CamSep 8 1

Siedlce University of Natural Sciences and Humanities
Polish Separation Science Society
Camera Separatoria
Volume 8, Number 1 / June 2016
Siedlce 2016

Honorary Editor:
Edward Soczewiński (Lublin)
Editors-in-Chief:
Bronisław K. Głód
(Siedlce)
Marian A. Kamiński (Gdańsk)
Editors:
Tadeusz Dzido (Lublin)
Bronisław K. Głód
(Siedlce)
Marian Kamiński (Gdańsk)
Piotr M. Słomkiewicz (Kielce)
Piotr Stepnowski (Gdańsk)
Monika E. Waksmundzka-Hajnos (Lublin)
Mieczysław Sajewicz
(Katowice)
Andrzej Stołyhwo
Language Editor:
John Podgórski
Technical Editors:
Paweł Piszcz
Reviewers:
Monika Asztemborska
Grzegorz Boczkaj
Bronisław K. Głód
Marian Kamiński
Paweł Piszcz
Mieczysław Sajewicz
Piotr M. Słomkiewicz
Monika E. Waksmundzka-Hajnos
Editorial office’s address:
Department of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry
Siedlce University of Natural Sciences and Humanities
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce
tel. :+48 (25) 643 10 40
e-mail: camera.separatoria@gmail.com
http://dach.ich.uph.edu.pl/camera_separatoria.html
Department of Chemical and Process Engineering, Chemical Faculty
Gdansk University of Technology
Gabriela Narutowicza 11/12 Str., 80-233 Gdańsk,
phone: +48 (58) 347 17 29
e-mail: marian.kaminski@pg.gda.pl www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/index.php/pl

SPIS TREŚCI
(CONTENTS)
Prace oryginalne / Original papers
Paulina NOWAK, Marian KAMIŃSKI
Alternatywne metodyki wydzielania, identyfikacji oraz oznaczania siarki elementarnej
w glebie z wykorzystaniem ekstrakcji do nisko polarnej cieczy,
chromatografii cieczowej i spektrofotometrii…….…………………………………………………….. 05
Paweł PISZCZ, Bronisław K. GŁÓD
Właściwości antyoksydacyjne ziół zbadane rożnymi metodami………………………...............…...23
Dorota CHRUSZCZYK, Marian KAMIŃSKI
Stopniowa chromatografia cienkowarstwowa w normalnych układach faz (NP-TLC),
jako technika rozdzielania i oceny składu grupowego frakcji asfaltenowych z utleniania
pozostałości próżniowej ropy naftowej…………………………………………………..………....…...32
Małgorzata KOWALCZYK, Monika ASZTEMORSKA
Micellar electrokinetic chromatography with bile salts for separation of flavanone
diastereomers………………………………………………………………………...……………….…...45
Instrukcje dla Autorów……………………………………………………………………………………..55
Instructions for Authors and Editorial Policy…………………………………………………………….59
Od Redakcji…………………………………..……………………………………………………………. 61
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

Camera Separatoria
PRACE ORYGINALNE
(Original papers)

CAMERA SEPARATORIA
Volume 8, Number 1 / June 2016, pp. 05-22
Paulina NOWAK, Marian KAMIŃSKI*
Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej
*Autor do korespondencji, e-mail: markamin@pg.gda.pl
Alternatywne metodyki wydzielania, identyfikacji oraz oznaczania siarki
elementarnej w glebie z wykorzystaniem ekstrakcji do nisko polarnej cieczy,
chromatografii cieczowej i spektrofotometrii
Streszczenie: W niniejszej pracy - na podstawie przeglądu literatury oraz badań -opracowano nowe metodyki
wydzielania, rozdzielania od składników towarzyszących, identyfikacji oraz oznaczania siarki elementarnej w glebach,
szczególnie zanieczyszczonych nisko lotnymi produktami pochodzącymi z ropy naftowej. Zastosowano ekstrakcję siarki,
nisko oraz średnio polarnych składników gleby do niepolarnego n-heksanu. Rozdzielano składniki ekstraktów techniką
kolumnowej elucyjnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej w normalnych układach faz (NP-HPLC) z detekcją
spektrofotometryczną w zakresie nadfioletu i światła widzialnego z tablicą fotoelementów(UV-VIS-DAD). W badaniach
uwzględniono także kolumnową wysokosprawną elucyjną chromatografię cieczową w odwróconych układach faz (RP -
HPLC), posiadającą zwiększający się ostatnio zasób literatury dla badania siarki rodzimej w środowisku naturalnym.
Badano także przydatność cienkowarstwowej chromatografii cieczowej w normalnych oraz odwróconych układach faz
(NP-TLC / RP-TLC). Jednakże ostatnie techniki są możliwe do zastosowania w identyfikacji oraz oznaczaniu siarki
rodzimej tylko w warunkach jej wysokich zawartości w analitach. Na podstawie badań wykazano, że najbardziej
korzystnymi warunkami ekstrakcji i ługowania siarki rodzimej w glebach mogących jednocześnie zawierać nisko i średnio
polarne zanieczyszczenia pochodzenia naftowego oraz po-węglowego, jest ekstrakcja / ługowanie rozpuszczalnikiem
alifatycznym, np. n-heksanem. Natomiast optymalnymi warunkami do rozdzielania, identyfikacji oraz oznaczania siarki
elementarnej, a także – w razie takiej potrzeby – oznaczania obecności i zawartości - nisko i średnio polarnych
zanieczyszczeń gleby, ekstrahowanych razem z siarką rodzimą jest wykorzystanie techniki NP-HPLC/ UV-VIS-DAD.
Ważne znaczenie w niniejszych badaniach ma możliwość identyfikacji analitu, nie tylko na podstawie parametrów
retencji, ale także na podstawie charakterystyki widma w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego, tzn., z
zastosowaniem detektora spektrofotometrycznego z tablicą fotoelementów, UV-VIS-DAD.
Słowa kluczowe: monitoring środowiska, chemia analityczna, gleby, wysokosprawna kolumnowa chromatog rafia
cieczowa, siarka rodzima, wydzielanie, identyfikacja, oznaczanie, detekcja UV-VIS-DAD
Alternative methods of isolation, identification and determination of elemental sulfur
in the soil with used extraction to low polar liquid, liquid chromatography and
spectrophotometry
Abstract: In the present study - based on literature review and research - developed new methods of isolation,
separation from components associated, identification and determination of elemental sulfur in the soil, especially
contaminated with low-volatile products derived from crude oil. Used sulfur extraction, low and medium polar constituents
of soils to non-polar n-hexane. Separated components of the extracts by using elution column high performance liquid
chromatography technique in normal phase systems (NP-HPLC) with spectrophotometric detection in the ultraviolet and
the visible light range with array of photoelements (UV-VIS-DAD).The studies also included an elution column high
performance liquid chromatography in reversed-phase systems (RP-HPLC) having increasing lately resource literature
for the study of native sulfur in the environment. Has also been studied the suitability of the thin layer chromaptography in
normal and reverse phase systems (NP-TLC / RP-TLC). However, recent techniques are possible for use in the
identification and determination of native sulfur only in terms of its high content in analytes. Studies have shown that the
most preferred extraction and leaching conditions, of native sulfur in the soil which ma y contain also low and medium
polar impurities, and the petroleum -carbon, is the extraction / leaching of aliphatic solvent, eg. N-hexane. While the
optimum conditions for the separation, identification and determination of the elemental sulfur, and - if necessary - the
determination of the presence and the content of - low and medium polar soil contaminants, extracted with native sulfur
is the use of the NP-HPLC / UV-VIS-DAD technique. Great importance in this study has the ability to identify the analyte
based not only on retention parameters, but also on the basis of a characteristic spectrum in the ultraviolet and visible
light, ie., using a spectrophotometric detector with an array of photoelements, UV-VIS-DAD.
Keywords: analytical chemistry, high performance column liquid chromatography, native sulfur, soil, environmental
monitoring, secretion, identification, determination, detection UV-VIS-DAD
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

6
1. Wstęp
(Introduction)
Siarka jest jednym z pierwiastków, który w postaci rodzimej, a także organicznych i nieorganicznych
związków chemicznych znajduje się z wielu przyczyn w różnego rodzajach gleb. Jest jednym z niezbędnych
pierwiastków dla organizmu żywego (głównie w postaci chemicznych związków), ale także dla świata roślin
(również w formie elementarnej) [1]. W glebie w rezultacie przemian chemicznych, zwłaszcza,
mikrobiologicznych, może być przekształcana do formy siarki rodzimej, tzn. pierwiastka. Istnieją też inne
przyczyny, które powodują, iż siarka może dostawać się do gleby w formie siarki rodzimej i znajdować się
tam w różnych, czasem bardzo wysokich zawartościach (rejony wydobycia, magazynowania i przeładunku
siarki, a także gleby, gdzie jako nawóz sztuczny zawierał siarkę lub tiosiarczany w celu jej wykorzystania
jako tzw. mikroelement gleby).
W niektórych miejscach obecność i zawartość siarki rodzimej w glebie może być szczególnie wysoka.
Dotyczy to rejonów odkrywkowych kopalni siarki [3], zbiorników z płynną siarką, a także wszystkich tych
zakładów, gdzie ma miejsce składowanie oraz dystrybucja siarki w postaci stałej, albo płynnej, w tym,
nowoczesnych rafinerii ropy naftowej lub zakładów produkcji kwasu siarkowego [4].
Niniejsza publikacja, bazująca na pracy badawczej, dotyczy metodyk badania obecności oraz
zawartości siarki w formie rodzimej w glebach. Studia i badania tego rodzaju są celowe, także ze względu na
istnienie dość ubogiej, ostatnio wzbogacanej, literatury odnoszącej się do problematyki monitorowania
środowiska pod względem obecności siarki w glebie [5, 14].
Obszary, gdzie może do gleby dostać się siarka w formie pierwiastkowej (rodzimej)
najprawdopodobniej wcale nie są niewielkie, uwzględniając zdolność siarki do sublimacji i resublimacji.
Poprzez swoje właściwości, jak możliwość mikrobiologicznego oraz chemicznego przekształcania w różnego
rodzaju pochodne organiczne i nieorganiczne, obecność siarki w podwyższonej zawartości może wpływać
negatywnie na środowisko, poprzez skażenie gleb i wód podziemnych, w tym szczególnie siarkowodorem,
lub organicznymi związkami chemicznymi siarki [6, 7]. Siarka w postaci utlenionej jako S +IV , to głównie
ditlenek siarki (SO 2 ) oraz nieorganiczne jony SO 2- 3 . Szczególnie ditlenek siarki oraz pochodne, w tym
tritlenek siarki (SO 3 ) oraz kwas siarkowy (VI) (H 2 SO 4 ), stanowią istotny problem w zakresie skażenia
środowiska.
Badania opisane w niniejszej publikacji mogą mieć również znaczenie dla gleboznawstwa oraz
rolnictwa, ponieważ z punktu widzenia fizjologii roślin niewielka zawartość siarki rodzimej w glebie jest
pożądana [8].
1.1. Przegląd literatury - metodyki identyfikacji i oznaczania siarki elementarnej w
środowisku naturalnym
(Literature review - methods of identification and determination of elemental sulfur in the
environment)
Poznane metodyki identyfikacji oraz oznaczania siarki rodzimej w środowis ku naturalnym można
podzielić na trzy grupy. Pierwsza grupa to metodyki, w których siarkę oznacza się w sposób pośredni
poprzez przekształcenie jej do innych chemicznych form (metodyki stosowane w okresie 1954-1997). Druga
grupa, to metodyki bezpośrednie oznaczania siarki elementarnej bez jej transformacji (metodyki stosowane
od 1997 do dzisiaj) oraz trzecia – grupa, to metodyki potencjalne, czyli te, które mogą posłużyć do
identyfikacji i oznaczania siarki, zwłaszcza na niskich poziomach stężeń z dodatkowymi sposobami
potwierdzenia identyfikacji (np. GC-MS, HPLC UV-VIS-DAD lub HPLC-MS itp.) [9].
W przypadku nieobecności związków siarki i obecności wyłącznie siarki rodzimej, najprostszym
2-
sposobem oznaczania jest jej utlenienie do postaci SO 4 i miareczkowanie mianowanym, rozcieńczonym
roztworem BaCl 2 z wytrąceniem całkowicie nierozpuszczalnego w wodzie BaSO 4 .
Za jedną z pierwszych metodyk identyfikacji oraz oznaczania siarki elementarnej w obecności
związków siarki, uważa się kolorymetrię [10].Technika kolorymetrii, to technika analityczna, która określa
stężenia roztworu barwnego za pomocą wizualnego porównania intensywności barwy roztworu badanego z
intensywnością barwy wzorców. Wyekstrahowaną elementarną siarkę, poprzez dodanie jonów cyjanku
(CN - ) przekształca się w jon tiocyjanowy (SCN - ). Następnie miareczkuje kationem żelaza (Fe 3+ ), do
uzyskania w sposób ilościowy [Fe(SCN) 6 ] 3- i oznacza się na podstawie stopnia intensywności czerwonej
barwy powstałego kompleksowego jonu (Metodyka Filermans’a i Brock’s 1978) [10].
Modyfikacja przez Trolsen’a i Jorgensen’a (w 1982) metody Filermans’a i Brock’s polega na dodaniu
octanu cynku do roztworu, aby wyeliminować zakłócenia spowodowane obecnością siarczków w badanej
próbce. Po modyfikacji oraz udoskonaleniu metodykidolna granica oznaczalności (LOQ) oraz precyzja
mieściła się w granicach 0,8-8 ppm (0,025-0,25 mM) zawartości siarki w badanym roztworze ekstrakcyjnym.
Jednakże pozostało jeszcze wiele czynników wpływających na jakość analizy, do których należą: stężenie
jonów Fe 3+ i CN - oraz stabilność jonu [Fe(SCN) 6 ] 3- [9].
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

7
Inną techniką analityczną wykorzystywaną do oznaczenia oraz identyfikacji siarki rodzimej była
polarografia. Metoda polegała na przyłożeniu liniowo wzrastającego potencjału elektrycznego do kroplowej
elektrody rtęciowej będącej elektrodą pracującą z cyklicznie odnawianą w trakcie pomiaru powierzchnią i
rejestracji natężenia prądu płynącego przez nią. Wartość stężenia obecnej w roztworze substancji
(ulegającej utlenianiu lub redukcji) była proporcjonaln a do wartości natężenia prądu. Siarkę elementarną
przekształcono do tiosiarczanu (S 2 O 2- 3 ) poprzez dodawanie siarczanu sodu (VI) (Na 2 SO 4 ). Późniejsze
badania wykazały, iż czułość metody może wzrosnąć do 5 µM (w roztworze) poprzez zastosowanie
polarografii z zróżnicowanym impulsem [12].
Inne metodyki oznaczania siarki rodzimej w roztworach bazowały na interakcji siarki z pokrytymi na
powierzchni aktywną miedzią, specjalnie preparowanymi płytkami do uzyskania siarczku miedzi (CuS).
Następnie uwalniany był siarkowodór (H 2 S) w formie gazowej za pomocą roztworu kwasu solnego (HCl).
Potem modyfikowano metodę–przekształcano otrzymywany siarkowodór (H 2 S) do siarczanu baru (BaSO 4 )
(w obecności H 2 O 2 oraz w warunkach wrzenia) - BaSO 4 był oznaczany metodą grawimetryczną, natomiast
uwolniony siarkowodór oznaczany był metodą jodometryczną [13, 14].
Kolejną modyfikacją metody oznaczania siarki elementarnej za pomocą siarczku miedzi było
wkładanie blaszki z CuS oraz srebrnej folii do jednej ampułki, którą przepłukiwano czystym tlenem (w temp.
450 o C). W tych warunkach dochodziło do przekształcania siarczku miedzi w siarczan srebra (Ag 2 SO 4 )
(później rozpuszczany w wodzie), który oznaczany był za pomocą chromatografii jonowej [9].
Powyższe metodyki oznaczania siarki rodzimej są skomplikowane oraz czasochłonne. We wszystkich
tych przypadkach, aby można było oznaczyć siarkę należy ją najpierw przekształcić w inną formę (zależną
od metodyki), co powoduje obniżenie dokładności oraz precyzji pomiaru.
Od 1997 za podstawową metodykę identyfikacji oraz oznaczania zawartości siarki w próbkach
środowiskowych uważa się chromatografie gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (GC-MS) [15].
Stosowana też była wysokosprawna kolumnowa chromatografia cieczowa w normalnych oraz odwróconych
układach faz (NP-HPLC oraz RP-HPLC) i metodyki jodo-azydkowe.
Oznaczanie obecności i zawartości siarki elementarnej w glebach, a także w innych materiałach
realizuje się z wykorzystaniem instrumentalnych metodyk analityki chemicznej, które należy poprzedzić
ekstrakcją, a niekiedy – dodatkowo-wzbogaceniem próbki we wzorzec. Do tego celu najczęściej stosowane
są różne techniki rozdzielania oraz wzbogacania. Najczęściej ekstrakcja siarki polega na ługowaniu
acetonem, chloroformem, dichlorometanem lub metanolem [14]. Ważne znaczenie posiada również dobór
ekstrahentu, który powinien w dostatecznym stopniu rozpuszczać siarkę, a przy okazji korzystnie-innego
rodzaju zanieczyszczenia gleby, ale nie powinien wcale lub w minimalnym stopniu rozpuszczać naturalnych
składników gleb, szczególnie przeszkadzających w analityce S 8 .
Siarka elementarna jest w różnym stopniu rozpuszczalna w wielu niepolarnych lub średnio polarnych
rozpuszczalnikach, rozpuszczalność siarki elementarnej w różnego rodzaju rozpuszczalnikach
przedstawiona została w tabeli nr 1.
Tabela 1. Rozpuszczalność siarki w rozpuszczalnikach.
Table 1. Sulfur solubility in solvents.
Lp. Rozpuszczalnik (Solvent) Rozpuszczalność (Solubility)
1. Aceton 604, 623, 610 (µg/ml)
2. Dichlorometan 6185, 6089, 6720 (µg/ml)
3. Chloroform 6670 (µg/ml)
4. Metanol 260, 247, 265 (µg/ml)
5. Etanol 0,066 % masy
6. Eter dimetylowy 0,181 % masy
7. Formamid dimetylowy (DMF) 0,191% masy
8. n-Heksan 0,40% masy
9. Czterochlorek węgla 0,832 % masy
10. Nitrobenzen 0,856 % masy
11. Chloroform 1,164 % masy
12. Anilina 1,259 % mas
13. Ksylen 2,051 % masy
14. Toluen 2,070 % masy
15. Benzen 2,093 % masy
16. Chlorobenzen 2,370 % masy
17. Disiarczek węgla 34,8 % masy
Vol. 8, No 1/2016
Bibliografia
(Bibliography)
[14]
[22]
Camera Separatoria

8
Natomiast nie rozpuszcza się ona całkowicie w wodzie oraz jest prawie nierozpuszczalna w
rozpuszczalnikach polarnych, takich jak alkohole, kwasy organiczne itp. Rozpuszczalnik/ekstrahent siarki
elementarnej nie powinien jednak absorbować światła w zakresie UV-VIS oraz ekstrahować naturalnych
składników gleb. Korzystną właściwością ekstrahentu powinna być też zdolność ekstrakcji zanieczyszczeń
gleby, ale nie naturalnych składników gleby, szczególnie składników przeszkadzających w identyfikacji i
oznaczaniu zawartości siarki oraz zanieczyszczeń gleby pochodzenia endogennego. Spośród nisko
polarnych rozpuszczalników najbardziej korzystny wydaje się n -heptan, lub n-heksan, ew. cykloheksan.
Natomiast, nie nadaje się toluen-znany dobrze rozpuszczalnik siarki- z powodu szerokiego zakresu absorbcji
światła UV. Z tego samego powodu, ale także ze względu na bardzo wysoką lotność nie znajduje
zastosowania dichlorometan (CH 2 Cl 2 ; DCM).
Zalecane we współczesnej literaturze metody ekstrakcji, rozdzielania, identy fikacji oraz oznaczania
siarki elementarnej w próbkach środowiskowych przedstawiono w tabeli nr 2. Zamieszczone w tabeli nr 2
dane wskazują, że rodzaj użytego ekstrahenta zależy od rodzaju próbki. W przypadku próbek gleby
stosowany jest dichlorometan i aceton.
Do oznaczania obecności i zawartości siarki w glebie wykorzystuje się głównie chromatografię gazową
(GC) oraz wysokosprawną chromatografię kolumnową w odwróconych układach faz (RP-HPLC) [14, 21].
Do potencjalnych technik analitycznych, na podstawie dokonanego przeglądu literatury, które można
zastosować do identyfikacji oraz oznaczania rodzimej siarki w glebie należą:
Cienkowarstwowa chromatografia cieczowa (TLC),
Wysokosprawna kolumnowa chromatografia cieczowa (HPLC),
Spektometria UV-VIS,
Chromatografia gazowa GC-TCD (Thermal Conductivity detector),
Chromatografia gazowa GC-ECD (Electron capture detector),
Chromatografia gazowa GC-FPD (Flame Photometric Detector).
W przypadku TLC parametrem odpowiadającym za identyfikację siarki elementarnej w glebie jest
współczynnik retencji, a za oznaczanie zawartości - intensywność plamki mierzona w warunkach
optymalnych (fotografowanie płytki w specjalnej komorze, aby światło rozkładało się równomiernie oraz
specjalnego oprogramowania za pomocą którego można odczytać intensywność plamki). W przypadku
HPLC siarkę elementarną oznacza się jakościowo i ilościowo. Dodatkowym parametrem odpowiadającym za
identyfikację w technice HPLC może być widmo siarki w zakresie UV z zastosowaniem detekcji UV -VIS-
DAD.
Vol. 8, No 1/2016
Rys.1. Widmo siarki elementarnej w zakresie nadfioletu (UV)
Fig.1. The spectrum of elemental sulphur in the UV-light range
Do identyfikacji oraz oznaczania siarki w próbkach gleby może być zastosowana stacjonarna
spektrofotometria UV-VIS, ponieważ siarka charakteryzuje się specyficznym widmem w zakresie UV -Rys. 1.
(widmo wykonane w badaniach własnych), jednakże tylko wówczas gdy ekstrakt z całą pewnością nie
zawiera innych składników absorbujących UV w zakresie 220 do 350 nm. Technika spektroskopii w zakresie
średniej podczerwieni (MIR - FTIR – Middle Infrared Fourier Transformation Spectroscopy) jest natomiast
Camera Separatoria

9
zupełnie nieprzydatna do identyfikacji, ani do oznaczania siarki elementarnej, ponieważ cząsteczka siarki S 8
jest całkowicie symetryczna i zupełnie nie absorbuje światła UV. Taki przebieg widma MIR – FTIR
potwierdza też, że mamy do czynienia właśnie tylko z siarką (S 8 ).
Tabela 2. Metody ekstrakcji, rozdzielania, identyfikacji oraz oznaczania siarki elementarnej w próbkach środowiskowych.
Table 2. Methods of extraction, separation, identification and determination of elemental sulfur in environmental samples.
Rodzaj próbki
środowiskowej
(Type of
environmental
samales)
Osady denne
(Bottom
sediments)
Węgiel (Coal)
Osady denne
(Bottom
sediments)
Osady jeziorne
(Lake
sediments)
Osady morskie
(Sea sediments)
Osady
pow ierzchniowe
(surface
sediments)
Węgiel, pył,
gleba, w oda
(Coal, dust, soil,
water)
Runo leśne
(Undergrowth)
Gleba (Soil)
Metody ekstrakcji siarki
elementarnej z środowiskowych
próbek
(M ethods for extracting elemental
sulfur from environmental Samales)
Ekstrakcja siarki z próbek
środowiskowych z wykorzystaniem n-
heksanu oraz cykloheksanu jako
rozpuszczalników, a następnie z
w ykorzystaniem 5% NaNO 2 azotynu
sodu w DMF (dimetyloforamidu) w
celu usunięcia w iązań S-S, a
następnie metanolem (1:6) i poddane
oznaczeniu
Ekstrakcja siarki z próbek
środowiskowych z wykorzystaniem
cykloheksanu oraz tetrachloroetanu
jako rozpuszczalnika– ekstrakcja w
aparacie Soxhleta
Brak informacji w artykule źródłowym
Ekstrakcja siarki z próbek
środowiskowych z wykorzystaniem
czterochlorku węgla jako
rozpuszczalnika
Ekstrakcja siarki z próbek
środowiskowych z wykorzystaniem
acetonu jako rozpuszczalnika
Brak informacji w artykule źródłowym
Węgiel, pył, gleba - Ekstrakcja siarki z
próbek środowiskowych z
w ykorzystaniem cykloheksanu =jako
rozpuszczalnika– ekstrakcja w
aparacie Soxhleta
Woda – ekstrakcja z w ykorzystaniem
sita 40-60 mesh XAD-2, a następnie
rozpuszczenie siarki w eterze
dietylow ym oraz cykloheksanie
Ekstrakcja siarki z próbek
środowiskowych z wykorzystaniem
acetonu jako rozpuszczalnika
Ekstrakcja siarki z próbek
środowiskowych z wykorzystaniem
dichlorometanu oraz acetonu jako
rozpuszczalnika
Metodyki rozdzielania, identyfikacji oraz
oznaczania siarki elementarnej (Methods of
separation, identification and determination of
elemental sulfur)
Metoda jodo-azydkowa–oznaczanie siarki
elementarnej w bezwodnym środowisku
Chromatografia gazowa ze spektometrią mas
(GC-MS) – kolumna Hp-5 capillary column(30 m x
0,25 mm I.D., 0,25 µm- grubość pow łoki,
Crosslinked 5X PH ME Siloxane; gaz nośny: 0,6
ml/min He; objętość dozow ania 5 µm (podział
iniekcji 1:10); spektrometr ustawiony na napięcie
jonizacji 70 eV.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
kolumnow a
w odwróconym układzie faz (RP-HPLC)- Warunki
:brak informacji w artykule źródłowym
Chromatografia gazowa ze spektometrią mas
(GC-MS) – kolumna Silic acapillary ( I.D. 25 mm)
okryta niepolarną pow ierzchnią związaną SPB-1
(0,25 µm grubości); gaz nośny: Ultra czysty hel;
ciśnienie 90kPa; potencjał jonizacji 70 eV; temp. w
kolektorze 220-280 o C
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
kolumnow a
w odwróconym układzie faz (RP-HPLC)- brak
informacji w artykule źródłowym
Liniow a w oltamperometria (LSV)- Warunki :brak
informacji w artykule źródłowym
Chromatografia gazowa (GC)- kolumna szklana 2
m x 4mm i.d. pakow ana: 5% OV-210/4% SE-30,
chromosorb W HP, 80-100 mesh; temp. kolumny
180 o C, przepływ: 75 ml/min, tr=2,3 min
Metoda kolorymetryczna z użyciem chlorku
żelaza, chlorku rtęci oraz cyjanku sodu,
oznaczanie w ykonane za pomocą
spektrofotometru -465 nm,
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
kolumnow a RP-HPLC:m Kolumna C18,
100mmx4,6 mm, ID, 3,5 µm, przepływ: 2,3 ml/min;
faza ruchoma: 90:10 MeOH:Woda (v:v); Długość
fali monitorow anej: 220 nm; Temp. kolumny: 45 o C,
Objętość dozow ania: 10 µl
Bibliografia
(Bibliography)
[17]
[15]
[16]
[9]
[16]
[16]
[20]
[18]
[14]
1.2. Zakres badań
(Scope of research)
Celem prac badawczych było opracowanie optymalnych warunków przygotowania próbek,
rozdzielania składników ekstraktu, identyfikacji oraz oznaczania elementarnej siarki w glebie technikami
chromatografii cieczowej uwzględniając wysokosprawną kolumnową elucyjną chromatografię cieczową w
normalnych oraz odwróconych układach faz (NP-HPLC oraz RP-HPLC) oraz zbadanie dokładności i precyzji
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

10
oznaczania. Zakres badań obejmował również przygotowanie wstępnej procedury identyfikacji oraz
oznaczania siarki w glebie techniką chromatografii cieczowej.
Postępowanie w zakresie poboru i przygotowania próbek do badań składnik ów i innych parametrów
gleb powinno uwzględnić zasady opisane w normach międzynarodowych [21]:
- PN-ISO 11464:1999 Jakość gleby - Wstępne przygotowanie próbek do badań fizyczno-chemicznych,
Pobór prób gleb należy przeprowadzić zgodnie z wymaganiami norm:
- PN-ISO 10381-1:2008 Jakość gleby -- Pobieranie próbek – Część 1: Zasady opracowywania programów
pobierania próbek,
- PN-ISO 10381-2:2007 Jakość gleby - Pobieranie próbek – Część 2: Zasady dotyczące technik pobierania,
- PN-ISO 10381-3:2007 Jakość gleby -- Pobieranie próbek – Część 3: Zasady dotyczące bezpieczeństwa
- PN-ISO 10381-4:2007 Jakość gleby - Pobieranie próbek – Część 4: Zasady dotyczące postępowania
podczas badań terenów naturalnych, zbliżonych do naturalnych oraz uprawnych.
- PN-R-04031:1997 Analiza chemiczno-rolnicza gleby. Pobieranie próbek.
2. Część eksperymentalna
(Experimental part)
2.1. Materiały
(Materials)
2.1.1. Rozpuszczalnik i eluenty - TLC
(Solvents and eulents - TLC)
W badaniach zastosowano następujące rozpuszczalniki stanowiące ekstrahenty, eluenty lub składniki
eluentów- badanie techniką TLC:
n-heksan (n-C6) do HPLC Merck (Niemcy),
dichlorometan (DCM) pure min. 99% Chempur (Polska)
eter tert-butylowo-metylowy (MTBE) do HPLC Merck (Niemcy),
tetrahydrofuran (THF) do HPLC Merck (Niemcy),
acetonitryl (ACCN) LiChrosolv (Niemcy),
aceton cz.d.a. POCh (Polska).
izopropanol (IzOH) cz.d.a. POCh (Polska)
2.1.2. Rozpuszczalniki i eluenty - HPLC
(Solvents and eulents)
W badaniach zastosowano następujące rozpuszczalniki stanowiące ekstrahenty, eluenty lub składniki
eluentów- badanie techniką TLC:
n-heksan (n-C6) do HPLC Merck (Niemcy),
dichlorometan (DCM) pure min. 99% Chempur (Polska)
eter tert-butylowo-metylowy (MTBE) do HPLC Merck (Niemcy),
acetonitryl (ACCN) LiChrosolv (Niemcy),
aceton cz.d.a. POCh (Polska).
izopropanol (IzOH) cz.d.a. POCh (Polska)
2.1.3. Substancje wzorcowe i badane próbki - TLC
(Reference substances and examined samples - TLC)
Materiały (wzorce oraz próbki) użyte do badań techniką TLC:
wzorce siarki elementarnej – roztwór nasycony S 8 w nC6,
1 g gleby pobrany z okolic Politechniki Gdańskiej ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 5 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Politechniki Gdańskiej ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 30 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Rafinerii Gdańskiej – Lotos Lab. ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka
pobrana na głębokości 5 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Rafinerii Gdańskiej – Lotos Lab. ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka
pobrana na głębokości 30 cm),
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

11
1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 5 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 30 cm).
2.1.4. Substancje wzorcowe i badane próbki - HPLC
(Reference substances and examined samples- HPLC)
Materiały (wzorce oraz próbki) użyte do badań techniką HPLC:
wzorce siarki elementarnej – roztwór nasycony S 8 w rozpuszczalniku,
1 g gleby pobrany z okolic Politechniki Gdańskiej ekstrahowany w 3 ml rozpuszczalnika (próbka
pobrana na głębokości 5 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Politechniki Gdańskiej ekstrahowany w 3 ml rozpuszczalnika (próbka
pobrana na głębokości 30 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Rafinerii Gdańskiej – Lotos Lab. ekstrahowany w 3 ml rozpuszczalnika
(próbka pobrana na głębokości 5 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Rafinerii Gdańskiej – Lotos Lab. ekstrahowany w 3 ml rozpuszczalnika
(próbka pobrana na głębokości 30 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml rozpuszczalnika (próbka
pobrana na głębokości 5 cm),
1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml rozpuszczalnika (próbka
pobrana na głębokości 30 cm).
W zależności od fazy ruchomej rozpuszczalnikami były:
n-heksan (n-C6) do HPLC Merck (Niemcy),
dichlorometan (DCM) pure min. 99% Chempur (Polska)
eter tert-butylowo-metylowy (MTBE) do HPLC Merck (Niemcy),
acetonitryl (ACCN) LiChrosolv (Niemcy),
aceton cz.d.a. POCh (Polska).
acetonitryl (ACCN) +1% izopropanol (IzOH)
aceton + 0,25% izopropanol (IzOH)
MTBE+0,25% IzOH
MTBE+5% IzOH
2.2. Aparatura i wyposażenie- TLC
(Instruments and equipments -TLC)
Aparatura, wyposażenie dla dwóch rodzajów badań techniką cienkowarstwowej chromatografii
cieczowej w normalnych oraz odwróconych układach faz (NP-TLC / RP-TLC) przedstawiono w tabeli nr 3.
Tabela 3. Aparatura, wyposażenie użyte w badaniu techniką TLC (NP-TLC oraz RP-TLC)
Table 3. Apparatus and equipment used in the technique TLC (NP-TLC and RP-TLC)
Aparatura oraz wyposażenie (Apparatus and equipment)
Lampa UV TB Telbid typ TB 02, długość fali 254 i 365 nm
Strzykawka: Mikrostrzykawka chromatograficzna o maksymalnej pojemności 100 μL
Szklana komora chromatograficzna
Bibuła do chromatografii cienkowarstwowej
Wirówka
Technika (Technique)
NP-TLC
RP-TLC
Rodzaj płytki TLC
2.3. Aparatura i wyposażenie- HPLC
(Instruments and equipments -HPLC)
Płytka TLC Silicagel 60 F254 (HX55003535, firma Merck, kraj pochodzenia
Niemcy) z fluoresceiną, o wymiarach 5 x 10 cm
Płytka TLC Silicagel 60 RP-18 F254S (HX44673134, firmy Merck, kraj pochodzenia
Niemcy) o wymiarach 5 x 7 cm
Aparatura oraz wyposażenie użyte do analizy techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej
kolumnowej w normalnym oraz odwróconym układzie faz HPLC (NP-HPLC oraz RP-HPLC) przedstawione
zostały w tabeli nr 4.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

12
Tabela. 4. Aparatura oraz wyposażenie zastosowane w analizach techniką HPLC (NP-HPLC oraz RP-
HPLC).
Table. 4. Instruments and equipment used in HPLC technique analyzes (NP-HPLC and RP-HPLC).
Aparatura
/wyposażenie
Charakterystyka (opis)(Characteristics (description))
(Apparatus and
equipment)
Aparat
chromatograficzny
(Chromatographic
apparatus)
Detektory
(Detectors)
Oprogramowanie
(Software)
Strzykawka (Syringe)
Chromatograf cieczowy LaChrom (Merck-Hitachi, Niemcy-Japonia), wyposażony w
czterokanałowy system elucji gradientowej z zaworami proporcjonującymi, wyposażony w
pompę Hitachi L-7110, zawór dozujący Rhodyne Rh-7125i z pętlą dozującą 1200 μL oraz
termostat Cobrabid 7350i-Polska
detektor spektrofotometryczny z matrycą fotodiodową typu UV-DAD L-7450A oraz
detektor refraktometryczny RID L-7490 –połączone szeregowo
oprogramowanie HSM-7000, wersja 3.1.1.
mikrostrzykawką chromatograficzną o maksymalnej pojemności 100 μL
Wirówka (Centrifuge)
Wirówka do odwirowania osadu w fiolkach z roztworami
2.4. Warunki chromatograficzne - TLC
(Chromatographicconditions – TLC)
Warunki chromatograficzne użyte w badaniu techniką NP-TLC:
Fazy ruchome:
• n-heksan (n-C6) do HPLC Merck (Niemcy),
• eter tert-butylowo-metylowy (MTBE) do HPLC Merck (Niemcy),
• n-heksan (nC6) + 5% MTBE
• MTBE+ 0,25% izopropanolu (IzOH)
Objętość dozowanej próbki: 5 µl / 50 µl
Płytka: Płytka TLC Silicagel 60 F 254 (HX55003535, firma Merck, kraj pochodzenia Niemcy) z
fluoresceiną, o wymiarach 5 x 10 cm
Stężenie próbki: 1 g gleby / 3 ml rozpuszczalnika
Warunki chromatograficzne użyte w badaniu techniką RP-TLC:
Fazy ruchome:
• n-heksan (n-C6) do HPLC Merck (Niemcy),
• tetrahydrofuran (THF) do HPLC Merck (Niemcy),
• acetonitryl (ACCN) LiChrosolv (Niemcy),
• MTBE+ 0,25% izopropanolu (IzOH)
• MTBE + 5% izopropanolu (IzOH)
• n-heksan (nC6) + 0,25% izopropanolu (IzOH)
• n-heksan (nC6) + 1% izopropanolu (IzOH)
• dichlorometan (DCM) + 0,25% izopropanolu (IzOH)
• tetrahydrofuran (THF) + 0,25% izopropanolu (IzOH)
• tetrahydrofuran (THF) + 1% izopropanolu (IzOH)
• aceton +0,25% izopropanolu (IzOH)
• acetonitryl (ACCN)+1% IzOH
Objętość dozowanej próbki: 5 µl / 50 µl
Płytka:Płytka TLC Silicagel 60 RP-18 F 254 S (HX44673134, firmy Merck, kraj pochodzenia Niemcy) o
wymiarach 5 x 7 cm
Stężenie próbki: 1 g gleby / 3 ml rozpuszczalnika
2.5. Warunki chromatograficzne - HPLC
(Chromatographic conditions – HPLC)
Warunki chromatograficzne wykorzystane do badaniu techniką wysokosprawnej chromatografii
cieczowej kolumnowej w normalnym oraz odwróconym układzie faz HPLC (NP -HPLC oraz RP-HPLC)
przedstawione zostały w tabeli nr 5.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

13
Tabela. 5. Warunki chromatograficzne zastosowane w badaniu techniką HPLC (NP-HPLC oraz RP-HPLC).
Table. 5. Chromatographic conditions used in HPLC technique (NP-HPLC and RP-HPLC).
Warunki stałe dla wszystkich analiz techniką HPLC (NP-HPLC oraz RP-HPLC)
(Constant conditions for all analyzes HPLC (NP-HPLC and RP-HPLC))
Objętość dozowanej próbki (Volume of dosing sample) 25 μL
Przepływ (Flow)
NP-HPLC
RP-HPLC
Technika (Technique)
NP-HPLC
RP-HPLC
2 ml/min
Kolumny HPLC (HPLC kolumn)
Kolumna Macherey-Nagel HPLC 250x4 mm, pakowana z
Nucleosil SiO 2, 100Å,3 μm (Niemcy)
Kolumna Symmetry C18, 100Å, 5 µm, 4,6 mm X 250 mm,
(Waters, USA)
Faza ruchoma
n-heksan (nC6)
MTBE
n-heksan (nC6)
dichlorometan (DCM)
acetonitryl (ACN)
acetonitryl (ACN) +1% izopropanol (IzOH)
aceton
aceton + 0,25% izopropanol (IzOH)
MTBE
MTBE+0,25%IzOH
MTBE+5%IzOH
2.7. Przygotowanie badanych próbek dla obu technik (TLC i HPLC)
(Preparation of tested samples for both techniques (TLC and HPLC))
Każdą próbkę gleby pobierano z dwóch głębokości 5 i 30 cm, masa próbki mieściła się
w granicach 200-300 g. Następnie metodą ćwiartowania wydzielono po 1,00 g gleby (+/- 0,01 g) do szklanej
fiolki i dodawano 3,00ml (+/- 0,01 ml) rozpuszczalnika/ekstrahenta. Potem potrząsano energicznie każdą
fiolką, aby siarka i inne składniki gleby wyekstrahowały. Po 10 min energicznego wytrząsania odwirowano
osad na wirówce (1400 obrotów/min).
2.8. Przygotowanie wzorców dla obu technik (TLC i HPLC)
(Preparation of standards for both techniques (TLC and HPLC))
W celu przygotowania roztworów wzorcowych siarki odważono 0,20 mg siarki (+/-0,01 mg) (w postaci
siarki elementarnej S 8 ) do fiolki i dodano 1 ml rozpuszczalnika. Następnie energicznie potrząsano fiolką
przez około 2 min (aby osad-siarka się rozpuścił).
2.9. Metody postępowania - TLC
(Methods - TLC)
Na płytkę TLC nanoszono 5 µl / 50 µl najpierw wzorca siarki elementarnej (pierwsza plamka), a
następnie roztworów przygotowanych z pobranych próbek gleby ekstrahowanych w n-heksanie. Plamki
znajdowały się w odległości 1 cm od siebie. Odparowano n-heksan pod wyciągiem, a następnie rozwinięto
poszczególne płytki w zależności od badania, w różnych rozpuszczalnikach. Wszystkie płytki poddane były
wizualizacji pod lampą UV w świetle 254 oraz 365 nm.
2.10. Metody postępowania - HPLC
(Methods - HPLC)
Ustabilizowano układ chromatograficzny. Następnie ustawiono prędkość przepływu eluentu na 2,0
ml/min. Następnie wprowadzono do pętli zaworu dozującego (za pomocą strzykawki chromat ograficznej)
kolejno próbki o objętości 25 µl.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

14
3. Wyniki
(Results)
3.1. Wyniki – identyfikacja siarki w próbkach gleby techniką TLC
(Results - identification of sulfur in the soil samples by TLC technique)
Przeprowadzono identyfikacje siarki elementarnej w próbkach za pomocą współczynnika Rf oraz k.
Wszystkie wartości przedstawione zostały w tabeli nr 6 (gdzie a odległość plamk i od startu [cm], b-długość
całkowita rozawijania [cm]).
Tabela 6. Zestawienie wartości współczynników: Rf (współczynnika opóźnie nia), k (współczynnika retencji)
dla układów TLC pod światłem 254 nm dla wzorca siarki (roztwór nasycony siarki elementarnej)
Table 6. Summary of factors: Rf (coefficient of delay), k (retention factor) for TLC systems under the light of
254 nm for standard of sulfur (saturated solution of elemental sulfur)
Technika (Technique)
NP-TLC
RP-TLC
Rozpuszczalnik
(Solvent)
a b Rf k Rm
DCM 3,95
0,79 0,27 -0,56
MTBE 3,51 0,70 0,43 -0,84
5
nC6 3,00 0,60 0,67 -0,41
nC6+5% MTBE 3,45 0,69 0,45 -0,80
MTBE+0,25% IzOH 2,81 0,56 0,79 -0,24
DCM 4,29 5,5 0,78 0,28 -1,27
nC6 5,20
0,65 0,54 -0,61
DCM + 0,25% IzOH 7,48 0,94 0,064 -1,19
nC6 + 0,25% IzOH 5,21 0,65 0,54 -0,28
nC6 + 1% IzOH 5,44 0,68 0,47 -0,33
THF 6,48 0,81 0,24 -0,62
THF+ 0,25% IzOH 6,48 0,81 0,24 -0,62
THF+ 1% IzOH 6,08 0,76 0,32 -0,49
ACCN 1,28 0,16 5,25 1,66
8
ACCN + 1% IzOH 2,32 0,29 2,45 0,89
Aceton 3,12 0,39 1,56 0,19
Aceton+0,25%IzOH 3,84 0,48 1,08 0,03
nC6 + 5% MTBE 4,00 0,50 1 0
MTBE 5,04 0,63 0,59 -0,53
MTBE+0,25% IzOH 5,44 0,68 0,47 -0,75
MTBE+5% IzOH 6,80 0,85 0,18 -1,73
Do faz ruchomych, które po dodaniu dodatku (w postaci niewielkiej ilości izopropanolu lub MTBE,
od 0,25-5 %) współczynnik R f wzrósł należą:
nC6 z dodatkiem IzOH (RP-TLC),
ACN z dodatkiem IzOH (RP-TLC),
Aceton z dodatkiem IzOH (RP-TLC),
MTBE z dodatkiem IzOH (RP-TLC),
nC6 z dodatkiem MTBE (NP-TLC),
DCM z dodatkiem IzOH (RP-TLC),
Natomiast do faz ruchomych, w których współczynnik R f maleje po dodaniu dodatku należą:
nC6 z dodatkiem MTBE (RP-TLC),
THF z dodatkiem IzOH (RP-TLC),
MTBE z dodatkiem IzOH (NP-TLC).
Porównanie wszystkich wartości Rf dla wszystkich przygotowanych faz ruchomych przedstawiono
rysunku nr 2 i 3.
na
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

MTBE
MTBE+0.25%IzOH
nC6
nC6+5%MTBE
DCM
Rf
nC6
nC6+0.25%IzOH
nC6+1%IzOH
nC6+5%MTBE
DCM
DCM+0.25%IzOH
ACN
ACN+0.25%IzOH
Aceton
Aceton+1%IzOH
MTBE
MTBE+0.25%IzOH
MTBE+5%IzOH
THF
THF+0.25%IzOH
THF+1%IzOH
Rf
15
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Rozpuszczalnik
Rys. 2. Wartości współczynnika Rf dla rozpuszczalników – RP-TLC
Fig. 2. The values of Rf factor for solvents – RP-TLC
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Rozpuszczalnik
Rys. 3. Wartości współczynnika Rf dla rozpuszczalników – NP-TLC
Fig. 3. The values of Rf factor for solvents – NP-TLC
Dla analizy techniką TLC wyznaczono również przyrost względny (dla używania fazy ruchomej bez
oraz z dodatkiem). Wykorzystano do tego wzór poniżej (1). Natomiast wyniki obliczeń przedstawione zostały
w tabeli 7 i 8.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

16
Przyrost względny:
P w = ∆k / k bd (
(1)
gdzie:
P w – przyrost względny
∆k – różnica między wartością k dla czystego eluentu i wartością k dla eluentu
z dodatkiem (w zależności od przyrostu mniejsza liczba odejmowana od większej)
k bd – wartość k dla czystego eluentu (bez dodatku)
Tabela 7. Przyrost względny dla badania techniką RP-TLC
Table 7. Relative increase for examination by RP-TLC technique
Faza ruchoma (Mobile phase) Rf k
Względny przyrost
(The relative growth)
nC6 0,65 0,54 -
nC6 + 0,25 % IzOH 0,65 0,54 0
nC6 + 1 % IzOH 0,68 0,47 -0,13
nC6+5%MTBE 0,63 0,59 0,09
DCM 0,78 0,28 -
DCM + 0,25 % IzOH 0,65 0,54 0,93
THF 0,84 0,19 -
THF + 0,25 % IzOH 0,81 0,23 0,21
THF + 1 % IzOH 0,76 0,32 0,68
ACN 0,16 5,25 -
ACN + 1 % IzoOH 0,29 2,45 -0,53
Aceton 0,39 1,56 -
Aceton + 0,25 % IzOH 0,48 1,08 0,31
MTBE 0,63 0,59 -
MTBE + 0,25 % IzOH 0,68 0,47 0,20
MTBE + 5 % IzOH 0,85 0,20 0,66
Tabela 8. Przyrost względny dla badania techniką NP-TLC
Table 8. Relative increase for examination by NP-TLC technique
Faza ruchoma (Mobile phase) Rf k
Względny przyrost
(The relative growth)
nC6 0,60 0,67 -
nC6 + 5 % MTBE 0,69 0,45 0,33
MTBE 0,70 0,43 -
MTBE+0,25%IzOH 0,56 0,79 -0,84
3.2. Wyniki – identyfikacja siarki w próbkach gleby techniką HPLC
(Results - identification of sulfur in the soil samples by HPLC technique)
Na rys. 4 zamieszczono typowe chromatogramy detektora UV-VIS-DAD, otrzymane dla mieszaniny
wzorcowej siarki elementarnej eluowanej n-heksanem w warunkach NP-HPLC na żelu krzemionkowym, rys.
5a-f zamieszczono przykłady chromatogramów, otrzymanych w warunkach NP -HPLC, z n-heksanem, jako
eluentem. Na rys. 6a-c odpowiednio chromatogramy dla kolumny C18. Widać, że wzorzec siarki daje tylko
jeden pik, natomiast w przypadku ekstraktów gleb, pojawia się większa ilość pików, która odpowiada za
zanieczyszczenia gleby w postaci węglowodorów aromatycznych. Obie techniki wykazały, iż elementarna
siarka znajduje się w znacznych ilościach w glebie pobranej z terenów Zakładów Chemicznych oraz terenu
Lotos Lab, które również wykazują obecność innych zanieczyszczeń-węglowodorów.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

17
Tabela 9. Czasy retencji oraz współczynniki retencji wyznaczone dla wzorca siarki (roztwór nasycony siarki
elementarnej)
Table 9. The retention times and the retention factors determined for standard of sulfur (saturated solution of
elemental sulfur)
Technika
(Technique)
Faza
ruchoma
(Mobile phase)
tR
[min]
k
(dla
t0=0,97
min)
(x0,62)
k
(dla t0=
1,18 min)
(x0,75)
k
(dla t0=
1,26 min)
(x0,80)
k
(dla t0=
1,46 min)
NP-HPLC nC6 1,55 0,60 0,31 0,23 0,06
RP-HPLC
nC6 1,49 0,16 0 -0,10 0,02
DCM 1,22 -0,05 -0,22 -0,27 -0,16
ACCN 5,96 3,62 2,82 2,59 3,08
ACCN+1%IzOH 6,26 3,85 3,01 2,77 3,29
Aceton 2,63 1,04 0,69 0,58 0,80
Aceton+0,25%IzOH 2,60 1,02 0,67 0,57 0,78
C
Rys. 4. Chromatogram wzorca siarki (25 µl 0,20 mg siarki elementarnej ekstrahowana w nC6, przepływ 2 ml/min,
kolumna Kolumna Macherey-Nagel HPLC o wymiarach 250 x 4 mm, pakowana z Nucleosil SiO2, 100Å, 3 μm (Niemcy) ,
faza ruchoma: nC6, detekcja UV-VIS-DAD, A-Widmo, B- chromatogram UV-VIS/DAD, piki: 1- S8; C – nałożone piki
chromatograficzne, dla 240, 320, 374 nm.
Fig. 4. Chromatogram of standard of sulfur (25 µL 0,20 mg of elemental sulfur dissolved in nC6, flow of 2 ml / min,
Column Macherey-Nagel HPLC with dimensions 250 x 4 mm, packed with Nucleosil SiO2, 100Å, 3 microns (Germany)
mobile phase: nC6, detection UV-VIS-DAD A-spectrum, B- chromatogram UV-VIS / DAD, peaks: 1- S8, C- imposed
chromatographic peaks for 240, 320, 374 nm .
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

18
Rys. 5. Chromatogramy dla warunków NP-HPLC; przepływ: 2 ml/min, kolumna Kolumna Macherey-Nagel HPLC o
wymiarach 250 x 4 mm, pakowana z Nucleosil SiO2, 100Å, 3 μm (Niemcy), faza ruchoma: nC6, detekcja UV-VIS-DAD,
A-Widmo, B-UV-VIS/DAD, objętość dozowania 25 µl:
a. 1 g gleby pobrany z okolic Politechniki Gdańskiej ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 5 cm),
b. 1 g gleby pobrany z okolic Politechniki Gdańskiej ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 30 cm),
c. 1 g gleby pobrany z okolic Rafinerii Gdańskiej – Lotos Lab. ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana
na głębokości 5 cm), (Piki: 1-węglowodory, 2-S8),
d. 1 g gleby pobrany z okolic Rafinerii Gdańskiej – Lotos Lab. ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana
na głębokości 30 cm), (Piki: 1-węglowodory, 2-S8),
e. 1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 5 cm), (Piki: 1-węglowodory, 2-S8),
f. 1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 30 cm). (Piki: 1-węglowodory, 2-S8).
Fig. 5. The chromatograms conditions for NP-HPLC; flow rate: 2 ml / min column column Macherey-Nagel HPLC with
dimensions 250 x 4 mm, packed with Nucleosil SiO2, 100A, 3 microns (Germany), mobile phase: NC6, detection UV -
VIS-DAD, A-spectrum, B-UV -VIS / DAD, dosage volume of 25 ml:
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

19
a) 1 g soil taken from the vicinity of the Technical University of Gdansk extracted in 3 ml of nC6 (sample taken at a
depth of 5 cm),
b) 1 g soil taken from the vicinity of the Technical University of Gdansk extracted in 3 ml of nC6 (sample taken at a
depth of 30 cm),
c) 1 g soil taken from the vicinity of Gdansk Refinery - Lotos Lab. extracted in 3 ml of nC6 (a sample taken at a
depth of 5 cm) (Peaks: 1-hydrocarbons, 2-S8),
d) 1 g soil downloaded from the vicinity of Gdansk Refinery - Lotos Lab. extracted in 3 ml of nC6 (sample taken 30
cm) (Peaks: 1-hydrocarbons, 2-S8),
e) 1 g of soil taken from the area of the Department of Chemical extracted in 3 ml of nC6 (sample taken at a depth
of 5 cm) (Peaks: 1-hydrocarbons, 2-S 8),
f) 1 g of soil taken from the area of the Department of Chemical extracted in 3 ml of nC6 (sample taken at a depth
of 30 cm). (Peaks: 1-hydrocarbons, 2-S8).
Rys. 6. Chromatogramy dla warunków RP-HPLC; przepływ: 2 ml/mi, kolumna: Kolumna Symmetry C18, 100Å, 5 µm, o
wymiarach 4,6 mm x 250 mm, (Waters, USA), faza ruchoma: nC6, detekcja UV-VIS-DAD, A-Widmo, B-UV-VIS/DAD,
objętość dozowania 25 µl :
a. 0,20 mg siarki elementarnej ekstrahowana w nC6,
b. 1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 5 cm) (Piki:1-mikropyły gleby, 2- S8, 3-węglowodory). BF- przepływ zwrotny,
c. 1 g gleby pobrany z okolic Zakładu Chemicznego ekstrahowany w 3 ml nC6 (próbka pobrana na
głębokości 30 cm) (Piki:1-mikropyły gleby, 2- S8, 3-węglowodory). BF- przepływ zwrotny.
Fig. 6. chromatograms for the conditions of RP-HPLC; flow rate: 2 ml / ml; column: Symmetry C18, 100Å, 5 µm, 4,6 mm
x 250 mm, (Waters, USA), mobile phase: NC6, detection UV-VIS-DAD, A-spectrum, B-UV -VIS / DAD, dosage volume of
25 µl:
a. 0.20 mg of elemental sulfur in nC6 extracted,
b. 1 g of soil taken from the area of the Department of Chemical extracted in 3 ml of nC6 (sample taken at a depth
of 5 cm) (Peaks 1-microdustof soil, 2-S 8, 3-hydrocarbons). BF- backflow,
c. 1 g of soil taken from the area of the Department of Chemical extracted in 3 ml nC6 (sample taken at a depth of
30 cm) (Peaks 1-microdust of soil, 2-S8, 3-hydrocarbons). BF- backflow.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

20
4. Dyskusja
(Discussion)
Dobór warunków ekstrakcji - ługowania siarki elementarnej i innych nisko polarnych składników gleby
oraz warunków elucji - optymalnym ekstrahentem do badań z zastosowaniem HPLC, tak z polarnym
sorbentem typu „SiO 2 ” żel krzemionkowy, czy z sorbentem niepolarnym typu C18 lub podobnym, powinien
spełniać kilka warunków:
• powinien być względnie dobrym rozpuszczalnikiem siarki i tych innych składników gleby, które mają
być identyfikowane i oznaczane;
• by możliwa była identyfikacja siarki na podstawie przebiegu jej widma UV-VIS – Rys.1;
• powinien nie absorbować światła UV w zakresie najkorzystniej od 200-400 nm;
• powinien posiadać taką samą lub niższą siłę elucyjną niż eluent, a w przypadku stosowania elucji
gradientowej niż początkowy eluent program elucji, a najkorzystniej być eluentem i lub posiadać
skład początkowego etapu programu elucji;
• w warunkach normalnych układów faz (NP -HPLC) oraz polarnego sorbentu jako wypełnienia
kolumny, eluent zapewniający retencję bardzo nisko polarnej siarki powinien być nisko polarny, a
sorbent o możliwie wysokiej polarności, taki jak, żel krzemionkowy, NH 2 , czy tlenku glinu, albo inny;
• w warunkach chromatografii, adsorbcyjnej z kolumną do odwróconych układów faz typu C18, czy
phenyl lub bi-phenyl, eluent z pewnością nie może zawierać wady, ani prostych alkoholi, w których
siarka jest całkowicie nierozpuszczalna. Jednocześnie elucja wysoce hydrofobowej siarki wymaga
także względnie nisko polarnego eluentu.
W praktyce, tak w warunkach NP, jak i z fazą stacjonarną C18, eluent w warunkach izokratycznych,
początkowy etap programu elucji powinien być odpowiednio: cieczą nisko, lub względnie nisko polarną. Dla
elucji siarki , potencjalnymi eluentami lub składnikami eluentu, które powinny w dużych zawartościach
stanowić eluent, lub być jednymi jego składnikami, są alkany, cykloalkany, chloro -alkany, estry alifatyczne i
ewentualnie estry typu octan etylu, lub propylu.
W niniejszych badaniach – doświadczalnie ustalono, że rozpuszczalność siarki w nC6 w temp.
pokojowej wynosi około 0,20 mg/ml. W warunkach NP zastosowano żel krzemionkowy jako fazę
stacjonarną oraz n-heksan albo eter metylowo-tertbutylowy (MTBE) jako eluent, dozując za każdym razem
roztwory wzorców i ekstrakty gleby jako roztwory w n-heksanie (pkt. 2.4.1.).
Natomiast, z zastosowaniem sorbentu niepolarnego typu C18 w badaniach uwzględniono jako
eluenty: n-heksan, MTBE, dichlorometan (DCM), acetonitryl (ACCN), ACCN+1% izoproponalu (IzOH),
aceton oraz aceton+0,25%IzOH (tabela nr 8), dozując za każdym razem roztwory wzorcowe i ekstrakty
gleby w danym eluencie jako rozpuszczalniku, stosowano wyłącznie elucję izokratyczną.
W celu elucji z kolumny składników gleby o podwyższonym powinowactwie do fazy stacjonarnej
zamiast elucji gradientowej lub blokowej zmiany siły elucji zastosowano przepływ zwrotny eluentu w
kolumnie, tak w kolumnie typu żel krzemionkowy jak i w typu C18.
1. Aby podnieść granicę detekcji oraz precyzje oznaczania obecności oraz zawartości siarki metodą
TLC należałoby zwiększyć dozowaną próbkę z 5 do 50 μL za pomocą automatycznego dozowania,
w celu uzyskania jednej wielkości plamek (dozowanie manualne przy takiej ilości dozowanej może to
wykluczyć i obniżyć precyzje badania).
2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa kolumnowa w normalnym układzie faz odnajduje również
zastosowanie w oznaczaniu obecności oraz zawartości siarki elementarnej w próbkach gleby.
Optymalnymi warunkami chromatograficznymi dla analizy techniką NP-HPLC są n-heksan jako faza
ruchoma, przepływ 2 mL/min, 25 µL dozowanej próbki oraz kolumna z Nucleosil SiO 2 100 3 μm
(Niemcy), przy detekcji RID oraz UV-VIS/DAD.
3. Aby podnieść granicę detekcji NP-HPLC UV-VIS/DAD należy zastosować metodę dodatku wzorca
wewnętrznego.
4. Każde z zastosowanych w badaniach warunków chromatograficznych (NP, RP) są przydatne do
"analityki", gdy gleba nie zawiera "kontaminantów" nisko polarnych - z ropy naftowej lub węgla. Gdy
zwiera - piki niektórych składników / grup składników nakładają się na pik siarki, a gdy - dodatkowo -
zawartość siarki jest niska, albo tylko śladowa, to studia i badania wykazały, że zastosowanie do
tych badań detektora typu DAD jest bardzo ważne, ponieważ dodatkowo zapewnia "identyfikację"
siarki na podstawie charakterystycznego dla niej widma w zakresie UV – rys. 1.
5. Detekcja RID, jest przydatna w analizach tylko w przypadku znacznych stężeń siarki w glebie, do
tego nie umożliwia uzyskania dodatkowej informacji - widma, i identyfikacja jest możliwa tylko na
podstawie wartości "k".
6. Otwartym problemem badawczym pozostaje przygotowanie próbek do analizy.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

21
5. Wnioski
(Conclusions)
1. Technika TLC może znaleźć zastosowanie do identyfikacji oraz oznaczania zawartości siarki
elementarnej w glebie jako „pół-ilościowa” metoda przesiewowa, obniżając czas i koszt badań.
Wynika to z względnie wysokich poziomów LOD / LOQ oraz niewielkiej precyzji.
2. Na podstawie badań wykazano, że najbardziej korzystne warunki identyfikacji i oznaczania siarki
rodzimej w glebach mogących jednocześnie zawierać nisko i średnio polarne zanieczyszczenia
pochodzenia naftowego oraz po-węglowego, jest ekstrakcja / ługowanie rozpuszczalnikiem
alifatycznym, np. n-heksanem oraz wykorzystanie NP-HPLC/UV-VIS-DAD /RID do rozdzielania od
innych składników matrycy analitycznej, identyfikacji oraz oznaczania siarki elementarnej. W razie
takiej potrzeby opracowana metodyka umożliwia identyfikację określonych składników oraz
oznaczenie orientacyjnej zawartości nisko i średnio polarnych zanieczyszczeń gleby.
3. Siarka jest "mikroelementem" dla niektórych roślin uprawnych, a szczególnie – fungicydem i coraz
częściej bywa w tym ostatniej funkcji stosowana. Niniejsza praca ma więc znaczenie dla rolnictwa.
Opracowanie i walidacja tego typu procedury analitycznej wymaga jeszcze dalszych badań.
1. The TLC technique can be used for identification and dete rmination of elemental sulfur in the soil as
"semi-quantitative" method of screening, reducing the time and cost of testing. This is due to the
relatively high levels of LOD / LOQ small and precise.
2. Studies have shown that the most favorable conditions for the identification and determination of
native sulfur in soils, which may also include low- and medium-polar impurities from petroleumcarbon
is the extraction / leaching of the aliphatic solvent, such as N-hexane, and the use of NP-
HPLC / VIS-UV-DAD / RID separation from other matrix analysis components, for identification and
determination of elemental sulfur. If necessary, this developed methodology enables the
identification of specific components and the determination of the orientation content low a nd
medium polar soil contamination.
3. Sulfur is "micronutrient" for some crops, particularly - a fungicide and is increasingly used in this last
function. This work is significant for agriculture. Development and validation of this type of analytical
procedure still requires further research.
6. Literatura
(Literature)
1. A. S. Modaihsh, W. A. Al-Mustafa, A. I. Metwally, Effect of elemental sulphur on chemical changes
and nutrient availability in calcareous soils, Plant and Soil, Vol. 116, 1989.
2. T. Bereda, „Siarka”, „Sulphur”, Państwowy Instytut Geologiczny, 2010.
3. A. Gąsiewicz, M. Jasionowski, A. Poberzhskyy, „Wpływ eksploatacji na cechy geochemiczne
środowiska powierzchniowego złóż siarki z pogranicza polsko-ukraińskiego”, The impact of
exploitation on the geochemical features of the environment of Surface deposits of sulfur from the
border of Polish-Ukrainian, Biuletyn Państwowego Instytutu Geologicznego 449, 2012.
4. E. Gutman, K. Kwiecień, „Polska Siarka”, Polish Sulphur, Zakład Wyd.-Usług. Adam Konieczny,
Warszawa, 1992.
5. T. Fernandes, Guidelines for Landfill Disposal of Sulfur Waste and Remediation of Sulfur Containing
Soils, Alberta Environment, 2011.
6. A. Bellok, E. Górecka, A. Kryza, M. Szuwarzyński, „Wpływ zakładów przemysłowych na
rozmieszczenie metali ciężkich w glebach i podgłebiu obszaru Trzebinia-Chrzanów”, The impact of
industrial plants on the distribution of heavy metals in the soil and subsoil area of Trzebinia-
Chrzanów, Przegląd Geologiczny, Tom 45, Nr 5, 1997.
7. A. S. Modaihsh, W. A. Al-Mustafa, A. I. Metwally, Effect of elemental sulphur on chemical changes
and nutrient availability in calcareous soils, Plant and Soil, Vol. 116, 1989.
8. G. Kulczycki, „Wpływ nawożenia siarką elementarną na zawartość mikroelementów w roślinach i
glebach”, Effect of fertilization by elemental sulfur on the content of micronutrients in plants and soils,
Katedra Żywienia Roślin, Roślin, Akademia Rolnicze we Wrocławiu, Zeszyty Problemowe Postępów
Nauk Rolniczych, Zeszyt 502, 2004.
9. C. Yu-Wei, H. A. Joly, N. Belzile, Determination of elemental sulfur in environmental samples by gas
chromatography-mass spectrometry, Chemical Geology, Vol. 137, 1997.
10. J. K. Bartlett, D. A. Skoog, Colorimetric Determination of Elemental Sulfur in Hydrocarbons,
Analytical Chemistry, Vol. 26, No. 6, 1954.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

22
11. J. H. Watkinson, A. Lee, D. R. Lauren, Measurement of elemental sulfur in soil and sediments - Field
sampling, sample storage, pretreatment, extraction and analysis by high performance liquid
chromatography, Australian Journal of Soil Research, Vol. 25 No. 2, 1987.
12. D. G Maynard, P. A. Addison, Extraction and colorimetric determination of elemental sulfur in organic
horizons of forest soils, Canadian Journal of Soil Science, Vol. 65, 1985.
13. K. Bielecki, G. Kulczycki, „Modyfikacja metody Buttersai Chenery’ego oznaczanie siarki ogólnej w
roślinach I glebie”, The modified method of Butters and Chenery'ego determination of total sulfur in
plants and soil, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Przemysł Chemiczny 91/5, 2012.
14. Development and validation of analytical methods for elemental sulfur in Alberta soils, Maxxam
Analytics, Government of Alberta, 2015.
15. G. Gryglewicz, S. Gryglewicz, Determination of elemental sulfur in coal by gas chromatographymass
spectrometry, Fresenius Journal of Analytical Chemistry, Vol.370, 2001.
16. K. Kuklińska, M. Cieszyńska, L. Wolska, J. Namieśnik, Analytical and bioanalytical problems
associated with the toxicity of element al sulfur, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 48, 2013.
17. W. Puacz, W. Szahun, J. Siepak, T. Sobczyński, Determination of Selected Sulphur Speciation
Forms in Fresh Water Lakes and Bottom, Poznań, Polish Journal of Environmental Studies, vol. 10,
No. 5, 2001.
18. D. G. Maynard, P. A. Addison, Extraction and colorimetric determination of elemental sulfur in
organic horizons of forest soils, Canadian Journal of Soil Science, Vol. 65, 1985.
19. K. Boratyński, A. Grom, M. Ziętek, „Badania nad zawartością siarki w glebie”, Research on sulfur
kontent in soil, Roczniki Gleboznawcze T. XXVI, Z. 3, Warszawa, 1975.
20. J. J. Richard, R. D. Vick, G. A. Junk, Determination of elemental sulfur by gas chromatography,
Environmental Science and Technology, Vol. 11, No. 12, 1977.
21. J. Namieśnik, J. Łukasiak, Z. Jamrógiewicz, „Pobieranie próbek środowiskowych do analizy ”,
Environmental sampling for analysis, PWN, Warszawa, 1995.
22. M. Bamberg, Gmelin Handbuch der Anorganischen Chemie, Schwefel, Teil A, Lieferung 3, VCH,
Weinheim, 1953, Dissertation, Univ. Saarbrücken, 1959.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

CAMERA SEPARATORIA
Volume 8, Number 1 / June 2016, pp. 23-31
Paweł PISZCZ, Bronisław K. Głód*
Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych,
Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce.
*Autor do korespondencji, e-mail: bkg@onet.eu
Właściwości antyoksydacyjne ziół zbadane rożnymi metodami
Streszczenie: Celem pracy było oszacowanie wartości całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) wodnych
ekstraktów ziół za pomocą różnych technik analitycznych. W metodzie odniesionej do rodników hydroksylowych rodniki
te były generowane w reakcji Fentona. Produkt ich reakcji z kwasem p-hydroksybenzoesowym oznaczany był za
pomocą HPLC/UV. Drugim celem było zbadanie możliwości oszacowania wartości CPA ekstraktów za pomocą HPLC z
detekcją elektrochemiczną (ED). W tym przypadku oczekuje się, że próg wykrywalności metody będzie znacznie niższy
od metod elektrochemicznych. W stosunku do metod opartych na generacji różnych rodników (w tym do opisanych w
literaturze chromatograficznej) jej zaletą było możliwość odniesienia CPA do antyoksydantów różnej mocy poprzez
zmianę potencjału elektrody pracującej. Wyniki skorelowane zostały z wartościami CPA odniesionymi do rodnika DPPH
oraz całkowitą zawartością polifenoli w próbce.
Słowa kluczowe: ekstrakty ziół, całkowity potencjał antyoksydacyjny, HPLC, DPPH, polifenole
The antioxidative properties of herbs estimated using various assays
Abstract: The aim of the paper was the estimation of total antioxidant potential (TAP) of aqueous extracts of herbs using
various analytical assays. In the assay related to the hydroxyl radicals they were generated by Fenton's reaction. The
product of their reaction with p-hydroxybenzoic acid was determined using HPLC/UV. The second aim was to investigate
the possibility to estimate of TAP values of extracts by HPLC with the electrochemical detection (ED). In this case, it is
expected much lower detection limit than that observed in the classical electrochemical methods. In comparison to the
methods based on the generation of various radicals (including these described in the chromatographic literature) the
advantage of the described assay was its ability to relate TAP to various antioxidants by changing the potential of the
working electrode. The results were correlated with the TAPs values related to the DPPH radicals as well as to the total
polyphenols content in the sample.
Key words: herbal extracts, total antioxidant potential, HPLC, DPPH, polyphenols
1. Wstęp
(Introduction)
Nie wiemy dlaczego się starzejemy i umieramy. Nie istnieje żadna teoria tłumacząca te procesy.
Wśród wielu hipotez ważną jest wolnorodnikowa. Rodniki są też istotne w olbrzymiej większości chorób jako
przyczyna, skutek bądź efekt uboczny [1]. Odgrywają one też pozytywną rolę ale ich nadmiar jest
zdecydowanie negatywny dla człowieka. W toku ewolucji organizmy żywe nauczyły się je usuwać
wytwarzając zmiatacze wolnych rodników (czasami utożsamiane z antyoksydantami) [9]. Niedomiar tych
ostatnich może być podawany z pożywieniem [13]. W szczególności wiele antyoksydantów występuje w
ziołach [17, 8].
Od dawna człowiek poszukiwał środków leczniczych do zwalczania gnębiących go chorób, utrzymania
dobrej kondycji, poprawy swego wyglądu, również w celu zwiększenia odporności organizmu i przedłużenia
życia. Tymi środkami były przede wszystkim różnorodne zioła rosnące w jego najbliższym otoczeniu. W
ziołach występują między innymi naturalne przeciwutleniacze takie jak polifenole, a w szczególności
flawonoidy i antocyjany, które mają zdolność do zmiatania reaktywnych form tlenu [22].
W badaniach in vitro dowiedziono, że flawonoidy występujące w liściach miłorzębu zabezpieczają
komórki hipokampa przed tworzeniem polipeptydu β-amyloidu odpowiedzialnego za rozwój choroby
Alzheimera. W leczeniu Alzheimera można zastosować również liście szałwii, której składniki działają
antyoksydacyjnie, przeciwzapalnie i sedatywnie [14]. Właściwości zdrowotne niektórych powszechnie
stosowanych ziół znane są już od stuleci, ich aktywność zależy przede wszystkim od ilości składników
bioaktywnych. Zioła takie jak majeranek, czosnek, tymianek czy rozmaryn są szeroko używane do
przygotowania wielu potraw w kuchni europejskiej. Ponadto zioła stosowane jako składniki diety, zaliczane
są do bardzo ważnych czynników prewencyjnych niektórych chorób.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

24
Antyoksydanty mogą być oznaczane wieloma technikami analitycznymi [16, 12, 7]. Często jest to
utrudnione lub niemożliwe gdy skład próbki jest nieznany albo gdy antyoksydanty reagują ze sobą lub
współdziałają. Wówczas oznaczana jest sumaryczna wielkość, całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA),
zależna od sumy ze stężeń wszystkich antyoksydantów przemnożonych przez ich st ałe szybkości reakcji z
rodnikami. W literaturze stosuje się wiele nazw tej wielkości [4]. Ponieważ wiele antyoksydantów działa na
podobnej zasadzie dlatego nie jest istotne stężenie poszczególnych z nich co jest dodatkową zaletą
stosowania pomiarów CPA. W pracy przedstawione zostaną próby zastosowania do oznaczeń CPA ziół
trzech opracowanych lub opracowywanych jeszcze przez nas nowych metod, (i) CPA odniesionego do
rodnika hydroksylowego [11], (ii) mierzone jako sumaryczne pole powierzchni wszystkich pików
chromatograficznych utlenianych na elektrodzie detektora elektrochemicznego [19] oraz (iii) jako pole
powierzchni pików różnicowej woltametrii pulsowej, w której potencjał odniesiony jest do rodnika
hydroksylowego i występuje w funkcji eksponencjalnej [2, 10]. Wyniki skorelowane zostaną z klasyczną
metodą odniesioną do rodnika DPPH oraz z całkowitym stężeniem polifenoli w próbce.
2. Materiał i metody badań
(Materials and methods)
2.1. Aparatura
(Apparatus)
Pomiary chromatograficzne przeprowadzono na zestawie HPLC z dwoma detektorami,
fotometrycznym i elektrochemicznym. W jego skład (Knauer, Berlin, Niemcy) wchodzi system naboru danych
(Smartline Menager 5000) z wbudowanym degazerem, podstawka na zbiorniki eluentu, mieszadło eluentu
(Dynamic Mixing Chamber), gradientowa pompa HPLC Smartline-1000, detektor spektrofotometryczny
(DAD) Smartline-2600, detektor amperometryczny (Recipe, Berlin, Niemcy) ClinLab EC3000 (elektroda
pracująca: elektroda z węgla szklistego, GC; elektroda odniesienia: Ag/AgCl; elektroda pomocnicza: Pt),
autosampler Smartline-3900, termostat powietrzny kolumn Smartline-4000, kolumna Eurosper RP -18 5 µm,
250 x 4 mm I.D. (Knauer), oprogramowanie do naboru i obróbki danych chromatograficznych – ClarityChrom
i EuroChrom.
pH roztworów mierzono na pH-metrze OP-208/1 firmy RADELKIS (Budapeszt, Węgry). Pomiary
kolorymetryczne prowadzono na fotometrze firmy Thermo Spectronic, model - Helios Epsilon (USA) oraz
spektrofotometrze Beckam DU68.
Pomiary woltamperometryczne prowadzono na potencjostacie AUTOLAB P GSTAT 12, firmy ECO
Chemie B.V. (Utrecht, Holandia) sterowanym programem GPES 4,9 z układem trójelektrodowym (elektroda
pracująca z węgla szklistego (GC); chlorosrebrowa elektroda odniesienia oraz elektroda pomocnicza
wykonana z drutu platynowego).
2.2. Odczynniki
(Reagents)
W pracy wykorzystano kwas p-hydroksybenzoesowy (p-HBA), 3,4-dihydroksybenzoesowy (3,4-DHBA)
oraz 3,4,5-trihydroksybenzoesowy (galusowy, 3,4,5-THBA), siarczan (VI) żelaza (II), metanol, DPPH - 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl, kwas kamfosulfonowy (Sigma – Aldrich), 95% kwas siarkowy (VI); kwas
askorbinowy, brom, wolframian sodowy, molibdenian sodowy, bezwodny węglan sodowy, kwas
ortofosforowy, siarczan litu (POCh, Gliwice, Polska), wodorotlenek sodu, etanol, wodorofosforan sodu,
diwodorofosforan sodu, nadtlenek wodoru (Chempur, Piekary Śląskie, Polska).
Wszystkie badane zioła oprócz, kwiatu bławatka i malwy czarnej zostały zebrane na Podlasiu w
okresie od maja do lipca 2009 r. Kwiat malwy czarnej został zakupiony w zakładzie zielarskim KAWON-
HURT, Krajewice 119, Gostyń, a kwiat bławatka w sklepie Dary Natury, Mirosław Angielczyk, Koryciny 73,
Grodzisk. Ekstrakty pozyskano z następujących ziół: chaber, kwiat bławatka (Centaurea cyanus), babka
(zwyczajna) lancetowata szerokolistna (Plantago major), babka lancetowata wąskolistna (Plantago
lanceolata), herbata (Herba thea), drapacz lekarski (Cnicus benedictus), dziurawiec zwyczajny (Hypericum
perforatum), hyzop lekarski (Hyssopus officinalis), lawenda lekarska (wąskolistna) (Lavandula angustifolia),
lebiodka pospolita (oregano) (Origanum vulgare), lipa szerokolistna (Tilia platyphyllos), majeranek
(Origanum majorana), malwa czarna (Alcea rosea), melisa lekarska (Melissa officinalis), mięta polna
(Mentha arvensis), mięta meksykańska (Agastache mexicana), mięta pieprzowa (Mentha piperita), miłorząb
japoński, dwuklapowy (Ginkgo biloba), nagietek lekarski (Calendula officinalis), nostrzyk żółty (Melilotus
officinalis), oregano, lebiodka pospolita (Origanum vulgare), podbiał pospolity (Tussilago farfara), pokrzywa
zwyczajna (Urtica dioica), poziomka pospolita (Fragaria vesca), rdest ptasi (Polygonum aviculare), skrzyp
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

25
polny (Equisetum arvense), szałwia wieszcza (Salvia divinorum), szałwia lekarska drobnolistna (Salvia
officinaalis).
2.3. Procedury pomiarowe
(Procedures)
Badane zioła były rozcierane w moździerzu w celu uzyskania jednorodnej mieszaniny. Następnie
odważono 0,2 g na 10 ml trójkrotnie destylowanej wody stosowanej do ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz
0,5 g na 25 ml wody stosowanej do parzenia. Zaró wno proces ekstrakcji jak i parzenia trwały 20 minut.
Przygotowane w ten sposób napary były wirowane i sączone przez sączek nylonowy o średnicy porów 0,45
μm (Millipore, USA). Ekstrakty przechowywane były w zamrażarce w temperaturze -26ºC. Początkowe
stężenie każdego z przygotowanych naparów wynosiło 0,02 g/ml (20 g/l).
CPA odniesione do rodników hydroksylowych (CPA OH ) ekstraktów ziół badano, opisaną wcześniej
przez nas, metodą HPLC/UV wykorzystującą rodniki hydroksylowe wytworzone w rekcji Fentona (0,3% wodę
utlenioną, roztwór żelaza (II) i bufor fosforanowy o pH=7,4) [18].
Zawartość polifenoli w ziołach zbadano wykorzystując zmodyfikowaną metodę Folina-Ciocalteua (FC)
[5] W reakcji polifenoli z odczynnikiem FC tworzą się niebieskie tlenki wolframu (W 8 O 23 ) i molibdenu
(Mo 8 O 23 ), których maksimum absorbancji jest przy 765 nm. Oznaczenie wykonano dodając do kolby
miarowej o objętości 10 cm 3 50 µl próbki o początkowym stężeniu 0,02 g/ml i 1 cm 3 odczynnika FC. Po 3
min. dodano 4 cm 3 20% Na 2 CO 3 i uzupełniono wodą do kreski. Następnie przez 30 min. próbki były
przechowywane w zaciemnionym miejscu w celu ustabilizowania się reakcji. Po tym czasie wykonano
pomiary kolorymetryczne przy długości fali 765 nm w stosunku do ślepej próby, będącej mieszaniną
odczynników bez dodatku próbki. Wynik oznaczenia podano jako równowartość kwasu galusowego na 1 g
suchego zioła (mg GAE/g).
Pomiar CPA DPPH polegał na zmieszaniu porcji roztworu badanej próbki i metanolu (całkowita objętość
próbki i metanolu wynosiła 1 cm 3 ) z 1 cm 3 1 mM DPPH rozpuszczonym w metanolu. Mieszaninę energicznie
wytrząsano i pozostawiono na 30 min. w temp. pokojowej w ciemności. Zmiany absorbancji roztworu
mierzono na fotometrze przy długości fali 517 nm. Wyniki zostały przeliczone na zawartość kwasu
galusowego na 1 g suchego zioła (mg GAE/g).
Pomiary chromatograficzne z detekcją elektrochemiczną (zakres potencjałów, E = 0 ÷ 1,0 V)
przeprowadzono w układzie faz odwróconych (RP -C18) na kolumnie Eurospher C18 (Knauer), jako fazę
ruchomą zastosowano bufor fosforanowy (pH=6,6). Pomiary prowadzono w temperaturze 20°C. Szybkość
przepływu fazy ruchomej wynosiła 1 ml/min, a objętość nastrzykiwanej na kolumnę próbki 20 μl. Miarą CPA
było sumaryczne pole powierzchni wszystkich pików eluowanych do 30 minuty trwania analizy.
Pomiary elektrochemiczne prowadzono w naczyńku elektrochemicznym o objętości 10 ml. Jako
elektrolit podstawowy zastosowano mieszaninę 100 mM NaClO 4 w 0,1 M roztworze buforu fosforanowego o
pH = 7,4 z dodatkiem kwasu kamfosulfonowego (o stężeniu końcowym 1 mM), dodawanym w celu ochrony
elektrody pracującej przed nieodwracalną adsorpcją różnych związków z badanego roztworu. Szybkość
skanowania wynosiła 200 mV/s, pomiary prowadzono w dodatnim zakresie potencjałów E = 0 ÷ 1,5 V. Przed
każdym pomiarem elektroda pracująca była mechanicznie czyszczona pastą diamentową oraz zawiesiną
wody i tlenku glinu o grubości ziaren 1 µm. Wszystkie analizowane roztwory były odtleniane za pomocą
argonu przez 5 minut.
3. Wyniki i dyskusja
(Results and discussion)
3.1. CPA ziół w odniesieniu do rodnika hydroksylowego
(TAP OH of herbs related to the hydroxyl radicals)
Najbardziej reaktywnym i szkodliwym jest rodnik hydroksylowy. Na dodatek występuje on naturalnie w
organizmach żywych. Dlatego sensowne wydawało się aby zbadać właściwośc i antyoksydacyjne ziół
właśnie w stosunku do tego rodnika. Metoda pomiaru polega na wytworzeniu rodnika hydroksylowego w
reakcji Fentona [12, 20]. Rodnik reaguje wówczas z sensorem (czyli związkiem, którego produkt reakcji z
rodnikiem można łatwo oznaczać analitycznie). Produkt reakcji rodnika z sensorem oznaczany jest
chromatograficznie. Pomiar wykonuje się powtórnie po dodaniu do układu badanej próbki. Miarą CPA jest
różnica pola powierzchni pików chromatograficznych produktu reakcji rodnika z sensorem przed i po dodaniu
próbki do układu.
Jedynym ziołem, w którym dało się zaobserwować wyraźny spadek wysokości i pola powierzchni piku
3,4-DHBA była pokrzywa. W pozostałych próbkach zmiany pola powierzchni oznaczanego piku były
nieznaczne i mieściły się w granicach niepewności pomiarowej. Te małe zmiany pola powierzchni piku lub
ich brak mogą świadczyć o tym, że antyoksydanty zawarte w badanym ekstrakcie występują w zbyt małym
stężeniu, bądź występują antyoksydanty o (i) silnych właściwościach redukcyjnych, takich jak wit. C (kwas
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

26
askorbinowy), które redukują jony Fe(III) do Fe(II) zwiększając stężenie rodników hydroksylowych lub (ii)
kompleksujących żelazo. Oznacza to, że pomiarów CPA odniesionych do rodnika hydroksylowego nie
można zastosować do badania ziół. Podobne ograniczenie zaobserwowano w przypadku pomiaru CPA
osocza i/lub surowicy krwi [9] w tym przypadku spowodowane jest to dużym stężeniem jonów żelaza
powstających w wyniku lizy erytrocytów.
3.2. CPA mierzone za pomocą HPLC z detekcją elektrochemiczną (ED)
(TAP measured by HPLC with electrochemical detection (HPLC-ED))
CPA ekstraktów ziół mierzony za pomocą HPLC/ED polegał na analizie chromatograficznej badanej
próbki. Jeśli potencjał elektrody pracującej ustawimy tak aby uzyskać dodatnie piki chromatogra ficzne to
oznaczamy wówczas te składniki próbki, które ulegają utlenianiu, czyli antyoksydanty. Miarą CPA jest
sumaryczne pole powierzchni pod wszystkimi pikami chromatograficznymi. Pomiary takie można by było
wykonać bez kolumny chromatograficznej (FIA). Wadą tego byłby wpływ objętości martwej układu na
pomiary CPA. Zastosowanie HPLC ma tę dodatkową zaletę, że można wyznaczyć CPA poszczególnych
związków lub grup związków rozdzielanych chromatograficznie. Pomiary można wykonywać przy różnych
potencjałach elektrody pracującej, tzn. odnosić CPA do różnych rodników. Przy niskich potencjałach
oznaczane są tylko mocne antyoksydanty, przy wysokich – jednocześnie silne i słabe antyoksydanty.
Pomiary wykonane przy różnych potencjałach umożliwiają uzyskanie hydrodyna micznych woltamogramów,
znacznie bardziej czułych (z powodu bardzo dużych prądów konwekcyjnych i minimalnych prądów
pojemnościowych) niż uzyskiwanych klasycznymi metodami woltametrycznymi [ 19]. Wadą tej metody jest to,
że próbki rzeczywiste mogą zanieczyszczać elektrodę pracującą i wskazane jest jej czyszczenie
mechaniczne po każdym użyciu.
Przykładowe chromatogramy HPLC uzyskane przy różnych potencjałach elektrody pracującej
przedstawiono na rysunku 1. Okazało się, że optymalną wartością potencjału wybraną do oznaczeń był 0,6
V. Przy niższym potencjale oznaczane piki były niskie, ich pola powierzchni obarczone były dużą
niepewnością pomiaru. Przy wyższych potencjałach nie zaobserwowano pojawiania się nowych pików na
chromatogramach (pochodzących od słabszych antyoksydantów), a jedynie wzrost ich całkowitego pola
powierzchni, natomiast potencjał elektrody pracującej był mniej odtwarzalny i elektroda częściej się
„zatruwała” co wymagało jej czyszczenia niemal po każdym pomiarze. Z otrzymanych hydrodynamicznyc h
woltamogramów (rys. 2) wynika, że CPA, można odnieść do niskocząsteczkowych, polarnych związków,
wymywanych w pobliżu objętości martwej kolumny (do 4 min.) oraz bardziej niepolarnych, dużych związków
organicznych. W przypadku mięty pieprzowej większy udział w CPA mają związki charakteryzujące się
większą retencją, a więc prawdopodobnie o większych cząsteczkach i mniej polarne, np. flawonoidy. W
przypadku mięty pieprzowej związki wysokocząsteczkowe stanowią ok. 96% sumarycznego pola
powierzchni dla niższych i ok. 93% dla wyższych potencjałów. Odpowiedzialne są one za drugą falę
utleniania. Dla innych ziół związki wysokocząsteczkowe stanowią dużo mniejszy procent sumarycznego pola
powierzchni piku.
Rys. 1. HPLC chromatogramy,
mięty pieprzowej o stężeniu 0,02
g/ml. Warunki chromatograficzne:
kolumna - Eurospher C18, 5 µm,
250 x 4 mm (Knauer); temperatura
20 °C; faza ruchoma - bufor
fosforanowy (pH 6,6); - szybkość
przepływu: 1 ml/min, detekcja
elektrochemiczna (E = 0,2 V ÷ 0,8 V
vs Ag/AgCl).
Fig. 1. HPLC chromatograms of
0.02 g/mL peppermint.
Experimental conditions: column –
Eurospher C18, 5 µm, 250 x 4 mm
(Knauer); temperature – 20°C;
mobile phase – phosphate buffer
(pH 6.6); flow rate – 1 mL/min,
electrochemical detection (E = 0.2 V
÷ 0.8 V vs Ag/AgCl).
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

CPA/TAP [nA·s]
27
150
100
niskocząsteczkowe/low molecular
wysokocząsteczkowe/high molecular
suma/sum
50
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
E [V]
Rys. 2. Hydrodynamiczny woltamogram mięty pieprzowej o stężeniu 0,02 g/ml. Warunki chromatograficzne: kolumna -
Eurospher C18 250 x 4 mm (Knauer); temp. – 20 ° C; faza ruchoma - bufor fosforanowy (pH=6,6); szybkość przepływu - 1
ml/min, detektor elektrochemiczny (E = 0,0 V ÷ 1,0 V vs Ag/AgCl).
Fig. 2. Hydrodynamic voltammogram of 0.02 g/ml peppermint. Experimental conditions: column - Eurospher C18 250 x
4 mm (Knauer); temp. – 20 ° C; mobile phase – phosphate buffer (pH 6.6); flow rate - 1 ml/min, electrochemical detection
(E = 0,0 V ÷ 1,0 V vs Ag/AgCl).
Wartości CPA ED badanych ziół, uzyskane dla potencjałów 0,6 V i 1 V, zostały zestawione w tabeli 1.
Okazało się, że najsilniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi charakteryzuje się majeranek, a
następnie szałwia drobnolistna i pokrzywa. Najmniejszą wartość CPA ED uzyskano dla babki lancetowatej
wąskolistnej, babki zwyczajnej i dziurawca. Wartość natężenia prądu wzrasta wraz ze wzrostem potencjału.
Ta zależność jest liniowa. Dlatego należy spodziewać się korelacji między wartościami CPA ED
wyznaczonymi przy różnych potencjałach, ale nie należy oczekiwać, że będzie ona wprost proporcjonalna.
Dlatego korelacja pomiędzy wartością CPA ED i potencjałem jest nieliniowa (rys. 2). Ze wzrostem potencjału
obserwuje się nieliniowy wzrost prądu. Niemniej jednak, okazało się, że istnieje dość dobra korelacja
pomiędzy wartościami CPA ED uzyskanymi przy dwóch różnych wartościach potencjału elektrody pracującej
(rysunek 3). Przecięcie korelacji z osią wartości CPA ED1.0 na rysunku 3 jest większe od zera, co oznacza, że
niektóre przeciwutleniacze można zaobserwować jedynie przy przyłożeniu napięcia 1,0 V do elektrody
pracującej. Podział pomiędzy silne i słabe przeciwutleniacze układa się w różny sposób dla różnych ziół
(rysunek 4).
Rys. 3. Korelacja pomiędzy wartościami CPA ED0.6 i CPA ED1.0 .
Fig. 3. Correlation between TAP ED0.6 and TAP ED1.0 .
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

28
Rys. 4. Wartości CPA ED0.6 (szare słupki) oraz CPA ED1.0 (suma szarych i czarnych) ziół.
Fig. 4. TAP ED0.6 (gray bars) and TAP ED1.0 (sum of gray and black bars) values of various herbs.
Zaobserwowano również dość dobrą korelację między wartościami CPA DPPH i CPA FCR uzyskanymi
stosując parzenie i ekstrakcję w aparacie Soxhleta jako sposoby przygotowania próbek. Dla obu zależności
regresja była zbliżona do jednego. Linia trendu przecina oś odpowiednio w wartościach 8,9 i 2,5 GAE dla
CPA FCR(SOX) (rysunek 5a) i CPA DPPH(SOX) (rysunek 5b). Oznacza to, że ekstrakcja za pomocą aparatu
Soxhleta jest bardziej skuteczna niż parzenie w procesie przygotowania próbki.
Rys. 5. Korelacja wartości (A): CPA FCR i (B): CPA D PPH próbek uzyskanych stosując parzenie i ekstrakcję w aparacie
Soxhleta.
Fig. 5. Correlation between (A): TAP FCR and (B): TAP DPPH values of samples obtained using infusion and extraction in a
Soxhlet apparatus.
3.3. Elektrochemiczny pomiar CPA
(Voltammetric measurements (TAP DPV ))
Z chemicznego punktu widzenia antyoksydanty są reduktorami. Dlatego możliwe jest ich oznaczanie
metodami elektrochemicznymi, a zwłaszcza technikami woltamperometrycznymi. Analiza danych dostarcza
tu dwóch ważnych parametrów: potencjału piku anodowego utleniania oraz natężenia prądu piku.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

29
Wykorzystanie tych dwóch parametrów do oceny antyoksydantów zaproponowali po raz pierwszy Chevion i
in. [6]. Potencjał piku jest bezpośrednio związany z potencjałem formalnym układu redoks, E ’o , do którego
należy antyoksydant, co pozwala ocenić, czy zajdzie reakcja z danym odczynnikiem utleniającym. Potencjał
formalny można zatem uznać za miarę mocy antyoksydacyjnej. Posługując się tym kryterium, Blasco i in. [3]
wyróżnili antyoksydanty o dużej (E o = 0,3 V) i średniej mocy (E o = 0,5 V). Yang i in. [21] zaproponowali
ocenę mocy antyoksydacyjnej flawonoidów na podstawie wartości potencjału piku anodowego utleniania.
Niezależnie od nich, Kilmartin i in. wykorzystali potencjały pierwszego piku anodowego w woltamperometrii
cyklicznej do charakterystyki polifenoli występujących w winach oraz w naparach herbaty i kawy [15].
Opisane metody można zastosować do tych próbek, w których jeden lub dwa silne antyoksy danty występują
w dużym stężeniu. W przypadku skomplikowanych próbek zaproponowana przez nas została metoda
polegająca na oznaczaniu pola powierzchni pod krzywą woltametryczną w której oś potencjałowa została
zamieniona na eksponent z potencjału mierzonego w stosunku do rodnika hydroksylowego [2, 10].
3.4. Korelacja różnych CPA
(Correlation between various TAPs)
CPA w odniesieniu do rodnika DPPH wyznaczono dla wodnych ekstraktów uzyskanych w aparacie
Soxhleta. Wyniki zestawiono w tabeli 1. Dla naparów wodnych wyekstrahowanych w aparacie Soxhleta
najwyższe wartości CPA miały melisa, dziurawiec, oregano i skrzyp. Zdolności oksydacyjne nagietka,
miłorzębu japońskiego oraz bławatka były małe.
Zaobserwowano dobrą, wprost proporcjonalną zależność między CPA odniesione do rodnika DPPH, a
całkowitym stężeniem polifenoli (rys. 6) oraz między CPA wyznaczonym za pomocą HPLC/ED przy różnych
potencjałach elektrody pracującej (tabela 1). Technika ta jest bardzo przydatna w oszacowywaniu
właściwości antyoksydacyjnych, ponieważ możemy oznaczać mocne bądź, równie ważne, słabe
antyoksydanty w zależności od ustawionego potencjału elektrody pracującej. Nie stwierdzono natomiast
korelacji pomiędzy CPA wyznaczonym elektrochemicznie (DPV), a innymi metodami (DPPH, ED, FC), które
znacznie różnią się od siebie. Metody oparte na słabych rodnikach, jakim jest DPPH, są czułe na próbki
zawierające tylko silne przeciwutleniacze.
Rys. 6. Korelacja pomiędzy CPA DPPH i CPA FCR .
Fig. 6. Correlation between TAP DPPH and TAP FCR .
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

30
Tabela 1. CPA ziół zbadanych różnymi technikami.
Table 1. TAP of herbs obtained using different assays.
Examined herbs
TAP FCR TAP DPPH TAP DPV TAP ED0.2V TAP ED0.6V TAP ED1.0V
H2O H2O SOX H2O H2O SOX
Ribwort plantain 31.7 34.2 16.9 18.5 - 0.02 0.9 14.7
Broadleaf plantain 22.5 46.5 18.2 22.4 - 1.3 1.5 18.4
St. John's wort 66.4 75.0 26.3 39.2 - 0.2 6.4 19.2
Mexican mint 27.1 42.7 6.9 12.2 - 3.3 13.7 20.8
Pot marigold 7.8 10.7 0.8 0.5 0.16 0.5 6.9 29.0
Cornflower 3.1 9.8 0.6 3.8 0.26 0.2 7.3 29.7
Field Mint 33.5 43.9 15.2 21.3 1.31 3.6 14.8 29.8
Common Knotgrass 10.9 24.6 1.5 12.6 - 0.9 5.7 31.6
Ginkgo biloba 2.7 14.5 1.6 3.9 0.37 0.8 7.1 33.6
Coltsfoot 31.6 31.5 12.7 12.9 0.92 1.0 6.1 33.9
Narrow-leaved lavender 22.4 29.0 12.0 13.8 - 3.6 22.3 38.1
Wild strawberry 35.0 64.1 18.9 22.8 1.87 0.4 18.3 46.3
Oregano 57.0 78.5 32.5 36.7 - 4.2 31.5 63.0
St. Benedict's thistle 7.9 22.6 6.9 11.8 - 23.4 31.7 67.5
Peppermint 41.5 61.9 17.3 20.5 - 1.2 23.4 69.0
Yellow melilot 10.7 12.9 3.3 4.5 0.11 2.9 28.3 81.9
Hyssop 44.0 47.9 15.5 17.7 0.92 0.5 35.8 86.8
Lemon balm 114.2 124.5 41.2 52.0 2.81 1.9 65.7 92.3
Field horsetail 47.3 57.7 17.2 32.2 1.96 5.2 92.7 135.4
Black hollyhock 38.5 38.2 13.6 16.2 1.16 5.3 43.9 138.5
Stinging nettle 13.1 20.1 5.1 7.7 0.87 34.9 90.4 148
Common sage 30.7 38.3 9.0 12.9 1.11 10.6 144.2 214.2
Marjoram 55.1 61.8 19.0 18.9 1.42 7.7 138.6 287.0
Explanatory notes:
TAP DPV – total surface area under the DPV curve (∙10 -6 ), TAP ED [µA∙s] - total surface area of all chromatographic peaks
recorded at 0.2, 0.6 or 1.0 V, TAP D PPH [GAE] - total antioxidant potential related to the DPPH radicals and TAP FCR [GAE]
- the total content of polyphenol estimated using, Folin-Ciocalteu reagent. For all experiments, RSD was < 5%.
Objaśnienia:
CPA DPV – pole powierzchni pod krzywą DPV(∙10 -6 ), CPA ED (µA·s) – całkowite pole powierzchni wszystkich pików
zarejestrowanych na chromatogramie względem potencjału elektrody pracującej (0,6 lub 1 V), CPA DPPH (GAE) –
całkowity potencjał antyoksydacyjny względem rodnika DPPH oraz FC (GAE) – całkowita zawartość polifenoli, odczynnik
Folina-Ciocalteua. RSD

31
[2] Biernacka I.A., Kiersztyn I., Głód B.K., Piszcz P., Wantusiak P.M.: Metody woltametryc zne w
wyznaczaniu całkowitego potencjału antyoksydacyjnego w emulsjach. Cam. Sep., 2013, 5s, 37.
[3] Blasco A.J., Rogerio M.C., Gonzalez M.C., Escarpa A.: Electrochemical index as a screening method to
determine total polyphenolics in foods: a proposal. Anal. Chim. Acta, 2005, 539 (1-2), 237-244.
[4] Chen R., Stenken J.A.: An in vitro hydroxyl radical assay for microdialysis sampling calibration. Anal.
Biochem., 2002, 306 (1), 40-49.
[5] Cheung L.M., Cheung P.C., Ooi V.E.C.: Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom
extracts. Food Chem., 2003, 81 (2), 249-255.
[6] Chevion S., Roberts M.A., Chevion M.: The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant
capacity. Free Rad. Biol. Med., 2000, 28 (6), 860-870.
[7] Cybul M., Nowak R.: Przegląd metod stosowanych w analizie właściwości antyoksydacyjnych wyciągów
roślinnych. Herba Polonica, 2008, 54 (1), 68-78.
[8] Dimitrios B.: Sources of natural phenolic antioxidants. Trends Food Sci. Tech., 2006, 17 (9), 505-512.
[9] Gil R., Głód B.K., Kulawik T., Woźniak A.: Changes of the total antioxidant potential in blood serum of
acute myocardial infarction patients treated by fibrynolysis or angioblasty. J. Vascular Res., 2004, 41
(S2), 45.
[10] Głód B.K., Kiersztyn I., Wantusiak P.M., Piszcz P.: Various electroanalytical assays used for the
determination of total antioxidant potential (TAP) in food. Cam. Sep., 2013, 5s, 39.
[11] Głód B.K., Piszcz P., Czajka K., Zarzycki P.K.: A new total antioxidant potential measurements using
RP-HPLC assay with fluorescence detection. J. Chromatogr. Sci., 2011, 49 (5), 401-404.
[12] Głód B.K., Piszcz P., Kiersztyn I., Lamert A., Zarzycki P.K.: Application of HPLC assay to the
measurements of total antioxidant potential, free radicals and antioxidants. Cam. Sep., 2009, 1, 41-66.
[13] Grajek W.: Rola przeciwutleniaczy w zmniejszaniu ryzyka wystąpienia nowotworów i chorób układu
krążenia. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2004, 1 (38), 3-11.
[14] Halliwell B.: The antioxidant paradox. Lancet, 2000, 355 (9210), 1179-1180.
[15] Kilmartin P.A., Hsu C.F.: Characterization of polyphenols in green, oolong, and black teas, and in
coffee, using cyclic voltammetry. Food Chem., 2003, 82 (4), 501-512.
[16] Prior R.L., Cao G.: In vivo total antioxidant capacity: comparison o f different analytical methods. Free
Radical Biol. Med. 1999, 27 (11-12), 1173-1181.
[17] Sroka Z., Żukowski P., Cisowski W.: Badanie aktywności przeciwutleniającej wyciągów uzyskanych z
liści buka (Fagi folium) i z ziela dziurawca (Hyperici herba). Adv. Clin. Exp. Med., 2003, 12 (3), 273-280.
[18] Wantusiak P.M., Głód B.K.: Application of UV detection in HPLC in the total antioxidant potential assay.
Cent. Eur. J. Chem., 2012, 10 (8), 1788-1790.
[19] Wantusiak P.M., Piszcz P., Głód B.K.: A fast and simple method for the measurement of total
antioxidant potential and a fingerprint of antioxidants. J. Chromatogr. Sci., 2012, 50 (10), 909-913.
[20] Winterbourn Ch.C.: Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicol. Lett., 1995,
82/83, 969-974.
[21] Yang B., Kotani A., Arai K., Kusu F.: Estimation of the antioxidant activities of flavonoids from their
oxidation potentials. Anal. Sci., 2001, 17 (5), 599-604.
[22] Ziemlański Ś., Wartanowicz M.: Rola antyoksydantów żywieniowych w stanie zdrowia i choroby . Ped.
Współ. Gastr., Hepat. i Żyw. Dziecka, 1999, 1 (2-3), 97-105.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

CAMERA SEPARATORIA
Volume 8, Number 1 / June 2016, pp. 32-44
Dorota CHRUSZCZYK, Marian KAMIŃSKI*
Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej,
ul. Gabriela Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, Poland
*Autor do korespondencji, e-mail: markamin@pg.gda.pl
Stopniowa chromatografia cienkowarstwowa w normalnych układach faz (NP-TLC),
jako technika rozdzielania i oceny składu grupowego frakcji asfaltenowych
z utleniania pozostałości próżniowej ropy naftowej
Streszczenie: W pracy opisano wyniki badań nad opracowaniem metodyki oceny składu grup owego i czystości frakcji
asfaltenowych techniką chromatografii cienkowarstwowej w normalnych układach faz (NP-TLC). Skupiono się na
doborze takich parametrów/warunków rozdzielania, jak stężenie i masa próbki, a także skład i kolejność eluentów
stosowanych podczas rozwijania chromatogramów TLC. Zastosowana trój-stopniowa metodyka polega na nałożeniu
5 µL frakcji asfaltenowej o stężeniu 2 mg/ml w dichlorometanie, w postaci plamki o jak najmniejszej średnicy na płytkę
TLC z żelem krzemionkowym typu F254. Eluenty zastosowane do rozwijania chromatogramów TLC to w kolejności:
pierwszy etap - mieszanina dichlorometan:metanol (95:5 v/v) do ok. 30% wysokości płytki, następnie: toluen do 60%
wysokości i w ostatnim etapie n-heksan nasycony wodą w 95%, na całą wysokość płytki. Procedura rozdzielania
grupowego powinna być, dodatkowo, poprzedzona oceną czystości badanych frakcji asfaltenowych na drodze
trzykrotnej elucji n-heksanem nasyconym w 95% wodą na wysokość 100% i wizualizacji pod lampą UV 365 nm - w celu
wstępnego wyjaśnienia obecności frakcji węglowodorów aromatycznych, eluowanych n-heksanem (n-C6).
Słowa kluczowe: wielostopniowa cienkowarstwowa chromatografia cienkowarstwowa w normalnych układach faz (n-St-
NP-TLC); asfalteny/frakcje asfaltenowe; skład grupowy - węglowodory nasycone/aromatyczne/polarne, asfalteny- SARA
Step normal phase thin layer chromatography (NP-TLC) as a separation technique
of asphaltenes fraction from the oxidation of petroleum vacuum residue for group
type estimation
Abstract: This paper describes the results of research on the optimal conditions development for the group type analysis
separation and the propose a methodology of evaluation group type composition and purity of the asphaltenes fraction
analysis by thin layer normal phase analysis. They focused on the selection of such parameters / separation conditions
as concentration and the mass of the sample, as well as the composition and sequence of eluents used during the
development of TLC chromatograms. Used a three-stage methodology consist in applying on a TLC F254 silica gel type
plate 5 µL of asphaltene fraction in 2 mg/mL in dichloromethane as a spot with as small as possible diameter. The
eluents were used in sequence: first step - mixture of dichloromethane:methanol (95:5 v/v) to approx. 30% of plate
height, then toluene to 60% height and n-hexane in 95% saturated with water in the whole plate height. The group type
separation procedure should be additionally preceded by asphaltenes fractions purity evaluation by three times elution
(to the 100% height) with n-hexane in 95% saturated with water and visualization in 365 nm UV lamp to clarify the
presence of aromatic hydrocarbons fractions, eluted with n-hexane (n-C6).
Key words: multistage normal phase thin layer chromatography (n-St-NP-TLC); asphaltenes/asphaltenes fractions;
hydrocarbon group type separation and analysis - saturated/aromatic/polar hydrocarbons, asphaltenes- SARA
1. Wstęp
(Introduction)
Asfalteny to składniki asfaltów naturalnych lub rop naftowych i węgli kamiennych, znajdujące się w
pozostałościach oraz rafinatach po ekstrakcji pozostałości z destylacji próżniowej. Wyróżnić można ponadto
frakcje asfaltenowe powstające w procesach oksydacji pozostałości próżniowej ropy naftowej. Przedmiotem
niniejszej publikacji jest opracowanie metodyki charakterystyki składu grupowego asfaltenów i frakcji
asfaltenowych. Może być ona również stosowana do rozdzielania grupowego ni elotnych, albo bardzo nisko
lotnych, naftowych lub powęglowych materiałów, zawierających w swym składzie tzw. asfalteny, stanowiące
względnie polarne frakcje, nierozpuszczalne w n-alkanach. W pracy zbadano możliwość zastosowania
planarnej cienkowarstwowej chromatografii cieczowej w normalnych układach faz (ang. Normal Phase Thin
Layer Chromatography, NP-TLC) w do rozdzielania i oceny składu grupowego asfaltenów i frakcji
asfaltenowych. Celem dalekosiężnym, jest zbadanie przydatności asfaltenów i frakcji asfaltenowych jako
potencjalnych adsorbentów w operacjach adsorpcji – desorpcji oraz chromatografii w normalnych, lub
odwróconych układach faz, w układach: ciecz – ciało stałe (L-S), lub gaz – ciało stałe (G-S).
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

33
1.1. Pojęcie składu grupowego produktów naftowych i metodyki oznaczania ich składu
grupowego
(Idea of Group – Type Content of low volatile petroleum fractions and products-methods of
determination its Group – Type Composition)
Skład grupowy tzw. ciężkich (nisko lotnych, albo nielotnych) produktów n aftowych ma ważne
znaczenie dla oceny właściwości użytkowych, przydatności materiału do dalszej przeróbki, oraz ustalenia
optymalnych warunków przebiegu procesów technologicznych rafinacji. Jest wykorzystywany podczas
komponowania produktów z zastosowaniem mieszania poszczególnych składników oraz dla oceny
właściwości użytkowych produktów. Dodatkowo, ułatwia ustalenie źródła ewentualnego skażenia środowiska
niskolotnymi, lub nielotnymi produktami naftowymi [1].
Niskolotne frakcje i produkty naftowe lub powęglowe o początkowej temperaturze destylacji powyżej
350°C składają się z tak ogromnej liczby różnego rodzaju związków chemicznych, że dotychczas nie jest i
być może nigdy nie będzie możliwe ich rozdzielanie na poszczególne składniki. Jedyną możliwością jest
zbadanie składu grupowego, do którego określania w tym przypadku ciągle jeszcze wykorzystuje się w
normach metodycznych wielostopniową adsorpcję/desorpcję w kolumnie ze świeżo aktywowanym jednym
lub kilkoma sorbentami. Elucja frakcji ma miejsce z wykorzystaniem kolejnych eluentów (desorbentów) o
wzrastającej sile elucyjnej. Zawartość poszczególnych frakcji oznacza się grawimetrycznie po odparowaniu
eluentu do tzw. stałej masy. Jako adsorbenty stosowane są najczęściej: aktywowany żel krzemionkowy [2-6],
czasem tlenek glinu [7], albo odpowiednio preparowany naturalny adsorbent - „Attapulcus Clay” [8]. W
przypadku zastosowania tych sorbentów wpływ na proces rozdzielania mają dwa zjawiska: rozpuszczalność
składników frakcji w stosowanych eluentach oraz ich powinowactwo do fazy aktywnej wypełnienia. Gdy
zastosujemy materiał taki jak kształtki szklane czy politetrafluoroetylen (PTFE), frakcjonowanie odbywa się
tylko dzięki zróżnicowaniu rozpuszczalności w płynie rozpuszczającym poszczególne frakcje [9,10]. Badan y
materiał rozdziela się najczęściej według tzw., procedury SARA (ang. Saturated, Aromatics, Resins,
Asphaltenes) na frakcję węglowodorów nasyconych (S), aromatycznych o zróżnicowanej liczbie pierścieni
aromatycznych (A), węglowodorów polarnych, tzw., „żywic” (R-Resins) oraz asfaltenów (Asph). Te ostatnie,
gdy badany materiał zawiera frakcję asfaltenową, wydziela się przed operacją adsorpcji/desorpcji na drodze
precypitacji, najczęściej we wrzącym, albo ciepłym n-heptanie (n-C7) [7,11,12] lub n-pentanie (n-C5) [8,13].
Opisane metodyki badań z wykorzystaniem precypitacji oraz kolejno – adsorpcji/desorpcji i
grawimetrii, są analitycznymi metodami bezwzględnymi, realizowanymi w skali preparatywnej lub semi -
preparatywnej. Pozwalają na uzyskanie określonej masy poszczególnych frakcji i ich wykorzystanie do
dalszych badań właściwości fizykochemicznych i składu. Podstawową wadą opisywanych metodyk
separacyjnych i analitycznych, jest ogromna praco- i czasochłonność, a także zużycie znacznych ilości
składników eluentów, co jest niezgodne z założeniami tzw. zielonych technologii i metodyk analitycznych.
W literaturze naukowej znaleźć można wiele publikacji opisujących zastosowanie wysokosprawnej
chromatografii cieczowej (ang. High Performance Liquid Chromatography, HPLC) do frakcyjnego
rozdzielania grupowego niskolotnych frakcji i produktów naftowych [14-18]. Jednakże te metodyki
separacyjne i analityczne nie znalazły dotychczas zastosowania w normach. Są one względnie kosztowne
oraz niewiele mniej czaso- i pracochłonne od opisanych wcześniej metodyk znormalizowanych, zwłaszcza te
realizowane w skali preparatywnej, z grawimetrycznym oznaczaniem. Realizowane w skali analitycznej
wymagają kalibracji za pomocą odpowiednich frakcji, otrzymanych w skali semi -preparatywnej, bądź
preparatywnej.
Metodyki HPLC znalazły dotychczas zastosowanie jedynie do badań składu grupowego naftowych
produktów o średniej lotności, takich jak oleje napędowe do silników Diesla (ON) czy paliwa do
turboodrzutowych silników lotniczych (paliwa typu JETA, lub JETB). Do rozdzielania wykorzystywano
detekcję refraktometryczną (ang. Refractive Index Detector, RID) oraz w przypadku niektórych z
opisywanych metodyk, z wykorzystaniem zwrotnego przepływu eluentu ( ang.: EBF – Eluent Back Flush) w
kolumnie HPLC. Kalibrację wykonywano względem określonych indywiduów chemicznych, reprezentujących
poszczególne grupy węglowodorów, tzn., względem: cykloheksanu – dla grupy „S”, 1-metylonaftalenu dla
grupy „A1”, fenantrenu dla grupy „A2+” oraz „R-Resins”. Gdy olej napędowy zawierał estry metylowe, lub
etylowe kwasów tłuszczowych, odpowiednio: FAME (ang.: Fatty Acids Methyl Esters), lub FAEE (Fatty Acids
Ethyl Esters), to metodyki zostawały zmodyfikowane [19-24]. Warto nadmienić, że w przypadku stosowania
HPLC do rozdzielania grupowego nisko lotnych i nielotnych frakcji i produktów naftowych można by także
zastosować podobną zasadę kalibracji, tzn., odnoszenia zawartości poszczególnych grup do względnej
zawartości ich „przedstawicieli”, np., względem skwalanu dla „S”, 1,3,5 tri-tert-butylo benzenu dla A1,
względem di-etylo-naftalenu, albo 1,4’ dietylo bifenylu dla A2, 1,4 di-etylo-antracenu dla „A3”, di-etylopirenu,
dla A4 itd.
Do rozdzielania grupowego można zaliczyć w pewnym sensie chromatografię wykluczania (dawniej ,
żelową) (ang. Size Exclusion Chromatography/Gel Permeation Chromatography, SEC/GPC), umożliwiającą
rozdzielanie pod względem wielkości cząsteczek (masy cząsteczkowej) składników badanych niskolotnych
frakcji naftowych czy powęglowych [25-28].
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

34
Skład grupowy asfaltu określić można również z zastosowaniem planarnej chromatografii
cienkowarstwowej (TLC) [29-31], planarnej chromatografii cienkowarstwowej sprzężonej z detektorem
płomieniowo-jonizacyjnym (ang. Thin Layer Chromatography Flame Ionization Detector, TLC-FID) [32-38] i
preparatywnej, odśrodkowej chromatografii cienkowarstwowej (ang. Preparative, Centrifugal Accerelated,
Radial Thin Layer Chromatography - aparat Chromatotron) [31,39]. Pierwsza technika dotyczy nie tyle
oznaczania, co oceny i orientacyjnego szacowania składu grupowego, druga i trzecia oznaczania
ilościowego poszczególnych grup składników.
Tabela 1. Zestawienie eluentów stosowanych w literaturze do rozdzielania pod względem składu grupowego
asfaltów i ciężkich frakcji z przeróbki ropy naftowej zawierających asfalteny.
Table 1. Summary of the most frequently used eluents to assess the group type composition of the bitumen
and crude oil heavy fractions content asphaltenes.
Grupa składników
(group of
compounds)
Vol. 8, No 1/2016
Związki nasycone
(Saturates)
Związki aromatyczne
(Aromatics)
TLC- SiO 2 [31] 1. eter naftowy 2. pentan:eter dietylowy (90:10 v/v)
*TLC- SiO2 [1] 3. n-heksan 2. toluen
Chromatotron-SiO2
[31,39]
TLC-FID- SiO2
[14,32,33,35,38]
Żywice
(Resins)
3. benzen:alkohol etylowy
(90:10 v/v)
1. dichlorometan:metanol
(95:5 v/v)
1. eter naftowy 2. eter naftowy:eter (8:2 v/v) 3. octan etylu
1. n-heksan 2. toluen
*TLC-FID- SiO2 [34] 3. n-heksan 2. toluen
3. dichlorometan:metanol
(95:5 v/v)
1. dichlorometan:metanol
(95:5 v/v)
TLC-FID- SiO 2
1. n-heptan 2. toluen 3. tetrahydrofuran
[36]
TLC-FID- SiO 2
3. dichlorometan:metanol
1. n-heksan 2. n-heksan:toluen (1:1 v/v)
[37]
(93:7 v/v)
* Elucja stopniowa w kolejności malejącej siły elucyjnej eluentu
W większości przypadków (tab. 1.) stosuje się rozwijanie chromatogramu TLC z zastosowaniem
trzech eluentów w kolejności wzrastającej siły elucyjnej. Najczęściej począwszy od n-heksanu lub n-heptanu
do pełnej wysokości płytki TLC/pręcika TLC-FID, przez toluen, do wysokości ok. 60% warstwy porowatej,
kończąc mieszaniną dichlorometan:metanol w stosunku 95:5 v/v do wysokości ok. 25 do 30% warstwy
wypełnienia. Rzadziej do wyeluowania związków nasyconych zastosować można eter, a w przypadku
związków aromatycznych jego mieszaniny lub roztwór n -heksan:toluen. Żywice alternatywnie eluuje się
tetrahydrofuranem lub octanem etylu, dawniej mieszaniną benzenu z alkoholem etylowym, aktualnie
niestosowaną przez wzgląd na jej toksyczność.
1.2. Komentarz do celu pracy i cel pracy
(Comment for and aim of the work )
Powyższa analiza problemu rozdzielania grupowego niskolotnych frakcji i produktów naftowych, a
także studium literatury wykonane w ramach niniejszej pracy pokazują, że chromatografia cienkowarstwowa
w normalnych układach faz (NP-TLC), a szczególnie, chromatografia cienkowarstwowa w sprzężeniu z
detekcją płomieniowo jonizacyjną (TLC-FID) to techniki rozdzielania, które powinny być szczególnie
predestynowane do rozdzielania grupowego (oznaczania jakościowego) ciężkich frakcji naftowych, a TLC-
FID także do badań ilościowych. Główną zaletą obu metodyk jest brak konieczności wcześniejszego
wydzielenia asfaltenów/frakcji asfaltenowych metodą precypitacji w n-alkanach. Technika cienkowarstwowej
chromatografii cieczowej w normalnych układach faz (NP-TLC) powinna być przydatna jako łatwa i tania
technika porównawczej oceny obecności innych, niż asfalteny frakcji w badanych frakcjach asfaltenowych,
oraz służyć do wstępnych badań nad doborem optymalnych warunków rozdzielania grupowego asfaltenów i
frakcji asfaltenowych techniką adsorpcji – desorpcji oraz kolumnowej chromatografii cieczowej. Jednak
wówczas potrzebny jest zupełnie inny skład eluentu.
Dla zidentyfikowania większości grup związków chemicznych stosuje się zwykle kilka sposobów
wizualizacji płytek TLC oraz wykonuje fotografie. W świetle widzialnym widoczna jest grupa
asfaltenów/frakcji asfaltenowej o barwie od ciemnobrązowej, do czarnej, a także część frakcji tzw. żywic o
barwie jasnobrązowej. Wizualizacja z zastosowaniem lampy UV emitującej światło o długości fali 365 nm
„ujawnia” jasnoniebieską do błękitnej fluorescencję spowodowaną przez grupy węglowodorów
aromatycznych (A1) i poliaromatycznych (A2+) oraz żywic (R) (bardziej niebieska fluorescencja). Kolejno,
wizualizując w świetle 254 nm, uwidacznia się zszarzenie płytki typu F 254 (zawierającej fluoresceinę czułą na
światło UV 254 nm) - w miejscach występowania absorpcji tego rodzaju światła, a także niekiedy słaba
Camera Separatoria

35
ciemnoniebieska lub ciemnofioletowa fluorescencja w zakresie światła widzialnego, spowodowana przez
niektóre grupy związków chemicznych, np. związki poliaromatyczne oraz żywice.
Interpretacji rozwiniętego chromatogramu dokonać można po chemicznym „wywołaniu” poprzez:
umieszczenie płytki TLC w oparach jodu, korzystnie w podwyższonej temperaturze - ok. 40°C, co
powoduje pojawienie się beżowo-brązowych adduktów jodu z większością organicznych związków
chemicznych. Jednakże operacja ta w przypadku ciężkich frakcji naftowych nie niesie dodatkowych
informacji
spryskanie płytki świeżo przygotowaną mieszaniną kwasu siarkowego i formaldehydu (98:2 v/v), co
powoduje pojawienie się w świetle 254 nm czerwonobrązowego zabarwienia w miejscu
występowania aromatycznych związków monocyklicznych i ciemnozielonego dla policyklicznych
związków aromatycznych [31]
spryskanie bądź wcześniejsza impregnacja płytki TLC siarczanem lub chlorkiem berberyny [40-43]
który, wzmacnia fluorescencję alkanów - frakcji, która w inny sposób jest niewidoczna na płytkach
TLC.
W pracach dotyczących rozdzielania grupowego produktów naftowych techniką chromatografii
cienkowarstwowej, z reguły stosowano kolejność elucji zgodną z wzrastającą siłą elucyjną. Zdaniem autorów
niniejszej publikacji i jak wykazały badania J. Gudebskiej jest to nieprawidłowe, gdyż na efekt rozdzielczy
wpływ mają dwa mechanizmy, powinowactwo grupy eluowanych składników do fazy stacjonarnej oraz ich
rozpuszczalność w stosowanych eluentach [44]. W przypadku zastosowania n -heksanu jako pierwszego
eluentu (nierozpuszczającego asfaltenów) dochodzi do utrudnienia dostępu rozpuszczalnika do składników
frakcji okludowanych wewnątrz asfaltenów lub frakcji asfaltenowych zawierających asfalteny. W niniejszej
pracy poświęconej grupowemu rozdzielaniu ciężkich frakcji naftowych zastosowano elucję stopniową w
kolejności malejącej siły elucyjnej.
Celem pracy jest opracowanie optymalnych warunków badania asfaltenów i frakcji asfaltenowych
technikami NP-HPLC oraz TLC-FID szczególnie w zakresie obecności i zawartości innych składników
grupowych, oprócz asfaltenów we frakcjach asfaltenowych i asfalcie.
2. Materiały
(Materials)
n-heptan (czda. Chempur, Polska)
membrana filtracyjna hydrofobowa z PTFE 0,45 µm, ϕ 47 mm (Merck Milipore, Niemcy)
sączek celulozowy jakościowy (Whatman)
chlorek metylenu (czda. POCH, Polska)
metanol (czda. POCH, Polska)
toluen (czda. POCH, Polska)
n-heksan (cz. do HPLC Merck, Niemcy)
płytki TLC pokryte żelem krzemionkowym SiO 2 F 254 (Merck Milipore, Niemcy)
3. Wyposażenie
(Equipment)
strzykawki mikrolitrowe 0-10 μL (Hamilton, USA)
komora wizualizacji płytek TLC z średnio- i nisko-ciśnieniową lampą rtęciową UV emitującą światło o
długości fali odpowiednio 365 i 254nm
eksykator nasycony oparami jodu
komory chromatograficzne z możliwością nasycania atmosfery parami odpowiednich eluentów
suszarka do płytek TLC (Zugil)
4. Charakterystyka materiałów wykorzystanych w badaniach
(Raw material characteristics)
Badane próbki pozyskano jako frakcje nierozpuszczalne w n-heptanie w procesie precypitacji asfaltu
drogowego 20/30 wyprodukowanego przez Lotos Asfalt (Grupa Lotos S.A.) dwoma opisanymi poniżej
metodami.
Próbkę A (ASTM D3279) uzyskano przez trzydziestominutowe ogrzewanie w temperaturze wrzenia
(98°C) pod chłodnicą zwrotną ok. 15 g asfaltu z n-heptanem w proporcji m/v 1:40, następnie mieszaninę
pozostawiono do ostygnięcia. Zawartość kolby podgrzaną do temperatury pomiędzy 38 -49°C filtrowano
przez membranę (0,45 μm) uprzednio zwilżoną 5 mL n-heptanu. Osad przemywano porcjami n-heptanu w
temperaturze pokojowej (po ok 10 mL) do momentu całkowitego wymycia frakcji w nim rozpuszczalnej i
suszono w suszarce próżniowej przez 15 min w temperaturze 104°C.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

36
Próbkę N4 (ASTM D4124) wyizolowano wykorzystując ok 6 g asfaltu i 100 mL n-heptanu
przypadającego na każdy gram surowca. Po godzinnym ogrzewaniu pod chłodnicą zwrotną w temperaturze
wrzenia n-heptanu (98°C) mieszaninę precypitującą pozostawiono do ochłodzenia oraz wydzielenia frakcji
asfaltenowej przez 16 godzin w temperaturze pokojowej bez dostępu światł a. Następnie filtrowano przez
zwilżony 5 mL n-heptanu sączek papierowy (jakościowy), osad przemywano n -heptanem. Sączek z osadem
umieszczono następnie w kolbie, do której dodano 150 mL n-heptanu i ogrzewano przez 30 min pod
chłodnicą zwrotną poddając sporadycznemu mieszaniu. Po usunięciu sączka roztwór przefiltrowano, a
wytrąconą frakcję asfaltenową wysuszono w 104°C.
Część materiału podano ługowaniu w układzie ciecz-ciało stałe z zastosowaniem n-heptanu i
przepływowej nasadki ekstrakcyjnej, niepozwalającej na zbieranie się cieczy wewnątrz gilzy ekstrakcyjnej.
Próbkę N4 oczyszczano 8 godzin, a próbkę A 20 godzin. Otrzymano w ten sposób frakcje nazwane
odpowiednio N4E i AEx.
5. Metodyka
(Methods)
Do wykonania roztworów nanoszonych na płytki TLC Si60 F 254 o wymiarach 5x10 cm wykorzystano
chlorek metylenu. Stężenia próbek wynosiły 1, 2, 5 i 10 mg/mL, a objętość nakładanych roztworów 2 i 5 μL.
Plamki nanoszono z wykorzystaniem nadmuchu zimnego powietrza mającego na celu przyspieszenie
odparowywania rozpuszczalnika, co przyczynia się do uzyskania plamek o mniejszej średnicy.
Chromatogramy rozwijane były między innymi z zastosowaniem trzech eluentów zgodnie i przeciwnie
z wzrastającą siłą elucyjną. Poniżej wymieniono szereg zastosowanych kombinacji wraz z określ eniem
wysokości elucji:
DCM:MeOH (95:5 v/v) 30%; toluen 60%; n-heksan 100%
3 x n-heksan 100%
3 x nasycony wodą w 95% n-heksan 100%
DCM:MeOH (95:5 v/v) 50%; toluen 100%
toluen 100%; DCM:MeOH (95:5 v/v) 50%
DCM:MeOH (95:5 v/v 30%); toluen 60%; 3 x nasycony wodą w 95% n-heksan 100%
Pomiędzy rozwijaniami płytki TLC każdorazowo suszono przez około 10 min w temperaturze 105°C.
Rozwinięte płytki obserwowane i fotografowane były w świetle widzialnym, w świetle lampy ultrafioletowej w
zakresie 254 i 365 nm długości fali oraz po wywołaniu w oparach jodu. Wykorzystany w badaniach, jako
eluent, n-heksan był nasycany wodą w temperaturze pokojowej.
Zbadano wpływ trzygodzinnej aktywacji płytki w temperaturze 130°C na wynik rozdzielania grupowego
frakcji asfaltenowych. Próbki w ilości 5 μL, o stężeniu 2 mg/mL nakładano na płytki TLC, a następnie
rozwijano mieszaniną DCM:MeOH (95:5v/v) do 30%, toluenem do 60% i n-heksanem do 100% wysokości
płytki. Z uwagi na brak poprawy rozdzielczości zrezygnowano z czasochłonnej aktywacji wykorzystywanych
płytek. Wszystkie uzyskane wyniki odnoszono do składu grupowego asfaltu oksydowanego 20/30, z którego
otrzymano badane próbki.
6. Wyniki i dyskusja
(Results and discussion )
6.1. Określenie optymalnego stężenia
(Determining the optimal concentration)
W przypadku badań, w których techniką TLC oznaczano skład grupowy ciężkich produktów naftowych
takich jak asfalty, oleje bazowe, pozostałości po destylacji atmosferycznej oraz próżniowej nakładana
„plamka” zawiera średnio od ok. 0,01 do 0,02 mg badanego materiału (1 μL 10-20 mg/mL) w przypadku
TLC-FID i oraz od 0,01 do 0,3 mg/mL (2-5 μL 5-60 mg/mL) dla TLC [1,14,34,35,37]. Ze względu na dużą
zawartość asfaltenów, parametrów takich jak stężenie i objętość nanoszonej próbki nie można bezpośrednio
adaptować dla oznaczeń frakcji asfaltenowej. Asfalteny w większej części nie są eluowane żadnym ze
stosowanych rozpuszczalników (pozostają na linii startu), w związku z czym stężenie w przeliczeniu na
dozowaną objętość plamki, powinno być tak dobrane, aby nie dochodziło do przeładowania (asfaltenami)
fazy stacjonarnej.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

37
A
B
10 5 2 1
10 5 2 1
Rys. 1. Fotografie chromatogramów na płytkach TLC Si60 F254 o wymiarach 5x10 cm; próbka: frakcja asfaltenowa N4E
wyizolowana wg normy ASTM D4124 poddana 8 h ekstrakcji gorącym n-heptanem oglądana w świetle widzialnym (A) i
przy 365 nm długości fali (B); kolejność elucji: DCM:MeOH (95:5 v/v) 30%, toluen 60%, n-heksan 100%; objętość
dozowania: 5 μL; stężenie dozowanych próbek: 10, 5, 2 i 1mg/mL DCM.
Fig. 1. Photography of chromatograms in 5x10 cm size TLC Si60 F 254 plates; sample: asphaltene fraction N4E isolated
according to the ASTM D4124 norm extracted 8 h with hot n-heptane viewed in visible light (A) and at 365 nm
wavelength (B); elution order: DCM:MeOH (95:5 v/v) 30%, toluene 60%, n-hexane 100%; dosing volume: 5 μL; sample
concentration: 10, 5, 2 and 1 mg/mL DCM.
Celem określenia optymalnego stężenia frakcji asfaltenowej nanoszonej na płytkę TLC nałożono 5 μL
próbki N4E o stężeniach: 10, 5, 2 i 1 mg/mL DCM i rozwijano kolejno: mieszaniną DCM:MeOH (95:5 v/v) na
wysokość 30%, toluenem na wysokość 60% i bezwodnym n -heksanem na wysokość 100%. Na podstawie
uzyskanych chromatogramów (rys. 1.) stwierdzono, że w przypadku zastosowania stężenia 10 i 5 mg/mL
miało miejsce przeładowanie fazy stacjonarnej oraz niecałkowite rozdzielenie frakcji żywic od asfaltenów.
Natomiast dla 1 mg/mL obecność frakcji żywicznej jest praktycznie niezauważalna. Na tej podstawie uznano,
że optymalna próbka frakcji asfaltenowej to 5 µL roztworu o stężeniu 2 mg/mL tzn. 0,01 mg materiału.
6.2. Badanie czystości frakcji asfaltenowej
(Study of asphaltenes fractions purity)
W zależności od metodyki izolacji frakcji asfaltenowej - zastosowanego surowca, proporcji
rozpuszczalnika, czasu i temperatury prowadzenia precypitacji oraz sposobu przemywania powstałego
osadu skład grupowy otrzymanych frakcji może różnić się znacząco. Wraz z asfaltenami mogą współstrącać
się żywice. Dodatkowo, żywice oraz węglowodory poliaromatyczne mogą być okludowane przez asfalteny
lub adsorbowane na ich powierzchni. Z tego powodu jest niezbędne dodatkowe oczyszczanie, gdyż
procedura wg. normy nie pozwala na całkowite odmycie tych frakcji.
W niniejszej pracy zaproponowano metodę wstępnego badania czystości frakcji asfaltenowej
polegającą na trzykrotnej elucji bezwodnym albo n asyconym w 95% wodą n-heksanem. Zastosowano
rozwijanie wielokrotne, gdyż większość składników próbki mających charakter względnie polarny nie
rozpuszcza się w n-alkanach. W ten sposób zwiększono drogę „rozwijania” składników i wydłużono czas
kontaktu nC6 z frakcją asfaltenową. Zabieg ten miał na celu uzyskanie lepszej wymiany masy i łatwiejszego
dostępu eluentu do okludowanej frakcji węglowodorów. W odniesieniu do standardowej procedury izolacji
frakcja asfaltenowa nie powinna zawierać składników rozpuszczalnych w krótkołańcuchowych
węglowodorach n-alifatycznych tzn. rozwijanie chromatogramu n -heksanem nie powinno „ujawniać”
niebieskiej fluorescencji widocznej przy 365 nm długości fali światła.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

38
A
B
N4 N4E A AEx N4 N4E A AEx
Rys. 2. Fotografie chromatogramów na płytkach TLC Si60 F254 o wymiarach 5x10 cm; próbki: frakcja asfaltenowa N4
wyizolowana wg normy ASTM D4124 i N4E dodatkowo poddana 8 h ekstrakcji gorącym n-heptanem oraz A frakcja
asfaltenowa wyizolowana wg ASTM D3279 i AEx poddana 20 h ekstrakcji n-heptanem oglądane przy 365 nm długości
fali; Trzykrotna elucja A- bezwodnym i B- nasyconym wodą w 95% n-heksanem; objętość dozowania: 5 μL, 2 mg/mL
DCM.
Fig. 2. Photography of chromatograms in 5x10 cm size TLC Si60 F 254 plates; sample: asphaltene fraction N4 isolated
according to the ASTM D4124 norm and N4E additionally extracted 8 h with n-heptane and asphaltene fraction A
isolated according to the ASTM D3279 norm and AEx additionally extracted 20 h with hot n-heptane viewed at 365 nm
wavelength; elution order: three times elution A- anhydrous and B- saturated with water in 95% n-hexane; dosing
volume: 5 μL, 2 mg/mL DCM.
Na rysunku numer dwa porównano rozwijania frakcji asfaltenowych z zastosowaniem bezwodnego i w
95% nasyconego wodą n-heksanu. Analizując wyniki stwierdzono, że zastosowanie nasyconego wodą n -
heksanu jest korzystniejsze, gdyż spowodowało elucję większej ilości węglowodorów wykazujących
niebieską fluorescencję pod wpływem światła 365 nm. Wykazano ponadto, że zastosowanie większej
proporcji surowiec rozpuszczalnik i przemywanie wytrąconej frakcji asfaltenowej gorącym n-heptanem
(próbka N4) ma wypływ na zmniejszenie ilości ww. składników. Brak niebieskiej fluorescencji powyżej
naniesionej plamki frakcji asfaltenowej w przypadku próbki N4E i AEx potwierdza słuszność stosowania
dodatkowego oczyszczania ekstrakcyjnego w układzie ciecz ciało stałe.
6.3. Określenie kierunku zmiany siły elucyjnej
(Determining the direction of change in strength elution)
W większości publikacji do oceny składu grupowego ciężkich frakcji ropy naftowej także zawierających
asfalteny stosowano kolejność elucji stopniowej zgodną ze wzrostem siły elucyjnej. Niepublikowane badania
J. Gudebskiej wykazały, że dla techniki TLC-FID optymalna jest odwrotna kolejność elucji [44]. Wydaje się,
że także w przypadku TLC korzystna jest kolejność odwrotna. W ramach niniejszej pracy wyk onano badania
porównujące obie metodyki. Na płytkę TLC obok frakcji asfaltenowych naniesiono plamkę asfaltu 20/30, z
którego wydzielono w/w substancje i rozwijano do połowy wysokości mieszaniną DCM:metanol (95:5 v/v)
oraz toluenem do 100% wysokości płytki, w pierwszym przypadku stosując dichlorometan jako pierwszy
eluent, w drugim toluen. Otrzymane rezultaty przedstawiono na rysunkach 3 oraz 4.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

39
A
B
C
D
N4 N4E Asf A AEx N4 N4E Asf A AEx N4 N4E Asf A AEx
N4 N4E Asf A AEx
Rys. 3. Fotografie chromatogramów na płytkach TLC Si60 F254 o wymiarach 5x10 cm ; próbki: N4-frakcja asfaltenowa
wyizolowana wg. normy ASTM D4124, N4E-frakcja N4 dodatkowo poddana 8 h ekstrakcji gorącym n-heptanem, Asfasfalt
20/30, A-frakcja asfaltenowa wyizolowana wg ASTM D3279, AEx-frakcja A poddana 20 h ekstrakcji gorącym n-
heptanem; wizualizacja w: A- świetle widzialnym, B- przy 254 nm długości fali C- przy 365 nm długości fali D- w świetle
widzialnym po wywołaniu w oparach jodu; kolejność elucji: DCM:MeOH (95:5 v/v) 50%, toluen 100%; objętość
dozowania: 5 μL, 2 mg/mL DCM.
Fig. 3. Photography of chromatograms in 5x10 cm size TLC Si60 F254 plates; sample: N4-asphaltene fraction isolated
according to the ASTM D4124 norm, N4E- N4 fraction additionally extracted 8 h with hot n-heptane, Asf-asphalt 20/30,
A-asphaltene fraction isolated according to the ASTM D3279 norm, AEx-fraction A additionally extracted 20 h with hot n-
heptane viewed at A-visible light, B-254 nm and C- 365 nm wavelength, D- after saturation in the fumes of iodine; elution
order: DCM:MeOH (95:5 v/v) 50%, toluene 100%; dosing volume: 5 μL, 2 mg/mL DCM.
A
B
C
D
N4 N4E Asf A AEx N4 N4E Asf A AEx N4 N4E Asf A AEx N4 N4E Asf A AEx
Rys. 4. Fotografie chromatogramów na płytkach TLC Si60 F 254 o wymiarach 5x10 cm ; próbki: N4-frakcja asfaltenowa
wyizolowana wg. normy ASTM D4124, N4E-frakcja N4 dodatkowo poddana 8 h ekstrakcji gorącym n-heptanem, Asfasfalt
20/30, A-frakcja asfaltenowa wyizolowana wg ASTM D3279, AEx-frakcja A poddana 20 h ekstrakcji gorącym n-
heptanem; wizualizacja w: A- świetle widzialnym, B- przy 254nm długości fali C- przy 365 nm długości fali D- w świetle
widzialnym po wywołaniu w oparach jodu; kolejność elucji: toluen 100%, DCM:MeOH (95:5 v/v) 50%; objętość
dozowania: 5 μL, 2 mg/mL DCM.
Fig. 4. Photography of chromatograms in 5x10 cm size TLC Si60 F254 plates; sample: N4-asphaltene fraction isolated
according to the ASTM D4124 norm, N4E- N4 fraction additionally extracted 8 h with hot n-heptane, Asf-asphalt 20/30,
A-asphaltene fraction isolated according to the ASTM D3279 norm, AEx-fraction A additionally extracted 20 h with hot n-
heptane viewed at A-visible light, B-254 nm and C- 365 nm wavelength, D- after saturation in the fumes of iodine; elution
order: toluene 100%, DCM:MeOH (95:5 v/v) 50%; dosing volume: 5 μL, 2 mg/mL DCM.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

40
Analizując chromatogramy, gdzie pierwszym eluentem był toluen zaobserwowano mniejszą ilość
eluowanej z czołem polarnej frakcji żywic charakteryzującej się brązowym zabarwieniem oraz większe
rozmycie, w przypadku frakcji wykazującej fluorescencje przy 265nm długości fali światła eluowanej
mieszaniną DCM:MeOH (95:5 v/v). Przyczyną takiej sytuacji może być niedostateczna penetracja plamki
przez rozpuszczalnik. Korzystniej jest więc zastosować mieszaninę chlorku metylenu, w którym asfalt eny w
całości się rozpuszczają, z metanolem, zwiększającym siłę elucyjną. W pierwszym etapie rozwijania
dochodzi wówczas do rozmycia części plamki, w tym „wymycia” polarnych żywic, co ułatwia późniejszą
elucję pozostałych frakcji toluenem. Kolejność zastosowanych eluentów nie ma tu jednak aż tak wielkiego
znaczenia jak w przypadku n-heksanu.
A
B
C
D
Rys. 5. Fotografie chromatogramów na płytkach TLC Si60 F254 o wymiarach 2,5x10 cm; próbki: Asf-asfalt 20/30, AExfrakcja
asfaltenowa wyizolowana wg ASTM D3279 poddana 20 h ekstrakcji gorącym n-heptanem oglądane: A-w świetle
widzialnym, B-przy 254 i C 365 nm długości fali światła oraz D- w świetle widzialnym po wywołaniu w oparach jodu;
Elucja mieszaniną DCM:MeOH (95:5 v/v) do 30% wysokości płytki, toluenem do 60% wysokości płytki , i nasyconym
wodą w 95% n-heksanem do 100% wysokości płytki; objętość dozowania: 5 μL, 2 mg/mL DCM.
Fig. 5. Photography of chromatograms in 2,5x10 cm size TLC Si60 F254 plates; sample: Asf- asphalt 20/30, AEx
asphaltene fraction isolated according to the ASTM D3279 norm additionally extracted 20 h with hot n-heptane viewed at
A- visible light, B-254 and C 365 nm wavelength, and C- in visible light after saturation in the fumes of iodine; Elution by
mixture of DCM:MeOH (95:5 v/v) 30%, toluene 60%, saturated with water in 95% n-hexane; dosing volume: 5 μL,:
2 mg/mL DCM.
Rysunek 5 przedstawia chromatogramy rozwinięte z zastosowaniem procedury trzyetapowej, gdzie
nałożone plamki rozwijano kolejno mieszaniną DCM:MeOH na wysokość 30%, następnie toluenem na
wysokość 60% oraz nasyconym wodą w 95% n -heksanem na wysokość 100%. W porównaniu do
wcześniejszych badań (rys. 3 i 4) odpowiednio skrócono obszary elucji toluenem i mieszaniną DCM:MeOH,
co pozwoliło na wprowadzenie trzeciego eluentu eluującego w głównej mierze węglowodory nasycone
widoczne jako niebieska fluorescencja przy 365 nm długości fali. Zastosowanie takiej procedury pozwala na
określenie składu grupowego asfaltu i frakcji asfaltenowych jako asfaltenów, żywic, węglowodorów mono i
poliaromatycznych oraz wspomnianej grupy związków nasyconych.
7. Podsumowanie
(Summary)
Uwzględniając wykonane doświadczenia zaproponowano metodykę oceny składu grupowego i
czystości frakcji asfaltenowej. W pierwszym etapie określono optymalną ilość próbki (frakcji asfaltenowej)
przypadającą na nakładaną plamkę wynoszącą około 0,01 mg. Nie dochodzi wówczas do nadmiernego
przeładowania w strefie asfaltenów przy możliwości określenia obecności i oceny frakcji poli -aromatycznej
oraz żywiczej.
Przygotowanie frakcji asfaltenowej powinno zostać w ten sposób wykonane, aby ni e zawierała
składników wykazujących fluorescencję pod lampą 365nm po trzykrotnym rozwijaniu chromatogramu TLC n -
heksanem nasyconym w 95% wodą. W praktyce konieczne jest zastosowanie w tym celu ekstrakcji w
aparacie Soxhleta, lub wykonanie na inny sposób całkowitego usunięcia rozpuszczalnych w n-alkanach
nisko polarnych składników frakcji asfaltenowej.
Możliwie jak najmniejsze plamki badanego materiału o masie ok. 0.01 g, zostają nałożone na płytkę
TLC z żelem krzemionkowym SiO 2 – F254, korzystnie z roztworu w dichlorometanie. Najpierw ma miejsce
trzykrotna elucja n-heksanem nasyconym w 95% wodą na 100% wysokości płytki oraz wizualizacja
Vol. 8, No 1/2016
Asf AEx Asf AEx Asf AEx Asf AEx
Camera Separatoria

41
wysuszonej płytki pod lampą 365 nm. Etap ten ma na celu określenie czy wszystkie składniki rozpuszczalne
w n-heptanie zostały wymyte z badanej próbki frakcji asfaltenowej na etapie jej oczyszczania. Eluowane są
w ten sposób potencjalnie obecne węglowodory nasycone oraz nisko polarne węglowodory aromatyczne,
podstawione grupami alifatycznymi i naftenowymi.
Procedura rozdzielania grupowego frakcji asfaltenowych polega na zastosowaniu płytki TLC z żelem
krzemionkowym typu F-254 o wysokości 10 cm, nałożeniu możliwie małych plamek badanego materiału o
masie ok. 0.01 g w roztworze, korzystnie w dichlorometanie oraz na elucji składników próbki, kolejno:
na wysokość 30% mieszaniną chlorek metylenu:metanol 95:5 v/v,
toluenem do 60% wysokości płytki,
n-heksanem nasyconym w 95% wodą, do 100% wysokości płytki.
Pomiędzy kolejnymi rozwijaniami płytki należy wysuszyć, każdorazowo w temperaturze ok. 105°C
przez 10min.
W przypadku badanej frakcji asfaltenowej wyróżniono 3 główne pod -frakcje: asfalteny – plamki
czarne, do czarno - brązowych ciągnące się od linii startu, żywice (Resines) w strefie czoła elucji mieszaniny
chlorku metylenu i metanolu, do zakresu brązowo-czarnej plamki asfaltenów oraz względnie polarne
węglowodory aromatyczne i poli -aromatyczne wykazujące fluorescencję przy 365 nm długości fali na
wysokości powyżej 30% wysokości płytki. Dodatkowo można zauważyć, że dolne krawędzie plamki frakcji
asfaltenowej nie ulegają przesunięciu podczas żadnego z etapów elucji. To pokazuje, że pomimo znacznej
siły elucyjnej mieszaniny DCM:MeOH 95:5 v/v jest ona niewystarczająca dla spowodowania elucji
najbardziej polarnej części frakcji asfaltenowej.
Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że technika NP-TLC jest łatwym i szybkim
narzędziem wstępnej oceny składu grupowego frakcji asfaltenowych i asfaltenów. Może być z powodzeniem
stosowana jako technika tzw. „pierwszego wyboru”, zarówno dla techniki TLC-FID, jak i dla HPLC. Wnioski z
wykonanych tu badań posłużyły do opracowania optymalnych warunków rozdzielania i oznaczania składu
grupowego asfaltenów i frakcji asfaltenowych techniką TLC-FID. Dobór optymalnych warunków rozdzielania
techniką TLC-FID jest znacznie bardziej praco- i czasochłonne, niż z wykorzystaniem techniki NP-TLC na
płytkach. Wykorzystanie detektora płomieniowo jonizującego umożliwia nie tylko ocenę, ale i oznaczanie
składu grupowego nielotnych mieszanin związków organicznych, co będzie przedmiotem kolejnej publikacji.
Niniejsze badania powinny też pomóc przy doborze optymalnych warunków rozdzielania grupowego
asfaltenów techniką HPLC. Będzie to przedmiotem dalszych prac. Najprawdopodobniej konieczne będzie
zastosowanie do rozdzielania warunków odwróconych układów faz (RP-HPLC).
Summary
Taking into account all experiments we proposed a methodology for evaluation of group type
analysis and asphaltenes fraction purity. In the first stage we determined an optimum amount of dosing
sample (asphaltene fraction) attributable to applied spot which is about 0,01 mg. In that case there is no
excessive overload in asphaltenes’ zone with the possibility to determine the presence of poliaromatics and
resin fraction.
Asphaltene fractions preparation should be done without use of ingredients that exhibit fluorescence
at 365nm wavelength after three times TLC chromatogram developing with n -hexane in 95% saturated by
water. In practice it is required to use the Soxhlet extraction or use another method to completely remove low
polar fraction soluble in n-alkanes.
The smallest as possible spot of tested material of approx. mass 0,01g are applied to TLC Si60 F254
plate, preferably from dichloromethane solution. First step is triple elution by n-hexane saturated in 95%by
water and the visualization of the dried plate under the 365 nm UV lamp. This step aims to determine
whether all n-heptane soluble components were eluted from asphaltene fractions during the purification.
During this step, potentially existing saturated hydrocarbons and low polarity aromatic hydrocarbons
substituted by aliphatic and naphthenic groups are being eluted.
Asphaltene fraction group type analysis involves using a 10cm high TLC silica gel F254 plates and
applying as small as possible tested material spot (approx. 0,01 g) preferably in dichloromethane solution
and elute it sequentially:
dichloromtethane:methanol 95:5 v/v solution to 30% of plate height
toluene to 60% plate height
n-hexane in 95% saturated by water to 100% of plate height
Between particular developments plates should be dried for about 10min in 105°C.
In the case of asphaltene fraction the test consist three major sub -fractions: asphaltenes-black to
black-brown dots extending from the start line, resins in the front of mixture of methylene chloride and
methanol solution zone to black -brown asphaltenes spot and relatively polar poli- and mono- aromatic
hydrocarbons showing fluorescence at 265 nm wavelength in more of the 30% of plate height. In addition it
can be seen that lower edges of asphaltenes fraction spots don’t move during any phase of elution. This
shows that despite significant elution force of DCM:MeOH 95:5 v/v mixture it is inadequate to cause elution
of most polar part of asphaltene fraction.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

42
Based on the study it can be concluded that the NP -TLC technique is an easy and quick tool for
preliminary assessment of asphaltene fractions and asphalt group type analysis. It can be successfully used
as a technique of choice for both TLC-FID and HPLC techniques. Conclusions form the studies were used to
develop optimal conditions for separation and determination group type analysis for TLC -FID. Choosing of
optimal conditions of separation by TLC-FID technique for asphalts and asphaltene fractions is much more
time consuming than for NP -TLC technique. The use of flame ionization detector can not only detect but also
determine the group composition of non-volatile organic compounds, which will be the subject of another
publication.
Present research may be also helpful in the selection of optimal conditions for group type analysis by
HPLC. This will be the subject of further work. Most likely, reverse-phase system (RP-HPLC) conditions will
be required for such separations.
Podziękowania
(Acknowledgements)
Praca wykonana w części w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Narodowe
Centrum Badań i Rozwoju (Program LIDER, edycja V, nr projektu: LIDER/036/573/L5/13/NCBR/2014) pt.
Badania nad otrzymywaniem i właściwościami sorbentów wytwarzanych z asfaltów.
Autorzy niniejszej pracy pragną podziękować grupie Lotos Asfalt Sp-ka z o.o., a szczególnie
p. Pawłowi Czajkowskiemu za przekazane do badań próbki asfaltów.
8. Literatura
(Literature)
[1] J. Kosińska, G. Boczkaj, J. Gudebska i M. Kamiński, “Fingerprinting niskolotnych frakcji i produktów
naftowych techniką cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC) w identyfikacji przecieków
procesowych oraz skażenia środowiska”, Fingerprint comparison of low-volatile petroleum products
by means of Thin Layer Chromatography (TLC) for identification of process leakages and
environmental pollution, Camera Separatoria 5 (2013) 55.
[2] ASTM D1319, Standard test method for hydrocarbon types in liquid petroleum products by
fluorescent indicator adsorption (2003).
[3] M. Granda, J. Bermejo, S. R. Moinelo i R. Menendez, Application of extrography for characterization
of coal tar and petroleum pitches, Fuel 69 (1990) 702.
[4] J. Bermejo, M. Granda, R. Menéndez i J. M. D. Tascón, Comparative analysis of pitches by
extrography and thermal analysis techniques, Carbon 32 (1994) 1001.
[5] J. Cerny, H. Pavliková i V. Machovic, Compound-class fractionation of liquids by extrography, Fuel
69 (1990) 966.
[6] J. D. McLean i P. K. Kilpatrick, Comparison of precipitation and extrography in the fractionation of
crude oil residua, Energy & Fuels 11 (1997) 570.
[7] ASTM D4124, Standard test methods for separation of asphalt into four fractions (2001).
[8] ASTM D2007, Standard test method for characteristic groups in rubber extender and processing oils
and other petroleum – derived oils by the clay – gel absorption chromatographic method (2003).
[9] F. S. Jacobs i R. H. Filby, Liquid chromatographic fractionation of oil-sand and crude oil asphaltenes,
Fuel 62 (1983) 1186.
[10] J. F. Schabron, J. F. Rovani i M. M. Sanderson, Asphaltene determinator method for automated oncolumn
precipitation and redissolution of pericondensed aromatic asphaltene components , Energy &
Fuels 24 (2010) 5984.
[11] ASTM D3279, Standard test method for n-heptane insolubles (1997).
[12] ASTM D6560, Standard test method for determination of asphaltenes ( heptane insolubles ) in crude
petroleum and petroleum products (2000).
[13] ASTM D893, Standard test method for insolubles in used lubricating oils (2014).
[14] M. A. Ali, A. Hassan i S. Arabia, Hydrocarbon group types analysis of petroleum products: a
comparative evaluation of HPLC and TLC analytical, Petroleum Science and Technology 20 (2002)
771.
[15] Y. Li, X. Deng i W. Yu, Group-type analyses of heavy petroleum fractions by preparative liquid
chromatography and synchronous fluorescence spectrometry: analyses of aromatics by ring number
of Liaohe vacuum gas oil , coker gas oil and heavy cycle oil, Fuel 77 (1998) 277.
[16] K. K. Bissada, J. Tan, E. Szymczyk, M. Darnell i M. Mei, Group-type characterization of crude oil and
bitumen. Part II: Efficient separation and quantification of normal -paraffins iso-paraffins and
naphthenes (PIN), Fuel 173 (2016) 217.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

43
[17] K. K. A. Bissada, J. Tan, E. Szymczyk, M. Darnell i M. Mei, Group-type characterization of crude oil
and bitumen. Part I: Enhanced separation and quantification of saturates, aromatics, resins and
asphaltenes (SARA), Organic Geochemistry 95 (2016) 21.
[18] R. Kartanowicz, E. Gilgenast i M. Kamiński, Group-type analysis of middle destillates by test method
IP-391/EN-12916/ASTM D6379 in terms of resolution and selectivity of chromatographic columns ,
Analytical Chemistry 52 (2007) 265.
[19] ASTM D6591-11, Standard test method fo determination of aromatic hydrocarbon types in midlle
distilates-High performance liquid chromatography method with refractive index detection, (2011)
[20] ASTM D6591-00, Standard test method fo determination of aromatic hydrocarbon types in midlle
distilates-High performance liquid chromatography method with refractive index detection, (2000)
[21] IP 391:2007, Petroleum products-Determination of aromatic hydrocarbon types in middle destillates-
High performance liquid chromatography methd with refractive index detection, (2007).
[22] PN-EN 12916:2016-03, Przetwory naftowe-Oznaczanie grup węglowodorów aromatycznych w
średnich destylatach-Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem współczynnika
załamania światła, (2016).
[23] PN-EN 12916:2008, Przetwory naftowe-Oznaczanie grup węglowodorów aromatycznych w średnich
destylatach-Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem współczynnika
załamania światła, (2008).
[24] PN-EN 12916:2003, Przetwory naftowe-Oznaczanie grup węglowodorów aromatycznych w średnich
destylatach-Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem współczynnika
załamania światła, (2003).
[25] S. I. Andersen, Concentration Effects in HPLC-SEC Analysis of Petroleum Asphaltenes, Journal of
Liquid Chromatography 17 (1994) 4065.
[26] B. R. Johnson, K. D. Bartle, A. a. Herod i R. Kandiyoti, N-methyl-2-pyrrolidinone as a mobile phase
in the size-exclusion chromatography of coal derivatives, Journal of Chromatography A 758 (1997)
65.
[27] F. Karaca i inni, The Calibration of Size Exclusion Chromatography Columns: Molecular Mass
Distributions of Heavy Hydrocarbon Liquids, Energy & Fuels 18 (2004) 778.
[28] M. J. Lazaro, C. a. Islas, a. a. Herod i R. Kandiyoti, Calibration of Size Exclusion Chromatography in
1-Methyl-2-pyrrolidinone for Coal-Derived Materials Using Standards and Mass Spectrometry,
Energy & Fuels 13 (1999) 1212.
[29] V. L. Cebolla, TLC-FID in quantitative hydrocarbon group type analysis of asphaltenes and other
heavy fossil fuels, Abstracts of Papers of the American Chemical Society 213 (1997) 71.
[30] C. Jarne, V. L. Cebolla, L. Membrado, K. Le Mapihan i P. Giusti, High-Performance Thin-Layer
Chromatography Using Automated Multiple Development for the Separation of Heavy Petroleum
Products According to Their Number of Aromatic Rings, Energy & Fuels 25 (2011) 4586.
[31] K. Dunn, G. V. Chilingarian, H. Lian, Y. Y. Wang i T. F. Yen, Analysis of Asphalt and Its Components
by Thin-Layer Chromatography, w Developments in Petroleum Science, 40 (2000) 305.
[32] D. A. Karlsen i S. R. Larter, Analysis of petroleum fractions by TLC-FID: applications to petroleum
reservoir description, Organic Geochemistry 17 (1991) 603.
[33] J. Vela, V. L. Cebolla, L. Membrado i J. M. Andres, Quantitative hydrocarbon group type analysis of
petroleum hydroconversion products sing an improved TLC-FID system, Journal of Chromatographic
Science 33 (1995) 417.
[34] M. Kamiński, J. Gudebska, T. Górecki, i R. Kartanowicz, Optimized conditions for hydrocarbon group
type analysis of base oils by thin-layer chromatography-flame ionisation detection, Journal of
Chromatography A 991 (2003) 255.
[35] B. K. Sharma, S. L. S. Sarowha, S. D. Bhagat, R. K. Tiwari, S. K. Gupta i P. S. Venkataramani,
Hydrocarbon group type analysis of petroleum heavy fractions using the TLC -FID technique, Journal
of Analytical Chemistry 360 (1998) 539.
[36] J. F. Masson, T. Price i P. Collins, Dynamics of bitumen fractions by thin-layer chromatography/flame
ionization detection, Energy and Fuels 15 (2001) 955.
[37] C. Jiang, S. R. Larter, K. J. Noke i L. R. Snowdon, TLC-FID (Iatroscan) analysis of heavy oil and tar
sand samples, Organic Geochemistry 39 (2008) 1210.
[38] E. Kim, E. J. Cho, S. Moon, J. Il Park i S. Kim, Characterization of Petroleum Heavy Oil Fractions
Prepared by Preparatory Liquid Chromatography with Thin-Layer Chromatography, High-Resolution
Mass Spectrometry, and Gas Chromatography with an Atomic Emission Detector, Energy and Fuels
30 (2016) 2932.
[39] K. Dunn, G. V. Chiinigarian i T. F. Yen, Bitumens: Liquid chromatography, w Encyclopedia of
Separation Science (2000) 2180.
[40] V. L. Cebolla i inni, Determination of hydrocarbon types in petroleum and coal-derived products by
thin-layer chromatography/densitometry, Journal of AOAC International 83 (2000) 1474.
[41] L. Mamlok, Technical Note: Berberine Hydrochloride for Detection (as a Detector) in Thin-Layer
Chromatography, Journal of Chromatographic Science 19 (1981) 53.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

44
[42] F. P. Cossíoi inni, Berberine cation: A fluorescent chemosensor for alkanes and other low-polarity
compounds. An explanation of this phenomenon, Organic Letters (2000) 2311.
[43] V. L. Cebolla i inni, Quantitative applications of fluorescence and ultraviolet scanning densitometry
for compositional analysis of petroleum products in thin-layer chromatography, Journal of
Chromatographic Science 37 (1999) 219.
[44] J. Gudebska, rozprawa doktorska, „Chromatografia cieczowa w oznaczaniu składu grupowego
olejów bazowych i asfaltów drogowych” Liquid chromatography for the determination of group type
analysis of base oil and road asphalts, Wydział Chemiczny Politchniki Gdańskiej, Gdańsk 1999.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

CAMERA SEPARATORIA
Volume 8, Number 1 / June 2016, pp. 45-54
Małgorzata KOWALCZYK, Monika ASZTEMBORSKA*
Institute of Physical Chemistry Polish Academy of Sciences, Kasprzaka 44/52, 01-224 Warsaw, Poland
*Corresponding author: e-mail: masztemborska@ichf.edu.pl
Micellar electrokinetic chromatography with bile salts for separation of flavanone
diastereomers
Abstract: Sodium cholate and sodium deoxycholate were applied in the micellar electrokinetic chromatography
technique as separating agents for the diastereomers of flavanone glycosides. The effects of the organic solvent buffer
modifier, bile salt type and concentration were evaluated for enhancing distereomer separation. The critical micelle
concentration of sodium cholate and sodium deoxycholate in the applied running buffer was determined. The bi nding
constants of flavanone glycosides to bile salts micelle were estimated. The elaborated analytical method was used to
analyse the flavanone fraction of bitter orange (Citrus aurantium) and grapefruit (Citrus paradisi) juice.
Key words: Bile salts, diastereomers separation, flavanone glycosides, MEKC, binding constants
Streszczenie: Cholan sodu i deoksycholan sodu zostały zastosowane w technice micelarnej elektrokinetycznej
chromatografii cieczowej jako czynnik rozdzielający diastereomery glikozydów flawanonów. Oceniono wpływ
rozpuszczalnika organicznego jako modyfikatora buforu, typu soli żółciowej oraz jej stężenia na wzmocnienie
rozdzielenia diastereomerów. Wyznaczono krytyczne stężenie micelarne cholanu sodu i deoksycholanu sodu w
zastosowanym buforze rozdzielającym. Oszacowano stałe trwałości glikozydów flawanonów z micelami soli żółciowych.
Opracowana metoda została wykorzystana do analizy frakcji flawanonowej w soku gorzkiej pomarańczy (Citrus
aurantium) i grejfruta (Citrus paradise).
Słowa kluczowe: Sole żółciowe, rozdzielanie diastereomerów, glikozydy flawanonów, MEKC, stałe trwałości
1. Introduction
Flavonoids are one of the largest groups of naturally occurring phenols and are widespread in the
plant kingdom. Due to their pharmacological role and their health benefits, the analysis of flavonoids is of
great importance [1, 2]. Flavanones belonging to the flavonoid group occur in relatively large quantities in
citrus fruits. Due to the asymmetric C2 position in their moiety, flavanones are chiral compounds and thus
can exist in two enantiomeric forms. As their glycosides have additional optically active sugar residue, they
appear as a pair of diastereomers. Most probably in nature they are synthesized in (-)-2S configuration but
during the plant growth or isolation procedure they may undergo partial or complete diastereomerization and
racemization [3].
Capillary electrophoresis (CE) has been proposed as a complementary technique to reversed -phase
high performance liquid chromatography (RP HPLC) for the separation of flavanone glycoside diastereomers
[4-6]. In comparison with HPLC, CE is characterized by higher resolving power. Although the separation of
diastereomers of flavanone glycosides in an achiral environment is theoretically possible, until now they were
separated only with the use of a chiral agent. The summary of various c hromatographic and electrophoretic
methods applied for separation of chiral flavonoids including diastereomers of flavanone glycosides is
presented in the review [7].
Among many surfactants able to form a micellar structure, bile salts play an important role, since they
are biosurfactants in mammals and important cholesterol end products. Due to their rigid steroidal structure
with hydrophobic and hydrophilic faces, their aggregation behaviour and micellar structure is different from
that of traditional linear surfactants. One consequence of planar polarity is that bile salts in aqueous systems
form smaller micelles than classical surfactants, with an aggregation number of 2-9 molecules [8]. Micelles of
various surfactants are applied in a particular mode of capillary electrophoresis – micellar electrokinetic
chromatography (MEKC). Since bile salts are chiral, their micelles have been applied in the separation of
enantiomers in the MEKC technique [9, 10].
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

46
Our preliminary studies have shown that sodium cholate (NaC) as a chiral surfactant can be useful in
the separation of selected flavanone glycosides [11]. In the current work, diastereomers of flavanone-7-Oglycosides
were separated by micellar electrokinetic chromatography (MEKC) using sodium cholate (NaC)
and sodium deoxycholate (NaDC) as additives in the background electrolyte. The effect of the buffer, organic
modifier and concentration of the bile salt additive on the migration time and resolution was studied. The
binding constants of flavanone glycosides to bile salts micelle were estimated. The elaborated analytical
method was used to analyse the flavanone fraction of bitter orange ( Citrus aurantium) and grapefruit (Citrus
paradisi) juice.
2. Materials and methods
2.1. Investigated compounds
The structures of the investigated flavanone glycosides are presented in Fig. 1. They are composed
from aglycone part and sugar residue. Neohesperidoside, rutinoside and glucoside comprise sugar moiety
while isosakuranetin (in poncirin and didymin), hesperetin (in hesperidin and neohesperidin), naringenin (in
naringin and narirutin) and eriodictyol (in eriocitrin, neoeriocitrin and pyracanthoside) are the aglycone parts.
Compound R1 R2 Gly
Gly
O
R1
R2
Poncirin
Didymin
Neohesperidin
Hesperidin
Narirutin
Naringin
H
OH
H
OCH3
OCH3
OH
O-Nh
O-Ru
O-Nh
O-Ru
O-Nh
O-Ru
OH
O
Neoeriocitrin
Eriocitrin
OH
OH
O-Nh
O-Ru
Pyracanthoside
O-Glu
Fig.1. The structures of the investigated flavanone glycosides; Nh –neohesperidoside, Ru – rutinoside, Glu – glucoside.
Naringin is the main bitter constituent of grapefruit (Citrus paradisi), narirutin and hesperidin are the
constituents of sweet orange (Citrus sinensis), eriocitrin occurs in lemon (Citrus limon), neohesperidin,
neoeriocitrin and poncirin are found in sour orange (Citrus aurantium), didymin was isolated from the leaves
of bee balm (Monarda didyma), while pyracanthoside is a constituent of the bark of the apple tree (Malus
domestica) [12]. It is generally accepted that flavanones are synthesized in nature in the S form. The
occurrence of the R form in plants is a result of nonenzymatic racemization or epimerisation. Flavanone
glycosides are weak acids with pKa values in the range of 9-10 [4].
2.2. Chemicals
Sodium cholate, sodium deoxycholate and sudan III were purchased from Fluka (Buchs, Switzerland)
and were used as received. Naringin, narirutin, hesperidin, neohesperidin, didymin poncirin and
pyracanthoside were obtained from Roth (Karlsruhe, Germany). Eriocitrin and neoeriocitrin were purchased
from Extrasynthese (Genay, France). Methanol, 2-propanol, acetonitrile, Na 2 B 4 O 7 , NaH 2 PO 4 were purchased
from Polskie Odczynniki Chemiczne (Gliwice, Poland).
All the other reagents used in preparing the buffer solution were of analytical grade and used without
further purification.
2.3 Apparatus and Procedure
All the separations were performed on a Beckman CE System (P/ACE CE System, Fullerton, CA,
USA) equipped with a diode array detector (DAD). The scan range was 190-300 nm and the
electropherograms were stored at 280 nm. A fused-silica capillary with dimensions 75 µm i.d. x 58 cm (48
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

47
cm effective length) was thermostated at 25°C. The new capillary was washed with 1 M HCl for 5 min than
with water for 2 min following by 0.1 M NaOH for 10 min and finally with water for 2 min. The applied voltage
was 20kV. Before each set of measurements the capillary was flushed with 0.1 M NaOH for 2 min, then
water for 2 min, and finally with the running buffer for 1.5 min.
Samples were injected by applying pressure of 0.75 psi for 3 s. All sample solutions and buffers were
filtered through 0.45 μm polypropylene syringe filters prior to use. Methanol and Sudan III were injected to
determine the electroosmotic flow (EOF) and the migration time of micelles, respectively.
2.4. Sample preparation
Sour orange and grapefruit juice samples were prepared similarly as in the procedure described
previously [13]. 5 ml of orange or grapefruit juice was applied to a DPA-6S SPE (6 ml tube, 500 mg)
cartridge of Supelco (Bellefonte, PA, USA). After washing with 10 ml of water and drying, the flavanones
were extracted with 1 ml of methanol.
3. Results and discussion
3.1. Effect of organic solvent buffer modifier
The pH of the running buffer was chosen as 7.5, below the expected pKa of flavanones to increase
possibility of interaction of non-ionised flavanones with anionic micelles of cholates. Three running buffers
were tested: tertraborate/borate (25 mM Na 2 B 4 O 7 /200 mM H 3 BO 3 ), phosphate (50 mM Na 2 HPO 4 /50 mM
NaH 2 PO 4 ) and borate/phosphate (50 mM Na 2 B 4 O 7 /200 mM NaH 2 PO 4 ). Finally, the borate/phosphate buffer
was chosen for further optimisation as giving overall the best resolution properties in the case of NaC and
NaDC.
Organic solvents are often used as modifiers of the running buffer to increase the resolution of closely
migrating analytes. They usually reduce electroosmotic flow (EOF). At high concentration, the organic
solvent may lead to micelle breakdown.
Our studies investigated the addition of three organic solvents: methanol, 2-propanol and acetonitrile
at concentration of 10%. At this concentration their influence on the CMC is rather small and can be
neglected [14].
Table 1 presents the electrophoretical parameters obtained for three selected flavanones in buffers
with the investigated organic additives for NaC and NaDC. For comparison, electrophoretic measurements
were performed with a buffer without organic modifier for the NaC micellar system. Since the solubility of
NaDC in a running buffer without organic modifier was insufficient to prepare a stable solution, it was
impossible to perform similar comparative measurements for this micellar system.
Table 1 Influence of organic solvent on diastereoseparation process of selected flavanones; conditions: pH
7.5, temp.25 0 C, capillary: 58 cm × 75 μm ID, voltage 20kV, detection 280 nm.
40 mM NaC/50 mM borate/200 mM 100 mM NaDC/50 mM
Flavanone
phosphate
borate/200 mM phosphate
10% ACN 10% 2- 10%- 10% 10% 2- 10%-
0%
PrOH MeOH ACN PrOH MeOH
Naringin t m2
1
app 2
R s
3
10.84
1.60
10.19
0.86
14.65
1.50
16.20
2.19
18.61
0.68
21.40
0.10
28.49
1.16
Neohesperidin
t m2
10.80
10.19
14.59
16.48
18.66
21.71
28.75
app
R s
0.90
0.72
1.50
2.72
0.89
0.81
1.62
Neoeriocitrin
t m2
8.89
10.35
14.29
14.64
13.37
18.77
17.93
app
R s
0.83
0
0.28
0.56
0.58
0.86
0.90
6.00 7.20 9.50
EOF t m ( eof )
(2.32) (1.93) (1.45)
1 t m2 - migration time of second migrated diasteromer [min],
app t 1 t separation factor, R s - resolution;
eof- electrophoretic mobility of buffer [10 -4 cm 2 V -1 s -1 ]
8.90
(1.56)
8.0
(1.74)
10.0
(1.39)
9.40
(1.48)
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

current [uA]
Current [uA]
48
The organic additive can influence the double electric layer on th e capillary wall and the
physicochemical properties of the running buffer (e.g. viscosity) as well as the stability and selective
properties of the micelle.
All the investigated organic solvents reduce the EOF of the solution buffer/NaC. Among them, 2-
propanol reduces the EOF the most effectively, while acetonitrile has a very small effect on electroosmotic
velocity (
0
eof
ACN
eof
MeOH
eof
2 PrOH
eof
). The longest migration times are observed for the buffer with
added methanol. This solvent also gives the highest resolution and separatio n factor for the flavanones
under consideration. Interestingly, the migration times of naringin and neohesperidin for NaC/acetonitrile are
slightly shorter than for the buffer without the addition of an organic solvent. In this case the diastereomer
resolution is the worst, and for neoeriocitrin is not even observable. It seems that acetonitrile unfavourably
modifies the micelle, making it less convenient for interaction with flavanones. As methanol gives the best
resolution of the selected diastereomers, this organic solvent was chosen for further optimisation of the
method.
3.2. Determination of critical micelle concentration
Critical micelle concentration (CMC) is an important value indicating the range of concentrations in a
solution where the surfactant starts to form micellar structures. Since the CMC is dependent on the solvent
and other dissolved species, it is important to determine this value under given experimental conditions (in
the running buffer solution). Among various methods used to determine the CMC, the current-based method
was applied due to its suitability and simplicity. In this method the electric current as a function of surfactant
concentration at a given electric field is measured using CE apparatus [15]. An increase in conductivity is
observed when the surfactant concentration exceeds the CMC. Thus the plot of electric current versus
surfactant concentration consists of two lines of different slopes corresponding to the monomer and micellar
state. The intersection of these lines defines the CMC.
The plots of the relation of observed current intensity vs. bile salt concentration are presented in Fig.
2. The CMC values determined from the plots are 18.1 mM for NaC and 7.1 mM for NaDC. These values are
in good agreement with those determined by other methods [16].
a)
160
150
140
130
120
CMC=18.1mM
y = 0.5475x + 101.05
R 2 = 0.9957
110
y = 0.38x + 103.9
R 2 = 0.9918
100
0 20 40 60 80 100 120
NaC [mM]
b)
160
150
140
130
y = 0.5017x + 103.29
R 2 = 0.999
120
CMC=7.1
110
100
y = 0.3341x + 104.29
R 2 = 0.9966
0 20 40 60 80 100 120
NaDC [mM]
Fig. 2. The relation of current intensity vs. NaC (a) and NaDC (b) concentrations obtained under MEKC conditions.
Running buffer: 50 mM borate/200 mM phosphate buffer, pH 7.5, 10% of methanol; voltage: 20kV.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

k
AU
49
3.3. Effect of bile salt concentration
The most important factor influencing the resolution in the studied system is the concentration of bile
salts. Fig. 3 presents electropherograms of neohesperidin obtained at various NaC concentrations.
0.250
0.225
0.200
0.175
0.150
0.125
0.100
0.075
0.050
0.025
0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Minutes
Fig 3. Electropherograms of neohesperidin diastereomers separation obtained at various NaC concentrations. Running
buffer: 50mM borate/200mM phosphate buffer, pH 7.5, 10% of methanol; voltage: 20kV.
The increase of bile salt concentration results in the increase of migration times and t eof . Since the
investigated flavanones are non-ionised under the studied conditions, the retention factor (instead of
mobility) was presented as a function of concentration. The influence of NaC and NaDC concentration on the
retention factor of the slower-migrating diastereomers of flavanones is presented in Fig. 4.
a)
7
6
5
4
3
naringin
neohesperidin
neoeriocitrin
poncirin
pyracanthoside
narirutin
hesperidin
eriocitrin
didymin
2
1
0
30 50 70 90 110
NaC [mM]
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

k
50
b)
7
6
5
4
3
naringin
neohesperidin
neoeriocitrin
poncirin
pyracanthoside
narirutin
hesperidin
eriocitrin
didymin
2
1
0
10 30 50 70 90 110
NaDC [mM]
Fig. 4. The dependence of retention factor from NaC (a) and NaDC (b) concentrations obtained for the studied
flavanones.
The retention factors were calculated from the equation:
k
t
t
eof
e
1
t
eof
t
t
e
mc
[1]
where t e , t eof and t mc are the migration times of the analyte, the unretained solute moving at the EOF rate and
the micelle, respectively.
The retention factor was not calculated for concentration of 10 and 20 mM of NaC and 10 of NaDC,
since it was not possible to determine the mobility of the surfactant. The method applied in the present paper
to measure the mobility of Sudan III as a micelle marker was not efficient below the CMC and in its vicinity.
The retention factors are practically linearly dependent on NaC and NaDC concentration. The slope is
proportional to the interaction between micelle and flavanone.
Fig. 5 illustrates the effect of NaC and NaDC on the resolution Rs of the flavanone diastereomers. For
flavanones with eriodictyol as the aglycone (neoeriocitrin and pyracanthoside), Rs grows almost linearly in
the whole studied concentration range, while for the rest of the compounds Rs grows relatively fast and
reach a plateau at about 60 mM.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

Resolution
Resolution
51
a)
4
3
2
NAR
NEH
NEE
PYR
PON
1
0
-1
0 20 40 60 80 100
NaC [mM]
b)
3
2
NAR
NEE
NUR
NEH
PON
DID
1
0
-1
0 20 40 60 80 100
NaDC [mM]
Fig. 5. The relation of resolution vs NaC (a) and NaDC (b) concentration obtained for separated diastereomers of
flavanones.
The micelle of NaC enables the separation of naringin, neoeriocitrin, neohesperidin, poncirin -
flavanone glycosides with neohesperidose moiety and pyracanthoside with glucosidic moiety. The separation
of diastereomers with rutinosidic moiety is not observed for NaC. The micelle of NaDC recognizes
diastereomers of flavanones with neohesperidosidic moiety and also two flavanones with rutinoside –
didymin and narirutin.
The micelle of NaC is more effective in separating neohesperidosidic diastereomers, however the
micelle of NaDC also recognizes two diastereomers from the rutinoside group.
3.4. Estimation of binding constants
MEKC with various bile salts as micellar agents were applied for estimation of binding constants
between bile salts and drugs [17], proteins [18] and enantiomers of 1,1’-binaphthyl-2,2’-diyl hydrogen
phosphate [19]. The presented models describe interactions between negatively c harged micelles and
charged analytes. Since investigated flavanones are non-ionised under applied pH the simplified model of
interactions is proposed basing on the model described by Saitoh and al. [18].
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

52
The retention factor k can be related to the distribution coefficient K of a solute S between micellar and
aqueous phase through:
V
V
mic
k K
[2]
where V mic and V aq are volumes of micellar and aqueous phases, while distribution coefficient K is given by
the relation of concentrations of a solute in micellar (S mic ) and aqueous phase (S aq ):
S
S
aq
mic
K [3]
The concentration of micellar phase is equal to difference between bile salt concentration B and CMC. Thus
the relation can be written as follows:
k
aq
v B CMC
K
1 v B CMC
where v is partial specific volume of micelle.
Since the volume fraction of micellar phase is very small ( 1 v B CMC 1) thus the equation 3 can be
simplified to:
k Kv B CMC
[5]
The binding constant K B of solute-micelle interaction can be defined as follows:
K
S
free
S
B
bound
B
[6]
CMC
where S bound and S free are concentrations of a solute bounded with bile salt and free solute.
S aq can be represented by S free :
Similarly S mic can be represented by S bound :
S
S
aq
S
V
free
aq
S
V
1
v
S
B
free
CMC
Sbound
v B CMC
By substitution of equations 7 and 8 to equation 3, we obtain:
S
mic
bound
[8]
mic
bound
B
K [8]
S
free
S
B
CMC
Finally the following relationship is obtained:
k KB B CMC
[9]
The binding constants of flavanones to NaC and NaDC were estimated from the slopes of linear relationship
of k vs. [B-CMC]. The obtained data are presented in table 2.
Table 2. Binding constants of flavanones to bile salts
Compound NaC NaDC
S 29.1±1.3 30.6±2.3
Naringin
R 31.1±1.6 31.2±2.3
S 26.3±1.4 30.7±3.2
Neohesperidin
R 27.8±1.8 31.4±3.4
S 10.7±0.5 6.4±0.7
Neoeriocitrin
R 11.7±0.5 6.7±0.8
S 44.7±3.2 49.9±3.6
Poncirin
R 45.4±3.2 49.0±3.4
S
25.3±2.0
Narirutin
21.4±0.9
R 25.6±2.1
S
Hesperidin
13.5±2.2 23.8±2.4
R
S
Eriocitrin
7.0±1.2 6.3±0.7
R
S
39.5±2.1
Didymin
25.6±1.5
R 39.1±2.0
S 12.2±1.0
Pyracanthoside
5.8±0.8
R 13.0±1.0
K
free
[4]
[7]
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

53
The estimated binding constants have values between 6 and 50 M. Independently on the kind of bile
salt the binding constants are higher for neohesperidosides than for rutinosides. More hydrophilic flavanones
(eriocitrin, neoeriocitrin, pyracanthoside) stronger interact with less hydrophobic NaC than NaDC. More
hydrophobic flavanones (poncirin, didymin, hesperidin, neohesperidin) form stronger complexes with less
hydrophilic NaDC than with NaC.
3.5. Practical applications
The elaborated methods were applied in practice to analyse the flavanone fraction of bitter orange
(Citrus aurantium) and grapefruit (Citrus paradisi) juice. The main components of the flavanone fraction of
bitter orange are neoeriocitrin, naringin and neohesperidin, while naringin with small amounts of narirutin and
neohesperidin are the main flavanones of grapefruit. Fig. 6a presents t he electropherograms of the
flavanone fraction of sour orange juice obtained with buffers containing 100 mM of NaC and NaDC.
Comparing the selective properties of NaC and NaDC, it is observed that although NaC is more selective
towards diastereomers it does not separate naringin and neohesperidin, while NaDC allows the separation of
diastereomers as well as all the flavanones found in bitter orange.
Fig. 6. Electropherograms of the flavanone fraction of sour orange juice (a) and grapefruit juice (b) obtained with buffer
50 mM borate/200 mM phosphate buffer, pH 7.5, 10% of methanol containing 100 mM of NaC and NaDC.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

54
The diastereomeric ratio 2S:2R of neoeriocitrin and naringin is 59:41 and 66:34, respectively, while
neohesperidin appears only in 2S form. The applied buffer seems more suitable than that used by Gel -
Moreto et al. [6] since very mild pH (7.5) does not promote the diastereomerization reaction [20]. In fact, the
obtained diastereomeric ratio of flavanones (2S:2R) is higher than those obtained by Gel-Moreto et al.
Electropherograms of the flavonoid fraction of grapefruit juice under the same conditions as in the
case of bitter orange juice are presented in Fig. 6b. The main component of grapefruit juice is naringin with
small amounts of narirutin and neohesperidin. The ratio of the S:R form of naringin was 55:45.
4. Concluding remarks
The micelles of NaC and NaDC are effective resolving agents for diastereomers of flavanone
glycosides with neohesperidosidic moiety. Although NaC exhibits better selective properties towards
diastereomers of flavanones, NaDC appears to be more effective for separating a mixture of flavanones from
citrus juices. The moderate diastereoselective properties of NaDC are accompanied by better selective
properties towards the group of flavanones than those of NaC.
5. References
[1] Harborne J, Wiliams C, (2000) Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 55:481-504.
[2] Marin F, Frutos M, Perez-Alvarez J, Martinez-Sanchez F, Del Rio J (2002) Flavonoids as nutraceuticals:
structural related antioxidant properties and their role on ascorbic acid preservation. In: Atta-ur-Rahman
(ed) Studies in Natural Products Chemistry. Vol 26. Elsevier Science, Amsterdam.
[3] Hahlbrock K (1981) Flavonoids. In: Preiss J (ed) The biochemistry of plants. Vol. 7. Academic Press,
San Diego.
[4] Gel-Moreto N, Streich R. Galensa R (2001) Chiral separation of six diasteromeric flavanone -7-Oglycosides
by capillary electrophoresis and analysis of lemon juice. J. Chromatogr. A 925:279-289.
[5] Aturki Z, Sinibaldi M (2003) Separation of diastereomers of flavanone-7-O-glycosides by capillary
electrophoresis using sulfobutyl ether-β-cyclodextrin as the selector. J. Sep. Sci. 26:844-850.
[6] Gel-Moreto N, Streich R, Galensa R (2003) Chiral separation of diastereomeric flavanone -7-Oglycosides
in citrus by capillary electrophoresis. Electrophoresis 24:2716-2722.
[7] Yáñez J, Andrews P, Davies N (2007) Methods of analysis and separation of chiral flavonoids. J.
Chromatogr. B 848:159-181.
[8] Coello A, Meijide F, Nunez E R, Tato J V (1996) Aggregation behavior of bile salts in aqueous solutions.
J. Pharm. Sci., 85:9-15.
[9] Muijselaar P G, Otsuka K, Terabe S (1997) Micelles as pseudo -stationary phases in micellar
electrokinetic chromatography. J. Chromatogr. A 780:41-61.
[10] Otsuka K, Terabe S (2000) Enantiomer separation of drugs by micellar electrokinetic chromatography
using chiral surfactants. J. Chromatogr. A 875:163-178.
[11] Asztemborska M, Miśkiewicz M, Sybilska D (2003) Separation of some chiral flavanones by micellar
electrokinetic chromatography. Electrophoresis, 26:844-850.
[12] Chapman & Hall, Dictionary of Natural Products, London, 1994.
[13] Krause M, Galensa R (1991) High-performance liquid chromatography of diastereomeric flavanone
glycosides in Citrus on β-cyclodextrin-bonded stationary phase (Cyclobond I). J. Chromatogr. 588:41-
45.
[14] Cole R, Sepaniak M, Hinze M, Gorse W, Oldiges K, (1991) Bile salt surfactants in micellar electrokinetic
capillary chromatography: application to hydrophobic molecule separations. J. Chromatogr. 557:113-
123.
[15] Cifuentes A, Bernal J, Diez-Masa J (1997) Determination of Critical Micelle Concentration Values Using
Capillary Electrophoresis Instrumentation. Anal Chem. 69:4271-4274.
[16] Reis S, Guimaraes Moutinho C, Matos C, de Castro B, Gameiro P, Lima J (2004) Noninvasive methods
to determine the critical micelle concentration of some bile acid salts. Anal. Biochem. 334:117-126.
[17] Schwarz M, Neubert R, Rüttinger H (1996) Application of capillary electrophoresis for characterizing
interactions between drugs and bile salts. Part I. J. Chromatogr. A 745:135-143.
[18] Saitoh T, Fukuda T, Tani H, Kamidate T, Watanabe H (1996) Equilibrium study on interactions between
proteins and bile-salt micelles by Micellar Electrokinetic Chromatography. Anal. Sci. 12:569-573.
[19] Szökő E, Gyimesi J, Szakács Z, Tarnai M (1999) Equilibrium binding model of bile salt-mediated chiral
micellar electrokinetic capillary chromatography. Electrophoresis 20:2754-2760.
[20] Wistuba D, Trapp O, Gel-Moreto N, Galensa R, Schurig V (2006) Stereoisomeric Separation of
Flavanones and Flavanone-7-O-glycosides by Capillary Electrophoresis and Determination of
Interconversion Barriers. Anal. Chem. 78:3424-3433.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

55
Camera Separatoria
INSTRUKCJE DLA AUTORÓW
W Camera Separatoria wydawane są artykuły oryginalne (nie publikowane wcześniej) oraz
przeglądowe poświęcone różnym działom nauki, techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane
będą listy do redakcji, informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek, reklamy, materiały
firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o konferencjach.
Artykuł do CamSep przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003 lub nowszym (w formacie .doc
lub .docx) zgodnie z przedstawionym poniżej opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres
e-mail: camera.separatoria@gmail.com. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu.
* * *
Jan KOWALSKI, Anna KOWALSKA* (Arial 12 pkt., bold)
1
Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii,
Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce,
* Autor do korespondencji, e-mail: camera.separatoria@gmail.com
2 Uniwersytet … (Afiliacja – Arial 9 pkt., normal bez boldu)
Tytuł artykułu w języku polskim – 12 pkt. Arial bold
Streszczenie: (Arial 9 pkt. normal bold). Treść streszczenia – Arial 9 pkt. kursywa bez boldu. Streszczenie
polskojęzyczne powinno zawierać około 500 – 700 znaków (ze spacjami). Należy w nim krótko wskazać czego dotyczy
artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków.
Słowa kluczowe: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą
Tytuł artykułu w języku angielskim – 12 pkt. Arial bold – kursywa
Abstract: (Arial 9 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne – Arial 9 pkt. kursywa bez boldu, powinno być
rozszerzone, o objętości około 1000 – 1200 znaków (ze spacjami). Powinno zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł,
co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków.
Key words: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą
Podtytuły ponumerowane – Arial 12 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna,
Wyniki i dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) – wersja polska -
normal i (angielska - kursywą),
Śródtytuły ponumerowane – Arial 11 pkt., bold, wersja polska i angielska - kursywą
Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany – Arial 10 pkt., odstępy między
wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden sposób podziałów wierszy. Wszystkie marginesy 2 cm.
Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane przenoszone z tekstem. Wzory
napisane w edytorze równań należy traktować jako element zdania np.:
Vol. 8, No 1/2016
V
t
F
R R
(1)
Camera Separatoria

56
gdzie:
V R – objętość retencji,
t R – czas retencji [min.],
F – przepływ gazu nośnego [cm 3 /s].
Symbole użyte we wzorach powinny mieć rozmiar zgodny z rozmiarem czcionki tekstu rozdziału.
Wzory należy numerować kolejno w całym tekście artykułu. Numery wzorów powinny być wyrównane do
prawej. Oznaczenia stosowane na rysunkach i w tabelach muszą być czytelne i zgodne z oznaczeniami
używanymi we wzorach i w tekście artykułu. Nazwy związków chemicznych stosować zgodnie z
nomenklaturą IUPAC, jednostki z układu SI.
W odpowiednie miejsca w tekście należy wstawić rysunki i tabele wraz z tytułami. Powinny one
znajdować się w miejscach, w których po raz pierwszy są do nich odwołania w tekście artykułu. Rysunki i
zdjęcia zamieszczone w artykule muszą być czytelne i kontrastowe oraz zapisane jako czarno -białe lub w
skali odcieni szarości (w wersji elektronicznej mogą być w kolorze).
Rysunki i tabele należy numerować kolejno w całym tekście artykułu (Rys. i Tab. nr arabskie).
Tytuły rysunków i tabel należy podać w języku polskim i angielskim (kursywą) jak na przykładzie
przedstawionym poniżej:
Tabela 1. Całkowita emisja metali z obszaru Polski według rodzajów działalności. Arial 10 pkt.
Table 1. Total emission of heavy metals in the area of Poland kinds of activities. Arial 10 pkt.
Ogółem
(Total)
Elektrociepłow nie, elektrow nie,
ciepłow nie
(Heat and power plants, power
stations)
Cd Pb Cu Zn Ni
tony
66,1 555,0 390,9 2345,1 295,8
1,9 19,9 12,8 59,2 72,2
Tabele w pionie nie mogą przekraczać szerokości 12 cm, a w poziomie – 18 cm. Czcionka wewnątrz tabeli –
Arial 8 lub 9 pkt.
Rysunek, wykres, czy inna forma materiału ilustracyjnego nie może przekraczać w pionie – szerokości
12 cm, wysokości 18 cm; w poziomie – szer. – 18 cm, wysokości – 9÷10 cm (na stronie musi zmieścić się
jeszcze podpis do rysunku). Materiał ilustracyjny powinien być zapisany z rozszerzeniem JPG i przesłany
dodatkowo w oddzielnych plikach podpisanych, jako Rys.1., Rys. 2. itd.
Rys. 1. Tytuł rysunku w języku polskim, Arial 9 pkt.
Fig. 1. Tytuł rysunku w języku angielskim, Arial 9 pkt.
Literatura
(w tekście numerujemy w kolejności cytowania [1], [2, 3], [4-8] itd., - Arial 10 pkt.):
1. L.E. Green, J.C. Worman, Research of separation…, Analytical Chemistry 37 (1965) 1620.
Oprócz danych bibliograficznych należy zamieścić tytuł, w tym także publikacji, materiału z internetu, opisu
patentowego itp. Tytuł w j. polskim, lub innym, niż język polskim jest pisany zwykłym drukiem w cudzysłowie,
tytuł w języku angielskim – kursywą.
2. T. Paryjczak, „Chromatografia gazowa…”, tłumaczenie tytułu na j. angielski kursywą, PWN, Warszawa
1986.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

57
(w przypadku, gdy tytuł pracy jest w innym języku, niż po angielsku, należy tytuł oryginalny napisać w języku
oryginału, a następnie jego tłumaczenie na język angielski - kursywą)
Wszystkie materiały:
artykuł (w formacie .doc, .docx, lub .rtf),
dodatkowo zdjęcia i rysunki (w formacie JPG),
prosimy przesyłać w formie plików, w jednej wiadomości na adres e-mail: camera.separatoria@gmail.com
* * *
Przesłany artykuł do CamSep podlega wstępnej ocenie przez Edytora, następnie przekazywany jest
dwóm recenzentom do oceny. Recenzenci pozostają anonimowi.
O przyjęciu artykułu do druku decyduje redakcja, w oparciu o przygotowaną recenzję. Jeśli w jej
wyniku zachodzi konieczność poprawienia artykułu przez autora, to powinno to nastąpić w okresie nie
dłuższym niż trzy tygodnie. Po tym terminie uważa się, że autor rezygnuje z publikacji lub gdy artykuł
zostanie przesłany do redakcji podlegać on będzie ponownej ocenie.
Po opublikowaniu autorzy bezpłatnie otrzymują elektroniczna wersję artykułu i właściwy nr CamSep
jako egzemplarz autorski.
Ogłoszenia/reklamy mogą być publikowane za odpowiednią, wcześniej ustaloną, opłatą.
Przepisy etyczne
Ważne jest, aby uzgodnić standardy etycznych zachowań dla wszystkich zaangażowanych w
działania publikacji: autora, redaktora czasopisma, recenzenta, wydawcy i społeczeństwa czasopism.
Redaktorzy i recenzent są zobowiązani do zapewnienia, że reklama, przedruk lub inny przychód komercyjny,
nie ma wpływu na decyzje redakcyjne. Nie mogą oni ujawniać żadnych informacji na temat przedstawionego
rękopisu do kogokolwiek innego niż autora artykułu. Niepublikowane materiały, ujawnione w przedstawionej
pracy, nie mogą być używane przez redaktorów/recenzentów, jako część własnych badań bez pisemnej
zgody autora. Powielanie lub adaptacja opublikowany wcześniej tabel, rycin, ilustracji lub obszernych
cytatów z innych źródeł, akceptowana jest tylko za posiadaniem odpowiedniej pisemnej zgody autora.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

58
Zapory ghostwriting i guest-autorship
Zgodnie z wytycznymi MNiSzW (https://pbn.nauka.gov.pl/static/doc/wyjasnienie_dotyczace_ghostwriting.pdf
[dostęp 19.01. 2012 r.]). oraz dbając o rzetelność naukową publikacji Redakcja Camera Separatoria wdraża
procedury wykluczające nieetyczne działania przy publikowaniu wyników badań. Warunkiem publikacji
artykułu jest ich zachowanie przez Autorów. Przejawy braku rzetelności i działań nieetycznyc h będą
dokumentowane przez redakcję. Po zakwalifikowaniu publikacji do druku Autor korespondujący
zobowiązany jest do przesłania oświadczenia, że wszyscy współautorzy brali czynny udział w jej
przygotowaniu i są współposiadaczami praw autorskich. Aby autorstwo było uzasadnione musi opierać się
na istotnym wkładzie do (i) opracowania idei (koncepcji) pracy, (ii) wykonania eksperymentu, (iii) analizy i/lub
interpretacji danych, (iv) opracowaniu artykułu i jego krytycznej oceny. Nie zalicza się do tego udziału
działania polegającego jedynie na zbieraniu funduszy lub zbieraniu danych oraz nadzorowanie pracy. W
oświadczeniu musi się także znajdować zapis o niepominięciu w składzie zespołu autorskiego nikogo, kto
wniósł istotny wkład badawczy w powstanie pracy. Redakcja może dodatkowo zwrócić się Autorów o
wskazanie tego z nich, który ma największy udział w publikacji i procentowego udziału pozostałych autorów,
a także podania który z autorów jest twórcą koncepcji badawczej, metodyki badań, analizy wyników itd.
.………………….…
miejscowość, data
………………..……………….
imię i nazwisko (nr dow. os.)
…………………………………………………..……..
afiliacja
…………………………………………………..……..
adres do korespondencji, e-mail, nr telefonu
Oświadczam, że zostałem poinformowany o zasadach związanych z zaporą ghostwriting i guest-authorship.
W związku z tym wraz z manuskryptem publikacji poniżej załączam informacje o podmiotach
przyczyniających się do jej powstania (wkład merytoryczny, rzeczowy, finansowy etc.), z podaniem ich
afiliacji oraz udziału, tj. informacji kto jest autorem koncepcji, wykonawstwa eksperymentu, obliczeń i/lub
wyprowadzenia wzorów, protokołu itp. oraz dane o źródłach finansowania publikacji (financialdisclosure).
Jako osoba zgłaszająca manuskrypt do druku ponoszę odpowiedzialność za podanie danych zgodnych z
prawdą. Zgłoszenie artykułu jest jednoznaczne z przekazaniem Redakcji praw do opublikowania artykułu w
wersji papierowej i elektronicznej.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

59
Instructions for Authors and Editorial Policy
Camera Separatoria is a scholarly and peer-reviewed journal (print and online) published 2 times per
year which was founded in 2009. It is a continuation of the journal Postępy Chromatografii (Progress in
Chromatography) devoted to the science, technique and technology of separation. It provides a medium for
the publication of theoretical and experimental studies and reviews related to separation science:
chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, exctraction, electroseparation etc.
Camera Separatoria publishes original (not published previously and are not currently under
consideration by another journal except in the form of an abstract or as part of a published lecture, review, or
thesis) and review papers from all branches of separation science, technique and technology. Additionally
letters to the editor; expert opinions; information on instrumentation, book reviews and information about
conferences as well as advertisements are also published. The journal welcomes contributions which
promote the exchange of ideas and rational discourse between practicing educators and material
researchers all over the world.
The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e -mail. No
limitation of the articles lengths are provided. The manuscript should be original, has not been published
previously and should not be currently being considered by another journal.
The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e -mail. No
limitation of the articles lengths are provided.
Manuscript should be prepared using MS-Word editor in the .doc/.docx format. It should be typed in
single-spaced lines using Arial 10p. font with the overall page numbering (at the center of bottom margins).
Tables (Arabic numeration, title in Polish and English, Arial 10p.), figures and figure captions (Arabic
numeration, in Polish and English, Arial 9p.) and references can be placed directly to the text. The main
heading appears in the following order:
- list of Authors by first, middle names, surname (capital letters); the Corresponding Author’s name should be
accompanied by an asterisk (*); if Authors are from more than one affiliation, use superscript numbers to
link the Authors’ names and their affiliations,
- list of affiliations and complete mailing addresses of the authors (including zip code, city, street, and
number; for universities, the faculty or department should be given),
- the title (should not exceed 20 words) of the article in Polish as well as English, (in all capital letters, Arial
12p.),
- if there is more than one affiliation, use asterisks to indicate the institute with which each author is affiliated,
as it is presented below:
Jan K. KOWALSKI, Karol ROBERT*
Department of Separation Science, Institute of Chemistry
ul. 1 Maja 3, 00-000 Warszawa
*e-mail: camera.separatoria@gmail.com
I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne
1 st Podlasie’s Chromatographic Meeting
Body text…
In the subsequent text, the following parts are is desirable: abstract (in Polish and English, Arial 9p.),
keywords (about five, in Polish and English, Arial 9p.), introduction (review of literature and formulation the
aim of the paper), experimental (reagents, apparatus, protocols, data analysis), results and discussion,
conclusions, acknowledgments and literature. The SI units and nomenclature recommended by IUPAC
should be used. References should be typed in the forms:
1. J.K. Kowalski, K. Robert, Research of separation…, Analytical Chemistry 44 (2000) 666.
2. A. Adzik, in Fundamentals of Separation Science, K. Karol, ed., PTNoR, Reymontówka 2000.
3. Polish standard PN – EN ISO 17993, text…
4. S. Separator, Proceedings of 2 nd Podlachia’s Chromatographic Meeting, Kotuń-Chlewiska, Sep. 12-18,
1987.
in a list at the end of article and numbered in the order of appearance. Citation in the text should be denoted
by number in square brackets.
One of the Editor first evaluates the manuscript. Exceptionally it can be accepted at this stage. Those
rejected at this stage are passed on to 2 experts for review. Acceptance for publication is subject to positive
recommendation from the referees. The referees remains anonymous throughout the process. Reviewers
are not supposed to contact the authors or to otherwise make their identity known. The referees are asked to
evaluate the manuscript according to the below rules within 3 weeks. Authors have three months to correct
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

60
the article after the reviewing process. After this time, the returned article is considered as newly received.
The authors receive the electronic version of their paper and the proper volume of Camera Separatoria free
of charge.
Advertisements may be published according to the prescribed rates.
* * *
Ethical guidelines
It is crucial to agree upon standards of expected ethical behavior for all involved in the act of
publishing: author, editor, reviewer, publisher and society. Editors and reviewer are committed to ensuring
that advertising, reprint or other commercial revenue has no impact or influence on editorial decisions. They
must not disclose any information about a submitted manuscript to anyone other than the corresponding
author. The unpublished materials disclosed in a submitted manuscript must not be used in an
editor's/referee’s own research without the express written consent of the author. The reproduction or
adaptation of previously published tables, figures, illustrations, or extensive quotations from other sources
must obtain appropriate written permission.
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria

61
Camera Separatoria
OD REDAKCJI
Z przykrością i smutkiem zawiadamiamy, że 18 kwietnia 2016 roku zmarł w wieku 77 lat
nasz przyjaciel i kolega, członek Komitetu Naukowego Camera Separatoria,
profesor Andrzej STOŁYHWO
Chcielibyśmy, aby następny numer Camera Separatoria został poświęcony Jego pamięci.
Serdecznie zapraszamy do przesyłania propozycji artykułów oryginalnych, przeglądowych
ale również wspomnień.
Redakcja
Vol. 8, No 1/2016
Camera Separatoria