CamSep 6 2

Siedlce University of Natural Sciences and Humanities 

Polish Separation Science Society 

Camera Separatoria 

Volume 6, Number 2 / December 2014 

Siedlce 2014

Honorary Editor: 

Edward Soczewiński (Lublin) 

Editors-in-Chief: 

Bronisław K. Głód 

(Siedlce) 

Marian A. Kamiński (Gdańsk) 

Editors: 

Tadeusz Dzido (Lublin) 


(Siedlce) 

Marian Kamiński (Gdańsk) 

Piotr M. Słomkiewicz (Kielce) 

Piotr Stepnowski (Gdańsk) 

Andrzej Stołyhwo (Warszawa) 

Monika E. Waksmundzka-Hajnos (Lublin) 

Mieczysław Sajewicz 

(Katowice) 

Language Editor: 

John Podgórski (Manchester) 

Technical Editors: 

Paweł Piszcz 

Reviewers: 

Monika Asztemborska 


Marian Kamiński 

Iwona Kiersztyn 

Paweł Piszcz 

Piotr M. Słomkiewicz 

Monika E. Waksmundzka-Hajnos 

Editorial office’s address: 

Department of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach 

Siedlce University of Natural Sciences and Humanities 

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce 

tel. : (25) 6431041 

e-mail: camera.separatoria@gmail.com 

URL: http://dach.ich.uph.edu.pl/camera_separatoria.html 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

SPIS TREŚCI 

(CONTENTS) 

Prace oryginalne / Original papers 

Grzegorz BOCZKAJ, Malwina MOMOTKO 

Zastosowanie chromatografii gazowej w analityce technicznej do charakterystyki ksylenu 

technicznego na potrzeby rejestracji w systemie REACH………………..……………………………55 

Patrycja MAKOŚ, Grzegorz BOCZKAJ 

Chemometryczne podejście do optymalizacji dyspersyjnej mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz 

(DLLME), jako metody przygotowania próbek do rozdzielania i oznaczania krezoli w ściekach 

rafineryjnych………………………………………………………………………………………………... 65 

Prace przeglądowe / Review papers 

Patrycja MAKOŚ, Grzegorz BOCZKAJ 

Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania lotnych związków 

azoto – organicznych (LZN) w próbkach wody i ścieków. …………………………………………….73 

Grzegorz BOCZKAJ, Anna FOKT, Malwina MOMOTKO, Marian KAMIŃSKI 

Zastosowania chromatografii wykluczania (SEC) w analityce technicznej i preparatyce 

– część I-sza……………………………….………………………...……………………………………..87 

Instrukcje dla autorów…………………………………………………………………………………….106 

Instructions for Authors and Editorial Policy……………………………………………………………110 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


PRACE ORYGINALNE 

(ORIGINAL PAPERS) 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

CAMERA SEPARATORIA 

Volume 6, Number 2 / December 2014, pp. 55-64 

Grzegorz BOCZKAJ * , Malwina MOMOTKO 

Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, 

*Autor do korespondencji: e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 

Zastosowanie chromatografii gazowej w analityce technicznej do charakterystyki 

ksylenu technicznego na potrzeby rejestracji w systemie REACH 

Streszczenie: W pracy przedstawiono metodykę badań ksylenu technicznego w celu jego charakterystyki zgodnie z 

wymaganiami rejestracyjnych systemu REACH. W badaniach zastosowano technikę chromatografii gazowej z 

detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC-FID) oraz w sprzężeniu ze spektrometrią mas (GC-MS) Chromatografia 

gazowa umożliwia wykonanie dwóch fundamentalnych oznaczeń tego typu mieszaniny – tzn. zbadania czystości 

mieszaniny oraz identyfikacji i oznaczenia głównych składników mieszaniny -poszczególnych izomerów ksylenu. 

Słowa kluczowe: Chromatografia gazowa, GC-FID, GC-MS, ksyleny, węglowodory aromatyczne, REACH, 

Usefulness of gas chromatography in technical analytics for characterization of 

technical grade mixed Xylene fraction for REACH registration 

Abstract: The paper presents a method for characterization of technical grade mixed xylene by means of gas 

chromatography with flame ionization detector (GC-FID) and coupled with mass spectrometry (GC-MS) in terms of 

REACH registration requirements. Gas chromatography allows to perform analysis of the two fundamental parameters of 

such type of mixture i.e. the purity analysis and identification as well as quantification of major components of the mixture 

– the isomers of xylene. 

Keywords: Gas chromatography, GC-FID, GC-MS, Xylenes, aromatic hydrocarbons, REACH. 

1. Wstęp 

(Introduction) 

REACH (ang. Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals) zostało wprowadzone na 

mocy rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady. Rozporządzenie dotyczy bezpiecznego stosowania 

chemikaliów, poprzez ich rejestrację i ocenę, oraz w niektórych przypadkach udzielanie zezwoleń, 

ograniczenia handlu oraz stosowania niektórych chemikaliów [1]. W praktyce system REACH wymaga 

dokonania rejestracji praktycznie każdej substancji chemicznej za wyjątkiem tych, których rejestracja jest 

regulowana innymi przepisami UE np. środki ochrony roślin, produkty biobójcze, produkty lecznicze, 

kosmetyki czy dodatki do żywności lub pasz. Z rejestracji wyłączone są substancje występujące naturalnie w 

przyrodzie, o ile nie są uznawane za niebezpieczne i nie zostały poddane modyfikacjom chemicznym. 

Obowiązki dotyczące rejestracji substancji zostały zdefiniowane dla producentów i importerów, a wymaganie 

przekazywania informacji dla dystrybutorów. Substancje można klasyfikować, jako dobrze zdefiniowane – 

gdy można zidentyfikować wszystkie składniki, obejmując skład w 100% lub jako substancje UVCB (ang.: 

Unknown or Variable composition, Complex reaction products or Biological materials) – których skład nie 

może być jednoznacznie określony. W przypadku substancji dobrze zdefiniowanych wyróżnia się substancje 

jedno-(główny składnik występuje w stężeniu co najmniej 80% m/m) i wieloskładnikowe (główny składnik 

występuje w stężeniu od 10 do 80% m/m). 

W niniejszej pracy przedstawiono elementy charakterystyki ksylenu technicznego (określanego jako 

mieszanina ksylenów) w zakresie czystości oraz zawartości poszczególnych izomerów wymagane w ramach 

zgłoszenia takiej substancji do systemu REACH. 

2. Część eksperymentalna 

(Experimental) 

2.1. Materiały 

(Materials) 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

Zastosowanie chromatografii gazowej w analityce technicznej do charakterystyki ksylenu… 

56 

W badaniach zastosowano ksylen techniczny (Mitsubitshi Co.). Substancje wzorcowe zakupiono w 

Sigma Aldrich. Wodór do analiz GC-MS oraz do detektora FID był dostarczany z wytwornicy wodoru. 

Powietrze i azot posiadało czystość 5,0 N i było doprowadzane z kompresora bezolejowego oraz ze 

zbiornika ciekłego azotu (LindeGas) po oczyszczeniu na sitach molekularnych i węglu aktywnym. 

2.2. Aparatura 

(Instruments) 

Do identyfikacji i oznaczania izomerów zastosowano Chromatograf gazowy HP 5890 (Hewlett- 

Packard, USA) sprzężony ze spektrometrem mas (HP 5972A), z kolumną kapilarną do chromatografii 

gazowej 60,0 m x 0,25 mm x 0,25 μm DB 5 ms (Agilent, USA), oprogramowanie Chemstation (Agilent, USA). 

W badaniach czystości wg ASTM D 2360 zastosowano Chromatograf gazowy AUTOSYSTEM (PERKIN 

ELMER, USA) z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) z kolumną kapilarną do chromatografii gazowej 

30,0 m x 0,25 mm x 0,25 μm IL-111 (Supelco, USA). 

Jako źródło wodoru do GC, w badaniach zastosowano wytwornicę wodoru (Packard, USA). 

2.3. Metody postępowania 

(Methods) 

Identyfikacja izomerów 

Do identyfikacji izomerów oraz głównych zanieczyszczeń zastosowano technikę GC-MS. Identyfikacji 

dokonywano na podstawie widm dla poszczególnych substancji rozdzielonych techniką GC-MS po 

porównaniu z biblioteką widm NIST. Identyfikację potwierdzono na podstawie wartości czasu retencji 

substancji wzorcowych. Próbkę dozowano w postaci pierwotnej (bez rozcieńczenia). Warunki analizy 

chromatograficznej podano poniżej: 

Objętościowe natężenie przepływu gazu nośnego (Wodór, 5,5 N): 1,1 ml/min wodór; Tryb Split 300:1; 

dozowana objętość: 0,4 μl; temp. dozownika 250°C; Program temperatury: 45°C (15 min.) – narost 10°C/min 

- 190°C (3 min.); temperatura linii transferowej GC-MS: 275°C; Typ jonizacji: EI (70eV); Tryb MS: SCAN w 

zakresie 35-300 m/z. 

Oznaczanie poszczególnych izomerów 

Badanie wykonano techniką kapilarnej chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometria mas (GC-MS) w 

trybie SCAN. Identyfikacji izomerów dokonano na podstawie wartości czasu retencji substancji wzorcowych. 

Zawartość izomerów oznaczono metodą wzorca wewnętrznego (n-butylobenzen) z uprzednim 

wyznaczeniem współczynników odpowiedzi każdego z izomerów względem wzorca wewnętrznego. Analizie 

chromatograficznej poddano próbkę badanego materiału po dodaniu do niej znanej masy wzorca 

wewnętrznego. Mieszaninę próbki z wzorcem wewnętrznym rozcieńczono w n-pentanie w stosunku 1:100. 

Warunki analizy chromatograficznej podano poniżej: 

Objętościowe natężenie przepływu gazu nośnego (Wodór, 5,5 N): 1,1 ml/min wodór; Tryb Split 150:1; 

dozowana objętość: 0,4 μl; temp. dozownika 250°C; Program temperatury: 45°C (15 min.) – narost 10°C/min 

- 190°C (3 min.); temperatura linii transferowej GC-MS: 275°C; Typ jonizacji: EI (70eV); Tryb MS: SCAN w 

zakresie 35-300 m/z. 

Oznaczanie czystości 

Badanie wykonano na podstawie metody opisanej w normie ASTM D 2360 – Zastosowanie techniki 

kapilarnej chromatografii gazowej z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC-FID). Czystość oznaczono 

na podstawie zawartości zanieczyszczeń oznaczonych metodą wzorca wewnętrznego (n-butylobenzen - 

NBB). Analizie chromatograficznej poddano próbkę badanego materiału po dodaniu do niej znanej masy 

wzorca wewnętrznego (NBB). Warunki analizy chromatograficznej podano poniżej: 

Objętościowe natężenie przepływu gazu nośnego (Azot, 5,0 N): 1,0 ml/min; Tryb Split 100:1, dozowana 

objętość: 0,4 μl; temp. dozownika 250°C; Program temperatury: 50°C (10 min.) – narost 10°C/min - 150°C (5 

min.), temperatura detektora FID: 250°C 

3. Wyniki i dyskusja 

(Results and discussion) 

3.1. Identyfikacja izomerów 

Na rysunkach 1-7 przedstawiono chromatogram GC-MS oraz widma poszczególnych składników 

próbki. Na podstawie widm dla poszczególnych substancji rozdzielonych techniką GC-MS po porównaniu z 

biblioteką widm NIST zidentyfikowano kolejno: etylobenzen, meta-ksylen, para-ksylen, orto-ksylen oraz n- 

nonan. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

57 G. Boczkaj, M. Momotko 

Na rys. 1. zamieszczono chromatogram GC-MS badanej próbki materiału, na rysunku 2 jego 

powiększenie, a na rysunkach 3-7 widma MS wybranych głównych składników próbki porównane z 

biblioteką widm z przypisaną identyfikacją. W tabeli 1 przedstawiono identyfikację poszczególnych pików 

chromatograficznych z procentowym prawdopodobieństwem ich identyfikacji. 

Tabela 1. Identyfikacja pików na podstawie widma MS dla chromatogramu GC-MS próbki ksylenu 

technicznego. 

Table 1. Identification of peaks on the basis of MS spectrum for GC-MS mixed xylene chromatogram. 

Rt [min] 

Nazwa 

Komentarz 

Name 

Comment 

P [%] 

15,260 ±0,005 Etylobenzen - 96 

16,185 ±0,005 m-Ksylen - 96 

16,278 ±0,005 p-Ksylen - 95 

16,352 ±0,005 Brak jednoznacznej identyfikacji Związek chemiczny o char. nasyconym - 

17,670 ±0,005 o-Ksylen - 95 

18,163 ±0,005 n-Nonan - 91 

19,222 ±0,005 Brak jednoznacznej identyfikacji Związek chemiczny o char. nasyconym - 

Rys. 1. Chromatogram GC-MS próbki. Identyfikacja jak podano w tab. 1 

Fig. 1. GC-MS chromatogram of the studied sample. Identification as described in table 1. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


58 

Rys. 2. Chromatogram GC-MS, w powiększeniu w zakresie wartości czasu retencji 14,80 – 19,40 min. 

Fig. 2. 

GC-MS chromatogram of the studied sample. Enlargement of the 14,80 – 19,40 min range. 

Rys. 3. Widmo MS piku zidentyfikowanego jako etylobenzen(góra) i widmo z bazy MS (dół). 

Fig. 3. 

MS spectrum of peak identified as ethylbenzene (up) and MS spectrum from the library (below). 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


Rys. 4. Widmo MS piku zidentyfikowanego jako m-ksylen. 

Fig. 4. 

MS spectrum of peak identified as m-xylene. 

Rys. 5. Widmo MS piku zidentyfikowanego jako p-ksylen. 

Fig. 5. 

MS spectrum of peak identified as p-xylene. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


60 

Rys. 6. Widmo MS piku zidentyfikowanego jako o-ksylen. 

Fig. 6. 

MS spectrum of peak identified as o-xylene 

Rys. 7. Widmo MS piku zidentyfikowanego jako n-nonan. 

Fig. 7. 

MS spectrum of peak identified as n-nonane. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


3.2. Oznaczanie poszczególnych izomerów 

Na rysunku 8 przedstawiono chromatogram GC-MS próbki ksylenu technicznego rozcieńczonego w 

stosunku 1:100 w n-pentanie. Rozdzielanie izomerów ksylenu techniką GC nastręcza pewnych problemów 

związanych z elucją meta- i para-ksylenu. Uzyskanie kompletnego rozdzielenia jest niezwykle trudne i 

wymaga rozcieńczenia mieszaniny do stężenia na poziomie pojedynczych ppm. W warunkach rozdzielania 

na kolumnach z fazą stacjonarną w postaci metylo i fenylo siloksanów izomery są eluowane w kolejności m- 

p- i o-. Odwrócenie kolejności elucji dwóch pierwszych izomerów ma miejsce w przypadku zastosowania 

kolumny z polarną fazą stacjonarną w postaci glikolu polietylenowego. W niniejszej pracy do oznaczeń 

zastosowano detektor MS zamiast standardowego FID, wykazując w toku badań bardzo podobne wartości 

współczynnika odpowiedzi poszczególnych izomerów. Wartości względnego współczynnika odpowiedzi 

obliczono względem n-butylo-benzenu jako wzorca wewnętrznego i wyniosły one: 1,12, 1,13 i 1,14 

odpowiednio dla izomerów meta-, para- i orto- a także etylobenzen: 1,10. Wykonanie oznaczeń w układzie 

GC-MS umożliwia wykonanie dwóch spośród wymaganych badań w jednym układzie tzn. – identyfikacja i 

oznaczenie izomerów. Na rysunku 9 przedstawiono powiększenie „newralgicznego” przedziału czasu elucji 

ukazującego uzyskane rozdzielenie izomerów meta- i para-. 

Rys. 8. Chromatogram GC-MS próbki ksylenu technicznego z wzorcem wewnętrznym (n-butylo-benzen, NBB) po 

rozcieńczeniu w n-pentanie w stosunku 1:100. Piki chromatograficzne do 6 minuty pochodzą od 

rozpuszczalnika. Piki w zakresie 16,825-19,122 min. to: 16,825 min. - etylobenzen, 17,436 min. - m-ksylen, 

17,521 min. - p-ksylen, 18,674 min. – o-ksylen, 19,222 min – brak jednoznacznej identyfikacji. Czas retencji 

wzorca wewnętrznego (NBB): 24,177 min. 

Fig. 8. 

GC-MS chromatogram of the xylene sample with adition of internal standard (n-butyl-benzene, NBB) after 

dilution in n-pentane at 1:100 ration v/v. Chromatographic peaks up to 6 min. are from the solvent. Peaks In the 

range of 16.825-19.122 min.: 16.825 min. - ethylbenzene, 17.436 min. - m-xylene, 17.521 min. - p-xylene, 

18.674 min. – o-xylene, 19.222 min – unidentified. Retention time of internal standard (NBB): 24.177 min. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


62 

Rys. 9. Chromatogram GC-MS z Rys. 8 w powiększeniu. 

Fig. 9. An enlargement of GC-MS chromatogram from fig. 8 

W wyniku przeprowadzonych badań oznaczono zawartość poszczególnych izomerów ksylenu na 

poziomie: m-ksylen = 39,10% (m/m), p-ksylen = 16,39% (m/m), o-ksylen = 27,83% (m/m). Dodatkowo 

oznaczono etylobenzen = 14,67% (m/m). 

3.3. Oznaczanie czystości 

Odwrotnie, jak ma to miejsce w przypadku oznaczania izomerów, warunki rozdzielania przy 

oznaczaniu czystości materiału są dobrane w sposób zapewniający wysoką rozdzielczość zanieczyszczeń 

od głównego składnika. W tym przypadku głównymi zanieczyszczeniami próbki mogą być n-alkany i 

cykloalkany, a także węglowodory aromatyczne frakcji „C9” (n-propylobenzen, izo-propylo-benzen i izomery 

trimetylobenzenu). Zastosowanie kolumn z fazą stacjonarną w postaci polisiloksanów nie zapewnia 

selektywności pozwalającej na „grupowe” rozdzielenie węglowodorów nasyconych od aromatycznych. 

Norma ASTM D 2360 [2] zaleca zastosowanie faz stacjonarnych w postaci glikolu polietylenowego (PEG) lub 

triscyjanoetoksypropanu (TCEP). W pierwszym przypadku eluowane są n-alkany do n-nonanu przed pikiem 

n-benzenu. Faza TCEP umożliwia „wycięcie” n-alkanów do n-C13 przed elucją benzenu. Ze względu na 

technologie produkcji frakcji ksylenowej, oddzielnej n-alkanów do n-C9 w zasadzie eliminuje ryzyko ko-elucji 

węglowodorów aromatycznych próbki z n-alkanami, ponieważ dłuższe węglowodory nasycone w tej frakcji 

praktycznie nie występują. W niniejszej pracy w badaniach zastosowano nowy rodzaj fazy stacjonarnej – 

ciecz jonową o handlowej nazwie IL-111, którą charakteryzuje się praktycznie identyczną selektywnością jak 

faza TCEP [3]. W warunkach badania n-alkany są eluowane w postaci niecałkowicie rozdzielonych pików 

chromatograficznych. Na chromatografie zidentyfikowano również benzen i toluen (Rys. 10-11). Norma 

wymaga również oznaczenia zawartości etylobenzenu, lecz jego zawartość jest dodawana do zawartości 

głównych składników. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


Rys. 10. Chromatogram GC-FID mieszaniny ksylenów. Przypisy pod pikami: ALKA – zanieczyszczenia próbki o 

charakterze nasyconym, B- benzen, T- toluen, E- etylobenzen, M-X i P-X – m-ksylen i p-ksylen, O-X – o-ksylen, 

NBB – n-butylo-benzen – wzorzec wewnętrzny. 

Fig. 10. GC-FID chromatogram of xylene mixture. Peak description: ALKA – saturated impurities of the sample, B- 

benzene, T- toluene, E- ethylbenzene, M-X i P-X – m-xylene i p-xylene, O-X – o-xylene, NBB – n-butylbenzene 

– internal standard. 

Rys. 11. Chromatogram GC-FID z rys. 10 w powiększeniu. 

Fig. 11. An enlargement of GC-FID chromatogram from fig. 10. 

Czystość badanego materiału jako mieszanina ksylenów (z uwzględnieniem etylobenzenu w głównych 

składnikach) wyniosła 97,99%. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


64 

4. Wnioski końcowe 

(Conclusions) 

Chromatografia gazowa od swoich początków stanowi istotne narzędzie w analityce technicznej 

produktów naftowych [4]. W chwili obecnej opracowane aplikacje pokrywają praktycznie cały zakres 

temperatury wrzenia frakcji naftowych [5-10]. W niniejszej pracy opisano metodyki oparte na chromatografii 

gazowej do charakterystyki frakcji ksylenowej na potrzeby rejestracji systemu REACH. W przypadku tego 

typu mieszaniny, uzupełniający charakter mają badania spektralne techniką UV-VIS oraz FT-IR w zakresie 

średniej podczerwieni oraz magnetycznego rezonansu jądrowego ( 1 H NMR). Skład grupowy badanego 

materiału można wykonać alternatywnie techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej w normalnym 

układzie faz (NP-HPLC) [11] albo techniką wielowymiarowej chromatografii gazowej (PIONA). Identyfikacja 

poszczególnych izomerów oraz głównych zanieczyszczeń techniką GC-MS oraz oznaczenie czystości 

techniką GC-FID charakteryzuje badaną mieszaninę w sposób jednoznaczny. 

5. Literatura 

(Literature) 

1. Rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. 

w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów 

(REACH), utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz 

uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak 

również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE 

i 2000/21/WE. 

2. ASTM D 2360: Standard test method for trace impurities in monocyclic aromatic hydrocarbons by gas 

chromatography. 

3. G. Boczkaj, P. Makoś, Separation of Volatile Oxygen-containing Organic Compounds by Gas 

Chromatography – selectivity comparison of different polarity stationary phases, Cam. Sep. 5 (2013) 

143. 

4. G. Boczkaj, M. Kamiński, Wykorzystanie chromatografii gazowej do destylacji symulowanej (SIMDIS). 

Aktualny stan wiedzy i nowe perspektywy, Postępy chromatografii i innych technik i technologii 

rozdzielania 2 (2010) 89. 

5. G. Boczkaj, M. Jaszczołt, M. Kamiński, Nowe metodyki oznaczania dodatków do paliw z 

zastosowaniem rozdzielania wielowymiarowego, Cam. Sep. 3 (2011) 115. 

6. G. Boczkaj, M. Jaszczołt, M. Kamiński, Badania emisji lotnych związków organicznych z asfaltów 

drogowych z wykorzystaniem techniki dynamicznej analizy fazy nadpowierzchniowej i chromatografii 

gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (DHS - GC - MS), Cam. Sep. 3 (2011) 35. 

7. G. Boczkaj, M. Kamiński, A. Przyjazny, Process control and investigation of oxidation kinetics of 

postoxidative effluents using gas chromatography with pulsed flame photometric detector (GC-PFPD), 

Ind. Eng. Chem. Res. 49 (2010) 12654. 

8. G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, New procedure for the determination of distillation temperature 

distribution of high-boiling petroleum products and fractions, Anal. Bioanal. Chem. 399 (2011) 3253. 

9. G. Boczkaj, M. Jaszczołt, A. Przyjazny, M. Kamiński, Application of normal phase high performance 

liquid chromatography followed by gas chromatography for analytics of diesel fuel additives, Anal. 

Bioanal. Chem. 405 (2013) 6095. 

10. G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, Characteristics of volatile organic compounds emission profiles 

from hot road bitumens, Chemosphere 104 (2014) 23. 

11. PN EN 12916: Przetwory naftowe - Oznaczanie grup węglowodorów aromatycznych w średnich 

destylatach - Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem współczynnika załamania 

światła. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria



Patrycja MAKOŚ, Grzegorz BOCZKAJ* 

Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, 

Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska, 

ul. Gabriela Narutowicza 11/12, 80-233 Gdańsk, 

*Autor do korespondencji, e-mail: grzegorz.boczkaj@gmail.com 

Chemometryczne podejście do optymalizacji dyspersyjnej mikroekstrakcji 

w układzie ciecz-ciecz (DLLME), jako metody przygotowania próbek do rozdzielania 

i oznaczania krezoli w ściekach rafineryjnych. 

Streszczenie: W pracy przedstawiono procedurę optymalizacji dyspersyjnej mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz 

(DLLME), z zastosowaniem frakcyjnych planów czynnikowych tj. planu Placketta-Burman’a oraz centralnego planu 

kompozycyjnego. Zdefiniowano parametry mające istotny wpływ na efektywność ekstrakcji krezoli i dla nich 

przeprowadzono procedurę optymalizacyjną, w wyniku której wyznaczono wartości optymalne parametrów w tym pH 6 

oraz objętość rozpuszczalnika dyspergującego wynoszącą 0,4 mL. 

Słowa kluczowe: dyspersyjna mikroekstrakcja w układzie ciecz-ciecz, frakcyjne plany czynnikowe, chromatografia 

gazowa, krezole, ścieki rafineryjne 

Chemometric approach to the optimization of dispersive liquid-liquid 

microextraction for the separation and determination of cresols in refinery 

wastewater. 

Abstract: This paper present the procedure to optimize dispersive liquid-liquid micro-extraction (DLLME), using 

fractional factorial plans i.e. Plackett-Burman design and central composite design. The parameters affecting the 

efficiency of extraction were determined and for them the optimum conditions were established, by which determined the 

optimum values of parameters including pH 6 and volume of disperser solvent equal 0,4 mL. 

Key words: dispersive liquid-liquid micro-extraction, fractional factorial plans, gas chromatography, cresols, refinery 

wastewater 

1. Wstęp 


Krezole klasyfikuje się jako substancje toksyczne i żrące, będące promotorami procesu 

nowotworowego. Wpływają również negatywnie na układ nerwowy, oddechowy, błony śluzowe i nerki. Do 

środowiska naturalnego przedostają się w wyniku działalności przemysłu koksowniczego, odlewniczego, 

chemicznego, a także rafineryjnego [1-2]. W wyniku procesów przetwórstwa ropy naftowej powstają znaczne 

ilości toksycznych ścieków, których skład różni się w zależności od pochodzenia surowca oraz stosowanych 

procesów technologicznych. Przeciętnie tego typu ścieki zawierają od 20 do 200 mg/L fenoli [3]. Z uwagi na 

ich wysoką toksyczność, wprowadzono ograniczenia zawartości fenoli w ściekach przemysłowych 

zrzucanych do zbiorników wodnych. Ich dopuszczalne stężenie wynosi 1 mg/L [4], dlatego konieczna jest 

ciągłe monitorowanie ich zawartości w ściekach przed i po oczyszczaniu. 

W celu oznaczania izomerów krezolu wykorzystuje się szereg technik analitycznych, w tym w głównej 

mierze technikę chromatografii gazowej w połączeniu z detektorami uniwersalnymi jak i selektywnymi [5-7]. 

Związki te z uwagi na swoje specyficzne właściwości, a także występowanie często w niskich stężeniach w 

próbkach charakteryzujących się skomplikowaną matrycą, wymagają zastosowania odpowiednich metod 

przygotowania próbek. W tym celu stosuje się różne typy ekstrakcji, w tym ekstrakcję w układzie ciecz-gaz 

do których zaliczane są techniki dynamicznej analizy fazy nadpowierzchniowej i statycznej analizy fazy 

nadpowierzchniowej, ekstrakcje w układzie ciecz-ciało stałe, w tym technikę ekstrakcji do fazy stałej [8], 

mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej. Do technik ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz zaliczane są klasyczna 

ekstrakcja ciecz-ciecz, mikroekstrakcja ciecz-ciecz, mikroekstrakcja do pojedynczej kropli [9], a także jedna z 

nowszych technik – dyspersyjna mikroekstrakcja w układzie ciecz-ciecz (DLLME). Jest to technika 

opracowana w 2006 roku przez Razae’a [10]. DLLME polega na dodaniu do próbki rozpuszczalnika 

ekstrakcyjnego, a także dyspergującego, który ma za zadanie rozbicie na drobne kropelki rozpuszczalnika 

ekstrakcyjnego. Taką mieszaninę wytrząsa się, a następnie odwirowuje i pobiera fazę sedymentacyjną. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

Chemometryczne podejście do optymalizacji… 

66 

W celu wyznaczenia optymalnych warunków ekstrakcji, coraz częściej wykorzystuje się plany 

czynnikowe, które umożliwiają jednoczesne określenie oddziaływań wielu niezależnych zmiennych [11-13]. 

Pozwalają one na wyodrębnienie czynników mających rzeczywisty wpływ na dany proces, a także określenie 

ich wzajemnych oddziaływań. Badanie wpływu wielu zmiennych niesie ze sobą konsekwencję wzrostu ilości 

doświadczeń. Przykładowo badając siedem zmiennych należałoby przeprowadzić aż 128 analiz. Dlatego w 

celu przebadania większej ilości czynników mających potencjalny wpływ na efekt danego procesu, 

wykorzystuje się tzw. frakcyjne plany czynnikowe. Jednym z przykładów jest tzw. plan Placketta-Burman’a 

[14], który poprzez wyeliminowanie dużej części kombinacji pozwala zbadać wpływ wielu czynników przy 

stosunkowo niewielkiej ilości eksperymentów. Plan ten zakłada możliwość oceny wpływu k = N-1 zmiennych, 

przy przeprowadzeniu N doświadczeń (N jest zawsze wielokrotnością 4). Ocenę wpływu danej zmiennej 

określa się poprzez porównanie średniej arytmetycznej odpowiedzi uzyskanych dla procesów 

zrealizowanych pod wpływem niskiego poziomu czynnika do średniej arytmetycznej odpowiedzi procesów 

wykonanych z zastosowaniem czynników w wysokim poziomie. Jest to plan, który umożliwia wyeliminowanie 

czynników nie mających istotnego wpływu na warunki danego procesu, jednak nie dostarcza wiarygodnej 

informacji o oddziaływaniu pomiędzy zmiennymi. Aby uzyskać tego typu informację należy rozszerzyć 

badania o zastosowanie innych planów czynnikowych tzn. centralnego planu kompozycyjnego, czyli planów 

który zakłada wyznaczenie nie tylko najniższych i najwyższych wartości danej zmiennej ale także punktów 

centralnych, przy większej ilości kombinacji. Oceny dokonuje się na podstawie utworzonej 3-wymiarowej 

powierzchni odpowiedzi [15]. 

W pracy przedstawiono procedurę doboru warunków techniki dyspersyjnej mikroekstrakcji w układzie 

ciecz-ciecz do oznaczania o-krezolu i m-krezolu w ściekach przemysłowych, z zastosowaniem modelu 

Placketta-Burman’a i centralnego planu kompozycyjnego. 

2. Część eksperymentalna 

(Experimental) 

2.1. Materiały 

(Materials) 

W badaniach zastosowano substancje wzorcowe: o-krezol, m-krezol, 4-chlorofenol, gazy techniczne: 

wodór – czystość 5,5N z wytwornicy wodoru (Packard, USA), Odczynniki: aceton (czystość do HPLC, 

POCH, Polska), dichlorometan (POCH, Polska), czterochlorek węgla (Merc, Germany), chloroform (POCH, 

Polska), 1,1,2,2-tetrachloroetan (POCH, Poland), NaCl (POCH, Polska), kwas solny 35-38% (POCH, 

Polska), wodorotlenek sodu (POCH, Polska). 

2.2. Aparatura 

(Apparatus) 

Chromatograf gazowy HP 5890 II ze spektrometrem mas HP 5972A (Hewlett-Packard, USA), 

Kolumna kapilarna: Rxi-624Sil MS (60m x 0,25mm x 1,40μm) (Restek, USA), Oprogramowanie 

Chemstation (Agilent, USA) wraz z bibliotekami widm NIST 05 i Wiley 8.0., Wirówka EBA 8S, Hettich 

(Niemcy), oprogramowanie wspomagające statystyczną kontrolę procesów Minitab ®15. 

2.3. Metody postępowania 

(Methods) 

2.3.1. Optymalizacja parametrów dyspersyjnej mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz 

W celu doboru optymalnych warunków DLLME, badano wpływ parametrów tj. rodzaj rozpuszczalnika 

ekstrakcyjnego, objętość rozpuszczalnika dyspergującego, dodatek soli, czas suszenia soli przed ekstrakcją, 

pH, a także prędkość i czas wirowania na efektywność ekstrakcji, którą oceniano na podstawie powierzchni 

pików. Dobór odpowiednich parametrów wyznaczono w oparciu o plan eliminacyjny Plackett’a-Burman’a 

oraz centralnego planu kompozycyjnego z zastosowaniem programu Minitab. 

2.3.2. Procedura dyspersyjnej mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz 

Procedura mikroekstrakcji polegała na umieszczeniu 10 mL próbki w fiolce wraz z dodatkiem NaCl. Następie 

do roztworu dodawano 0,5 mL rozpuszczalnika ekstrakcyjnego oraz zoptymalizowaną objętość 

rozpuszczalnika dyspergującego (acetonu). Fiolkę zakręcano szczelnie korkiem, wytrząsano, a następnie 

odwirowywano. Otrzymaną w ten sposób fazę sedymentacyjną pobierano za pomocą strzykawki 

mikrolitrowej i dozowano w objętości 2 µL do chromatografu gazowego. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

67 P. Makoś, G. Boczkaj 

2.3.3. Warunki analizy chromatograficznej 

W badaniach stosowano kolumnę kapilarną Rxi-624Sil MS (Restek, USA), gaz nośny: wodór, objętościowe 

natężenie przepływu 1 mL/min, Temperatura dozownika: 250°C, Temperatura źródła jonów (EI, 70 eV) 

200°C, Temperatura linii łączącej chromatograf gazowy z detektorem MS 310°C; Program temperaturowy: 

50°C (5 min) – narost 5°C/min -115°C (0 min) – narost 10°C/min - 250°C (5 min), tryb SIM, w którym 

identyfikowano izomery krezolu na podstawie wartości czasu retencji przy rejestracji sygnału dla wartości 

m/z równej 107. Sposób optymalizacji warunków rozdzielania opisano we wcześniejszej pracy [13]. 

3. Wyniki i dyskusja 

(Results and discussion) 

3.1. Dobór rozpuszczalnika ekstrakcyjnego 

(Selection of the extraction solvent) 

W pierwszym etapie zbadano wpływ rozpuszczalnika ekstrakcyjnego na wzbogacenie analitów, które 

oceniane było na podstawie porównania pól powierzchni pików pochodzących od izomerów krezolu. W tym 

celu testowano 4 chlorowane rozpuszczalniki organiczne różniące się gęstością tj. dichlorometan (DCM) 

(1,33 g/cm 3 ), czterochlorek węgla (1,59 g/cm 3 ), chloroform (1,49 g/cm 3 ) i 1,1,2,2-tetrachloroetan (1,59 g/cm 3 ) 

w objętości 0,5 mL, przy niezmienionych pozostałych warunkach. Na podstawie uzyskanych wyników, 

największą wydajność ekstrakcji stwierdzono podczas użycia dichlorometanu, który wykorzystano do 

dalszych badań. 

Na rys. 1 przedstawiono wpływ poszczególnych rozpuszczalników organicznych na wydajność 

ekstrakcji, dla m-krezolu w celu zapewnienia przejrzystości wykresu, gdyż wszystkie badane parametry miały 

bardzo zbliżony wpływ na obydwa izomery. 

Rys. 1. Wpływ typu rozpuszczalnika ekstrakcyjnego na wydajność ekstrakcji techniką DLLME. 

Fig. 1. Effect of the type of extraction solvent on efficiency of extraction by DLLME. 

3.2. Zastosowanie planu Placketta-Burman’a 

(Application of Plackett-Burman design) 

W celu identyfikacji pozostałych zmiennych, które mają statystycznie istotny wpływ na wydajność 

ekstrakcji wykorzystano plan eliminacyjny Placketta-Burmana. Czyli plan o rozdzielczości III, w którym 

oddziaływania dwuczynnikowe są uwikłane z efektami głównymi. Dla każdego z wybranych parametrów 

określono zakres metody poprzez wyznaczenie najniższych wartości określanych jako poziom dolny (-1), a 

także najwyższych wartości oznaczanych jako poziom górny (+1). Wszystkie parametry zestawiono w tabeli 

1. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


68 

Tabela 1. Zestawienie niskich i wysokich poziomów zmiennych w matrycy 2 7-4 planu Placketta-Burmana. 

Table 1. A list of low and high levels of factors in 2 7–4 Plackett–Burman design matrix. 

Zmienne (Variables) 

Poziom (level) 

Symbol 

Niski (-1) 

Wysoki (+1) 

(code) 

(low) 

(high) 

pH A 6 10 

Objętość rozpuszczalnika dyspergującego 

[mL] 

B 0,4 1,2 

Masa dodatku soli [g NaCl] C 0 1 

Prędkość wirowania [obr/min] D 3000 5000 

Czas wirowania [min] E 3 7 

Czas wytrząsania [min] F 1 3 

Czas suszenia NaCl w 100 o C [min] G 0 30 

W badaniach przyjęto matrycę dla 7 zmiennych zgodnie z zasadą tworzenia macierzy według planu 

dwuczynnikowego Placketta Burmana, w którym wykorzystano możliwie najmniejszą liczbę układów, równą 

8. Zastosowaną macierz przedstawiono w tabeli 2. 

Tabela 2. Matryca planu czynnikowego Placketta-Burmana dla zbadania siedmiu zmiennych (k = 7), którym 

przypisano dwa poziomy wartości w ramach ośmiu doświadczeń (N = 8). 

Table 2. The matrix of Plackett-Burman design for investigation of seven variables (k = 7) which are 

assigned to two levels for the eight experiments (N = 8). 

Lp. A B C D E F G 

1. +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 

2. +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 

3. +1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 

4. +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 

5. -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 

6. -1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 

7. -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 

8. -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 

Główny wpływ poszczególnych czynników określano na postawie całkowitych pól powierzchni pików. 

Wykres Pareto, przedstawiony na rys. 2 A) prezentuje w sposób wizualny czynniki mające wpływ na 

efektywność ekstrakcji. Przy czym pozioma kreska określa 95% poziom ufności. Uzyskane wyniki wskazują, 

że parametrami mającymi statystycznie istotny wpływ na odzyski analitów są przede wszystkim pH, a także 

objętość rozpuszczalnika dyspergującego. W mniejszym stopniu wpływ może mieć również efekt wysalania, 

czyli dodatek NaCl. Czynniki tj. pH oraz rozpuszczalnik dyspergujący wykazują ujemny efekt, co zostało 

przedstawione na rys. 2 B), gdzie zaznaczone są wyłącznie punkty A i B, gdyż jedynie one mają wyraźny 

wpływ na efekt końcowy procesu. Pozostałe parametry zgodnie z zastosowanym planem jedynie w 

niewielkim stopniu mogą wpływać na zmiany pól powierzchni pików, dlatego na rys. 2 B) nie zostały 

oznaczone. 

Na wykresach przedstawiono wpływ poszczególnych parametrów dla m-krezolu, ponieważ wartości 

uzyskane dla o-krezolu są niemal identyczne. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


Rys. 2. 

Fig. 2. 

A). Wykres Pareto przedstawiający wpływ głównych parametrów i B). Wykres przedstawiający dodatni lub 

ujemny wpływ poszczególnych czynników. Pionowa linia na wykresie określa poziomie ufności 95%. 

A). Pareto chart of standardized main effect, B). Normal plot showing positive or negative impact of factors. 

Vertical line in the chart defines 95% confidence level. 

3.3. Zastosowanie centralnego planu kompozycyjnego 

(Application of central composite design) 

Na podstawie uzyskanych wartości z planu Placketta-Burman’a, czynniki, które uznane zostały za 

mające statystycznie istotny wpływ na efektywność ekstrakcji, w dalszym etapie poddano optymalizacji 

z zastosowaniem centralnego planu kompozycyjnego. W tym celu wyznaczono dla dwóch parametrów 

zarówno poziom niski (-1), wysoki (+1), a także centralny (0) oraz tzw. punkty gwiezdne wynoszące 

odpowiednio α = -1,4 i α = 1,4. Są to punkty leżące na osiach trójwymiarowej powierzchni odpowiedzi. 

Wartości wyznaczonych punktów zawarto w tabeli 3. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


70 

Tabela 3. Zestawienie niskich, wysokich i centralnych poziomów zmiennych w matrycy 2 3 planu centralnych 

kompozycji. 

Table 3. A list of low, high and central levels of factors in the 2 3 central composite design. 

Poziom 

Gwiezdne punkty 

(Level) 

(Star points) (α=1,4) 

Symbol 

Niski Centralny Wysoki 

-α +α 

(-1) 

(0) 

(+1) 

pH A 6 8 10 4 14 

Zmienna 

(Variables) 

Objętość rozpuszczalnika 

dyspergującego [mL] 

B 0,4 0,8 1,2 0 1,68 

Tabela 4. Warunki eksperymentalne wykorzystywane w celu przeprowadzenia optymalizacji 

z zastosowaniem centralnego planu 2 3 kompozycyjnego. 

Table 4. Experimental conditions used to perform the optimization using the 2 3 central composite design. 

A 

B 

-1 -1 

-1 1 

1 -1 

1 1 

-1,4 0 

+1,4 0 

0 -1,4 

0 +1,4 

0 0 

0 0 

0 0 

0 0 

0 0 

Zgodnie z zasadami tworzenia centralnego planu kompozycyjnego w celu optymalizacji dwóch 

parametrów należało przygotować 13 nowych próbek, jednak z uwagi na założony brak istotności 

pozostałych parametrów, możliwe było wykorzystanie czterech wyników z planu Placketta-Burmana. 

Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że zastosowanie pH 6, a także najniższej z założonych 

objętości rozpuszczalnika dyspergującego, pozwala na najefektywniejsze przeprowadzenie dyspersyjnej 

mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz. Uzyskane wartości są zbieżne z wykresem współzależności 

parametrów wyznaczonym na postawie wartości z planu Placketta-Burmana, który przedstawiono na rys. 3. 

Rys. 3. Powierzchnie współzależności dwóch parametrów w planie Placketta-Burman’a. 

Fig. 3. The surfaces of correlation two parameters in the Plackett-Burman design. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


4. Wnioski 

(Conclusions) 

W pracy przedstawiono możliwość zastosowania frakcyjnych planów czynnikowych w celu wykonania 

optymalizacji dyspersyjnej mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz. Zastosowane plany czynnikowe w dużej 

mierze przyczyniły się do skrócenia czasu wykonania optymalizacji, zmniejszenia ilości odczynników, przy 

jednoczesnym zwiększeniu ilości uzyskach informacji. Umożliwiły wyznaczenie parametrów mających 

rzeczywisty wpływ na efektywność ekstrakcji, a także określenie ich współzależności, przy niewielkich 

ilościach wykonanych analiz. Zastosowanie zoptymalizowanej metody do badania próbek ścieków 

rafineryjnych pod kątem jej przydatności do badania zawartości izomerów krezoli będzie przedmiotem 

kolejnej pracy. 

5. Literatura 

(References) 

1. A.Starek, Krezol – mieszanina izomerów, PiMOŚP, 1 (2007) 95. 


from hot road bitumens, Chemosphere 107 (2014), 23–30 

3. Lanouette, K.H., Treatment of phenolic wastes., Chem. Eng. 84 (1977) 99. 

4. Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 24 lipca 2006 r. w sprawie warunków, jakie należy spełnić 

przy wprowadzaniu ścieków do wód lub do ziemi, oraz w sprawie substancji szczególnie szkodliwych 

dla środowiska wodnego. Dz.U.06.137.984 

5. G. Boczkaj, P. Makoś, Zastosowanie technik rozdzielania do identyfikacji i oznaczania lotnych związków 

tlenoorganicznych stosowanych w analityce procesowej wody i ścieków, Cam. Sep. 6 (2014) 23. 

6. G. Boczkaj, M. Kamiński, A. Przyjazny, Process control and investigation of oxidation kinetics of 

postoxidative effluents using gas chromatography with pulsed flame photometric detector (GC-PFPD), 

Ind. Eng. Chem. Res. 49 (2010) 12654. 

7. G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, New Procedures for Control of Industrial Effluents Treatment 

Processes, Ind. Eng. Chem. Res. 53 (4) (2014), 1503. 

8. A. Kovács, M. Mörtl, A. Kende, Development and optimization of a method for the analysis of phenols 

and chlorophenols from aqueous samples by gas chromatography–mass spectrometry, after solid 

phase extraction and trimethylsilylation., Microchem. J. 99 (2011) 125. 

9. M. Saraji, M. Bakhshi, Determination of phenols in water samples by single-drop micro-extraction 

followed by in-syringe derivatization and gas chromatography–mass spectrometric detection, J. 

Chromatogr. A 1098 (2005) 30. 

10. M. Rezaee, Y. Assadi, M-R. M. Hosseini, E. Aghaee, F. Ahmadi, S. Berijani, Determination of organic 

compounds in water using dispersive liquid–liquid micro-extraction, J. Chromatogr. A 1116 (2006) 1. 

11. FDA, Guidance for Industry PAT – A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, 

Manufacturing and Quality Assurance, 2004. 

12. L. B. Abdulra’uf, G. H. Tan, Chemometric approach to the optimization of HS-SPME/GC–MS for the 

determination of multiclass pesticide residues in fruits and vegetables, Food Chem. 177 (2015) 267. 

13. A.N. Panagiotou, V.A. Sakkas, T.A. Albanis, Application of chemometric assisted dispersive liquid–liquid 

microextraction to the determination of personal care products in natural waters, Anal. Chim. Acta 649 

(2009) 135. 

14. Montgomery D.C., Design and Analysis of Experiments, 6th Ed., Wiley, 2005. 

15. https://onlinecourses.science.psu.edu/stat503/node/59 (data dostępu: 27.06.2015). 

16. G. Boczkaj, P. Makoś, Separation of Volatile Oxygen-containing Organic Compounds by Gas 

Chromatography – selectivity comparison of different polarity stationary phases, Cam. Sep. 5 (2) (2013) 

143-151 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

72 


PRACE PRZEGLĄDOWE 

(REVIEW PAPERS) 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria



Patrycja MAKOŚ, Grzegorz BOCZKAJ* 

Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, 


Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania lotnych 

związków azoto – organicznych (LZN) w próbkach wody i ścieków. 

Streszczenie: W pracy dokonano przeglądu i porównania metod opartych na chromatografii gazowej do oznaczania 

lotnych związków azoto-organicznych (LZN) w próbkach wody i ścieków. Przedstawione zostały metodyki analityczne 

wykorzystujące zarówno detektory selektywne tj. detektor azotowo-fosforowy (NPD), detektor powierzchniowej jonizacji 

(SID), detektor chemiluminescencyjny azotu (CLND), detektor wychwytu elektronów (ECD) jak i detektorów 

uniwersalnych typu spektrometr mas (MS), tandemowy spektrometr mas (MS/MS) oraz detektor płomieniowo jonizacyjny 

(FID). Ze względu na wysoką toksyczność oraz negatywne oddziaływanie LZN na środowisko, konieczne staje się 

opracowanie nowych metod analitycznych, które umożliwią oznaczenie związków na niskich poziomach stężeń. Spośród 

dostępnych metod największą popularnością i największym potencjałem do różnorodnych zastosowań jest 

chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas, ponieważ w połączeniu z odpowiednią techniką izolacji lub/i 

wzbogacania analitów, zapewnia niskie granice wykrywalności względem większości związków z grupy LZN. Pozostałe 

detektory wykazują wysoką selektywność dla mniejszej liczby związków LZN. 

Słowa kluczowe: Lotne związki azoto-organiczne, LZN, woda, ścieki, chromatografia gazowa, detektory uniwersalne, 

detektory selektywne. 

Application of gas chromatography for separation and quantification of Volatile 

Nitrogen-containing Compounds (VNCs) in samples of water and wastewater. 

Abstract: The paper presents a review and comparison of gas chromatographic methods for determination of Volatile 

Nitrogen-containing Compounds (VNCs) in samples of water and wastewater. The analytical methods that uses both 

selective detectors such as Nitrogen-Phosphorus Detector (NPD), Surface Ionization Detector (SID), 

Nitrogen Chemiluminescence Detector (CLND), Electron Capture Detector (ECD) and universal detectors: Mass 

Spectrometry (MS), Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) and Flame Ionization Detector (FID) were described. Due to 

the high toxicity and negative effects of VNCs on the environment, it becomes necessary to develop new analytical 

methods that allow determination of compounds at low concentration level. Among all available methods, the most 

popular and the greatest potential for a variety of applications have gas chromatography coupled with mass 

spectrometry, because in combination with techniques of isolation and / or enrichment of the analytes, provide low limits 

of detection for most VNCs. Other detectors have a high selectivity for a smaller number of VNCs compounds. 

Key words: Volatile Nitrogen-containing Compounds, VNCs, water, wastewater, gas chromatography, universal 

detectors, selective detectors. 

Użyte skróty: AALLME- Metoda mikroekstrakcji ciecz-ciecz wspomagana powietrzem, AFID- 

Alkaliczny detektor płomieniowo-jonizacyjny, CE - Elektroforeza kapilarna, CLLE- Ciągła ekstrakcja ciecz-ciecz, CLND- 

Detektor chemiluminescencyjny azotu, DCM-dichlorometan, DLLME-Dyspersyjna mikroekstrakcja w układzie cieczciecz, 

DUSA-DLLME- Dyspersyjna mikroekstrakcja w układzie ciecz-ciecz wspomagana promieniowanie mikrofalowym, 

ECD- Detektor wychwytu elektronów, ECNI- Ujemna jonizacja wychwytu elektronów, EI- Jonizacja elektronowa, FAEMEmikroekstrakcja 

z wytworzeniem emulsji za pomocą włókna, FID-Detektor płomieniowo-jonizacyjny, GC- Chromatografia 

gazowa, HF-LPME- Mikroekstrakcja przez membranę do fazy ciekłej ,HLLE- jednorodna ekstrakcja ciecz-ciecz, HSME- 

Mikroekstrakcja z fazy nadpowierzchniowej, HS-SDME - Ekstrakcja do pojedynczej kropli umieszczonej w fazie 

nadpowierzchniowej, HS-SPME -mikroekstrakcja z fazy nadpowierzchniowej, In-tube SPME- Mikroekstrakcja do fazy 

stacjonarnej w otwartej rurze, IRMS-Jonizacja oznaczania stosunków izotopowych, LC- Chromatografia cieczowa, LOD- 

Granica wykrywalności, LV-DAI- Bezpośrednie dozowanie dużej objętości próbki, LZN- Lotne związki azoto-organiczne, 

LZO- Lotne związki organiczne, LZS- Lotne związki siarko-organiczne, LZT- Lone związki tleno-organiczne, MA-HS- 

SPME- mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej z fazy nadpowierzchniowej wspomagana promieniowaniem mikrofalowym, 

MS-Spektrometr mas, MS/MS- tandemowa spektrometria mas, NDMA- N-Nitrozodimetyloamina, NMOR- N- 

Nitrozomorfolina, NPD- Detektor azotowo-fosforowy, NPIP- N- Nitrozopiperydyna, NPYR- N- Nitrozopirolidyna, PFBAY- 

Pentafluorobenzaldehyd, PDMS- Polidimetylosiloksan, PDMS/DVB- Kopolimer diwinylobenzenu i polidimetylosiloksanu, 

PFBOC- chlorek pentafluoro benzylowy, PLOT- Kolumna kapilarna z warstwą porowatą, PPESK- 

Poliftalazoeterosulfoketon, RSD- względne odchylenie standardowe, SBSE- Ekstrakcja ruchomym elementem 

sorpcyjnym, SDME- Mkiroekstrakcja do pojedyńczej kropli, SHS- Statyczna analiza fazy nadpowierzchniowej, SID- 

Detektor powierzchniowej jonizacji, SIM- Selektywne monitorowanie jonów, SPE- Ekstrakcja do fazy stałej, SPME- 

Mkroekstrakcja do fazy stacjonarnej, TD/SD- Termiczna desorpcja połączona z ekstrakcją sorpcyjną, TFECF- 2,2,2- 

trifluoroetylo chlorometanian, TID- Detektor termojonowy, US EPA- Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska, UV- 

Promieniowanie ultrafioletowe 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania lotnych związków LZN… 

74 

1. Wstęp 


Lotne związki organiczne (LZO) określone są przez Amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (US 

EPA) jako związki organiczne o prężności par wyższej od 0,01 kPa w temperaturze 25°C [1]. W ich skład 

wchodzą m.in. lotne związki siarko-organiczne (LZS), tleno-organiczne (LZT), lotne związki azoto-organiczne 

(LZN), lotne węglowodory aromatyczne oraz alifatyczne. Z pośród szerokiej gamy tych związków, ważną rolę 

w zanieczyszczaniu środowiska wodnego ogrywają lotne związki azoto-organiczne (Tabela 1), które 

charakteryzują się wysoką toksycznością, trwałością i zdolnością do akumulacji w łańcuchu pokarmowym. 

LZN są również niebezpieczne dla zdrowia ludzi ponieważ działają drażniąco na układ oddechowy, skórę 

oraz błony śluzowe. W środowisku wodnym mogą przekształcać się do nitrozo amin, z których aż 85% 

zostało zakwalifikowanych jako substancje rakotwórcze [2]. Wobec czego większość państw ustaliło 

maksymalne dopuszczalne stężenie nitrozoamin w wodzie, w tym dla głównego przedstawiciela nitrozo 

dimetyloaminy (NDMA) wynoszącej 10 ng/L [3-5] Natomiast w ściekach graniczna wartość wynosi 200 ng/L 

[6]. Głównymi emitentami/źródłami LZN jest przemysł rafineryjny i petrochemiczny [7-13], farmaceutyczny 

[14], jak również przemysł zajmujący się wytwarzaniem tworzyw sztucznych, barwników, antyutleniaczy oraz 

materiałów wybuchowych. LZN mogą także powstawać w wodzie pitnej na skutek chlorowania wody [15-16]. 

Ze względu na wymogi oznaczania LZN na bardzo niskim poziomie stężeń, konieczne jest stosowanie 

bardzo czułych i selektywnych technik analitycznych. Aktualnie w analityce wody i ścieków wykorzystuje się 

przede wszystkim techniki chromatograficzne, w tym chromatografię gazową (GC) z detektorami 

uniwersalnymi oraz selektywnymi [17], chromatografię cieczową (LC) [18-19] oraz elektroforezę kapilarną 

(CE) [21]. Oznaczanie LZN w próbkach wody stwarza wiele problemów z uwagi na specyficzne właściwości 

fizykochemiczne tj. wysoka polarność, zasadowy charakter, wysoka lotność i rozpuszczalność w wodzie. W 

przypadku amin dodatkowy problem stanowi obecność wiązania wodorowego, które wywołuje ogonowanie 

pików oraz brak charakterystycznych jonów uniemożliwiających stosowanie detektora MS [22-23]. Dlatego 

nieodzownym elementem technik chromatograficznych jest stosowanie izolacji lub/i wzbogacania analitów, a 

w przypadku amin stosowanie odpowiednich odczynników upochadniających. 

Tabela 1. Zestawie popularnych związków z grupy lotnych związków azoto-organicznych (LZN). 

Table 1. A list of common compounds from the group of Volatile Nitrogen-containing Compounds (VNCs). 

Aminy (Amines) 

Związki nitrowe (Nitro Compounds) 

C H 3 

NH 

CH 3 

NH 2 

NO 2 

CH 3 

CH 3 

C H 3 

Diizobutylamina 

Anilina 

N-Nitrozoaminy (N-Nitrosamines) 

Nitrobenzen 

N 

NO 

N 

NO 

N 

NO 

O 

N 

NO 

H 3 C 

N-Nitrosodimetyloamina 

(NDMA) 

N- Nitrozopirolidyna 

(NPYR) 

N- Nitrozopiperydyna 

(NPIP) 

N-Nitrozomorfolina 

(NMOR) 

Heterocykliczne związki azotowe (Heterocyclic nitrogen compounds) 

H 

N 

N 

Pirol 

N 

Pirydyna 

Indol 

N 

H 

N 

Pirymidyna 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


2. Zastosowanie chromatografii gazowej z detektorami selektywnymi 

(Application of gas chromatography with selective detectors) 

2.1. Detektor azotowo-fosforowy (NPD) 

(Nitrogen-Phosphorus Detector) 

Jedna z najpowszechniej wykorzystywanych metod oznaczania związków azoto-organicznych w 

próbkach wody i ścieków oparta jest na zastosowaniu chromatografii gazowej w połączeniu z selektywnym 

detektorem azotowo-fosforowym (NPD), nazywanym również detektorem termojonowym (ang. Thermionic 

Detector, TID). Pierwszy tego typu detektor został opracowany w 1964 roku przez Karmen i Giuffrida do 

oznaczania fosforowych i chlorowanych węglowodorów [24]. Dopiero trzy lata później stwierdzono również 

jego przydatność w identyfikacji związków azotowych [25]. Ówczesny detektor tzw. 

alkaliczny detektor płomieniowo-jonizacyjny (ang. Alkali Flame Ionization Detector, AFID), w którym sygnał 

otrzymywany był poprzez zastosowanie źródła jonizacji w postaci soli metali alkalicznych oraz palnika 

zasilanego wodorem i powietrzem, charakteryzował się słabą stabilnością oraz koniecznością częstej 

wymiany źródła jonów. W celu wyeliminowania tych wad, stosowano wiele nowych rozwiązań [26], jednak 

najlepsze rezultaty otrzymali w 1974 roku Kolb i Bisschof, którzy zastąpili sole metali alkalicznych, nielotnym 

krzemianem rubidu osadzonym na szklanym złożu, natomiast palnik zastąpiono drutem platynowym oraz 

zastosowano znacznie mniejszy przepływ objętościowy wodoru, który uniemożliwiał podtrzymywanie 

płomienia w detektorze. Dzięki takim zabiegom uzyskano wyższą czułość, selektywność oraz poprawę 

stabilności [27]. Zasada działania współczesnych detektorów azotowo-fosforowych polega na wytworzeniu w 

detektorze aktywnej warstwy granicznej lub plazmy w temperaturze 600-800°C, w której następuje rozkład 

związków na produkty elektroujemne (NO 2 , CN i PO 2 ), a następnie wytworzeniu ujemnych jonów (CN - , PO - , 

PO 2- , i PO 3- ) w podwyższonej temperaturze z zastosowaniem katalizatorów alkalicznych umieszczonych w 

źródle ceramicznym [28-29]. 

Krótkołańcuchowe aminy alifatyczne stwarzają wiele problemów podczas izolacji z próbek wody, a 

także w trakcie oznaczeń chromatograficznych [30-31]. Dlatego jednym z wymogów oznaczania amin na 

niskich poziomach stężeń jest zastosowanie upochodniania. Najpopularniejszymi odczynnikami 

derytatyzującymi stosowanymi w technice GC-NPD są chlorek pentafluorobenzylowy (ang. 

Pentafluorobenzoyl Chloride, PFBOC) [32], chlorek dimetylotiofosfoniowy [33] oraz 2,2,2-trifluoroetylochlorometanian 

(ang. 2′,2′,2-trifluoroethyl chloroformate, TFECF) [34]. Po przeprowadzeniu analitów w 

pochodne, należy zastosować odpowiednią technikę ekstrakcji. Przykładowo podczas zastosowania 

termicznej desorpcji połączonej z ekstrakcją sorpcyjną (ang. Thermal Desorption / Sorptive Extraction, 

TD/SD), krótkołańcuchowe aminy mogą być oznaczane w stężeniach sub-ppb [32]. Natomiast po 

zastosowaniu techniki mikroekstrakcji z fazy nadpowierzchniowej (ang. Headspace solid-phase micro 

extraction, HS-SPME), wartości LOD dla amin krórkołańcuchowych mieszczą się w zakresie od 3 do 56 µg/L 

[35]. Lotne II i III rzędowe aminy w układzie statycznej analizy fazy nadpowierzchniowej (ang. Static 

Headspace, SHS) połączonej z GC-NPD, w warunkach zasadowych, rozdzielone na selektywnej kolumnie 

PoraPLOT Amines, mogą być oznaczane na niskich poziomach stężeń w zakresie od 0,2 do 20 µg/L. W 

przypadku I rzędowych związków tj. metyloamina, propyloamina i butyloamina wartości LOD są znacznie 

wyższe i wynoszą odpowiednio 1000, 2000, 3000 µg/L. Dodatkowo, kolumna która umożliwia rozdzielenie 

szerokiej gamy związków aminowych, wymaga systematycznego dodania amoniaku do próbki w stężeniu 

0,05M, w celu uzyskania zadowalającej powtarzalności [37]. Zupełnie innym typem izolacji amin tj. 

metyloamina, dimetyloamina oraz trimetyloamina jest procedura mikrodyfuzji, którą przeprowadza się w 

kolbie dyfuzyjnej Cavett’a przedstawionej na rysunku 1, aż do momentu osiągnięcia stanu równowagi. W 

połączeniu z detekcją GC-NPD, zapewnia niskie granice wykrywalności [38]. 

Większość metod analitycznych opartych na GC-NPD sprawdza się w przypadku oznaczania 

nitrozoamin w strumieniach ścieków, gdzie stężenie tych związków jest bardzo duże. Natomiast często 

pomimo zastosowania technik ekstrakcyjnych tj. mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej (ang. Solid Phase 

Microextraction, SPME), ciągła ekstrakcja ciecz-ciecz (ang. Continuous Liquid–Liquid Extraction, CLLE) oraz 

ekstrakcja do fazy stałej (ang. Solid Phase Extraction, SPE), technika ta nie jest wystarczająco czuła, aby 

sprostać wymogom analityki wody pitnej. Aktualne standardy wymagają stosowania metod, których wartość 

granicy wykrywalności mieści się w zakresie 1 – 10 ng/L [39-42]. Dodatkowo nie zaleca się stosowania 

połączenia SPME z układem GC-NPD w oznaczaniu N-nitrozoamin, ponieważ wartości odzysku mieszczą 

się w granicy +/- 30% dla związków tj. NDMA, NDPA, NDEA, NMEA, natomiast w przypadku NDMA wartość 

ta wynosi aż +159%. Ponadto nie możliwe jest oznaczenie NPIP, ze względu na występowanie zakłóceń 

matrycy. Wartości LOD również nie są zadowalające, gdyż mieszczą się w zakresie od 70 do 350 ng/L [42]. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


76 

Rys. 1. Kolba dyfuzyjna Cavett’a. 

Fig. 1. Cavett diffusion flask. 

2.2. Detektor powierzchniowej jonizacji (SID) 

(Surface Ionization Detector) 

Zasada działania detektora powierzchniowej jonizacji (SID), wykorzystuje zjawisko tworzenia jonów 

dodatnich i ujemnych podczas desorpcji termicznej cząsteczek z powierzchni ciała stałego. Detektor SID 

składa się z diody która ogrzewa anodę będącą emiterem i katodę spełniającą funkcję kolektora jonów. 

Podczas przejścia próbki przez diodę, padające na powierzchnię emitera cząsteczki ulegają desorpcji i 

przemieszczają się zgodnie z polem elektrycznym do elektrody kolektorowej [40]. W zależności od rodzaju 

konstrukcji materiał jonizujący stanowi Ru, Ir, Pt oraz Mo [43-45]. SID może pracować jako detektor 

selektywny dla związków fosforowych, azotowych oraz po niewielkiej modyfikacji jako detektor uniwersalny 

typu FID [46]. Jednak szczególnie sprawdza się w oznaczaniu śladowych zawartości związków organicznych 

[47]. Wydajność jonizacji związków azotowych uzależniona jest od charakteru grup funkcyjnych. 

Przykładowo w grupie amin I-, II-, i III-rzędowych wydajność wzrasta wraz ze wzrostem rzędowości. Dla 

trzeciorzędowych alkiloamin wartość ta mieści się w zakresie 0,1-0,05 A/Pa·cm 2 [48]. Pod względem czułości 

oraz selektywności dla związków azoto-organicznych SID wykazuje zbliżone wartości do detektora NPD [37]. 

Istotną zaletą detektora SID, jest możliwość pracy w próżni, jak i pod ciśnieniem atmosferycznym oraz fakt 

niskiej wrażliwości na parę wodną. Jest to dużym ułatwieniem szczególnie podczas analityki wody i ścieków, 

ponieważ to eliminuje konieczność stosowania czasochłonnych procedur usuwania wody [40,48]. Technika 

GC-SID znalazła praktyczne zastosowanie przede wszystkim w badaniu zawartości związków 

wielkocząsteczkowych, w tym głównie leków oraz pestycydów [50-52]. Istnieje tylko kilka doniesień nad 

zastosowaniem detektora SID w analityce wody i ścieków. 

Z przeprowadzonych badań nad porównaniem detektorów NPD i SID, w których zastosowano 

mieszaninę składającą się z 6 związków azotowych (acetonitryl, pirydyna, dimetyloformamid, 

diizobutyloamina, anilina i nitrobenzen), wynikają znaczne różnice w otrzymanych chromatogramach. Na 

chromatogramie otrzymanym w wyniku analizy GC-SID, jedynie 2 związki tj. pirydyna oraz diizobutyloamina 

wykazują większą intensywność sygnału, w porównaniu z tym uzyskanym w wyniku analizy GC-NPD. 

Ponadto na podstawie wartości LOD wykazano, że detektor SID sprawdza się głównie w oznaczaniu amin 

III-rzędowych [49,53-54]. 

2.3. Detektor chemiluminescencyjny azotu (CLND) 

(Nitrogen Chemiluminescence Detector) 

Kolejnym selektywnym detektorem stosowanym w chromatografii gazowej do wykrywania związków 

azoto-organicznych jest detektor chemiluminescencji azotu (CLND). Jego zasada działania, zgodnie z 

reakcjami (1) i (2) polega na spaleniu próbki w wysokiej temperaturze (>1000°C) i wytworzeniu tlenku azotu 

(NO), który następnie w reakcji z ozonem generuje dwutlenek azotu w stanie wzbudzonym (NO 2 *), co 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


przyczynia się do wytworzenia fotonu światła w zakresie od 600 do 900 nm, czyli powstania zjawiska 

chemiluminescencji [55]. W przypadku nitrozoamin, zjawisko to uwarunkowane jest powstawaniem rodnika 

nitrozylowego pod wpływem wysokiej temperatury - reakcja (3) i (4) [56]. 

(1) R − N + O → CO + H O + NO 

(2) NO + O → NO ∗ → NO + hv () 

(3) R − N = NO + O → CO + H O + 2NO 

(4) R − N = NO → R − N + NO ∗ 

Zastosowanie układu ekstrakcji SPME w połączeniu z GC-CLND zapewnia najbardziej wiarygodne 

wyniki w oznaczaniu N-nitrozoamin w próbkach ścieków, w porównaniu do metod wykorzystujących 

detektory typu MS oraz NPD. Wyznaczone w badaniu wartości odzysku dla 6 związków wynosiły +/-15%, a 

wartości LOD mieściły się w zakresie 15-110 ng/L [42]. Znacznie niższe wartości LOD dla N- 

nitrozodimetyloaminy można uzyskać stosując metodę polegającą na filtracji próbki, a następnie ekstrakcji 

ciągłej dichlorometanem (DCM). Po otrzymaniu fazy organicznej zatęża się ją do 1 mL i nanosi na pułapkę 

sorpcyjną. Pozostałości rozpuszczalnika usuwa się za pomocą strumienia helu i stosując desorpcję 

termiczną wprowadza się wzbogaconą próbkę do kolumny chromatograficznej. Tak złożona procedura 

umożliwia oznaczenie NDMA na poziomie 2 ng/L [57]. Metoda, która znacząco skraca czas analizy oraz 

zmniejsza stukrotnie zużycie DCM oparta jest na zastosowaniu ekstrakcji SPE z zastosowaniem 

membranowych krążków ekstrakcyjnych C18, które mają za zadanie usunąć obojętne i niepolarne związki. 

Następnie próbka ekstrahowana jest niewielką ilością DCM. Dalsza procedura nie ulega zmianie, a wartość 

LOD dla NDMA wynosi 3 ng/L [58]. Klasyczna ekstrakcja ciecz-ciecz dichlorometanem, umożliwia 

oznaczenie nitrofenoli w układzie GC-CLND w zakresie 0,1-1,0 µg/L [59]. 

2.4. Detektor wychwytu elektronów (ECD) 

(Electron Capture Detector) 

Detektor wychwytu elektronów, którego zasada działania oparta jest na zjawisku absorpcji elektronów 

przez cząsteczki elektrofilowe, wykazuje wysoką czułość wobec związków zawierających atomy o dużym 

powinowactwie elektronowym, głównie dla chlorowcoorganicznych, dla których jest detektorem 

specyficznym. Dla związków z grupy LZN jest detektorem selektywnym, jednak w przypadku bardzo 

złożonego składu matrycy stopień selektywności nie jest wystarczający. Jednym ze sposobów zwiększenia 

czułości detektora ECD, jest wprowadzenie cięższych halogenów do struktur analitów. Ponieważ odpowiedź 

detektora wzrasta w następującej kolejności F


78 

Przykładem metody oznaczania związków nitrowych, w której nie stosuje się odczynników do 

derywatyzacji jest metoda ekstrakcji SPME z włóknem z polianiliny, która wykazuje wysoką trwałość 

termiczną w porównaniu do handlowo dostępnych włókien z polidimetylosiloksanu (ang. 

Polydimethylsiloxane, PDMS, kopolimeru diwinylobenzenu i polidimetylosiloksanu (ang. 

Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene, PDMS/DVB), poliakrylanu [66]. Dodatkowo metoda zapewnia niskie 

granice wykrywalności [67]. Zastosowanie włókna w postaci Poliftalazynoeterosulfoketonu (ang. 

Poly(phthalazine ether sulfone ketone), PPESK) zapewnia o trzy rzędy wielkości mniejsze wartości LOD niż 

włókna na bazie kopolimeru carbowax/diwinylobenzen (CW/DVB), ze względu na wysokie powinowactwo do 

nitrowych związków aromatycznych wywołanego oddziaływaniem π-π, dipol-dipol oraz oddziaływaniami 

polarnych grup funkcyjnych [68]. Dobre wyniki zapewnia również metoda polegająca na mikroekstrakcji do 

fazy stacjonarnej z fazy nadpowierzchniowej wspomagana promieniowaniem mikrofalowym (MA-HS-SPME). 

Wydajność ekstrakcji jest nawet 4-krotnie wyższa niż w przypadku zastosowania konwencjonalnego 

ogrzewania [69]. Inną metodą oznaczania związków nitrowych, która nie wymaga stosowania odczynników 

do derywatyzacji oraz czasochłonnych procedur ekstrakcji jest technika bezpośredniego dozowania dużej 

objętości próbki do kolumny chromatografu gazowego (LV-DAI). Metoda ta polega na jednoczesnym 

wprowadzeniu próbki w objętości 50µL i wstępnej obróbki on-line, podczas której woda adsorbowana jest 

przez sorbent umieszczony w rurze wlotowej, a anality desorbowane są w temperaturze 150°C i 

przenoszone do kolumny chromatografu gazowego [70]. 

Porównanie powyżej opisanych metod oznaczania związków z grupy LZN techniką chromatografii 

gazowej z detektorami selektywnymi przedstawiono Tabeli 2. 

Tabela 2. Zestawienie metod analitycznych opartych na chromatografii gazowej z detektorami 

selektywnymi stosowanymi do oznaczania LZN. 

Table 2. A list of gas chromatographic methods with selective detectors for the determination of VNCs. 

Detektor 

(Detector) 

AFID - 

NPD 

SID 

CLND 

ECD 

Technika 

izolacji/ 

wzbogacania 

(Isolation/ 

enrichment 

technique) 

TD/SE 

Odczynnik 

upochadniający 

(Derivatizing 

reagent) 

Chlorek 

dimetylotiofosfonio 

wy 

PFBOC 

- TFECF 

HS-SPME - 

- - 

Oznaczane związki 

(Determinated 

compounds) 

Matryca próbki 

(Sample matrix) 

LOD 

Aminy, aminokwasy - 0,5 µg/L [33] 

Aminy krótkołańcuchowe 

(C2-C6) 

I i II-Rzędowe aminy 

alifatyczne 

Aminy krótkołańcuchowe 

(C1-C6) 

Trimetyloamina, 

Woda 

wodociągowa 


3. Zastosowanie chromatografii gazowej z detektorami uniwersalnymi 

(Application of gas chromatography with universal detectors) 

3.1. Detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID) 

(Flame Ionization Detector) 

Popularnym detektorem uniwersalnym wykorzystywanym w chromatografii gazowej do oznaczania 

związków zawierających w swej budowie wiązania C-H, jest detektor płomieniowo-jonizacyjny. W analityce 

lotnych związków azoto-organicznych jest stosowany przede wszystkim do oznaczania amin alifatycznych, 

aromatycznych oraz nitrowych związków aromatycznych, poprzez uprzednie przygotowanie próbki z 

zastosowaniem różnych technik ekstrakcyjnych. Dodatkowo, w celu zwiększenia czułości często stosuje się 

także odczynniki upochaniające w postaci: estru butylowego kwasu chloromrówkowego [71], oraz 

bezwodnika octowego [72]. 

Oznaczanie N-nitrozoamin w próbkach z wodną matrycą, techniką chromatografii gazowej z 

detektorem płomieniowo-jonizacyjnym w połączeniu z ekstrakcją SPE bez zastosowania upochadniania, nie 

zapewnia wystarczającej czułości [73]. Podczas wykorzystania tej samej techniki przygotowania próbki i 

oznaczeniu analitów techniką GC-FID otrzymuje się wartości LOD o 2 – 3 rzędy wielkości wyższe niż w 

przypadku detektora NPD [73]. Natomiast inne techniki ekstrakcji tj. ekstrakcja do pojedynczej kropli z fazy 

nadpowierzchniowej (HS-SDME) [74], ekstrakcja z ruchomym elementem sorpcyjnym (SBSE) [75] pozwala 

na oznaczenie amin alifatycznych dla których wartości LOD są rzędu µg/L. Metoda mikroekstrakcji cieczciecz 

wspomagana powietrzem (ang. Air-Assisted Liquid–Liquid Microextraction, AALLME) polegająca na 

jednoczesnej derywatyzacji oraz ekstrakcji poprzez zastosowanie szybkiej reakcji z estrem butylowym kwasu 

chloromrówkowego w środowisku zasadowym, z wytworzeniem pochodnych karbaminianowych, zapewnia 

niskie wartości LOD w zakresie 0,3 – 2,6 µg/L. Powstałe pochodne są stabilne termicznie, a cała procedura 

przygotowania próbki może być wykonana w ciągu 5 min [71]. 

Aromatyczne związki nitrowe tj. nitrobenzen, nitrotoluen, nitrofenol oraz ich pochodne mogą być z 

powodzeniem oznaczane w oparciu o różne typy ekstrakcji w połączeniu z techniką chromatografii gazowej 

z detekcją FID. Przykładem metody wymagającej najmniejszego nakładu czasu pracy jest jednorodna 

ekstrakcja ciecz-ciecz (HLLE), nazywana inaczej dyspersyjną mikroekstrakcją w układzie ciecz-ciecz 

(DLLME), w której wykorzystywane jest zjawisko rozdzielania faz w trójskładnikowym układzie 

rozpuszczalników tj. woda/metanol/chloroform [76] lub woda/acetonitryl/CCl 4 i woda/metanol/CCl 4 [77]. W 

każdym z układów otrzymuje się porównywalne wartości LOD rzędu µg/L. Bardziej czasochłonna metoda 

SPME-GC/FID, w której stosuje się nietrwałe, niepolarne włókna wykonane z polidimetylosiloksanu 

umożliwia oznaczanie nitrowych związków aromatycznych dla których wartości LOD wynoszą 9 – 15 µg/L 

[78]. Natomiast zmodyfikowana metoda polegająca na mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej w otwartej rurce 

(In-tube SPME) i GC-FID, pomimo zastosowania derywatyzacji nie wykazuje zadowalających wyników. W 

porównaniu z innymi związkami z grupy fenoli, dla nitrofenolu obserwuje się najniższą wydajność ekstrakcji. 

Poprawę efektywności ekstrakcji można uzyskać jedynie poprzez dodatek NaCl [72]. Procedura 

mikroekstrakcji z fazy nadpowierzchniowej (HSME), w której wykorzystuje się rozpuszczalniki w objętości µL 

zawieszone na końcu igły w porównaniu do standardowej procedury SDME, zapewnia niższe granice 

wykrywalności aromatycznych związków nitrowych w próbkach wody i ścieków [79-80]. 

3.2. Spektrometr mas (MS) 

(Mass Spectrometry) 

Popularnym detektorem stosowanym do oznaczania LZN w próbkach z wodną matrycą jest 

spektrometr mas, którego zasada działania polega na pomiarze stosunku masy do ładunku elektrycznego 

(m/z). Związki mogą być poddawane różnym typom jonizacji. Przykładowo, zastosowanie GC-MS w 

warunkach ujemnej jonizacji wychwytu elektronów (ang. Electron Capture Negative Ionization, ECNI) do 

detekcji nitrowych związków aromatycznych w ściekach, w porównaniu do metody opartej na jonizacji 

elektronowej (ang. Electron Ionization, EI) oraz oznaczania stosunków izotopowych (ang. Isotope Ratio 

Mass Spectrometry, IRMS), wykazuje znacznie wyższą selektywność i czułość względem wszystkich 

analitów. Ponadto zastosowanie EI w trybie selektywnego monitorowania jonów (ang. Single Ion Monitoring, 

SIM), stwarza wiele problemów na etapie identyfikacji związków, ze względu na występowanie licznych 

koelucji oraz dużych podobieństw w widmach masowych [81-83]. Pomimo tych niekorzystnych cech metoda 

EI w trybie SIM jest najpowszechniej wykorzystywanym układem do oznaczania nitrowych związków 

organicznych w próbkach z wodną matrycą. Chromatografię gazową z detektorem MS z jonizacją 

elektronową stosuje się w połączeniu z odpowiednią techniką ekstrakcji, m.in. SPE [81-82,84], SPME 

[81,83], dyspersyjna mikroekstrakcja w układzie ciecz-ciecz wspomagana promieniowanie mikrofalowym 

(DUSA-DLLME) [85],SDME [79,86], mikroekstrakcja przez membranę do fazy ciekłej (HF-LPME) [87]. 

Zastosowanie ekstrakcji do fazy stałej z konwecjonalnymi sorbentami typu C-18 nie przynoszą 

zadowalających rezultatów gdyż wykazują jedynie silne oddziaływania hydrofobowe. Znacznie wyższą 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


80 

selektywność uzyskuje się poprzez zastosowanie sorbentu w postaci żelu krzemionkowego związanego z 

fentotiazyną, ponieważ zapewnia zarówno oddziaływania hydrofobowe jak i wzajemne oddziaływania 

związane z przenoszeniem ładunku [84]. Dobre wyniki uzyskuje się także poprzez zastosowanie DLLME 

wspomaganej ultradźwiękami (ang. Direct Ultrasound-Assisted, DUSA). Wykorzystanie energii 

ultradźwięków do rozbijania fazy ekstrakcyjnej, eliminuje konieczność stosowania rozpuszczalników 

dyspergujących, które zwykle negatywnie wpływają na przenoszenie analitów z fazy wodnej do fazy 

ekstrakcyjnej [85]. Porównywalne wartości LOD uzyskuje się z zastosowaniem mikroekstrakcji poprzez 

membranę do fazy ciekłej (ang. Hollow Fibre Liquid Phase Microextraction, HF-LPME) oraz mikroekstrakcji 

do pojedynczej kropli. Przy czym SDME nie zapewnia zadowalających wartości współczynnika determinancji 

(r 2 ) oraz względnego odchylenia standardowego (RSD) [86-87]. 

Aminy alifatyczne z uwagi na brak charakterystycznych jonów muszą zostać poddane derywatyzacji 

przed analizą GC-MS. Typowymi odczynnikami upochadniającymi zapewniającymi selektywne wykrywanie 

amin są: chlorek benzosulfonylu [88], jod [89] oraz pentafluorobenzaldehyd (PFBAY) [91]. Odczynniki te 

umożliwiają otrzymanie pochodnych w przeciągu minuty. Otrzymane pochodne po zastosowaniu 

odpowiedniej techniki izolacji/wzbogacania mogą być oznaczane w stężeniach rzędu µg/L, w roztworach 

wodnych. 

W przypadku oznaczania amin aromatycznych ciekawym rozwiązaniem jest połączenie 

mikroekstrakcji z wytworzeniem emulsji za pomocą włókna (ang. Fiber-Assisted Emulsification 

Microextraction, FAEME) połączonej z GC-MS. Nowa technika ekstrakcji nie różni się znacząco od 

klasycznej DLLME, z wyjątkiem tego, że zamiast rozpuszczalnika dyspergującego, do wytworzenia emulsji 

stosuje się drobne włókna ciał stałych. Taka metoda nie tylko eliminuje konieczność stosowania 

dodatkowego rozpuszczalnika, a także umożliwia oznaczenie związków na jeszcze niższym poziomie stężeń 

[91]. 

Metoda GC-MS z jonizacją chemiczną w trybie selektywnego monitorowania jonów zapewnia niskie 

granice wykrywalności związków należących do grupy N-nitrozoamin w roztworach wodnych. Zastosowanie 

tandemowej spektrometrii mas (ang. Tandem mass spektrometry, MS/MS) jedynie nieznacznie obniża 

wartości LOD. Sprawdza się natomiast w przypadku oznaczania próbek o bardziej złożonym składzie 

matrycy tj. ścieki przemysłowe i komunale, ponieważ znacząco eliminuje wpływ matrycy [92]. Metoda oparta 

na zastosowaniu MS/MS jest zalecana przez US EPA do oznaczania N-nitrozoamin w próbkach wody pitnej 

[93]. Przy czym ta sama metoda w warunkach jonizacji elektronowej nie zapewnia wystarczającej czułości 

dla nitrozoamin występujących w śladowych ilościach [94]. Jonizacja EI, spełniała wymagane standardy 

wyłącznie w połączeniu z potrójnym kwadrupolem [95]. 

W tabeli 3 zostały porównane metody chromatografii gazowej z detektorami uniwersalnymi 

stosowanymi w analityce LZN wody i ścieków. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


Tabela 3. Zestawienie metod analitycznych opartych na chromatografii gazowej z detektorami 

selektywnymi stosowanymi do oznaczania LZN. 

Table 3. 

A list of gas chromatographic methods with universal detectors for the determination of VNCs. 

Detektor 

(Detector) 

FID 

MS 

MS/MS 

Technika 

izolacji/ 

wzbogacania 

(Isolation/ 

enrichment 

technique) 

Odczynnik 

upochadniający 

(Derivatizing reagent) 

Oznaczane 

związki 

(Determinated 

compounds) 

Matryca próbki 

(Sample matrix) 

SPE - N-Nitrozoaminy 

Woda 

wodociągowa, 

ścieki, woda z 

2,0 – 3,8 mg/L [73] 

rzeki, stawu 

Woda 

HS-SPME - 

wodociągowa, 2,5 – 25 µg/L [74] 

woda z rzeki 

SBME - Ścieki 10 – 50 ng/L [75] 

AALLME 

Ester butylowy kwasu 

chloromrówkowego 

Aminy alifatyczne 

LOD 

Woda 

wodociągowa, 

ścieki, woda z 

rzeki, 

0,3 – 2,6 µg/L [71] 

Woda, ścieki 0,09 – 0,1µg/L [76] 

HLLE - 

Nitrowe związki 

DLLME 0,09 – 0,5µg/L [77] 

aromatyczne 

SPME - Woda z jeziora 9 - 15 µg/L [78] 

In-tube-SPME Bezwodnik octowy 4-nitrofenol Woda - [72] 

HSME - 


aromatyczne 

Ścieki 0,02 – 0,06 µg/L [79] 

SDME - 

woda 0,09 – 0,11 µg/L [80] 

SPME, SPE - 

Ścieki 

0,1 – 0,44 ng/L [81] 

SPE - 30 – 270 ng/L [82] 

SPME - Woda 73 – 780 µg/L [83] 


Woda 

SPE - 

0,06 –0,3 µg/L [84] 

aromatyczne 

środowiskowa 

DUSA-DLLME - Ścieki 0,03-0,91 µg/L [85] 

Woda 

SDME - 

wodociągowa, 0,11-0,8 µg/L [86] 

podziemna 

Woda 

HF-LPME - 

wodociągowa, 0,3 –0,64 µg/L [87] 

podziemna 

LLE 

chlorek 

I i II – rzędowe 

benzenosulfonylu aminy alifatyczne 

Woda pitna 0,8 – 65,4 µg/L [88] 

HS-SPME Jod I - rzędowe aminy Woda 0,83 -1,23 µg/L [89] 

HS-SDME PFBAY 

Krótkołańcuchowe 

aminy alifatyczne 

Woda 0,6 – 1,1 µg/L [90] 

FAEME - 

Aminy 

aromatyczne 

Woda z rzeki 0,01 –0,2 µg/L [91] 

SPE 

N-nitrozoaminy 

Woda pitna, 

woda z basenu 

1 – 2 ng/L [92] 

SPE - N-nitrozoaminy Woda pitna 0,1 - 1,7 ng/L [94] 

SPE - N-nitrozoaminy 

Woda pitna, 

ścieki 

0,4 – 4,0 ng/L [95] 

Literatura 

(Literature) 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


82 

4. Wnioski końcowe 

(Conclusions) 

Aktualnie istnieje wiele różnorodnych metod opartych na technice chromatografii gazowej 

stosowanych w analityce lotnych związków azoto-organicznych w wodnych roztworach. W każdej z tych 

metod konieczne jest zastosowanie odpowiednich technik izolacji lub/i wzbogacania analitów, w celu 

zwiększenia ich czułości. Spośród dostępnych detektorów najpowszechniej wykorzystywanym i 

wykazującym największy potencjał do różnorodnych zastosowań jest spektrometr mas. Dużą zaletą tego 

typu detektorów jest możliwość oznaczenia związków dla których uprzednio wykonano kalibrację oraz 

wykrycie pozostałych związków obecnych w próbce na podstawie obszernych bibliotek widm. Jednak w 

przypadku związków tj. aminy alifatyczne, które nie posiadają charakterystycznych jonów, analiza GC-MS 

jest utrudniona i wymaga zastosowana odpowiedniego odczynnika do derywatyzacji. Aminy alifatyczne 

mogą być z powodzeniem oznaczane także z zastosowaniem detektorów selektywnych tj. azotowofosforowy 

(NPD) lub powierzchniowej jonizacji (SID). W przypadku nitrozoamin jedynym detektorem 

spełniającym rygorystyczne warunki jest spektrometr mas oraz tandemowy spektrometr mas, który 

sprawdza się w szczególności w analityce wody, ponieważ znacząco eliminuje negatywny wpływ matrycy, 

przez co stwarza możliwość oznaczenia analitów na niskich poziomach stężeń. Detektory typu NPD i CLND 

mogą być stosowane jedynie w analityce ścieków, gdyż w nich dopuszczalne stężenie nitrozoamin jest 

znacznie wyższe. Metodyki oparte na wykorzystaniu detektora płomieniowo jonizacyjnego nie zapewnia 

wystarczającej czułości. Najniższe wartości granicy wykrywalności rzędu ng/L dla nitrowych związków 

aromatycznych w próbkach wody i ścieków zapewnia technika GC-ECD. Pozostałe opisane metody 

pozwalają na oznaczenie tych związków w stężeniach µg/L. 

5. Literatura 

(Literature) 

1. US EPA Compendium of methods for the determination of toxic organic compounds in ambient air, 

method TO-14, EPA-600/4-84-041, US Environmental Procetion Agency, Research Tringle Park, NC, 

1984. 

2. Suez Environment, Internal report, 2007 

3. MOE. (2000). Ontario Ministry of the Environment and Energy. Regulation Made Under the Ontario 

Water Resources. Act: Drinking Water Protection—Larger Water Works. 

4. DHS. (2002). California Department of Health Services; NDMA in California Drinking Water; 

5. Water Quality Standards, Establishment of Numeric Criteria for Priority Toxic Pollutants, States 

Compliance. Fed. Regist. 246 (1992) 60848. 

6. V.Y. Taguchi, S.W.D. Jenkins, D.T. Wang, J.F.P. Palmentier, E.J. Reiner, Determination of N- 

nitrosodimethylamine by isotope dilution, high-resolution mass spectrometry, Can. J. Appl. Spectrosc. 

39 (1994) 87. 

7. M. Ulman, Z. Chilmonczyk, Volatile Organic Compounds-components, sources, determination. A 

review., Chem. Anal. 52 (2007) 173. 

8. B. Zielinska, Atmospheric transformation of diesel emissions, Exp. Toxicol. Pathol., 57 (2005) 31. 

9. G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, New Procedures for Control of Industrial Effluents Treatment 

Processes. Ind Eng Chem Res. 53 (2014) 1503. 


from hot road bitumens. Chemosphere 104 (2014) 23. 

11. G. Boczkaj, M. Jaszczołt, M. Kamiński, Badania emisji lotnych związków organicznych z asfaltów 

drogowych z wykorzystaniem techniki dynamicznej analizy fazy nadpowierzchniowej i chromatografii 

gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (DHS - GC - MS), Cam. Sep. 3 (2011) 35. 

12. K. Lissitsyna, S. Huertas, L.C. Quintero, L.M. Polo, Novel simple method for quantitation of nitrogen 

compounds in middle distillates using solid phase extraction and comprehensive two-dimensional gas 

chromatography, Fuel 104 (2013) 752. 

13. T. Dijkmans, M.R. Djokic, K.M. Van Geem, G.B. Marin, Comprehensive compositional analysis of sulfur 

and nitrogen containing compounds in shale oil using GC, GC–FID/SCD/NCD/TOF-MS, Fuel 140 

(2015) 398. 

14. A. Zhanga, Y. Li, Y. Songa, J. Lva, J. Yang, Characterization of pharmaceuticals and personal care 

products as N-nitrosodimethylamine precursors during disinfection processes using free chlorine and 

chlorine dioxide, J. Hazard. Mater. 276 (2014) 499. 

15. W.A. Mitch, A.C. Gerecke, D.L. Sedlak, A N-Nitrosodimethylamine (NDMA) precursor analysis for 

chlorination of water and wastewater, Water Res. 37 (2003) 3733. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


16. S.H. Park, L.P. Padhye, P. Wang, M. Cho, J.H. Kim, C.H. Huang, N-nitrosodimethylamine (NDMA) 

formation potential of amine-based water treatment polymers: Effects of in situ chloramination, 

breakpoint chlorination, and pre-oxidation, J. Hazard. Mater. 282 (2015) 133. 

17. G. Boczkaj, M. Kamiński, Zastosowanie chromatografii gazowej z detektorami selektywnymi w analityce 

lotnych związków siarki i azotu, Cam. Sep. 3 (2011) 51. 

18. E. Pehlivanoglu-Mantas, D.L. Sedlak, Measurement of dissolved organic nitrogen forms in wastewater 

effluents: Concentrations, size distribution and NDMA formation potential, Water Res. 42 (2008) 3890. 

19. M. Lee, Y. Lee, F. Soltermann, U. von Gunten, Analysis of N-nitrosamines and other 

nitro(so)compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV 

photolysis/Griess reaction, Water Res. 47 (2013) 4893. 

20. E. Pehlivanoglu-Mantas, D.L. Sedlak, Measurement of dissolved organic nitrogen forms in wastewater 

effluents: Concentrations, size distribution and NDMA formation potential, Water Res. 42 (2008) 3890– 

3898. 

21. Y. Suna, L. Lianga, X. Zhaoa, L. Yua, J. Zhanga, G. Shib, T. Zhou, Determination of aromatic amines in 

water samples by capillary electrophoresis with amperometric detection, Water Res. 43 (2009) 41. 

22. S. Mishra, V. Singh, A. Jain, K.K. Verma, Simultaneous determination of ammonia, aliphatic amines, 

aromatic amines and phenols at μg l -1 levels in environmental waters by solid-phase extraction of their 

benzoyl derivatives and gas chromatography-mass spectrometry, Analyst 126 (2001) 1663. 

23. L. Cai, Y. Zhao, S. Gong, L. Dong, C. Wu, Use of a Novel Sol-Gel Dibenzo-18-Crown-6 Solid-Phase 

Microextraction Fiber and a New Derivatizing Reagent for Determination of Aliphatic Amines in Lake 

Water and Human Urine, Chromatographia 58 (2003) 615. 

24. A. Karmen, L. Giuffrida, Enhancement of the response of the hydrogen flame ionization detector to 

compounds containing halogens and phosphorus, Nature 201 (1964) 1204. 

25. W.A. Aue, C.W. Gehrke, R.C. Tmdle, D.L. Stalling, C.D. Ruyle, Application of the Alkali-Flame Detector 

to Nitrogen Containing Compounds, J. Gas Chromarogr. 5 (1967) 381. 

26. E. D. Conte, Eugene F. Barry, Alkali flame ionization detector for gas chromatography using an alkali 

salt aerosol a the enhancement source, J.Chromatogr. A 644 (1993) 349. 

27. B. Kolb, J. Bischoff, A New Design of a Thermionic Nitrogen and Phosphorus Detector for GC, J. 

Chrom. Sci. 12 (1974) 625. 

28. C.A. Burgett, D.H. Smith, H.B. Bente, The Nitrogen-Phosphorus Detector and Its Applications in Gas 

Chromatography., J. Chromatogr. 134 (1977) 57. 

29. H. Snijders, H-G. Janssen, C. Cramers, Design and optimization of a novel type nitrogen-phosphorus 

detector for capillary gas chromatography, J. Chromatogr. A 732 (1996) 51. 

30. H. Kataoka, Gas chromatography of amines as various derivatives, J. Chromatogr. Lib. 70 (2005) 364. 

31. H. Kataoka, Derivatization reactions for the determination of amines by gas chromatography and their 

applications in environmental analysis, J. Chromatogr. A 733 (1996) 19. 

32. E. Baltussen, F. David, P. Sandra, H-G. Janssen, C. Cramers, C, Capillary GC determination of amines 

in aqueous samples using sorptive preconcentration on polydimethylsiloxane and polyacrylate phases, 

J. High Resolut. Chromatogr. 21 (1998) 645. 

33. K. Jacob, C. Falkner, W. Vogt, Derivatization method for the high-sensitive determination of amines and 

amino acids as dimethylthiophosphinic amides with the alkali flame-ionization detector, J. Chromatogr. 

A 167 (1978) 67. 

34. M. Dalene, G. Skarping, H. Tinnerberg, Biological monitoring of hexamethylene diisocyanate by 

determination of 1,6-hexamethylene diamine as the trifluoroethyl chloroformate derivative using capillary 

gas chromatography with thermoionic and selective-ion monitoring, J. Chromatogr. B 656 (1994) 319. 

35. M. Ábalos, J.M. Bayona, F. Ventura, Development of a solid-phase microextraction GC-NPD procedure 

for the determination of free volatile amines in wastewater and sewage-polluted waters, Anal. Chem. 71 

(1999) 3531. 

36. Y. Hwang, T. Matsuo, K. Hanaki, N. Suzuki, Identification and quantification of sulfur and nitrogen 

containing compounds in wastewater, Wat. Res. 29 (1995) 711. 

37. C. Maris , A. Laplanche , J. Morvan , M. Bloquel, Static headspace analysis of aliphatic amines in 

aqueous samples, J. Chromatogr. A 846 (1999) 331. 

38. M.K. Abdul-Rashid, J.P. Riley, M.F. Fitzsimons, G.A. Wolff, Determination of volatile amines in sediment 

and water samples, Anal. Chim. Acta 252 (1991) 223. 

39. Method 607, Nitrosamines. Code of Federal Regulations: Protection of the Environment, Part 136, Title 

40, US GPO: Washington, DC, 1982. 

40. California Department of Health Services: Drinking Water Notification Levels and Response Levels. 

41. J.E. Grebel, I.H. Suffet, Nitrogen–phosphorus detection and nitrogen chemiluminescence detection of 

volatile nitrosamines in water matrices: Optimization and performance comparison, J. Chromatogr. A 

1175 (2007) 141. 

42. J. E. Grebel, C.C. Young, I.H. Suffet, Solid-phase microextraction of N-nitrosamines, J. Chromatogr. A 

1117 (2006) 11. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


84 

43. U.Kh. Rasulev, U. Khasanov, V.V. Palitcin, Surface-ionization methods and devices of indication and 

identification of nitrogen-containing base molecules, J. Chromatogr. A 896 (2000) 3. 

44. T. Fujii, High-performance emitters for use in a surface ionization detector for gas chromatography, J. 

Chromatogr. A 355 (1986) 375. 

45. H. Kishi, T. Fujii, G. Sato, Surface ionization detector with a supersonic free jet for gas chromatography 

some applications, J. Chromatogr. A 750 (1996) 335. 

46. B. Kolb, M. Auer, P. Pospisil, Reaction mechanism In an ionization detector with tunable selectivity for 

carbon, nitro gen and phosphorus, J. Chromatogr. Sci. 15 (1977) 53. 

47. H. Kishi, T. Fujii, A Surface Ionization Detector for Gas Chromatography: Use of a Supersonic Free Jet, 

Anal. Chem. 68 (1996) 2776. 

48. E. Ya. Zandberg, A. G. Kamenev, V. I. Paleev, U. K. Rasulev, Visokochuvstvitelny detector aminov i ikh 

proizvodnikh, Zhurnal Analyticheskoy Khimii 35 (1980) 1188. 

49. W. Li, D. Wu, S. Chen, H. Peng, Y. Guan, Study of the surface ionization detector for gas 

chromatography, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 6812. 

50. K. Watanabe, H. Hattori, M. Nishikawa, A. Ishii, T. Kumazawa, H. Seno, O. Suzuki, Simultaneous 

determination of cocaethylene and cocaine in blood by gas chromatography with surface ionization 

detection, Chromatographia 44 (1997) 55. 

51. H. Hattori, T. Yamada, O. Suzukib, Gas chromatography with surface ionization detection in forensic 

analysis, J. Chromatogr. A 674 (1994) 15. 

52. S. Takahashi, F. Nagamura, M. Sasaki, T. Fujii, Gas chromatography with surface ionization detection 

of nitro pesticides, Chem. Pap. 63 (2009) 613. 

53. U.Kh. Rasulev, E.G. Nazarov, G.B. Khudaeva, Chromatographic determination of trace amounts of 

amines using a surface ionization detector, J. Chromatogr. A 704 (1995) 473. 

54. T. Fujii, Surface ionization organic mass spectrometry: applications in gas chromatography, Eur. J. 

Mass Spectrom. 2 (1996) 263. 

55. J.C. Greaves, D. Garvin, Chemically induced molecular excitation: excitation spectrum of the nitric 

oxide-ozone system. J. Chem. Phys. 30 (1959) 348. 

56. D.H. Fine, D. Lieb, F. Rufeh, Principle of operation of the thermal energy analyzer for the trace analysis 

of volatile and non-volatile N-nitroso compounds, J. Chromatogr. A 107 (1975) 351. 

57. B.A. Tomkin, W.H. Griest, C.E. Higgins, Determination of N-nitrosodimethylamine at part-per-trillion 

levels in drinking waters and contaminated groundwaters, Anal. Chem. 67 (1995) 4387. 

58. B.A. Tomkins, W.H. Griest, Determinations of N-nitrosodimethylamine at part-per-trillion concentrations 

in contaminated groundwaters and drinking waters featuring carbon-based membrane extraction disks, 

Anal. Chem. 68 (1996) 2533. 

59. M. Alber, H. B. Bohm, J. Brodesser, J. Feltes, K. Levsen, H. F. Scholer, Determination of nitrophenols in 

rain and snow, Fresenius Z Anal Chem 334 (1989) 540. 

60. K. Blau, J.M. Halket (Eds.), Handbook of Derivatives for Chromatography, Wiley, Chichester, 1993. 

61. T.C. Schmidt , M. Less , R. Haas , E. von Low, K. Steinbach , G. Stork, Gas chromatographic 

determination of aromatic amines in water samples after solid-phase extraction and derivatization with 

iodine, I. Derivatization. J. Chromatogr. A 810 (1998) 161. 

62. M. Less , T.C. Schmidt , E. von Low , G. Stork, Gas chromatographic determination of aromatic amines 

in water samples after solid-phase extraction and derivatization with iodine, II. Enrichment, J. 

Chromatogr. A 810 (1998) 173. 

63. R. Haas, T. C. Schmidt, K. Steinbach, E. von Low, Derivatization of aromatic amines for analysis in 

ammunition wastewater, II: Derivatization of methyl anilines by iodination with a Sandmeyer-like 

reaction, Fresenius J. Anal. Chem. 359 (1997) 497. 

64. T.C. Schmidt, R. Haas, K. Steinbach, E. von Low, Derivatization of aromatic amines for analysis in 

ammunition wastewater, I. Derivatization via bromination of the aromatic ring, Fresenius J. Anal. Chem. 

357 (1997) 909. 

65. I. V. Gruzdeva, M. V. Alferovab, B. M. Kondratenoka, I. G. Zenkevich, Quantification of Chloroanilines in 

Drinking Water by Gas Chromatography as Bromo Derivatives, J. Anal. Chem. 66 (2011) 955. 

66. S. Calderara, D. Gardebas, F. Martinez, Solid phase micro extraction coupled with on-column GC/ECD 

for the post-blast analysis of organic explosives, Forensic Sci. Int. 137 (2003) 6. 

67. X. Li, J. Chen, L. Du, Analysis of chloro- and nitrobenzenes in water by a simple polyaniline-based solidphase 

microextraction coupled with gas chromatography, J. Chromatogr. A 1140 (2007) 21. 

68. W. Guan, F. Xu, W. Liu, J. Zhao, Y. Guan, A new poly(phthalazine ether sulphone ketone)-coated fiber 

for solid-phase microextraction to determine nitroaromatic explosives in aqueous samples, J. 

Chromatogr. A 1147 (2007) 59. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


69. Y. Huang, Y-C. Yang, Y. Yuen Shu, Analysis of semi-volatile organic compounds in aqueous samples 

by microwave-assisted headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography– 

electron capture detection, J. Chromatogr. A 1140 (2007) 35. 

70. B. Yu, Y. Song, L. Han, H. Yu, Y. Liu, H. Liu, Optimizations of packed sorbent and inlet temperature for 

large volume-direct aqueous injection-gas chromatography to determine high boiling volatile organic 

compounds in water, J. Chromatogr. A 1356 (2014) 221. 

71. M.A. Farajzadeh, N. Nouri, Simultaneous derivatization and air-assisted liquid–liquid microextraction of 

some aliphatic amines in different aqueous samples followed by gas chromatography-flame ionization 

detection, Anal. Chim. Acta 775 (2013) 50. 

72. J. Olejniczak, J. Staniewski, Enrichment of phenols from water with in-situ derivatization by in-tube solid 

phase microextraction–solvent desorption prior to off-line gas chromatographic determination with largevolume 

injection, Anal. Chim. Acta 588 (2007) 64. 

73. B. Jurado-Sanchez, E. Ballesteros, M. Gallego, Comparison of the sensitivities of seven N-nitrosamines 

in pre-screened waters using an automated preconcentration system and gas chromatography with 

different detectors, J. Chromatogr., A 1154 (2007) 66. 

74. M. Kaykhaiia, S. Nazari, M. Chamsaz, Determination of aliphatic amines in water by gas 

chromatography using headspace solvent microextraction, Talanta 65 (2005) 223. 

75. F. Kamarei, H. Ebrahimzadeha, Y. Yamini, Optimization of solvent bar microextraction combined with 

gas chromatography for the analysis of aliphatic amines in water samples, J. Hazard. Mater. 178 (2010) 

747. 

76. H. Ebrahimzadeh, Y. Yamini ,F. Kamarei, S. Shariati, Homogeneous liquid–liquid extraction of trace 

amounts of mononitrotoluenes from waste water samples, Anal. Chim. Acta 594 (2007) 93. 

77. H. Ebrahimzadeha, Y. Yamini, F. Kamarei, Optimization of dispersive liquid–liquid microextraction 

combined with gas chromatography for the analysis of nitroaromatic compounds in water, Talanta 79 

(2009) 1472. 

78. J-Y. Horng, S-D. Huang, Determination of the semi-volatile compounds nitrobenzene, isophorone, 2,4- 

dinitrotoluene and 2,6-dinitrotoluene in water using solid-phase microextraction with a 

polydimethylsiloxane- coated fibre, J. Chromatogr. A 678 (1994) 313. 

79. H. Ebrahimzadeh, Y. Yamini, F. Kamarei, M. Khalili-Zanjan, Application of headspace solvent 

microextraction to the analysis of mononitrotoluenes in waste water samples, Talanta 72 (2007) 193. 

80. E. Psillakis, N. Kalogerakis, Application of solvent microextraction to the analysis of nitroaromatic 

explosives in water samples, J. Chromatogr. A 907 (2001) 211. 

81. S. Jonsson, L. Gustavsson, B. van Bavel, Analysis of nitroaromatic compounds in complex samples 

using solid-phase microextraction and isotope dilution quantification gas chromatography–electroncapture 

negative ionisation mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1164 (2007) 65. 

82. US Environmental Protection Agency, Method 3535A SW-846, Solid-Phase Extraction (SPE), Office of 

Solid Waste, Washington, DC, 1998. 

83. M. Berg, J. Bolotin, T.B. Hofstetter, Compound-specific nitrogen and carbon isotope analysis of 

nitroaromatic compounds in aqueous samples using solid-phase microextraction coupled to GC/IRMS, 

Anal. Chem. 79 (2007) 2386. 

84. X-T. Peng, X. Zhao, Y-Q. Feng, Preparation of phenothiazine bonded silica gel as sorbents of solid 

phase extraction and their application for determination of nitrobenzene compounds in environmental 

water by gas chromatography–mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 9314. 

85. C. Cortadaa, L. Vidal, A. Canals, Determination of nitroaromatic explosives in water samples by direct 

ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction followed by gas chromatography–mass 

spectrometry, Talanta 85 (2011) 2546. 

86. E. Psillakis, N. Kalogerakis, Application of solvent microextraction to the analysis of nitroaromatic 

explosives in water samples, J. Chromatogr. A 907 (2001) 211. 

87. E. Psillakis, D. Mantzavinos, N. Kalogerakis, Development of a hollow fibre liquid phase microextraction 

method to monitor the sonochemical degradation of explosives in water, Anal. Chim. Acta 501 (2004) 3. 

88. H. Zhang, S. Ren, J. Yu, M. Yang, Occurrence of selected aliphatic amines in source water of major 

cities in China, J. Environ. Sci. 24 (2012) 1885. 

89. L. Rubio, S. Sanllorente, L.A. Sarabia, M.C. Ortiz, Optimization of a headspace solid-phase 

microextraction and gas chromatography/mass spectrometry procedure for the determination of 

aromatic amines in water and in polyamide spoons, Chemometr. Intell. Lab. 133 (2014) 121. 

90. C. Deng, N. Li, L. Wang, X. Zhang, Development of gas chromatography–mass spectrometry following 

headspace single-drop microextraction and simultaneous derivatization for fast determination of shortchain 

aliphatic amines in water samples, J. Chromatogr. A 1131 (2006) 45. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


86 

91. W. Fenga, R. Jianga, B. Chena, G. Ouyang, Fiber-assisted emulsification microextraction coupled with 

gas chromatography–mass spectrometry for the determination of aromatic amines in aqueous samples, 

J. Chromatogr. A 1361 (2014) 16. 

92. R. Pozzi, P. Bocchini, F. Pinelli, G.C. Galletti, Determination of nitrosamines in water by gas 

chromatography/chemical ionization/selective ion trapping mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1218 

(2011) 1808. 

93. J.W. Munch, M.V. Bassett, In, National Exposure Research Laboratory, Office of Research and 

Development, US EPA., Cincinnati, Ohio, 2004. 

94. J.W. Munch, M.V. Bassett, Method development for the analysis of N-nitrosodimethylamine and other 

N-nitrosamines in drinking water at low nanogram/liter concentrations using solid-phase extraction and 

gas chromatography with chemical ionization tandem mass spectrometry, J. AOAC Int. 89 (2006) 486. 

95. J.A. McDonald, N. B. Harden, L. D. Nghiem, S.J. Khan, Analysis of N-nitrosamines in water by isotope 

dilution gas chromatography–electron ionisation tandem mass spectrometry, Talanta 99 (2012) 146. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


Volume 6, Number 2/ December 2014, pp. 87-105 

Grzegorz BOCZKAJ *,1 , Anna FOKT, Malwina MOMOTKO 1 , Marian KAMIŃSKI 1 

1 Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, 


Zastosowania chromatografii wykluczania (SEC) w analityce technicznej 

i preparatyce – część I-sza. 

Streszczenie: W pracy scharakteryzowano założenia teoretyczne oraz mechanizm rozdzielania w warunkach 

chromatografii wykluczania (SEC). Przeanalizowano wady i zalety tej techniki rozdzielania. Przedstawiono przegląd 

zastosowań obejmujący wykorzystanie SEC w analityce technicznej oraz w preparatyce. SEC w warunkach liofilowych 

znajduje zastosowanie do rozdzielania mieszanin polimerów t.j. polistyren, polibutadien, poliizopren, 

poli(dimetylosiloksan), poliamidy(np. nylon 6), poliakrylonitryl, poliolefiny, poli(alkohol winylowy), polichlorek winylu. W 

warunkach niewodnych rozdzieleniu ulegają także substancje nisko-, średnio- i wysokocząsteczkowe, takie ropa 

naftowa, oleje, asfalty, smoły, żywice. Główne zastosowania dla mieszanin substancji niskocząsteczkowych to 

rozdzielanie sacharydów, tłuszczów (grupowo na TAG, DAG, MAG i WKT), środków powierzchniowo czynnych, 

dodatków w polimerach, antybiotyków, węglowodorów aromatycznych. W warunkach hydrofilowych rozdzielaniu ulegają 

bardzo polarne polimery, biopolimery polisacharydy, białka, nukleotydy, czasami także w połączeniach z substancjami 

chemicznymi o niższej polarności, rozpuszczalnymi w wodzie. W drugiej części pracy opisane zostaną specyficzne 

zastosowania SEC w rozdzielaniu wielowymiarowym oraz preparatyce. 

Słowa kluczowe: chromatografia wykluczania, chromatografia żelowa, zastosowanie chromatografii, asfalteny, rozkład 

masy cząsteczkowej 

Applications of Size Exclusion Chromatography (SEC) in technical analytics and 

preparative scale separations – I-st part. 

Abstract: The paper describe the theoretical basis and the separation mechanism in size exclusion chromatography 

(SEC). Advantages and disadvantages of the process are highlighted. This work contain a review of applications in 

technical analytics and preparative separations. SEC in lipophilic conditions is used for separation of polymer mixtures 

including polystyrene, polybutadiene, polyisoprene, poly (dimethylsiloxane), polyamides (eg. nylon 6), polyacrylonitrile, 

polyolefins, poly (vinyl alcohol), polyvinyl chloride. In non-aqueous conditions also other mixtures can be separated 

including low-, medium- and high-molecular components such as crude oil, oils, bitumen, tar, resins. Main applications 

regarding to low-molecular substances include separations of saccharides, fats (group-type separation as TAG, DAG, 

MAG and FFA), surfactants, polymer additives, antibiotics, aromatic hydrocarbons. In hydrophilic SEC conditions a 

mixtures containing polar polymers, biopolymers as polysaccharides, proteins, nucleotides sometimes also with 

connection with other low polarity chemical substances soluble in water. The second part of this paper will include a 

specific applications of SEC in multidimentional and preparative separations. 

Key words: size exclusion chromatography, gel permeation chromatography, application of chromatography, 

asphaltene, molecular weight distribution 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

Zastosowania chromatografii wykluczania (SEC)… 

88 

Użyte skróty/ Used Abbreviations 

Oznaczenie/skrót nazwa polska nazwa angielska 

Å Angstrem Angstrem 

ASTM 

Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i 

Materiałów 

American Society for Testing and 

Materials 

ACN Acetonitryl Acetonitrile 

BHT 2,6-ditert-butylo-4-hydroksytoluen 2,6-ditert-butylo-4-hydroksytoluene 

DVB Diwinylobenznen Divinylbenzene 

DAG Diacyloglicerole Diacylglycerols 

GFC Chromatografia sączenia molekularnego Gel Filtration Chromatography 

DMF Dimetyloforamid Dimethylformamide 

DMSO sulfotlenek dimetylu Dimethyl sulfoxide 

DVB Diwinylobenznen Divinylbenzene 

GPC Chromatografia żelowa Gel Permeation Chromatography 

M Masa molowa Molecular Mass 

HFIP Heksafluoroizopropanol Hexafluoroisopropanol 

HPMCP Ftalan hydroksypropylometylocelulozy hydroxypropylmethylcellulose 

phthalate 

HPLC Wysokosprawna chromatografia cieczowa High Performance Liquid 

Chromatography 

HPSEC Wysokosprawna chromatografia High Performance Size Exclusion 

wykluczania 

Chromatography 

IR Podczerwień Infrared 

LALLSD 

Laserowy detektor światła rozproszonego 

dokonujący pomiaru pod małą ilością kątów 

Low Angle Laser Light Scattering 

Detector 

LC Chromatografia cieczowa Liquid Chromatography 

LMWH Heparyny o niskiej masie cząsteczkowej Low Molecular Weight Heparins 

LLSD Laserowy detektor światła rozproszonego Laser Light Scattering Detector 

mAb Przeciwciała monoklonalne Monoclonal Antibodies 

MAG Monoacyloglicerole Monoacylglycerol 

MALLSD- 

Laserowy detektor światła rozproszonego 

dokonujący pomiaru pod wieloma kątami 

Multi Angle Laser Light Scattering 

Detector 

Mm Masa molowa Molecular Mass 

Mn Liczbowo średnia masa cząsteczkowa Number-Average Molecular Weight 

Mw Wagowy średni ciężar cząsteczkowy Weight-Average Molecular Weight 

NMP N-metylopirolidon N-methylpyrrolidone 

PDI Wskaźnik polidyspersyjności Polydispersity index 

PEG Glikol polietylenowy Polyethylene glycol 

PEO Tlenek polietylenu Polyethylene oxide 

PVP Poliwinylopirolidonu Polyvinylpyrrolidone, 

RI (RID) Detektor refraktometryczny Refractive Index Detector 

SEC Chromatografia wykluczania Size Exclusion Chromatography 

TAG Triacyloglicerole Triacylglycerols 

TCB 1,2,4-trichlorobenzen 1,2,4-trichlorobenzene 

THF- Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran 

TMS Trimetylosilil Trimethylsilyl 

UV Ultrafiolet Ultraviolet 

WKT Wyższe kwasy tłuszczowe Higher fatty acids 

1. WSTĘP 


Techniki rozdzielania we współczesnej analityce technicznej stanowią podstawowe źródło identyfikacji 

związków chemicznych. Zapewniają rozdzielenie i izolację substancji chemicznych w postaci czystej z ich 

mieszanin. W połączeniu z odpowiednią metodą detekcji umożliwiają charakterystykę mieszaniny pod 

względem ilościowym i jakościowym. Techniki wykorzystywane do rozdzielania wykorzystuje się także w 

preparatyce. Preparatyka polega na wydzielaniu większych ilości frakcji zawierających wybrane związki. W 

przypadku technik preparatywnych i analitycznych mechanizm rozdzielania przebiega w identyczny sposób, 

różnice wynikają ze skali rozdzielania tzn. rozmiarów kolumny, wielkości przepływów oraz ilości i stężenia 

dozowanej mieszaniny. W wyniku pojedynczej analizy chromatograficznej można uzyskać informacje na 

temat składu i właściwości danej próbki. Stosując chromatografię cieczową można dokonać analizy około 

80% znanych związków chemicznych [1]. 

Chromatografia wykluczania to jedna z odmian chromatografii cieczowej. Charakteryzuje się szerokim 

zastosowaniem w analizie i preparatyce związków wielkocząsteczkowych. Jest jedną ze starszych technik 

analitycznych, w której w dalszym ciągu ma miejsce intensywny rozwój. Technikę tą charakteryzuje szeroki 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

89 G. Boczkaj, A. Fokt, M. Momotko, M. Kamiński 

zakres zastosowań. Umożliwia wyznaczenie masy cząsteczkowej oraz jej rozkładu, często niezbędnej 

informacji do poznania właściwości fizykochemicznych polimerów oraz biopolimerów. Dzięki tej technice, 

można oznaczyć również dodatki uszlachetniające oraz zanieczyszczenia występujące w polimerach, 

olejach, tłuszczach, żywności i kosmetykach. W skali preparatywnej umożliwia otrzymywanie frakcji 

polimerów i biopolimerów m.in. z materiałów biologicznych, biochemicznych, mikrobiologicznych, a także 

przygotowanie próbek do badań. Reasumując wymienione zastosowania technika ta jest niezbędna w wielu 

branżach przemysłowych takich jak przemysł farmaceutyczny, spożywczy, tworzyw sztucznych [2]. 

Celem niniejszej pracy jest przybliżenie zasady rozdzielania, techniką chromatografii wykluczania. 

Przegląd zastosowań ma wykazać, jak ważną rolę w analityce i preparatyce pełni ta technika. W pracy 

opisano sposób postępowania w przypadku podstawowych analiz wykonywanych opisywaną techniką. 

2. Chromatografia wykluczania (SEC) 

Size Exclusion Chromatography (SEC) 

2.1. Wprowadzenie 


Podstawowym celem i zastosowaniem chromatografii wykluczania (ang. Size Exclusion 

Chromatography, SEC) jest zapewnienie informacji dla konkretnego materiału polimerowego dotyczącej 

rozkładu masy molekularnej. Cząsteczki można rozdzielić względem masy cząsteczkowej, ponieważ średni 

czas przebywania danej cząsteczki (zależny od współczynnika dyfuzji) w porach zależy od jej wielkości. 

Nazwa SEC jest aktualnie głównie stosowaną dla tej techniki oraz będzie używana w tej pracy. Znane 

jest także określenie dawniej stosowane - chromatografia żelowa (ang. Gel permeation chromatography, 

GPC). Kolejnym określeniem opisywanej techniki chromatograficznej jest chromatografia sączenia 

molekularnego (Gel Filtration Chromatography, GFC). Pojęcie "żel" powszechnie kojarzy się z użyciem 

sztywnych lub półsztywnych żeli organicznych jako fazy stacjonarnej. W chromatografii wykluczania dotyczy 

to zarówno żeli organicznych jak i związków nieorganicznych. W praktyce, powyższe sposoby nazywania 

tej techniki stosowane są do dnia dzisiejszego zamiennie [3]. 

SEC jest jedną z ważniejszych technik rozdzielania. Powszechnie stosuje się ją do charakteryzowania 

polimerów. Chromatografia wykluczania prawie całkowicie zastępuje tradycyjne metody określania masy 

cząsteczkowej, takie jak osmometria, ultrawirowanie, a pomiar wiskozymetryczny i refraktometryczny 

prowadzone są głównie w połączeniu z tą techniką. Zalety SEC obejmują względną prostotę, uniwersalność 

oraz zdolność do określenia całkowitego rozkładu masy cząsteczkowej. Chromatografia wykluczania 

odgrywa ważną rolę w rozdzieleniu i charakteryzowaniu białek i polimerów. Technika ta w połączeniu z 

odpowiednia detekcją umożliwia stosunkowo szybką analizę [4]. 

2.2. Charakterystyka techniki chromatografii wykluczania 

(Description of Size Exclusion Chromatography) 

2.2.1. Założenia teoretyczne i opis zjawisk w SEC 

(Teoretical Assumption and SEC phenomena description) 

W warunkach chromatografii wykluczania wykorzystuje się zróżnicowanie drogi i czasu dyfuzji 

podczas, którego przez pory przenikają cząsteczki o zróżnicowanej wielkości i masie cząsteczkowej. 

Przepływają one przez pory, które znajdują się wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny. Ważne jest, aby 

wyeliminować oddziaływania sorpcyjne między powierzchnią wypełnienia kolumny i cząsteczkami 

rozdzielanych substancji, tak by mechanizm rozdzielania był termodynamicznie prosty. Warunki SEC 

umożliwiają powiązanie wartości logarytmu masy cząsteczkowej rozdzielanych cząsteczek z objętością elucji 

z kolumny w postaci prostej korelacji liniowej [5]. Kolumny są wypełnione cząsteczkami z tworzywa 

porowatego, ziarna wypełnienia mają średnicę ok. 5 do 10 mikrometrów. Do wnętrza porów mogą 

dyfundować cząsteczki badane i cząsteczki eluentu. Faza ruchoma wypełnia pory i przestrzeń między nimi. 

Próbka wstrzykiwana jest w postaci rozcieńczonego roztworu w tym samym rozpuszczalniku, który stanowi 

fazę ruchomą. Cząsteczki są wymywane w kierunku wylotu kolumny wraz z eluentem w określony sposób, 

który jest monitorowany „online” przez detektor. Cząsteczki o rozmiarach większych niż średnica porów 

wypełnienia są wykluczane. Nie penetrują one ziaren wypełnienia i jako pierwsze opuszczają kolumnę. 

Kolejno eluowane są cząsteczki o pośrednich wielkościach. Długość czasu ich przebywania w porach 

wypełnienia zależy od ich promienia hydrodynamicznego, a także jest bezpośrednio związana z wielkością i 

kształtem cząsteczek. Analogicznie, cząsteczki o średnicach dużo mniejszych niż pory wypełnienia penetrują 

wewnątrz porów i w ten sposób są zatrzymywane na dłuższy czas - przez co są eluowane jako ostatnie. 

Cząsteczki, które wnikają do wszystkich porów oraz nie wykazują żadnych oddziaływań sorpcyjnych z fazą 

stacjonarną są eluowane z wartością tzw. objętości martwej kolumny. Cząsteczki wykazujące oddziaływania 

sorpcyjne z fazą stacjonarną są eluowane z objętością elucji wyższą, niż wartość objętości martwej [6]. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


90 

Objętość elucji cząsteczek wykluczanych służy do określenia objętości przestrzeni międzyziarnowej w 

kolumnie oraz tzw. porowatości. Cząsteczki wykluczane posiadają bardzo wysokie wartości promienia 

hydrodynamicznego, więc nie są w stanie wniknąć do porów i przebywają tylko w przestrzeni 

międzyziarnowej. Zarówno dla wykluczanych cząsteczek jak i najmniejszych (które wnikają do wszystkich 

porów) nie można scharakteryzować rozkładu masy. Dla najmniejszych cząsteczek można jedynie 

zastosować inną kolumnę lub szeregowo połączony zestaw kolumn [7]. 

Zasada opisana powyżej jest ogólnie znana i przyjęta jako główny mechanizm rozdzielania zwany 

wykluczaniem sterycznym. Poza wykluczeniem sterycznym wyróżnia się inne mechanizmy rozdzielenia, 

które mogą odgrywać rolę w określonych warunkach: ograniczona dyfuzja oraz rozdzielanie podczas 

przepływu kapilarnego. 

Mechanizm rozdzielania ograniczonej dyfuzji opiera się na założeniu, że czas potrzebny cząsteczką 

by dyfundować w głąb porów jest porównywalny z czasem pobytu w danej strefie kolumny. W takim 

przypadku głębokość przenikania jest regulowana przez współczynnik dyfuzji, który jest pośrednio związany 

z wielkością cząsteczki. Duże cząsteczki wnikają powoli, a zatem nie pozostają wystarczająco długo, by 

przeniknąć do całej dostępnej objętości. Rozdzielanie przez ograniczoną dyfuzję może mieć miejsce głównie 

przy rozdzielaniu małych cząsteczek. 

Rozdzielanie podczas przepływu (chromatografia hydrodynamiczna) opiera się na idei strumienia 

przepływającego przez wąską kapilarę, w której występuje paraboliczny profil prędkości przepływu cieczy. 

Kolumnę wypełniają małe stałe nieporowate cząstki, które tworzą system wąskich „naczyń włosowatych”. Dla 

każdej rozdzielanej substancji chemicznej objętość wykluczania zależy od jej wymiaru geometrycznego i 

odległości od ścianek. Duże cząsteczki częściej występują bliżej środka kapilary i w związku z tym 

przepływają szybciej niż mniejsze cząsteczki, które mogą być usytuowane blisko ściany, gdzie przepływ jest 

powolny. Rozdzielenie mechanizmem przepływu kapilarnego może odbywać się w obszarze bardzo 

wysokich mas cząsteczkowych [5]. W SEC podział substancji rozpuszczonej między dwiema fazami jest 

kontrolowany wyłącznie przez entropię [3]. Liczba sposobów, w których poszczególne cząsteczki mogą 

zajmować przestrzeń wewnątrz poru, jest określona przez ilość pozycji (reprezentujących poszczególne 

stany) w siatce, która charakteryzuje dany por. Mniejsza cząsteczka jest utrzymywana dłużej w porach, 

ponieważ posiadają one większą liczbę prawdopodobnych stanów (i dlatego posiada większą entropię). 

Twierdzi się również, że chromatografia wykluczania jest techniką, w której efekt rozdzielczy jest niezależny 

od temperatury. W rzeczywistości jednak temperatura ma pośredni wpływ na rozdzielanie w SEC, poprzez 

jej wpływ na lepkość roztworów polimerowych [3]. 

Należy podkreślić, że w chromatografii wykluczania nie mogą zachodzić żadne chemiczne, ani 

fizyczne oddziaływania pomiędzy fazą stacjonarną, a analizowanymi substancjami. Prowadzą one do 

obniżenia sprawności kolumny. W przeciwieństwie do innych rodzajów chromatografii, w chromatografii 

wykluczania istnieje górny limit czasu retencji, przy założeniu braku zjawisk typu adsorpcja, rozpuszczanie. 

Dzieje się tak ponieważ nie ma takich cząsteczek, które pozostawałyby dłużej w kolumnie od cząsteczek 

całkowicie penetrujących fazę stacjonarną. 

2.2.2. Rodzaje chromatografii wykluczania 

(Types of SEC) 

Chromatografia wykluczania może być wykonywana w dwóch różnych układach. Rozdzielanie może 

odbywać się w warunkach liofilowych (niewodnych) oraz w warunkach hydrofilowych (wodnych). W obydwu 

przypadkach stosuje się różne eluenty, fazy stacjonarne i rozdziela różne mieszaniny. Głównie w przypadku 

warunków wodnych stosuje się dodatki do eluentu. Warunki liofilowe stosuje się do rozdzielenia nisko i 

średnio polarnych polimerów, natomiast hydrofilowe dla wysoko polarnych polimerów- polisacharydów, 

nukleotydów, białek i biopolimerów. 

Istotne jest użycie odpowiednich faz ruchomych i stacjonarnych. Fazy stacjonarne nie mogą wchodzić 

w reakcje z analizowaną substancją. Sorbenty zbudowane są z żeli polimerowych lub nieorganicznych. Żele 

nieorganiczne stosuje się głównie w warunkach wodnych. 

Rozpuszczalnik do SEC musi być „kompatybilny” z materiałem wypełniającym kolumny i musi tworzyć 

stabilne roztwory zapobiegające wytrącaniu polimeru z roztworu przed lub w trakcie analizy. Lepkość 

„dobrego” rozpuszczalnika powinna być niska, ponieważ wraz ze wzrostem lepkości efektywność 

rozdzielania zmniejsza się i zwiększa się opór przepływu. Jednakże, nie zawsze może być to osiągnięte ze 

względu na trudną rozpuszczalność niektórych polimerów a danym rodzaju rozpuszczalników. 

Rozpuszczalniki stosowane w technice SEC powinny mieć niską toksyczność, być niepalne, tanie, stabilne, 

nie korozyjne w stosunku do układu chromatograficznego i kolumny. Zazwyczaj, jest to niemożliwe, aby 

rozpuszczalnik spełniał wszystkie wymagania. Rozpuszczalniki o czystości stosowanej do wysokosprawnej 

chromatografii cieczowej (ang. High Performance Liquid Chromatography, HPLC) nie są konieczne, a 

czystość powyżej 99% jest dla większości zastosowań SEC wystarczająca [7,8]. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


2.2.2.1. Warunki liofilowe 

(Lyophilic conditions) 

Fazy stacjonarne 

Obecnie na rynku dostępnych jest wiele różnych faz stacjonarnych. Pierwszą fazę stacjonarną do 

rozdzielania polimerów hydrofobowych opracował Moore The Dow Chemical Company- poprzez sieciowanie 

diwinylobenzenu (DVB), który nadal jest bardzo często stosowanym sorbentem. Powstałe porowate żele 

mogły być syntezowane z różną średnią wielkością porów. Następnie powstała skomercjalizowana linia tego 

produktu – „Styragel”. Jedną z kluczowych cech, które uczyniły „Styragel” szeroko stosowaną fazą 

stacjonarną jest ich minimalne oddziaływanie z polimerami organicznymi. Pojawiły się jednak mechaniczne 

ograniczenia w jej stosowaniu. Usieciowany polistyren będący żelem polimerowym jest powszechnie 

wykorzystywany do rozdzielania polimerów w niewodnych warunkach. Bardzo popularne są sorbenty 

zbudowane z kopolimeru styrenu oraz opisanego wcześniej diwinylobenzenu (SDVB). Mają różne nazwy 

firmowe tj. Poragel, Lichrogel, TSK-gel od G-1000 do G-7000. 

W warunkach niewodnych stosuję się także porowatą krzemionkę. Jednak, pomimo większej 

stabilności od żelów polimerowych na jej powierzchni następuje niepożądana adsorpcja. Zmniejszenie 

wielkości porów mogło poprawić wydajność rozdzielania. W związku z tym, na rynku pojawiła się faza 

stacjonarna wprowadzona przez firmę Waters pod nazwą handlową μPorasil. Wytrzymałość i sztywność 

cząstek pozwoliła wytrzymać wysokie naprężenia ścinające związane z szybkością przepływu fazy 

ruchomej. Do niepolarnego rozdzielania stosuje się także powszechnie dezaktywowane silanami o krótkim 

łańcuchu alifatycznym. W 2011 roku pojawiły się kolumny o modyfikowanej powierzchni poprzez silanizację 

z trimetylosililem (ang. Trimethylsilyl, TMS). Główną zaletą tych cząstek jest obniżenie kwasowości grup 

silanolowych poprzez ich dezaktywację [9,10]. 

Poza wymienionymi poprzednio wyróżnia się także żele dekstranowe, agarozowe oraz akrylowe i 

metakrylowe, które stosowane są również w warunkach wodnych. 

Fazy ruchome 

Tetrahydrofuran (THF), toluen, chloroform, dichlorometan, N-metylo-pirolidon stanowią typowe 

rozpuszczalniki do SEC. THF stanowi najczęściej organiczny rozpuszczalnik do SEC w warunkach 

niewodnych, ponieważ rozpuszcza wiele polimerów syntetycznych. Nie rozpuszcza biopolimerów, ale także 

niektórych ważnych syntetycznych polimerów: poliamidów, poliolefin, poli(tereftalanu etylenu) i poli(alkoholu 

winylowego). THF ma właściwości higroskopijne, poza tą wadą posiada wiele zalet w świetle zastosowania 

do SEC. Spełnia on takie warunki dobrego rozpuszczalnika jak niska lepkość, niska wartość zakresu 

absorpcji („cut-off”) dla promieniowania ultrafioletowego (ang. Ultraviolet, UV) oraz niska cena. Inne 

niekorzystne właściwości to tworzenie z powietrzem mieszaniny wybuchowej, oraz tworzenie wybuchowych 

nadtlenków – co ma istotne znaczenie w przypadku odzysku rozpuszczalników po analizie, oraz może mieć 

niekorzystny wpływ w przypadku rozdzielania substancji podatnych na utlenianie. Mimo potencjalnego 

zagrożenia można bezpiecznie wykorzystywać THF bez specjalnych laboratoryjnych środków ostrożności. 

Utlenianiu można skutecznie zapobiegać poprzez zastosowanie 0,025% 2,6-ditert-butylo-4-hydroksytoluenu 

(BHT). 

Do badań poli(dimetylosiloksanu), jako eluent stosuje się toluen. Toluen jest również tradycyjnym 

rozpuszczalnikiem SEC, który rozpuszcza niepolarne i średnio polarne polimery, takie jak polistyren, 

polibutadien oraz poliizopren. Zalety tego rozpuszczalnika to stosunkowo niską toksyczność i doskonała 

stabilność. Jednak wadą jest brak możliwości stosowania z detekcją UV. 

Chloroform posiada kilka cennych zalet jak wysoką zdolność rozpuszczania różnych polimerów, brak 

absorpcji światła dla detekcji UV czy niepalność. Jednak wady jakie posiada decydują o tym, iż jest używany 

tylko wtedy, gdy nie ma innej alternatywy. Jest bardzo toksyczny i zarazem ma wysoką lotność. Posiada 

silnie żrące właściwości. Utlenianie prowadzi do powstawania niebezpiecznego fosgenu. Należy uwzględnić 

również wysoki koszt utylizacji odpadów. Poza opisanymi charakterystycznymi rozpuszczalnikami wyróżnia 

się także inne, opisane poniżej. 

1,2,4-trichlorobenzen (ang. 1,2,4-trichlorobenzene, TCB) to typowy rozpuszczalnik w SEC stosowany dla 

poliolefin w temperaturze powyżej 135°C. Rozpuszcza polistyren, a więc może być stosowany do kalibracji 

metodyki. 

1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (ang. Heksafluoroizopropanol, HFIP) wykazuje silne 

oddziaływania wodorowe i zdolność do rozpuszczania wielu polimerów, w tym organicznych, 

nierozpuszczalnych w innych rozpuszczalnikach, takich jak poliamidy (np. nylon 6), poliakrylonitryl, 

polietylen. HFIP jest żrący. Stosowalność jego ogranicza wysoka cena, choć koszty mogą być w pewnym 

stopniu obniżone przez redestylację. Dodatek 0,1% trifluorooctanu sodu stosuje się do powstrzymania efektu 

powstawania polielektrolitów analizowanych polimerów. HFIP nie rozpuszcza polistyrenu, a więc w celu 

kalibracji kolumny stosuje się poli(metakrylan metylu). Jest idealnym rozpuszczalnikiem do pomiarów w SEC 

z użyciem laserowego detektora światła rozproszonego (ang. Laser Light Scattering Detector, LLSD). 

Kolejnym przykładem rozpuszczalnika w warunkach hydrofobowych, średnio polarnym jest 

dimetyloformamid (DMF), który zwykle stosuje się z dodatkiem 0,1% bromku litu. Rozdzielanie z użyciem 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


92 

czystego rozpuszczalnika prowadzi do uzyskania niepoprawnej powierzchni piku. Jest dobrym 

rozpuszczalnikiem dla poliakrylonitrylu lub poli(alkoholu winylowego). Rozpuszcza polistyren. 

N-metylopirolidon (NMP) to eluent który jest dobrą alternatywą dla rozdzielania polimerów, które nie 

rozpuszczają się w THF. Posiada pożądane właściwości, takie jak niska lotność, niska palność, stosunkowo 

niska toksyczność i zdolność do rozpuszczania wielu polimerów. 

Sulfotlenek dimetylu (ang. Dimethyl sulfoxide, DMSO) to również rozpuszczalnik organiczny, który może 

być używany do polimerów, które są nierozpuszczalne w THF lub w innych rozpuszczalnikach organicznych. 

DMSO to najlepszy wybór dla żywic mocznika formaldehydu, które są nierozpuszczalne w większości innych 

rozpuszczalników. Może on być również stosowany do analizy skrobi. 

Do rozpuszczalników, które mogą być stosowane w wysokich temperaturach ( 220°C) należy o- 

chloronaftalen [5]. 

W niektórych przypadkach wymagane jest zastosowanie dodatków do fazy ruchomej. Na przykład, 

0,05M bromek litu dodaje się do średnio polarnych rozpuszczalników, takich jak DMF, NMP. Te 

rozpuszczalniki wykorzystywane są do analizy polimerów takich, jak poliuretany lub poliimidy. Podczas 

analizy w wysokiej temperaturze poliolefin, należy dodać około jeden gram przeciwutleniacza na 4 litry fazy 

ruchomej (np. TCB). Pomoże to zmniejszyć utlenianie próbki, znajdującej się w podajniku w wysokiej 

temperaturze, przed dozowaniem. Dodatek do eluentu substancji o mniejszej masie cząsteczkowej jak np. 

sole powstrzymuje powstawanie agregatów, oddziaływań z fazą stacjonarną, a także oddziaływań 

międzycząsteczkowych. 

Jeżeli w substancji rozdzielanej są obecne grupy funkcyjne (np. –COOH), dodanie do fazy ruchomej 

dodatku, który zawiera również niektóre grupy funkcyjne, zapewnia bezawaryjną pracę. Zapobiega to 

zniszczeniu kolumny poprzez zmianę chemizmu powierzchni. Typowymi dodatkami są: alkohole (metanol i 

etanol) zawierające grupę –OH, dietyloaminy zawierające grupę -NH 2 , kwas octowy lub kwas trifluorooctowy 

zawierające grupę –COOH [11]. 

Rozpuszczalniki w warunkach niewodnych mają wpływ na trwałość chemiczną żelu. Rozpuszczalniki mogą 

powodować pęcznienie żelów. Stopień pęcznienia w różnych rozpuszczalnikach będzie zależeć od stopnia 

sieciowania żelu. Generalnie, nowoczesne fazy stacjonarne w SEC mogą być stosowane w szerokim 

zakresie rozpuszczalników organicznych, chociaż, w zależności od procesu produkcyjnego te właściwości 

mogą się różnić. W związku z tym, zawsze zaleca się, aby stosować wytyczne producenta co do 

kompatybilności żelu z rozpuszczalnikiem. W przypadku dostarczania do kolumny jednego rozpuszczalnika i 

następnie drugiego, ważne jest sprawdzenie, mieszalności obydwu rozpuszczalników [3]. 

Podsumowując, na opisanych powyżej fazach stacjonarnych i ruchomych, charakteryzujących warunki 

liofilowe można rozdzielać głównie nisko i średni polarne polimery. Specyfikacje kolumn do SEC podają 

kompatybilne rozpuszczalniki organiczne oraz mieszaniny/ grupy związków, które w danych warunkach 

ulegają rozdzielaniu. Są to takie polimery jak polistyren, polibutadien, poliizopren, poli(dimetylosiloksan), 

poliamidy(np. nylon 6), poliakrylonitryl, poliolefiny, poli(alkohol winylowy), polichlorek winylu. W warunkach 

niewodnych rozdzieleniu ulegają także substancje nisko-, średnio- i wysokocząsteczkowe, takie ropa 

naftowa, oleje, asfalty, smoły, żywice. Substancje niskocząsteczkowe: sacharydy, tłuszcze, środki 

powierzchniowo czynne, dodatki w polimerach, antybiotyki, węglowodory aromatyczne. 

Tabela 1. Podsumowanie względem polarności niektórych faz stacjonarnych, ruchomych oraz rozdzielanych 

mieszanin w warunkach hydrofobowych. 

Table 1. Summary of SEC phases and it’s applications. 

Polarność Nisko-polarne Średnio-polarne 

Faza stacjonarna SDVB Akrylowa/metakrylowa; 

Poliestrowa 

Eluent THF, toluen, TCB DMF, DMSO, NMP 

Rozdzielane 

substancje 

Polistyren, poliolefiny, polichlorek 

winylu, żywice itp. 

Poliuretany, poliimidy, celuloza, 

skrobia, itp. 

2.2.2.2. Warunki hydrofilowe 

(Hydrophilic conditions) 

Fazy stacjonarne 

Pierwsze fazy stacjonarne polimerowe zostały opracowane przede wszystkim do analizy naturalnych 

polimerów i zostały one oparte na lekko usieciowanych polimerach np. dekstranu czy agarozy. Natomiast 

wypełnienia kolumn dla wysokosprawnej SEC w warunkach wodnych zostały opracowane tak, aby były 

sztywne i mogły tolerować szeroki zakres pH, zachowując funkcje podobne do miękkich żeli. 

Chromatografia żelowa w wodnych rozpuszczalnikach odbywa się na półsztywnych i niesztywnych 

żelach. Związki o masie sięgającej kilkuset tysięcy mogą być rozdzielane na fazach stacjonarnych 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


zbudowanych z usieciowanego dekstranu (np. „Sephadex”). Stosuje się także usieciowany poliakryloamid 

(np. „Bio-Gel-P”) czy żele akrylowe i metakrylowe. „Sepharose” to wypełnienie składające się z agarozy. 

Agaroza rozdziela także związki o większej masie cząsteczkowej i tak samo jak w dwóch wcześniej 

wymienionych fazach, rozdzielanie tych związków odbywa się pod niskim ciśnieniem, aby nie „sprasować” 

żelu. W celu polepszenia rozdzielania związków o dużej masie, rozpuszczalnych w wodzie powstały żele o 

specjalnym zastosowaniu, głównie żele nieorganiczne. Wyróżnia się tutaj: żel krzemionkowy, szkło 

porowate, a także dezaktywowany żel krzemionkowy (dawniej dezaktywacja glikolem polietylenowym, 

obecnie głównie silanizowanie powierzchni sorpcyjnej). Jako fazę stacjonarną zaczęto stosować także 

delikatnie sulfonowany polistyren pod nazwą „Aquapak”. Specjalnie do charakterystyki białek pojawiły się 

skomercjalizowane przez firmę Waters Corporation kolumny SEC z użyciem diolu jako grupy funkcyjnej [12]. 

Idealne fazy stacjonarne dla wodnego SEC powinny być wysoce hydrofilowe. Wymagania te wynikają 

z natury polimerów przeznaczonych do analizy. Zarówno naturalne, jak i syntetyczne polimery rozpuszczalne 

w wodzie mogą być niejonowe (neutralne) lub jonowe (polielektrolity), hydrofilowe lub stosunkowo 

hydrofobowe. Polimerowy materiał fazy stacjonarnej, który nie jest wysoce hydrofilowy może wykazywać 

oddziaływania hydrofobowe ze składnikami próbki. Dodatkowo, naładowana powierzchnia materiału 

wypełnienia może powodować jonowe oddziaływania z polielektrolitami polimerów. W praktyce w 

warunkach wodnych, niektóre fazy stacjonarne wykazują pewien stopień hydrofobowości i ładunek jonowy. 

Zarówno jonowe, jak i hydrofobowe właściwości są niepożądane, ponieważ powodują one 

obniżenie zjawisk wykluczania. Producenci materiałów wypełniających kolumny dążą do minimalizacji takich 

oddziaływań, jednak mimo to niezbędna jest modyfikacja eluentu. 

 

Fazy ruchome: 

Wybór eluentu jest zależny od rodzaju rozdzielanej próbki oraz od oddziaływań z fazą stacjonarną. 

Zakłada się, że eluent, który można stosować do rozdzielania na kolumnach jednego producenta, powinien 

nadawać się do rozdzielania z zastosowaniem kolumny innych producentów. 

W związku z niekorzystnymi zjawiskami jak oddziaływania sorpcyjne i jonowe stosuje się dodatki do 

eluentów. Oddziaływania adsorpcyjne mogą być zauważalne przez takie zjawiska jak ostre czołowe 

krawędzie piku, mała powierzchnia piku, niska powtarzalność. Oddziaływanie jonowe zakłócające zjawisko 

wykluczania może być zauważalne dla niskich wartości objętości elucji. Podczas optymalizacji składu 

eluentu, powtarzalność chromatogramów jest wskaźnikiem określającym najlepszy zestaw warunków. 

Do wodnych faz ruchomych zwykle stosuje się roztwory soli/bufory, które obniżają oddziaływania jonowe lub 

modyfikatory organiczne, które zmniejszają właściwości hydrofobowe w stosunku do eluentu. 

W przypadku rozdzielania polimerów niejonowych czysta woda często może być stosowana jako eluent. Dla 

próbek jonowych zaleca się stosowanie soli lub buforu jako dodatku do eluentu. Solami powszechnie 

stosowanymi są siarczan sodu, azotan sodu i octan sodu. Siłę jonową można zmieniać w zależności od 

rodzaju próbki, lecz na ogół nie przekracza się stężenia 1,0 M. Bufory stosuje się aby kontrolować pH [11]. 

Polimery anionowe np. sole sodowe kwasu akrylowego można eluować stosując bufor o pH 7-9. Sól sodowa 

sulfonianu polistyrenu również jest polimerem anionowym, ale często nie wymywanym w takich warunkach, 

gdyż wykazuje oddziaływania hydrofobowe. Można je zniwelować poprzez wprowadzenie niektórych 

modyfikatorów organicznym do fazy ruchomej. Metanol jest zalecanym modyfikatorem w przypadku 

stosowania jako fazę stacjonarną żelu z grupami –OH. Można także stosować inne rozpuszczalniki np. 

acetonitryl (ACN). Ważne jest, aby przestrzegać zaleceń producentów dotyczących stosowania 

rozpuszczalników organicznych w warunkach wodnych, ponieważ zły rozpuszczalnik może nieodwracalnie 

uszkodzić kolumnę. 

Polimery kationowe można eluować stosując wyższe stężenia soli będących dodatkami (0,3-1,0M), a pH w 

zakresie 2-7. Jako dodatek stosuje się chlorek sodu, ale także kwas mrówkowy i kwas trifluorooctowy. Tak 

jak w przypadku anionowych polimerów, występowanie silnych oddziaływań hydrofobowych w próbce, 

wymaga dodania organicznych modyfikatorów fazy ruchomej. 

W przypadku rozdzielania białek i peptydów podstawowym dodatkiem jest arginina. Arginina 

stabilizuje strukturę białek oraz zapobiega wzajemnym oddziaływaniom pomiędzy białkiem, a fazą 

stacjonarną. Jednym z ograniczeń argininy, jest możliwość pogarszania czułości detekcji w zakresie długości 

fali poniżej 220 nm [3]. W przypadku analizy agregatów białka za pomocą SEC wykorzystuje się 

odpowiednią fazę ruchomą. Nowością jest stosowanie lotnej fazy ruchomej: 20% ACN, 0,1% 

trifluorooctowego kwasu i 0,1 % kwasu mrówkowego lub wodorowęglanu amonu o pH=7. Wykorzystując taki 

eluent uzyskuje się powtarzalne wyniki rozdzielania agregatów, a przy tym możliwe jest sprzężenie SEC z 

spektrometria mas (MS) [13]. 

Ważne jest, aby bufory fazy ruchomej, sole, i modyfikatory, posiadały wysoką czystość w celu 

zminimalizowania szumów chromatograficznych. 

Podsumowując, w warunkach hydrofilowych rozdzielaniu ulegają bardzo polarne polimery, biopolimery 

polisacharydy, białka, nukleotydy, czasami także w połączeniach z substancjami chemicznymi o niższej 

polarności, rozpuszczalnymi w wodzie. Polimery mogą mieć postać jonową (kationowe i anionowe) lub 

niejonową. 

Typowym polimerem kationowym rozdzielanym w warunkach wodnych jest poli-2-winylopirydyna. Z kolei 

polimerem anionowym np. sól sodowa kwasu akrylowego lub sulfonian sodowy. W warunkach wodnych 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


94 

rozdziela się głównie związki polarne, na polarnych fazach stacjonarnych i ruchomych. Tabela 2 przedstawia 

w skrócie dopasowanie tych 3 elementów. 

Tabela 2. Podsumowanie względem polarności niektórych faz stacjonarnych, ruchomych oraz rozdzielanych 

mieszanin w warunkach hydrofilowych. 

Table 2. A comparison of SEC hydrophilic conditions. 

Polarność Bardzo polarne Mniej polarne 

Faza stacjonarna 

Akrylowe/akrylowe z grupami Żel krzemionkowy, SiO 2 –diol 

–OH 

Eluent Woda; pH od 1,5 do 13 Wodna z dodatkami; pH od 2 

do 10 

Substancje rozdzielane Dekstran, PEG, PEO, Polimery anionowe i 

kationowe, białka, peptydy 

2.2.3. Metody detekcji 

(Methods of detection) 

Szczegółowy opis metod detekcji w SEC będzie przedmiotem odmiennej pracy. Detektory są używane 

do monitorowania cząsteczek substancji rozpuszczonej w eluencie podczas rozdzielania. Do detekcji w SEC 

wykorzystuje się detektory czułe na zmianę stężenia oraz na masę cząsteczkową. Detektor 

spektrofotometryczny światła UV oraz podczerwieni (ang. Infrared, IR) mają sygnał proporcjonalny wyłącznie 

do stężenia próbki w rozpuszczalniku, pod warunkiem wykazywania absorpcji światła w zastosowanym 

zakresie. Sygnał detektorów refraktometrycznych (ang. Refractive Index Detector, R) oraz LLSD jest 

proporcjonalny do masy molowej i stężenia. Wiskozymetr to detektor proporcjonalny do iloczynu stężenia i 

masy cząsteczkowej do potęgi wykładnika Marka-Houwinka. Choć detektory stężenia mogą występować 

samodzielnie, detektory masy cząsteczkowej zapewniają przydatne informacje jedynie w zestawieniu z 

detektorem stężeniowym [14]. Ponieważ detektor RI ma właściwości najbardziej odpowiednie, aby być 

uniwersalnym detektorem jest on najczęściej używany do analizy syntetycznych polimerów. Detektor UV 

może być stosowany do związków zawierających wiązanie podwójne, sprzężone podwójne wiązanie, 

pierścień aromatyczny, grupę karbonylową -CO lub grupę nitrową -NO 2 . Jego zastosowanie w SEC jest 

ograniczone przez fakt, że wiele polimerów wykazuje słabą absorpcję światła UV. Stosowanie detektora UV 

do SEC jest również ograniczone tym, że część rozpuszczalników, w tym THF, ma wysoki „cut-off” w 

zakresie UV do 230 nm, w porównaniu z innymi rozpuszczalnikami używanymi w chromatografii cieczowej 

jak metanol lub acetonitryl. Detektor UV stosuje się do detekcji substancji zawierających polistyren i 

kopolimery styrenu, nitrocelulozę, żywice epoksydowe, żywice fenolowo-formaldehydowe, nienasycone 

żywice alkidowe, poliestry i białka. Zasada działania detektorów IR jest podobna do detektorów UV. 

Głównym ograniczeniem detektora IR w SEC jest to, że stosowane rozpuszczalniki jako fazy ruchome mają 

silną absorpcję przy długościach fali, które mogą być potencjalnie stosowane w celu monitorowania polimeru 

eluowanego z kolumny. Detektory IR obecnie znajdują zastosowanie głównie w przypadku rozdzielania 

poliolefin w TCB, gdzie detektor IR może być stosowany nie tylko do monitorowania stężenia, ale również w 

celu określenia chemicznej różnorodności kopolimerów polietylenu i rozgałęzień polietylenu. Detektory 

współczynnika załamania światła (refraktometryczne) mogą być stosowane do wykrywania wszystkich 

związków o niezerowym przyroście współczynnika załamania światła. Refraktometryczny indeks przyrostu 

(dn/dc) może być różny dla różnych polimerów. Możliwe są wartości ujemne, a wartości bliskie zeru zdarzają 

się raczej rzadko. W przypadku zerowego dn/dc odpowiedź detektora może być polepszona poprzez wybór 

innego rozpuszczalnika o innym współczynniku załamania światła. Dla związków o wysokiej absorpcji światła 

UV, takich jak te, które zawierają pierścienie aromatyczne, czułość detektora RI, może być znacznie 

mniejsza w porównaniu z detektorem UV [3]. 

W przypadku detektorów stężeniowych LLSD jest detektorem masy cząsteczkowej, który nie wymaga 

założenia dotyczącego składu i budowy próbki. Korzystając z detekcji za pomocą wielo-kątowego 

laserowego detektora światła rozproszonego (ang. Multi Angle Light Scattering Detector, MALLSD) możliwe 

jest uzyskanie kolejnej informacji - promienia cząsteczki. Otrzymana wartość jest bardzo precyzyjna 

ponieważ dokonuje się pomiaru światła rozproszonego pod różnymi kątami w zależności od wybranego 

modelu Wyatt Technology produkuje detektory MALLS dokonujące pomiaru pod 18 kątami. Laserowy 

detektor mało-kątowy światła rozproszonego (ang. Low Angle Light Scattering Detector, LALLSD) dokonuje 

pomiaru pod małą liczbą kątów. Jest to detektor rzadziej stosowany ponieważ dokonuje mniej precyzyjnego 

pomiaru, niż detektor MALLS. Detektor pomiaru lepkości (wiskozymetr) jest wrażliwy na masę 

cząsteczkową, ale tylko z użyciem metody uniwersalnego kalibrowania. Wymaga to użycia polimerów o 

znanej masie cząsteczkowej, takich jak polistyren. Wartości masy cząsteczkowej obliczone za pomocą 

detektora pomiaru lepkości są poprawne jeśli standardowy polimer i próbki przygotowane są według 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


uniwersalnej kalibracji. Dla liczb bezwzględnych, które nie wymagają kalibracji kolumny stosuje się 

rozpraszanie światła. Nowością jest połączenie detektorów pomiaru lepkości i RI. Za pomocą takiego 

połączenia, możliwe jest określenie konformacji, w tym obecności długołańcuchowych rozgałęzień oraz 

właściwości polimerów w roztworze [15]. 

2.2.4. Zalety i ograniczenia SEC 

Stosując GPC można ustalić kilka ważnych parametrów takich jak m.in. średni (wagowy, masowy, 

liczbowy) ciężar cząsteczkowy, czy rozkład masy cząsteczkowej polimeru. Wartości te są ważne, ponieważ 

wpływają one na wiele charakterystycznych właściwości fizycznych polimeru i wpływają na różnice w 

końcowym wykorzystaniu polimeru. Chromatografia wykluczania w swoim zastosowaniu posiada wiele zalet, 

ale także i pewne ograniczenia. Analizowane składniki próbki są dość łatwe do wykrycia. Jest to jedna z 

zalet zastosowania tej metody. W SEC dla większości próbek otrzymuje się wysoki sygnał z zastosowaniem 

detektora refraktometrycznego, pomimo stosunkowo niskiej czułości tego detektora. W chromatografii 

wykluczania cała próbka jest eluowana szybko, bez potrzeby elucji gradientowej lub innej skomplikowanej 

procedury. Świadczy to o kolejnej zalecie tej metody. Kolejną zaletą jest przewidywalny czas rozdzielania. 

Zazwyczaj początek oraz koniec elucji może być dość dokładnie przewidziany jeszcze przed rozdzielaniem. 

Wszystkie związki eluują pomiędzy objętością dla retencji t ex (czas całkowitego wykluczenia) i t o. (czas 

martwy). Dlatego serie różnych próbek mogą być dozowane ze z góry ustalonymi seriami w czasie, bez 

zagrożenia, że piki z pierwszej analiz nałożą się z pikami z analizy kolejnej. Sprzyja to zautomatyzowanemu 

dozowaniu próbek. Przewidywalny czas rozdzielania w SEC oznacza mniej czasu spędzonego na 

oczekiwanie na całkowite wyeluowanie nieznanej próbki. W chromatografii wykluczania stosunkowo łatwo 

można zidentyfikować nieznany pik próbki. Dzieje się tak ponieważ retencja jest ściśle związana z masą 

molową, a także przewidywalna dla związków o znanej strukturze. W przypadku SEC, inaczej niż w innych 

odmianach cieczowej chromatografii (ang. Liquid Chromatography, LC), objętość czasu retencji jest 

związana tylko z strukturą, a nie także z różnymi aspektami oddziaływań sorpcyjnych. Piątym z kolei 

pozytywnym aspektem zastosowania chromatografii żelowej jest brak chemicznych przemian podczas 

rozdzielania. Zazwyczaj brak oddziaływań sorpcyjnych sprawia, że jest to jedna z „łagodniejszych” technik 

rozdzielania. Kolejna zaleta wynika z właściwości fazy stacjonarnej stosowanej podczas opisywanej metody 

chromatograficznej. Przejawia się brakiem problemów z dezaktywacją. Kolumna nie ma skłonności do 

akumulowania nierozdzielanych związków, pochodzących z zanieczyszczonych rozpuszczalników i próbek. 

Zagrożeniem i ograniczeniem w SEC, jak w każdej innej LC, jest zatykanie spieków kolumny przez próbkę, 

która zawiera cząsteczki stałe. W związku z tym próbki przed wstrzyknięciem są filtrowane. Najbardziej 

poważną wadą jest ograniczona „pojemność” pików. Tylko kilka pików próbki może być zawarte na 

chromatografie w postaci rozdzielonej. Zazwyczaj chromatografia wykluczania jest niezdolna do rozdzielenia 

kompleksów, wieloskładnikowych próbek bez wcześniejszej separacji innymi metodami. Kolejnym 

ograniczeniem SEC jest brak możliwości stosowania do próbek, których składniki mają podobny rozmiar. 

Problem pojawia się np. przy rozdzielaniu izomerów. Analiza dużych cząsteczek wymaga cierpliwości. Czas 

rozpuszczania ich jest długi i może trwać, w najgorszym przypadku, nawet do kilku tygodni. 

Rozpuszczalność takich cząsteczek zależy od szeregu parametrów, takich jak rodzaj rozpuszczalnika, masa 

cząsteczkowa, polidyspersyjność [12]. 

3. Przegląd zastosowań SEC 

(Review of SEC applications) 

Podczas analizy SEC połączonej z różnymi metodami detekcji można zmierzyć absolutny ciężar 

cząsteczkowy, rozkład masy cząsteczkowej, wielkość cząsteczki, generować informacje o strukturze 

wielkocząsteczkowej, budowie, agregacji i rozgałęzieniu. 

Stosując SEC naukowcy mogą charakteryzować cząsteczki, takie jak polimery syntetyczne, naturalne, 

związki pochodzenia biologicznego. Dla wszystkich cząsteczek oznaczane parametry mają niezliczone 

zastosowania. Dzięki tej technice można kontrolować wytrzymałość i wydajność otrzymywania polimeru 

oraz jego polidyspersyjność. SEC ma zastosowanie także w przemyśle farmaceutycznym, gdzie producenci 

farmaceutyczni mogą analizować i dostosowywać „działanie” niektórych produktów oraz w przemyśle 

spożywczym ułatwiając analizę wydajności i jakości produktów. 

Rozkład masy cząsteczkowej 

Określanie masy cząsteczkowej i jej rozkładu jest podstawowym i szeroko stosowanym 

zastosowaniem SEC. Za pomocą tej techniki wyznaczyć można liczbową średnią masę cząsteczkową (M n ), 

wagowy średni ciężar cząsteczkowy (M w ) i wskaźnik polidyspersyjności (PDI). W warunkach analitycznych 

metodą SEC rozdzielać można oligomery, związki małocząsteczkowe, polimery syntetyczne i pochodzenia 

naturalnego. Zazwyczaj, substancje będące polimerami syntetycznymi oraz pochodzenia naturalnego nie 

składają się z dużej liczby identycznych cząsteczek. Są to substancje polidyspersyjne, składające się z 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


96 

cząsteczek o różnej długości (różnej masie cząsteczkowej), zawierających różną liczbę jednostek. Podczas 

badania związków wielkocząsteczkowych ważne są obliczone statystycznie informacje o średnich 

wartościach i odchyleniach od tych wartości. Polidyspersyjność próbki rośnie wraz z rozszerzeniem rozkładu 

masy cząsteczkowej. Przed interpretacją chromatogramu, pod kątem masy cząsteczkowej próbki i jej 

rozkładu należy wykonać kalibrację metody. Kalibracja polega na określeniu zależności między objętością 

elucji, a masą cząsteczkową. Krzywą kalibracyjną można przygotować na kilka sposobów, w zależności dla 

jakich związków ma być użyta. Wyróżnia się cztery powszechnie stosowane metody kalibracji. Trzy z nich 

można stosować w połączeniu z pojedynczym detektorem, są to: bezpośrednia kalibracja za pomocą frakcji 

wąskodyspersyjnych, kalibracja za pomocą polimerów polidyspersyjnych oraz standardowa kalibracja z 

uniwersalnymi parametrami. Czwarty typ kalibracji SEC wymaga użycia dwóch detektorów, połączonych 

szeregowo. Dodanie do SEC drugiego detektora czułego na masę cząsteczkową zapewnia bezpośredni 

sposób kalibracji, bez potrzeby korzystania z zewnętrznego wzorcowania. Takie detektory są 

udoskonaleniem klasycznych technik. W celu takowej kalibracji korzysta się z LALLSD, MALLSD oraz z 

detektora pomiaru lepkości. 

Najbardziej podstawowa kalibracja polega na pomiarze objętości retencji kilku wąskodyspersyjnych 

frakcji danego polimeru, których wartości średniej masy cząsteczkowej są znane. Polimery wzorcowe 

powinny charakteryzować szeroki zakres mas cząsteczkowych oraz posiadać wąski rozkład, czyli M w ≈M n ≈ 

M SEC, gdzie M SEC to masa cząsteczkowa odpowiadająca elucji w maksimum piku chromatograficznego. 

Odczytanie wartości M SEC bezpośrednio z zależności kalibracyjnej nie jest poprawne w przypadku układów 

polidyspersyjnych i nie jest stosowane. W wyniku kalibracji otrzymuje się chromatogramy kilku wąskodyspersyjnych 

frakcji danego polimeru o znanych wartościach średniej masy cząsteczkowej. Należy 

pamiętać, że pomiary wykonywane w celu sporządzenia krzywej wzorcowej dokonuje się w tych samych 

warunkach jak podczas analizy badanych próbek. Same dane dotyczące objętości elucji nie są 

wystarczające. Wykreśla się punktowo zależność czasu retencji poszczególnych frakcji względem logM, 

łączy punkty krzywą/linią trendu. Uzyskaną w taki sposób krzywą przedstawia Rys. 1. 

7 

log(M) 

6 

5 

4 

3 

y = -0,408x + 15,17 

R² = 0,992 

seria wzorcowa 

2 

1 

0 

20 22 24 26 28 30 

Rt [min] 

Rys. 1 Krzywa kalibracyjna 

Fig. 1 Calibration curve 

W takim przypadku zależność kalibracyjna opisana jest równaniem: 

Y = AX + B , (1) 

Y - logM, (M – masa cząsteczkowa) 

X - czas retencji. 

Jest to najprostszy sposób kalibracji, ale ma ograniczenia w swojej przydatności ze względu na mały wybór 

standardowych polimerów. Kalibracja ta wymaga użycia dużego zakresu różnych mas cząsteczkowych, aby 

całkowicie pokryć cały zakres mas badanej próbki. Obecnie w warunkach niewodnych stosuje się jako 

polimery wzorcowe polistyren, polimetakrylan metylu, polietylen. Natomiast w warunkach wodnych: 

politlenek etylenu lub glikol polietylenowy, poli(kwas akrylowy) i polisacharydy. Na mechanizmie tego typu 

kalibracji bazują pozostałe sposoby kalibracji. 

Aby określić masę cząsteczkową i jej rozkład wyznacza się krzywą elucji próbki w tych samych 

warunkach jak krzywą kalibracji. Stosuje się ten sam eluent, szybkość przepływu, temperaturę. Wykreśla 

linię zerową chromatogramu, czyli łączy prostą linią, zaczynając od odcinka poprzedzającego pik, kończąc 

na odcinku, który może nastąpić po wymyciu zanieczyszczeń (pik ujemny). Do sporządzonej linii 

doprowadzane są linie prostopadłe dzielące chromatogram na przedziały o równej szerokości. Powinno 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


powstać co najmniej 25 przedziałów, jeśli wyznaczane są ręcznie. Najczęściej dostępne programy do 

obróbki danych SEC sporządzają minimum kilkaset fragmentów dla każdej analizy. Średnia masa 

cząsteczkowa jest przypisana do każdego przedziału czasu w oparciu o opisaną powyżej kalibrację, czyli o 

krzywą kalibracji. Do celów obliczeniowych przyjmuje się, że każdy przedział czasu charakteryzuje 

monodyspersyjny rozkład masy cząsteczkowej. Odczytanie z otrzymanego piku, który jest podzielony na 

fragmenty o równej szerokości, odpowiedniego czasu retencji wymaga dalszej analizy otrzymanych danych 

[16]. Jednym ze sposobów jest stworzenie w arkuszu kalkulacyjnym tabeli, przedstawionej poniżej (Tabela 

3). 

Tabela 3. Tabela opisująca sposób obliczeń M n i M w. 

Table 3. An example of SEC table calculation. 

t[min] A ΣA %A/ΣA M i A i /Mi A i *M i A i *M i 

2 

… … … … … … … … 

Pierwsza kolumna tabeli informuje o czasie retencji, w którym ma miejsce elucja. Powierzchnie (A) obliczono 

dla pól poszczególnych fragmentów. Wykorzystuję się wartość różnicy czasu na osi x oraz różnicę sygnałów 

na osi y, których wartość rozpoczyna się w miejscu linii zerowej. Następnie obliczona się skumulowaną 

powierzchnię ΣA (np. dla kilkuset małych fragmentów). Kolumna „%A/ΣA” określa stosunek [%] danej, 

pojedynczej powierzchni do skumulowanej powierzchni. Dla wartości 50% (połowy powierzchni danego 

fragmentu) odczytuje się czas retencji. Korzystając z równania krzywej kalibracyjnej oblicza dla danego 

czasu wartość M i . A i oznacza wartość skumulowanych powierzchni (ΣA). Trzy ostatnie kolumny są to 

wartości wykorzystywane w obliczeniach. 

Do obliczeń najczęściej stosuje się niżej przedstawione zależności [17]: 

M = 

∑ 

∑( ⁄ ) 

(2) M = ∑ ∙ 

∑ 

(3) PDI = 

 

(4) 

M i - masa fragmentu i [g/mol] 

A i - pole fragmentu piku o masie M i [-] 

W przypadku powyższych zależności należy dokonywać korekty wartości A i dla poszczególnych 

zakresów M i ze względu na zależność współczynnika załamania światła od masy cząsteczkowej. W 

przypadku prostej normalizacji ma miejsce zawyżanie zawartości frakcji wysokomolekularnej i zaniżanie 

zawartości frakcji niskomolekularnej. 

Kalibracja z wykorzystaniem wąskich frakcji nie jest jedyną i niezawodną metodą. Stosuje się także 

kalibrację za pomocą polimerów polidyspersyjnych. Dla wielu polimerów brakuje dobrych wzorców, a 

frakcjonowanie w celu ich otrzymania jest nieopłacalne. Określa się zależność kalibracyjną na podstawie 

znajomości funkcji rozkładu masy cząsteczkowej polidyspersyjnego wzorca kalibracyjnego oraz korzystając 

z chromatogramu danej próbki polimeru. Procedura obejmuje porównanie znormalizowanej powierzchni 

pików z łączną frakcją pobraną z krzywej rozkładu. 

Poszczególne objętości elucji V i są dopasowane do masy cząsteczkowej M i pobranej z krzywej rozkładu 

masy cząsteczkowej, jest to możliwe ponieważ procentowa część powierzchni piku i udział wagowy są 

identyczne. Krzywą rozkładu ciężaru cząsteczkowego polidyspersyjnych próbek wzorcowych określono 

doświadczalnie. Rozkład masy cząsteczkowej wzorców musi objąć większość lub wszystkie zakresy 

dynamiczne próbki. Dwie określone doświadczalnie wartości średnich mas (M) dla jednej lub dwóch różnych 

próbek polidyspersyjnych muszą być znane jako wynik pomiarów pomocniczych do sporządzenia krzywej 

rozkładu masy cząsteczkowej. Balke wraz z współpracownikami opracował metodę efektywnej liniowej 

kalibracji. Krzywa została wyrażona poprzez równanie: 

V = C − C logM , (5) 

V e - objętość elucji (retencja) [ml] 

M - masa cząsteczkowa [g/mol] 

Początkowo metoda ta sprawiała problemy podczas poszukiwania stałych C 1 i C 2 . Zmodyfikowana metoda 

bierze pod uwagę wyszukiwanie pojedynczego parametru. Zakłada się, że polidyspersyjność -D, jest funkcją 

nachylenia - C 2 . Otrzymane równanie kalibracji jest słuszne, gdy wartość współczynnika kierunkowego 

równania jest zoptymalizowana w celu zminimalizowania różnicy między rzeczywistą, a obliczoną 

polidyspersyjnością. Współczynnik kierunkowy jest ustalony i stały. Następnie ustala się stałą C 1 , która jest 

również zoptymalizowana w celu zminimalizowania różnicy między rzeczywistymi, a obliczonymi 

wartościami. 

Opisaną kalibrację za pomocą frakcji lub niefrakcjonowanych polimerów stosuje się, gdy seryjnie 

analizuje się za pomocą SEC próbki jednego polimeru. W przypadku, gdy bada się różne polimery, zaleca 

się stosowanie innej zależności kalibracyjnej, która uzyskana jest poprzez pomiar objętości retencji dla 

wąskich frakcji polistyrenu. Stosuje się uniwersalne parametry kalibracyjne. W celu zrozumienia tej metody, 

należy rozważyć zależność między masą cząsteczkową, graniczną liczbą lepkościową, objętością 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


98 

hydrodynamiczną, objętością przypadkowych swobodnie stykających się łańcuchów polimeru w roztworze. 

Relację tę opisuje równanie Einsteina–Simha dotyczące prawa dla cząsteczek w zawiesinie: 

[Ƞ] = C( 

), (6) 

 

[Ƞ] - graniczna liczba lepkościowa zmierzona w warunkach rozdzielania chromatograficznego [cm 3 /g] 

V h - objętość hydrodynamiczna [ml] 

M- masa [g] 

C- stała [-] 

Poniższa zależność charakteryzuje makrocząsteczki w roztworze. Bazuje na teorii Flory’ego-Foxa i pomaga 

zrozumieć metodę uniwersalnej kalibracji. 

 

[Ƞ] = ɸ( ( ) 

), (7) 

 

ɸ - stała Flory’ego [-] 

s 2 - średni kwadrat odległości końców od środka łańcucha [cm] 

Gdy oba równania mnoży się przez M otrzymuje się iloczyn [Ƞ] M, który jest uniwersalnym parametrem 

podczas kalibracji kolumn do SEC. Benoit i jego współpracownicy wykreślili ten parametr w funkcji objętości 

elucji dla polimerów o różnej strukturze, badanych w identycznych warunkach. Powstała jedna krzywa 

kalibracji. W praktyce można ustalić następującą zależność: 

[Ƞ] 1 M 1 =[Ƞ] 2 M 2, (8) 

gdzie indeks 1 odnosi się do standardowych polimerów, a indeks 2 do próbek polimerów. Nieznaną masę 

można wyliczyć wykorzystując znajomość danych dotyczących uniwersalnego wzorca użytego do kalibracji. 

Zależność ta, aby była użyteczna musi zostać zmodyfikowana. Korzystać należy z równania: 

Vol. 6, No 2/2014 

logM = 

 

 

log 

 

+ 

 

logM , (9) 

Niezbędne jest także równanie Marka-Houwinka: 

[Ƞ] = KM (10) 

Korzystając z zależności 10 można obliczyć wartości stałych K i a [3,18]. 

W wyniku analizy techniką chromatografii żelowej otrzymuje się zazwyczaj wartości M n mniejsze, a 

wartości M w większe w porównaniu z wartościami otrzymanymi metodami klasycznymi. Analizę masy 

cząsteczkowej metodą SEC przeprowadza się dla wielu substancji. SEC może być stosowany samodzielnie 

lub razem z innymi technikami w celu poprawy analizy jakościowej. W warunkach niewodnych bada się 

oligomery, związki wielkocząsteczkowe (np. nisko i średnio polarne polimery) oraz niektóre 

niskocząsteczkowe. Za pomocą SEC głównie określa się dla tych substancji średnie masy cząsteczkowe, ich 

rozkład oraz polidyspersyjność. 

W przypadku oligomerów, SEC umożliwia całkowite rozdzielenie w skali analitycznej niższych członów 

ich szeregu homologicznego. Wyższe oligomery posiadają piki odpowiadające poszczególnym członom 

szeregu (merom), które nie są całkowicie rozdzielone. Jeśli masa cząsteczkowa oligomeru rośnie dalej 

otrzymuje się ciągłą krzywą elucji, podobnie jak dla polimerów. Badane oligomery to np. polietery, 

poliuretany, żywice. Z przeprowadzonych badań dla żywic wynika, że technikę SEC można stosować do 

scharakteryzowania próbki przez producentów żywicy oraz przez użytkowników końcowych. Charakteryzuje 

się m.in. żywice fenylowo-formaldehydowe powstałe przez polikondensację [19,20]. Rozdzielane w 

hydrofobowych warunkach polimery to głównie syntetyczne substancje oraz niektóre pochodzenia 

naturalnego. Analizę masy cząsteczkowej przeprowadza się np. dla nylonów – poliamidów [21]. Innym 

przykładem syntetycznego polimeru dla którego przeprowadza się, poza klasycznymi metodami określania 

ciężaru cząsteczkowego, analizę techniką SEC jest polichlorek winylu [22]. Próbki polimerów liniowych 

powstałych przez termiczną polimeryzację eteru bisfenolu-A-diglicydylowego (ang. bisphenol-A-diglycidyl 

ether, DGEBA) z trzema aminami: benzyloaminą, p-chloroaniliną i cykloheksyloaminą bada się z 

wykorzystaniem THF jako eluentu. Określenie średnich wartości mas cząsteczkowych umożliwia ocenę 

stopnia cyklizacji [23]. Chromatografię żelową wyposażoną w LLSD z użyciem organicznego eluentu stosuje 

się do określenia M n i M w praktycznie każdego rodzaju polimerów, takich jak elastyczne polimery 

polistyrenowe, polimery prętowe, polimery gwiaździste, liniowe kopolimery blokowe oraz gwiaździste 

kopolimery blokowe [24]. W przypadku analizy kopolimerów blokowych, z wykorzystaniem SEC w 

warunkach wodnych, napotyka się trudności w uzyskaniu krzywej kalibracyjnej. Rozwiązaniem okazuje się 

sporządzenie krzywej kalibracyjnej za pomocą homopolimerów. Krzywą wykonuje się z wykorzystaniem 

parametrów Marka-Houwinka. Średnia masa cząsteczkowa oznaczona tą metodą jest w doskonałej 

zgodności z danymi otrzymanymi metodą osmometrii [25]. Wśród polimerów naturalnych, dla których 

przeprowadza się rozkład masy cząsteczkowej z organicznym eluentem można wymienić polisacharydy oraz 

ligninę. Można przeprowadzić analizę zarówno niemodyfikowanej celulozy oraz jej pochodnych. 

Przeprowadzone badania nad ftalanem hydroksypropylometylocelulozy (ang. hydroxypropylmethylcellulose 

phthalate, HPMCP) wykazują, że jest łatwo rozpuszczalny w wielu rozpuszczalnikach organicznych, które 

mogą być używane jako eluent w SEC. Analiza wykonana z zastosowaniem acetonu jako fazy ruchomej 

wykazała silne oddziaływanie pomiędzy polimerem, a materiałem wypełniającym kolumnę. Analiza 

wykonywana z użyciem THF jako fazy ruchomej wykazała również, że występują pewne oddziaływania z 

Camera Separatoria


kolumną, ale są one znacznie słabsze niż obserwowane w acetonie. W tym przypadku podaję się 

informację, że nieprawidłowe zachowanie HPMCP w THF może być tłumione przez dodanie 5% roztworu 

kwasu octowego [26]. 

Rozkład masy cząsteczkowej w warunkach niewodnych można przeprowadzać również dla takich substancji 

jak ropa, oleje, asfalty. Często w przypadku np. ropy oraz smoły węglowej stosuję się metodę „odcisku 

palca” (ang. fingerprinting”). Powstałe najróżniejsze chromatogramy porównywanych próbek umożliwiają 

stwierdzenie jak ropa była przerabiana lub jakiego jest pochodzenia. Do badań asfaltów w warunkach 

niewodnych wykorzystuje się kolumny wypełnione najczęściej wysoce usieciowanymi kopolimerami [27]. 

Niskocząsteczkowymi substancjami rozdzielanymi w celu sporządzenia rozkładu masy cząsteczkowej są 

sacharydy, tłuszcze, witaminy oraz dodatki w polimerach. Często dokonuję się pomiaru wartości masy 

cząsteczkowej i rozkładu mas cząsteczkowych dla niskocząsteczkowej heparyny (ang. Low Molecular 

Weight Heparin, LMWH), która jest polisacharydem, przy użyciu najczęściej dwóch metod detekcji: 

ultrafioletowej (UV) oraz refraktometrycznej. Jednak te detektory wymagają kalibracji z wykorzystaniem 

wzorców. European Pharmacopeia do analizy LMWH za pomocą chromatografii wykluczania zaleca użycie 

tych dwóch detektorów, które wymagają takowej kalibracji. Nowsza metoda proponuje korzystanie z 

MALLSD, który nie wymaga korzystania z wzorców [28]. 

W warunkach wodnych za pomocą chromatografii wykluczania dokonuje się głównie analizy 

materiałów biologicznych oraz polimerów polarnych. Substytuty osocza krwi, takie jak dekstran i 

hydroksyetyloskrobia, powodują rozszerzenie objętości cieczy w naczyniach krwionośnych ze względu na 

ich wysokie ciśnienie osmotyczne. Stosowane są klinicznie do rozszerzania naczyń krwionośnych. Efekt ten, 

uzyskuje się tylko wtedy, jeśli substytuty te są obecne w osoczu. Z tego powodu znajomość czasu retencji 

ma duże znaczenie. Czas przebywania jest bezpośrednio związany z rozkładem masy cząsteczkowej 

polidyspersyjnych hydrokoloidów. Znajomość rozkładu, określonego metodą SEC z wykorzystaniem 

kalibracji wąsko-dyspersyjnymi frakcjami, ma istotne znaczenie w kontrolowaniu zwiększania objętości 

osocza [29]. Żelatyna jest polipeptydem wytwarzanym z kwaśnej lub zasadowej hydrolizy kolagenu 

pochodzącego z skóry i kości. Żelatyna jest stosowana w przemyśle spożywczym i w przemyśle 

farmaceutycznym jako stabilizator do tabletek. Analiza techniką SEC może być stosowana do każdego 

rodzaju żelatyny, niezależnie od jej punktu izoelektrycznego oraz warunków procesu hydrolizy kolagenu. 

Wykorzystuje się eluent wodny z buforem fosforanowym o pH 5,5 dla kwaśnej żelatyny i o pH 6,6 dla 

żelatyny podstawowej [30]. W szczególności w przypadku związków pochodzenia biologicznego, technika 

SEC posiada szeroki zakres innych zastosowań poza przygotowaniem rozkładu masy cząsteczkowej. 

Natomiast z użyciem wodnego eluentu dokonuje się m.in. analizy rozkładu masy cząsteczkowej niektórych 

polielektrolitów. Zarówno biopolimery jak i polimery syntetyczne obdarzone ładunkiem można 

charakteryzować za pomocą chromatografii wykluczania. Przykładem charakteryzowanego polimeru może 

być poliakrylan sodu, który ma szerokie zastosowanie przemysłowe. Oznaczenie jego masy cząsteczkowej 

(M w ) oraz analiza jej rozkładu jest ważnym elementem kontroli jakości tego produktu. Użycie do badania 

eluentu wodnego z buforem soli o pH>7 gwarantuje dokładną analizę rozkładu masy cząsteczkowej 

poliakrylanu sodu bez żadnych niepożądanych oddziaływań [31]. 

Oznaczanie dodatków/zanieczyszczeń (o innych masach) 

Chromatografię żelową wykorzystuję się m.in. do oznaczania substancji, które są składnikami próbki, 

w tym zanieczyszczeń, które różnią się rozmiarami cząsteczek. 

W warunkach niewodnych SEC umożliwia rozdzielanie polimerów nisko i średni polarnych od 

związków powierzchniowo czynnych, które zawarte są w mniejszym stężeniu, z wykorzystaniem THF jako 

eluentu. Otrzymane związki mogą być odzyskane i oznaczone np. metodą spektrofotometryczną. Z 

wykorzystaniem THF można także określić stężenie dodatków lub produktów reakcji o dużej masie 

cząsteczkowej zawartych w komponentach o niższej masie. Polimer może być oddzielany np. od oleju 

smarowniczego. Stosując toluen jako eluent można rozdzielić mieszaniny łatwo topliwych klei zawierających 

polimery, żywice, woski [12]. Chromatografia wykluczania umożliwia oznaczanie także smarów, dodatków 

uszlachetniających, tłuszczów, kosmetyków, plastyfikatorów, antyutleniaczy, konserwantów, pozostałości 

rozpuszczalnika i innych substancji w polimerach. Wysokosprawna chromatografia wykluczania, z 

zastosowaniem organicznego rozpuszczalnika, podczas analizy tłuszczów może służyć do oddzielenia 

monomerów, dimerów i trimerów kwasów tłuszczowych zawartych w termicznie utlenionych lub zużytych 

tłuszczach i olejach jadalnych. Rozdzielanie odbywa się z użyciem kopolimeru SD-DVB jako fazy 

stacjonarnej i toluenu jako eluentu, z detekcją refraktometryczną. W tych samych warunkach można 

dokonać rozdzielania i analizy ilościowej mono-, di- i tri glicerydów. W przypadku analizy monomerów, 

dimerów i trimerów kwasów tłuszczowych można zastosować zarówno SEC jak i wysokosprawną 

chromatografię wykluczania (ang. High Performance Size Exclusion Chromatography, HPSEC). HPSEC 

oznacza zastosowanie sprawniejszych kolumn o mniejszych ziarnach, o wielkości około 5µm. Poniżej 

zobrazowane są obydwa chromatogramy dla mieszanin standardowych. HPSEC umożliwia szybszą elucję 

[32]. 

Wysokosprawna chromatografia wykluczania znalazła zastosowanie do badania rozpadu trzech różnych 

olejów po smażeniu: olej z oliwek, olej słonecznikowy oraz mieszaniny tych olejów. Oceniano i porównywano 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


100 

je za pomocą pomiaru zawartości frakcji polarnych oraz oligomerów TAG. Podczas badania każdy olej 

stosowany był 10 krotnie. Po każdym użyciu uzupełniany nowym, ale nie wylewany. Za pomocą SEC 

zanalizowano zawartość TAG w wydzielonej wcześniej polarnej frakcji. Zawartość oligomerów TAG w 

polarnej frakcji obliczono jako sumę polimerów o niskiej M w i dimerów TAG. Najmniejszą zawartość 

posiadała oliwa z oliwek, jednak ze względu na cenę i nienajgorsze wyniki dopuszcza się stosowanie 

mieszaniny olei [33]. 

Oznaczanie „grupowe” – MAG/DAG/TAG/WKT w tłuszczach 

Chromatografia wykluczania posiada zastosowanie w badaniu składu tłuszczów. Wynik oznaczania 

informuje o zawartości poszczególnych grup związków chemicznych w badanym materiale. Tłuszcze to estry 

glicerolu i kwasów tłuszczowych. Glicerol może tworzyć estry z jedną, dwiema i trzema cząsteczkami kwasu 

tłuszczowego. Powstają wtedy: monoacyloglicerole (MAG), diacyloglicerole (DAG), triacyloglicerole (TAG). 

Zawartość wymienionych związków oraz wolnych kwasów tłuszczowych (WKT) w tłuszczu, analizowanym za 

pomocą techniki SEC w warunkach hydrofobowych, określa jego skład grupowy. 

Podczas obróbki termicznej tłuszczów zachodzą przemiany oksydatywne i oksydatywno-termiczne, 

które powodują powstawanie wielu związków. Powstają związki takie jak polimery, dimery, utlenione TAG, 

WKT, DAG oraz MAG. Metoda wysokosprawnej chromatografii wykluczania pozwala na ich rozdzielenie, 

ponieważ różnią się masą cząsteczkową. Aby zidentyfikować grupy związków powstające w tłuszczach np. 

po smażeniu stosuje się następujące warunki: kolumny wypełnione usieciowanym kopolimerem styrenu i 

DVB, detektor refraktometryczny. Rozdzielenie odbywa się w warunkach niewodnych z zastosowaniem THF 

jako eluentu z dodatkiem utleniacza - BHT. Wykonuje się krzywe kalibracyjne z zastosowaniem jako wzorca 

glikolu polipropylenowego o znanej masie. Krzywe te można wyznaczyć dla jednej kolumny i dla dwóch 

kolumn połączonych szeregowo. Na podstawie tych krzywych wyznacza się masy cząsteczkowe związków 

występujących w tłuszczach smażalniczych oraz identyfikuje się je. Tabela 2.4. obrazuje wyniki analizy 

tłuszczów po smażeniu oraz porównuje dane uzyskane z użyciem jednej i dwóch kolumn. 

Tabela 4. Identyfikacja związków obecnych w tłuszczu po smażeniu. 

Table 4. Identyfication of compounds from lipid streams after frying. 

Jedna kolumna 

Obliczona masa cząsteczkowa 

Dwie kolumny 

Związek 

4280 8740 – 2440 Polimery 

1830 1740 dimery TAG 

910 930 utlenione TAG 

850 860 TAG (frakcja niepolarna) 

630 650 DAG 

320 370 MAG 

220 280 Kwasy tłuszczowe 

Zaleca się stosowanie dwóch szeregowo połączonych kolumn. Pozwala to rozdzielić związki 

polimeryczne na 3 frakcje. Analizie najlepiej jest poddać wyodrębnione wcześniej frakcje polarne. Umożliwia 

to identyfikacje wszystkich grup związków, które powstają w tłuszczach w czasie obróbki termicznej 

ponieważ identyfikacji związków takich jak np. utlenione TAG, DAG (o małej masie cząsteczkowej zbliżonej 

do TAG) przeszkadza obecność TAG (frakcja niepolarna). Natomiast produkty polimeryzacji identyfikowane 

są w próbach badanego oleju bezpośrednio. Analizę ilościową tłuszczów poddanych np. smażeniu metodą 

HPSEC prowadzi się z zastosowaniem detektora refraktometrycznego. Niezbędna jest znajomość, dla 

wszystkich rodzajów związków występujących w danych tłuszczach, wielkości sygnałów przypadających na 

jednostkę masy. Wyniki analizy ilościowej wykazują, że różne związki, które są obecne we frakcjach 

polarnych dają sygnały zbliżone do TAG z których powstały. Umożliwia to ilościowe oznaczenie 

poszczególnych grup związków, które znajdują się w tłuszczach poddanych działaniu wysokich temperatur 

[37]. 

SEC umożliwia określanie struktury makrocząsteczek, np. rozgałęzienia. Rozgałęzienie 

długołańcuchowe jest znanym zjawiskiem strukturalnym polietylenu, którego charakterystyka ma znaczenie, 

ponieważ wpływa na wiele właściwości tego polimeru. Oznaczanie rozgałęzienia można przeprowadzić przy 

użyciu chromatografii żelowej z detektorem lepkościowym i MALLSD (w celu określenia promienia 

bezwładności). Podstawą sposobu określenia rozgałęzienia jest użycie polidyspersyjnych liniowych próbek 

odniesienia, do porównania z rozgałęzionymi polimerami. Rozgałęziony polimer jest bardziej zwarty, niż 

polimer liniowy dla danej masy cząsteczkowej. W rezultacie rozgałęzione cząsteczki mają mniejszą objętość 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


hydrodynamiczną, mniejszy promień bezwładności i niższą lepkość. Zatem stopień rozgałęzienia można 

wyznaczyć z różnicy w lepkości granicznej (oznaczonej metodą SEC-VIS) lub w promieniu bezwładności 

(określanego za pomocą SEC-MALLS). Porównuje się rozgałęziony polimer z analogiczną próbką 

prostoliniową [42]. 

W warunkach wodnych dokonuje się głównie analizy białek i peptydów, kwasów nukleinowych, 

hormonów, toksyn, witamin, niektórych sacharydów. SEC jest techniką szeroko stosowaną do 

szczegółowego charakteryzowania białek terapeutycznych oraz służy do oceny ilościowej i jakościowej 

agregatów. Łagodne warunki fazy ruchomej zezwalają na charakterystykę białek przy minimalnym wpływie 

na struktury konformacyjne i środowisko lokalne. W celu poprawy rozdzielania między białkiem, a 

agregatami dostosowuje się różne parametry prowadzenia analizy. Przede wszystkim dobierana jest 

odpowiednia wielkość porów. Dobór wielkości porów zależy od wielkości (masy cząsteczkowej) białka i jego 

składników, które mają być rozdzielone. Dla scharakteryzowania mieszaniny białek, stosowane są typowe 

wielkości porów pomiędzy 150 i 500Å. Dla białek terapeutycznych (o M w około 15-80 kDa) stosuje się 

wielkość porów 150-200 Å. Wielkość porów 200-300 Å jest zwykle stosowana dla mAb (przeciwciała 

monoklonalne - M w około 50 kDa). W przypadku bardzo dużych białek (M w > 200 kDa) pory o wielkości 500- 

1000 Å oferują najlepszą selektywność. Do analizy białek, peptydów i związków pokrewnych najczęściej 

stosuje się detektory UV. Niedawno Latypov wykazał imponujący sposób, który ukazuje jak odróżnić 

rekombinowane ludzkie przeciwciała monoklonalne IgG1 i IgG2. Ze względu na ich skłonność do tworzenia 

agregatów były poddawane odwirowywaniu. Nienaruszone przeciwciała monoklonalne były oddzielone od 

rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych agregatów metodą chromatografii wykluczania [34, 35]. 

W warunkach hydrofilowych oczyszczanie próbek za pomocą metody chromatografii wykluczania ma 

zastosowanie nie tylko w przypadku materiałów biologicznych. Substancje pomocnicze w lekach to 

substancje nieaktywne farmakologicznie, stosowane głównie jako nośnik. Znaczna zawartość (30-80% 

substancji stałej) takich substancji polimerowych to celuloza, hydroksypropyloceluloza, 

hydroksypropylometyloceluloza, octan celulozy, bursztynian hydroksypropylometylocelulozy. Są to związki o 

bardzo dużej masie cząsteczkowej, których zawartość najdokładniej można oznaczyć metodą SEC w 

połączeniu z detekcją IR, stosując jako eluent wodę z dodatkiem 1,5% DMF [36]. 

Również na zasadzie większej i mniejszej masy molowej dwóch komponentów, można oznaczyć 

składnik o niskiej masie molowej od polimeru. Przykładem może być oczyszczanie poliwinylopirolidonu (ang. 

Polyvinylpyrrolidone, PVP) z etanolu z zastosowaniem Sephadexu jako faza stacjonarna. 

Wykorzystanie SEC do frakcjonowania i preparatyki. 

W przypadku techniki preparatywnej stosuje się urządzenia różniące się konstrukcją od stosowanych 

do SEC w warunkach analitycznych. Podczas rozdzielania preparatywnego dozuje się duże objętości i 

zwiększa stężenie próbki, aby osiągnąć wysoką wydajność próbki. Jednak objętość dozowania ma swoje 

ograniczenia, wielkość, której nie może przekraczać. Rozdzielanie preparatywne polega na uzyskiwaniu 

frakcji np. polimerów, biopolimerów. Często wyizolowaną frakcję, o określonym zakresie masy 

cząsteczkowej poddaje się dalszej analizie stosując inne metody analityczne/chromatograficzne. Wydzielone 

za pomocą preparatywnej techniki SEC niskocząsteczkowe frakcje z żywności, gleb, produktów naftowych 

poddawane są analizie na zawartość niskocząsteczkowych zanieczyszczeń. Frakcjonowanie za pomocą 

chromatografii żelowej asfaltów i składników asfaltu jest tak samo skuteczne jak przypadku precypitacji ich z 

rozpuszczalnikiem [38]. 

W układach biologicznych zastosowanie SEC opiera się głównie na oczyszczaniu substancji od 

domieszek stosując uprzednio frakcjonowanie w warunkach preparatywnych. Technika ta umożliwia również 

odsalanie białek. Rozdzielanie materiałów biologicznych prowadzone jest w warunkach wodnych. Jednym z 

rodzaju rozdzielanych białek są składniki krwi. Żelem stosowanym zazwyczaj do rozdzielania białek 

wchodzących w skład osocza krwi jest Sephadex G-200. Często do oczyszczania stosuje się łączenie 

metody chromatografii żelowej z innymi metodami analitycznymi. Przykładem może być oczyszczanie 

kininogenu z osocza krwi człowieka. Wyodrębnia się formę małocząsteczkową, która spełnia funkcję 

fizjologiczną w procesach zapalnych. W organizmie ludzkim występują również formy wielkocząsteczkowe, 

pełniące inne funkcje. Pierwsze oczyszczanie składało się z 9 etapów, poza chromatografią wykluczania 

wykorzystano chromatografię jonowymienną [39]. SEC w warunkach wodnych umożliwia badanie 

składników krwi ryb i innych zwierząt. Duże znaczenie chromatografia żelowa ma podczas oczyszczania 

enzymów. Wyróżnić można oczyszczanie składników celulozy- karboksymetylocelulozę i awicelulozę, 

oczyszczanie ureazy z próchnicy. Izolacja wielu enzymów nie odbywa się wyłącznie z zastosowaniem 

techniki SEC, ale jest ona nieodłącznym elementem, gdyż zwiększa ona czystość wyizolowanych substancji. 

Chromatografia wykluczania służy również do charakterystyki innych białek jak np. wirusy białkowe. Po 

wydzieleniu białek lub peptydów, pochodzących z wirusa, określa się ich masę. Różnica mas (dwa składniki 

o różnej masie) występuje również w przypadku białek jakimi są toksyny (pochodzące z grzybów, jadu 

wężów). Składniki o różnych masach wykazują często różne właściwości. Stosując do chromatografii w 

warunkach wodnych żele sztywne o dużych porach można oczyszczać wirusy, unikając zjawiska adsorpcji. 

Przykładem może być oczyszczanie wirusa mozaiki tytoniowej z wyciągu zakażonych liści tytoniowych. W 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


102 

tym przypadku zaobserwowano, że wirus jest izolowany, od innych rozpuszczalnych substancji znajdujących 

się w roślinie, ponieważ jest wymywany w objętości martwej kolumny. SEC w tych warunkach (liofilowych) w 

układach biologicznych wykorzystywana jest również do rozdzielania sacharydów np. z krowiej protrombiny. 

Można uzyskiwać oczyszczone hormony, witaminy i toksyny izolowane z organizmów roślinnych i 

zwierzęcych stosując zazwyczaj jako fazę stacjonarną Sephadex. Tego rodzaju faza stacjonarna umożliwia 

także badanie i wydzielanie antybiotyków. SEC znajduje zastosowanie także w przemyśle spożywczym, 

umożliwia m.in. rozdzielanie barwników syntetycznych z soków [18,40]. 

Dodatkowe zastosowania. 

Kolumny stosowane do odsalania w warunkach SEC są wykorzystywane nie tylko w celu usunięcia 

zanieczyszczeń o małej masie cząsteczkowej takich jak sól. Wykorzystuje się je także w celu wymiany 

buforu przed i po zastosowaniu do różnych technik chromatograficznych oraz do szybkiego usuwania 

reagentów po zakończonej reakcji między wysokocząsteczkowymi i niskocząsteczkowymi reagentami. W ten 

sposób można usuwać fenol z cieczy przed wykonaniem rozdzielania w warunkach chromatografii 

jonowymiennej lub usuwać niezarejestrowane nukleotydy podczas sekwencjonowania, produkty i inhibitory 

enzymów oraz nieprzereagowane radioaktywne dodatki np. z reakcji znakowania kwasów nukleinowych 

przed przygotowaniem kwasu nukleinowego [41]. 

Sterylizacja jest podstawowym elementem procesu tworzenia polimerów stosowanych w medycynie. 

Jednak, techniki sterylizacji mogą mieć destrukcyjny wpływ na podstawowe cechy polimerów i wywoływać 

rozerwanie łańcucha, rozerwanie wiązania i zmiany w masie cząsteczkowej. W przypadku polimerów, które 

stosowane są do materiałów umożliwiających czasowe uwalnianie leku, wpływ sterylizacji musi być starannie 

monitorowany. Zmiany w strukturze polimeru mogą w zasadniczy sposób wpłynąć na wydajność i działanie 

danego leku. Chromatografia wykluczania z tradycyjną pojedynczą detekcją ma w tym przypadku 

ograniczone zastosowanie. Nie umożliwia niezbędnej, zaawansowanej analizy strukturalnej. Problem ten 

można rozwiązać poprzez zastosowanie w SEC połączenia kilku technik detekcji: MALLSD, 

refraktometrycznej i detektora lepkościowego. Uzyskane wyniki umożliwiają ilościową analizę destrukcji 

polimeru używanego w celach medycznych pod wpływem sterylizacji i umożliwiają rozwój skutecznych 

metod przygotowania danego polimeru [42-43]. 

Nowatorskim rozwiązaniem jest zastosowanie chromatografii wykluczania do wyznaczania rozkładu 

temperatury destylacji z zastosowaniem metody destylacji symulowanej (SIMDIS). W tym rozwiązaniu 

zastosowano standardowe kolumny SDVB oraz tetrahydrofuran jako eluent [44]. 

Porady przy stosowaniu GPC w analityce technicznej. 

Chromatografia wykluczania nastręcza pewnych trudności, a także posiada istotne ograniczenia. Aby 

otrzymać wiarygodne wyniki warto zastosować się do szeregu „dobrych praktyk” stosowania SEC. Badanie 

należy rozpocząć od poprawnie przygotowanej próbki. Badana próbka musi być rozpuszczona. Nie zaleca 

się zastosowania w tym celu ultradźwięków lub mieszadła magnetycznego, ponieważ może nastąpić 

degradacja próbki i rozrywanie łańcucha. Dlatego, należy cierpliwie poczekać, aż próbka rozpuści się, 

rozpuszczając pojedyncze łańcuchy. Jeśli proces rozpuszczania trwa kilka dni lub tygodni stosuje się 

stabilizowany rozpuszczalnik. W niektórych przypadkach zaleca się przechowywanie pojemnika z 

rozpuszczaną próbką w ciemnym otoczeniu/pomieszczeniu. W razie potrzeby, można zastosować delikatne 

mieszanie do uzyskania jednorodnego roztworu. W przypadku roztworów zawierających żele lub cząstki, 

filtruje się je przez filtr membranowy o średnicy porów równej lub mniejszej od 0,45µm. W przypadku próbek 

o dużych masach cząsteczkowych, filtr musi posiadać odpowiednią średnicę porów, aby uniknąć degradacji 

analizowanej substancji. Jednakże, nawet jeżeli cząsteczki są całkowicie rozpuszczone, to nie gwarantuje to 

odpowiedniej charakterystyki. Składniki mogą być zatrzymywane w kolumnie z powodu niepożądanych 

oddziaływań między fazą stacjonarną, a próbką lub częściowo usunięte podczas filtrowania. Dlatego zaleca 

się monitorowanie i mierzenie odzysku próbek. Najprostszym sposobem na sprawdzenie odzysku próbki jest 

pomiar powierzchni piku z i bez wypełnienia kolumny, zachowując niezmiennie pozostałe warunki. W celu 

pomiaru trzykrotnie wstrzykuje się ślepą próbę oraz badaną próbkę zaczynając od badania bez wypełnienia 

kolumny [45]. 

Dla próbek o dużej masie zaleca się przygotowanie niższych stężeń niż przy analizie związków 

małocząsteczkowych. Cząsteczki o wysokiej masie cząsteczkowej potrzebują miejsca do zajmowania ich 

hydrodynamicznych objętości bez ingerencji z innymi. Tabela 4. podsumowuje zalecane stężenia próbki na 

podstawie masy molowej. Zalecenia te są dla próbek o wąskim rozkładzie mas cząsteczkowych- o niskiej 

polidyspersyjności. Dla próbek o dużej polidyspersyjności wyższe stężenia są możliwe. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


Tabela 5. Zalecane stężenia próbki na podstawie masy molowej [46]. 

Table 5. Optimal concentration of samples depending on molecular mass. 

Masa cząsteczkowa [g/mol] 

Stężenie 

100-10000 2 mg/mL (0.2%) 

1000-1000000 1–2 mg/mL (0.1–0.2%) 

>1000000 0.5 mg/mL lub mniej (0.05%) 

Dla próbek które osiągają masę kilku milionów Daltonów rozważa się dodatkowe elementy doświadczalne. 

Ważne jest dostosowanie natężenia przepływu fazy ruchomej. Zwiększenie objętości przepływu może 

przyspieszyć analizę w warunkach SEC jednak dla związków o dużej masie może mieć niekorzystny wpływ 

na wynik. Polimery wykazują poszerzanie kształtu piku po uruchomieniu elucji w zbyt wysokiej prędkości 

przepływu, ponieważ mają bardzo niskie współczynniki dyfuzji. Zmniejszenie szybkości przepływu do np. 

0,25 ml/min lub mniejszej spowoduje otrzymanie bardziej realistycznych kształtów pików dla próbek o dużej 

masie. 

W celu poprawy analizy metodą SEC można także ograniczyć czas rozdzielania oraz ilość użytego 

eluentu poprzez zastosowanie krótszych kolumn, ale z tą samą średnicą wewnętrzną. Niestety, w wyniku 

takiego postępowania zmniejsza się rozdzielczość, a za nią dokładność i precyzja wyznaczenia masy 

cząsteczkowej. Na szybkość rozdzielania ma także wpływ dopasowanie wymiarów kolumny do czasu 

przepływu. Tabela 5. przedstawia optymalne dopasowanie średnicy wewnętrznej kolumny do prędkości 

liniowej i stosowanego przepływu. Stosując kolumny o dużej średnicy w połączeniu z dużą prędkością 

przepływu można osiągnąć dużą dokładność wyniku. Wewnętrzna średnica kolumny może być w tym 

przypadku tym większa, im krótsza jest kolumna [47]. 

Tabela 6. Prędkość liniowa i zalecana objętość przepływu dla typowych wymiarów kolumn stosowanych w 

SEC [47]. 

Table 6. Optimal linear velocity and volumetric flow for typical dimensions of SEC columns 

Rodzaj SEC Średnica wewnętrzna 

kolumny [mm] 

Prędkość 

[cm/min] 

liniowa 

Analityczna 7,5-8 2 0,5-1 

Preparatywna 20 2 3-10 

Objętościowe natężenie 

przepływu [ml/min] 

4. Podsumowanie 

(Summary) 

Mechanizm rozdzielania w SEC jest stosunkowo prosty, jeśli wyeliminuje się oddziaływania sorpcyjne 

między fazą stacjonarną, a fazą ruchomą. Opiera się na zasadzie przepływu cząsteczek, substancji 

rozpuszczonej w eluencie, o różnej wielkości i masie oraz „sączeniu” ich przez porowate wypełnienia 

kolumny. Rozdzielane cząsteczki wymywane są w zależności od wielkości - im mniejsze tym dłużej mogą 

przebywać wewnątrz porów. Rozdzielanie może następować w dwóch rodzajach warunków – liofilowych (z 

zastosowaniem organicznych eluentów) i hydrofilowych (z zastosowaniem wodnych eluentów wraz z 

dodatkami). 

Chromatografię wykluczania charakteryzuje szeroki zakres zastosowań. Odpowiednio dobrane 

warunki rozdzielania, tzn. faza stacjonarna, faza ruchoma oraz dodatki, wpływają na efektywność 

rozdzielania. SEC poza zastosowaniem w analityce, charakteryzuje się szerokim wykorzystaniem w 

frakcjonowaniu i przygotowywaniu związków do dalszej analizy, w szczególności substancji pochodzenia 

biologicznego. 

Literatura 

(Literature) 

[1] http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/tch/tch_tr_wu5.pdf [data dostępu: 

15.06.2015] 

[2] P. Stepnowski, E. Synak, B. Szafranek, Z. Kaczyński; Techniki separacyjne; Wydawnictwo 

Uniwersytetu Gdańskiego; Gdańsk 2010. 

[3] Ch. Wu; Handbook of Size Exclusion Chromatography and Related Techniques; Marcel Dekker, Inc. 2 

(2004). 

[4] C.E.H. Knapman; Developments in Chromatography-1; Applies Science Publisher LTD (1978). 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


104 

[5] S. Podzimek; Light Scattering,Size Exclusion Chromatography and Asymmetric Flow Field Flow 

Fractionation; A John Wiley & Sons, Inc. (2011). 

[6] J. Nawrocki; Wyznaczanie zakresu wykluczania dla wypełnień stosowanych w wysokosprawnej 

chromatografii wykluczania (HPSEC). 

http://www.staff.amu.edu.pl/~ZTUW/ftp/B3%20Wyznaczanie%20zakresu%20wykluczania.pdf [data 

dostępu: 16.12.2014]. 

[7] M. Kamiński; Chromatografia Cieczowa; Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny. 

Bezpłatny dostęp do wersji elektronicznej: 

http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/index.php/pl/matpomoc 

[8] D. Held; Tips & Tricks:GPC/SEC Method Optimization; The Column 6 (4.04.2013). 

[9] E.S.P. Bouvier, S. M. Koza; Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by 

UHPLC; Trends in Analytical Chemistry (2014). 

[10] http://www.waters.com/waters/en_PL/Frequently-Asked-GPC-SEC-Questions/nav.htm?cid=10167847 

[data dostępu: 20.12.2013]. 

[11] D. Held; Tips&Tricks: GPC/SEC Method Development; The Column 22 (3.12.2012). 

[12] L.R. Snyder, J.J. Kirkland; Introduction to modern liquid chromatography; John Wiley & Sons, Inc. 

(1974). 

[13] A. Chakrabarti, J. Steve; Analysis of Monoclonal Antibody Aggregates by SEC Using MS-Friendly 

Mobile Phases; LCGC (10.2014) 13. 

[14] S. Kromidas; HPLC Made to Measure: A Practical Handbook for Optimization; Wiley-vCH Verlahg 

BmbH & Co. KGaA, Weinheim (2006). 

[15] C. Henry; Sec Weighs In; Analytical Chemistry News & Features (1.07. 1996). 

[16] D. Held, P. Kilz; Tips & Tricks: GPC/SEC From a Chromatogram to the Molar Mass Distribution; The 

Column (15.12.2014). 

[17] ASTM D5296:97; Standard test method for molecular weight averages and molecular weight 

distribution of polystyrene by high performance size-exclusion chromatography. 

[18] D. Berek, M. Dressler, M.Kubinstr, K.Marcinka; Chromatografia żelowa; PWN 1 (1989). 

[19] S. Chakraborty, S. Bandyopadhyay , S. Dasgupta , R. Mukhopadhyay , A.S. Deuri. 

Application of GPC in characterization of MP resin through correlation of softening point and methylol 

content with weight average molecular weight; Polymer Testing 25 (2006) 12. 

[20] F. Gores; Absolute Molar Masses for Phenol Formaldehyde Resins with GPC/SEC-ESI; LCGC Asia 

Pacific (01.01.2012). 

[21] Applictation Note: GPC Characterization of Nylon using Formic Acid for Reduced Cost per Analysis; 

Malvern Instruments Limited (2014). 

[22] K.B. Andersson, A. Holmström, E.M. Sörvik; A comparison between different ways to obtain 

molecular weight distributions of PVC and a study on the anomalies of PVC in tetrahydrofuran 

solutions; Die Makromolekulare Chemie 1 (12.03.2003) 166 (1973), 247. 

[23] M. Szesztay, Z. László-Hedvig, F. Tüdős, H. H. Hörhold, J. Klee; GPC estimation of molecular mass 

distribution of addition polymers from bisphenol-a-diglycidyl ether and amines; Die Angewandte 

Makromolekulare Chemie 1(12.03.2003). 

[24] K. Se, T. Sakakibara, E. Ogawa; Molecular weight determination of star polymers and star block 

copolymers using GPC equipped with low-angle laser light-scattering; Polymer 43 (2002) 5447. 

[25] F. S.C. Chang; GPC Analysis of Block Copolymers; Advances in Chemistry, 125 (2009). 

[26] E. Meehan; Characterisation of hydroxypropylmethylcellulose phthalate (HPMCP) by GPC using a 

modified organic solvent; Anal. Chim. 557 (2006) 2. 

[27] L.R. Snyder; Determination of asphalt molecular weight distributions by gel permeation 

chromatography; Anal. Chem. 41 (1969). 

[28] L. Rao and J. Beirne ; Molecular Weight Determination of LMWH SEC/MALS vs. SEC/UV-RI; Wyatt 

Technology Corporation 7/24/12 (2012). 

[29] R. Lemmes, D. Schwengers, B. Weimann; Determination of molar mass and molar mass distribution 

of blood plasma substitutes (plasma expanders); Makromolekulare Chemie. Macromolecular 

Symposia 1 (2.03.2011). 

[30] G. Reinhold; Molar Mass Determination of Gelatins Using GPC/SEC; LCGC (01.02.2012). 

[31] K. Ito; Effects of Solvent pH on the SEC Analysis of Sodium Polyacrylate; LCGC (01.01.2013). 

[32] C.N. Christopoulou, E.G Perkins; High Performance Size Exclusion Chromatography of Monomer 

Dimer and Trimer Mixtures; JAOCS, 1338 (1989), 66. 

[33] S. Bastida, F.J. Sanchez-Muniz; Polar Content vs. TAG Oligomer Content in the Frying-Life 

Assessment of Monounsalturated and Polyunsanturated Oils Used in Deep-Frying; JAOCS 5 (2002). 

[34] S. Fekete, A. Beck, J.L. Veuthey, D. Guillarme; Theory and practice of size exclusion chromatography 

for the analysis of protein aggregates; J Pharm Biomed Anal 101 (2014) 161–173, 165. 

[35] H. Wang, Z. Hao, X. Liu, S. Lin; Analysis of Monoclonal Antibodies and Their Fragments by SEC 

Coupled with HRAM-MS; The Column (15.12.2014). 

[36] M. Zhou , K. Ito; Characterization of Polymeric Excipients by SEC-IR; LCGC (06.01.2012). 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


[37] R. Pawłowicz, B. Drozdowski; Analiza jakościowa i ilościowa tłuszczów smażalniczych metodą 

HPSEC; Tłuszcze Jadalne, 32 (1997), 71. 

[38] K. H. Altgelt; Gel permeation chromatography of asphalts and asphaltenes. Part I. Fractionation 

procedure; Die Makromolekulare Chemie 1. 

[39] W. Sakamoto, O. Nishikaze; Purification and immunochemical properties of human low molecular 

weight kininogen. J Biochem (1979). 

[40] A. Striegel, W.W. Yau, J.J. Kirkland, D.D. Bly; Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography: 

Practice of Gel Permeation and Gel Filtration Chromatography; John Wiley & Sons, Inc. (2009), 393. 

[41] Harvard Apparatus; Guide to Gel Filtration or Size Exclusion Chromatography; (2010) 11. 

[42] I. Suárez, B. Coto; Determination of long chain branching in PE samples by GPC-MALS and GPC- 

VIS: Comparison and uncertainties; European Polymer Journal 49 (2013) 492. 

[43] B. Sabagh, A. Valero-Navarro; Using Multi-Detection GPC/SEC to Determine Impact of Sterilization on 

Medical-Grade Polymers; The Column 10 (5.06.2014) 

[44] G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, Size-exclusion chromatography for the determination of the 

boiling point distribution of high-boiling petroleum fractions, J. Sep. Sci. 38 (2015), 741. 

[45] D. Held, Peter Kilz; Tips & Tricks GPC/SEC: Sample Recovery and More; The Column (06.10.2014) 

[46] D. Held; Tips & Tricks GPC/SEC: The Art of Analyzing High Molar Mass Samples; The Column 10 

(5.06.2014) 

[47] D. Held, G. Reinhold, Peter Kilz; Tips & Tricks GPC/SEC: U-GPC? Making GPC/SEC faster; The 

Column 6 (06.04.2010) 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

106 Instrukcje dla autorów 


INSTRUKCJE DLA AUTORÓW 

W Camera Separatoria wydawane są artykuły oryginalne (nie publikowane wcześniej) oraz 

przeglądowe poświęcone różnym działom nauki, techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane 

będą listy do redakcji, informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek, reklamy, materiały 

firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o konferencjach. 

Artykuł do CamSep przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003 lub nowszym (w formacie .doc 

lub .docx) zgodnie z przedstawionym poniżej opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres 

e-mail: camera.separatoria@gmail.com. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu. 

* * * 

Jan KOWALSKI, Anna KOWALSKA* (Arial 12 pkt., bold) 

1 

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii, 

Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce, 

* Autor do korespondencji, e-mail: camera.separatoria@gmail.com 

2 Uniwersytet … (Afiliacja – Arial 9 pkt., normal bez boldu) 

Tytuł artykułu w języku polskim – 12 pkt. Arial bold 

Streszczenie: (Arial 9 pkt. normal bold). Treść streszczenia – Arial 9 pkt. kursywa bez boldu. Streszczenie 

polskojęzyczne powinno zawierać około 500 – 700 znaków (ze spacjami). Należy w nim krótko wskazać czego dotyczy 

artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. 

Słowa kluczowe: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą 

Tytuł artykułu w języku angielskim – 12 pkt. Arial bold – kursywa 

Abstract: (Arial 9 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne – Arial 9 pkt. kursywa bez boldu, powinno być 

rozszerzone, o objętości około 1000 – 1200 znaków (ze spacjami). Powinno zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł, 

co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. 

Key words: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą 

Podtytuły ponumerowane – Arial 12 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna, 

Wyniki i dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) – wersja polska - 

normal i (angielska - kursywą), 

Śródtytuły ponumerowane – Arial 11 pkt., bold, wersja polska i angielska - kursywą 

Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany – Arial 10 pkt., odstępy między 

wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden sposób podziałów wierszy. Wszystkie marginesy 2 cm. 

Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane przenoszone z tekstem. Wzory 

napisane w edytorze równań należy traktować jako element zdania np.: 

V R 

t 

RF 

(1) 

gdzie: 

V R – objętość retencji, 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

Instrukcje dla autorów 

107 

t R – czas retencji [min.], 

F – przepływ gazu nośnego [cm 3 /s]. 

Symbole użyte we wzorach powinny mieć rozmiar zgodny z rozmiarem czcionki tekstu rozdziału. 

Wzory należy numerować kolejno w całym tekście artykułu. Numery wzorów powinny być wyrównane do 

prawej. Oznaczenia stosowane na rysunkach i w tabelach muszą być czytelne i zgodne z oznaczeniami 

używanymi we wzorach i w tekście artykułu. Nazwy związków chemicznych stosować zgodnie z 

nomenklaturą IUPAC, jednostki z układu SI. 

W odpowiednie miejsca w tekście należy wstawić rysunki i tabele wraz z tytułami. Powinny one 

znajdować się w miejscach, w których po raz pierwszy są do nich odwołania w tekście artykułu. Rysunki i 

zdjęcia zamieszczone w artykule muszą być czytelne i kontrastowe oraz zapisane jako czarno-białe lub w 

skali odcieni szarości (w wersji elektronicznej mogą być w kolorze). 

Rysunki i tabele należy numerować kolejno w całym tekście artykułu (Rys. i Tab. nr arabskie). 

Tytuły rysunków i tabel należy podać w języku polskim i angielskim (kursywą) jak na przykładzie 

przedstawionym poniżej: 

Tabela 1. Całkowita emisja metali z obszaru Polski według rodzajów działalności. Arial 10 pkt. 

Table 1. Total emission of heavy metals in the area of Poland kinds of activities. Arial 10 pkt. 

Ogółem 

(Total) 

Elektrociepłownie, elektrownie, 

ciepłownie 

(Heat and power plants, power 

stations) 

Cd Pb Cu Zn Ni 

tony 

66,1 555,0 390,9 2345,1 295,8 

1,9 19,9 12,8 59,2 72,2 

Tabele w pionie nie mogą przekraczać szerokości 12 cm, a w poziomie – 18 cm. Czcionka wewnątrz tabeli – 

Arial 8 lub 9 pkt. 

Rysunek, wykres, czy inna forma materiału ilustracyjnego nie może przekraczać w pionie – szerokości 

12 cm, wysokości 18 cm; w poziomie – szer. – 18 cm, wysokości – 9÷10 cm (na stronie musi zmieścić się 

jeszcze podpis do rysunku). Materiał ilustracyjny powinien być zapisany z rozszerzeniem JPG i przesłany 

dodatkowo w oddzielnych plikach podpisanych, jako Rys.1., Rys. 2. itd. 

Rys. 1. Tytuł rysunku w języku polskim, Arial 9 pkt. 

Fig. 1. Tytuł rysunku w języku angielskim, Arial 9 pkt. 

Literatura 

(w tekście numerujemy w kolejności cytowania [1], [2, 3], [4-8] itd., - Arial 10 pkt.): 

1. L.E. Green, J.C. Worman, Research of separation…, Anal. Chem., 37(1965)1620. 

Oprócz danych bibliograficznych należy zamieścić tytuł, w tym także publikacji, materiału z internetu, opisu 

patentowego itp. Tytuł w j. polskim, lub innym, niż język polskim jest pisany zwykłym drukiem w cudzysłowie, 

tytuł w języku angielskim – kursywą. 

2. T. Paryjczak, „Chromatografia gazowa…”, tłumaczenie tytułu na j. angielski kursywą, PWN, Warszawa 

1986. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


(w przypadku, gdy tytuł pracy jest w innym języku, niż po angielsku, należy tytuł oryginalny napisać w języku 

oryginału, a następnie jego tłumaczenie na język angielski - kursywą) 

Wszystkie materiały: 

artykuł (w formacie .doc, .docx, lub .rtf), 

dodatkowo zdjęcia i rysunki (w formacie JPG), 

prosimy przesyłać w formie plików, w jednej wiadomości na adres e-mail: camera.separatoria@gmail.com 

* * * 

Przesłany artykuł do CamSep podlega wstępnej ocenie przez Edytora, następnie przekazywany jest 

dwóm recenzentom do oceny. Recenzenci pozostają anonimowi. 

O przyjęciu artykułu do druku decyduje redakcja, w oparciu o przygotowaną recenzję. Jeśli w jej 

wyniku zachodzi konieczność poprawienia artykułu przez autora, to powinno to nastąpić w okresie nie 

dłuższym niż trzy tygodnie. Po tym terminie uważa się, że autor rezygnuje z publikacji lub gdy artykuł 

zostanie przesłany do redakcji podlegać on będzie ponownej ocenie. 

Po opublikowaniu autorzy bezpłatnie otrzymują elektroniczna wersję artykułu i właściwy nr CamSep 

jako egzemplarz autorski. 

Ogłoszenia/reklamy mogą być publikowane za odpowiednią, wcześniej ustaloną, opłatą. 

Przepisy etyczne 

Ważne jest, aby uzgodnić standardy etycznych zachowań dla wszystkich zaangażowanych w 

działania publikacji: autora, redaktora czasopisma, recenzenta, wydawcy i społeczeństwa czasopism. 

Redaktorzy i recenzent są zobowiązani do zapewnienia, że reklama, przedruk lub inny przychód komercyjny, 

nie ma wpływu na decyzje redakcyjne. Nie mogą oni ujawniać żadnych informacji na temat przedstawionego 

rękopisu do kogokolwiek innego niż autora artykułu. Niepublikowane materiały, ujawnione w przedstawionej 

pracy, nie mogą być używane przez redaktorów/recenzentów, jako część własnych badań bez pisemnej 

zgody autora. Powielanie lub adaptacja opublikowany wcześniej tabel, rycin, ilustracji lub obszernych 

cytatów z innych źródeł, akceptowana jest tylko za posiadaniem odpowiedniej pisemnej zgody autora. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


109 

Zapory ghostwriting i guest-autorship 

Zgodnie z wytycznymi MNiSzW (https://pbn.nauka.gov.pl/static/doc/wyjasnienie_dotyczace_ghostwriting.pdf 

[dostęp 19.01. 2012 r.]). oraz dbając o rzetelność naukową publikacji Redakcja Camera Separatoria wdraża 

procedury wykluczające nieetyczne działania przy publikowaniu wyników badań. Warunkiem publikacji 

artykułu jest ich zachowanie przez Autorów. Przejawy braku rzetelności i działań nieetycznych będą 

dokumentowane przez redakcję. Po zakwalifikowaniu publikacji do druku Autor korespondujący 

zobowiązany jest do przesłania oświadczenia, że wszyscy współautorzy brali czynny udział w jej 

przygotowaniu i są współposiadaczami praw autorskich. Aby autorstwo było uzasadnione musi opierać się 

na istotnym wkładzie do (i) opracowania idei (koncepcji) pracy, (ii) wykonania eksperymentu, (iii) analizy i/lub 

interpretacji danych, (iv) opracowaniu artykułu i jego krytycznej oceny. Nie zalicza się do tego udziału 

działania polegającego jedynie na zbieraniu funduszy lub zbieraniu danych oraz nadzorowanie pracy. W 

oświadczeniu musi się także znajdować zapis o niepominięciu w składzie zespołu autorskiego nikogo, kto 

wniósł istotny wkład badawczy w powstanie pracy. Redakcja może dodatkowo zwrócić się Autorów o 

wskazanie tego z nich, który ma największy udział w publikacji i procentowego udziału pozostałych autorów, 

a także podania który z autorów jest twórcą koncepcji badawczej, metodyki badań, analizy wyników itd. 

.………………….… 

miejscowość, data 

………………..………………. 

imię i nazwisko (nr dow. os.) 

…………………………………………………..…….. 

afiliacja 

…………………………………………………..…….. 

adres do korespondencji, e-mail, nr telefonu 

Oświadczam, że zostałem poinformowany o zasadach związanych z zaporą ghostwriting i guest-authorship. 

W związku z tym wraz z manuskryptem publikacji poniżej załączam informacje o podmiotach 

przyczyniających się do jej powstania (wkład merytoryczny, rzeczowy, finansowy etc.), z podaniem ich 

afiliacji oraz udziału, tj. informacji kto jest autorem koncepcji, wykonawstwa eksperymentu, obliczeń i/lub 

wyprowadzenia wzorów, protokołu itp. oraz dane o źródłach finansowania publikacji (financialdisclosure). 

Jako osoba zgłaszająca manuskrypt do druku ponoszę odpowiedzialność za podanie danych zgodnych z 

prawdą. Zgłoszenie artykułu jest jednoznaczne z przekazaniem Redakcji praw do opublikowania artykułu w 

wersji papierowej i elektronicznej. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria


Vol. 6, No 2/2014 

Instructions for Authors and Editorial Policy 

Camera Separatoria is a scholarly and peer-reviewed journal (print and online) published 2 times per 

year which was founded in 2009. It is a continuation of the journal Postępy Chromatografii (Progress in 

Chromatography) devoted to the science, technique and technology of separation. It provides a medium for 

the publication of theoretical and experimental studies and reviews related to separation science: 

chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, exctraction, electroseparation etc. 

Camera Separatoria publishes original (not published previously and are not currently under 

consideration by another journal except in the form of an abstract or as part of a published lecture, review, or 

thesis) and review papers from all branches of separation science, technique and technology. Additionally 

letters to the editor; expert opinions; information on instrumentation, book reviews and information about 

conferences as well as advertisements are also published. The journal welcomes contributions which 

promote the exchange of ideas and rational discourse between practicing educators and material 

researchers all over the world. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e-mail. No 

limitation of the articles lengths are provided. The manuscript should be original, has not been published 

previously and should not be currently being considered by another journal. 

The manuscript can be submitted to any editor, together with the cover letter, using e-mail. No 

limitation of the articles lengths are provided. 

Manuscript should be prepared using MS-Word editor in the .doc/.docx format. Detailed rules are 

presented on http://www.uph.edu.pl/index.php/druki-firmowe/dokumenty-wydawnictwa-ap.html. It should be 

typed in single-spaced lines using Arial 10p. font with the overall page numbering (at the center of bottom 

margins). Tables (Arabic numeration, title in Polish and English, Arial 10p.), figures and figure captions 

(Arabic numeration, in Polish and English, Arial 9p.) and references can be placed directly to the text. The 

main heading appears in the following order: 

- list of Authors by first, middle names, surname (capital letters); the Corresponding Author’s name should be 

accompanied by an asterisk (*); if Authors are from more than one affiliation, use superscript numbers to 

link the Authors’ names and their affiliations, 

- list of affiliations and complete mailing addresses of the authors (including zip code, city, street, and 

number; for universities, the faculty or department should be given), 

- the title (should not exceed 20 words) of the article in Polish as well as English, (in all capital letters, Arial 

12p.), 

- if there is more than one affiliation, use asterisks to indicate the institute with which each author is affiliated, 

as it is presented below: 

Jan K. KOWALSKI, Karol ROBERT* 

Department of Separation Science, Institute of Chemistry 

ul. 1 Maja 3, 00-000 Warszawa 

*e-mail: camera@separatoria.eu 

I Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne 

1 st Podlasie’s Chromatographic Meeting 

Body text… 

In the subsequent text, the following parts are is desirable: abstract (in Polish and English, Arial 9p.), 

keywords (about five, in Polish and English, Arial 9p.), introduction (review of literature and formulation the 

aim of the paper), experimental (reagents, apparatus, protocols, data analysis), results and discussion, 

conclusions, acknowledgments and literature. The SI units and nomenclature recommended by IUPAC 

should be used. References should be typed in the forms: 

1. J.K. Kowalski, K. Robert, Research of separation…, J. Sep. Sci., 44(2000)666. 

2. A. Adzik, in Fundamentals of Separation Science, K. Karol, ed., PTNoR, Reymontówka 2000. 

3. Polish standard PN – EN ISO 17993, text… 

4. S. Separator, Proceedings of 2 nd Podlachia’s Chromatographic Meeting, Kotuń-Chlewiska, Sep. 12-18, 

1987. 

in a list at the end of article and numbered in the order of appearance. Citation in the text should be denoted 

by number in square brackets. 

One of the Editor first evaluates the manuscript. Exceptionally it can be accepted at this stage. Those 

rejected at this stage are passed on to 2 experts for review. Acceptance for publication is subject to positive 

recommendation from the referees. The referees remains anonymous throughout the process. Reviewers 

are not supposed to contact the authors or to otherwise make their identity known. The referees are asked to 

evaluate the manuscript according to the below rules within 3 weeks. Authors have three months to correct 

Camera Separatoria


111 

the article after the reviewing process. After this time, the returned article is considered as newly received. 

The authors receive the electronic version of their paper and the proper volume of Camera Separatoria free 

of charge. 

Advertisements may be published according to the prescribed rates. 

* * * 

Ethical guidelines 

It is crucial to agree upon standards of expected ethical behavior for all involved in the act of 

publishing: author, editor, reviewer, publisher and society. Editors and reviewer are committed to ensuring 

that advertising, reprint or other commercial revenue has no impact or influence on editorial decisions. They 

must not disclose any information about a submitted manuscript to anyone other than the corresponding 

author. The unpublished materials disclosed in a submitted manuscript must not be used in an 

editor's/referee’s own research without the express written consent of the author. The reproduction or 

adaptation of previously published tables, figures, illustrations, or extensive quotations from other sources 

must obtain appropriate written permission. 

Vol. 6, No 2/2014 

Camera Separatoria

CamSep 6 2

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?