, Paweł K. Zarzycki, Vicki L. Clifton, Jerzy 

Adamski, Bronisław K. Głód 

5. Nowe metodyki oznaczania dodatków do paliw silnikowych z zastosowaniem 

rozdzielania wielowymiarowego LC-GC 

Grzegorz Boczkaj, Mariusz Jaszczołt, Marian Kamiński 

6. Optymalne warunki rozdzielania i izolacji flawonoidów i naftochinonów 

z metanolowych ekstraktów roślinnych z zastosowaniem preparatywnej 

chromatografii cieczowej w odwróconych i normalnych układach faz 

Anita Skrzypczak, Mariusz Jaszczołt, Rafał Banasiuk, Tycjan Kolanko, 

Aleksandra Królicka, Marian Kamiński 

7. Application of micro-TLC platform for fractionation of highly organic 

compounds loaded materials 

Paweł K. Zarzycki 

8. Wielowymiarowe rozdzielanie oraz bez-kalibracyjne oznaczenie składu 

złożonych mieszanin składników w chromatografii cieczowej 

Marian Kamiński, Marcin M. Kamiński 

9. Chromatograficzne metody rozdzieleń składników cieczy jonowych 

Piotr Stepnowski 

10. Prosta metodyka rozdzielania i oznaczania słodzików i cukrów w produktach 

spożywczych z zastosowaniem technik wysokosprawnej chromatografii 

cieczowej 

Paweł Kwiatkowski, Mariusz Jaszczołt, Marian Kamiński 

11. Czynniki wpływające na migrację izomerów optycznych rozdzielanych 

metodą elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej (PPEC) w odwróconym 

układzie faz 

Beata Polak 

12. Badania emisji lotnych związków organicznych z asfaltów drogowych 

z wykorzystaniem techniki dynamicznej analizy fazy nad-powierzchniowej 

i chromatografii gazowej i spektrometrii mas 

Grzegorz Boczkaj, Marian Kamiński 

13. Sprzężenie chromatografii planarnej z spektrometrią mas 

Anna Klimek-Turek, Tadeusz H. Dzido 

Podczas sesji posterowej zaprezentowano plakaty: 

1. Analiza porównawcza kwasów tłuszczowych i steroli w mięśniu odwłokowym 

garneli crangon crangon w sezonie letnim w cyklu dwurocznym 

Adriana Mika, Marek Gołębiowski, Edward Skorkowski, Piotr Stepnowski 



245 

2. Profil kwasów tłuszczowych w mięśniu odwłokowym garneli bałtyckiej 

crangon crangon z zwględnieniem kwasu epa i dha w cyklu rocznym 


3. Różnorodność kwasów tłuszczowych i steroli zidentyfikowanych w tkankach 

miękkich clupea harengus metodą GC-MS i MALDI-TOF/MS 


4. Identyfikacja produktów elektrochemicznego rozkładu cieczy jonowych 

za pomocą techniki GC-MS 

Aleksandra Fabiańska, Marek Gołębiowski, Piotr Stepnowski, Ewa Maria 

Siedlecka 

5. Zastosowanie technik HPLC-UV i LC-MS do identyfikacji produktów 

elektrochemicznego rozkładu wybranych cieczy jonowych 

Aleksandra Fabiańska, Marek Gołębiowski, Jadwiga Wiśniewska, Piotr 

Stepnowski, Ewa Maria Siedlecka 

6. Sililowanie jako uniwersalna technika derywatyzacji farmaceutyków 

w analizie GC i GC-MS 

Jolanta Kumirska, Natalia Migowska, Magda Caban, Paulina Łukaszewicz, 

Anna Białk-Bielińska, Małgorzata Czerwicka, Piotr Stepnowski 

7. Zastosowanie detektora azotowo-fosforowego (NPD) do oznaczania 

farmaceutyków techniką gc 

Jolanta Kumirska, Natalia Migowska, Magda Caban, Mirko Weinhold, 

Anna Białk-Bielińska, Jorg Töming, Piotr Stepnowski 

8. Cykliczne sililowanie oraz tert-butylodimetylosililowanie jako technika 

derywatyzacji ß-blokerów, ß-agonistów oraz antyepileptyków 

Magda Caban, Piotr Stepnowski, Marek Kwiatkowski, Natalia Migowska, 

Jolanta Kumirska 

9. Zastosowane złóż ekstarkcyjnych o charakterze polimerycznym do wydzielania 

leków o właściwościach zasadowych 

Magda Caban, Piotr Stepnowski, Marek Kwiatkowski, Natalia Migowska, 

Jolanta Kumirska 

10. Analiza jakościowa i liściowa kwasów tłuszczowych, estrów metylowych 

i alkoholi calliphora vicina z wykorzystaniem HPLC-LLSD i GC/MS 

Marek Gołębiowski, Monika Paszkiewicz, Anna Grubba, Mieczysława 

I. Boguś, Piotr Stepnowski 

11. Zastosowanie GC/MS-SIM do analizy lipidów kutikularnych sarcophaga 

Canaria 

Marek Gołębiowski, Monika Paszkiewicz, Alma Oleszczak, Mieczysława 

I. Boguś, Piotr Stepnowski 

12. Zastosowanie GC i GC/MS do analizy jakościowej i ilościowej monoi 

disacharydów w próbkach biologicznych 

Monika Paszkiewicz, Marek Gołębiowski, Dorota Wirkus, Radosław 

Owczuk, Piotr Stepnowski 

13. Zastosowanie technik chromatograficznych do analizy składu lipidów 

powierzchniowych blatta orientalia 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

246 


Marek Gołębiowski, Monika Paszkiewicz, Agata Sikora, Emilia Włóka, 

Wioletta Wieloch, Elżbieta Przybysz, Mieczysława Boguś, Piotr Stepnowski 

14. Optymalizacja rozdzielania enancjomerów związków pochodnych 

2,6-diketopiperazyny w chromatografii cieczowej 

Kamila Szwed, Maciej Dawidowski, Anna Bielejewska 

15. Oznaczanie wybranych farmaceutyków w próbkach środowiskowych 

pobranych z rejonów przybrzeżnych południowego bałtyku i województwa 

pomorskiego przy zastosowaniu techniki LC-MS/MS 

Anna Białk-Bielińska, Marta Borecka, Grzegorz Siedlewicz, Kinga Kornowska, 

Ksenia Pazdro, Jolanta Kumirska, Piotr Stepnowski 

16. Optymalizacja warunków rozdzielania chromatograficznego mieszanin 

polisacharydów wyizolowanych ze ściany komórkowej różnych szczepów 

bakterii z rodzaju enterococcus 

Anna Bychowska, Małgorzata Czerwicka, Kinga Marszewska, Zbigniew 

Maćkiewicz, Piotr Stepnowski, Zbigniew Kaczyński 

17. Analiza chromatograficzna wosków powierzchniowych 

Beata Szafranek, Elżbieta Synak, Piotr Stepnowski 

18. Wykorzystanie technik chromatograficznych do określenia składu 

cukrowego o-polisacharydów wyodrębnionych z wybranych szczepów 

bakterii rodzaju cronobacter 

Kinga Marszewska, Małgorzata Czerwicka, Anna Bychowska, Jadwiga 

Wiśniewska, Janusz Rak, Piotr Stepnowski, Zbigniew Kaczyński 

19. Zastosowanie chromatografii w analizie struktury o-polisacharydów bakterii 

pectobacterium atrospeticum 

Małgorzata Czerwicka, Jolanta Kumirska, Jerzy Gajdus, Anna Bychowska, 

Kinga Marszewska, Jadwiga Wiśniewska, Piotr Stepnowski, 

Zbigniew Kaczyński 

20. Wykorzystanie technik chromatograficznych do wyodrębniania i analizy 

strukturalnej polisacharydowych składników ściany komórkowej bakterii 

enterococcus faecium 

Zbigniew Kaczyński, Anna Bychowska, Małgorzata Czerwicka, Kinga 

Marszewska, Piotr Stepnowski 

21. Wyznaczanie izoterm adsorpcji jednopierścieniowych węglowodorów 

aromatycznych na sorbencie haloizytowym metodą inwersyjnej chromatografii 

gazowej 

Kamil Czech, Piotr M. Słomkiewicz 

22. Wpływ położenia podstawnika na adsorpcję z fazy wodnej chloropochodnych 

aniliny na sorbentach haloizytowych 

Magdalena Garnuszek, Beata Szczepanik, Piotr Słomkiewicz, Bożena 

Syzdół 

23. Badania nad selektywnością rozdzielenia wybranych fenolokwasów 

w układach RP HPLC z różnymi adsorbentami i modyfikatorami eluentu 

Beata Misiołek, Anna Klimek-Turek, Tadeusz H. Dzido 

24. Metodyka rozdzielania, identyfikacji i oznaczania kumaryny w napojach 

alkoholowych oraz maceratach z turówki wonnej - wykorzystanie od- 



247 

wróconych układów faz, detekcji UV/DAD i przepływu zwrotnego w kolumnie 

Anita Skrzypczak, Marian Kamiński 

25. Metody badań całkowitego potencjału antyoksydacyjnego produktów 

pszczelarskich 

Elwira Lewczuk, Katarzyna Ciołek, Paweł Wantusiak, Paweł Piszcz, 

Iwona Kiersztyn, Bronisław K. Głód, Paweł K. Zarzycki 

26. α- i ß- cyklodekstryny rozpuszczone w cieczy jonowej jako fazy stacjonarne 

w chromatografii gazowej 

Monika Sobótka, Monika Asztemborska, Janusz Lipkowski 

27. Oznaczanie aktywności przeciwutleniającej olejów roślinnych 

Piotr Kościesza, Rafał Jurczak, Paweł Piszcz, Paweł Wantusiak, Iwona 

Kiersztyn, Bronisław K. Głód 

28. Determination of bisphenol a and related EDCS compounds in milk 

using micro-TLC and temperature-dependent inclusion chromatography 

Paweł K. Zarzycki, Elżbieta Włodarczyk, Deborah Hodgson, Vicki 

L. Clifton 

29. Wpływ cieczy jonowych jako dodatków do cyklodekstrynowej fazy 

ruchomej na chiralne rozdzielanie w wysokosprawnej chromatografii 

cieczowej 

Agata Papierz, Monika Asztemborska 

30. Pro- i antyoksydanty w procesie fermentacji miodów 

Adrian Szabrański, Paweł Wantusiak, Paweł Piszcz, Bronisław K. Głód 

Obradom towarzyszyły prezentacje i wykłady firm chromatograficznych: 

1. Janusz Polkowski, Merck, 

2. Witold Ryttel, Knauer, 

3. John Podgórski, Shimadzu, 

4. Tomasz Gromulski, Karol Skup, Perlan Technologies. 

Firma Merck ufundowała trzy nagrodę za najlepszą prezentację posterową 

oraz dwie nagrody pocieszenia. Otrzymały je: 

1. Adrian Szabrański, Pro- i antyoksydanty w procesie fermentacji miodów, 

Zakład Chemii Analitycznej, UP-H Siedlce, 

2. Magdalena Caban, Zastosowanie złóż ekstrakcyjnych o charakterze polimerycznym 

do wydzielania leków o właściwościach zasadowych, Zakład 

Analizy Środowiska, UG Gdańsk, 

3. Kinga Marszewska, Wykorzystanie technik chromatograficznych do określania 

składu cukrowego O-polisacharydów wyodrębnionych z wybranych 

szczepów bakterii rodzaju Cronobacter, Zakład Analizy Środowiska, UG 

Gdańsk. 

Materiały konferencyjne zostały wydane w postaci książki abstraktów, 

jako numer specjalny czasopisma Camera Separatoria. Uczestnicy otrzymali 

również trzeci numer czasopisma. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

248 


Spotkaniu towarzyszyły imprezy dodatkowe, bankiet powitalny, uświetniony 

występem Alicji z Państwowej Szkoły Muzycznej w Warszawie oraz Karola 

Adamczyka absolwenta Państwowej Szkoły Muzycznej II stopnia w Siedlcach. 

Tradycyjnie wieczór ubogacił koncert fortepianowy pani prof. Moniki 

Waksmundzkiej-Hajnos. 



249 

Wycieczka zorganizowana została do miejscowości Mielnik nad Bugiem oraz 

na Świętą Górę Grabarkę. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

250 


Po drodze przejechaliśmy przez Drohiczyn oraz najmniejszą miejscowość 

w Polsce, liczącą tylko jednego mieszkańca, Końskie Góry. 

Organizatorzy III Podlaskiego Spotkania Chromatograficznego dziękują 

Sponsorom: Prezydent Miasta Siedlce, Merck bez których pomocy zorganizowanie 

konferencji byłoby utrudnione. 




Camera Separatoria 

PRACE PRZEGLĄDOWE 

(REVIEW PAPERS)

252 





Anita SKRZYPCZAK 1 , Mariusz JASZCZOŁT 1 , 

Aleksandra KRÓLICKA 2 , Marian KAMIŃSKI 1* 

1 

Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechniki Gdańskiej, 

ul. Narutowicza 11/12, 80-233 Gdańsk, 

e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl* 

2 

Zakład Ochrony i Biotechnologii Roślin, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-GU Med, 

Kładki 24, 80-822 Gdańsk 

Techniki i metody chromatografii cieczowej w rozdzielaniu, 

oznaczaniu oraz izolowaniu naftochinonów i flawonoidów 

z roślin 

Liquid chromatography techniques and methods 

in separation, determination and isolation 

of naphthoquinones and flavonoids from plants 

Streszczenie: W niniejszej pracy przedstawiono przegląd technik oraz metod chromatografii 

cieczowej w zakresie rozdzielania, oznaczania oraz izolowania naftochinonów i flawonoidów 

z ekstraktów roślinnych w szczególności z ekstraktów roślin mięsożernych (łac. plantae carnivorae). 

Przedstawiono techniki najczęściej wykorzystywane podczas rozdzielania, oznaczania 

i izolowania metabolitów wtórnych, takie jak cienkowarstwowa chromatografia cieczowa (Thin 

Layer Chromatography) oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa (High Performance 

Liquid Chromatography). Przeanalizowano metody i warunki rozdzielania w normalnym i odwróconym 

układzie faz (Normal- and Reversed- Phase) oraz w warunkach chromatografii podziałowej 

ciecz-ciecz z fazą stacjonarną generowaną dynamicznie LLPC (Liquid-Liquid Partition 

Chromatography). 

Słowa kluczowe: naftochinony, flawonoidy, ekstrakty roślinne, cienkowarstwowa chromatografia 

cieczowa (TLC), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), chromatografia podziałowa 

ciecz-ciecz z fazą stacjonarną generowaną dynamicznie (LLPC). 

Abstract: This work is a review of liquid chromatography techniques and methods used for separation, 

determination and isolation of naphthoquinones and flavonoids from the plants 

extracts, in particular, from the extracts of Carnivorous plants (plantae carnivorae). Presented 

techniques are the most frequently used during the processes of separation, determination and 

isolation of secondary metabolites i.e. thin layer chromatography (TLC) and high performance 

liquid chromatography (HPLC). Described and analyzed methods and separation conditions in 

normal and reversed phase (NP and RP) and Liquid-Liquid Partition Chromatography. 

Key words: naphthoquinones, flavonoids, plants extracts, thin layer chromatography (TLC), 

high performance liquid chromatography (HPLC), Liquid-Liquid Partition Chromatography 

(LLPC).

254 

A. Skrzypczak, M. Jaszczołt, A. Królicka, M. Kamiński 

1. Wprowadzenie 

(Introduction) 

Metabolity wtórne z grupy naftochinonów oraz flawonoidów wykazują 

właściwości przeciwbakteryjne, przeciwgrzybiczne, istnieją także doniesienia 

o właściwościach przeciwnowotworowych w przypadku naftochinonów [1-3]. 

Naftochinony, czyli diketonowe pochodne naftalenu, występują powszechnie 

w roślinach z rodzin Bignoniaceae, Verbanaceae, Ebenaceae, Plumbaginaceae 

oraz w roślinach owadożernych z rodzin: Dionophyllaceae, Nepathaceae 

i Droseraceae. Zawarte są w liściach, owocach, korzeniach i drewnie [4, 5, 6]. 

Dowiedziono, że naftochinony posiadają właściwości cytostatyczne, 

przeciwzapalne, bakterio i grzybobójcze, wykazują działanie przeciwwirusowe, 

antymalaryczne oraz hamują rozwój pasożytów takich jak Schistosoma 

mansoni i Trypanosoma cruzi [5, 7]. Właściwości naftochinonów związane 

są ze zdolnością do generacji aktywnych form tlenu, inhibicją enzymów topoizomeraz 

oraz ich oddziaływaniem z DNA [5]. Dzięki właściwościom oksydacyjnym 

naftochinony są zdolne do tworzenia nieodwracalnych kompleksów 

z aminokwasami, prowadząc często do inaktywacji białka. Dzięki 

wysokiemu potencjałowi redoks związki te mogą, także stymulować łańcuch 

oddechowy w komórkach bakterii prowadząc do powstania toksycznych 

rodników tlenowych i efektu bakteriobójczego [8]. 

Flawonoidy pełnią w roślinach funkcję barwników, antyoksydantów, oraz 

stanowią ochronę przed promieniowaniem UV i patogenami. Dowiedziono 

ponadto, że flawonoidy są związkami farmakologicznie czynnymi. Posiadają 

one aktywność antywirusową, antybakteryjną, antyalergiczną, a także działają 

przeciwzapalnie i przeciwskurczowo. Efekty farmakologiczne flawonoidów 

wynikają z ich własności antyoksydacyjnych, zdolności do chelatowania 

jonów metali oraz do oddziaływania z enzymami, błonami komórkowymi 

i DNA [7, 9-12]. 

Z uwagi na aktywność farmakologiczną naftochinonów i flawonoidów dużego 

znaczenia nabrało opracowanie selektywnych i czułych metod rozdzielania, 

oznaczania i izolacji metabolitów wtórnych z ekstraktów roślinnych. 

Chromatografia cieczowa jest najczęściej stosowaną techniką do rozdzielania, 

oznaczania i izolowania metabolitów wtórnych z ekstraktów roślinnych. 

Najstarszą techniką analizy naftochinonów i flawonoidów jest chromatografia 

planarna, zarówno bibułowa, jak i cienkowarstwowa [13]. Obecnie 

badania ekstraktów roślinnych bogatych w substancje z grupy naftochinonów 

i flawonoidów wykonuje się przede wszystkim z wykorzystaniem techniki 

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). 


Techniki i metody chromatografii cieczowej w rozdzielaniu, oznaczaniu oraz izolowaniu… 

255 

Rozdzielanie, oznaczanie i izolowanie naftochinonów oraz flawonoidów 

z zastosowaniem cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC) 

w normalnym i odwróconym układzie faz oraz w warunkach 

chromatografii podziałowej ciecz-ciecz z fazą stacjonarną 

generowaną dynamicznie 

(Separation, determination and isolation of naphthoquinones 

and flavonoids using thin-layer chromatography (TLC) in normal 

and reverse phase and Liquid-Liquid Partition Chromatography) 

Cienkowarstwowa chromatografia cieczowa wykorzystywana jest 

przede wszystkim do stwierdzenia obecności poszukiwanego składnika 

w badanej mieszaninie lub stwierdzenia jego braku. Współczesne odmiany 

tej techniki, z zastosowaniem detektora UV-VIS typu DAD oraz skanerów, 

pozwalają na identyfikację, jakościową jak i ilościową. Mimo wszystko, 

dokładność i precyzja chromatografii cienkowarstwowej są wyraźnie mniej 

korzystne, niż uzyskiwane z zastosowaniem techniki kolumnowej wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej – HPLC. Chromatografia cienkowarstwowa 

jest również wykorzystywana do celów semi-preparatywnych [18]. 

Do rozdzielania naftochinonów i flawonoidów z zastosowaniem cienkowarstwowej 

chromatografii cieczowej najczęściej wykorzystuje się układ 

faz normalnych lub chromatografię podziałową ciecz-ciecz z fazą stacjonarną 

generowaną dynamicznie, a rzadziej odwrócony układ faz. Jako fazę stacjonarną 

najczęściej stosowano żel krzemionkowy [14-23], a w przypadku 

odwróconego układu faz, żel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi 

[18, 21]. W normalnym układzie faz w postaci fazy ruchomej stosowano 

mieszaniny takich rozpuszczalników, jak: heksan, octan etylu, chloroform, 

benzen, eter etylowo-metylowy [14-17], w warunkach chromatografii 

podziałowej z dynamicznie generowaną fazą stacjonarną stosowano heksan, 

toluen, chloroform, octan etylu, kwas mrówkowy, kwas octowy, metanol 

[18-23], a w odwróconym układzie faz stosowano: acetonitryl, metanol, kwas 

octowy, wodę [18, 21]. Rozdzielanie substancji na cienkich warstwach fazy 

stacjonarnej wykonywano niekiedy wielokrotnie, rozwijając chromatogram 

kilkakrotnie w tej samej lub różnych fazach ruchomych. 

Flawonoidy charakteryzują się wysoką polarnością, dlatego w rozdzielaniu 

związków z tej grupy szczególne zastosowanie znajduje chromatografia 

podziałowa ciecz-ciecz z fazą stacjonarną dynamicznie generowaną (LLPC). 

Fazą stacjonarną w LLPC jest polarny adsorbent, a niepolarna faza ruchoma 

jest bliska nasyceniu polarnym rozpuszczalnikiem np. wodą bądź metanolem. 

W LLPC występują oddziaływania charakterystyczne zarówno dla układów 

adsorpcyjnych jak i podziałowych, a o przewadze danych oddziaływań decyduje 

rodzaj fazy stacjonarnej, rodzaj analitu, a także stopień wysycenia niepolarnego 

eluentu polarnym rozpuszczalnikiem. W chromatografii podziałowej 

ciecz-ciecz z fazą stacjonarną dynamicznie generowaną, oddziaływania niespecyficzne 

(dyspersyjne), w przeciwieństwie do normalnego układu faz, mają 

znaczący wpływ i decydują o wartości współczynnika podziału i związanych 

z nim wartości takich jak objętość i czas retencji (V r i t r ). 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

256 


W tabeli 1 przedstawiono zastosowane dotychczas w literaturze 

przedmiotu, warunki rozdzielania, oznaczania lub izolowania naftochinonów 

i flawonoidów w ekstraktach roślinnych w normalnym układzie faz cienkowarstwowej 

chromatografii cieczowej (NP-TLC), odwróconym układzie faz 

cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (RP-TLC) oraz w warunkach 

chromatografii podziałowej ciecz-ciecz z fazą stacjonarną generowaną dynamicznie 

(LLPC). 


Vol. 3, No 2/2012 Camera Separatoria 

Tabela 1. Warunki rozdzielania, oznaczania lub izolowania naftochinonów i flawonoidów w ekstraktach roślinnych w normalnym 

układzie faz cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (NP-TLC), odwróconym układzie faz cienkowarstwowej 

chromatografii cieczowej (RP-TLC) oraz w warunkach chromatografii podziałowej ciecz-ciecz 

z fazą stacjonarną generowaną dynamicznie (LLPC) 

Table 1. Conditions of separation, determination and isolation of naphthoquinones and flavonoids from the plants 

extracts in normal phase thin layer chromatography (NP-TLC), reversed phase thin layer chromatography 

(RP-TLC) and Liquid-Liquid Partition Chromatography (LLPC) 

Lp. 

(Nr) 

Odmiana 

techniki TLC 

(Type of technique 

TLC) 

Faza 

stacjonarna 

(Stationary 

phase) 

Faza ruchoma 

(Mobile phase) 

Rozdzielane/ oznaczane 

metabolity Materiał roślinny 

(Separated/ determined 

(Plant material) 

metabolites) 

1 NP-TLC Si 60 CH 3 Cl plumbagina Drosera Peltata 

2 NP-TLC Si 60 F 254 , 

3 NP-TLC Si 60 

4 NP-TLC Si 60 F 254 

Heksan/ AcOEt, 

(85:15 v/v) 

Heksan/ AcOEt 

(5:2 v/v) 

Heksan/ AcOEt 

(90:10 v/v) 

plumbagina, 

3-o-metylo droseron, 

6-hydroksy plumbagina, 

dihydroksynaftochinon, 

oraz szikinony 

plumbagina 

ramentaceon i jego 

dimery oraz inne 

naftochinony 

Plumbago 

capensis 

Plumbago 

auriculata 

Euclea racemosa 

ssp. schimperi 

Warunki 

detekcji 

(Detection 

conditions) 

Obserwacja 

w świetle widzialnym 

oraz 

przy dł. fali 

365 nm 

Lit. 

(Ref.) 

[14] 

Brak danych [15] 

Obserwacja 

w świetle UV 

o długości fali 

λ 1 =254 

i λ 2 =366 nm 

[16] 


Uwagi 

(Comments) 

TLC, wykorzystano do 

analizy frakcji otrzymanych 

za pomocą kolumnowej 

chromatografii 

cieczowej 





cieczowej 

Analiza składu ekstraktu 

Plumbago auriculata 

w dichlorometanie 

TLC zastosowano do 

analizy składu ekstraktów 

oraz frakcji zebranych 

za pomocą 

kolumnowej hromatografii 

cieczowej 


257

Camera Separatoria Vol. 3, No 2/2012 

5 HILIC-TLC Si 60 

6 LLPC-TLC 

7 

LLPC-TLC oraz HI- 

LIC-TLC 

Si 

(20 cm×20 cm) 

płytki szklane 

1) Si 60 F 254 

2) Si 60 F 254 

3) Celuloza 

MN300 

4) Celuloza 

MN300 

5) Celuloza 

MN300 

6) Celuloza 

MN300 

8 LLPC-TLC Si 60 F 254 

9 LLPC-TLC Si 60 F 254 

1-BuOH: 

AcOH:H 2 O 

(4:1:5 v/v) oraz 

AcOH:H 2 O 

(3:17 v/v) 

CHCl 3 :MeOH 

(85:15, v/v) 

1) AcOEt: 

HCOOH: 

CH 3 COOH:H 2 O 

(100:11:11:26 v/v) 

2) AcOEt: 

MeOH: H 2 O 

(63:12:9 v/v) 

3) 1-BuOH: 

AcOH: H 2 O 

(60:15:75 v/v) 

4) (2:98 v/v) 

5) AcOH:H 2 O 

(15:85 v/v) 

6) CH 3 Cl:AcOH: 

H 2 O (50:45:5 v/v) 

CH 2 Cl 2 /MeOH 

(85:15) 

AcO- 

Et:HCOOH:CH 3 C 

OOH:H 2 O 

(100:11:11:26) 

4-O-glukozyd 

7-metylohydrojuglonu 

i 4-O-glukozyd 

hydroplumbaginy 

3-o-β-d-galaktozyd 

kwercetyny, 

3-o-β-l-arabinozyd 

kwercetyny 

flawonoidy 

kwercetyna 

i jej glikozydy 

Flawonoidy, w tym 

kwercetyna 

Drosera 

rotundifoli 

Drosera 

intermedia 

Byrsonima crassa 

Cymbopogon citratus 

Nymphaea 

pulchella, 

gracilis i elegans 

Acacia pennata 


Obserwacja 

w świetle UV 

o długości fali 

λ=254nm 

1) Spryskanie 

1% roztw. boranu 

2-aminoetylodifenylowego 

w Me- 

OH oraz 5% 

roztw. PEG 400 

w EtOH 

Dla układów od 

2-6 stosowano 

obserwacje pod 

lampą UV przy 

λ=366 nm 

Spryskanie roztworem 

[(NH 4 ) 4 Ce(SO 4 ) 4 

*2H 2 O]–H 2 SO 4 

Spryskanie 

płytek NP/PEG 

i obserwacja 

w świetle UV 

o λ=254 nm oraz 

λ=366 nm 

[19] 

[20] 

[21] 

[22] 

Zastosowano dwuwymiarową 

cienkowarstwową 

chromatografię 

cieczową (2D-TLC) 





cieczowej 

Do analizy flawonoidów 

zawartych w frakcjach 

otrzymanych za pomocą 

chromatografii semiprep. 

RP-HPLC zastosowano 

6 układów 

chromatograficznych 

TLC 

TLC, wykorzystano 

do analizy frakcji 

otrzymanych za pomocą 

kolumnowej chromatografii 

cieczowej 

Identyfikacja głównych 

grup składników zawartych 

w ekstraktach 

Acacia pennata otrzymanych 

za pomocą 

różnych ekstrahentów 

258 A. Skrzypczak, M. Jaszczołt, A. Królicka, M. Kamiński


10 LLPC-TLC 

11 RP-TLC RP-18 F 254 

12 RP-TLC RP-18 F 254 

Si60 F 254 n-heksan/AcOEt/ 

(20 cm×20 cm, MeOH 

0,2 mm) (100/15/1v/v) 

MeOH:H 2 O 

1:1 (v/v) 

H 2 O:MeOH: 

:CH 3 CN 

(3:2:1) 

naftochinony 

glukozyd 4-hydroksy 

naftochinonu; rossolizyd; 

glukozyd hydroplumbaginy, 

plumbagina; 

ramentaceon 

kwercetyna 

i jej glikozydy 

Arnebia 

densiflora 

Drosera 

rotundifolia 

Drosera 

intermedia 

Skaner TLC λ= 

520 nm 

Obserwacja w 

świetle widzialnym 

oraz w świetle 

UV o λ= 365 

nm 

Nymphaea 

Spryskanie roztworem 

pulchella, 

Nymphaea gracilis 

[(NH 

i Nymphaea 

4 ) 4 Ce(SO 4 ) 4 

*2H 

elegans 

2 O]–H 2 SO 4 

[23] 

[18] 

[21] 

Do analizy ilościowej 

naftochinonów zastosowano 

połączenie 

techniki TLC z densytometrią 

Analiza metabolitów 

zawartych w metanolowych 

ekstraktach z D. 

rotundifolia oraz 

D. intermedia 





cieczowej 


259

260 A. Skrzypczak, M. Jaszczołt, A. Królicka, M. Kamiński 

Rozdzielanie, oznaczanie i izolowanie naftochinonów oraz flawonoidów 

z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) 

w normalnym i odwróconym układzie faz oraz w warunkach 

chromatografii podziałowej ciecz-ciecz z fazą stacjonarną 

generowaną dynamicznie 

(Separation, determination and isolation of naphthoquinones 

and flavonoids using high performance liquid chromatography (HPLC) 

in normal and reverse phase and Liquid-Liquid Partition 

Chromatography) 

Obecnie, najczęściej stosowaną techniką do rozdzielania, oznaczania 

bądź izolowania naftochinonów oraz flawonoidów jest wysokosprawna 

chromatografia cieczowa (HPLC). 

W tabeli 2 przedstawiono warunki rozdzielania, oznaczania lub izolowania 

naftochinonów i flawonoidów w ekstraktach roślinnych w normalnym 

układzie faz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (NP-HPLC), odwróconym 

układzie faz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC) 

oraz w warunkach chromatografii podziałowej ciecz-ciecz z fazą stacjonarną 

generowaną dynamicznie (LLPC). 

Najczęściej stosowanym układem chromatograficznym do analizy zawartości 

naftochinonów i flawonoidów w ekstraktach roślinnych jest układ faz 

odwróconych (RP-HPLC) w warunkach izokratycznych, albo z zastosowaniem 

elucji gradientowej. Od wielu lat, i najczęściej także obecnie, jako fazy 

stacjonarne stosowane są fazy wiązane z niepolarnymi ugrupowaniami 

o osiemnastu atomach węgla (C18) [30-31, 33-34, 36, 38-40], dwunastu atomach 

węgla (C12) [32] oraz ośmiu atomach węgla-(C8) [35]. Średnica ziaren 

wypełnienia kolumny, podczas rozdzielania i oznaczania metabolitów, wynosi 

najczęściej 5 μm, rzadziej 4 lub 3 μm, a podczas rozdzielania semipreparatywnego, 

mającego na celu izolację metabolitów, najczęściej stosowane 

jest wypełnieni kolumny o ziarnach 10 μm [17]. 

Jako eluenty wykorzystuje się mieszaniny wody oraz rozpuszczalnika 

organicznego [30-40] tj.: metanolu, acetonitrylu, rzadziej tetrahydrofuranu. 

Często, dodatek do eluentu stanowi kwas np. mrówkowy, octowy lub trifluorooctowy, 

w celu zmiany pH eluentu, cofnięcia dysocjacji kwasowej, oraz 

zwiększenia w ten sposób hydrofobowości rozdzielanych i oznaczanych 

substancji. 

Składniki ekstraktów rozdziela się i oznacza przeważnie przy użyciu 

warunków elucji gradientowej, ze względu na różnorodny skład ekstraktu roślinnego, 

uzyskuje się w ten sposób krótszy czas analizy i oszczędność eluentów. 

Alternatywą jest stosowanie elucji skokowej, albo tzw. rozdzielania 

wielowymiarowego. 

Najczęstszym detektorem w przypadku rozdzielania i oznaczania 

składników ekstraktów roślinnych techniką HPLC jest detektor spektrofotometryczny 

z matrycą fotodiodową (UV-VIS/DAD), lub spektrometr masowy 

(ESI-MS), rzadziej detektor refraktometryczny (RI) i oczywiście tylko w warunkach 

elucji izokratycznej. 



261 

Druga grupa metod separacyjnych, stosowana często dawniej, 

a obecnie rzadziej to wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnym 

układzie faz (NP-HPLC). Fazą stacjonarną najczęściej wykorzystywaną 

jest wówczas żel krzemionkowy 60 lub 100 Å. W literaturze opisano także 

stosowanie związanych faz stacjonarnych typu: - CN, DIOL (odpowiednio 

cyjanopropylowa [26] i dihroksypropylowa [27] faza związana z żelem krzemionkowym), 

oraz mieszaniny n-heksanu, chloroformu, dichlorometanu, 

2-propanolu, octanu etylu, dioksanu oraz tetrahydrofuranu, w różnym stosunku 

objętościowym jako składniki eluentu [17, 24-29]. 

Chromatografia podziałowa ciecz-ciecz z fazą stacjonarną generowaną 

dynamicznie (LLPC/NP-W) jest rzadko stosowana w technice wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej. Jednak podczas jednoczesnego rozdzielania 

naftochinonów oraz flawonoidów, różniących się znacznie polarnością, 

jest ona przydatna, ze względu na zmniejszenie retencji rozdzielanych metabolitów 

i wzrost retencji polarnych składników ekstraktów oraz ma miejsce 

wyraźne zwiększenie pojemności separacyjnej układu, stąd mimo wyraźnej 

asymetrii pików spowodowanej nieliniowością izoterm sorpcji, tego rodzaju 

układy rozdzielcze mają szczególnie korzystne właściwości w skali preparatywnej 

[41]. Jako fazy stacjonarne w LLPC-HPLC stosuję się żel krzemionkowy 

lub żel krzemionkowy modyfikowany grupami dihydroksypropylowymi 

(DIOL), a jako fazy ruchome wykorzystuje się mieszaniny eterów alifatycznych 

i cyklicznych lub węglowodory alifatyczne i ich chloropochodne jako nisko-polarne 

składniki eleuntu z metanolem, izopropanolem, acetonitrylem, 

jako polarne składniki eluentu, przy czym eluent posiada wodę w ilości zbliżonej 

do nasycenia się nią eluentu [29, 41-42]. 

Vol. 3, No 2/2012 

Camera Separatoria


Tabela 2. Warunki rozdzielania, oznaczania lub izolowania naftochinonów i flawonoidów w ekstraktach roślinnych w normalnym 

układzie faz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (NP-HPLC), odwróconym układzie faz wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej (RP-HPLC) oraz w warunkach chromatografii podziałowej ciecz-ciecz 

z fazą stacjonarną generowaną dynamicznie (LLPC) 

Table 2. Conditions of separation, determination and isolation of naphthoquinones and flavonoids from the plants 

extracts in normal phase high performance liquid chromatography (NP-HPLC), reversed phase high 

performance liquid chromatography (RP-HPLC) and Liquid-Liquid Partition Chromatography (LLPC) 

Lp. 

(Nr) 

Odmiana 

techniki 

HPLC 

(Type of 

technique 

HPLC) 

Faza 

stacjonarna 

(Stationary 

phase) 

1 NP-CC Si 60 

2 NP.-CC 

semi-prep Si 

(Merck, 

0.063–0.200 mm) 

3 NP.-CC Si 60 

Faza ruchoma 

(Mobile phase) 

A:hex B:AcOEt 

od 100%A do 0%, 

skokowo co 10% B 

hex : AcOEt; 9:1, 8:2 

do 1:1 

DCM:AcOEt 

(20:80), 

Rozdzielane/ 

oznaczane 

metabolity 

(Separated/ 

determined 

metabolites) 

Naftochinony, np. 

ramentaceon 

Oznaczano 6 naftochinonów, 

w tym: 

ramentaceon, 

5,5’-Dihydroksy- 

-7,7’-binaftochinon 

Flawonoidy, w tym: 

kwercetyna 

Materiał 

roślinny 

(Plant 

material) 

Euclea 

racemosa 

Euclea 

natalensis 

Buddleja 

globosa 

Warunki 

detekcji 

(Detection 

conditions) 

Lit. 

(Ref.) 

UV-VIS [17] 

B/d [24] 

B/d [25] 

Uwagi 

(Comments) 

Wyizolowano 10 frakcji 

bogatych w poszczególne 

metabolity stosując elucję 

skokową, zwiększają 

zawartość octanu etylu 

o 10% v/v 

W celu wyizolowania frakcji 

bogatych w poszczególne 

naftochinony zastosowano 

semipreparatywną 

kolumnową 

chromatografię cieczową 

oraz elucję gradientową 

Do identyfikacji otrzymanych 

frakcji za pomocą 

chromatografii kolumnowej 

wykorzystano technikę 

TLC 



4 NP-HPLC 

5 NP-HPLC 

6 LLPC-HPLC 

7 

NP-HPLC 

oraz 

LLPC-HPLC 

8 RP-HPLC 

9 RP-HPLC 

μBondapak- 

CN(300 mm x 

3,9 mm, 10 μm) 

Lichrospher DIOL 

250 mm 

x 4 mm, 

5 μm 

μSpherogel, 

30 mm x 8 mm, 

10 μm 

DIOL LiChrosorb 

125 mm x 4 mm 

RP-18 (250 

mmx10 mm, 

10 m) 

RP 18 

(150 mm×4 mm) 

CHCOOH: hex, 

1% kw. octowego 

(brak danej 

dot. stosunku) 

A:hex, B:THF 

0-15 min 10-50%B 

15-25 min 50%B 

hex:CH 3 Cl: 

izopropanol 

(30:70:2 v/v/v) 

1) Dioksan: heksan: 

(b/d, v/v/v) 

2) dioksan: heksan:MeOH 

(40:40:20 v/v/v). 

CH 3 CN:H 2 0 

0 min.1:1 v/v 

40 min.100:0 v/v 

CH 3 CN:0,1% COOH 

(25:75 v/v) 

plumbagina, 

ramentaceon, 

juglon, lawson, 

izodiospyrin, 

mamegakinone 

plumbagina, 

ramentaceon, 

kwercetyna 

i mirycetyna 

1,4 naftochinon, 

plumbagina 

Kwercetyna 

oraz kempferol 

Naftochinony, 

np. ramentaceon 

Flawonoidy, 

w tym kwercetyna 

Diospyros 

Usambarensis, 

Roth 

Dionaea 

muscipula, 

Drosera 

capensis 

Plumbago 

zeylanica 

Ginkgo 

Biloba 

Euclea 

racemosa 

Buddleja 

globosa 

UV 

λ=254 nm 

[26] 

UV-DAD [27] 

UV-VIS [28] 

1) UV-DAD 

2) detektor 

elektrochemiczny 

ED 

[29] 

UV-VIS [17] 

UV-DAD [25] 

Za pomocą NP-HPLC 

rozdzielono i oznaczono 

6 naftochinonów 

NP-HPLC zastosowano 

do oznaczania zawartości 

2 naftochinonów oraz 

dwóch flawonoidów 

w ekstraktach z roślin 

poddanych elicytacji 

Opracowana metoda ma 

służyć do szybkiego oznaczania 

wybranych naftochinów 

w ekstraktach 

z Plumbago Zeylanica 

Do oznaczania kwercetyny 

oraz kempferolu zastosowano 

dwa układu separacyjne, 

pierwszy NP-HPLC 

z detektorem UV-DAD 

oraz drugi LLPC-HPLC 

z detektorem ED 


jako kolejny etap po 

chromatografii kolumnowej 

do wyizolowania frakcji 

bogatych w określone 

naftochinony 


do identyfikacji składników 

zawartych w frakcjach 

otrzymanych z zastosowaniem 

NP-CC 


263


10 RP-HPLC 

11 RP-HPLC 

12 RP-HPLC 

13 RP-HPLC 

14 RP-HPLC 

LiChrospher 100 

RP18e (250 mm 

x 4,0 mm, 

5 m) 

LiChrospher C18 

(250 mm x 4 mm) 

Phenomenex 

C-12 

(150 mm x 

4,6 mm, 4 m) 

Zorbax C18-AAA 

150 mmx4,6 mm, 

3,5 m 

Nucleosil 100-5 

C18 

250 mm x 4 mm 

5 m 

H 2 O:MeOH 

Program elucji: 

0 min 2:98 

10 min 50:50 

30 min 100:0 

40 min 100:0 (v/v) 

MeOH:0,5% H 3 PO 4 

(46:54 v/v) 

H 2 O:AcCN; 


0 min 85:12 

10 min 70:30 

20 min 50:50 

30 min 20:80 

0,1 M CH 3 COOH: 

MeOH 

(33:67 v/v) 

2,5%HCOOH:100% 

MeOH 


0 min: 95:5 

15 min 70:30 

40 min 60:40 

plumbagina 

Flawonoidy 

np. kwercytyna 

Naftochinony 

Naftochinony: 

1,4-naftochinon, 

plumbagina, 

juglon, lawson 

Związki fenolowe 

Plumbago 

zeylanica 

Ginkgo biloba 

Eleutherine 

americana 

Dionaea 

muscipula, 

D.rotundifolia, 

D.spathulata, 

D. capensis, 

J. regia, 

P. tomentosa, 

133 indyjskie 

rośliny 

lecznicze 

UV-DAD 254 

nm 

RID oraz UV- 

DAD 370 nm 

UV-DAD 254 

nm oraz 

detector MS 

z pułapką 

jonową 

UV-VIS-DAD 

260 nm 

[30] 

[31] 

[32] 

[33] 

UV-DAD [34] 

Opracowaną metodę 

zwalidowano i wyznaczono 

parametry tj. LOQ 

(LOQ=0,06 µg/ml), LOD 

(LOD=0,02 µg/ml), zakres 

liniowości 

(10–200 µg/ml) 

Do oznaczenia flawonoidów 

w Ginkgo biloba zastosowano 

detektor spektrofotometryczny 

typu 

DAD oraz detektor refraktometryczny. 

Temperatura 

termostatowania kolumny 

wynosiła 35°C. 

Zarówno w analizach 

z zastosowaniem detektora 

UV-DAD jak i detektora 

MS wykorzystano te same 

warunki chromatograficzne 

z tym, że do eluentu 

w analizach MS dodano 

0,01% kwas mrówkowy. 

Autorzy badali także eluenty 

z inną zawartością 

metanolu, jednakże ten 

uznali za najbardziej selektywny 

i stabilny. 

Opracowana metoda pozwoliła 

na oznaczenie jakościowe 

związków 

z grup tj. kwasy fenolowe, 

flawonoidy, kumaryny, 



15 RP-HPLC 

16 RP-HPLC 

Agilent C8 

250 mm x 

4,6 mm 

5 m 

Hypersil-ODS 

125 mm x 

4,6 mm 

5 m 

17 RP-HPLC Brak danych 

18 RP-HPLC 

Hypersil BDS 

250 mm× 

4.6 mm, 

5 μm 

60 min 50:50 

65 min 45:55 

90-98 min 0:100 

A: H 2 O/HCOOH 

100:0,2 v/v 

B: MeOH/THF 

100:5 v/v 


0 min 41: 59 

40 min 31: 69 

60 min 30: 70 

70 min 28,5: 71,5 

80 min 0:100 

0,025MH 3 PO 4 :100% 

MeOH 


0 min-3 min 82:18 

11 min-14 min 55:45 

MeCN:H 2 O:AcOH 

62,5:32,5:5 

95%CH 3 CN+5%THF: 

0,2M CH 3 COOH 

38:62 

Naftochinony 

Oznaczano 

5 flawonoidów, 

w tym kwerycytyne 

i kempferol 

Oznaczano 

5 Naftochinonów, 

w tym ramentaceon 

oraz szikonine 

Naftochinony 

i flawonoidy 

9 gatunków roślin 

z rodziny 

Boraginaceae 

Semen 

cuscutae 

Euclea 

natalensis 

D.rotundifolia 

D.madagascariensis 

UV-DAD 

214 nm 

275 nm 

520 nm 

UV-DAD 

360 nm 

UV-DAD, 

430 

i 352 nm 

[35] 

[36] 

[37] 

UV-DAD [38] 

chinony w 83-ech gatunkach 

roślin indyjskich. 

Opracowano metodę 

oznaczania jakościowego 

i ilościowego ośmiu naftochinonów 

w dziewięciu 

gatunkach roślin z rodziny 

Boraginaceae 

Zbadano 40 próbek materiału 

roślinnego zebranego 

z różnych regionów Chin 

w celu oznaczenia zawartości 

pięciu wybranych 

flawonoidów. Opracowana 

metoda charakteryzuje się 

liniowością >0,999 w stosunkowo 

dużym zakresie 

stężeń metabolitów. 

Do oznaczenia ilościowego 

4 naftochinonów zastosowano 

dł. fali 430 nm, 

a do oznaczenia szikoniny 

zastosowano dł. fali 

352 nm 

Opracowana metoda pozwoliła 

na jednoczesne 

oznaczenie naftochinonów 

oraz flawonoidów 

w dwóch gatunkach roślin 


265


19 RP-HPLC 

20 RP-HPLC 

Bondapak C18 

300x3,9 mm 

Superspher 100 

RP18 

250x2 mm, 5 μm 

MeOH:H 2 O 8:2 + 

0,1% TFA 

A: H 2 O:CH 3 CN: 

HCOOH 94,5:5: 

0,5 v/v 

B:H 2 O:CH 3 CN: 

HCOOH 5:94,5: 

0,5 v/v 


0-5 min. A:B 90:10 

5-32 min A:B 

70: 30 

32-40 min A:B 

0: 100 

plumbagina 

Naftochinony i Flawonoidy, 

w tym 

plumbagina 

Plumbago 

rosea L. 

D. adelae, 

D. aliciae, 

D. capensis, 

D. cuneifolia, 

D. ramanacea 

D. binata 

UV-VIS 

254 nm 

UV-DAD 

259 nm i 

ESI/MS 

[39] 

[40] 


do oznaczania zawartości 

plumbaginy w ekstraktach 

z roślin poddanych 

elicytacji 

Opracowana metoda 

z zastosowaniem detektora 

UV-DAD i ESI/MS 

pozwoliła na zbadanie 

składu metabolicznego 

pięciu gatunków roślin 

oraz wyznaczenie gatunku, 

w którym występuję 

największe stężenie 

plumbaginy 



267 

2. Podsumowanie 

(Conclusion) 

Chromatografia cieczowa, zarówno cienkowarstwowa jak i kolumnowa, 

znajduje szerokie zastosowanie w rozdzielaniu, oznaczaniu oraz izolacji 

metabolitów wtórnych z grupy naftochinonów i flawonoidów w materiale roślinnym. 

Za pomocą chromatografii cienkowarstwowej metabolity rozdzielane 

są w układzie faz normalnych (NP-TLC) w warunkach adsorpcyjnych, bądź 

z zastosowaniem chromatografii podziałowej ciecz-ciecz z fazą stacjonarną 

generowaną dynamicznie (LLPC-TLC), a rzadziej z wykorzystaniem odwróconego 

układu faz (RP-TLC). W przypadku rozdzielania i oznaczania naftochinonów 

i flawonoidów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej 

głównie stosowany jest odwrócony układ faz (RP-HPLC), a rzadziej 

NP-HPLC w warunkach adsorpcyjnych lub LLPC-HPLC. Jednakże do izolowania 

metabolitów roślinnych w skali semi-preparatywnej bądź preparatywnej 

wykorzystywana jest najczęściej kolumnowa chromatografia cieczowa 

w normalnym układzie faz lub z zastosowaniem chromatografii podziałowej 

ciecz-ciecz z fazą stacjonarną generowaną dynamicznie (LLPC) Złożoność 

matrycy próbki materiału roślinnego oraz rodzaj wykorzystywanego detektora, 

decyduje o zastosowaniu elucji izokratycznej bądź gradientowej. 

W literaturze istnieje wiele procedur rozdzielania metabolitów roślinnych 

[14-41], jednak dotychczas nie opracowano procedury uniwersalnej, 

przydatnej do rozdzielania metabolitów większej grupy roślin. Warunki rozdzielania 

zaproponowane w literaturze są odpowiednie dla ekstraktów 

otrzymanych z konkretnych roślin, poddanych określonym warunkom elicytacji 

i otrzymanych w określonych warunkach ługowania. W przypadku pojawienia 

się w ekstrakcie dodatkowych substancji, będących wynikiem zmiany 

hodowli czy sposobu ekstrakcji stają się one nieskuteczne, albo tylko 

częściowo skuteczne. 

3. Podziękowania 

(Acknowledgments) 

Praca realizowana dzięki wsparciu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa 

Wyższego w ramach grantu promotorskiego Nr N N405 3757 37. 

Praca współfinansowana przez Unie Europejską w ramach Europejskiego 

Funduszu Społecznego. Projekt systemowy Województwa Pomorskiego 

pn. "InnoDoktorant - stypendia dla doktorantów, II edycja. 

Literatura 

(Literature) 

1. F. Gafner, J.C. Chapuis, J.D. Msonthi, K. Hostettmann, Cytotoxic naphthoquinones, 

molluscicidal saponins and flavonols from Diospyros 

zombensis, Phytochemistry, 26(1987)2501. 

Vol. 3, No 2/2012 

Camera Separatoria

268 


2. P.P. Mebe, G.A. Cordell, J.M. Pezzuto, Pentacyclic triterpenes and naphtoquinones 

from Euclea divinorium, Phytochemistry, 47(1998)311. 

3. A. Wube, B. Streit, S. Gibbons, K. Asres, F. Bucar, In vitro 12(S)-HETE 

inhibitory activities of naphthoquinones isolated from the root bark of 

Euclea racemosa ssp. Schimperi, J. Ethnopharmacol., 102(2005)191. 

4. G. Bringmann, D. Feineis, Stress-related polyketide metabolism of 

Dioncophyllaceae and Ancistrocladaceae, J. Exp. Bot., 52(2001)2015. 

5. K.C.G. De Moura, F.S. Emerya, C. Neves-Pintoa, Pinto MCFR, Dantas 

AP, Salomão K, Castro S.L., Pinto A.V., Trypanocidal Activity of Isolated 

Naphthoquinones from Tabebuia and Some Heterocyclic Derivatives: 

A Review from an Interdisciplinary Study, J. Braz. Chem. Soc., 

12(2001)325. 

6. S. Kohlmünzer, „Farmakognozja. Podręcznik dla studentów farmacji.” 

Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2003. 

7. M.M. Cowan, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clin. Microbiol., 

12(1999)564. 

8. T. Tokunaga, N. Takada, M. Ueda, Mechanism of antifeedant activity of 

plumbagin, a compound concerning the chemical defense in carnivorous 

plant, Tetrahedron Lett., 45(2004)7115. 

9. T.P. Cushnie, A.J. Lamb, Antimicrobial activity of flavonoids, J. Antimicrob. 

Agents., 26(2005)343. 

10. E. Jr. Middleton, C. Kandaswami, T.C. Theoharides, The effects of plant 

flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, 

and cancer, Pharmacol. Rev., 52(2000)673. 

11. P.G. Pietta, Flavonoids as Antioxidants, J. Nat. Prod., 63(2000)1035. 

12. Z. Zhu, C. Li, N.Q. Li, Electrochemical studies of quercetin interacting 

with DNA, Microchem. J., 71(2002)57 

13. Z. Jerzmanowska, Substancje roślinne. Metody wyodrębniania, PWN, 

Warszawa 1970. 

14. N. Didry, L. Dubreuil, F. Trotin, M. Pinkas, Antimicrobial activity of aerial 

parts of Drosera peltata Smith on oral bacteria, J. Ethnopharmacol., 

60(1998)91. 

15. T. Sreelatha, A. Hymavathi, J. Madhusudhana Murthy, P.U. Rani, 

J. Madhusudana Rao, K. Suresh Babu, A new benzil derivative from 

Derris scandens: Structure-insecticidal activity study, Bioorg. Med. 

Chem. Lett., 20(2010)549. 

16. J.J. Marion-Meyer, F. Kooy, A. Joubert, Identification of plumbagin 

epoxide as a germination inhibitory compound through a rapid bioassay 

on TLC, S. Afr. J. Bot., 73(2007)654. 

17. A. Wube, B. Streit, S. Gibbson, K. Ares, F. Bucar, In vitro 12(S)-HETE 

inhibitory activities of naphthoquinones isolated from the root bark of 

Euclea racemosa ssp. Schimperi, J. Ethnopharm., 38(2005)325. 

18. J. Budzianowski, Naphtohydroquinone glucosides of Drosera rotundifolia 

and D. intermedia from in vitro cultures, Phytochem., 44(1996)1145. 

19. M. Sannomiya et al., Flavonoids and antiulcerogenic activity from 

Byrsonima crassa leaves extracts, J. Ethnopharmacol., 97(2005)1. 



269 

20. A. Figueirinha, A.Paranhos, J.J. Pe´rez-Alonso, C. Santos-Buelga, 

M.T. Batista, Cymbopogon citratus leaves: Characterisation of flavonoids 

by HPLC–PDA–ESI/MS/MS and an approach to their potential as 

a source of bioactive polyphenols, Food Chem., 110(2008)718. 

21. S. Marquina, J. Bonilla-Barbosa, L. Alvarez, Comparative phytochemical 

analysis of four Mexican Nymphaea species, Phytochem., 

66(2005)921. 

22. A.B. Dongmo, T. Nguelefack, M.A. Lacaille-Dubois, Antinociceptive 

and anti-inflammatory activities of Acacia pennata wild (Mimosaceae), 

J. Ethnopharmacol., 98(2005)201. 

23. Bozan B., Baser K.H.C., Kara S., Quantitative Determination of Naphthoquinones 

of Arnebia densiflora by TLC-Densitometry, Fitoterapia, 

70(1999)402. 

24. F. van der Kooy, J.J.M. Meyer, N. Lall, Antimycobacterial activity and 

possible mode of action of newly isolated neodiospyrin and other naphthoquinones 

from Euclea natalensis, S. Afr. J. Bot., 72(2006)349. 

25. N. Backhouse, L. Rosales, C. Apablaza, L. Goity, S. Erazo, R. Negrete, 

C. Theodoluz, J. Rodriguez, C. Delporte, Analgesic, anti-inflammatory 

and antioxidant properties of Buddleja globosa, Buddlejaceae, J. Ethnopharmacol., 

116(2008)263. 

26. A. Marston, K. Hostettmann, High-performance liquid chromatography 

of some naturally occurring naphthoquinones, J. Chromatogr., 

295(1984)526. 

27. A. Krolicka, A. Szpitter, E. Gilgenast, G. Romanik, M. Kaminski, E. Lojkowska, 

Stimulation of antibacterial naphthoquinones and flavonoids 

accumulation in in vitro carnivorous plants by addition of elicitors, Enzym. 

Microb. Tech., 42(2008)216. 

28. M.M. Gupta, R.K. Verma, G.C. Uniyal, S.P. Jain, Determination of 

plumbagin by normal-phase high-performance liquid chromatography, 

J. Chromatogr., 637(1993)209. 

29. R. Aguilar-Sánchez F. A´huatl-Garcıa, M.M. Davila-Jimenez, M.P. Elizalde-Gonzalez, 

M.R.G. Guevara-Villa, Chromatographic and electrochemical 

determination of quercetin and kaempferol in phytopharmaceuticals, 

J. Pharma. Biomed. Anal., 38(2005)239. 

30. Y. Wang, T. Huang; High-performance liquid chromatography for quantification 

of plumbagin, an anti-Helicobacter pylori compound of Plumbago 

zeylanica L., J. Chromatogr. A; 1094(2005)99. 

31. K. Chiu, Y. Cheng, J. Chen, C.J. Chang, P. Yang; Supercritical fluids 

extraction of Ginkgo ginkgolides and flavonoids, J. Supercritical Fluids; 

24(2002)77. 

32. S. Paramapojn, M. Ganzera, W. Gritsanapan, H. Stuppner; Analysis of 

naphthoquinone derivatives in the Asian medicinal plant Eleutherine 

americana by RP-HPLC and LC-MS, J. Pharm. Biomed. Anal.; 

47(2008)990. 

33. P. Babula, R. Mikelova, V. Adam, R. Kizek, L. Havel, Z. Sladky, Using 

of liquid chromatography coupled with diode array detector for determi- 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

270 


nation of naphthoquinones in plants and for investigation of influence of 

pH of cultivation medium on content of plumbagin in Dionaea muscipula, 

J. Chromatogr. B, 842(2006)28. 

34. S. Surveswaran, Y. Cai, H. Corke, M. Sun; Systematic evaluation of natural 

phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants, Food 

Chem., 102(2007)938. 

35. Y. Hu, Z. Jiang, K.S. Leung, Z. Zhao; Simultaneous determination of 

naphthoquinone derivatives in Boraginaceous herbs by highperformance 

liquid chromatography, Anal. Chim. Acta, 577(2006)26. 

36. M. Ye, Y. Li, Y. Yan, H. Liu, X. Ji; Determination of flavonoids in Semen 

Cuscutae by RP-HPLC, J. Pharm. Biomed. Anal., 28(2002)621. 

37. M.J. Bapela, N. Lall, J.J.M. Meyer, Seasonal variation of naphthoquinones 

in Euclea natalensis subspecies natalensis, J. S. Afr. Bot., 

74(2008)218. 

38. D.H. Paper, E. Karall, M. Kremser, L. Krenn; Comparison of the antiinflammatory 

effects of Drosera rotundifolia and Drosera madagascariensis 

in the HET-CAM assay, Phytother. Res., 19(2005)323. 

39. P. Komaraiah, R. Naga Amrutha, P.B. Kavi Kishor, S.V. Ramakrishna, 

Elicitor enhanced production of plumbagin in suspension cultures of 

Plumbago rosea L., Enzyme and Microbial. Technology, 31(2002)634. 

40. Ł. Marczak, A. Kawiak, E. Łojewska, M. Stobiecki, Secondary metabolites 

in in vitro cultured plants from the Drosera genus, Phytochem. 

Anal., 16(2005)143. 

41. M. Kamiński, B. Śledzińska, J. Klawiter, Studies on the optimization of 

parameters of preparative liquid chromatographic columns for production 

of cardiac glycosides, J. Chromatogr., 367(1986)45. 

42. V.R. Meyer, Practical high-performance liquid chromatography, John 

Wiley & Sons 1988. 





PRACE ORYGINALNE 

(ORIGINAL PAPERS) 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

272 





Grzegorz BOCZKAJ 1* , Mariusz JASZCZOŁT, Marian KAMIŃSKI 2 

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, 

ul. G. Narutowicza 11/12, 80-233 Gdańsk 

e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 1* , mknkj@chem.pg.gda.pl 2 

Badania emisji lotnych związków organicznych z asfaltów 

drogowych z wykorzystaniem techniki dynamicznej analizy 

fazy nadpowierzchniowej i chromatografii gazowej sprzężonej 

ze spektrometrią mas (DHS – GC – MS) 

A research on emission of volatile organic comopunds (VOC) 

from road bitumen by dynamic headspace gas chromatography 

mass spectrometry (DHS – GC – MS) 

Streszczenie: Asfalty drogowe pochodzenia naftowego są wytwarzane z pozostałości z destylacji 

próżniowej ropy naftowej. Ze względu na częściowy kraking termiczny mający miejsce na 

etapie destylacji próżniowej oraz jej utleniania (oksydacji) prowadzącego do powstania finalnego 

produktu, w gotowej masie bitumicznej występują lotne związki organiczne. Podczas dalszego 

wykorzystania asfaltu, na etapie jego ekspedycji oraz budowy dróg, z gorącej masy bitumicznej 

ma miejsce częściowe uwalnianie rozpuszczonych w niej LZO. 

Od wielu lat prowadzone są badania nad ocena oddziaływania budowy dróg asfaltowych 

na środowisko, w tym głównie na zdrowie ludzi pracujących podczas budowy. Głównie 

badany jest skład mgły asfaltowej, z ukierunkowaniem na wielopierścieniowe węglowodory 

aromatyczne (WWA). W mniejszym stopniu analizuje się skład powietrza na zawartość LZO. Ze 

względu na wysoką złowonność emitowanych składników, a także ich toksyczność, konieczne 

jest opracowanie standardowych procedur dedykowanych oznaczaniu wielkości emisji LZO 

oraz kluczowych grup związków tj. związki z grupy BTEX, pirydyna i jej pochodne. 

W pracy przedstawiono wyniki badań nad składem fazy lotnej asfaltów drogowych. Porównano 

zawartość zidentyfikowanych związków w fazie nadpowierzchniowej czterech próbek 

mas bitumicznych – pozostałości próżniowej oraz trzech asfaltów utlenionych o różnym stopniu 

przetworzenia. Wyniki badań wykazały znaczne różnice w składzie oraz zawartości LZO. 

Słowa kluczowe: asfalty, lotne związki organiczne LZO, analiza fazy nadpowierzchniowej, 

chromatografia gazowa, spektrometria mas 

Abstract: The petroleum based road bitumen is produced from the residuum of the crude oil 

vacuum distillation. A volatile organic compounds are present in the road bitumen regarding to 

the thermal cracking which takes place during the vacuum distillation and especially in the oxidation 

reactors. While later use of the bitumen i.e. the expedition stage as well as road paving 

stage, a partial emission of VOC from hot bituminous material takes place. 

For many years a results of the researches on the environmental impact of the bitumen 

road paving processes are published. Most of the studies relates to the impact of such processes 

on human health, especially on the exposure of the workers, which are employed during 

road paving. The most part of the researches relates to the composition of the bitumen fumes, 

in which the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are the target group of compounds. The 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

274 

G. Boczkaj, M. Jaszczołt, M. Kamiński 

minor issue is the evaluation of VOC emitted during the use of hot bitumen. Regarding to the 

high malodourness and toxicity of some groups of VOC i.e. BTEX, pyridine and its derivatives, 

the development of standardized procedures for VOC determination is an important challenge. 

The paper presents a results of the research on composition of volatile phase of road bitumen. 

The content of identified compounds in the headspace phase was compared for four 

samples of bitumen – vacuum residuum and three oxidized road bitumen of different rate of oxidation. 

The results of the research revealed a difference of composition and content of VOC. 

Key words: Bitumen, asphalt, volatile organic compounds VOC, headspace analysis, gas 

chromatography, mass spectrometry 

1. Wstęp 


Badania emisji mgły asfaltowej są tematem wielu prac naukowych. 

Analiza składu mgły wykazała, że składa się ona z mikrokropel asfaltu, pary 

wodnej oraz lotnych związków organicznych [1]. Występowanie wielu grup 

związków chemicznych, o szerokim zakresie masy molekularnej, powoduje 

że analiza składu oparów asfaltu, w celu uzyskania kompleksowej informacji, 

musi być wykonywana z zastosowaniem różnych technik analitycznych. Na 

poniższym rysunku 1 przedstawiono podział metod monitorowania i oceny 

emisji oparów asfaltu. 

Rys. 1. Metody monitorowania i oceny emisji oparów asfaltu 

Fig. 1. A comparison of methods for monitoring and evaluation of the emission of bitumen fumes 

Ze względu na trudności wykonywania oznaczeń w warunkach rzeczywistych, 

prowadzone są badania nad opracowaniem metod symulacyjnych, 

pozwalających na wykorzystanie zależności korelacyjnych wyników 


Badania emisji lotnych związków organicznych a asfaltów drogowych… 

275 

uzyskiwanych dla próbek asfaltu w warunkach laboratoryjnych, dla oszacowania 

emisji w warunkach rzeczywistych. 

Niezależnie od warunków analiz – rzeczywistych [2] lub symulowanych 

[3-4], procedury analityczne wykazują duże podobieństwo. Różnica polega 

głównie na typie emitera/medium z którego pobierana jest próbka powietrza 

z oparami. Ogólny schemat postępowania przestawiono na 

poniższym rysunku 2. W celu identyfikacji i oznaczenia zawartości LZO 

w oparach asfaltu z reguły stosuje się techniki wzbogacania próbki, głównie 

z zastosowaniem rurek sorpcyjnych. Rurki sorpcyjne wypełnione są jednym 

lub kilkoma typami sorbentów (głównie układy jedno-, dwu- i trój-złożowe). 

Pozwala to na selektywne pułapkowanie analitów w szerokim zakresie lotności 

i polarności, przy jednoczesnym zapewnieniu ilościowego uwolnienia 

analitów na etapie desorpcji. Obecnie powszechnie stosuje się desorpcję 

termiczną z bezpośrednim dozowaniem desorbatu do kolumny, lub z zastosowaniem 

dodatkowego ogniskowania desorbatu na mikropułapkach sorpcyjnych 

lub kriogenicznych. Na etapie pobierania próbki oparów, należy stosować 

filtry zatrzymujące niskolotne i nielotne składniki oparów. W ich skład 

wchodzą głównie mikrokrople asfaltu. Jako filtry stosuje się warstwę waty silanizowanej 

lub filtr teflonowy. Filtry po etapie pobierania ekstrahuje się rozpuszczalnikiem, 

a ekstrakt poddaje analizie w celu oznaczenia zawartości 

wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) oraz w określenia 

składu grupowego. W przypadku oznaczania związków z grupy WWA 

w próbkach o skomplikowanej matrycy, tj. ciężkie produkty naftowe, procedura 

przygotowania próbki składa się z co najmniej dwóch etapów [5, 8]. 

Występowanie w produktach uzyskiwanych z pozostałości z destylacji 

próżniowej ropy naftowej lotnych związków organicznych, jest konsekwencją 

krakingu termicznego. Rozkład związków obecnych w pozostałości próżniowej 

na skutek ich przegrzewania na elementach grzejnych instalacji destylacji 

próżniowej oraz reaktorów oksydacji asfaltu, powoduje powstawanie lotnych 

związków o charakterze nienasyconym – olefin oraz związków 

aromatycznych, tj. związki z grupy BTEX, aromatyczne związki azotu (pirydyna), 

a także lotne związki siarki (siarkowodór, merkaptany, tiofen). W wyniku 

ich utleniania gorącym powietrzem podczas oksydacji asfaltów, powstają 

inne lotne związki m.in. ketony, tioketony, aldehydy, kwasy karboksylowe. 

Część z powstałych LZO jest usuwana z reaktora oksydacji wraz z gorącym 

powietrzem, reszta LZO pozostaje rozpuszczona w asfalcie i może być 

uwalniana do atmosfery podczas ekspedycji asfaltu cysternami samochodowymi 

lub kolejowymi, ale przede wszystkim podczas wykorzystywania gorącej 

masy bitumicznej do budowy nawierzchni drogowej [6, 7, 9]. Stąd konieczna 

jest procedura kontroli ilości generowanych LZO w asfalcie oraz 

identyfikacji poszczególnych związków chemicznych. Do analizy próbek asfaltów 

w zakresie lotnych związków organicznych w warunkach laboratoryjnych, 

można zastosować technikę analizy fazy nadpowierzchniowej (ang. 

headspace analysis). 

W pracy przedstawiono wyniki badań, w zakresie identyfikacji i porównania 

zawartości lotnych związków organicznych, dla czterech próbek 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

276 


materiałów bitumicznych – pozostałości próżniowej oraz trzech asfaltów 

utlenionych. 

Rys. 2. Schemat procedur analitycznych stosowanych do monitoringu i oceny emisji oparów 

asfaltu 

Fig. 2. A scheme of the analytical procedures used for monitoring and evaluation of the emission 

of the bitumen fumes 



277 

2. Część ekperymentalna 

(Experimental) 

Materiały 

(Materials) 

Próbki pozostałości próżniowej oraz asfaltów 35/50, 50/70 i 160/220 

otrzymano z Grupy LOTOS S.A.; 

Hel (Linde Gas, Polska) czystości 5,0 N; 

Aparatura 

(Apparatus) 

Chromatograf gazowy HP 5890 (Hewlett-Packard, USA) sprzężony ze 

spektrometrem mas (HP 5972A), z kolumną kapilarną do chromatografii 

gazowej 60,0 m x 0,25 mm x 0,25 µm DB5ms (Agilent, USA), oprogramowanie 

Chemstation (Agilent, USA); 

System do dynamicznej analizy fazy nadpowierzchniowej Hewlett Packard 

(USA) Purge & Trap Concentrator, model G1901-60502, pułapka 

wypełniona 150 mg sorbentu Tenax TA; 

Metody postępowania 

(Methods) 

Dynamiczna analiza fazy nadpowierzchniowej i chromatografia gazowa 

sprzężona ze spektrometrią mas (DHS-GC-MS) 

(Dynamic headspace analysis and gas chromatography coupled with mass 

spectrometry (DHS-GC-MS) 

Próbkę materiału bitumicznego (ok. 100 mg) umieszczono w 15 ml 

fiolce do analizy fazy nadpowierzchniowej, którą następnie zamknięto kapslem 

z membraną. Przez membranę wprowadzono dwie kapilary z topionej 

krzemionki – jedną doprowadzającą gaz (hel) omywający lustro materiału bitumicznego 

i drugą, którą odbierano gaz z uwalnianymi analitami. Próbkę 

umieszczono w bloku grzejnym i termostatowano przez 20 minut w temperaturze 

200°C. Następnie włączono przepływ gazu, którym wymywano uwalniane 

z masy bitumicznej anality do pułapki sorpcyjnej utrzymywanej w temperaturze 

30°C. Wymywanie prowadzono przez 11 minut. Pułapkę 

podgrzewano do 260°C, desorpcję analitów z pułapki prowadzono w temperaturze 

270°C przez 4 minuty. Desorbat kierowano przy pomocy ogrzewanego 

połączenia (200°C) z topionej krzemionki (ang. Fused silica) bezpośrednio 

do chromatografu gazowego. Warunki analizy chromatograficznej 

oraz parametry spektrometru zestawiono poniżej. 

Gaz nośny: Hel, 1,1 ml/min, 

Program temperatury 40°C (5 min.) - narost 5°C/min - 250°C (15 min.), 

Warunki detekcji: GC-MS (tryb SCAN), Temp. linii łączącej GC-MS 

310°C, Temperatura źródła jonów (EI, 70eV) 200°C, Tryb SCAN od 

34 do 250 m/z. 

Dla każdej próbki wykonano trzy analizy. Identyfikacji substancji dokonano 

na podstawie widma masowego z wykorzystaniem bibliotek widm 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

278 


NIST i Wiley. Pole powierzchni pików zidentyfikowanych substancji obliczono 

dla wybranych jonów – charakterystycznych dla danej substancji. 

3. Wyniki i dyskusja 

(Results and discussion) 

Utlenianie asfaltów drogowych ma na celu zmianę jago właściwości 

użytkowych, jako lepiszcza stosowanego w nawierzchniach produkowanych 

z mieszanki mineralno asfaltowej. Dzięki utlenianiu pierwotnego surowca jakim 

jest pozostałość próżniowa uzyskuje się niższą wartość penetracji oraz 

wyższą wartość temperatury mięknienia (PIK). Taki asfalt jest odporniejszy 

na eksploatację oraz warunki atmosferyczne – polepszają się jego właściwości 

w porównaniu z pierwotnym surowcem do pracy zarówno w niższych, 

jak również wyższych temperaturach. 

Na poniższym rysunku 1 przedstawiono nałożenie chromatogramów 

GC-MS dla całkowitego prądu jonowego (TIC) zarejestrowanych dla próbek pozostałości 

próżniowej oraz najsilniej utlenionego asfaltu 35/50. Z zarejestrowanych 

chromatogramów wynika, że utleniony asfalt posiada znacznie większą 

zawartość lotnych związków organicznych. Zastosowane warunki badań pozwoliły 

na analizę lotnej frakcji w szerokim zakresie lotności związków – najcięższe 

zidentyfikowane składniki fazy lotnej to węglowodory n-C 12 i n-C 13 . 

Porównanie jakościowe wykazało znaczne różnice w składzie fazy 

lotnej pozostałości próżniowej oraz słabo utlenionego asfaltu 160/220 w porównaniu 

z asfaltami silnie utlenionymi 50/70 i 35/50. Pozostałość próżniowa 

posiada niską zawartość lotnych związków organicznych, wśród których zidentyfikowano 

głównie węglowodory nasycone – alkany i cykloalkany oraz 

alkeny. 

Rys. 3. Nałożenie chromatogramów DHS-GC-MS próbek (1) pozostałości próżniowej i (2) asfaltu 

drogowego 35/50 

Fig. 3. An overlay of DHS-GC-MS chromatograms of (1) vacuum residuum and (2) road bitumen 

35/50 samples 



279 

Tabela 1. Zestawienie zidentyfikowanych LZO oraz porównanie zawartości 

w czterech próbkach materiałów bitumicznych 

Table 1. Identified VOC and comparison of its content in four samples of 

bituminous materials 

Związek 

(Compound) 

50/70 35/50 160/220 

Pozostałość 

próżniowa 

(vacuum 

residuum) 

Pole powierzchni 

[umowne jednostki powierzchni u.j.p.] 

(Area) 

[conventional area units] 

aceton 42912 45171 14450 0 

izobutyraldehyd 867 1142 0 0 

2-butenal 602 834 0 0 

butanal 3099 4057 967 0 

2-butanon 1822 2349 451 0 

kwas octowy 9005 7939 0 0 

Heksan 2023 1923 740 320 

2-pentenal 2422 2648 678 0 

3-metylo-butanal 329 480 0 0 

3-etylo-2,5-dihydro-furan 720 1238 0 0 

Benzen 2176 2469 0 0 

2-metylo-pentan 333 975 192 0 

pentanal 1852 196 429 0 

heptan 1522 1534 584 655 

3-metyleno-4-metylo-1-pentanol 367 486 0 0 

2,4-pentadienal 2262 2621 0 0 

toluen 3305 3887 963 458 

1,3-pentadien-5-al 786 1206 160 0 

3-etylo-heksan 2320 2467 0 1304 

1,2-dimetylo-cykloheksan 654 761 86 0 

1,1,2-trimetylo-cykloheksan 134 236 0 1177 

heptanal 2842 3581 663 0 

nonan 1730 1854 715 234 

2,4-dimetylo-heptan 1730 1854 715 234 

6-metylo-2-heptanon 1957 2422 604 0 

oktanal 2102 2780 1159 0 

dekan 1953 2198 640 212 

kumen 3122 3608 2142 364 

4-metylo-benzaldehyd 224 3738 1027 324 

nonanal 1739 2436 650 406 

undekan 2366 2506 981 359 

4-etylo-1,2-dimetylo-benzen 18660 18184 15254 5301 

cyklododekan 0 398 0 0 

dekanal 234 1578 1022 386 

dodekan 2762 3460 1274 401 

tridekan 1233 2339 1765 263 

4-penten-2-ol 8769 10110 2746 0 

W asfaltach utlenionych zidentyfikowano szereg związków, których 

występowanie w asfalcie wynika z częściowego krakingu termicznego pozo- 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

280 


stałości próżniowej oraz utleniania powstałych i obecnych w pozostałości 

próżniowej olefin. W tabeli 1 przedstawiono zestawienie zidentyfikowanych 

lotnych związków organicznych w czterech próbkach materiałów bitumicznych 

oraz porównanie pól powierzchni pików. 

Jak wynika z danych przedstawionych w tabeli 1, największą grupę 

związków powstałych w wyniku krakingu termicznego stanowią związki karbonylowe 

– aldehydy i ketony. Ich występowanie w oparach asfaltu przyczynia 

się do większej odorowości, a zatem uciążliwości miejsc emisji oparów 

dla otoczenia. 

W fazie lotnej zidentyfikowano także trzy ważne, punktu widzenia 

oceny toksyczności oparów asfaltu, związki aromatyczne – benzen, toluen 

oraz 4-etylo-1,2-dimetylo-benzen. Benzen zidentyfikowano jedynie w asfaltach 

silnie utlenionych tj. 35/50 i 50/70, stąd ten związek oprócz konieczności 

jego monitorowania z powodu potwierdzonej kancerogenności, może być 

także dobrym wskaźnikiem stopnia krakingu termicznego zachodzącego na 

etapie oksydacji asfaltów. W identycznych warunkach, wykonano także analizę 

fazy nadpowierzchniowej pustej zakapslowanej fiolki, co pozwoliło na 

sprawdzenie sygnału tła. Na chromatogramie fazy gazowej z pustej fiolki nie 

stwierdzono żadnych lotnych związków. Graficzne podsumowanie powyższej 

tabeli przedstawiono na rysunku 4. 

100% 

160/220 50/70 35/50 PP 

80% 

60% 

40% 

20% 

0% 

Rys. 4. Graficzne porównanie zawartości zidentyfikowanych związków chemicznych w próbkach 

materiałów bitumicznych. 160/220, 50/70, 25/50 – utleniane asfalty drogowe, 

PP – pozostałość próżniowa 

Fig. 4. A graphical comparison of the content of identified compounds in bituminous materials. 

160/220, 50/70, 35/50 – oxidized road bitumen, PP – vacuum residuum 



281 


W pracy przedstawiono wyniki badań nad składem lotnej frakcji pozostałości 

próżniowej oraz zmian wywołanych jej utlenianiem w celu uzyskania 

asfaltów drogowych. Badania wykazały, że zarówno podczas destylacji 

próżniowej (powstają głównie olefiny i węglowodory aromatyczne, a także 

siarkowodór), jak i podczas procesu oksydacji (powstają głównie lotne 

związki tleno-organiczne takie jak alkohole, aldehydy, ketony i kwasy organiczne 

oraz związki siarko- i azoto-organiczne) ma miejsce kraking termiczny, 

w wyniku czego powstaje szeroka gama lotnych związków organicznych. 

Obecność benzenu w fazie lotnej jedynie silnie utlenionych asfaltów 35/50 

i 50/70 predysponuje ten związek jako jeden ze wskaźników stopnia krakingu 

termicznego. 

Zastosowanie techniki dynamicznej analizy fazy nadpowierzchniowej 

w opcji przedstawionej w pracy, tj. ciągłe wymywanie lotnych składników 

uwalnianych z termostatowanego gorącego materiału bitumicznego pozwala 

na uzyskanie szerokiej informacji analitycznej, bez potrzeby wykonywania 

skomplikowanych, a często także „odczynniko – chłonnych” operacji przygotowania 

próbki do analizy. 

Przedstawiona w pracy procedura jest możliwa do pełnej automatyzacji, 

co jest korzystne z punktu widzenia analityki procesowej realizowanej 

w laboratoriach przemysłowych. 

Summary 

The paper presents a results of the research on the composition of volatile 

fraction of the vacuum residuum and changes made by the oxidation of 

the residuum, which is used for production of the road bitumen. The research 

revealed, that during the vacuum distillation (a olefins and aromatic hydrocarbons 

and hydrogen sulfide are formed) as well as during the oxidation 

process (mostly the oxygen-containing volatile organic compounds i.e. aldehydes, 

ketones and carboxylic acids, sulfur- and nitrogen-containing VOCs 

are formed) the thermal cracking takes place. That results in formation of wide 

variety of volatile organic compounds. The presence of benzene only in 

the volatile phase of strong oxidized bitumen i.e. 35/50 and 50/70 predispose 

this compound to be an good indicator of the thermal cracking rate. 

The use of dynamic headspace technique in the type described in the 

paper i.e. continuous purging of volatiles emitted form thermostated hot bituminous 

bulk allows to achieve wide analytical information, without the need 

of using of the sophisticated, and often also reagent-consuming, procedures 

of sample preparation. 

Presented procedure can be fully automated, what is preferable for 

process analytics made in industrial laboratories. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

282 



(Acknowledgements) 


Wyższego w ramach grantu promotorskiego Nr N N209 761740. 



pn. „InnoDoktorant - stypendia dla doktorantów”, II edycja. 

Literatura 

(Literature) 

1. G. Boczkaj, M. Kamiński, Problem emisji oparów podczas ekspedycji materiałów 

bitumicznych oraz budowy dróg asfaltowych, A bitumen fumes 

emmision during expedition of the bitumen materials and road paving, 

Jakość powietrza a jakość życia 1(2011)23. 

2. I. Burstyn, H. Kromhout, C. Johansen, S. Langard, T. Kauppinen, J. Shaham, 

G. Ferro, P. Boffetta, Bladder cancer incidence and exposure to 

polycyclic aromatic hydrocarbons among asphalt pavers, Ann. Occup. 

Hyg., 1(2000)43. 

3. J. Wang, D.M. Lewis, V. Castranova, D.G. Frazer, T. Goldsmith, S. Tomblyn, 

J. Simpson, S. Stone, A. Afshari, P.D. Siegel, Characterization of asphalt 

fume composition under simulated road paving conditions by GC/MS and 

microflow LC/Quadrupole time of flight MS, Anal. Chem., 73(2001)3691. 

4. P.R. Heikkila, V. Vaananen, M. Hameila, K. Linnainmaa, Mutagenicity of 

bitumen and asphalt fumes, Toxicology in Vitro, 17(2003)403. 

5. E. Gilgenast, G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, Sample preparation 

procedure for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in 

petroleum vacuum residue and bitumen, Anal. Bioanal. Chem. 401 

(2011)1059. 

6. G. Boczkaj, M. Kamiński, Zastosowanie chromatografii gazowej z detektorami 

selektywnymi w analityce lotnych związków siarki i azotu, Camera 

Separatoria 3(2011)51. 

7. G. Boczkaj, M. Kamiński, Badania korelacji retencji z właściwościami fizykochemicznymi 

wybranych grup organicznych związków siarki w podziałowej 

chromatografii gazowej, Postępy chromatografii i innych technik 

i technologii rozdzielania 2(2010)29. 

8. G.Boczkaj, E. Gilgenast, P. Nowicka, A. Przyjazny, M Kamiński., Procedura 

przygotowania próbki do oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów 

aromatycznych w produktach technicznych. I. Produkty z destylacji 

próżniowej ropy naftowej, Postępy chromatografii i innych technik 

i technologii rozdzielania 2(2010)38. 

9. G. Boczkaj, M. Gołębiowski, M. Kamiński, P. Stepnowski, Identyfikacja lotnych 

składników ścieków z instalacji oksydacji asfaltów z wykorzystaniem 

chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS), Postępy 

chromatografii i innych technik i technologii rozdzielania 2(2010) 130. 




Mariusz JASZCZOŁT 1 , Grzegorz BOCZKAJ 1 , 

Aleksander LEWANDOWSKI 1 , Anita SKRZYPCZAK 1 , 

Aleksandra KRÓLICKA 2 , Marian KAMIŃSKI 1* 

1 

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Instytut Chemii, 

Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, ul. Gabriela Narutowicza 11/12, 

80-233 Gdańsk 

e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl*, mariusz.jaszczołt@gmail.com 

2 

Uniwersytet Gdański i Gdański Uniwersytet Medyczny, 

Miedzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-GUM, Zakład Ochrony i Biotechnologii Roślin, 

ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk 

Opracowanie optymalnych warunków rozdzielania 

i identyfikacji metabolitów roślin z rodzaju droseraceae, 

z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej 

chromatografii cieczowej 

A research on the composition of eluent for separation of plant 

metabolites by column reversed phase liquid chromatography 

Streszczenie: Od kilku lat na świecie trwają badania składników roślin owadożernych wykazujących 

atrakcyjne właściwości biologicznie czynne, tj. działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybowe, 

antyoksydacyjne, a być może, także, przeciwnowotworowe. Pozyskiwanie substancji biologicznie 

aktywnych z materiału naturalnego, na drodze hodowli in vitro a następnie ekstrakcji 

i rozdzielania jest bardziej korzystne pod względem ekonomicznym, niż ich wytwarzanie metodami 

syntezy chemicznej, która w wielu przypadkach składa się z wielu etapów, a wypadkowa 

efektywność jest często niezadowalająca. 

W pracy zaprezentowano wyniki badań dotyczących opracowania najkorzystniejszych 

warunków rozdzielania oraz identyfikacji składników ekstraktów roślin owadożernych z czterech 

roślin rodziny Droseraceae, tzn., Drosera binata, Drosera capensis, Drosera aliciae oraz Dionea 

muscipula. Badania polegały na zaprojektowaniu optymalnego układu chromatograficznego 

oraz optymalnych warunków rozdzielania pozwalających w sposób możliwie jak najbardziej selektywny 

rozdzielić składniki z grupy naftochinonów oraz flawonoidów. Wykorzystano techniki 

kolumnowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej, w odwróconych układach faz (RP- 

HPLC), Porównano wyniki badań uzyskane z zastosowaniem elucji gradientowej. Za każdym 

razem stosowano przepływ zwrotny eluentu w kolumnie. Stosowanie elucji gradientowej jest celowe 

w badaniach składu metabolicznego roślin, identyfikacji oraz oznaczania zawartości 

składników w ekstraktach, a także w kontroli jakości i standaryzacji materiału zielarskiego. 

Słowa kluczowe: plumbagina, ramentaceon, chloroplumbagina, droseron, mirycetyna, kwercetyna, 

HPLC 

Abstract: For several years have been carried out researches of chemical compounds with attractive 

biological activity (antimicrobial, antifungal, antioxidant and anticancer activity) founded 

in insectivorous plants. Production of plant metabolites from in vitro cultures by procedures 

consisting of the extraction methods and separation techniques is economically more advantageous, 

than “classic” methods of chemical synthesis, which are consisted of many steps, which 

final efficiency is unsatisfactory. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

284 

M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński 

A developed most favorable conditions for separation and identification of the components 

of extracts of four plants from Droseraceae: Drosera aliciae, Dionea muscipula, Drosera 

binata and Drosera capensis are presented in the paper. The optimal conditions of the chromatographic 

system provide a selective separation of naphthoquinones and flavonoids from the 

samples of plant extracts. Column chromatography techniques in reversed phase conditions 

were used in the researches. The paper presents a comparison of separations made in different 

chromatographic systems with gradient elution. After every separation the direction of the eluent 

flow in the column was inversed. 

Application of gradient elution is significant in researches for identification of the compounds 

and quantitative determination of plant metabolites, as well as for the quality control and 

standardization of natural herbal materials. 

Key words: plumbagin, ramentaceone, chloroplumbagin, droserone, myricetin, quercetin, 

HPLC 

1. Wstęp 


W roślinach owadożernych zidentyfikowano szeroką gamę związków 

chemicznych, w tym między innymi takie związki chemiczne jak: naftochinony, 

flawonoidy, glukozydy i kwasy fenolowe. Niektóre z nich posiadają aktywność 

farmakologiczną i są stosowane w produkcji preparatów leczniczych. 

Przykładowo rosiczka, jest od dawna wymieniana w farmakopei. 

Poza tym stosowania jest w fitoterapii, homeopatii i lecznictwie ludowym [1]. 

Wśród związków zawartych w roślinach z rodziny Droseraceae ze 

względu na właściwości lecznicze na uwagę zasługują zawarte w nich naftochinony 

tj.: plumbagina, chloroplumbagina, hydroksyplumbagina i ramentaceon 

oraz flawonoidy: kwercetyna i mirycetyna [2, 3]. 

Plumbagina wykazuje działanie: przeciwbakteryjne, przeciwmalaryczne, 

przeciwkancerogenne, antyoksydatywne oraz przeciwmiażdżycowe. Jej właściwości 

przeciwnowotworowe zostały potwierdzone wynikami eksperymentów 

in vitro na komórkach zarodkowych myszy [4]. Działanie cytotoksyczne 

plumbaginy prowadzi do apoptozy komórek rakowych. Plumbagina działa 

silnie bakteriobójczo m.in. na gronkowce, paciorkowce, prątki oraz dwoinki, 

które wywołują choroby układu oddechowego. Do efektów ubocznych stosowania 

plumbaginy należą biegunki, wysypki, zwiększanie liczby białych 

krwinek oraz wzrost stężenia fosforanów w surowicy krwi. Plumbagina jest 

ponadto szkodliwa dla wątroby [4, 5, 6]. 

Chloroplumbagina występuje m.in. w roślinie Plumbago zeylanica 

z rodziny Plumbaginaceae. Roślina ta posiada właściwości wykrztuśne, 

przeciwzapalne, przeciwreumatyczne oraz moczopędne. Jest stosowana 

w leczeniu niestrawności, biegunki oraz chorób skóry. Ekstrakty alkoholowe 

oraz wodne wykazują właściwości przeciwbakteryjne. Działanie czystej chloroplumbaginy 

nie zostało dotychczas zbadane [7]. 

Ramentaceon występuje w roślinach z gatunku Drosera, jego zawartość 

waha się w zależności od rodzaj gatunku oraz warunków hodowli. Występuje 

on również w roślinach z gatunku Ebenaceae [8]. 7-metylojuglon 

wykazuje właściwości przeciwbakteryjne w stosunku do bakterii z gatunku 


Opracowanie optymalnych warunków rozdzielania i identyfikacji metabolitów roślin… 

285 

Neisseria gonorrhoeae oraz działanie przeciwgrzybowe w stosunku do grzybów 

z gatunku Cladosporium cucumerinum, działanie cytotoksyczne w stosunku 

do komórek nowotworowych raka okrężnicy oraz działanie toksyczne 

w stosunku do niektórych owadów. Ponadto posiada działanie przeciwgruźlicze, 

a także jest inhibitorem kwasu 12-hydroksyeicosatetraenowego, który 

jest kluczowym przekaźnikiem sygnału w tworzeniu przerzutów i procesie 

miażdżycy [7, 8]. 

Droseron występuje w większości roślin owadożernych. Związek ten 

posiada właściwości spazmolityczne (rozkurczające mięśnie gładkie), przeciwkaszlowe 

oraz właściwości antybiotyczne [7]. 

2. Część eksperymentalna 


Materiały i odczynniki 

(Materials and reagents) 

Materiał roślinny gatunków: Drosera aliciae, Drosera capensis, Drosera 

binata oraz Dioneae muscipula hodowany w warunkach in vitro w Zakładzie 

Ochrony i Biotechnologii Roślin Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii 

Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. 

Certyfikowane wzorce: plumbagina, mirycetyna, kwercetyna użyte 

w badaniach zostały zakupione w firmie Sigma Aldrich (USA). Substancje 

niedostępne na rynku, tj chloroplumbagina i droseron zostały otrzymane na 

drodze syntezy chemicznej na Wydziale Chemicznym Politechniki Gdańskiej. 

Ramentaceon, którego wzorzec również nie jest dostępny w sprzedaży 

został wyizolowany z wykorzystaniem preparatywnej chromatografii cieczowej 

(P-LC). 

W badaniach wykorzystywano następujące rozpuszczalniki: metanol 

(MeOH), acetonitryl (ACN), izopropanol (izo-PrOH), tetrahydrofuran 

(THF),1,4-dioksan (diox) o czystości do HPLC (Merck, Niemcy). Kwas siarkowy 

(cz.d.a.) został zakupiony w firmie P.P.H Standard (Polska). Woda dejonizowana 

stosowana w badaniach pochodziła z urządzenia Milli Q (Millipore, 

USA). 

Aparatura 

(Equipment) 

Gradientowy chromatograf cieczowy wyposażony w czterokanałowy 

system elucji gradientowej z zaworami proporcjonującymi (tzw. gradient niskociśnieniowy) 

i pompę L-6200 (Merck – Hitachi, Niemcy, Japonia), zawór 

dozujący Rh-7161 (Rheodyne, USA) z pętlą dozującą 20 µl, detektor 

UV-DAD 7450A, dodatkowo w sześciodrogowy dwupołożeniowy zawór 

Rh-7010 (Rheodyne, USA), do zmiany kierunku przepływu fazy ruchomej 

w kolumnie (backflash), oprogramowanie D 7000 HPLC System Manager 

(Merck - Hitachi, Niemcy, Japonia) został wykorzystany w badaniach. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

286 


Badania z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej 

zostały przeprowadzone z wykorzystaniem kolumny LiChrospher 100 RP-18e 

o średnicy ziarna 5 µm oraz wymiarach 125 mm x 4 mm (Merck, Niemcy). 

Procedura analityczna 

(Analytical procedure) 

Celem badań z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej chromatografii 

cieczowej było opracowanie procedury umożliwiającej najbardziej selektywne 

rozdzielanie składników zawartych w ekstraktach roślin owadożernych. 

W badaniach podjęto, także, próbę identyfikacji rozdzielonych składników zawartych 

w ekstraktach z roślin: Dionaea muscipula i Drosera aliciae. 

Procedury rozdzielania zostały poprzedzone przygotowaniem mieszaniny 

substancji wzorcowych i ekstraktów z roślin owadożernych. Ekstrakty 

metanolowe roślin z gatunków D. muscipula, D. aliciae, D. capensis 

i D. binata pochodziły z hodowli in vitro Zakładu Ochrony i Biotechnologii 

Roślin, Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii UG i GUMed. W badaniach 

wykorzystane zostały rośliny rozmnażane in vitro, ponieważ znajdują 

się one pod całkowitą ochroną. 

W celu dokładnego wyznaczenia stężenia składników zawartych w ekstraktach 

metanolowych roślin owadożernych, 1 ml ekstraktu został przeniesiony 

do zważonej fiolki, następnie odparowany do sucha w strumieniu azotu 

i powtórnie zważony. Sucha masa została rozpuszczona w 1 ml metanolu. 

W badaniach rozdzielano metanolowe ekstrakty roślin owadożernych 

z gatunku D. muscipula i D. aliciae, które posłużyły, jako materiały reprezentatywne. 

Autorzy badan założyli, że optymalne warunki rozdzielania dla gatunków 

wzorcowych będą optymalne również ekstraktów z innych gatunków 

roślin owadożernych. Dodatkowo zastosowanie ekstraktów metanolowych 

z jedynie dwóch gatunków roślin owadożernych był pozwolił zmniejszyć stopień 

zużycia eluentów oraz umożliwił znaczną oszczędność czasu. Eluent 

stanowiła mieszanina wody z dodatkiem kwasu siarkowego (VI) (pH 3) oraz 

składnika organicznego: metanol, izopropanol, tetrahydrofuran i acetonitryl. 

Etap badań miał na celu potwierdzenie wniosków wyciągniętych na podstawie 

wyników badań dotyczących opracowania najkorzystniejszego składu 

eluentu do rozdzielania składników ekstraktów roślin owadożernych z zastosowaniem 

chromatografii planarnej, z zastosowaniem wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej w warunkach elucji gradientowej. 

Na podstawie uzyskanych wyników, w dalszych badaniach nad rozdzielaniem 

składników czterech ekstraktów metanolowych zastosowano 

trójskładnikowy eluent, w którego skład wchodziła woda z dodatkiem H 2 SO 4 

(pH 3) oraz dwa składniki organiczne tj: metanol i izopropanol. W tabeli 1 

przedstawiono skład eluentu trójskładnikowego oraz przebieg programu elucji, 

w którym poddano rozdzieleniu cztery metanolowe ekstrakty roślin: 

D. muscipula, D. aliciae, D. capensis i D. binata. 

Objętościowe natężenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 1 ml/min, 

objętość dozowanej próbki wynosiła 20 µl. W badaniach w sposób automatyczny 

poprzez program D - 7000 HSM co 0,4 s rejestrowano widmo w za- 



287 

kresie 205 do 800 nm (z wyjątkiem eluentu, którego składnikiem był THF tutaj 

widmo rejestrowano w zakresie 220-800 nm, gdyż THF silnie absorbuje 

promieniowanie UV do 220 nm). W wyniku rejestracji widma otrzymano 

3-wymiarowy chromatogram, który odwzorowany był na ekranie monitora 

w formie poziomicowej. W badaniach stosowano zawór do przepływu zwrotnego 

eluentu, w celu wyeluowania z kolumny substancji silnie związanych 

z powierzchnią sorpcyjną. Zawór był przełączany w 23 minucie każdego 

analizy, aby wyeluowane zostały substancje niskopolarne, tj. chlorofile, karotenoidy 

oraz woski. 

Przedstawiona procedura analityczna zgodna z przedstawioną w pracy 

dyplomowej Aleksandra Lewandowskiego [8]. 

Tabela 1. Program elucji oraz skład eluentów dwuskładnikowych 

Table 1. A Comparison of the elution programs and the composition 

of 2-component eluents 

Nr układu 

chromatograficznego 

(Number 

of chromatographic 

system) 

Składniki eluentu 

(Eluent component) 

A 

B 

Kolumna 

chromatograficzna 

(Chromatographic 

column) 

Program elucji 

(Elution program) 

t [min] A B 

1 

H 2 O + 

H 2 SO 4 

(pH=3) 

izo- 

PrOH 

(2- 


RP-18e, 5 mm, 

125 x 4 mm 

0 95 5 

20 5 95 

30 5 95 

t [min] A B 

2 

H 2 O + 

H 2 SO 4 

(pH=3) 

MeOH 


RP-18e, 5 mm, 

125 x 4 mm 

0 95 5 

20 5 95 

30 5 95 

t [min] A B 

3 

H 2 O + 

H 2 SO 4 

(pH=3) 

THF 


RP-18e, 5 mm, 

125 x 4 mm 

0 95 5 

20 5 95 

30 5 95 

t [min] A B 

4 

H 2 O + 

H 2 SO 4 

(pH=3) 

ACNl 


RP-18e, 5 mm, 

125 x 4 mm 

0 95 5 

20 5 95 

30 5 95 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

288 


Tabela 2. Program elucji oraz skład eluentu trójskładnikowego 

Table 2. A Comparison of the elution programs and the composition of 

3-component eluents 

Nr układu 

chromatograficznego 

(Number 

of chromatographic 

system) 

Składniki eluentu 

(Eluent komponent) 

A B C 

Kolumna 

chromatograficzna 

(Chromatogr. 

kolumn) 

Program elucji 

(Elution program) 

t[min] A B C 

5 

H 2 O + 

H 2 SO 4 

pH=3 

MeOH) 

izo- 

PrOHl 


RP-18e, 5 mm, 

125 x 4 mm 

0 90 5 5 

14 30 65 5 

14,1 45 50 5 

20 10 50 40 

30 10 50 40 

Wyniki i dyskusja 

(Results and disccussion) 

Tabela 3. Zestawienie substancji rozdzielonych w ekstrakcie Dionaea muscipula 

wraz z wyznaczonymi współczynnikami retencji k oraz 

współczynnikami selektywności α, rozdzielanych z wykorzystaniem 

programów elucji zamieszczonych w tabeli 1-2 

Table 3. A comparison of the substances separated in Dionaea muscipula 

extract and calculated values of retention coefficient (k) and selectivity 

coefficient (α) of separated substances with the use of 

elution programs listed in tab. 1-2 

D. muscipula / Składnik organiczny 

eluentu: izopropanol 

(D. muscipula / Organic komponent 

of the eluent: isopropanol) 

Substancja 

t 

(Substance) R k α 1 α 2 

D. muscipula / Składnik organiczny eluentu: 

izopropanol 

(D. muscipula / Organic component 

of the eluent: methanol) 

Substancja 

t 

(Substance) 

R k α 1 α 2 

A 3,74 2,56 - 1,25 A 6,04 4,75 - 1,44 

B 4,40 3,19 1,25 1,70 B 8,23 6,84 1,44 1,61 

E 6,76 5,44 1,70 1,11 E 12,60 11,00 1,61 1,04 

- - - - - - - - - - 

F 7,37 6,02 1,11 1,06 F 13,07 11,45 1,04 1,05 

Mirycetyna 

(Mirycetin) 

Kwercetyna 

(Quercetin) 

7,78 6,41 1,06 1,08 

8,34 6,94 1,08 1,34 

Mirycetyna 

(Mirycetin) 

Kwercetyna 

(Quercetin) 

13,73 12,08 1,05 1,10 

15,00 13,29 1,10 1,07 

I 10,82 9,30 1,34 1,18 I 15,91 14,15 1,07 1,02 

- - - - - I 2 16,20 14,43 1,02 1,11 



289 

Plumbagina 

(Plumbagin) 

12,54 10,94 1,18 1,05 

Plumbagina 

(Plumbagin) 

17,87 16,02 1,11 1,07 

J 13,10 11,48 1,05 1,15 J 19,02 17,11 1,07 1,06 

Chloroplumbagina 

(Chloroplumbagin) 

14,86 13,15 1,15 - 

D. muscipula/ Składnik organiczny 

eluentu: tetrahydrofuran 

(D. muscipula / Organic component 

of the eluent: tetrahydrofuran) 

Substancja 

(Substance) 

t R k α 1 α 2 



20,09 18,13 1,06 - 

D. muscipula/ Składnik organiczny eluentu: 

acetonitrylu 

(D. muscipula / Organic komponent 

Substancja 

(Substance) 

of the eluent: acetonitrile) 

t R k α 1 α 2 

- - - - - A 5,13 3,89 - 1,17 

B 5,13 3,89 - 1,75 B 5,81 4,53 1,17 1,33 

E 8,21 6,82 1,75 1,16 E 7,36 6,01 1,33 1,05 

F1 9,34 7,90 1,16 1,09 F1 8,29 6,90 1,09 1,11 

F 10,08 8,60 1,09 1,04 - - - - - 

Mirycetyna 

(Mirycetin) 

Kwercetyna 

(Quercetin) 

10,43 8,93 1,04 1,05 

10,94 9,42 1,05 1,15 

Mirycetyna 

(Mirycetin) 

Kwercetyna 

(Quercetin) 

7,70 6,33 1,05 1,09 

9,07 7,64 1,11 1,19 

I 12,45 10,86 1,15 1,03 I 12,89 11,28 1,24 1,10 

- - - - - I2 10,60 9,10 1,19 1,24 

Plumbagina 

(Plumbagin) 

12,80 11,19 1,03 1,05 

Plumbagina 

(Plumbagin) 

14,03 12,36 1,10 1,15 

J 13,33 11,70 1,05 1,09 - - - - - 



14,42 12,73 1,09 - 



15,92 14,16 1,15 - 

Współczynniki retencji k zostały obliczone dla wszystkich zidentyfikowanych 

substancji, współczynniki selektywności wyznaczono natomiast dla 

substancji, dla których posiadano wzorce oraz dla substancji powtarzających 

się w badanych ekstraktach. Współczynnik selektywności określa stopień 

rozdzielenia pików dwóch sąsiednich składników rozdzielanej mieszaniny. 

Na rys. 1 przedstawiony jest sposób wyznaczenia parametru na podstawie 

chromatogramu, korzystając ze wzoru (1) oraz wzoru (2) [9]. W tabeli 3 kreski 

„-„ w rubryce dotyczącej współczynników selektywności oznaczają, że 

dana substancja nie jest poprzedzona wcześniejszą substancją bądź za nią 

nie ma już piku kolejnej substancji. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

290 


Rys. 1. Schemat sposobu wyznaczania współczynnika selektywności [9] 

Fig. 1. Scheme of method of calculation selectivity factor [9] 

k 

i 

t 

 

i 

t 

t 

gdzie: 

k i – współczynnik retencji i-tej substancji, 

t i – czas retencji i-tej substancji, 

t m – czas martwy[min]. 

m 

m 

(1) 

 

k 

k 

1 

0 

(2) 

gdzie: 

– współczynnik selektywności, 

k 0 – współczynnik retencji substancji słabiej oddziałującej z faza stacjonarną 

k 1 – współczynnik retencji substancji silniej oddziałującej z faza stacjonarną 

Na podstawie otrzymanych chromatogramów podjęto także próbę identyfikacji 

substancji zawartych w ekstraktach roślinnych. Widma spektralne posłużyły 

do identyfikacji metabolitów, o dostępnych wzorcach – identyfikacja 

na podstawie dwóch parametrów – widma i wartości czasu retencji, a także 

do identyfikacji substancji „powtarzających się” w każdym z eluentów. Piki 

substancji, zidentyfikowanych na podstawie wzorców zostały opisane na 

chromatogramach za pomocą nazw wzorców, pozostałym substancjom zostały 

przypisane symbole dużych liter alfabetu. Substancje występujące 

w niskich stężeniach zostały opisane na chromatogramach małymi literami 

alfabetu. 

Zastosowanie do rozdzielenia składników ekstraktów z roślin owadożernych 

eluentu, będącego mieszaniną izopropanolu i wody zakwaszonej 

H 2 SO 4 do pH 3, pozwoliło stwierdzić obecność 40 substancji w ekstrakcie 

Dionaea muscipula i 34 w ekstrakcie Drosera aliciae. Współczynniki retencji 



291 

k dla 27-miu zaobserwowanych substancji z ekstraktu Dionaea muscipula 

mieściły się w optymalnym przedziale od 1÷10. Ponadto metabolity, których 

wzorce były w posiadaniu nieznacznie wykraczały poza ten przedział, 

k = 10,94 dla plumbaginy i k = 13,15 dla chloroplumbaginy. W ekstrakcie 

Drosera aliciae współczynniki k dla 22 substancji mieściły się w optymalnym 

przedziale, natomiast współczynnik k dla kolejnych trzech substancji odbiegał 

tylko o 0,87 od przedziału optymalnego. Dla Dionaea muscipula analiza 

chromatogramów rozdzielania metabolitów, których wzorce były dostępne, 

pozwala stwierdzić, iż flawonoidy są w tym układzie najlepiej rozdzielone od 

substancji im towarzyszących, natomiast dla naftochinonów otrzymano bardzo 

dobre rozdzielenie od substancji im towarzyszących przy wartości współczynnika 

k niewiele powyżej 10. Dla Drosera aliciae układ z eluentem zawierającym 

izopropanol pozwolił zidentyfikować tylko dwa metabolity, których wzorce 

były dostępne i posiadały one współczynniki retencji mniejsze od 10. Należy 

zaznaczyć, że rozdzielenie ramentaceonu od innych składników ekstraktu jest 

najlepsze spośród badanych układów chromatograficznych. 

Wykorzystanie, jako eluentu mieszaniny metanolu i wody zakwaszonej 

H 2 SO 4 do pH 3 pozwoliło w ekstrakcie Dionaea muscipula stwierdzić 

obecność 41 substancji a w ekstrakcie z Drosera aliciae 38 substancji. 

W tym układzie tylko dla 15 substancji współczynniki retencji k z ekstraktu 

Dionaea muscipula i z Drosera aliciae mieszczą się w przedziale od 1÷10. 

Można uznać, że współczynniki k dla mirycetyny oraz dla kwercetyny tylko 

nieznacznie wykraczają poza optymalny przedział, w przypadku naftochinonów 

różnice są natomiast już zbyt duże. W tym eluencie rozdzielenie flawonoidów 

między sobą jest najlepsze spośród badanych układów. 

Rys. 2. Chromatogram detektora UV-VIS (typ DAD) rozdzielania ekstraktu metanolowego 

D. muscipula eluentu izopropanol : woda 65:35 (v/v) z dodatkiem kwasu siarkowego 

(VI) do pH 3, kolumna LiChrosphere RP18e 125 x 4 mm, 5 µm, natężenie przepływu, 

objętość dozowania 20 µl 

Fig. 2. The UV-VIS/DAD detector chromatogram of D. muscipula methanol extract. Eluent: isopropanol 

: water in addition H 2 SO 4 (pH 3) 65:35 (v/v), column: LiChrosphere RP18e 

125 x 4 mm, 5 µm, flow rate 1ml/min, injection volume 20 µl 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

292 


Program elucji (Elution program): 

t[min] A B C 

0 90 5 5 

14 30 65 5 

14,1 45 50 5 

20 10 50 40 

30 10 50 40 


D. aliciae. Warunki rozdzielania, jak na rys. 2 

Fig. 3. The UV-VIS/DAD detector chromatogram of D. aliciae methanol extract. Separation 

conditions were the same as in Fig. 2 


D. capensis. Warunki rozdzielania, jak na rys. 2 

Fig. 4. The UV-VIS/DAD detector chromatogram of D. capensis methanol extract. Separation 




293 


D. binata. Warunki rozdzielania, jak na rys. 2 

Fig. 5. The UV-VIS/DAD detector chromatogram of D. binata methanol extract. Separation 


Badania, w których składnikiem eluentu była mieszanina tetrahydrofuranu 

i wody zakwaszonej H 2 SO 4 do pH 3 pozwoliło w ekstrakcie Dionaea 

muscipula uzyskać rozdzielenie 34 substancji a w ekstrakcie z Drosera aliciae 

39 substancji. W tym układzie 18 współczynników retencji k z ekstraktu 

Dionaea muscipula oraz 22 z ekstraktu Drosera aliciae mieści się w optymalnym 

przedziale. Dla Dionaea muscipula kolejnych 8 odbiega tylko o 2,73 

a dla Drosera aliciae kolejnych 7 wartości k odbiega tylko o 1,18 od optymalnego 

przedziału. Przykładowo dla Dionaea muscipula współczynnik k dla 

plumbaginy wynosi k = 11,19, a dla chloroplumbaginy k = 12,73. Zastosowanie 

tetrahydrofuranu jako eluentu pozwala uzyskać mniej selektywne rozdzielenie 

badanych związków, niż w układach gdzie organicznym składnikiem 

eluentu był metanol lub izopropanol. 

Mieszanina acetonitylu z wodą zakwaszoną H 2 SO 4 do pH 3 pozwoliła 

wyodrębnić w ekstrakcie Dionaea muscipula 33, a w ekstrakcie Drosera aliciae 

39 substancji. Dla ekstraktu Dionaea muscipula współczynniki retencji k 

17 a dla ekstraktu Drosera aliciae 25 substancji znajdowały się w odpowiednim 

przedziale wartości. Współczynnik retencji plumbaginy k = 12,36 można 

również uznać za nieznacznie odbiegający. W tym układzie uzyskano najlepsze 

rozdzielenie kwercetyny z ekstraktu Dionaea muscipula od substancji 

towarzyszących oraz mirycetyny z ekstraktu Drosera aliciae od substancji 

o mniejszym czasie retencji t R . Rozdzielenie naftochinonów z ekstraktu Dionaea 

muscipula było bardzo selektywne, aczkolwiek współczynniki k były 

znacznie większe niż w przypadku izopropanolu czy THF. Dla ekstraktu Drosera 

aliciae rozdzielenie naftochinonów było lepsze tylko w przypadku eluentu, 

którego składnikiem organicznym jest izopropanol. 

Podsumowanie powyższych wyników doprowadziło do stworzenia 

optymalnego programu elucji (w tab. 2), w którym rozdzielono ekstrakty 4 roślin 

owadożernych: D. muscipula, D. aliciae, D. capensis, D. binata (chromatogramy 

na rys. 1, 2, 3 i 4). Parametry retencyjne i rozdzielcze miały zadowalające 

wartości. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

294 


W ekstrakcie Dionaea muscipula uzyskano rozdzielenie 38 substancji 

(chromatogram na rys. 2). Współczynniki retencji k 15 substancji znajdowały 

się w optymalnym przedziale (2÷10). Zastosowany układ chromatograficzny 

pozwolił selektywnie rozdzielić flawonoidy. Naftochinony odznaczają się 

współczynnikami retencji większymi od 10, ich rozdzielenie jest selektywne, 

jedynie chloroplumbagina posiada niską wartości współczynnika selektywności 

α 1 i α 2 = 1,02. 

W ekstrakcie Drosera aliciae zidentyfikowano 38 substancji (rys. 3). 

Współczynniki retencji k 12 substancji znajdowały się w optymalnym przedziale, 

kolejnych 5 odbiegały o 1,97. Zastosowany układ chromatograficzny 

pozwolił selektywnie rozdzielić flawonoidy. Naftochinony również są selektywnie 

rozdzielone, jednakże ich współczynniki retencji wynoszą k = 11,97 

dla ramentaceonu oraz k = 12,68 dla droseronu. 

Ekstrakt z Drosera capensis rozdzielono 33 substancji (rys. 4). Współczynniki 

retencji k 13 substancji znajdowały się w przedziale 1÷10, kolejne 3 

różniły się tylko o 1,16 k. Analiza chromatogramu pozwoliła jedynie zidentyfikować 

mirycetynę. Rozdzielenie mirycetyny było w pełni selektywne. 

W ekstrakcie Drosera binata zidentyfikowano 34 substancje (rys. 5). 

Współczynniki retencji k 13 substancji znajdowały się w optymalnym przedziale 

1÷10, kolejnych 6 odbiegały o dwie jednostki k. Zastosowany układ 

chromatograficzny pozwolił selektywnie rozdzielić flawonoidy. Jedynym zidentyfikowanym 

naftochinonem była plumbagina, która posiadała współczynnik 

retencji k = 14,09. Współczynniki selektywności α wskazują, iż zostało 

uzyskane lepsze rozdzielenie tego naftochinonu od substancji 

towarzyszących eluowanych po plumbaginie. 


Badania z zastosowaniem eluentów dwuskładnikowych do rozdzielenia 

ekstraktów z roślin D. muscipula i D. aliciae za pomocą wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz doprowadziły do szeregu 

wniosków: 

Izopropanol będący organicznym składnikiem eluentu, nadaje mu odpowiednią 

siłę elucyjną, ponadto jego zastosowanie pozwala selektywnie 

rozdzielić flawonoidy oraz naftochinony od substancji im towarzyszących, 

Współczynniki retencji k substancji z ekstraktów rozdzielanych przy 

użyciu eluentu, którego składnikiem jest izopropanol znajdują się 

w optymalnym przedziale wartości 1÷10. 

Eluent, którego składnik stanowił metanol wykazuje słabą siłę elucyjną, 

aczkolwiek bardzo selektywnie pozwala rozdzielić między sobą składniki 

z grupy flawonoidów. 

Układ chromatograficzny, w którym użyto acetonitrylu bardzo selektywnie 

rozdzielał kwercetynę z ekstraktu Dionaea muscipula oraz mirycetynę 

z ekstraktu Drosera aliciae od substancji towarzyszących. 



295 

Rozdzielenie naftochinonów z zastosowaniem acetonitrylu okazało się 

selektywne, aczkolwiek współczynniki k substancji rozdzielonych były 

znacznie większe niż w przypadku izopropanolu czy THF. 

Do opracowania możliwie optymalnego programu elucji do rozdzielania 

i oznaczania składników ekstraktów roślinnych wybrano wodę z kwasem 

oraz składniki organiczne: metanol i izopropanol. Metanol, ponieważ 

selektywnie rozdzielał flawonoidy, izopropanol, gdyż selektywnie 

rozdzielał naftochinony. 

Dla ekstraktów z D. capensis i D. binata program elucji wymaga jeszcze 

pewnych modyfikacji, które sprawią iż rozdzielenie zawartych w nich 

substancji będzie bardziej selektywne, co pozwoli rozdzielić więcej substancji. 

Trudne, a w wielu przypadkach niemożliwe jest opracowanie uniwersalnej 

metodyki rozdzielania ekstraktów roślin różnych gatunków, które 

często wykazują znaczne różnice składu jakościowego i ilościowego. 

Summary 

The research on using binary mixtures as eluent for separation of 

plant extracts D. muscipula i D. aliciae with HPLC gave conclusions, which 

are listed below: 

Isopropanol as a component of the eluent gives him an adequate elution 

strength, furthermore its application gives selective conditions for 

separation of flavonoids and naphthoquinones from other accompanying 

compounds, 

The k values of substances from chromatographed extracts with the 

use of isopropanol are in optimal range from 1 to 10, 

Methanol as component of the eluent has weak elution strength, however 

very selective conditions for separation of flavonoid compounds 

were reported, 

The chromatographic system in which the acetonitrile was used has 

a selective properties for separation of quercetin in respect to other 

components in Dionaea muscipula extract and of myricetin in respect to 

other compounds of Drosera aliciae extract, 

The separation of naphthoquinones with the use of acetonitrile was selective, 

however the k values of separated substances were much higher 

than with the use of isopropanol or THF, 

The optimal composition of the eluent for optimal elution program for 

separation and identification of plant extracts components must include 

water with acid addition and organic components: methanol and isopropanol. 

Methanol gives selective properties for separation of flavonoids 

and isopropanol for separation of naphthoquinones, 

For D. capensis and D. binata extracts the elution program needs much 

more modifications, which influence its properties for selective separation 

of more components of the extracts, 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

296 


It is hard and even in many cases impossible to develop a universal 

methodology for separation of different kind of plant extracts, which very 

often have very different qualitative and quantitative properties. 

Literatura 

(Literature) 

1. M. Nowiński, „Dzieje upraw i roślin leczniczych“, History of crops and 

medicinal plants, Państwowe Wydawnictwo Rolne i Leśne, Warszawa 

1980. 

2. A. Krolicka, A. Szpitter, E. Gilgenast, G. Romanik, M. Kaminski, E. Lojkowska, 

Stimulation of antibacterial naphthoquinones and flavonoids 

accumulation in carnivorous plants grown in vitro by addition of elicitors, 

Enzyme Microb. Tech., 42(2008)216. 

3. P. Babula, R. Mikelova, V. Adam, R. Kizek, L. Havel, Z. Sladky, Using 

of liquid chromatography coupled with diode array detector for determination 

of naphthoquinones in plants and for investigation of influence of 

pH of cultivation medium on content of plumbagin in Dionaea muscipula, 

J. Chromatogr. B, 842(2006)28. 

4. M.J. Bapela, N. Lall, J.J.M. Meyer, Variation of active constituents 

in Euclea natalensis based on seedling stages , seasons and fertilizers, 

J. S. Afr. Bot., 74(2008)218. 

5. http://www.rozanski.cal.pl/ 

6. Y.P. S. Bajaj; Medicinal and aromatic plants XI; Springer Verlag, New 

York, NY, 1999. 

7. B. Hazra, M. D. Sarma, U. Sanyal Separation methods of quinonoid 

constituents of plants used in Oriental traditional medicines, J. Chromatogr. 

B, 812(2004)259. 

8. S.M. Ziaratnia, K.J. Kunert, N. Lall, Isolation and identification of a novel 

chlorophenol from a cell suspension culture of Helichrysum aureonitens, 

J. S. Afr. Bot., 75(2009)97. 

9. M. Kamiński (ed.), „Chromatografia cieczowa”, Liquid chromatography, 

CEEAM, Gdańsk 2004. 

10. A. Lewandowski, praca magisterska, Politechnika Gdańska 2010. 




Paweł M. WANTUSIAK*, Paweł PISZCZ, 

Monika SKWAREK, Bronisław K. GŁÓD 

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, 

Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, 


*e-mail: wantusiak@gmail.com 

Właściwości antyoksydacyjne miodów 

wyznaczone metodami chromatograficznymi 

Antioxidative properties of honeys determined 

using HPLC techniques 

Streszczenie: Zarówno wolne rodniki jak i antyoksydanty można oznaczać metodami bezpośrednimi, 

do jakich zaliczamy EPR czy metody elektroanalityczne. Bardzo krótki czas życia 

spowodowany wysoką reaktywnością wielu rodników nie pozwala jednak na szerokie stosowanie 

metod bezpośrednich. Dlatego opracowano szereg metod pośrednich. Polegają one na badaniu 

produktów reakcji wolnych rodników z tzw. pułapkami spinowymi. Metody te zastosowane 

przez nas zostały do opracowania chromatograficznych metod oznaczania całkowitego potencjału 

antyoksydacyjnego (CPA). CPA jest funkcją sumy iloczynów stężeń wszystkich antyoksydantów 

w próbce przez ich moc (stałe szybkości reakcji). 

W pracy przedstawiono wstępne wyniki chromatograficznego oznaczania CPA w różnych 

gatunkach miodów, zioło-miodów i miodów pitnych. Wyniki te skorelowane zostały z całkowitą 

zawartością polifenoli w próbce. 

Słowa kluczowe: wolne rodniki, antyoksydanty, całkowity potencjał antyoksydacyjny, miód, zioło 

miód, miód pitny 

Abstract: Free radicals as well as antioxidants can be analyzed using direct methods, such as 

EPR or electroanalytical ones. However, very short life span, due to the high reactivity, does not 

allow for the extensive use of direct methods. Therefore, indirect techniques were elaborated. 

They are based on examination of the products of radicals reactions with the so-called spin 

traps. These methods were developed by us to elaborate total antioxidant potential (TAP) measurements, 

which is a function of the sums of products of all antioxidants in the sample by their 

reaction rate constants. 

The paper presents our preliminary results of the chromatographic determination of various 

honeys, herbal honeys and meads. These results were correlated with the, determined 

photometrically, total concentration of polyphenols. 

Key words: free radicals, antioxidants, total antioxidant potential, honey, herbhoney, mead 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

298 

P.M. Wantusiak, P. Piszcz, M. Skwarek, B.K. Głód 

1. Wstęp 


Wszystkie organizmy aerobowe potrzebują do życia tlenu. Główną organellą 

komórkową wykorzystującą tlen, a jednocześnie odpowiedzialną 

za dostarczanie energii, jest mitochondrium. Całkowita redukcja tlenu cząsteczkowego 

poprzedzana jest etapami pośrednimi, w których udział biorą enzymy 

endogenne, pełniące rolę katalizatorów. W trakcie stopniowych przemian elektronowych 

cześć pobieranego przez organizmy żywe tlenu (1÷4%) przekształcana 

jest w wolne rodniki (WR) tlenowe lub reaktywne formy tlenu (RFT). Źródłami 

wolnych rodników są również reakcje red/ox związków endo- lub 

egzogennych (zanieczyszczenie środowiska), szereg stanów chorobowych 

i zmiany podaży tlenu. Ich nadmiar narusza równowagę red/ox w organizmie 

przyczyniając się do wielu chorób, starzenia i śmierci [1-3]. 

Wolne rodniki są to cząsteczki, ich fragmenty, jony, atomy bądź też 

grupy atomów posiadające na swojej powłoce walencyjnej (według innej definicji 

– na ostatnim orbitalu) co najmniej jeden niesparowany elektron. Ten 

niesparowany elektron nadaje im właściwości paramagnetycznie i czyni je 

reaktywnymi [4-6]. 

Od wielu lat ludzkość poszukuje tzw. złotego środka, który mógłby zatrzymać 

lub chociaż spowolnić proces starzenia się organizmów żywych, 

szczególnie ludzi. Za proces ten w dużej mierze odpowiedzialne są wolne 

rodniki. Naturalną obroną są związki określane mianem antyoksydantów, 

które naturalnie występują w naszym organizmie. Antyoksydantem nazywany 

jest związek, który występując w bardzo małym stężeniu chroni aktywne 

biologiczne związki przed utlenianiem [5]. Niestety ich stężenia często okazują 

się, np. pod wpływem różnych chorób, niewystarczające. Ich niedobór 

może być uzupełniany przez pożywienie. Takim dostępnym źródłem antyoksydantów 

są różne wyroby pszczelarskie, w tym miody i ich pochodne. 

Właściwości antyoksydacyjne miodu, wynikają z obecności w nim zarówno 

antyoksydantów enzymatycznych jak i nieenzymatycznych. Wśród 

enzymatycznych przeciwutleniaczy wyróżnić można katalazę i peroksydazę 

glutationową [7]. Główny enzym miodu, oksydaza glukozy, jest enzymem, 

którego działanie uaktywnia się dopiero w wodnym roztworze miodu. 

W obecności tlenu powoduje ona katalityczne utlenianie glukozy do glukono- 

1,5-laktonu z jednoczesnym wytworzeniem nadtlenku wodoru, H 2 O 2 

[7, 8].Obecność nadtlenku wodoru, H 2 O 2 , w połączeniu z jonami żelaza 

na plus drugim stopniu utlenienia, Fe(II), również obecnymi w miodzie jako 

jedne z mikroelementów, może początkować reakcje wolnorodnikowe 

i przez analogię do reakcji Fentona prowadzić do powstania wysoce reaktywnych 

rodników hydroksylowych, ● OH. Tworzenie rodników hydroksylowych 

może zostać zahamowane przez enzym katalazę, która redukuje nadtlenek 

wodoru, H 2 O 2 , do wody i tlenu cząsteczkowego (jedna cząsteczka 

katalazy efektywnie redukuje około 6 milionów cząsteczek H 2 O 2 /minutę). Im 

wyższe jest stężenie oksydazy glukozy oraz niższe stężenie katalazy w miodzie, 

tym wyższa jest zawartość w nim H 2 O 2 [9]. 


Właściwości antyoksydacyjne miodów wyznaczone metodami chromatograficznymi 

299 

Do antyoksydantów nieenzymatycznych zalicza się (i) flawonoidy (hesperytyna, 

trycetyna, myricetyna, pinocembryna, galangina, kampferol, 

kwercetryna, naryngenina, chrysina, pinobanksina, luteolina), (ii) niearomatyczne 

kwasy organiczne (cytrynowy), (iii) kwasy fenolowe i ich estry (chlorogenowy, 

galusowy, cynamonowy, benzoesowy, kofeinowy, wanilinowy, ferulowy, 

abiscynowy, elagowy), (iv) wolne aminokwasy (głównie prolina), 

(v) witaminy (E - α-tokoferol, C - kwas askorbinowy), (vi) pochodne karotenoidów 

(vii) itp. [10-12]. 

Miód znany jest od starożytności, jako jedna z pierwszych naturalnych 

substancji słodzących. Jest on naturalnym produktem pszczelim, pozyskiwanym 

między innym z nektaru kwiatowego, soków, żywicznych wydzielin 

roślin, rosy miodowej oraz materiałów wtórnych pochodzących z przeróbki 

nektaru roślinnego przez niektóre owady (tzw. spadź). Jest wonną, słodką, 

lepką i gęstą substancją o charakterystycznym zabarwieniu od jasnozłotego 

po ciemny brąz, występującą zarówno w postaci płynnej, jak i krystalicznej. 

Pod względem chemicznym jest przesyconym, wodnym roztworem cukru, 

zawierającym głównie monosacharydy glukozę i fruktozę. Zawiera cały szereg 

związków o różnym działaniu, w tym antyoksydanty. Jego skład zależy 

pochodzenia miodu, środowiska, klimatu, gleby, sposobu wytwarzania 

i przechowywania itp. [13]. 

Ziołomiód jest produktem miodopodobnym, pośrednio wytwarzanym 

przez pszczoły, których dieta opiera się głównie na sacharozie, wzbogacanej 

dodatkowo przez pszczelarzy wyciągami ziołowymi bądź też sokami owocowymi 

[14, 15]. 

Miód pitny jest otrzymywany z fermentacji wodnego roztworu miodu 

pszczelego (tak zwanej brzeczki miodowej). Istnieje kilka kryteriów, według 

których można dokonać podziału dojrzałych miodów pitnych na kilka klas. 

Miody pitne dzielone są głównie ze względu na (i) sposób przygotowania 

brzeczki miodowej (sycone, niesycone), (ii) stosunek zawartości miodu i wody 

w brzeczce (półtorak, dwójniak, trójniak, czwórniak), (iii) dodatkowe 

składniki uzupełniające brzeczkę (naturalne, korzenno-ziołowe, chmielowe, 

owocowe) oraz (iv) czasu leżakowania i dojrzewania) [16, 17]. 

Starania indywidualnych producentów miodu pitnego, doprowadziły do 

powstania regulacji prawnej produkcji miodów pitnych oraz moszczów owocowych 

[18]. Spowodowało to wpisanie miodu pitnego na listę produktów 

tradycyjnych i regionalnych, i uzyskanie statusu Gwarantowanej Tradycyjnej 

Specjalności Unii Europejskiej [19, 20]. 

Wzrastające wymogi konsumentów co do jakości miodu spowodowały 

rozwój nowych technik i metod jej oceny. Główne z nich to badania zawartości 

wody i przewodnictwa elektrycznego, badania zawartości popiołu, analiza 

pyłku kwiatowego za pomocą TLC i GC, pomiar zawartości 

5-metylohydroksyfurfuralu, HMF (obecność tego związku wzrasta w trakcie 

dłuższego przechowywania miodu) [21, 22]. 

Wolne rodniki jak i antyoksydanty można oznaczać metodami bezpośrednimi, 

wykorzystując ich właściwości paramagnetyczne (EPR w przypadku 

WR) lub łatwość utleniania/redukcji [23]. Bardzo krótki czas życia i wyso- 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

300 


ka reaktywność wielu rodników bardzo utrudnia te pomiary. Dlatego opracowano 

szereg metod pośrednich. Polegają one na badaniu produktów reakcji 

wolnych rodników ze związkami naturalnie występującymi w organizmach żywych 

lub z tzw. pułapkami spinowymi [24]. Metody te przystosowaliśmy do 

opracowania chromatograficznych metod oznaczania całkowitego potencjału 

antyoksydacyjnego (CPA), będącego funkcją sumy iloczynów stężeń wszystkich 

antyoksydantów w próbce przez ich moc (stałe szybkości reakcji). 

W pracy przedstawiono wstępne wyniki chromatograficznego wyznaczania 

CPA różnych gatunków miodów, zioło-miodów i miodów pitnych. 

Jedna z technik polegała na generacji, w reakcji Fentona [25], rodników hydroksylowych 

i chromatograficznym oznaczaniu produktu ich reakcji z kwasem 

p-hydroksybenzoesowym w układzie RP-HPLC z detekcją UV-205. Miarą 

CPA drugiej techniki jest sumaryczne pole powierzchni pod wszystkimi 

pikami zarejestrowanymi na detektorze amperometrycznym przy określonym 

potencjale elektrody pracującej. Wyniki te skorelowane zostały z całkowitą 

zawartością polifenoli w próbce. 

2. Część eksperymentalna 


2.1. Aparatura 

(Apparatus) 

Pomiar chromatograficzne wykonywano na wysokosprawnym chromatografie 

cieczowym (Knauer, Berlin, Niemcy) składającym się z butli z eluentem, 

modułu Smartline Manager 5000, pompy dwutłokowej Smartline 1000 

(regulacja przepływu fazy ruchomej 0,001-50 ml/min), mieszadła magnetycznego, 

dozownika pętlicowego D-14163 (objętość pętli 20 µl), termostatu 

kolumn Smartline 4000 z zakresem temperatur 5 ÷ 85 ºC, kolumny analitycznej 

Eurospher RP-18 (5 µm, 250 x 4 mm), detektora spektrofotometrycznego 

UV Smartline PDA 2800 z matrycą diodową DAD (zakres pracy 

lampy 190-1020 nm),detektora elektrochemicznego EC3000 (elektroda pracująca: 

elektroda z węgla szklistego; elektroda odniesienia: Ag/AgCl; elektroda 

pomocnicza: Pt), komputerowych systemów rejestracji i przetwarzania 

danych - Eurochrom 2000 oraz Clarity Chrom, zbiornika eluatu. 

Ponadto w pracy stosowano spektrofotometr firmy ThermoSpectronic, 

Model: Helios Epsilon (USA) i pH-metr OP-208/1 firmy RADELKIS (Budapeszt, 

Węgry). 

2.2. Materiały i odczynniki 

(Materials and reagents) 

Przedmiotem badań całkowitego potencjału antyoksydacyjnego były 

próbki miodów i ziołomiodów z różnego rodzaju roślin, oraz próbki miodów 

pitnych. Próbki te zostały zakupione w sklepach, a niektóre z nich bezpośrednio 

nabyto od pszczelarzy. Wykaz wszystkich próbek, jak i miejsca ich 

pochodzenia szczegółowo przedstawiono w tabeli 1. 



301 

Tabela 1. Wykaz miodów stosowanych w badaniach 

Table 1. List of tested honeys 

Nr pasieki 

(No apiary) 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

Adres 

(Address) 

Gospodarstwo Pasieczne 

„Sądecki Bartnik”, 33-331 Stróże, 

woj. Małopolskie 

Pasieka Kazimierz Przestrzelski, 

18-400 Łomża, 

woj. Podlaskie 

Pasieka Władysław Jezior, 

21-200 Parczew, 

woj. Lubelskie 

Gospodarstwo Pasieczne „Kuszka”, 

Krzysztof Fujerski, 78-550 Czaplinek, 

woj. Zachodnio - Pomorskie 

Pasieka „Pod Dębami”, Józef Niedźwiecki, 

14-500 Braniewo, 

woj. Warmińsko - Mazurskie 

Pasieka Helena Wernerowa, 

Seroczyn, 08-110 Siedlce, 

woj. Mazowieckie 

Pasieka „Namysłowski Bartnik”, Antoni 

Teuerle, 57-315 Przeczów, 

woj. Dolnośląskie 

Pasieka „PH Barć”, Włodzimierz Cyc, 

23-425 Biszcza, 


Pasieka „Leśny Dar” 

Szymaniak Jerzy 

Chodów, 08-110 Siedlce, 

woj. Mazowieckie 

Spółdzielnia Pszczelarska „Apis”, 

20-471 Lublin, 


Costel S. Pietro Terme VIA. G.P. Piana, 

1450, Włochy 

Rodzajmiodu 

(Type of honey) 

aloesowy, aroniowy, głogowy, 

pokrzywowy, sosnowy, 

z propolisem, 

z pyłkiem 

akacjowy, lipowy, macierzankowy, 

spadziowy, wielokwiatowy, 

wierzbowy, wrzosowy 

akacjowy, gryczany, lipowy, 

mniszkowy, rzepakowy, wielokwiatowy 

akacjowy , gryczany, 

spadziowy 

lipowy, spadziowy, 

wielokwiatowy 

lipowy, wielokwiatowy 

akacjowy, gryczany, 

spadziowy 

lipowy, wielokwiatowy 

akacjowy, lipowy, gryczany 

– półtorak „Jadwiga” 

– dwójniak „Kurpiowski” 

– trójniak „Piastowski” 

– czwórniak „Korzenny” 

wielokwiatowy 

W pomiarach zastosowano kwas 4-hydroksybenzoesowy (p-HBA), 

kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy (3,4-DHBA), kwas 3,4,5-trihydroksybenzoesowy 

(3,4,5-THBA), siarczan(VI) żelaza(II) i buforowany (pH 7,4) roztwór 

soli fizjologicznej w tabletkach (Sigma – Aldrich, Niemcy); diwodoroortofosforan 

sodu, wodoroortofosforan potasu, wodorotlenek sodu, brom, 3% wodny 

roztwór nadtlenek wodoru, wolframian sodowy, molibdenian sodowy, węglan 

sodowy bezwodny, 85% kwas ortofosforowy, kwas solny oraz siarczan litu 

(POCh, Gliwice, Polska). 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

302 


2.3. Warunki pomiarowe 

(Measurement parameters) 

Pomiary chromatograficzne przeprowadzono w układzie faz odwróconych 

(RP–C18) stosując bufor fosforanowy (pH 6,6) jako fazę ruchomą. Objętość 

dozowanej na kolumnę próbki wynosiła 20 µl, zaś szybkość przepływu 

fazy ruchomej 1 ml/min. Pomiary przeprowadzono w temperaturze 20°C. 

W pomiarach zastosowano dwa rodzaje detektorów: fotometryczny (długość 

fali 205 nm) i elektrochemiczny (zakres potencjału, E = 0 ÷ 1,2 V). 

Głównym etapem pomiaru CPA jest wygenerowanie rodnika hydroksylowego, 

● OH, w reakcji analogicznej do reakcji Fentona [25]. Krótki czas 

życia rodnika hydroksylowego oraz jego duża reaktywność nie pozwalają na 

jego bezpośrednie oznaczanie. Możliwe jest natomiast uzyskanie bardziej 

stabilnego produktu reakcji tego rodnika z antyoksydantem (pułapka spinowa), 

a co za tym idzie jego pośrednie oznaczanie. Gdy substratem reakcji 

jest kwas p-hydroksybenzoesowym wówczas jej produktem jest kwas 

3,4-dihydroksybenzoesowy. Reakcję pHBA z rodnikiem hydroksylowym 

przeprowadza się dwukrotnie, bez i po dodaniu badanej próbki do mieszaniny 

reakcyjnej. Miarą CPA jest zmniejszenie pola powierzchni piku kwasu 

3,4-DHBA pod wpływem próbki. 

Reakcje prowadzące do wygenerowania rodnika hydroksylowego oraz 

powstania kwasu 3,4-DHBA (reakcja podstawowa) przeprowadzono w układzie 

pomiarowym składającym się z 500 µl buforu fosforanowego, pH=7,4; 

100 µl 1 Mm pHBA; 100 µl 0,03% wody utlenionej; 100 µl wody destylowanej 

i 200 µl 2 mM siarczanu (V) żelaza (II). W przypadku układu zawierającego 

badaną próbkę, objętość wody destylowanej zmniejszano odpowiednio tak, 

aby ich sumaryczna objętość wynosiła 100 µl. Pomiar chromatograficzny 

dokonywano po 7 minutach od zmieszania wszystkich reagentów, przy czym 

jako ostatni dodawany był siarczan żelaza. Po tym czasie obserwowano 

niewielkie zmiany wysokości piku p-HBA. 

Pole powierzchni piku 3,4-DHBA jest proporcjonalne do jego stężenia 

w badanej próbce, które bezpośrednio zależy od ilości wygenerowanych 

rodników hydroksylowych. Na rysunku 1 przedstawiono zależność pomiędzy 

polem powierzchni 3,4-DHBA, a stężeniem jonów żelaza, użytym do wygenerowania 

rodników w reakcji Fentona. Powyżej 2 mM Fe 2+ krzywa asymptotycznie 

zbliżała się do maksimum. 

Krzywe kalibracyjne obu kwasów przedstawiono na rysunku2. Próg 

wykrywalności, D L , kwasu 3,4-DHBA wynosi 3·10 -5 mM, kwasu p-HBA 

6·10 -4 mM dla stosunku sygnał/szum = 3, a zakres dynamiki liniowej od 

3·10 -5 (6·10 -4 ) do 0,01 mM dla kwasu 3,4-DHBA (p-HBA). Oznaczenie CPA 

przeprowadzano przy maksimum absorbancji kwasu 3,4–DHBA, tj. 205 nm. 



303 

Rys. 1. Zależność pola powierzchni kwasu 3,4-DHBA od stężenia Fe 2+ użytego do generowania 

rodników w reakcji Fentona (stężenie wody utlenionej 0,03%, p-HBA 1 mM). Warunki 

chromatograficzne: kolumna Eurospher – C18 5 µm 250 x 4 mm (Knauer), temp 20ºC, 

szybkość przepływu 1 ml/min, 100 mM bufor fosforanowy (pH 6.6),detektor UV 205 nm. 

Fig. 1. Dependence of the surface area of 3,4-DHBA peak on the concentration of Fe 2+ used to 

the radicals generation in Fenton reaction (concentration of hydrogen peroxide - 0.03%, 

p-HBA - 1 mM). Chromatographic conditions: column – Eurospher C18 5 µm, 250 x 

4 mm I.D. (Knauer), temp. – 20ºC, flow rate – 1 ml/min, mobile phase – 100 mM phosphate 

buffer (pH 6.6), UV detector – 205 nm. 

Rys. 2. Krzywe kalibracyjne kwasu p-HBA (●) i 3,4-DHBA (♦). Warunki chromatograficzne 

jak na rysunku 1. 

Fig. 2. Calibration curves of pHBA(●) and DHBA(♦). Chromatographic conditions as on figure 1. 

Na rysunku 3 przedstawiono zależność zmiany pola powierzchni piku 

od stężenia danego miodu. Zależności te mają przebieg liniowy w małym 

zakresie stężeń (0-1,5 mg/ml). Pozwala to na proste przeliczanie wartości 

CPA badanych próbek w celu ich późniejszego porównania. Zakres liniowy 

charakterystyczny jest dla wszystkich przeanalizowanych próbek. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

304 


Rys. 3. Wpływ stężenia miodu (pasieka nr 3) na zmianę pola powierzchni piku kwasu 

3,4-DHBA. Warunki chromatograficzne jak narysunku 1. 

Fig. 3. Influence of the concentration of honeys on the decrease of the surface area of DHBA 

peak. Chromatographic conditions as on figure 1. 

Wartości CPA otrzymane dla wszystkich przeanalizowanych próbek 

miodów przeliczono na ekwiwalent kwasu galusowego (GAE = mg GA/g 

miodu). Obliczenia oparto o równanie krzywej wzorcowej wykonanej dla tego 

kwasu (rysunek 4). 

Rys. 4. Krzywa kalibracyjna kwasu galusowego. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 1. 

Fig. 4. Calibration curve of 3,4,5-THBA.Chromatographic conditions as on figure 1. 



305 

Oznaczenie CPA za pomocą detektora elektrochemicznego polegało 

na wykonaniu chromatogramu próbki miodu techniką HPLC w układzie faz 

odwróconych, z detekcją elektrochemiczną w dodatnim zakresie potencjałów, 

E(V) = 0 ÷ 1,2 V. Miarą CPA ED była sumaryczna powierzchnia pików 

powstałych do 20 minuty trwania analizy. 

Do pomiaru całkowitej zawartości polifenoli w miodzie wykorzystano 

zmodyfikowaną metodę z użyciem odczynnika Folina – Ciocalteua (FCR) 

[26]. Odczynnik ten utlenia polifenole zawarte w próbce tworząc równocześnie 

barwne tlenki wolframu (W 8 O 23 ) i molibdenu (Mo 8 O 23 ) powstające z redukcji 

kwasu fosfowolframowego (H 3 PW 12 O 40 ) i kwasu fosfomolibdenowego 

(H 3 PMo 12 O 40 ). W wyniku reakcji powstaje niebieskie zabarwienie tlenków, 

które wykazuje maksimum absorbcji przy długości fali 765 nm. Natężenie 

zabarwienia proporcjonalne jest do całkowitej zawartości polifenoli w badanej 

próbce. Zawartość polifenoli (PC) w próbce odczytano z krzywej wzorcowej 

wykonanej dla kwasu galusowego (rysunek 5). Wynik oznaczenia 

podano jako ekwiwalent tego kwasu w przeliczeniu na 1 g produktu. 

Rys. 5. Krzywa wzorcowa kwasu galusowego wyznaczona przy długości fali 765 nm 

Fig. 5. Calibration curve of gallic acid determined at a wavelength of 765 nm 



Zarówno wolne rodniki, RFT jak i antyoksydanty są z jednej strony 

szkodliwymi, z drugiej nieodzownymi składnikami organizmów żywych. 

Rozwój nauki i technik analitycznych pozwala na coraz dokładniejsze ich 

oznaczanie, a także wyjaśnienie ich wpływu na organizm człowieka. Jak 

wiemy, zasadniczy wpływ na zdrowie ma sposób odżywiania się. Zawarte 

w pokarmach antyoksydanty pozwalają skuteczniej bronić się przed szkodliwym 

działaniem wolnych rodników. W produktach pochodzenia pszczelego 

dużą grupę związków stanowią polifenole i ich pochodne. Jak wskazują da- 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

306 


ne literaturowe [27], to właśnie ta grupa związków w dużej mierze odpowiedzialna 

jest za ich właściwości antyoksydacyjne. Przedstawione w pracy wyniki 

badań CPA umożliwiły wyznaczenie szeregu antyoksydacyjnego miodów, 

ziołomiodów oraz miodów pitnych pochodzących z różnych rejonów 

Polski. 

Miody można opisać różnymi parametrami. Między innymi, różne miody 

charakteryzują się różną konsystencją. Miody łatwiej się zestalające zawierają 

z reguły więcej antyoksydantów, a mniej wody. Dlatego miody, lipowy, 

spadziowy i akacjowy (rysunek 6), łatwiej się zestalające charakteryzują 

się wyższym CPA. W jaki sposób stan skupienia wpływa na właściwości antyoksydacyjnych 

miodu nie jest jeszcze dokładnie wyjaśnione chociaż wielokrotnie 

potwierdzone [28]. 

Rys. 6. CPA miodów (pasieka nr 2) o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają średnie ± SD z 3 

niezależnych doświadczeń. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 1. 

Fig. 6. TAP values (apiary no 2) of various honeys (final concentration 1 mg/ml).Data are presented 

as means from 3 independent experiments ± SD. Chromatographic conditions 

as on figure 1. 

Wartości CPA miodów pszczelich jak i pitnych (rysunek 6 i 7) zależą 

głównie od stężenia polifenoli [27]. Okazało się, że ze wszystkich zbadanych 

próbek największymi stężeniami polifenoli charakteryzowały się miody pitne, 

półtorak i dwójniak. Oprócz miodów zawierają one szereg dodatków o silnych 

właściwościach antyoksydacyjnych. Istnieje wyraźna korelacja pomiędzy 

CPA, a zawartością polifenoli w miodach pitnych (rysunek 8). 



307 

Rys. 7. CPA miodów pitnych o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają średnie ± SD 

z 3 niezależnych doświadczeń. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 1. 

Fig. 7. TAP values of the various meads (final concentration 1 mg/ml). Data are presented as 

means from 3 independent experiments ± SD. Chromatographic conditions as on figure 

1. 

Rys. 8. Korelacja wartości CPA i zawartości polifenoli w miodach pitnych. Badane miody pitne 

(według wzrostu zawartości polifenoli): czwórniak, trójniak, dwójniak, półtorak 

Fig. 8. Correlation between CPA and concentration of polyphenols in meads. 

Właściwości antyoksydacyjne miodów pitnych nie zależą bezpośrednio 

od źródła botanicznego rośliny (jak w przypadku miodu pszczelego), tylko 

od sposobu przygotowania brzeczki miodowej. Im większy jest udział 

miodu do wody w brzeczce, tym większe są wartości CPA danego miodu 

pitnego. Zależność pomiędzy CPA a objętościowym stosunkiem miodu do 

wody przedstawiono na rysunku 9. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

308 


Rys. 9. Zależność CPA od stosunku objętościowego miodu do wody, użytych w procesie fermentacji. 

Badane miody pitne (według wzrostu CPA): czwórniak, trójniak, dwójniak, półtorak. 

Fig. 9. Correlation between CPA and the ratio honey/water, used in fermentation process. 

CPA oznaczono również w ziołomiodach. Największą zdolnością antyoksydacyjną 

charakteryzuje się ziołomiód pokrzywowy (rysunek 10), natomiast 

pomiar całkowitej zawartości polifenoli (tabela 2) klasyfikuje go na 

ostatnim miejscu. Okazuje się, że polifenole nie wpływają na wartości CPA 

ziołomiodów w sposób liniowy, tak jak w przypadku miodów i miodów pitnych, 

a CPA pochodzące od nie-polifenoli ma dużo większy wpływ. 

Rys. 10. CPA ziołomiodów o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają średnie ± SD z 3 niezależnych 

doświadczeń. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 1. 

Fig. 10. TAPs of the various herbhoneys (final concentration 1 mg/ml). Data are presented as 

means from 3 independent experiments ± SD. Chromatographic conditions as on figure 

1. 



309 

Tabela 2. Całkowita zawartość polifenoli w ziołomiodach, w przeliczeniu na 

ekwiwalent kwasu galusowego (GA) w 1 g. Wyniki przedstawiają 

średnie ± SD z 3 niezależnych doświadczeń. 

Table 2. Total polyphenols content in herbhoneys (expressed as gallic 

acid equivalent). The data represent means ± SD of 3 independent 

experiments. 

Odmiana miodu 

mg GA/ 1 g miodu 

z propolisem 0,53±0,06 

z pyłkiem 0,43±0,04 

sosnowy 0,36±0,02 

aloesowy 0,33±0,03 

głogowy 0,27±0,03 

aroniowy 0,25±0,02 

pokrzywowy 0,23±0,02 

Antyoksydanty oznaczać można elektrochemicznie (reakcja utleniania), 

a więc również stosując detektor elektrochemiczny po ich chromatograficznym 

rozdziale. W pracy zaproponowano alternatywną metodę pomiaru 

CPA – pomiar całkowitego pola powierzchni wszystkich pików zarejestrowanych 

na detektorze amperometrycznym (CPA ED ). W tym przypadku antyoksydanty 

nie są utleniane wygenerowanym rodnikiem, jak w opisywanej do tej 

pory metodzie, a na powierzchni elektrody. Do badań zastosowano elektrodę 

z węgla szklistego, dogodną do pracy w środowisku wodnym. Olbrzymią 

zaletą tej metody jest możliwość dokonywania pomiarów przy różnych potencjałach 

elektrody pracującej (rysunek 11). W pewnym sensie może to 

symulować oddziaływanie badanych próbek z różnymi rodnikami. Związki 

dające piki przy niskich potencjałach są silnymi antyoksydantami, przy wysokich 

– słabymi. Pomiary przedstawione w pracy wykonywane były w układzie 

faz odwróconych. Retencja w tym przypadku jest wprost proporcjonalna 

do hydrofobowości próbki, która jest wprost proporcjonalna do jej pola 

powierzchni cząsteczkowej, a odwrotnie proporcjonalna do polarności (określonej 

np. przez moment dipolowy lub stałą dysocjacji). Oznacz to, że 

CPA ED , można odnieść do niskocząsteczkowych, polarnych związków, wymywanych 

w objętości martwej kolumny oraz niepolarnych dużych związków 

organicznych [29]. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

310 


0,6 

0,5 

0,4 

Sygnal [nA] 

1,9 

11,6 

0.0 V 

0,5 

0,4 

Sygnal [nA] 

3,6 

0.2 V 

0,3 

0,3 

2,1 

11,7 

0,2 

0,1 

0,2 

0,1 

15,7 

0,0 

czas [min] 

0 5 10 15 20 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

4 

3 

2 

1 

0 

Sygnal [nA] 

0.4 V 

5,2 

3,5 4,7 

2,1 2,5 

11,6 

15,6 

czas [min] 

0 5 10 15 20 

Sygnal [nA] 

8,5 

0.8 V 

5,2 

2,2 

3,8 

11,3 

13,1 

15 

czas [min] 

-1 

0 5 10 15 20 

0,0 

czas [min] 

0 5 10 15 20 

. 

4 

3 

2 

1 

0 

Sygnal [nA] 

0.6 V 

8,5 

5,2 

2,5 3,5 4,7 

11,4 13,1 14,9 

czas [min] 

0 5 10 15 20 

9 2,1 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

-1 

Sygnal [nA] 

1.0 V 

8,5 

1,9 5,2 

4,6 

3,8 

11,1 13,1 14,9 

czas [min] 

0 5 10 15 20 

Rys. 11. Chromatogramy miodu gryczanego (pasieka nr 3) o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają 

średnie ± SD z 3 niezależnych doświadczeń. Warunki chromatograficzne: 

kolumna Eurospher – C18 5 µm, 250 x 4 mm (Knauer), temp. 20ºC. Faza ruchoma: 

100 mM bufor fosforanowy (pH 6.6), szybkość przepływu 1 ml/min, detektor elektrochemiczny 

(E = 0,0 – 1,0 V vs Ag/AgCl). 

Fig. 11. HPLC chromatograms of the 1 mg/ml buckwheat honey. Chromatographic conditions: 

column – Eurospher C18 5 µm, 250x4 mm I.D. (Knauer), temp. – 20ºC, flow rate – 

1.0 ml/min, mobile phase – 100 mmol/l phosphate buffer (pH 6.6), electrochemical 

detector with the working electrode potential (E = 0,0 – 1,0 V vs Ag/AgCl). 

Z porównania chromatogramów przedstawionych na rysunku 11 wynika, 

że ze wzrostem potencjału następuje wzrost wysokości wszystkich pików 

chromatograficznych ale w różnych stopniu i startując od różnego potencjału. 

Wysokość piku chromatograficznego proporcjonalna jest do stężenia 

antyoksydantu, zaś potencjał jego utleniania do mocy antyoksydacyjnej. Piki 

chromatograficzne dające sygnał przy czasie retencji 3,6, 11,7, 15,7 minuty, 



311 

pochodzą od silniejszych antyoksydantów, których stężenie (jak można sądzić 

po wysokości piku) jest niższe, aniżeli stężenie antyoksydantów pojawiających 

się w dalszych potencjałach. Z kolei piki pojawiające się przy potencjale 

0,4 i 0,6 V (o czasie retencji 5,2 i 8,5 minuty) charakteryzują się 

słabszą mocą antyoksydacyjną, ale występują prawdopodobnie w większym 

stężeniu. 

Miarą całkowitego potencjału antyoksydacyjnego jest sumaryczne pole 

powierzchni wszystkich zarejestrowanych pików. Jest to wielkość sumaryczna 

(w pewnym sensie uśredniona) w stosunku do wszystkich pików zarejestrowanych 

na chromatogramie. Pozwala ona śledzić CPA różnych klas 

związków, zarówno nisko- jaki wysokocząsteczkowych (rys. 12). Czasy retencji 

w pobliżu objętości martwej kolumny do 5 minuty, prawdopodobnie 

odpowiadają retencji niskocząsteczkowych związków polarnych, najprawdopodobniej 

nieorganicznych. 

Rys. 12. Zależność CPA ED 

od potencjału dla miodu gryczanego (pasieka nr 3) o stężeniu 

1 mg/ml. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 11. 

Fig. 12. Dependence of CPA ED on the potential, obtained for 1 mg/ml buckwheat honey from 

apiary No 1. Chromatographic conditions as on figure 11. 

Optymalną wartością wybraną do oznaczeń był potencjał równy 0,8 V, 

ponieważ w wyższym potencjale nie zaobserwowano dodatkowych sygnałów 

elektrochemicznych (pochodzących ewentualnie od słabszych antyoksydantów), 

a jedynie wzrost całkowitego pola powierzchni. Dodatkowo w potencjale 

powyżej 1,0 V dochodzi do rozkładu wody na elektrodzie węglowej, 

co uniemożliwia dokładny pomiar CPA ED . 

CPA ED zależny jest od potencjału elektrody pracującej. Przy potencjałach 

z obszaru granicznego prądu dyfuzyjnego należałoby oczekiwać jego 

korelacji z oddziaływaniem próbki z silnymi rodnikami, np. hydroksylowymi 

(porównaj rysunki 7 i 13). 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

312 


Wartości CPA ED miodów pitnych (rysunek 13) są dużo mniejsze aniżeli 

czystych miodów. Spowodowane to jest oczywiście znacznym rozcieńczeniem 

miodów pitnych. W przypadku CPA obserwuje się raczej wyższą jego 

wartość dla miodów pitnych (rysunek 7) niż dla miodów nektarowych (rysunek 

6). W tym przypadku rozcieńczenie miodów pitnych niwelowane jest 

powstawaniem etanolu w procesie fermentacji. Najniższe stężenie alkoholu 

etylowego jest w czwórniaku (11%), zaś najwyższe w półtoraku (16%). Na 

rysunku 14 przedstawiono korelację pomiędzy CPA, CPA ED a procentową 

zawartością etanolu. 

Rys. 13. CPA ED miodów pitnych o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają średnie ± SD z 3 

niezależnych doświadczeń. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 11. 

Fig. 13. TAP ED values of various meads (final concentration 1 mg/ml). Data are presented 

as means from 3 independent experiments ± SD. Chromatographic conditions as on 

figure 11. 

... 

Rys. 14. Korelacja między CPA, CPA ED i stężeniem etanolu w miodach pitnych z rysunku 13. 

Fig. 14. Correlation between CPA, CPA ED and concentration of ethanol, in meads from figure 13. 



313 

Jak sugerują dane literaturowe [14, 15] właściwości antyoksydacyjne ziołomiodów 

również skorelowane są z ich zabarwieniem. Ziołomiody zielono-żółte 

(pokrzywowy, aloesowy), czerwone (aroniowy), powinny charakteryzować się 

większą zdolnością antyoksydacyjną aniżeli miody jasne. O ile takie założenia 

potwierdzają badania CPA (rysunek 10), to pomiar CPA ED kształtuje szereg antyoksydacyjny 

ziołomiodów w innej kolejności (rysunek 15). Może to być spowodowane 

występowaniem związków nieorganicznych dających sygnał elektrochemiczny 

lecz nie reagujących z rodnikiem hydroksylowym. 

500 

450 

CPA 

DE 

[nAs] 

400 

100 

50 

0 

z pylkiem 

z propolisem 

sosnowy 

aloesowy 

aroniowy 

pokrzywowy 

glogowy 

Rys. 15. CPA ED ziołomiodów o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają średnie ± SD z 3 niezależnych 

doświadczeń. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 11. 

Fig. 15. TAP ED values of the different herb honeys (final concentration - 1 mg/ml). Data are 

presented as means from 3 independent experiments ± SD. Chromatographic conditions 

as on figure 11. 

Duża wartość CPA ED ziołomiodu z pyłkiem jest związana z występowaniem 

piku chromatograficznego przy czasie retencji 3,3 minuty, który stanowi 

75,5% całkowitego pola powierzchni. Prawdopodobnie pik ten nie pochodzi 

od jednego związku, a jest wynikiem słabego rozdziału chromatograficznego 

kilku różnych związków o podobnym czasie retencji (rysunek 16). 

Właściwości antyoksydacyjne miodu w dużej mierze zależą od położenia 

geograficznego, a co za tym idzie, także i od warunków klimatycznych, 

w których jest on wytwarzany przez pszczoły. 

Wyższe właściwości antyoksydacyjne miodu obserwowane są w strefach 

klimatu ciepłego. Warunki klimatyczne Polski nie stwarzają najlepszych 

warunków do produkcji miodu, ponieważ Polska leży w strefie klimatu umiarkowanego 

chłodnego. W ciągu roku znacznie więcej jest dni zimnych niż 

ciepłych. Z kolei większość dni ciepłych jest pochmurnych lub deszczowych. 

Okres, na jaki przypada produkcja miodu przez pszczoły obejmuje miesiące 

od kwietnia do października. Na rysunku 17 przedstawiono wartość CPA 

miodów z różnych rejonów kraju z zaznaczeniem rozkładu średnich temperatur 

od czerwca do sierpnia. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

314 


Rys. 16. Chromatogram miodu z pyłkiem o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają średnie 

±SD z 3 niezależnych doświadczeń. Warunki chromatograficzne jak na rysunku 11. 

Fig. 16. HPLC chromatogram of the 1 mg/ml pollen honey. Data are presented as means from 

3 independent experiments ± SD. Chromatographic conditions as on figure 11. 

Rys. 17. 

Fig. 17. 

Mapa Polski z zaznaczonym rozkładem średnich temperatur od czerwca do sierpnia 

i wartościami CPA miodów 

Map of Poland with the average temperatures (June to August) and CPAs of honeys 

Miody pochodzące ze wschodniej części Polski, gdzie temperatury na 

przełomie czerwca – sierpnia są większe aniżeli temperatury na północnej 



315 

i południowej części Polski, charakteryzują się większymi wartościami CPA, 

które dokładnie podano w tabeli 3. Zależność tą doskonale widać na przykładzie 

miodu lipowego i spadziowego. W pracy przebadano również miód 

wielokwiatowy pochodzący z południowej części Włoch. Wartość jego całkowitego 

potencjału antyoksydacyjnego jest wyższa (CPA = 13,1 GAE) 

w porównaniu do miodów polskich (średnia wartość CPA dla miodu wielokwiatowego 

to 11,2 GAE), co najprawdopodobniej uwarunkowane jest cieplejszym 

klimatem tamtego regionu. 

Tabela 3. CPA miodów o stężeniu 1 mg/ml. Wyniki przedstawiają średnie ± 

SD z 3 niezależnych doświadczeń. Warunki chromatograficzne 

jak na rys. 1 

Table 3. TAPs of 1 mg/ml honeys. The data represent means ± SD of 3 

independent experiments 

miód 

CPA [GAE] 

województwo 

gryczany spadziowy lipowy wielokwiatowy akacjowy 

Małopolskie 7,8 6,9 6,5 4,6 3,9 

Podlaskie – 9,6 9,9 6,3 9,0 

Lubelskie 7,6 – 9,2 5,7 4,6 

Zach.-Pom. 3,6 8,4 – – 6,8 

War.-Maz. – 8,6 7,8 4,7 – 

Mazowieckie – – 10,7 9,1 – 

Dolnośląskie 6,7 6,6 – – 5,8 

Lubelskie – – 6,4 7,1 – 

Mazowieckie 7,2 – 9,2 – 4,2 

Włochy – – – 13,1 – 

Poza wpływem temperatury powietrza na wartość CPA rozpatrywanych 

miodów, duży wkład w te wartości ma również bogata szata roślinna 

oraz uprzemysłowienie danych regionów. Brak wyraźnego rozwoju przemysłu 

w regionach województwa podlaskiego i mazowieckiego, a co za tym 

idzie, brak znacznego zanieczyszczenia powietrza oraz duże zróżnicowanie 

gatunkowe roślin tych regionów przekłada się na wzrost wartości CPA badanych 

miodów. Średnia wartość CPA miodów dla województwa podlaskiego 

wynosi 8,7, zaś dla mazowieckiego 7,7 GAE. W regionach uprzemysłowionych 

wartość ta spada do 6,3 GAE (województwo dolnośląskie). 

4. Wnioski 

(Conclusions) 

1. Pomiar CPA ED umożliwia oznaczanie antyoksydantów o różnej mocy 

z uwzględnieniem podziału (w oparciu o czas retencji) na nisko- i wysokocząsteczkowe. 

2. Dla miodów pitnych znaleziono liniową korelację pomiędzy CPA odniesionym 

do rodnika hydroksylowego i mierzonym na detektorze 

elektrochemicznym. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

316 


3. Istnieje korelacja pomiędzy CPA, a stanem skupienia i barwą miodu. 

Miody krystaliczne i ciemne charakteryzują się większymi wartościami 

CPA aniżeli miody jasne, płynne. 

4. Wartości CPA miodów i miodów pitnych w dużej mierze zależą od zawartości 

w nich związków polifenolowych. Zaobserwowano liniowy 

wzrost wartości CPA wraz ze wzrostem zawartości polifenoli. 

5. Właściwości antyoksydacyjne miodu pitnego uzależnione są od stosunku 

miodu do wody w brzeczce. Im większy jest udział miodu do 

wody, tym większe są jego wartości CPA. 

6. Ze wzrostem procentowej zawartości etanolu następuje wzrost wartości 

CPA miodów pitnych. 

7. Większymi właściwościami antyoksydacyjnymi charakteryzują się 

miody pochodzące zewschodnich regionów Polski. 

5. Literatura 

(Literature) 

1. A. Gendźwił, Reaktywne formy tlenu i hiporeaktywność naczyń we 

wstrząsie septycznym. Część I – Reaktywne formy tlenu i hiporeaktywność 

naczyń, Pol. Merk. Lek., XXIII, 136(2007)280. 

2. M. Gajewski, E. Kamińska, Ł. Wysocki, Sz. Szczepanik, G. Sygitowicz, 

M. Wojciechowski, J. Pachecka, S. Maśliński, Gospodarka tlenowa 

w organizmie. Część I. Warunki normy fizjologicznej, Życie Weterynaryjne, 

80(2005)380. 

3. S. Ziemlański, M. Wartanowicz, Rola antyoksydantów żywieniowych 

w stanie zdrowia i choroby, Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, 

Hepatologia i Żywienie Dziecka, 1(1997)97. 

4. F.Ch. Cheng, J.F. Jen, T.H. Tsai, Hydroxyl radical in living systems and 

its separation methods, J. Chromatogr. B, 781(2002)481. 

5. M. Valko, C.J. Rhodes, J. Moncol, M. Izakovic, M. Mazur, Free radicals 

metals and antioxidants in oxidative stress – induced cancer, Chem. 

Biol. Interac., 160(2006)1. 

6. B.K. Głód, E. Olszewska, P. Piszcz, Wolne rodniki a stres oksydacyjny, 

Tłuszcze Jadalne, 41(2006)254. 

7. B.R. D’Arcy, Antioxidants in Australian Floral Honeys – Identification of 

health-enhancing nutrient components, Australian Government, RIRDC, 

05/40(2005)1. 

8. R.J. Weston, The contribution of catalase and other natural products to 

the antibacterial activity of honey: a review, Food Chem., 71(2000)235. 

9. I.M. Emens, A different and safe method of split thickness skin graft 

fixation: Medicinal honey application, Burns, 33(2007)782. 

10. V. Baltrušaityté, P.R. Venskutonis, V. Čeksteryté, Radical scavenging 

activity of different floral origin honey and beebread phenolic extracts, 

Food Chem., 101(2007)502. 

11. G. Beretta, P. Granata, M. Ferrero, M. Orioli, R.M. Facino, Standarization 

of antioxidant properties of honey by a combination of spectropho- 



317 

tometric/fluorometric assays and chemometrics, Anal. Chim. Acta, 

533(2005)185. 

12. R. Socha, L. Juszczak, S. Pietrzyk, T. Fortuna, Antioxidant activity and 

phenolic composition of herbhoneys, Food Chem., 113(2009)568. 

13. J. Lachman, D. Kolihová, D. Miholová, J. Košata, D. Titěra, K. Kult, 

Analysis of minority honey components: Possible use for the evaluation 

of honey quality, Food Chem., 101(2007)973. 

14. L. Juszczak, R. Socha, J. Różnowski, T. Fortuna, K. Nalepka, Physicochemicals 

properties and quality parameters of herbhoneys, Food 

Chem., 113(2009)538. 

15. R. Socha, L. Juszczak, S. Pietrzyk, T. Fortuna, Antioxidant activity and 

phenolic composition of herbhoneys, Food Chem., 113(2009)568. 

16. J. Rogala, Miody pitne, czyli jak w domowych warunkach najstarszy 

polski trunek przysposobić, Wydawnictwo Baobab, Warszawa 2005. 

17. A. Gałuszka, Miody pitne, krupniki i piwa miodowe, Wydawnictwo Prószyński 

i S-ka, Warszawa 2006. 

18. Dz.U. Nr 272, poz. 2696, 2004. 

19. Dz.U. L 93 z 31.03.2006, str. 1. 

20. Dz.U. L 93 z 31.03.2006r., str. 12, z późn. zm. 

21. J.F. Cotte, H. Casabianca, S. Chardon, J. Lheritier, M.F. Grenier- 

Loustalot, Application of carbohydrate analysis to verify honey authenticity, 

J. Chromatogr. A, 1021(2003)145. 

22. M. Zappalá, B. Fallico, E. Arena, A. Verzera, Methods for the detremination 

of HMF in honey: a comparision, Food Control, 16(2005)273. 

23. Y.L. Hu, Y. Lu, G.J. Zhou, X.H. Xia, A simple electrochemical method 

for the determination of hydroxyl free radicals without separation process, 

Talanta, 74(2008)760. 

24. B.K. Głód, P. Grieb, Modified Analytical Method for Hydroxyl Radicals 

Using Spin Trapping and Ion Exclusion Chromatography, Chem. Anal. 

47(2002)399. 

25. B.K. Głód, E. Olszewska, P. Piszcz, Całkowity potencjał antyoksydacyjny: 

jego oznaczanie oraz zastosowanie w badaniach biomedycznych, 

Tłuszcze Jadalne, 41(2006)264. 

26. C. Peri, G. Pompei, An assay of different phenolic fractions in wines, 

Am. J. Enol. Vitic., 22(1971)55. 

27. B. Kędzia, E. Hołderna-Kędzia, Występowanie związków fenolowych 

w miodzie pszczelim, 4, 225-232, Wydawnictwo Medyczne Borgis, 

Warszawa 2008. 

28. M. Liviu Al, D. Daniel, A. Moise, O. Bobis, L. Laslo, S. Bogdanov, Physico-chemical 

and bioactive properties of different floral origin honeys 

from Romania, Food Chem., 112(2009)863. 

29. M. Skwarek, Praca magisterska, „Mechanizm retencji kwasów karboksylowych 

na różnych kolumnach HPLC”, Retention Mechanism of Carboxylic 

Acids on a Different HPLC Columns, Akademia Podlaska, 

Siedlce 2008. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

318 





Anita SKRZYPCZAK, Marian KAMIŃSKI * 

Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, 

Politechnika Gdańska, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-233 Gdańsk, 

e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl* 

Nowa metoda rozdzielania składników oraz oznaczania 

kumaryny w napojach alkoholowych i w maceratach 

z turówki wonnej (hierochloe odorata) z wykorzystaniem 

RP-HPLC i przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie 

New method of separation of components and the determination 

of the coumarin in alcoholic beverages and a sweet grass 

(hierochloe odorata) macerates using RP-HPLC and reverse 

flow of an eluent in the column (backflush) 

Streszczenie: Kumaryna (1,2-benzopiron) jest naturalną substancją występującą w roślinach 

stosowanych jako dodatki smakowe i aromatyczne do napojów alkoholowych. W wyniku pojawienia 

się doniesień o toksyczności kumaryny, ograniczono wykorzystanie ekstraktów roślinnych 

zawierających ją jako dodatek do żywności i napojów. Ustalono, że maksymalny poziom 

zawartości kumaryny, bezpieczny dla ludzi w żywności i napojach bezalkoholowych, wynosi 

2 mg/kg, a w napojach alkoholowych wynosi 10 mg/kg. Biorąc pod uwagę powyższe, niezwykle 

ważne jest dysponowanie szybką i selektywną metodą oznaczania zawartości kumaryny zarówno 

w napojach alkoholowych, jak i w maceratach turówki wonnej, stosowanych do produkcji 

smakowych napojów alkoholowych. Praca prezentuje wyniki badań nad warunkami rozdzielania 

i oznaczania kumaryny w napojach alkoholowych i maceratach z turówki wonnej wykorzystywanych 

do produkcji wódek ziołowych. Warunki analityczne dobrano w ten sposób, by zapewnić 

optymalną selektywność rozdzielania w jak najkrótszym czasie. W tym celu zastosowano odwrócony 

układ faz RP-HPLC oraz detektor UV-DAD. 

Słowa kluczowe: kumaryna, 1,2-benzopiron, Hierochloe odorata, odwrócony układ faz wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej RP-HPLC, przepływ zwrotny eluentu w kolumnie 

Abstract: The Coumarin (1.2 benzopiron) is a natural substance occurring in plants which is used as 

a flavor and an aroma of alcoholic beverages. As a result of reports concerning toxicity of the coumarin, 

the use of the plants extracts, which were food and beverages additives is reduced. It was established 

that the maximum content of coumarin, safe for human use in food and soft drinks is 2 mg/kg, 

in alcoholic drinks is 10 mg/kg. Given the above, it is very important to possess a rapid and selective 

method for the determination of coumarin in the flavoured alcoholic beverages, as well as macerates 

of Hierochloe odorata used to produce the alcoholic beverages. This paper presents results of research 

on the conditions of separation and determination of coumarin in alcoholic beverages and macerates 

of the sweet grass used for the production of herbal vodka. Analytical conditions were defined to 

ensure optimum selectivity of separation in the shortest possible time. For this purpose, the reversed 

phase RP-HPLC and UV-DAD detector, were used. 

Key words: coumarin, 1.2-benzopyrone, Hierochloe odorata, Reversed-Phase High Performance 

Liquid Chromatography RP-HPLC, reverse flow of an eluent in the column (backflush) 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

320 

A. Skrzypczak, M. Kamiński 

1. Wprowadzenie 


Kumaryna (1,2-benzopiron) o wzorze strukturalnym przedstawionym 

na rys. 1, posiada szczególne właściwości aromatyczne. Dawniej była powszechnie 

stosowana do aromatyzowania napojów, jednak po stwierdzeniu 

jej toksyczności ograniczono to zastosowanie [1, 2]. Ustalono, że maksymalny 

poziom zawartości kumaryny, bezpieczny dla ludzi w żywności i napojach 

bezalkoholowych, wynosi 2 mg/kg, a w napojach alkoholowych wynosi 

10 mg/kg [3, 4]. 

Stwierdzono, że kumaryna po przekroczeniu określonej dawki działa 

depresyjnie na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) oraz uszkadza narządy 

miąższowe przede wszystkim wątrobę. U ludzi poważne objawy zatrucia 

(bóle i zawroty głowy, nudności i wymioty) występują po zażyciu 3-4 g kumaryny, 

jednak już wielogodzinne wdychanie zapachu świeżego siana lub zbyt 

duże dawki napojów zawierających kumarynę mogą wywołać ból głowy 

i oszołomienie [1, 2]. 

Rys. 1. Wzór strukturalny kumaryny 

Fig.1. Structural formula of coumarin 

Wczesne metody analizy zawartości kumaryny w żywności oraz w innych 

produktach najczęściej opierały się na technice chromatografii bibułowej 

(PC) [5] oraz cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC) w normalnym 

układzie faz [6-11]. 

Obecnie najczęściej stosowaną techniką do oznaczenia jakościowego 

i ilościowego kumaryny jest chromatografia gazowa [15, 16, 20-22], wysokosprawna 

chromatografia cieczowa (HPLC) w odwróconym układzie faz z detektorem 

spektrofotometrycznym z matryca fotodiodową (UV-VIS typu DAD) 

lub ze spektrometrem mas (MS) [1, 10-20]. 

W badaniach zawartości kumaryny z zastosowaniem chromatografii 

gazowej wykorzystuje się detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID) [21] lub 

spektrometr mas (MS) [20, 22]. Najczęściej stosuje się kolumny kapilarne 

[20-22], a w zależności od stosowanego detektora stosuje się jako gaz nośny: 

azot [21] bądź hel [20, 22]. 

W metodach analizy kumaryny z zastosowaniem chromatografii cieczowej 

w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) najczęściej wykorzystywana 

jest faza stacjonarna modyfikowana łańcuchami oktadecylowymi (ODS), 

a jako składniki eluentu wykorzystuje się wodny roztwór octanu amonu oraz 

wodne mieszaniny metanolu bądź acetonitrylu z dodatkiem kwasu octowego 

bądź mrówkowego [1, 10-20]. 


Nowa metoda rozdzielania składników oraz oznaczania kumaryny w napojach alkoholowych… 

321 

W literaturze opisano wiele metod oznaczania kumaryny w żywności 

oraz innych produktach. Jednakże metody te, w odniesieniu do metodyki 

przedstawionej w niniejszej pracy, charakteryzują się wykorzystaniem droższej 

aparatury (HPLC-MS, GC-MS) bądź długim - ponad 30 minutowym czasem 

analizy (GC-MS, GC-FID), a w przypadku analizy maceratów wymagają 

wstępnego etapu przygotowania próbki (HPLC-MS, HPLC-DAD, GC-MS, 

GC-FID). 

2. Część doświadczalna 


Próbki 

(Samples) 

Próbki napojów alkoholowych zawierających ekstrakt Hierochloe odorata 

jak również macerat turówki wonnej (alk. 52% obj.) otrzymano od dwóch 

polskich producentów smakowych napojów alkoholowych. 

Odczynniki i materiały 

(Reagents and materials) 

Kumaryna o czystości ≥99% (do HPLC) (Sigma-Aldrich®, Niemcy), 

metanol do HPLC (Merck, Niemcy), woda dejonizowana otrzymana z urządzenia 

Milli Q produkcji Millipore (USA), kwas octowy cz.d.a. (Chempur, Polska). 

Aparatura 

(Apparatus) 

Chromatograf cieczowy LaChrom (Merck-Hitachi), wyposażony 

w czterokanałowy system elucji, pompę L-7100, degazer, zawór dozujący 

Rheodyne Rh-7125 z pętlą dozującą 20 µl, kolumnę chromatograficzną, detektor 

spektrofotometryczny UV-VIS-DAD 7450, oprogramowanie HSM oraz 

dodatkowo w sześciodrogowy dwupołożeniowy zawór Rheodyne Rh-7000, 

w celu wykonywania przepływu zwrotnego eluentu przez kolumnę. 

Parametry metody 

(Method parametres) 

Próbki napojów spirytusowych analizowane były w formie pierwotnej 

(bez rozcieńczania). Próbka maceratu trawy żubrowej została rozcieńczona 

w stosunku 1:3 za pomocą 52% etanolu, w celu zapewnienia liniowości odpowiedzi 

detektora. 

W badaniach zastosowano kolumnę LiChrospher® 100, RP18e, 5 μm, 

250 x 4 mm (Merck, Niemcy), temperatura kolumny 25°C. 

Rozdzielanie składników maceratu roślinnego Hierochloe odorata 

oraz smakowych napojów alkoholowych prowadzono w warunkach elucji 

izokratycznej, gdzie eluent stanowiła mieszanina metanolu z wodą w stosunku 

1:1 z dodatkiem kwasu octowego (pH 3,3). Przepływ wynosił 

1 ml/min, objętość dozowania wynosiła 20 µl. Po zakończeniu elucji kumary- 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

322 


ny z próbek maceratu przełączono kolumnę do trybu elucji wstecznej, w celu 

elucji wszystkich składników silnie oddziałujących z fazą stacjonarną. Długość 

fali, przy której prowadzono monitorowanie: 278 nm. 

Analizę jakościową oparto o porównanie widm w zakresie 210 do 

600 nm, w tym na określeniu długości fali maksimum widma piku z rozdzielania 

próbki napoju spirytusowego i próbki maceratu trawy żubrowej z widmem 

wzorca kumaryny, a także o porównanie czasu retencji lub współczynników 

retencji (k) odpowiedniego piku na chromatogramach próbek 

z wartością czasu retencji (współczynników retencji) substancji wzorcowej. 

Analizę ilościową dokonano metodą krzywej kalibracyjnej, w oparciu 

o sygnał detektora UV- VIS typu DAD. Wykonano dwie krzywe kalibracyjne, 

jedną dla próbki napoju spirytusowego (krzywa 4-punktowa) oraz drugą dla 

próbki maceratu trawy żubrowej (krzywa 4-punktowa). W celu sporządzenia 

krzywej kalibracyjnej dla próbek napoju spirytusowego przygotowano roztwory 

wzorcowe kumaryny w zakresie stężeń od 3,45 do 14,85 [mg kumaryny/dm 

3 , 40% etanolu]. W celu wykreślenia krzywej kalibracyjnej zawartości 

kumaryny dla maceratu trawy żubrowej przygotowano roztwory wzorcowe 

w zakresie stężeń od 198 do 660 [mg kumaryny/dm 3 , 52% etanolu]. 

Za granicę wykrywalności (LOD) oraz oznaczalności (LOQ) kumaryny, 

przyjęto zawartość w mg/dm 3 odpowiadającą pikowi, odpowiednio o wysokości 

3 krotności oraz 10-cio krotności poziomu szumów detektora. 



Warunki elucji opisane wcześniej pozwoliły na szybkie i selektywne 

rozdzielenie kumaryny od innych składników zawartych w smakowym napoju 

spirytusowym bądź w maceracie z trawy żubrowej. 

Czas retencji kumaryny w napoju spirytusowym wyniósł 5,85 min. (k = 1,95), 

a w maceracie trawy żubrowej wyniósł 5,88 (k = 1,97). Całkowity czas analizy 

napoju spirytusowego nie przekroczył 8-iu minut. Całkowity czas analizy 

maceratu Hierochloe odorata wraz z przepływem zwrotnym eluentu przez 

kolumnę i elucją w ten sposób składników o wysokiej retencji, nie przekroczył 

25 minut. 

Granica wykrywalności kumaryny dla opracowanej metody wynosi 

0,2 mg/L, a granica oznaczalności wyniosła 0,6 mg/L. 

Równanie krzywej kalibracyjnej dla kumaryny zawartej w napoju alkoholowym 

wynosiło y = 47158x + 9211,4, a współczynnik korelacji wyniósł 

0,999. Równanie krzywej kalibracyjnej dla kumaryny zawartej w maceracie 

wynosiło y = 45516x + 10 6 , a współczynnik korelacji wyniósł 0,998. Wartości 

pola powierzchni dla substancji wzorcowej oraz kumaryny w badanej próbce 

są wartościami średnimi dla co najmniej dwóch rezultatów nieróżniących się 

o więcej niż 5% względnych. 



323 

Tabela 1. Porównanie danych statystycznych metody oznaczania kumaryny 

w napoju alkoholowym oraz w maceracie Hierochloe odorata 

Table 1. Comparison of statistical data of determination of coumarin in the 

alcoholic beverage and the macerate of Hierochloe odorata 

Oznaczanie kumaryny 

w napoju alkoholowym 

Oznaczanie kumaryny 

w maceracie Hierochloe 

odorata 

Współczynnik korelacji R 2 0,999 0,998 

Względne odchylenie standardowe 

(% RSD dla n=5) 

0,3 0,9 

Granica oznaczalności LOQ [mg/L] 0,6 

Granica wykrywalności LOD [mg/L] 0,2 

Rys. 2. Chromatogram rozdzielania składników próbki smakowego napoju alkoholowego, uzyskany 

za pomocą detektora UV-DAD. Kolumna: LiChrospher® 100, RP18e, 5 μm, 

250 x 4 mm. Temperatura kolumny: 25°C. Przepływ: 1 ml/min. Eluent: MeOH-H 2 O 1:1 v/v, 

z dodatkiem CH 3 COOH (pH=3,3). Typ elucji: izokratyczna. Detektor: UV-DAD. Objętość 

dozowana: 20 µl. A – chromatogram przy długości fali- 278 nm, B – chromatogram 

w odwzorowaniu poziomicowym w zakresie od 210 nm do 600 nm. C – Widmo kumaryny 

uzyskane za pomocą detektora UV-DAD 

Fig. 2. Chromatogram of separation process of alcoholic beverage sample components produced 

by the UV-DAD detector. Column: LiChrospher® 100, RP18e, 5 μm, 250 x 4 mm. 

Column temperature: 25 o C. Flow: 1 ml/min. Eluent: MeOH-H 2 O 1:1 v/v, with addition of 

CH 3 COOH (pH=3,3). Type of elution: isocratic. Detector: UV-DAD. Sample injection volume: 

20 µl. A – chromatogram at a wavelength of - 278 nm, B – chromatogram in the 

leveling mapping in a range from 210 nm to 600 nm. C – Spectrum of coumarin produced 

by the UV-DAD detector 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

324 


Rys. 3. Chromatogram rozdzielania składników próbki maceratu z turówki wonnej, uzyskany za 

pomocą detektora UV-DAD. Kolumna: LiChrospher® 100, RP18e, 5 μm, 250 x 4 mm. 

Temperatura kolumny: 25 o C. Przepływ: 0,8 ml/min. Eluent: MeOH-H 2 O 1:1 v/v, z dodatkiem 

CH 3 COOH (pH=3,3). Typ elucji: izokratyczna. Detektor: UV-DAD. Objętość dozowana: 

20 µl. A – chromatogram przy długości fali- 278 nm, B – chromatogram w odwzorowaniu 

poziomicowym w zakresie od 210 nm do 600 nm. C – Widmo kumaryny 

uzyskane za pomocą detektora UV-DAD 

Fig. 3. Chromatogram of separation process of the sweet grass macerate sample components 

produced by the UV-DAD detector. Column: LiChrospher® 100, RP18e, 5 μm, 250 x 

4 mm. Column temperature: 25 o C. Flow: 0.8 ml/min. Eluent: MeOH-H 2 O 1:1 v/v, with 

addition of CH 3 COOH (pH=3,3). Type of elution: isocratic. Detector: UV-DAD. Sample 

injection volume: 20 µl. A – chromatogram at a wavelength of - 278 nm, B – chromatogram 

in the leveling mapping in a range from 210 nm to 600 nm. C – Spectrum of coumarin 

produced by the UV-DAD detector 

W tabeli 1 przedstawiono dane statystyczne opracowanej metody. Uzyskana 

powtarzalność wartości czasu retencji, współczynnika korelacji oraz 

względnego odchylenia standardowego %RSD (obliczonego dla 5 kolejnych 

dozowań próbki roztworu wzorcowego substancji badanej) zarówno dla kumaryny 

oznaczanej w smakowym napoju alkoholowym jak i maceracie Hierochloe 

odorata, świadczy o zadawalającej powtarzalności opracowanej metody. 

Na rys. 2 i 3 przedstawiono odpowiednio przykłady chromatogramów 

dla próbki napoju spirytusowego oraz maceratu trawy żubrowej. 



325 

Istotną zaletą metodyki zastosowanej w niniejszej pracy jest wykorzystanie 

przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie. Co szczególnie dla próbek 

maceratu z turówki wonnej zapewnia bardzo dobrą powtarzalność parametrów 

retencji i umożliwia nie stosowanie kolumn ochronnych, jak również 

wstępnego przygotowania próbki z zastosowaniem techniki ekstrakcji do fazy 

stałej (SPE ang. Solid Phase Extraction). 

4. Wnioski 

(Conclusions) 

Opisana w literaturze technika oznaczania kumaryny w żywności [15] 

z zastosowaniem HPLC-MS/MS charakteryzuje się ok. 10 krotnie niższą 

granicą wykrywalności i oznaczalności od metodyki opisanej w niniejszej 

pracy. Należy jednakże wziąć pod uwagę, iż koszty aparatury są wielokrotnie 

wyższe w przypadku HPLC-MS/MS niż w przypadku HPLC-DAD. Ponadto, 

autorzy publikacji [15] porównali i stwierdzili, że współczynnik zmienności 

(względne odchylenie standardowe) dla techniki HPLC- MS/MS jest większy 

niż dla techniki HPLC-DAD, co powoduje, że powtarzalność oznaczania kumaryny 

z zastosowaniem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią 

mas jest znacząco mniejsza. 

Biorąc pod uwagę, iż w badanych próbkach smakowych napojów alkoholowych 

stężenie kumaryny nigdy nie było niższe niż 4 mg/L, można stwierdzić, 

że przedstawiona w niniejszym artykule metoda jest w pełni przydatna do 

kontroli zawartości kumaryny w napojach alkoholowych, a także w maceratach 

trawy żubrowej. 

Zastosowanie przepływu zwrotnego podczas analiz maceratu z turówki 

wonnej pozwoliło na ominięcie etapu wstępnego oczyszczania próbki np. 

techniką ekstrakcji do fazy stałej (SPE), co pozwoliło na skrócenie całkowitego 

etapu badania próbki, a także zapewnia całkowite usunięcie z kolumny 

związków silnie oddziałujących z fazą stacjonarną, co zapewnia powtarzalność 

wyników oznaczania i długi „czas życia” kolumny. 

Opracowana metodyka powinna być także przydatna do badania zawartości 

kumaryny w żywności, po zastosowaniu odpowiedniej metody ekstrakcji/ługowania 

opisanej w literaturze np. w pracy [1]. 


(Acknowledgments) 


Wyższego w ramach grantu promotorskiego Nr N N405 3757 37. 



pn. "InnoDoktorant - stypendia dla doktorantów, II edycja. 

Podziękowania Pani dr Bogumile Makuch za przekazane informacje 

będące pomoce w redagowaniu niniejszej pracy. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

326 


Literatura 

(Literature) 

1. C. Sproll, Winfried Ruge, Claudia Andlauer, Rolf Godelmann, Dirk 

W. Lachenmeier., HPLC analysis and safety assessment of coumarin in 

foods, Food Chem., 109(2008)462. 

2. B.G. Lake, Coumarin metabolism, toxicity and carcinogenicity: relevance 

for human risk assessment, Food Chem. Toxicol., 37(1999)423. 

3. Codex alimentarius (1985). General requirements for natural flavourings 

(CAC/GL 29.1987), www.codexalimentarius.net. 

4. European Parliament and Council (2006). Proposal for a Regulation of 

the European Parliament and of the Council on flavourings and certain 

food ingredients with flavouring properties for use in and on foods. 

http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/additives/com2006_427_e 

n.pdf. 

5. C.V. van Sumere, G. Wolf, H. Teuchy, J. Kint, A new thin-layer method 

for phenolic substances and coumarins, J. Chromatogr., 20(1965)48. 

6. M. Runkel, M. Tegtmeier, W. Legrum, Metabolic and analytical interactions 

of grapefruit juice and 1,2-benzopyrone (coumarin) in man, Eur. 

J. Clin. Pharmacol., 50(1996)225. 

7. J. Sherma, S.L. Schafer, K. Morris, Determination of coumarin in vanilla 

flavorings by quantitative high performance thin layer chromatography, 

J. Liq. Chromatogr., 10(1987)3585. 

8. W. Cisowski, E. Pałka-Gudyka, M. Krauze-Baranowska, Z. Królicki Preparative 

TLC of coumarins with gradient elution, J. Planar Chromatogr., 

4(1991)471. 

9. M.J. Cikalo, S.K. Poole, C.F. Poole. A thin layer chromatographic method 

for establishing the botanical origin of the cinnamons of commerce, 

J. Planar Chromatogr., 5(1992)135. 

10. R.M.S. Celeghini, J.H.Y. Vilegas, F.M. Lanças, Extraction and quantitative 

HPLC analysis of coumarin in hydroalcoholic extracts of Mikania 

glomerata spreng (“guaco”) leaves, J. Braz. Chem. Soc., 

12(6)(2001)706. 

11. D.P. Bogan, G.J. Keating, H. Reinartz, C.F. Duffy, M.R. Smyth, 

R. O’Kennedy, Analysis of coumarins. In R.O’Kennedy & R.D. Thorens 

(Eds.), Coumarins. biology applications and mode of action (pp. 267– 

–302). Chichers, UK: John Wiley & Sons. 

12. K. Sagara, T. Oshima; T. Yoshida, Determination of Cinnamomi Cortex 

by high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr., 

409(1987)365. 

13. A.W. Archer, Determination of cinnamaldehyde, coumarin and cinnamyl 

alcohol in cinnamon and cassia by high-performance liquid chromatography, 

J. Chromatogr. A, 447(1988)272. 

14. A. Bettero, C.A. Benassi, Determination of coumarin and 

6-methylcoumarin in cosmetics by high-performance liquid chromatography, 

J. Pharm. Biom. Anal., 1(2)(1983)229. 



327 

15. M. Raters, R. Matissek, Analysis of coumarin in various foodsusing liquid 

chromatography with tandem masss pectrometric detection, Eur. 

Food Res. Technol., 227(2008)637. 

16. L.S. de Jager, G.A. Perfetti, G.W. Diachenko, Determination of coumarin, 

vanillin, and ethyl vanillin in vanilla extract products: liquid chromatography 

mass spectrometry method development and validation studies, 

J. Chromatogr. A, 1145(1)(2007)83. 

17. F. Grundschober, Zeitschrieftfur Lebensmittel- Untersuchung und 

– Forschung, 204(1997)399. 

18. Z.D. He, C.F. Qiao, Q.B. Han, C.L. Cheng, H.X. Xu, R.W. Jiang, Authentication 

and quantitative analysis on the chemical profile of cassia 

bark (cortex cinnamomi) by high-pressure liquid chromatography, 

J. Agric. Food Chem., 53(7)(2005)2424. 

19. M.H. Huang, S.J. Sheu, Determination of Cinnamomi constituents by 

high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis, 

J. High Resolut. Chromatogr., 23(9)(2000)561. 

20. Z. Yang, T. Kinoshita, A. Tanida, H. Sayama, A. Morita, N. Watanabe, 

Analysis of coumarin and its glycosidically bound precursor in Japanese 

green tea having sweet-herbaceous odour, Food Chem., 114(2009)289. 

21. A.A. Rahim, B. Saad, H. Osman, N.H. Hashim, S. Yahya, K. Md Talib 

Simultaneous determination of diethylene glycol, diethylene glycol monoethyl 

ether, coumarin and caffeine in food items by gas chromatography, 

Food Chem., 126(3)(2011)1412. 

22. S.B. Stanfill, A.M. Calafat, C.R. Brown, G.M. Polzin, J.M. Chiang, 

C.H. Watson, D.L. Ashley, Concentrations of nine alkenylbenzenes, 

coumarin, piperonal and pulegone in Indian bidi cigarette tobacco, Food 

Chem. Toxicol., 41(2003)303. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

328 





Kamil CZECH 1,2 , Piotr M. SŁOMKIEWICZ 1,2* 

1 

Zakład Fizyki Chemicznej, Instytut Chemii, Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach, 

ul. Świętokrzyska 15 G, 25-406 Kielce 

2 

Laboratorium Badań Strukturalnych, Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach, 

ul. Świętokrzyska 15 G, 25-406 Kielce 

* 

e-mail:piotres@ujk.edu.pl 

Zastosowanie pakietów oprogramowania komputerowego 

do wyznaczania izoterm adsorpcji metodą inwersyjnej 

chromatografii gazowej 

The use of computer software modules to determination 

the adsorption isotherms by the inwerse gas chromatography 

Streszczenie: W artykule opisano metodę opracowania danych pomiarowych za pomocą pakietu 

programów komputerowych do wyznaczania izoterm adsorpcji metodą inwersyjnej chromatografii 

gazowej. Obliczenia zademonstrowano na przykładzie wyznaczania izotermy adsorpcji 

o-ksylenu na sorbencie haloizytowym. 

Słowa kluczowe: inwersyjna chromatografia gazowa, oprogramowanie, o-ksylen, haloizyt 

Abstract: In this article the method of study of measuring data with use the computer software 

modules to determination the adsorption isotherms was described. An example of the calculations 

the experiment data of adsorption o-xylene on halloysite sorbent was demonstrated. 

Key Words: inversegas chromatography, software, o-xylene, halloysite 

1. Wstęp 


Do pomiarów adsorpcji często wykorzystuje się metody inwersyjnej 

chromatografii gazowej. Pomiary adsorpcji, wykonywane za pomocą tej metody, 

polegają na wprowadzeniu próbki adsorbatu na adsorbent umieszczony 

w kolumnie chromatograficznej i analizie otrzymanego chromatogramu. 

Na podstawie wielkości charakterystycznych dla położenia i kształtu profilu 

piku chromatograficznego można obliczyć fizykochemiczne parametry procesu 

adsorpcji. Zwykle do pomiaru wykonywanego metodą inwersyjnej 

chromatografii gazowej używa się typowego chromatografu gazowego wyposażonego 

w dozownik, kolumnę zawierającą adsorbent oraz detektor. Natomiast 

jest mało użyteczne standardowe oprogramowanie dostarczane 

przez producentów chromatografów do rejestracji opracowania wyników 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

330 

K. Czech, P.M. Słomkiewicz 

pomiarów inwersyjnej chromatografii gazowej. Oprócz pomiaru czasu retencji 

piku chromatograficznego oraz obliczania jego powierzchni, jakie umożliwia 

standardowe oprogramowanie, jest konieczne wykonywanie innych operacji 

jak np. określanie kształtu piku, możliwość nakładania na siebie kilku 

pików. Do wyznaczania izoterm adsorpcji można stosować metodę podziału 

piku zaliczaną do metod inwersyjnej chromatografii gazowej. Wymaga ona 

podzielenia piku na segmenty. Do takiego podziału można zastosować program 

KSPD (Komputerowy Program Przetwarzania Danych) [1]. Program 

ten nie posiada funkcji, które umożliwiałyby zaawansowane opracowanie 

wyników. Do tego celu niezbędne jest zastosowanie tzw. Pakietu programów 

komputerowych. Pakietem nazywamy zestaw programów, które umożliwiają 

obróbkę danych liczbowych, kompatybilnych pomiędzy sobą, a równocześnie 

umożliwiają jednostkowe wykonywanie operacji z tymi danymi. Dane 

przenoszone pomiędzy programami z pakietu mogą być przetwarzane przez 

program za pomocą operacji, których nie posiada inny z programów pakietu. 

Rys. 1. Schemat opracowania danych chromatograficznych za pomocą programu KSPD, Excel 

i Origin 

Fig. 1. The scheme elaborate of chromatographic data by the KSPD, Excel and the Origin software 


Zastosowanie pakietów oprogramowania komputerowego do wyznaczania izoterm adsorpcji… 

331 

Schemat ideowy opracowania danych chromatograficznych do wyznaczenia 

izoterm adsorpcji metodą inwersyjnej chromatografii gazowej przedstawiono 

na rysunku 1. Program KSPD służy do rejestracji i wyznaczania parametrów 

podziału piku chromatograficznego. Następnie obliczenia fizykochemiczne 

są wykonywane przez program Excel. Program Origin służy do określania 

postaci równania izotermy adsorpcji i wyznaczania charakteryzujących ją 

wielkości. Ten program umożliwia także sprawdzanie zgodności różnych 

równań izoterm adsorpcji w wynikami pomiarów adsorpcyjnych. 

W niniejszym artykule przedstawiono metodę obliczenia izotermy adsorpcji 

o-ksylenu metodą inwersyjnej chromatografii gazowej z użyciem pakietu 

składającego się z KSPD, Excela i Origina. 

2. Wyznaczanie izoterm adsorpcji metodą podziału piku 

(The determination of adsorption isotherms 

by profile peak method) 

Metodę obliczania wielkości adsorpcji i ciśnienia parcjalnego adsorbatów 

opisaną w pracy [2] przystosowano do komputerowej metody określania 

powierzchni piku chromatograficznego [3]. 

Na podstawie wielkości powierzchni piku chromatograficznego i powierzchni 

adsorpcyjnej określanej, jako pole utworzone na chromatografie 

przez moment od wprowadzenia próbki do kolumny adsorbatu do rozciągniętej 

linii schodzenia piku (rys. 2), wyznacza się dla każdego punktu izotermy 

ilość zaadsorbowanej substancji oraz odpowiadające jej równowagowe 

ciśnienie parcjalne w ruchomej fazie gazowej. Powierzchnię adsorpcyjną 

dzieli się na i - części równoległych do linii podstawowej (segmenty). 

Powierzchnie poszczególnych segmentów spełniają zależność: 

I 

S s 

S Is 

(1) 

1 

gdzie: 

S S – całkowita powierzchnia adsorpcyjna [mVs], 

S Is – powierzchnia segmentu I całkowitej powierzchni adsorpcyjnej. 

Wielkość adsorpcji a iI substancji i może być obliczona na podstawie równania: 

a 

iI 

n 

I 

 

 

1 

mS 

S 

p 

Is 

(2) 

gdzie: 

n – ilość moli dozowanego adsorbatu [mol], 

S p – całkowita powierzchnia piku adsorpcyjnego [mVs], 

m – masa adsorbenta [g]. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

332 


Odpowiadające wielkości adsorpcji a iI substancji i ciśnienie parcjalne p iI jest 

obliczone przez podzielenie wysokości piku chromatograficznego na I części 

(rys. 2) zgodnie z równaniem: 

I 

h h I 

1 

gdzie: 

h – wysokość piku [mV], 

h I – wysokość I części piku [mV]. 

Równowagowe ciśnienia oblicza się z równania: 

(3) 

p 

iI 

I 

 

n hI 

 

1 

RT 

FS 

(4) 

p 

F – wielkość przepływu gazu nośnego [cm 3 /s], 

T – temperatura [K], 

R – stała gazowa. 

Dla ilustracji sposobu obliczania zastosowano równanie izotermy Langmuira, 

które użyto w pracy [4] do wyrażenia izotermy adsorpcji benzenu na sorbencie 

haloizytowym. 

Funkcję izotermy adsorpcji wyrażono za pomocą równania Langmuira: 

a 

a 

A 

S 

r b 

1 

K 

 

 

n 

A 

pA 

n 

A 

pA 

K 

(5) 

gdzie: 

a A – masa adsorbatu [g], 

a s – masa adsorbentu [g], 

r – stopień pokrycia, 

K A – stała równowagi adsorpcji adsorbatu [kPa -1 ], 

p A – ciśnienie parcjalne adsorbatu A [Pa], 

n – współczynnik potęgowy (bezwymiarowy), 

b – współczynnik proporcjonalności (bezwymiarowy). 



333 

Rys. 2. Ilustracja sposobu podziału chromatogramu do wyznaczania izoterm adsorpcji metodą 

podziału piku 

(a) dzielenie całkowitej powierzchni adsorpcyjnej S s na segmenty, gdzie S Is oznacza 

powierzchnię segmentu I, 

(b) dzielenie całkowitej wysokości h piku adsorpcyjnego na segmenty, gdzie h i oznacza 

wysokość segmentu 

Fig. 2. (The method of dividing profile of chromatographic used for peak determination of adsorption 

isotherms by profile peak method; 

(a)the divison of total adsorption area S s for segments, where S Is is the part l of adsorption 

area, 

(b)the divison of total height of adsorption peak h for segments, where h i is the part of 

height of adsorption peak) 

3. Program komputerowy system przetwarzania danych 

(The computer programme system of processing of data) 

Program Komputerowy System Przetwarzania Danych KSPD [1] jest 

programem przeznaczonym do obróbki danych chromatograficznych. W jego 

skład wchodzi dwukanałowy przetwornik analogowo-cyfrowy, program rejestracji 

sygnałów z przetwornika, którego zadaniem jest również podstawowa 

obróbka danych zarejestrowanych procesów oraz baza danych. 

Przetwornik analogowo-cyfrowy jest urządzeniem znajdującym się na zewnątrz 

komputera, wykorzystującym szeregowe łącze RS 232 do przesyłania 

danych. Program KSPD pracuje w środowisku Windows. Źródło programu 

zostało napisane w języku bazy danych Delphi firmy Borland. Program 

korzysta z mechanizmów zarządzania bazą danych i generatora raportów tej 

firmy stanowiący pakiet narzędziowy Delphi. Wszystkie dane, łącznie z przetworzoną 

postacią sygnału z chromatografu są pamiętane w tablicach danych 

w formacie Pradox. KSPD jest w dużej mierze bazą danych i to bazą, 

w której tablice mogą być swobodnie wykorzystywane do budowy własnych 

baz danych lub jako standardowe dane przetwarzane w innych programach 

np. Excel, Origin itp. Głównym oknem programu KSPD jest typowe okno 

formularza ukazującego się po uruchomieniu programu (rys. 3). Formularz 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

334 


ten składa się z dwóch sekcji, z których każda jest związana z jednym kanałem 

pomiarowym. Na rysunku 4 przedstawiono okno tego programu z podzielonym 

pikiem oraz obliczonymi wartościami pola piku i pól poszczególnych 

segmentów powierzchni adsorpcyjnej. Program ten umożliwia wybranie 

liczby segmentów, na jakie może być podzielona powierzchnia adsorpcyjna. 

Liczbę podziału można wprowadzić w oknie Liczba półek, przez otwarcie 

zakładki Integrator w polu wyboru trybu pracy integratora i wybraniu rodzaju 

pracy Profil adsorpcyjny (rys. 5). 

Rys. 3. Główne okno programu KSPD 

Fig. 3. Main window of KSPD programme 



335 

Rys. 4. Podział piku za pomocą programu KSPD 

Fig. 4. The dividing profile of chromatographic peak by KSPD programme 

Rys. 5. Wybór liczby segmentów do podziału piku 

Fig. 5. The choice of number for dividing profile of chromatographic peak 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

336 


4. Program Excel 

(Excel programme) 

Excel jest najpopularniejszą aplikacją używaną do przetwarzania danych 

liczbowych. To program symulujący na ekranie komputera tzw. zeszyt, 

który jest standardowym dokumentem i składa się z arkuszy. Do komórek 

arkusza można wprowadzać dane w postaci liczb, tekstów i formuł obliczeniowych. 

Wprowadzane dane widoczne są zarówno w komórce aktywnej, 

jak i na pasku formuły. Przez formułę obliczeniową należy rozumieć zapis, 

który przy spełnieniu pewnych wymogów formalnych pozwala otrzymać 

w wybranej komórce wynik obliczeń zrealizowanych zgodnie z procedurą rachunkową 

wprowadzoną przez użytkownika. Procedura działa wykorzystując 

wartości liczbowe, które mogą być podane w sposób jawny (jako stałe) lub 

występować jako adresy komórek, w których zostały umieszczone wartości 

liczbowe. Excel posiada ok. 200 wbudowanych funkcji, które obejmują podstawowe 

zagadnienia matematyki, statystyki i logiki, operacje na tekstach 

i bazach danych. Możliwe jest także wykonywanie rozmaitych obliczeń fizykochemicznych 

[5]. Na rysunku 6 przedstawiono wyniki podziału piku przeniesione 

z programu KSPD i obliczanie wielkości adsorpcji a iI substancji i 

i ciśnienia parcjalnego p iI za pomocą programu Excel. 

5. Program Origin 

(Origin programme) 

W opisie wykonywania obliczeń całą procedurę postępowania przedstawiono 

zgodnie z instrukcją programu [6] i pracą [7]. Wszystkie polecenia 

procedur podawano zgodnie z angielskojęzyczną wersją programu. 

Uruchomienie programu Origin powoduje otwarcie standardowego 

okna, które zawiera arkusz do wstawiania danych (rys. 7). Tak, jak w przypadku 

programu Excel, arkusz składa się z komórek ułożonych w kolumny 

oznaczone literami i wierszy oznaczonych liczbami. Wyniki pomiarów stopnia 

adsorpcji i prężności parcjalnej adsorbatów wstawiono, jako dane programu 

Excel. Program Origin jest kompatybilny z programem Excel i zawiera 

odwołania do niego. Rozwinięcie opcji (Analysis) na pasku menu pozwala 

wybrać polecenie obliczenia metodą najmniejszych kwadratów (Nonlinear 

least squares fitter). Okno dialogowe wyboru równania (Select function) 

przedstawiono na rysunku 8. Należy wybrać polecenie (Function), rozwinąć 

jego pasek i wybrać opcję (Edit function), otwierając okno dialogowe przedstawione 

na rysunku 9. Do tego okna wpisuje się równanie Langmuira (5). 

Jako wartości stałe tego równania wpisuje się w pasku formuły (Parameter 

names) K A ,n, bstała równowagi adsorpcji adsorbatu, współczynnik potęgowy, 

współczynnik proporcjonalności, jako wartości niezależne (Independent 

Variables) p A – ciśnienie parcjalne adsorbatu, a jako wartości zależne (Dependent 

Variables) r stopień pokrycia. W polu definicji (Definition) wpisano 

równanie (5), w polu formy wybrano rodzaj (Equations) i w polu nazwy wpisano 

równanie Langmuira. Przyciskając przycisk (Save) można zapisać po- 



337 

stać tego równania i wówczas przy kolejnych obliczeniach równanie to będzie 

dostępne w oknie dialogowym wyboru funkcji (rys. 8). Następnie otwiera 

się okno dialogowe programu - wybieranie danych do obliczeń (Select 

Dataset). To okno (rys. 10) służy do przyporządkowania niezależnym i zależnym 

wielkościom równania Langmuira (5) danych z arkusza (rys. 7), które 

wstawiono w oknie dialogu edycji funkcji (rys. 9). Przyporządkowanie polega 

na zaznaczeniu wybranej wielkości oraz zaznaczeniu wybranych danych 

i naciśnięciu przycisku (Assign). Przed wykonaniem właściwych obliczeń 

metodą najmniejszych kwadratów, można określić ilość cyfr znaczących 

w obliczanych stałych w równaniu i liczbę iteracji, otwierając okno dialogowe 

(Control Parameters). Na rysunku 11 przedstawiono to okno z zaznaczoną 

liczbą cyfr znaczących i liczbą iteracji. Jest możliwe także ograniczenie wielkości 

obliczanych stałych przez utworzenie przedziału wartości dopuszczalnych. 

Taki przedział tworzy się wstawiając dopuszczalne minimalne i maksymalne 

wartości (okno dialogowe Parameter Constrains, rys. 12). Stałą 

równowagi adsorpcji adsorbatu K A , współczynnik potęgowy ni współczynnik 

proporcjonalności b oblicza się metodą najmniejszych kwadratów otwierając 

okno dialogowe (Fitting Session), zaznaczając pola wyboru (Vary?) i naciskając 

przycisk (10 Iter). W oknach (Value) i (Error) zostają wyświetlone wyniki 

obliczeń (rys. 13), a w polu opisowym zostaje wyświetlony raport. 

Rys. 6. Obliczanie wielkości adsorpcji a iI substancji i i ciśnienia parcjalne p iI za pomocą programu 

Excel 

Fig. 6. The calculations of adsorption a iI substance i and partial pressure p iI by Excel programme 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

338 


Rys. 7. Okno programu Origin z zamieszczonymi wynikami pomiarów adsorpcji 

Fig. 7. Window of Origin programme with the adsorption measurement data 

Rys. 8. Okno programu - wybór funkcji 

Fig. 8. Window of Origin programme – the selection of function 



339 

Rys. 9. Okno programu - wprowadzanie nowej funkcji 

Fig. 9. Window of Origin programme – the introduction of new function 

Rys. 10. Okno programu - wybieranie danych do obliczeń 

Fig. 10. Window of Origin programme – the selection of data of calculations 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

340 


Rys. 11. Okno programu - określanie dokładności obliczeń 

Fig. 11. Window of Origin programme – the determination of accuracy of calculations 

Rys. 12. Okno programu – określanie przedziału wartości obliczanych parametrów 

Fig. 12. Window of Origin programme –the determination of range of calculated parameters 



341 

Rys. 13. Okno programu – obliczanie stałej równowagi adsorpcji adsorbatu K A , współczynnika 

potęgowego n, współczynnika proporcjonalności b metodą najmniejszych kwadratów 

Fig. 13. Window of Origin programme – the calculations of adsorption equilibrium constants 

K A , power coefficient n, proportionality coefficient b by least-squares method 

6. Przykład obliczeń 

(Example of calculations) 

Jako przykład do obliczeń przedstawiono sposób wyznaczania izotermy 

adsorpcji o-ksylenu na sorbencie haloizytowym z kopalni Dunino. 

Pomiary adsorpcyjne wykonano przy użyciu chromatografu gazowego 

505 M sprzężonego z komputerem PC wyposażonym w przetwornik analogowo-cyfrowy 

i program KSPD. Przed pomiarami adsorpcji rurkę sorpcyjną 

zawierającą sorbent haloizytowy kondycjonowano w strumieniu azotu 

10 cm 3 /min, w temp. 195°C przez 24 godziny. Termostat rurki adsorpcyjnej 

utrzymywał zadaną temperaturę pomiaru ±0,2°C. Temperatura dozownika 

160°C, temperatura detektora 160 ° C. Pomiary adsorpcji wykonano w temperaturze 

180°C. Na Rysunku 14 przedstawiono przykład dopasowania krzywej 

wyrażonej przez równanie (5) do wyników pomiarów adsorpcji o-ksylenu. 


(Conclusions) 

Pakiet programów komputerowych składający się z KSPD, Excela i Origina 

pozwala na szybkie opracowanie wyników. Możliwość przenoszenia danych 

pomiędzy programami z pakietu i przetwarzania ich za pomocą operacji, 

których nie posiada inny z programów pakietu zdecydowanie ułatwia pracę. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

342 


Praca finansowana z projektu nr 6/1/821/POKL 2009 „Stypendia naukowe dla doktorantów 

kierunków istotnych dla rozwoju regionu” 

Literatura 

(Literature) 

1. Lech, Program komputerowy KSPD, Metroster, Toruń, 1999. 

2. S. Wigdegrauz, Raztchety w gazovoj chromatografii, Izd. Khimija, Moskwa, 

1978. 

3. P.M. Słomkiewicz, Wyznaczanie stałych równowagi adsorpcji metodą 

inwersyjnej chromatografii gazowej, Aparatura Badawcza i Dydaktyczna, 

9/2(2004)109-117. 

4. K. Czech, P.M. Słomkiewicz, Wyznaczanie izoterm adsorpcji benzenu 

na adsorbentach mineralnych metodą inwersyjnej chromatografii gazowej 

(w druku), materiały IX Konferencji Chromatograficznej, Poznań 

2011. 

5. W. Ufnalski, Excel dla chemików…,WNT, Warszawa, 2000. 

6. Origin User`s Manual, Microcal Software Inc. Northampton MA, USA, 

1999. 

7. P.M. Słomkiewicz, Zastosowanie programu Origin do analizy regresyjnej 

wyników badań kinetyki reakcji katalitycznych, Aparatura Badawcza 

i Dydaktyczna, 9/1(2004)6-12. 





INSTRUKCJE DLA AUTORÓW 

W Camera Separatoria wydawane są artykuły oryginalne (nie publikowane 

wcześniej) oraz przeglądowe poświęcone różnym działom nauki, 

techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane będą listy do redakcji, 

informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek, reklamy, 

materiały firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o konferencjach. 

Artykuł do CamSep przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003 

lub nowszym (w formacie .doc lub .docx) zgodnie z przedstawionym poniżej 

opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres e-mail: 

psc1@onet.eu. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu. 

* * * 

Jan KOWALSKI 1 , Anna KOWALSKA 2* (Arial 10 pkt., bold) 

1 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii, 

Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce, 

e-mail: psc1@onet.eu 

2 

Uniwersytet … (Afiliacja – Arial 8 pkt., normal bez boldu) 

Tytuł artykułu w języku polskim – 12 pkt. Arial bold 

Streszczenie: (Arial 8 pkt. normal bold). Treść streszczenia – Arial 8 pkt. kursywa bez boldu. 

Streszczenie polskojęzyczne powinno zawierać około 500-700 znaków (ze spacjami). Należy 

w nim krótko wskazać czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie 

wniosków. 

Słowa kluczowe: Arial 8 pkt., bez boldu, kursywą 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

344 

Instrukcje dla autorów 

Tytuł artykułu w języku angielskim – 12 pkt. Arial bold 

- kursywa 

Abstract: (Arial 8 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne – Arial 8 pkt. kursywa bez 

boldu, powinno być rozszerzone, o objętości około 1000-1200 znaków (ze spacjami). Powinno 

zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. 

Key words: Arial 8 pkt., bez boldu, kursywą 

* autor do korespondencji 

Podtytuły – Arial 11 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna, Wyniki 

i dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) – wersja polska 

- normal i (angielska - kursywą), 

śródtytuły – Arial 10 pkt., bold, wersja polska - normal i (angielska 

- kursywą) 

Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany – Arial 

10 pkt., odstępy między wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden sposób 

podziałów wierszy. Marginesy dostosować tak, aby wysokość kolumny 

tekstowej miała 19 cm (bez nr stron), a szerokość 12 cm - zgodnie z wymogami 

zamieszczonymi na stronie: 

http://www.uph.edu.pl/index.php/druki-firmowe/dokumenty-wydawnictwa-ap.html 

http://dach.ich.uph.edu.pl/pl/_cs.html 

http://dach.ich.uph.edu.pl/download/cam_sep/CamSep_ww.pdf 

Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane przenoszone 

z tekstem. Wzory napisane w edytorze równań należy traktować 

jako element zdania np.: 

V 

t 

F 

R R 

(1) 

gdzie: 

V R – objętość retencji, 

t R – czas retencji [min.], 

F – przepływ gazu nośnego [cm 3 /s]. 

Symbole użyte we wzorach powinny mieć rozmiar zgodny z rozmiarem 

czcionki tekstu rozdziału. Wzory należy numerować kolejno w całym tekście 

artykułu. Numery wzorów powinny być wyrównane do prawej. Oznaczenia 

stosowane na rysunkach i w tabelach muszą być czytelne i zgodne z oznaczeniami 

używanymi we wzorach i w tekście artykułu. Nazwy związków chemicznych 

stosować zgodnie z nomenklaturą IUPAC, jednostki z układu SI. 

W odpowiednie miejsca w tekście należy wstawić rysunki i tabele wraz 

z tytułami. Powinny one znajdować się w miejscach, w których po raz pierwszy 

są do nich odwołania w tekście artykułu. Rysunki i zdjęcia zamieszczone 

w artykule muszą być czytelne i kontrastowe oraz zapisane jako czarno- 

-białe lub w skali odcieni szarości. 



345 

Rysunki i tabele należy numerować kolejno w całym tekście artykułu 

(Rys. i Tab. nr arabskie). 

Tytuły rysunków i tabel należy podać w języku polskim i angielskim 

(kursywą) jak na przykładzie przedstawionym poniżej: 

Tabela 1. Całkowita emisja metali z obszaru Polski według rodzajów działalności. 

Arial 10 pkt. 

Table 1. Total emission of heavy metals in the area of Poland kinds of 

activities. Arial 10 pkt. 

Ogółem 

(Total) 

Elektrociepłownie, elektrownie, 

ciepłownie 

(Heat and power plants, power 

stations) 

Cd Pb Cu Zn Ni 

tony 

66,1 555,0 390,9 2345,1 295,8 

1,9 19,9 12,8 59,2 72,2 

Tabele w pionie nie mogą przekraczać szerokości 12 cm, a w poziomie 

– 18 cm. Czcionka wewnątrz tabeli – Arial 8 pkt. 

Rysunek, wykres, czy inna forma materiału ilustracyjnego nie może 

przekraczać w pionie – szerokości 12 cm, wysokości 18 cm; w poziomie – 

szer. – 18 cm, wysokości – 9÷10 cm (na stronie musi zmieścić się jeszcze 

podpis do rysunku). Materiał ilustracyjny powinien być zapisany z rozszerzeniem 

JPG i przesłany dodatkowo w oddzielnych plikach podpisanych jako 

Rys. 1., Rys. 2. itd. 

Rys. 1. Tytuł rysunku w języku polskim, Arial 8 pkt. 

Fig. 1. Tytuł rysunku w języku angielskim, Arial 8 pkt. 

Literatura 

(w tekście numerujemy w kolejności cytowania [1], [2, 3], [4-8] itd., - Arial 

10 pkt.): 

1. L.E. Green, J.C. Worman, Research of separation…, Anal. Chem., 

37(1965)1620. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

346 


Oprócz danych bibliograficznych należy zamieścić tytuł, w tym także 

publikacji, materiału z internetu, opisu patentowego itp. Tytuł w j. polskim, 

lub innym, niż język polskim jest pisany zwykłym drukiem w cudzysłowie, 

tytuł w języku angielskim – kursywą. 

2. T. Paryjczak, „Chromatografia gazowa…”, tłumaczenie tytułu na j. angielski 

kursywą, PWN, Warszawa 1986. 

(w przypadku, gdy tytuł pracy jest w innym języku, niż po angielsku, należy 

tytuł oryginalny napisać w języku oryginału, a następnie jego tłumaczenie na 

język angielski - kursywą) 

Wszystkie materiały: 

artykuł (w formacie .doc lub .rtf), 

dodatkowo zdjęcia i rysunki (w formacie JPG), 

prosimy przesyłać w formie plików, w jednej wiadomości na adres e-mail: 

psc1@onet.eu 

* * * 

Przesłany artykuł do CamSep podlega wstępnej ocenie przez Edytora, 

następnie przekazywany jest dwóm recenzentom do oceny. Recenzenci 

pozostają anonimowi. 

O przyjęciu artykułu do druku decyduje redakcja, w oparciu o przygotowaną 

recenzję. Jeśli w jej wyniku zachodzi konieczność poprawienia artykułu 

przez autora, to powinno to nastąpić w okresie nie dłuższym niż trzy tygodnie. 

Po tym terminie uważa się, że autor rezygnuje z publikacji lub gdy 

artykuł zostanie przesłany do redakcji podlegać on będzie ponownej ocenie. 

Po opublikowaniu autorzy bezpłatnie otrzymują elektroniczna wersję 

artykułu i właściwy nr CamSep jako egzemplarz autorski. 

Ogłoszenia/reklamy mogą być publikowane za odpowiednią, wcześniej 

ustaloną, opłatą. 

Przepisy etyczne 

Ważne jest, aby uzgodnić standardy etycznych zachowań dla wszystkich 

zaangażowanych w działania publikacji: autora, redaktora czasopisma, 

recenzenta, wydawcy i społeczeństwa czasopism. Redaktorzy i recenzent 

są zobowiązani do zapewnienia, że reklama, przedruk lub inny przychód 

komercyjny, nie ma wpływu na decyzje redakcyjne. Nie mogą oni ujawniać 

żadnych informacji na temat przedstawionego rękopisu do kogokolwiek innego 

niż autora artykułu. Niepublikowane materiały, ujawnione w przedstawionej 

pracy, nie mogą być używane przez redaktorów/recenzentów jako 

część własnych badań bez pisemnej zgody autora. Powielanie lub adaptacja 

opublikowany wcześniej tabel, rycin, ilustracji lub obszernych cytatów z innych 

źródeł, akceptowana jest tylko za posiadaniem odpowiedniej pisemnej 

zgody autora. 



347 

Instructions for Authors and Editorial Policy 

Camera Separatoria is a scholarly, and peer-reviewed journal (print 

and online) published 2 times per year which was founded in 2009. It is 

a continuation of the journal Postępy Chromatografii (Progress in Chromatography) 

devoted to the science, technique and technology of separation. 

It provides a medium for the publication of theoretical and experimental studies 

and reviews related to separation science: chromatography, electrophoresis, 

mass spectrometry, exctraction, electroseparation etc. 

Camera Separatoria publishes original (not published previously and 

are not currently under consideration by another journal except in the form of 

an abstract or as part of a published lecture, review, or thesis) and review 

papers from all branches of separation science, technique and technology. 

Additionally letters to the editor; expert opinions; information on instrumentation, 

book reviews and information about conferences as well as advertisements 

are also published. The journal welcomes contributions which promote 

the exchange of ideas and rational discourse between practicing 

educators and material researchers all over the world. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the 

cover letter, using e-mail. No limitation of the articles lengths are provided. 

The manuscript should be original, has not been published previously and 

should not be currently being considered by another journal. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the 

cover letter, using e-mail. No limitation of the articles lengths are provided. 

Manuscript should be prepared using MS-Word editor in the 

.doc/.docx format. Detailed rules are presented on 

http://www.uph.edu.pl/index.php/druki-firmowe/dokumenty-wydawnictwa-ap.html. 

It should be typed in single-spaced lines using Arial 10p. font with the overall 

page numbering (at the center of bottom margins). Tables (Arabic numeration, 

title in Polish and English, Arial 10p.), figures and figure captions 

(Arabic numeration, in Polish and English, Arial 8p.) and references can be 

placed directly to the text. The main heading appears in the following order: 

- list of Authors by first, middle names, surname (capital letters); the Corresponding 

Author’s name should be accompanied by an asterisk (*); if Authors 

are from more than one affiliation, use superscript numbers to link the 

Authors’ names and their affiliations, 

- list of affiliations and complete mailing addresses of the authors (including 

zip code, city, street, and number; for universities, the faculty or department 

should be given), 

- the title (should not exceed 20 words) of the article in Polish as well as 

English, (in all capital letters, Arial 12p.), 

- if there is more than one affiliation, use asterisks to indicate the institute 

with which each author is affiliated, 

as it is presented below: 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

348 


Jan K. KOWALSKI, Karol ROBERT* 

Department of Separation Science, Institute of Chemistry 

ul. 1 Maja 3, 00-000 Warszawa 

*e-mail: camera@separatoria.eu 

I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne 

1 st Podlasie’s Chromatographic Meeting 

Body text… 

In the subsequent text, the following parts are is desirable: abstract 

(in Polish and English, Arial 8p.), keywords (about five, in Polish and English, 

Arial 8p.), introduction (review of literature and formulation the aim of 

the paper), experimental (reagents, apparatus, protocols, data analysis), results 

and discussion, conclusions, acknowledgments and literature. The SI 

units and nomenclature recommended by IUPAC should be used. References 

should be typed in the forms: 

1. J.K. Kowalski, K. Robert, Research of separation…, J. Sep. Sci., 

44(2000)666. 

2. A. Adzik, in Fundamentals of Separation Science, K. Karol, ed., PTNoR, 

Reymontówka 2000. 

3. Polish standard PN – EN ISO 17993, text… 

4. S. Separator, Proceedings of 2 nd Podlachia’s Chromatographic Meeting, 

Kotuń-Chlewiska, Sep. 12-18, 1987. 

in a list at the end of article and numbered in the order of appearance. Citation 

in the text should be denoted by number in square brackets. 

One of the Editor first evaluates the manuscript. Exceptionally it can 

be accepted at this stage. Those rejected at this stage are passed on to 2 

experts for review. Acceptance for publication is subject to positive recommendation 

from the referees. The referees remains anonymous throughout 

the process. Reviewers are not supposed to contact the authors or to otherwise 

make their identity known. The referees are asked to evaluate the manuscript 

according to the below rules within 3 weeks. Authors have three 

months to correct the article after the reviewing process. After this time, the 

returned article is considered as newly received. The authors receive the 

electronic version of their paper and the proper volume of Camera Separatoria 

free of charge. 

Advertisements may be published according to the prescribed rates. 

Ethical guidelines 

* * * 

It is crucial to agree upon standards of expected ethical behavior for 

all involved in the act of publishing: author, editor, reviewer, publisher and 

society. Editors and reviewer are committed to ensuring that advertising, re- 



349 

print or other commercial revenue has no impact or influence on editorial decisions. 

They must not disclose any information about a submitted manuscript 

to anyone other than the corresponding author. The unpublished materials 

disclosed in a submitted manuscript must not be used in an 

editor's/referee’s own research without the express written consent of the 

author. The reproduction or adaptation of previously published tables, figures, 

illustrations, or extensive quotations from other sources must obtain 

appropriate written permission. 

Vol. 3, No 2/2011 

Camera Separatoria

350

CamSep 3 2

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?