CamSep 7 1

36
Tabela 5. Zestawienie wyznaczonych parametrów chromatograficznych, uzyskanych w wyniku analizy
chromatograficznej (RP HPLC) próbki kwercetyny, z zastosowaniem różnych kwasów, jako dodatków do
eluentu
Table 5. Summary of the derived chromatographic parameters, obtained by the analysis of samples of
myricetin, using different acids as additives to the eluent.
Lp.
Rodzaj
kwasu
Liczba półek
teoretycznych,
N [-]
Współczynnik
asymetrii
As 0,5 [-]
Współczynnik
asymetrii,
As 0,1 [-]
Czas retencji,
tr [min]
Współczynnik
retencji, k [-]*
(Type of
acid)
(Number of
theoretical
plates, N [-])
(Asymmetry
factor,
As0,5 [-])
(Asymmetry
factor,
As0,1 [-])
(Retention
time, tr [min])
1 H3PO4
6872 1,50 2,00 5,04
1,55
5,03
7740 1,50 2,16 5,02 1,53
2 HCl
4198 1,33 2,20 5,25
1,65
5,21
4143 0,90 1,66 5,16 1,60
3 H 2SO 4
11620 1,00 1,60 5,08
1,57
5,08
10817 0,99 1,50 5,08 1,57
4 CH3COOH
6343 1,50 1,85 5,65
1,85
5,64
5944 1,50 2,00 5,63 1,84
5 TFA
4193 1,00 2,50 5,18
1,61
5,20
4535 2,00 2,20 5,21 1,63
* wartość czasu retencji substancji niezatrzymywanej: t0 = 1,98 min
(Retention
factor, k [-])
Z otrzymanych wyników badań dotyczących określenia wpływu zastosowania różnych rodzajów
kwaśnego modyfikatora na parametry chromatograficzne (tabele 4 i 5) można zauważyć,
że najkorzystniejszy wpływ na sprawność rozdzielania ma obecność tlenowych kwasów nieorganicznych
w fazie ruchomej. Dla kwasu siarkowego oraz ortofosforowego otrzymano następujące wartości:
(kwercetyna: N H2SO4 = 13495; N H3PO4 = 13223 oraz mirycetyna: N H2SO4 = 11620; N H3PO4 = 7740).
W przypadku pozostałych kwasów, na chromatogramach widoczne jest niewielkie przesunięcie w
wartościach czasów retencji analitów oraz różnice w szerokościach połówkowych, co wpływa na
rozbieżności wyznaczonych liczb półek teoretycznych (rys. 3 i 4). Identyczna zależność obserwowana jest
także ze względu na wartość współczynnika asymetrii pików. Najlepszą symetrię pików pochodzących od
analizowanych związków uzyskano dla kwasów nieorganicznych zwłaszcza dla kwasu siarkowego i solnego,
np. dla kwasu siarkowego, współczynnik As 0,5 piku właściwego dla kwercetyny oraz mirycetyny wynosi 1.
Obecność w eluencie kwasów organicznych skutkuje wzrostem czasu retencji w porównaniu do kwasów
nieorganicznych. Te rezultaty są efektem zastosowania powszechnie używanego, zwłaszcza
w chromatografii białek i peptydów, kwasu trifluorooctowego [24]. Wynika to z tworzenia, tzw. par jonowych
dzięki dodatkowi TFA, a w konsekwencji minimalizowania ładunku zdysocjowanych grup funkcyjnych
peptydu i zwiększenia jego hydrofobowości [24-26]. W przypadku rozdzielenia i analizy polifenoli
charakteryzuje się jednak znacznie mniejszą sprawnością i gorszą symetrią pików zwłaszcza w porównaniu
do kwasu siarkowego i ortofosforowego (tabele 4 i 5). Jedynie zastosowanie kwasu solnego daje podobny
efekt jak dla TFA w postaci liczby półek teoretycznych, jednakże w przypadku HCl uzyskiwane są piki
o większej symetrii.
W celu sprawdzenia zasadności użycia kwasu jako dodatku do eluentu przy rozdzielaniu związków
będących słabymi kwasami wykonano analizę chromatograficzną mieszanin dwóch polifenoli w identycznych
warunkach, z tą tylko różnicą, że dla pierwszego przypadku eluent nie zawierał dodatku, a drugim obecny
był kwas siarkowy (jako dodatek z użyciem którego uzyskano najlepsze wartości parametrów
chromatograficznych). Dodatkowo, zastosowano inny rodzaj kolumny chromatograficznej, mianowicie
kolumnę C-18 zamiast C-18e, wykorzystywanej we wcześniejszym etapie badań. Zabieg ten miał na celu
porównanie wartości współczynników retencji oraz asymetrii pików, w zależności od zastosowanej kolumny
chromatograficznej (tabele 4-6). Rezultaty w postaci chromatogramów przedstawiono na rys. 5.
1,54
1,63
1,57
1,85
1,62
Vol. 7, No 1/2015
Camera Separatoria