CamSep 1

CHROMATOGRAFIA ŻELOWA
Chromatografia wykluczania (SEC), zwana również chromatografią
żelową (GPC), znajduje ogromne zastosowanie w separacji peptydów
i białek oraz do odsalania. Bazuje na wykorzystaniu różnicy wielkości
i kształtu, a w konsekwencji różnic w wartości efektywnego promienia hydrodynamicznego
rozdzielanych substancji. Molekuły o różnych rozmiarach
w różnym stopniu penetrują pory sorbentu. Małe cząsteczki są w większym
stopniu zatrzymywane w kolumnie, a duże są szybciej eluowane. SEC ma
zastosowanie do rozdzielania peptydów i białek o masie molowej w zakresie
2 do 1000 kDa. Technika ta może być stosowana do wyznaczania masy molowej
białek. Jednak nie tylko masa cząsteczkowa, ale również kształt cząsteczki
białka oraz oddziaływania sorpcyjne, trudne do całkowitego wyeliminowania
mają wpływ na retencję, dlatego też konieczna jest staranna
kalibracja przy użyciu odpowiednich białek kalibracyjnych.
Dużego znaczenia nabierają, ostatnio, złoża SEC wykonane w technologii
ruchomych ligandów, „tentacle” (podobnie jak w przypadku złóż jonowymiennych).
Rozmiary porów i ich rozkład gwarantują rozdzielenie białek
zgodnie z wielkością i kształtem cząsteczek. „Dynamiczne” ligandy uniemożliwiają
małym cząsteczkom wniknięcie wewnątrz porów, a większe molekuły
mają utrudnioną głębszą penetrację [57].
SEC jest szczególnie użyteczna jako początkowy etap frakcjonowania,
do izolacji dużych ilości zanieczyszczeń, lub jako końcowy etap rozdzielania
oczyszczonych białek, tzw. „polishing step”.
Należy też zwrócić uwagę na szczególną przydatność chromatografii
żelowej do odsalania peptydów i białek. Do tego celu stosuje się często, ciągle
jeszcze, tzw. miękkie sita molekularne. Coraz większe znaczenie mają
„twarde” wypełnienia kolumn w tych zastosowaniach, takie jak DIOL [58],
a także szkła porowate o zdezaktywowanej powierzchni (rys. 6 – przykład
analizy mieszaniny białek z wykorzystaniem GPC-DIOL).
128