CamSep 7 1

Siedlce University of Natural Sciences and Humanities 

Polish Separation Science Society 

Camera Separatoria 

Volume 7, Number 1 / June 2015 

Siedlce 2015

Honorary Editor: 

Edward Soczewiński (Lublin) 

Editors-in-Chief: 

Bronisław K. Głód 

(Siedlce) 

Marian A. Kamiński (Gdańsk) 

Editors: 

Tadeusz Dzido (Lublin) 


(Siedlce) 

Marian Kamiński (Gdańsk) 

Piotr M. Słomkiewicz (Kielce) 

Piotr Stepnowski (Gdańsk) 

Andrzej Stołyhwo (Warszawa) 

Monika E. Waksmundzka-Hajnos (Lublin) 

Mieczysław Sajewicz 

(Katowice) 

Language Editor: 

John Podgórski (Manchester) 

Technical Editors: 

Paweł Piszcz 

Reviewers: 

Monika Asztemborska 


Marian Kamiński 

Iwona Kiersztyn 

Paweł Piszcz 

Mieczysław Sajewicz 

Piotr M. Słomkiewicz 

Monika E. Waksmundzka-Hajnos 

Editorial office’s address: 

Department of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry 

Siedlce University of Natural Sciences and Humanities 

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce 

tel. : (25) 6431041 

e-mail: camera.separatoria@gmail.com 

URL: http://dach.ich.uph.edu.pl/camera_separatoria.html 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

SPIS TREŚCI 

(CONTENTS) 

Prace przeglądowe / Review papers 

Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ 

Techniki i metody wyodrębniania, rozdzielania i oznaczania frakcji asfaltenowej 

w rafineryjnych strumieniach procesowych…………….………………………………………………. 5 

Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ 

Zastosowanie technik chromatograficznych do badań charakterystyki fizykochemicznej czystych 

substancji i mieszanin ………………………………………………………………………………….....17 

Prace oryginalne / Original papers 

Marta GLINKA, Marina ANTOLAK, Rafał ŁUKAJTIS, Marian KAMIŃSKI 

Wpływ rodzaju kwasu jako dodatku do eluentu na parametry rozdzielania polifenoli techniką 

chromatografii cieczowej w odwróconych układach faz (RP-HPLC)…….………………………….. 25 

Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD 

O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania 

całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Część I. Dobór warunków chromatograficznych.…...41 

Judyta KOSIŃSKA, Grażyna GAŁĘZOWSKA, Sebastian ZALEWSKI, 

Marian KAMIŃSKI 

Chromatografia cienkowarstwowa i technika TLC-FID w badaniach składu grupowego, 

szczególnie, tłuszczów i produktów ich konwersji………………………………………………....…...52 

Judyta KOSIŃSKA, Monika ŚMIEŁOWSKA, Marian KAMIŃSKI 

Badania nad rozdzielaniem grupowym technikami sorpcji i chromatografii. 

Część I – Wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) dla doboru warunków 

rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji technikami kolumnowymi.…………………...…...70 

Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD 

O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania całkowitego 

potencjału antyoksydacyjnego. Część II. Właściwości antyoksydacyjne mięsa………………..…...87 

Instrukcje dla Autorów……………………………………………………………………………………..94 

Instructions for Authors and Editorial Policy…………………………………………………………….98 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria


PRACE PRZEGLĄDOWE 

(Review papers) 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

CAMERA SEPARATORIA 

Volume 7, Number 1 / June 2015, pp. 05-16 

Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ* 

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej 

*Autor do korespondencji, e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 

Techniki i metody wyodrębniania, rozdzielania i oznaczania frakcji asfaltenowej 

w rafineryjnych strumieniach procesowych 

Streszczenie: W pracy przedstawiono metodyki izolacji frakcji asfaltenowej z rafineryjnych strumieni procesowych w tym 

ropy naftowej, olei i asfaltów w skali analitycznej i preparatywnej. Uwzględniono podstawowe zależności pomiędzy 

właściwościami otrzymanej frakcji, a ciśnieniem, temperaturą, proporcją oraz rodzajem czynnika precypitującego, a także 

czasem i temperaturą kontaktu oraz techniką oczyszczania powstałego osadu. Dodatkowo opisano techniki pozwalające 

na dalsze rozdzielenie wydzielonej frakcji oraz przedstawiono sposoby badania zawa rtości asfaltenów w surowcu 

i produktach jego przeróbki. 

Słowa kluczowe: asfalteny, precypitacja, rozdzielanie grupowe, wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC, 

chromatografia cienkowarstwowa z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym TLC-FID 

Techniques and methods of isolation, separation and quantification of asphaltene 

fraction in refinery process streams 

Abstract: The paper presents methods of isolation of asphaltene fraction from refinery process streams especially from 

crude oil, oils and bitumen in analytical and preparative scale. The relationship between the properties of the obtained 

fraction, pressure, temperature, proportion and type of precipitating agent, time and contact temperature and the solid 

asphaltenes purification techniques are described in details. Additionally the techniques used for further separation of 

asphalthenes into subsequent fractions are discussed as well as methods used for quantitative analysis of asphaltenes 

content in the feedstock and products of its processing. 

Keywords: asphaltenes, precipitation, group-type separation, high performance liquid chromatography HPLC, thin layer 

chromatography with flame ionization detector TLC-FID. 

1. Wstęp 

1. Introduction 

Asfalteny są klasą związków chemicznych, stanowiących grupę składników surowej ropy naftowej, 

występującej w całości po przeróbce w pozostałości z destylacji próżniowej oraz produktów ekstrakcji lub jej 

konwersji. Charakteryzuje się je na podstawie rozpuszczalności składników tej grupy w określonych 

n-alkanach. W strukturze cząsteczek asfaltenów znajdują się przede wszystkim wielopierścieniowe 

skondensowane struktury poliaromatyczne, a także niewielkie ilości struktur alicyklicznych oraz raczej 

niewielka liczba prostych i rozgałęzionych łańcuchów węglowodorowych [1, 2]. Asfalteny wykazują 

rozpuszczalność w rozpuszczalnikach takich jak np.: toluen, tetrahydrofuran (THF), benzen i dichlorometan 

(DCM). Pod względem morfologicznym są policyklicznymi węglowodorami aromatycznymi z peryferyjnie 

przyłączonymi łańcuchami alifatycznymi zdolnymi do tworzenia ok. 6-członowych agregatów, a dalej 

ok. 8-członowych klastrów układających się w struktury pseudografitowe [3]. Asfalteny to czarno-brązowe, 

błyszczące substancje polarne zawierające w swej budowie heteroatomy siarki, azotu i tlenu oraz metale 

takie jak wanad, nikiel i żelazo. Większość składników frakcji asfaltenowej wykazuje rozkład termiczny 

poniżej temperatury wrzenia. Ich budowa i właściwości fizykochemiczne różnią się w zależności od metody, 

jaką je wyizolowano. Asfalteny to frakcja ropy naftowej lub produktów ropopochodnych, która nie rozpuszcza 

się w lekkich rozpuszczalnikach węglowodorowych, głównie n-pentanie, n-heksanie, n-heptanie i izo-oktanie. 

W literaturze bardzo często asfaltenami nazywana jest zarówno pozostałość nierozpuszczalną w parafinach 

jak i tę część otrzymanej frakcji, która rozpuszcza się w benzenie lub toluenie tj. nie zawierającą karbenó w 

(rozpuszczalnych w disiarczku węgla) i karboidów (nierozpuszczalnych w disiarczku węgla) [4, 5]. Asfalteny 

są głównymi składnikami asfaltów drogowych i mieszanek asfaltowych, nadającymi im spoistość i lepkość 

[6]. Można je stosować jako dodatek do gum mi neralnych poprawiający wytrzymałość na rozciąganie 

i nadający twardość [7]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

6 

Asfalteny to także prekursory tworzenia się koksu stanowiącego jeden z głównych problemów 

w procesach hydrorafinacji, hydroodsiarczania [8], oraz hydrokrakingu katalitycznego. Zdyspergowane, 

w niskim stężeniu obniżają temperaturę precypitacji wosków, działając jak inhibitory nukleacji, natomiast 

wpływ dużych agregatów przy wyższych stężeniach na proces żelacji jest dokładnie odwrotny [9]. 

Ze względu na wszystkie wyżej wymienione właściwości as faltenów, ważne jest, aby poznać ich 

charakterystykę fizykochemiczną i opisać ilościowo jej zależność od techniki izolacji, za pomocą której je 

uzyskano. Frakcja asfaltenowa o kontrolowanych właściwościach fizykochemicznych może znaleźć 

zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. W niniejszej pracy porównano metody izolacji oraz rozdzielania 

i oznaczania frakcji asfaltenowej. Ponadto opisano również wpływ najważniejszych parametrów na ich 

właściwości. 

2. Precypitacja standardowa 

2. Standard precipitation 

Precypitacja standardowa, służąca pierwotnie do oznaczania zawartości asfaltenów w materiałach 

pochodzenia naftowego, jest najczęściej spotykaną i najlepiej opisaną techniką izolacji frakcji asfaltenowej. 

Istotą metody jest dodanie do surowca odpowiedniego czynnika precypitującego, czyli takiego, w którym 

rozpuszczają się wszystkie, albo większość, składników przetworów naftowych, a nie rozpuszcza się frakcja 

asfaltenowa. Istnieje wiele odmian tej operacji, które podzielić można ze względu na wykorzystany s urowiec, 

czynnik precypitujący, proporcje składników, sposób przemywania osadu oraz wykorzystaną aparaturę. 

Najczęściej miesza się surowiec i rozpuszczalniki, a następnie odfiltrowuje wytrącony osad. Do oddzielenia 

frakcji od przesączu alternatywnie wykorzystuje się również wirówki obrotowe, gdzie każdorazowo po 

dodaniu świeżej porcji czynnika precypitującego i odwirowaniu zlewa się ciecz znad osadu. Kolejnym 

krokiem, może być, ale nie musi, oczyszczanie asfaltenów z koprecypitatów i innych niechcianych 

składników zawartych w próbce. 

W zależności od zastosowanego surowca i czynnika precypitującego lub jego mieszanin oraz ich 

wzajemnej proporcji, a także temperatury prowadzenia procesu i czasu kontaktu składników możliwa jest 

nieskończenie duża liczba wariantów metodyki. Najczęściej stosowane są jednak te ujęte w normach, 

w szczególności serii ASTM oraz inne zestawione w tabeli 1. 

Tabela 1 Zestawienie wybranych norm opisujących techniki izolacji frakcji asfaltenowej [10-14]. 

Table 1 Selected standards describe the asphaltenes isolation techniques [10-14]. 

Norma 

Zakres zastosowania 

metodyki 

Precypitant 

Objętość 

precypitanta 

[mL/g próbki] 

Temperatura 

mieszania i czas 

kontaktu 

ASTM D893-02 oleje bazow e n-pentan 10 w irow anie 20min - 

ASTM D2007-03 

ASTM D3279-97 

ASTM D4124-01 

w ypełniacze gumow e, 

oleje naftow e oraz 

oleje, których 

temperatura destylacji 

rozpoczyna się 

pow yżej 260°C 

stałe i półstałe asfalty 

naftow e nie 

zaw ierające lub 

zaw ierające 

nieznaczne ilości 

materii mineralnej, 

oleje napędow e, 

ciężkie oleje opałow e, 

ropa naftow a 

asfalty naftow e, 

destylaty próżniow e, 

oleje napędow e i oleje 

smarow e 

n-pentan 10 

n-heptan 100 

n-heptan 100 

delikatne ogrzewanie do 

rozpuszczenia się 

osadu, chłodzenie 

30min 

ogrzew anie 15-30min, 

chłodzenie 60min, 

filtrow anie 38-49°C 

ogrzew anie do 

rozpuszczenia się 

osadu (1godz.), 

chłodzenie przez noc 

Rodzaj 

filtra 

filtr 

papierow y 

w łókno 

szklane 

szybki/ 

średni 

ilościow y 

filtr 

papierow y 

Operacje dodatkowe 

2-krotne 

odw irowywanie osadu 

ze św ieżą ok. 10mL 

porcją pentanu 

przemycie kolby i filtru 

porcjami po 60mL 

pentanu 

przemyw anie 3 

porcjami n-heptanu po 

10mL 

do osadu dodaje się 

150mL n-heptanu, 

ogrzew a 30min i 

filtruje na gorąco 

przez św ieży filtr 

ASTM D4124-09 

ASTM D6560-00 

asfalty naftow e, 

destylaty próżniow e, 

oleje napędow e i oleje 

smarow e 

olej napędow y, 

resztkowy olej opałowy, 

olej smarow y, asfalt, 

ropa naftow a 

izooktan 100 

n-heptan 30 

ogrzew anie, chłodzenie 

i mieszanie po 2 

godziny 

ogrzew anie 60±5min, 

chłodzenie 90-150min 

średni filtr 

szklany 

filtr 

Whatman 

42 

- 

ekstrakcja 

uzyskanego osadu w 

aparacie Soxhleta 

gorącym n-heptanem 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

7 

Norma 

WRI (World 

Resources 

Institute) 

IFP 9313 

absorbance 

versus maltenes 

at 750nm 

Zakres zastosowania 

metodyki 

Precypitant 

Objętość 

precypitanta 

[mL/g próbki] 

- n-heptan 40 

- n-heptan 20-200 

Temperatura 

mieszania i czas 

kontaktu 

ogrzew anie 5min w 

80°C, mieszanie 

16godz. w temperaturze 

pokojow ej, odstaw ienie 

30min 

ogrzew anie 5min w 

80°C, filtrow anie w temp 

pokojow ej 

Rodzaj 

filtra 

średni filtr 

szklany 

filtr z estrów 

celulozy 

0,45µm 

Operacje dodatkowe 

nie krócej niż 60min z 

następczym 

rozpuszczeniem w 

toluenie (30-60mL) 

- 

- 

W 1916 roku Marcusson stworzył pojęcie „asfalteny”, obejmujące frakcję nierozpuszczalną 

w mieszaninie n-pentanu, izopentanu i cyklopentanu (temperatura wrzenia 88°C). Scharakteryzował on 

oprócz asfaltenów jeszcze trzy inne frakcje: kwasy asfaltogenowe i ich bezwodniki, żywice asfaltenowe, a 

jako pozostałość- składniki olejowe [15]. Ancheyta powtórzył doświadczenie Marcussona stosując 

pentanowy strumień rafineryjny zawierający 40,9% n-pentanu, 30,5% izopentanu, 3,4% propan-butanu, 

25,9% n-heksanu i n-heptanu. Próbkę ropy naftowej zmieszanej w stosunku 1:60 względem precypitanta 

podgrzewano do temperatury ok. 92°C przez 20 minut i pozostawiono na godzinę do ochłodzenia, następnie 

przefiltrowano, przemyto trzema porcjami heptanu i wysuszono w 107°C. W porównaniu z zastosowaniem 

czystego n-pentanu, uzyskano większą ilość frakcji asfaltenowej, jednak ze względu na złożoną mieszaninę 

rozpuszczalnika wyizolowane, z zastosowaniem jednakowej procedury, asfalteny charakteryzowały się 

odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi [16]. 

W 1941 roku do precypitacji wykorzystano n-pentan w temperaturze pokojowej (dodawany porcjami 

po 100, 75 i 50 mL) w proporcji 45:1 względem asfaltu, pozostawiając tak przygotowaną mieszaninę „na 

noc”. Po odsączeniu i przemyciu osadu dodano do niego pozostałości osadz one na ściankach kolby, 

wysuszono w 105°C i zważono [17]. W podobny sposób można wydzielić asfalteny z wykorzystaniem 

izopentanu, zmieszanego w proporcji 1:40 po 24 godzinnej ekspozycji [18], oraz n-pentanu w takiej samej 

proporcji po 2 godzinnej ekspozycji [19]. 

Izolacja frakcji asfaltenowej możliwa jest również z innych surowców niż ropa naftowa i jej przetwory. 

Asfalteny z rozdrobnionych mieszanek kauczukowych izolować można z wykorzystaniem zimnego eteru 

naftowego jako precypitanta w proporcji 1:49. Próbkę po wymieszaniu z rozpuszczalnikiem umieszcza się w 

chłodnym miejscu na 48 h, przesącza, a powstały osad przemywa eterem naftowym do czasu, gdy nie 

zauważa się pierścieni olejowych [7]. Asfalteny z węgla otrzymuje się w procedurze trzy-etapowej poprzez 

pierwotne rozpuszczenie w pirydynie, dodanie do frakcji rozpuszczalnej toluenu i właściwą precypitację 

n-heksanem. Badania węglową spektroskopią magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Carbon Nuclear 

Magnetic Resonance, CNMR) wykazały, że cząsteczki asfaltenów węglowych zawierają w swojej strukturze 

większą ilość węgli aromatycznych i krótsze alifatyczne łańcuchy boczne w stosunku do asfaltenów 

wydzielonych z ropy naftowej [20]. 

W 2004 roku E. Hong i P. Watkinson wykorzystali pozostałość próżniową (ang. Vacum Residue, VR) 

i pozostałość po destylacji atmosferycznej (ang. Atmospheric Tower Bottoms, ATB) jako surowiec do 

precypitacji. Rolę rozpuszczalników pełniły: czyste n-alkany, olej bazowy (ang. Lube Oil Base-Stock- 

Paraflex, PFX), ciężki próżniowy olej napędowy (ang. Heavy Vacuum Gas Oil, HVGO) i wzbogacona frakcja 

żywiczna (ang. Resin Enriched Fraction, REF) odzyskana z VR poprzez frakcjonowaną ekstrakcję płynem w 

stanie nadkrytycznym. Precypitacja przeprowadzana była w sposób standardowy poprzez 30 minutowe 

mieszanie surowca z czynnikiem precypitującym w temperaturze 60 °C w przypadku n-alkanów i 85°C dla 

mieszanin wieloskładnikowych. Badania wykazały, że dla surowców poddanych precypitacji 

z zastosowaniem n-heptanu, n-dekanu i n-dodekanu, ilość uzyskanej frakcji asfaltenowej wzrastała wraz ze 

spadkiem liczby atomów węgla w łańcuchu węglowodorowym. W mniejszym stopniu tendencję tę stwierdza 

się dla cieczy precypitujących stanowiących mieszaniny bardziej polarnych frakcj i i surowców z dodatkiem 

alifatycznych rozpuszczalników, gdyż dodatek składnika bogatego w żywice hamuje wytrącanie się frakcji 

asfaltenowej, poprzez zwiększenie jej rozpuszczalności. Asfalteny rozpuszczają się w roztworze w zakresie 

temperatur od 100 do 140°C, ale mogą wytrącać się ponownie w temperaturze powyżej 200°C [21]. 

Dodatkowo stwierdzono, że ilość wydzielonych asfaltenów maleje monotonicznie wraz ze wzrostem 

temperatury, a efekt ten ma głównie znaczenie w temperaturach poniżej 160°C. Potwierdza t o wcześniejsze 

badania spadku procentowej zawartości wytrąconych asfaltenów wraz ze wzrostem temperatury dla 

czystego n-heptanu i jego mieszaniny z toluenem w granicach 24-80°C [22]. 

E. Buenrostro-Gonzalez i inni poddali badaniom olej martwy (ang. Dead Oil), czyli olej o bardzo niskiej 

prężności par pozbawiony całkowicie frakcji lotnej, lub stosunkowo gęsty, tak że nie zawiera rozpuszczonego 

gazu (utracił swoje lotne składniki). Do 5g próbki po wstępnej filtracji dodawano czynnika precypitującego, 

którym był zamiennie n-pentan, n-heptan, n-nonan i n-dodekan w ilości 0,52; 1; 2; 3; 4; 7; 10; 30; 50 cm 3 /g. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

8 

Całość mieszano w wytrząsarce ultradźwiękowej 10 min i pozostawiano „na noc”. Wytrącone asfalteny 

filtrowano przez sączek teflonowy 0,45 µm i suszono w suszarce próżniowej pod ciśnieniem 0,1 bar w 

temperaturze 60°C przez 6 godzin. Dla dwóch badanych olei stwierdzono największy odsetek 

wyizolowanych asfaltenów w przypadku precypitacji z wykorzystaniem n-pentanu i proporcji surowiec 

rozpuszczalnik 1:50 [23]. Takie same wnioski wyciągnięto analizując ropę naftową z zastosowaniem n - 

pentanu i n-heptanu przy 24godzinnej ekspozycji oraz z zastosowaniem procedury 2-etapowej, polegającej 

na pierwotnym zmieszaniu surowca z czynnikiem precypitującym w stosunku 1:3, przefiltrowaniu wytrąconej 

frakcji i dodaniu do przesączu kolejnej porcji rozpuszczalnika w proporcji 1:18 [24]. Zależność pomiędzy 

ilością i masą molową wytrąconych asfaltenów, a rodzajem i proporcją rozpuszczalnika badał wcześniej 

Rassamdana. Wykazał, że spośród badanych n-alkanów o 5, 6, 7, 8 i 10 atomów węgla w łańcuchu i dla 

proporcji od 1:1 do 1:10 g ropy/ml węglowodoru największą wydajność i najmniejszą liczbową i wagową 

masę cząsteczkową uzyskuje się dla 0,1 g/mL pentanu [25]. Dodatkowo udowodnił, że 72% asfaltenów 

rozpuszcza się ponownie w ropie po odparowaniu rozpuszczalnika wykorzystanego podczas precypitacji tak, 

aby zyskać zbliżony do początkowego skład surowca, a 62% gdy zamiast odparowania rozpuszczalnika 

dodana jest świeża porcja ropy [26]. 

Wydajność precypitacji zwiększyć można przez dodatkowe wydzielenie frakcji asfaltenowej 

z powstałego przesączu. Przesącz po asfaltenach wydzielonych z pozostałości próżniowej n -heptanem lub 

octanem etylu z zastosowaniem procedury całonocnej i proporcji 1:50 poddano ponownej precypitacji 

z wykorzystaniem n-pentanu. Badania wykazały znaczny wz rost ilości odzyskanej frakcji. W przypadku 

n-heptanu zaobserwowano wzrost, a dla octanu etylu spadek masy molowej [27]. 

Wykorzystanie do precypitacji mniejszej ilości czynnika precypitującego bądź użycie czynnika lotnego, 

takiego jak etan, czy propan może spowodować współstrącenie frakcji żywicznej. Większy odsetek 

wyizolowanej frakcji asfaltenowej wiąże się ze zmniejszeniem ilości atomów węgla w łańcuchu precypitanta 

i jego mniejszą masą molową [28, 29]. Wydajność precypitacji rośnie wraz ze wzrostem proporcji surowiecrozpuszczalnik 

do ok. 1:20 (% wagowego), aż osiągnie pleteu przy stosunku ok. 1:40, dalsze zwiększanie 

ilości rozpuszczalnika nie ma więc ekonomicznego uzasadnienia [30]. Szacuje się, że łańcuch alkilowy 

asfaltenów wyizolowanych za pomoc ą n-C7, n-C5 i ciekłym propanem będzie zawierał odpowiednio 

ok. 7, 8 i 9 atomów węgla. Najdłuższy łańcuch w przypadku asfaltenów izolowanych propanem, a tym 

samym większy udział grup alifatycznych w stosunku do aromatycznych, skutkuje najmniejszą polarnością 

wyizolowanej frakcji. Dobór czynnika precypitującego ma również wpływ na wygląd i masę molową. Im 

krótszy łańcuch czynnika alkilowego, tym mniejsza masa molowa i bardziej „luźna” budowa asfaltenów [31]. 

Już w 1985 roku wykazano, że na wartość średnią masy molowej asfaltenów wpływ może mieć również 

proporcja surowiec rozpuszczalnik. Dla zbadanych próbek asfaltenów z ropy naftowej masa wzrastała wraz 

ze zwiększeniem ilości n-heptanu w mieszaninie precypitującej od 8400 Da dla proporcji 1:20 do 9000 Da 

dla 1:60 [32]. 

Na właściwości fizyko-chemiczne asfaltenów wpływ ma również sposób przemywania powstałego 

osadu. Przeprowadzone badania wykazały, że masa molowa asfaltenów jest najniższa dla asfaltenów 

nieprzemywanych i wzrasta odpowiednio dla klasycznego przemywania, przemywania wspomaganego 

ultradźwiękami i ekstrakcji z zastosowaniem aparatu Soxhleta. W kolejności odwrotnej wzrasta natomiast 

stopień czystości osadu, określony na podstawie badań średniej masy molowej, gęstości i rozpuszczalności 

[33, 34]. Oczyszczanie asfaltenów poprzez ekstrakcję (w aparacie Soxhleta) czynnikiem precypitującym daje 

najlepsze wyniki pod względem czystości odzyskanej frakcji. Po 72 godzinach oczyszczania możliwe jest 

zwiększenie ich zawartości z ok. 20 do 40%. Dodatkowo wraz ze wzrostem czasu przemywania wzrasta 

masa molowa [35]. Popularną metodą oczyszczania z współstrąconych maltenów jest reprecypitacja. 

Wydzieloną frakcję rozpuszcza się w rozpuszczalniku wtórnym, najczęściej chlorku metylenu lub toluenie, do 

powstałej mieszaniny dodaje się nadmiar czynnika precypitującego, który powoduje ponowne wyt rącenie się 

asfaltenów z roztworu [36-39]. Osad poddać można filtracji otrzymując w ten sposób oczyszczoną frakcję. 

W 2012 roku przeprowadzono badania porównujące standardową precypitację asfaltenów z izolacją z 

wykorzystaniem rozpuszczalnika aromatycznego jakim był benzotrifluorek (ang. Benzotrifluoride, BTF). Do 

asfaltu dodano odczynnika (n-heptanu lub BTF) w proporcji 1:40 względem masy surowca, wymieszano 

wspomagając ultradźwiękami i pozostawiono w ciemności, w temperaturze pokojowej na 16 godzin. 

Wytrącone asfalteny odfiltrowano na filtrze o średnicy porów 1,2µm i przemywano czynnikiem 

precypitującym do odbarwienia się przesączu. Następnie osad rozpuszczono w niewielkiej ilości 

DCM/metanol (93:7 v/v) i odparowano rozpuszczalnik. Badania wyk azały, że wydajność precypitacji z 

zastosowaniem BTF jest mniejsza, niż dla n-heptanu. Dodatkowo dla n-heptanu przeprowadzono badania 

nad wpływem temperatury na wygląd uzyskanej frakcji. Dla temperatur 22, 30 i 45°C asfalteny były czarne, 

kruche, twarde i o ostrych krawędziach, w temperaturze 60°C kolor zmienia się na brązowy, a 90°C cząstki 

są mniejsze i bardziej błyszczące [40]. 

Poza tradycyjnymi metodami precypitacji można wyróżnić dwie rzadziej stosowane metodyki 

wydzielania frakcji asfaltenowej. Pierwsza, polega na zastosowaniu siły odśrodkowej i następczej filtracji, 

druga zaś, na wykorzystaniu rozpuszczalnika pierwotnego dla zapewnienia lepszego kontaktu pomiędzy 

surowcem, a czynnikiem precypitującym. W fiolce wirówkowej umieszczono próbkę dodając 40 ml/g pentanu 

i wymieszano do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Następnie umieszczono ją w kąpieli wodnej w 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

9 

temperaturze 15,6°C i mieszano 10 min (2500 obr/min). Po tym czasie próbka została odstawiona na 12 

godz. w zaciemnione miejsce, a następnie ponownie termostatowana i mieszana. Przed dekantacją 

n-pentanu asfalteny odwirowywano. Do pozostałego osadu dodano 25 ml świeżego czynnika 

precypitującego na każdy ml pozostałości, mieszano 10min w temperaturze 15,6°C i odwirowano. 

Przemywanie powtarzano 4-krotnie, a otrzymane asfalteny rozpuszczono w benzenie z niewielkim 

dodatkiem metanolu (zapobiega sorpcji asfaltenów na sączku) i przefiltrowano do uprzednio wytarowanej 

kolby. Rozpuszczalnik wtórny odparowano w strumieniu gazu obojętnego, a osad wysuszono w sus zarce 

próżniowej w temperaturze 105°C [41]. 

W 1972 roku zbadano odsetek wytrąconej frakcji asfaltenowej w zależności od zastosowanego 

czynnika precypitującego, przy zachowaniu stałej proporcji w stosunku do surowca wynoszącej 1:40 

i benzenu jako rozpuszczalnika pierwotnego. Wyniki badań, zestawione w tabeli nr 2, wykazały, że 

największą wydajność precypitacji można uzyskać stosując jako czynnik precypitujący związki z grupy izo - 

alkanów, nieco mniejszą, gdy użyjemy n-alkanów, a najmniejszą w przypadku węglowodorów cyklicznych 

bez i z podstawnikami. Dodatkowo, w przypadku rozpuszczalników cyklicznych, zwiększenie ilości atomów 

węgla występujących w ich strukturze ma najmniejszy wpływ na wydajność precypitacji [42]. 

Tabela 2 Odsetek nierozpuszczonej frakcji w zależności od użytego czynnika precypitującego. 

Table 2 The percentage of insoluble fraction, depending on the used precipitating agent. 

% 

% 

% 

% 

Czynnik 

Czynnik 

Czynnik 

Czynnik 

nierozpuszczo 

nierozpuszczo 

nierozpuszczo 

nierozpuszczo 

precypitujący 




nej frakcji 

nej frakcji 

nej frakcji 

nej frakcji 

n-pentan 16,9 izopentan 17,6 n-penten 16,2 cyklopentan 1,0 

n-heksan 13,5 izoheksan 15,3 n-heksen 13,0 

metylocyklopentan 

1,4 

n-heptan 11,4 izoheptan 12,8 n-hepten 10,9 

etylocyklopentan 

1,9 

n-oktan 9,8 izooktan 11,5 n-okten 9,0 cykloheksan 0,7 

n-nonan 9,4 izononan 10,0 n-nonen 8,6 

metylocykloheksan 

1,0 

n-dekan 9,0 izodekan 9,8 n-deken 8,5 

etylocykloheksan 

1,4 

Innymi alternatywnymi, dość często stosowanymi w różnych proporcjach rozpuszczalnikami 

pierwotnymi są toluen i dichlorometan [43-45]. Badania nad zależnością ilości wytrąconych asfaltenów w 

układach zawierających 10, 17, 25 i 35% wagowych oleju ciężkiego w toluenie wykazały że ilość, 

wydzielonych z zastosowaniem n-heptanu, asfaltenów zależy od stężenia materiału wejściowego (stężenia 

oleju w toluenie) [46]. 

3. Frakcjonowanie asfaltenów 

3. Asphaltenes fractionation 

Frakcjonowanie wydzielonych wcześniej asfaltenów przeprowadzić można na kilka sposobów, 

najczęściej pod względem rozpuszczalności oraz polarności. Jedna z metod obejmuje wykorzystanie w tym 

celu aparatu Soxhleta i ekstrakcję mieszaniną czynnika precypitującego i wybranego rozpuszczalnika 

polarnego w różnych proporcjach. Procedura ekstrakcyjna przebiega według schematu przedstawionego na 

rysunku 1. Najczęściej surowiec stanowią pozostałości z poprzedniej ekstrakcji. Badania wykazały że 

ostatnia frakcja, rozpuszczalna w mieszaninie 1:2 (v/v) toluen:n-heptan ma najbardziej złożoną strukturę przy 

jednoczesnej najmniejszej ilości pierścieni aromatycznych i aromatycznych atomów węgla [47]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Rys 1 Schemat frakcjonowania asfaltenów [47]. 

Fig 1 Asphaltenes fractionation scheme [47]. 

Camera Separatoria

10 

Tą samą technikę wykorzystano do frakcjonowania asfaltenów z zastosowaniem czystego 

tetrahydrofuranu i mieszaniny rozpuszczalników THF:aceton w proporcjach 1:60, 2:50, 3:40, 5:20 i 6:10. 

Każdą z próbek poddawano 24 godzinnej ekstrakcji. Stwierdzono, że wraz ze wzrostem stężenia THF masa 

molowa asfaltenów rośnie [35]. 

Asfalteny frakcjonować można również na podstawie zmiennej rozpuszczalności wchodzących w ich 

skład komponentów. W tym celu wykorzystuje się mieszaninę, w której znajduje się substancja polarnarozpuszczalnik 

(np. chlorek metylenu, toluen, tetrahydrofuran) i rozpuszczalnik dyspergujący (np. n-heptan, 

n-pentan). Wyizolowane wcześniej asfalteny rozpuszcza się w polarnym rozpuszczalniku w określonym 

stosunku, a następnie dodaje rozpuszczalnika dyspergującego. Całość miesza się i odwirowuje wydzielając 

pierwszą frakcję asfaltenową. Kolejne, otrzymuje się poprzez dodanie do poprzedniego supernatantu nowej 

porcji substancji polarnej w określonej proporcji [48]. Stwierdzono, że asfalteny stanowiące mniej polarną 

frakcję łatwiej ulegają dyspersji w rozpuszczalniku [49]. 

Jako rozpuszczalnik dyspergujący bardzo często wykorzystuje się aceton i n-heptan, gdyż obie te 

substancje można stosunkowo łatwo usunąć z wydzielonej frakcji. Ponadto czynniki te charakteryzują się 

właściwościami niepolarnymi i słabo polarnymi [50]. Stosowaną mieszaninę n-heptanu z toluenem nazywa 

się heptolem i wykorzystuje się do rozdzielenia asfaltenów na frakcje: lekką (rozpuszczalną w hepto lu) 

i ciężką [51]. Na podstawie badań rozpuszczalności asfaltenów w heptolu stwierdzono, że mechanizm 

precypitacji jest kontrolowany przez oddziaływania dyspersyjne między asfaltenami i rozpuszczalnikiem. 

Tendencja mniej rozpuszczalnych frakcji do strącania się w toluenie sugeruje, że frakcja rozpuszczalna 

zakłóca oddziaływania polarne i wiązań wodorowych, które są siłą napędową precypitacji [52]. 

Zastosowanymi w trój stopniowej metodzie, frakcjonowania asfaltenów z ropy naftowej, 

zaproponowanej przez M. Tojima rozpuszczalnikami były mieszaniny toluen/n -heptan w proporcjach: 35/65 

(F1), 25/75 (F2) i 18/82 (F3). Średnia molowa masa cząsteczkowa najmniej rozpuszczalnej frakcji F1 

wynosiła ok. 17800 Da i malała odpowiednio do 11100 i 10300 dla F2 i F3. Odwrotną tendencję wykryto dla 

wartości proporcji liczby atomów wodoru do atomów węgla [53]. 

Ciężką ropę naftową i pozostałość po destylacji atmosferycznej rozpuszczono w THF w stosunku 1:10 

m/m, dodano odpowiednią ilość n-heksanu, mieszano 40 min i pozostawiono do stabilizacji na godzinę, 

następnie odwirowywano 40 min i wysuszono w próżni. Czynność tą powtarzano wykorzystując różne ilości 

czynnika dyspergującego tak aby otrzymać 4 frakcje różniące się polarnością. Dla pozostałości próżniowej 

zastosowano proporcję n-heksan:THF wynoszącą 1,3:1, 1,6:1 i 2,3:1, natomiast dla ciężkiej ropy naftowej 

1,8:1, 2,6:1 i 3,6:1. Otrzymane frakcje charakteryzowały się większą polarnością i wartością momentu 

dipolowego niż „wyjściowe” asfalteny, z których wyizolowano frakcje [54]. 

Popularną metodą frakcjonowania asfaltenów jest frakcjonowanie w kolumnie. Wyizolowaną uprzednio 

frakcję (ok. 80 mg) umieszcza się w celce ekstrakcyjnej, do której podaje się czynnik precypitujący (ditlenek 

węgla) w ilości 60 g/h, przy zachowaniu stałej wartości ciśnienia i temperatury. Następnie mieszanina 

przechodzi do dwóch ustawionych szeregowo pułapek, gdzie w wyniku barbotażu dochodzi do wymiany 

masy pomiędzy wprowadzanym surowcem, a pełniącym rolę czynnika ekstrahującego etanolem. Po 

zakończeniu operacji alkohol odparowuje się, a wysuszony ekstrakt waży. Badania dowiodły, że każdy 

kolejny ekstrakt zawiera większą ilość związków aromatycznych, oraz mniejszą ilość n-alkanów w stosunku 

do poprzedniego. Metodą tą możliwe jest wyekstrahowanie do 12% asfaltenów. Dodatkowo stwierdzono, że 

temperatura nie ma większego wpływu na proces ekstrakcji w przeciwieństwie do ciśnienia i obecności 

rozpuszczalnika. Zwiększenie ciśnienia (od 130 do 300 bar) prowadzi do ekstrakcji cięższych n-alkanów i 

związków aromatycznych oraz bardziej rozgałęzionych i cyklicznych alkanów. Porównanie procesu, dla tych 

samych warunków ciśnienia i temperatury, bez i z dodatkowym rozpuszczalnikiem (toluen, dichlorometan) 

pokazuje, że cięższe i bardziej rozgałęzione n-alkany i związki cykliczne ekstrahuje się, gdy stosuje się 

modyfikatory [55]. Zarówno w przypadku ropy naftowej jak i produktów ropopochodnych możliwe jest 

frakcjonowanie poprzez elucję rozpuszczalnikową. Wyizolowane wcześniej asfalteny rozpuszcza się i 

immobilizuje na wypełnieniu kolumny, przez którą przepuszcza się szereg rozpuszczalników. Zastosowane 

eluenty oraz charakterystykę eluowanych związków porównano w tabeli poniżej [56, 57]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

11 

Tabela 3 Charakterystyka wyizolowanych z zastosowaniem wybranych eluentów frakcji asfaltenowych. 

Table 3 Characteristics of selected asphaltenes fractions and their eluent. 

Eluent Charakterystyka frakcji Eluent Charakterystyka frakcji 

n-heksan zw iązki nasycone n-heksan zw iązki nasycone 

15% toluen, 

64% n-heksan, 

zw iązki aromatyczne 

85% n-heksan 

36% benzen 

zw iązki aromatyczne 

chloroform 

polarne zw iązki aromatyczne, nie zasadow e 

zw iązki heterocykliczne zaw ierające atomy chloroform zw iązki zaw ierające heteroatomy 

N, O, S 

10% eter dietylow y, 90% 

„monofenole” 

95% chloroform, 

zasadow e, azotow e fenole 

chloroform 

3% etanol, 

97% eter dietylow y 

metanol 

3% etanol, 

97% chloroform 

3% etanol, 

97% tetrahydrofuran 

3% etanol, 

97% pirydyna 

pirydyna 

zasadow e zw iązki heterocykliczne 

zaw ierające azot 

cząsteczki wysoce-funkcjonalne zawierające 

10% heteroatomów 

„polifenole” 

grupy funkcyjne o w zrastającej zawartości N i 

O 

grupy funkcyjne o w zrastającej azotozasadow 

ości 

cząsteczki w ysoce funkcjonalne 

5% eter dietylow y 

93% chloroform, 7% 

etanol 

pirydyna 

zasadow e, azotow e amidy 

zw iązki w ysoce polarne 

Oprócz standardowej fazy stacjonarnej, jaką jest żel krzemionkowy możliwe jest wykorzystanie 

inertnego wypełnienia np. Politereftalanuetylu (PTFE). Metodę tą zastosowano w 2015 roku do porównania 

profilu rozpuszczalności asfaltenów pozyskanych z ropy naftowej i pochodzących z niej depozytów. Próbkę 

po rozpuszczeniu w chlorku metylenu naniesiono na PTFE, przeniesiono do kolumienki i odparowano 

rozpuszczalnik w strumieniu azotu. Całość w celu wyizolowania maltenów ekstrahowano n -heptanem 

w temperaturze pokojowej przez 60 min. Poszczególne frakcje asfaltenów wymyto mieszaninami 

DCM:n-heptan w proporcji: (F1) 15:85, (F2) 30:70, frakcję (F3) otrzymano z zastosowaniem czystego 

dichlorometanu, a (F4) z zastosowaniem mieszaniny 90:10 (DCM:metanol). Pierwsze cztery frakcje 

eluowano w warunkach temperatury pokojowej przez 60 min, ostatnią piąta frakcję (F5) wyeluowano trzema 

porcjami rozpuszczalnika (DCM: metanol 90:10) w 120°C przez 15min [58]. 

Poza frakcjonowaniem wcześniej wytrąconych asfaltenów możliwe jest wydzielenie podfrakcji 

asfaltenowych bezpośrednio z surowca np. smoły węglowej poprzez rozpuszczenie jej w chloroformie 

i naniesienie na żel krzemionkowy. Całość „pakuje” się do kolumny z zachowaniem kolejności: 5 mm piasku, 

60 mm żelu krzemionkowego i ponownie 5 mm piasku. Pierwszym wprowadzanym eluentem jest n-heksan 

(F1), następnie toluen (F2) i pirydyna (F3). Frakcję 4 otrzymano poprzez ekstrakcję dimetyloformamidem 

pozostałości zaadsorbowanych na żelu krzemionkowym [59].Znana jest również metoda oparta na 

procedurze składającej się z siedmiu kroków. Procedura zakłada następującą kolejność wykorzystywania 

eluentów i otrzymywanych w wyniku ekstrakcji frakcji: n-heksan (F1), 64/36 n-heksan/benzen (F2), 

chloroform (F3), 95/5 chloroform/eter dietylowy (F4), 93/7 chloroform/etanol (F5), pirydyna (F6). Ostatnią 

frakcją nazwano pozostałość zaadsorbowaną na wypełnieniu kolumny, ekstrahowaną pirydyną 

z wykorzystaniem aparatu Soxhleta [44]. 

Opracowana w 2008 roku technika zakłada precypitację asfaltenów z zastosowaniem kolumny 

chromatograficznej. Próbkę, pozostałości po destylacji atmosferycznej rozpuszczoną w mieszaninie 

1:1 dichlorometan:toluen, dozuje się do stalowej kolumny wypełnionej politetrafluoroetylenem (ang. 

Politetrafluoroetylene, PTFE). Rozdzielanie składników próbki następuje dzięki elucji skokowej 

z zastosowaniem 4 lub 3 mieszanin. W pierwszym przypadku (procedura 4 stopniowa) uzyskanymi frakcjami 

są malteny (elucja n-heptanem) oraz cztery frakcje asfaltenów eluowane kolejno: cykloheksanem, toluenem 

i chlorkiem metylenu (każdy z eluentów przepływał przez kolumnę 15minut). Do rozdzielenia 

z zastosowaniem trzech mieszanin wykorzystano elucję n-heptanem, następnie w minucie: 2-giej 

cykloheksan, 15-tej mieszaninę toluen:metanol (98:2), a w 40-tej ponownie n-heptan. Na skutek takiej 

sekwencji elucji otrzymano 3 frakcje: malteny, oraz asfalteny rozpuszczalne i nierozpuszczalne 

w cykloheksanie. Jako detektor do badań wykorzystano: detektor UV-vis i odparowalnościowy detektor 

laserowy rozpraszania światła (ang. Evaporative Light Scattering Detector, ELSD) [23, 60]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

12 

4. Oznaczanie zawartości asfaltenów 

4. Determination of asphaltenes contents 

Dzięki zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (ang. High Performance Liqid 

Chromatography, HPLC) w układzie faz normalnych (ang. Normal Phase, NP) możliwe jest określenie składu 

grupowego produktów naftowych z podziałem na: węglowodory nasycone i aromatyczne, żywice oraz 

asfalteny (ang. Saturates, Aromatics, Resins, Asphaltenes, SARA). Możliwe jest również dalsze podzielenie 

występujących w próbce związków aromatycznych i niearomatycznych z uwzględnieniem jedno -, dwu-, tróji 

wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych [61]. W przypadku materiałów zawierających asfalteny 

bezpośrednia analiza chromatograficzna pozwala na określenie składu w zakresie SAR (ang. Saturates, 

Aromatics, Resins) [62, 63]. Technika HPLC posiada bowiem istotne ograniczenie - nie może być 

zastosowana w przypadku produktów zawierających asfalteny. Składniki frakcji asfaltenowej ze względu na 

swoją wysoką polarność trwale adsorbują się na powierzchni sorpcyjnej fazy stacjonarnej w postaci żelu 

krzemionkowego, a także innych faz do NP, tj. żel krzemionkowy modyfikowany grupami amino propylowymi 

(NH 2 ), której późniejsza regeneracja jest bardzo trudna, a często wręcz niemoż liwa. Powszechnie 

stosowanym detektorem w tej metodyce jest różnicowy detektor refraktometryczny (ang. Refractive Index 

Detector, RID). Dodatkowo w układzie szeregowym można zastosować detektor spektrofotometryczny w 

zakresie ultrafioletu i światła widzialnego UV-VIS (ang. Ultraviolet, Visible, UV-VIS) z matrycą fotodiodową 

(ang. Diode Array Detector, DAD). Umożliwia on identyfikację poszczególnych indywiduów na podstawie 

widma UV-VIS, a także zwiększenie czułości detekcji w przypadku niskiej zawartości niektórych frakcji. 

W tym przypadku przed analizą próbki techniką HPLC wykonuje się klasyczne wydzielenie asfaltenów 

poprzez precypitację z n-heptanu i dokonuje ich oznaczenia metodą grawimetryczną. Alternatywą dla tej 

metody jest technika cienkowarstwowej chromatografii cieczowej sprzężonej z detektorem płomieniowo 

jonizacyjnego (ang. Thin Layer Chromatography- Flame Ionization Detector, TLC-FID). Rozdzielanie ma 

miejsce na cienkiej warstwie żelu krzemionkowego osadzonego na pręcikach kwarcowych umieszczonych 

po 6-10 stuk w specjalnej „ramce”. Po naniesieniu próbki mikrostrzykawką ma miejsce elucja skokowa 

z zastosowaniem kolejno kilku mieszanin eluentów. Standardowo stosowanymi eluentami są n-heksan, 

toluen i mieszanina DCM:metanol (95:5 v/v) [64-66]. Po rozwinięciu w danym eluencie, do określonej 

wysokości czoła eluentu, suszy się pręciki i umieszcza w kolejnej komorze z innym eluentem. Po 

zakończeniu całej sekwencji wysuszone pręciki umieszczane są w przystawce do detektora FID. Ruchoma 

głowica przesuwa się wzdłuż wybranego pręcika, a spalane w utleniającym płomieniu grupy związków 

chemicznych są wykrywane w układzie elektrod detektora jako karbojony. Sygnał detektora FID jest 

praktycznie proporcjonalny do zawartości poszczególnych grup węglowodorów. Udział każdej z frakcji jest 

wyznaczany na podstawie oczekiwanego zakresu elucji dla danej grupy metodą prostej normalizacji na 

podstawie pola powierzchni piku danej grupy w stosunku do sumy pól powierzchni. Zwiększenie dokładności 

oznaczeń jest możliwe poprzez zastosowanie współczynników korekcyjnych wyznaczonych na podstawie 

substancji wzorcowych dla poszczególnych grup (SARA). Technika TLC-FID jest najczęściej stosowana do 

określenia składu grupowego asfaltów i ciężkich destylatów naftowych [67]. W stosunku do innych metod 

(frakcjonowanie kolumnowe SARA wg normy ASTM D4124) TLC -FID zużywa zdecydowanie mniej 

rozpuszczalników organicznych i wymaga mniejszego nakładu czasu i pracy. Możliwe jest zarówno 

określenie składu grupowego wg SARA jak i zbadanie stopnia oczyszczenia już wyizolowanej frakcji 

asfaltenowej. Jednocześnie, analiza tych drugich powodować może wiele problemów przez wzgląd na 

obecność dużej ilości związków polarnych, które zatrzymywane są w miejscu nakładania próbki. Dodatkowo, 

frakcje polarne przez wzgląd na zmienną ilość heteroatomów, a tym samym zmienny współczynnik 

odpowiedzi detektora FID, komplikują analizę ilościową. 

W 2008 roku podjęto próbę opracowania metodyki przydatnej dla rozdzielania wysokopolarnych frakcji 

w oparciu o porównanie wielkości nakładanych kropli oraz charakterystykę wykorzystywanych pręcików (żel 

krzemionkowy, żel krzemionkowy domieszkowany miedzią (II)) i 3 stopniowy program elucji: heksan (90% 

długości pręcików), heksan:toluen (1:1 v/v, 60%) i DCM:metanol (93:7 v/v, 30%). Stwierdzono, że nanosząc 

1 µl roztworu (15 mg/ml DCM) w postaci dużej kropli (3,5 -4 mm) można uzyskać lepszą rozdzielczość 

pomiędzy asfaltenami i żywicami niż dla 1-1,5 mm promienia kropli [68]. Autorzy niniejszej pracy, korzystając 

z doświadczeń prof. M. Kamińskiego, z którego zespołu się wywodzą mają na to zjawisko inny pogląd. 

Problem rozdzielania mieszanin zawierających asfalteny techniką TLC-FID polega na zjawisku częściowego 

ograniczenia dostępu niepolarnego rozpuszczalnika jakim jest n-heptan do kropli naniesionej mieszaniny z 

powodu występowania frakcji asfaltenowej, która nie podlega rozpuszczaniu ani elucji tym 

rozpuszczalnikiem. Obserwowane zjawisko opisane w pracy [68] jest więc związane ze zwiększeniem 

dostępu na skutek zwiększenia powierzchni kropli. Jest to podejście w zasadniczym stopniu niezgodne ze 

„sztuką chromatograficzną”. Rozwiązaniem problemu opracowanym na Politechnice Gdańskiej w zespole 

prof. Kamińskiego jest zastosowanie sekwencji elucji, w której eluent rozpuszczający asfalteny (mieszanina 

DCM:metanol 95:5 v/v) jest stosowany jako pierwszy. Elucja ma miejsce na wysokość 2,5 cm. Następnie 

stosowany jest n-heksan i mieszanina heksan:toluen (90:10 v/v) pozwalająca na rozdzielenie SAR. Frakcja 

asfaltenowa pozostaje do końca sekwencji na wysokości 2,5 cm. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

13 

5. Wnioski końcowe 

5. Conclusions 

Wydzielenie asfaltenów z surowca nastąpić może po kilku do nawet kilkunastu godzinach kontaktu 

z czynnikiem precypitującym. Najczęściej gdy precypitacja odbywa się „na zimno”, to znaczy w temperaturze 

pokojowej, czas kontaktu surowca z rozpuszczalnikiem wynosi od 12 do 72 godzin, natomiast gdy odbywa 

się w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika od 0,5 do 3 godzin. Poza temperaturą, w której dochodzi do 

ustalenia się równowagi pomiędzy składnikami ważna, ze względu na rozpuszczalność frakcji asfaltenowej, 

jest temperatura samej filtracji. Ilość wydzielonych asfaltenów maleje monotonicznie wraz ze wzrostem 

temperatury, a efekt ten ma głównie znaczenie w temperaturach poniżej 160°C. Ze zmianą temperatury 

zmienia się także wygląd asfaltenów. 

Kolejnym parametrem determinującym właściwości fizykochemiczne wydzielonej frakcji jest proporcja 

surowca i dodawanego czynnika precypitującego. Wydajność precypitacji rośnie wraz ze wzrostem proporcji 

surowiec-rozpuszczalnik do ok. 1:20 (% wagowego), aż osiągnie pleteu przy stosunku ok. 1:40. 

Wykorzystanie do precypitacji mniejszej ilości czynnika precypitującego bądź użycie czynnika lotnego może 

spowodować współstrącenie frakcji żywicznej, dlatego bardzo ważna jest procedura 

przemywania/oczyszczania powstałego osadu. W tym celu wykorzystuje się między innymi reprecypitację, 

ekstrakcję ciecz-ciało stałe i wielokrotne przemywanie osadu świeżymi porcjami precypitanta. Dodatkowo dla 

zapewnienia lepszej wymiany masy pomiędzy składnikami można wspomóc proces precypitacji działaniem 

promieniowania ultradźwiękowego lub zastosować rozpuszczalnik pierwotny próbki. 

Stosując odpowiednią procedurę możliwe jest więc otrzymanie asfaltenów o z góry zaplanowanych 

właściwościach fizykochemicznych. Ponadto w razie potrzeby lub dla wyizolowania węższej frakcji możliwe 

jest zastosowanie frakcjonowania, a kontrola czystości frakcji odbywać się może z zastosowaniem jednej 

z opisanych metodyk analizy ilościowej 

Podziękowania 

Acknowledgements 

Praca finansowana w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Narodowe Centrum 

Badań i Rozwoju (Program LIDER, edycja V, nr projektu: LIDER/036/573/L -5/13/NCBR/2014) pt. Badania 

nad otrzymywaniem i właściwościami sorbentów wytwarzanych z asfaltów. 

6. Literatura 

References 

[1] J. G. Speight, "Chemical composition," in The chemistry and technology of petroleum, 3rd edition, 

Nowy Jork, Marcel Dekker, 1999, pp. 187-243. 

[2] K. H. Altgelt and M. M. Boduszynski, "Structural group characterization of heavy petroleum fractions," 

in Composition and analysis of heavy petroleum fractions, Nowy Jork, Marcel Dekker, 1994, pp. 159- 

199. 

[3] O. C. Mullins, "The modified Yen model," Energy & Fuels, vol. 24, pp. 2179-2207, 2010. 

[4] J. G. Speight, "Petroleum asphaltenes part 1: Asphaltenes, resins and the structure of petroleum," Oil 

Gas Science Technology, vol. 59, pp. 467-477, 2004. 

[5] J. G. Speight, "The chemical and physical structure of petroleum: effects on recovery operations," 

Journal of Petroleum Science and Engineering, vol. 22, pp. 3-15, 1999. 

[6] M. L. Greenfield and D. D. Li, "Chemical compositions of improved model asphalt systems for 

molecular simulations," Fuel, vol. 115, pp. 347-356, 2014. 

[7] F. S. Rostler and H. W. Sternberg, "Compounding rubber with petroleum products, correlation of 

chemical characteristics with compounding properties and analysis of petroleum products used as 

compounding ingredients in rubber," Industrial and Engineering Chemistry, vol. 41, pp. 598-608, 1949. 

[8] F. Kumata and H. Seki, "Deactivation of hydrodesulfurization catalysts for resids: Effect of 

hydrodemetallization operation conditions," Studies in Surface Science and Catalysis, vol. 126, pp. 

357-364, 1999. 

[9] H. D. Dettman, J. P. Jahnke, R. K. Prud'home and J. F. Tinsley, "Waxy gels with asphaltenes 1: 

characterization of precipitation, gelation, yield stress, and morphology," Energy & Fuels, vol. 23, pp. 

2056-2064, 2009. 

[10] J. F. Rovani, M. M. Sanderson and J. F. Schabron, "Pavement performance and prediztion 

symposium," in Optimized asphaltene determinator and waxphaltene determinator separations for 

rapid characterization of asphalt binders, Laramie, 2010. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

14 

[11] ASTM D 2007 Standard test method for characteristic groups in rubber extender and processing oils 

and other petroleum-derived oils by the clay-gel absorption chromatographic method, 2003. 

[12] ASTM D 4124 Standerd test methods for separation of asphalt into four fractions, 2001. 

[13] ASTM D 6560 Standard test method for determination of asphaltenes (heptane insolubles) in crude 

petroleum and petroleum products, 2000. 

[14] ASTM D 893 Standard test method for insolubles in used lubricating oils, 2002. 

[15] J. Marcusson, "Zur unterscheidung von natur und kunst asphalt," Zeitschrift für Angewandte Chemie, 

vol. 29, pp. 21-25, 1916. 

[16] J. Ancheyta, G. Centeno, J. A. Garcia, G. Morroquin, E. Tenorio, A. Torres and F. Trejo, "Extraction 

and characterization of asphaltenes from different crude oils and solvents," Energy & Fuels, vol. 16, 

pp. 1121-1127, 2002. 

[17] O. G. Strieter, "Method for determining the components of asphalts and crude oils," Journal of 

Research of the National Bureau of Standards, vol. 26, pp. 415-418, 1941. 

[18] G. O'Donnell, "Separating asphalt into its chemical constituents," Analytical Chemistry, vol. 23, pp. 

894-898, 1951. 

[19] L. R. Kleinschmidt, "Chromatographic method for the fractionation of asphalt into distinctive groups of 

components," Journal of Research of the National Bureau of Standards , vol. 54, pp. 163-166, 1955. 

[20] E. Buenrestro-Gonzalez, H. Groenzin, C. Lira-Galeana and O. C. Mullins, "The overriding chemical 

principles that define asphaltenes," Energy & Fuels, vol. 15, pp. 972-978, 2001. 

[21] E. Hong and P. Watkinson, "A study of asphaltene solubility and precipitation," Fuel, vol. 83, pp. 1881- 

1887, 2004. 

[22] S. I. Andersen, A. Keul and E. Stenby, "Variation in composition of subfractions of petroleum 

asphaltenes," Petroleum Science and Technology , vol. 15, pp. 611-645, 1997. 

[23] E. Buenrostro-Gonzalez, A. Gil-Villegas, C. Lira-Galena and J. Wu, "Asphaltene precipitation in crude 

oils: Theory and experiments," American Institute of Chemical Engineers Jou rnal, vol. 50, pp. 2552- 

2570, 2004. 

[24] M. Fossen, H. Kallevik, K. D. Knudsen and J. Sjoblom, "Asphaltenes precipitated by two -step 

precipitation procedure. 1. Interfacial tension and solvent properties," Energy & Fuels, vol. 21, pp. 

1030-1037, 2007. 

[25] B. Dabir, M. Nematy, A. R. Mehrabi, H. Rassamdana and M. Sahimi, "Asphalt flocculation and 

deposition III. The molecular weight distribution," Fuel, vol. 75, pp. 1633-1645, 1996. 

[26] B. Dabir, M. Farhani, N. Nematy, H. Rassamdana and M. Sahimi, "As phalt flocculation and deposition 

I. The onset of precipitation," American Institute of Chemical Engineers Journal, vol. 42, pp. 10-22, 

1996. 

[27] S. D. Bhagot, S. Z. Erhan, C. D. Sharma and B. K. Sharma, "Maltenes and asphaltenes of petroleum 

vacum residues: physico-chemical characterization," Petroleum Science and Technology, vol. 25, pp. 

93-104, 2007. 

[28] G. A. Mansoori, M. Shariaty-Niassa and D. Vazquez, "Polidispersity of heavy organics in crude oils 

and their role in oil well fouling," Journal of Petroleum Science ang Engineering, vol. 58, pp. 375-390, 

2007. 

[29] G. A. Mansoori and D. Vazquez, "Identification and measurement of petroleum precipitates," Journal 

of Petroleum Science and Engineering, vol. 26, pp. 49-55, 2000. 

[30] G. Gonzalez, E. F. Lucas and M. A. Sousa, "Asphaltenes precipitation from crude oil and hydrocarbon 

media," Energy & Fuels, vol. 20, pp. 2544-2551, 2006. 

[31] Y. Gu, P. Luo and X. Wang, "Characterization of asphaltenes precipitated with three light alkanes 

under different experimental conditions," Fluid Phase Equilibria, vol. 291, pp. 103-110, 2010. 

[32] S. Acevedo, I. Layrisse, B. Mendez, H. Rivas and A. Rojas, "Asphaltenes and resins from the Orinoco 

basin," Fuel, vol. 64, pp. 1741-1747, 1985. 

[33] K. Akbarzadeh, H. Alboudwarej, J. Beck, W. Y. Svrcek and H. W. Yarranton, "Regular solution model 

for asphaltene precipitation from bitumens and solvents," American Institute of Chemical Engineers 

Journal, vol. 49, pp. 2948-2956, 2003. 

[34] K. Akbarzadeh, H. Alboudwarej, J. Beck, W. Y. Svrcek and H. W. Yarranton, "Sensitivity of asphaltene 

properties to separation techniques," Energ Fuel, vol. 16, pp. 462-469, 2002. 

[35] S. Acevedo, A. Amorin, G. Escobar, J. Pinnate and M. A. Ranaudo, "Observations about the structure 

and dispersion of petroleum asphaltenes aggregates obtained from dialysis fractionation and 

characterization," Energy & Fuels, vol. 11, pp. 774-778, 1997. 

[36] R. B. Fisher, J. E. Hunt, J. T. Miller, P. Thiyagarajan and R. E. Winans, "Subfractionation and 

characterization of Mayan asphaltene," Energy & Fuels, vol. 12, pp. 1290-1298, 1998. 

[37] R. Alvarez, J. N. Bolanos, J. Douda and M. E. Llanos, "Structure of maya asphaltene-resin complexes 

through the analysis of soxhlet extracted fractions," Energy & Fuels, vol. 18, pp. 736-742, 2004. 

[38] L. A. Alcazar-Vara, E. Buenrostro-Gonzalez and J. A. Garcia-Martinez, "Effect of asphaltenes on 

equilibrium and rheological properties of waxy model systems," Fuel, vol. 93, pp. 200-212, 2012. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

15 

[39] M. Barcenas, E. Buenrostro-Gonzalez, Y. Duda, P. Orea and L. S. Zamudio-Rivera, "Study of medium 

effect on asphaltene agglomeration inhibitor efficiency," Energy & Fuels, vol. 22, pp. 1917-1922, 2008. 

[40] P. Fotland, E. Gilje, H. Hoiland and O. Bjoroy, "Asphaltene precipitation from athabasca bitumen using 

an aromatic diluent: A composition to standard n-alkane liquid precipitants at different temperatures," 

Energy & Fuels, vol. 26, pp. 2648-2654, 2012. 

[41] R. L. Hubbard and K. E. Stanfield, "Determination of asphaltebes, oils, and resins in asphalt," 

Analytical Chemistry, vol. 20, pp. 460-465, 1948. 

[42] D. L. Mitchell and J. G. Speight, "The solubility of asphaltenes in hydrocarbon solvents," Fuel, vol. 52, 

pp. 149-152, 1973. 

[43] R. Altoe, L. C. M. Cirilo, G. Gonzalez, H. E. Lopes, E. F. Lucas, M. C. K. de Oliveira and C. Teixeira, 

"Solution behavior of asphaltic residues and deasphalted oil prepared by extraction of heavy oil," 

Colloid Surface A, vol. 445, pp. 59-66, 2014. 

[44] J. Bermejo, M. Granda, R. Menendez and J. M. D. Tascon, "Comparative analysis of pitches by 

extrography and thermal analysis techniques," Carbon, vol. 32, pp. 1001-1010, 1994. 

[45] J. Czarnecki, T. Dabros, J. Sjoblom, P. Tchoukov, Z. Xu and F. Yang, "Role of asphaltenes in 

stabilizing thin liquid emulsion films," Langmuir, vol. 30, pp. 3024-3033, 2014. 

[46] C. W. Anglea, H. Hamza, Y. Long and L. Lue, "Precipitation of asphaltenes f rom solvent-diluted heavy 

oil and thermodynamic properties of solvent-diluted heavy oil solutions," Fuel, vol. 85, pp. 492-506, 

2006. 

[47] J. Ancheyta, G. Centeno and F. Trejo, "Precipitation, fractionation and characterization of asphaltenes 

from heavy and light crude oils," Fuel, vol. 83, pp. 2169-2175, 2004. 

[48] S. Fogler, V. Nalwaya, P. Piumsomboon and V. Tantayakom, "Studies on asphaltenes through 

analysis of polar fractions," Industrial & Engineering Chemistry Research, vol. 38, pp. 964-972, 1999. 

[49] G. Que, H. Shan, C. Yang and L. Zhang, "Dipole moment variation af a petroleum residue during 

catalytic and thermal upgrading," Energy & Fuels, vol. 23, pp. 2086-2089, 2009. 

[50] S. I. Andersen, E. Buenrostro-Gonzalez, J. A. Garcia-Martinez and C. Lira-Galeana, 

"Solubility/molecular structure relationship of asphaltenes in polar and nonpolar media," Energy & 

Fuels, vol. 16, pp. 732-741, 2002. 

[51] D. M. Barrera, D. P. Ortiz and H. W. Yarranton, "Molecular weight and density distributions of 

asphaltenes from crude oils," Energy & Fuels, vol. 27, pp. 2474-2487, 2013. 

[52] K. L. Gawrys, P. K. Kilpatrick and P. Matthew Spiecker, "Aggregation and solubility behavior of 

asphaltenes and their subfractions," Journal of Colloid and Interface Science, vol. 267, pp. 178-193, 

2003. 

[53] A. Furuta, M. Imamura, S. Suhara and M. Tojima, "Effect of heavy asphaltene on stability of residual 

oil," Catalysis Today, vol. 43, pp. 347-351, 1998. 

[54] L. Li, Y. Li, J. Wang, C. Yang, G. Yang and L. Zhang, "Study on the polarity, solubility, and stacking 

characteristics of asphaltenes," Fuel, vol. 128, pp. 366-372, 2014. 

[55] A. Boukir, P. Doumenq, M. Guiliano and G. Mille, "Supercritical fluid extraction of bal 150 crude oil 

asphaltenes," Energy & Fuels, vol. 14, pp. 89-94, 2000. 

[56] J. Bermejo, M. Granda, R. Menendez and S. R. Moinelo, "Application of extrography for 

characterization of coal tar and petroleum pitches," Fuel, vol. 69, pp. 702-705, 1990. 

[57] R. H. Filby and F. S. Jacobs, "Liquid chromatographic fractionation of oil-sand and crude oil 

asphaltenes," Fuel, vol. 62, pp. 1186-1192, 1983. 

[58] T. Miao, E. Rogel, M. Roye and J. Vien, "Comparing asphaltenes: Deposit versus crude oil," Fuel, vol. 

147, pp. 155-160, 2015. 

[59] G. P. Blumer, H. W. Kleffner, W. Lucke and M. Zander, "Fractionation of coal-tar pitch by extrography," 

Fuel, vol. 59, pp. 600-602, 1980. 

[60] J. F. Rovani Jr, M. M. Sanderson and J. F. Schabron, "Asphaltene determination method for 

automated on-column precipitation and redissolution of pericondensed aromatic asphaltene 

components," Energy & Fuels, vol. 24, pp. 5984-5996, 2010. 

[61] E. Gilgenast, M. Kaminski and R. Kartanowicz, "Group -type analysis of middle distillates by test metod 

IP-391/ EN-12916/ ASTM D 6379 in terms of resolution and selectivity of chromatographic columns," 

Chemia Analityczna, vol. 52, pp. 265-280, 2007. 

[62] N. Aske, H. Kallevik and J. Sjoblom, "Determination of saturate, aromatic, resin, and, asphaltenic 

(SARA) components in crude oils by means of infrared and near-infrared spectroscopy," Energy & 

Fuels, vol. 15, pp. 1304-1312, 2001. 

[63] E. Buenrostro-Gonzalez, C. A. Islas -Flores and C. Lira-Galeana, "Comparisons between open column 

chromatography and HPLC SARA fractionations in petroleum," Energy & Fuels, vol. 19, pp. 2080- 

2088, 2005. 

[64] T. Górecki, J. Gudebska, M. Kamiński and R. Kartanowicz, "Optimized conditions for hydrocarbon 

group type analysis of base oils by thin-layer chrimatography-flame ionization detection," Journal of 

Chromatography A, vol. 991, pp. 255-266, 2003. 

[65] A. F. Nikolaides, Bituminous miztures and pavemants VI, Londyn: Taylor & Francis, 2015. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

16 

[66] M. K. Sharma and T. F. Yen, Asphaltene particles in fossil fuel exploration, recovery, refining, and 

production processes, Nowy Jork: Plenum Press, 1994. 

[67] PN-EN 12916, Przetwory naftowe- Oznaczanie grup węglowodorów aromatycznych w średnich 

destylatach- Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem współczynnika 

załamania światła, 2008. 

[68] C. Jiang, S. R. Larter, K. J. Noke and L. R. Snowdon, "TLC-FID (latroscan) analysis of heavy oil tar 

sand samples," Organic Geochemistry, vol. 39, pp. 1210-1214, 2008. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria



Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ* 

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej 

*Autor do korespondencji, e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 

Zastosowanie technik chromatograficznych do badań charakterystyki 

fizykochemicznej czystych substancji i mieszanin 

Streszczenie: W pracy przedstawiono metody wyznaczania charakterystyki fizykochemicznej substancji czystych i ich 

mieszanin z zastosowaniem technik chromatograficznych. Opisano metodę destylacji symulowanej oraz techniki 

odwróconej chromatografii cieczowej i gazowej. Przedstawiono metody wyznaczania parametrów rozpuszczalności, 

entalpii adsorpcji, współczynnika podziału, porowatości, właściwości kwasowo-zasadowych. 

Słowa kluczowe: destylacja symulowana, chromatografia odwrócona, charakterystyka fizykochemiczna 

Study of physicochemical characteristic of pure substances and mixtures by means 

of chromatographic techniques 

Abstract: The paper presents methods of determination of the physicochemical properties of pure substances and their 

mixtures by the use of chromatographic techniques. Simulated distillation, reversed gas and liquid chromatography have 

been described. Basic equation and relationship allowing to calculate solubility parameters, adsorption enthalpy and 

isotherm, partition coefficient, porosity and acid/based characteristic are also given. 

Key words: simulated distillation, inverse chromatography, physicochemical characterization 

1. Wstęp 

1. Introduction 

Właściwości fizykochemiczne czystych substancji i ich mieszanin wyznaczać można z zastosowaniem 

wielu technik w zależności od badanego materiału i parametru. Nie rzadko kompleksowe badania wiążą się 

z koniecznością zastosowania dużej liczby różnej aparatury badawczej, co znacznie wydłuża czas 

przeprowadzanych badań i zwiększa koszty. Alternatywą dla metod „klasycznych” jest zastosowanie w tym 

celu technik chromatograficznych. Pozwalają one na szybkie i stosunkowo proste (oparte na podstawowych 

parametrach retencji i równaniach matematycznych) wyznaczenie podstawowych właściwości 

fizykochemicznych podczas jednej analizy. 

Do najczęściej spotykanych technik chromatograficznych pozwalających na określenie charakterystyki 

badanej substancji należą chromatografia gazowa i cieczowa. Do najlepiej opanowanych metodyk 

opierających się na chromatografii gazowej najeżą destylacja symulowana (ang. Simulated Distillation, 

SIMDIS) i odwrócona chromatografia gazowa (ang. Inverse Gas Chromatography, IGC). Pierwsza pozwala 

na zbadanie rozkładu temperatury destylacji mieszaniny w czasie ok. 1 godziny wykorzystując do tego mniej 

niż 1mL substancji badanej. Zaletą IC jest natomiast możliwość jej zastosowania do badania powierzchni 

ciał stałych w postaci filmów, włókien, proszków, a także struktur krystalicznych i amorficznych. Zasada 

metody polega na uzyskiwaniu informacji na temat substancji stanowiącej fazę stacjonarną na podstawie 

analizy związków testowych o znanych właściwościach. Aktualnie technikę IC podz ielić można na trzy grupy, 

z których jako pierwsza, we wczesnych latach 60, pojawiła się, za sprawą profesora Kiselev’a, odwrócona 

chromatografia gazowa [1], następnie zaczęto stosować odwróconą chromatografię cieczową, w której 

największą wartość aplikacyjną posiada odwrócona chromatografia wykluczania. 

W praktyce odwróconą chromatografię wykonywać można w dwóch wariantach, z których najczęściej 

stosowany opiera się na wykorzystaniu takiej wartości stężenia próbki, aby mogło być one przybliżone 

nieskończonym rozcieńczeniem- stężenie substancji rozpuszczonej jest mniejsze od 0,01P/P0. Cząsteczki 

nie oddziałują między sobą, a parametry retencji można powiązać z prawem Henry’ego. Gdy przedmiotem 

badania stają się izotermy adsorpcji oraz współczynniki dyfuzji i porowatość konieczne jest zastosowanie 

bardziej skomplikowanego badania przy tzw. „stężeniu skończonym” [2]. 

W pracy opisano podstawy metod wyznaczania parametrów fizykochemicznych z zastosowaniem 

technik chromatograficznych z uwzględnieniem najczęściej stosowanych zależności matematycznych. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

18 

2. Destylacja symulowana 

2. Simulated Distillation 

Destylacja symulowana (ang. Simulated Distillation, SIMDIS), której początki sięgają roku 1960 [3, 4] 

polega na wyznaczaniu rozkładu temperatury destylacji mieszaniny na podstawie zarejestrowanego 

chromatogramu. Technika ta opisana w normach serii PN-EN-ISO, PN-EN oraz ASTM jest najczęściej 

stosowana w kontekście wyznaczania temperatury destylacji produktów naftowych. Rozdzielanie wykonuje 

się techniką chromatografii gazowej, jako detektor stosując najczęściej detektor płomieniowo jonizacyjny 

(ang. Flame Ionization Detector, FID) rzadziej detektor cieplno przewodnościowy (ang. Thermal Conductivity 

Detector, TCD). Zastosowanie niepolarnej fazy stacjonarnej skutkują elucją składników mieszaniny, zgodnie 

z ich temperaturą wrzenia. Wyniki korelowane są następnie z temperaturą wrzenia na podstawie 

przeprowadzonej kalibracji czasu retencji od temperatury wrzenia substancji wzorcowych - n-alkanów. 

Wartość temperatury wrzenia badanej próbki oblicza się z zależności [5] (1): 

(1) 

R i - czas retencji uzyskania kolejnego procent odzysku [min] 

R 1 - czas retencji wzorca eluowanego bezpośrednio przed R i [min] 

R 2 - czas retencji wzorca eluowanego bezpośrednio po R i [min] 

B 1 - temperatura wrzenia substancji o czasie retencji R 1 [°C] 

B 2 - temperatura wrzenia substancji o czasie retencji R 2 [°C] 

Destylacja symulowana pozwala ponadto na uzyskanie dodatkowych informacji (poza temperaturą 

wrzenia) na temat badanych próbek poprzez zastosowanie podczas analizy detektorów selektywnych takich 

jak detektor chemiluminescencji siarki (ang. Sulfur Chemiluminescence Detector, SCD) [6], pulsacyjny 

detektor płomieniowo-fotometryczny (ang. Pulsed Flame Photometric Detector, PFPD), detektor emisji 

atomowej (ang. Atomic Emission Detector, AED), detektor chemiluminescencji azotu (ang. 

Chemiluminescence Nitrogen Detector, CND), detektor emisji atomowej ze wzbudzeniem od plazmy 

mikrofalowej (ang. Microwave Plasma Emission Detector, MED) [7] oraz spektrometr mas (ang. Mass 

Spectrometer, MS) [8]. Zastosowanie detektorów selektywnych pozwoliło między innymi na ocenę stopnia 

konwersji polietylenu podczas pirolizy prowadzącej do otrzymania olejów smarowych i wosków [9]. 

Na podstawie informacji zebranych w wyniku badania metodą destylacji symulowanej można ponadto 

określić zakres masy cząsteczkowej frakcji ropy naftowej zawierającej w swoim składzie od 5 do 120 

atomów węgla. Obejmuje to zakres masy cząsteczkowej pomiędzy 72 a 1700 g/mol. Ustalono, że 

temperatura 50% wagowych frakcji odpowiada normalnej temperaturze wrzenia czystego składnika, co w 

oparciu o znaną gęstość umożliwia dokonanie odpowiednich obliczeń i uzyskanie wyniku różniącego się o 

ok. 2% od wartości rzeczywistej [10]. 

Jedną z nowatorskich metod określaną jako EC-GC (ang. Empty Column Gas Chromatography) jest 

zastosowanie pustej kolumny o dezaktywowanej powierzchni (ang. Fused Silica Tubing, FST) do badania 

rozkładu temperatury destylacji produktów naftowych [11]. Różnice pomiędzy wartościami wyznaczonych 

temperatur dla trzech frakcji wahają się w granicach 0,37 -2°C w przypadku początku temperatury destylacji, 

oraz 0,9-2°C dla końca temperatury destylacji w stosunku do klasycznej metody SIMDIS. Opracowana 

metoda pozwala obniżyć temperaturę, elucji składników produktów naftowych przez ograniczenie 

oddziaływań między substancjami analizowanymi a fazą stacjonarną. Jej wadą jest jednak możliwość 

zastosowania dla związków wrzących powyżej temperatury 128°C w przypadku początkowej temperatury 

pieca chromatograficznego wynoszącej 40°C. Dalsze badania wykazały większą zgodność wyznaczanej 

temperatury wrzenia w warunkach EC-GC dla czystych substancji chemicznych [12]. Koncept fazy 

stacjonarnej o dezaktywowanej powierzchni został zastosowany do metodyki SIMDIS z kolumnami 

pakowanymi, w których fazę stacjonarną stanowi silanizowany żel krzemionkowy [13]. Opracowano również 

metodykę SEC-RID umożliwiającą badanie rozkładu temperatury destylacji wysokowrzących frakcji 

naftowych w warunkach chromatografii wykluczania [14]. Bardziej szczegółowy przegląd prac dotyczących 

metodyki SIMDIS przedstawiono w [15]. 

3. Odwrócona chromatografia gazowa 

3. Inverse gas chromatography 

Odwrócona chromatografia gazowa (ang. Inverse Gas Chromatography, IGC), jest obok destylacji 

symulowanej drugą najczęściej stosowaną techniką wyznaczania właściwości fizykochemicznych badanych 

substancji z zastosowaniem technik chromatograficznych. Ta technika zakłada wyznaczenie parametrów 

fizykochemicznych substancji stanowiących fazę stacjonarną najczęściej naniesioną na inertny nośnik przy 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

19 

wykorzystaniu parametrów chromatograficznych i wyników uzyskanych podczas analizy grup związków 

testowych. 

Odwrócona chromatografia gazowa pozwala w przypadku porowatych substancji stałych na 

wyznaczenie izotermy adsorpcji, energii powierzchniowej, ciepła adsorpcji, heterogeniczności złoża 

i współczynnika dyfuzji oraz przepuszczalności [16], najczęściej w warunkach nieskończonego 

rozcieńczenia. Izotermę adsorpcji wyznaczyć można na podstawie wielkości powierzchni i wysokości piku 

chromatograficznego oraz całkowitej powierzchni adsorpcyjnej [17]. Heterogeniczność oblicza się natomiast 

w oparciu o pierwszą pochodną zależności zaadsorbowanej substancji i potencjału adsorpcji. IGC um ożliwia 

ponadto określenie wypływu i wkładu oddziaływań dyspersyjnych i kwasowo zasadowych (wg Levisa) na 

napięcie powierzchniowe poprzez analizę energii adsorpcji grup związków o różnych właściwościach [18]. 

W tym celu najczęściej stosuje się równanie Dorris i Gray’a do określania wkładu dyspersyjnych sił Londona 

na wartość napięcia powierzchniowego [19] [20]. Badania z zastosowaniem tej metody pozwoliły na 

określenie właściwości powierzchniowych serii smektytów o różnym składzie chemicznym. 

Scharakteryzowano oddziaływania pomiędzy powierzchnią materiału, a alkenami, oraz stwierdzono, że 

wysokie wartości określanego parametru oddziaływań są spowodowane istnieniem silnych centrów 

kwasowych związanych z między-warstwowymi kationami i strukturą chemiczną związku [21]. 

Technika IGC jest najczęściej stosowana do wyznaczania parametru Flory -Huggins’a (2) 

charakteryzującego oddziaływania pomiędzy substancją rozpuszczoną, a fazą stacjonarną i parametru 

rozpuszczalności Hildebranda . 

(2) 

1- indeks odpowiadający substancji rozpuszczonej (wzorcowi) [-] 

2- indeks odpowiadający badanemu materiałowi (fazie stacjonarnej) [-] 

M 1 - masa molowa substancji rozpuszczonej [kg/mol] 

- prężność pary nasyconej substancji rozpuszczonej [Pa] 

B 11 - drugi współczynnik wirialny substancji rozpuszczonej [-] 

- objętość molowa [m 3 /mol] 

ρ i - gęstość [kg/m 3 ] 

R- uniwersalna stała gazowa [J/(mol ·K)] 

T- temperatura kolumny [K] 

V g - objętość retencji [m 3 /kg] 

Występujący w równaniu drugi współczynnik wirialny wyznaczyć można z zastosowaniem odwróconej 

chromatografii gazowej [22], lub wykorzystując zależności matematyczne opierające się na korelacji 

Tsonopoulos’a [23] i Pitzer’a Curl’a [24]. Posiadając zbiór wartości i dla rozpuszczonych substancji 

testowych wyznaczyć można nachylenie liniowej zależności lewej strony poniższego równania do , które 

jest proporcjonalne do parametru rozpuszczalności w badanym materiale (3). 

(3) 

Z zastosowaniem tej metody określono zmiany zachodzące w ciągu procesów utleniania mieszaniny 

oleju mineralnego i poli-α-olefiny. Zmiany wartości odzwierciedlają zmieniające się powinowactwo do 

różnych rodzajów mieszanin (oddziaływania międzycząsteczkowe) oraz potencjał mieszalności 

i rozpuszczalność [25]. Na przykład wraz ze wzrostem wartości parametru Flory-Huggins’a wskazuje na 

spadek mieszalności substancji testowej i składników wypełnienia kolumny. Dodatkowo wprowadzając do 

równania parametr binarny I 1,2 zależny od masy cząsteczkowej i natury chemicznej możliwe jest określenie 

występujących oddziaływań, polarnych i wiązań wodorowych [26]. 

W 2005 roku opracowano procedurę pozwalającą na wyznaczenie szeregu parametrów 

fizykochemicznych na podstawie parametrów retencyjnych (nie używając bezpośrednio wartości czasu, czy 

indeksu retencji) z zastosowaniem kapilarnej kolumny wypełnionej ciekłą w warunkach pokojowych cieczą 

jonową (ang. Room Temperature Ionic Liquid, RTIL) [27]. Fazę stacjonarną stanowiły: 1-butylo-3- 

metyloimidazo heksafluorofosforan, chlorek 1-metylo-3-oktaimidzaolu oraz imidek 

di(trifluorometylosulfoniowy)-1-butylo-3-etyloimidazoliowy, a badaniu poddano 31 związków organicznych 

tj. alkany, alkeny, alkiny, cykloalkany, związki aromatyczne i alkohole. Podstawą obliczeń była znajomość 

parametrów opisujących między innymi liczbę moli składników fazy stacjonarnej w kolumnie, prędkość 

przepływu gazu nośnego, temperaturę kolumny, prężność par, oddziaływania pomiędzy substancją badaną 

a fazą stacjonarną, objętość molową i lotność. Ich wartości pozwoliły na wyprowadzenie równań, dzięki 

którym możliwe stało się wyznaczenie współczynnika aktywności przy nieskończonym rozcieńczeniu, 

parametru rozpuszczalności Hildebranda oraz Hansena, cząstkową molową entalpię i rozpuszczalność 

dwutlenku węgla w wybranej RTIL. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

20 

IGC wykorzystać można również do wyznaczenia udziału wagowego współczynnika aktywnoś ci 

∞ 

rozpuszczalnika w nieskończonym rozcieńczeniu Ω 2 (4), wartości energii swobodnej Gibbsa (5) oraz 

cząstkowego molowego ciepła mieszania (6) [28]. Fazę stacjonarną stanowił izotaktyczny, krystaliczny 

Poli(1-buten) o niskiej masie cząsteczkowej, immobilizowany poprzez sporządzenie roztworu 

w cykloheksanie (stężenie 10%) i odparowaniu próżniowemu rozpuszczalnika, na Chromosorbie. 

Na podstawie wartości objętości retencji możliwe stało się obliczenie wyżej wymienionych parametrów 

termodynamicznych według zależności: 

(4) 

(5) 

R- stała gazowa [kJ/ (mol K)] 

V g ° - objętość retencji [cm 3 /mol] 

P 2 ° -ciśnienie par rozpuszczalnika w temperaturze T [bar] 

M 2 - masa molowa rozpuszczalnika [g/mol] 

B 22 - współczynnik wirialny rozpuszczalnika [-] 

V 2 - objętość molowa rozpuszczalnika [cm 3 /mol] 

T- temperatura dokonywania pomiarów [K] 

Zaprojektowanie wąsko-kanałowej prostokątnej kolumny i wykorzystanie zmodyfikowanej techniki IGC 

(ang. Rectangular Thin-Channel Column Inverse Gas Chromatography, RTCCIGC) pozwoliło na określenie 

współczynnika podziału (K) i dyfuzji (D p ) niskocząsteczkowego rozpuszczalnika w membranie polimerowej. 

Badania przeprowadzono dla etanolu i membran z dioctanu celulozy (ang. Cellulose DiAcetate, CDA) oraz 

sulfonowanego poli(etero etero) ketonu (ang. Sulfonated Poly(Ether Ether Ketone), SPEEK). Opracowano 

model matematyczny do opisu profilu prędkości przepływu gazu nośnego i stężenia rozpuszczalnika 

w kolumnie niezbędny do predykcji współczynnika dyfuzji. Równanie charakteryzujące ten parametr opiera 

się na zależnościach między innymi pomiędzy współczynnikiem podziału, wartościami opisującymi wymiary 

kolumny i uśrednioną prędkością gazu nośnego w kolumnie [29]. 

(6) 

(7) (8) 

-bezwymiarowa wartość czasu retencji [-] 

- bezwymiarowa wariancja piku (wartość eksperymentalna) [-] 

- bezwymiarowa wariancja piku związana z „czynnikami zewnętrznymi” (dodatkowa długość 

przewodu łączącego, objętości martwe) 

- grubość membrany [cm] 

- obszar średniej prędkości gazu nośnego wewnątrz kolumny [cm/s] 

- połowa wysokości kanału [cm] 

- długość kanału [cm] 

Widegren i Bruno wykazali, że za pomocą odwróconej chromatografii gazowej można z powodzeniem 

przewidzieć entalpię adsorpcji węglowodorów [30]. Swoje badania przeprowadzali z użyciem detektora TCD 

oraz pakowanej kolumny miedzianej, którą wypełniono około 25g frakcji 180 -250µm cementu portlandzkiego. 

W zakresie temperatur 30-190°C badany był przepływ gazu nośnego, temperatura przepływomierza, 

ciśnienie pary wodnej oraz czas retencji. Dzięki trzem pierwszym wartościom możliwe było wyliczenie 

skorygowanego natężenia przepływu gazu nośnego (9) pozwalającego na obliczenie objętości retencji 

węglowodorów, a w rezultacie entalpii adsorpcji ΔH a według zależności (10): 

(9) 

(10) 

F c - skorygowany przepływ gazu nośnego [mL/min] 

j- współczynnik ściśliwości Martin’a- James’a [-] 

t’ R - zredukowany czas retencji (t R -t 0 ) [min] 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

21 

w s - masa adsorbentu [g] 

R- stała gazowa [kJ/(mol K)] 

T- temperatura kolumny [K] 

C- stała charakteryzująca entropię [mL/g] 

Z przeprowadzonych badań wynika, że wartość energii sorpcji wzrasta ze wzrostem liczby atomów 

węgla w cząsteczce oraz nieznacznie maleje w stosunku do węglowodorów rozgałęzionych oraz cyklicznych 

względem ich liniowych odpowiedników o takiej samej liczbie atomów w cząsteczce. 

Tą samą metodą badano również entalpię adsorpcji organicznych tioli i sulfidów, charakteryzujących 

się nieprzyjemnym zapachem, wykorzystywanych jako dodatek do mieszanek gazowych w celu łatwiejszej 

identyfikacji wycieków [31]. W tym celu zastosowano kolumny typu WCOT z fazą stacjonarną w postaci 

syntetycznej gliny Laponite-RD o wzorze sumarycznym Na + 0,7[(Si 8 Mg 5,5 Li 0,3 )O 20 (OH) 4 ] -0,7 – czystej oraz 

zimmobilizowaną warstwą oktadekanu nazywaną dalej organo-glinową. Pomiarów objętości retencji 

dokonywano w 4 do 7 temperaturach w zakresach 35-75°C dla kolumny organo-glinowej i 130-250°C dla 

kolumny glinowej. Wyniki badań wskazują na większą wartość entalpii adsorpcji sulfidów w porównaniu 

z tiolami dla obu rodzajów wypełnień. Oznacza to, iż te drugie w mniejszym stopniu zdolne są adsorbować 

się na powierzchni gleby. Zasugerowano, że może mieć to związek z zawartością wilgoci w próbkach gliny. 

IGC stosowana może być również do badania oddziaływań pomiędzy stosowanym wypełnieniem 

kolumny, a substancjami rozdzielanymi co pozwana na określenie aplikacyjności nowo wprowadzanych faz 

do zastosowań przy rozdzielaniu charakterystycznych grup substancji chemicznych. W tym celu zbadano 

różne rodzaje asfaltów i frakcji asfaltenowych [32] [33]. Immobilizowano 10% wagowych fazy stacjonarnej na 

nośniku, którego rolę pełnił Fluoropak 80, a następnie zbadano charakterystykę retencyjną grupy związków 

wzorcowych w tym alkoholi, kwasów, amin, estrów, olefin, związków aromatycznych, cyklicznych 

i zawierających siarkę. Dla każdej z substancji obliczono współczynnik oddziaływań (ang. Interraction 

Coefficient, I P ) jako 100-krotność różnicy pomiędzy logarytmem objętości retencji (V R ) badanego związku, 

a objętością retencji wzorcowego n-alkanu o takiej samej masie cząsteczkowej (wartość wyznaczona na 

podstawie wykresu zależności logarytmu V R od masy molekularnej n-parafin). W związku z tym, że n-alkany 

słabo oddziałują z polarną fazą stacjonarną (oddziaływania dyspersyjne), można przyjąć, że współczynnik 

oddziaływań jest jedynie miarą powinowactwa funkcyjnych grup substancji wzorcowych do osadzonych 

asfaltów/ asfaltenów. Dzięki temu możliwe stało się podjęcie prób skorelowania wartości I P ze składem 

grupowym badanego asfaltu. Wykazano, że im wyższy jest skorygowany w oparciu o l iczbę kwasową 

i zawartość związków azotu w próbce współczynnik oddziaływań formamidu tym większa procentowa 

zawartość sumy asfaltenów i żywic asfaltenowych. Za pomocą techniki IGLC możliwe jest również 

analizowanie asfaltów w kontekście ich trwałości podczas utleniania bezpośrednio w kolumnie [34]. Zaletą 

tej metody jest łatwe i precyzyjne sterowanie szybkością narostu temperatury i przepływu powietrza oraz 

uzyskanie powtarzalnych warunków utleniania. Zastosowanie odwróconej chromatografii gazowej eliminuj e 

ponadto dodatkowy etap występujący gdy utlenienie przeprowadza się na zewnątrz kolumny a tym samym 

możliwość zanieczyszczenia próbki. 

4. Odwrócona chromatografia cieczowa 

4. Inversed Liquid chromatography 

Obok najczęściej stosowanej odwróconej chromatografii gazowej wyróżnić można odwróconą 

chromatografię wykluczania (ang. Inversed Size Exclusion Chromatography, ISEC) dzięki której możliwe jest 

uzyskanie danych na temat wewnątrz-ziarnowej ε i (11) i między-ziarnowej ε e porowatości kolumny oraz 

rozkładzie wielkości porów adsorbentu ø (12). W badaniach wykorzystuje się dane dotyczące retencji próbki 

polistyrenu o znanym wąskim rozkładzie masy cząsteczkowej [35]. 

(11) (12) 

- porowatość całkowita [-] 

V T - objętość elucji niezatrzymywanego trasera (objętość martwa) [mL] 

V e - objętość elucji substancji wykluczanej [mL] 

V g - objętość geometryczna kolumny [mL] 

Metodę tą wykorzystano do wyznaczenia porowatości oraz stosunku faz dla serii kationo -wymiennych 

adsorbentów powszechnie stosowanych do oczyszczania białek. W badaniach zastosowano wzorce 

dekstranu, polimeru glukozy rozpuszczalnego w wodzie. Stwierdzono, że procedura przygotowania 

adsorbentu gdzie polimery wytworzone in situ lub wszczepiane w materiał bazowy ma znaczący wpływ na 

wymiary porów i stosunek faz charakteryzowany jako dostępna powierzchnia adsorbentu przypadająca na 

jednostkę objętości fazy ruchomej [36]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

22 

W 2015 roku grupa naukowców z Polski wykorzystała zależności pozwalające na obliczenie stałych 

równowagi adsorpcji dla IGC i dostosowała ją na potrzeby chromatografii cieczowej. Wyznaczono izotermy 

i entalpię adsorpcji aniliny i 4-chloroaniliny na haloizycie metodą podziału szczytu piku [37]. 


5. Conclusions 

Wyznaczanie parametrów fizykochemicznych badanych substancji zarówno w przypadku 

chromatografii standardowej jak i odwróconej jest stosunkowo szybkie, wydajne i łatwe. Rozwój metodyk jak 

i poszukiwanie zależności matematycznych pozwalających korelować posz czególne parametry 

spowodowały możliwość uzyskania dużej ilości informacji na temat próbki podczas jednej analizy. Obecnie 

destylacja symulowana praktycznie całkowicie wyparła technikę klasyczną i jest powszechnie stosowana 

zwłaszcza w kontekście analizy rozkładu temperatury destylacji produktów naftowych. Chromatografia 

odwrócona jest natomiast doskonałym narzędziem badań nad nowymi substancjami stosowanymi głównie 

w przemyśle farmaceutycznym, polimerami oraz innowacyjnymi fazami stacjonarnymi. 



Praca finansowana w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Narodowe 

Centrum Badań i Rozwoju (Program LIDER, edycja V, nr projektu: LIDER/036/573/L -5/13/NCBR/2014) 

pt. Badania nad otrzymywaniem i właściwościami sorbentów wytwarzanych z asfaltów. 

6. Literatura 

(References) 

1. K. Shcherbakova, Y. I. Yashin, V. Andrej, Kiselev's contributions to the science of adsorption, molecular 

interaction and chromatography, Pure and Applied Chemistry 61 (1989) 1829. 

2. D. Butler i D. R. Williams, Particulate characterization: inverse gas chromatography w Encyclopedia of 

Separation Science, Londyn, Elsevier Science Ltd, 2000, pp. 3609-3614. 

3. F. T. Eggertsen, S. Groennings, J. J. Holst, Analytical distillation by gas chromatography programmed 

temperature operation, Analytical Chemistry 32 (1960) 904. 

4. L. E. Green, L. J. Schmauch, J. C. Worman, Simulated distillation by gas chromatography, Analytical 

Chemistry 36 (1964) 1512. 

5. PN-EN 15199-3, Oznaczanie rozkładu temperatur wrzenia metodą chromatografii gazowej - ropa 

naftowa. 

6. L. M. Meyer i R. L. Shearer, Simultaneous measurement of hydrocarbons and sulfur compounds using 

flame ionization and sulfur chemiluminescence detection for sulfur simulated distillation, Journal of High 

Resolution Chromatography 22 (1999) 386. 

7. J. L. Buteyn i J. J. Kosman, Multielement simulated distillation by capillary GC-AED, Journal 

Chromatography Science, 28 (1990) 19. 

8. W. P. Fitzgerald i S. G. Roussis, Gas chromatographic simulated distillation-mass spectrometry for the 

determination of the boiling point distributions of crude oils, Analytical Chemistry 72 (2000) 1400. 

9. E. M. Canto, M. B. De Souza, A. D. M. Lima i M. L. M. Valle, Using simulated distillation or density to 

maximize lubricants production from low density pole ethylene LDPE pyrolysis , Chemical Engineering 

Transactions 26 (2012) 219. 

10. A. G. Goossens, Prediction of molecular weight of petroleum fractions, Industrial & Engineering 

Chemistry Research 35 (1996) 985. 

11. G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, A new procedure for the determination of distillation temperature 

distribution of high-boiling petroleum products and fractions, Analytical and Bioanalytical Chemistry 399 

(2011) 3253. 

12. G. Boczkaj, M. Kamiński, Research on the separation properties of empty-column gas chromatography 

(EC-GC) and conditions for simulated distillation (SIMDIS), Analytical and Bioanalytical Chemistry 405 

(2013) 8377. 

13. G. Boczkaj, M. Momotko, A. Przyjazny, M. Kamiński, Studies of separation performance of silanized 

silica gel for simulated distillation, Journal of Separation Science, 2015. DOI: 10.1002/jssc.201501127. 

14. G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, Size-exclusion chromatography for the determination of the 

boiling point distribution of high-boiling petroleum fractions, Journal of Separation Science 38 (2015) 

741. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

23 

15. M. Momotko, G. Boczkaj, Use of simulated distillation for analysis of petroleum -derived products 

(Zastosowanie destylacji symulowanej do analizy produktów naftowych), Przemysł Chemiczny 4 (2015) 

594. 

16. F. Thielmann, Introduction into the characterization of porous materials by inverse gas chromatography, 

Joural of Chromatography A 1037 (2004) 115. 

17. K. Czech, P. M. Słomkiewicz, Zastosowanie pakietów oprogramowania komputerowego do 

wyznaczania izoterm adsorpcji metodą inwersyjnej chromatografii gazowej, Camera Separatoria 

3 (2011) 329. 

18. M. M. Chehimi, M. L. Abel, C. Perruchot, M. Delamar, S. F. Lascelles, S. P. Armes, The determination 

of the surface energy of conducting polymers by inverse gas chromatography at infinite dilution, 

Synthetic Metals, 104 (1999) 51. 

19. G. M. Dorris, D. G. Gray, Adsorption, spreading pressure, and London force interactions of 

hydrocarbons on cellulose and wood fiber surfaces, Journal of Colloid Interface Science 71 (1979) 93. 

20. G. M. Dorris, D. G. Gray, Adsorption of n-alkanes at zero coverage on cellulose paper and wood fibers, 

Journal of Colloid Interface Science 77 (1980) 353. 

21. T. J. Bandosz, J. Jagiełło, B. Andersen, J. A. Schwarz, Inverse gas chromatography study of modified 

smectite surface, Clays Clay Minerals 40 (1992) 306. 

22. A. Voelkel i J. Fall, Influence of prediction method of the second virial coefficient on inverse gas 

chromatographic parameters, Journal of Chromatography A 721 (1995) 139. 

23. C. Tsonopoulos, An empirical correlation of second virial coefficients, American Institute of Chemical 

Engineers 20 (1974) 263. 

24. K. S. Pitzer, R. F. Curl, The volumetric and thermodynamic properties of fluids. 3. Empirical equation for 

the 2nd virial coefficient, Journal of the American Chemical Society 79 (1957) 2369. 

25. A. Voelkel, J. Fall, Application of inverse gas chromatography to the examination of annealing 

processes of semi-synthetic base oils, Journal of Chromatography A 982 (2002) 245. 

26. A. Voelkel, J. Janas, J. A. Garcia-Dominguez, Inverse gas chromatography in characterization of 

surfactants. Determination of binary parameter, Journal of Chromatography A 654 (1993) 135. 

27. F. Mutelet, V. Butet, J. Jean-Noel, Application of Inverse Gas Chromatography and Regular Solution 

Theory for Characterization of Ionic Liquids, Industrial & Engineering Chemistry Research 44 (2005) 

4120. 

28. M. K. Kozłowska, U. Domańska, M. Lempert, M. Rogalski, Determination of thermodynamic properties 

of isotactic poly(1-butene) at infinite dilution using density and inverse gas chromatography, Journal of 

Chromatography A 1068 (2005) 297. 

29. R. Y. M. Huang, P. Shao, G. Nawawi, X. Feng, C. M. Burns, Measurements of partition, diffusion 

coefficients of solvents in polymer membranes using rectangular thin-channel column inverse gas 

chromatography (RTCCIGC), Journal of Membrane Science. 188 (2001) 205. 

30. J. A. Widegren, T. J. Bruno, Enthalpy of adsorption for hydrocarbons on concrete by inverse gas 

chromatography, Journal of Chromatography A 1218 (2011) 4474. 

31. K. E. Miller, T. J. Bruno, Enthalpy of fuel gas odorants on surrogate soil surface by gas chromatography, 

Journal of Chromatography A 975 (2002) 311. 

32. T. C. Davis, J. Petersen, Inverse gas-liquid chromatographic studies of asphalt. Comparison with 

analyses by fractionation, Analytical Chemistry 39 (1967) 1852. 

33. T. C. Davis, J. C. Petersen, W. E. Haines, Inverse gas-liquid chromatography a new approach for 

studying petroleum asphalts, Analytical Chemistry 38 (1966) 241. 

34. T. C. Davis, J. C. Petersen, An adaptation of inverse gas-liquid chromatography to asphalt oxidation 

studies, Analytical Chemistry 38 (1966) 1938. 

35. M. Al-Bokari, D. Cherrak, G. Guiochon, Determination of the porosities of monolithic columns by inverse 

size-exclusion chromatography, Journal of Chromatography A 975 (2002) 275. 

36. P. DePhillips, A. M. Lenhoff, Pore size distributions of cation-exchange adsorbents determined b y 

inverse size-exclusion chromatography, Journal of Chromatography A 883 (2000) 39. 

37. P. M. Słomkiewicz, B. Szczepanik, M. Garnuszek, Determination of adsorption isotherms of aniline and 

4-chloroaniline on halloysite adsorbent by inverse liquid chromatography, Applied Clay Science 114 

(2015) 221. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

24 


PRACE ORYGINALNE 

(Original papers) 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria



Marta GLINKA, Marina ANTOLAK, Rafał ŁUKAJTIS, Marian KAMIŃSKI* 

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, 

Gdansk University of Technology, Chemical Faculty, Chemical and Process Engineering Department 

ul. Gabriela Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, Poland 

*Autor do korespondencji, e-mail: markamin@pg.gda.pl 

Wpływ rodzaju kwasu jako dodatku do eluentu na parametry rozdzielania polifenoli 

techniką chromatografii cieczowej w odwróconych układach faz (RP-HPLC) 

Streszczenie: Chromatografia cieczowa jest jedną z technik najczęściej wykorzystywanych w badaniach składu mieszanin, 

a także do wydzielania czystych składników z mieszanin w postaci frakcji eluatu. Z punktu widzenia współczesnej chemii, 

farmakologii, a także medycyny, czy biotechnologii, chromatografia pełni ważną rolę, w zakresie analityki jakościowej 

i ilościowej. Dzięki możliwości otrzymywania naturalnych składników biologicznie czynnych w czystej postaci z ekstraktów 

pochodzenia naturalnego, jak i składników mieszanin po syntezie organicznej, ma też ważne znaczenie w skali preparatywnej, 

i coraz większe, w skali procesowej. W celu zapewnienia efektywności procesu konieczne jest dobranie optymalnych warunków 

realizacji operacji rozdzielania, detekcji oraz kolekcji frakcji, w zależności od właściwości fizykochemicznych składników 

rozdzielanej mieszaniny. Niniejsza praca dotyczy badań nad optymalizacją warunków stosowanych przy rozdzielaniu 

składników jednej z grup związków chemicznych stanowiących metabolity roślinne – polifenole. 

W pracy zbadano wpływ na retencję, selektywność i sprawność rozdzielania, w tym także na s ymetrię pików, poprzez 

zastosowanie dodatków do eluentu w postaci kwasów (HCl, H3PO4, H2SO4, CH3COOH, TFA), do rozdzielania wybranych, 

naturalnie występujących materiale roślinnym polifenoli w warunkach RP HPLC. 

W rozdzielaniu peptydów w układach RP, w tym, w proteomice, najczęściej używanym modyfikatorem fazy ruchomej, jest k was 

trifluorooctowy (TFA). Spełnia on wówczas dwie funkcje: 

- ogranicza kwaśną dysocjację peptydu (na tzw. „C-końcu”), co zwiększa poziom hydrofobowości molekuł; 

- solwatuje sprotonowane lub spolaryzowane, dodatnio naładowane fragmenty cząsteczki peptydu lub białka ujemnymi jonami 

zdysocjowanego kwasu, powodując wyraźne dodatkowe podwyższenie hydrofobowości rozdzielanych cząsteczek. 

W przypadku polifenoli i warunków RP, obecny w eluencie kwas, powoduje jedynie cofnięcie dysocjacji elektrolitycznej 

rozdzielanych mniej lub bardziej kwaśnych związków chemicznych. Wpływa to na wyraźny wzrost hydrofobowości cząsteczek. 

Zwiększenie hydrofobowości skutkuje wzrostem współczynnika retencji , poprawą symetrii pików i lepszym rozdzieleniem 

składników mieszaniny w stosunków do warunków rozdzielania bez dodatku kwasu do eluentu. Badania tej pracy potwierdzają 

konieczność dodania k wasu do eluentu, w przypadku stosowania warunków faz odwróconych ( RP). Pokazują, że każdy 

z badanych k wasów powoduje korzystne efekty, jednak, najbardziej korzystne - zwłaszcza dla celów analityki - okazuje się 

stosowanie niewielkiego dodatku kwasu siarkowego (VI). 

Słow a kluczow e: RP-HPLC, Polifenole, Optymalizacja rozdzielania, Kwasowy modyfikator eluentu 

Effects of the acid additive to the eluent on the chromatographic parameters of 

separation of polyphenols using reversed phase liquid chromatography (RP-HPLC) 

Abstract: Liquid chromatography is the one of commonly used technique in research of mixture composition, and also for 

separation of pure components form of eluate fractions. From the standpoint of modern chemistry, pharmacology, medicine or 

biotechnology, chromatography plays an significant role in the field of qualitative and quantitative analysis. Additionally, through 

the possibility of isolation from natural origin extracts the biologically active components in its pure form, as well as the 

components of the mixture after organic synthesis, chromatography is important technique, which can be used in preparati ve 

and also in process scale. In order to provide the effectiveness of the process, it is necessary to select the optimum condit ions 

of the separation, detection and collection of fractions, which dep end on the physiochemical properties of separated 

components constituting the mixture. This paper, include the research related to optimization of chromatographic conditions, 

applied for the separation of the one group of chemical compounds, namely plant metabolites – polyphenols. In this research, 

effects of retention, separation selectivity and efficiency, including the symmetry of peaks, by applying the additive to the eluent 

in the form of acids (HCl, H3PO4, H2SO4, CH3COOH, TFA) for separation naturally occurring in plant polyphenols under RP- 

HPLC conditions was investigated. 

In the separation of peptides under RP conditions, including proteomics, the most commonly used acidic modifier is 

trifluoroacetic acid (TFA). It meets two functions: 

- reduces the acid dissociation of the peptide (on the so-called “C-end”), which results in an increase hydrophobicity of the 

molecules; 

- causes the sal vation of the protonated or positively polarized fragments of the peptide or protein molecule by negative ions 

dissociated acid, resulting in a noticeable increase hyrophobicity of separated molecules. 

In the case of polyphenols and RP conditions, the presence of acid in the eluent, cause only the withdrawal of electrolytic 

dissociation of separated acidic compounds. This can affect the significant increase in the hydrophobicity of the molecules. In 

addition, increasing hydrophobicity resulting in increase the retention rate, improvement of peak symmetry and better separat ion 

of mixture components, regarding to separation without the addition of acid to the eluent. Research, carried out in this study, 

confirm that it is necessary to use acid additive to the eluent, in the case of reversed phase (RP) conditions. Indicate that each 

of tested acids results in beneficial effects, however, the most preferred - especially for the purpose of analysis – turns out 

a small addition of sulfuric acid (VI). 

Key w ords: RP-HPLC, Polyphenols, Optimization of separation, Acidic eluent modifier 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

26 

1. Wstęp 

(Introduction) 

1.1. Polifenole – właściwości fizykochemiczne i wykorzystanie 

(Polyphenols – physiochemical properties and their applications) 

Polifenole są naturalnie występującymi związkami chemicznymi, charakteryzującymi się obecnością 

pierścieni aromatycznych podstawionych przynajmniej dwiema grupami hydroksylowymi (–OH). Głównymi 

źródłami polifenoli są: owoce, warzywa, przyprawy, zioła oraz napoje tj. czerwone wino, czy zielona herbata. 

Ze względu na swoje właściwości farmakologiczne, w tym przeciwutleniające, polifenole wykorzystywane są 

jako składniki kosmetyków oraz farmaceutyków. Dieta bogata w związki z grupy polifenoli, ze względu na ich 

sile działanie antyoksydacyjne, może znacznie zmniejszyć ryzyko wielu schorzeń cywilizacyjnych, m.in. 

chorób nowotworowych oraz układu krążenia [1, 2]. Ponadto, związki te wykazują działanie 

przeciwalergiczne, a także przeciwzapalne [3]. Dodatkowo stwierdzono, że polifenole pochodzenia 

naturalnego są łatwiej przyswajalne przez organizmy żywe w porównaniu do syntetycznych 

przeciwutleniaczy, tj. BHA (butylohydroksyanizolu) czy BHT (butylohydroksytoluenu). Dlatego korzystne jest 

pozyskiwanie naturalnych polifenoli z materiału roślinnego. To z kolei wpływa na rozwój technik rozdzielania 

i wydzielenia tych substancji w postaci czystej w skali preparatywnej oraz procesowej. 

Ze względu na budowę strukturalną, polifenole można podzielić na kilka następujących podgrup: 

kwasy fenolowe, flawonoidy, kwasy hydroksycynamonowe [4]. Najlepiej poznaną dotychczas grupą są 

flawonoidy (rys. 1), ich struktura chemiczna oparta jest na układzie flawonu. Zawierają one 15 atomów 

węgla, które tworzą, dwa pierścienie fenylowe, połączone ze sobą po przez strukturę piranu (flawanole, 

antocyjany) bądź pironu (flawony, flawanony, flawanole, izoflawony). 

a) b) 

Rys.1. Struktury molekularne dwóch flawonoidów: a) kwercetyna, b) mirycetyna. 

Fig. 1. Molecular structures of two flavonoids: a) quercetin, b) myricetin. 

Naturalnie występujące flawonoidy, będące przedmiotem niniejszych badań, posiadają w swojej 

strukturze grupy hydroksylowe znajdujące się w konkretnych położeniach. Grupy –OH, znajdujące się blisko 

struktury ketonu lub umiejscowi one kilka obok siebie, mają kwasowy charakter, dlatego w obecności wody 

dochodzi do odszczepiania protonów. 

Flawonoidy zwykle występują jako glikozydy flawonoidowe (rys. 2), zawierające w swojej strukturze 

część cukrową, rozpuszczalną w wodzie (glikozydy) oraz nie cukrową, znacznie gorzej rozpuszczalną 

(aglikony), jednakże oba rodzaje charakteryzują się dobrą rozpuszczalnością 

w alkoholach. Są to głównie O – glikozydy, bądź C – glikozydy [5]. 

a) b) 

Rys. 2. Struktury molekularne flawonoidów w postaci: a) O – glikozydu (Apiin), b) C – glikozydu (Vitexin). 

Fig. 2. Molecular structure of flavonoids in the form of: a) O – glycoside (Apiin), b) C – glycoside (Vitexin). 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

27 

1.2. Modyfikatory eluentów wykorzystywanych w technice wysokosprawnej chromatografii 

cieczowej w układzie faz odwróconych RP-HPLC – rodzaje i funkcje stosowanych 

dodatków 

(Modifiers of eluents used in the reversed phase high performance liquid 

chromatography (RP-HPLC) – classification and function of additives) 

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych (RP -HPLC) jest główną 

techniką wykorzystywaną obecnie do rozdzielania polifenoli pochodzących z materiałów roślinnych 

[5-6]. Powierzchnia sorpcyjna w tego typu układach składa się z niepolarnych, hydrofobowych łańcuchów 

alkilowych (np. nC18, nC8), propylonitrylowych bądź arylowych lub diarylowych, a także innych (np. C32, 

izo- lub fluoro-alkanów, o określonych strukturach molekuł), związanych wiązaniami kowalencyjnymi 

z powierzchnią nośnika (np. na drodze reakcji grup –OH na powierzchni żelu krzemionkowego z 

utworzeniem wiązań siloksanowych z C18, albo z innymi grupami funkcyjnymi o charakterze hydrofobowym). 

Fazę ruchomą zwykle stanowi mieszanina wody i składnika organicznego (najczęściej acetonitrylu (ACN) 

bądź metanolu (MeOH)). 

W celu optymalizacji warunków rozdzielania mieszanin o złożonym składzie (np. próbki ekstraktów 

roślinnych) wykorzystuje się różnego typu modyfikacje układów ch romatograficznych. 

Ma to na celu zwiększenie efektywności procesu rozdzielania, a w konsekwencji uzyskanie składników 

mieszaniny o jak najwyższej czystości. W układzie faz odwróconych najłatwiejszą do wykonania, 

a zarazem dającą znaczące rezultaty, jest modyfikacja fazy ruchomej polegająca na wprowadzeniu 

dodatków w ilości nie większej niż kilka procent objętościowych. Jednocześnie, nie powodującej szkodliwego 

działania na fazę stacjonarną. W tabeli nr 1 zestawiono najczęściej wykorzystywane przykłady 

modyfikatorów oraz opisano ich rolę. 

Tabela 1. Zestawienie dodatków do eluentów, wykorzystywanych w chromatografii cieczowej 

w układach faz odwróconych (RP). 

Table 1. Summary of additives to the eluents, used in reversed phase (RP) liquid chromatography. 

Lp. Rodzaj dodatku do 

eluentu 

Przykłady Funkcje 

Lit. 

(Type of eluent 

additive) 

1. Kw asy/zasady 

organiczne lub 

nieorganiczne 

(Organic or inorganic 

acids/bases) 

(Examples) 

CH 3COOH, TFA, 

DMA, TMA, MEA, 

H 2SO 4, RSO 2 - H + 

(Functions) 

- stosowane w celu “cofnięcia” dysocjacji elektrolitycznej 

(odpow iednio kwasowej, zasadowej) substancji 

rozdzielanych 

(applied to „withdraw” electrolytic (acid/base) dissociation of 

separated substances) 

(Ref.) 

[7, 8] 

2. Kompleksony 

(Complexing agents) 

3. Środki 

pow ierzchniowoczynne 

(Surfactants) 

EDTA 

SDS, SLS 

- solw atacja sprotonowanych grup funkcyjnych (przez aniony 

posiadające hydrofobowe fragmenty cząsteczek) dla 

zw iększenia oddziaływań hydrofobowych z powierzchnią 

sorpcyjną 

(solvation of protonated functional groups (via anions with 

hydrophobic moieties) to increase the hydrophobic 

interaction with sorption surface) 

- stosowane w celu kompleksow ania jonów metali ciężkich, 

a także zmniejszenia heterogeniczności powierzchni 

sorpcyjnej 

(used for the complexation of heavy metals ions and to 

reduce the heterogeneity of the sorption surface) 

- micellizacja (tw orzenie micelli „normalnych” bądź 

odw róconych”) 

(micellisation – the formation of “normal” or “reversed” 

micelles) 

[9] 

[10] 

4. Sole 

(Salts) 

RSO 3 - Me + , RSO 3 - H + , 

R’R 3N + OH - , ’R 3N + X - 

- tw orzenie par jonowych z jonami próbki, w celu utw orzenie 

neutralnych par jonow ych 

(the formation of Ion pairs with ions contained in the sample, 

in order to create a neutral ion pairs) 

* TFA – kwas trifluorooctowy (ang. Trifluoroacetic acid); DMA – dimetyloamina (ang. Dimethyloamine); TMA – trimetyloamina (ang. 

Trimethyloamine); MEA – monoetanoloamina (ang. Monoethanolamine); R – symbol niepolarnej, hydrofobowej grupy funkcyjnej 

(ang. symbol of the non-polar, hydrophobic functional group); EDTA – kwas wersenowy (ang. Ethylenediaminetetraacetic acid); SDS 

– siarczan dodecylu sodu (ang. Sodium dodecyl sulfate); SLS – siarczan laurylu sodu (ang. Sodium laureth sulfate); Me + – kation 

metalu (ang. metal cation); X - – anion niemetalu (ang. non-metal anion). 

[11] 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

28 

Do rozdzielania substancji o charakterze kwaśnym, jak ma to miejsce, np. w przypadku polifenoli, 

korzystne jest stosowanie kwasów, jako dodatku do fazy ruchomej, w celu obniżenia pH eluentu, tak by 

spełniony był następujący warunek pH < (pK a – 0,5 ÷ 1), jednakże przy zachowaniu wartości bezpiecznej dla 

fazy stacjonarnej – tzn. niepowodującej hydrolizy wiązań siloksanowych. W praktyce, za optymalną wartość 

uznaje się pH ≥ 2. Obniżenie wartości pH eluentu stosowanego do rozdzielania lub analizy związków 

chemicznych będących słabymi kwasami powoduje cofnięcie dysocjacji elektrolitycznej a w konsekwencji 

wzrost hydrofobowości i siły oddziaływań z fazą stacjonarną. W poniższej tabeli przedstawiono opisane w 

literaturze naukowej, przykładowe warunki chromatograficzne, stosowane do rozdzielania flawonoidów 

obecnych w ekstraktach roślinnych techniką RP -HPLC z wykorzystaniem różnych rodzajów kwasów jako 

modyfikator fazy ruchomej. 

Tabela 2. Zestawienie przykładowych warunków rozdzielania flawonoidów techniką RP-HPLC. 

Table 2. Summary of examples of chromatographic conditions for flavanoids separation using RP -HPLC. 

Ekstrahowany 

materiał 

Przygotowanie 

próbki/warunki 

Warunki chromatograficzne Przykład oznaczanych 

polifenoli 

Lit. 

ekstrakcji 

(Extracted 

material) 

Cynara 

cardunculus 

Oliwa z oliwek 

(Olive oil) 

Ilex 

paraguariens 

Zielona herbata 

(Green tea) 

(Sample 

preparation/extraction 

conditions) 

Ekstrakcja liści w 70% 

EtOH z dodatkiem kw asu 

mrów kowego (pH = 3,2) 

(Extraction of leaves with 

70% EtOH and addition of 

formic acid, pH = 3,2) 

Ekstrakcja SPE, C 8, 

rozpuszczalniki (w 

kolejności użycia): 

n-heksan (elucja 

składników 

niepolarnych), 

acetonitryl, metanol 

oraz mieszanina 

metanol-w oda (1:1 

v/v) (wymywanie 

kolejnych frakcji 

składników 

polarnych) 

(Extraction SPE, C 8; 

solvents, respectively, in 

the order: 

n-hexane (in order to 

remove the non-polar 

fraction) 

acetonitrile, 

methanol, methanolwater 

1:1 v/v) (in 

order to gradually 

remove polar 

fractions) 

Ekstrakcja z 

w ykorzystaniem gorącej 

w ody 

(Extraction by the using a 

hot water) 

Ekstrakcja z 

w ykorzystaniem gorącej 

w ody 


hot water) 

(Chromatographic 

conditions) 

Eluent A: H 2O (z dodatkiem 

HCOOH do pH = 3,2) 

Eluent B: CH 3CN 

Elucja gradientow a: 

30 min: gradient liniow y od 0 do 

100% B 

Kolumna: C 18 

Temperatura: 27˚C 

V = 0,6 ml/min 

Detekcja: DAD 

Eluent A: H 2O/CH 3COOH 

(98:2 v/v)/ 

Eluent B: CH 3OH/ CH 3CN (1:1 v/v) 


25 min: 95 – 70% A 

10 min: 70 – 60% A 

5 min: 60 – 52% A 

10 min: 52 – 30% A 

5 min: 30 – 0% A 

10 min: 0 – 95% A 

5 min: 95% A 

Kolumna: C 18 



Detekcja: DAD 

Eluent A: H 2O/CH 3COOH (98:2 v/v) 

Eluent B: CH 3OH/CH 3COOH 

(98:2 v/v) 


30 min: 15 – 40% B 

10 min: 40 – 75% B 

5 min: 75 – 85% B 

Kolumna: IB-SIL RP C 18 

Temperatura: (nie podano) 


Detekcja: DAD 

Eluent: H 2O/CH 3OH (70:30 v/v) + 

0,1% CH 3COOH 

Kolumna: SB-C 18 

Temperatura: (nie podano) 

V = 1 ml/min 

Detekcja: DAD 

(Example of analyzed 

polyphenols) 

Luteolina O-lukozyd; 

Luteolina 

7-O-malonylglukozyd; 

Apigenina 

7-O-rutynozyd; 

Kw as 

3,4-dihydroksyfenylooctowy; 

Tyrosol; 

Oleuropeina; 

Rutyna; 

Pochodne kaw oilo; 

Procyjanidy; 

Epikatechina; 

Katechina; 

(Ref.) 

[12] 

[13] 

[14] 

[15] 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

29 

Ekstrahowany 

materiał 

Przygotowanie 

próbki/warunki 

ekstrakcji 

Warunki chromatograficzne 

Przykład oznaczanych 

polifenoli 

Lit. 

(Extracted 

material) 

Suplementy 

diety 

zawierające 

polifenole 

(Dietary 

supplements 

containing 

polyphenols) 

Suplementy 

diety 

zawierające 

polifenole 

(Dietary 

supplements 

containing 

polyphenols) 

(Sample 

preparation/extraction 

conditions) 

Ekstrakcja z 

w ykorzystaniem metanolu 


methanol) 

Ekstrakcja z 

w ykorzystaniem metanolu 


methanol) 

(Chromatographic 

conditions) 

Eluent A: H 2O/CF 3COOH 

(99,95:0,05 v/v) 

Eluent B: CH 3CN 


0,5 min: 95 – 80% A 

1,5 min: 80 – 60% A 

1,5 min: 60 – 10% A 

Kolumna: C 18 


V = 1 ml/min (t = 0 min); 0,5 ml/min 

(t = 0,5 min); 0,4 ml/min ( t= 2 min); 

0,9 ml/min (t=3,5 min) 

Detekcja: DAD 

Eluent A: CH 3CN 

Eluent B: H 2O/CF 3COOH 

(99,95:0,05 v/v) 


0,5 min: 8 – 13% A 

0,5 min: 13 % A 

1 min: 13 – 25% A 

0,5 min: 25 – 35% A 

0,5 min: 35% A 

1 min: 35 – 70% A 

1,5 min: 70 – 80% A 

0,5 min: 80 – 8% A 

Kolumna: RP-18e 


V = 1,3 ml/min (t = 0-1 min); 1,2 

ml/min (t = 1-3 min); 1,3 ml/min (3- 

4,5 min); 1,2 ml/min (4,5-5 min) 

Detekcja: DAD 

(Example of analyzed 

polyphenols) 

Rutyna; 

Kw ercetyna; 

Hesperydyna; 

Rutyna; 

Kw ercetyna; 

Hesperydyna; 

Neohesperydyna; 

Katechiny; 

(Ref.) 

[16] 

[17] 

Na podstawie zestawionych w tabeli nr 2 przykładów przytoczonych z literatury naukowej, można 

zauważyć, że istnieje wiele możliwości optymalizacji warunków rozdzielania chromatograficznego, tak aby 

wyizolować związki chemiczne z grupy polifenoli z materiał u roślinnego. Dotychczasowe rezultaty badań 

dotyczących rozdzielania mieszanin polifenoli [12-17] sugerują, że korzystniejsze jest użycie acetonitrylu 

który charakteryzuje się większą siłą elucji niż metanol co ma wpływ szczególnie na współczynnik retencji 

[16]. Zaobserwowano m.in. znaczące skrócenie czasu retencji składników mieszanin. Rezultaty innych 

badań dowodzą, że użycie dodatku do fazy ruchomej w postaci buforów może powodować rozkład 

izoflawonów o charakterze estrowym, dlatego tak istotne jest, by w tego typu rozdzieleniach zapewnić 

kwaśne środowisko fazy ruchomej [18]. Magiera i współpracownicy udowodnili również że wzrost pH od ok. 

3 do 6 powodował zwiększenie stopnia rozmycia pików chromatograficznych, natomiast dla pH = 2,5÷3 

uzyskali oczekiwany poziom rozdzielenia składników [16,17]. W większości przypadków zastosowań techniki 

RP, znacznie bardziej korzystne jest stosowanie elucji gradientowej, pozwalającej na uzyskanie 

wymaganego stopnia rozdzielenia oraz wyższej czułości. Tego typu rozdzielani a są zazwyczaj preferowane, 

gdy obecne w mieszaninie substancje charakteryzują się istotnymi różnicami w hydrofobowości. 

Jednakże do zastosowań na większą skalę (semi-preparatywną, preparatywną), realizacja rozdzielania w 

programie elucji gradientowej jest niekorzystna i może to powodować utrudnienia związane z realizacją 

procesu, głównie poprzez konieczność ścisłej kontroli składu eluentu oraz stosowanie dodatkowej aparatury. 

Należy nadmienić także, że w przypadku elucji gradientowej, proces recyrkulacji eluentu, a także regeneracji 

złoża kolumny jest znacznie bardziej utrudniony, niż w przypadku elucji izokratycznej, co także wywiera 

istotny wpływ na możliwość wykorzystania na skalę procesową. Ze względu na powyższe, w pracy 

badawczej przeprowadzono rozdzielania jedynie w warunkach izokratycznych z zastosowaniem ACN, jako 

organicznego składnika eluentu. Rozwiązanie to umożliwiło także na dokonanie jednoznacznej oceny 

wpływu dodatku kwasu na retencję składników (przy niezmiennej sile elucyjnej fazy ruchomej). 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

30 

2. Część doświadczalna 

(Experimental) 

2.1. Aparatura i odczynniki 

(Apparatus and reagents) 

W celu zbadania wpływu rodzaju kwasu na retencję polifenoli, wykorzystano chromatograf cieczowy 

LaChrom (Merck – Hitachi, Niemcy) z czterokanałowym systemem elucji gradientowej z zaworami 

proporcjonującymi; pompę L-7100 oraz zawór dozujący Rheodyne Rh-7725i z pętlą dozującą o objętości 20 

μl; detektor: UV-VIS DAD L-300 z rejestracja w zakresie długości fali promieniowania: 200÷360 nm oraz 

kolumny chromatograficzne: LiChrospher RP18 5 µm, 250x4 mm (Merck, Niemcy), LiChrospher RP18e 

5 µm, 250x4 mm (Merck, Niemcy). Próbki wzorców rozpuszczano w acetonitrylu oraz filt rowano 

z wykorzystaniem filtrów strzykawkowych (0,45 µm, Millipore). Próbki dozowano strzykawką o objętości 

całkowitej 100 µl (Hamilton, USA). 

Substancje wzorcowe: kwercetyna (Sigma Aldrich), mirycetyna (Sigma Aldrich). 

Pozostałe odczynniki: acetonitryl o czystości gradient grade (Merck, Niemcy), woda dejonizowana 

(otrzymana za pomocą aparatu Mili Q, Milipore, USA), kwas solny cz.d.a. (POCH, Polska), kwas 

trifluorooctowy o czystości gradient grade (Merck, Niemcy), kwas siarkowy cz.d.a. (P.P.H. Standard, P olska), 

kwas octowy cz.d.a. (POCH, Polska). 

2.2. Metodyka badań 

(Research) 

Każdorazowo pobierano ok. 50 µl roztworu kwercetyny (stężenie ok. 1,8 mg/ml w acetonitrylu (ACN) 

lub mirycetyny (ok.2 mg/ml w AcCN). Wprowadzono do pętli zaworu dozującego o objętości: 20 μl. Objętość 

dozowania wynosiła więc wówczas 20 µl. 

Objętość dozowania Vi, w przypadku wysokosprawnej chromatografii cieczowej w skali analitycznej, 

powinna być jak najmniejsza. Zawsze powinna być mniejsza od wartości wyrażenia: ((Vc/N)1/2), gdzie: 

Vc - objętość wypełnienia kolumny, a N - liczba półek teoretycznych kolumny. Dla kolumny o długości 

wypełnienia, Lc=250 mm i jego średnicy dc = 4 mm, gdy liczna półek teoretycznych kolumny N, to ok. 5000, 

wynosi ok. 43 μL. W praktyce objętość dozowania powinna, więc, mieścić się w granicach od 5 do 40 μl. 

W przypadku niniejszych badań, wynosiła 20 μl, co jest zgodne z podaną wyżej zasadą. 

Rejestrację widm prowadzono w zakresie promieniowania o długościach fali: od 200 do 560 nm, 

z zastosowaniem detektora UV -DAD L-300. Chromatogramy uwzględnione w tej pracy wykonano dla takich 

długości fali, by zapewnić liniowy zakres odpowiedzi detektora. 

Dokładne dane w Tabeli 3. 

Tabela 3. Zestawienie warunków rozdzielania chromatograficznego. 

Table 3. Summary of chromatographic separation conditions. 

1 Substancje 

wzorcowe 

a) 

b) 

Kwercetyna (ang. Quercetin) , C = 1,8 mg/ml 

Mirycetyna (ang. Myricetin), C = 2 mg/ml 

(Reference 

substances) 

2 Skład eluentów 

(Composition of 

eluents) 

3 Kolumna 

Chromatograficzna 

(Column) 

4 Natężenie 

przepływu eluentu 

(Eluent flow rate) 

5 Detekcja 

Mieszanina ACN/H2O 3:7 (v/v) zakwaszana do pH = 3: 

Mixture of ACN//H2O 3:7 (v/v), pH adjusted to 3, with: 

a) CH3COOH (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), 

b) H3PO4 (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), 

c) TFA (0,5 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), 

d) HCl (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), 

e) H2SO4 (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), 

a) LiChrospher RP18e 5 µm, 250x4 mm, t0 = 1,98 min, 

b) LiChrospher RP18 µm, 250x4 mm, t0 = 1,98 min. 

1 ml/min 

UV – VIS DAD 

(Detection) 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

31 

Zastosowano elucję izokratyczną z fazą ruchomą, w postaci mieszaniny dwuskładnikowej (3:7 v/v): 

acetonitrylu oraz wody z dodatkiem kwasu: octowego, ortofosforowego, trifluorooctowego (TFA), solnego 

bądź siarkowego. 

Objętość dodatku kwasu wyznaczono doświadczalnie z wykorzystaniem pH-metru, tak by pH czystego 

roztworu wodnego wynosiło 3. W tym celu do 1 dm 3 wody dodawano porcjami znaną objętość kwasu, 

kontrolując by pH nie przekraczało wymaganej wartości. Następnie sporządzono roztwory eluentów 

ACN/H2O (3:7 v/v) z dodatkiem analogicznej do wyznaczonej ilości dodatku danego kwasu na 1 dm 3 

mieszaniny (tabela 3). Rozdzielanie wykonano w temperaturze pokojowej (20˚C). Natężenie przepływu 

eluentu ustawiono na 1 ml/min 

3. Wyniki i dyskusja 

(Results and discussion) 

Analiza wpływu dodatku różnych kwasów do fazy ruchomej na parametry rozdzielania 

chromatograficznego, została przeprowadzona z użyciem dwóch naturalnie występujących w materiale 

roślinnym polifenoli z grupy flawonoidów: kwercytyny oraz miry cetyny. Związki te posiadają właściwości 

słabych kwasów (pKa ≈ 6,5) [19], szczególnie ze względu na obecność hydroksylowych grup funkcyjnych 

obecnych w ich strukturze. W przypadku tego typu związków chemicznych dodatek kwasu do eluentu ma 

wpływ na cofnięcie ich dysocjacji elektrolitycznej, a tym samym na wzrost ich hydrofobowość [20]. Równanie 

1, przedstawia schematyczną reakcję dysocjacji kwasu w środowisku wodnym: 

(1) 

gdzie: 

H x A – kwas, 

H 3 O + – jon hydroniowy, 

A x- – anion reszty kwasowej. 

W przypadku słabych kwasów, dysocjacja zachodzi jedynie w pewnym, ograniczonym stopniu. W tego 

typu roztworach ustala się równowaga między częścią zdysocjowaną a niezdysocjowaną, co oznacza, że 

liczba zdysocjowanych cząsteczek jest identyczna jak liczba cząsteczek powstałych w wyniku połączenia się 

jonów. Stosunek stężeń powyższych indywiduów chemicznych pozwala na wyznaczenie stałej dysocjacji 

(K a ), wyrażonej równaniem nr 2: 

(2) 

gdzie: 

[ ] – stężenie poszczególnych indywiduów chemicznych (cząsteczki/jony), [mol/dm 3 ] 

Alternatywnie do wartości K a , można posługiwać się parametrem pK a , określającym w sposób 

ilościowy moc kwasu. Zależność stałą dysocjacji, a mocą kwasu przedstawia równanie (3): 

, (3) 

natomiast pH wyrażane jest jako zależność: 

Jeśli do roztworu słabego kwasu, znajdującego się w równowadze określonej wzorem (2) zostaną 

wprowadzone w jony hydroniowe (obniżenie pH roztworu mocnym kwasem), wówczas pierwotnie ustalona 

równowaga zostanie zakłócona, i w konsekwencji nastąpi cofnięcie dysocjacji – wzrost stężenia 

niezdysocjowanego kwasu oraz spadek stężenia jonów. Wynika to z nadmiaru jonów [H 3 O + ] w roztworze w 

stosunku do jonów [A x- ] i ponownego łączenia się wyżej wspomnianych jonów w cząsteczki. Efekt ten ma 

znaczenie zwłaszcza podczas realizacji rozdzielania w odwróconym układzie faz, gdzie mamy do czynienia 

z oddziaływaniami sorpcyjnymi rozdzielanych substancji z hydrofobowymi fragmentami f azy stacjonarnej 

[21, 22]. Rozdzielanie w układzie RP substancji, które w zastosowanych warunkach chromatograficznych 

ulegają dysocjacji, powoduje że są one eluowane z objętością martwą kolumny. 

Analogiczne zjawisko wykorzystywane jest w niniejszych badaniach. Obniżenie pH eluentu. 

Wybrane do badań kwasy różnią się pod względem siły oraz hydrofobowości. Największą 

hydrofobowością spośród zastosowanych kwasów charakteryzują się kwasy: TFA oraz octowy. Natomiast 

pod względem kwasowości, szereg ten przedstawia się następująco: kwas solny (najsilniejszy kwas, 

pKa = -8,0) > kwas siarkowy (pKa = -3,0) > TFA (pKa = 0,52) > kwas ortofosforowy (pKa = 2,12) > kwas 

octowy (pKa = 4,76). Wszystkie z wybranych kwasów spełniają wymagany warunek, mianowicie pK a kwasu, 

(4) 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

32 

stanowiącego dodatek do eluentu musi posiadać niższą wartość, niż rozdzielane składniki – w powyższych 

badaniach wybrane flawonoidy. Powoduje to gwarancję cofnięcia dysocjacji elektrolitycznej analitów. 

Chromatogramy z przeprowadzonych badań przedstawione są na rysunkach 3 i 4. Celem 

jednoznacznego oraz dokładnego ukazania wpływu rodzaju kwasu, jako dodatku do eluentów na 

poszczególne związki z grupy flawonoidów, analizie chromatograficznej poddano pojedyncze wzorce. 

Umożliwiło to także określenie kolejności elucji powyższych (analiza jakościowa) oraz wyznaczenie wartości 

głównych parametrów chromatograficznych. Wszystkie analizy roztworu wzorców flawonoidów, wykonano 

przynajmniej dwukrotnie, dla każdego z eluentów, a przedstawione wyniki są wartościami ś rednimi co 

najmniej dwóch rezultatów, dla których wartości błędu względnego nie przekraczają pięciu procent. 

a) 

b) 

0,16 

0,14 

0,12 

0,10 

0.08 

0,06 

0,04 

0,02 

0,00 

c) 

0,18 

0,16 

0,14 

0,12 

0,10 

0.08 

0,06 

0,04 

0,02 

0,00 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

33 

d) 

e) 

Rys. 3. Chromatogramy, otrzymane z zastosowaniem detektora UV-VIS DAD, roztworu wzorca kwercetyny 

w acetonitrylu, o stężeniu 1,8 mg / ml ACN. Dozowano 20 µl roztworu wzorca. Kolumna: LiChrospher RP18e, 

250 x 4 mm, 5 µm; Eluent: acetonitryl : woda (3:7 v/v) z dodatkiem kwasu: a) CH 3COOH, 

b) TFA, c) HCl, d) H3PO4, e) H2SO4; pH =3; przepływ 1 ml/min, długość fali 365 nm. 

Fig. 3 Chromatograms (DAD, λ = 365 nm) obtained for the standard solution of quercetin in acetonitrile (C = 1,8 mg/ml 

ACN). Sample injection volume: 20 μl. Column: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 μm. Eluent: acetonitrile:water 

(3:7 v/v) with addition of: a) CH3COOH, b) TFA, c) HCl, d) H3PO4, e) H2SO4; pH = 3; flow rate: 1 ml/min. 

a) 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

34 

b) 

0,12 

0,10 

0,08 

0,06 

0.04 

0,02 

0,00 

c) 

0,10 

0,08 

0,06 

0.04 

0,02 

0,00 

d) 

e) 

Vol. 7, No 1/2015 

Rys. 4. Chromatogramy, otrzymane 

z zastosowaniem detektora UV-VIS DAD, roztworu 

wzorca mirycetyny w acetonitrylu, o stężeniu 2 mg / 

ml ACN. Dozowano 20 µl roztworu wzorca. 

Kolumna: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 µm; 

Eluent: acetonitryl : woda (3:7 v/v) z dodatkiem 

kwasu: a) CH 3COOH, b) TFA, c) HCl, d) H 3PO 4, 

e) H 2SO 4, pH w roztworze wodnym = 3, przepływ 

1 ml/min, długość fali 370 nm. 

Fig. 4 Chromatograms (DAD, λ = 370 nm) obtained 

for the standard solution of myricetin in acetonitrile 

(C = 2 mg/ml ACN). Sample injection volume: 20 μl. 

Column: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 μm. 

Eluent: acetonitrile:water (3:7 v/v) with addition of: 

a) CH3COOH, b) TFA, c) HCl , d) H3PO4, e) H2SO4; 

pH = 3; flow rate: 1 ml/min. 

Camera Separatoria

35 

Na podstawie uzyskanych w trakcie badań chromatogramów dla kwercetyny i mirycetyny wyliczone 

zostały parametry chromatograficzne właściwe dla poszczególnych składników mieszaniny wzorców [23]. 

Wyznaczenie m.in. współczynnika retencji (k), czy liczby pólek teoretycznych (N) dla różnych eluentów, przy 

zastosowaniu tej samej kolumny stanowi „materiał odniesienia” i pozwala na określenie najlepszych z pośród 

przeanalizowanych warunków rozdzielania. Liczbę pólek teoretycznych wyznaczono na podstawie 

szerokości połówkowej pików (4), ze względu na bardziej dokładne wyznaczanie jej wartości. 

, (4) 

gdzie: 

t r – czas retencji (czas mierzony od momentu zadozowania próbki do maksimum piku na 

chromatogramie), [min] 

w 0,5 – szerokość połówkowa piku, [min]. 

Jest to konsekwencją asymetryczności otrzymanych doświadczalnie pików – pik symetryczny, 

charakteryzuje się współczynnikiem symetryczności wynoszącym 0,95 – 1. Liczba półek teoretycznych 

wyznaczana przy pomocy szerokości piku u jego podstawy daje najbardziej dokładne wartości, w przypadku 

pików o kształcie gaussowskim. Jako czas retencji substancji niezatrzymywanej (tzw. czas martwy kolumny), 

do obliczeń przyjęto wartość wyznaczoną doświadczanie (na podstawie chromatogramu wykonanego z 

użyciem trasera – azotanu sodu), równą: t 0 = 1,98 min. Wartość ta dla każdego z dodatków eluentu jest taka 

sama. Wynika to z mechanizmów sorpcji w układzie faz odwróconych – substancje nie wykazujące 

oddziały wań z fazą stacjonarną, tj. sole nieorganiczne nie są zatrzymywane, ze względu na brak 

jakichkolwiek oddziaływań z fazą stacjonarną (jedynie wnikają we wszystkie pory wypełnienia kolumny). 

W tabeli 4 i 5 zestawiono otrzymane wyniki. 

Tabela 4. Zestawienie wyznaczonych parametrów chromatograficznych, uzyskanych w wyniku analizy 

chromatograficznej (RP HPLC) próbki kwercetyny, z zastosowaniem różnych kwasów, jako dodatków do 

eluentu. 

Table 4. Summary of the derived chromatographic parameters, obtained by the analysis of samples of 

quercetin, using different acids as additives to the eluent. 

Lp. 

Rodzaj 

kwasu 

Liczba półek 

teoretycznych, 

N [-] 

Współczynnik 

asymetrii, 

As0,5 [-] 


asymetrii, As0,1 

[-] 

Czas retencji, 

tr [min] 


retencji, k [-]* 

(Type of 

acid) 

(Number of 

theoretical 

plates, N [-]) 

(Asymmetry 

factor, As0,5 [-]) 

(Asymmetry 

factor, As0,1 [-]) 

(Retention 

time, tr [min]) 

1 H 3PO 4 

13223 1,00 2,00 9,09 

3,59 

9,04 

10975 1,00 1,57 8,98 3,53 

2 HCl 

6212 1,20 1,86 9,31 

3,70 

9,29 

6113 0,80 1,86 9,26 3,68 

3 H2SO4 

13495 1,00 1,60 9,15 

3,62 

9,15 

13296 1,00 1,43 9,15 3,62 

4 CH3COOH 

7158 1,50 2,00 10,30 

4,20 

10,30 

7180 1,50 1,75 10,29 4,19 

5 TFA 

5025 1,50 2,20 9,18 

3,64 

9,21 

5191 1,50 1,86 9,23 3,66 

* wartość czasu retencji substancji niezatrzymywanej: t0 = 1,98 min 

(Retention 

factor, k [-]) 

3,56 

3,69 

3,62 

4,20 

3,65 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

36 

Tabela 5. Zestawienie wyznaczonych parametrów chromatograficznych, uzyskanych w wyniku analizy 

chromatograficznej (RP HPLC) próbki kwercetyny, z zastosowaniem różnych kwasów, jako dodatków do 

eluentu 

Table 5. Summary of the derived chromatographic parameters, obtained by the analysis of samples of 

myricetin, using different acids as additives to the eluent. 

Lp. 

Rodzaj 

kwasu 



N [-] 


asymetrii 

As 0,5 [-] 


asymetrii, 

As 0,1 [-] 

Czas retencji, 

tr [min] 


retencji, k [-]* 

(Type of 

acid) 

(Number of 

theoretical 


(Asymmetry 

factor, 

As0,5 [-]) 

(Asymmetry 

factor, 

As0,1 [-]) 

(Retention 

time, tr [min]) 

1 H3PO4 

6872 1,50 2,00 5,04 

1,55 

5,03 

7740 1,50 2,16 5,02 1,53 

2 HCl 

4198 1,33 2,20 5,25 

1,65 

5,21 

4143 0,90 1,66 5,16 1,60 

3 H 2SO 4 

11620 1,00 1,60 5,08 

1,57 

5,08 

10817 0,99 1,50 5,08 1,57 

4 CH3COOH 

6343 1,50 1,85 5,65 

1,85 

5,64 

5944 1,50 2,00 5,63 1,84 

5 TFA 

4193 1,00 2,50 5,18 

1,61 

5,20 

4535 2,00 2,20 5,21 1,63 

* wartość czasu retencji substancji niezatrzymywanej: t0 = 1,98 min 

(Retention 


Z otrzymanych wyników badań dotyczących określenia wpływu zastosowania różnych rodzajów 

kwaśnego modyfikatora na parametry chromatograficzne (tabele 4 i 5) można zauważyć, 

że najkorzystniejszy wpływ na sprawność rozdzielania ma obecność tlenowych kwasów nieorganicznych 

w fazie ruchomej. Dla kwasu siarkowego oraz ortofosforowego otrzymano następujące wartości: 

(kwercetyna: N H2SO4 = 13495; N H3PO4 = 13223 oraz mirycetyna: N H2SO4 = 11620; N H3PO4 = 7740). 

W przypadku pozostałych kwasów, na chromatogramach widoczne jest niewielkie przesunięcie w 

wartościach czasów retencji analitów oraz różnice w szerokościach połówkowych, co wpływa na 

rozbieżności wyznaczonych liczb półek teoretycznych (rys. 3 i 4). Identyczna zależność obserwowana jest 

także ze względu na wartość współczynnika asymetrii pików. Najlepszą symetrię pików pochodzących od 

analizowanych związków uzyskano dla kwasów nieorganicznych zwłaszcza dla kwasu siarkowego i solnego, 

np. dla kwasu siarkowego, współczynnik As 0,5 piku właściwego dla kwercetyny oraz mirycetyny wynosi 1. 

Obecność w eluencie kwasów organicznych skutkuje wzrostem czasu retencji w porównaniu do kwasów 

nieorganicznych. Te rezultaty są efektem zastosowania powszechnie używanego, zwłaszcza 

w chromatografii białek i peptydów, kwasu trifluorooctowego [24]. Wynika to z tworzenia, tzw. par jonowych 

dzięki dodatkowi TFA, a w konsekwencji minimalizowania ładunku zdysocjowanych grup funkcyjnych 

peptydu i zwiększenia jego hydrofobowości [24-26]. W przypadku rozdzielenia i analizy polifenoli 

charakteryzuje się jednak znacznie mniejszą sprawnością i gorszą symetrią pików zwłaszcza w porównaniu 

do kwasu siarkowego i ortofosforowego (tabele 4 i 5). Jedynie zastosowanie kwasu solnego daje podobny 

efekt jak dla TFA w postaci liczby półek teoretycznych, jednakże w przypadku HCl uzyskiwane są piki 

o większej symetrii. 

W celu sprawdzenia zasadności użycia kwasu jako dodatku do eluentu przy rozdzielaniu związków 

będących słabymi kwasami wykonano analizę chromatograficzną mieszanin dwóch polifenoli w identycznych 

warunkach, z tą tylko różnicą, że dla pierwszego przypadku eluent nie zawierał dodatku, a drugim obecny 

był kwas siarkowy (jako dodatek z użyciem którego uzyskano najlepsze wartości parametrów 

chromatograficznych). Dodatkowo, zastosowano inny rodzaj kolumny chromatograficznej, mianowicie 

kolumnę C-18 zamiast C-18e, wykorzystywanej we wcześniejszym etapie badań. Zabieg ten miał na celu 

porównanie wartości współczynników retencji oraz asymetrii pików, w zależności od zastosowanej kolumny 

chromatograficznej (tabele 4-6). Rezultaty w postaci chromatogramów przedstawiono na rys. 5. 

1,54 

1,63 

1,57 

1,85 

1,62 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

37 

Rys. 5. Chromatogramy, otrzymane z zastosowaniem detektora UV, roztworu wzorca mirycetyny oraz kwercetyny 

w acetonitrylu. Dozowano 20 µl kwercetyny oraz 10 µl mirycetyny. Kolumna: LiChrospher RP18, 250 x 4 mm, 5 µm; 

Eluent: acetonitryl : woda (3:7 v/v); Chromatogram: a) bez dodatku kwasu do eluentu; b) z dodatkiem kwasu H 2SO4 

(pH w roztworze wodnym = 3) , przepływ 1 ml/min, długość fali 254 nm. 

Fig. 5 Chromatogram (DAD, λ = 254 nm) obtained for standards mixture of myricetin and quercetin in acetonitrile. 

Sample injection volume: 20 μl (quercetin) and 10 μl (myricetin). Column: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 μm. Eluent: 

acetonitrile:water (3:7 v/v) with addition of: a) without acid, b)with H 2SO4 (0,05 %; pH = 3); flow rate: 1 ml/min. 

Porównując chromatogramy przedstawione na rysunku nr 5 można zauważyć niewątpliwy wpływ 

obecności kwasu w fazie ruchomej (w tym przypadku, kwasu siarkowego) na kształt pików 

a w konsekwencji na jakość rozdzielania, w stosunku do warunków w których nie zastosowano żadnego 

modyfikatora eluentu. Obniżenie pH eluentu skutkuje bardzo wyraźną poprawą jakości rozdzielania 

polifenoli. Świadczą o tym również wartości podstawowych parametrów chromatograficznych przedstawione 

w tabeli 6. 

Tabela 6. Zestawienie parametrów chromatograficznych, uzyskanych w wyniku rozdzielania 

chromatograficznego w warunkach RP HPLC próbki kwercetyny oraz mirycetyny, bez oraz z zastosowaniem 

kwasu siarkowego, jako dodatku do eluentu 

Table 6. Summary of the derived chromatographic parameters, obtained b y the analysis of mixture samples 

(myricetin and quercetin), with and without acid as additive to the eluent. 

Dodatek 

kwasu 

(Acid 

additive) 

Brak 

(Without) 

Kwas 

siarkowy 

(Sulphuric 

acid) 

Wzorzec 

(Standard) 

Kwercetyna 

(Quercetin) 

Mirycetyna 

(Myricetin) 

Kwercetyna 

(Quercetin) 

Mirycetyna 

(Myricetin) 



N [-] 

(Number of 

theoretical 



asymetrii 

As0,1[-] 

(Asymmetry 

factor, 

As 0,1[-]) 


asymetrii 

As0,5[-] 

(Asymmetry 

factor, 

As 0,5[-]) 

Czas 

retencji, tr 

[min] 

(Retention 

time, t r 

[min]) 


retencji, k [-] 

(Retention 


23 - - 7,70 2,09 

688 - - 11,63 3,67 

3410 2,61 1,01 5,91 1,37 

2724 2,48 1,20 10,05 3,03 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

38 

Ze względu na znaczne rozmycie pików na chromatogramie uzyskanym z rozdzielania bez dodatku 

modyfikatora do eluentu, nie było możliwe precyzyjne obliczenie parametrów chromatograficznych (rys.5). 

Obecność kwasu siarkowego ma wpływ na poprawę symetrii pików i istotny wzrost liczby półek 

teoretycznych. Skrócenie czasu retencji w obecności kwasu w eluencie jest trudne do wyjaśnienia. 

Wyznaczone współczynniki asymetrii (As 0,1 ) dla składników mieszaniny zawierającej kwercetynę oraz 

mirycetynę (tabela 6) różnią się od wartości uzyskanych dla pojedynczych składników (tabela 4 i 5). Wynika 

to z zastosowania innego rodzaju kolumny, mianowicie kolumny typu RP18 bez „endcappingu” 

i konsekwencji możliwości występowania oddziaływań grup polarnych analiów z powierzchnią wypełnienia. 

Efektem jest „ogonowanie” pików i zwiększenie ich asymetryczności [27]. Dodatkowo, wpływ ma również 

większa objętość próbki wprowadzanej do zaworu dozującego (30 μl). Podobne różnice można także 

zauważyć w przypadku wartości czasu retencji badanych polifenoli, jednak porównując wartości 

współczynników retencji nie widać znaczących zmian. Uzyskane wartości współczynników retencji przy 

zastosowaniu różnych kwasów, jako modyfikatorów, pozwoliły również w sposób pośredni (na podstawie 

zestawienia par odpowiednich chromatogramów pojedynczych wzorców, rys. 3 i 4) wyznaczyć wartoś ci 

współczynników selektywności oraz rozdzielczości dla użytych w badaniach polifenoli. Rodzaj 

zastosowanego kwasu nie ma znaczącego wpływu na wartość tego parametru (tabela nr 7). 

, (5) 

gdzie: 

k 1 – współczynnik rwetencji substancji eluującej wcześniej, [-] 

k 2 – współczynnik retencji substancji eluującej później, [-] 

, (6) 

gdzie: 

t r1 – czas retencji substancji eluującej wcześniej, [min] 

t r2 – czas retencji substancji eluującej później, [min] 

w b1 – szerokość piku nr 1, mierzona u jego podstawy, [min] 

w b2 – szerokość piku nr 2, mierzona u jego podstawy, [min] 

Tabela 7. Zestawienie wyznaczonych wartości współczynników selektywności rozdzielania 

chromatograficznego kwercetyny oraz mirycetyny, w zależności od zastosowanego modyfikatora eluentu. 

Tabele 7. Values of selectivity coefficients, obtained by the analysis of myricetin and quercetin mixture, with 

and without acid as additive to the eluent. 

Lp. 

Rodzaj 

kwasu 

(Type of 

acid) 


selektywności, α [-] 

(Selectivity 

coefficient, α [-]) 

Rozdzielczość pików, 

R [-] 

(Resolution of peaks, 

R [-]) 

1 H3PO4 2,31 2,02 

2 HCl 2,26 3,58 

3 H2SO4 2,31 3,67 

4 CH 3COOH 2,27 3,35 

5 TFA 2,25 3,08 

W tabeli 7 zestawiono także wyliczone parametry rozdzielczości pików, w zależności od rodzaju 

dodatku do eluentów. W każdym z przypadków osiągnięto wymagany stopień rozdzielenia pików: R > 1 [23]. 

Najniższą wartość parametru określającego rozdzielczość pików uzyskano w przypadku zastosowania 

kwasu fosforowego (R = 2,02) jako modyfikatora fazy ruchomej, natomiast najlepszy w przypadku kwasu 

siarkowego (R = 3,67). Dodatek w postaci kwasu solnego gwarantuje zbliżoną wartość parametru 

rozdzielczości do kwasu siarkowego. Jednak, należy ponadto zauważyć, że użycie HCl powoduje 

zmniejszenie liczby półek teoretycznych, N, (tabela 4 i 5). 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

39 

4. Podsumowanie 

(Summary) 

Wyniki przeprowadzonych badań, wskazują, że zastosowanie modyfikatorów fazy ruchomej w postaci 

kwasów przy rozdzielaniu polifenoli z grupy flawonoidów, a także wielu innych organicznych związków 

chemicznych zdolnych do odszczepiania protonów w wodzie, jest konieczne w warunkach faz odwróconych 

(RP). 

Najlepsze wartości parametrów chromatograficznych, które mają wpływ na jakość rozdzielania 

substancji, uzyskano - w przypadku kwasów nieorganicznych - dla kwasu siarkowego (VI). 

Spośród kwasów organicznych kwas octowy (AcOH) okazał się bardziej korzystny od 

trifluorooctowego (TFA). Kwas octowy jest tylko nieco mniej korzystny pod względem wpływu na sprawność 

rozdzielania od kwasu siarkowego, natomiast, jego zaletą jest lotność oraz to, że nie jest to kwas mocny. 

Pomimo najbardziej korzystnych wyników otrzymanych przy zastosowaniu kwasu siarkowego 

(tj. pod względem symetrii pików oraz liczby półek teoretycznych), do wydzielania rozdzielanych polifenoli w 

skali preparatywnej, bardziej praktyczne może być użycie kwasu octowego. Jest on bardziej lotny, co 

umożliwia łatwiejsze usunięcie go z otrzymanych frakcji i jest nie jest mocnym kwasem, co zapewnia brak 

"destrukcyjnego" działania w warunkach podwyższonej zawartości w okresie wzbogacania frakcji eluatu. 

Results of this study indicate that the use of mobile phase modifiers, in the form of acids is necessary, 

when polyphenols (from the group of flavanoids) and many organic compounds capable to cleveage of 

protons in water under reversed phase (RP) conditions are separated. 

In the case of inorganic acids, the best values of chromatographic parameters (affecting the quality of 

the separation) were obtained with sulfuric acid (VI). 

Among the organic acids, the addition of acetic acid (AcOH) proved to be more advantageous than 

trifluoroacetic (TFA). Acetic acid, in comparison to the sulfuric acid, is less preferred in terms of its impact on 

the efficiency of separation. However, its advantage is volatility and the fact, that AcA is not a strong acid. 

Although the most favorable results obtained using sulfuric acid (i.e. symmetry of peaks, number of 

theoretical plates), separation and isolation in preparative scale of polyphenols, may be more practical with 

AcA. As mentioned above, acetic acid is more volatile, which makes it easier to remove from obtained 

fractions. Additionally, acetic acid is not a strong acid, which provides no “destructive” influence under its 

elevated content during enrichment of eluate fractions. 

Literatura 

(References) 

[1] B.A. Graf, P.E. Milbury, J.B. Blumberg, Flavonols, flavones, flavanones, and human health: 

Epidemiological evidence, Journal of Medicinal Food 8 (2005) 281 

[2] D. Chen, S.B. Wan, H. Yang, J. Yuan, T.H. Chan, Q.P. Dou, Chapter 7 – EGCG, green tea 

polyphenols and their synthetic analogs and prodrugs for human cancer prevention and treatment , 

Advances in Clinical Chemistry 53 (2011) 155 

[3] I. Erlud, Review of the flavonoids quercetin, hesperetin, and narigenin. Dietary sources, bioactivities, 

bioavailability, and epidemiology, Nutrition Research 24 (2004) 851 

[4] Y. Liu, P. Wang, F. Chen, Y. Yuan, Y. Zhu, H. Xan, X. Hu, Role of plant polyphenols in acrylamide 

formation and elimination, Food Chemistry 186 (2015) 46 

[5] S. Gouveia, P.C. Castilho, Characterisation of phenolic acid derivatives and flavonoids from different 

morphological parts of Helichrysum obconicum by a RP -HPLC-DAD-(-)-ESI-MS n method, Food 

Chemistry 129 (2011) 333 

[6] D. Romanova, D. Grancai, B. Jozova, P. Bozek, A. Vachalkova, Determination of apigenin in rat 

plasma by high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A 870 (2000) 463 

[7] F.L. Vigni, C. Baschieri, A. Marchetti, M. Cocchi, RP-HPLC and chemometrics for wheat flour protein 

characterization in an industrial bread-making process monitoring context, Food Chemistry 139 (2013) 

553 

[8] F. Khuda, Z. Iqbal, Y. Shah, L. Ahmmad, F. Nasir, A.Z. Khan, Amanullah, N. Shahbaz, Method 

development and validation for simultaneous determination of lumefantrine and its major metabolite, 

desbutyl lumefantrine in human plasma using RP -HPLC/UV detection, Journal of Chromatography B 

944 (2014) 114 

[9] K.R. Naidu, U.N. Kale, M.S. Shingare, Stability indicating RP-HPLC method for simultaneous 

determination of amlodipine and benazepril hydrochloride from their combinationdrug product, Journal 

of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 39 (2005) 147 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

40 

[10] R.I. El-Bagary, M.A. Fouad, M.A. El-Shal, E.H. Tolba, Forced degradation of mometasone furoate and 

development of two RP-HPLC methods for its determination with formoterol fumarate or salicylic acid, 

Arabian Journal of Chemistry (2015) doi:10.1016/j.arabjc.2015.05.005 

[11] M. Gazdag, K. Mihalyfi, S. Gorog, Ion-pair RP-HPLC separation of thymopoietin fragments and related 

peptides, Analytica Chimica Acta 352 (1997) 231 

[12] P. Pinelli, F. Agostini, C. Comino, S. Lanteri, E. Portis, A. Romani, Simultaneous quantification of 

caffeoyl esters and flavonoids in wild and cultivated cardoon leaves, Food Chemistry 105 (2007) 1695 

[13] A. Bendini, M. Bonoli, L. Cerretani, B. Biguzzi, G. Lercker, T.G. Toschi, Liguid-liquid and solid-phase 

extractions of phenols from virgin olive oil and their separation by chromatographic and electrophoretic 

methods, Journal of Chromatography A 985 (2003) 425 

[14] R. Filipa, P. Lopeza, G. Gibertib, J. Coussioa, G. Ferraroa, Phenolic compounds in seven South 

American Ilex species, Fitoterapia 72 (2001) 774 

[15] M. Ding, H. Yang, S. Xiao, Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reve rsed-phase 

column liquid chromatography, Journal of Chromatography A 849 (1999) 637 

[16] S. Magiera, Opracowanie metod oznaczania mieszanin wybranych związków polifenolowych, 

wybranych leków oraz ich metabolitów i ich aplikacje, rozprawa doktorska, Politechnika Rzeszowska, 

Gliwice 2012 

[17] S. Magiera, I. Baranowska, A. Lautenszleger, UPLC-UV method for the determination of flavanoids in 

dietary supplements and for evaluation of their antioxidant activities , of Pharmaceutical and 

Biomedical Analysis 102 (2015) 468 

[18] E. Cienfuegos-Jovellanos, M. del Mar Quinones, B. Muguerza, L. Moulay, M.Miguel, A. Aleixandre, 

Antihypertensive effect of a polyphenol- rich cocoa powder industrially processed to preserve the 

original flavonoids of the cocoa beans, Journal of Agricultural Food Chemistry 57 (2009) 6156 

[19] S. Zheng, Z. Ma, H. Han, J. Ye, R. Wang, S. Cai, H. Zhou, L. Yu, S. Zeng, H. Jiang, Post-column 

mobile phase adjustment: A strategy to eliminate the contradiction between liquid chromatography and 

mass spectrometry in the determination of flavonoids in rat plasma, Journal of Pharmaceutical and 

Biomedical Analysis 95 (2014) 176 

[20] A. Skrzypczak, M. Jaszczołt, A. Królicka, M. Kamiński, Techniki i metody chromatografii cieczowej w 

rozdzielaniu, oznaczaniu oraz izolowaniu nafto chinonów i flawonoidów z roślin, Camera Separatoria 

3 (2011) 253 

[21] M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, Opracowanie 

optymalnych warunków rozdzielania i identyfikacji metabolitów roślin z rodzaju droseraceae, 

z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej, Camera Separatoria 

3 (2011) 283 

[22] M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, Badania nad 

doborem najkorzystniejszego składu eluentu do rozdzielania metabolitów wtórnych z grupy 

naftochinonów i flawonoidów z zastosowaniem chromatografii planarnej w normalnym i odwróconym 

układzie faz, Camera Separatoria 3(2011) 14 

[23] M. Kamiński, Chromatografia Cieczowa (praca zbiorowa), Centrum Doskonałości Analityki 

i Monitoringu Środowiskowego, Gdańsk 2004 

[24] M. Shibue, C.T. Mant, R.S. Hodges, Effect of anionic ion-paring reagent concentration (1-60 mM) on 

reversed-phase liquid chromatography elution behavior of peptides, Journal of Chromatography A 

1080 (2005) 58 

[25] Y. Chen, A.R. Mehok, C.T. Mant, R.S. Hodges, Optimum concentration of trifluoroacetic acid for 

reversed-phase liquid chromatography of peptides revisited, Journal of Chromatography A, 1043 

(2004) 9 

[26] D.C. Guo, C.T. Mant, R.S. Hodges, Effects of ion-pairing reagents on the prediction of peptide 

retention in reversed-phase high-resolution liquid chromatography, Journal of Chromatography A 386 

(1987) 205 

[27] P. Novotna, V. Pacáková, Z. Bosáková, K. Štulìk, High-performance liquid chromatographic 

determination of some anthraquinone and naphthoquinone dyes occurring in historical textiles , Journal 

of Chromatography A, 863 (1999) 235 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria



Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD* 

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych, 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach 

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce. 

*Autor do korespondencji, e-mail: bkg@onet.eu 


całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Część I. Dobór warunków 

chromatograficznych. 

Streszczenie: Do oznaczania aktywności antyoksydacyjnej próbek spożywczych najczęściej stosowana jest metoda 

wykorzystująca rodnik 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowy (DPPH). Zmiany stężenia rodnika są w niej oznaczane 

fotometrycznie, przy 517 nm. Wadą tej metody jest interferencja zarówno przez zredukowaną postać rodnika jak i 

składniki badanej próbki absorbujące światło przy 517 nm. Dlatego, do oznaczania zmian stężenia rodnika DPPH 

zastosowano chromatografię cienkowarstwową. Celem pracy było rozdzielenie różnych form DPPH za pomocą TLC oraz 

zbadanie możliwości zastosowania tej techniki do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA). 

Słowa kluczowe: chromatografia cienkowarstwowa, TLC; 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl, DPPH; antyoksydanty; 

całkowity potencjał antyoksydacyjny, CPA. 

About the possibility of application of thin layer chromatography to the 

measurements of the total antioxidant potential. Part I. Chromatographic conditions. 

Abstract: The antioxidant activity of food samples usually is determined using the 1,1-diphenyl-2-pikrylohydrazyl radical 

(DPPH). Changes of the radical concentration are determined photometrically at 517 nm. The disadvantage of this 

method is the interference by the reduced form of radical as well as the sample components absorbing light at 517 nm. 

Therefore, changes in the DPPH concentration where measured using thin layer chromatography. The aim of the study 

was the separation of the different forms of DPPH using TLC and examine its applicability to the determination of the 

total antioxidant potential (TAP). 

Key words: thin layer chromatography, TLC; 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH; antioxidants; total antioxidant 

potential, TAP. 

1. Wprowadzenie 

/Introduction/ 

Wolne rodniki są cząsteczkami, jonami, atomami lub grupami atomów posiadającymi na powłoce 

walencyjnej (lub na ostatnim orbitalu) jeden lub więcej niesparowanych elektronów, nadającym im 

właściwości paramagnetyczne. Niektóre z nich są wysoce reaktywne, niestabilne, dążą do przyłączania 

elektronów lub wodorów od otaczających ich cząsteczek, prowadząc do ich utleniania. Wiąże się to ze 

zmianą biochemicznych właściwości utlenionych cząsteczek. Wolne rodniki mają zdolność uszkadzania 

struktury błon komórkowych, lipidów, białek i kwasów nukleinowych w komórce. W konsekwencji może to 

doprowadzić do uszkodzenia funkcji życiowych komórek, tkanek organizmu i całego organizmu [1-3]. 

Rodniki odgrywają ważną rolę w wielu działach chemii, biologii, medycyny i są przedmiotem wielu 

badań związanych z problemami zdrowotnymi. Organizmy rozwinęły wiele mechanizmów obronnych, aby 

chronić się przed działaniami wolnych rodników. System obronny organizmów żywych przed wolnymi 

rodnikami można podzielić na trzy etapy: (i) zapobiegający ich wytwarzaniu (np. chelatory metali 

przejściowych - hemoglobina, laktoferyna), (ii) usuwający wolne rodniki (antyoksydanty lub zmiatacze 

wolnych rodników) oraz (iii) naprawiający uszkodzenia przez nie wywołane [4, 5]. Antyoksydanty są 

substancjami występującymi w stężeniach niskich w porównaniu ze składnikami utleniającymi i opóźniają 

bądź hamują utlenianie spowodowane przez wolne rodniki. Utrzymanie równowagi pomiędzy ilością wolnych 

rodników a antyoksydantami ma ogromne znaczenie dla zachowania zdrowia. Ekspozycja organizmu na 

działanie wolnych rodników określane jest mianem „stresu oksydacyjnego”. Intensywność stresu zależy od 

rodzaju i ilości wolnych rodników, sprawności organizmu i zasobu antyoksydantów istniejących w 

organizmie. Antyoksydanty tworzą barierę ochronną występują zarówno w części hydrofobowej jak i 

hydrofilowej (wodnej) znajduje się w cytoplazmie komórek i płynach pozakomórkowych [3, 6, 7]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

42 

Jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru sumarycznych właściwości antyoksydacyjnych, ze 

względu na prostotę, krótki czas analizy oraz stosunkowo wysoką dokładność i odtwarzalność wyników, jest 

metoda oparta o badanie stopnia przereagowania z próbką rodnika DPPH (1,1 -difenylo-2-pikrylohydrazylu). 

Wykorzystywana jest ona do pomiaru CPA (całkowitego potencjału antyoksydacyjnego) żywności, owoców, 

soków itp. Rodnik DPPH rozpuszcza się wyłącznie w rozpuszczalnikach organicznych, dlatego też metoda 

uniemożliwia oznaczenie antyoksydantów o charakterze hydrofilowym. Pomiar CPA polega na dodaniu do 

alkoholowego roztworu DPPH o barwie purpurowej, próbki zawierającej przeciwutleniacz, który redukuje 

rodnik do DPPH-H zabarwiony na żółto. Zmianę barwy roztworu mierzy się spektrofotometrycznie przy 

maksimum absorbancji - 517 nm. [8-10, 19]. W pracy przedyskutowano możliwość rozdzielania postaci 

utlenionej i zredukowanej rodnika DPPH za pomocą TLC. 

2. Część Eksperymentalna 

/Experimental/ 

2.1. Aparatura 

/Apparatus/ 

Pomiary chromatograficzne techniką TLC zostały wykonane przy użyciu komór chromatograficznych 

typu DS II D (Chromdes, Lublin) o wymiarach 10 x 5 cm i 20 x 20 cm oraz płytek szklanych pokrytych żelem 

krzemionkowym NP (Silicagel 60 i Silicagel 60 F 254S ) oraz płytek szklanych pokrytych żelem krzemionkowym 

modyfikowanymi grupami oktadecylowymi (RP-18WF 254S ) (Merck, Niemcy), 5 x 10 cm, grubość złoża 0,25 

mm. Plamki zamieniono na chromatogramy za pomocą skanera HP Scanjet G210 oraz pakietu 

oprogramowania ScionImage oraz ImageJ [20]. 

2.2. Odczynniki chemiczne 

/Chemicals/ 

Podczas badań wykorzystano następujące odczynniki: n-heksan cz.d.a., etanol cz.d.a 96,6 %,, 2- 

propanol cz.d.a., wodoroortofosforandisodu, diwodoroortofosforan sodu (Chempur, Piekary Śląskie, Polska), 

aceton cz.d.a (Stanlab, Lublin, Polska), metanol cz.d.a HPLC (Honeywell, Niemcy), dichlorometan HPLC, 33 

% kwas solny cz.d.a., kwas galusowy (POCh, Gliwice, Polska), acetonitryl Chromasolv, DPPH (Sigma - 

Aldrich, Niemcy). Wszystkie roztwory wodne wykorzystane w badaniach przygotowano stosując wodę 

trójkrotnie destylowaną z kwarcu. W pracy stosowano 1 mM metanolowy roztwór DPPH. 

2.3. Możliwość zastosowania skanera biurowego w TLC 

/The ability to use office scanner in TLC/ 

W pracy zbadano możliwość zastosowania skanera biurowego do przekształcenia w formę cyfrową 

obrazu płytki chromatograficznej [20]. Płytki skanowane były z rozdzielczością 300 DPI w trybie milion a 

kolorów i zapisywane w formacie TIFF. Następnie wyniki były poddawane obróbce: konwersji do skali 

szarości, przycięciu skanowanej płytki i redukcji szumu za pomocą metody Savitzkyego-Golay’a [11]. 


/Results and Discussion/ 

3.1. Retencja rozpuszczalników 

/Retention of solvents/ 

Rozpuszczalniki możemy podzielić na polarne (np. woda, aceton) i niepolarne (np. heksan czy 

czterochlorek węgla). Niepolarne charakteryzują się niską stałą dialektryczną i momentem dipolowym. W 

chromatografii często stosowaną miarą polarności są współczynniki Hildebranda. Na R f wpływa polarność 

zarówno fazy ruchomej jak i próbki. W układzie faz prostych wzrost polarności rozpuszczalnika zwiększa R f 

[12, 13]. Składniki eluentów mogą być tak samo zatrzymywane na płytkach TLC jak inne (badane) związki. 

Zakłóca to pomiar chromatograficzny. Dlatego też we wstępnej fazie badań sprawdzono powinowactwa 

rozpuszczalników do fazy stacjonarnej. Na Rys. 1 i 2 oraz w Tabeli 1 pokazano odległości przebyte przez 

różne rozpuszczalniki w czasie 5 min oraz czasy potrzebne na przebycie całej płytki. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

43 

1 2 

Rys. 1. Odległości przebyte przez różne rozpuszczalniki na płytce NP w czasie 5 min. 

Fig. 1. Distance completed by different solvents on the NP plate in 5 min. 

Rys. 2. Odległości przebyte przez różne rozpuszczalniki na płytce RP-18WF 254S w czasie 5 min. 

Fig. 2. Distance completed by different solvents on the RP-18WF 254S plate in 5 min. 

Tabela 1 Czasy, t [s], przebycia płytki przez rozpuszczalniki. 

Table 1 The migration times t [s], of plates by the solvents. 

Rozpuszczalniki 

Solvents 

NP 

t [s]/ time 

RP 

2-propanol 1320 2032 

etanol 860 - 

heksan 456 390 

aceton 244 365 

dichlorometan - 1046 

metanol - 648 

acetonitryl - 268 

Okazało się, że zaobserwowano tę samą kolejność szybkości poruszania się rozpuszczalników 

wzdłuż obu płytek. Najpowolniejszy przepływ, około 22 min dla płytki NP i 33 min dla RP -18W, 

zaobserwowano dla 2-propanolu (Tabela 1). Acetonitryl i aceton migrują dosyć szybko przez płytkę RP-18W, 

około 4,5 minuty. Wyniki te wskazują na to, że może dojść do niekontrolowanego rozdzielenia substancji 

oznaczanej i pojawienia się innych plamek wskutek rozdzielania rozpuszczalników. Dlatego należy unikać 

mieszaniny wielu rozpuszczalników i dobierać proste fazy układy. 

3.2. Rozdzielanie różnych postaci DPPH za pomocą chromatografii cienkowarstwowej 

/Separation of the different forms of DPPH by TLC/ 

Możliwość rozdzielenia różnych form DPPH zbadano stosując różne modyfikacje układu 

chromatograficznego (i) fazy stacjonarne (NP lub RP), (ii) fazy ruchome, (iii) temperaturę, (iv) nasycenie lub 

jego brak, komory, (v) krotność rozwijania oraz (vi) krotność niecałkowitego rozwijania. W Tabelach 2 (płytki 

NP) i 3 (płytki RP-18W) przedstawiono zależność współczynników retencji i opóźnienia różnych form rodnika 

DPPH od stężeń rozpuszczalników i współczynników Hildebranda faz ruchomych (Tabela 4). 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

44 

Tabela 2. Wartości współczynników retencji (k) i opóźnienia (R f ) różnych form rodnika DPPH oraz stężeń 

rozpuszczalników i współczynników Hildebranda ( ) faz ruchomych w układzie faz normalnych. 

Table 2. The values of retention (k) and delay (R f ) coefficients of various forms of DPPH and 

concentrations of solvents, and the Hildebrand ( ) coefficients of mobile phases in the normal 

phase systems. 

Faza ruchoma 

Mobile phase 

Stężenie 

acetonu 

[%] 

R fDPPH• R fDPPH-H k DPPH • k DPPH-H 

heksan/aceton 14,52 7,6051 0,28 0,25 3,00 2,57 

heksan/aceton 14,68 7,6087 0,36 0,31 2,23 1,78 

heksan/aceton 14,82 7,6111 0,31 0,3 2,33 2,23 

heksan/aceton 14,97 7,6139 0,24 0,21 3,76 3,17 

heksan/aceton 15,11 7,6173 0,32 0,28 2,57 2,13 

heksan/aceton 15,25 7,6213 0,39 0,34 1,94 1,56 

heksan/aceton 15,97 7,6360 0,22 0,19 4,26 3,55 

heksan/aceton 16,67 7,6469 0,24 0,205 3,88 3,17 

heksan/aceton 17,36 7,6646 0,24 0,21 3,76 3,17 

heksan/aceton 18,03 7,6786 0,17 0,145 5,90 4,88 

heksan/aceton 18,69 7,6926 0,2 0,19 4,26 4,00 

heksan/aceton 19,35 7,7027 0,32 0,28 2,57 2,13 

heksan/aceton 20 7,7200 0,43 0,38 1,63 1,33 

heksan/aceton 20,13 7,7224 0,31 0,27 2,70 2,23 

heksan/aceton 20,26 7,7263 0,36 0,31 2,23 1,78 

heksan/aceton 20,38 7,7280 0,28 0,26 2,85 2,57 

heksan/aceton 20,51 7,7298 0,29 0,25 3,00 2,45 

heksan/aceton 20,63 7,7329 0,34 0,3 2,33 1,94 

heksan/aceton 24,81 7,8208 0,44 0,43 1,33 1,27 

heksan/aceton 29,97 7,9294 0,52 0,49 1,04 0,92 

heksan/aceton 34,98 8,0346 0,53 0,52 0,92 0,89 

heksan/aceton 65,23 8,6696 1 1 1 1 

aceton 100 9,4000 0,96 0,99 0,04 0,01 

heksan/aceton/ 

EtOH 

heksan/aceton/ 

EtOH 

40 8,9200 0,98 0,98 0,02 0,02 

35,71 8,4669 0,71 0,66 0,4 0,51 

heksan/EtOH 33,33 8,5991 0,8 0,8 0,25 0,25 

2-propanol/ 

aceton/EtOH 

2-propanol/ 

aceton 

27,78 9,1000 0,27 0,27 2,70 2,70 

33,33 9,9323 0,24 0,24 3,17 3,17 

2-propanol 100 10,2000 0,89 0,89 0,12 0,12 

acetonitryl/woda 11 12,7108 1 1 0 0 

acetonitryl/ 

MeOH 

11 11,9089 1 1 0 0 

acetonitryl 100 11,8000 1 1 0 0 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

45 

Tabela 3. Wartości współczynników retencji (k) i opóźnienia (R f ) różnych form rodnika DPPH oraz stężeń 

rozpuszczalników i współczynników Hildebranda ( ) faz ruchomych w układzie faz odwróconych. 

Table 3. The values of retention (k) and delay (R f ) coefficients of various forms of DPPH and 

concentrations of solvents, and the Hildebrand ( ) coefficients of mobile phases in the reversed 

phase systems. 


Solvents 

Stężenie 

acetonu 

[%] 

R fDPPH• R fDPPH-H k DPPH • k DPPH-H 

heksan/aceton 14,68 7,6087 0,43 0,47 1,33 1,11 

heksan/aceton 15,25 7,6213 0,34 0,39 1,96 1,57 

heksan/aceton 15,40 7,6234 0,41 0,46 1,44 1,17 

heksan/aceton 20,00 7,7200 0,5 0,55 2,17 1,81 

heksan/aceton 20,26 7,7263 0,44 0,49 1,28 1,03 

aceton 100 9,4 1 1 0 0 

2-propanol 100 10,2 0,86 0,86 0,16 0,16 

acetonitryl 100 11,8 0,95 0,98 0,05 0,02 


Stężenie 

MeOH [%] 

R fDPPH• R fDPPH-H k DPPH• 

k DPPH-H 

acetonitryl/MeOH 4,76 11,8524 0,95 0,99 0,05 0,01 




acetonitryl/MeOH 

33,33 

12,1654 

5 0,95 0,96 0,05 0,04 

MeOH 100 12,9 0,91 0,94 0,1 0,07 


Stężenie 

wody [%] 

R fDPPH• R fDPPH-H k DPPH• k DPPH-H 

MeOH/woda 1,96 13,0620 0,85 0,91 0,18 0,1 

MeOH/woda 2,91 13,1430 0,86 0,9 0,16 0,11 

MeOH/woda 3,85 13,2115 0,85 0,89 0,18 0,13 

MeOH/woda 

4,76 

13,2855 

6 

0,91 

0,94 0,1 

MeOH/woda 9,91 13,7019 0,83 0,87 0,2 0,15 

MeOH/woda 13,04 13,9562 0,62 0,67 0,62 0,49 

MeOH/woda 13,79 14,0169 0,61 0,66 0,64 0,51 

MeOH/woda 14,53 14,0769 0,72 0,71 0,39 0,42 

MeOH/woda 15,11 14,1239 0,65 0,69 0,54 0,45 

MeOH/woda 15,25 14,1393 0,71 0,76 0,41 0,32 

MeOH/woda 15,40 14,1474 0,65 0,7 0,54 0,43 

MeOH/woda 15,54 14,1639 0,59 0,62 0,68 0,61 

MeOH/woda 15,82 14,1814 0,66 0,7 0,51 0,43 

MeOH/woda 15,97 14,196 0,63 0,69 0,59 0,45 

MeOH/woda 16,67 14,2443 0,59 0,66 0,54 0,45 

MeOH/woda 20,00 14,52 0,6 0,67 0,66 0,5 


Stężenie 

wody [%] 

0,07 

R fDPPH• R f DPPH-H k DPPH• k DPPH-H 

acetonitryl/woda 9,91 12,7108 0,92 0,95 0,08 0,05 



Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

46 









Tabela 4. Wartości współczynnika Hildebranda czystych rozpuszczalników. 

Table 4. The values of Hildebrand parameters of pure solvents. 

Rozpuszczalnik 

/Solvent/ 

heksan aceton 2propanol etanol acetonitryl metanol woda 

7,3 9,4 10,2 11,2 11,8 12,9 21 

Dobierając rozpuszczalnik(i) o odpowiednim współczynniku Hildebranda można sterować retencją i 

selektywnością rozdzielania. Na Rys. 3 zostały przedstawione zależności współczynnika opóźnienia DPPH, 

• 

R f , od współczynnika Hildebranda fazy ruchomej. Największe wartości R fDPPH otrzymano dla 

współczynników Hildebranda równych ok. 12. 

1.0 

0.8 

y = -0.0399x + 1.4267 

R² = 0.6905 

0.6 

R f 

0.4 

0.2 

y = 0,332x - 2,126 

R² = 0,969 

Rf heksan/aceton 

Rf ACN/MeOH 

ACN/MeOH/HOH 

y = -0,248x + 4,151 

R² = 0,924 

0.0 

7 9 11 13 15 

Rys. 3. Wpływ współczynnika Hildenbranda na wartości R f . Warunki chromatograficzne: płytka RP-18W, 

20°C, wysycona komora. 

Fig. 3. The influence of Hildebrand parameter on R f values. Chromatographic conditions: plate - RP-18, 

temp. - 20°C, chamber - saturated. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

47 

3.3. Dobór fazy ruchomej do rozdzielania dwóch form rodnika DPPH 

/Selection of the mobile for the separation of two forms of the DPPH radical/ 

Najlepsze rozdzielanie DPPH od DPPHH, zarówno na płytkach RP jak i NP, uzyskano dla mieszaniny 

dwuskładnikowej heksan – aceton (80:20 v/v). Na płytkach RP zaobserwowano brak elucji (R f = 0) rodnika 

DPPH gdy fazą ruchomą był czysty heksan. Minimum retencji (R f = 1) i rozdzielenia z kolei otrzymano dla 

metanolu, acetonitrylu, acetonu, dichlorometanu oraz 2-propanolu. W przypadku mieszanin 

dwuskładnikowych takich jak metanol - woda od 5 do 10% wody następuje spadek współczynnika 

opóźnienia, od 0,9 do 0,8. Powyżej 20% wody plamka DPPH • ulega całkowitemu rozmyciu. A zatem 

współczynnik opóźnienia maleje, wraz ze wzrostem stężenia rozpuszczalnika bardziej polarnego. Dodatek 

wody spowodował nieznaczne rozdzielenie dwóch form od siebie. Lepsze rozdzielenie otrzymano w układzie 

heksan – aceton. Wraz ze wzrostem acetonu od 15-20% współczynnik opóźnienia wzrasta. Plamki 

pochodzące od obu form nie są do końca rozdzielone, ale obie barwy są bardzo wyraźne. Współczynnik 

opóźnienia mieści się w graniach 0,4-0,5. Stosowanie innych faz ruchomych, takich jak acetonitryl/woda czy 

acetonitryl/metanol nie poprawiało rozdzielania. Dodatek wody (10 do 15%) współczynnik opóźnienia. 

Wzrost zawartości wody powyżej 30% zmniejszał R f i zmieniał kolejność wymywania (DPPH-H > DPPH). 

Również na płytkach NP nie zaobserwowano elucji (R f = 0) dla heksanu. Dla acetonu, dichlorometanu, 

2-propanolu, dichlorometanu/metanolu oraz dichlorometanu/etanolu zaobserwowano minimalną retencję (R f 

≈ 1) DPPH • . Najlepsze rozdzielenie otrzymano dla mieszaniny heksan/aceton (ok. 32% acetonu). Wzrost 

stężenia acetonu (powyżej 65%) likwiduje retencję (Rys. 4). 

1.0 

0.8 

R f 

0.6 

0.4 

0.2 

0.0 

0 20 40 60 80 100 

c [%] 

Rys. 4. Zależność współczynnik opóźnienia (R f ) DPPH od stężenia acetonu. Warunki chromatograficzne: 

faza ruchoma – aceton-woda, płytka - NP, temp. - 20°C, komora - wysycona. 

Fig. 4. The dependence of delay factor (Rf) of DPPH on acetone concentration. Chromatographic conditions: 

mobile phase - acetone-water, plate - NP, temp. - 20°C, chamber - saturated. 

3.4. Rozdzielanie dwóch form rodnika DPPH za pomocą HPLC/UV 

/Separation of two forms of DPPH using HPLC/UV/ 

Do rozdzielania formy utlenionej od zredukowanej rodnika DPPH można zastosować wysokosprawną 

chromatografię cieczową (HPLC). Na rys. 5 przedstawiono chromatogram 1 mM DPPH po reakcji z kwasem 

galusowym (faza ruchoma - metanol/woda, 80:20, v/v) oraz skan płytki RP-18W rozwiniętej w mieszaninie 

heksan/aceton. Wynika z niego, że większą selektywnością charakteryzuje się HPLC niż TLC. Plamki TLC 

nie są dobrze rozdzielone. Dodatkowe piki/plamki spowodowane są przez zanieczyszczenia i/lub produkty 

utlenienia/redukcji DPPH. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

mAU 

48 

3.5. Rozwijanie płytek 

/Developing of TLC plates/ 

Do najważniejszych metod rozwijania chromatogramów w TLC zaliczamy metodę mikrocyrkulacji, 

wstępującą, spływową (zstępującą), horyzontalną, dwukierunkową (2 –D, dwuwymiarową), kołową [14, 15]. 

Dobór odpowiedniej techniki rozwijania w dużej mierze wpływa na retencję próbki. Do najczęściej 

stosowanych technik zalicza się stopniowe rozwijanie, rozwijanie wielokrotne, gradientowe, „stref klinowych”, 

poziome [16, 17]. Na Rys. 6 przedstawiono wielokrotne rozwijanie tej samej płytki NP za pomocą tego 

samego rozpuszczalnika. Okazało się, że technika ta jest nieskuteczna, nie uzyskano lepszego rozdzielenia 

DPPH • (plamka fioletowa) od DPPH-H (plamka o barwie żółtej). To samo dotyczy rozwijania stopniowego i 

dwukierunkowego. 

3.6. Retencja DPPH w komorze wysyconej i niewysyconej 

/Retention of DPPH in the saturated and unsaturated chamber/ 

Retencja próbki zależy od jej oddziaływania zarówno z fazą ruchomą jak i stacjonarną. Z kolei 

oddziaływanie składników obu tych faz zależy od stopnia wysycenia komory (zwilżenia fazy stacjonarnej). 

Duży wpływ na współczynnik retencji, k, ma stopień nasycenia komory parami rozpuszczalnika. Wykazano, 

że dla dwuskładnikowego rozpuszczalnika, heksan/aceton najlepiej jest zastosować płytkę w wysyconej 

komorze (rys. 7). 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

0 2 4 6 8 10 12 14 16 

min 

Rys. 5. HPLC chromatogram oraz skan płytki chromatograficznej TLC 1 mM DPPH po częściowej redukcji 

kwasem galusowym. Warunki chromatograficzne HPLC: kolumna - COSMOSIL 5 μm, 4,6 x 250 mm, 5C18– 

AR–II (Waters), temp. - 5 o C, faza ruchoma - metanol/woda (80:20, v/v), szybkość przepływu - 1 ml/min, 

detektor - UV 517 nm. Warunki chromatograficzne TLC: płytka - RP-18W, obj. nastrzyku - 30 l, temp. - 5 o C, 

faza ruchoma - heksan/aceton (80:20% v/v), komora - wysycona. 

Fig. 5. HPLC chromatogram and scan of the TLC chromatographic plate of 1 mM DPPH after its partial 

reduction by gallic acid. Chromatographic conditions, HPLC: column - Cosmosil 5 mm, 4.6 x 250 mm, 5C18- 

AR-II (Waters), temp. - 5°C, mobile phase - methanol / water (80:20, v/v), flow rate - 1 ml/min., detector - UV 

517 nm. Chromatographic conditions, TLC: plate - RP-18W, volume - 30 l, temp. - 5°C, mobile phase - 

hexane / acetone (80:20% v/v), chamber - saturated. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

k 

49 

Rys. 6. TLC chromatogram 1 mM DPPH. Warunki chromatograficzne: płytka - NP, temp. - 20 o C, faza 

ruchoma – heksan/aceton (80:20% v/v), komora - wysycona. 

Fig. 6. TLC chromatogram of 1mM DPPH. Chromatographic conditions: plate - NP, temp. - 20 o C, mobile 

phase – hexane/acetone (80:20% v/v), chamber - saturated. 

4 

3 

wysycona 

niewysycona 

2 

1 

0 

k DPPH-H 

k DPPH∙ 

Rys. 7. Zależność współczynnika retencji k utlenionej i zredukowanej formy rodnika DPPH • od stanu 

wysycenia komory chromatograficznej. 

Fig. 7. The dependence of retention coefficient k of oxidized and reduced forms of DPPH • on the state of 

saturation of the chromatographic chamber. 

3.7. Wpływ temperatury na rozdzielenie dwóch form DPPH 

/Effect of temperature on the separation of the two forms of the DPPH radicals/ 

Temperatura wpływa na sprawność (zmniejszenie lepkości rozpuszczalnika), retencję i selektywność 

rozdzielania chromatograficznego. W Tabeli 5 przedstawiono zależność współczynnika retencji k od 

temperatury, w zakresie od –26 o C do +20 o C. Najwyższe współczynniki retencji otrzymano w -10 o C dla płytki 

RP-18W, zaś dla płytki NP w +5 o C. W trakcie trwania procesu chromatograficznego zmiana temperatury 

spowodowała wystąpienie różnych zmian w rozdzielczości i tempie migracji cząsteczek badanego związku. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

50 

Tabela 5. Wartość współczynnika retencji, k, oraz współczynnika selektywności, α, dla dwóch form rodnika 

DPPH na różnych płytkach w zależności od temperatury. 

Table 5.The retention, k, and selectivity, α, coefficients of two forms of DPPH radicals at different plates and 

temperatures. 

temperatura 

[ o C] 

-26 -20 -15 -10 +5 +20 

RP 

k DPPH • 1,35 1,41 1,52 3,12 2,50 1,28 

k DPPH-H 1,16 1,19 1,28 2,50 2,03 1,03 

α DPPH 1,16 1,19 1,19 1,25 1,23 1,24 

NP 

k DPPH • 2,32 3,60 2,69 2,79 5,48 3,33 

k DPPH-H 2,00 2,91 2,22 2,32 4,04 2,79 

α DPPH 1,16 1,24 1,21 1,20 1,36 1,19 

Zależność współczynnika selektywności od temperatury opisuje równanie van’t Hoffa: 

gdzie: α –współczynnik selektywności, ΔΔH o , ΔΔS o – zmiana entalpii i entropii procesu, k – współczynnik 

retencji, R – stała gazowa, T – temperatura [K]. 

Brak liniowej zależności ln od 1/T sugeruje, że retencja DPPH nie jest opisana jednym mechanizmem 

oddziaływań. 

4. Wnioski 

/Conclusions/ 

TLC można zastosować do rozdzielenia formy utlenionej rodnika DPPH od zredukowanej DPPH -H. 

Najkorzystniejsze warunki występują przy zastosowaniu dwuskładnikowej fazy ruchomej heksanu/acetonu 

(80:20% v/v) w układzie faz odwróconych. Temperatura ma wpływ na selektywność rozdzielania. W części 2 

pracy przedstawiona zostanie możliwość zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania 

całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) różnych gatunków mięs. 

5. Literatura 

/References/ 

[1] P. Socha, Zastosowanie zmiataczy wolnych rodników w leczeniu chorób przewodu pokarmowego i w 

leczeniu żywieniowym dzieci, Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie 

Dziecka, 3, 2, 129-133, 2001. 

[2] B.K. Głód, P. Piszcz, I. Kiersztyn, A. Lamert, P. Zarzycki, Zastosowanie HPLC do oznaczania wolnych 

rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego, Postępy Chromatografii, 

Monografia nr 111, 41-66, wydawnictwo Akademia Podlaska, 2009. 

[3] V. Jakus, The role of free radicals, oxidative stress and antioxidant systems in diabetic vascular 

disease, BratislavskéLekárskeListy, 101, 10, 541-551, 2000. 

[4] E. Syweńki, M. Gryboś, Disease of Free Radicals, Chorobawolnychrodników, Advances in Clinical and 

Experimental Medicine, 14, 3, 573-582, 2005. 

[5] Ś. Ziemlański, M. Wartanowicz, Rola antyoksydantów żywieniowych w stanie zdrowia i choroby, 

Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie Dziecka, 1, 2/3, 97-105, 1999 

[6] H. Puzanowska-Tarasiewicz, L. Kuźmicka, Tarasiewicz, Antyoksydanty a reaktywne formy tlenu, 

Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 43, 1, 9-14, 2010. 

[7] A.R. Ndhlala, M. Moyo, J. V. Staden, Natural antioxidants: Fascinating or mythical biomolecules?, 

Molecules, 15, 6905-6930, 2010. 

[8] K. Mishra, H. Ojha, N. K. Chaudhury, Estimation of antiradical properties of antioxidants using DPPH 

assay: A critical review and results, Food Chemistry, 130, 1036-1038, 2012. 

[9] P. Molyneux, The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating 

antioxidant activity, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 26, 2, 211–219, 2004. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

51 

[10] P. Ionita, Is DPPH Stable Free Radical a Good Scavenger for Oxygen Active Species?, Chemical 

Papers, 59, 1, 11-15, 2005. 

[11] M. Zarzycka, Praca doktorska, Zastosowanie termostatowanej mikrochromatografii cienkowarstowej 

dla celów analizy farmaceutycznej, Zakład Toksykologii I Bioanalityki na Wy dziale Budownictwa i 

Inżynierii Środowiska Politechniki Koszalińskiej, Koszalin 2011. 

[12] J.C. Touchstone, J. C. Chen, K. M. Beaver, Improved separation of phospholipids In Thin Layer 

Chromatography, LIPIDS, 15, 1, 61-62, 1979. 

[13] Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, 232-275, Wydawnictwa Naukowo Techniczne, Warszawa 

2000. 

[14] M.F. Striegel, J. Hill, Thiny-Layer Chromatography for Binding Media Analysis, The Getty 

Conservation Institute, Los Angeles, 1996. 

[15] L. Ciesla, M. Waksmundzka-Hajnos, Multidimensional and multimodal separations by HPTLC in 

phytochemistry, in High Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC), M.M. Srivastava, Ed., 

Springer, Berlin, Germany, 69-92, 2011. 

[16] J. Sherma, B. Fried, Handbook of Thin-Layer Chromatography, Marcel Dekker, Inc, New York, 2003. 

[17] R. Kocjan, Chemia analityczna. Podręcznik dla studentów. Analiza instrumentalna 2, Wydawnictwo 

Lekarskie PZWL, Warszawa 2000. 

[18] M. Kowalczyk, Praca doktorska, Cholany jako układy samoorganizujące się w technikach 

rozdzielczych, Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk, Warszawa 2009. 

[19] P.M. Wantusiak, P. Piszcz, M. Skwarek, B.K. Głód, Właściwości antyoksydacyjne miodów 

wyznaczone metodami chromatograficznymi, Camera Separatoria, 3, 2, 297-317, 2011. 

[20] B.K. Głód, P.M. Wantusiak, P. Piszcz, E. Lewczuk, P.K. Zarzycki, Application of micro-TLC to the total 

antioxidant potential (TAP) measurement. Food Chemistry, 173, 749-754, 2015. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria



Judyta KOSIŃSKA 1 , Grażyna GAŁĘZOWSKA 1,2 , Sebastian ZALEWSKI 1 , 

Marian KAMIŃSKI 1* 

1 Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, 80-233 Gdańsk, 

ul, Narutowicza 11/12 

2 Zakład Toksykologii Środowiska, Wydział Nauk o Zdrowiu z Oddziałem Pielęgniarstwa i Instytutem Medycyny Morskiej 

i Tropikalnej, Gdański Uniwersytet Medyczny, 80-204 Gdańsk, ul. Dębowa 23 

* Autor do korespondencji, e-mail: markamin@pg.gda.pl 

Chromatografia cienkowarstwowa i technika TLC-FID w badaniach składu 

grupowego, szczególnie, tłuszczów i produktów ich konwersji 

Streszczenie: Praca dotyczy zbadania celowości stosowania oraz określenia korzystnych warunków wykorzystania 

"klasycznej" chromatografii cienkowarstwowej w normalnych układach faz (NP-TLC) oraz techniki chromatografii 

cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo - jonizacyjną (TLC-FID) na pręcikach kwarcowych, jako technik 

zapewniających oznaczanie składu grupowego, w badaniach nad: 

- ustaleniem optymalnych warunków rozdzielania grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji z zastosowaniem 

kolumnowej chromatografii elucyjnej w warunkach normalnych układów faz (NP-HPLC), albo w warunkach kolumnowej 

chromatografii wykluczania z jednoczesną adsorpcją o charakterze oddziaływań polarnych (GPC/SEC-NP), 

- oceną składu grupowego, tzn. orientacyjnym oznaczaniem składu grupowego tego rodzaju produktów, 

- oceną składu frakcji eluatu, tzn. oceny czystości kolekcjonowanych składnik ów rozdzielanych techniką HPLC w skali 

semi-preparatywnej / preparatywnej. 

W niniejszej pracy zwrócono też uwagę na możliwość wykorzystania klasycznej techniki NP-TLC do wstępnych 

badań nad opanowaniem korzystnych warunków wykorzystania wysokosprawnej kol umnowej elucyjnej chromatografii 

cieczowej wykluczania sterycznego (GPC-SEC) i słabej adsorpcji o charakterze oddziaływań polarnych, w normalnych 

układach faz (NP), tzn., wykorzystywania w sposób optymalny warunków GPC-SEC-NP do grupowego rozdzielania w/w 

produktów. Badania dotyczyły również określenia optymalnych warunków stosowania techniki TLC -FID do określania 

składu grupowego na przykładzie rozdzielania i oznaczania zawartości składników niektórych tłuszczów i produktów ich 

konwersji, a także, obecności i zawartości grup składników w technicznym FAME, tzn., estrach metylowych kwasów 

tłuszczowych, jako pochodnym tłuszczów roślinnych – bio-komponencie paliwowym, dodawanym do „naftowego” oleju 

napędowego do zasilania silników Diesla. 

Wnioski z badań i studiów niniejszej pracy dotyczą techniki NP-TLC lub NP-TLC-FID. Są też aktualne dla badań nad 

wykorzystaniem chromatografii kolumnowej wykluczania z jednoczesną adsorpcją – GPC-SEC-NP – do rozdzielania 

grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji, a także dla badań nad podobnymi warunkami rozdzielania innych 

złożonych mieszanin związków chemicznych, z wykorzystaniem adsorpcji w normalnych układach faz, lub jednocześnie 

– wykluczania i słabej adsorpcji. Wyniki pokazują istotne korzyści ze stosowania techniki TLC, w "pilotowych" badaniach 

nad doborem korzystnych warunków wykorzystywania wysokosprawnej chromatografii cieczowej wykluczania z 

jednoczesną kontrolowaną niskoenergetyczną adsorpcją, zwłaszcza z zastosowaniem normalnych układów faz, tzn. 

warunków GPC-SEC-NP. 

Słowa kluczowe: chromatografia cienkowarstwowa w normalnych układach faz – NP-TLC, chromatografia 

cienkowarstwowa z detekcją płomieniowo-jonizacyjną – TLC-FID, rozdzielanie grupowe, tłuszcze i produkty ich 

konwersji, nielotne frakcje i produkty naftowe. 

Thin-layer chromatography and TLC-FID technique in studies concerning group 

composition of, especially, fats and products of their conversion 

Abstract: The work investigates a desirability of application and discusses determination of favorable conditions of 

"classic" normal phase thin-layer chromatography (NP-TLC) and thin layer chromatography with flame ionization 

detection (TLC-FID) on quartz rods as techniques enabling to determine group composition, in studies concerning: 

- determination of optimal conditions for group separation of fats and products of their conversion by means of normal - 

phase liquid chromatography (NP-HPLC) or size exclusion liquid chromatography with simultaneous adsorption of polar 

interactions character (GPC/SEC-NP), 

- evaluation of group composition, i.e. approximate determination of group composition of this type of products, 

- evaluation of eluate fraction composition, i.e. assessment of collected components’ purity, separated by HPLC in a 

semi-preparative/preparative scale. 

In submitted work an attention was paid to possibilities of using “classic” NP-TLC for preliminary studies to select 

favorable conditions applicable for high performance size exclusion liquid chromatography (GPC -SEC) and weak 

adsorption of a polar interactions character, in normal phase (NP) systems, i.e. applying the conditions of GPC -SEC-NP 

group separation of aforementioned products in optimal manner. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

53 

The research was also aimed to determine the optimal conditions of TLC-FID technique used to specify the group 

composition basing on an example of presence determination and separation of some fats’ components and products of 

their conversion, as well as, the presence and content of group components in a technical FAME, i.e. fatty acid methyl 

esters, as derivatives of vegetable fats – bio-fuel component added to diesel fuel used in diesel engines. 

The conclusions of the research and studies concerns NP-TLC or NP-TLC-FID technigues. They are also valid for 

researches discussing the usage of high performance size exclusion chromatography with simultaneous adsorption – 

GPC-SEC-NP – for group separation of fats and products of their conversion, as well as, for researches based on similar 

separation conditions of other complex mixtures, using adsorption in normal phase systems, or simultaneously – 

exclusion and weak adsorption. The results indicate significant benefits which arise from usage of TLC technique, in the 

"pilot" studies concerning the selection of favorable conditions for size exclusion high performance liquid chromatography 

with simultaneous and controlled low energy adsorption, especially by using the normal-phase, i.e. GPC-SEC-NP 

conditions. 

Key words: normal-phase thin-layer chromatography – NP-TLC, thin-layer chromatography with flame ionization 

detection – TLC-FID, group separation, fats and products of their conversion, non-volatile fractions and petroleum 

products. 



Klasyczna chromatografia cienkowarstwowa (TLC, ang. Thin Layer Chromatography), będąca 

odmianą chromatografii planarnej, jest stosowana powszechnie od lat 30-tych XX-wieku. W ostatnich latach 

– od czasu wprowadzenia tzw. skanerów, zwłaszcza typu UV-VIS DAD – przeżywa kolejny "renesans". 

Chromatografia cienkowarstwowa posiada ogrom ną liczbę różnego rodzaju zastosowań 

rozdzielczych, w tym, w zastosowaniach mikro-preparawynych, a szczególnie, analitycznych – m.in. w 

ochronie zdrowia, badaniach leków, żywności, wyciągów roślinnych, grzybowych, w różnych gałęziach 

gospodarki i innych, a także w badaniach naukowych [1–16]. Największa grupa zastosowań, jak to wynika z 

literatury, dotyczy analityki zawartości określonych związków chemicznych, albo grup związków 

chemicznych w rozdzielanych mieszaninach. Wyraźnie mniej aplikacji technika TLC znalazła w 

zastosowaniu wyłącznie do rozdzielania grupowego. W tym przypadku jest ona wykorzystywana przede 

wszystkim jako metodyka tzw. „odcisku palca” (ang. fingerprinting), w badaniach złożonych mieszanin 

wieloskładnikowych, o niskolotnych albo nielotnych składnikach, np. do identyfikacji niskolotnych produktów 

naftowych w monitoringu środowiska czy diagnozowaniu miejsc przecieków w instalacjach procesowych 

rafinerii ropy naftowej itp. [17]. Technikę TLC można również wykorzystać, jako narzędzie do identyfikacji 

źródeł skażenia środowiska. Z jej pomocą możemy np. szybko odróżniać skażenie środowiska niskolotnymi 

produktami pochodzenia naftowego od powęglowych, czy spożywczych, lub o innym charakterze [18, 19]. 

Innym niezwykle ważnym obszarem zastosowań techniki chromatografii cienkowarstwowej, NP-TLC 

oraz RP-TLC, jest łatwe oraz względnie mało kosztowne uzyskanie informacji o korzystnych warunkach 

rozdzielania określonych mieszanin z zastosowaniem HPLC [20–26]. Technika TLC jest wykorzystywana 

tutaj: 

- do szybkiego "szacowania" składu złożonych mieszanin, zwłaszcza składu grupowego, a także 

zawartości określonych składników / grup składników w różnego typu mieszaninach. W pracy doktorskiej J. 

Gudebskiej [27] technika TLC była wykorzystywana m. in. w celu ko ntroli składu grupowego eluatu, a tym 

samym, w celu identyfikacji jakościowej grup związków, znajdujących się we frakcjach odbieranych z 

kolumny według zmodyfikowanej normy PN-72/C-04025 [28]. 

- w badaniach nad wstępnym doborem optymalnych warunków rozdzielania techniką HPLC/UPC, tzn., 

rodzaju fazy stacjonarnej, fazy ruchomej, czy doboru odpowiedniego składu eluentu w izokratycznych 

warunkach rozdzielania, a także do optymalizacji przygotowania próbki/wsadu do rozdzielania. Na rysunku 1 

przedstawiono schematyczne porównanie stopnia rozdzielenia poszczególnych grup składników dla oleju 

bazowego SAE30 (parafiny – nie widoczne w świetle ultrafioletowym, fluoryzujące pod wpływem światła o 

długości fali 365 nm „monoaromaty” jednopierścieniowe, podstawione alifatycznie/alicyklicznie węglowodory 

aromatyczne – jasnofioletowa plamka w górnej części płytki, „di aromaty” – pasmo intensywnie fioletowe 

pośrodku płytki, „poliaromaty” – skupione powyżej plamki nałożonej i żywice – plamka fioletowo-brązowa 

pozostająca na starcie), przy zastosowaniu warunków elucyjnego rozdzielania techniką sorpcji -desorpcji z 

elucją stopniową w kolumnie szklanej z żelem krzemionkowym jak w metodzie PN -72/C-04025, oraz po jej 

zmodyfikowaniu [27]. 

- potencjalnie może być wykorzystywana przy doborze i opracowaniu optymalnych warunków realizacji 

procedur wielokolumnowego (multi column - NC) i wielowymiarowego (multidimensional - nD) rozdzielania 

skomplikowanych mieszanin, szczególnie z elucją izokratyczną. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

54 

λ = 254 nm 

1 

2 

Czoło eluentu 

(nC 6 /nC 7 ) 

Węglowodory nasycone 

(Saturates) 

Niedostateczne 

rozdzielenie 

(Incomplete 

separation) 

Jednopierścieniowe 

węglowodory aromatyczne 

(mono-aromatics) 

Dwupierścieniowe 


(di-aromatics) 

Wielopierścieniowe 


(di-aromatics) 

Żywice (Resins) 

Start 

Rys. 1. Chromatogramy NP-TLC frakcji odebranych z kolumny chromatograficznej według PN-72/C-04025 

(1) i zmodyfikowanej PN-72/C04025 (2) dla oleju bazowego SAE 30. Faza stacjonarna – żel krzemionowy. 

Faza ruchoma – n-heksan (nC 6 ) [27]. 

Fig.1. NP-TLC chromatograms of fractions collected from column chromatography according to PN-72/ C- 

04025 (1) and modified PN-72/C04025 (2) for SAE 30 base oil. Stationary phase – silica gel. Mobile phase – 

n-hexane (nC 6 ) [27]. 

Technika TLC może być również pom ocna do wstępnego doboru korzystnych warunków z elucją 

gradientową, chociaż w tym przypadku korzyści z jej stosowania są znacznie mniejsze. 

Szczególnie istotne znaczenie ma też informacja o tym, czy wszystkie nielotne i niskolotne składniki 

rozdzielanej mieszaniny są eluowane z kolumny z wykorzystaniem eluentu o określonym składzie oraz sile 

elucyjnej, w tym, o składzie odpowiadającym końcowemu składowi eluentu w warunkach elucji gradientowej. 

Z wykorzystaniem TLC można też uzyskać informacje o nierozpuszc zalności bądź bardzo niskiej 

rozpuszczalności określonych składników w eluencie. Jeżeli – mimo kilkukrotnej elucji eluentem o 

określonym składzie – na starcie pozostaje plamka składników mieszaniny, która zupełnie nie „poruszyła 

się”, wówczas: 

- ma miejsce tak wysoko energetyczna adsorpcja, która powinna zostać uznana za chemisorpcję [19], 

albo, 

- ma miejsce całkowity brak rozpuszczalności określonych składników rozdzielanej mieszaniny w 

zastosowanym eluencie [19]. 

Mieszanina taka, wprowadzona do kolumny, spowoduje wyraźne przytkanie/zatkanie kolumny, a w 

rezultacie wytrącenia się nierozpuszczalnych składników, albo dezaktywację części/całej powierzchni 

sorpcyjnej kolumny, pod wpływem trwałej sorpcji bardzo silnie sorbowanych składników rozdzielanej 

mieszaniny. Składniki takie nie będą desorbowane nawet przez zastosowanie eluentu o najwyższej sile 

elucyjnej, zarówno w warunkach zwykłego przepływu eluentu w kolumnie (NF), jak i w warunkach zwrotnego 

przepływu eluentu w kolumnie (EBF) [19]. 

Obecnie technika TLC-FID, swoje zastosowanie znajduje główne w rozdzielaniu grupowym i badaniu 

składu grupowego wieloskładnikowych, rozpuszczalnych w eluencie, niskolotnych lub nielotnych materiałów 

organicznych, w ich analityce technicznej oraz kontroli jakości. Służy głów nie do szacunkowego badania 

składu grupowego w/w produktów/materiałów, w tym tłuszczów i produktów ich konwersji [29–34]. 

W badaniach "lipidów", w tym tłuszczów i ich pochodnych, wykorzystanie chromatografii 

cienkowarstwowej [35–41] ma miejsce zarówno w sposób tradycyjny, tzn. w normalnych układach faz (NP- 

TLC), jak i – jednak znacznie rzadziej – z zastosowaniem w sposób nietypowy odwróconych układów faz 

(RP). W normalnych układach faz stosowane są nadal naturalne adsorbenty, głównie żel krzemionkowy, ale 

też – chociaż znacznie rzadziej – tlenek glinu, krzemian magnezu, ziemia okrzemkowa oraz bezwodne, 

nisko i średnio polarne, jedno lub kilku składnikowe, eluenty. W ostatnich latach coraz szersze 

zastosowanie – także w TLC – znajdują adsorbenty typu NP, o grupach funkcyjnych związanych wiązaniami 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

55 

siloksanowymi, na powierzchni porów żelu krzemionkowego. Są to sorbenty typu DIOL, NH2, CN, AMID, 

SCX, SAX, o grupach funkcyjnych odpowiednio: alkilo-, lub arylo- diol, amina, nitryl, amid, kwas sulfonowy, 

czy zasada amoniowa i inne, np. cyklodekstryny, kwas holowy, acetylocholina i inne – w zasadniczej 

większości związane na powierzchni porów wewnątrz-ziarnowych. 

W podobny sposób wykorzystuje się również fazy stacjonarne do odwróconych układów faz (RP -TLC). 

Przy czym, raczej wyłącznie o fazie stacjonarnej typu C18 (oktadekan związany wiązaniem siloksanowym na 

powierzchni żelu krzemionkowego). Niekiedy też z wykorzystaniem faz stacjonarnych typu CN 

zastosowanych z bezwodnym, nisko- i średnio-polarnym eluentem. Jak dotychczas, bardzo rzadko prowadzi 

się tego rodzaju badania z wykorzystaniem TLC i grup funkcyjnych typu C8, lub PHENYL i innych, 

związanych z żelem krzemionkowym. 

W związku ze szczególnie wysoką hydrofobowością tłuszczów i części produktów ich konwersji – 

szczególnie triacylogliceroli (TAG) oraz różnego rodzaju estrów kwasów tłuszczowych, czy esterów steroli, a 

w konsekwencji brakiem ich rozpuszczalności w polarnych rozpuszczalnikach organicznych, mających nawet 

niewielkie zawartości wody, a także w wodzie, w warunkach rozdzielania z wykorzystaniem sorbentów do 

RP-TLC, nie stosuje się jakiegokolwiek dodatku wody do eluentu, tak podczas rozdzielania jednoetapowego, 

jak i w pierwszym etapie rozdzielania kilkuetapowego. W takim przypadku składnikami eluentu są: acetonitryl 

(AcCN), bezwodny metanol (MeOH) (rzadziej bezwodny etanol, który jest higroskopijny) czy izopropanol 

(IzOH), aceton (ACT), dichlorometan (DCM), dichloroetan (DCE), chloroform, etery, albo ich mieszaniny. 

Jest oczywiste, że w warunkach normalnych układów faz (NP), podwyższanie polarności eluentu, 

powoduje wzrost jego siły elucyjnej, a podwyższanie polarności fazy stacjonarnej, powoduje wzrost energii 

oddziaływań składników układu rozdzielczego z powierzchnia sorpcyjną fazy stacjonarnej. Natomiast, 

zastosowanie faz stacjonarnych do chromatografii faz odwróconych z bezwodnym eluentem, jest przyczyną 

innych oddziaływań – tak na powierzchni fazy stacjonarnej, jak i w przestrzeni eluentu, niż w warunkach, gdy 

eluent zawiera wodę. Znacznie większą rolę odgrywają wówczas oddziaływania kwadrupolowe oraz 

dyspersyjne, niż ma to miejsce w obecności wody w eluencie. Wówczas, gdy rozdzielana mieszanina 

zawiera oprócz składników lipofilowych – głównie triacylogliceroli (TAG), czy "karotenów", "poliacetylenów", 

"izoprenoidów", lub tokoferoli itp. składników – też składniki polarne, np. glicerynę, monoacyloglicerole i 

względnie polarne, jak, wolne kwasy tłuszczowe, czy diacyloglicerole, lub polifenole, karotenoidy, albo 

sterole – wówczas w TLC, zarówno w normalnych (NP), jak i odwróconych (RP) układach faz, stosuje się 

wielo- (dwu, lub trójstopniowe) rozdzielanie [17] albo rozdzielanie dwuwymiarowe [42–45]. Przykłady 

rozdzielania trójstopniowego, w przypadku rozdzielania nielotnych produktów naftowych, przedstawiono na 

rysunku 2. 

Rys. 2. Fotografie chromatogramów TLC po 3-stopniowej elucji w kierunku malejącej siły elucyjnej 

eluentu: eluent 1 – dichlorometan:metanol 95:5 (v/v) 3,5 cm, eluent 2 – toluen 5,5 cm, eluent 3 – 

heksan 9 cm, wizualizacja: a) λ = 254 nm, b) λ = 366 nm; próbki: SAE30 – olej bazowy SAE30; BS – olej 

bazowy Bright Stock; CON – ciężki olej napędowy; OO – olej opałowy; PA – pozostałość atmosferyczna; 

PP – pozostałość próżniowa; Jet – paliwo turboodrzutowych silników lotniczych; LOTOS – olej smarowy 

mineralny „LOTOS” [17]. 

Fig. 2. Photographs of TLC chromatograms after 3-step elution carried out towards decreasing elution 

strength: eluent 1 – dichloromethane:methanol 95:5 (v/v) 3.5 cm, eluent 2 – toluene 5.5 cm, eluent 3 – 

hexane 9 cm, visualization: a) λ = 254 nm, b) λ = 366 nm; samples: SAE30 – base oil SAE30; BS – base oil 

BrightStock; CON – heavy fuel oil; OO – heating oil; PA – atmospheric residue; PP – vacuum residue; Jet – 

aircraft fuel; LOTOS – mineral oil “LOTOS” [17]. 

Rozdzielanie wielostopniowe może odbywać się na dwa sposoby, zależnie od charakteru 

rozpuszczalności składników rozdzielanej mieszaniny w eluentach stosowanych w kolejnych etapach elucji, 

podobnie jak to opracował swego czasu autor i współpracownicy dla rozdzielania grupowego tzw. 

pozostałości próżniowych z destylacji ropy naftowej, asfaltów, czy tzw. "smół powęglowych" [19]. Postępuje 

się z zasady w ten sposób, by pierwszym eluentem był taki, w którym wszystkie składniki /grupy składników 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

56 

rozdzielanej mieszaniny dobrze się rozpuszczają. Np. w przypadku mieszaniny zawierającej TAG'i, DAG'i, 

MAG'i, WKT oraz glicerynę, szczególnie, gdy zawartość dwóch ostatnich grup składników nie jest śladowa, 

to pierwszym eluentem powinien być eluent, w którym wszystkie w/w grupy składników się rozpuszczają, 

tzn., np. tetrahydrofuran (THF), dioksan, aceton, butanon (MEK – metylo-etylo-keton), czy etoksyetanol itp. 

lub mieszanina tych składników z nisko polarnym składnikiem eluentu, np. z dichlorometanem, 

chloroformem, eterem di-etylowym (Et-O-Et), eterem metylowo-tertbutylowym (MTBE), etrem etylowotertbutylowym 

(ETBE), n-heksanem (nC 6 ), octanem etylu itp. składnikami eluentu. W przypadku gdy 

stosowany eluent ma niską siłę elucyjną w konkretnych, zastosowanych warunkach rozdzielania, to elucję 

wykonuje się na prawie całą wysokość płytki TLC, albo pręcika TLC -FID. Natomiast, w przypadku 

zastosowania eluentu o wysokiej sile elucyjnej elucję wykonuje się na 1/3 do 2/3 wysokość płytki TLC / 

pręcika TLC-FID. Tzn., elucję wykonuje się na tym niższą wysokość płytki, im większą siłę elucyjną posiada 

eluent, będący dobrym rozpuszczalnikiem wszystkich składników rozdzielanej mieszaniny. W kolejnych 

etapach elucji stosuje się eluenty o odpowiednio: wyższej, albo niższej sile elucyjnej, niekoniecznie będące 

dobrymi rozpuszczalnikami wszystkich składników / grup składników rozdzielanej mieszaniny oraz elucję na 

o tyle wyższym dystansie, na płytce TLC, im niższa jest siła elucyjna zastosowanego eluentu. Należy jednak 

pamiętać, że w technice TLC nigdy nie może być stosowany eluent, w którym jakiś składnik mieszaniny 

zupełnie się nie rozpuszcza! 

Dla porządku, należy też wspomnieć o potencjalnej możliwości wykorzystywania warunków 

oddziaływań hydrofilowych (HILIC) w chromatografii cienkowarstwowej – TLC-HILIC. Warunki te, znajdują 

jednak zastosowanie tylko do rozdzielania polarnych składników / grup składników o względnie dobrej 

rozpuszczalności w wodzie. W przypadku składników tłuszczów i produktów ich konwersji dobrze 

rozpuszcza się w wodzie tylko gliceryna. W związku z czym, warunki HILIC nie mają zastosowania w 

rozdzielaniu tłuszczów i produktów ich konwersji, tak w warunkach TLC, jak i HPLC lub UPLC. 

W chromatografii adsorpcyjnej na retencję i selektywność rozdzielania ma wpływ temperatura. 

Jednakże, szczególnie w normalnych układach faz z bezwodnymi eluentami, ale też i z hydrofobowymi 

fazami stacjonarnymi, gdy eluent nie zawiera wody, na retencję i selektywność rozdzielania ma wpływ 

aktywność powierzchni sorpcyjnej adsorbentu, a także stopień nasycenia komory TLC oparami eluentu i 

stopień równowagi na/w bezpośrednim sąsiedztwie powierzchni sorpcyjnej między warstwą adsorbatu a 

oparami eluentu. W konsekwencji, w bezwodnych warunkach układów faz normalnych, a także w warunkach 

hydrofobowych faz stacjonarnych – tak, z bezwodnymi, jednoskładnikowymi, jak i z wieloskładnikowymi, 

eluentami – bezpośrednie przenoszenie optymalnych warunków oraz otrzymywanych wówczas parametrów 

retencji (k) i selektywności ( ) podczas rozdzielania TLC do chromatografii kolumnowej (HPLC), nie 

prowadzi do identycznych wartości współczynnika retencji (k). Ogólnie można stwierdzić, że określony eluent 

– nawet jednoskładnikowy – ma zawsze niższą, czasem tylko niewiele niższą, siłę elucyjną w warunkach 

NP-TLC, niż w warunkach NP-HPLC [19,26]. 

Niektórzy badacze donoszą, że w przypadku gdy wartość współczynnika retencji (k) obliczona na 

podstawie R f z zależności (1), wynosi k TLC : 

k TLC = (1-R f )/R f (1) 

gdzie R f , to współczynnik retencji w chromatografii cienkowarstwowej, obliczany jako stosunek drogi 

migracji środka plamki/pasma wzdłuż płytki TLC, do drogi migracji czoła eluentu wyznaczany dla 

jednostopniowej elucji w TLC, 

to: k HPLC = a k TLC (2) 

gdzie: a Є < 1 ; 1/2 > (3) 

czyli, wartość k określonego składnika / grupy eluowanych składników, dla warunków NP HPLC może 

być nawet dwukrotnie niższa, niż w warunkach TLC [25]. Wynika to z okoliczności, że w warunkach NP -TLC, 

eluent nie znajduje się w równowadze z powierzchnią sorpcyjną fazy stacjonarnej (zróżnicowane wartości 

tzw. stopnia nasycenia komory TLC parami składników eluentu), gdy równowaga taka, tzn., miedzy 

składnikami eluentu, powierzchnią fazy stacjinarnej kolumny - w warunkach chromatografii kolumnowej i 

elucji izokratycznej ze stałym składem eluentu - ma miejsce. Dodatkowo, duży wpływ na to ma adsorpcja 

wody na powierzchni sorpcyjnej płytek, a jej ilość jest różna, w różnych warunkach prowadzenia badań 

(zależna od wilgotności względnej powietrza), co za tym idzie, może nastąpić częściowa dezaktywacja fazy 

stacjonarnej [26]. 

W przypadku bezwodnych eluentów i hydrofobowych faz stacjonarnych, także ma miejsce podobna 

reguła, z tym że, dla względnie wysoce hydrofobowych "analitów", różnice wartości k TLC i k HPLC są bardzo 

niewielkie. Przyczyną tego jest mniejszy wpływ warunków rozdzielenia na właściwości sorpcyjne fazy 

stacjonarnej w przypadku rozdzielania substancji średnio i nisko polarnych [26]. 

W warunkach TLC może też mieć miejsce tzw. efekt demiksji. Zjawisko to obserwujemy gdy składniki, 

dwu- lub wieloskładnikowego eluentu, różnią się znacznie siłą elucyjną. Dodatkowo, istotne znaczenie ma 

też jednoczesna różnica lepkości poszczególnych składników eluentów. Następuje powstawanie tzw. „frontu 

demiksji”, tzn. granicy frontu elucji eluentu bogatego w składnik o wyraźnie wyższej sile elucyjnej, często o 

dodatkowo wyższej lepkości i napięciu powierzchniowym. Wówczas wyniki rozdzielania w układach 

rozdzielczych TLC, szczególnie NP-TLC, mogą mieć tylko orientacyjne znaczenie dla przewidywani a 

rozdzielania w NP-HPLC. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

57 

Warto też zwrócić uwagę na korzyści, ale także niedogodności, techniki cienkowarstwowej 

chromatografii cieczowej z detekcją płomieniowo -jonizacyjną TLC-FID, tzn., odmiany chromatografii 

cienkowarstwowej (TLC), z zastosowaniem kwarcowych pręcików pokrytych mikro-ziarnistą, specjalnie 

spreparowaną fazą stacjonarną z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (FID). Jest to technika umożliwiająca 

otrzymanie jedno- lub kilkustopniowego rozdzielenia w/g zasady chromatografii cienkowarstwowej, a 

następnie "ilościowych" rezultatów oznaczenia zawartości organicznych niskolotnych składników i grup 

składników badanej mieszaniny w formie pików chromatograficznych, dzięki przeprowadzeniu wysuszonego 

pręcika TLC z rozdzielonymi frakcjami składników rozdzielanej mieszaniny "immobilizowanych" na 

powierzchni sorpcyjnej, przez płomień powietrzno-wodorowy wewnątrz głowicy detekcyjnej detektora 

płomieniowo-jonizacyjnego FID [42, 46–48]. 

Schemat ideowy zasady działania i detekcji systemu TLC-FID zamieszczono na rysunku 3. Należy 

mieć świadomość, że uzyskanie zadowalającej precyzji oznaczania składu mieszanin związków 

organicznych techniką TLC-FID, wymaga bardzo starannej powtarzalności wykonania wszystkich etapów 

badania oraz znacznej wprawy operatora. Mimo to, oznaczenia są wielokrotnie mniej dokładne i znacznie 

mniej precyzyjne, niż ma to miejsce w chromatografii gazowej z detekcją płomieniowo -jonizacyjną (GC-FID) 

[49]. Wynika to z okoliczności wprowadzania do płomienia detektora TLC-FID składników badanej 

mieszaniny, znajdujących się na powierzchni fazy stacjonarnej w postaci stałej, ewentualnie ciekłej, a nie jak 

w technice GC-FID, w postaci oparów w gazie nośnym. W przypadku GC-FID, sygnał detekcyjny w postaci 

prądu elektrycznego spowodowanego przez strumień karbokationów CH 2 

+ 

powstaje natychmiast w 

przestrzeni detekcyjnej. W detektorze typu TLC-FID musi najpierw nastąpić odparowanie "analitu" z 

powierzchni sorpcyjnej, jego piroliza (w części spalanie), a kolejno dopiero wytworzenie w/w karbokationów. 

Przy typowej prędkości przemieszczania pręcika wynoszącej ok. 2 mm/sek, prowadzi to do uzyskiwania 

wielokrotnie niższej czułości detektora TLC-FID, niż GC-FID. W konsekwencji badanie składu mieszanin 

techniką TLC-FID może dotyczyć tylko składników występujących w badanej mieszaninie na względnie 

wysokim poziomie zwartości, a granica oznaczalności (LOQ) wynosi orientacyjnie od 0.05 % m/m, do ok 0.5 

% m/m. Jest tym niższa, im większa jest prędkość ruchu pręcika przez płomień. 

Rys. 3. Schemat stanowiska pomiarowego TLC-FID Iatroscan i procedury postępowania w czasie 

oznaczania składu grupowego tą metodą. 

Fig. 3. The scheme of TLC-FID Iatroscan measurement site and procedures applied while determining the 

group composition by this method. 

Badanie składu mieszanin związków organicznych techniką klasycznej chromatografii TLC z 

fotometrycznym oznaczaniem intensywności plamek jest, jednakże, bardziej utrudnione, często też jeszcze 

mniej dokładne i mniej precyzyjne, niż techniką TLC-FID. Przede wszystkim jednak, w warunkach 

wykonywania oznaczeń z zastosowaniem "klasycznej" TLC, nie można wykorzystać metodyki "prostej 

normalizacji", jaką często stosuje się w TLC-FID. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

58 

W technice klasycznej chromatografii cienkowarstwowej (TLC) - w przypadku gdy anality nie wykazują 

barwy w świetle widzialnym - mamy do dyspozycji kilka metod wizualizacji plamek/pasm na powierzchni 

płytek, dzięki czemu można wykonać analizę obrazu i na podstawie jej wyników, wykonać oznaczenie masy / 

stężenia analitu / analitów. Są to: 

1. Oświetlanie powierzchni płytek za pomocą lampy emitującej promieniowanie UV 365 nm (koniecznie 

w okularach ochronnych, absorbujących całkowicie światło w zakresie UV!). W takim przypadku widoczna 

jest fluorescencja wzbudzona przez światło 365 nm, widoczna w zakresie widzialny m tych składników 

rozdzielanej mieszaniny, które zjawisko fluorescencji wykazują w sposób naturalny. Jest to metoda 

wizualizacji o szczególnie wysokiej czułości. 

2. Wykorzystanie płytek "F 254 " , lub "F 254+365 " z trwale obecnym w bardzo niewielkich ilościach, 

immobilizowanym na powierzchni sorpcyjnej płytki TLC – luminoforem, którym często bywa siarczek cynku 

(ZnS), lub innego rodzaju „fluoresceina”. Nie ma ona, jednocześnie, wpływu na retencję i selektywność 

rozdzielania. „Luminofor”, pod wpływem odpowiedniego rodzaju światła UV, zapewnia powstawanie białej, 

zielonkawej, żółtawej, albo innej barwy luminescencji powierzchni sorpcyjnej płytki TLC, w zakresie światła 

widzialnego. Płytka TLC umieszczona po rozwinięciu i wysuszeniu, w świetle odpowiedniego rodzaj u lampy 

UV ("niskociśnieniowej" – głównie 254 nm lub "średnio-ciśnieniowej" – głównie 280 i 365 nm) pokazuje obraz 

obecności plamek tych składników rozdzielanej mieszaniny, które absorbują odpowiednie światło UV w 

formie "szarości" o zróżnicowanej intensywności – proporcjonalnej do masy/zawartości badanego składnika 

w obrębie plamki. Nie jest to sposób o wysokiej czułości, jednak stosunkowo uniwersalny, gdyż bardzo wiele 

organicznych związków chemicznych posiada struktury molekularne absorbujące światło UV o długości fali 

254 nm. Niektóre, także 365 nm. 

3. Jedną ze stosowanych metod wizualizacji w TLC, jest „chemiczne” wywoływanie barwy plamek, w 

zakresie światła widzialnego. Należy wyróżnić dwie odrębne metodyki: 

a) Wywoływanie "uniwersalne", ale o niezbyt wysokiej czułości i o nie najlepszej powtarzalności 

rezultatów "ilościowych", tzn., 

- Wywoływanie brązowej / żółto-brązowej barwy plamek w oparach jodu (I 2 ) – rysunek 4, 

- Wywoływanie zaczernienia, albo zszarzenia plamek składników mieszaniny na płytce poprzez 

spryskanie jej powierzchni przy pomocy nebulizera, mgłą stężonego kwasu siarkowego H 2 SO 4 . 

Uniwersalność w/w metodyk jest jednak ograniczona. Sprowadza się do wywoływania barwy plamek tylko 

organicznych związków chemicznych, jednak nie węglowodorów nas yconych (alkanów i cykloalkanów), a w 

przypadku olefin, posiadających jedynie pojedyncze wiązania podwójne, czułość jest bardzo niewielka. 

Barwę łańcuchów alifatycznych, albo cykloalifatycznych, można wywołać poprzez spryskiwanie wysuszonej 

płytki TLC, roztworem siarczanu berberyny [50], jednak i w tym przypadku czułość jest bardzo mała. 

Rys. 4. Przykład chromatogramów uzyskanych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, TLC. 

Fotografie płytek TLC: po lewej Si 60 F 254 , po prawej RP 18 F 254 . Eluent: THF. Oznaczenia: linia ciągła – plamki 

widoczne przy 254 nm, plamki koloru brązowawego – plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. 1- 

TAG, 2-DAG, 3-MAG, 4-WKT, 5-olej rzepakowy. Próbki 1-3 – oleiniany, próbka 4 – kwas erukowy. Stężenie 

wszystkich próbek wynosiło 10 mg/mL, na płytkę TLC nanoszono po 5 µL każdej z próbek [51]. 

Fig. 4. Examplary chromatograms obtained by means of thin layer chromatography, TLC. Photographs of 

TLC plates: on the left Si 60 F 254 , on the right RP 18 F 254 . Eluent: THF. Meaning of lines: a solid line - spots 

visible at 254 nm, brown spots - spots visible after development in iodine vapor. 1-TAG, 2-DAG, 3-MAG, 4- 

WK , 5-rapeseed oil. Samples 1-3 – oleates, sample 4 - erucic acid. Concentration of all samples was equal 

10 mg/Ml, on the TLC plate was applied 5 µL of each sample [51]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

59 

b) "Specyficzne" metodyki wywoływania barwy określonych grup związków chemicznych, albo jonów, 

tak organicznych, jak i nieorganicznych – o określonych grupach funkcyjnych lub jonach, albo wręcz 

określonych indywiduów chemicznych – dzięki przeprowadzeniu na powierzchni sorbentu reakcji 

chemicznych, prowadzących do utworzenia pochodnych wykazujących barwę w świetle widzialnym, albo 

znacznie częściej, wykazujących fluorescencję (rzadziej luminescencję lub fosforescencję) w świetle 

widzialnym, pod wpływem oświetlenia płytki światłem UV 254 nm, lub/i 365 nm. W ostatnich latach metodyki 

te nie są już raczej rozwijane, posiadają jednak bardzo bogatą literaturę, wśród której należy przede 

wszystkim, wyróżnić prace J.F.K. York'a [52–54]. Ostatniego rodzaju procedury wywoływania barwy 

opracowano również dla tłuszczów i ich pochodnych, jednakże, w ramach badań niniejszej pracy nie będą 

one stosowane. 

Badania niniejszej pracy, w zakresie wykorzystywania techniki klasycznej chromatografii 

cienkowarstwowej, mają charakter nie-ilościowy, dlatego ograniczono się do wykorzystania wywoływania 

barwy plamek parami jodu. 

Celem badań niniejszej pracy jest określenie celowości stosowania oraz ustalenie korzystnych 

warunków wykorzystania technik "klasycznej" chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w normalnych (NP - 

TLC F 254 ) z wykorzystaniem żelu krzemionkowego jako adsorbentu oraz żelu krzemionkowego ze 

związanymi grupami C18 („RP-TLC F 254 ”), a także chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo - 

jonizacyjną (NP-TLC-FID), w badaniach nad opanowaniem optymalnych warunków rozdzielania grupowego 

oraz badania składu grupowego i otrzymywania grup składników będących tłuszczami i produktami ich 

konwersji, a także, wykorzystania tych technik rozdzielczych i analitycznych, jako metodyk "fingerprintingu" i 

szacunkowego badania składu grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji. 

Odległym – jednakże, jak się wydaje, coraz bardziej realnym - celem tej serii badań, jest opracowanie 

optymalnych warunków stosowania kolumnowej wysokosprawnej elucyjnej chromatografii cieczowej 

(HPLC/UPC) w trybie wielokolumnowym i wielowymiarowym, oraz w sposób zautomatyzowany, w 

rozdzielaniu, identyfikacji i oznaczaniu składu, tzn. oznaczaniu zawartości poszczególnych izomerów 

acylogliceroli - w tym z rozdzielaniem ich izomerów optycznych, a także izomerów cis i trans. Opanowanie 

takich metodyk rozdzielania i oznaczania, powinno także umożliwić, otrzymywanie wysokiej czystości 

składników tłuszczów i ich pochodnych, jako grup składników albo indywiduów chemicznych, w skali semi - 

preparatywnej lub preparatywnej. 

2. Część doświadczalna 


2.1. Materiały i próbki: 

W badaniach wykorzystano: aluminiowe płytki TLC silica gel 60 F 254 oraz TLC silica gel 60 RP-18 

F 254 s, pręciki kwarcowe Chromarod SIII pokryte żelem krzemionkowym, metanol cz.d.a. POCh (Polska), 

chlorek metylenu cz.d.a. POCh (Polska), n-heksan do HPLC Merck (Niemcy), tetrahydrofuran cz.d.a. POCh 

(Polska), izopropanol cz.d.a. POCh, kwas trifluorooctowy 99% Sigma-Aldrich (Niemcy). 

2.2. Sprzęt i wyposażenie: 

Komory do chromatografii cienkowarstwowej; analizator TLC-FID IATROSCAN produkcji Iatron Labs. 

(Japonia). Uzupełnienie wyposażenia stanowiły: automatyczny dozownik próbek SES 3200/IS-01, suszarka 

pręcików TLC TK-8, przetwornik analogowo-cyfrowy i oprogramowanie do obróbki danych Chomik (Polska), 

urządzenie do wizualizacji plamek na płytkach TLC z lampą UV 254/365nm. 

2.3. Procedura prowadzenia badań TLC / TLC-FID: 

W badaniach techniką TLC-FID, wykorzystano analizator IATROSCAN oraz pręciki kwarcowe 

Chromarod SIII pokryte żelem krzemionkowym. W przypadku klasycznej techniki TLC wykorzystano płytki 

pokryte żelem krzemionkowym typu „H60” oraz typu „RP”, w obu przypadkach zawierającym wskaźnik 

fluorescencyjny odpowiednio typu typu „F254”. Fazę ruchomą lub składniki fazy ruchomej, stanowiły: 

dichlorometan (DCM), toluen (T), chloroform, izomeryzat, n-heksan (n-C6), metanol (MeOH), izopropanol 

(izoOH) oraz ich mieszaniny. 

Elucję wykonywano: 

rozwijanie trójstopniowe (dichlorometan:metanol 95:5 v/v, toluen, n -heksan – w dwóch kierunkach, tj. 

w kierunku rosnącej oraz malejącej siły elucyjnej), 

rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 95:5v/v + 0,075% TFA), 

rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 97:3 v/v + 0,075% TFA), 

rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 95:5 v/v + 0,5% CH 3 COOH), 

rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 97:3 v/v + 0,5% CH 3 COOH). 

W celu cofnięcia dysocjacji kwaśnej rozdzielanych związków chemicznych stosowano kwas 

trifluorooctowy jako dodatek do eluentu w stężeniu 0,075% lub kwas octowy w stężeniu 0,5%. Bezpośrednio 

przed każdym rozdzielaniem, ramkę z pręcikami aktywowano w płomieniu wodorowym detektora FID, 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

60 

trzykrotnie w czasie 35s, 50s, 50s, natomiast płytki TLC wygrzewano w suszarce w temp. 110˚C, w czasie 5 

h. Aktywowane płytki TLC oraz ramki z pręcikami TLC-FID przechowywano przez 10 min w eksykatorze, w 

celu ochłodzenia. Plamki nakładano z wykorzystaniem automatycznego aplikat ora, dozując 1 l roztworu o 

stężeniu 0,5 mg badanej mieszaniny/mL heksanu. W celu przyśpieszenia odparowywania rozpuszczalnika, 

powierzchnię pręcika/płytki ogrzewano strumieniem ciepłego powietrza. Po nałożeniu plamek zarówno 

pręciki jak i płytki TLC suszono przez 5 minut w suszarce, w temperaturze 50ºC, po czym umieszczano je na 

10 min w eksykatorze. Po tym czasie wieszano nad rozpuszczalnikiem w komorze chromatograficznej (10 

minut) i poddawano rozwijaniu. Schemat stanowiska przedstawiono na rysunku 3. 

Detekcja z zastosowaniem techniki TLC-FID następowała podczas przejścia każdego pręcika, w 

czasie 35 sekund, przez płomień wodorowy detektora FID z jednoczesną cyfrową rejestracją sygnału z 

elektrometru. Na rysunku 5 przedstawiono widok ramki z pręcikami TLC Chromarods SIII, umieszczonej w 

komorze detektora, analizatora Iatroscan. 

W przypadku techniki TLC, po rozwinięciu płytek, wykonywano wizualizację pod lampą UV przy 

254nm oraz 365nm. Rozdzielnie i oznaczania każdej próbki wykonano trzykrotnie. 

Rys. 5. Widok ramki z dziesięcioma pręcikami TLC umieszczonej w komorze detektora FID, w aparacie 

Iatroscan. 

Fig. 5. View of frame with ten rods placed in the TLC-FID chamber in Iatroscan apparatus. 



Technika TLC i TLC-FID w rozdzielaniu grupowym niskolotnych produktów naftowych 

Na rysunku 6-tym zamieszczono przykład dwóch chromatogramów TLC-FID, przedstawiających 

rezultaty rozdzielania grupowego na pręcikach Chromarods SIII i detekcji za pomocą detektora FID w 

aparacie IATROSCAN, odpowiednio: oleju bazowego typu bright stock, otrzymanego w rezultacie rafinacji 

pozostałości próżniowej z ropy naftowej – na rys. 6A oraz pozostałości z destylacji próżniowej, z której 

brighstock został otrzymany – rys. 6B. 

Elucja była wykonywana po dwukrotnej aktywacji pręcika w płomieniu wodorowym w czasie 35 i 50s, 

n-heksanem (nC6) na dystansie ok. 95% długości warstwy fazy stacjonarnej, toluenem (T) na dystansie ok. 

55% wysokości tej warstwy oraz mieszaniną dichlorometan-metanol w stosunku objętościowym 95:5 (v/v) 

(DCM/MeOH 95:5), na dystansie ok. 30%. Z tym, że w przypadku brightstocku – w kolejności malejącej siły 

elucyjnej, tzn kolejno: nC6, T, DCM -MeOH 95:5, a w przypadku pozostałości próżniowej, w kierunku spadku 

siły elucyjnej na tym samym dystansie wysokości jak dla oleju bazowego. Piki na tych chromatogramach to, 

odpowiednio: a,a’ – frakcja węglowodorów alifatycznych i alicyklicznych, z nieznaczną, najprawdopodobniej 

zawartością jednopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z rozbudowanymi strukturami 

alifatycznymi i alicyklicznymi, co powoduje brak możliwości adsorpcyjnych oddziaływań pierścienia 

aromatycznego z powierzchnią sorbentu, b,b’ – nielotne jednopierścieniowe węglowodory aromatyczne w 

ten sposób podstawione alifatycznie i alicyklicznie, że możliwa jest sorpcja pierścienia aromatycznego do 

powierzchni aktywnego żelu krzemionkowego, c,c’ – jedno- i dwu- oraz wyżej-pierścieniowe podstawione 

alifatycznie i alicyklicznie węglowodory aromatyczne o powinowactwie sorpcyjnym do powierzchni SiO 2 

zbliżonym do 1-metylonaftalenu, fenantrenu, pirenu, benzo(a)pirenu itp.; d,d’ – tzw. żywice” (resins) – 

węglowodory polarne, zawierające w strukturze molekularnej pierwiastki inne niż C/H, tzn. N, O, SH, Ni, Fe; 

e’ – asfalteny – podstawione alifatycznie/alicyklicznie – wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

61 

zawierające grupy karboksylowe i inne struktury z N, S, O, o dotychczas bliżej nie określonych, 

skomplikowanych strukturach molekularnych, jednocześnie nierozpuszczalne w n-alkanach. 

Technika TLC-FID okazała się niezwykle przydatna w badaniach składu grupowego nisko lotnych i 

nielotnych frakcji i produktów naftowych różnego rodzaju, otrzymywanych podczas operacji destylacji 

próżniowej ropy naftowej, w tym z pozostałości próżniowej. Ta technika okazuje się też przydatna dla 

rozdzielania oraz badania składu grupowego innego rodzaju wieoskładnikowych mieszanin, organicznych 

związków chemicznych. Przy czym dobór warunków rozdzielania jest uprzednio wykonywany z 

zastosowaniem „klasycznej” techniki cienkowarstwowej chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Technika 

TLC jest też przydatna do wstępnego doboru warunków rozdzielania grupowego dla techniki HPLC/UPLC 

(UPC), mimo podanych powyżej ograniczeń z prostym przenoszeniem parametrów retencji i selektywności z 

techniki TLC do HPLC/UPLC. 

Rys. 6. Przykład chromatogramu TLC-FID po 3-stopniowej elucji gdzie eluentami były – dichlorometan:metanol 

95:5 (v/v), toluen, heksan, A) olej bazowy Bright Stock, elucja w „kierunku” wzrostu siły elucyjnej kolejnych eluentów; B) 

pozostałość próżniowa, elucja w „kierunku” spadku siły elucyjnej kolejnych eluentów. 

Fig. 6. TLC-FID chromatograms after 3-step elution where the eluents were – dichloromethane:methanol 95:5 (v/v), 

toluene, hexane, A) base oil Bright Stock, elution carried out towards increasing elution strength; B) atmospheric 

residue, elution carried out towards decreasing elution strength. 

Dobór warunków rozdzielania grupowego acylogliceroli i ich pochodnych 

Wstępny dobór składników i składu eluentu dla chromatografii kolumnowej w układach faz normalnych 

wykonano z zastosowaniem „zwykłej” chromatografii cienkowarstwowej (TLC) z płytkami z żelem 

krzemionkowym. Wpłynęło to na skrócenie czasu i zmniejszenie kosztów badań, ponieważ – jak wiadomo – 

na jednej płytce TLC można rozdzielać kilka próbek równocześnie. Dodatkowo, widać czy w przypadku 

zastosowania określonych eluentów „na starcie” nie pozostają plamki substancji bardzo silnie sorbowanych. 

Wartości liczbowe parametrów Rf i k uzyskanych dla różnych warunków rozdzielania acylogliceroli (TAG, 

DAG, MAG), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), kwasów tłuszczowych (FA) w układzie faz 

normalnych z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelem krzemionkowym (SiO 2 - 

F 254 ) zestawiono w Tabeli 1. Zamieszczono tam także wartości k obliczone na podstawie Rf. 

Badania obejmowały wykorzystanie różnych zawartości izopropanolu w eluencie, jako modyfikatora 

zwiększającego silę elucji fazy ruchomej, jak również dodatku do eluentu dwóch rodzajów kwasu- octowego i 

trifluorooctowego. 

W przypadku stosowania żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej, korzystne jest zastosowanie 

silniejszego eluentu – mieszaniny heksanu i izopropanolu w stosunku objętościowym 95:5 oraz modyfikatora 

kwasowego – kwasu trifluorooctowego. W przypadku stosowania pręcików z naniesioną fazą stacjonarną 

konieczne jest aktywowanie powierzchni pręcików przez poddanie ich ogrzewaniu i jednoczesnym spalaniu 

zanieczyszczeń w płomieniu wodorowym (3 razy przez 50 sekund). 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

62 

Tabela 1. Wartości współczynników Rf oraz k dla mono-, di-, tri-acylogliceroli (MAG, DAG, TAG), 

estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), kwasów tłuszczowych (FA) oraz 

glicerolu; faza stacjonarna: SiO 2 - F 254 , faza ruchoma: zgodnie ze wskazaniem w tabeli. 

Table 1. The values of Rf and k for mono-, di-, tri-acylglycerols (MAG, DAG, TAG), fatty acid methyl esters 

(FAME), fatty acids (FA) and glycerol; stationary phase: SiO 2 - F 254 , mobile phase: as indicated in table. 

Substancje 

(Substances) 

płytki nieaktyw ow ane 

(non-activated plates) 

97% n-heksanu, 3% izopropanolu 

(97% of hexane, 3% of isopropanol) 

WARTOŚCI Rf i k 

(Rf and k values) 

95% n-heksanu, 5% izopropanolu 

(95% of hexane, 5% of isopropanol) 

0,5%CH 3COOH 0,075% TFA 0,5% CH 3COOH 0,075% TFA 

płytki aktyw ow ane 

(activated plates) 

Rf k Rf k Rf k Rf k Rf K 

TAG 0,28 2,57 0,48 1,1 0,56 0,8 0,57 0,8 0,58 0,7 

DAG 0,05 19,0 0,21 3,8 0,30 2,3 0,33 2,0 0,35 1,9 

MAG 0,04 24,0 0,11 8,1 0,16 5,3 0,21 3,8 0,23 3,3 

FAME 0,02 49,0 0,03 32,3 0,13 6,7 0,04 24,0 0,18 4,6 

FA 0 0 0,04 24,0 0 0,40 1,5 

Glicerol 

(glycerol) 0 0 0 0 0 

Badania z zastosowaniem chromatografii cieczowej z wykorzystaniem pręcików pokrytych 

sorbentem oraz detektora płomieniowo- jonizacyjnego – TLC-FID 

Z przeglądu literatury wynika, iż chromatografia planarna jest powsz echnie stosowana do rozdzielania 

grupowego frakcji mono-, di-, tri-acylogliceroli (MAG, DAG, TAG), kwasów tłuszczowych (FA), estrów 

metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) [30, 55]. Przykład chromatogramu TLC-FID rozdzielania 

mieszaniny wzorców lipidów oraz mieszaniny wzorców acylogliceroli i kwasów tłuszczowych przedstawiono 

na rysunku 7. Natomiast na rysunku 8 zamieszczony został przykładowy chromatogram rozdzielania próbki 

pobranej z naturalnego zbiornika słodkowodnego zawierającej lipidy. 

Rys. 7. Chromatogramy TLC-FID oraz TLC-FPD: A) mieszaniny wzorców lipidów : 1. Ester cholesterolu, 2. TAG, 3. 

Cholesterol, 4. Fosfatydyloetanolamina, 5. Fosfatydylocholina, 6. Fosfatydyloinozytol, 7. Sfingomielina, 8. 

Lizofosfatydylocholina; warunki rozdzielania: pręciki Chromarod SIII; elucja: 1) chloroform -metanol-woda-25%amoniak 

47:20:2,5:0,28 – 7cm. 2) heksan-eter dietylowy 63:7 – 10cm. B) mieszaniny wzorców glicerydów : 1. TAG 

(tripalmitynian), 2. FA (kwas palmitynowy), 3. 1,3-DAG (1,3-dimirystynian), 4. 1,2-DAG (1,2-dipalmitynian), 5. MAG 

(monopalmitynian); warunki rozdzielania: pręciki Chromarod SIII; elucja: benzen / chloroform / kwas octowy 50:20:0,7 – 

10cm [55]. 

Fig. 7. TLC-FID and TLC-FPD chromatograms: A) lipids standards mixture: 1. Cholesterol ester, 2. TAG, 3. 

Cholesterol, 4. Phosphatidyl ethanolamine, 5. Phosphatidyl choline, 6. Phosphatidyl inositol, 7. Sphingomyelin, 8. 

Lysophosphatidyl choline; separation conditions: Chromarod SIII rods; elution: 1st. Chloroform -Methanol-Water- 

25%Ammonia 47:20:2.5:0.28 – 7cm; 2nd. Hexane-Diethyl ether 63:7 – 10cm; B) glycerides standards mixture: 1. 

TAG (tripalmitin), 2. FA (palmitic acid), 3. 1,3-DAG (1,3-dimyristin), 4. 1,2-DAG (1,2-dipalmitin), 5. MAG (monopalmitin); 

separation conditions: Chromarod SIII rods; elution: Benzene / Chloroform / Acetic acid 50:20:0.7 – 10cm [55]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

63 

Rys. 8. Chromatogram TLC-FID otrzymany dla próbki, zawierającej głównie okrzemki z rodziny Asterionella 

sp., Fragilaria sp., and Tabellaria sp., pobranej z nowofundlandzkiego strumienia w maju 2005r., poprzez 

holowanie sieci o drobnych oczkach (20 µm). Iatroscan – warunki rozdzielania: przepływ powietrza 2,0 

L/min, H 2 190 mL/min. HC – węglowodory; SE/WE – estry sterolowe i woskowe; KET – ketony; TAG – 

triacyloglicerole; FFA – wolne kwasy tłuszczowe; ALC – alkohole; ST – sterole; DAG – diacyloglicerole; 

AMPL – lipidy polarne rozpuszczalne w acetonie; PL – fosfolipidy; NLM – materiał nie-lipidowy [za zgodą 

56]. 

Fig. 8. TLC-FID chromatogram of a net-tow sample (20-μm mesh, consisted mainly of the pennate diatoms 

Asterionella sp., Fragilaria sp., and Tabellaria sp., taken from a Newfoundland stream in May, 2005. 

Iatroscan conditions: air flow 2.0 L/min, H2: 190 mL/min. HC – hydrocarbon; SE/WE – steryl and wax esters; 

KET – ketone; TAG – triacylglycerol; FFA – free fatty acid; ALC – alcohol; ST – sterol; DAG – diacylglycerol; 

AMPL – acetone-mobile polar lipids; PL – phospholipid; NLM – nonlipid material [with the consent of 56]. 

Widać, że technika TLC-FID może być bardzo przydatna do badań składu grupowego tłuszczów i 

produktów ich konwersji, co jest przedmiotem badań niniejszej pracy. Powyższe wnioski z przeglądu 

literatury zmobilizowały do wykonania badań techniką TLC-FID w celu sprawdzenia czy nie okaże się ona 

konkurencyjna wobec techniki NP-HPLC w badaniach składu grupowego materiałów zawierających tłuszcze 

i wybrane produkty ich konwersji. W przypadku pozytywnych wyników możnaby stosować w/w techniki 

zamiennie, w zależności od wyposażenia laboratorium i dostępności odpowiedniej aparatury. 

Przykłady chromatogramów otrzymanych z zastosowaniem TLC -FID w badanich składu grupowego 

oleju palmowego „bielonego” oraz handlowego FAME przedstawiono na rysunkach 9 i 10. 

Wykonane badania wykazały, że zastosowanie techniki TLC-FID do rozdzielania acylogliceroli i ich 

pochodnych wymaga bardzo powtarzalnej realizacji procedury postępowania. Zmiana czasu 

kondycjonowania pręcików w komorze nad rozpuszczalnikiem nie wpływa na przeciętne udziały powierzchni 

pików poszczególnych grup substancji, lecz pogarsza się powtarzalność wyników oznaczeń. Natomiast, 

takie parametry, jak zawartość wody w eluencie, a szczególnie czas przebywania pręcików nas powierzchnią 

eluentu, w jego oparach, oraz stężenie próbki nanoszonej na pręcik, mają wpływ na stopień rozdzielenia 

pików. 

Otrzymane wyniki wykazują, że precyzja oznaczeń składu grupowego oznaczania MAG, DAG, TAG, FAME, 

FA metodą TLC-FID, wyznaczona dla odchylenia standardowego, mieści się w granicach około 5% (± 2,5%) 

zawartości oznaczanych grup związków chemicznych i jest wyraźnie gorsza od rezultatów otrzymanych 

techniką HPLC. 

Rozdzielanie i analityka z wykorzystaniem wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej (HPLC) jak 

również chromatografii cienkowarstwowej TLC-FID stanowi doskonały wybór dla badań składu grupowego 

różnych materiałów. Klasyczna chromatografia cienkowarstwowa (TLC) pozwala jednakże tylko na 

jakościowe zapoznanie się ze składem grupowym badanego materiału. 

Przedstawione procedury są konkurencyjne do procedury przedstawionej w normie EN 14105 [57], w której 

zanieczyszczania FAME oznacza się z wykorzystaniem kapilarnej chromatografii gazowej (CGC) i 

„prekolumnową” derywatzacją metanolem kwasów tłuszczowych powstałych w rezultacie hydrolizy do 

lotnych, metylowych pochodnych. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

64 

Rys. 9. Chromatogram TLC-FID rozdzielania składników „olej palmowy-bielony” z zastosowaniem żelu 

krzemionkowego jako fazy stacjonarnej na kwarcowych pręcikach „SIII”, eluent: mieszanina n-heksan : 

izopropanol 95: 5 (v/v) z 0,075% TFA, gdzie: A – monoacyloglicerole (MAG), B – FAME, C – diacyloglicerole 

(DAG), D – triacyloglicerole (TAG). 

Fig. 9. TLC-FID chromatogram of "blanched palm oil" components separation using silica gel as a stationary 

phase on quartz rods „SIII”, eluent: n-hexane : isopropanol 95: 5 (v/v) with 0.075% TFA, A – 

monoacylglycerols (MAG). B – FAME, C – diacylglycerols (DAG), D – triacylglycerolS (TAG). 

Rys. 10. Chromatogram TLC- FID rozdzielania składników handlowego „FAME” z zastosowaniem żelu 

krzemionkowego jako fazy stacjonarnej na kwarcowych pręcikach „SIII”, eluent: mieszanina n-heksan : 

izopropanol 95: 5 (v/v) z 0,075% TFA, gdzie: A – kwasy tłuszczowe i glicerol. B – monoacyloglicerole (MAG), 

C – FAME, D – diacyloglicerole (DAG), E – triacyloglicerole (TAG). 

Fig. 10. TLC-FID chromatogram of commercial "FAME" components separation using silica gel as a 

stationary phase on the quartz rods „SIII”, eluent: n-hexane : isopropanol 95: 5 (v / v) with 0.075% TFA, A - 

fatty acids and glycerol, B – monoacylglycerols (MAG), C – FAME, D – diacylglycerols (DAG), E – 

triacylglycerols (TAG). 

Badania techniką TLC i TLC-FID oraz odniesienie ich rezultatów do HPLC, dla typowego rozdzielania 

grupowego oraz dla rozdzielania w warunkach GPC/SEC-NP/RP 

Badania realizowane z zastosowaniem techniki chromatografii cienkowarstwowej (TLC) – żel 

krzemionkowy, DIOL, CN, NH 2 , RP18 z i bez „fluoresceiny 254 nm”, miały dwa cele: 

• wyjaśnienie, czy inne fazy stacjonarne, niż powszechnie stosowane w grupowym rozdzielaniu 

lipidów i produktów konwersji tłuszczów, nie posiadają na tyle bardziej korzystnej selektywności, by było 

celowe zastąpienie nimi żelu krzemionkowego w rozdzielaniu g rupowym tej klasy produktów i materiałów, 

techniką HPLC, albo klasycznej preparatywnej chromatografii kolumnowej, 

a także, 

• wyjaśnienie na drodze doświadczalnej, czy i w jakim stopniu technika TLC, może być przydatna w 

doborze optymalnej fazy stacjonarnej, składników oraz składu eluentu do rozdzielania grupowego lipidów i 

produktów konwersji tłuszczów w warunkach chromatografii wykluczania, z jednoczesną adsorpcją. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

65 

Uzyskane wyniki potwierdziły znaną z literatury zasadę celowości stosowania techniki TLC do doboru 

najbardziej korzystnych składników eluentu oraz do wstępnego doboru optymalnego składu eluentu do 

rozdzielania grupowego w warunkach, tak chromatografii w normalnych układach faz (NP) do grupowego 

rozdzielania lipidów i produktów konwersji w tłuszczu, a także – choć w mniejszym stopniu – przydatność 

TLC do rozdzielania składników poszczególnych grup, z zastosowaniem hydrofobowej fazy stacjonarnej C18 

F 254 oraz bezwodnych eluentów o różnych zakresach polarności (RP-TLC F 254 ). 

Szczególnie celowe jest stosowanie do takich badań płytek HPTLC (szczególnie typu F 254 ), z żelem 

krzemionkowym, jako fazą stacjonarną, o drodze rozwijania chromatogramu TLC w zakresie 3÷6 cm, i 

dokonywanie kilkuetapowej „wizualizacji”, tzn. fotografii cyfrowej, w celu dokumentow ania, a także 

wykonania cyfrowego przetwarzania obrazu w zwykłe chromatogramy. 

Wizualizację oraz fotografie cyfrowe płytek wykonywano po kolejnych etapach rozwijania i wysuszeniu 

płytki: 

• pod lampą UV 254 nm widoczne są plamki / pasma składników, absorbujące światło 

niskociśnieniowej lampy rtęciowej, gdy ich zawartość w dozowanej na płytkę próbce, przekracza ok. 0,1–0,5 

% m/v, albo znacznie niższe zawartości, jeśli substancja, albo grupa substancji wykazuje 

fluorescencję / luminescencję pod wpływem światła lamy rtęciowej niskociśnieniowej („254 nm”); 

• pod lampą UV 360 nm widoczne są tylko plamki/pasma składników fluoryzujących pod wpływem 

światła lampy rtęciowej „365 nm” – najczęściej fluorescencja niebieska, w przypadku węglowodorów 

aromatycznych. 

Po ostatnim etapie rozwijania płytki oraz jej wysuszeniu dokonywano wizualizacji po ekspozycji płytki 

w oparach jodu w czasie ok. 10 minut w temperaturze pokojowej (możliwość zaobserwowania obecności 

dużej części nielotnych organicznych składników / grup składników próbki, występujących w stężeniu w 

mieszaninie badanej, wyższym od ok. 0,1–0,5%. Po ekspozycji płytki w parach jodu i wizualizacji w świetle 

widzialnym, a następnie, odparowaniu jodu (co najmniej 24 godziny), możliwe jest ewentualne 

zastosowanie, dodatkowo, spryskania, albo zanurzenia płytki w odpowiednim roztworze „wywołującym” 

barwę, albo fluorescencję / luminescencję lipidów i produktów ich konwersji, albo tylko wybranych grup 

związków chemicznych, lub określonych substancji, w celu ich „wizualizacji” i oceny stężenia. Istnieje bardzo 

bogata literatura metodyczna w tym zakresie. Do tego rodzaju badań, można z przekonaniem polecić 

publikacje i podręczniki prof. H. Jork’a i współpracowników [52 –54]. W ramach opisywanych tu badań, 

„selektywne wywoływanie” wykonywano tylko w przypadku niektórych badanych próbek, tzn., tylko w celu 

wizualizacji i oceny stężenia – polioxy-glicerydów, nad-kwasów tłuszczowych, czy cholesterolu i innych 

steroli (wyniki nie prezentowane w tej pracy). Natomiast, w przypadku wszystkich badań wykonywanych 

techniką TLC, dokonywano wizualizacji płytek w świetle UV-254 nm, 360 nm, a na końcu w świetle 

widzialnym, po „uniwersalnym” wywołaniu barwy plamek na płytce TLC za pomocą par jodu, dokonując 

ekspozycji każdej płytki TLC, zawsze w takich samych warunkach i przez taki sam okres czasu. 


(Conclusions) 

Bazując na danych literatury oraz na wykonanych badaniach, dobrano warunki rozdzielania 

grupowego wzorców, reprezentujących główne składniki tłuszczów i produktów ich konwersji, a także, dla 

wieloskładnikowych próbek z różnych etapów procesu technologicznego przetwarzania tłuszczów, 

otrzymanych z zakładów tłuszczowych oraz z zakładów wytwarzających/stosujących FAME. Zastosowano 

chromatografię cienkowarstwową w normalnych układach faz z żelem krzemionkowym, jako fazą 

stacjonarną – „NP-TLC-F 254 ” i „NP-HPTLC-F 254 ”, a także technikę NP-TLC-FID na pręcikach Chromarod SIII, 

gdy faza stacjonarna to warstewka mikro-ziarnistego żelu krzemionkowego o specjalnej preparatyce na 

pręcikach kwarcowych o średnicy 2mm. Studia i badania dotyczyły też chromatografii cienkowarstwowej z n - 

oktedecylosiloksanem (C18) jako fazą stacjonarną – płytki aluminiowe „RP-TLC-F 254 ” i „RP-HPTLC-F 254 ”, 

pokryte fazą stacjonarną C18. Wykorzystywano warunki elucji izokratycznej jedno-, lub kilkustopniowej, z 

jedno- lub dwu składnikowymi eluentami o różnych składach, dostosowanych do celu rozdzielania. 

Na podstawie wyników studiów literatury oraz wykonanych badań, należy sformułować następujące 

wnioski, aktualne nie tylko dla tłuszczów i produktów ich konwersji, ale także dla rozdzielania różnego 

rodzaju innych złożonych mieszanin związków chemicznych, z wykorzystaniem wykluczania i słabej 

adsorpcji (GPC-SEC-NP lub GPC-SEC-RP): 

- Ze wszech miar korzystne jest wykorzystywanie techniki TLC, w badaniach "pilotowych" nad doborem 

korzystnych warunków wykorzystania wysokosprawnej, kolumnowej chromatografii cieczowej, tak typowej 

adsorpcyjnej, jak i w warunkach jednoczesnego wykluczania oraz kontrolowanej adsorpcji polarnej w 

normalnych układach faz, tzn., warunków GPC-SEC-NP; 

- Jest także celowe wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej z niepolarną, hydrofobową fazą 

stacjonarną typu C18 oraz organicznych bezwodnych eluentów o różnej polarności dla określenia 

optymalnych warunków rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji z wykorzystaniem faz 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

66 

stacjonarnych typu C18 oraz bezwodnych eluentów o różnej polarności, a także do badania wykluczania i 

słabej adsorpcji w warunkach hydrofobowych (lipofilowych) (GPC-SEC-RP); 

- Technika TLC-FID, oddaje nieocenione usługi w rozdzielaniu grupowym oraz ocenie składu grupowego 

tłuszczów i produktów ich konwersji. Podobnie jak w badaniach tego typu innych nielotnych, albo bardzo 

nisko-lotnych skomplikowanych mieszanin związków chemicznych [58–62]; 

- Natomiast, wykorzystywanie techniki TLC-FID w badaniach "pilotowych" nad doborem korzystnych 

warunków wykorzystania wysokosprawnej, kolumnowej chromatografii cieczowej w warunkach 

jednoczesnego wykluczania oraz kontrolowanej adsorpcji w normalnych układach faz (GPC-SEC-NP), nie 

wydaje się celowe, tak ze względu, tak na stosunkowo wysokie koszty stosowania, jak i względnie dużą 

praco- i czasochłonność wykonania badań; 

- Odległym, jednakże – jak się wydaje – coraz bardziej realnym celem opisywanych badań, jest opracowanie 

optymalnych warunków stosowania kolumnowej wysokosprawnej elucyjnej chromatografii cieczowej (HPLC / 

UPC) w trybie wielokolumnowym (NC) i wielowymiarowym (nD) oraz w sposób zautomatyzowany, w 

rozdzielaniu, identyfikacji, oznaczaniu, a także otrzymywaniu w skali semi-preparatywnej lub preparatywnej, 

wysokiej czystości składników tłuszczów i ich pochodnych – jako grup składników, albo, indywiduów 

chemicznych. 

Conclusions 

Conditions for group separation of chemical standards, representing main constituents of fats and 

products of their conversion, as well as, multi -component samples obtained from different stages of fats 

processing, were selected basing on literature data and conducted studies. During studies normal-phase thin 

layer chromatography (with silica gel as stationary phase) – „NP-TLC-F 254 ” i „NP-HPTLC-F 254 ”, and NP-TLC- 

FID technique utilizing Chromarod SIII rods were used. Studies and research were also concerning thin layer 

chromatography with n-octadecyl-siloxane (C18) as the stationary phase – aluminum plates "RP-TLC-F 254 " 

and "RP-HPTLC-F 254 ", covered with C18 stationary phase. Isocratic elution conditions were used in one- or 

several steps mode, with one- or two- component mobile phases having different compositions, adapted to 

the purpose of separation. 

Based on the results of literature studies and conducted research utilizing GPC-SEC-NP or GPC-SEC- 

RP, the following conclusions which are valid not only for fats and products of their conversion, but also for 

separation of many other complex mixtures, can be drawn: 

- It is highly advantageous to use TLC technique in "pilot" studies performed to select favorable conditions for 

high performance liquid column chromatography, in typical adsorption mod e, as well as during simultaneous 

exclusion and controlled polar adsorption in normal phase systems, ie., GPC SEC-NP conditions; 

- It is also advisable to use thin-layer chromatography with a non-polar, hydrophobic stationary phase, type 

C18, and organic anhydrous mobile phases of different polarity to determine the optimum conditions for the 

separation of fats and products and to examine exclusion and poor adsorption in hydrophobic (lipophilic) 

conditions (GPC-SEC-RP); 

- TLC-FID is an inestimable technique in group separation and group composition analysis of fats and 

products of their conversion. TLC-FID is also very useful in other studies of this type, concerning non-volatile 

or low-volatile very complex mixtures of chemical compounds [58-62]; 

- On the other hand, the usage of TLC-FID technique in "pilot" studies applied to selection of favorable 

separation conditions for high performance liquid column chromatography under simultaneous exclusion and 

controlled adsorption in normal phase (GPC-SEC-NP), does not seem to be appropriate, because this 

technique is relatively time-consuming, quite expensive in use, as well as, labour-consuming; 

- A distant, but - as it seems - more and more real aim of this research is to develop optimal conditions for 

high performance elution chromatography (HPLC/UPC) in a multi-column (NC), multidiemsional (ND), and 

automated manner, for separation, identification and determination, as well as, production of fats and 

products of their conversion in semi-preparative or preparative scale, as pure chemical compounds or 

groups of compounds. 



Prace były finansowane przez Narodowe Centrum Nauki numer rejestracyjny projektu badawczego: 

N N312 417237, numer umowy: 4172/B/P01/2009/37, pt. "Wykorzystanie chromatografii wykluczania 

i adsorpcji do rozdzielania i oznaczania grupowego lipidów i produktów konwersji w tłuszczach jadalnych" . 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

67 

Literatura 

(Literature) 

1. Y. W. Wang, T. F. Yen, Rapid separation and characterization of fuels by Thin Layer Chromatography, 

Journal of Planar Chromatography, 3 (1990) 376-380. 

2. Vreven F., “Neue Perspektiven in der chemischen Analytik von Bindemitteln wie Bitumen und Teer”, 

New perspectives in the chemical analytics of binders such as bitumen and tar, Asphalt, 1 (1994). 

3. K. Dunn, G.V. Chilingarian, H. Lian, Y.Y. Wang, T.F.Yen, Chapter 11 Analysis of Asphalt and Its 

Components by Thin-Layer Chromatography, Developments in Petroleum Science, 40, part B (2000) 

305. 

4. S. Chattopadhyay, S. Das, R. Sen, Rapid and precise estimation of biodiesel by high performance thin 

layer chromatography, Applied Energy, 88 (2011) 5188. 

5. S. Agatonovic-Kustrin, Ch. M. Loescher, Qualitative and quantitative high performance thin layer 

chromatography analysis of Calendula officinalis using high resolution plate imaging and 

artificial neural network data modeling, Analytica Chimica Acta, 798 (2013) 103–108. 

6. M. A. Hawrył , M. Waksmundzka-Hajnos, Two-dimensional thin-layer chromatography of selected 

Polygonum sp. extracts on polar-bonded stationary phases, Journal of Chromatography A, 1218 

(2011) 2812–2819. 

7. M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, „Badania nad 



układzie faz”, A research on the composition of the eluent for separation of plant metabolites by 

reverse phase planar chromatography, Camera Separatoria, 3:1 (2011) 147-160. 

8. H. A. Khan, I. A. Arif, J. B. Williams, A. M. Champagne, M. Shobrak, Skin lipids from Saudi Arabian 

birds, Saudi Journal of Biological Sciences (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.sjbs.2013.09.008 

9. M. J. Baran, P. K. Zarzycki, „Szybka metoda frakcjonowania lipidów i substancji niepolarnych w 

piórach ptaków z wykorzystaniem termostatowanej mikrochromatografii planarnej (micro-TLC)”, Fast 

method for fractionation of lipids and related non-polar substances from birds’ feathers using 

thermostated micro-TLC, Camera Separatoria, 3:1 (2011) 221-227. 

10. P. K. Zarzycki, M. M. Ślączka, E. Włodarczyk, M. J. Baran, Micro-TLC Approach for Fast Screening of 

Environmental Samples Derived from Surface and Sewage Waters, Chromatographia, 76 (2013) 

1249–1259. 

11. P. K. Zarzycki, M. M. Ślączka, M. B. Zarzycka, M. A. Bartoszuk, E. Włodarczyk, M. J. Baran, 

Temperature-controlled micro-TLC: A versatile green chemistry and fast analytical tool for separation 

and preliminary screening of steroids fraction from biological and environmental samples , Journal of 

Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 127 (2011) 418–427. 

12. M. Jeleń, B. Morak-Młodawska, K. Pluta, Thin-layer chromatographic detection of new 

azaphenothiazines, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55 (2011) 466–471. 

13. D. D. Joshi, Herbal Drugs and Fingerprints, 2012 Evidence Based Herbal Drugs, Springer India 2012, 

http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-81-322-0804-4_3# 

14. A. Puscas, A. Hosu, C. Cimpoiu, Application of a newly developed and validated high-performance 

thin-layer chromatographic method to control honey adulteration, Journal of Chromatography A, 1272 

(2013) 132– 135. 

15. M. Kucharska, J. Grabka, A review of chromatographic methods for determination of synthetic food 

dyes, Talanta, 80 (2010) 1045–1051. 

16. A. A. Herod and M.-J. Lazaro, Thin-Layer (Planar) Chromatography, Encyclopedia of Separation 

Science. 

17. J. Kosińska, G. Boczkaj, J. Gudebska, M. Kamiński, „Fingerprinting niskolotnych frakcji i produktów 

naftowych techniką cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC) w identyfikacji przecieków 

procesowych oraz skażenia środowiska”, Fingerprint comparison of low-volatile petroleum products by 

means of Thin Layer Chromatography (TLC) for identification of process leakages and environmental 

pollution, Camera Separatoria 5:2 (2013) 55-69. 

18. Z. Wang , M. Fingas , D. S. Page, Oil spill identification, Journal of Chromatography A 843 (1999) 

369–411. 

19. M. Kamiński, wyniki niepublikowanych badań własnych, the results of own unpublished studies. 

20. M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, „Badania nad 



układzie faz”, A research on the composition of the eluent for separation of plant metabolites by 

reverse chase planar chromatograchy, Camera Separatoria 3:1 (2011) 147-160. 

21. W. Gołkiewicz, M. Jaroniec, Continuous TLC as a pilot technique for optimization of gradient HPLC. 1. 

Theoretical considerations for stepwise gradient TLC with binary mobile phase, Journal of High 

Resolution Chromatography 1:5 (1978) abstract. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

68 

22. W. Gołkiewicz, TLC as a pilot technique for the optimization of gradient HPLC II. Use of data obtained 

from RP-18 plates for the prediction of gradient programs in reversed-phase liquid chromatography, 

Chromatographia 14:11 (1981) 629-632. 

23. T. Tuzimski, Thin-Layer Chromatography (TLC) as Pilot Technique for HPLC. Utilization of Retention 

Database (Re) vs. Eluent Composition of Pesticides, Chromatographia 56 (2002) 379-381. 

24. J. K. Różylo, M. Janicka, R. Siembida, Advantages of TLC as a Pilot Technique for HPLC, Journal of 

Liquid Chromatography 17:17 (1994) abstract. 

25. E. Soczewiński, T. Wawrzynowicz, Thin-layer chromatography as a pilot technique for the optimization 

of preparative column chromatography, Journal of Chromatography A 218 (1981) 729-732. 

26. S. Reuke, H.E. Hauck, Thin-layer chromatography as a pilot technique for HPLC demonstrated with 

pesticide samples, Fresenius Journal of Analytical Chemistry 351 (1995)739-744. 

27. J. Gudebska, rozprawa doktorska pt. „Chromatografia cieczowa w oznaczaniu składu grupowego 

olejów bazowych i asfaltów drogowych”, PhD thesis entitled: Liquid chromatography for the 

determination of group composition of base oils and road bitumens, Gdańsk (1999) 1-92. 

28. Norma PN-72/C-04025 – „Oznaczanie składu grupowego węglowodorów metodą chromatografii 

elucyjnej”, PN-72/C-04025 Standard – Determination of hydrocarbons group composition by elution 

chromatography. 

29. R.J. Hamilton, Thin-layer chromatography–flame ionization detection for lipid analysis (chapter 1.4) in 

Lipid Analysis in Oils and Fats, Springer Science & Business Media (2012). 

30. L. Striby , R. Lafont, M. Goutx, Improvment in the Iatroscan thin-layer chromatography—flame 

ionisation detection analysis of marine lipids. Separation and quantitation of mono- and diacylglycerols 

in standards and natural samples, Journal of Chromatography A 849 (1999) 371. 

31. S. Zhou, Quantitation of Lipid Classes by Thin-Layer Chromatography with Flame Ionization 

Detection, Current Protocols in Food Analytical Chemistry D:D1:D1.6 (2003) D1.6.1. 

32. J.-L. Sebedio, Utylization of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection for Lipid Analyses 

(chapter 4) in New Trends in Lipid and Lipoprotein Analyses, The American Oil Chemists Society 

(1995). 

33. T. Ohshima, R.G Ackman, New Dvelopments in Chromarod/Iatroscan TLC-FID: Analysis of Lipid 

Class Composition, Journal of Planar Chromatography 4 (1991) 27-57. 

34. A . Timmins, R . G . Ackman, TLC-FID with Special Reference to Marine Lipids and Other High- 

Molecular-Weight Organic Compounds(chapter 11) in Lipid Analysis and Lipidomics: NewTechniques 

and Applications, American Oil Chemists' Society Publishing (2006) 261-270. 

35. P. Dudley, R. Anderson, Separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thin-layer 

chromatography, Lipids 10 (1975) 113. 

36. R. Wilson, J.R. Sargent, High-resolution separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thinlayer 

chromatography, Journal of Chromatography A 623 (1992) 403. 

37. B. Fuchs, R. Suess, K. Teuber, M. Eibisch, J. Schiller, Lipid analysis by thin-layer chromatography – a 

reviev of the current state, Journal of Chromatography A 1218 (2011) 2754. 

38. J.J. Myher, A. Kuksis, General strategies in chromatographic analysis of lipids, Journal of 

Chromatography B 671 (1995) 77. 

39. D. Allan, S. Cockroft, A modified procedure for thin-layer chromatography of phospholipids, Journal of 

Lipid Research 23 (1982) 1373. 

40. Casimir C. Akoh, David B. Min (ed.), Food Lipids. Chemistry, Nutrition and Biotechnology, second ed. 

revised and expanded, Marcel Dekker, Inc., USA, (2002). 

41. M. Buchgraber, F. Ulberth, H. Emons, E. Anklam, Triacylglycerol profiling by using chromatographic 

techniques (a review), European Journal of Lipid Science and Technology 106 (2004) 621–648. 

42. R.J. Hamilton, Lipid analysis using thin-layer chromatography and the Iatroscan (chapter 1) in Lipid 

Analysis in Oils and Fats, Springer Science & Business Media (2012). 

43. G. Gałęzowska, M. Kamiński, „Nowa metoda oznaczania komponentów skomplikowanych mi eszanin 

typu specyfiki farmaceutyczne z wykorzystaniem rozdzielania grupowego i wielowymiarowej 

wysokosprawnej chromatografii cieczowej”, New method of complex mixtures like pharmaceutical 

specifics determination using multidimensional high performance liquid chromatography and group 

type separation, Camera Separatoria 3:1 (2011) 201–219. 

44. G. Boczkaj, M. Jaszczołt, M. Kamiński, „Nowe metodyki oznaczania dodatków do paliw z 

zastosowaniem rozdzielania wielowymiarowego”, New procedures for fuel additives determination by 

multidimensional separation systems, Camera Separatoria 3:1 (2011) 115–127. 

45. K. Awai, R. Matsuoka, Y. Shioi, Lipid and fatty acid compositions of Symbiodinium strains, 

Proceedings of the 12th International Coral Reef Symposium, 6A Cell and molecular biology of 

symbiosis, Cairns, Australia (9-13 July 2012). 

46. M. Ranny, Methods of Thin-Layer Chromatography with Flame Ionization Detection (TLC-FID) in Thin- 

Layer Chromatography with Flame Ionization Detection, Springer Science & Business Media, (2012). 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

69 

47. M. Kamiński, J. Gudebska, T. Górecki, R. Kartanowicz, Optimized conditions for hydrocarbon group 

type analysis of base oils by thin-layer chromatography–flame ionisation detection, Journal of 

Chromatography A 991 (2003) 255–266. 

48. B.-J. Yang; L. Zheng; X.-T. Han; M.-G. Zheng, Development of TLC-FID technique for rapid screening 

of the chemical composition of microalgae diesel and biodiesel blends , Fuel 111 (2013) 344–349. 

49. T. Hooper, Ch. C. Parrish, Profiling neutral lipids in individual fish larvae by using shortcolumn gas 

chromatography with flame ionization detection, Limnology and Oceanography: Methods 7 (2009) 

411–418. 

50. V. L. Bebolla, L. Membrado, M. P. Domingo, P. Henrion, R. Garriga, P. González, F. P. Cossío, A. 

Arrieta, J. Vela, Quantitative Applications of Fluorescence and Ultraviolet Scanning Densitometry for 

Compositional Analysis of Petroleum Products in Thin -Layer Chromatography, Journal of 

Chromatographic Science 37 (1999) 219-226. 

51. J. Kosińska, wyniki niepublikowanych badań własnych, the results of own unpublished studies. 

52. H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer, Thin-Layer Chromatography. Reagents and Detection 

Methods, Volume 1a – Physical and Chemical Detection Methods: Fundamentals, Reagents I, VCH, 

Weinheim, 1990. 

53. C. Weins, H. Jork, Toxicological evaluation of harmful substances by in situ enzymatic and biological 

detection in high-performance thin-layer chromatography, Journal of Chromatography A 750 (1996) 

403. 

54. H. Struck, H. Karg, H. Jork, Thin-layer chromatographic determination of testosterone and delta4- 

androstene-3,17-dione from bovine foetal testicular tissue, Journal of Chromatography A 36 (1968) 74. 

55. IATROSCAN technical information from catalogue IATROSCANTM MK-6 TLC-FID/FPD Dual 

Detestion System, Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. 

56. C.C. Parrish, Determination of Total Lipid, Lipid Classes, and Fatty Acids in Aquatic Samples in Lipids 

in Freshwater Ecosystems, edited by M.T. Arts, B.C. Wainman, Springer-Verlag New York, Inc., New 

York (1998) 4–20. 

57. Norma PN-EN 14105 – „Produkty przetwarzania olejów i tłuszczów – Estry metylowe kwasów 

tłuszczowych (FAME) - Oznaczanie zawartości wolnego i ogólnego glicerolu oraz mono -, di- i 

triacylogliceroli”, PN-EN Standard – Fat and oil derivatives – Fatty Acid Methyl Esters (FAME) – 

Determination of free and total glycerol and mono-, di-, tri-glyceride content (2003). 

58. B.N. Barman, Hydrocarbon-Type Analysis of Base Oils and Other Heavy Distillates by Thin-Layer 

Chromatography with Flame-lonization Detection and by the Clay-Gel Method, Journal of 

Chromatographic Science 34 (1996) 219–225. 

59. S. Bharati, R. Patience, N. Mills, T. Hanesand, A new North Sea oil-based standard for Iatroscan 

analysis, Organic Geochemistry 26 (1997) 49–57. 

60. J. Vela, L. Membrado, V.L. Cebolla, A.C. Ferrando, Suitability of Thin-Layer Chromatography-Flame 

Ionization Detection with Regard to Quantitative Characterization of Different Fossil Fuel Products. II. 

Calibration Methods Concerning Quantitative Hydrocarbon -Group Type Analysis, Journal of 

Chromatographic Science 36 (1998) 487–494. 

61. V.L. Cebolla, J. Vela, L. Membrado, A.C. Ferrando, Coal-Tar Pitch Characterization by Thin-Layer 

Chromatography with Flame Ionization Detection, Chromatographia 42 (1996) 295–299. 

62. B.N. Barman, Behavioral differences between group I and group II base oils during thermo-oxidative 

degradation, Tribology International 35 (2002) 15–26. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria



Judyta KOSIŃSKA 1 , Monika ŚMIEŁOWSKA 1 , Marian KAMIŃSKI 1* 

1 Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, 80-233 Gdańsk, 

ul, Narutowicza 11/12 

* Autor do korespondencji, e-mail: markamin@pg.gda.pl 

Badania nad rozdzielaniem grupowym technikami sorpcji i chromatografii. Część I – 

Wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) dla doboru warunków 

rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji technikami kolumnowymi. 

Streszczenie: Przeprowadzono badania wyjaśniające wpływ eluentu oraz fazy stacjonarnej na wartość parametrów 

elucji mono-, di-, triacylogliceroli oraz wolnych kwasów tłuszczowych, eluowanych w warunkach cienkowarstwowej 

chromatografii cieczowej (TLC). Celowo wykorzystano sorbenty inne niż kopolimer styrenu i di -winylobenzenu (SDVB). 

Starano się dobrać taki eluent, aby możliwe było rozdzielanie tłuszczów za pomocą chromatografii wykluczania z 

kontrolowaną sorpcją. W przyszłości rozwiązania te powinny zastąpić drogie kolumny z wypełnieniem SDVB. 

Modyfikując warunki rozdzielania można znacznie zmieniać rozdzielczość i selektywność układów rozdzielczych. Dobór 

optymalnego składu eluentu i programu elucji powinien być dokonywany z zastosowaniem techniki TLC, co znacznie 

przyspiesza dobór optymalnych warunków separacji. 

Słowa kluczowe: chromatografia cieczowa, TLC, GPC/SEC, rozdzielanie tłuszczów, oddziaływania sorpcyjne 

Studies on group separation using sorption and chromatographic techniques. Part I 

– Usefulness of thin layer chromatography (TLC) in conditions pre-selection for 

separation of fats and their conversion products using column techniques. 

Abstract: This paper shows results of investigations explaining influence of the type of the eluent and the nature of the 

stationary phase for elution parameters of model compounds eluted in the thin layer chromatography (TLC) conditions. 

Separation of mono-, di-, triglycerides and free fatty acids was performed using TLC plates dedicated to normal phase 

chromatography (silica gel “Si60 F 254”) and reversed phase chromatography (oktadecylosilan phase “RP18 F254”). 

Single-step elutions using eight selected eluents of varying elution strength were carried out. Performed studies revealed 

that certain modifications of separation conditions can lead to changes in resolution and selectivity of separation 

systems. Studies were conducted to create model separation systems and to examine which model system gives such 

good results of tested compounds separation that it is worth to transfer the best conditions to a larger scale – to studies 

using column liquid chromatography. Sorbents other than a copolymer of styrene and divinylbenzene (SDVB) were used 

intentionally, and the aim was to select an appropriate eluent which would allow for separation of fats using size 

exclusion chromatography with controlled sorption. In the future, this solution should replace expensive SDVB packed 

columns. 

Key words: liquid chromatography, TLC, GPC/SEC, separation of fats, sorption interactions 

1. WSTĘP 


Podczas poszczególnych etapów otrzymywania tłuszczów jadalnych wymagana jest ścisła kontrola 

jakości, w tym składu produktu końcowego. Kontrola powinna też obejmować tłuszcze podczas ich 

przetwarzania oraz użytkowania. Ma to znaczenie między innymi ze względu na możliwość powstawania 

izomerów trans o potencjalnym działaniu rakotwórczym, wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, c zy 

produktów polimeryzacji, hydrolizy lub/i utleniania tłuszczów. Poza tym analityka tłuszczów jadalnych 

dostarcza informacji na temat składu w zakresie kwasów tłuszczowych oraz zawartości naturalnych 

składników o cenionych walorach żywieniowych (kwasy ome ga-3, tokoferole, fitosterole) oraz pozwala na 

kontrolowanie usunięcia substancji zbędnych, których obecność może stanowić zagrożenie zdrowia 

konsumenta (m. in. pozostałości pestycydów, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), trwałe 

zanieczyszczenia organiczne (TZO)) [1-3]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

71 

Przeprowadzanie kontroli jakości tłuszczów, czy produktów ich konwersji, wymaga zapewnienia 

odpowiednich procedur i narzędzi. W badaniach tłuszczów i produktów ich konwersji pod względem składu, 

w zakresie kwasów tłuszczowych, stosowane obecnie, znormalizo wane metodyki i procedury, w 

przeważającej większości wykorzystujące kapilarną chromatografię gazową (CGC), są pracochłonne na 

etapie przygotowania próbki do badań (zmydlanie, tworzenie estrów metylowych kwasów tłuszczowych 

(FAME)). Wykonanie oznaczeń składu wymaga bardzo sprawnej kolumny i jest czasochłonne. Analityka 

tłuszczów i produktów ich konwersji związana jest z potrzebą posiadania dostatecznie czystych wzorców. Te 

otrzymuje się dzięki wieloetapowemu rozdzielaniu z tłuszczów czy produktów ich konwersji albo dzięki 

syntezie i wydzieleniu czystych składników z mieszaniny poreakcyjnej na drodze rozdzielania. Wiąże się to z 

potrzebą stworzenia warunków, pozwalających na selektywne rozdzielanie, oznaczanie, a także 

otrzymywanie wzorców analitycznych w postaci czystych indywiduów chemicznych określonych 

acylogliceroli, kwasów tłuszczowych i innych składników. 

W Tab.1. zestawiono oraz scharakteryzowano najważniejsze znormalizowane metodyki 

wykorzystujące rozdzielanie chromatograficzne w analityce tłuszczów i ich pochodnych. 

W przypadku badań nad zastosowaniem sorpcyjnej kolumnowej wysokosprawnej chromatografii 

cieczowej HPLC do rozdzielania oraz oznaczania tłuszczów, ich pochodnych i produktów konwersji, warto 

wykorzystać cienkowarstwową chromatografię cieczową jako technikę pilotową (przy wykorzystaniu 

sorbentów tak polarnych, jak i hydrofobowych oraz eluentów o zróżnicowanej sile elucyjnej). 

Chromatografia cienkowarstwowa była przed laty powszechnie stosowana. Obecnie jest nadal 

używana do rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji, a przede wszystkim do orientacyjnej oceny 

składu. Zastosowanie normalnego układu faz (NP) pozwala na rozdzielanie grup związków chemicznych o 

różnej polarności. W odwróconych układach faz (RP) ma miejsce selekcja cząst eczek lipidów i ich 

pochodnych, które należą do tej samej klasy w zakresie polarności, ale różnią się hydrofobowością. 

Najczęściej używaną fazą stacjonarną w technice NP -TLC jest żel krzemionkowy, czasem tlenek glinu lub 

ziemia okrzemkowa (szczególnie dawniej). Obecnie prym wiodą żel krzemionkowy modyfikowany 

chemicznie grupami R-NH 2 , R-CN, DIOL – dla warunków NP lub C-18, C-8, grupami alkilofenylowymi – dla 

warunków RP [13]. 

Interesującym zastosowaniem jest użycie jako fazy stacjonarnej w chromatografii cienkowarstwowej, 

a także w kolumnowej, sorbentów impregnowanych azotanem (V) srebra, kwasem borowym lub kwasem 

etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). W tab. 2. przedstawiono najważniejsze zastosowanie wyżej 

wspomnianych impregnowanych sorbentów. 

Technika cienkowarstwowej chromatografii cieczowej TLC (Thin Layer Chromatography) posiada 

niewątpliwe zalety w postaci prostoty wykonania badań, niskich kosztów sprzętu, niewielkiego zużycia 

eluentów. Plamki na chromatogramach TLC można obserwować pod lampą UV 254 nm (płytki typu F-254 z 

„fluoresceiną”) albo 365 nm (wykazujące fluorescencję struktury aromatycznej) lub wywoływać żółtobrunatną 

barwę adduktów I 2 w oparach jodu – nie dotyczy to jednak składników obecnych w bardzo niskich lub 

śladowych zawartościach. 

Istotnymi wadami TLC jest względnie niska rozdzielczość oraz często niska czułość. Bardzo trudna 

realizacja elucji gradientowej, którą zastępuje się w praktyce najczęściej elucją skokową. Technika TLC jest 

też nieprzydatna do rozdzielania i badania lotnych związków chemicznych. Wpływ stopnia nasycenia komory 

chromatograficznej parami eluentu na rozdzielanie analitów, przenoszenie warunków rozdzielania pod 

względem wartości parametrów, takich jak: współczynnik retencji (k), współczynnik selektywności (α) w 

warunkach NP-TLC powoduje, że przenoszenie tych parametrów z TLC do chromatografii kolumnowej NP - 

HPLC nie daje identycznych rezultatów [18]. Najczęściej w HPLC wartości k są wyższe niż dla TLC. Mimo to, 

cienkowarstwowa chromatografia cieczowa dostarcza istotnych informacji na temat zależności składu 

eluentu i rodzaju fazy stacjonarnej, tzn. wpływu parametrów układu chromatograficznego na rozdzielanie. 

Technika TLC może i powinna być stosowana jako technika pilotowa w doborze optymalnych warunków 

elucji i rozdzielania dla techniki HPLC. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

72 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

73 

Tab. 2. Zastosowanie impregnowanych sorbentów w rozdzielaniu tłuszczów za pomocą TLC lub HPLC w 

zależności od zastosowanego impregnatu fazy stacjonarnej 

Tab. 2. The use of impregnated sorbents in the separation of fats by TLC or HPLC depending on the 

applied impregnant of the stationary phase 

Impregnat Zastosowanie Publikacje 

Azotan (V) srebra 

Rozdzielanie tłuszczów na grupy związków chemicznych, [14-15] 

posiadające tę samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych, 

tzn. rozdzielanie izomerów cis/trans. 

Kwas borowy Rozdzielanie izomerów diacylogliceroli oraz izomerów [13,16] 

fosfolipidów. 

Kwas 

etylenodiaminotetraoctowy 

Rozdzielanie fosfolipidów kwasowych. [17] 

W tej pracy uwzględniono żel krzemionkowy oraz sorbent typu „C18” – oktadekan związany 

wiązaniem siloksanowym z żelem krzemionkowym (tzw. RP18), jako fazy stacjonarne oraz związki 

chemiczne należące do różnych grup w zakresie polarności oraz hydrofobowości, jako substancje 

modelowe. Tabela związków modelowych obejmuje także substancje lotne (Tabela 3). Badania niniejszej 

pracy dotyczą przede wszystkim tłuszczów i produktów ich konwersji, tzn. acylogliceroli, kwasów 

tłuszczowych i gliceryny. Zostały też wykonane badania w odniesieniu do niżej polarnych i bardziej 

hydrofobowych wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) oraz nisko dyspersyjnych 

polistyrenów, a także reprezentantów innych grup, bardziej polarnych i mniej hydrofobowych związków 

chemicznych, rozpuszczalnych w różnym stopniu w rozpuszczalnikach organicznych. Kolejne prace będą 

dotyczyły bardziej szczegółowo innych grup związków chemicznych i innych rodzajów sorbentów. 

Cele programu badań, których jeden z etapów zrealizowano w tej pracy, to: 

1. Opracowanie ogólnych zasad grupowego rozdzielania, techniką kolumnowej elucji wysokosprawnej 

(HPLC) lub ultrasprawnej (UPC) chromatografii cieczowej, organicznych związków chemicznych, 

rozpuszczalnych w określonych rozpuszczalnikach organicznych, z uwzględnieniem parametrów elucji 

i retencji związków chemicznych o szerokim zakresie polarności i hydrofobowości, począwszy od bardzo 

nisko polarnych składników ropy naftowej i jej produktów, badanych przez nasz zespół od wielu lat w 

zakresie rozdzielania grupowego, poprzez acyloglicerole (TAG – triacyloglicerole, DAG – 

diacyloglicerole, MAG – monoacyloglicerole), wolne kwasy tłuszczowe (WKT) i ich estry metylowe 

(FAME) czy etylowe (FAEE), ketony, alkohole, aldehydy, kwasy karboksylowe, hydroksykwasy i keto kwasy 

oraz ich estry, amidy, imidy itp., a także naftochinony, polifenole i inne metabolity roślinne, grzybowe lub 

bakteryjne z uwzględnieniem rozpuszczalnych w acetonitrylu aminokwasów, peptydów oraz białek, czy 

kwasów nukleinowych i nukleotydów. Badania niniejszej serii prac nie obejmują związków chemicznych 

rozpuszczalnych wyłącznie w wodzie lub roztworach buforowych, tzn. cukrów, amin biogennych itp. 

Przedmiotowe rozdzielania grupowe ma być docelowo realizowane technika HPLC w skali semi - 

preparatywnej lub preparatywnej oraz przede wszystkim ma dotyczyć otrzymywania w czystej postaci 

wybranych indywiduów organicznych związków chemicznych, jako tzw. wzorców analitycznych, a także w 

formie użytkowej, np. dla dokładnego badania ich właściwości fizykochemicznych, jako substratów do 

dalszych syntez, a być może także jako naturalnych składników leków. Technika cienkowarstwowej elucyjnej 

chromatografii cieczowej z polarną fazą stacjonarną (NP) albo hydrofobową fazą stacjonarną C18 (RP), 

służy tu jako metodyka badań pilotowych, informująca o orientacyjnych wartościach parametrów elucji (R f ), 

retencji (k) i selektywności ( ) dla określonego rodzaju faz stacjonarnych i odpowiednich dla nich eluentów o 

różnych wartościach siły elucji dla określonego sorbentu i eluowanych składników modelowych 

rozdzielanych mieszanin. 

2. W przypadku wielu mieszanin rozdzielanych związków chemicznych pochodzenia naturalnego, 

rozdzielanie grupowe, będące przedmiotem niniejszej serii prac powinno być w pierwszym etapie 

wykonywane techniką HPLC z zastosowaniem „klasycznych” warunków lipofilowego wykluczania. W tym 

celu stosuje się obecnie kosztowne kolumny HPLC – najczęściej wypełnione porowatym, kulistym 

kopolimerem styrenu i di-winylobenzenu (SDVB) o określonej średniej wartości średnic porów 

wewnątrzziarnowych. Płytki TLC pokryte warstwą tego rodzaju „sorbentu” nie są dostępne, w tym także z tej 

przyczyny, że dla realizacji elucji i rozdzielania w warunkach wykluczania (GPC-SEC Gel Permeation 

Chromatography / Size Exclusion Chromatography) musiałyby być one bardzo długie, tak więc badania 

techniką klasycznej GPC-SEC będą wykonywane wyłącznie techniką kolumnową. Mimo to niektóre warunki 

rozdzielania techniką GPC-SEC z zastosowaniem tetrahydrofuranu (THF), ewentualnie innych 

rozpuszczalników, jak dichlorometanu (DCM), acetonu, dimetylosulfotlenku (DMSO), dimetyloformamidu 

(DMF), jako eluentu mogą być też „modelowane” z zastosowaniem techniki TLC, szczególnie z płytkami typu 

C18 lub Phenyl (np. oddziaływania hydrofobowe lub kwadrupolowe na powierzchni sorpcyjnej). Dotyczy to 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

74 

układów TLC z płytkami z fazą stacjonarną C18 albo Phenyl czy CN oraz z eluentami wykazującymi bardzo 

wysokie siły elucji względem fazy typu C18 lub Phenyl lub CN, tzn. z zastosowaniem THFu, acetonu, metyloetyloketonu 

(2-butanonu), eteru tert -butylowo-metylowego (MTBE) lub eteru tert -butylowo-etylowego (ETBE), 

eteru diizopropylowego (iP-O-iP) lub dietylowego (Et -O-Et) albo DCMu lub chloroformu (CHCl 3 ), jako 

eluentów. Wówczas otrzymane wnioski można najprawdopodobniej przenieść do warunków wykorzystania 

SDVB do elucji i rozdzielania. Ta kwestia jest także przedmiotem niniejszej serii publikacji. Wstępne wnioski 

zastosowania „RP-TLC” do modelowania GPC-SEC-SDVB zamieszczono także w niniejszej pracy. 

3. Należy jednak stwierdzić, że podstawowym celem tej części badań niniejszej serii prac, jest idea 

zastąpienia kolumn SDVB, kolumnami typu C18 lub Phenyl albo CN, w badaniach z wykorzystaniem 

GPC/SEC w warunkach lipofilowych. Powodzenie jest uwarunkowane dobraniem takiego składu eluentu, 

albo takiego eluentu jednoskładnikowego, że zapewni on brak oddziaływań sorpcyjnych, także o charakterze 

van der Waalsa, wszystkich składników eluowanych mieszanin z powierzchnią fazy stacjonarnej typu C18 

lub Phenyl lub CN, tzn. energia oddziaływania eluentu z fazą stacjonarną winna być co najmniej rząd 

wyższa, niż energia oddziaływań któregokolwiek ze składników rozdzielanej mieszaniny. 

Najprawdopodobniej nie jest to możliwe w przypadku elucji wysokowrzących i niskopolarnych składników 

ropy naftowej, ale powinno być możliwe w przypadku gliceryny, acylogliceroli, WKT, a być może i FAME. 

Wówczas, ze wszech miar celowe by było zastąpienie w warunkach GPC-SEC SDVB za pomocą C18 lub 

Phenyl. Dodatkowo, niekiedy korzystny może być taki dobór składu eluentu w warunkach wykorzystania 

hydrofobowych faz stacjonarnych HPLC do chromatografii wykluczania z jednoczesnymi słabymi 

oddziaływaniami sorpcyjnymi (GPC-SEC-RP) by bardziej hydrofobowe a jednocześnie mniejsze cząsteczki 

były nieco silniej sorbowane na powierzchni fazy stacjonarnej, niż większe i niżej hydrofobowe molekuły. 

Taka sytuacja może mieć miejsce w przypadku niektórych polifenole, gdy pochodne mniejszego naftalenu, 

mają więcej grup hydroksylowych czy karboksylowych lub tlenowyc h niż pochodne większego fenantrenu 

czy antracenu, albo pirenu. Jednakże odwrotne sytuacje są znacznie częstsze, tzn. gdy ze wzrostem masy 

cząsteczkowej / wielkości cząsteczek wzrasta ich hydrofobowość i jednocześnie spada polarność. Wówczas 

bardziej korzystne od warunków GPC-SEC-RP, powinny być warunki GPC-SEC-NP! 

4. Najważniejszym elementem celu serii przygotowywanych publikacji jest zbadanie możliwości oraz 

zakresu przydatności jednoczesnego wykorzystania do rozdzielania grupowego warunków wykluczania oraz 

słabej polarnej adsorpcji – GPC-SEC-NP. Takie postępowania powinno mieć ogromny zakres zastosowań, 

ponieważ prawie regułą jest, że w zakresie określonych grup organicznych związków chemicznych ma 

miejsce wzrost ich polarności i spadek hydrofobowości w miarę zmniejszania się wielkości cząsteczek. 

Typowym przykładem są: TAG/DAG/MAG, czy FAME/WKT, czy poliglikole, czy poliestry, lub polifenole o 

takich samych lub rosnących liczbach grup hydroksylowych oraz grup karboksylowych ze zmniejszaniem się 

cząsteczek, a także alkohole alifatyczne, ketony alifatyczne, kwasy karboksylowe, kwasy -karboksylowe, - 

ketokwasy itd. Wówczas stosowanie warunków „klasycznej” chromatografii wykluczania wymaga bardzo 

długiej i bardzo wysoce sprawnej kolumny do rozdzielania związków chemicznych mało różniących się 

wielkością cząsteczki. Na przykład, dla rozdzielania etanolu, metanolu i wody do linii bazowej w warunkach 

klasycznej chromatografii wykluczania, potrzeba kolumny o co najmniej N=100 000 półek teoretycznych, gdy 

z zastosowaniem optymalnych warunków GPC-SEC-NP wystarczy około 1 000 półek teoretycznych. 

Podstawowym zadaniem niniejszej pracy, oprócz zaprezentowania i uzasadnienia powyższych idei, 

jest jak opisano powyżej. Celem niniejszej, pierwszej z serii kilku prac, jest zbadanie zależności między 

parametrami retencji i selektywności, a także wpływu rozpuszczalności w eluencie, wybranych związków 

chemicznych, traktowanych jako substancje modelowe reprezentujące określone grupy związków 

chemicznych, eluowane i rozdzielane w warunkach sorpcji-desorpcji oraz chromatografii techniką 

cienkowarstwowej chromatografii cieczowej – TLC, a rodzajem fazy stacjonarnej i składem eluentu. Przy 

czym, w badaniach należy wziąć pod uwagę także problem ewentualnej ograniczonej rozpuszczalności 

składników badanych mieszanin w stosowanych eluentach, szczególnie składników względnie polarnych w 

niskopolarnych eluentach lub odwrotnie. Dalekosiężnym celem niniejszej serii publikacji jest opracowanie 

zasad ogólnych oraz nowych/zaktualizowanych procedur wielowymiarowego (nD) i wielokolumnowego (NC) 

rozdzielania wieloskładnikowych mieszanin w celu otrzymywania czystych grup związków chemicznych lub 

czystych indywiduów. 

2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA 


2.1. Rozpuszczalniki i eluenty 

(Solvents and eluents) 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

75 

W badaniach zastosowano następujące eluenty: tetrahydrofuran cz.d.a. POCh (Polska), 

dichlorometan cz.d.a. POCh (Polska), n-heksan do HPLC Merck (Niemcy), izopropanol cz.d.a. POCh 

(Polska), aceton cz.d.a. POCh (Polska), eter tert-butylowo-metylowy do HPLC Merck (Niemcy). 

2.2. Substancje wzorcowe i próbki badane 

(Reference substances and examined samples) 

Monooleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), monopalmitynian glicerolu 99% Sigma-Aldrich 

(USA), dioleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), trioleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), kwas 

stearynowy 98,5% Sigma-Aldrich (USA), kwas erukowy 99% Dr Theodor Schuchardt (Niemcy), olej 

rzepakowy Kujawski (Polska). 

2.3. Płytki TLC 

(TLC plates) 

W części doświadczalnej dotyczącej cienkowarstwowej chromatografii cieczowej wykorzystano płytki 

aluminiowe do TLC: Si 60 , F 254 Merck (Niemcy) oraz RP-18, F 254 Merck (Niemcy). 

2.4. Aparatura 

(Instruments) 

Zestaw do rozwijania chromatogramów cienkowarstwowych oraz wizualizacji plamek składający się z: 

komór chromatograficznych, strzykawki do nanoszenia próbek na płytki chromatograficzne w postaci 

plamek pod wyciągiem laboratoryjnym (dygestorium), lampy UV o dwóch zakresach długości 

promieniowania (254 nm oraz 365 nm) do wizualizacji chromatogramów, eksykator z jodem do 

wywoływania chromatogramów, eksykator z chlorkiem wapnia do przechowywania płytek; 

Zestaw do odparowania rozpuszczalnika w strumieniu azotu, w skład którego wchodzą: butla z gazem 

obojętnym (N 2 ); pokrywa firmy J.T. Baker (Niemcy) wykonana z poliamidu, wyposażona w igły oraz 

podłączenie gazu; metalowy statyw, w którym umieszcza się fiolki z próbkami; wypływ azotu 

umieszczony nad powierzchnią odparowywanej cieczy; 

Waga analityczna Radwag. 

2.5. Metody postępowania 

(Methods) 

Procedura badania parametrów elucji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej 

Wstępny dobór optymalnych warunków rozdzielania mono -, di-, triacylogliceroli oraz wolnych kwasów 

tłuszczowych wykonano, wykorzystując płytki TLC dedykowane chromatografii w normalnym (żel 

krzemionkowy „Si60 F 254”) oraz odwróconym (faza oktadecylosilanowa „RP18 F254”) układzie faz. 

Zastosowano zestaw ośmiu eluentów, charakteryzujących się różną, najczęściej względnie wysoką, siłą 

elucji: izopropanol (izoOH), aceton (ACET), MTBE:izoprpoanol (MTBE:izoOH 3:1 v/v), eter tert-butylowometylowy 

(MTBE), tetrahydrofuran (THF), dichlorometan (DCM), n -heksan:popan-2-ol (nC6:izoOH 3:1 v/v), 

n-heksan (nC6). Jedynie n-heksan i dichlorometan charakteryzowały się niską siłą elucji w warunkach NP - 

TLC oraz nietypowymi oddziaływaniami sorpcyjnymi w przypadku RP-TLC (jak i inne eluenty w przypadku 

warunków RP – brak wody w eluencie). 

Wykonano szereg elucji, dozując, na płytki obu rodzajów sorbentu, za pomocą strzykawki po 5 μl 

każdego z roztworów w dichlorometanie, tj.: mieszaniny polistyrenów, mieszaniny związków hydrofobowych 

z dodatkiem benzo-a-pirenu, mieszaniny związków polarnych, mieszaniny tłuszczów, oraz po 2 μl 

roztworów pojedynczych acylogliceroli, kwasu erukowego i próbki oleju rzepakowego w acetonie. Dozowanie 

wykonywano pod wyciągiem laboratoryjnym. Wysoka lotność CH 2 Cl 2 oraz acetonu zapewniała 

natychmiastowe odparowanie rozpuszczalnika oraz niewielkie wymiary plamek. Następnie płytki 

umieszczono w pozycji pionowej w komorach wysyconych parami poszczególnych rozpuszczalników. Po 

rozwinięciu chromatogramów płytki suszono, a efekty rozdzielania obserwowano pod lampą UV, emitującą 

promieniowanie o długości 254 oraz 365 nm – tzw. wizualizacja w świetle UV. Dla każdego etapu 

wizualizacji plamek stosowano inny charakter linii obwiedni plamek, tzn. linia ciągła odpowiadała wizualizacji 

w świetle o długości 254 nm, natomiast linia przerywana – wizualizacji w świetle o długości 365 nm. 

Ostatnim etapem wywoływania chromatogramów było umieszczenie płytek na 10 min. w eksykatorze 

z jodem (w oparach jodu) i obserwacja brązowych plamek, które powstały na skutek kontaktu z parami jodu. 

Warto nadmienić, iż brązowe zabarwienie plamek pojawiało się tylko wtedy gdy w strukturze danej substancji 

badanej obecne były wiązania podwójne w łańcuchu węglowym. Przykładowo, w przypadku kwasu 

erukowego obserwowano brązowe zabarwienie plamek, natomiast kwas stearynowy nie wykazywał tej 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

76 

cechy. Wszystkie obserwacje uzyskane po rozwinięciu chromatogramów na płytkach TLC dokumentowano 

obrysowując plamki ołówkiem oraz wykonując fotografie. Retencję substancji rozdzielanych określono, 

obliczając współczynnik opóźnienia R f oraz współczynnik retencji k. 

Tab.3. Zestawienie badanych próbek. 

Tab.3. List of examined samples. 

Nazwa próbki Składniki Stężenie roztworu 

pojedynczego 

związku chemicznego 

TAG/DAG/MAG/WKT 1) trioleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml 

ZWIĄZKI POLARNE 1) metanol 

2) etanol 

3) woda 

4) gliceryna 

5) dimetyloformamid 

6) kwas octowy 

7) kwas mlekowy 

8) kwas benzoesowy 

9) aceton 

2) dioleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml 

3) monooleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml 

4) kwas erukowy 25 mg/ml 2,5 mg/ml 

--- po 1 mg/ml 

Stężenie każdego związku 

w roztworze mieszaniny 

związków chemicznych 

ZWIĄZKI NIEPOLARNE 1) benzen 

2) ksylen 

3) naftalen 

4) antracen 

5) metyloantracen 

6) fenantren 

7) piren 

8) koronen 

9) cykloheksan 

--- po 1 mg/ml 

2,1 mg/ml 

OLEJ RZEPAKOWY 

POLISTYRENY + STYREN 1) 2,75*10 6 

2) 1,2*10 6 2,5 mg/ml 

--- 

3) 1,2*10 5 2,12 mg/ml 

4) 1,02*10 4 2,3 mg/ml 

5) 0,95*10 3 4,3 mg/ml 

6) styren 0,2 μl/ml 

Stężenie w roztworze: 25 mg/ml. 

3. WYNIKI I DYSKUSJA 


Przedmiotem pracy jest przedstawianie wyników badań wyjaśniających wpływ eluentu oraz fazy 

stacjonarnej na wartość parametrów elucji, w tym, retencji wybranych modelowych związków chemicznych, 

reprezentujących poszczególne grupy, eluowanych w warunkach cienkowarstwowej chromatografii 

cieczowej (TLC). Jest to pierwsza praca z serii prac poświęconych badaniom rozdzielania grupowego nisko, 

średnio i względnie wysoko polarnych organicznych związków chemicznych, realizowanym przez autorów 

już od kilku lat. Rozdzielano mono-, di-, triacyloglicerole oraz wolne kwasy tłuszczowe, wykorzystując płytki 

TLC dedykowane chromatografii w normalnym (żel krzemionkowy „Si60 F 254”) oraz odwróconym (faza 

oktadecylosilanowa „RP18 F254”) układzie faz. Przeprowadzono szereg elucji z wykorzystaniem ośmiu 

eluentów o zróżnicowanej sile elucyjnej, a także innych niż acyloglicerole grup organicznych związków 

chemicznych. 

W badaniach celowo wykorzystano sorbenty inne niż kopolimer styrenu i diwinylobenzenu oraz 

starano się dobrać odpowiedni eluent, aby możliwe było rozdzielanie tłuszczów za pomocą chromatografii 

wykluczania z kontrolowaną sorpcją. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

77 

Poniżej zestawiono rezultaty badań uzyskane z wykorzystaniem opisanych warunków 

chromatograficznych. 

Eluent: izopropanol 

Mobile phase: isopropanol 

A 

Eluent: aceton 

Mobile phase: acetone 

B 

Rys. 1. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza 

stacjonarna: po lewej – Si60 F254, po prawej – RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe – faza ruchoma: A) izopropanol, 

B) aceton. Oznaczenia: linia ciągła – plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana – plami widoczne przy 365 nm, 

plamki koloru brązowawego – plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 – MAG, 2 – 

DAG, 3 – TAG, 4 – kwas erukowy, 5 – olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. 

Fig. 1. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: 

on the left –Si 60 F254, on the right – RP 18 F254. Single-step elution – mobile phase: A) isopropanol, B) acetone. 

Symbols: solid line – spots visible at 254 nm, dashed line – spots visible at 365 nm, brownish spots – spots visible 

after development in iodine vapor. Examined samples: 1 – MAG, 2 – DAG, 3 – TAG, 4 – erucic acid, 5 – rapeseed 

oil. Sample solvent: acetone. 

Eluent: MTBE:izopropanol (3:1 v/v) 

Mobile phase: MTBE:isopropanol (3:1 v/v) 

C 

Eluent: eter tert-butylowo-etylowy 

Mobile phase: methyl tert-butyl ether 

D 


stacjonarna: po lewej – Si60 F254, po prawej – RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe – faza ruchoma: C) MTBE : 

izopropanol (3:1 v/v), D) MTBE. Oznaczenia: linia ciągła – plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana – plami 

widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego – plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane 

próbki: 1 – MAG, 2 – DAG, 3 – TAG, 4 – kwas erukowy, 5 – olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. 


on the left – Si60 F254, on the right – RP18 F254. Single-step elution – mobile phase: C) MTBE : isopropanol (3:1 

v/v), D) MTBE. Symbols: solid line – spots visible at 254 nm, dashed line – spots visible at 365 nm, brownish spots 

– spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 – MAG, 2 – DAG, 3 – TAG, 4 – erucic acid, 

5 – rapeseed oil. Sample solvent: acetone. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

78 

Eluent: tetrahydrofuran 

Mobile phase: tetrahydrofuran 

E 

Eluent: dichlorometan 

Mobile phase: dichloromethane 

F 


stacjonarna: po lewej – Si60 F254, po prawej – RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe – faza ruchoma: E) THF, F) 

DCM. Oznaczenia: linia ciągła – plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana – plami widoczne przy 365 nm, 

plamki koloru brązowawego – plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 – MAG, 2 – 

DAG, 3 – TAG, 4 – kwas erukowy, 5 – olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. 


on the left – Si60 F254, on the right – RP18 F254. Single-step elution – mobile phase: E) THF, F) DCM. Symbols: 

solid line – spots visible at 254 nm, dashed line – spots visible at 365 nm, brownish spots – spots visible after 

development in iodine vapor. Examined samples: 1 – MAG, 2 – DAG, 3 – TAG, 4 – erucic acid, 5 – rapeseed oil. 

Sample solvent: acetone. 

Eluent: n-heksan:izopropanol (3:1 v/v) 

Mobile phase: n-hexane:isopropanol (3:1 v/v) 

G 

Eluent: n-heksan 

Mobile phase: n-hexane 

H 


stacjonarna: po lewej – Si 60 F254, po prawej – RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe – faza ruchoma: G) n-heksan : 

izopropanol (3:1 v/v), H) n-heksan. Oznaczenia: linia ciągła – plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana – 

plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego – plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. 

Rozdzielane próbki: 1 – MAG, 2 – DAG, 3 – TAG, 4 – kwas erukowy, 5 – olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: 

aceton. 


on the left – Si60 F254, on the right – RP18 F254. Single-step elution – mobile phase: G) n-hexane : isopropanol (3:1 

v/v), H) n-hexane. Symbols: solid line – spots visible at 254 nm, dashed line – spots visible at 365 nm, brownish 

spots – spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 – MAG, 2 – DAG, 3 – TAG, 4 – erucic 

acid, 5 – rapeseed oil. Sample solvent: acetone. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

79 

Tab. 4. Wartości współczynników R f dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem 

ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu Si60. 

Tab. 4. The values of Rf coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile 

phases and Si60 stationary phase. 

Próbka 

(Sample) 

MAG 

DAG 

TAG 

IzoOH 

ACET 

MTBE:izoOH 

3:1v/v 

Faza stacjonarna Si60 

(Si60 stationary phase) 

Eluent 

(Mobile phase) 

MTBE THF DCM 

nC6:izoOH 

3:1v/v 

0,62 0,65 0,69 0,37 0,71 0 0,44 0 

0,72 0,78 0,86 0,71 0,82 

0,15 * 

0,27 ** 

nC6 

0,71 0 

0,76 0,82 0,90 0,78 0,86 0,67 0,78 0 

kwas 

0,63 0,64 0,79 0,61 0,77 0,18 0,68 0 

erukowy 

olej 

0,76 0,82 0,86 0,78 0,86 0,68 0,78 0 

rzepakowy 

* 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = eter tertbutylowo-metylowy:izopropanol, 

MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = 

dichlorometan, nC6:izoOH = n-heksan:izopropanol, nC6 = n-heksan. 

* 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl 

ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nC6:izoOH = n- 

hexane:isopropanol, nC6 = n-hexane. 

Tab. 5. Wartości współczynników R f dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem 

ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu RP18. 

Tab. 5. The values of Rf coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile 

phases and RP18 stationary phase. 

Próbka 

(Sample) 

MAG 

DAG 

TAG 

IzoOH 

ACET 

MTBE:izoOH 

3:1v/v 

Faza stacjonarna RP18 

(RP18 stationary phase) 

Eluent 


MTBE THF DCM 

nC6:izoOH 

3:1v/v 

0,67 0,68 0,84 0,71 0,85 0,36 0,74 0 

0,62 0,60 0,86 0,83 0,88 

0,75 * 

0,71 ** 

nC6 

0,86 0 

0,41 0,41 0,89 0,86 0,89 0,82 0,88 0 

kwas 

0,63 0,64 0,84 0,80 0,85 0,70 0,83 0 

erukowy 

olej 

rzepakowy 

0,42 0,43 0,89 0,86 0,89 0,77 0,88 0 







Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

80 

Tab. 6. Wartości współczynników k dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem 

ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu Si60. 

Tab. 6. The values of k coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile 

phases and Si60 stationary phase. 

Próbka 

(Sample) 

MAG 

DAG 

TAG 

IzoOH 

ACET 

MTBE:izoOH 

3:1v/v 

Faza stacjonarna Si60 

(Si60 stationary phase) 

Eluent 


MTBE THF DCM 

nC6:izoOH 

3:1v/v 

0,61 0,53 0,45 1,72 0,41 -- 1,29 -- 

0,39 0,28 0,16 0,41 0,22 

5,58 * 

2,76 ** 

nC6 

0,40 -- 

0,32 0,22 0,11 0,27 0,16 0,49 0,29 -- 

kwas 

0,58 0,56 0,27 0,61 0,30 4,64 0,48 -- 

erukowy 

olej 

0,32 0,22 0,16 0,27 0,16 0,46 0,29 -- 

rzepakowy 







Tab. 7. Wartości współczynników k dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem 

ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu RP 18. 

Tab. 7. The values of k coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile 

phases and RP 18 stationary phase. 

Próbka 

(Sample) 

MAG 

DAG 

TAG 

IzoOH 

ACET 

MTBE:izoOH 

3:1v/v 

Faza stacjonarna RP18 

(RP18 stationary phase) 

Eluent 


MTBE THF DCM 

nC6:izoOH 

3:1v/v 

0,49 0,48 0,20 0,40 0,18 1,75 0,34 -- 

0,61 0,67 0,16 0,21 0,14 

0,34 * 

0,41 ** 

nC6 

0,16 -- 

1,47 1,42 0,13 0,16 0,13 0,22 0,13 -- 

kwas 

0,58 0,57 0,20 0,25 0,18 0,43 0,20 -- 

erukowy 

olej 

1,39 1,35 0,13 0,16 0,13 0,31 0,13 -- 

rzepakowy 







Na podstawie chromatogramów, które zostały zamieszczone w pracy (rys.1–4), jak również wartości 

współczynników R f i k (tab. 4–7), a także chromatogramów otrzymanych dla grup związków chemicznych: 

polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów (których szczegółowe wyniki zostaną przedstawione w kolejnej 

części tej serii prac), można wyciągnąć następujące wnioski: 

dla układu rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako Si 60 i ośmioma różnymi eluentami 

- dla grup związków chemicznych polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów: 

W przypadku zastosowania izopropanolu, jak również acetonu, jako fazy ruchomej uzyskano układ, gdzie 

występują oddziaływania o charakterze NP (polarna adsorpcja), wraz z którymi może występować 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

81 

wykluczanie steryczne. Świadczy o tym zbliżona elucja polarnych i hydrofobowych związków chemicznych z 

delikatną przewagą większej retencji polarnych związków chemicznych. Ponadto niepolarne polistyreny 

uległy silnej adsorpcji, co nie powinno występować, gdyby miały miejsce tylko oddziaływania typu NP. Silna 

adsorpcja polistyrenów świadczy albo o występowaniu wykluczania sterycznego, albo o słabej 

rozpuszczalności tych związków chemicznych w eluencie. Silniejsza adsorpcja polarnych związków 

chemicznych, aniżeli hydrofobowych została zaobserwowana, gdy eluentem była mieszanina 

MTBE:izopropanolu (3:1 v/v), jednak żadna z tych mieszanin nie uległa rozdzieleniu. Polisty reny nie uległy 

elucji w ogóle, co potwierdziło słabą rozpuszczalność tych związków w izopropanolu, który jest składnikiem 

eluentu. Z koleji niewielka elucja polistyrenów (R f ≈ 0,025) została zaobserwowana dla MTBE jako fazy 

ruchomej. W tym przypadku miała również miejsce zwiększona adsorpcja polarnych związków chemicznych. 

Natomiast hydrofobowe związki chemiczne wykazały zwiększoną retencję i uzyskane zostało ich 

rozdzielenie. Podobne obserwacje odnotowano także, gdy użytym eluentem był THF. DCM powoduje z kolei 

zwiększoną retencję polarnych związków chemicznych (zostają na linii „startu”), która może wynikać ze 

słabej rozpuszczalności niektórych związków chemicznych w DCM (np. woda). W przypadku hydrofobowych 

związków chemicznych, można zauważyć, że związki chemiczne silniej sorbowane zostają rozdzielone, 

natomiast te, wykazujące niższą retencję – nie uległy rozdzieleniu. Polistyreny ulegają elucji, jednak nie 

rozdzielają się. Zaobserwowano, iż n-heksan posiada zbyt niską siłę elucji i/lub jest zbyt słabym 

rozpuszczalnikiem dla badanych związków chemicznych, aby przy zastosowaniu sorbentów Si 60 (jak również 

RP 18 ) rozdzieleniu uległy jakiekolwiek związki chemiczne, poza silnie hydrofobowymi. Jednakże dodatek 

izopropanolu do eluentu (n-heksan:izopropanol (3:1 v/v)), spowodował, że nastąpiło częściowe rozdzielenie 

hydrofobowych związków chemicznych, jednak polarne związki chemiczne pozostały nierozdzielone 

i posiadały retencję zbliżoną do najsilniej sorbowanych hydrofobowych związków chemicznych. 

- dla tłuszczów, tj. MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego: 

Podczas stosowania izopropanolu jako eluentu tłuszcze są eluowane zgodnie z malejącą masą 

cząsteczkową, za wyjątkiem kwasu erukowego (WKT), który to jest eluowany przed monooleinianem 

glicerolu (MAG). Elucja w tej samej kolejności, tj.: TAG, DAG, WKT, MAG miała także miejsce, gdy 

zastosowane zostały następujące fazy ruchome: MTBE, THF oraz n-heksan:izopropanol (3:1 v/v). Natomiast 

elucja całkowicie zgodna z malejącą masą cząsteczkową (tj. bez zamiany kolejności elucji MAG oraz WKT) 

miała miejsce w przypadku zastosowania acetonu jako fazy ruchomej. Dodatkowo, warunki tego rozdzielania 

okazały się bardziej korzystne niż w przypadku użycia izopropanolu, ponieważ uzyskano niższe wartości 

współczynników retencji (tab. 6), co sugeruje krótszy czas trwania analizy; dyskusyjna pozostała natomiast 

kwestia efektywnego rozdzielania DAG i TAG (mają zbliżone współczynniki retencji). Z kolei najniższymi 

wartościami współczynników retencji charakteryzowały się próbki rozdzielane w mieszaninie MTBE:izoOH 

(3:1v/v). W przypadku tego układu rozdzielczego prawdopodobnie występuje wykluczanie steryczne z 

sorpcją typu NP. Należałoby sprawdzić za pomocą kolumnowej chromatografii wykluczania czy możliwe jest 

rozdzielenie TAG i DAG, ponieważ z rezultatów uzyskanych za pomocą TLC wynika, iż retencja obu 

związków jest zbliżona. Gdy jako fazę ruchomą zastosowano MTBE zaobserwowano, iż tłuszcze zostały 

lepiej rozdzielone niż w przypadku zastosowania mieszaniny MTBE:izopropanol (3:1 v/v), jednak MAG uległ 

znacznie silniejszej adsorpcji, co może znacznie wydłużać czas analizy, gdyby opisywane warunki zostały 

przeniesione do kolumnowej chromatografii wykluczania. W przypadku zastosowania tego układu 

chromatograficznego w kolumnowej GPC, może być konieczne zastosowanie zaworu przepływu zwrotnego. 

Po zastosowaniu DCM jako eluentu, tłuszcze są eluowane w kolejności: trioleinian glicerolu; 1,3-dioleinian 

glicerolu; kwas erukowy; 1,2-dioleinian glicerolu. W przypadku zastosowania układu rozdzielczego z 

sorbentem oznaczonym jako Si 60 i DCM jako eluentem możliwe jest zatem rozdzielenie próbki DAG na dwa 

izomery, charakteryzujące się różną polarnością, przy czym izomer 1,3 - jest mniej polarny aniżeli izomer 

1,2.Tłuszcze są lepiej rozdzielone niż w przypadku zastosowania tetrahydrofuranu jako eluentu, jednak WKT 

oraz obydwa izomery DAG uległy znacznie silniejszej adsorpcji, co może znacznie wydłużać czas analizy, 

gdyby opisywane warunki zostały przeniesione do kolumnowej chromatografii wykluczania. M onooleinian 

glicerolu zostaje na linii „startu”. W przypadku zastosowania tego układu chromatograficznego w kolumnowej 

GPC, również konieczne byłoby zastosowanie zaworu przepływu zwrotnego. Oddziaływania, jakie mają 

miejsce mają charakter układu NP (polarna adsorpcja). Współczynniki opóźnienia dla acylogliceroli i wolnych 

kwasów tłuszczowych, uzyskane po zastosowaniu mieszaniny n-heksan:izopropanol (3:1 v/v), wskazują na 

to, iż w kolumnowej GPC mogą się one dobrze rozdzielać. Oddziaływania, jakie mają miej sce w tym 

wypadku to prawdopodobnie wykluczanie steryczne z adsorpcją typu RP (hydrofobowa adsorpcja). 

Ponownie, n-heksan, stosowany bez dodatku izopropanolu, posiada zbyt niską siłę elucji i/lub jest zbyt 

słabym rozpuszczalnikiem dla badanych związków chemicznych, aby przy zastosowaniu sorbentów Si 60 

i RP 18 rozdzieleniu uległy jakiekolwiek związki chemiczne, poza silnie hydrofobowymi. Po przeanalizowaniu 

wyników większości jednostopniowych elucji (poza tą, gdzie fazą ruchomą był właśnie n -heksan), 

zauważalne jest także, że głównym składnikiem obecnym w próbce oleju rzepakowego są triacyloglicerole. 

dla układ rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako RP 18 i ośmioma różnymi eluentami: 

- dla grup związków chemicznych polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów: 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

82 

Układ rozdzielczy z izopropanolem jako eluentem charakteryzuje się występowaniem oddziaływań o 

charakterze RP (hydrofobowa adsorpcja). Hydrofobowe związki chemiczne są dobrze rozdzielone, a polarne 

związki chemiczne są szybko eluowane. Podobnie jak miało to miejsce w przypadku użycia sorbentu Si 60 , 

wystąpiła silna adsorpcja polistyrenów, co potwierdza ich niską rozpuszczalność w izopropanolu. Po 

zastosowaniu acetonu jako eluentu, można zauważyć lepsze rozdzielenie związków hydrofobowych, a tak że 

delikatną elucję polistyrenów, co dementuje hipotezę, iż polistyreny miałyby się nie rozpuszczać w acetonie. 

Zauważalne jest, że w przypadku zastosowania MTBE, jak również THF, jako fazy ruchomej polistyreny 

ulegają elucji, natomiast gdy do eluentu dodany został izopropanol (MTBE:izopropanolu (3:1 v/v)) elucja nie 

zachodziła. W układzie rozdzielczym z mieszaniną MTBE:izopropanolu (3:1 v/v) zauważalna jest silniejsza 

sorpcja hydrofobowych związków chemicznych, niż polarnych, natomiast układ rozdzielczy bez dodatku 

izopropanolu do MTBE oraz ten, w którym eluentem jest THF, charakteryzuje się zbliżoną adsorpcją 

polarnych związków chemicznych i hydrofobowych. Jednak w tym przypadku, gdy fazą ruchomą jest MTBE, 

polarne związki chemiczne uległy nieco silniejszej adsorbcji. Zastosowanie DCM jako eluentu, powoduje 

spadek retencji hydrofobowych związków chemicznych w porównaniu do rezultatów uzyskanych przy 

zastosowaniu fazy stacjonarnej oznaczonej jako Si 60 i DCM jako eluentu, jednak związki chemiczne nie 

zostały całkowicie rozdzielone. Polarne związki chemiczne są sorbowane w sposób podobny jak przy 

zastosowaniu sorbentu Si 60 . Obserwuje się jednak znacznie lepsze rozdzielenie polistyrenów. W przypadku 

zastosowania mieszaniny n-heksan:izopropanol (3:1 v/v) oraz sorbentu oznaczonego jako RP 18 , zauważalne 

jest lepsze rozdzielenie hydrofobowych związków chemicznych, niż przy zastosowaniu sorbentu Si 60 , 

podczas gdy polarne związki chemiczne wykazują znacznie niższą retencję. Polistyreny rozdzielają się w 

podobny sposób jak przy zastosowaniu sorbentu Si 60 . 

- dla tłuszczów, tj. MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego: 

W układach rozdzielczych, gdzie zastosowano izopropanol, jak również aceton jako fazę ruchomą 

acyloglicerole są eluowane zgodnie z rosnącą masą cząsteczkową i rosnącą hydrofobowością. Jednakże, w 

przypadku izopropanolu można ponownie zaobserwować odwróconą kolejność elucji WKT i MAG. Oba 

układy (zarówno ten z izopropanolem jak i acetonem) stwarzają lepsze warunki do rozdzielania tłuszczów niż 

Si 60 , co można stwierdzić na podstawie otrzymanych wartości parametrów elucji. W przypadku gdy eluentem 

był MTBE lub THF acyloglicerole były eluowane w kolejności zgodnej z malejącą masą cząsteczkową i 

malejącą hydrofobowością. W przypadku stosowania MTBE 

ponownie moż na zaobserwować odwróconą kolejność elucji WKT i MAG, a oddziaływania, jakie występują 

mają charakter NP (polarna adsorpcja), ewentualnie z wykluczaniem sterycznym. Kwestia efektywnego 

rozdzielania MAG i WKT (mają takie same współczynniki retencji) pozostaje dyskusyjna w układzie 

rozdzielczym, w którym zastosowany został THF, a mechanizmem decydującym o rozdzielaniu jest 

wykluczanie steryczne. Układ ten wprawdzie charakteryzuje się niską retencją tłuszczów, jednak zbliżone 

współczynniki opóźnienia R f (tab. 7) świadczą o tym, że związki mogą ulegać elucji w bardzo zbliżonym 

czasie retencji i nie rozdzielać się – należy to sprawdzić za pomocą kolumnowej chromatografii wykluczania. 

Gdy eluent zawierał dodatek izopropanolu (MTBE:izopropanol (3:1 v/v)) wśród tłus zczów, zauważono 

dominację wykluczania sterycznego z oddziaływaniami typu RP – związki są eluowane w kolejności: TAG, 

DAG, MAG, WKT, czyli w kolejności podyktowanej malejącą masą cząsteczkową, natomiast dyskusyjna 

pozostaje kwestia efektywnego rozdzielania MAG i WKT (mają takie same współczynniki retencji). 

Należałoby sprawdzić czy acyloglicerole i wolne kwasy tłuszczowe ulegają rozdzieleniu przy zastosowaniu 

kolumnowej GPC w tych samych warunkach rozdzielczych. W przypadku zastosowania DCM jako fazy 

ruchomej tłuszcze były eluowane w kolejności: trioleinian glicerolu; 1,2-dioleinian glicerolu; 1,3-dioleinian 

glicerolu; kwas erukowy; monooleinian glicerolu, a oddziaływania, jakie miały miejsce to najprawdopodobniej 

wykluczanie steryczne, być może z oddziaływaniami o charakterze NP (polarna adsorpcja). Zastosowanie 

kolumnowej GPC do dokładniejszego zbadania charakteru oddziaływań, jakie mają miejsce, powinno 

zapewnić dobre rozdzielenie TAG; 1,2-DAG; MAG i WKT, jednak silna sorpcja MAG prawdopodobnie 

wymagać będzie zastosowania zaworu przepływu zwrotnego. Po zastodowaniu DCM jako eluentu 

dyskusyjna pozostaje natomiast kwestia efektywnego rozdzielania 1,3-DAG oraz WKT (zbliżone 

współczynniki retencji). W mieszaninie n-heksan:izopropanol (3:1 v/v), tłuszcze są eluowane w kolejności: 

TAG, DAG, WKT, MAG, a mechanizmem decydującym o rozdzielaniu prawdopodobnie jest wykluczanie 

steryczne. Gdy n-heksan jest pozbawiony dodatku izopropanolu, MAG i DAG zostają na linii „startu”, nie 

ulegając elucji w ogóle. Jedynie TAG oraz WKT wykazuje rozmycie plamki, co widoczne jest także po próbie 

rozdzielenia próbki oleju rzepakowego, gdzie stężenie TAG jest wysokie. Świadczy to o niezbyt wysokiej sile 

elucyjnej n-heksanu oraz o tym, że przyczyną braku elucji MAGów i DAGów jest ich słaba rozpuszczalność 

w eluencie. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

83 

Tab. 8. Prawdopodobnie występujące oddziaływania pomiędzy cząsteczkami rozdzielanych związków chemicznych 

a powierzchnią fazy stacjonarnej, występujące w badanych warunkach chromatograficznych TLC. 

Tab. 8. Probable interactions occurring, in examined TLC conditions, between molecules of separated compounds and 

the stationary phase surface. 

Vol. 7, No 1/2015 

Eluenty 


Si60 

Stosowane fazy stacjonarne 

(Stationary phases used) 

Izopropanol 

(isopropanol) 

GPC/SEC-NP lub NP-LC 

RP-LC 

Aceton 

(acetone) 

GPC/SEC-NP 

GPC/SEC-RP 

MTBE : izopropanol (3:1 v/v) 

(MTBE:isopropanol) (3:1 v/v) 

GPC/SEC-NP 

GPC/SEC-RP 

MTBE GPC/SEC-NP NP-LC lub GPC/SEC-NP 

THF NP-LC GPC/SEC 

DCM NP-LC GPC/SEC-NP lub GPC/SEC 

n-heksan : izopropanol (3:1 v/v) 

(n-hexane:isopropanol) (3:1 v/v) 

GPC/SEC-NP 

GPC/SEC 

n-heksan 

(n-hexane) 

- - 

W tab. 8 zestawiono podsumowanie wniosków cząstkowych na temat oddziaływań, jakie 

najprawdopodobniej mają miejsce w poszczególnych układach chromatograficznych. W przypadku, gdy 

charakter mechanizmu rozdzielania określono mianem wyłącznie, "wykluczania" (GPC/SEC), mamy do 

czynienia praktycznie z „czystym” wykluczaniem sterycznym rozdzielanych związków chemicznych. Gdy 

układ chromatograficzny posiada cechy układu GPC/SEC -NP, o rozdzielaniu związków chemicznych 

decyduje występowanie, obok wykluczania sterycznego, oddziaływań dyspersyjnych, dipolowych, polarnych 

oraz wodorowych, zaś gdy posiada cechy GPC/SEC-RP – obok wykluczania sterycznego, występowanie 

oddziaływań van der Waalsa, a także o charakterze π-π, π-para elektronowa i kwadrupolowych. 

4. WNIOSKI KOŃCOWE 

Technika TLC pozwoliła na uzyskanie orientacyjnych informacji na temat rozdzielczości i retencji 

badanych związków chemicznych. Z przeprowadzonych badań wynika, iż określone modyfikacje warunków 

kolumnowej chromatografii wykluczania mogą prowadzić do zmian rozdzielczości i selektywności układów 

rozdzielczych. Poznanie oddziaływań, jakie mają miejsce między cząsteczkami tłuszczów i produktów ich 

konwersji a powierzchnią fazy stacjonarnej oraz znalezienie optymalnego składu eluentu i programu elucji 

może i powinno być dokonywane z zastosowaniem techniki chromatografii cienkowarstwowej (TLC), co w 

zasadniczym stopniu przyspiesza oraz ułatwia dobór optymalnych warunków separacji. Następnie, zasadne 

jest przeniesienie najważniejszych wniosków do warunkó w wysokosprawnej chromatografii kolumnowej 

(HPLC), najpierw w skali modelowej, a następnie, preparatywnej. W ten sposób można w zasadniczym 

stopniu przyśpieszyć opracowanie optymalnych warunków rozdzielania grupowego oraz "szczegółowego" 

skomplikowanych mieszanin związków chemicznych, w tym, tłuszczów i produktów ich konwersji. 

Realizowane badania powinny w przyszłości pozwolić na opracowanie zautomatyzowanej aparatury do 

wielokolumnowego (NC) i wielowymiarowego (nD), preparatywnego rozdzielania tłuszczów i produktów ich 

konwersji.. Docelowo taka zautomatyzowana aparatura może posłużyć do otrzymywania użytkowych ilości 

"wzorców" tłuszczów i produktów ich konwersji. 

Podczas przenoszenia warunków rozdzielania zastosowanych podczas badań TLC do chromatografii 

kolumnowej (HPLC), należy pamiętać, iż w przypadku chromatografii cieczowej, w tym, w chromatografii 

wykluczania (GPC/SEC), najbardziej korzystne są warunki, gdy rozpuszczalnikiem składników rozdzielanej 

mieszaniny jest eluent, a w przypadku elucji gradientowej – ciecz o składzie identycznym jak początkowy 

eluent w programie elucji. W warunkach „klasycznej” chromatografii wykluczania eluent, będący 

rozpuszczalnikiem mieszaniny dozowanej do kolumny powinien, dodatkowo, zapewnić minimalizację, a 

najkorzystniej brak oddziaływań sorpcyjnych wszystkich składników rozdzielanej mieszaniny z powierzchnią 

porów wypełnienia kolumny. Wówczas elucja z kolumny ma miejsce w kolejności od największych do 

najmniejszych cząsteczek. Największe mają „do dyspozycji” jako "drogę dyfuzji" tylko niewielką przestrzeń 

największych porów w wypełnieniu kolumny. Najmniejsze największą przestrzeń wszystkich porów – 

największych, średnich i najmniejszych. Powyższe dotyczy „klasycznej” chromatografii wykluczania, a więc 

przy braku oddziaływań sorpcyjnych składników rozdzielanej mieszaniny z powierzchnią mikro -porów 

wypełnienia kolumny. Natomiast w przypadku, gdy skład eluentu oraz faza stacjonarna kolumny zostały w 

ten sposób dobrane, że oprócz efektu wykluczania, będą miały miejsce słabe oddziaływania adsorpcyjne, do 

tego – korzystnie, tym silniejsze, im niższa masa molekularna rozdzielanych substancji - powinno to 

powodować wzrost rozdzielczości tak „zaprojektowanego” układu rozdzielczego, podobnie, jak to 

obserwowano podczas badań techniką TLC, opisanych w niniejszej pracy. 

RP18 

Camera Separatoria

84 

Takie warunki powinny mieć wówczas miejsce, gdy powierzchnia sorpcyjna wypełnienia kolumny, 

charakteryzująca się określonym rozkładem wielkości porów dostosowanym do wielkości rozdzielanych 

cząsteczek. Jednocześnie jest nieco polarna, a eluent nie jest na tyle polarny, by zapewniał całkowitą 

eliminację adsorpcji. Gdy w takich warunkach rozdzielaniu grupowemu mają podlegać np. tri -, di- oraz 

monoacyloglicerole – TAG/DAG/MAG, wówczas oczywista wydaje się być kolejność elucji: 1 – TAG, 2 – 

DAG, 3 – MAG, ponieważ w tej kolejności wzrasta polarność w/w grup składników rozdzielanej mieszaniny. 

Jednakże, jak wykazały badania TLC, gdy mieszanina zawiera także wolne kwasy tłuszczowe (WKT), to 

kolejność elucji już nie jest oczywista, gdyż WKT są co prawda względnie mniejszymi cząsteczkami od 

TAG/DAG/MAG i w warunkach „klasycznej” GPC/SEC powinny być eluowane jako ostatnie, jednak są 

znacznie mniej polarne niż monoacyloglicerole (MAG'i). Kolejność elucji w warunkach GPC -NP może 

wówczas zależeć od polarności eluentu oraz od polarności fazy stacjonarnej. Istnieje możliwość doboru w 

ten sposób rodzaju fazy stacjonarnej oraz rodzaju eluentu, by mimo niezbyt wysokiej sprawności kolumny, 

tzn. ograniczonej liczbie półek teoretycznych, nie tylko miało miejsce rozdzielanie grupowe, ale by 

odwrócona została kolejność elucji dwóch ostatnich grup MAG/WKT. Badania wykonane techniką HPLC, 

których rezultaty będą przedmiotem kolejnej publikacji wykazały, że jest też możliwe, by miało miejsce 

częściowe rozdzielanie pod względem polarności w ramach poszczególnych grup, szczególnie w ramach 

grupy WKT i MAG'ów. Jednakże, kolumna HPLC, typu GPC/SEC -NP powinna wówczas charakteryzować 

się bardzo wysoką sprawnością (bardzo wysoka liczba półek teoretycznych (N)). Stąd, warunki GPC/SEC - 

NP są przydatne do wstępnego rozdzielania grupowego. Natomiast, "szczegółowe" rozdzielanie pod 

względem zróżnicowania polarności jest celowe w typowych warunkach NP -HPLC, z elucją gradientową. W 

przypadku rozdzielania bardzo skomplikowanych mieszanin, można, a czasem należy, najpierw dokonać 

rozdzielania "wstępnego" w warunkach HPLC - GPC-SEC-NP, a następnie poszczególne frakcje rozdzielać 

w warunkach NP-HPLC z elucją gradientową [A. Stołyhwo, wyniki niepublikowanych badań]. Jest to 

szczególnie celowe gdy celem rozdzielania jest preparatywne wydzielanie czystych związków chemicznych, 

albo określonych grup związków chemicznych. 

Odwrotna sytuacja będzie miała miejsce, gdy wraz ze spadkiem wielkości cząsteczek (spadkiem masy 

molekularnej) będzie miał miejsce wzrost hydrofobowości i spadek polarności składników, lub grup 

składników rozdzielanej mieszaniny. Taka sytuacja jest dość rzadka, jednak nie jest wykluczona. Wówczas 

korzystne może być powiązanie warunków chromatografii wykluczania z warunkami słabych oddziaływań 

hydrofobowych GPC/SEC-RP. 

Na zakończenie należy zwrócić uwagę, że badania ostatnich lat wykazują [18-21], że rozdzielanie 

poszczególnych izomerów acylogliceroli jest możliwe z wykorzystaniem HPLC i faz stacjonarnych typu C18 

lub podobnych, o wysokim stopniu hydrofobowości powierzchni sorpcyjnej oraz z wykorzystaniem elucji 

gradientowej i z takimi bezwodnymi składnikami eluentu, jak, dichloroetan, dichlorometan, chloroform, 

acetonitryl itp. Jednocześnie kolumny "typu RP" powinny charakteryzujących się bardzo wysoką 

sprawnością oraz wysoką selektywnością. 

Badania nad zastosowaniem wysokosprawnej wielowymiarowej (nD) i wielokolumnowej (NC) 

chromatografii cieczowej do rozdzielania w skali semi-preparatywnej mieszanin tłuszczów i produktów ich 

konwersji, w celu otrzymywania czystych grup związków chemicznych / określonych indywiduów 

chemicznych są przedmiotem kolejnej przygotowywanej publikacji. 

Conclusions 

TLC technique allows to obtain approximate information about resolution and retention of the 

examined compounds. Partial conclusions summarizing interactions, which most probably take place in 

various chromatographic systems is presented in tab.12. In cases where the nature of the separation 

mechanism is denoted as GPC/SEC, only steric exclusion of separated chemical compounds takes place. 

When the chromatographic system has the characteristics of the GPC/SEC-NP, the separation of chemicals 

is based on occurrence of dispersion, dipole, polar and hydrogen interactions, next to steric exclusion. When 

the chromatographic system has the characteristics of the GPC/SEC-RP – next to steric exclusion, there 

also occur van der Waals forces, as well as a π-π, π-electron pair and quadrupole ones. 

Our research shows that certain modifications of size-exclusion chromatography may lead to changes 

in resolution and selectivity of chromatographic systems. Good cognition and knowledge of interactions that 

take place between molecules of fats (and products of their conversion) and the surface of the stationary 

phase, as well as, finding an optimal mobile phase composition and elution program, can and should be 

done by means of thin layer chromatography (TLC), as TLC technique crucially accelerates and facilitates 

the selection of optimal conditions for separation. In next step, it is justifiable to transfer, first to model scale 

and than to preparative scale, the most important conclusions form TLC to high performance liquid 

chromatography (HPLC) conditions. In such a way, it is possible to significantly accelerate the process of 

optimal conditions selection for group and “detailed” separation of complex mixtures of chemical compounds, 

including fats and products of their conversion. In future, conducted studies should led to construction of an 

automated multi-column (NC) and multi-dimensional (nD) separation system which could be used for 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

85 

preparative separation of fats and products of their conversion. Ultimately, such automated chromatographic 

system should have potential to be used in fats’ standards production. 

When transferring separation conditions used in the thin layer chromatography (TLC) to high 

performance liquid chromatography (HPLC), it should be noted that in the case of liquid chromatography, 

including exclusion chromatography (GPC/SEC), the solvent of the sample should be the same as mobile 

phase used. In case of a gradient elution – the solvent should have identical composition as the initial mobile 

phase used in elution program. During “classical” size exclusion chromatography, the mobile phase has to 

ensure minimization, or preferably, absence of sorption interactions between all components of the sample 

being separated and the surface of the pores of the stationary phase. Then the elution of substances form 

the column takes place in the order from the largest to the smallest particles. The biggest ones have, as the 

“diffusion path”, only a small space of the largest pores of stationary phase at their disposal. Th e smallest 

ones have the biggest space – the space of all pores (the largest, medium and smallest). The same applies 

to the "classical" size exclusion chromatography, when the sorption interactions between components of 

separated sample and the surface of the micro-pores of the column packing are absent. However, in the 

case where the mobile phase composition and the stationary phase of the column have been selected in 

such a way that, in addition to exclusion effects, weak adsorption interactions take plac e – preferably, the 

stronger the lower the molecular weight of the separated sample is – an increase of resolution in such 

'designed' separation system should be obtained, as it was observed during the studies carried out by means 

of TLC and described in this paper. 

Such conditions should take place when the sorption area of stationary phase has a defined pore size, 

which is properly and adequately selected for the size of separated particles. At the same time, the 

stationary phase should be slightly polar, while the mobile phase is not sufficiently polar to provide complete 

elimination of adsorption. When tri -, di- and monoalyloglycerols are subjected to separation in described 

conditions, the order of elution seems to be obvious: 1 – TAG, 2 – DAG, 3 – MAG, according to increasing 

polarity. However, as it was proved by TLC studies, when the examined sample contained also free fatty 

acids (FFA) the elution order was not so clear and obvious. However, FFA are relatively smaller particles 

than TAG/DAG/MAG and in case of „classical” GPC/SEC they should be eluted as the last ones, they are 

significantly less polar than monoacylglycerols (MAG). The elution order in GPC -NP conditions may depend 

on the polarity of the mobile phase and the polarity of the stationary phase. Despite of quite low efficiency of 

the column, i.e. a limited number of theoretical plates, there is a possibility to select a stationary phase type 

and a type of mobile phase in such a way to obtain good group separation and reversed elution order o f the 

last two groups, i.e. MAG/FFA. Studies carried out by HPLC technique, the results of which will be the 

subject of another paper, revealed that it is also possible to obtain group separation in relation to polarity, 

especially within the FFA and MAG groups. However, the GPC/SEC-NP HPLC columns should than have a 

very high efficiency (a very high number of theoretical plates (N)). Therefore, the GPC/SEC-NP conditions 

are useful for the initial group separation. In contrast, “detailed” separation, in rel ation to polarity differences, 

is advisable during classical NP-HPLC conditions with gradient elution. In the case of highly complex 

mixtures separation, it is possible or sometimes indispensable, to firstly perform “initial” separation by HPLC - 

GPC/SEC-NP, and then separate respective fractions by means of NP -HPLC with gradient elution 

[A. Stołyhwo, unpublished results of studies]. It is particularly advisable when the aim of the separation is to 

obtain pure chemical compounds or groups of compounds in preparative scale. 

Opposite situation will take place when during the particle size decrease (and the molecular mass 

decrease) the hydrophobicity of separated compounds (or group of compounds) will increase and their 

polarity will decrease. Such situation occurs infrequently, however is possible. Then, it may be profitable to 

link up the GPC/SEC conditions with the conditions of weak hydrophobic interactions GPC/SEC-RP. 

Finally, it should be noticed that recent studies [18 -21] showed that the separation of individual 

acyloglycerol isomers is possible by means of HPLC and C18 (or similar) stationary phases, with gradient 

elution, and with anhydrous mobile phases such as dichloroethane, dichloromethane, chloroform, 

acetonitrile, etc. Simultaneously, the columns of “RP-type” should be characterized by a very high efficiency 

and high selectivity. 

Studies concerning usage of high performance multi -diemnsional (nD) and multicolumn (NC) liquid 

chromatography for separation of fats and products of their conversion in semi-preparative scale, in order to 

obtain pure chemical compounds or groups of compounds, are the subject of the next research paper. 


(Acknowledgements) 

Prace były finansowane przez Narodowe Centrum Nauki numer rejestracyjny projektu badawczego: 

N N312 417237, numer umowy: 4172/B/P01/2009/37, pt. "Wykorzystanie chromatografii wykluczania 

i adsorpcji do rozdzielania i oznaczania grupowego lipidów i produktów konwersji w tłuszczach jadalnych" 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

86 

5. LITERATURA 

(Literature) 

1. Praca zbiorowa pod red. R. Aparicio, J. Harwood, Handbook of olive oil, Springer, New York 2013. 

2. Praca zbiorowa pod red. F.D. Gunstone, J.L. Harwood, A. J. Dijkstra, The lipid handbook, CRC Press, 

New York 2007. 

3. T. Płatek, Wybrane problemy procesu rafinacji oleju rzepakowego, Tłuszcze Jadalne, 41 (2006) 65. 

4. Norma PN-EN 14105: 2004 Produkty przetwarzania olejów i tłuszczów. Estry metylowe kwasó w 

tłuszczowych (FAME). Oznaczanie zawartości wolnego i ogólnego glicerolu oraz mono -, di 

i triacylogliceroli. 

5. Norma PN-EN 14106: 2004 Produkty przetwarzania olejów i tłuszczów. Estry metylowe kwasó w 

tłuszczowych (FAME). Oznaczanie zawartości wolnego glicerolu. 

6. Norma PN EN-ISO 5508: 1996 Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą GC. 

7. Norma PN EN-ISO 6800: 2002 Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych pozycji 2 cząsteczek 

triacylogliceroli. 

8. Norma PN EN-ISO 8420: 2004 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie zawartości związków 

polarnych. 

9. Norma PN EN-ISO 9936: 2007 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie zawartości tokoferoli 

i tokotrienoli. Metoda HPLC. 

10. Norma PN-EN ISO 12228: 2002 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie poszczególnych 

steroli i ich całkowitej zawartości. Metoda GC. 

11. Norma PN-EN ISO 16931: 2009 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie zawartości 

spolimeryzowanych triacylogliceroli metodą chromatografii sitowej (HP SEC). 

12. Norma PN-EN ISO 18395: 2008 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie mono-, di-, 

triacylogliceroli i glicerolu metodą chromatografii sitowej (HP SEC). 

13. B. Fuchs, R. Suess, K. Teuber, M. Eibisch, J. Schiller, Lipid analysis by thin layer chromatography – a 

review of the current state, Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 2754. 

14. P. Dudley, R. Anderson, Separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thin -layer 

chromatography, Lipids, 10 (1975) 113. 

15. R. Wilson, J.R. Sargent, High-resolution separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thinlayer 

chromatography, Journal of Chromatography A, 623 (1992) 403. 

16. J.J. Myher, A. Kuksis, General strategies in chromatographic analysis of lipids, Journal of 

Chromatography B, 671 (1995) 3. 

17. D. Allan, S. Cockroft, A modified procedure for thin-layer chromatography of phospholipids, The Journal 

of Lipid Research, 23 (1982) 1373. 

18. Praca zbiorowa pod red. J. L. Sebedio, E.G. Perkins, New trends in lipid and lipoprotein analyses, 

AOCS Press, Champaign 1995. 

19. M. Cerkowniiak, A. Puckowski, P. Stepnowski, M. Gołębiewski, The use of chromatographic techniques 

nfor the separation and the identification of insect lipids, Journal of Chromatography B, 937 (2013), 67- 

78. 

20. F. Sakouhi, Ch.Absalon, H. Kallel, S. Boutkhchina, Comparative analysis of triacyloglicerols from Olea 

europea L.fruits using HPLC and MALDI-TOFS., European Journal of Lipid Science and Technology 

2010, 112, 574-579. 

21. P.Q. Tranchida, P. Donato, P. Dugo, G. Dugo, L. Mondello, Comprehensive chromatographic methods 

for the analysis of lipids, Trends in Analytical Chemistry, Vol 26, No,.3, 2007. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria



Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD* 

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych, 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach 

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce 

*Autor do korespondencji, e-mail: bkg@onet.eu 


całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Część II. Właściwości antyoksydacyjne 

mięsa. 

Streszczenie: Antyoksydanty są związkami zapobiegającymi lub opóźniające utlenianie zachodzące w organizmie 

ludzkim i produktach spożywczych. Te, które występują w żywności, są korzystne dla naszego zdrowia, wspomagają 

leczenie i profilaktykę chorób. Do tej pory niewiele jest informacji na temat żywności pochodzenia zwierzęcego. W mięsie 

po uboju dochodzi do niekontrolowanych reakcji chemicznych, obniżenia pH oraz powstawania nowych antyoksydantów. 

W trakcie przygotowywania mięsa do spożycia następują zmiany w mikrostrukturze tkanki łącznej i włókien mięśniowych, 

które w efekcie powodują zmiany właściwości antyoksydacyjnych. Celem pracy było (i) zbadanie możliwości oznaczania 

całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA), odniesionego do rodnika DPPH, za pomocą TLC; (ii) zastosowanie 

opracowanej metody do oznaczania CPA wyrobów mięsnych oraz (iii) zastosowanie TLC jako fingerprint (odcisk palca) 

właściwości antyoksydacyjnych mięs. 

Słowa kluczowe: chromatografia cienkowarstwowa, TLC; 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl, DPPH; antyoksydanty; 

całkowity potencjał antyoksydacyjny, CPA, mięso. 

About the possibility of application of thin layer chromatography to the 

measurements of the total antioxidant potential. Part II. Antioxidant properties of the 

meat. 

Abstract: Antioxidants are compounds which prevent or delay the oxidation occurring in the human b ody and/or food 

products. Those, occurring in the food are advantageous for our health; enhance treatment and prevention of diseases. 

So far, there is little information on food of animal origin. In the meat after slaughter occurs uncontrolled chemical 

reactions decreased pH and the formation of new antioxidants. During the meat preparation for consumption changes 

occur in the microstructure of connective tissue and muscle fibers that have the effect on changes in their antioxidant 

properties. The aim of this study was (i) examine the possibility of determining of total antioxidant capacity (CPA), 

referred to the DPPH, by TLC; (ii) the application of this method for the determination of the CPA of meat and (iii) the use 

of TLC as a fingerprint of antioxidant properties of meats. 

Key words: thin layer chromatography, TLC; 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH; antioxidants; total antioxidant 

potential, TAP, meat. 



Skład mięsa zależy od wieku, masy zwierzęcia, płci, gatunku i zmian jakie zachodzą w tuszy po uboju. 

Mięso zwierząt rzeźnych zawiera pełnowartościowe białka, niezbędne aminokwasy, które są potrzebne do 

budowy tkanek, a organizm człowieka nie jest w stanie sam sobie ich wytworzyć. Z żywieniowego punktu 

widzenia mięso jest także źródłem związków mineralnych oraz witamin. Ich zawartość waha się w zależności 

od poszczególnych mięśni i części tuszy ale także od sposobu żywienia i gatunku zwierzęcia. W ciągu 24 

godzin ustala się glikogenoliza (rozkład glikogenu do glukozy lub glukozo-6-fosforanu) i końcowe pH (5,3- 

5,7). Poszczególne gatunki mięsa i ryb różnią się pomiędzy sobą barwą, wielkością i strukturą tkanki 

mięśniowej/tłuszczowej [1-3]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

88 

Istotną rolę w przeciwdziałaniu powstawania uszkodzeń wolnorodnikowych pełnią związki hamujące 

wytwarzanie rodników i/lub uczestniczące w przemianie ich w nieaktywne pochodne. Związki te, tworzą 

system antyoksydacyjny, a ze względu na mechanizm działania dzieli się je na enzymatyczne i 

nieenzymatyczne, niskocząsteczkowe (askorbinian, tokoferol, koenzym CoQ, glutation). Do antyoksydantów 

enzymatycznych zalicza się katalazę (CAT), peroksydazę glutationową (GPx) czy dysmutazę ponadtlenkową 

(SOD) [4-6]. Antyoksydanty dzielimy również na hydrofobowe (lipofilne), występujące w błonach 

komórkowych i lipoproteinach osocza, i hydrofilowe, występujące w cytoplazmie komórek i płynach 

pozakomórkowych [7]. Problemem analitycznym jest oznaczenie obu grup antyoksydantów. 

2. Część Eksperymentalna 


Aparatura 

(Apparatus) 

Pomiary chromatograficzne techniką TLC wykonane zostały przy użyciu komór chromatograficznych 

typu DS II d (Chromdes, Lublin) o wymiarach 10 x 5 cm i 20 x 20 cm oraz płytek szklanych, pokrytych żelem 

krzemionkowym NP (Silicagel 60 i Silicagel 60 F 254S ) lub pokrytych żelem krzemionkowym modyfikowanym 

grupami oktadecylowymi (RP -18WF 254S ) (Merck, Niemcy) o wymiarach 5 x 10 cm i grubości 0,25 mm. 

Rejestracji i przetwarzania danych dokonano za pomocą skanera HP Scanjet G210 oraz pakietu 

oprogramowania ScionImage oraz ImageJ [8]. 

Odczynniki chemiczne 

(Chemicals/reagents) 

W trakcie badań wykorzystano odczynniki: n-heksan cz.d.a., etanol cz.d.a. 96,6 %, 2-propanol cz.d.a., 

wodoroortofosforan disodu, diwodoroortofosforan sodu (Chempur, Piekary Śląskie, Polska), aceton cz.d.a 

(Stanlab, Lublin), metanol HPLC grade (Honeywell, Niemcy), dichlorometan HPLC, 35 % kwas solny cz.d.a., 

kwas galusowy (POCh, Gliwice, Polska), acetonitryl Chromasolv, DPPH, 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl 

(Sigma-Aldrich, Niemcy). 

Materiał badawczy 

(Materials) 

Jako materiał do badań zastosowano dwa rodzaje mięsa drobiowego (filet z indyka, filet z kurczaka), 

trzy rodzaje mięsa wołowego (szponder wołowy, cielęcinę, karkówkę wołową), trzy rodzaje mięsa 

wieprzowego (słoninę, schab wieprzowy, łopatkę wieprzową) oraz dwa gatunki ryb tłustych (łosoś wędzony, 

śledź). Mięso zostało zakupione w sklepach znajdujących się na terenie miasta Siedlce. 

Przygotowywanie mięsa 

(Meat preparation) 

Wszystkie roztwory wodne wykorzystane w badaniach przygotowano stosując wodę trójkrotnie 

destylowaną z kwarcu. Ekstrakty mięsa o stężeniu 0,5 g/ml przygotowano przez rozpuszczenie 2 g 

rozmrożonego, zmielonego mięsa (60 sek.) w 4 ml rozpuszczalnika (metanol, heksan, aceton, acetonitryl, 

dichlorometan, woda trójkrotnie destylowana, woda zakwaszona do pH 2). Ekstrakty mięsa umieszczano na 

płuczce ultradźwiękowej, sączono i odwirowano (3 min; 18000 obr./min). Tak przygotowany materiał do 

badań przechowywano szczelnie w foli aluminiowej w lodówce w temp. +5 o C. 

Oznaczania CPA w odniesieniu do rodnika DPPH 

(Determination of CPA related to the DPPH radical) 

W pracy stosowano 1 mM metanolowy roztwór DPPH. Na wstępie badań opracowano metodę 

rozdzielania formy zredukowanej od utlenionej rodnika DPPH na płytkach zarówno w układzie faz prostych 

jak i odwróconych. Zbadano wpływ warunków chromatograficznych na rozdzielanie: komora wysycona i 

niewysycona, fazy NP i RP -18W, wpływ temperatury, skład fazy ruchomej oraz technika wielokrotnego 

rozwijania. Opracowaną metodę [9] zastosowano do oznaczania CPA mięsa. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

CPA DPPH• [GAE] 

89 

Oznaczanie całkowitego stężenia polifenoli 

(Determination of the total polyphenols contentration) 

W mięsach oznaczono całkowitą zawartość polifenoli wykorzystując metodę fotometryczną Folina – 

Ciocalteua (FC). Polifenole reagując z FCR wytwarzają niebiesko zabarwiony roztwór (λ = 765 nm). Barwa 

ta powstaje w wyniku redukcji dwóch kwasów, fosfomolibdenowego oraz fosfowolframowego [8]. 

Do kolby o objętości 5 ml odpipetowano 0,5 ml ekstraktu wodnego mięsa i dodano 0,5 ml odczynnika 

Folina – Ciocalteua, odczekano 5 min., a następnie dodano 2 ml 20% Na 2 CO 3 i uzupełniono wodą kolbę do 

kreski. Na 30 min. mieszaninę odstawiono w ciemne miejsce. Pomiar wykonano w stosunku do ślepej próby 

przy 765 nm. Wykonano krzywą wzorcową kwasu galusowego (stężenie od 0 do 0,1 mg/ml). Wynik 

oznaczenia podano jako ekwiwalent kwasu galusowego w przeliczeniu na 1 g produktu. 

Pomiar CPA mięsa 

(Measurement of TAP of the meat) 

Właściwości antyoksydacyjne mięsa oznaczano mierząc intensywność plamki fioletowej (formy 

utlenionej DPPH • ). Po reakcji redukcji rodnik zmienia zabarwienie na jasno-żółte (DPPH-H). Oznaczanie 

rodnika przeprowadzono za pomocą TLC. Reakcje pomiędzy rodnikiem, a próbką mięsa przeprowadzano na 

płytkach NP i RP-18W w temperaturze +20 o C, w komorze wysyconej, w której fazą ruchomą był 

heksan/aceton (1:0,254 v/v). Jako próbę kontrolną zastosowano mieszaninę roztworu DPPH w metanolu [9]. 

Do próbki mięsa o objętości 200 µl dodano 100 µl 1 mM metanolowego roztworu DPPH. Pomiar 

chromatograficzny wykonano po 5 minutach. Po tym czasie zaobserwowano zmianę barwy roztworu. 

Badaną próbkę mięsa z DPPH • (5 μl) nanoszono na płytkę. Na rozwiniętej płytce zaobserwowano plamki 

pochodzące zarówno od formy utlenionej (fioletowa) jak i zredukowanej (żółta) rodnika DPPH oraz plamki 

pochodzące od antyoksydantów niereagujących z tym rodnikiem. Całkowitą zawartość antyoksydantów 

(CPA) w badanej próbce mięsa odczytano z krzywej wzorcowej wykonanej dla kwasu galusowego 

(w zakresie stężeń 0 ÷ 0,02 mg/ml). Wynik oznaczenia podano jako ekwiwalent tego kwasu w przeliczeniu 

na 1 g produktu. 


(Results and Discussion) 

Dobór warunków pomiarowych 

(Measurement conditions) 

Wartości CPA różnych mięs uzyskane na płytkach NP i RP -18W porównano na Rys. 1. Wynika z 

niego, że w obu przypadkach otrzymano, w granicach niepewności pomiarowych, te same wyniki. Do 

dalszych badań wybrano płytki RP ze względu na lepsze rozdzielenie obu form DPPH. 

80 

60 

40 

20 

0 

cielęcina 

schab 

filet z 

kurczaka 

wołowina 

szponder 

łopatka 

wieprzowa 

filet z 

indyka 

łosoś 

wędzony 

N P 

RP 

Rys. 1. 

Fig. 1. 

CPA [GAE] mięs po 5 minutach ekstrakcji dichlorometanem. Warunki chromatograficzne: 

temperatura - 20 o C, faza ruchoma - heksan/aceton (80:20% v/v), ilość naniesionej próbki - 5 l. 

TAP [GAE] of meat after 5 min. extraction with dichloromethane. Chromatographic conditions: 

temperature - 20 o C, mobile phase - hexane/acetone (80:20% v/v), injection volume - 5 l. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria



90 

Właściwości antyoksydacyjne ekstraktów mięsnych 

(The antioxidant properties of the meat extracts) 

Stężenie antyoksydantów (stąd CPA DPPH• ) zależy od czasu ekstrakcji (Rys. 2). Z jednej strony jego 

wydłużenie zwiększa współczynnik ekstrakcji, z drugiej zaś zwiększa prawdopodobieństwo utlenienia próbki. 

Dla różnych gatunków mięs uzyskano podobną zależność CPA od czasu ekstrakcji (Rys. 2) i od 

zastosowanego rozpuszczalnika (Rys. 3). Maksymalne wartości CPA uzyskano dla ok. 5 min. ekstrakcji. 

Powyżej 10 min. wartości CPA asymptotycznie dążą do stałej wartości. Największym CPA charakteryzuje się 

mięso wołowe (ok. 21 μg GA/1 g mięsa). Najsłabszymi właściwościami antyoksydacyjnymi charak teryzował 

się metanolowy ekstrakt łopatki wieprzowej (ok. 8,9 μg GA/1 g mięsa). Większe wartości CPA otrzymano dla 

rozpuszczalników bardziej polarnych. 

40 

30 

SZPONDER WOŁOWY 

FILET z KURCZAKA 

ŁOPATKA WIEPRZOWA 

20 

10 

0 

0 5 10 15 20 25 

Czas ekstrakcji [min] 

Rys. 2. 

Fig. 2. 

Wpływ czasu ekstrakcji metanolem na płuczce ultradźwiękowej) na CPA DPPH [GAE]. 

The influence of extraction time (using methanol and ultrasonic bath) on TAP DPPH [GAE]. 

20 

ACETON METANOL HEKSAN 

10 

0 

0 5 10 15 20 25 

Czas ekstrakcji [min] 

Rys. 3. 

Fig. 3. 

Wpływ czasu ekstrakcji na CPA DPPH [GAE] filetu z kurczaka. 

The influence of time extraction on TAP DPPH [GAE]. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

91 

Wizualizacja za pomocą rodnika DPPH 

(Visualisation using the DPPH radical) 

Wizualizację płytek przeprowadzono w układzie faz odwróconych. Fazą ruchomą była mieszanina 

dwuskładnikowa: metanol/woda o stosunku objętościowym (95:5, v/v). Zastosowana faza ruchoma wymywa 

takie związki jak, witaminy E (α, β, γ – tokoferole) oraz witaminę D [10]. Na płytkach RP-18W uzyskano 

najlepsze rozdzielanie tych właśnie związków. Na podstawie obecności i intensywności żółtych plamek 

można stwierdzić występowanie w badanych ekstraktach związków o właściwośc iach przeciwutleniających. 

Rodnik DPPH reaguje z antyoksydantami co powoduje odbarwienie fioletowego tła (Rys. 4). 

W metanolowych ekstraktach znajdują się zarówno polarne antyoksydanty (R f = 0,75 i 0,86 dla wołowiny 

i łososia), średnio polarne (mięso drobiowe - filet z kurczaka i indyka R f = 0,25), jak i niepolarne 

(R f = 0). Wołowina i łosoś wędzony charakteryzują się zbliżoną ilością i intensywnością plamek żółtych 

(Rys. 4) oraz wartością CPA DPPH• . Z otrzymanych wyników można wywnioskować, że każda próbka zawiera 

bardzo podobne antyoksydanty, średnio polarne. 

Rys. 4. TLC chromatogram uzyskany w wyniku wizualizacji metanolowym roztworem DPPH dla próbek 

mięsnych ekstrahowanych metanolem. Warunki chromatograficzne: płytka RP-18W, faza ruchoma - 

metanol/woda (95:0,5, v/v), wizualizacja - 1 mM DPPH. (1 – schab wieprzowy; 2 – filet z indyka; 4 – 

szponder wołowy; 5- łosoś wędzony; 6 – filet z kurczaka; 8 – łopatka wieprzowa; 9 – cielęcina 

wieprzowa i 10 - karkówka wieprzowa) 

Fig. 4. TLC chromatogram obtained by visualization using methanolic solution of DPPH for meat samples 

extracted in methanol. Chromatographic conditions: plate - RP-18W, mobile phase - methanol/water 

(95:0,5, v/v), visualization - 1 mM DPPH. (1 - pork loin, 2 - turkey fillet, 4 - beef brisket, 5 - smoked 

salmon; 6 - chicken fillet; 8 - pork shoulder; 9 - veal and 10 - pork neck). 

Wpływ rozpuszczalnika ekstrakcyjnego CPA próbek 

(The influence of solvents on TAP values) 

Za właściwości antyoksydacyjne próbek mięsnych odpowiedzialne s ą różne związki, które 

rozpuszczalne są w różnych rozpuszczalnikach. Dlatego niemożliwe jest uzyskanie informacji o pełnej 

aktywności antyoksydacyjnej próbki po ekstrakcji tylko jednym rozpuszczalnikiem [11]. Na Rys. 5 

przedstawiono całkowite stężenie poli fenoli w różnych gatunkach mięsa. Najniższa zawartość polifenoli 

występuje w karkówce wieprzowej (ok.6 GAE), a najwyższa zaś w wołowinie (szponder) – 9,38 GAE i filecie 

z kurczaka – 9,27 GAE. Oznacza to, że redukcja rodnika DPPH najprawdopodobniej spowodowana jest 

przez polifenole. Długotrwałe przechowywanie mięsa może wywołać chemiczne utlenienie polifenoli, a tak że 

niekontrolowane procesy enzymatyczne. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria


Zawartość polifenoli 

[mg GA / g mięsa] 

zawatość polifenoli 

[mg GAE/ g mięsa] 

92 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

łopatka 

wiep. 

łosoś w. cielęcina indyk kurczak wołowina 

Rys. 5. Zawartość polifenoli w mięsach. Warunki pomiarowe: pomiar fotometryczny 765 nm, stężenie mięsa 

- 0,05 g/ml. Wyniki przedstawiają średnią z 3 pomiarów. 

Fig. 5. The concentration of polyphenols in meats. Measuring conditions: photometric measurements at 765 

nm, concentration of the meat - 0.05 g/ml. The results represent the average of 3 measurements. 

CPA DPPH• różnych gatunków mięsa ekstrahowanych przez różne rozpuszczalniki przedstawiono na 

Rys. 6. Okazało się, że najsilniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi charakteryzuje się mięso łososia 

wędzonego po ekstrakcji heksanem. Z drugiej strony najniższe CPA otrzymano dla cielęciny ekstrahowanej 

acetonem. Łosoś wędzony bez względu na użyty do ekstrakcji rozpuszczalnik zawsze (w granicach 

niepewności pomiarowej) charakteryzuje się bardzo silnymi właściwościami antyoksydacyjnymi. 

Prawdopodobnie spowodowane jest to tym, że łosoś wędzony zawiera dym wędzarniczy, który ma działanie 

konserwujące i antybakteryjne. Substancjami czynnymi dymu są związki (pochodne gwajakolu i syringolu), 

które wykazują silne właściwości antyoksydacyjne [15]. W tym miejscu warto zauważyć, że CPA mięsa 

zależy od jego obróbki. Między innymi powstają tzw. MRPs (ang.: Maillard Reaction Products), czyli produkty 

reakcji Maillarda, tzn. reakcji między aminokwasami a cukrami. Obróbka może zwiększać aktywność 

antyoksydacyjną niektórych białek z powodu zmian jakie zachodzą w ich II i III rzędowej strukturze. Obróbka 

mięsa, zarówno do spożycia jak i do analizy może przyczynić się do utleniania antyoksydantów. W 

konsekwencji może dojść do degradacji endogennych antyoksydantów takich jak witamina C, E, polifenoli, 

tioli czy karotenoidów [12-14]. Zawartość antyoksydantów w różnych gatunkach mięs zależy od 

zastosowanego do ekstrakcji rozpuszczalnika. Najwięcej antyoksydantów zawiera mięso z łososia. 

70 

60 

50 

40 

MeOH 

Woda 

Woda-HCl 

Heksan 

Aceton 

30 

20 

10 

0 

cielęcina 

filet z 

indyka 

karkówka łopatka filet z 

kurczaka 

wołowina 

łosoś 

wędzony 

Rys. 6. CPA DPPH• [GAE] różnych gatunków. Warunki ekstrakcji i chromatograficzne jak na Rys. 5. 

Rys. 6. TAP DPPH• [GAE] of different types of meat. Extraction and chromatographic conditions as on Fig. 5. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

93 

4. Literatura 

(Literature) 

[1] G.H. Zhou, X.L. Xu, Y. Liu, Preservation technologies for fresh meat – A review, Meat Science, 86, 

119-128, 2010. 

[2] W. Migdał, D. Wojtysiak, K. Palka, M. Natonek-Wiśniewska, I. Duda, A. Nawocień, Skład chemiczny 

i parametry tekstury wybranych mięśni tuczników rasy polskiej białej zwisłouchej ubijanych w różnym 

wieku, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (55), 277-284, 2007. 

[3] T. Kołczak, Jakość wołowiny, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 1 (56), 5-22, 2008. 

[4] B.K. Głód, P. Piszcz, I. Kiersztyn, A. Lamert, P. Zarzycki, Zastosowanie HPLC do oznaczania wolnych 

rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego, Postępy Chromatografii 

(Camera Separatotria), 1, 41-66, 2009. 

[5] H. Puzanowska-Tarasiewicz, L. Kuźmicka, M. Tarasiewicz, Antyoksydanty a reaktywne formy tlenu, 

Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 43 (1), 9-14, 2010. 

[6] A.R. Ndhlala, M. Moyo, J.V. Staden, Natural antioxidants: Fascinating or mythical biomolecules? 

Molecules, 15, 6905-6930, 2010. 

[7] B. Gryszczyńska, M. Iskra, Współdziałanie antyoksydantów egzogennych i endogennych 

w organizmie człowieka, Nowiny Lekarskie, 77 (1), 50-55, 2008. 

[8] B.K. Głód, P.M. Wantusiak, P. Piszcz, E. Lewczuk, P.K. Zarzycki, Application of micro-TLC to the total 

antioxidant potential (TAP) measurement, Food Chemistry, 173, 749-754, 2015. 

[9] P. Piszcz, M. Tomaszewska, B.K. Głód, O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej 

do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Cześć I. Dobór warunków 

chromatograficznych, Camera Separatoria, 7 (1), 41-51, 2015. 

[10] M.M. Srivastava (Ed.), High Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC), Springer-Verlag 

Berlin Heidelberg 2011. 

[11] D. Plust, Praca doktorska, Pojemność przeciwutleniająca wybranych surowców pochodzenia 

zwierzęcego, Akademia Rolnicza, Szczecin 2007. 

[12] A. Serpen, V. Gökmen, V. Fogliano, Total antioxidant capacities of raw and cooked meat, Meat 

Science 90, 60-65, 2012. 

[13] M. Hęś, J. Korczak, Wpływ produktów utleniania lipidów na wartość odżywczą białka, Nauka Przyroda 

Technologie, 1 (1), 1-15, 2007. 

[14] A. Michalska, H. Zieliński, Produkty reakcji Maillarda w żywności, Żywność. Nauka. Technologia. 

Jakość, 2 (51), 5-16, 2007. 

[15] A. Lebiedzińska, Łososie wędzone cennym źródłem składników odżywczych, Magazyn Przemysłu 

Rybnego, 2 (50), 33-36, 2006. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

94 


INSTRUKCJE DLA AUTORÓW 

W Camera Separatoria wydawane są artykuły oryginalne (nie publikowane wcześniej) oraz 

przeglądowe poświęcone różnym działom nauki, techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane 

będą listy do redakcji, informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek, reklamy, materiały 

firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o konferencjach. 

Artykuł do CamSep przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003 lub nowszy m (w formacie .doc 

lub .docx) zgodnie z przedstawionym poniżej opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres 

e-mail: camera.separatoria@gmail.com. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu. 

* * * 

Jan KOWALSKI, Anna KOWALSKA* (Arial 12 pkt., bold) 

1 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii, 

Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce, 

* Autor do korespondencji, e-mail: camera.separatoria@gmail.com 

2 Uniwersytet … (Afiliacja – Arial 9 pkt., normal bez boldu) 

Tytuł artykułu w języku polskim – 12 pkt. Arial bold 

Streszczenie: (Arial 9 pkt. normal bold). Treść streszczenia – Arial 9 pkt. kursywa bez boldu. Streszczenie 

polskojęzyczne powinno zawierać około 500 – 700 znaków (ze spacjami). Należy w nim krótko wskazać czego dotyczy 

artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. 

Słowa kluczowe: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą 

Tytuł artykułu w języku angielskim – 12 pkt. Arial bold – kursywa 

Abstract: (Arial 9 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne – Arial 9 pkt. kursywa bez boldu, powinno być 

rozszerzone, o objętości około 1000 – 1200 znaków (ze spacjami). Powinno zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł, 

co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. 

Key words: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą 

Podtytuły ponumerowane – Arial 12 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna, 

Wyniki i dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) – wersja polska - 

normal i (angielska - kursywą), 

Śródtytuły ponumerowane – Arial 11 pkt., bold, wersja polska i angielska - kursywą 

Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany – Arial 10 pkt., odstępy między 

wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden sposób podziałów wierszy. Wszystkie marginesy 2 cm. 

Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane przenoszone z tekstem. Wzory 

napisane w edytorze równań należy traktować jako element zdania np.: 

Vol. 7, No 1/2015 

V 

t 

F 

R R 

(1) 

Camera Separatoria

95 

gdzie: 

V R – objętość retencji, 

t R – czas retencji [min.], 

F – przepływ gazu nośnego [cm 3 /s]. 

Symbole użyte we wzorach powinny mieć rozmiar zgodny z rozmiarem czcionki tekstu rozdziału. 

Wzory należy numerować kolejno w całym tekście artykułu. Numery wzorów powinny być wyrównane do 

prawej. Oznaczenia stosowane na rysunkach i w tabelach muszą by ć czytelne i zgodne z oznaczeniami 

używanymi we wzorach i w tekście artykułu. Nazwy związków chemicznych stosować zgodnie z 

nomenklaturą IUPAC, jednostki z układu SI. 

W odpowiednie miejsca w tekście należy wstawić rysunki i tabele wraz z tytułami. Powinny one 

znajdować się w miejscach, w których po raz pierwszy są do nich odwołania w tekście artykułu. Rysunki i 

zdjęcia zamieszczone w artykule muszą być czytelne i kontrastowe oraz zapisane jako czarno -białe lub w 

skali odcieni szarości (w wersji elektronicznej mogą być w kolorze). 

Rysunki i tabele należy numerować kolejno w całym tekście artykułu (Rys. i Tab. nr arabskie). 

Tytuły rysunków i tabel należy podać w języku polskim i angielskim (kursywą) jak na przykładzie 

przedstawionym poniżej: 

Tabela 1. Całkowita emisja metali z obszaru Polski według rodzajów działalności. Arial 10 pkt. 

Table 1. Total emission of heavy metals in the area of Poland kinds of activities. Arial 10 pkt. 

Ogółem 

(Total) 

Elektrociepłow nie, elektrow nie, 

ciepłow nie 

(Heat and power plants, power 

stations) 

Cd Pb Cu Zn Ni 

tony 

66,1 555,0 390,9 2345,1 295,8 

1,9 19,9 12,8 59,2 72,2 

Tabele w pionie nie mogą przekraczać szerokości 12 cm, a w poziomie – 18 cm. Czcionka wewnątrz tabeli – 

Arial 8 lub 9 pkt. 

Rysunek, wykres, czy inna forma materiału ilustracyjnego nie może przekraczać w pionie – szerokości 

12 cm, wysokości 18 cm; w poziomie – szer. – 18 cm, wysokości – 9÷10 cm (na stronie musi zmieścić się 

jeszcze podpis do rysunku). Materiał ilustracyjny powinien być zapisany z rozszerzeniem JPG i przesłany 

dodatkowo w oddzielnych plikach podpisanych, jako Rys.1., Rys. 2. itd. 

Rys. 1. Tytuł rysunku w języku polskim, Arial 9 pkt. 

Fig. 1. Tytuł rysunku w języku angielskim, Arial 9 pkt. 

Literatura 

(w tekście numerujemy w kolejności cytowania [1], [2, 3], [4-8] itd., - Arial 10 pkt.): 

1. L.E. Green, J.C. Worman, Research of separation…, Analytical Chemistry 37 (1965) 1620. 

Oprócz danych bibliograficznych należy zamieścić tytuł, w tym także publikacji, materiału z internetu, opisu 

patentowego itp. Tytuł w j. polskim, lub innym, niż język polskim jest pisany zwykłym drukiem w cudzysłowie, 

tytuł w języku angielskim – kursywą. 

2. T. Paryjczak, „Chromatografia gazowa…”, tłumaczenie tytułu na j. angielski kursywą, PWN, Warszawa 

1986. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

96 

(w przypadku, gdy tytuł pracy jest w innym języku, niż po angielsku, należy tytuł oryginalny napisać w języku 

oryginału, a następnie jego tłumaczenie na język angielski - kursywą) 

Wszystkie materiały: 

artykuł (w formacie .doc, .docx, lub .rtf), 

dodatkowo zdjęcia i rysunki (w formacie JPG), 

prosimy przesyłać w formie plików, w jednej wiadomości na adres e-mail: camera.separatoria@gmail.com 

* * * 

Przesłany artykuł do CamSep podlega wstępnej ocenie przez Edytora, następnie przekazywany jest 

dwóm recenzentom do oceny. Recenzenci pozostają anonimowi. 

O przyjęciu artykułu do druku decyduje redakcja, w oparciu o przygotowaną recenzję. Jeśli w jej 

wyniku zachodzi konieczność poprawienia artykułu przez autora, to powinno to nastąpić w okresie nie 

dłuższym niż trzy tygodnie. Po tym terminie uważa się, że autor rezygnuje z publikacji lub gdy artykuł 

zostanie przesłany do redakcji podlegać on będzie ponownej ocenie. 

Po opublikowaniu autorzy bezpłatnie otrzymują elektroniczna wersję artykułu i właściwy nr CamSep 

jako egzemplarz autorski. 

Ogłoszenia/reklamy mogą być publikowane za odpowiednią, wcześniej ustaloną, opłatą. 

Przepisy etyczne 

Ważne jest, aby uzgodnić standardy etycznych zachowań dla wszystkich zaangażowanych w 

działania publikacji: autora, redaktora czasopisma, recenzenta, wydawcy i społeczeństwa czasopism. 

Redaktorzy i recenzent są zobowiązani do zapewnienia, że reklama, przedruk lub inny przychód komercyjny, 

nie ma wpływu na decyzje redakcyjne. Nie mogą oni ujawniać żadnych informacji na temat przedstawionego 

rękopisu do kogokolwiek innego niż autora artykułu. Niepublikowane materiały, ujawnione w przedstawionej 

pracy, nie mogą być używane przez redaktorów/recenzentów, jako część własnych badań bez pisemnej 

zgody autora. Powielanie lub adaptacja opublikowany wcześniej tabel, rycin, ilustracji lub obszernych 

cytatów z innych źródeł, akceptowana jest tylko za posiadaniem odpowiedniej pisemnej zgody autora. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

97 

Zapory ghostwriting i guest-autorship 

Zgodnie z wytycznymi MNiSzW (https://pbn.nauka.gov.pl/static/doc/wyjasnienie_dotyczace_ghostwriting.pdf 

[dostęp 19.01. 2012 r.]). oraz dbając o rzetelność naukową publikacji Redakcja Camera Separatoria wdraża 

procedury wykluczające nieetyczne działania przy publikowaniu wyników badań. Warunkiem publikacji 

artykułu jest ich zachowanie przez Autorów. Przejawy braku rzetelności i działań nieetycznych będą 

dokumentowane przez redakcję. Po zakwalifikowaniu publikacji do druku Autor korespondujący 

zobowiązany jest do przesłania oświadczenia, że wszyscy współautorzy brali czynny udział w jej 

przygotowaniu i są współposiadaczami praw autorskich. Aby autorstwo było uzasadnione musi opierać się 

na istotnym wkładzie do (i) opracowania idei (koncepcji) pracy, (ii) wykonania eksperymentu, (iii) analizy i/lub 

interpretacji danych, (iv) opracowaniu artykułu i jego krytycznej oceny. Nie zalicza się do tego udziału 

działania polegającego jedynie na zbieraniu funduszy lub zbieraniu danych oraz nadzorowanie pracy. W 

oświadczeniu musi się także znajdować zapis o niepominięciu w składzie zespołu autorskiego nikogo, kto 

wniósł istotny wkład badawczy w powstanie pracy. Redakcja może dodatkowo zwrócić się Autorów o 

wskazanie tego z nich, który ma największy udział w publikacji i procentowego udziału pozostałych autorów, 

a także podania który z autorów jest twórcą koncepcji badawczej, metodyki badań, analizy wyników itd. 

.………………….… 

miejscowość, data 

………………..………………. 

imię i nazwisko (nr dow. os.) 

…………………………………………………..…….. 

afiliacja 

…………………………………………………..…….. 

adres do korespondencji, e-mail, nr telefonu 

Oświadczam, że zostałem poinformowany o zasadach związanych z zaporą ghostwriting i guest-authorship. 

W związku z tym wraz z manuskryptem publikacji poniżej załączam informacje o podmiotach 

przyczyniających się do jej powstania (wkład merytoryczny, rzeczowy, finansowy etc.), z podaniem ich 

afiliacji oraz udziału, tj. informacji kto jest autorem koncepcji, wykonawstwa eksperymentu, obliczeń i/lub 

wyprowadzenia wzorów, protokołu itp. oraz dane o źródłach finansowania publikacji (financialdisclosure). 

Jako osoba zgłaszająca manuskrypt do druku ponoszę odpowiedzialność za podanie danych zgodnych z 

prawdą. Zgłoszenie artykułu jest jednoznaczne z przekazaniem Redakcji praw do opublikowania artykułu w 

wersji papierowej i elektronicznej. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

98 

Instructions for Authors and Editorial Policy 

Camera Separatoria is a scholarly and peer-reviewed journal (print and online) published 2 times per 

year which was founded in 2009. It is a continuation of the journal Postępy Chromatografii (Progress in 

Chromatography) devoted to the science, technique and technology of separation. It provides a medium for 

the publication of theoretical and experimental studies and reviews related to separation science: 

chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, exctraction, electroseparation et c. 

Camera Separatoria publishes original (not published previously and are not currently under 

consideration by another journal except in the form of an abstract or as part of a published lecture, review, or 

thesis) and review papers from all branches of separation science, technique and technology. Additionally 

letters to the editor; expert opinions; information on instrumentation, book reviews and information about 

conferences as well as advertisements are also published. The journal welcomes contributio ns which 

promote the exchange of ideas and rational discourse between practicing educators and material 

researchers all over the world. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e -mail. No 

limitation of the articles lengths are provided. The manuscript should be original, has not been published 

previously and should not be currently being considered by another journal. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e -mail. No 

limitation of the articles lengths are provided. 

Manuscript should be prepared using MS-Word editor in the .doc/.docx format. It should be typed in 

single-spaced lines using Arial 10p. font with the overall page numbering (at the center of bottom margins). 

Tables (Arabic numeration, title in Polish and English, Arial 10p.), figures and figure captions (Arabic 

numeration, in Polish and English, Arial 9p.) and references can be placed directly to the text. The main 

heading appears in the following order: 

- list of Authors by first, middle names, surname (capital letters); the Corresponding Author’s name should be 

accompanied by an asterisk (*); if Authors are from more than one affiliation, use superscript numbers to 

link the Authors’ names and their affiliations, 

- list of affiliations and complete mailing addresses of the authors (including zip code, city, street, and 

number; for universities, the faculty or department should be given), 

- the title (should not exceed 20 words) of the article in Polish as well as English, (in all capital letters, Arial 

12p.), 

- if there is more than one affiliation, use asterisks to indicate the institute with which each author is affiliated, 

as it is presented below: 

Jan K. KOWALSKI, Karol ROBERT* 

Department of Separation Science, Institute of Chemistry 

ul. 1 Maja 3, 00-000 Warszawa 

*e-mail: camera.separatoria@gmail.com 

I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne 

1 st Podlasie’s Chromatographic Meeting 

Body text… 

In the subsequent text, the following parts are is desirable: abstract (in Polish and English, Arial 9p.), 

keywords (about five, in Polish and English, Arial 9p.), introduction (review of literature and formulation the 

aim of the paper), experimental (reagents, apparatus, protocols, data analysis), results and discussion, 

conclusions, acknowledgments and literature. The SI units and nomenclature recommended by IUPAC 

should be used. References should be typed in the forms: 

1. J.K. Kowalski, K. Robert, Research of separation…, Analytical Chemistry 44 (2000) 666. 

2. A. Adzik, in Fundamentals of Separation Science, K. Karol, ed., PTNoR, Reymontówka 2000. 

3. Polish standard PN – EN ISO 17993, text… 

4. S. Separator, Proceedings of 2 nd Podlachia’s Chromatographic Meeting, Kotuń-Chlewiska, Sep. 12-18, 

1987. 

in a list at the end of article and numbered in the order of appearance. Citation in the text should be denoted 

by number in square brackets. 

One of the Editor first evaluates the manuscript. Exceptionally it can be acc epted at this stage. Those 

rejected at this stage are passed on to 2 experts for review. Acceptance for publication is subject to positive 

recommendation from the referees. The referees remains anonymous throughout the process. Reviewers 

are not supposed to contact the authors or to otherwise make their identity known. The referees are asked to 

evaluate the manuscript according to the below rules within 3 weeks. Authors have three months to correct 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

99 

the article after the reviewing process. After this time, the returned article is considered as newly received. 

The authors receive the electronic version of their paper and the proper volume of Camera Separatoria free 

of charge. 

Advertisements may be published according to the prescribed rates. 

* * * 

Ethical guidelines 

It is crucial to agree upon standards of expected ethical behavior for all involved in the act of 

publishing: author, editor, reviewer, publisher and society. Editors and reviewer are committed to ensuring 

that advertising, reprint or other commercial revenue has no impact or influence on editorial decisions. They 

must not disclose any information about a submitted manuscript to anyone other than the corresponding 

author. The unpublished materials disclosed in a submitted manuscript must not be used in an 

editor's/referee’s own research without the express written consent of the author. The reproduction or 

adaptation of previously published tables, figures, illustrations, or extensive quotations from other sources 

must obtain appropriate written permission. 

Vol. 7, No 1/2015 

Camera Separatoria

CamSep 7 1

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?