Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Miesięcznikcopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Farmaceutycznywww.fpn.info.plCena 24,50 złPrzegląd NaukowyIC Value - Current 4,55MNiSW 4ROK VII (XI)Nr 3/2010 (62)Scientific Review in PharmacyWpływ wybranych induktorówna profil izoform cytochromu P450w wątrobie szczura w różnych fazachżycia pozapłodowegoOcena lekowrażliwości ziarenkowców Gramdodatnichizolowanych z materiałów klinicznych pacjentówhospitalizowanych w oddziale chirurgiiurazowo-ortopedycznejDabigatran – doustny bezpośredni inhibitor trombiny.0W poszukiwaniu doskonałego leku przeciwzakrzepowego 0Wpływ endotoksyny Desulfovibriop desulfuricansna ekspresję genów kodujących IL-6 i receptor IL-6w komórkach nowotworowych jelita grubego Caco-2ISSN 1425-507321latWłaściwości lecznicze betuliny i kwasu betulinowego,składników ekstraktu z kory brzozyWpływ inhibitorów pompy protonowej (H + /K + -ATPazy)na układ kostny szczurów0Ekspresja genu surwiwiny w raku jelita grubego1

Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:Prof. dr hab. Krystyna OlczykAdres redakcji / Editorial Adress:ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / PolandTel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax. + 48 32 364 11 58E-mail: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.plKonsultacyjna Rada Naukowa / Scientific BoardPrzewodniczący / Head:Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - SosnowiecCzłonkowie / Members:Prof. dr hab. Edward Bańkowski - BiałystokProf. dr Karmela Barišić - Zagreb, ChorwacjaProf. dr hab. Jerzy Brandys - KrakówProf. dr Vitalis Briedis - Kaunas, LitwaProf. dr hab. Elżbieta Brzezińska - ŁódźProf. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, HiszpaniaProf. dr. Lionel Buéno - Toulouse, FrancjaProf. dr hab. Kazimierz Głowniak - LublinProf. dr hab. Edmund Grześkowiak - PoznańProf. dr Filiz Hincal - Ankara, TurcjaProf. dr. Michael Horowitz - Adelaide, AustraliaProf. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, AustriaSekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary:Dr n. med. Robert D. WojtyczkaE-mail: fpn@kwiecinski.plProf. dr hab. Renata Jachowicz - KrakówProf. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - LublinProf. dr hab. Krzysztof Jonderko - SosnowiecProf. dr hab. Marcin Kamiński - KatowiceProf. dr Vesna Kuntić - Belgrade, SerbiaProf. dr hab. Jan Pachecka - WarszawaProf. dr hab. Jerzy Pałka - BiałystokProf. dr hab. Janusz Pluta - WrocławProf. dr hab. Janusz Solski - LublinProf. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, JaponiaProf. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, FrancjaProf. dr hab. Marek Wesołowski - GdańskProf. dr Mira Zečević - Belgrade, SerbiaCzłonkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:Dr n. farm. Paweł OlczykDr n. biol. Małgorzata KępaMgr Anna SzeremetaMgr Agnieszka Jura – PółtorakDr n. hum. Anna KierczakWydawca / Publisher:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego21latAdres Wydawcy / Publisher Adress:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Polandtel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor:Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy PartykaE-mail: agnieszka.romanska@kwiecinski.plNakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copiesFarmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego.Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawachz 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowanianadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodąwydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcjanie odpowiada.All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyrightlaws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves therights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprintsare allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible foradvertisements and reader letters.

Zdj. Zygmunt WieczorekSzanowni Państwo,Koleżanki i Koledzy,Drodzy CzytelnicyZapraszam na łamy trzeciego w bieżącym roku numeruFarmaceutycznego Przeglądu Naukowego.Z dumą informuję Państwa, iż czasopismo nasze posiadanową, profesjonalną i „przyjazną” stronę internetową.Korzystając z niej można – dzięki dwom wyszukiwarkom,z których jedna oparta jest na nazwisku autora, zaś druga– na (przybliżonym) tytule artykułu, odnaleźć publikacjęz zakresu poszukiwanej dziedziny. Strona ta jest dziełemnaszego niezwykle zdolnego, pracowitego i obdarzonegoartystycznym talentem informatyka, który pracuje obecnienad anglojęzyczną wersją nowej strony internetowej. Jejuruchomienie pozwoli na „przypomnienie” członkom KonsultacyjnejRady Naukowej z zagranicy o FarmaceutycznymPrzeglądzie Naukowym. Żywię nadzieję, iż nasz Przegląd zczasem stanie się czasopismem o szerszym, międzynarodowymzasięgu. Powoli i sami nadsyłamy prace anglojęzycznei jest ich coraz więcej. Z pewnością będziemy FPN niebawemprzesyłać poza granice kraju.Nową stronę internetową Farmaceutycznego PrzegląduNaukowego znajdą Państwo pod adresem fpn.sum.edu.pl.Można do niej także dotrzeć poprzez stronę Śląskiego UniwersytetuMedycznego w Katowicach (www.sum.edu.pl),otwierając zakładkę p.t.: Wydawnictwa.Szanowni Państwo. W bieżącym numerze tradycyjnie informacjao naukowej konferencji. Tym razem jest to zapowiedźInternational Symposium on Medicinal Chemistry, które odbędziesię w Brukseli, w dniach 5 – 9 wrzesień bieżącego roku.Jak zawsze zachęcam do lektury prac zamieszczonychw bieżącym numerze Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego,i – jak zawsze – zachęcam do nadsyłania prac, dziękiktórym możemy podziwiać Państwa dorobek naukowy, aleprzede wszystkim uczyć się i poszerzać swoją wiedzę.Życzę miłej lektury w już coraz cieplejsze, i niemalpachnące nadchodzącym latem, dni.Serdecznie Państwa pozdrawiam,Redaktor NaczelnyProf. dr hab. Krystyna Olczyk

Nr 3 / 2010Spis treściWpływ wybranych induktorów na profil izoform cytochromu P450w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowego0 8The influence of the some inductors on the composition 0of the cytochrome P450 isoforms in the rat liverin the different phases of the life after birth0Ocena lekowrażliwości ziarenkowców Gramdodatnichizolowanych z materiałów klinicznych pacjentów 0hospitalizowanych w oddziale chirurgii urazowo-ortopedycznej0 16Antimicrobial susceptibility of Gram-positive cocciisolated 0from clinical specimens from orthopedic patients0Dabigatran – doustny bezpośredni inhibitor trombiny.0W poszukiwaniu doskonałego leku przeciwzakrzepowego 0 22Dabigatran – oral direct trombin inhibitor.In search of the perfect anticoagulant drugWpływ endotoksyny Desulfovibriop desulfuricansna ekspresję genów kodujących IL-6 i receptor IL-6w komórkach nowotworowych jelita grubego Caco-20 27The influence of Desulfovibrio desulfuricans endotoxin on IL-6and IL-6 receptor genes expression 0in colon cancer Caco-2 cellsWłaściwości lecznicze betuliny i kwasu betulinowego,składników ekstraktu z kory brzozy0 33Therapeutic properties of betulin and betulinic acid,components of birch bark extract033Wpływ inhibitorów pompy protonowej (H + /K + -ATPazy)na układ kostny szczurów0 40Effect of proton pump (H + /K + -ATPase) inhibitors 0on skeletal system in rats0Ekspresja genu surwiwiny w raku jelita grubego 0 46Survivin Gene Expression in Colorectal Cancer

Farm Przegl Nauk, 2010,3, 8-15Wpływ wybranych induktorów na profil izoform cytochromu P450w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowegoThe influence of the some inductors on the compositionof the cytochrome P450 isoforms in the rat liverin the different phases of the life after birthAndrzej Plewka 1 , Danuta Plewka 2 , Józef Waloszek 1 , Jacek Marczyński 11Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec2Katedra Morfologii, Zakład Histologii, Śląski Uniwersytet Medyczny, KatowiceStreszczenieJedną z unikalnych właściwości mikrosomalnego układumetabolizmu leków i ksenobiotyków jest jego indukcyjnośćzachodząca pod wpływem różnych związkówchemicznych. Celem badań było wykazanie jak zmieniasię profil konstytucyjnych i indukowalnych izoform cytochromuP450 związanych z metabolizmem ksenobiotykóww funkcji wieku. Szczególnej uwadze poddano te izoformy,które pojawiają się w różnych fazach życia szczura poindukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonowej i deksametazonowej.Badania przeprowadzono na samcach szczurzychrasy Wistar. Serie badawcze obejmowały 8 grup wiekowych,tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne.W wyizolowanej z wątroby frakcji mikrosomalnej ocenianopoziomy następujących białek: CYP3A1, CYP2C11,CYP2C6, CYP2A1, CYP1A1, CYP1A2 i CYP2B1/2. Wykazano,że w serii fenobarbitalowej z ocenianych izoform,trzy, tj. CYP2B1/2, CYP2C6 i CYP2A1 były obserwowanewe wszystkich badanych przedziałach wiekowych. Najdynamiczniejprzyrastała izoforma CYP2B1/2, która począwszyod 2 miesiąca życia szczura 7-krotnie przekraczała poziomujawniony w najmłodszej z badanych grup. PoziomCYP2C6 i CYP2A1 w tym samym czasie osiągał wartości,co najwyżej 3-krotnie przewyższające poziom zwierzątnajmłodszych. W serii β-naftoflawonowej izoforma CY-P1A1 szybko zwiększała swoje stężenie i już u zwierząt2 miesięcznych stwierdzono poziom sięgający 700% wartościgrupy najmłodszej. W serii deksametazonowej bardzodynamicznie narastał poziom izoformy CYP3A1. Już w1 miesiącu życia stwierdzono ponad 300% indukcję, któraw kolejnych fazach życia sięgała nawet 650% kontroli.Na podstawie badań można sądzić, że zmiany całkowitejzawartości cytochromu P450 nie wynikają z podobnychzmian, przynajmniej głównych indukowalnych izoform tejhemoproteiny.Słowa kluczowe: szczur, wątroba, wiek, cytochrom P450,indukcjaAbstractOne of the unique features of the microsomal system of themedicines and xenobiotics metabolism is its induction happeningunder the influence of the different chemical compounds.The aim of the resarches was to demonstrate howthe profile of the constitutional and inducible cytochromeP450 isoforms connected with the xenobiotic metabolismis changing in the function of the age of the rat. Especially,the attention was turned to these isoforms that appear inthe different phases of the rat life after the phenobarbitale,β-naphthoflawone and dexametazone induction. Theresearches were done on male rats (breed of Wistar). Theresearch series concerned 8 age groups of the rats: 0.5-, 1-,2-, 4-, 8-, 12-, 20- and 28 months old. There were evaluatedthe levels of the following proteins: CYP3A1, CYP2C11,CYP2C6, CYP2A1, CYP1A1, CYP1A2 and CYP2B1/2 inthe isolated from the liver microsomal fraction. It was provedthat the in phenobarbitale series three of the evaluated isoforms:CYP2B1/2, CYP2C6 and CYP2A1 were observedin all researched age brackets. The isoform CYP2B1/2 wasgrowing the most dynamic, starting from the 2. month ofthe rat life it exceeded seven times the level revealed inthe youngest of the researched groups. At the same time,the level of CYP2C6 and CYP2A1 reached values whichat the most exceeded three times the level of the youngestanimals. In the β-naphthoflawone series the concentrationof the isoform CYP1A1 was increasing very fast and thelevel reaching 700 per cent of the value of the youngestgroup was already observed in the 2-month-old animals. Inthe dexametazone series the level of the isoform CYP3A1was growing very dynamic. In the first month of life therewas already founded over 300 per cent induction, which inthe following phases of life reached even 650 per cent ofthe control. According to the researches it can be concludedthat general changes of the cytochrome P450 content do notresult from the synchronized changes of the main constitutionaland inducible isoforms of this hemoproptein.Key words: rat, liver, ageing, cytochrome P450, induction8

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073WstępJedną z unikalnych właściwości mikrosomalnego układumetabolizmu leków jest jego indukcyjność zachodząca podwpływem związków chemicznych w metabolizmie, którychuczestniczy [1-5]. Liczbę tych związków szacuje się obecniena ponad 250. Są to substancje różne tak pod względemnatury chemicznej jak i działania biologicznego.Induktory dzieli się na kilka grup. Reprezentantem pierwszejz nich jest fenobarbital, drugiej 3-metylocholantren czyβ-naftoflawon a trzeciej, 16α-karbonitryl pregnenolonu.Pierwsza grupa induktorów obejmuje związki przestrzennei niepolarne, takie jak barbiturany czy wielochlorowcowebifenyle. Do grupy drugiej należą związki o płaskich pierścieniach,między innymi policykliczne węglowodory aromatyczne,fenotiazyny, indole czy flawonoidy. Do trzeciejnależą głównie hormony steroidowe i ich analogi. Kolejnąz nich reprezentuje etanol [6-8]. Indukowana etanolem izoformaCYP2E1 odpowiada za wysoką aktywność oksydacyjną,conajmniej 3-krotny wzrost zużycia NADPH i jestona zaangażowana w mikrosomalną peroksydację lipidów[9]. Ostatnią z omawianych grup reprezentuje klofibrat [10],który indukuje rodzinę 4 cytochromu P450. Izoenzymy tepojawiają się z równoczesną proliferacją peroksysomów[10] i zwiększają hydroksylację kwasów tłuszczowych.Fenobarbital indukuje akumulację mRNA dla cytochromówP450 2B1 i 2B2 z poziomów niemierzalnych w wątrobachszczurów kontrolnych do dominujących po indukcjijuż po kilku godzinach [11]. W wątrobach szczurów fenobarbitalpowoduje w ciągu 3-4 godzin 20-50 krotny wzrosttempa transkrypcji genu dla cytochromu P450 2B1 i 2B2, poczym następuje akumulacja specyficznego mRNA [12, 13].Wzrost zawartości cytochromu P450 jest porównywalny dowzrostu transkrypcji. Maksymalną zawartość ogólną cytochromuP450 uzyskuje się w 3 dniu po podaniu induktora,jednak nie przekracza ona poziomu kontrolnego więcej niż2-4-krotnie. Zwiększonej zawartości hemoproteiny towarzyszytakże przyrost ogólnej masy wątroby, wzrost stężeniabiałka i fosfolipidów. Indukcji podlega aktywność reduktazyzależnej od NADPH, N-demetylaza 4-aminopiryny czybenzofetaminy, hydroksylazy aniliny, hydratazy epoksydowejitd.Z drugiej grupy induktorów najlepiej poznanym jest3-metylocholantren, β-naftoflawon oraz benzo(a)piren. Tagrupa związków indukuje wyspecjalizowaną, ale też ograniczonąliczbę enzymów. Po podaniu induktora tej grupy,aktywność monooksygenazowa zaczyna narastać po4 - i osiąga maksimum po 24 godzinach. Jest to spowodowanedziałaniem induktora na transkrypcję P4501A1-mRNA,który zwykle nie ulega ekspresji w wątrobie zwierząt kontrolnych.Stopień indukcji różni się w zależności od narządu[14, 15], ale z reguły jest wyższy od fenobarbitalowego.Indukowane poziomy aktywności enzymatycznej przekraczajączęsto kilkadziesiąt razy wartość grup kontrolnych.Indukcji podlega między innymi aktywność hydroksylazywęglowodorów aromatycznych (AHH), transferazy kwasuUDP-glukuronowego, hydroksylazy acetanilidu itd. [16].16α-Karbonitryl pregnenolonu (PCN), główny induktorfizjologiczny wywołuje proliferację wątrobowej siateczkiśródplazmatycznej i wzrost ogólnej zawartości cytochromuP450. Ksenobiotyk ten indukuje odmienne aktywnościmonooksygenazowe niż fenobarbital i 3-metylocholantren[17]. Wykazano, że PCN czy deksametazon podwyższajątempo syntezy cytochromu P450 oraz akumulację mRNAdla podrodziny CYP3A [18]. Sugeruje to, że etap transkrypcjijest fazą regulatorową w mechanizmie indukcyjnym[19, 20].Zależnie od natury chemicznej ksenobiotyków zwyklesą indukowane izoenzymy CYP należące do poszczególnychpodrodzin. Na przykład, główne izoformy indukowaneprzez policykliczne węglowodory aromatyczne czy benzo-(a)piren należą do podrodziny CYP1A. Chlordan, dieldrin,chlorowane węglowodory czy fenobarbital zwykle indukująizoformy CYP2B. Deksametazon i metyrapon przeważnieindukują białka podrodziny CYP3A.Osobny problem to zmieniająca się indukcyjności różnychform cytochromu P450 w poszczególnych przedziałachwieku. Niewiele jest prac, które określały rozwojoweróżnice w składzie izoenzymów cytochromu P450 i aktywnościachenzymatycznych z nimi związanych. Zawartościizoform zazwyczaj korelowano z markerowymi aktywnościamiposzczególnych form cytochromu. I tak, aktywnośćCYP 2B1/2 i 1A1/2 monitorowano odpowiednioprzez ocenę N-demetylacji benzofetaminy i O-deetylację7-etoksyrezorufiny [21]. Uzyskane wyniki sugerowały, żeu szczura niska indukcyjność CYP1A1/2 w okresie okołoporodowymrosła w fazie starzenia. Przeciwnie, wysoka indukcyjnośćCYP2B1/2 po podaniu fenobarbitalu u zwierzątmłodych obniżała się wraz z wiekiem. Zapewne, powodemsłabej indukcyjności CYP1A1/2 noworodka, jest fakt, żeizoenzym ten jest główną formą w tym okresie życia. Analogicznie,indukcyjność cytochromu P450 2B1/2 jest najniższau dojrzałych zwierząt, u których enzym ten dominuje.Celem badań było wykazanie jak zmienia się profil indukowalnychizoform cytochromu P450 związanych z metabolizmemksenobiotyków w funkcji wieku. Szczególnie ważnebyło określenie zestawu tych izoform w różnych fazach życiaszczura po indukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonoweji deksametazonowej.Materiały i metodyZwierzętaBadania przeprowadzono na samcach szczurzych rasyWistar. Zwierzęta pochodziły z hodowli Centralnej ZwierzętarniŚląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach-Ligocie.Serie badawcze obejmowały 8 grup wiekowych,tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne.Zwierzęta grupy najmłodszej przebywały cały czas z matkami.Po usamodzielnieniu się, każde zwierzę przebywałoosobno w klatkach plastikowych a hodowla była prowadzonaw tym samym pomieszczeniu o ustalonej wilgotnościpowietrza (około 60%), temperaturze (20-22 0 C) i rytmie12-godzinowego oświetlenia (dzień-noc: 6 00 -18 00 ). Szczurykarmiono paszą standardową (LSM), którą usuwano na12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny dostęp dowody.Szczury zabijano przez dekapitację. Natychmiast pobieranowątroby i umieszczano je w lodowatym roztworze solifizjologicznej.9

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Badania uzyskały akceptację Komisji Etycznej ŚląskiegoUniwersytetu Medycznego w Katowicach.TraktowanieSzczurom pierwszej serii eksperymentalnej podawanodootrzewnowo dwukrotnie fenobarbital w dawkach po 75mg/kg masy ciała na 3- i 2 dni przed dekapitacją. Wszystkieiniekcje wykonano o godzinie 9 00 . Zwierzęta drugiejserii doświadczalnej otrzymywały trzykrotnie dootrzewnowoβ-naftoflawon. Podawano go na 3-, 2- i 1 dzień przeddekapitacją w dawkach po 40 mg/kg masy ciała zawsze ogodzinie 9 00 . Wreszcie, zwierzęta trzeciej serii doświadczalnejotrzymywały dootrzewnowo deksametazon. Podawanogo o godzinie 9 00 w postaci zawiesiny w oleju kukurydzianymrównież trzykrotnie na 3-, 2- i 1 dzień przed zabiciemw dawce po 20 mg/kg masy ciała. Stała godzina podawaniainduktora podyktowana była podatnością układu monooksygenazzależnych od cytochromu P450 na zmiany podwpływem rytmu okołodobowego [22, 23]Izolacja frakcji mikrosomalnejWątrobową frakcję mikrosomalną izolowano wedługmetody Dallnera [24]. Po kilkukrotnym przepłukaniu wroztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkieskrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjemaz tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutęi czterech pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnymbył 0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowymbuforze Tris-HCl o pH=7,4. Na 1 gram tkankidodawano 5 cm 3 tego roztworu. Ten i kolejne etapy obróbkiwątroby prowadzano w temperaturze 2-4 0 C.Uzyskane czyste frakcje mikrosomalne zawieszanow zbuforowanym 20% o/o roztworze glicerolu, tak abystężenie białka było nie mniejsze niż 5 mg/cm 3 . Próby tenatychmiast zamrażano w temperaturze -20 0 C. W badaniachpilotowych czystość frakcji mikrosomalnej ocenianopoprzez wykonanie zdjęć w mikroskopii elektronowej,a niezależnie oceniano poziom aktywności enzymu markerowegofrakcji mitochondrialnej (dehydrogenazy bursztynianowej),jako ewentualnego zanieczyszczenia uzyskanychmikrosomów. Brak aktywności tej dehydrogenazy oznaczałbrak obecności mitochondriów we frakcji mikrosomalnej.Rozdział elektroforetyczny i elektroblotingPodłożem roboczym używanym do rozdziału elektroforetycznegobiałek był żel poliakrylamidowy o grubości 1 mmi długości 15 cm a sam rozdział odbywał się w układzie opisanymprzez Laemmliego [25]. W swoim początkowym odcinkuzłoże było 4% żelem (tzw. stacking gel) w 0,125 milimolowymTris-HCl (pH 6,8) zawierającym 0,1% SDS. Częśćrobocza złoża to 10% żel (tzw. running gel) w 0,375 milimolowymTris-HCl (pH 8,8) zawierającym także 0,1% SDS.W przestrzeniach wokółelektrodowych stosowano 0,1% roztwórSDS, zawierający w 1 dm 3 6 g Trisu i 28,8 g glicyny.W miarę potrzeby pH tego roztworu ustawiano na 8,5.Po zakończeniu elektroforezy białka z żelu zostały przeniesionena błonę nitrocelulozową, stosując elektroblotingmokry. Transfer trwał 1 godzinę przy napięciu 100 V w buforzeo pH 8,3 o składzie: 25 milimolowy Tris-HCl, 192 milimolowaglicyna i 20% o/o metanol.Wykrywanie antygenówNitroceluloza po transferze była inkubowana przez 30minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym(1% buforowana kazeina), a następnie z odpowiednimprzeciwciałem pierwotnym przez całą noc w temperaturze4 0 C. Przeciwciała odnosiły się do następujących białek:CYP3A1, CYP2C11, CYP2C6, CYP2A1, CYP1A1, CY-P1A2 i CYP2B1/2.Po usunięciu przeciwciała, błona nitrocelulozowa była3-krotnie płukana w roztworze kazeiny, a następnie inkubowanaprzez 30 minut z odpowiednim biotynylowanymprzeciwciałem wtórnym. W kolejnym etapie błona zostałaumieszczona w roztworze ABC na 10 minut (ABC - kompleksawidyna-biotynylowana-peroksydaza). Po usunięciutego roztworu i wypłukaniu, nitrocelulozę równoważonoprzez 5 minut 0,1 molowym buforem Tris-HCl o pH 9,5,a następnie dodano roztwór substratu (BCIP/NBT). CałośćRyc. 1. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażonych w nanomolach/mg białka mikrosomalnegou szczurów w różnym wieku po indukcji fenobarbitalowej.10

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Ryc. 2. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażonych w nanomolach/mg białka mikrosomalnegou szczurów w różnym wieku po indukcji β-naftoflawonowej.była inkubowana przez 30 minut w ciemności, płukanaw buforze PBS i suszona. Wybarwione bloty poddano ilościowejanalizie densytometrycznej.WynikiSeria fenobarbitalowaW serii fenobarbitalowej stwierdzono obecność izoform 2B1/2,2C6 i 2A1 we wszystkich ocenianych grupach wiekowych.Izoforma 2B1/2 ulegała silnej indukcji i jej poziomyrosły w kolejnych grupach wiekowych (Ryc. 1). Już po 1miesiącu życia pozapłodowego, poziom tej izoformy stanowił240% wartości stwierdzonej w grupie 0,5 miesięcznej,przyjętej jako grupa odniesienia. W kolejnych miesiącachrósł on jeszcze dynamiczniej, przekraczając conajmniej7-krotnie poziom stwierdzony w grupie najmłodszej. Po1 roku życia indukcyjność była słabsza, ale w dalszym ciągusięgała poziomu 500-600% wartości grupy odniesienia.Izoforma 2C6 również zwiększała swój poziom w funkcjiwieku szczura (Ryc. 1). Począwszy od 1 miesiąca życia pozapłodowegojej poziom wynosił 250-300% wartości grupy najmłodszej,a stan trwał do 1 roku życia. W tym przedziale wiekunastąpił wyraźny spadek stężenia tej izoformy (około 125%wartości grupy 0,5 miesięcznej), ale w miarę starzenia się zwierzątpoziom ten ponownie narastał, tak że w grupie najstarszejstwierdzono poziom rzędu 250% wartości grupy odniesienia.Trzecia z ocenianych izoform, tj. CYP2A1 zachowywałasię podobnie do 2C6. Stwierdzone przyrosty poziomu tejizoformy były jednak nieco wyższe i przekraczały nawet450% wartości grupy najmłodszej (Ryc. 1). I tym razemujawniono spadek poziomu tego białka w 1 roku życia i delikatnywzrost w kolejnych fazach życia, gdzie poziom tenprzekraczał 300% wartości grupy odniesienia.Seria β-naftoflawonowaW tej serii doświadczalnej we wszystkich grupach wiekowychstwierdzono obecność izoform 1A1, 1A2 i 2A1.Poziom pierwszej z nich narastał po 2 tygodniach życiapozapłodowego. Jeśli przyjąć wartość z tej grupy wiekowejza punkt odniesienia, to już w 1 miesiącu życia szczura obserwowano2-krotny wzrost stężenia 1A1 (Ryc. 2). Po kolejnymmiesiącu życia wartość ta ponownie podwajała się,przekraczając poziom 450%. Przez kilka kolejnych miesięcyujawnił się niższy, ale stabilny, około 300% poziomtej izoformy. Po 1 roku życia następował stały, stabilnyspadek poziomu, aż do około 150% w grupie najstarszej.Izoforma 1A2 najwyższy poziom osiągała w najmłodszejz badanych grup (Ryc. 2). Od tej chwili obniżała swójpoziom do około 75% wartości grupy najmłodszej, któryutrzymywał się co najmniej do 1 roku życia. U zwierząt starszychnastępował dalszy spadek, tak że w ostatniej grupiewiekowej był on 2-krotnie niższy w porównaniu do zwierzątnajmłodszych.Trzecia z ujawnionych izoform, tj. CYP2A1 zwiększałaswoje poziomy najbardziej dynamicznie. Już po 1 miesiącużycia pozapłodowego został stwierdzony prawie 4-krotnywzrost stężenia tego białka w porównaniu do grupy najmłodszej(Ryc. 2). W kolejnych miesiącach poziom ten dalejnarastał, przekraczając wartość 800% grupy odniesienia.Dopiero w dwóch ostatnich grupach wiekowych nastąpiłwyraźny spadek poziomu izoformy 2A1, ale i tak stanowiłon 350% wartości grupy najmłodszej.Seria deksametazonowaW tej serii doświadczalnej we wszystkich grupach wiekowychstwierdzono obecność izoform 3A1, 2C11 i 2C6.Poziom izoformy 3A1 ulegał silnej indukcji we wszystkichbadanych grupach wiekowych (Ryc. 3). Już po 1 miesiącu życiapozapłodowego, poziom tej izoformy stanowił 540% wartościstwierdzonej w grupie 0,5 miesięcznej, przyjętej jako grupa odniesienia.W kolejnych miesiącach wzrost ten nie był tak dynamiczny,ale przekraczał conajmniej 3-krotnie poziom stwierdzonyw grupie najmłodszej. Bardzo silny przyrost poziomu izoformystwierdzono u zwierząt najstarszych, gdzie sięgał poziomu650% wartości grupy odniesienia.11

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Ryc. 3. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażonych w nanomolach/mg białka mikrosomalnegou szczurów w różnym wieku po indukcji deksametazonowej.Ryc. 4. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażona jako procent kontroli u szczurów w różnymwieku po indukcji deksametazonowej.Izoforma 2C11 również zwiększała swój poziomw funkcji wieku szczura (Ryc. 3). Począwszy od 1 miesiącażycia pozapłodowego jej poziom wynosił 450% wartościgrupy najmłodszej. Od 4 miesiąca życia przyrost poziomutej izoformy był słabszy, tak że w 1 roku życia obserwowanopowrót do poziomu grupy najmłodszej. W kolejnych przedziałachwieku nastąpił ponowny stężenia tej izoformy (dookoło 200% wartości grupy 0,5 miesięcznej).Trzecia z ocenianych izoform zmieniała się bardzo dynamiczniew funkcji wieku. Już w 1 i 2 miesiącu życia poziomCYP2C6 był praktycznie 4-krotnie wyższy w porównaniudo szczurów najmłodszych (Ryc. 3). Poziom tej izoformyw kolejnych grupach wiekowych był nadal wysoki i oscylowałna poziomie 300% w porównaniu do grupy najmłodszeja stan ten trwał aż do końca życia zwierząt.W serii deksametazonowej stwierdziliśmy obecność takichsamych izoform cytochromu P450 we wszystkich grupachwiekowych, jak w serii kontrolnej [26]. Pozwoliło to12na szerszą charakterystykę obserwowanych zmian profilutych izoform.I tak, CYP3A1 podlegał silnej indukcji już u zwierzątnajmłodszych, gdzie ujawniliśmy wzrost poziomu tej izoformydo ponad 300% kontroli (Ryc. 4). W kolejnych fazachżycia szczura indukcyjność ta sięgała conajmniej 600%. Dopierood 8 miesiąca życia indukcyjność tej izoformy spadała.Od około 400% w 8 miesiącu do niecałych 150% w 20miesiącu życia. W najstarszej z badanych grup ujawniliśmyefekt inhibitorowy, bowiem poziom CYP3A1 stanowił tylko60% wartości grupy kontrolnej.Porównując uzyskane wyniki z odpowiednimi wartościamigrup kontrolnych stwierdzono, że CYP2C11 uzwierząt najmłodszych 1,5-krotnie zwiększa swój poziompo traktowaniu deksametazonem (Ryc. 4). W kolejnej grupiewiekowej indukcja osiągała poziom 350% kontroli, alew kolejnych fazach wieku deksametazon wyraźnie obniżałpoziom CYP2C11. U 2 miesięcznych zwierząt inhibicja pro-

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073wadziła do spadku zawartości tego białka do poziomu 35%kontroli. W kolejnych grupach wiekowych hamowanie byłosłabsze (od 60 do 70% kontroli). U szczurów najstarszych obserwowanowartości charakterystyczne dla kontroli.CYP2C6 u zwierząt niedojrzałych płciowo podlegałinhibicji pod wpływem deksametazonu. Prowadziła onado spadku sięgającego 40% kontroli u zwierząt 0,5 miesięcznych,ale w trzech kolejnych grupach wiekowych byłasłabsza i oscylowała na poziomie 80% kontroli (Ryc. 4).Począwszy od 8 miesiąca obserwowano nawet 2-krotną indukcjętej izoformy, ale zwierzęta najstarsze zareagowały nadeksametazon ponowną inhibicją CYP2C6.DyskusjaPodanie fenobarbitalu w zasadzie nie zmieniało profiluzmian poziomu cytochromu P450 w funkcji wieku w porównaniudo kontroli [27-29]. Należy zauważyć, że we wszystkichgrupach wiekowych fenobarbital pełnił funkcję induktorową,chociaż w zróżnicowanym stopniu. Szczególnie wysokąindukcyjność obserwowano w grupach zwierząt młodychi dojrzałych płciowo (2-8 miesięcy), gdzie omawiany związekco najmniej podwajał stężenie hemoproteiny w mikrosomach,co obserwowano również w innych laboratoriach [30,31], jakkolwiek spotyka się wyższą indukcję [32].U szczurów traktowanych fenobarbitalem w mikrosomachakumuluje się prawdopodobnie kilkanaście różnych izoenzymówP450, w tym izoformy CYP3A1, CYP3A2, CYP2C6,CYP2C7 i CYP2A1 a zwłaszcza izoformy 2B1 i 2B2 [11, 33-35]. Mechanizm, poprzez który fenobarbital stymuluje ekspresjętych białek jest już dość dobrze poznany [11, 33, 36].Dotyczy on modulacji czynników transkrypcyjnych działającychna cis-elementy właściwego genu CYP [37]. Istotnaw tym mechanizmie jest sekwencja promotorów dla CYP,posiadających relatywnie mało sekwencji wiążących dla tzw.wątrobowych wzmacniających czynników transkrypcyjnych,co może być odpowiedzialne za niską konstytutywną ekspresjęCYP2B1/2 [38], głównych form cytochromu P450 indukowanychprzez fenobarbital [39]. Przykładowo mRNA dlawątrobowego CYP2B1 i 2B2 nie zmienia swojego stężeniaw funkcji wieku [40-42], jednak po indukcji fenobarbitalowejrośnie ono, szczególnie u szczurów młodych [40, 43].Wykazano również, że na przykład hormon wzrostujest antagonistą dla indukcji fenobarbitalowej [44, 45]. Jestprawdopodobne, że hormon ten może regulować ekspresjęgenów P450 wpływając na łączenie transkryptów, transporti stabilizowanie RNA, translację mRNA, stabilność i aktywnośćenzymu [45]. Ponieważ fenobarbitalowa indukcja CYP2B1/2 wymaga syntezy nowego białka, to należy brać poduwagę i takie dodatkowe czynniki regulujące jak, inhibicyjnedziałanie cAMP [47] oraz transdukcyjne sygnały kinazybiałkowej C [48]. Okazało się ponadto, że fenobarbital podwyższasyntezę hemu, syntezę apocytochromu P450 i inkorporacjęhemu do tego apobiałka dzięki czemu nie dochodzido kumulacji hemu w hepatocytach.Wchodzenie w okres starzenia się zwierząt obniża indukcyjnośćcytochromu P450 pod wpływem fenobarbitalui co istotne, jest ona utrzymana praktycznie na niezmiennympoziomie, aż do końca życia. Jest to o tyle ciekawe, że w tejfazie życia następował stopniowy spadek stężenia białka mikrosomalnego.Tak więc zmniejszenie indukcyjnego działaniafenobarbitalu w stosunku do cytochromu P450 w omawianymokresie życia, ma prawdopodobnie różne przyczyny[49, 50], ale jedna z nich zapewne wynika z ograniczonychmożliwości biosyntetycznych hepatocytów. Ze względu nabrak wyraźnych oznak pobudzenia syntezy białka de novo,należy sądzić, że induktor w tej fazie życia szczura stabilizujecytochrom P450 drogą wydłużonego czasu półtrwania.β-Naftoflawon przejawiał efekt indukcyjny we wszystkichgrupach wiekowych [51]. W tej serii badawczej znamiennymdla cytochromu P450 jest to, że po indukcjiβ-naftoflawonem przebieg zmian poziomu tego białkaw funkcji wieku jest zbieżny z grupami kontrolnymi. Jest tonowe spostrzeżenie, bowiem w literaturze istnieją sugestieo braku zmian ogólnego stężenia omawianego cytochromubez względu na wiek zwierząt [14, 28, 31].Porównując dynamikę narastania zawartości cytochromuP450 w grupach kontrolnych i grupach omawianej serii induktorowej,zauważono wręcz takie same tendencje w przedzialewieku 12-28 miesięcy. Przyjmując, że β-naftoflawon indukujetę samą rodzinę izoform cytochromu P450 [52], znaczy to, żepocząwszy od 12 miesiąca życia zwierząt nie zmiana się składjakościowy tych izoform. Z drugiej strony biorąc pod uwagęfakt, że w omawianym przedziale wieku następuje spadek zawartościbiałka mikrosomalnego w serii β-naftoflawonowej,to biorąc pod uwagę stabilną indukcyjność, należy przyjąć, żeo ile zawartość właściwa cytochromu P450 faktycznie rosła, tojego zawartość bezwzględna zachowuje status quo.Szczególnej uwagi wymaga grupa 15-dniowa. O ilew pozostałych grupach wiekowych indukcyjność cytochromuP450 po fenobarbitalu była wyższa niż po β-naftoflawonie,o tyle w grupie 15-dniowej obserwowano tendencję odwrotną.Wyniki tej pracy potwierdzają, że w kilka dni po urodzeniuizoformy P450 indukowane przez induktory typu I sąwyraźnie zdominowane przez hemoproteiny stymulowaneinduktorami typu II. Dopiero wraz z wiekiem relacje te ulegająodwróceniu i stan ten zostaje zachowany do końca życia.Wpływ deksametazonu na zawartość cytochromu P450miał zupełnie inny charakter niż działanie obu powyżejomówionych induktorów [53-55]. W tym przypadku efektinduktorowy obserwowano w przedziale od 4 do 20 miesiącażycia. Podobne efekty wpływu deksametazonu na układmonooksygenaz zależnych od cytochromu P450 odnotowanow innych laboratoriach [56-58], jednak przy wyższychdawkach deksametazonu, sięgających 100 mg/kg, stosowanychnawet przez kilka dni.W skrajnych grupach wiekowych, tj. w grupach niedojrzałychpłciowo oraz u zwierząt bardzo starych, związek tenbył inhibitorem omawianego cytochromu [59]. Konstatacjata dotyczy wyłącznie zawartości właściwej cytochromuP450. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że w grupach zwierzątmłodych serii deksametazonowej stężenie białka było wysokiea ogólny poziom cytochromu P450 nie zmieniał się,to można przyjąć, że deksametazon u młodych zwierzątstymuluje syntezę tej hemoproteiny w takim stopniu, że jejstężenie absolutne narasta. W grupie najstarszej, przy spadkuogólnego stężenia białka i praktycznie niezmiennym poziomiezawartości właściwej cytochromu P450 przez całyokres życia zwierząt, absolutne stężenie omawianej hemoproteinyw tej serii badawczej również rosło.13

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Wnioski1. Spośród badanych białek, w każdej serii induktorowejujawniono co najmniej trzy izoformy CYP, które występowaływe wszystkich grupach wiekowych.2. W każdej serii induktorowej jedna z badanych izoformcechowała się wyraźnie wyższym poziomem.3. Szczególnie wysokie poziomy badanych izoform obserwowanou zwierząt dojrzałych płciowo, które jednaknie ukończyły 1-roku życia.Piśmiennictwo1. Pavek P, Dvorak Z. Xenobiotic-induced transcriptionalregulation of xenobiotic metabolizing enzymes of thecytochrome P450 superfamily in human extrahepatictissues. Curr Drug Metab 2008; 9: 129-143.2. Czekaj P. Phenobarbital-induced expression of cytochromeP450 genes. Acta Biochim Pol 2000; 47: 1093-1105.3. Bièche I i wsp. Reverse transcriptase-PCR quantificationof mRNA levels from cytochrome (CYP)1, CYP2and CYP3 families in 22 different human tissues. PharmacogenetGenomics 2007; 17: 731-742.4. Wogan GN i wsp. Environmental and chemical carcinogenesis.Semin Cancer Biol 2004; 14: 473-486.5. Moon YJ, Wang X, Morris ME. Dietary flavonoids: effectson xenobiotic and carcinogen metabolism. ToxicolIn Vitro 2006; 20: 187-210.6. Cederbaum AI. Cytochrome P450 2E1-dependent oxidantstress and upregulation of anti-oxidant defense in livercells. J Gastroenterol Hepatol 2006; 21 (Suppl 3): 22-25.7. Jimenez-Lopez JM, Cederbaum AI. CYP2E1-dependentoxidative stress and toxicity: role in ethanol-induced liverinjury. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2005; 1: 671-685.8. Cederbaum AI. CYP2E1 - biochemical and toxicologicalaspects and role in alcohol-induced liver injury. MtSinai J Med 2006; 73: 657-672.9. Yeldandi AV, Rao MS, Reddy JK. Hydrogen peroxidegeneration in peroxisome proliferator-induced oncogenesis.Mutat Res 2000; 448: 159-177.10. Amacher DE i wsp. Hepatic microsomal enzyme induction,beta-oxidation, and cell proliferation following administrationof clofibrate, gemfibrozil, or bezafibrate in theCD rat. Toxicol Appl Pharmacol 1997; 142: 143-150.11. Sueyoshi T, Negishi M. Phenobarbital response elementsof cytochrome P450 genes and nuclear receptors.Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001; 41: 123-143.12. Zelko I, Negishi M. Phenobarbital-elicited activation ofnuclear receptor CAR in induction of cytochrome P450genes. Biochem Biophys Res Commun 2000; 277: 1-6.13. Kemper B. Regulation of cytochrome P450 gene transcription byphenobarbital. Prog Nucl Acid Res Mol Biol 1998; 61: 25-64.14. Matsuda T i wsp. Induction of CYP isoenzymes invarious organs of rats by 3-methylcholanthrene orβ-naphthoflavone. Cancer Lett 1995; 97: 137-143.15. Lupp A i wsp. Transplantation of fetal liver tissue suspensioninto the spleens of adult syngenic rats: inducibilityof cytochrome P450 dependent monooxygenasefunctions by beta-naphthoflavone, phenobarbital anddexamethasone. Exp Toxicol Pathol 1999; 51: 65-74.16. Muller D, Gloockner R, Rost M. Monooxygenation,cytochrome P4501A1 and P4501A1-mRNA in ratliver slices exposed to beta-naphthoflavone and dexamethasonein vitro. Exp Toxic Pathol 1996; 48:433-438.17. Hulla JE, Juchau MR. Developmental aspects ofP450IIIA: prenatal activity and inducibility. Drug MetabRev 1989; 20: 765-779.18. LeCluyse EL. Pregnane X receptor: molecular basis forspecies differences in CYP3A induction by xenobiotics.Chem Biol Interact 2001; 134: 283-289.19. Agrawal AK, Shapiro BH. Differential expression ofgender-dependent hepatic isoforms of cytochromeP-450 by pulse signals in the circulating masculine episodicgrowth hormone profile of the rat. J PharmacolExp Ther 2000; 292: 228-237.20. Jones SA i wsp. The pregnane X receptor: a promiscuousxenobiotic receptor that has diverged during evolution.Mol Endocrinol 2000; 14: 27-39.21. Achmer DE, Schomaker SJ. Ethylomorphine N-demethylase activity as a marker for cytochrome P450CYP3A activity in rat hepatic microsomes. Toxicol Lett1998; 94: 115-125.22. Plewka A i wsp. Circadian changes of cytochrome P-450-dependent monooxygenase system in the rat liver. Pol JPharmacol Pharm 1992; 44: 655-661.23. Czekaj P i wsp. Daily and circadian rhythms in the activityof mixed function oxidases system in rats of differentage. Biol Rhythm Res 1994; 25: 67-75.24. Dallner G. Isolation of rough and smooth microsomes -general. Methods Enzymol 1974; 32: 191-215.25. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227: 680-685.26. Plewka A i wsp. Wiek jako czynnik modyfikujący profilizoform cytochromu P450 w wątrobie szczura. FarmPrzegl Nauk 2009; 12: 15-20.27. Plewka A, Kamiński M. Wpływ wieku i fenobarbitaluna aktywność wątrobowego układu oksydaz o funkcjimieszanej u szczurów. Folia Med Cracov 1992; 33:141-154.28. Plewka A, Plewka D, Kamiński M. Induktorowe modyfikacjepoziomu wątrobowego cytochromu P-450 wfunkcji wieku szczura. Post Hig Med Dośw 1994; 48:457-470.29. Plewka A, Bienioszek M, Plewka D. Changes in themale rat hepatic cytochrome P-450 level, heme oxygenaseand δ-aminolevulinic acid synthase activities atvarious stages of life. Mech Ageing Develop 1994; 74:79-88.30. Asoh M i wsp. Induction of hepatic CYP2B in foetaland neonatal rats after maternal administration of phenobarbital.Pharmacol Toxicol 1999; 84: 18-23.31. Bani M-H i wsp. Modulation of snake hepatic cytochromeP450 by 3-methylcholanthrene and phenobarbital.Comp Biochem Physiol 1998; 119C: 143-148.32. Hood A, Liu J, Klaassen CD. Effects of phenobarbital,pregnenolone-16alpha-carbonitrile, and propylthiouracilon thyroid follicular cell proliferation. Toxicol Sci1999; 50: 45-53.14

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507333. Agrawal AK, Shapiro BE. Phenobarbital induction ofhepatic CYP2B1 and CYP2B2: pretranscriptional andpost-transcriptional effects of gender, adult age, andphenobarbital dose. Mol Pharmacol 1996; 49: 523-531.34. Brown SES i wsp. Critical role of extracellular matrixon induction by phenobarbital of cytochrome P4502B1/2 in primary cultures of adult rat hepatocytes. LabInvest 1995; 73: 818-827.35. Mäkinen J i wsp. Modulation of mouse and human phenobarbital-responsiveenhancer module by nuclear receptors.Mol Pharmacol 2002; 62: 366-378.36. Meredith C i wsp. Studies on the induction of rat hepaticCYP1A, CYP2B, CYP3A and CYP4A subfamilyform mRNAs in vivo and in vitro using precision-cut ratliver slices. Xenobiotica 2003; 33: 511-527.37. Sueyoshi T, Negishi M. Phenobarbital response elementsof cytochrome P450 genes and nuclear receptors.Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001; 41: 123-143.38. Kawamoto T i wsp. Phenobarbital-responsive nucleartranslocation of the receptor CAR in induction of theCYP2B gene. Mol Cell Biol 1999; 19: 6318-6322.39. Waxman DJ, Azaroff L. Phenobarbital induction of cytochromeP-450 gene expression. Biochem J 1992; 281: 577-592.40. Ejiri N, Katayama K, Doi K. Induction of cytochromeP450 isozymes by phenobarbital in pregnant rat and fetallivers and placenta. Exp Mol Pathol 2005; 78: 150-155.41. Ejiri N i wsp. Microarray analysis on CYPs expressionin pregnant rats after treatment with pregnenolone-16alpha-carbonitrileand phenobarbital. Exp Mol Pathol2005; 78: 71-77.42. Schilter B i wsp. Activation of cytochrome P450 geneexpression in the rat brain by phenobarbital-like inducers.J Pharmacol Exp Ther 2000; 294: 916-922.43. Klinger W i wsp. Cytochrome P450 (P450) isoformsexpression, P450 concentration, monooxygenase activities,reactive oxygen species format ion, lipid peroxidation,and glutathione content in wild catch carp andtench liver-influence of a two weeks exposure to phenobarbital.Exp Toxicol Pathol 2001; 52: 513-522.44. Shapiro BH i wsp. Growth hormone-dependent and -independentsexually dimorphic regulation of phenobarbital-inducedhepatic cytochromes P450 2B1 and 2B2.Archiv Biochem Biophys 1994; 312: 234-239.45. Ganem LG i wsp. Phenobarbital induction of CYP2-B1/2 in primary hepatocytes: endocrine regulation andevidence for a single pathway for multiple inducers. ToxicolAppl Pharmacol 1999; 155: 32-42.46. Aubrecht J i wsp. Differential induction of mRNA expeessionof cytochromes P450 (CYP2B1 and CYP1A1/2)by metyrapone in primary rat hepatocyte cultures. ResCommun Mol Pathol Pharm 1996; 94: 47-61.47. Marc N i wsp. Regulation of phenobarbital induction ofthe cytochrome P450 2b9/10 genes in primary mouse hepatocyteculture. Involvement of calcium- and cAMP-dependentpathways. Eur J Biochem 2000; 267: 963-970.48. Sidhu JS, Omiecinski CJ. cAMP-associated inhibitionof phenobarbital-inducible cytochrome P450 geneexpression in primary rat hepatocyte cultures. J BiolChem 1995; 270: 12762-1273.49. Johnson TN, Tanner MS, Tucker GT. A comparison of theontogeny of enterocytic and hepatic cytochromes P4503A in the rat. Biochem Pharmacol 2000; 60: 1601-1610.50. Johnson TN, Tanner MS, Tucker GT. Developmentalchanges in the expression of enterocytic and hepatic cytochromesP4501A in rat. Xenobiotica 2002; 32: 595-604.51. Plewka A, Plewka D. Evaluation of activity of cytochromeP-450-dependent monooxygenase system inducedby β-naphthoflavone or dexamethasone in rats at differentages. Age 1995; 18: 159-165.52. Kawajiri K, Fujii-Kuriyama Y. Cytochrome P450 generegulation and physiological functions mediated bythe aryl hydrocarbon receptor. Arch Biochem Biophys2007; 464: 207-212.53. Kocarek TA, Reddy AB. Negative regulation by dexamethasoneof fluvastatin-inducible CYP2B expressionin primary cultures of rat hepatocytes: role of CYP3A.Biochem Pharmacol 1998; 55: 1435-1443.54. Pereira TM, Lechner MC. Differential regulation of thecytochrome P450 3A1 gene transcription by dexamethasonein immature and adult rat liver. Eur J Biochem1995; 229: 171-177.55. Kim H i wsp. Differential induction of rat hepatic cytochromesP450 3A1, 3A2, 2B1, 2B2, and 2E1 in response to pyridinetreatment. Drug Metab Dispos 2001; 29: 353-360.56. Ushio F i wsp. Differential induction of cytochromeP-450 isozymes by rifampicin in the Chinese hamster,Cricetus griseus. Comp Biochem Physiol C PharmacolToxicol Endocrinol 1995; 112: 163-168.57. Lupp A i wsp. Transplantation of fetal liver tissue suspensioninto the spleens of adult syngenic rats: effectsof beta-naphthoflavone, phenobarbital and dexamethasoneon cytochrome P450 isoforms expression and onglycogen storage. Exp Toxicol Pathol 1998; 50: 173-183.58. Akhtar MK, Kelly SL, Kaderbhai MA. Cytochromeb 5modulation of 17-α hydroxylase and 17-20 lyase(CYP17) activities in steroidogenesis. J Endocrinol2005; 187: 267-274.59. Fernández-Pérez L i wsp. Steroid binding sites in livermembranes: interplay between glucocorticoids, sex steroids,and pituitary hormones. J Steroid Biochem MolBiol 2008; 109: 336-343.data otrzymania pracy: 29.01.2010 r.data akceptacji do druku: 24.02.2010 r.Adres do korespondencji:dr hab. Andrzej Plewkaadres: Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny, 41-200 Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30tel.: +48 32 364 14 30e-mail: aplewka@sum.edu.pl15

Farm Przegl Nauk, 2010,3, 16-21Ocena lekowrażliwości ziarenkowców Gramdodatnichizolowanych z materiałów klinicznych pacjentówhospitalizowanych w oddziale chirurgii urazowo-ortopedycznejAntimicrobial susceptibility of Gram-positive cocci isolatedfrom clinical specimens from orthopedic patientsMałgorzata Kępa 1 , Danuta Idzik 1 , Robert D. Wojtyczka 1 , Iwona Krzyżecka 1 ,Anna Góras‐Zawiązalec 2 , Jerzy Pacha 1 , Krzysztof Jasik 11Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnejw Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach,2Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Pracownia Bakteriologii Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego nr 4w BytomiuStreszczenieZakażenia nabywane w oddziale chirurgii urazowo-ortopedycznej,mimo że nie należą do najczęstszych, to jednakwiążą się ze znacznym przedłużeniem hospitalizacji pacjentówi wzrostem nakładów finansowych na leczenie.Chociaż, są one nieodzownym elementem funkcjonowaniaszpitala, to należy dążyć różnymi metodami do ich ograniczenia,np. poprzez ciągłą kontrolę wrażliwości na antybiotykiszpitalnej flory bakteryjnej. Dlatego celem pracy byłookreślenie lekowrażliwości ziarenkowców Gramdodatnich,wyizolowanych z materiałów klinicznych, pobranych odpacjentów oddziału chirurgii urazowo-ortopedycznej. Materiałdo badań stanowiło 105 szczepów Gramdodatnichziarenkowców, wyizolowanych głównie z rany i materiałuśródoperacyjnego, których lekowrażliwość określono metodądyfuzyjno-krążkową, zgodnie z zaleceniami KORLD iNCCLS. Przeprowadzone badania wskazują na dominującyudział, w Gramdodatnich zakażeniach ziarenkowcowych,bakterii z rodzaju Staphylococcus spp. (64,76%) i Enterococcusspp. (25,71%), a najczęściej izolowanym gatunkiembył S. aureus (57,14%). Wszystkie wyizolowane gronkowcebyły oporne na penicylinę, a największą wrażliwośćwykazały na trimetoprim/sulfametoksazol, ciprofloksacynęi doksycyklinę. Najskuteczniejsze wobec szczepów E. faecalisokazały się antybiotyki β-laktamowe – ampicylinai penicylina, natomiast w stosunku do E. faecium aktywnabyła jedynie doksycyklina. Żaden z przebadanych szczepówgronkowców i enterokoków nie wykazał oporności naglikopeptydy. Szczepy Staphylococcus spp. oporne na metycylinęoraz Enterococcus spp. oporne na wysokie stężeniaaminoglikozydów charakteryzowały się także zwiększonąopornością na inne grupy antybiotyków. Szczepy wielolekoopornenajczęściej izolowane były z ran. W przeprowadzonychbadaniach wyizolowano 14 szczepów zaliczanychdo drobnoustrojów alarmowych. Wśród nich było 12 metycylinoopornychszczepów S. aureus i 2 szczepy S. pyogenes.Uzyskany w badaniach profil bakteryjnej wrażliwościkoreluje z wynikami, otrzymywanymi w innych polskichszpitalach. Ze względu na narastanie oporności bakterii naAbstractInfections acquired by patients on an orthopedic traumaward, although not very frequent, may cause a significantlyprolonged hospitalization time and are responsiblefor some additional treatment costs. In spiteof the fact that infections are invariably connected withhospital work, their occurrence should be limited; thiscould be done thanks to the continuous monitoring ofbacterial susceptibility to antibiotics on the ward. Inthe work we tried to determine the drug susceptibilityof Gram-positive cocci isolated from clinical specimensfrom orthopedic patients. One hundred and fivestrains of Gram-positive cocci were isolated from theoperative wounds and intra-operative material, thendisk diffusion susceptibility testing was done accordingto KORLD and NCCLS standards. Our investigationshowed the prevalence of Gram-positive cocci ofStaphylococcus spp. (64.76%) and Enterococcus spp.(25.71%); S. aureus (57.14%) was the most frequentlyisolated species. All the isolated staphylococci werepenicillin insusceptible. The greatest bacterial susceptibilitywas manifested in case of trimethoprimsulfamethoxazole,ciprofloxacin and doxicycline.E. faecalis was susceptible to beta-lactam antibiotics,i.e. ampicillin and penicillin, however E. faecium wassusceptible only to doxicycline. None of the examinedStaphylococus spp. or Enterococcus spp. was susceptibleto glycopeptides. Meticillin resistant Staphylococcusspp. as well as Enterococcus spp. resistantto high concentration of aminoglycosides showed elevatedresistance to antibiotics of other classes. Mostfrequently, multidrug resistant bacteria were isolatedfrom wounds. There were isolated 14 alarming bacterialstrains, i.e. 12 meticillin resistant S. aureus speciesand 2 S. pyogenes species. We obtained a bacterialprofile that corresponds to the profiles of otherPolish hospitals. Considering the increasing bacterialdrug resistance, it is necessary to monitor the susceptibilityof bacteria to drugs as well as to control the ad-16

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073antybiotyki konieczna wydaje się stała kontrola lekowrażliwościdrobnoustrojów oraz zużycia antybiotyków, w celuwczesnego wykrycia zagrożenia mikrobiologicznego.Słowa kluczowe: lekowrażliwość, oddział urazowo-ortopedyczny,ziarenkowce Gramdodatnieministration of antibiotics in Polish hospitals in orderto avoid and eliminate microbiological hazard.Key words: antimicrobial susceptibility, orthopedic traumaward, Gram-positive cocciWykaz skrótów: CNS - coagulase-negative staphylococci – gronkowce koagulazoujemne, HLAR - high-levelaminoglycoside resistance – oporność na wysokie stężenia aminoglikozydów, KORLD - KrajowyOśrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, MLS B- resistance to macrolide,lincosamide and streptogramin B – oporność na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B,MHA - Mueller-Hinton agar, MRCNS - methicillin resistant coagulase-negative staphylococci– gronkowce koagulazoujemne oporne na metycylinę, MRSA - methicillin resistant S. aureus– S. aureus oporny na metycylinę, NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards,obecnie Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), VISA - vancomycin intermediateS. aureus – S. aureus średniowrażliwy na wankomycynę, VRE - vancomycin resistant enterococci– enterokoki oporne na wankomycynę, VRSA - vancomycin resistant S. aureus – S. aureusoporny na wankomycynęWstępW oddziałach chirurgii urazowo-ortopedycznej interwencyjnycharakter wykonywanych zabiegów przyczyniasię do występowania zakażeń szpitalnych z częstością od1% do 4%. Do najczęściej izolowanych patogenów wywołującychte zakażenia należą ziarenkowce Gramdodatnie,a wśród nich głównie szczepy Staphylococcus aureus (15-23%), koagulazoujemne gronkowce (5-9%) i szczepy Enterococcusspp. (10-14%) [1].Coraz poważniejszym problem terapeutyczny stanowiąmetycylinooporne szczepy gronkowców, nie tylko wskutekbraku wrażliwości na wszystkie antybiotyki β-laktamowe,ale także ze względu na szybko narastającą oporność na antybiotykiinnych grup [2, 3].Enterokoki pozyskały dominującą pozycję wśród szpitalnychpatogenów, dzięki naturalnej oporności na znacznąliczbę antybiotyków i chemioterapeutyków, jak i zdolnośćszybkiego nabywania nowych mechanizmów oporności.Jednak ze względów klinicznych najistotniejsza jest ich nabytaoporność na wysokie stężenia aminoglikozydów i antybiotykiglikopeptydowe [4].Na oddziałach chirurgii urazowo-ortopedycznej obserwujesię także dużą koncentrację drobnoustrojów alarmowych,stąd też konieczny jest w ich przypadku, wzmożonynadzór epidemiologiczny polegający m. in. na ciągłej kontroliwrażliwości na antybiotyki szpitalnej flory bakteryjnej[5].Cel pracyCelem pracy było określenie lekowrażliwości ziarenkowcówGramdodatnich, wyizolowanych z materiałówklinicznych, pobranych od pacjentów i przekazanych doKatedry i Zakładu Mikrobiologii. Przeprowadzono analizępomiędzy pochodzeniem szczepów, a stopniem ich wrażliwościna zastosowane antybiotyki i chemioterapeutyki orazoceniono występowanie szczepów wielolekoopornych i patogenówalarmowych.Materiał i metody badańMateriał do badań stanowiło 105 szczepów Gramdodatnichziarenkowców, wyizolowanych z różnych materiałów klinicznych,pochodzących od pacjentów oddziału chirurgii urazowoortopedyczneji przekazanych do Katedry i Zakładu Mikrobiologiize szpitalnego laboratorium mikrobiologicznego.Ocenę lekowrażliwości badanych szczepów przeprowadzonometodą dyfuzyjno-krążkową, zgodnie z zaleceniamiKrajowego Ośrodka Referencyjnego ds. LekowrażliwościDrobnoustrojów (KORLD) i National Committee for ClinicalLaboratory Standards (NCCLS) [6, 7].Wśród wyizolowanych szczepów bakterii wykrywanotakże mechanizmy oporności na antybiotyki, stosując metodyzalecane przez KORLD [6].W celu oznaczenia wytwarzania penicylinaz przez gronkowceokreślono ich wrażliwość na penicylinę metodą dyfuzyjną,stosując krążek z penicyliną G 10 IU. Wykrywaniewrażliwości gronkowców na metycylinę wykonano metodądyfuzyjno-krążkowa z oksacyliną (1 μg) i cefoksytyną (30μg) oraz metodą przeglądową na podłożu MHA z oksacylinąw stężeniu 6 μg/cm 3 i dodatkiem 4% NaCl.Oznaczenie wrażliwości gronkowców na makrolidyi linkosamidy wykonano metodą dwóch krążków (krążkiz erytromycyną 15 μg i klindamycyną 2 μg). Odczyt i interpretacjękliniczną otrzymanych wyników przeprowadzonozgodnie z zaleceniami KORLD [6].W przypadku enterokoków określenie oporności wysokiegostopnia na aminoglikozydy polegało na oznaczeniu ichwrażliwość metodą dyfuzyjno-krążkową na streptomycynę300 μg i gentamycynę 120 μg. Oporność szczepu na obydwazastosowane w badaniu antybiotyki określano jako opornośćwysokiego stopnia na wszystkie antybiotyki aminoglikozydowe(HLAR) [6].Wyniki badańZe względu na specyfikę oddziału chirurgii urazowo-ortopedycznej,wyizolowane szczepy bakteryjne pochodziły17

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Ryc. 1. Udział procentowy poszczególnych ziarenkowców Gramdodatnichwyizolowanych z materiału klinicznego.OX – oksacylinaE – erytromycynaCC – klindamycynaCIP – ciprofloksacynaD – doksycyklinaP – penicylinaSXT – trimetoprim/sulfametoksazolRyc. 2. Lekowrażliwość szczepów Staphylococcus aureus na antybiotykii chemioterapeutyki z antybiogramu podstawowego.OX – oksacylinaE – erytromycynaCC – klindamycynaCIP – ciprofloksacynaD – doksycyklinaP – penicylinaSXT – trimetoprim/sulfametoksazolRyc. 3. Lekowrażliwość koagulazoujemnych szczepów Staphylococcusspp. na antybiotyki i chemioterapeutyki z antybiogramu podstawowego.głównie z rany – 62 szczepy (59,05%) i materiałuśródoperacyjnego – 16 szczepów (15,24%).Drobnoustroje izolowano także z takich materiałów,jak: płyn z przetoki – 7 szczepów (6,67%),ropa – 5 (4,76%), mocz – 4 (3,81%), bioptat – 2(1,90%), plwocina – 2 (1,90%), płyn punkcyjny– 2 (1,90%), krew – 1 (0,95%), odleżyna – 1(0,95%), wymaz z rurki intubacyjnej – 1 szczep(0,95%) oraz inne – 2 (1,90%),Spośród 105 wyizolowanych szczepów ziarenkowcówGramdodatnich największą grupęstanowiły bakterie z rodzaju Staphylococcus spp.– 68 szczepów (64,76%) i Enterococcus spp. – 27szczepów (25,71%). Wyizolowano także 9 szczepów(8,57%) z rodzaju Streptococcus spp. oraz1 szczep (0,95%) Micrococcus sp. Wśród wszystkichwyhodowanych drobnoustrojów dominowałygatunki: Staphylococcus aureus – 60 szczepów,Enterococcus faecalis – 24 szczepy oraz gronkowcekoagulazoujemne – 7 szczepów (Ryc. 1).Szczep Micrococcus sp., wyizolowany z krwi,był wrażliwy na wszystkie zastosowane antybiotykii chemioterapeutyki.Wszystkie wyizolowane szczepy gronkowcazłocistego były oporne na penicylinę, 20,0%spośród nich wykazywało metycylinooporność,a 25,0% oporność na erytromycynę i klindamycynę(oporność typu kMLS B- konstytutywna).Jednoczesną oporność na metycylinę i typu MLS Bzaobserwowano u 13,33% szczepów S. aureus.Odsetek szczepów opornych i średniowrażliwychna doksycyklinę wynosił odpowiednio – 13,33%i 15,0%. Większość zbadanych gronkowców wykazywaławysoką wrażliwość na: ciprofloksacynę(91,67%) i trimetoprim/sulfametoksazol (91,67%)– Ryc. 2.W grupie koagulazoujemnych gronkowcówoporność na większość zastosowanych antybiotykówbyła wysoka (Ryc. 3). Wszystkie przebadaneszczepy CNS cechowały się opornością na penicylinę.Oporność na metycylinę wyniosła 71,43%,a na erytromycynę i klindamycynę – 85,71%(łączną oporność typu MRCNS i kMLS Bwykazało57,14% szczepów). Prawie połowa badanychszczepów wykazała oporność na ciprofloksacynę(42,87%) i doksycyklinę (57,14%). Wszystkiewyhodowane szczepy odznaczały się wrażliwościąna trimetoprim/ sulfametoksazol.Wyhodowane szczepy paciorkowców odznaczałysię wrażliwością na ampicylinę i penicylinę.Wrażliwość wobec erytromycyny wykazało5 szczepów (55,56%), a wobec klindamycyny6 szczepów (66,67%). Natomiast oporność na obaantybiotyki stwierdzono w przypadku 3 badanychszczepów (33,33%) - 2 szczepy S. mitis i 1 szczepStreptococcus sp. (Ryc.4).W przypadku enterokoków dobór antybiotykówdo oznaczenia lekowrażliwości zależał odrodzaju materiału klinicznego, z którego danyszczep został wyizolowany. Dla 4 szczepów en-18

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Ryc. 4. Lekowrażliwość szczepów Streptococcus spp. na antybiotykii chemioterapeutyki.Ryc. 5. Lekowrażliwość na antybiotyki szczepów z rodzaju Enterococcusspp., wyizolowanych z moczu.HLAR i 100% (2/2) szczepów E. faecium HLAR.Największą aktywnością w stosunku do enterokoków,wyhodowanych z innego materiału niżmocz, odznaczały się ampicylina (91,30%) ipenicylina (91,30%). Badane szczepy wykazaływysoką oporność na doksycyklinę - 59,09%szczepów opornych i 22,73% szczepów o średniejwrażliwości, gentamycynę - 65,22% szczepówopornych i streptomycynę - 69,57% szczepówopornych (Ryc.6).Wysoką oporność tylko na gentamycynę wykazywało13,04% szczepów enterokoków, tylkona streptomycynę 17,39% szczepów, a w stosunkudo obu antybiotyków jednocześnie – 52,17%szczepów, co jest równoznaczne z obecnością fenotypuHLAR.Badane szczepy E. faecalis (wyizolowanez materiału klinicznego innego niż mocz), wykazująceoporność wysokiego stopnia na antybiotykiaminoglikozydowe, charakteryzowały sięwiększą opornością na doksycyklinę – 90,0%,w porównaniu ze szczepami wrażliwymi na wysokiestężenia aminoglikozydów, wśród którychoporność ta wyniosła 40,0%. Na ampicylinęi penicylinę 100% szczepów E. faecalis pozostałowrażliwych. Wszystkie szczepy E. faecium,wyizolowane z materiału innego niż mocz, byłyoporne na wysokie stężenia antybiotyków aminoglikozydowych,wykazując jednocześnie 100%oporności na ampicylinę i penicylinę. Wobec tychszczepów aktywna była jedynie doksycyklina.Wśród 4 szczepów enterokoków wyizolowanychz moczu (3 szczepy E. faecalis i 1 szczep E. faecium)3 szczepy (75,0% szczepów) były wrażliwena ampicylinę, penicylinę i nitrofurantoinę,połowa szczepów wykazała oporność na doksycyklinęi norfloksacynę, a 25,0% szczepów byłaśredniowrażliwa.Wśród przebadanych 105 szczepów bakteriido patogenów alarmowych należało 14 szczepów(13,33%), w tym 12 szczepów metycylinoopornychgronkowców złocistych (MRSA) i 2 szczepyStreptococcus pyogenes.Ryc. 6. Lekowrażliwość na antybiotyki szczepów z rodzaju Enterococcusspp., wyizolowanych z materiału klinicznego innego niż mocz.terokoków izolowanych z moczu oznaczono dodatkowo ichwrażliwość na nitrofurantoinę i norfloksacynę. Nie oznaczanow tych przypadkach oporności wysokiego stopnia na antybiotykiaminoglikozydowe (Ryc. 5).Zbadane 23 szczepy enterokoków charakteryzowały siędużym odsetkiem szczepów opornych na wysokie stężeniaaminoglikozydów. Szczepy o fenotypie HLAR izolowanebyły głównie z rany – 80,0% (8/10) szczepów E. faecalisDyskusjaSpośród 67 szczepów z rodzaju Staphylococcusspp. 25,37% wykazało metycylinoopornośći były to szczepy izolowane głównie z ran– 64,71%. Szczepy oporne na metycylinę (MRSAi MRCNS) są oporne in vivo na wszystkie antybiotykiβ-laktamowe, tj. penicyliny, penicylinyskojarzone z inhibitorami β-laktamaz, cefalosporyny i karbapenemy[6].Odsetek metycylinoopornych gronkowców był o połowęniższy od podawanego przez innych autorów (51,6-67%).Oporność na metycylinę dotyczyła 20,0% gronkowców złocistychi 71,43% koagulazoujemnych, a uzyskane wyniki odpowiadająkrajowym danym, mieszczącym się w granicach15-40% dla szczepów S. aureus i 46‐80% dla szczepów CNS19

Farm Przegl Nauk, 2010, 3[8 - 13]. W przeprowadzonych badaniach oporność na penicylinędotyczyła wszystkich szczepów gronkowców, natomiastw piśmiennictwie oceniana jest średnio na 90% [12].Wrażliwość badanych szczepów S. aureus była dość wysoka– dla erytromycyny, klindamycyny, doksycykliny i wynosiłaok. 70,0%, a dla ciprofloksacyny i trimetoprimu/ sulfametoksazoluok. 90,0%, co koreluje z wynikami uzyskanymiprzez innych autorów [8, 11, 12, 14, 15]. CNS charakteryzowałysię mniejszą wrażliwością na działanie zastosowanychleków i tylko ok. 14% szczepów było wrażliwych na erytromycynęi klindamycynę oraz ok. 43% na ciprofloksacynęi doksycyklinę. Jedynym w pełni skutecznym lekiem okazałsię trimetoprim/sulfametoksazol, chociaż 100% aktywnośćtego chemioterapeutyku wobec koagulazoujemnych gronkowcówjest raczej rzadko spotykana, a nawet niektórzy autorzywskazują na zdecydowanie większą oporność [11, 12].Analiza wzorów oporności wykazała dodatkowo wielolekoopornośćszczepów gronkowców metycylinoopornych,co sygnalizowane jest w wielu opracowaniach [2, 3, 8, 12].Skuteczne w leczeniu zakażeń gronkowcami metycylinoopornymipozostają antybiotyki glikopeptydowe – wankomycynai teikoplanina. Wśród analizowanych gronkowcównie oznaczono żadnego szczepu VISA i VRSA. Szerokiestosowanie glikopeptydów, w ostatnich latach, doprowadziłodo pojawienia się szczepów średniowrażliwych, a nawetniewrażliwych na glikopeptydy [2, 9, 10, 14].Według różnych opracowań od 70% do 90% zakażeń enterokokowychwywoływanych jest przez szczepy E. faecalis,a 5%-25% przez szczepy E. faecium. Pozostałe 5% infekcjiwywołują szczepy: E. durans, E. avium, E. gallinarumi E. casseliflavus, co jest zgodne z otrzymanymi wynikamibadań [4, 16, 17]. Około 50% szczepów Enterococcus spp.izolowanych w zakażeniach szpitalnych charakteryzuje sięfenotypem HLAR, a wśród nich ponad 80% izolatów należydo gatunku E. faecium i 32% do gatunku E. faecalis [17, 18].Wyniki analiz, przeprowadzonych w grupie enterokoków,wyizolowanych z materiału innego niż mocz, potwierdzająwysoki stopień oporności na antybiotyki aminoglikozydowewśród 52,17% szczepów Enterococcus spp., które w 83,33%zostały wyizolowane z ran. Odsetek szczepów HLAR, należącychdo E. faecium i E. faecalis, był nieco wyższy odśredniej krajowej i wyniósł odpowiednio 100% i 47,62%.Wśród wszystkich wyizolowanych enterokoków wrażliwośćna ampicylinę i penicylinę wyniosła ponad 90%,jednak należy zauważyć, że wrażliwe były jedynie szczepyz gatunku E. faecalis, natomiast oporność dotyczyła ogółuszczepów E. faecium. Wyniki badań wrażliwości na antybiotykiβ-laktamowe zamieszczone w innych opracowaniach,wykazują wyższy odsetek szczepów opornych wśródobu gatunku, ale podkreślany jest znacznie większy udziałw tej oporności szczepów E. faecium. Gentamycyna, streptomycynai doksycyklina wykazały niską aktywność wobecenterokoków, rzędu 20-35%. Takie dane potwierdzają doniesieniao narastającej oporności na leki przeciwbakteryjneszczepów Enterococcus spp. izolowanych w Polsce. Wykazanoobecność 52,17% enterokoków opornych na wysokiestężenia aminoglikozydów, a dodatkowo ok. 15% szczepówbyło opornych tylko na jeden aminoglikozyd. Wyższaoporność szczepów E. faecalis HLAR na doksycyklinę oraz100% oporność szczepów E. faecium HLAR na ampicylinęi penicylinę potwierdza obserwacje wielu badaczy, o równocześniewyższej oporności szczepów o fenotypie HLARna inne grupy antybiotyków. Doksycyklina i norfloksacynaokazały się nieskuteczne wobec większości szczepówE. faecalis, wyizolowanych z moczu. W przypadku szczepuE. faecium, skuteczna była jedynie doksycyklina.Nowe zagrożenie stanowią szczepy Enterococcus spp.niewrażliwe na glikopeptydy (VRE), stosowane w przypadkuzakażeń enterokokowych, nie dających się leczyć innymiantybiotykami [16, 17]. Odsetek izolatów VRE, w niektórychkrajach, dotyczy od 13,6% do 20% wszystkich zakażeńenterokokowych [18, 19]. Oporność typu VRE nie wystąpiław przypadku żadnego z przebadanych szczepów.Mały odsetek izolatów zidentyfikowanych w obrębierodzaju Streptococcus spp. (9 szczepów) Micrococcus sp.(1 szczep) wskazuje na niewielki ich udział w etiologii zakażeńna diagnozowanym oddziale chirurgii urazowo-ortopedyczneji nie pozwala na miarodajną ocenę ich lekowrażliwości.Wnioski1. Dominujący udział w etiologii zakażeń, w oddziale chirurgiiurazowo‐ortopedycznej, miały szczepy z rodzajuStaphylococcus spp. – 64,76% i Enterococcus spp.– 25,71%, a wśród nich S. aureus – 60 szczepów orazE. faecalis – 24 szczepy.2. Oporność na metycylinę wykazało 20% szczepówS. aureus (MRSA) i aż 71,43% szczepów gronkowcówkaogulazoujemnych (MRCNS). Zarówno, w grupieMRSA, jak i MRCNS, odsetek szczepów opornych nainne antybiotyki był znacznie wyższy niż wśród szczepówmetycylinowrażliwych.3. Wszystkie przebadane gronkowce były oporne na penicylinę,a największą wrażliwość wobec nich wykazały trimetoprim/sulfametoksazol,ciprofloksacyna i doksycyklina.4. Wśród zakażeń enterokokowych, wykazano duży udziałszczepów HLAR. Oporności tej często towarzyszyłazwiększona oporność na inne antybiotyki.5. Antybiotyki β-laktamowe – ampicylina i penicylina okazałysię najskuteczniejszymi lekami wobec szczepówE. faecalis, natomiast szczepy E. faecium wrażliwe byłyjedynie na doksycyklinę.6. Żaden szczep z rodzaju Staphylococcus spp. i Enterococcusspp. nie był oporny na glikopeptydy.7. Metycylino- i wielolekooporne gronkowce oraz enterokokio fenotypie HLAR najczęściej izolowano z ran.8. Patogeny alarmowe stanowiły 13,33% ogółu izolatówi należało do nich 12 szczepów MRSA i 2 szczepy Streptococcuspyogenes.9. Otrzymane wzory lekowrażliwości, dla większości wyizolowanychszczepów, korelują z wynikami uzyskiwanymidla ziarenkowców Gramdodatnich z innych polskichszpitali.10. W celu ograniczenia narastającej oporności bakterii naantybiotyki, konieczne jest ciągłe monitorowanie lekowrażliwościi racjonalne stosowanie antybiotykoterapii.Sposób finansowania: badania własne - umowa nr:KNW-2-048/0820

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Piśmiennictwo1. Gaździk TS. Zakażenia w ortopedii. Urban & Partner.Wrocław 2004.2. Wilk I, Ekiel A, Martirosian G. Gronkowce – nowe właściwościstarych patogenów. Nowa Klinika 2004; 7-8(11): 719-723.3. Krawczyk B. Diagnostyka molekularna w zakażeniachszpitalnych. Post Mikrobiol 2007; 46 (4): 367-378.4. Piekarska K. Enterokoki – czynniki wirulencji i chorobotwórczości.Post Mikrobiol 2006; 3 (45): 195-207.5. Grzesiowski P, Rychlewska A. Aktualna sytuacja epidemiologicznaw polskich szpitalach. Podsumowanieraportów wg Wytycznych Głównego Inspektora Sanitarnegoz maja 2004 w sprawie rejestracji i raportowaniazakażeń szpitalnych. Warszawa 27 czerwca 2005.6. Hryniewicz W i wsp. Rekomendacje doboru testów dooznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki2006. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego.Warszawa 2006.7. National Committee for Clinical Laboratory Standards.2003. Approved standard M2-A8. Performance standardsfor antimicrobial disk susceptibility tests, 8 th ed.NCCLS, Wayne, Pa.8. Romaniszyn D i wsp. Nadzór epidemiologiczny i mikrobiologicznynad zakażeniami miejsca operowanego wośrodku ortopedycznym. Ortop Traumatol Rehab 2006;8 (6): 639-645.9. Dzierżanowska D i wsp. Lekooporne drobnoustroje wzakażeniach szpitalnych. Post Mikrobiol 2004; 1 (43):81-105.10. Bednarek M, Majda-Stanisławska E. Występowanieszczepów metycylinoopornych gronkowców złocistych(MRSA) oraz trudności w leczeniu wywołanych przeznie infekcji u dzieci hospitalizowanych w Klinice. PrzeglEpidemiol 2006; 60: 49-52.11. Mikołajczyk D i wsp. Oporność na kotrimoksazol gronkowcówmetycylinoopornych izolowanych z materiałuklinicznego w latach 2001-2003. Med Dośw Mikrobiol2005; 57: 235-240.12. Kochman M i wsp. Wrażliwość na wybrane antybiotykibakterii izolowanych z próbek materiału klinicznegow Polsce w 1998 roku – analiza wyników badań ankietowychcz. I. Lekowrażliwość gronkowców. Przegl Epidemiol2005; 59: 679-694.13. Bartoszewicz M i wsp. Fenotypowa charakterystykagronkowców koagulazoujemnych izolowanych z ran odpacjentów hospitalizowanych na oddziale oparzeniowymi chirurgii urazowej. Med Dośw Mikrobiol 2005;57: 247-252.14. Pszenna M, Rokosz A, Łuczak M. Lekowrażliwośćszczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych od pacjentówszpitala SP ZOZ w Nidzicy. Med Dośw Mikrobiol2006; 58: 1‐9.15. Wydmuch Z i wsp. Oporność na chinolony wybranychziarenkowców Gramdodatnich izolowanych z materiałuklinicznego w szpitalu regionu śląskiego. Diagn Lab2003; 39: 515-521.16. Szachta P i wsp. Wankomycynooporne enterokoki - charakterystykazagrożeń i perspektyw terapeutycznych GastroenterolPol 2008; 15 (4): 251-254.17. Bronk M, Samet A. Szpitalne bakteriemie enterokokowe.Post Mikrobiol 2008; 47 (3): 339-344.18. Kawalec M, Hryniewicz W. Oporność enterokoków naaminoglikozydy i glikopeptydy – podstawy biologicznei znaczenie kliniczne. Nowa Klinika 1999; 5 (6):520-523.19. Wieczyńska J, Kamińska W, Dzierżanowska D. Enterokoki– patogeny XXI wieku. Post Mikrobiol 2001; 3(40): 257-278.data otrzymania pracy: 03.11.2009 r.data akceptacji do druku: 18.03.2010 r.Adres do korespondencji:dr n. biol. Małgorzata KępaKatedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach,ul. Jagiellońska 4, 41‐200 Sosnowiectel. +48 32 364 16 21 - 25;e-mail: mkepa@sum.edu.pl21

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073DabigatranW 2008 r. dopuszczano do obrotu w całejUnii Europejskiej preparat Pradaxa (eteksylandabigatranu). Preparat dostępny jest w także Kanadzie,w postaci kapsułek 75 mg i 110 mg, zewskazaniem do stosowania w żylnych powikłaniachzakrzepowo – zatorowych (Tab. I.)Farmakokinetyka dabigatranuEteksylan dabigatranu (628 D) jest prolekiemszybko i całkowicie przekształcanym do formy aktywnejdabigatranu (471 D) w procesie hydrolizyprzy udziale esteraz osoczowych. Lepiej wchłania sięw środowisku kwaśnym. Pokarm nie wpływa na dostępnośćbiologiczną dabigatranu. Z uwagi na małądostępność biologiczną (5 - 7.2%) w celu osiągnięciaodpowiedniego stężenia w osoczu należy stosowaćdość duże dawki leku. Jest częściowo metabolizowanyw wątrobie bez udziału cytochromu P450. Poosiągnięciu stanu stacjonarnego okres półtrwania wynosi14-17h. Dabigatran wiąże się z białkami osoczaw 34-35%. T max osiągane jest po 1.25-3 godz. Jestwydalany przez nerki w ok. 85% i w ok. 20% z żółcią[11]. U chorych z ciężkimi zaburzeniami czynnościnerek (klirens kreatyniny

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Ryc. 2. Mechanizm działania dabigatranu.Proces krzepnięcia in vivo jest inicjowany głównie przez szlak dawniej nazywanyzewnątrzpochodnym, a jego czynnikiem wyzwalającym jest wynikającaz uszkodzenia naczynia ekspresja TF. Kolagen aktywuje drogę dawniej nazywanąwewnątrzpochodną, której obecnie przypisuje się funkcję pomocniczą -modulatora układu zewnątrzpochodnego Uszkodzenie śródbłonka umożliwiapołączenie się TF z czynnikiem VII i wytworzenie przy współudziale jonówwapnia i fosfolipidów proteolitycznie aktywowanego kompleksu TF/VIIa. Powstałykompleks aktywuje czynnik IX, który z kolei wraz z aktywnym czynnikiemVIII (VIIIa), jonami wapnia i fosfolipidami tworzy kompleks - tenazę, której zadaniemjest aktywacja czynnika X. Aktywny czynnik X (Xa) na powierzchni płytkowychfosfolipidów wraz z aktywnym czynnikiem V (Va) i protrombiną tworzykolejny kompleks - protrombinazę. W kompleksie tym tworzona jest trombina,która odszczepia od fibrynogenu dwie pary fibrynopepydów (fibrynopeptydyA i B). Powstałe w ten sposób monomery fibryny polimeryzują spontaniczniew sieć przestrzenną fibryny, która przy udziale aktywnego czynnika XIII (XIIIa)jest stabilizowana kowalencyjnymi wiązaniami krzyżowymi. Powstała fibrynawzmacnia pierwotny czop płytkowy tworząc stabilny zakrzep płytkowo-fibrynowy[12, 13].TF- czynnik tkankowy, PLT – płytki krwi, FL- fosfolipidyDabigatran w wybranych badaniach klinicznychdabigatran jest podobnie skuteczny w prewencjiżylnej choroby zakrzepowo-zatorowej u pacjentówpoddanych operacjom ortopedycznym jakheparyna drobnocząsteczkowa, bez zwiększeniaryzyka krwawienia. Badania te stały się podstawądo rejestracji leku z powyższym wskazaniem.We wrześniu 2009 roku ogłoszono wynikibadania RE-LY (The Randomized EvaluationofLong-Term Anticoagulation Therapy), któregocelem było porównanie skuteczności dabigatranui warfaryny w prewencji udaru i zatoru obwodowegou pacjentów z migotaniem przedsionkówbez chorób zastawek serca oraz co najmniej jednymczynnikiem udaru mózgu [18]. Wyniki badaniaRE-LY dowodzą, że dabigatran jest takżeskuteczny i bezpieczny u chorych z migotaniemprzedsionków. W mniejszej z badanych dawek(2 × 110 mg/dobę) okazał się podobnie skuteczny,ale bardziej bezpieczny niż warfaryna.W większej dawce (2×150 mg/dobę) lek powodowałporównywalne ryzyko krwawień, ale dawałlepszą ochronę przed powikłaniami zatorowymi.W obu dawkach obserwowano redukcję groźnychdla życia krwawień śródczaszkowych. Coważne, w trakcie długoterminowej obserwacji niestwierdzono hepatotoksyczności. Na pełną ocenęprzydatność terapeutycznej i bezpieczeństwa dabigatranupozwolą badania w grupach pacjentówz chorobą wieńcową oraz po interwencjach sercowych.W II fazie badań klinicznych znajdują siędwa inne bezpośrednie inhibitory trombiny. FirmaAstra Zeneca bada substancję pod robocząnazwą AZD0837 a firma Mitsubishi PharmaMCC977 [14].Działania niepożądane i interakcjeRE-VOLUTION jest programem badawczym z udziałem dabigatranu,na który składają się zakończone badania kliniczne nad prewencjąpierwotną zakrzepicy żylnej (RE-MODEL, RE-MOBILIZEi RE-NOVATE) [15, 16, 17] oraz będące nadal w toku badania kliniczneoceniające skuteczność i bezpieczeństwo dabigatranu u chorychz rozpoznaną zakrzepicą żylną (RE-COVER i RE-MEDY) [14]. W badaniachRE-MODEL, RE-MOBILIZE i RE-NOVATE dowiedziono, żeTab. II. Farmakologiczne właściwości doustnych antykoagulantów i dabigatranu24Właściwości Doustne antykoagulanty DabigatranSpecyfika działaniaWiele miejsc wiązaniaNieselektywnePowolny początek działaniaWąskie okno terapeutyczneJedno miejsca wiązaniaSelektywneSzybki początek działaniaSzerokie oknoterapeutyczneDzienna ilość dawek 1 1Droga podania Doustna DoustnaBadanialaboratoryjneZróżnicowanieodpowiedzi na lekINRWysokieOznaczanie INR nie jestkonieczneBrakDotychczasowe obserwacje nie wskazują naistnienie poważnych działań niepożądanych dabigatranu[14-19]. Najczęstsze są krwawienia, którewystępują u około 14% pacjentów, w tym dużekrwawienia u poniżej 2% pacjentów. Dyspepsja,wynikająca z dodatku kwasu winowego, który poprawiawchłanianie dabigatranu, jest obserwowanau ok. 11% chorych.Dabigatran wchodzi w nieliczne interakcjez lekami. Metabolizm bez udziału cytochromuP450 i niewielki stopień wiązaniaz białkami osocza ogranicza liczbę możliwychinterakcji lekowych. Biodostępnośćleku przy jednoczesnym stosowaniu inhibitorówpompy protonowej zmniejsza sięo 20-30%. Dabigatran jest substratem glikoproteinyP, dlatego należy zachować szczególnąostrożność w przypadku jednoczesnegostosowania inhibitorów glikoproteiny P.Warto zaznaczyć, że nie ma substancji odwracającejwłaściwości przeciwzakrzepowedabigartanu

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tab III. Badania kliniczne III fazy z udziałem dabigatranuBadanieGrupa pacjentówLekreferencyjnyLiczbapacjentówDatazakończeniaRE-NOVATERE-MOBILIZERE-MODELPrewencja pierwotna i leczenie żylnej choroby zakrzepowozatorowejw zabiegach ortopedycznych enoksyparyna 7500 2007-2009RE-LY Migotanie przedsionków warfaryna 18113 2009RE-COVERRECOVER IIRE-MEDYLeczenie ostrej żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej warfaryna 26002600Wtórna prewencja żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej20112012warfaryna 1800 2011Tab. IV. Interakcje dabigatranuInterakcje za pośrednictwem białek transportowychAmiodaron, werapamil i klarytromycyna zwiększają stężenie dabigatranu w osoczu.Inhibitory glikoproteiny PZaleca się ostrożność podczas stosowania silnych inhibitorów glikoproteinyi monitorowanie kliniczne pacjenta.Aktywatory glikoproteiny PRifampicyna i ziele dziurawca mogą zmniejszać ogólnoustrojową ekspozycję na dabigatran.Interakcje związane z właściwościami metabolicznymi dabigatranuIstnieje ryzyko krwawień związane z podaniem NLPZ o okresach półtrwania w fazie eliminacji dłuższych niż 12 godzin; zaleca się klinicznąobserwację chorego.Interakcje farmakodynamiczneZe względu na ryzyko wystąpienia krwawienia nie powinno się stosować dabigatranu z lekami przeciwkrzepliwymii przeciwpłytkowymi.Podsumowanie1. Dabigatran jest jedynym obecnie zarejestrowanymdoustnym bezpośrednim inhibitorem trombiny zewskazaniem do stosowania w prewencji epizodówzakrzepowo-zatorowych po przebytych zabiegachortopedycznych.2. Dabigatran posiada większość cech idealnego leku przeciwkrzepliwego,co umożliwia jego wygodne dawkowaniebez konieczności monitorowania procesu koagulacji,gwarantując pełne współdziałanie pacjenta z lekarzem.3. Toczące się badania kliniczne oraz nowe badaniaw grupach pacjentów z chorobą wieńcową lub po interwencjachsercowych, dostarczą pełniejszych informacjio skuteczności i bezpieczeństwie stosowania dabigatranu.Piśmiennictwo1. Hixson-Wallace JA, Dotson JB, Blakey SA. Effect of regimencomplexity on patient satisfaction and compliance withwarfarin therapy. Clin Appl Thromb Hemost 2001; 7: 33-37.2. Bounameaux H. The novel anticoagulants: entering anew era. Swiss Med Wkly 2009; 139: 60-64.3. Bauer KA. New anticoagulants. Hematology Am SocHematol Educ Program 2006; 450-456.4. Turpie AG. Oral, direct factor Xa inhibitors in developmentfor the prevention and treatment of thromboembolicdiseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007; 27:1238-1247.5. Gross PL, Wetz JI. New anticoagulants for treatment ofvenous thromboembolism. Arterioscler Thromb VascBiol 2008; 28: 380-386.6. Ansell J. Factor Xa or thrombin: is factor Xa a bettertarget? J Thromb Haemost 2007; 5: 60-64.7. Hauel NH i wsp. Structure-based design of novel potentnonpeptide thrombin inhibitors. J Med Chem 2002; 45:1757-1766.8. Baetz BE, Spinler SA. Dabigatran etexilate: an oral directthrombin inhibitor for prophylaxis and treatment ofthromboembolic diseases. Pharmacotherapy 2008; 28:1354-1373.9. Stangier J i wsp. Pharmacokinetic profile of the oraldirect thrombin inhibitor dabigatran etexilate in healthyvolunteers and patients undergoing total hip replacement.J Clin Pharmacol 2005; 45: 555-563.10. Blech S i wsp. The metabolism and disposition of theoral direct thrombin inhibitor, dabigatran, in humans.Drug Metab Dispos 2008; 36: 386-399.11. Stangier J i wsp. The pharmacokinetics, pharmacodynamicsand tolerability of dabigatran etexilate, a new oraldirect thrombin inhibitor, in healthy male subjects. Br JClin Pharmacol 2007; 64: 292-303.12. Rapaport SI, Rao LV. The tissue factor pathway: howit has become a “Prima Ballerina”. Thromb Haemost1995; 74: 7-17.13. Bouchard BA i wsp. Interactions between platelets andthe coagulation system. Academic Press 2002; 229-253.14. Garcia D, Libby E, Crowther MA. The new oral anticoagulants.Blood 2010; 115: 15-20.15. Ginsberg JS i wsp. Oral thrombin inhibitor dabigatranetexilate vs the North-American enoxaparinregimen for prevention of venous thromboembolismafter knee arthroplasty surgery. J Arthoplasty 2009;24: 1-9.16. Eriksson BI i wsp. Dabigatran etexilate versusenoxaparin for prevention of venous thromboembolismafter total hip replacement: a randomised,double-blind, non-inferiority trial. Lancet 2007;370: 949-956.25

Farm Przegl Nauk, 2010, 317. Eriksson BI i wsp. Oral dabigatran etexilate vs. subcutaneousenoxaparin for the prevention of venous thromboembolismafter total knee replecement: the RE-MODEL randomizedtrial. J Thromb Haemost 2007; 5: 2178-2185.18. Connolly SJ i wsp. Dabigatran versus warfarin in patientswith atrial fibrillation. N Engl J Med 2009; 361:1139-1151.19. Bellamy L, Rosencher N, Eriksson B. Adherence toa new oral anticoagulant treatment prescription: dabigatranetexilate. Patient Prefer Adherence 2009; 3:173-177.data otrzymania pracy: 04.02.2010 r.data akceptacji do druku: 09.03.2010 r.Adres do korespondencji:Ewa ChabielskaSamodzielna Pracownia BiofarmacjiUniwersytet Medyczny w Białymstokuul. Mickiewicza 2C, 15-222 Białystokbiofarm@umwb.edu.pl26

Farm Przegl Nauk, 2010,3, 27-32copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073The influence of Desulfovibrio desulfuricans endotoxin on IL-6and IL-6 receptor genes expression in colon cancerCaco-2 cellsWpływ endotoksyny Desulfovibrio desulfuricansna ekspresję genów kodujących IL-6 i receptor IL-6w komórkach nowotworowych jelita grubego Caco-2Krzysztof Cholewa 1 , Ludmiła Węglarz 1 , Beata Parfiniewicz 1 , Jolanta Lodowska 1 , Marzena Jaworska-Kik 21Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach2Katedra i Zakład Biofarmacji, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachAbstractBiological activity of lipopolysaccharide (LPS) derivedfrom bacteria of Desulfovibrio desulfuricans specieswas evaluated by analyzing its effect on the expressionof IL-6 and IL-6 receptor (IL-6R) genes at the transcriptionallevel in human colon cancer cells Caco-2. Real-timeRT-QPCR based on TaqMan methodology was applied toanalyze quantitatively the transcript levels of target genes.The amount of mRNAs produced in cells was determinedas a function of time of treatment (1, 6, 12, 24 h) and LPSconcentration (10, 50, 100 μg/cm 3 ). Exposure to LPS inincreasing dose in a short time of incubation (1 h) downregulatedthe transcription of analyzed genes comparedto their constitutive expression, whereas the elongationof incubation (6 h) in the presence of 50 μg/cm 3 LPS increasedtranscriptional activity of both genes.Key words: IL-6, IL-6R, LPS, Desulfovibrio desulfuricans,QRT-PCR, Caco-2 cellsStreszczenieBadano aktywność biologiczną lipopolisacharydu (LPS)z bakterii gatunku Desulfovibrio desulfuricans poprzezanalizę jego wpływu na ekspresję genów kodującychIL-6 i receptor IL-6 na poziomie transkrypcji w ludzkichkomórkach nowotworowych jelita grubego linii Caco-2.Ocenę aktywności transkrypcyjnej badanych genów prowadzonoz zastosowaniem techniki RT-QPCR w czasierzeczywistym w oparciu o metodologię TaqMan. Liczbętranskryptów w komórkach określano w funkcji czasuoddziaływania LPS i jego stężenia. Traktowanie komórekprzez krótki czas LPS we wzrastających stężeniachprowadziło do zmniejszenia ekspresji badanych genóww stosunku do konstytutywnej ekspresji, a wydłużenie inkubacji(6 godzin) w obecności 50 μg/cm 3 LPS zwiększyłoaktywność transkrypcyjną obu genów.Słowa kluczowe: IL-6, IL-6R, LPS, Desulfovibrio desulfuricans,ORT-PCR, Caco-2 cellsIntroductionIntestinal epithelial cells in addition to their physicalbarrier role, can function as integral components of thehost’s mucosal immune system. The ability of these cellsto secrete cytokines in response to inflammatory or pathogenicstimuli is well established [1]. Intestinal epitheliumremains in continuous contact with heterogeneous populationsof intestinal microbiota and bacterial products that canmodulate immunologic functions of epithelial cells [2, 3]. Inresponse to bacterial invasion, e.g., by Salmonella dublin,Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenesand enteroinvasive Escherichia coli, they rapidlyup-regulate expression and secretion of proinflammatorycytokines, including IL-8, monocyte chemotactic protein-1,granulocyte-macrophage colony stimulating factor and tumornecrosis factor α [4].Bacterial lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin componentof the outer membrane is the principal active agentcapable of activating immune and non-immune host cellsduring infections mediated by Gram-negative bacteria. Itacts as a potent stimulus of expression of cytokines, adhesiveproteins and proiflammatory molecules. It has been reportedthat LPS originating from intestinal flora could aggravateinflammatory bowel disease [3]. Bacterial endotoxins havebeen detected in the plasma of inflammatory bowel diseasepatients and an abnormal microflora and/or deregulated immuneresponse toward the resident bacterial flora togetherwith an increased permeability of the intestinal mucosa havebeen invoked as cofactors responsible for endotoxemia [5].27

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Sulfate-reducing bacteria of Desulfovibrio desulfuricansspecies are ubiquitous in nature and are also constituentsof the normal anaerobic flora of human digestive tract[6]. However, occasionally they can become opportunisticpathogens. Their increased populations have been found inpatients suffering from ulcerative colitis and Crohn’s disease[7]. In addition, cases of abdominal infections such asabscess and cholecystitis, bacteremia and septicemia causedby these bacteria have been described [8]. Our previous studieson the activity of D. desulfuricans endotoxins revealedthe changes in cytokine secretion by colonic epithelial cellsand endothelial cells induced by LPS isolated from intestinaland soil strains of these bacteria [9, 10]. Furthermore, endotoxinsderived from D. desulfuricans demonstrated greaterbiological potency in stimulating TNF-α secretion from humanmononuclear cells compared to endotoxins from Escherichiacoli and Salmonella minnesota [11].With regards to the mucosal immune system, interleukin-6(IL-6) is a cytokine of particular interest because itis involved in both inflammatory and normal immune responses.Under physiologic conditions IL-6 expression isimportant for the host response to a number of infections. Ithas been shown to preferentially enhance IgA secretion byPeyer’s patch B cells, and also to induce IgG secretion, macrophagedifferentiation, T cell proliferation and to regulatethe acute-phase protein responses [12]. Several studies havesuggested that intestinal epithelial cells may be a significantsource of IL-6 in the intestine and that high levels of IL-6can affect neighbouring intestinal epithelial cells consideringthe presence of IL-6 receptors on both their basolateraland apical surfaces [13, 14].Under pathological states excessive secretion of IL-6may play a major role in the pathogenesis of many diseasesincluding inflammatory bowel disease and earlycolitis-associated cancers [15, 16, 17]. Its increased levels inthe serum and in mucosal biopsies of patients with inflammatorybowel diseases during the acute phase of inflammationcorrelated with the severity of disease and were predictive ofa flare [18, 19]. Similar results were observed in ulcerativecolitis, where elevated IL-6 mRNA expression in inflamedmucosa was determined [20]. Furthermore, it has been reportedthat IL-6 and IL-6 receptor mRNAs were increasedin colonic adenocarcinoma compared with normal coloniccells, and that proliferative activity of the tumor could beregulated by locally produced IL-6 [21, 22]. IL6 appears toact in a paracrine fashion to promote angiogenesis and tumorgrowth. Inhibiting IL6 may therefore have therapeuticutility for treatment of cancers characterized by oncogenicRas mutations [23].IL-6 exerts its biological effects by binding to a membranereceptor consisting of two components, a 80 kDa lowaffinitybinding protein (designated as gp 80 or IL-6R) and a130 kDa transducing element (gp130) that has no significantaffinity for IL-6 but associates with the gp 80 component toform a high-affinity functional IL-6 receptor [24].Because of the above-summarized importance of IL-6in the innate mucosal immune responses and its role in inflammation,we have analyzed whether LPS from D. desulfuricansintestinal strain affects transcriptional activationof IL-6 and its receptor genes in human colon cancer cellsby analyzing the amount of the corresponding mRNAs producedin cells as a function of time of treatment and LPSconcentration.Material and MethodsCell culture and treatmentThe human colonic adenocarcinoma cell line Caco-2 waspurchased from the German Collection of Microorganismsand Cell Cultures (Braunschweig, Germany). The cells werecultured in RPMI 1640 medium (Sigma) supplemented with10% fetal bovine serum (GIBCO, BRL), 100 U/cm 3 penicillinand 100 µg/cm 3 streptomycin (Sigma). The cultures weremaintained as monolayers at 37°C in a 95% air-5% CO 2humidatmosphere.The basic culture method of the Caco-2 cells for IL-6and IL-6R expression was as follows. Cell cultures wereinitiated at 1x10 6 cells/well in 12-well tissue culture plateswith RPMI complete medium. Three days after plating, themedium was changed for serum-free medium and the cellswere cultured for two days. Afterwards the medium was replacedagain with fresh one containing 10 mM HEPES andno serum. The cultures were then incubated for 1, 6, 12, and24 h in the absence and presence of one of the followingtreatments: 10 µg/cm 3 LPS, 50 µg/cm 3 LPS and 100 µg/cm 3LPS. After the indicated time periods, the monolayers wererinsed with phosphate-buffered saline and used for RNA extraction.Preparation of LPSThe intestinal strain of D. desulfuricans was isolatedfrom feces derived from patients with asiderotic anemia andcholestasis according to the method described previously[25]. Endotoxic LPS was isolated from bacterial cells accordingto the water-phenol method of Westphal et al. [26].Stock solution of 1 mg/cm 3 of LPS was made in RPMI 1640culture medium and vortexed for 10 min using ultrasonicbath (Decon Ultrasonic Ltd., England). This stock was thendiluted to the final concentrations of 10 µg/cm 3 , 50 µg/cm 3and 100 µg/cm 3 in RPMI.RNA extraction and evaluationTotal cellular RNA was extracted from the control andLPS-treated cells with the use of TRIZOL reagent (Invitrogen)according to the producer’s protocol. Quality andquantity of isolated RNA was evaluated using 1.0% agarosegel electrophoresis with subsequent visualization by ethidiumbromide staining and optical density measurements atλ=260nm using a GeneQuant pro RNA/DNA Calculator(Amersham Biosciences), respectively.Real-time QRT-PCR assayTranscriptional activity of the analyzed genes was evaluatedwith the use of the quantitative real-time PCR method(QRT-PCR) based on the TaqMan flurogenic detection system(TaqMan R , PE Applied Biosystems). Glyceraldehyde-28

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50733-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was included as anendogenous control in each single QRT-PCR to monitor RT-PCR efficiencies for all samples. To amplify the fragmentsof all analyzed genes, commercially available gene specificprimer pairs and probes were used (GenBank accession no.:IL-6: Hs0017431_m1; IL-6R: Hs00794121_m1; GAPDH:Hs99999905_m1) (PE Applied Biosystems). Reverse transcriptionand amplification reactions were performed usingthe ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE AppliedBiosystems). The thermal profile of one-step RT-PCRwas as follows: 50°C for 30 min (reverse transcription) followedby 95°C for 15 min (DNA polymerase activation) andthen 40 cycles of amplification at 94°C for 15 s and 60°C for1 min each. QRT-PCR assay was performed in triplicate foreach sample. PCR product size was verified by electrophoresison a 6% polyacrylamide gel with silver staining andcomparing its mobility with that of molecular mass markerpBR322/HaeIII (MBI Fermentas) based on the programGelScan version 1.45.Quantification of expression of the analyzed genesTranscriptional activity of IL-6 and IL-6R genes wasevaluated on the basis of copy number of their mRNAs relatedto 1 µg of total RNA. To quantify the mRNA copynumbers of all the examined genes, the standard curve methodwas used. A commercially available fragment of β-actincDNA (TaqMan R DNA Template Reagent Kit, PE AppliedBiosystems) was amplified in five different concentrations(from 0.6 µg/cm 3 to 12 µg/cm 3 ) as recommended by Bustin[27]. Values of copy numbers for the standards were calculatedbased on the relationship that 1 ng of DNA is equalto 333 genome equivalents (TaqMan PCR Reagent Kit ProtocolP/N 402823). Amplification plots for each dilution ofthe control template were used to determine the Ct value.A standard curve was generated by plotting the Ct valuesagainst the log of a known amount of β-actin cDNA copynumbers.Statistical analysisThe experimental data were expressed as means ± standarddeviation. Results were analyzed using Shapiro-Wilktest, for comparing sample means Duncan test was allpied,influences between modulating factors were calculated usingbifactoral variation analysis. Results were subjectedto statistical analysis using Statistica PL ver. 6.0 software(StatSoft) with the significance level set at p < 0.05.ResultsIn this study we analyzed mRNA expression for IL-6,IL-6 receptor and GAPDH in human colon Caco-2 cellstreated with D. desulfuricans endotoxin, by the use of realtime QRT-PCR. The specificity of QPCR amplification wasconfirmed experimentally by polyacrylamide gel electrophoresiswhich revealed the presence of single productswith the desired lengths of 95bp, 118bp and 122bp for IL-6,IL-6R and GAPDH, respectively. In all samples tested, mR-NAs of GAPDH and two target genes were detected, whichindicated the integrity of the RNA extracts and the lack ofRT-PCR inhibitors.Descriptive statistics of the expression of GAPDH genein cells treated different concentrations of LPS and in controlcells is demonstrated in Table IA. Statistical analysis ofthe experimental data with the use of Duncan test showedsignificant differences (p ˂ 0.005, data not shown) in transcriptionalactivity of GAPDH gene in cells when consideredboth at each experimental time point following treatmentwith increasing LPS dose and as a function of incubationperiod. The unstable transcription of the GAPDH genein response to LPS inclined us to exclude the utilization ofTable I. Descriptive statistics of expression of GAPDH gene (A), IL-6 gene (B) and IL-6 receptor gene (C) in Caco-2 cellsat different concentration of LPS and in control cells. The values are expressed as mean ± S.D. number of copies of targetgenes transcript per 1 µg of total RNAA)B)C)LPS concentration[μg/cm 3 ]0 10 50 100time [hour]1 2190000±85440 2233333±245832 1903333±347754,7 1630000±308058,46 1983333±72342 1936667±65064 1906667±45092,5 2013333±220529,712 129416±9695 134226±3801 144189±9672,4 134457±4821,624 126338±8133 128427±6413 145744±7575,2 138779±2047,1LPS concentration[μg/cm 3 ]0 10 50 100time [hour]1 17±7,5 15±1,3 8±1,6 7±1,06 4±0,5 9±1,2 19±10,6 10±0,112 4±1,8 3±1,5 5±3,2 3±0,924 3±1,4 1±0,1 3±0,02 4±3,2LPS concentration[μg/cm 3 ]0 10 50 100time [hour]1 33095±10239,8 27044±2997,3 17990±6327,1 18509±7825,76 20139±6597,2 17588±8059,4 21459±1235,9 25452±8281,812 19733±5749,6 515±59,1 581±229,2 433±28,824 730±468,1 535±177,9 491±118,0 451±16,829

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Fig. 1. Bifactoral variation analysis of the number of IL-6 mRNA copiescalculated per 1 µg of total RNA in Caco-2 cells at various concentrationsof LPS and different time of incubation.IL-6 gene was evoked by LPS at a dose of 50μg/cm 3 following 6 h incubation with the cells.This time period (6 h) of four incubation timesappeared also to be most efficient in termsof the IL-6 transcript level made in responseto LPS at 100 μg/cm 3 concentration. Longertimes of cell treatment (12 h, 24 h) with endotoxinas compared to 6 h time period resultedin progressive down-regulation of IL-6 genetranscription by LPS of all three doses, whichindicates relatively rapid changes induced onthis gene level by endotoxin. Surprisingly, innon-stimulated cells a significant increase ofexpression of IL-6 gene could be observed afterthe first hour of incubation. The extensionof incubation time to 6 h with no LPS causedsignificant decrease in the amount of IL-6 transcriptwhich did not change statistically significantlyover incubation up to 24 hours (Fig. 1).As opposed to IL-6 gene, IL-6 receptor expressionlevel in control cells was going downduring time of incubation, but just as IL-6, alsoIL-6R expression revealed dependence on theconcentration of stimulating factor and time ofincubation (p=0.0029). As shown in Fig. 2, the6 h incubation with LPS was the most effectiveperiod influencing the changes in expressionlevel of IL-6R. The increase in concentration ofLPS caused increase in IL-6R gene transcriptionalactivity, although the observed changeswere not statistically significant. The highestexpression of IL-6 receptor gene was evokedby LPS at 100 μg/cm 3 dose following 6 h incubationwith the cells. Caco-2 culture exposedto different LPS concentration for 24 h did notchange the basal expression of IL-6R gene.Fig. 2. Bifactoral variation analysis of the number of IL-6 receptor mRNAcopies calculated per 1 µg of total RNA in Caco-2 cells at various concentrationsof LPS and different time of incubation.this gene as a reference for the calculation of target genesexpression in Caco-2 cells. Therefore, the transcript copynumbers of IL-6 and IL-6R were recalculated per 1 µg oftotal cellular RNA, as recommended by Bustin [27], especiallyas higher dispersion of the results for internal controlsare noted.In the next step of the study, we determined IL-6 andIL-6R mRNA levels in control cells and cells treated withthree doses of LPS for four different times. The values of expressionin terms of transcript copy numbers of the analyzedgenes are demonstrated in Table IB and IC. Cultured Caco-2cells constitutively expressed detectable levels of mRNAsfor IL-6 and IL-6R. Bifactoral variation analysis of the experimentaldata for IL-6 gene transcription showed that thetime of incubation with LPS and its concentration cooperatedin the influence on mean values of IL-6 expression level(p=0.0005). As shown in Fig. 1, the highest expression of30DiscussionA lot of immunological evidences supportthe role of bacterial antigens such as thosecontained in bacterial cell wall in the pathogenesisof inflammatory bowel disease, whichis characterized by overactivation of the intestinal immunesystem [28]. On the other hand, poorly regulated inflammatoryresponse to pathogenic bacterial infections may causean increase risk for developing cancer [29]. The close proximityof Gram-negative bacteria adhering to the epithelialcell surface may increase the local concentration of LPSwhich triggers immune response in the intestinal mucosa.LPS may account for the release of exaggerated amounts ofpro-inflammatory cytokines detected in mucosal specimensand stools from inflammatory bowel disease patients [3].An exaggerated mucosal immune response may, in turn, accountfor the intestinal damage. This hypothesis is supportedby the findings that LPS interacts with Toll-like receptors onintestinal epithelial cells [30]. These cells, besides laminapropria mononuclear cells have been shown to be the majorsource of IL-6 seen in inflammatory bowel diseases [31].Production and secretion of IL-6 may be both the nor-

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073mal status of intestinal epithelial cells and the result of aninflammatory response [32]. This cytokine is considered toplay a cell protective role and counteract some of the injuriouseffects of sepsis and endotoxemia [33]. IL-6 has beenshown to decrease paracellular permeability suggesting itsbarrier protective function [34]. Oral administration of IL-6to mice decreased permeability and reduced bacterial invasionthrough the gastrointestinal tract [35]. Increased mRNAlevels for IL-6 in the mucosa of endotoxemic mice supportthe concept that IL-6 is produced locally in the intestinalmucosa during sepsis and endotoxemia [31]. In this context,up-regulation of IL-6 gene in Caco-2 colonocytes inresponse to D. desulfuricans LPS at up to 50 μg/cm 3 during6 h lasting exposure could suggest that its stimulatoryeffect on IL-6 expression may have a meaning in the protectiveeffects of IL-6 in the intestinal mucosa by reducingendotoxin-induced permeability and mucosal injury. Someof the authors claimed that intestinal epithelial Caco-2 andHT-29 cells did not produce IL-6 in response to any of thebacteria tested. As observed by Jung et al. [4], the infectionof monolayers of human colon epithelial cell lines (T84, Caco-2,HT-29) with various invasive Gram-negative bacteriaresulted in up-regulation of mRNA levels of several cytokinesexcluding that of IL-6. In contrast, Madrigal-Estebaset al. [35] presented similar to our effects of the increase ofIL-6 gene expression achieved by stimulating Caco-2 cellswith bacterial LPS, however, its concentration was lower,i.e., 10 ng/cm 3 in 4 h incubated culture.We also observed the increase of IL-6 receptor genetranscriptional activation following Caco-2 cells stimulationwith 50 μg/cm 3 LPS for 6 h. The coordinated transcriptionof IL-6 and IL-6 receptor encoding genes suggests autocrinestimulation of colonic epithelial cells by their product IL-6.Looking at the present data, it can also be thought that prolongationof cell incubation with LPS till 12 - 24 h couldinduce its harmful or damaging effects on cells resulting insignificant decrease and even abolishment of expression ofthe analyzed genes. Furthermore, the progressive increase ofLPS concentration at a short time (1 h) of incubation seemsto inhibit IL-6 and IL-6R genes expression in Caco-2 cells.With respect to the crucial role of IL-6 in the pathogenesisof chronic intestinal inflammation and the presence of D.desulfuricans in the intestine of healthy people, it can behypothesized that the ability of D. desulfuricans LPS todown-regulate IL-6 and IL-6 receptor genes may suggestsits role in limiting the initiation or propagation of inflammationwhich is a characteristics of harmless members of theintestinal microbiota.Finally, it can be concluded that D. desulfuricans LPSmight act as a regulatory agent in intestinal ecosystem dependingon host or environmental conditions. The presentedfindings can suggest that these bacteria may limit or promoteinflammatory responses in the colon.References1. McGee DW, McGee JR. Cytokine production by intestinalepithelial cells. In: Kaiserlian D., ed. Antigen presentationby intestinal epithelial cells. Austin, TX: RGLandes 1996; 95-106.2. Lan J-G, at al. Different cytokine response of primarycolonic epithelial cells to commensal bacteria. World JGastroenterol 2005; 11: 3375-3384.3. Caradonna L, at al. Enteric bacteria, lipopolysaccharidesand related cytokines in inflammatory bowel disease:biological and clinical significance. J EndotoxinRes 2000; 6: 205-14.4. Jung HC, at al. A distinct array of proinflammatory cytokinesis expressed in human colon epithelial cells in responseto bacterial invasion. J Clin Invest 1995: 95: 55-65.5. Aoki KA. Study of endotoxemia in ulcerative colitisand Crohn’s disease. Acta Med Okoyama 1978; 32:147-158.6. Dzierżewicz Z, at al. Activity of sulphate reducing inthe human digestive tract. Bull Pol Acad Sci Biol 1994;42: 171-176.7. Gibson GR, Cummings JH, MacFarlane GT. Growthand activities of sulphate-reducing bacteria in gut contentsof healthy subjects and patients with ulcerativecolitis. FEMS Microbiol Ecol 1991; 86: 103-112.8. Goldstein EJC, et al. Desulfovibrio desulfuricans bacteremiaand review of human Desulfovibrio infections. JClin Microbiol 2003; 41: 2752-2754.9. Węglarz L, at al. Biological activity of Desulfovibriodesulfuricans lipopolysaccharides evaluated via interleukin-8secretion by Caco-2 cells. Scand J Gastroenterol2003; 38: 73-79.10. Węglarz L, at al. Desulfovibrio desulfuricans lipopolysaccharidesinduce endothelial cells IL-6 and IL-8 secretionand E-selectin and VCAM-1 expression. CellMol Biol Lett 2003; 8: 991-1003.11. Węglarz L, at al. Effect of endotoxins isolated fromDesulfovibrio desulfuricans soil and intestinal strain onthe secretion of TNF-α by human mononuclear cells.Pol J Environ Stud 2006; 15: 615-622.12. Akira S, at al. Biology of multifunctional cytokines:IL-6 and related molecules (IL-1 and TNF). FASEB J1999; 4: 2860-2867.13. Shirota K, at al. Interleukin-6 and its receptor are expressedin human intestinal epithelial cells. VirchowsArch B Cell Pathol 1990; 58: 303-308.14. Wang L, at al. IL-6 induces NFκB activation in the intestinalepithelia. J Immunol 2003; 171: 3194-3201.15. Nishimoto N, Kishimoto T. Inhibition of IL-6 for thetreatment of inflammatory diseases. Curr Opin Pharmacol2004; 4: 386-391.16. Atreya R, Neurath MF. Involvement of IL-6 in thepathogenesis of inflammatory bowel disease and coloncancer. Clin Rev Allergy Immunol 2005; 28: 187-195.17. Grivennikov S, at al. IL-6 and Stat3 Are Required forSurvival of Intestinal Epithelial Cells and Developmentof Colitis-Associated Cancer. Cancer Cells 2009; 15(2): 103-113.18. Hosokawa T, et al. Interleukin-6 and soluble interleukin-6receptor in the colonic mucosa of inflammatorybowel disease. J Gastroenterol Hepatol 1999; 14:987-996.19. Nancey S, at al. Serum interleukin-6, soluble interleukin-6receptor and Crohn’s disease activity. Dig Dis Sci2008; 53: 242-247.31

Farm Przegl Nauk, 2010, 320. Isaacs KL, Sartor RB, Haskill S. Cytokine messengerRNA profiles in inflammatory bowel disease mucosadetected by polymerase chain reaction amplification.Gastroenterology 1992; 103: 1587-1595.21. Brozek W, at al. Differentiation-dependent expressionand mitogenic action of interleukin-6 in human coloncarcinoma cells: Relevance for tumour progression. EurJ Cancer 2005; 41: 2347-2354.22. Esfandi F, Ghobadloo SM, Basati G. Interleukin-6 levelin patients with colorectal cancer. Cancer Lett 2006;244: 76-78.23. Ancrile B, Lim KH, Counter CM. Oncogenic Ras-inducedsecretion of IL6 is required for tumorigenesis.Genes Dev 2007; 21: 1714-1719.24. Scheller J, Rose-John S. Interleukin-6 and its receptor:from bench to bedside. Med Microbiol Immunol 2006;195: 173-183.25. Dzierżewicz Z, et al. Isolation and evaluation of susceptibilityto sulphasalazine of Desulfovibrio desulfuricansstrains from the human digestive tract. Acta MicrobiolPol 1997; 46: 175-187.26. Westphal O, Luderitz O, Bister FZ. Bacterial strains andisolation of bacterial lipopolysaccharides. Naturforsch1952; 78: 148-154.27. Bustin SA. Quantification of mRNA using real-timereverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.J Mol Endocrinol 2002; 29: 23-39.data otrzymania pracy: 03.02.2010 r.data akceptacji do druku: 16.03.2010 r.28. Ogra PL, et al. Mucosal Immunology. 2 nd ed., San Diego,Academic Press 1999; 1055-1080.29. Erdman SE, Poutahidis T Roles for Inflammation andRegulatory T Cells in Colon Cancer. Toxicol Pathol2010; 38 (1): 76-87.30. Cario E, et al. Lipopolysaccharide activates distinctsignaling pathways in intestinal epithelial cell lines expressingToll-like receptors. J Immunol 2000; 164: 966-972.31. Wang Q, et al. Induction of the stress response increasesIL-6 production in intestinal mucosa of endotoxemicmice. Clin Sci 2000; 99: 489-496.32. McGee DW, et al. Transforming growth factor-β andIL-1 β act in synergy to enhance IL-6 secretion by theintestinal epithelial cell line, IEC-6. J Immunol 1993;2: 970-978.33. Wang Q, et al. Endotoxemia and IL-1β stimulate mucosalIL-6 production in different parts of the gastrointestinaltract. J Surg Res 1998; 76: 27-31.34. Wang L, et al. Interleukin-6 induces keratin expressionin intestinal epithelial cells. J Biol Chem 2007; 282:8219-8227.35. Madrigal-Estebas L, et al. Differential expression andupregulation of interleukin-1alpha, interleukin-1betaand interleukin-6 by freshly isolated human small intestinalepithelial cells. Mediators Inflamm 2002; 11:313-319.Adres do korespondencji:prof. dr hab. Ludmiła WęglarzKatedra i Zakład Biochemiiul. Narcyzów 141-200 Sosnowiectel. +48 32 364 10 70e-mail: lweglarz@sum.edu.pl32

Farm Przegl Nauk, 2010,3, 33-39copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Właściwości lecznicze betuliny i kwasu betulinowego,składników ekstraktu z kory brzozyTherapeutic properties of betulin and betulinic acid,components of birch bark extractBarbara Zdzisińska 1 , Agnieszka Szuster-Ciesielska 1 , Wojciech Rzeski 1,2 , Martyna Kandefer-Szerszeń 11Zakład Wirusologii i Immunologii, Instytut Mikrobiologii i Biotechnologii,Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie2Zakład Biologii Medycznej, Instytut Medycyny Wsi, LublinStreszczenieLiście brzozy wykorzystywane są w ziołolecznictwie jakołagodne środki moczopędne w chorobach dróg moczowych.Wodne wyciągi z tych liści znalazły także zastosowanie włagodzeniu bólu mięśni i stawów, natomiast tradycyjniestosowane są jako środki zapobiegające wypadaniu włosóworaz łagodzące alergiczne zmiany skórne. Ostatnio więcejuwagi poświęca się ekstraktowi z kory brzozy, złożonemugłównie z trójterpenów, takich jak betulina i kwas betulinowy.Jak wykazały doświadczenia obydwa terpeny posiadająaktywność przeciwzapalną, przeciwnowotworową,przeciwbakteryjną oraz przeciwwirusową, dlatego mogąznaleźć zastosowanie w leczeniu wielu infekcyjnych i nieinfekcyjnychchorób człowieka oraz zwierząt domowych.Słowa kluczowe: kora brzozy, betulina, kwas betulinowy,zastosowanie leczniczeAbstractThe leaves of birch trees are used as diuretic for the treatmentof bacterial and inflammatory conditions of urinarytract. The tea from leaves is also recommended for treatmentbone and joint complaints. Traditionally the leaf teais used to prevent hair loss and externally as a wash forskin rashes. Recently more attention is paid to severalbiological activity of birch bark extract, which is mainlycomposed of two triterpenes, such as betulin and betulinicacid. As it was detected in experiments, both of these triterpenespossess several biological activity: anti-inflammatory,antitumor, antibacterial and antiviral and can beused to treat several infectious and noninfectious illnessof human beings and domestic animals.Key words: birch bark, betulin, betulinie acid, therapeuticapplicationTerpenyTerpeny są naturalnie występującymi substancjami,wytwarzanymi przez wiele roślin i niektóre zwierzęta. Ichstężenie zwykle jest duże w strukturach rozrodczych orazw liściach roślin, w czasie i zaraz po kwitnieniu. Węglowodoryte są także jednym z głównych składników żywicoraz olejków eterycznych i często odpowiadają za specyficznyzapach rośliny pełniąc rolę atraktantów lub repelentów.Fizjologiczną funkcją tych wtórnych metabolitów jestnajprawdopodobniej udział w odporności roślin przeciwkopatogenom, ponieważ wysokie stężenie terpenów może byćtoksyczne dla tych organizmów [1, 2].Biosynteza terpenów zachodzi w wyniku połączeniapięciowęglowych jednostek izoprenowych (C 5H 8) w formyłańcuchowe lub pierścieniowe, w wyniku czego powstajezwiązek organiczny o wzorze ogólnym (C 5H 8) n. W zależnościod wielkości cząsteczki wyróżnia się kolejno: hemiterpeny(n=1), monoterpeny (n=2), seskwiterpeny (n=3),diterpeny (n=4), triterpeny (n=6), tetraterpeny (n=8) orazpoliterpeny. Betulina i kwas betulinowy zaliczane są dotriterpenów pentacyklicznych, natomiast liniowym triterpenemjest skwalen, główny składnik oleju otrzymywanegoz wątroby rekina. Przykładem hemiterpenów jest wchodzącyw skład olejków eterycznych kwas izowalerianowy. Inneznane terpeny to, np.: geraniol, mentol i kamfora (monoterpeny),farnezol (seskwiterpen, składnik olejku lipowego),retinol (diterpen, fundamentalny chromofor zaangażowanyw transdukcję światła w sygnały wizualne), likopen i karoteny(tetraterpeny) oraz naturalna guma, zaliczana do politerpenówzbudowanych z długich łańcuchów izoprenowych[3]. Terpeny z łatwością ulegają modyfikacjom chemicznym,a ich pochodne, najczęściej tlenowe, zwane są terpenoidami.Ogromna ilość struktur i funkcji terpenów oraz ich pochodnychod dawna wzbudza duże zainteresowanie wśródnaukowców. Niektóre z tych związków znalazły komercyjnezastosowanie w zapobieganiu oraz terapii wielu chorób,dzięki swoim właściwościom przeciwbakteryjnym, przeciwgrzybiczym,przeciwpasożytniczym, przeciwwirusowym,przeciwalergicznym, przeciwdrgawkowym, przeciwzapalnym,przeciwhiperglikemicznym oraz immunomodulacyjnym.Stosuje się je także jako naturalne substancje ochronnew przechowywaniu produktów rolniczych oraz jako naturalneśrodki owadobójcze [3]. Badania ostatnich lat wykazały,że niektóre terpeny mogą znaleźć zastosowanie w leczeniuosteoporozy, ponieważ wykazują aktywność anaboliczną33

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Ryc. 1. Struktura chemiczna szkieletu lupanowego, betuliny (1) i kwasu betulinowego (2).zwiększając masę kości i poprawiając ich architekturę. Naprzykład, kwas ursolowy nie tylko stymuluje różnicowanieosteoblastów i ich mineralizację in vitro, ale również indukujekościotworzenie in vivo [4].BetulinaBetulina (lup-20(29)-ene-3β,28-diol) jest jednym z najpowszechniejwystępujących w przyrodzie triterpenów. Znalezionoją w ponad dwustu gatunkach roślin, ale najlepszym źródłemtego terpenu jest zewnętrzna warstwa kory białych gatunkówbrzóz (Betula), np. B. verrucosa, B. pendula, B. pubescensi B. alba, gdzie występuje w ilości 20 -35%. To właśnie betulina,występująca w formie krystalicznych skupisk w dużych,cienkościennych, powstających na wiosnę komórkach, nadajebiałe zabarwienie korze tych drzew. Z kory brzozowej możnają wyizolować za pomocą sublimacji oraz na drodze ekstrakcjirozpuszczalnikami organicznymi (chloroformem, acetonem,etanolem). Zawartość betuliny w ekstraktach pochodzącychz kory różnych gatunków brzóz wynosi 70 – 80%, pozostałączęść stanowią inne terpeny: lupeol, kwas betulinowy (4– 12%), aldehyd betulinowy czy kwas oleanolowy [5]. Betulinępo raz pierwszy wyizolował z kory brzozy i opisał Lowitzw 1788 roku. Dopiero w roku 1952 ustalono dokładną (przypominającąsteroidy) strukturę betuliny [6, 7]. Związek ten,zaliczany do triterpenów pentacyklicznych typu lupanu, zbudowanyjest z trzydziestowęglowego szkieletu, który tworząułożone względem siebie w konfiguracji trans cztery pierścieniesześcioczłonowe i jeden pięcioczłonowy. Betulina jest węglowodoremaktywnym chemicznie dzięki ugrupowaniom hydroksylowymprzy węglu 3 i 28 oraz grupie izopentylowej przywęglu 19. Stanowi ona substrat do syntezy kwasu betulinowego,który różni się od betuliny obecnością grupy karboksylowejprzy węglu 17, w miejsce grupy hydroksymetylowej. Wzorystrukturalne betuliny, kwasu betulinowego oraz szkieletu lupanowegoprzedstawione są na Ryc. 1 [7].Terpeny typu lupanu stały się obiektem znacznego zainteresowaniaod momentu odkrycia, że kwas betulinowy jestczynnikiem indukującym proces apoptozy komórek czerniakaludzkiego. W kolejnych badaniach stwierdzono dużą aktywnośćbiologiczną betuliny oraz jej pochodnych. Jednymz mechanizmów działania tego związku jest hamowanie zależnejod c-AMP, katalitycznej podjednostki kinazy białkowejPKA – enzymu, który bierze udział w wielu szlakach sygnałowychoraz regulacyjnych. Właściwości farmakologicznebetuliny widoczne są już przy małych stężeniach. Ważną cechątej substancji jest brak toksyczności zarówno in vivo jak iin vitro, co umożliwia stosowanie jej jako leku. Stwierdzono,że u myszy betulina jest nietoksyczna w dawce 500 mg/kgwagi ciała [8]. Badania farmakokinetyczne wykazały dobrąbiodostępność betuliny podawanej dootrzewnowo gryzoniomoraz podskórnie psom. Po 28 dniach podawania tego związkuw dawce 300 mg/kg wagi ciała, stężenie betuliny w plazmiekrwi tych zwierząt wynosiło 0,33 μg/ml [8, 9].Właściwości hepatoochronneWłaściwości hepatoochronne naturalnych triterpenoidówzależą w dużej mierze od ich struktury chemicznej.Nawet subtelne różnice w budowie tych związków mogąznacząco wpływać na ich biologiczną aktywność. Betulinajuż w niskim stężeniu ma zdolność zmniejszania hepatotoksycznościchlorku kadmu (CdCl 2) w stosunku do linii ludzkichhepatocytów HepG2, natomiast jej utleniona pochodna– kwas betulinowy nie wykazuje już takich właściwości[10]. Działanie ochronne betuliny nie polega na wiązaniuprzez nią toksycznego związku, ponieważ najlepszy efekthepatoochronny uzyskano po zastosowaniu betuliny przedpodaniem CdCl 2. Przypuszcza się, że betulina indukujesyntezę białek działających ochronnie na komórki wątroby[10]. Chlorek kadmu indukuje też apoptozę hepatocytów,a betulina chroni komórki przed śmiercią, głównie na drodzehamowania apoptozy zależnej od reakcji Fas/FasL [11].Wykazano również, że betulina chroni hepatocyty przed innymitoksycznymi związkami, mianowicie przed alkoholemetylowym i paracetamolem. Terpen ten znacząco obniża,zależną od metabolizmu etanolu i paracetamolu, produkcjęreaktywnych form tlenu (ROS), które działają toksyczniena wątrobę [12]. W doświadczeniach z użyciem hodowlikomórek gwiaździstych wątroby, odpowiedzialnych za procesyjej włóknienia stwierdzono, że betulina hamuje procesaktywacji tych komórek, znacząco obniżając markeryaktywacji, czyli produkcję białka α-SMA i prokolagenu I,charakterystycznego dla aktywowanych komórek gwiaździstych.Oznacza to możliwość zastosowania betuliny jakoleku hamującego i prawdopodobnie odwracającego proceswłóknienia wątroby spowodowany nadużyciem alkoholulub hepatotoksycznych leków [dane nie opublikowane].Właściwości przeciwkamiczePodawanie betuliny zmniejsza ryzyko wystąpienia kamicynerkowej przy hiperoksalurii, czyli zaburzeniachmetabolicznych polegających na zwiększonym wydalaniu34

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073szczawianów z moczem. Betulina powoduje spadek wysyceniamoczu szczawianami poprzez zwiększenie objętościwydalanego moczu. Obserwuje się także zmniejszenie ilościwydalanych szczawianów. Prawdopodobnie przeciwkamiczedziałanie betuliny polega na hamowaniu enzymówbiorących udział w syntezie szczawianów z kwasu glikolowego.Betulina reguluje także stężenie magnezu oraz glikozaminoglikanów,które chronią przed wytrącaniem siękamieni [13].Właściwości immunomodulacyjneW doświadczeniach in vivo betulina wykazuje aktywnośćprzeciwzapalną hamując obrzęk łapy gryzoni indukowanykaraginianem [14]. Podawana w niskiej dawce (30-90mg/kg wagi ciała) betulina stymulowała w wątrobie gryzoniaktywność enzymów antyoksydacyjnych, w tym dysmutazyponadtlenkowej (SOD) i peroksydazy glutationowej (GPx)[15]. Betulina oraz kwas betulinowy są inhibitorami wieluenzymów, m.in. posiadają zdolność wiązania się do fosfolipazyA2. Enzym ten jest odpowiedzialny za uwalnianiez błon komórkowych kwasu arachidonowego, głównegosubstratu do syntezy prostaglandyn oraz leukotrienów,uczestniczących w powstawaniu procesu zapalnego [16].Wykazano również, że betulina może wzmagać produkcjęniektórych cytokin. Dodatek tego terpenu do hodowlileukocytów stymulowanych mitogenami, powodowałwzrost syntezy TNF-α, cytokiny o działaniu prozapalnymi przeciwnowotworowym, natomiast nie wpływał na produkcjęinnej prozapalnej cytokiny - IFN-γ oraz działającejprzeciwzapalnie IL-10. Fakt ten może oznaczać, że leukocyty,które produkują wymienione cytokiny wykazują odmiennąwrażliwość na betulinę. Betulina może pobudzać monocyty,będące źródłem TNF-α, ale nie wpływa na limfocytypomocnicze (Th) produkujące IFN-γ i IL-10. Terpen tenmoże działać także na szlak sygnałowy związany z czynnikiemNF-κB, który wpływa na ekspresję genów kodującychTNF-α, ale nie ma związku z syntezą IFN-γ i IL-10 [17].Betulina hamuje też wytwarzanie rodnika ponadtlenkowegoprzez neutrofile stymulowane N-formylometionyloleucylofenyloalaniną (fMLP) hamując nadmierną aktywację leukocytówi zapobiegając stresowi oksydacyjnemu [18].Właściwości przeciwdrgawkowe i analgestyczneW badaniach in vitro oraz in vivo na modelu mysim wykazano,że betulina może wiązać się z receptorami kwasuγ-aminomasłowego – GABA, który jest neuroprzekaźnikiemo działaniu hamującym w całym układzie nerwowym.Odpowiada on za zmniejszanie pobudliwości i rozluźnieniemięśni. Zablokowanie jego działania powoduje konwulsje,natomiast znaczne i długotrwałe braki tego neuroprzekaźnikaprowadzą do śmierci. Betulina wiążąc się z receptoramiGABA działa agonistycznie, czyli podobnie do tegoczynnika. Poprzez podanie betuliny można znieść działaniebikukuliny, związku będącego kompetycyjnym antagonistąGABA, wiążącym się do jego receptorów i wywołującymdrgawki. Betulina działa przeciwkonwulsyjnie blokując receptoryprzed aktywowaniem ich przez antagonistę GABA[19]. Ciekawy jest fakt, że podobny do betuliny kwas betulinowynie wykazuje takich właściwości. Na szczególnąuwagę zasługuje antynocyceptywne (analgestyczne) działaniebetuliny. W badaniach na gryzoniach jest ona bardziejaktywna niż aspiryna czy paracetamol [20].Właściwości przeciwwirusowePrzeprowadzone badania wykazały, że betulina działahamująco na wirus opryszczki pospolitej (Herpes simplexvirus) typu 1 (HSV-1) oraz typu 2 (HSV-2). Kuracja polegającana stosowaniu betuliny w połączeniu z acyklowirem- znanym środkiem przeciwwirusowym, wyraźnie wskazujena synergistyczne działanie tych substancji, ponieważ efektprzeciwwirusowy był znacznie silniejszy, niż podczas podaniatych leków oddzielnie. Oprócz tego betulina, kwas betulinowyoraz inne pochodne tego triterpenu wykazują działanieprzeciw wirusowi HIV. Aktywność ta związana jestz hamowaniem fuzji wirusa z komórką oraz zakłócaniemfunkcjonowania odwrotnej transkryptazy, co wywołuje upośledzeniedojrzewania cząstek wirusa oraz ich uwalnianiaz zakażonej komórki [21, 22, 23]. Betulina hamuje równieżreplikację wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy gębowejbydła (VSV) oraz wirusa zapalenia mózgu i mięśniasercowego (EMCV) [24].Przeciwnowotworowa aktywność betulinyBetulina posiada niższą aktywność przeciwnowotworowąniż kwas betulinowy [25]. Na przykład słabiej hamujeproliferację komórek czerniaka w porównaniu z pochodnymikwasu betulinowego [26]. Także linie komórek białaczkowych(HL60, U937, K562) i nerwiaka zarodkowego sąbardziej oporne na betulinę niż na inne badane triterpenytypu lupanu [27]. Jednakże ostatnio wykazano, że betulinaindukuje apoptozę komórek raka jelita grubego, raka piersioraz raka płuc [28, 29], głównie na drodze zwiększeniaprzepuszczalności błon mitochondrialnych. Obecność cholesterolusilnie zwiększa przeciwnowotworowe działaniebetuliny w stosunku do komórek białaczkowych (Jurkat),raka szyjki macicy (HeLa) oraz raka płuc (A549), co wskazujena jej wpływ na funkcję błon komórkowych [30]. Betulinaindukuje apoptozę komórek raka płuc A549 powodujączmiany w ekspresji wielu genów. Na szczególną uwagęzasługuje hamowanie przez betulinę ekspresji białka szokutermicznego Hsp90, odpowiedzialnego, między innymi zalekooporność wielu komórek nowotworowych [29].Inne biologiczne właściwości betulinyW doświadczeniach in vitro z użyciem komórek nabłonkowychdróg oddechowych stwierdzono, że betulinazwiększa wydzielanie śluzu, co sugeruje możliwość jej zastosowaniaw regulacji funkcji błon śluzowych w przewlekłychchorobach dróg oddechowych [31]. Betulina i kwasbetulinowy stymulują aktywność śródbłonkowej syntazytlenku azotu (eNOS) i wytwarzanie NO. Są też inhibitoramioksydazy NADPH, hamując w komórkach śródbłonkanaczyniowego stres oksydacyjny i poprawiając ich funkcje.Świadczy to o potencjalnej możliwości zastosowania tychterpenów w chorobach sercowo-naczyniowych [32]. Jedną35

Farm Przegl Nauk, 2010, 3z ostatnio odkrytych, najciekawszych właściwości betulinyjest jej zdolność wiązania się do receptorów melanokortynowych.Receptory te wiążąc melanokortyny odpowiadająza pigmentację skóry, natomiast wiążąc ACTH wpływają nawagę ciała. Betulina, z jej charakterystyczną strukturą możebyć prekursorem niskocząsteczkowych inhibitorów receptorówmelanokortynowych. Z drugiej strony aktywność ta sugerujekonieczność podjęcia badań nad wpływem betulinyna regulacje hormonalne w organizmie [33].Kwas betulinowyKwas betulinowy (BA), czyli kwas 3ß, hydroksyl-lup-20(29)-en-28-owy, podobnie jak betulina występuje w zewnętrznejkorze wielu gatunków drzew, np. w białej korzebrzozowatych, jednak jego zwartość w roślinach jest stosunkowoniewielka [34]. Wyjątek stanowi bagienna roślina - bobrektrójlistkowy (Menyanthes trifoliata), której podziemneczęści zawierają znaczne ilości wolnego BA oraz saponin,posiadających ten terpen w części aglikonowej. BA wykazujenajwiększą aktywność biologiczną spośród triterpenówpentacyklicznych i posiada wiele cennych z punktu widzeniamedycznego właściwości, np.: działa przeciwzapalnie,przeciwnowotworowo, przeciwmalarycznie, przeciwwirusowooraz hepatoochronnie [35].Właściwości przeciwnowotworowePrzeciwnowotworowa aktywność BA wynika z jegozdolności do hamowania angiogenezy w obrębie nowotworu,inhibicji eukariotycznej topoizomerazy I (działanie antyproliferacyjne)oraz pobudzania drogą wewnątrzpochodnąapoptozy w komórkach nowotworowych.Inhibicja angiogenezy następuje w wyniku hamowaniaaktywności kluczowego dla tego procesu enzymu - aminopeptydazyN, którego zwiększona ekspresja widoczna jest wniektórych typach nowotworów [34]. Innym mechanizmemprowadzącym do hamowania angiogenezy jest aktywacjaselektywnej, zależnej od proteasomu degradacji czynnikówtranskrypcyjnych: Sp1, Sp3 i Sp4, które regulują ekspresjęczynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) [36].BA jest też inhibitorem eukariotycznej topoizomerazy I,równie skutecznym jak powszechnie stosowany inhibitortego enzymu - CPT (camptothecin). Topoizomeraza I mazdolność hydrolizy pojedynczego wiązania fosfodwuestrowegow nici DNA, co prowadzi do rozplecenia podwójnejhelisy i umożliwia enzymom replikacyjnym dostęp domatrycy. Działanie kwasu betulinowego polega na bezpośredniejinterakcji z topoizomerazą I, co powoduje jej inaktywacjęi zapobiega tworzeniu kompleksu z nicią DNA.W konsekwencji BA uniemożliwia replikację i hamuje proliferacjękomórek nowotworowych [37]. Najważniejszymprzeciwnowotworowym mechanizmem działania BA jestjego zdolność do inicjowania mitochondrialnej (wewnątrzpochodnej)drogi apoptozy [38, 39, 40]. Zaprogramowanaśmierć komórek odgrywa decydującą rolę w utrzymywaniutkankowej homeostazy, a cechą charakterystyczną ludzkichnowotworów jest właśnie zdolność unikania apoptozy.Terapia przeciwnowotworowa opiera się głównie na indukowaniumitochondrialnej drogi apoptozy. Taką indukcjęwywołuje radioterapia oraz wiele chemioterapeutyków, cojest wynikiem stresu komórkowego bądź uszkodzenia DNA[41].BA indukuje powstawanie ROS w liniach nowotworowychróżnego pochodzenia, co wpływa na zwiększenieprzepuszczalności zewnętrznej błony mitochondrialnej.Inkubacja z antyoksydantami poprzedzająca podanie BA,ratuje komórki przed apoptotyczną śmiercią, co dowodzi,że indukcja ROS przez BA jest niezbędna do zainicjowaniaśmierci komórek w drodze wewnątrzpochodnej [40]. Białkanależące do rodziny Bcl-2, wśród których są zarównobiałka antyapoptotyczne, np.: Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, jak iproapoptotyczne, np.: Bax, Bak, Bad, mogą oddziaływać namitochondria regulując przepuszczalność ich błony. BA wykazujezdolność modulowania poziomu ekspresji tych białek,dzięki czemu może zwiększać stopień przepuszczalnościbłony mitochondrialnej i pobudzać apoptotyczną śmierćkomórek nowotworowych [42].W walce z nowotworami ogromne znaczenie może miećzdolność BA do indukcji apoptozy w sposób niezależnyod białka p53 – silnego supresora nowotworzenia. Jeżeliw czasie cyklu komórkowego dojdzie do bardzo dużegouszkodzenia DNA lub nieprawidłowego powielenia materiaługenetycznego, stojące na straży białko p53 aktywujetranskrypcję odpowiednich genów i kieruje komórkęw stronę apoptozy. Mutacja w genie dla białka p53 jest jednąz głównych przyczyn powstawania nowotworów, dlategogodny uwagi jest fakt, że BA w podobny sposób indukujeapoptozę w liniach komórkowych z prawidłową ekspresjąbiałka p53, jak i liniach komórkowych z mutacją genu dlatego białka [41].Kwas betulinowy, dzięki swojej zdolności współdziałaniaz różnymi cytotoksycznymi czynnikami, takimi jak:promieniowanie jonizujące, chemioterapeutyki czy TRAIL,może być stosowany w różnych kombinacjach terapeutycznych,jako środek wzmagający skuteczność terapii przeciwnowotworowej[38]. Interesujący jest fakt, że komórki nerwiakazarodkowego (neuroblastoma) oporne na działaniedoksorubicyny, są wrażliwe na działanie BA. Podobnie, BAjest cytotoksyczny w stosunku do komórek ostrej białaczkiwieku dziecięcego, które cechuje oporność na standardowechemioterapeutyki. Dzięki takim właściwościom, BA możebyć postrzegany jako potencjalny lek przezwyciężającypewne formy oporności na chemioterapeutyki stosowanew terapii przeciwnowotworowej. Dotychczas wykazanoprzeciwnowotworowe działanie BA w stosunku do następującychludzkich nowotworów: czerniaka (melanoma),nerwiaka zarodkowego (neuroblastoma), glejaka wielopostaciowego(glioblastoma), rdzeniaka (medulloblastoma),mięsaka Ewinga, białaczki (leukemia) oraz kilku typówraka (carcinoma), np.: raka głowy i szyi, okrężnicy, płuc,nerkowokomórkowego, wątrobowokomórkowego, prostaty,piersi, jajnika i szyjki macicy [42]. Z medycznego punktuwidzenia, ogromne znaczenie ma selektywna cytotoksycznośćniskich stężeń BA w stosunku do komórek nowotworowych,przy braku toksyczności tych samych dawek w stosunkudo komórek prawidłowych. Obecnie BA znajduje sięw I/II fazie badań klinicznych i jest stosowany powierzchniowona dysplastyczne znamiona, które potencjalnie mogąprzeobrazić się w czerniaka [34].36

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Właściwości przeciwwirusoweW toku poszukiwań środków leczniczych pochodzenianaturalnego, zdolnych do zwalczania infekcji spowodowanejwirusem HIV wykazano, że takie właściwości posiadaekstrakt z liści rośliny znanej z łacińskiej nazwy - Syzigiumclaviflorum, którego głównymi, aktywnymi składnikamisą: kwas betulinowy i jego pochodna - kwas platanowy.Efektem poszukiwań bardziej aktywnych biologicznie,półsyntetycznych pochodnych BA, było odkrycie kwasudihydrobetulinowego, który wykazuje silniejsze właściwościprzeciwwirusowe niż BA oraz kwasu 3-O-(3’,3’-dimetylobursztynylo)-betulinowego, znanego również jakoDSB lub Bevirimat, wykazującego bardzo silne właściwościhamowania replikacji wirusa HIV typu 1 w zainfekowanychlimfocytach H9 [43, 44, 45]. Mechanizm przeciwwirusowegodziałania pochodnych BA zależy od lokalizacji dołączonychłańcuchów bocznych. Obecność łańcucha bocznegow pozycji C3 w cząsteczce BA hamuje etap dojrzewaniawirusa HIV-1, natomiast występowanie łańcucha bocznegow pozycji C28, powstrzymuje wnikanie wirusa HIV-1 dokomórki. DSB jest bardzo obiecującym inhibitorem etapudojrzewania, natomiast nie hamuje wnikania wirusa HIV-1do komórki. Inne pochodne BA, związki znane jako: IC9564i A43-D posiadają łańcuch boczny podstawiony w pozycjiC28 i są inhibitorami wnikania wirusa HIV-1 do komórki.Godny uwagi jest fakt, że wirusy należące do podtypu C,które stanowią w przybliżeniu 50% wszystkich wyizolowanychna całym świecie wirusów HIV typu 1, są stosunkowobardziej wrażliwe na pochodne BA będące inhibitorami wnikanianiż podtypy A i B. W II fazie badań klinicznych jestobecnie Bevirimat, stosowany jako doustny lek u pacjentówzakażonych wirusem HIV. Wstępne badania wykazały, żepojedyncze, doustne dawki tego kwasu są dobrze tolerowaneprzez pacjentów, a jego koncentracja w cytoplazmie wynosiłaod 8 do 58 µg/ml [43].Właściwości przeciwzapalne i przeciwalergiczneKwas betulinowy jest czynnym związkiem wielu roślinwykazujących aktywność przeciwzapalną. Ekstrakt z kłączywodnej rośliny - lotosu orzechodajnego (Nelumbo nucifera),zawierający m.in. BA, wykazuje dużą aktywność przeciwzapalnąw obrzęku indukowanym serotoniną i karaginianem.Z kolei wyciąg z głowienki pospolitej (Prunella vulgaris),zawierający BA oraz kwas ursolowy i jego pochodne, posiadawłaściwości przeciwalergiczne. Frakcja triterpenowatego ekstraktu hamuje degranulację mastocytów oraz uwalnianieß-heksozaminidazy i histaminy. Kluczową rolę wmodulowaniu odpowiedzi czynnej na stan zapalny odgrywazwiększona produkcja tlenku azotu. Zaobserwowano, że BAma zdolność hamowania syntezy NO w pobudzanych przyużyciu LPS mysich makrofagach [7]. Kwas betulinowy jestrównież modulatorem produkcji cytokin przez subpopulacjelimfocytów pomocniczych Th1 i Th2. Subpopulacja limfocytówTh1 odpowiedzialna jest za produkcję cytokin prozapalnych:IL-2 i IFN-γ, natomiast subpopulacja Th2 wytwarzaIL-4 oraz IL-10 o właściwościach przeciwzapalnych,która prawdopodobnie hamuje produkcję prozapalnych cytokinprzez subpopulację limfocytów Th1. BA zwiększa nieznacznieprodukcję IL-10 i jednocześnie hamuje produkcjęIFN-γ, przez co wywiera efekt przeciwzapalny [17].Właściwości hepatoochronneDziałanie hepatoochronne BA polega prawdopodobniena hamowaniu powstawania anionorodników ponadtlenkowychw komórkach HepG2 poddanych działaniu etanolujako hepatotoksyny. Najlepszy efekt hepatoochronny uzyskujesię podając BA na 24 h przed intoksykacją etanolem,co powoduje znaczne zmniejszenie powstawania anionorodnikówponadtlenkowych w komórkach HepG2. Hepatoochronnyefekt naturalnych triterpenów zależy równieżod rodzaju hepatotoksyny indukującej produkcję ROS. BAnie wykazuje właściwości hepatoochronnych w przypadkuzastosowania estru forbolu (PMA) jako induktora ROS,natomiast inny naturalny triterpen - kwas oleanowy, w tychsamych warunkach znacznie obniża produkcję zarówno anionorodnikówponadtlenkowych, jak i nadtlenku wodoru [12].Właściwości przeciwbakteryjneGruźlica, wywoływana przez bakterie Mycobacteriumtuberculosis, jest jedną z najcięższych chorób zakaźnych, powszechniewystępującą na całym świecie. Wielolekowa oporność,coraz częściej spotykana wśród klinicznych izolatów mykobakteryjnych,skłania naukowców do poszukiwania nowychleków, skutecznych w jej zwalczaniu. Najbardziej obiecującesą nowe leki, o strukturze chemicznej odmiennej od tych stosowanychdotychczas. Duże nadzieje wiąże się z naturalniewystępującymi triterpenami i ich pochodnymi. BA wykazujewprawdzie stosunkowo niewielkie właściwości przeciwmykobakteryjne,z MIC (minimalnym stężeniem hamującym wzrostdrobnoustrojów) równym 50 µg/ml, ale jego pochodna - esterp-kumarowy BA, wykazuje dużo większą aktywność (MIC =6,25 µg/ml) [46]. Godny uwagi jest fakt, że ta pochodna BAwykazuje również silne działanie przeciwmalaryczne w stosunkudo Plasmodium falciparum, podczas gdy sam BA wykazujeniewielką aktywność przeciwzarodźcową [47].Piśmiennictwo1. Theis N, Lerdau M. The evolution of function inplant secondary metabolites. Int J Plant Sci 2003;164: 93-102.2. Cornwell PL. Monoterpenes in brest cancer chemoprevention.Breast Canc Res Treat 1997; 46: 191-197.3. Paduch R i wsp. Terpenes: substances useful in humanhealthcare. Arch Immunol Ther Exp 2007; 55:325-327.4. Lee SU i wsp. Anabolic activity of ursolic acid in bone:stimulating osteoblast differentiation in vitro and inducingnew bone formation in vivo. Pharmacol Res 2008;58: 290-296.5. Krasutsky PA. Birch bark research and development.Nat Prod Rep 2006; 23: 919-942.6. Eckerman C, Ekman R. Comparison of solvents forextraction and crystallization of betulinol from birchbark waste. Paperi ja Puu - Papper och Trä 1985; 67:100–106.37

Farm Przegl Nauk, 2010, 37. Achrem-Achremowicz J, Janeczko Z. Betulina - prekursornowych środków leczniczych. Farmacja Polska2002; 58: 799-804.8. Alakurtti S, Mäkelä T, Koskimies S, Yli-KauhaluomaJ. Pharmacological properties of the ubiquitous naturalproduct betulin. Eur J Pharm Sci 2006; 29: 1-13.9. Jäger S, Laszczyk MN, Scheffler A. A preliminary pharmacokineticstudy of betulin, the main pentacyclic triterpenefrom extract of outer bark of birch (Betulae albacortex). Molecules 2008; 13: 3224-3235.10. Miura N i wsp. Protective effects of triterpene compoundsagainst the cytotoxicity of cadmium in HepG2cells. Mol Pharmacol 1999; 56: 1324-1328.11. Oh SH, Choi JE, Lim SC. Protection of betulin againstcadmium-induced apoptosis in hepatoma cells. Toxicology2006; 220: 1-12.12. Szuster-Ciesielska A, Kandefer-Szerszeń M. Protectiveeffects of betulin and betulinic acid against ethanol-inducedcytotoxicity in HepG2 cells. Pharmacol Rep2005; 57: 588-595.13. Bochniewska V i wsp. Kamica układu moczowego udzieci – inhibitory i promotory krystalizacji. PediatrMed Rodz 2006; 2: 91-99.14. Lin LW i wsp. Comparison with various parts of Broussonetiapapyrifera as to the antinociceptive and antiinflammatoryactivities in rodents. Biosci BiotechnolBiochem 2008; 72: 2377-2384.15. Lin YC i wsp. Analgesic and anti-inflammatory activitiesof Torenia concolor Lindley Var. formosana Yamazakiand betulin in mice. Am J Chin Med 2009; 37: 97-111.16. Bernard P i wsp. Ethnopharmacology and bioinformaticcombination for leads discovery: application to phospholipaseA2 inhibitors. Phytochemistry 2001; 58: 865-874.17. Zdzisińska B i wsp. Differential effect of betulin andbetulinic acid on cytokine production in human wholeblood cell cultures. Pol J Pharmacol 2003; 55: 235-238.18. Yamashita K i wsp. Effect of three triterpenoids, lupeol,betulin, and betulinic acid on the stimulus-induced superoxidegeneration and tyrosyl phosphorylation of proteinsin human neutrophils. Clin Chim Acta 2002; 25:91-96.19. Muceniece R i wsp. Betulin binds to γ-aminobutyric acidreceptors and exerts anticonvulsant action in mice. PharmacolBiochem Behav 2008; 90: 712–716.20. De Souza MT i wsp. Phytochemical and antinociceptiveproperties of Matayba elaeagnoides Radlk. barks. Z Naturforsch.C 2007; 62: 550-554.21. Pavlova NI i wsp. Antiviral activity of betulin, betulinicand betulonic acids against some enveloped and non-envelopedviruses. Fititerapia 2003; 74: 489-492.22. Gong Y i wsp. The synergistic effects of betulin withacyclovir against herpes simplex viruses. Antiviral Res2004; 64: 127–130.23. Tolstikova TG wsp. Biological activity and pharmacologicalprospects of lupane terpenoids: II. semisyntheticlupane derivatives. Bioorg Khim 2006; 3: 261–276.24. Kamińska T i wsp. A comparision of the antiviral activityof three triterpenoids isolated from Betula alba bark.Ann Univ Mariae Curie-Skłodowska, Sectio C 2004; 59:7-13.25. Kvasnica M i wsp. Synthesis of phathalates of betulinicacid and betulin with cytotoxic activity. Bioorg MedChem 2005; 13: 3447-3454.26. Kim DSH, Pezzuto JM, Pisha E. (1998): Synthesis ofbetulinic acid derivatives with activity against humanmelanoma. Bioorg Med Chem Lett 1998; 8: 1707-1712.27. Hata K, Hori K, Ogasawara H, Takahashi S. Anti-leukemiaactivities of lup-28-al-20(29)-en-3-one, a lupanetriterpene. Toxicol Lett 2003; 143: 1-7.28. Gauthier C i wsp. Synthesis and cytotoxicity of bidesmosidicbetulin and betulinic acid saponins. J Nat Prod2009; 72: 72-81.29. Pyo JS i wsp. Anti-cancer effect of betulin on a humanlung cancer cell line: a pharmacoproteomic approachusing 2 D SDS PAGE coupled with nano-HPLC tandemMass Spectrometry. Planta Med 2009; 75: 127-31.30. Mullauer FB, Kessler JH, Medema JP. Betulin is a potentanti-tumor agent that is enhanced by cholesterol. PLoSOne 2009; 4: 1-8.31. Lee CJ, Seok JH, Hur GM, Lee JH, Park JS, Seol IC,Kim YH. Effects of ursolic acid, betulin and sulfur containingcompounds on mucin release from airway gobletcells. Planta Med 2004; 70: 1119-1122.32. Steinkamp-Fenske K i wsp. Reciprocal regulation of endothelialnitric-oxide synthase and NADPH oxidase bybetulinic acid in human endothelial cells. J PharmacolExp Ther 2007; 322: 836-842.33. Muceniece R i wsp. Betulin binds to melanocortin receptorsand antagonizes alpha-melanocyte stimulatinghormone induced cAMP generation in mouse melanomacells. Cell Biochem. Funct 2007; 25: 591-596.34. Fulda S. Betulinic acid for cancer treatment and prevention.Int J Mol Sci 2008; 9: 1096-1107.35. Patocka J. Biologically active pentacyclic triterpenesand their current medicine signification. J Appl Biomed2003; 1: 7-12.36. Chintharlapalli S, Papineni S, Ramaiah SK, Safe S. Betulinicacid inhibits prostate cancer growth through inhibitionof specificity protein transcription factors. CancerRes 2007; 67: 2816-2823.37. Chowdhury A i wsp. Betulinic acid, a potent inhibitorof eukaryotic topoisomerase I: identification of the inhibitorystep, the major functional group responsible anddevelopment of more potent derivatives. Med Sci Monit2002; 8: 254-260.38. Fulda S, Debatin KM. Sensitization for anticancer druginducedapoptosis by betulinic acid. Neoplasia 2005; 7:162-170.39. Liby K i wsp. Novel semisynthetic analogues of betulinicacid with diverse cytoprotective, antiproliferativeand proapoptotic activities. Mol Cancer Ther 2007; 6:2113-2119.40. Tan Y, Yu R, Pezzuto JM. Betulinic acid-induced programmedcell death in human melanoma cells involvesmitogen-activated protein kinase activation. Clin CancerRes 2003; 9: 2866-2875.41. Selzer E i wsp. Effects of betulinic acid alone and incombination with irradiation in human melanoma cells.J Invest Dermatol 2000; 114: 935-940.38

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507342. Rzeski W i wsp. Betulinic acid decreases expression ofbcl-2 and cyklin D1, inhibits proliferation, migration andinduces apoptosis in cancer cells. Naunyn-Schmiedeberg’sArch Pharmacol 2006; 374: 11-20.43. Huang L, Ho P, Chen CH. Activation and inhibition ofproteasome by betulinic acid and its derivatives. FEBSLett 2007; 581: 4955-4959.44. Lai W i wsp. Betulinic acid derivatives that target gp120and inhibit multiple genetic subtypes of human immunodeficiencyvirus type 1. Antimicrob Agents Chemother2008; 52: 128-136.45. Sakalian M i wsp. 3-O-(3’,3’-dimethysuccinyl) betulinicacid inhibits maturation of the human immunodeficiencyvirus type 1 Gag precursor assembled in vitro. J Virol2006; 80: 5716-5722.46. Tanachatchairatana T, Bremner JB, Chokchaisiri R, SuksamrarnA. Antimycobacterial activity of cinnamate-basedesters of the triterpens betulinic, oleanolic and ursolicacids. Chem Pharm Bull 2008; 56: 194-198.47. Suksamrarn A, Tanachatchairatana T, KanokmedhakulS. Antiplasmodial triterpenes from twigs of Gardenia saxatilis.J Ethnopharmacol 2003; 88: 275-277.data otrzymania pracy: 25.02.2010 r.data akceptacji do druku: 05.03.2010 r.Adres do korespondencji:Barbara ZdzisińskaZakład Wirusologii i ImmunologiiInstytut Mikrobiologii i Biotechnologii UMCSul. Akademicka 19, 20-033 Lublintel: +48 81 537 59 42, fax: 81 537 59 40e-mail: basiaz@poczta.umcs.lublin.pl39

Farm Przegl Nauk, 2010,3, 40-45Wpływ inhibitorów pompy protonowej (H + /K + -ATPazy)na układ kostny szczurówEffect of proton pump (H + /K + -ATPase) inhibitorson skeletal system in ratsMaria Pytlik, Urszula Cegieła, Barbara Nowińska, Urszula Klementys,Aleksandra Budny, Beata Soja, Arnold PłaczekKatedra i Zakład Farmakologii,Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląskiego Uniwersytetu Medycznego w KatowicachStreszczenieOmeprazol oraz pantoprazol są najczęściej stosowanymiinhibitorami pompy protonowej (H+/K+-ATPazy) odpowiedzialnejza końcową fazę wytwarzania kwasu solnegoprzez komórki okładzinowej żołądka. Ich wpływ na V-ATPazę obecną w osteoklastach nie jest poznany. Celempracy było zbadanie wpływu inhibitorów pompy protonowej(H + /K + -ATPazy) – omeprazolu i pantoprazolu naukład kostny szczurów. Badania wykonano na szczurach,szczepu Wistar, samicach o wyjściowej masie ciała 210–240 g, które podzielono na grupy (n = 8–10): I - szczurykontrolne; II - szczury otrzymujące omeprazol (3 mg/kgip); III - szczury otrzymujące pantoprazol (3 mg/kg ip).Leki podawano przez 28 dni. Wpływ inhibitorów pompyprotonowej (H + /K + -ATPazy) na układ kostny oceniano woparciu o badania makrometryczne, histomorfometryczneoraz własności mechaniczne. Badania makrometryczneobejmowały pomiar długości oraz średnicy kości piszczeloweji udowej a także ich masy i masy substancji mineralnych.Badania histomorfometryczne wykonano w kościpiszczelowej (przyrost kości na grubość oraz szerokośćosteoidu od strony okostnej i śródkostnej, powierzchnięprzekroju porzecznego trzonu i jamy szpikowej) orazw kości udowej (szerokość beleczek w nasadzie i przynasadziedalszej). Własności mechaniczne przynasadykości piszczelowej i trzonu kości udowej przeprowadzonoz zastosowaniem testu zginania przy trzypunktowymnacisku, natomiast szyjki kości udowej z zastosowaniemtestu kompresyjnego, przy użyciu aparatu Instron 3342.Pantoprazol silniej niż omeprazol zaburzał przebudowętkanki kostnej szczurów w wyniku nasilenia resorpcjiz jednoczesnym zahamowaniem procesów kościotworzeniai mineralizacji. Pantoprazol również silniej niż omeprazolosłabiał własności mechaniczne kości szczurów,a zwłaszcza przynasady kości piszczelowej o strukturzebeleczkowej.AbstractOmeprazole and pantoprazole are inhibitors of protonpump (H + /K + -ATPase) responsible for the last phase ofHCl production by parietal cells in the stomach. Their effecton V-ATPase in osteoclasts is not well recognized. Theaim of the present study was to investigate the effect ofproton pump (H + /K + ATP-ase) inhibitors – omeprazole andpantoprazole on skeletal system in rats. The experimentswere carried out on female Wistar rats (initial body mass:210–240 g) divided into following groups (n = 8–10): Icontrol rats; II rats receiving omeprazole (3 mg/kg ip); IIIrats receiving pantoprazole (3 mg/kg ip). The drugs wereadministered for 28 days. The effect of the proton pumpinhibitors on the skeletal system was estimated based onevaluation of bone macrometric and histomorphometricparameters, and mechanical properties. Tibial and femoralmass and mass of the bone mineral, length and diameter(macrometric parameters) were measured. The histomorphometricmeasurements were performed in the tibia (endostealand periosteal transverse growth and width of osteoid,transverse cross-section area of the diaphysis and ofthe marrow cavity) and the femur (width of trabeculae inthe distal epiphysis and metaphysis). Mechanical propertiesof the tibial metaphysis and femoral diaphysis wereassessed in the three-point bending tests, and those of thefemoral neck – in the compression test. Pantoprazole, inthe stronger way than omeprazole, disturbed bone remodelingin rats. Bone remodeling disorders were the result ofintensification of bone resorption with concurrent inhibitionof bone formation and mineralization. Pantoprazoleweakened bone mechanical properties, especially thoseof the tibial metaphysis (trabecular bone). This effect wasstronger than that of omeprazole.Key words: omeprazole, pantoprazole, risk of osteoporosisSłowa kluczowe: omeprazol, pantoprazol, ryzyko osteoporozy40

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073WstępInhibitory pompy protonowej (H + /K + -ATPazy) silniei długotrwale hamują wytwarzanie kwasu solnegoprzez komórki okładzinowe żołądka [1]. Spośród inhibitorówH + /K + -ATPazy najczęściej stosowany jest omeprazoli pantoprazol. Są to proleki ulegające aktywacjiw kwaśnym środowisku (pH ok. 1,0) kanalików wyprowadzającychkwas solny z komórki okładzinowej. Nieaktywneproleki pod wpływem jonów wodorowych ulegają protonowaniudo aktywnego cyklicznego sulfenamidu. Aktywnymetabolit posiada zdolność tworzenia wiązania kowalencyjnegoz wolnymi grupami sulfhydrylowymi cysteinyH + /K + -ATPazy, powodując zahamowanie przyłączenia ATPdo enzymu i jego unieczynnienie [2-5]. Wiązanie aktywnegometabolitu z enzymem jest nieodwracalne, a zahamowaniewydzielania kwasu solnego w żołądku utrzymuje siędo momentu zsyntetyzowania nowych cząsteczek H + /K + --ATPazy i wbudowania jej w błonę komórkową kanalikówwydzielniczych komórki okładzinowej. Skutkiem takiegodziałania jest zahamowanie wydzielania kwasu solnegotrwające 24–48 godzin, które jest wyraźnie dłuższe od czasupółtrwania proleku w osoczu (ok. 1,5–2 h) [2].W rąbku szczoteczkowym osteoklastów występujewodniczkowa pompa protonowa H + -ATPaza (V-ATPaza)kontrolująca niezwykle istotne dla procesów resorpcji wewnątrzkomórkowei zewnątrzkomórkowe pH osteoklastów[6]. V-ATPaza zbudowana jest z domeny transbłonowej Votworzącej kanał jonowy oraz z cytoplazmatycznej domenykatalitycznej V 1, złożonej z 8 podjednostek (A-H). Ze względuna występowanie różnych izoform podjednostek A i Bw domenie katalitycznej, V-ATPaza może być wrażliwa nietylko na działanie specyficznych inhibitorów dla tej pompy,ale także dla inhibitorów H + /K + -ATPazy występującejw komórkach okładzinowych żołądka [7, 8]. Dotychczaswpływ inhibitorów pompy protonowej (H + /K + -ATPazy)na układ kostny ogranicza się do sprzecznych doniesień[9-12].Celem pracy było zbadanie wpływu inhibitorów pompyprotonowej (H + /K + -ATPazy) – omeprazolu i pantoprazoluna układ kostny szczurów.Materiał i metodyBadania wykonano, za zgodą Lokalnej Komisji Etycznejw Katowicach (nr 16/2009), na 26 szczurach szczepu Wistar,samicach o wyjściowej masie ciała 210–240 g, które podzielonona trzy grupy. Szczury kontrolne grupy I otrzymywałydootrzewnowo (ip) 0,9% roztwór NaCl (1 ml/kg), szczurygrupy II otrzymywały omeprazol (3 mg/kg ip), natomiastszczury grupy III otrzymywały pantoprazol (3 mg/kg ip). Wbadaniach stosowano omeprazol – Helicid 40, fiolki (Zentiva)i pantoprazol – Controloc, fiolki (Altana Pharma AG).Leki podawano jeden raz dziennie. Po zakończeniu podawanialeków zwierzęta uśpiono przez podanie ketaminy (Bioketan)87,5 mg/kg ip i ksylazyny (Rometar) 12,5 mg/kg ip.W pełnym znieczuleniu ogólnym zwierzęta zostały uśmiercone,po czym izolowano kości: piszczelowe (lewą i prawą)i udowe (lewą i prawą). Bezpośrednio po wyizolowaniui oczyszczeniu z tkanki mięśniowej lewe kości piszczelowei udowe ważono z dokładnością do 0,1 mg, a następnie przyużyciu suwmiarki dokonano pomiaru długości oraz średnicymierzonej w połowie długości z dokładnością do 0,1 mm.Procesy przebudowy tkanki kostnej zostały określonepoprzez ocenę parametrów ilościowych (masa kości i masasubstancji mineralnych) oraz histomorfometrycznych w kościo strukturze beleczkowej i zbitej. Wpływ badanych lekówna tkankę kostną o strukturze beleczkowej oceniono napodstawie parametrów opisujących kościotworzenie i/lubresorpcję oraz mikroarchitekturę kości (szerokość beleczekkostnych w nasadzie i w przynasadzie kości udowej), natomiastna tkankę kostną o strukturze zbitej na podstawie parametrówopisujących kościotworzenie (przyrost trzonu kościpiszczelowej, a także szerokość osteoidu od strony okostneji śródkostnej) oraz resorpcję (powierzchnia jamy szpikoweji stosunek powierzchni jamy szpikowej do powierzchni całegotrzonu kości piszczelowej). Dodatkowo wpływ lekówna tkankę kostną oceniano w oparciu o badania powierzchnikości korowej i całego trzonu kości piszczelowej.Badania parametrów histomorfometrycznych wykonanona preparatach histologicznych sporządzonych ze skrawkównieodwapnionych kości uzyskanych w wyniku cięciatrzonu prawej kości piszczelowej oraz nasady dalszej prawejkości udowej. Z trzonu kości piszczelowej skrawki ciętoprostopadle do osi długiej kości, rozpoczynając od miejscaprzyrośnięcia kości strzałkowej, w kierunku nasady bliższej.Z nasady dalszej prawej kości udowej cięto skrawki przekrojupodłużnego ze środkowej części kłykcia przyśrodkowegow płaszczyźnie strzałkowej. Uzyskane skrawki barwiono,za wyjątkiem pierwszego skrawka przekroju poprzecznegotrzonu kości piszczelowej, który został wykorzystany dooznaczeń przyrostu trzonu kości na grubość. W celu wykonaniaoznaczenia przyrostu trzonu kości piszczelowejna grubość wszystkim szczurom dwukrotnie (24 godzinyprzed rozpoczęciem podawania leków i 24 godziny przeduśmierceniem zwierząt) podano chlorowodorek tetracyklinyw dawce 20 mg/kg ip, substancja (Sigma). Ocena histomorfometrycznapreparatów histologicznych została przeprowadzonaz wykorzystaniem zestawu obejmującego mikroskopNikon typu Optiphot-2 o zakresie światła widzialnegoi ultrafioletowego, kamerę typu RGB (Cohu) i komputerz kartą akwizycji obrazu (Nikon) oraz oprogramowanie LuciaG 4.51, służące do cyfrowych pomiarów histologicznych[13].Badania własności mechanicznych kości o zróżnicowanejbudowie: trzonu lewej kości udowej i szyjki prawejkości udowej o strukturze zbitej oraz przynasady lewej kościpiszczelowej o strukturze beleczkowej wykonano przyużyciu zestawu obejmującego aparat firmy Instron 3342oraz komputer z oprogramowaniem Bluehill file 2.13.Własności mechaniczne trzonu lewej kości udowej i przynasadylewej kości piszczelowej badano z zastosowaniemtestu zginania przy trzypunktowym nacisku. W tym celutrzony lewych kości udowych i przynasady lewych kościpiszczelowych poddawano działaniu liniowo wzrastającejsiły nacisku skierowanej prostopadle do osi długiej kościprzyłożonej w połowie długości trzonu kości udowej lubw obrębie przynasady kości piszczelowej. Szybkość narastaniasiły nacisku wynosiła 100 N/min. Na podstawie analizyuzyskanych wykresów funkcji nacisk-ugięcie w zakresie41

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Tab. I. Przyrost masy ciała szczurów oraz masa kości i masa substancji mineralnych po stosowaniu omeprazolui pantoprazoluParametryKontrolaOmeprazol(3 mg/kg ip)Pantoprazol(3 mg/kg ip)Przyrost masy ciała [g] 14,10 ± 1,35 20,88 ± 1,68 ** 22,00 ± 3,46 *Masa kości[mg]Masa kości[mg/100 gmasy ciała]Masasubstancji mineralnych[mg]Masasubstancji mineralnych[mg/100 mg masy kości]Nasadakości piszczelowej88.92 ± 6,46 88.27 ± 3,44 86.55 ± 1,60Trzon z przynasadamikości piszczelowej431,70 ± 12,38 405,18 ± 10,92 410,81 ± 10,26Kość udowa 763,55 ± 15,67 710,88 ± 13,67 ** 711,98 ± 14,90 **Nasadakości piszczelowej34,80 ± 2,49 35,92 ± 1,51 34,86 ± 0,90Trzon z przynasadamikości piszczelowej168,87 ± 4,61 164,75 ± 4,34 165,13 ± 3,05Kość udowa 298,63 ± 5,27 288,93 ± 4,32 286,35 ± 5,16Nasadakości piszczelowej32,81 ± 0,70 29,11 ± 0,67 *** 29,46 ± 0,65 **Trzon z przynasadamikości piszczelowej214,09 ± 4,12 194,68 ± 3,46 ** 191,51 ± 5,97 *Kość udowa 342,14 ± 8,59 311,70 ± 6,50 *** 315,36 ± 6,82 **Nasadakości piszczelowej39,07 ± 4,02 33,23 ± 0,83 34,05 ± 0,46Trzon z przynasadamikości piszczelowej49,41 ± 1,16 47,11 ± 0,25 46,58 ± 0,62Kość udowa 44,78 ± 0,37 43,84 ± 0,27 43,86 ± 0,31Wyniki przedstawiono w postaci średniej arytmetycznej ± SEM (n = 8–10). * – Statystycznie istotne różnice w odniesieniudo wyników uzyskanych u szczurów grupy kontrolnej: * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001.odkształcenia plastycznego w trzonie lewej kości udoweji w przynasadzie lewej kości piszczelowej oznaczano: maksymalnąsiłę nacisku wytrzymywaną przez kość, ugięcieprzy maksymalnej sile nacisku, siłę powodującą złamaniekości, ugięcie przy sile łamiącej, natomiast w zakresie odkształceniaelastycznego moduł Younga [14-15]. Wytrzymałośćmechaniczną szyjki prawej kości udowej badano przyużyciu testu kompresyjnego z wyznaczeniem siły potrzebnejdo jej złamania. W tym celu badane szyjki poddawanodziałaniu liniowo wzrastającego nacisku (100 N/min) skierowanegorównolegle do osi długiej kości przyłożonego dogłowy kości udowej.W kościach udowych i piszczelowych metodą mineralizacji[16] oceniano również masę substancji mineralnych(popiołu) oraz wyliczano masę substancji mineralnych/100mg masy kości.Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnie arytmetyczne± SEM. Statystycznej oceny wyników badań, w którychporównywano działanie leków z grupą kontrolną, dokonanoużywając testu t-Studenta dla danych niezależnych.Różnice uznano za istotne statystycznie przy p ≤ 0,05. Obliczeniastatystyczne przeprowadzono przy użyciu programukomputerowego Excel 2003, Microsoft.WynikiPrzyrost masy ciała szczurów oraz parametry ilościowe kościdługich po stosowaniu omeprazolu lub pantoprazoluW porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie szczurówkontrolnych, omeprazol i pantoprazol statystycznie istotniezwiększały przyrost masy ciała, odpowiednio o 48,1%i 56,0% (tabela I). Omeprazol i pantoprazol statystycznieistotnie zmniejszały masę kości udowej, odpowiednio o 6,9%i 6,75%, a także masę substancji mineralnych w kości udowej(o 8,9% i 7,83%). Masa substancji mineralnych uległa równieżstatystycznie znaczącemu zmniejszeniu w nasadziei w trzonie z przynasadami (bliższą i dalszą) kości piszczelowejodpowiednio o 11,3% i 9,1% po stosowaniu omeprazoluoraz o 10,2% i 10,6% po stosowaniu pantoprazolu (tabela I).Parametry makrometryczne i histomorfometryczne w kościpiszczelowej i udowej po stosowaniu omeprazolu lub pantoprazoluW porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie szczurówkontrolnych, omeprazol i pantoprazol nie zmieniały statystycznieznacząco długości i średnicy kości piszczelowej oraz udowej(tabela II). Omeprazol nie powodował istotnych zmian powierzchnijamy szpikowej, kości korowej i całego trzonu kościoraz powierzchni jamy szpikowej do trzonu kości piszczelowej.W odniesieniu do grupy kontrolnej, pantoprazol w odróżnieniuod omeprazolu, statystycznie znacząco zmniejszał powierzchniękości korowej (o 7,5%) oraz powierzchnię jamy szpikowej do całegotrzonu kości (o 11,6%) i nieznacząco statystycznie zwiększał(o 6,5%) powierzchnię jamy szpikowej kości piszczelowej (tabelaII).Zarówno omeprazol jak i pantoprazol zmniejszały statystycznieistotnie w odniesieniu do grupy kontrolnej szerokośćosteoidu od strony okostnej i od strony jamy szpikowejw kości piszczelowej. Omeprazol spowodował zmniejszenieszerokości osteoidu od strony okostnej o 36,4% i od stronyjamy szpikowej o 18,3%, natomiast pantoprazol odpowiednioo 33,2% i 32,9%. Jednocześnie pantoprazol zmniejszał statystycznieistotnie o 23,4% przyrost trzonu kości piszczelowejna grubość od strony okostnej (tabela II).Omeprazol i pantoprazol spowodowały statystycznieistotne w odniesieniu do grupy kontrolnej zmniejszenie sze-42

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tab. II. Parametry makrometryczne i histomorfometryczne kości piszczelowej i kości udowej po stosowaniu omeprazolui pantoprazoluParametryDługość kości [mm]Średnica kości[mm]Powierzchnia przekrojupoprzecznego kościpiszczelowej [mm 2 ]KontrolaOmeprazol(3 mg/kg ip)Pantoprazol(3 mg/kg ip)Kość piszczelowa 38,73 ± 0,22 38,12 ± 0,17 38,25 ± 0,29Kość udowa 34,78 ± 0,21 34,06 ± 0,19 34,22 ± 0,25Kość piszczelowa 2,62 ± 0,03 2,54 ± 0,02 2,56 ± 0,04Kość udowa 3,28 ± 0,04 3,23 ± 0,03 3,24 ± 0,04Jamy szpikowej 0,869 ± 0,032 0,803 ± 0,026 0,926 ± 0,025Kości korowej 3,196 ± 0,103 3,051 ± 0,038 2,957 ± 0,062 *Całego trzonu 4,065 ± 0,127 3,854 ± 0,058 3,882 ± 0,055Powierzchnia jamy szpikowej/trzonu kości piszczelowej 0,214 ± 0,005 0,208 ± 0,004 0,239 ± 0,007 *Przyrost trzonu kościokostnej 38,28 ± 1,28 34,22 ± 1,11 29,33 ± 1,39 ***piszczelowej na grubość odstrony [μm]jamy szpikowej 19,50 ± 0,69 19,93 ± 1,41 17,86 ± 0,70Szerokość osteoidu kościpiszczelowej od strony [μm]Szerokość beleczek kostnych wkości udowej [μm]okostnej 17,34 ± 0,49 11,03 ± 0,58 *** 11,58 ± 0,67 ***jamy szpikowej 7,63 ± 0,22 6,24 ± 0,18 ** 5,12 ± 0,54 **w nasadzie 78,42 ± 1,24 71,15 ± 1,38 ** 68,58 ± 0,88 ***w przynasadzie 39,68 ± 1,35 35,77 ± 0,69 * 35,07 ± 0,75 *Wyniki przedstawiono w postaci średniej arytmetycznej ± SEM (n = 8–10). * – Statystycznie istotne różnice w odniesieniudo wyników uzyskanych u szczurów grupy kontrolnej: * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001.Tab. III. Własności mechaniczne kości udowej i przynasady kości piszczelowej po stosowaniu omeprazolu i pantoprazoluParametrywłasności mechanicznychKości udowejKontrolaOmeprazol(3 mg/kg ip)Pantoprazol(3 mg/kg ip)Siła [N]maksymalna 96,02 ± 3,57 95,70 ± 1,41 90,67 ± 4,22łamiąca 95,82 ± 3,60 95,64 ± 1,75 90,54 ± 4,26Ugięcie przy sile [mm]maksymalnej 0,55 ± 0,02 0,55 ± 0,02 0,56 ± 0,03łamiącej 0,57 ± 0,03 0,59 ± 0,02 0,56 ± 0,03Moduł Younga [MPa] 5462,73 ± 626,59 5518,27 ± 220,81 5710,85 ± 232,33Siła łamiąca szyjkę kości udowej 96,34 ± 3,26 87,91 ± 5,68 87,60 ± 3,31Przynasady kości piszczelowejSiła [N]maksymalna 121,77 ± 8,28 113,77 ± 6,70 110,63 ± 5,94łamiąca 95,24 ± 6,13 82,86 ± 4,40 79,22 ± 4,25 *Ugięcie przy sile [mm]maksymalnej 1,01 ± 0,08 0,93 ± 0,07 0,79 ± 0,03 *łamiącej 1,28 ± 0,07 1,21 ± 0,07 1,09 ± 0,05Moduł Younga [MPa] 1477,81 ± 156,05 1411,70 ± 80,98 1627,.73 ± 91,57Wyniki przedstawiono w postaci średniej arytmetycznej ± SEM (n = 8–10). * – Statystycznie istotne różnice w odniesieniudo wyników uzyskanych u szczurów grupy kontrolnej: * – p < 0,05.rokości beleczek kostnych w nasadzie kości udowej odpowiednioo 9,3% i 12,6% oraz w przynasadzie kości udowejo 9,85% i 11,62% (tabela II).Własności mechaniczne kości udowej i przynasady kościpiszczelowej po stosowaniu omeprazolu lub pantoprazoluOmeprazol i pantoprazol w porównaniu z wynikami uzyskanymiw grupie szczurów kontrolnych nieznacząco statystycznieosłabiały własności mechaniczne trzonu i szyjki kościudowej o strukturze zbitej. Pantoprazol silniej niż omeprazol,ale nieistotnie statystycznie, zmniejszał maksymalną siłę i siłęłamiącą trzon kości udowej oraz szyjkę kości udowej (tabelaIII). W porównaniu z wynikami grupy kontrolnej pantoprazolrównież silniej niż omeprazol osłabiał własności mechaniczneprzynasady kości piszczelowej o strukturze beleczkowej.Statystycznie znacząco zmniejszał siłę łamiącą przynasadę(o 16,82%) oraz nieistotnie zmniejszał siłę maksymalnąprzy jednoczesnym znaczącym statystycznie zmniejszeniu (o21,77%) ugięcia przy tej sile (tabela III).DyskusjaOmeprazol i pantoprazol podawano szczurom w dawce3 mg/kg mc. (ip). Dawkę tę ustalono w oparciu o najczęściejstosowaną dawkę dobową (20–40 mg) tych leków u ludziw leczeniu choroby wrzodowej z uwzględnieniem powszechniewykorzystywanego dziesięciokrotnego przelicznikawynikającego z szybszego metabolizmu u szczurów.Wyniki przeprowadzonych badań histomorfometrycznychwykazały, że pantoprazol silniej niż omeprazol zaburzałprzebudowę kości u szczurów, powodując zmianyw strukturze kości beleczkowej i zbitej świadczące o wzrościeobrotu metabolicznego z nasileniem resorpcji i zahamowaniemkościotworzenia.Intensyfikację procesów resorpcji po badanych inhibitorachpompy protonowej wykazano w kości o strukturzebeleczkowej oraz zbitej. W kości beleczkowej na nasilenieresorpcji lub zahamowanie kościotworzenia wskazywałoznaczące zmniejszenie szerokości beleczek kostnych w nasadziei w przynasadzie kości udowej występujące po sto-43

Farm Przegl Nauk, 2010, 3sowaniu obu leków. Argumentem przemawiającym za hamowaniemprocesu kościotworzenia w kości piszczelowejo strukturze zbitej było znaczące zmniejszenie szerokościosteoidu (niezmineralizowanej macierzy kostnej) zarównood strony okostnej, jak i śródkostnej oraz zmniejszenie przyrostukości piszczelowej na grubość od strony okostnej, przyczym istotne statystycznie tylko po stosowaniu pantoprazolu.Potwierdzeniem uzyskanych wyników wskazujących nahamowanie kościotworzenia po stosowanych lekach byłotakże zmniejszenie powierzchni kości korowej w trzoniekości piszczelowej statystycznie znaczące po stosowaniupantoprazolu.Przedstawione wyniki badań histomorfometrycznychw powiązaniu ze zmianami ilościowymi masy kości, masysubstancji mineralnych, masy substancji mineralnych/masykości wskazują na znaczącą intensyfikację procesów resorpcyjnychprowadzącą do utraty masy kostnej. Zmniejszeniesyntezy macierzy kostnej i upośledzenie procesu jej mineralizacji,zwłaszcza po stosowaniu pantoprazolu, może być następstwemwzrostu tempa przebudowy i niedostatecznej odpowiedziprocesu kościotworzenia na zwiększoną resorpcjękości. Potwierdzeniem zaobserwowanych zaburzeń w przebudowietkanki kostnej po stosowanych inhibitorach H + /K + -ATPazy było niewielkie osłabienie własności mechanicznychtrzonu i szyjki kości udowej o budowie zbitej oraz znaczącepogorszenie wytrzymałości przynasady kości piszczelowejo strukturze beleczkowej. Pantoprazol silniej niż omeprazolpogarszał własności mechaniczne kości zwłaszcza o strukturzebeleczkowej. Wskazuje na to zmniejszenie maksymalnejsiły oraz statystycznie znaczące zmniejszenie siły powodującejpęknięcie przynasady kości piszczelowej. Pantoprazolrównież statystycznie znacząco zmniejszał ugięcie przynasadykości piszczelowej przy maksymalnej sile.Wyniki przeprowadzonych w niniejszej pracy badań invivo wykazały, że pantoprazol silniej niż omeprazol zaburzałprzebudowę tkanki kostnej i osłabiał własności mechanicznekości szczurów szczególnie o strukturze beleczkowej. Niekorzystnezmiany w tkance kostnej po stosowaniu pantoprazoluoraz omeprazolu u szczurów wskazują, że inhibitory pompyprotonowej (H + /K + -ATPazy) obecnej w żołądku nie hamująwodniczkowej pompy protonowej (H + -ATPazy) w rąbkuszczoteczkowym osteoklastów i nie wykazują ochronnegodziałania na kości. Uzyskane wyniki badań in vivo wskazujące,że badane inhibitory pompy protonowej nie tylkonie hamowały resorpcji, ale dodatkowo ją nasilały pozostająw sprzeczności z wcześniej prowadzonymi badaniami invitro, które wykazały hamowanie aktywności osteoklastówprzez inhibitory H + /K + -ATPazy [17, 18] oraz z badaniamiwskazującymi na zmniejszenie resorpcji u dorosłych pacjentówpo stosowaniu omeprazolu [11].Brak hamującego działania omeprazolu na aktywnośćosteoklastów podobnie jak w niniejszym badaniu, wykazałBodde i wsp., którzy uzasadniają uzyskane wyniki degradacjąomeprazolu i brakiem jego konwersji do aktywnegometabolitu w środowisku zatoki resorpcyjnej [19]. Tutunjii wsp. wykazali, że degradacja omeprazolu była wolniejszaw roztworze o pH 2,0–4,0 niż w roztworze o pH 5,0–6,0[20]. W oparciu o dane literaturowe dotyczące degradacjii aktywacji omeprazolu nie można wykluczyć, że inhibitorypompy protonowej (H + /K + -ATPazy) nie ulegają konwersjido aktywnego metabolitu w środowisku zatoki resorpcyjnejosteoklastów, w której pH wynosi 4,5–6,0 [19, 20, 21].Protonowanie omeprazolu lub pantoprazolu do aktywnychmetabolitów w kanalikach komórek okładzinowych żołądkazachodzi w pH około 1,0 [1, 4].Uzyskane w niniejszej pracy wyniki pogorszenia własnościmechanicznych kości szczurów po stosowaniu pantoprazoluoraz omeprazolu są zgodne z ostatnimi obserwacjamiklinicznymi wskazującymi, że terapia inhibitoramipompy protonowej zwiększa ryzyko złamań biodra [12].Wright i Proctor [22] sugerują, że wzrost ryzyka złamań kościbiodrowej po stosowaniu inhibitorów pompy protonowejmoże być skutkiem zmniejszonego jelitowego wchłanianiawapnia i zwiększonej utraty masy kostnej. Również Kirkpanturi Altun [23] wykazali zmniejszenie gęstości mineralnejkości u pacjentów hemodializowanych stosującychomeprazol. Przedstawione dane wskazują, że długotrwałaterapia pantoprazolem lub omeprazolem może zwiększać ryzykorozwoju osteoporozy zwłaszcza, gdy leki są stosowaneu osób w podeszłym wieku.Wnioski1. Długotrwała terapia pantoprazolem lub omeprazolemmoże zwiększać ryzyko rozwoju osteoporozy.2. Pantoprazol silniej niż omeprazol zaburza przebudowękości w wyniku nasilenia resorpcji z jednoczesnymhamowaniem kościotworzenia i mineralizacjioraz osłabia wytrzymałość mechaniczną kościo strukturze gąbczastej.Praca zrealizowana w ramach badań statutowychKNW-1-147/08Piśmiennictwo1. Hoogerwerf WA, Pasricha PJ. Farmakoterapia choróbzależnych od działania kwasu solnego, choroby wrzodoweji choroby refluksowej. W: Farmakologia Goodmanai Gilmana. Red. tłum. Krzemiński TF, Buczko W, CzuczewarSJ. Wydawnictwo Czelej; Lublin 2007; 1029-1043.2. Sachs G, Shin JM, Howden CW. Review article: the clinicalpharmacology of proton pump inhibitors. AlimentPharmacol Ther 2006; 23 (2 Suppl.): 2-8.3. Shin JM i wsp. The site of action of pantoprazole in thegastric H + /K( + )-ATPase. Biochim Biophys Acta 1993;1148: 223-233.4. Shin JM, Cho YM, Sachs G. Chemistry of covalent inhibitionof the gastric (H + ,K + )-ATPase by proton pumpinhibitors. J Am Chem Soc 2004; 126: 7800-7811.5. Shin JM, Sachs G. Differences in binding properties oftwo proton pump inhibitors on the gastric H + , K + -ATPasein vivo. Biochem Pharmacol 2004; 68: 2117-2127.6. Yao G, Feng H, Cai Y. Characterization of vacuolar - AT-Pase and selective inhibition of vacuolar -H(+)-ATPasein osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun 2007;357 (4), 821-827.7. Chatterjee D i wsp. The osteoclast proton pump differsin pharmacology and catalytic subunits from other vacuolarH(+)-ATPases. J Exp Biol 1992; 172: 193-204.44

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50738. Rousselle AV, Heymann D. Osteoclastic acidification pathwaysduring bone resorption. Bone 2002; 30: 533-540.9. Cui GL i wsp. Long-term omeprazole treatment suppressesbody wright gain and bone mineralization in youngmale rats. Scand J Gastroenteral 2001: 36, 1011-1015.10. Kocsis I i wsp. Short-term omeprazole treatment doesnot influence biochemical parameters of bone turnoverin children. Calcif Tissue Int 2002; 71: 129-132.11. Mizunashi K i wsp. Effect of omeprazole, an inhibitorof H + , K + -ATPase on bone resorption in humans. CalcifTissue Int 1993; 53: 21-25.12. Yang YX i wsp. Long-term proton pump inhibitor therapyand risk of hip fracture. Jama 2006; 296: 2947-2953.13. Cegieła U i wsp. Effects of 6-mercaptopurine (6-MP) onhistomorphometric parameters of the rat bones. PharmacolRep 2005; 57: 515-522.14. Turner C.H., Burr D.B.: Basic biomechanical measurementsof bone: a tutorial. Bone, 1993; 14: 595-608.15. Cullinae DM, Einhorn TA.: Bimechanice of bone. W:Principles of bone biology. Red. Bilezikian JP, RraiszLG, Rodan GA Wyd. II. Academic Press, San Diego, SanFrancisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo,2002, 17-32.16. Pytlik M i wsp. Effects of retinol on development ofosteopenic changes induced by bilateral ovariectomy inrats. Pol J Pharmacol 2004; 56: 345-352.17. Hall TJ, Chambers TJ. Na + /H + antiporter is the primaryproton pump transport system used by osteoclasts duringbone resorption. J Cell Physiol 1990; 142: 420-424.18. Tuukkanen J, Vaananen HK. Omeprazole, a specific inhibitorof W + - K+-ATPase, inhibits bone resorption invitro. Calcif Tissue Int 1986; 38: 123-125.19. Bodde EW i wsp. No increased bone formation aroundalendronate or omeprazol loaded bioactive bone cementsin a femoral defect. Tissue Eng Part A 2008;14: 29-39.20. Tutunji MF i wsp. Reactions of sulfenic acid with2-mercaptoethanol: a mechanism for the inhibition ofgastric (H + -K + )-adenosine triphosphate by omeprazole.J Pharm Sci 2007; 26: 196-208.21. Takahashi N i wsp. Cells of Bone. Osteoclast generation.W: Principles of bone biology. Red. Bilezikian JP, RaiszLG, Rodan GA. II wyd. Academic Press, San Diego, SanFrancisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo;2002; 109-126.22. Wright MJ i wsp. Proton pump - inhibiting drugs, calciumhomeostasis, and bone health. Nutr Rev 2008; 66:103-108.23. Kirkpantur A i wsp. Proton pump inhibitor omeprazoleuse is associated with low bone mineral density in maintenancehaemodialysis patients. Int J Clin Practice 2009; 63:261-268.data otrzymania pracy: 24.02.2010 r.data akceptacji do druku: 19.03.2010 r.Adres do korespondencji:dr hab. n. farm. Maria PytlikKatedra i Zakład Farmakologii,Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicachul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiectel.(fax.) +48 32 364 15 40e-mail: mariapytlik@gmail.com45

Farm Przegl Nauk, 2010,3, 46-51Ekspresja genu surwiwiny w raku jelita grubegoSurvivin Gene Expression in Colorectal CancerSławomir Dudek 1 , Celina Kruszniewska-Rajs 1 , Marta Plato 1 , Małgorzata Stachowicz 1 ,Ewa Nowakowska 2 , Małgorzata Muc-Wierzgoń 2 , Marek Rudzki 3 , Dariusz Waniczek 3Jerzy Arendt 3 , Izabela Woźniczko 1 , Magdalena Tkacz 4 , Urszula Mazurek 11Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Sosnowiec;2Katedra i Oddział Kliniczny Chorób Wewnętrznych Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Bytom;3Katedra i Oddział Kliniczny Chirurgii Ogólnej i Gastroenterologicznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznegow Katowicach, Bytom;4Zakład Systemów Informatycznych, Instytutu Informatyki Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach, SosnowiecStreszczenieSurwiwina to niedawno odkryte białko antyapoptotyczne– unikatowy przedstawiciel rodziny IAPs (ang. inhibitoryapoptosis proteins), które hamuje apoptozę oraz regulujepodziały komórek, promując ich przeżycie i ekspansję.Białko to chroni komórki przed śmiercią w czasie podziału.Ze względu na nadekspresję genu surwiwiny w wielutypach nowotworów uznano ją za marker w diagnostycenowotworów oraz potencjalny cel w terapii przeciwnowotworowej.W przedstawionej pracy analizowano zmianystężenia surwiwiny w raku jelita grubego oraz podsumowanoaktualną wiedzę na temat terapii celowanej skierowanejprzeciw surwiwinie. Kwestią nierozwiązaną jestbezpieczeństwo hamowania ekspresji genu surwiwiny.AbstractSurvivin is a recently discovered anti-apoptotic protein(IAP) which inhibits apoptosis and regulates mitosis.Survivin is present in the majority of tumours, so it canbe a useful gain in tumour therapy. The intensive studiesto inhibit the expression of survivin gene are carried out.Antisense oligonucleotides, or RNAi are examined as thegene suppressing factors on DNA level. Additionally, theintroduction of other molecules can increase the chance oftumour cell destruction. However, the side effects of thistherapy are still unknown.Key words: survivin, IAP proteins, antisense oligonucleotides,RNAi, ribozyme, aptamers, cancer therapySłowa kluczowe: surwiwina, białka IAP, oligonukleotydyantysensowne, RNAi, rybozymy, aptamery, terapia przeciwnowotworowaWstępSurwiwina odkryta w 1997 r. jest cząsteczką budzącąduże zainteresowanie jako marker wczesnych etapów transformacjinowotworowej oraz cel terapii przeciwnowotworowej.W zależności od profilu stężeń jej izoform oraz ichlokalizacji w komórce reguluje równowagę między proliferacjąi śmiercią komórki. Jest to białko zaliczane do rodzinyinhibitorów apoptozy (inhibitors of apoptosis - IAP), do którejnależy jeszcze siedem znanych białek ssaków: apollon,HIAP1, HIAP2, liwina, NAIP, Ts-IAP, XIAP [1], pełniącychróżne funkcje w komórce, zarówno w czasie podziału, jakrównież w apoptozie. Białka IAP wiążąc kaspazy poprzezdomeny BIR (Baculovirus IAP Repeat) blokują ich enzymatycznąaktywność, co sprzyja immortalizacji komóreknowotworowych [2]. Domena BIR składa się z trzech helisα oraz trzech harmonijek β, do których przyłączane są kaspazy– enzymy z grupy proteaz, pośrednio odpowiadająceza fragmentację materiału genetycznego i podział komórkina ciałka apoptotyczne. Surwiwina, w przeciwieństwie dopozostałych białek IAP posiada tylko jedną domenę BIR [3],niezbędną do zachowania antyapoptotycznych właściwości[4]. Surwiwina wykazuje ok. 26,3% strukturalnego podobieństwaz XIAP - najlepiej poznanym białkiem IAP [2, 5,6]. W odróżnieniu od pozostałych białek IAP surwiwina nieposiada na C-końcu domeny RING (Really Interesting NewGene) o strukturze palca cynkowego, charakteryzującej sięaktywnością ligazy E3 ubikwityny. Domeny odpowiedzialnejza znakowanie ubikwityną i degradację kaspaz (rola antyapoptotyczna)i białek IAP (rola proapoptotyczna).Gen surwiwiny zlokalizowany jest na chromosomie17q25, koduje mRNA o długości 431 pz (izoforma dzika)oraz białka o różnej długości. Oprócz dzikiej surwiwiny(142 aa) w komórkach ludzkich potwierdzono obecność kilkuinnych izoform tego białka: surwiwiny-2α (74 aa) [7],surwiwiny-2β (165 aa), surwiwiny-ΔEx3 (137aa) [8] orazsurwiwiny-3β (120aa) [9]. Różnią się one między sobą ilościąaminokwasów oraz funkcjami. Przykładowo forma 2β46

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Ryc. 1. Mechanizmy hamowania apoptozy z udziałem surwiwiny oraz strategie terapii genowej związane z wyciszaniemaktywności transkrypcyjnej genu surwiwiny, prowadzącej do indukcji apoptozy.ma mocno zredukowane zdolności antyapoptotyczne, podobniejak 2α, która współdziałając z formą dziką obniża jejwłaściwości antyapoptotyczne.Przeciwdziałanie apoptozie z udziałem surwiwiny zachodzipoprzez inhibicję kaspaz efektorowych, prawdopodobniekaspazy 3 i 7 oraz poprzez przyłączenie jej domikrotubul wrzeciona mitotycznego. Surwiwina równieżpośrednio hamuje apoptozę, łącząc się z proapoptotycznymczynnikiem Smac/DIABLO [10], który pod wpływem sygnałówproapoptotycznych jest uwalniany z mitochondriów,umożliwiając w ten sposób aktywację kaspaz. Prowadzi todo apoptozy zależnej od kaspaz. Surwiwina wykazuje równieżzdolność do łączenia się z innymi białkami uczestniczącymiw regulacji apoptozy np. w połączeniu z białkiem(HBXIP - hepatitis B X-interacting protein) jest w staniehamować w sposób pośredni kaspazę 9 odpowiedzialną zazapoczątkowanie wewnętrznego, mitochondrialnego szlakuapoptozy (ryc. 1).Wyciszenie ekspresji genu surwiwiny umożliwia aktywacjęapoptozy oraz wywołuje zaburzenia w segregacjichromosomów, tworzenie nieprawidłowych jedno lub wielobiegunowychwrzecion podziałowych, mikronukleację,nieprawidłowości w przebiegu cytokinezy oraz poliploidyzację[3].Aktywność transkrypcyjna genu kodującego surwiwinęjest hamowana przez białko supresorowe p53, uczestniczące:w regulacji cyklu komórkowego, w procesach naprawyDNA oraz w indukcji apoptozy [5]. Cechą charakterystycznąsurwiwiny jest duża różnica pomiędzy ekspresją genuw komórkach prawidłowych w porównaniu do komóreknowotworowych. Stwierdzono obecność tego białka w prawiewszystkich typach nowotworów, w dzielących się komórkachprawidłowych zaś jej brak w nieproliferujących,prawidłowych komórkach [11, 12]. Zainspirowało to wielubadaczy do rozpoczęcia badań nad opracowaniem nowejstrategii leczenia chorób nowotworowych opartej na wybiórczymblokowaniu ekspresji genu surwiwiny (ryc. 1).Terapia ta zawierałaby metody leczenia farmakologicznegojak i metody biologii molekularnej, począwszy od regulacji,transkrypcji, translacji [13], aż do potranslacyjnej modyfikacjibiałek i blokowaniu ich funkcji. W danych literaturowychopisano wiele rodzajów terapii genowej celowanejprzeciwko genowi surwiwiny.Surwiwina – cel terapii genowejStrategie terapii genowej, której celem jest surwiwina(ryc.1) w dużej części związane są z zastosowaniemantysensownych oligonukleotydów (ASO) – krótkich jednoniciowychfragmentów kwasów nukleinowych wiążą-47

Farm Przegl Nauk, 2010, 348cych się do DNA, RNA lub białka surwiwiny na zasadziehybrydyzacji, z wykorzystaniem wiązań wodorowych.W przypadku zahamowania ekspresji tego genu w komórkachnowotworowych istnieje duże prawdopodobieństwosamoistnego zapoczątkowania apoptozy, której aktywnośćmoże być zwiększona poprzez wprowadzenie do komórkiinnych czynników proapoptotycznych jak 5-fluorouracyl lubcisplatyna [12]. Wyniki badań wielu autorów wykazały, żesurwiwina może regulować wrażliwość komórek na śmierćindukowaną przez TRAIL (tumor necrosis factor-relatedapoptosis inducing ligand). Obniżenie ekspresji genu surwiwinyuwrażliwia komórki oporne na apoptozę indukowanąprzez TRAIL. W zależności od realizowanej koncepcji terapeutycznej,poszczególne drogi postępowania określane sąróżnymi terminami: strategia tripleksu, strategia antysensu,strategia rybozymowa, strategia aptamerowa oraz wyciszanieekspresji genu za pomocą interferencyjnego RNA.Strategia tripleksu prowadzi do hamowania procesutranskrypcji przez tworzenie stabilnych, trójniciowych połączeńmiędzy syntetycznymi oligonukleotydami i dwuniciowąhelisą DNA genu surwiwiny [14]. Tworzenie stabilnychtripleksów odpowiednich oligodeoksynukleotydów i DNAw komórkach raka płuca linii A549 powodowało istotnezmniejszenie stężenia białka surwiwiny i indukcję apoptozykomórek nowotworowych [14].Strategia antysensu – prowadzi do zahamowania procesutranslacji zsyntetyzowanego już mRNA tworząc dupleks oligonukleotyduz mRNA surwiwiny za pomocą wiązań wodorowychtypu Watsona-Cricka. W Europejskim Biuletynie Patentowym2007/12, opublikowano patent dotyczący stosowaniaantysensownego oligonukleotydu leczniczego skierowanegona surwiwinę w połączeniu z czynnikiem chemioterapeutycznym,chlorowodorkiem gemcytabiny,w celu polepszenia efektywnościchemioterapii. Patenty U.S. 6 077 709i 6 165 788 zawierają sposoby modulacjiekspresji lub nadekspresji genusurwiwiny poprzez antysensowneoligonukleotydy (ASO), które są użytecznew leczeniu raka trzustki, prostaty,okrężnicy, sutka, płuc, pęcherzamoczowego, żołądka, nerwiaka niedojrzałego,chłoniaka nieziarniczegoi raka obejmującego komórki keratynocytówlub fibroblastów. Patent U.S.6 335 194 zawiera metodyczny opisstrategii antysensownych oligonukleotydówskierowanych na surwiwinęw leczeniu nowotworów w połączeniuz chemioterapią oraz przedstawiawyniki tej terapii. Połączenie antysensownegooligonukleotydu, któryhamuje ekspresję genu surwiwiny,z chemioterapią w leczeniu nowotworów,w porównaniu wynikami leczeniakażdą metodą osobno, charakteryzujesię znacznie większą skutecznością[15].Strategia rybozymowa – w tejterapii krótkie odcinki RNA o specyficznejsekwencji zasad, mają zdolność do samotrawieniai enzymatycznego cięcia zdefiniowanych cząsteczek mRNA.Hamują one aktywność surwiwiny poprzez degradację jegomRNA np. w komórkach raka prostaty, co znacząco wpływana zwiększenie wrażliwości komórek na cisplatynę [16].Strategia aptamerowa (łac. dopasowany) do wyciszaniaekspresji genów wykorzystuje kilkunasto- lub kilkudziesięcio-nukleotydowesekwencje DNA, RNA, lub łańcuchypeptydowe, które wykazują specyficznie powinowactwodo określonych molekuł, głównie białek, gdyż ich strukturaprzestrzenna pasuje do kształtu danej cząsteczki. Do tejpory uzyskano bardzo wiele aptamerów wobec całego szeregumolekuł. Bardzo interesującym supresorem surwiwinysą substancje naśladujące oligopeptydy - peptydomimetyki(peptidomimetics), które opracowano znając strukturę surwiwinyw obrębie odcinka wiążącego Hsp90 [17]. Stwierdzono,że połączenie surwiwiny z białkiem opiekuńczymHsp90, znacznie wpływa na jej stabilność w komórce.Zniszczenie oddziaływań pomiędzy tymi białkami prowadzido degradacji surwiwiny w proteasomach powodując zaburzeniaw przebiegu mitozy lub apoptozę [18].Krótki interferujący RNA (siRNA) jest wykorzystywanydo wyciszania ekspresji genu surwiwiny [19], zwiększającwrażliwość komórek nowotworowych na różne czynnikiproapoptotyczne. Wyciszenie genu surwiwiny metodąinterferencji RNA obserwowano w wielu typach komóreknowotworowych np. raka piersi, wątroby, szyjki macicy,prostaty, trzustki, płuc i jelita grubego [20, 21]. Dodatkowostwierdzono, że kombinacja RNAi wyciszającego ekspresjęgenu surwiwiny z wprowadzeniem ligandu TRAIL przynosio wiele lepsze skutki niż samo działanie interferującegoRNA.Ryc. 2. Dendrogram wyznaczony metodą aglomeracji hierarchicznej z miarą odległościCzebyszewa przedstawiający zróżnicowanie transkryptomów wycinków jelitaróżniących się stopniem zaawansowania raka jelita grubego: jelito prawidłowe(K- kontrola), rak w stopniu zaawansowania CS I, CS II, CS III i CS IV, w nawiasachzaznaczono nr badanej próbki.

Ryc. 3. Średnie wartości sygnału fluorescencji mRNA surwiwiny wyznaczone technikąmikromacierzy oligonukleotydowych HGU 133A (Affymetrix) charakterystycznedla wycinków gruczolakoraka jelita w różnym stopniu zaawansowania (CSI - CS IV) oraz dla jelita prawidłowego (K).Celem pracy była ocena stopnia zróżnicowania stężeniamRNA genu kodującego surwiwinę w wycinkach prawidłowychjelita grubego w porównaniu do komórek gruczolakoraka.Materiał i metodycopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Materiał do badań molekularnych stanowiły wycinkijelita grubego ocenione na podstawie analizy histopatologicznejjako prawidłowe lub jako wycinki gruczolakorakaw stopniu zaawansowania klinicznego (CS) I - IV. Na pobraniewycinków do analizy molekularnej uzyskano zgodęchorego oraz Zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego UniwersytetuMedycznego. W komórkach gruczolakoraka i jelitaprawidłowego wyznaczono transkryptom (22283 mRNA),techniką mikromacierzy oligonukleotydowych, z zastosowaniempłytek HGU 133A (Affymetrx). Część eksperymentalnąrozpoczęto od ekstrakcji RNA przy użyciu odczynnikaTrizolTM, zgodnie z instrukcją producenta, a następnieotrzymany całkowity RNA oczyszczono przez trawienieDNazą I (deoksyrybonukleazą I) na kolumnach zestawuRNesey Mini Kit firmy Qiagen. Około 8 μg całkowitegoRNA wykorzystano do syntezy dwuniciowego cDNA (GibcoBRL SuperScript Choince system). W kolejnym etapiezsyntetyzowano cRNA (RNA komplementarne do cDNA),który wyznakowano biotyną (reakcja transkrypcji in vitro,Enzo kit). Biotynylowany cRNA poddano procesowi fragmentacjioraz hybrydyzacji z mikromacierzą Test3 oraz HG-U133A (Affymetrix) i znakowaniu kompleksem streptawidyna-fikoerytryna.Intensywność fluorescencji została zanalizowanaprzy użyciu skanera GeneArray Scanner G2500A.Ilość oraz jakość całkowitego RNA, cDNA i cRNA ocenionotechniką elektroforezy w 1,2% żelu agarozowym. Analizęotrzymanych wyników przeprowadzono wykorzystującprogramy MicroArray Suite 5.0 i Data Mining Tool (Affymetrix)oraz SAM (Significance Analysis of Microarrays),Excel 2007 i Statistica 8. Zmiany aktywności transkrypcyjnejgenów w wycinkach gruczolakorakaw porównaniu do kontrolijelitaprawidłowego oceniano ponormalizacji wyników w programieRMA Express.WynikiW pierwszym etapie analizyw programie Microarray Suite zostaływygenerowane raporty analiz,na podstawie których dokonanooceny jakości uzyskanych wynikówna kolejnych mikromacierzachi podjęto decyzję o wyłączeniu lubwłączeniu kolejnych transkryptomówdo analizy porównawczej.Wygenerowane sygnały fluorescencji,charakterystyczne dla zdefiniowanychtranskryptów znormalizowanow programie RMAExpress,a następnie dla wybranych grupgenów wykonano analizę statystycznąwyników mającą na celu porównanie otrzymanychtranskryptomów i ocenę ich zróżnicowania wynikającegoze stopnia zaawansowania zmian nowotworowych jelita.Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują zróżnicowanietanskryptomów komórek raka jelita od kontroli. W grupietranskryptomów gruczolakoraka jelita zarysowuje się zróżnicowaniena dwie podgrupy różniące się stopniem zaawansowaniaraka (ryc.2).Ostatnim etapem analizy statystycznej mikromacierzyoligonukleotydowych było porównanie stopnia zróżnicowaniastężenia mRNA surwiwiny (ryc. 3, tab. I). Otrzymanewyniki wskazują, że gen kodujący surwiwinę jest aktywnytranskrypcyjnie zarówno w komórkach jelita prawidłowegojak i w komórkach gruczolakoraka, z wyraźną tendencją nadekspresjiw raku.DyskusjaLiczne badania mające na celu ocenę potencjalnychmożliwości zastosowania surwiwiny w diagnostyce i terapiinowotworów obejmujące analizę częstości jej występowania,mechanizmów działania i udziału w procesieapoptozy i regulacji cyklu komórkowego dostarczają wielusprzecznych danych. Porównywanie wyników prac różnychgrup badawczych jest obecnie niemożliwe ze względu naznaczne różnice metod stosowanych do wykrywania lubpółilościowego oznaczania poziomu transkryptów lub białkasurwiwiny. Wielu autorów podkreśla, że zróżnicowanieaktywności transkrypcyjnej surwiwiny ściśle związanejest z aktywnością proliferacyjną komórek. Tak więc niew każdym przypadku surwiwina jest dobrym celem, terapeutycznym.Gianani i wsp. [22], stwierdzili, że aktywnośćtranskrypcyjna surwiwiny nie jest specyficznym markeremdla raka jelita. Surwiwina może stanowić cel terapeutycznytylko w przypadku indywidualizacji leczenia, jeśli u pacjentauda się wykryć różnice w ekspresji pomiędzy kontroląa próbkami badanymi, jednak nie może to stanowić o pod-49

Farm Przegl Nauk, 2010, 3Tab. I. Wyniki analizy porównawczej sygnałów fluorescencji dla mRNA surwiwiny (BIRC5-baculoviral IAP repeatcontaining5), wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HGU133A (Affymetrix), przeprowadzonejw programie SAM (significance analysis of microarrays) wskazujące stopień zróżnicowania aktywności transkrypcyjnejw gruczolakoraku jelita w porównaniu do kontroli. SLR – logarytm różnicy sygnału fluorescencji pomiędzy kontrolą arakiem, parametr q-value – wskazujący procent prawdopodobieństwa, że obserwowana różnica jest przypadkowa orazwspółczynnik „score”, wskazujący znamienność statystyczną obserwowanej różnicy, wyliczony na podstawie analizy testuT-studenta z analizą permutacjiSurwiwina Porównanie SLR Współczynnik „score”Parametrq-value”210334_x_atK/CSI i CS II 0,363 -1,39637 22K/CSIII i CS IV 0,037 -0,22717 50202094_atK/CSI i CS II 0,898 -0,62801 39K/CSIII i CS IV 0,898 -0,62801 39K/CSI i CS II 0,851 -3,19387 5202095_s_atK/CSIII i CS IV 0,252 -0,42529 43jęciu decyzji w sprawie diagnozy. Podobne wnioski możnawyciągnąć na podstawie wyników otrzymanych przez naszzespół. Zupełnie inne wnioski wyciągnęli Nasu i wsp. [23],którzy wykrywali mRNA surwiwiny w tkankach raka piersioraz tkankach nienowotworowych otaczających guz metodąRT−PCR. Autorzy tych badań obserwowali ekspresję surwiwinyw blisko 90% tkanek guzów: 37 z 41, a także śladowąekspresję w 23% przypadków tkanek otaczających: 3 z 13.Występowanie surwiwiny nie było związane ze stanem klinicznympacjentek i przebiegiem choroby. Na tej podstawieuznano surwiwinę za dobry marker diagnostyczny i cel terapeutycznyraka piersi.Z ilości badań przeprowadzanych na całym świecie orazzachęcających wyników powinniśmy być zadowoleni, że jużniedługo dostępne będą terapie przeciwnowotworowe wykorzystującezjawisko hamowania ekspresji lub całkowitejdestabilizacji surwiwiny. Należy jednak pamiętać, że białkoto nie jest całkowicie niepożądane w organizmie ludzkim.Surwiwina występuje w prawidłowych limfocytach, którepełnią niepodważalną rolę w naszej odporności. Dodatkowowystępuje również w komórkach macierzystych, tak więcnależy dołożyć wszelkich starań aby stwierdzić czy zahamowanieekspresji surwiwiny nie będzie dla nas szkodliwe.Udokumentowano, że wyciszenie ekspresji surwiwiny możebyć przyczyną powstawania komórek aneuploidalnych orazpoliploidalnych [24]. Choć w znikomym zakresie może byćniezwykle niebezpieczne w przypadku powstania nowychklonów nowotworów, o których jeszcze bardzo mało wiemy.Badania częściowo finansowane z projektu MNiSWnr NN404 167234 oraz badań statutowych KNW1-002/09Piśmiennictwo1. Holcik M. The IAP proteins. Trends Genet 2002; 18:537-538.2. Deveraux QL, Reed JC. IAP family proteins - suppressorsof apoptosis. Genes Dev 1999; 13: 239-252.3. Wolanin K, Piwocka K. Rola i znaczenie surwiwiny wprzebiegu mitozy. Postępy Biochem 2007; 53: 10-18.4. Kaczmarek-Borowska B, Zmorzyński S, Filip A. Biologicznarola surwiwiny. Współcz Onkol 2008; 12: 437-440.5. Rupniewska Z, Koczkodaj D, Wąsik-Szczepanek E.Biologia surwiwiny (Część I). Acta Haemat Pol 2005;36: 371-379.6. Schimmer AD. Inhibitor of Apoptosis Proteins: TranslatingBasic Knowledge into Clinical Practice. Cancer Res2004; 64: 7183–7190.7. Caldas H, Honsey LE, Altura RA. Survivin 2alpha: anovel Survivin splice variant expressed in human malignancies.Mol Cancer 2005; 4: 11.8. MahotkaC i wsp. Survivin-deltaEx3 andsurvivin-2B:two novelsplice variants of the apoptosisinhibitor survivinwithdifferent antiapoptotic properties. Cancer Res1999; 59: 6097-6102.9. Badran A i wsp. Identification of a novel splice variant ofthe human anti-apoptosis gene survivin. Biochem BiophysRes Commun 2004; 314: 902-907.10. Bury J i wsp. Survivin in cancer diagnosis and therapy -a review. ANNALES UMCS 2008; 63: 78-84.11. Altieri DC. Survivin in apoptosis control and cell cycleregulation in cancer. Prog Cell Cyc Research 2003; 5:447-452.12. Urbaniak J. Ekspresja surwiwiny w nowotworach ludzkich.Adv Clin Exp Med 2004; 13: 1037-1046.13. Xia C i wsp. Induction of apoptosis in mesotheliomacells by antisurvivin oligonucleotides. Mol Cancer Ther2002; 1: 687-694.14. Shen C i wsp. Triplex−forming oligodeoxynucleotidestargeting survivin inhibit proliferation and induce apoptosisof human lung carcinoma cells. Cancer Gene Ther2003; 10: 403–410.15. PATEL Bharvin Kumar, Westfield, US; Kompozycjazawierająca antysensowny oligonukleotyd surwiwinyi gemcytabinę do leczenia raka. 21.03.2007 EuropejskiBiuletyn Patentowy 2007/1216. Pennati M, Binda M, Colella G. Ribozyme-mediatedinhibition of survivin expression increases spontaneousand drug-induced apoptosis and decreases the tumorigenicpotential of human prostate cancer cells. Oncogene2004; 23: 386-94.17. Plescia J i wsp. Rational design of shepherdin, a novelanticancer agent. Cancer Cell 2005; 7: 457-468.18. Fortugno P i wsp. Regulation of survivin function byHsp90. PNAS 2003; 100: 13791-13796.50

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507319. Williams NS i wsp. Identification and validation of genesinvolved in the pathogenesis of colorectal cancer usingcDNA microarrays and RNA interference. Clin CancerRes 2003; 9: 931-946.20. Nakao K i wsp. Survivin downregulation by siRNA sensitizeshuman hepatoma cells to TRAIL-induced apoptosis.Onc Rep 2006; 16: 389-392.21. Hai-Tao G i wsp. Down-regulation of survivin expressionby small interfering RNA induces pancreatic cancercell apoptosis and enhances its radiosensitivity. World JGastroenterol 2006; 12: 2901-2907.22. Gianani R i wsp. Expression of survivin in normal, hyperplastic,and neoplastic colonic mucosa. Hum Pathol2001; 32: 119-125.23. Nasu S i wsp. Survivin mRNA expression in patientswith breast cancer. Anticancer Res 2002; 22:1839–1843.24. Li F i wsp. Pleiotropic cell-division defects and apoptosisinduced by interference with survivin function. NatCell Biol 1999; 1: 461 – 466.data otrzymania pracy: 15.10.2009 r.data akceptacji do druku: 23.03.2010 r.Adres do korespondencji:Sławomir DudekKatedra i Zakład Biologii Molekularnej SUMul. Narcyzów 141-200 Sosnowiece-mail: biolmolfarm@sum.edu.pl51

Farm Przegl Nauk, 2010, 3INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OFMANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewedtransdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicineand related sciences. The journal publishes conferencereports and materials, conference announcements, as well asletters to the Editor.2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printedand an electronic form. Electronic versions of articles are to besent to kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl or supplied onCD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagramsand figures) should be addressed to:Scientific Review in Pharmacy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Disk label should contain the first name(s) and surname(s)of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphicsshould be included in separate files. Do not paste pictures andgraphics to text files. The Editor advises to use Star Office,Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.3. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief.The Authors are encouraged to suggest their reviewers,however the final selection of a reviewer is up to the EditorialBoard. The Editor-in-Chief reserves the right to correct orabbreviate the text (after the Author’s approval).Authors are requested to resubmit the revised manuscriptwithin four weeks. Papers that are not resubmitted withinfour weeks will be treated as a new submission.The manuscript that has been rejected by the ScientificReview in Pharmacy should not be resubmitted.4. A cover letter should be included with the manuscript, containinga declaration that the manuscript has not been previouslypublished in print or electronic format and is not under considerationby another journal or electronic medium, signed by allthe Authors. It should also include written approval from thehead of the institution in which the study was conducted.5. All human and animal research will have obtained ethical consentfrom the local Bioethical or Ethical Committee.6. The material sent in and the review will remain among thedocumentation of the Board of Editors.7. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the wholeof the copyrights for the published papers (including the rightto publishing in print, on electronic media, such as CD-ROMdisks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries isallowed without any written permission of the Editor.8. Instructions for authors:8.1. Manuscript Page Setup• Paper: white, A4 format.• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.• Text: Double-spaced, one side of the page only.• Numbering: Insert page numbers at bottom right of eachpage.• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extraline space between paragraphs.• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,with one line above. Indent first line after a subhead. Use anextra line space between the subhead and the text.• Title or Heading of the article: boldface, on separateline.• Second-level subhead: boldface, on separate line.• Third-level subhead: italic, on separate line.8.2. Organization of Manuscript• Title page should include: submission date and Author(s)full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’full current affiliations (for papers with multiply authors,please enumerate the authors and their affiliations in thefollowing way: Author 1 , Author 2 , etc; 1 Affiliation, 2 Affiliation,etc.). Affiliations should contain the full name of the institution.One corresponding author must be designated forpapers with coauthors. At the bottom of the page the fullname, academic degrees/titles, and address of the correspondingauthor should be given, including the telephonenumber, fax number and/or e-mail address. If researchhas been funded, please indicate the source of funding(including grant index/symbol, grant agencies, corporations,or sponsors).• The second page should include an abstract (150-250words). The abstract must be self-contained, and must notrequire reference to the paper to be understood. The abstractshould present objectives and scope of the study orreasons for writing the paper. The methods and techniquesor approaches should be described only to the extent necessaryfor comprehension. The findings and conclusionsshould be concise and informative. The abstract shouldbe followed by the key words consistent with the MedicalSubject Headings Index Medicus, and should not containunfamiliar terms that are not defined, undefined acronymsand reference citations. Neither displayed equations orlists should appear in the abstract.• Body text should be organized as follows:original paper - introduction, material and methods descriptions,research results, discussion;review papers – free structure;case studies – introduction (motivation for the study), casedescriptions, discussion of the characteristic symptoms,treatment results etc.• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-whitephotographs) should be put into a separate envelope. Oneach figure there should be its number (Arabic numerals),the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.Figure captions should be placed on separate pages andnumbered consecutively using Arabic numerals. Previouslypublished visual materials should be supplied togetherwith the written consent of the Publisher for reprint.• Tables, each on a separate page, should be numberedusing Roman numerals and preceded by their captions.Table captions should be placed on separate pages, numberedusing Roman numerals.• The papers should not exceed the following limitations:original and review work – 10 pages and others – 5 pages.8.3. References to the works cited should be presented at theend of the paper and arranged according to the sequenceof citations in the body text. The acronyms for journal titlesshould be used according to Index Medicus. Each entry,starting with a new line, should be given a number andmust be presented as follows:• journal citation:Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:557-67.If there are more than three authors, the name of the firstone should be given, followed by an ,,et al” annotation.Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activity andglycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:97-102.• the specific chapter:Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. BiochemiaHarpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.Warszawa 1994, 59-69.• monograph:Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw2004.References to the works cited within the text should be numberedusing Arabic numerals and placed between brackets,e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations:original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliographyentries.52

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowaneprace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe,z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych.Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na tematkonferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłaćw formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:Farmaceutyczny Przegląd Naukowy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:CMYK, rozdzielczość 300 dpi.3. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonychkażdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca sięautorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcjazastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniuz autorem).Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu,zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającymczterech tygodni. W przeciwnym raziepraca będzie traktowana jako nowa publikacja.Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta niemoże być ponownie przedkładany Redakcji FarmaceutycznegoPrzeglądu Naukowego.4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie byłauprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcjiinnego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawieraćrównież podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodęKierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczeniepublikacji w czasopiśmie.5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, któresą przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, musząmieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacjiRedakcji.7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskichdo wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, nanośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszczasię natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.8. Instrukcje dla autorów8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, nabiałym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnegoodstępu między kolejnymi wierszami.• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy odstrony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnymrogu.• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowychodstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównanedo lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstemnależy wprowadzić jeden odstęp.• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubionączcionką.• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochylonączcionką,8.2 Układ manuskryptu• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora-(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowychprzy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliacjękażdego z nich, w następujący sposób Autor 1 , Autor 2 ,…; 1 Afiliacja, 2 Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim,nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję,dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanychprosimy o wskazanie źródła finansowania (w tymnumery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lubsponsorów).• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będąceautonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczaćodnośników literaturowych. Streszczenie powinnozawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawoweprocedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych,metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Podstreszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w językupolskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject HeadingsIndex Medicus.• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,według następującego schematu:prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,dyskusja oraz wnioski;prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziałyi podrozdziały;prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby,charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe)powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane,opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać naoddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframiarabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane,należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy naponowną publikację.• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należyponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułamiumieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać naoddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframirzymskimi.• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinnawynosić 10, a pozostałych – 5 stron.8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowaniaw tekście pracy.Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z IndexMedicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,powinna być opatrzona numerem oraz zredagowanazgodnie z niżej podanym przykładem:• czasopismo naukowe:np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibroticdisorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podaćnazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activityand the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;331: 97-102.• wydawnictwo zbiorowe:np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: BiochemiaHarpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 1994, 59-69.• monografia:np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław2004.Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych,powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracachoryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do10 pozycji.53

PRENUMERATAProsimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literamii dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeratyotrzymają Państwo po około 2 tygodniachod dokonania wpłaty.Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeratyi Kolportażu:WYDAWCAGrupa Dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-BiałaTEL. 033 817 38 99Nr rachunku odbiorcy:0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158ODBIORCA:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/274 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............Nr rachunku odbiorcy:0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158ODBIORCA:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/274 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............