Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Zdj. Zygmunt WieczorekSzanowni Państwo,Koleżanki i Koledzy,Drodzy CzytelnicyNiezwłocznie, w ślad za czwartym numerem FarmaceutycznegoPrzeglądu Naukowego, przedkładamy Państwunumer piąty naszego czasopisma. Zawiera on jak zawsze artykułyz różnych ośrodków naukowych naszego kraju.Z radością informuję Państwa, iż wzrasta liczba pracoczekujących na publikację, co stanowi z pewnością wyrazrosnącego zainteresowania naszym czasopismem, docenieniaregularności ukazywania się kolejnych numerów, a conie mniej ważne – niedługiego – pomimo czasu przeznaczonegona recenzowanie prac – okresu oczekiwania na ichopublikowanie.W Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym drukowaćbędziemy także pełnotekstowe prace rekomendowane przezPana prof.dr hab. Edmunda Grześkowiaka oraz prof.dr hab.Annę Jelińską – Przewodniczących Komitetu OrganizacyjnegoOgólnopolskiej Konferencji Naukowej p.t.: Postępw ocenie jakości substancji i produktów leczniczych, któreto prace prezentowane będą podczas wspomnianej Konferencji.Pragnę Państwa także poinformować, iż przygotowujemykolejne aplikacje do baz czasopism, by FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy stał się bardziej dostępny dla szerokiejrzeszy czytelników i autorów, a z drugiej strony – jako rekomendowaneczasopismo – zyskał wyższą aniżeli obecniepunktację ministerialną, tak ważną dla nas ocenianych zapublikacyjny dorobek.Szanowni Państwo, tradycyjnie zamieszczamy informacjęo nadchodzącej Konferencji naukowej. Podobniejak poprzednio, przedstawiamy przedsięwzięcie dotyczącebadań i nieustannej pracy nad jakością kształcenia farmaceutów,tak bardzo leżącą na sercu nauczających tegoważnego i prestiżowego zawodu. Konferencja ta, pod nazwąUniversities Challenged: better higher educationthrough a better ranking system in Europe?, odbędzie sięw Brukseli, 29 czerwca tego roku.A z ważnych wydarzeń, jakie miały miejsce ostatnio,należy wspomnieć o uroczystości z dnia 13 maja br., któraodbyła się w Łazienkach Królewskich w Warszawie,a podczas której laureaci VIII edycji konkursu Fundacji narzecz Wspierania Rozwoju Polskiej Farmacji i Medycynyotrzymali granty, przeznaczone na finansowanie projektówbadawczych w dziedzinie nauk farmaceutycznych i medycznych.Uroczystości towarzyszyła dyskusja panelowa natemat „Współpracy lekarza z pacjentem i jej wpływu na wynikterapii”, lecz także i pytanie czy temat ten powinien znaleźćsię w programie studiów medycznych. Odpowiedź byłajasna. Natomiast, mając zaszczyt uczestniczenia w tej Konferencjiz przyjemnością zabrałam głos, informując szerokiegrono Znakomitości ze świata polskiej medycyny, iż na kierunkufarmacja już od kilku lat nauczamy szeroko pojętejopieki farmaceutycznej, obejmującej zagadnienia kooperacjipacjenta z farmaceutą, jako przedstawicielem zawodu medycznego.Opieka farmaceutyczna, jako nowy przedmiot (wwymiarze 45 godzin dydaktycznych) znalazła się w nowychstandardach kształcenia, zarekomendowanych UchwałąRady Głównej Szkolnictwa Wyższego Pani Minister Naukii Szkolnictwa Wyższego. To nowoczesne, dostosowane dowymogu czasów, nauczanie przyszłych adeptów sztuki farmaceutycznejjest niewątpliwie wynikiem konsekwentnejpracy dziekanów i nauczycieli akademickich WydziałówFarmaceutycznych, którzy wspierani pomocą kierownictwaPolskiego Towarzystwa Farmaceutycznego jak i KierownictwaDepartamentu Nauki i Szkolnictwa WyższegoMinisterstwa Zdrowia, czuwają nad stałym uaktualnianiemtreści programowych, realizowanych ze studentami kierunkufarmacja.Szanowni Państwo, zbliża się z wolna koniec semestru,a i na horyzoncie widać już sesję egzaminacyjną. Życzęszczególnej pogody ducha podczas tych trudnych – dla naszychstudentów – dni, a dla relaksu polecam napisanie pracydo Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego.Już niebawem pojawi się czerwcowy numer naszegoczasopisma, a zatem – do zobaczenia.Z serdecznymi pozdrowieniami,Redaktor NaczelnyProf. dr hab. Krystyna Olczyk

Nr 5 / 2010Spis treściProleki w terapii nowotworów.Część II. Strategie ADEPT i V/GDEPT0 11Prodrugs in cancer therapy. Part II. ADEPT and V/GDEPT strategiesZastosowanie mikroperymetriiw diagnostyce schorzeń centralnej części siatkówki0 17The diagnostics role of microperimetry in central retinal diseasesCzy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcegodla porównania jego aktywności metabolicznej z aktywnością ludzkiego cytochromu P450w badaniach in vivo lub in vitro? Część II – nadzieje 0 21Is there an animal model for a human cytochrome P450 activityin in vivo and in vitro investigations? Part II – expectationsWpływ temperatury i czasu sterylizacji termicznena generowanie wolnych rodników w diazotanie izosorbitolu0 28Effect of temperature and time of thermal sterilization on formation 0of free radicals in isosorbide dinitrateRozkład termiczny wybranych substancji pomocniczychstosowanych w technologii stałych postaci leków0 34Thermal decomposition of selected excipients 0used in solid dosage technology0Steroidy neuroaktywne jako modulatory receptorów GABAa– perspektywy zastosowania w terapii0 40Neuroactive steroids as modulators of GABAa receptors 0– perspectives for therapy040Bivalirudin can change strategy in interventional cardiology 0allowing one day discharge after elective percutaneouscoronary and peripheral interventions0 45Biwalirudyna może zmienić strategię w kardiologii interwencyjnejumożliwiając wykonanie wybranych przezskórnych zabiegów, 0zarówno wieńcowych jak i obwodowych, w trybie ambulatoryjnym

Universities Challenged: Better Higher Educationthrough a Better Ranking System in Europe?Renaissance HotelBrussels29 th June 2010Organised by“An International Symposium for gathering knowledge, discussing the latest challenges andsharing best practices in higher education quality and standards in Europe”14 Great College Street, Westminster, London, SW1P 3RXT: +44 (0) 845 606 1535F: +44 (0) 845 606 1539W: publicpolicyexchange.co.uk

“In order to achieve a mapping of European higher education that provides guidanceand transparency, we need ranking tools that take into account the existingdiversity in terms of languages, subject areas, profiles, student services,research and teaching quality. CHE is among the projects which aregiving an important contribution towards this objective.”- Ján Figel, EU Commissioner, November 2008“Quality assurance is vital for making European higher education attractive andtrustworthy, in line with the objectives of the EU modernisation agenda for highereducation and the Bologna Process. Globalisation, economic integration and increasedacademic and professional mobility are making mutual recognition and cross-borderquality assurance increasingly important. As a consequence, higher education isbecoming more transparent and credible for citizens, employers and studentswithin and outside Europe.”- Ján Figel, EU Commissioner, September 2009“The Lisbon objectives and the Bologna reforms are major change drivers in highereducation in Europe, and are having a significant impact both on quality assurancedevelopments and rankings as tools to bring greater transparency to higher education.”- Ms. Barbara Nolan, Head of Unit, Higher Education and Erasmus, EuropeanCommission, International Symposium on Standards in Higher Educationorganised by the Centre for Parliamentary Studies, December 2009Abstract and ProgrammeThe concept of university rankings in Europe has generally become accepted as an essentialresource for prospective students because "comparable information on higher educationinstitutions and their teaching and research programmes should make it easier for students andresearchers to make informed choices on where and what to study and where to work. Betterinformation would also help policy-makers at institutional, national and European levels developfuture strategies in higher education”. The relative merit between the growing numbers of rankingsystems, however, has emerged as a subject for vigorous debate.Recognising the need for clarity, the European Commission launched a new initiative "for thedesign and testing of a new multi-dimensional university ranking system with globaloutreach" that is also independent from public authorities and universities. It is hoped that throughits emergence as a top priority on the EU higher education agenda, a new comprehensive rankingsystem will facilitate not only greater transparency and accountability of universities but also helppolicymakers to develop longer term strategies as part of the broader HE modernisation agenda.With universities widely regarded as a measure of national economic achievements andaspirations in a globalised market, the need for a clearer and more representative ranking systemhas never been more paramount. This special International Symposium provides a timelyopportunity for universities and other stakeholders across Europe to examine the overhaul of theuniversity ranking system within the context of the wider HE reform process. The symposium willconsider the challenges that lie ahead in terms of constellation between rankings, qualityassurance systems and standards – barriers that must be overcome in order to achieve the visionof creating a European Higher Education Area with a robust framework to improve the comparativequality and competitiveness of universities across Europe.The Centre for Parliamentary Studies welcomes the participation of all key partners, responsibleauthorities and stakeholders. The Symposium will support the exchange of ideas and encouragedelegates to engage in thought-provoking topical debate.

Tuesday 29 th June 2010Renaissance Hotel, Brussels09:00 Registration and Morning Refreshments10:00 Chair’s Welcome and Opening RemarksProf. Luc François PhD, Director, AUGent (confirmed)10:10 Session One:The Design and Testing of a Multi-Dimensional Global RankingSystem in Europe Framework of the Future Ranking System – Indicators andDimensions Expected Results – Implementation Challenges Best Practices and Lessons Learned so farSpeaker:Mr. Robin van IJperen, Policy Officer, Directorate General forEducation and Culture European Commission (confirmed)10:35 First Round of Discussions11:05 Morning Coffee Break11:25 Session Two: Accountability of Higher Education within thePerspective of Rankings and TransparencySpeaker:Mr. Noël Vercruysse, Head of the Department of Higher Education,Flemish Ministry11:50 Second Round of Discussions12:30 Networking Lunch

13:30 Session Three: Dynamics of University Rankings in Europe Defining Indicators and Dimensions of the University RankingSystems in Europe International Comparison – Existing Practices Challenges Ahead Best Practices and Future ScenariosSpeaker: tbc13:55 Third Round of Discussions14:35 Coffee Break14:45 Session Four: The Global Institutional Profiles Project – LatestAnalysis of World University Rankings Thomson Reuters’ Global Institutional Profiles Project captures keyinformation about institutions to create a picture of universities as awhole. The first use of this data will be to inform the Times HigherEducation World University Ranking, but the underlying profiles canbe used in a variety of ways. A brief overview of the content andprocess of the project and status of where we are todaySpeaker:Mr. Simon Pratt, Project Manager for Institutional Research,Thomson Reuters (confirmed)15:10 Fourth Round of Discussions15:50 Chair’s Summary and Closing Remarks16:00 Networking Reception and Refreshments17:00 Symposium Close** Please note that the programme and speakers are subject to change without notice **

Farm Przegl Nauk, 2010,5, 11-16copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Proleki w terapii nowotworów.Część II. Strategie ADEPT i V/GDEPTProdrugs in cancer therapy. Part II. ADEPT and V/GDEPT strategiesAndrzej Stańczak, Marta SzumilakZakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w ŁodziStreszczenieWiększość stosowanych obecnie leków przeciwnowotworowychcharakteryzuje wysoka toksyczność systemowai brak wybiórczości względem tkanki nowotworowej.Jednym ze sposobów zwiększania skuteczności terapiii ograniczania jej toksyczności jest projektowanie proleków.Nowoczesne proleki tzw. Tumor Activated Prodrugsprojektuje się w oparciu o nieustannie rosnącą wiedzę natemat budowy i funkcji tkanki nowotworowej. Szereg jejcech np. hipoksja, obecność specyficznych antygenówbądź receptorów, czy wadliwy system naczyniowy, stanowipunkt uchwytu umożliwiający selektywne dostarczeniei aktywację proleku w obrębie guza. Niniejszy artykułstanowi próbę zapoznania czytelnika z nowoczesnymitechnikami farmakoterapii, takimi jak ADEPT (Antibody-directedenzyme prodrug therapy) i V/GDEPT (Virus/Gene-directed enzyme prodrug therapy) mającymi na celuobniżenie toksyczności systemowej chemioterapeutykóworaz zwiększenie skuteczności ich działania.Słowa kluczowe: proleki, leki przeciwnowotworowe,ADEPT, GDEPT, VDEPTAbstractMost currently used anticancer drugs are characterized byhigh systemic toxicity and lack of tumor selectivity. Oneway to increase effectiveness of treatment and reduce itstoxicity is prodrug design. Advanced prodrugs so-calledTumor Activated Prodrugs are designed on the basis ofever-growing knowledge of the structure and function oftumor tissue. Several of its features such as: presence ofspecific antigens or receptors, vascular system failure orhypoxia can be the targets allowing the selective deliveryand activation of prodrugs within the tumor. This work isan attempt to acquaint the reader with the latest techniquesof pharmacotherapy such as ADEPT (Antibody-directedenzyme prodrug therapy) and V/GDEPT (Virus/Genedirectedenzyme prodrug therapy) aimed at reducing systemictoxicity and increasing chemiotherapeutic agents’efficacy.Key words: prodrugs, anticancer drugs, ADEPT, GDEPT,VDEPTWprowadzenieProleki zajmują istotną pozycję w terapii nowotworów,bowiem ich stosowanie pozwala na ograniczenie toksycznościsystemowej oraz zwiększenie wybiórczości aktywnychcytotoksycznie leków, do których zostają przekształcanew organizmie ludzkim. Proleki projektuje się tak, by stanowiłysubstrat dla odpowiednich enzymów obecnych w tkancenowotworowej, zapewniając ich kontrolowaną i przewidywalnąaktywację w miejscu działania. Jednak występowanieenzymów metabolizujących proleki chemioterapeutykówbardzo często nie ogranicza się tylko do komórek nowotworowych,co znacznie obniża wybiórczość terapii. Aby pokonaćte ograniczenia opracowano nowoczesne, złożone strategie,w których podanie proleku jest poprzedzone wybiórczym dostarczeniemdo tkanki nowotworowej egzogennego enzymuza pośrednictwem przeciwciała monoklonalnego (ADEPT)lub przy pomocy wektora wprowadzającego gen samobójczykodujący odpowiedni enzym (V/GDEPT) [1].Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy(ADEPT)Enzymatyczna terapia prolekowa kierowana przeciwciałem(ADEPT) jest jedną z metod, mających na celu selektywnedostarczenie związków cytotoksycznych do komóreknowotworowych. Opiera się na użyciu przeciwciał monoklonalnychlub ich fragmentów, jako wektorów przenoszącychspecyficzne enzymy, które mają zdolność aktywowaniaproleków do związków działających cytotoksycznie [2-6].Strategia ADEPT obejmuje dwa etapy. W pierwszymz nich podaje się koniugat enzym-przeciwciało, który selektywniewiąże się ze specyficznym antygenem, obecnymtylko na powierzchni komórek nowotworowych. Prolek podajesię po upływie czasu niezbędnego do usunięcia z układukrążenia niezwiązanego koniugatu enzym/monoklonalneprzeciwciało. Aktywacja proleku następuje w przestrzenizewnątrzkomórkowej celowanej tkanki nowotworowej(rys.1). Wykazano, że jedna cząsteczka enzymu jest w sta-11

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Ryc. 1. Strategia ADEPT.nie uaktywniać szereg cząsteczek proleku, co znaczniezwiększa stężenie aktywnej substancji w obrębie tkankizmienionej nowotworowo, w porównaniu z przyległą (sąsiadującą)tkanką prawidłową. Nie mniej istotny jest fakt,że uwalnianie aktywnego leku w przestrzeni zewnątrzkomórkowej,umożliwia „zabijanie” sąsiadujących komóreknowotworowych, które nie mają na powierzchni antygenu(tzw. „bystander effect”) [5-8].Enzymy używane do konstruowania koniugatów powinnyspełniać szereg wymagań takich jak: stabilność i wysokaaktywność katalityczna w fizjologicznym pH oraz zdolnośćaktywacji jak największej ilości cząsteczek proleku [7].Dzieli się je na trzy podstawowe klasy [8, 9]:• Enzymy niewystępujące u ssaków, niemające ludzkichanalogów: β-laktamaza (β-L), karboksypeptydazaG2 (CPG2), amidaza penicylinowa G (PGA),deaminaza cytozynowa (CD). Proleki projektowanew oparciu o system ADEPT zawierający te enzymysą nietoksyczne i stabilne w krwiobiegu, ponieważnie stanowią substratów dla endogennych enzymówludzkich. Ponadto, w organizmie ludzkim nie masubstancji hamujących aktywność tych enzymów.Użycie ich wiąże się z ryzykiem odpowiedzi immunologicznejorganizmu ludzkiego (obce białka).• Enzymy niewystępujące u ssaków, aczkolwiek mająceludzkie analogi: β-glukuronidaza (β-G), nitroreduktaza(NR). Możliwość ich wykorzystaniawiąże się z subtelnymi różnicami w aktywności,w porównaniu z ludzkimi analogami np. najwyższaaktywność w różnym zakresie pH, niestety podobniejak enzymy należące do klasy pierwszej, majązdolność wywoływania odpowiedzi immunologicznej.• Enzymy występujące u ssaków: fosfataza alkaliczna(AP), karboksypeptydaza A (CPA), β-glukuronidaza(β-G). Ich użycie może spowodować niespecyficznąaktywację proleku i doprowadzić do wystąpienia silnychefektów ubocznych. Zaletą jest brak odpowiedziimmunologicznej.Rodzaj przeciwciała użytegow projektowaniu systemu ADEPTma również kluczowe znaczenie,ponieważ warunkuje selektywnąaktywację proleku w obrębie tkankinowotworowej. Przeciwciałopowinno zapewniać wybiórczewiązanie się koniugatu z antygenamitkanki nowotworowej i tymsamym uniemożliwiać lub chociażminimalizować jego transport dozdrowych komórek. Istotne jest,aby kowalencyjne wiązanie pomiędzyenzymem i przeciwciałem niewpływało negatywnie na powinowactwoprzeciwciała do antygenunowotworowego i jednocześnie nieniszczyło katalitycznych zdolnościużytego enzymu. Innym problememskuteczności ADEPT jest rozmiarkoniugatu, który bywa zbytduży by efektywnie penetrować do tkanki nowotworowej.Próbą przezwyciężenia tego ograniczenia jest konstruowaniekoniugatów przy użyciu tylko fragmentów przeciwciałtakich jak F(ab’) 2, F(ab’) i scFv, które znacznie zwiększająprzenikanie koniugatów w obręb nowotworu i umożliwiająszybsze usunięcie niezwiązanego koniugatu z krwi obwodowej[3, 7].Proleki projektowane dla systemu ADEPT muszą byćznacznie mniej toksyczne niż odpowiadające im aktywneleki, stabilne w fizjologicznym pH, wykazywać odpowiedniewłaściwości farmakologiczne i farmakokinetyczne orazstanowić dogodny substrat dla aktywujących je enzymóww warunkach fizjologicznych. Większość proleków dla terapiiADEPT stanowi pochodne znanych leków przeciwnowotworowycho dobrze poznanych parametrach farmakokinetycznychi wysokiej aktywności cytotoksycznej, lecz o niew pełni wykorzystanym potencjale klinicznym ze względuna wąski indeks terapeutyczny i nasiloną toksyczność systemową[7, 10].Ograniczenia metody ADEPT obejmują immunogennośćkoniugatów, która uniemożliwa powtarzanie terapii, niewystarczającąilość antygenów nowotworowych, stanowiącychcel dla koniugatu oraz aktywację zewnątrzkomórkowowąproleku, która narzuca przymus przenikania aktywnego lekuprzez błony komórkowe [7, 8, 11].W literaturze opisano szereg systemów ADEPTwykorzystujących różnorodne kombinacje enzymów, przeciwciałi proleków. Wybrane z nich przedstawia tabela I.Mimo wielu badań przedklinicznych, badania klinicznesystemów ADEPT ograniczają się tylko do kilku badańI fazy [5]. Wczesne badania prowadzono z użyciem koniugatuzbudowanego z karboksypeptydazy G 2pochodzeniabakteryjnego i fragmentu F(ab) 2przeciwciała monoklonalnegoanty-CEA (CEA-carcinoembryonic antigen).Prolek stanowił glutaminian kwasu (2-chloroetylo)-(2-mezyloksyetylo)-4-aminobenzoesowego (CMDA) lub glutaminianpochodnej karbaminianowej iperytu bisjodofenolowego.Zbyt długi czas eliminacji koniugatu wymuszałdodatkowy etap obejmujący podanie przeciwciał przeciwko12

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tab. I. Wybrane systemy ADEPTEnzym Prolek Lek PiśmiennictwoFosforan etopozydu Etopozyd [12]Fosfataza alkaliczna Fosforan mitomycyny C Mitomycyna C [13, 14]Fosforan doksorubicyny Doksorubicyna [15]Deaminaza cytozynowa 5-Fluorocytozyna 5-Fluorouracyl [16]Cefalosporyna-doksorubicyna Doksorubicyna [17]β-laktamazaCefalosporyna-alkaloidy VincaHydrazyddeacetylowinblastyny[18]Iperyt azotowy-cefalosporyna Iperyt azotowy [19]Fenoksyacetamid melfalanu Melfalan [20]Amidaza penicylinowa 4’-Hydroksyfenyloacetylopalitoksyna Palitoksyna [21]Fenoksyacetamid doksorubiciny Doksorubicyna [20]5-(Azyrydyn-1-ylo)-CB19544-hydroksylamino-2-[11, 22]Nitroreduktazanitrobenzamid4-Nitrobenzyloksy- pochodneAktynomycyna,Mitomycyna C i in.[23]β-glukuronidazaGlukuronid epirubicyny Epirubicyna [24]Glukuronidy doksorubicyny Doksorubicyna [25]α-galaktozydazaN-[4-α-galaktopiranozylo)-benzylo]-daunomycynaDaunomycyna [22, 26]Karboksypeptydaza G 2Glutaminiany iperytowych analogów kwasu Iperytowe analogi kwasu[28]p-aminobenzoesowegop-aminobenzoesowegoKarboksypeptydaza A α-Alaninowa pochodna metotreksatu Metotreksat [3]Cyklofosfamid, IfosfamidCB1954Cytochrom P-450 izoenzymCYP2B1 szczuraNitroreduktazaTab. II. Wybrane systemy GDEPTProlek Enzym Lek PiśmiennictwoGancyklowir (GCV)Kinaza tymidynowa (HSV-TK) wirusa Herpes simplexTrifosforan gancyklowiru [36]5-Fluorocytozyna Bakteryjna (E. coli)(5-FC)deaminaza cytozynowa5-Fluorouracyl (5-FU) [37, 38]iperytowa pochodnaamidu kwasu fosforowego(+akroleina)5-(Azyrydyn-1-ylo)-4-hydroksylamino-2-nitrobenzamidCPT-11 Karboksyesteraza 2 SN-38 [41][39][40]koniugatowi, zanim podano prolek. Odpowiedź immunologicznauniemożliwiała powtarzalność terapii [29, 30]. BadaniomI/II fazy poddano także system ADEPT składającysię z koniugatu zbudowanego z fragmentu scFv przeciwciałaMFE-23 anty-CEA i bakteryjnej karboksypeptydazy G 2oraz kwasu 4{[di(2-jodoetylo)amino]fenylo}oksykarbonylo-L-glutaminowego jako proleku. Koniugat okazał się dobrzetolerowany, szybko usuwany poprzez wątrobę i wywoływałznacznie słabszą odpowiedź immunologiczną [31, 32].Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy(GDEPT)Enzymatyczna terapia prolekowa kierowana genem(GDEPT) (rys. 2) stanowi kolejny, bardzo ciekawy przykładterapii celowanej, ukierunkowanej selektywnie nazabijanie komórek nowotworowych. Polega ona na wprowadzaniudo komórek nowotworowych genów kodującychenzymy, które mają ulegać ekspresji dając w pełniaktywne produkty. W następnym etapie, podobnie jakw strategii ADEPT, podaje się nieaktywne proleki będącesubstratami dla tych enzymów. Cząsteczki proleku, powniknięciu do komórek nowotworowych, zostają aktywowanedo cytotoksycznych produktów powodującychich śmierć [11, 33, 34].Do wprowadzenia genów samobójczych w terapiiGDEPT używa się lipidów kationowych, peptydów lub„nagiego” DNA. Wektory wirusowe (retrowirusy, adenowirusy)są wykorzystywane, jako nośniki genów w strategiiVDEPT (Virus Directed Enzyme Prodrug Therapy)[11, 33, 34]. Zarówno w strategii GDEPT jak i VDEPT zachodziproces zwany transdukcją, polegający na ekspresjiw komórce nowotworowej obcego dla niej genu kodującegoenzym. W przeciwieństwie do terapii ADEPT prolek,aby mógł zostać przekształcony do aktywnego leku musiprzeniknąć przez błonę komórkową do wnętrza komórki.13

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Ryc. 2. Strategia GDEPT/VDEPT.Ryc. 3. Bioaktywacja gancyklowiru.Ryc. 4. Bioaktywacja 5-fluorocytozyny.Nie mniej istotna jest zdolność przenikania aktywnegoleku do okolicznych „niezainfekowanych” genem komórek(tzw. „bystander effect”), która także warunkuje skutecznośćtej strategii [6, 11, 33,35]. Najczęściej stosowanymiprolekami w strategii GDEPTsą analogi nukleozydowe orazzwiązki alkilujące [33]. Wybraneschematy GDEPT przedstawiatabela II.Kinaza tymidynowa wirusaHerpes simplex (HSV-TK)i deaminaza cytozynowa bakteriiE. coli to jedne z najlepiej scharakteryzowanychenzymów użytychdo projektowania strategiiGDEPT [6]. Kinaza tymidynowawirusa (HSV-TK), w przeciwieństwiedo analogu ludzkiego, mazdolność fosforylowania szeregunukleozydów np. gancyklowiru.Ekspresja genu kodującego tenenzym w komórkach guza czynije zdolnymi do przekształcaniagancyklowiru w jego aktywnąpostać – trifosforan (rys. 3), którywbudowując się do DNA komórkize względu na brak grupy3’-hydroksylowej w cząsteczcedeoksyrybozy powoduje zahamowaniesyntezy kwasu nukleinowegoi prowadzi do śmiercikomórki. Terapia ta jest obecniew fazie badań klinicznych w leczeniuglejaka wielopostaciowegoi guzów mózgu [42].Deaminaza cytozynowabakterii E. coli katalizuje przekształcenie5-fluorocytozyny do5-fluorouracylu (rys 4), aktywnegocytotoksycznie metabolitustosowanego w chemioterapiinowotworów piersi, głowy i szyioraz przewodu pokarmowego.W schemacie GDEPT proces tenzachodzi wewnątrz komórki nowotworowej,co obniża toksycznośćsystemową 5-fluorouracylui pozwala na znaczne zwiększeniestężenia aktywnego leku w obrębietkanki nowotworowej [34, 43].Najsłabszym ogniwem strategii GDEPT i VDEPT jestbrak wydajnych i selektywnych wobec komórek nowotworowychwektorów przenoszących geny kodujące enzymy,a także nieefektyny proces transdukcji komórek nowotworowychin vivo [11, 42]. Nieustannie prowadzi siębadania mające na celu usprawnienie selektywnegotransportu genów, nasilenie ich ekspresji, oraz zwiększaniepowinowactwa proleków do miejsc aktywnychenzymów [6].Praca finansowana przez Uniwersytet Medyczny w Łodziw ramach prac własnych nr 502-13-702.14

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Piśmiennictwo1. Han HK. Targeted prodrug design to optimize drug delivery.AAPS Pharmsci 2000; 2: 1-10.2. Bagshawe KD. Towards generating cytotoxic agents atcancer sites. Br. J. Cancer 1989; 60: 275-281.3. Melton GR, Sherwood RF. Antibody-Enzyme Conjugatesfor Cancer therapy J. Natl. Cancer Inst. 1996; 88:153-156.4. Grzybek M. i wsp. Proleki i ich postaci – zastosowanie.Medycyna Weterynaryjna 2002; 58: 420-425.5. Kratz F. i wsp. Prodrugs strategies in anticancer chemotherapy.Chem Med Chem 2007; 3: 20-53.6. Hida K, Hanes J, Ostermeier M. Directed evolution fordrug and nucleic acid delivery. Adv Drug Deliv Rev2007; 59: 1562-1578.7. Niculescu-Duvaz I, Springer CJ. Antibody-directed enzymeprodrug therapy (ADEPT): a review. Adv DrugDeliv Rev 1997; 26: 151-172.8. Senter PD, Springer JC. Selective activation of anticancerprodrugs by monoclonal antibody-enzyme conjugates.Adv Drug Deliv Rev 2001; 53: 247-264.9. Wang B, Siahaan T, Soltero R. Drug delivery: Principlesand Applications. John Wiley & Sons Inc. Hoboken.New Jersey 2005.10. Stella VJ, Himmelstein KJ. Prodrugs and site-specificdrug delivery. J Med Chem 1980; 23: 1275-1282.11. Rooseboom M. Commandeur JNM. Vermeulen NPE.Enzyme-catalyzed activation of anticancer prodrugs.Pharmacol Rev 2004; 56: 153-102.12. Senter PD i wsp. Anti-tumor effects of antibody-alkalinephosphatase conjugates in combination with etoposidephosphate. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 4842-4846.13. Senter PD i wsp. Enhancement of the in Vitro and inVivo Antitumor Activities of Phosphorylated MitomycinC and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-AlkalinePhosphatase Conjugates. Cancer Res1989; 49: 5789-5792.14. Sahin U i wsp. Specific activation of the prodrug mitomycinphosphate by a specific anti-CD30/anti-alkalinephosphatase monoclonal antibody. Cancer Res. 1990;50: 6944-6948.15. Senter PD. Activation of prodrugs by antibody-enzymeconjugates: a new approach to cancer therapy. FASEB J1990; 4: 188-193.16. Wallace PM. i wsp. Intratumoral generation of5-fluorouracil mediated by an antibody-cytosine deaminaseconjugate in combination with 5-fluorocytosine.Cancer Res 1994; 54: 2719-2723.17. Vrudhala VM, Svensson HP, Senter PD. Cephalosporinderivatives of doxorubicin and melphalan and their activationby monoclonal antibody- lactamase conjugates. JMed Chem 1995; 38: 1380-1385.18. Shepherd TA i wsp. A novel targeted delivery systemutilizing a cephalosporin-oncolytic prodrug activated byan antibody β-lactamase conjugate for the treatment ofcancer. Bioorg Med Chem Lett 1991; 1: 21-26.19. Aleksander RP i wsp. Cephalosporin nitrogen mustardcarbamate prodrugs for „ADEPT”. Tetrahedron Lett1991; 32: 3269-3272.20. Vrudhala VM i wsp. Prodrugs of doxorubicin and melphalanand their activation by a monoclonal antibody–penicillin G amidase conjugate. J Med Chem 1993; 36:919-92.21. Bignami GS i wsp. N-(4’-hydroxyphenylacetyl)palytoxin:a palytoxin prodrug that can be activated by amonoclonal antibody penicillin G amidase conjugate.Cancer Res 1992; 52: 5759-5764.22. Sherwood RF. Advanced Drug delivery reviews: enzymeprodrug therapy. Adv Drug Deliv Rev 1996; 22:269-288.23. Mauger DL i wsp. Self-immolative prodrugs. Candidatesfor antibody-directed enzyme prodrug therapy inconjunction with nitroreductase enzyme. J Med Chem1994; 37: 3452-3458.24. Haisma HJ i wsp. A monoclonal antibody-βglucuronidaseconjugate as activator of the prodrug epirubicin-glucuronidefor specific treatment of cancer. BrJ Cancer 1992; 66: 474-478.25. Bosslet K, Czech J, Hoffmann D. Tumor-selective ProdrugActivation by Fusion Protein-mediated Catalysis.Cancer Res 1994; 54: 2151-215926. Bagshawe KD i wsp. Developments with targeted enzymesin cancer therapy. Curr Opin Immunol 1999; 11:579-583.27. Springer CJ i wsp. Novel prodrugs which are activatedto cytotoxic alkylating agents by carboxypeptidase G2.J Med Chem 1990; 33: 677-681.28. Frei E III i wsp. Preclinical studies and clinical correlationof the effect of alkylating dose. Cancer Res 1988;48: 6417-6423.29. Napier MP i wsp. Antibody-directed Enzyme ProdrugTherapy: Efficacy and Mechanism of Actionin Colorectal Carcinoma. Clin Cancer Res 2000; 6:765-772.30. Francis CJ i wsp. A phase I trial of antibody directedenzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advancedcolorectal carcinoma or other CEA producingtumors. Br J Cancer 2002; 87: 600-607.31. Mayer A i wsp. A phase I Study of Single Administrationof Antibody-Directed enzyme prodrug Therapywith the Recombinant Anti-Carcinoembrionic AntigenAntibody-Enzyme Fusion Protein MFECP1 and a Bis-Iodo Phenol Mustard Prodrug. Clin Cancer Res 2006;12: 6509-6516.32. Mayer A i wsp. A phase I/II trial of Antibody DirectedEnzyme Prodrug Therapy (ADEPT) with MFECP1 andZD2767P. Br J Cancer 2004; 91(Suppl 1): 8-23.33. Springer CJ, Niculescu-Duvaz I. Gene-directed enzymeprodrug therapy (GDEPT): choice of prodrugs. AdvDrug Deliv Rev 1996; 22: 351-364.34. McNeish IA i wsp. Gene directed enzyme prodrug therapyfor cancer. Adv Drug Deliv Rev 1997; 26: 173–18435. Freeman SM i wsp. The bystander effect: tumor regressionwhen a fraction of the tumor mass is geneticallymodified. Cancer Res 1993; 53: 5274-5283.36. Chen SH i wsp. Gene therapy for brain tumors: regressionof experimental gliomas by adenovirus mediatedgene transfer in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91: 3054-3057.15

Farm Przegl Nauk, 2010, 537. Mullen CA, Kilstrup M, Blaese RM. transfer of the bacterialgene for cytosine deaminase to mammalian cells conferslethal sensitivity to 5-fluorocytosine: a negative selectionsystem. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 33-37.38. Guo X i wsp. In vitro evaluation of cancer-specific NF-B-CEA enhancer–promoter system for 5-fluorouracilprodrug gene therapy in colon cancer cell lines. Br JCancer 2007; 97: 745-754.39. Chen L, Waxman DJ. Cytochrome P450 Gene-directedEnzyme Prodrug Therapy (GDEPT) for Cancer. CurrPharm Des 2002; 8: 1405-1416.40. Benouchan M i wsp. Delivery of the bacterial nitroreductasegene into endothelial cells prolongs the survivalof tumour-bearing mice by bystander mechanisms. Int JOncol 2006; 28: 457-462.41. Oosterhoff DM i wsp. Gene-directed Enzyme ProdrugTherapy for Osteosarcoma: Sensitization to CPT-11 inVitro and in Vivo by Adenoviral Delivery of a Gene EncodingSecreted Carboxylesterase-2. Mol Cancer Ther2003; 2: 765-771.42. Avendano C, Menendez CJ. Medicinal Chemistry ofAnticancer Drugs. Elsevier B.V. Oxford 2008.43. Miller CR i wsp. Intratumoral 5-fluorouracil producedby cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy iseffective for experimental human glioblastomas. CancerRes 2002; 62: 773-780.data otrzymania pracy: 15.02.2010 r.data akceptacji do druku: 31.03.2010 r.Adres do korespondencji:Andrzej StańczakZakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego UM w Łodzi,91-151 Łódź; ul. Muszyńskiego 1,tel. +48 42 677 92 52; e-mail: andrzej.stanczak@umed.lodz.pl16

Farm Przegl Nauk, 2010,5, 17-20copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Zastosowanie mikroperymetriiw diagnostyce schorzeń centralnej części siatkówkiThe diagnostics role of microperimetry in central retinal diseasesAnna Michalska, Mariola Dorecka, Dorota Romaniuk, Joanna Miniewicz-Kurkowska, Wanda RomaniukKlinika Okulistyki Katedry Okulistyki Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w KatowicachStreszczenieW pracy przedstawiono nowe metody badania czułościcentralnej części siatkówki, które pozwalają na szersządiagnostykę schorzeń plamki oraz ocenę efektów leczniczych.Celem pracy jest przedstawienie badania mikroperymetrycznego,omówienie zasady działania MikroperymetruMP-1 oraz jego zastosowania w praktyce klinicznej.Wnioski: Mikroperymetria może być cennym uzupełnieniemdiagnostyki schorzeń centralnej części siatkówki.Słowa kluczowe: perymetria, mikroperymetria, MikroperymetrMP-1, czułość centralna siatkówki, plamka, centralnaczęść siatkówkiSummaryA new method of examination of central retinal sensitivityis presented in the paper. The method allows to performmore detailed diagnoses of the macular diseases and toevaluate effects of the treatment. The aim of this study isto reveal all possibilities of using Microperimeter MP-1 inthe examination of the retinal sensitivity and its importantrole in clinical practice.Conclusion: Microperimetry examination is a very importantmethod during diagnosing of macular diseases.Key words: perimetry, microperimetry, MicroperimeterMP-1, central retinal sensitivity, macula, central retinaWstępOcena funkcji centralnej części siatkówki - plamki (dawniejnazywana plamką żółtą) jest niezmiernie ważna dlaprognozowania postępu choroby oraz oceny skutecznościleczenia.Badanie pola widzenia (perymetria) jest często stosowanepraktyce okulistycznej. Ocenia ono zdolność postrzeganiabodźców świetlnych w polu widzenia przy patrzeniuna wyznaczony punkt. Daje to możliwość precyzyjnej analizyprogu czułości siatkówki. Dane perymetryczne uzyskiwanesą podczas patrzenia badanego na punkt fiksacyjny,gdzie bodźce świetlne prezentowane są przez projektorw różnej odległości od tego punktu. Badanie to jest wiarygodnei powtarzalne dopóki pacjent utrzymuje prawidłowąfiksację [1, 2].Standardowa perymetria jest powszechnie wykorzystywanado oceny uszkodzeń siatkówki między innymiw jaskrze, ponieważ widzenie centralne jest najdłużej zachowane.U pacjentów ze schorzeniami plamki zostaje onouszkodzone jako pierwsze. Dotychczasowe badania perymetryczneuniemożliwiały wykrycie niewielkich, dyskretnychmroczków umiejscowionych w centralnym polu widzenia[1].Firma Rodenstock wprowadziła na rynek SkaningowyOftalmoskop Laserowy (SLO Scanning Laser Ophthalmoscope),który miał stanowić przełom w badaniach nad chorobamiplamki. SLO pozwalał na badanie perymetrycznez uwzględnieniem dokładnej lokalizacji mroczków, zwanemikroperymetrią. System nie posiadał automatycznej kontroliruchów oka, więc badania nie były w pełni wiarygodneze względu na ich małą powtarzalność [ 1-3].Mikroperymetr MP-1(produkt firmy Nidek Technologies)jest udoskonalonym urządzeniem do badania proguczułości centralnej części siatkówki, a więc zdolności postrzeganiabodźców. Łączy on w sobie cyfrową fotografiędna oka z mikroperymetrią komputerową umożliwiającnałożenie badania perymetrycznego na zdjęcie dna oka[1, 3-5] ( ryc.1).Celem pracy jest przedstawienie mikroperymetrii, omówieniezasady jej działania a także analiza badań i zastosowaniaw praktyce klinicznej.Metoda badaniaMikroperymetr MP-1 posiada wbudowaną czarno-białąkamerę na podczerwień stale monitorującą siatkówkę bezkonieczności rozszerzania źrenicy. Bodźce, w postaci punktuświetlnego, prezentowane są za pomocą diody ciekłokrystalicznejna wybranym obszarze badanej siatkówki. Istniejemożliwość wybrania jednego z pięciu rozmiarów bodźca(Goldmann I – V). System automatycznej kontroli ruchówoka pozwala na powtórną prezentację bodźców świetlnychw tych samych punktach badanego obszaru. Badanie rozpoczynamyod wykonania zdjęcia dna oka (Ryc.1), a następniewyboru pola odniesienia, czyli punktu orientacyjnego (ROI-17

Farm Przegl Nauk, 2010, 5region of interest). Korzystnie jest wybrać obszar bogatyw szczegóły np. naczynia siatkówki. Obraz ten jest cyfrowozapisywany i łączony z odpowiadającym mu obszarem siatkówkina ekranie. Następnie prezentowane są bodźce w różnejodległości od punktu fiksacji. Aparat dostosowuje się doruchów oka 25 razy na sekundę. Przez cały czas badania rejestrowanesą ewentualne zmiany położenia rzeczywistegoobrazu dna oka do obrazu z obranym punktem odniesienia.W razie zmiany położenia oka badanie jest automatyczniezatrzymywane do momentu uzyskania prawidłowej fiksacji.Kamera w Mikroperymetrze MP-1 umożliwia wykonaniekolorowego zdjęcia dna oka i nałożenie na nie badaniaperymetrycznego. Dzięki temu można dokładnie porównaćumiejscowienie ubytków czułości siatkówki z jej zmianamimorfologicznymi. Wyniki badania mogą być przedstawioneza pomocą symboli: wypełnione kwadraty przedstawiajądostrzeżone bodźce, a puste kwadraty bodźce niedostrzeżone.Do każdego kwadratu można dołączyć liczbę informującąo progowej wartości bodźca w dB, przy zakresie skaliod 0 (najsilniejszy bodziec) do 20 dB (najsłabszy bodziec)(ryc.2). Interpretację obrazu ułatwia kolorystyka znaków:Ryc. 1. Kolorowa fotografia dna oka uzyskana za pomocąMikroperymetru MP-1 (materiał własny).Ryc. 2. Prawidłowy wynik badania mikroperymetrycznegoplamki. We wszystkich punktach uzyskano maksymalnączułość siatkówki. Obszar badania 12 stopni (materiałwłasny).barwa zielona oznacza największą czułość siatkówki z reakcjąna najsłabszy bodziec; barwa czerwona pełnego kwadratuobrazuje reakcję na maksymalny bodziec, natomiastpustego kwadratu - oznacza brak reakcji na taki bodziec, cookreślane jest odpowiednio jako mroczek względny i bezwzględny.Mikroperymetr MP-1 daje możliwość wyboruobszaru badanego, jego zakresu jak i precyzyjnej topografiiw zależności od lokalizacji istniejącej patologii. Szablonplamkowy pozwala na wybór pola badania zawartego w 8,10, 12, 20 stopniach. W perymetrii statycznej nie ma takiejmożliwości, gdyż obszar badania jest ściśle określony.Szablon siatkówkowy Mikroperymetru MP-1 pozwala nazbadanie obszaru zawartego w 40 stopniach, podobnie jakw klasycznej perymetrii statycznej.Aparat analizuje stabilność fiksacji podczas badania.Każdy ruch oka poza punkt fiksacyjny jest rejestrowanyi obrazowany w postaci jasnoniebieskich punktów. Na koniecfiksacja jest analizowana w trzech kategoriach w zależnościod wyniku badania, może zawierać się w przedzialestabilnym, względnie stabilnym i niestabilnym [1-9].Zastosowanie Mikroperymetru MP-1w chorobach centralnej części siatkówki– plamkiW piśmiennictwie możemy znaleźć liczne doniesieniadotyczące zastosowania mikroperymetrii w chorobachplamki [5-14].Rohrschneider i wsp. [3, 4] porównywali wyniki badańprzy użyciu Mikroperymetru MP-1 z wynikami badańwykonanych SLO) u pacjentów z różnymi schorzeniamicentralnej części siatkówki. Do badań na obu aparatach wykorzystanopodobne parametry: ten sam rozmiar bodźców,ich liczbę oraz zakres strategii progowej. Uzyskane wynikibadań były porównywalne w większości przypadków, co dozakresu i głębokości ubytków. Jednak u niektórych pacjentówMikroperymetr MP-1 wykazał większe obniżenie czułościsiatkówki i zmiany w wielkości mroczka, co świadczyo jego większej czułości.Ta sama grupa badaczy przeprowadziła porównanie standardowejperymetrii Octopus 101 z Mikroperymetrem MP-1na zdrowych ochotnikach. Czułość siatkówki była mierzonapodobnymi algorytmami badań, przy użyciu podobnychwartości progowych i wielkości bodźców. Uzyskane wynikibyły porównywalne w centralnej części pola widzenia,a różnica pomiędzy aparatami wynosiła w przybliżeniu 15dB.Obszar plamy ślepej i dolna część pola widzenia wykazała znaczneróżnice znamienne statystycznie zawierające się w przedzialeod 11,4 dB do 18,3 dB w zależności od umiejscowienia bodźca.Zastosowanie Mikroperymetru MP-1 wydłużało czas badania,ale dawało możliwość oceny stabilności fiksacji [2].Yamike i wsp. [7] badali czułość okolicy plamki i jej grubośću pacjentów w przebiegu obrzęku plamki po zakrzepieżyły centralnej siatkówki. Mikroperymetria była wykonanaw zakresie 20 stopni okolicy plamki. Grubość siatkówkimierzona była za pomocą OCT (Optical Coherence Tomography).Uzyskane wyniki potwierdziły korelację pomiędzyzwiększoną grubością siatkówki a obniżeniem jej czułości.W miejscu obrzęku plamki czułość była znacznie obniżona,a głębokość ubytków wzrastała wraz z grubością plamki.18

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Inna grupa badaczy oceniała czułość siatkówki MikroperymetremMP-1 u pacjentów z centralną retinopatią surowiczą( CSC, Central Serous Chorioretinopathy ). W grupie21 osób (21 oczu) z CSC wykonano badanie mikroperymetryczneokolicy plamki w zakresie 10 stopni, oraz wykonanobadanie OCT tej okolicy. Badanie OCT uwidoczniło zmianyw budowie siatkówki, w zakresie warstwy barwnikowejoraz połączeń warstwy wewnętrznej i zewnętrznej fotoreceptorówgłównie w okolicy plamki. W badaniu czułościsiatkówki wykazano wartości prawidłowe w miejscach nieobjętychprocesem chorobowym, w pozostałej części doszłodo obniżenia czułości. Autorzy stwierdzili, że w oczachz CSC zmiany w morfologii siatkówki znajdują swoje odzwierciedleniew mapie jej czułości [8].Badanie centralnej czułości siatkówki może być pomocnew ocenie skuteczności zastosowanego leczenia. W piśmiennictwiemożemy znaleźć doniesienia na temat oceny czułościplamki u pacjentów przed i po terapii fotodynamicznejw przebiegu chorób neowaskularyzacyjnych naczyniówkiokolicy podplamkowej [6]. W prezentowanej pracy autorzybadali pacjentów Mikroperymetrem MP-1 przed terapiąfotodynamiczną, następnie jeden, trzy i sześć miesięcy pozabiegu. Badano obszar 10 stopni okolicy plamki. Po miesiącuod zastosowanego leczenia uzyskano znaczącą poprawęw zakresie czułości siatkówki u wszystkich pacjentów,a u większości stwierdzono nieznaczną poprawę ostrościwzroku. W kolejnych badaniach po trzech i sześciu miesiącachnie uzyskano aż tak znaczącego wzrostu czułościw centralnej części siatkówki oraz poprawy ostrości wzroku[6].Mikroperymetria znalazła zastosowanie w ocenie skutecznośćterapii po iniekcjach doszklistkowych anty-VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) u osób z neowaskularyzacjąnaczyniówkową (CNV, Choroidal Neovascularisation)[10]. Badacze porównywali czułość okolicy plamkiprzed i po podaniu iniekcji za pomocą MikroperymetruMP-1. Badanie przeprowadzono na 21 oczach z CNV przedterapią oraz jeden i sześć miesięcy po zastosowanym leczeniu.Średnia czułość siatkówki w 10 stopniowym polu badaniauległa poprawie z 4,8+/- 2,8 dB na 6,5+/- 3,2 dB po miesiącu,oraz na 7,4+/- 4,4 dB po sześciu miesiącach. W badaniuliczba mierzonych punktów z mroczkami względnymizmalała znacząco, a mroczki bezwzględne uległy redukcjiw 15 oczach po sześciu miesiącach. Wraz z wzrostem czułościsiatkówki zauważono poprawę ostrości wzroku. Powyższewyniki według autorów dowodzą, że po iniekcjachdoszklistkowych anty-VEGF dochodzi do poprawy czułościsiatkówki w okolicy plamki, jednak w niektórych oczachmoże dojść do powiększenia mroczków po leczeniu.Greenstein i wsp. [11] oceniali za pomocą MiroperymetruMP-1 lokalizację i stabilność fiksacji oraz centralną czułośćsiatkówki u pacjentów z różnymi schorzeniami plamki.W badaniu wzięło udział 15 osób ze starczym zwyrodnieniemplamki, chorobą Besta, chorobą Stargardta i innymi.Rozpoznania potwierdzone były w badaniu angiografii fluoresceinowej.Badanie wykazało u 4 osób fiksację plamkową,u pozostałych fiksacja była ekscentryczna. Badanie czułościplamki wykazało korelację pomiędzy obszarami hypofluorescencjiw angiografii fluoresceinowej a obniżeniem czułościsiatkówki. Wnioskują więc, że mikroperymeria to badanieo dużej użyteczności w ocenie powiązań pomiędzy zaburzeniamimorfologicznymi siatkówki a funkcją widzenia.DyskusjaBadanie czułości centralnej siatkówki za pomocą mikroperymetriistanowi bardzo cenną metodę diagnostyki schorzeńcentralnej części siatkówki. Badanie to ma znacznąprzewagę nad standardowo stosowanymi metodami ocenyczułości siatkówki dzięki licznym funkcjom dodatkowym.System kontroli ruchów oka podczas badania, kontrola fiksacji,wybór i zakres obszaru badania pozwalają na dokładniejszeprzeprowadzenie badania. Z analizy piśmiennictwawynika, że badanie mikroperymetryczne ma znaczną przewagęnad innymi metodami badania pola widzenia. MikroperymetrMP-1 dokładniej analizuje czułość wybranego obszarusiatkówki, dzięki powtarzalności bodźców oraz gwa-Ryc. 3. Wynik badania mikroperymetrycznego u pacjentaz otworem w plamce. Obszar badania obejmuje 8 stopniokolicy plamki. W miejscu otworu widoczne mroczki bezwzględne– puste kwadraty. Na obszarze wokół obniżenieczułości siatkówki – kolor pomarańczowy i żółty, pojedynczeobszary prawidłowej czułości – kolor zielony (materiałwłasny).Ryc. 4. Kolorowe zdjęcie dna oka z nałożonym badaniemmikroperymetrycznym u tego samego pacjenta z otworemw plamce (materiał własny).19

Farm Przegl Nauk, 2010,5, 21-27copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Czy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcegodla porównania jego aktywności metabolicznej z aktywnościąludzkiego cytochromu P450 w badaniach in vivo lub in vitro?Część II – nadziejeIs there an animal model for a human cytochrome P450 activityin in vivo and in vitro investigations? Part II – expectationsAndrzej PlewkaZakład Proteomiki,Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachStreszczenieJednym z celów wielu badań było scharakteryzowanieaktywności wielu izoenzymów cytochromu P450 u wielugatunków zwierząt w celu znalezienia praktycznegosposobu porównania tego ważnego etapu metabolicznegopomiędzy zwierzętami testowymi a człowiekiem. Porównujesię w tym celu parametry kinetyczne enzymówi ich aktywności oraz profile inhibicji uzyskane u różnychgatunków zwierząt z danymi otrzymanymi z badań wątrobyludzkiej w celu znalezienia gatunku zwierzęcia najbardziejzbliżonego do człowieka pod względem aktywności różnychaktywności enzymatycznych izoform cytochromu P450.W tym celu oznacza się in vitro wątrobową aktywność związanąz izoformami cytochromu P450 dla wielu substancji takich,jak O-deetylacja fenacetyny, 7-hydroksylacja kumaryny,hydroksylacja tolbutamidu, 4’-hydroksylacja S-mefenytoiny,O-demetylacja dekstrometorfanu, 6-hydroksylacja chlorzoksazonuczy 6 β-hydroksylacja testosteronu a także badawpływ selektywnych inhibitorów izoform cytochromu P450na aktywność enzymów w mikrosomach wątroby różnychzwierząt. Stwierdzono, że praktycznie żadne z badanych gatunkówzwierząt nie było podobne do człowieka we wszystkichbadanych aktywnościach enzymatycznych izoformcytochromu P450. U każdego z gatunków jedynie kilka spośródaktywności CYP może być rozważane jako porównywalnedo człowieka.AbstractIt was the aim of many investigations to characterize theactivity of the izoenzymes cytochome P450 at differentanimal species in order to find practical way of the comparisonof this important metabolic stage among testedanimals and human. To achive this one compare kineticparameters of enzymes and their activities as well as inhibitionprofile recived at different species with datas recivedfrom researchs of human liver. In vitro, in humanand animal liver were estimated cytochromes P450 izoenzymedependent activities for different drugs: phenacetinO-deethylase, coumarin 7-hydroxylase, tolbutamide hydroxylase,S-mephenytoin 4’- hydroxylase, dextromethorphanO-demetylase, chlorzoxazone 6- hydroxylase andtestosterone 6 β- hydroxylase and was investigated effectof specific inhibitors. Today we know no animals speciesin which xenobiotic metabolizm is similar to human (in allinvestigated activities), in every species only some CYPactivities are comparable with human.Key words: animals species, human, enzyme activities,kinetic parameters, inhibition, cytochrome P450, CYPSłowa kluczowe: gatunek zwierząt, człowiek, aktywnośćenzymatyczna, parametry kinetyczne, inhibicja, cytochromP450, CYPAktywności enzymatycznei parametry kinetyczneUżywanie związków chemicznych jako inhibitorówprzynosi wiele korzyści w związku z łatwością użycia i powszechnądostępnością. Główną wadą tego postępowaniajest konieczność ustalenia właściwych warunków doświadczeniaw celu zapewnienia selektywności inhibicji tylko dlajednej izoformy cytochromy P450. Dla przykładu, wykazano,że ketokonazol, bardzo silny inhibitor CYP3A4, użytyw wysokim stężeniu może również hamować aktywnośćkatalityczną innych izoform cytochromu P450 [1].21

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Właśnie dlatego jednym z celów tej pracy jest scharakteryzowanieaktywności wielu izoenzymów cytochromuP450 u wielu gatunków zwierząt w celu znalezieniapraktycznego sposobu porównania tego ważnego etapumetabolicznego pomiędzy zwierzętami testowymi a człowiekiem.Po pierwsze, aktywności enzymatyczne i parametrykinetyczne zostały określone z użyciem takichsubstratów, jak 7-etoksyrezorufina, kumaryna, 7-etoksy-4-triflurometylokumaryna, diklofenak, S-mefenytoina, bufuralol,chlorzoksazon, testosteron, kwas laurynowy i inne,w mikrosomach wątroby myszy, szczura, królika, psa,świnki morskiej i miniaturowej, małpy, kota, psa, koniaoraz człowieka. Użyte ksenobiotyki są dobrze znanymisubstratami markerowymi dla ludzkich izoenzymów cytochromP450. Po drugie, określono profile inhibicji z użyciemprzeciwciał skierowanych do różnych izoenzymówcytochromu P450 oraz inhibitorów chemicznych takich,jak α-naftoflawon, furafilina, pilocarpina, sulfafenazol, chinidyna,chinina, dietyloditiokarbaminian czy ketokonazol.W ten sposób stwarzamy nadzieję, że kolejne badania dostarcząwiele nowych informacji na temat międzygatunkowegometabolizmu porównawczego. Porównuje się w tymcelu parametry kinetyczne enzymów, aktywności enzymóworaz profile inhibicji uzyskane u różnych gatunków zwierzątz danymi otrzymanymi z badań mikrosomów wątroby ludzkiejw celu znalezienia gatunku najbardziej zbliżonego doczłowieka pod względem aktywności różnych aktywnościenzymatycznych cytochromu P450.Do tej pory nie do końca wiadomo, które izoenzymyP450 odgrywają wiodącą rolę w metabolizmie lekóww wątrobie rzadko wykorzystywanych w tym celu zwierząt,takich jak małpa, świnia, koń, pies czy kot, mimo iżstwierdzono u nich obecność wielu izoform cytochromuP450. W grupie zwierząt domowych najlepiej poznanometabolizm leków u psa ze względu na to, iż stanowi onwzorcowy model zwierzęcy w badaniach przedklinicznychi analizach toksyczności. Jak dotąd u psa określonoaktywności katalityczne izoform z użyciem określonychsond dla CYP1A1/1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 i 3A4 [2, 3].Charakterystyka sekwencji aminokwasowych niektórychcytochromów P450 wykazała i potwierdziła, iż CYP należącedo podrodzin P450 1A, P450 2C, P450 3A i P450 2Dwystępują u psa [3-6].Dane na temat aktywności enzymatycznych izoform cytochromuP450 u konia i kota są bardzo fragmentaryczne.Jednak już na początku lat siedemdziesiątych ubiegłego wiekuYeary i Gerken [7] przedstawili krótkie doniesienie na tematbiotransformacji niektórych substancji w mikrosomachwątrobowych konia, a w kilka lat później Martmez-Zedilloi wsp. [8] opublikowali badania dotyczące metabolizmu invitro po traktowaniu parationem u tego samego zwierzęcia.Dopiero dwie dekady później Komori i wsp. [9] sporządzilicharakterystykę P450 mikrosomów wątroby konia, izolującbiałka należące do podrodzin cytochromu P450. Był to okresbadań nad cytochromem P450, kiedy to izolowano i oczyszczanoróżne jego izoformy u wielu gatunków zwierząt.Z tego okresu pochodzą pierwsze dane na temat metabolizmuleków u kotów, które można znaleźć w międzygatunkowym(w tym między innymi, chomik, małpa, królik mysz,szczur i oczywiście człowiek) badaniu dotyczącym substratówCYP2A i 3A [10-13]. Pomimo upływu wielu lat, prawdopodobnieżadna izoforma cytochromu P450 nie zostaławyizolowana i w pełni scharakteryzowana u kota.Dopóki pełna charakterystyka katalitycznych sondi chemicznych inhibitorów dotyczy wyłącznie organizmuludzkiego [14, 15] oraz szczura, myszy i królika i dopókinadal tak mało wiemy na temat metabolizmu ksenobiotykówzwiązanego z cytochromem P450 u takich zwierząt,jak koń, kot, świnka morska, małpa i w pewnym stopniupies, dopóty będzie zasadne używanie tych narzędziw celu głębszego poznania procesów I fazy biotransformacjiu wyżej wymienionych zwierząt. W tym celu oznacza sięin vitro wątrobową aktywność związaną z izoformami cytochromuP450 dla wielu substancji takich, jak O-deetylacjafenacetyny, 7-hydroksylacja kumaryny, hydroksylacja tolbutamidu,4’-hydroksylacja S-mefenytoiny, O-demetylacjadekstrometorfanu, 6-hydroksylacja chlorzoksazonu czy6β-hydroksylacja testosteronu a także bada wpływ selektywnychinhibitorów izoform cytochromu P450 na aktywnośćenzymów w mikrosomach wątroby nie tylko człowieka, aleteż takich zwierząt jak małpa, koń, pies, kot i inne.Cytochrom P450 u człowieka i innych ssakówNadrodzina cytochromu P450 bierze udział w wielu reakcjachoksydacji i często odgrywa decydującą rolę w metabolizmiei ocenie kinetyki ksenobiotyków. Modele zwierzęcesą używane do przewidywania kinetyki i toksycznościu człowieka. Międzygatunkowe porównanie napotyka jednakna dwie zasadnicze trudności. Po pierwsze, w narządachczłowieka istnieją duże wewnątrzpopulacyjne wariacje pomiędzyposzczególnymi izoformami CYP, jako konsekwencjaróżnic fenotypowych na skutek polimorfizmu genetycznego.Po drugie, pomimo, że izoformy cytochromu P450są zaklasyfikowane do odrębnych podrodzin na podstawiepodobieństwa w sekwencji aminokwasów, to wysoki stopieńpodobieństwa sekwencji nie oznacza automatyczniepodobnej specyficzności katalitycznej. Nawet pojedynczasubstytucja aminokwasów może spowodować zmianęspecyficzności substratu. Dlatego ortologiczne geny i/lubenzymy nie pozwalają automatycznie na porównanie specyficznościkatalitycznej pomiędzy gatunkami. W dodatkubardzo różne izoenzymy CYP mogą katalizować te sameaktywności.W związku z ekstrapolacją gatunek-gatunek, ważna jestwiedza na temat, które podobieństwa lub różnice istniejąpomiędzy izoenzymami i podrodzinami cytochromu P450,jak również poziomami ich ekspresji. U ludzi najważniejszeizoenzymy podrodzin CYP, które biorą udział w metabolizmieksenobiotyków i związków endogennych to CYP:1A1, 2A6, 2B6, 2C9, 2D6, 2E1 i 3A4, ze względu na ichznaczący udział w całkowitym wątrobowym stężeniu cytochromuP450, który wynosi odpowiednio 13, 4, 1, 8, 15, 16i 30%. U zwierząt poziomy powiązanych aktywności izoenzymówokreślonych podrodzin mogą być bardzo różne.Na przykład aktywności 7-hydroksylazy kumaryny u ludzisą do 200 razy wyższe niż u szczura. Odnośnie aktywnościCYP3A u szczurów opisano różnice pod względem płci,gdzie osobniki męskie mają 5-10 razy wyższą aktywnośćniż żeńskie, podczas gdy podobne aktywności CYP3A ob-22

CYPSubstraty endogenneKsenobiotykiaktywującecopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tab. IA. Niektóre wybrane cechy charakterystyczne izoform cytochromu P450 u człowieka (zmodyfikowane na podstawie[20, 46, 47])1A11A21B16β-Hydroksylacjatestosteronu, ω-2 oksydacjaprostaglandyn,C-2-hydroksylacja17β-estradiolu6β-Hydroksylacjatestosteronu,C2‐hydroksylacja17β-estradiolu6β-, 16α-Hydroksylacjatestosteronu,C4‐hydroksylacja17β-estradiolu2A6 -2B616α-,16β-, 17-Hydroksylacja testosteronuPolicyklicznewęglowodoryaromatyczne,benzo[a]pirenAcetaminofen,2-AAF,aflatoksyna B1Aminyheterocykliczne,areny arylowe,nitroarenyAflatoksyna B1,nikotyna, benzo[a]piren, N-nitrozodietyloamina,NNKStyren,cyklofosfamid,6‐aminochryzen,ifosfamid,azobenzen2C8 - -Ksenobiotykimetabolizowane7-Etoksykumaryna,7‐etoksyrezorufina,8‐hydroksylacjaR-warfaryny7‐Etoksyrezorufina,kaffeina, fenacetyna,6‐hydroksylacjaR-warfaryny,imipraminaInduktor(y)3-MC, BNF,TCDD,dym tytoniowy,omeprazol,3-MC, BNF,TCDD,dym tytoniowy,omeprazolInhibitor(y)7,8-Benzoflawon,apigenina,α‐naftoflawonFurafilina,izosafrol, 7,8-benzoflawon,apigenina7‐Etoksyrezorufina - -1,3-Butadien,kumarynaBenzofetamina,diazepam,pentoksyrezorufina,fenantren,benzyloksyrezorufinaFenytoina, retinol,kwas retinowy,tolbutamid,4-hydroksylacjaS-mefenytoiny-FenobarbitalRifampicynaKumaryna,metoksalen,8-metoksypsoralenα-Naftoflawon,metyraponSulfafenazolserwowano u ludzi i samców szczurzych. Dlatego, aby przewidziećkinetykę i toksyczność u ludzi, różnice gatunkowepomiędzy izoenzymami CYP powinny być wzięte po uwagępodczas selekcji zwierząt do badań in vitro i in vivo.Tylko w części badań podawane są informacje na temat,u których gatunków badano różnice odnośnie aktywnościizoenzymów cytochromu P450. W części tych badań zaledwiedwa lub trzy gatunki zwierząt były poddane badaniuporównawczemu, a w innych badano tylko jeden lub dwasubstraty. Ponadto, nie zawsze były używane najbardziej powszechnesubstraty dla izoform cytochromu P450. Dlategoteż podane różnice międzygatunkowe odnośnie aktywnościizoenzymów CYP wydają się być fragmentaryczne.Celem tego opracowania jest podkreślenie roli znaczącychizoform cytochromu P450 u ssaków ze zwróceniemuwagi na ich ekspresję, indukcyjność, charakter inhibicji,preferencje substratowe, szczególnie analizując te informacjew ujęciu toksykologii ludzi. Ze względu na ograniczonemożliwości pracy nie jest możliwe podanie całej odnoszącejsię do tematu literatury, dlatego czytelnik będzie musiał sięodwołać do innych prac zawierających bardziej szczegółoweinformacje [16-22]. Informacje z tych i innych publikacjizostały użyte, jako materiał źródłowy i zgromadzone wtabeli I, podsumowując niektóre z ważniejszych cech kilkuzwiązanych ze sobą izoform cytochromów P450.Aktywność metabolicznaCelem jednej z unikalnych prac w tym zakresie byłoscharakteryzowanie aktywności dziewięciu izoform cytochromuP450 u siedmiu gatunków zwierząt, w celu porównaniatego ważnego etapu metabolicznego pomiędzy różnymibadanymi w laboratoriach zwierząt a człowiekiem [21].Aktywności enzymów i parametry kinetyczne były w wielubadaniach oznaczane w stosunku do dobrze znanych substratówmarkerowych dla izoenzymów ludzkiego cytochromuP450. Skoro wiemy, że różne izoenzymy cytochromuP450 mogą katalizować tą samą aktywność [23], dodatkoweinformacje są konieczne, aby ustalić gatunki zwierząt najbardziejzbliżone do człowieka pod względem aktywnościenzymów cytochromu P450. Dlatego też, profile inhibicjizostały ocenione dla szerokiego zakresu zarówno przeciwciałjak i inhibitorów chemicznych. Im bliższy będzie profilinhibicji u danego gatunku zwierzęcia w porównaniu doczłowieka, tym samym bliższa będzie specyficzność katalitycznacytochromu P450 tego gatunku. Zarówno parametrykinetyczne enzymów, jak i aktywności enzymatyczne lubpoziomy ich ekspresji, jak i profile inhibicji (katalitycznespecyficzności) były użyte do postawienia prognozy w odniesieniudo gatunków zwierząt najbardziej podobnych doludzkich. Ponadto, musimy wziąć pod uwagę, że u ludzi23

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Tabela IB. Niektóre wybrane cechy charakterystyczne izoform cytochromu P450 u człowieka – ciąg dalszy (na podstawie[20, 46, 47])CYPSubstratyendogenneKsenobiotykiaktywujące2C9 - -2C18 - -2C19 - -2D6 - NNK2E13A44A9/11Alkohole,nitrozoaminy6β-Hydroksylacjatestosteronu,6β‐hydroksylacjaprogesteronu,2‐hydroksylacja17β-estradioluβ-Oksydacja iω-hydroksylacjakwasówtłuszczowychAcetaminofen,benzen,akrylonitryl,chloroform,styren,nitrozoaminyAcetaminofen,aflatoksynaB1, benzo[a]piren, ifosfamid,cyklofosfamid-KsenobiotykimetabolizowaneChloramfenikol,ibuprofen, fenytoina,diklofenak, heksobarbital,4-hydroksylacjaS-mefenytoiny, naproksenN-Demetylacja diazepamu,4-hydroksylacjaS-mefenytoiny,p-hydroksylacja fenytoinyDiazepam, omeprazol,heksobarbital,N-demetylacja imipraminy,4-hydroksylacjaS-mefenytoinyKodeina, sparteina,amitryptylina, bufarolol,imipramina, sparteina,dekstrometorfanAcetaminofen, enfluran,halotan, akrylonitryl,izoniazyd, chlorzoksazon,p-nitrofenol, etanolAntypiryna, DEX, chinina,diazepam, erytromycyna,nifedypina, cyklosporyna AC12-Hydroksylacja kwasulaurynowegoInduktor(y)RifampicynaInhibitor(y)Sulfafenazol, warfarynaRifampicyna -Rifampicyna-Alkohol,aceton, pirazol,izoniazyd,głodzenie,Fenobarbital,DEX,karbamazepina,fenytoina,rifampicyna,erytromycynaSulfafenazol, omeprazol,tranylcypraminaChinidyna, chinina,paroksentynaDisulfiram,4‐metylopirazol,dietyloditiokarbaminianTroleandomycyna, TAO,ketokonazol- Estry ftalowe, ciprofibratróżne poziomy izoform cytochromu P450 pokazują szerokizakres aktywności spowodowanych osobniczą zmiennościąi/lub polimorfizmem genetycznym [24, 25]. Szerzej do tegoproblemu wrócimy w części trzeciej tego opracowania.W kilku badaniach zajmowano się różnicami gatunkowymiw ocenie aktywności enzymatycznych izoenzymówcytochromu P450 [np. 26-34]. Ogólnie rzecz biorąc wynikiopisane w tych badaniach są podobne bez względu na to,z jakiego laboratorium pochodziły. Jednakże, obserwowanopewne różnice, np. w odniesieniu do metabolizmu tolbutamidui inhibicji aktywności hydroksylacji tego związku[21], w porównaniu do metabolizmu diklofenaku. Odmiennewyniki uzyskał Eagling i wsp. [33], którzy badaliuruchamianą przez szereg substancji, inhibicję aktywności4-hydroksylazy tolbutamidu, w reakcji katalizowanej przezCYP2C9 z mikrosomów wątroby człowieka i szczura. Furafilina,inhibitor ludzkiego CYP1A2, nie powodowała inhibicjiaktywności 4-hydroksylazy tolbutamidu w mikrosomachwątroby ludzkiej, a w mikrosomach wątroby szczurahamowanie ujawniało się dopiero przy wysokich stężeniachinhibitora. W laboratorium Bogaardsa i wsp. [21], diklofenakzostał użyty, jako substrat dla CYP2C9. Używająctego substratu nie stwierdzono inhibicji wywołanej przezfurafilinę w mikrosomach wątroby szczura. Dlatego teżdiklofenak może być lepszym substratem niż tolbutamiddla białek homologicznych z CYP2C9 u szczura. Shareri wsp. [26] porównali aktywność 4-hydroksylazy tolbutamiduu ludzi z mikrosomami małpy oraz psa rasy beagle.U psa nie stwierdzili oznaczalnej aktywności 4-hydroksylazytolbutamidu. Jednakże, w przeciwieństwie do metabolizmutolbutamidu, została u tego gatunku stwierdzona aktywność4-hydroksylazy diklofenaku. Chociaż Sharer i wsp. [26]stwierdzili podobną wartość V maxu ludzi i małp, co potwierdzająwyniki laboratorium Bogaardsa i wsp. [21], to K mdlametabolizmu tolbutamidu u małpy okazało się 4-krotniewyższe niż w ludzkich mikrosomach. W przypadku metabolizmudiklofenaku zostało stwierdzone 25-35krotnie wyższeK m, wskazując na znacznie większe powinowactwo ludzkiegoCYP2C9 w stosunku do diklofenaku niż białka związanez CYP2C9 u małpy w stosunku do tolbutamidu.24

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073W laboratorium Chauret i wsp. [19] nie stwierdzono znamiennychstatystycznie różnic w aktywności O-deetylazyfenacetyny u człowieka, psa, kota i konia. Również Shareri wsp. [26] nie zaobserwowali znamiennych rozbieżnościw aktywności innego markera katalitycznego dla ludzkiegoCYP1A1/2 tj., O-deetylazy etoksyrezorufiny w mikrosomachczłowieka i psa. Zmienność uzyskanych wyników dlaczłowieka obserwowana w badanych aktywnościach u człowiekajest ogromna, aczkolwiek zgodna z innymi danymipochodzącymi z innych laboratoriów [35, 36]. Przyczyna ażtak dużej zmienności może wynikać na przykład z ekspozycjiczęści osobników na induktory CYP1A1/1A2 [36, 37].Innym czynnikiem, który w tym przypadku powinien byćbrany pod uwagę jest polimorfizm genetyczny. Genetycznazmienność w obrębie ludzkich izoform cytochromów P450została już dobrze udokumentowana a warianty alleli dla genówcytochromów P450 zostały też zidentyfikowane. Wielez tych genetycznych wariantów charakteryzowało się substytucjamiw regionach niekodujących odpowiednich genów,np. w obrębie intronów lub regionów flankujących. Ponadto,warianty genetyczne określające precyzyjnie charakter funkcjonalnyi strukturalny zostały również scharakteryzowanew obrębie danej populacji. Względne częstości występowaniaodpowiednich alleli często różnią się w zależności od regionuetnicznego. Genetycznie zaprogramowane różnice w profiluekspresji cytochromu P450 prawdopodobnie prezentują ważnądeterminantę ryzyka chemicznej toksyczności.U człowieka zaobserwowano znamiennie większą aktywność7-hydroksylazy kumaryny w porównaniu z kotem(8-krotna), psem (6-krotna) i koniem (4-krotna), podczasgdy pomiędzy innymi gatunkami nie wykazano znamiennychróżnic. W laboratorium Chauret i wsp. [19] aktywność7-hydroksylazy kumaryny w mikrosomach wątroby psai człowieka była analogiczna do obserwacji Sharera i wsp.[26]. Pearce i wsp. [27] podali, iż wskaźnik aktywności7-hydroksylazy kumaryny układa się w szeregu człowiek> pies > kot, co pokrywa się z innymi wynikami [19, 21].W laboratorium Chauret i wsp. [19] u konia stwierdzonoznamiennie wyższą aktywność hydroksylazy tolbutamiduniż u kota (34-krotnie), psa (10-krotnie) i człowieka(2-krotnie). U człowieka zaobserwowano 20-krotnie znamienniewyższą aktywność tej hydroksylazy niż u kotai 6-krotnie wyższą u psa, podczas gdy nie stwierdzono znamiennychróżnic między psem i kotem. Aktywność hydroksylazytolbutamidu obserwowana w laboratorium Chaureti wsp. [19] w ludzkich mikrosomach wątrobowych była analogicznado obserwowanej przez innych badaczy [26, 38].W tym samym laboratorium [19] zanotowano niskie lubniewykrywalne ilości aktywności hydroksylazy tolbutamiduw inkubatach mikrosomów psa, co potwierdzono w badaniachSharera i wsp. [26].Nie zaobserwowano znamiennych różnic w aktywności4’-hydroksylazy S-mefenytoiny wśród wielu badanychgatunków zwierząt. Yasumori i wsp. [39] odnotowali różnicegatunkowe w stereoselektywnym metabolizmie mefenytoinyz udziałem CYP2C. Na przykład, u człowiekajest 17-krotnie większa preferencja dla 4’-hydroksylacjiS-mefenytoiny, podczas gdy u psa 3-krotnie większa preferencjadla 4’-hydroksylacji R-mefenytoiny. W laboratoriumChauret i wsp. [19] badano wyłącznie metabolizmS-mefenytoiny, a uzyskane przez nich wyniki dla psa i człowiekabyły zgodne z podawanymi przez Sharera i wsp. [26].Zaobserwowano też dużą zmienność u człowieka, co obserwowanojuż wcześniej przez innych i zapewne wynika toz faktu, iż CYPC19 jest polimorficzny [40].Odnośnie aktywności O-demetylazy dekstrometorfanu,zdecydowanie największą aktywność ze wszystkich gatunkówzwierząt domowych zanotowano u konia. Przewyższałaona 22-krotnie poziom obserwowany u człowieka,52-krotnie u psa i 24-krotnie u kota. Poziom aktywności tejdemetylazy zmierzony w ludzkich mikrosomach Chaureti wsp. [19] był zgodny z wcześniej odnotowanymi wartościamidla tej izoformy [38].U konia występuje znamiennie wyższa aktywność6-hydroksylazy chlorzoksazonu w stosunku do człowieka,kota i psa, ale nie zaobserwowano znamiennych różnic tegomarkera CYP2E1 między psem, kotem i człowiekiem [19].Sharer i wsp. [26] również nie znaleźli znamiennych różnicmiędzy człowiekiem i psem używając innego markeraCYP2E1, tj. N-demetylazy N-nitrozodimetylaminy.W ludzkich inkubatach mikrosomalnych była 7-krotniewyższa aktywność 6β-hydroksylazy testosteronu niż u konia,kota i psa [19]. Odmienne wyniki przedstawili Shareri wsp. [26]. W badaniach zespołu Chauret i wsp. [19] mikrosomypsa wykazały znamiennie wyższe niż u człowiekaaktywności dwóch markerów katalitycznych dla CYP3A,tj. aktywność l'-hydroksylazy midazolamu i N-demetylazyerytromycyny. Z drugiej strony, autorzy innych laboratoriówdonoszą [41, 42], iż niektóre aktywności związanez CYP3A4 zarówno u psa jak i kota w porównaniu z odpowiednimiwartościami u człowieka są mniejsze, co pokrywasię z badaniami zespołu Chauret i wsp. [19]. Niwa i wsp.[43] podają, że wskaźnik tworzenia 6β-hydroksytestosteronuu psa wynosi 0.59 nmol/(mg-min), czyli więcej niż w laboratoriumChauret i wsp. [19], podczas gdy Komori i wsp. [44]uzyskali aktywność 0.24 nmol/(mg-min) w mikrosomach konia,co jest zgodne z wynikami laboratoriom Chauret [19].Generalnie rzecz biorąc, żaden z badanych gatunkówzwierząt domowych i doświadczalnych nie wykazywałwzmożonej aktywności metabolicznej dla badanych substancji,mimo iż u konia obserwowano raczej znamienniewyższe aktywności niż u pozostałych gatunków zwierząt.U człowieka i konia zaobserwowano większą zmiennośćaktywności metabolicznej niż u psa i kota. Wynika to z faktu,iż badania u ludzi i konia przeprowadzono na populacjigeneralnej, natomiast psy i koty pochodziły z laboratoryjnychszczepów wsobnych. Z tego powodu wśród zwierzątlaboratoryjnych były mniejsze różnice genetyczne. Także takiesamo środowisko i dieta, eliminujące niektóre czynniki,mogły przyczynić się do odmiennej indukcji niektórych izoformcytochromu P450 [45]. Gdyby niniejsze badanie przeprowadzićna psach i kotach z populacji generalnej, można byoczekiwać większej zmienności danych metabolicznych.Piśmiennictwo1. Newton DJ, Wang RW, Lu AYH. Cytochrome P450 inhibitors:evaluation of specificities in the in vitro metabolismof therapeutic agents by human liver microsomes.Drug Metab Dispos 1995; 23: 154-158.25

Farm Przegl Nauk, 2010, 52. Sharer JE i wsp. Comparisons of phase I and phase IIin vitro hepatic enzyme activities of human, dog, rhesusmonkey, and cynomolgus monkey. Drug Metab Dispos1995; 23: 1231-1241.3. Nakamura A i wsp. Purification and characterization of adog cytochrome P450 isozyme belonging to the CYP2Dsubfamily and development of its antipeptide antibody.Drug Metab Dispos 1995; 23: 1268-1273.4. Uchida T i wsp. Isolation of cDNAs coding for threedifferent forms of liver microsomal cytochrome P-450from polychlorinated biphenyl-treated beagle dogs. MolPharmacol 1990; 38: 644-651.5. Shiraga i wsp. Isolation and characterization of four cytochromesP450 isozymes from untreated and phenobarbital-treatedbeagle dogs. Biol Pharm Bull 1994; 17: 22-28.6. Lamba JK i wsp. Genetic contribution to variable humanCYP3A-mediated metabolism. Adv Drug DelivRev 2002; 54: 1271-1294.7. Yeary RA, Gerken D. Hepatic drug metabolism in vitroin the horse. Biochem Pharmacol 1971; 20: 3219-3221.8. Martmez-Zedillo G i wsp. Cytochrome P-450 and parathionmetabolism in the fetal and adult gonads of thehorse. Life Sci 1979; 25: 327-332.9. Komori M i wsp. Purification and characterization of aform of P450 from horse liver microsomes. J Biochem1993; 114: 445-448.10. Pearce R, Greenway D, Parkinson A. Species differencesand interindividual variation in liver microsomalcytochrome P450 2A enzymes: effects on coumarin,dicumarol, and testosterone oxidation. Arch BiochemBiophys 1992; 298: 211-225.11. Miyazawa M, Sugie A, Shimada T. Roles of human CY-P2A6 and 2B6 and rat CYP2C11 and 2B1 in the 10-hydroxylation of (-)-verbenone by liver microsomes.Drug Metab Dispos 2003; 31: 1049-1053.12. Voorman RL i wsp. Metabolism of delavirdine, a humanimmunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase inhibitor,by microsomal cytochrome P450 in humans, rats,and other species: probable involvement of CYP2D6 andCYP3A. Drug Metab Dispos 1998; 26: 631-639.13. Miyazawa M, Shindo M, Shimada T. Roles of cytochromeP450 3A enzymes in the 2-hydroxylation of 1,4-cineole, a monoterpene cyclic ether, by rat and humanliver microsomes. Xenobiotica 2001; 31: 713-723.14. Guengerich FP. Characterization of human cytochromeP450 enzymes. FASEB J 1992; 6: 745-748.15. Wrighton SA i wsp. In vitro methods for assessing humanhepatic drug metabolism: their use in drug development.Drug Metab Rev 1993; 25: 453-484.16. Dogra SC, Whitelaw ML, May BK. Transcriptionalactivation of cytochrome P450 genes by different classesof chemical inducers. Clin Exp Pharmacol Physiol1998; 25: 1-9.17. Pelkonen O, Raunio H. Metabolic activation of toxins: Tissue-specificexpression and metabolism in target organs.Environ Health Perspect 1997; 105(suppl.4): 767-774.18. Rendic S, Di-Carlo FJ. Human cytochrome P450 enzymes:A status report summarizing their reactions, substrates,inducers, and inhibitors. Drug Metab Rev 1997;29: 413-580.19. Chauret N i wsp. In vitro comparison of cytochromeP450-mediated metabolic activities in human, dog, cat,and horse. Drug Metab Dispos 1997; 25: 1130-1136.20. Omiecinski CJ, Remmel RP, Hosagrahara VP. Concisereview of the cytochrome P450s and their roles in toxicology.Toxicol Sci 1999; 48: 151-156.21. Bogaards JJ i wsp. Determining the best animal modelfor human cytochrome P450 activities: a comparison ofmouse, rat, rabbit, dog, micropig, monkey and man. Xenobiotica2000; 30: 1131-1152.22. Gaikovitch EA i wsp. Polymorphisms of drug-metabolizingenzymes CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP1A1,NAT2 and of P-glycoprotein in a Russian population.Eur J Clin Pharmacol 2003; 59: 303-312.23. Guengerich FP. Comparisons of catalytic selectivity ofcytochrome P450 subfamily enzymes from differentspecies. Chem Biol Interact 1997; 106: 161-182.24. Snawder JE, Lipscomb JC. Interindividual variance ofcytochrome P450 forms in human hepatic microsomes:correlation of individual forms with xenobiotic metabolismand implications in risk assessment. Regul ToxicolPharmacol 2000; 32: 200-209.25. Yamazaki H i wsp. Inter-individual variation of cytochromeP4502J2 expression and catalytic activities inliver microsomes from Japanese and Caucasian populations.Xenobiotica 2006; 36: 1201-1209.26. Sharer JE i wsp. Comparisons of phase I and phase IIin vitro hepatic enzyme activities of human, dog, rhesusmonkey, and cynomolgus monkey. Drug Metab Dispos1995; 23: 1231-1241.27. Pearce R, Greenway D, Parkinson A. Species differencesand interindividual variation in liver microsomalcytochrome P450 2A enzymes: effects on coumarin,dicumarol, and testosterone oxidation. Arch BiochemBiophys 1992; 298: 211-225.28. Tomlinson ES i wsp. Dexamethasone metabolism invitro: species differences. J Steroid Biochem Mol Biol1997; 62: 345-352.29. Zhang L i wsp. Species difference in stereoselectiveinvolvement of CYP3A in the mono-N-dealkylation ofdisopyramide. Xenobiotica 2001; 31: 73-83.30. Remmel RP i wsp. Studies on the metabolism of the novel,selective cyclooxygenase-2 inhibitor indomethacinphenethylamide in rat, mouse, and human liver microsomes:identification of active metabolites. Drug MetabDispos 2004; 32: 113-122.31. Anzenbacher P i wsp. Presence and activity of cytochromeP450 isoforms in minipig liver microsomes. Comparisonwith human liver samples. Drug Metab Dispos1998; 26: 56-59.32. Gut I i wsp. Metabolism of new-generation taxanes inhuman, pig, minipig and rat liver microsomes. Xenobiotica2006; 36: 772-792.33. Eagling VA, Tjia JF, Back DJ. Differential selectivity ofcytochrome P450 inhibitors against probe substrates inhuman and rat liver microsomes. Br J Clin Pharmacol1998; 45: 107-114.34. Vaclavikova R i wsp. Different in vitro metabolism ofpaclitaxel and docetaxel in humans, rats, pigs, and minipigs.Drug Metab Dispos 2004; 32: 666-674.26

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507335. Yang TJ i wsp. Inhibitory monoclonal antibodies to humancytochrome P450 1A2: analysis of phenacetin O-deethylation in human liver. Pharmacogenetics 1998; 8:375-382.36. Hewitt NJ, Lecluyse EL, Ferguson SS. Induction of hepaticcytochrome P450 enzymes: methods, mechanisms,recommendations, and in vitro-in vivo correlations. Xenobiotica2007; 37: 1196-1224.37. Walsky RL, Boldt SE. In vitro cytochrome P450 inhibitionand induction. Curr Drug Metab 2008; 9: 928-939.38. Rodrigues AD. Prioritization of clinical drug interactionstudies using in vitro cytochrome P450 data: proposedrefinement and expansion of the “rank order” approach.Drug Metab Lett 2007; 1: 31-35.39. Yasumori T i wsp. Species differences in stereoselectivemetabolism of mephenytoin by cyto chrome P450 (CYP2Cand CYP3A). J Pharmacol Exp The. 1993; 264: 89-94.40. Wrighton SA i wsp. In vitro methods for assessing humanhepatic drug metabolism: their use in drug development.Drug Metab Rev 1993; 25: 453-484.41. Eberhart DC i wsp. Species differences in the toxicityand cytochrome P450 IIIA-dependent metabolism ofdigitoxin. Mol Pharmacol 1991; 40: 859-867.42. Shimada T i wsp. Cytochrome P450-dependent drugoxidation activities in liver microsomes of various animalspecies including rats, guinea pigs, dogs, monkeys,and humans. Arch Toxicol 1997; 71: 401-408.43. Niwa T i wsp. Species and sex differences of testosteroneand nifedipine oxidation in liver microsomes of rat,dog and monkey. Xenobiotica 1995; 25: 1041-1049.44. Komori M i wsp. Purification and characterization of aform of P450 from horse liver microsomes. J Biochem1993; 114: 445-448.45. Nelson DR. Cytochrome P450 nomenclature, 2004.Methods Mol Biol 2006; 320: 1-10.46. Michalets EL. Update: clinically significant cytochromeP450 drug interactions. Pharmacotherapy. 1998; 18: 84-112.47. Tredger JM, Stoll S. Cytochromes P450 – their impacton drug treatment. Hospital Pharm. 2002; 9: 167-173.data otrzymania pracy: 23.02.2010 r.data akceptacji do druku: 12.04.2010 r.Adres do korespondencji:dr hab. Andrzej PlewkaZakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny41-200 Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30telefon: +48 32 364 14 30e-mail: aplewka@sum.edu.pl27

Farm Przegl Nauk, 2010,5, 28-33Wpływ temperatury i czasu sterylizacji termicznejna generowanie wolnych rodników w diazotanie izosorbitoluEffect of temperature and time of thermal sterilization on formationof free radicals in isosorbide dinitratePaweł Ramos, Barbara PilawaKatedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachStreszczenieWolne rodniki generowane są w substancjach leczniczychpodczas sterylizacji termicznej. Celem niniejszej pracyjest określenie wpływu warunków sterylizacji termicznejna koncentrację i właściwości wolnych rodników w diazotanieizosorbitolu. W pracy zbadano również wpływ czasuprzechowywania leku na koncentrację wolnych rodnikóww diazotanie izosorbitolu. Porównano oddziaływania magnetycznew leku sterylizowanym w różnych warunkach.Metodą ciągłego nasycenia mikrofalowego wyznaczonorodzaj poszerzenia linii EPR testowanego leku. Sterylizacjętermiczną przeprowadzono zgodnie z obowiązującyminormami. Wolne rodniki w diazotanie izosorbitoluzbadano z zastosowaniem spektroskopii elektronowegorezonansu paramagnetycznego (EPR) na pasmo X (9.3GHz). Dla wszystkich ogrzewanych próbek diazotanu izosorbitolurejestrowano widma EPR. Wykazano, że układwolnych rodników w sterylizowanym termicznie lekuma charakter złożony. Wolne rodniki w sterylizowanymtermicznie leku rozmieszczone są jednorodnie. W diazotanieizosorbitolu sterylizowanym zachodzą szybkie procesyrelaksacji spin-sieć. Koncentracja wolnych rodnikóww diazotanie izosorbitolu sterylizowanym termicznie jestz zakresu 2.5x10 16 -5.4x10 16 spin/g, a jej wartość zależyod temperatury i czasu sterylizacji. Koncentracja wolnychrodników w diazotanie izosorbitolu zmienia się wrazz czasem przechowywania próbki po sterylizacji.AbstractFree radicals are formed in drugs during thermal sterilization.The aim of this work is to determine influence ofthermal sterilization on concentration and properties offree radicals in the analyzed isosorbide dinitrate. Effect ofthe storage time on free radical concentration in the drugsterilized at different conditions was tested. Magneticinteractions in the drug sterilized at different conditionswere studied. Type of broadening of EPR lines for thethermally sterilized drug was analyzed by continuous microwavesaturation method. Sterilization was performedaccording to the norms. Free radicals were studied by theuse of an X-band (9.3 GHz) electron paramagnetic resonance(EPR) spectroscopy. EPR spectra were obtained forthe all heated samples. Complex character of free radicalsystem in the analysed drug was proved. Free radicals inthe sterilized drug are homogeneously distributed. Fastspin-lattice relaxation processes exist in the isosorbide dinitrate.Free radical concentrations in isosorbide dinitrateare in the range 2.5x10 16 -5.4x10 16 spin/g. Free radicalconcentration depends on temperature and time of sterilization.Free radical concentration depends on storagetime of the drug after sterilization.Key words: isosorbide dinitrate, thermal sterilization,free radicals, EPR spectroscopySłowa kluczowe: diazotan izosorbitolu, sterylizacja termiczna,wolne rodniki, spektroskopia EPRWstępWolne rodniki mogą powstawać podczas rozpadu homolitycznegowiązań chemicznych w cząsteczkach, coprowadzi do występowania niesparowanych elektronóww układzie [1]. Wolne rodniki generowane są w wyniku działaniaświatła, promieniowania jonizującego, wysokiej temperaturyi niektórych katalizatorów [1-5]. Trwałość wolnychrodników organicznych jest zróżnicowana [1-5]. Stabilnośćwolnych rodników zależy od ich struktury chemicznej orazod warunków fizykochemicznych charakteryzujących otoczeniepróbki. Wysoką trwałość stwierdzono w przypadkuwolnych rodników w jednostkach aromatycznych [1]. Czasżycia wolnych rodników rośnie wraz z obniżeniem temperaturyoraz po usunięciu tlenu z otoczenia próbki [1].Wolne rodniki w organizmach żywych występujązarówno w stanach prawidłowych jak i patologicznych[6]. W naturalnych warunkach w zdrowym organizmie,wolne rodniki powstają podczas procesu utleniania biologicznegow łańcuchu oddechowym w mitochondriach,28

w przebiegu niektórych reakcji enzymatycznych katalizowanychprzez enzymy, podczas autooksydacji związkówbiologicznie czynnych oraz w procesach fagocytozy[6]. Reakcje wolnorodnikowe towarzyszą przemianomksenobiotyków w organizmie [7]. Wolne rodniki powstająw procesach enzymatycznej hydroksylacji niektórychleków [7].Warunkiem prawidłowego funkcjonowania organizmujest regulacja poziomu wolnych rodników w tkankach [7].Brak równowagi pomiędzy powstawaniem i usuwaniemwolnych rodników z organizmu może stanowić przyczynędestrukcji struktur biologicznych. Wolne rodniki oddziałująnegatywnie na białka, kwasy nukleinowe, inaktywują enzymyoraz niszczą błony komórkowe [7].Reakcje wolnorodnikowe mają duże znaczenie w wielustanach chorobowych i procesach zachodzących w organizmach[7]. Wolne rodniki odgrywają rolę w stanach zapalnych,chorobie niedokrwiennej serca, chorobach genetycznychi nowotworowych, niewydolności oddechowej, chorobachneurologicznych, chorobach przewodu pokarmowegooraz w procesach starzenia się organizmów [7].Metodą stosowaną do badania wolnych rodników jestspektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego(EPR) [6]. W niniejszej pracy metodę EPR wykorzystanow poszukiwaniu optymalnych warunków sterylizacjitermicznej diazotanu izosorbitolu. Celem wykonanych badańjest określenie wpływu temperatury i czasu sterylizacjitermicznej na koncentrację i właściwości wolnych rodnikóww diazotanie izosorbitolu. Wyznaczono warunki sterylizacjitermicznej diazotanu izosorbitolu, którym towarzyszy generowanieminimalnej ilości wolnych rodników w próbce.Materiały i metodyW pracy zbadano wolne rodniki w diazotanie izosorbitolu,który został poddany sterylizacji termicznej zgodniez obowiązującymi normami [8-9]. Lek sterylizowanow temperaturze 160 o C, 170 o C i 180 o C w czasie ogrzewaniawynoszącym odpowiednio 120 minut, 60 minut i 30 minut.Sterylizację przeprowadzono w suszarce z wymuszonymtermoobiegiem powietrza. Wzórstrukturalny diazotanu izosorbitoluprzedstawia Rycina 1 [10]. Lek zakupionow Firmie SIGMA. Próbkimiały postać sproszkowaną.Widma leku rejestrowano z wykorzystaniemspektrometru elektronowegorezonansu paramagnetycznegona pasmo X (9.3 GHz) FirmyRADIOPAN-Poznań. Częstotliwośćpromieniowania mikrofalowego rejestrowanabyła miernikiem MCM101 Firmy EPRAD-Poznań.Widma EPR mierzono w postacipierwszej pochodnej absorpcji przywysokim tłumieniu 15 dB (2.2 mW),aby uniknąć nasycenia mikrofalowegolinii. Całkowita moc mikrofalowawytwarzana przez klistron wynosiła70 mW.copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073O 2NOOW pracy wyznaczano następujące parametry widm EPR(Ryc. 2): amplitudę (A), intensywność integralną (I), szerokośćlinii (∆B pp) oraz współczynnik rozszczepienia spektroskopowegog.Jako wzorzec koncentracji wolnych rodników zastosowanoultramarynę, wykazującą wysoką stabilność występującychw niej centrów paramagnetycznych. W celu zwiększeniadokładności pomiaru zastosowano również kryształrubinu, jako tzw. wzorzec wewnętrzny. Dla każdej analizowanejpróbki i ultramaryny rejestrowano sygnał EPR rubinu.Dla linii EPR kryształu rubinu wyznaczono amplitudę.Koncentracja wolnych rodników w badanych próbkachN (spin/g) została wyznaczona według wzoru:N = n u(I pA ruW u)/(I uA rpW pm)gdzie: n u- ilość centrów paramagnetycznych w ultramarynie(1.2 x 10 19 spin); I p, I u– intensywność integralnadla krzywej absorpcji rezonansowej próbki i ultramaryny;A rp,A ru- amplituda linii EPR rubinu rejestrowanej przy tymsamym wzmocnieniu dla próbki i ultramaryny; W p,Wu- wzmocnienie dla próbki i ultramaryny; m - masa próbki.W pracy analizowano kształt widm EPR w celu potwierdzeniahipotezy o złożonym układzie wolnych rodnikóww sterylizowanym termicznie diazotanie izosorbitolu.Dla widm rejestrowanych w zakresie mocy mikrofalowej2.2-70 mW wyznaczono następujące parametry asymetriilinii EPR: A 1/A 2, A 1-A 2, B 1/B 2oraz B 1-B 2(Ryc. 2). Parametryte określają asymetrię w różnych kierunkach widmaEPR.OONO 2Ryc. 1. Wzór strukturalny diazotanu izosorbitolu [10].Ryc. 2. Widmo EPR zarejestrowane w postaci pierwszej pochodnej absorpcjiz zaznaczoną amplitudą linii (A), szerokością linii (ΔB pp), rezonansową indukcjąmagnetyczną (B r) oraz parametrami asymetrii linii: A 1, A 2, B 1i B 2.29

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Ryc. 3. Widmo EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanego w temperaturze180 °C przez 30 minut zarejestrowane w temperaturze pokojowej z mocą mikrofalowąwynoszącą 2.2. mW.Analizie poddano również wpływ mocy mikrofalowejna amplitudę i szerokość linii EPR w celu określenia sposoburozmieszczenia wolnych rodników w sterylizowanymtermicznie leku.WynikiDla wyjściowych nieogrzewanych próbek diazotanuizosorbitolu nie rejestrowano widm EPR. Widma EPR rejestrowanodla wszystkich próbek diazotanu izosorbitolu sterylizowanychtermicznie. Widma EPR otrzymano dla lekusterylizowanego w temperaturze 160 °C przez 120 minut,w temperaturze 170 °C przez 60 minut oraz w temperaturze180 °C przez 30 minut. Przykładowe widmo EPR diazotanuizosorbitolu sterylizowanego w 180 °C przez 30 minut dlapomiaru wykonanego przy niskiej mocy mikrofalowej pokazanona Rycinie 3.Stwierdzono, że warunki sterylizacji termicznej wpływająna amplitudę (A), szerokość(ΔB pp) i intensywność integralną(I) linii EPR. Zależność amplitudy,szerokości i intensywności integralnejlinii EPR od temperatury i czasusterylizacji termicznej diazotanu izosorbitoluprzedstawiono w Tabeli 1.Amplituda (A) linii EPR rośniewraz ze wzrostem temperatury sterylizacjidla stosowanych czasów tegoprocesu (Tabela 1). Szerokość linii(ΔB pp) maleje wraz ze wzrostem temperaturysterylizacji dla stosowanychczasów ogrzewania leku (Tabela 1).Intensywność integralna (I) malejewraz ze wzrostem temperatury sterylizacjidla stosowanych czasówogrzewania (Tabela 1).Stwierdzono, że koncentracjawolnych rodników w diazotanie izosorbitolumaleje wraz ze wzrostemtemperatury sterylizacji dla stosowanychczasów ogrzewania (Tabela I).Średnia wartość współczynnika rozszczepienia spektroskopowegog (+0.0002) dla badanych próbek diazotanu izosorbitoluwynosiła odpowiednio: 1.9980 (dla 160 °C i 120minut), 1.9970 (dla 170 °C i 60 minut) oraz 2.0082 (dla 180°C i 30 minut).Badano również wpływ czasu przechowywania lekuna parametry widm EPR i koncentrację wolnych rodnikóww diazotanie izosorbitolu sterylizowanym termicznie.W Tabeli I porównano parametry widm EPR oraz koncentracjęwolnych rodników w diazotanie izosorbitolu sterylizowanymtermicznie w temperaturach 160 °C (120 minut),170 °C (60 minut) oraz 180 °C (30 minut) dla pomiarówwykonanych 10 minut po sterylizacji, 5 dni oraz 10 dni posterylizacji. Stwierdzono, że parametry widm EPR i koncentracjawolnych rodników w badanym leku zależą od czasuprzechowywania próbki. Koncentracja wolnych rodnikóww leku sterylizowanym w temperaturze 160 °C maleje wrazz czasem przechowywania próbki (Tabela 1). W przypad-Tab. I. Amplituda (A), intensywność integralna (I) i szerokość (ΔB pp) linii EPR oraz koncentracja (N) wolnych rodnikóww sterylizowanym termicznie diazotanie izosorbitolu. Dane dotyczą widm EPR rejestrowanych 10 minut, 5 dni oraz 10 dnipo sterylizacji termicznej. Pomiary wykonano w temperaturze pokojowej przy mocy mikrofalowej wynoszącej 2.2 mWParametry widm EPR ikoncentracja wolnychrodników30A [j.wzgl.](+ 0.1)I [j.wzgl.](+ 0.1)ΔB pp[mT](+ 0.02)N x 10 16 [spin/g](+ 0.1 x 10 16 )10minutWarunki sterylizacji160 °C (120minut) 170 °C (60minut) 180 °C (30minut)Czas po sterylizacji Czas po sterylizacji Czas po sterylizacji5 dni 10 dni 10 minut 5 dni 10 dni 10 minut 5 dni 10 dni2.6 1.9 1.7 3.1 3.4 3.7 4.1 5.3 4.51.7 1.3 1.3 1.2 1.4 1.8 0.9 1.9 1.50.53 0.50 0.60 0.38 0.50 0.62 0.43 0.57 0.535.4 3.4 4.4 3.1 2.5 4.1 2.9 4.1 3.1

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073B1/B2A1-A2 [j.wzgl.]A1/A2DIAZOTAN IZOSORBITOLU1,210,80,60,40,200 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1M/MoDIAZOTAN IZOSORBITOLU00 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9-0,005-0,01-0,015-0,02-0,025-0,03-0,035-0,04M/MoDIAZOTAN IZOSORBITOLU1,210,80,60,40,200 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1M/MoDIAZOTAN IZOSORBITOLU0,0500 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1-0,05160°C/120min.170°C/60min.180°C/30min.160°C/120min.170°C/60min.180°C/30min.160°C/120min.170°C/60min.180°C/30min.ku diazotanu izosorbitolu sterylizowanegow temperaturach 170 °C i 180 °C koncentracjawolnych rodników po kilku dniach od sterylizacjijest większa aniżeli kilka minut poprzeprowadzeniu tego procesu (Tabela 1).Przeprowadzona analiza kształtu widmEPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanegotermicznie pozwoliła stwierdzić iż niezależnieod warunków sterylizacji widma EPRwykazują zawsze dużą asymetrię kształtu(Ryc. 3). Kształt widm EPR wszystkich badanychpróbek silnie zależy od mocy mikrofalowej.Wszystkie analizowane parametry kształtulinii EPR: A 1/A 2(a), A 1-A 2(b), B 1/B 2(c),oraz B 1-B 2(d) dla sterylizowanego diazotanuizosorbitolu zależą od mocy mikrofalowej.Zależności parametrów A 1/A 2(a), A 1-A 2(b), B 1/B 2(c) oraz B 1-B 2(d) kształtu liniiEPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanegow temperaturach 160 °C, 170 °C i 180 °Cpokazano na Rycinie 4. Zmiana parametrówkształtu widm EPR wraz z mocą mikrofalowąwskazuje na złożony charakter układuwolnych rodników w próbkach diazotanuizosorbitolu sterylizowanego termicznie.Zbadano również wpływ mocy mikrofalowejna amplitudę i szerokość linii EPRdiazotanu izosorbitolu sterylizowanegotermicznie. Parametry widm EPR wszystkichbadanych próbek diazotanu izosorbitoluzależą od mocy mikrofalowej. Wpływmocy mikrofalowej na amplitudę (A) liniiEPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanegow temperaturach 160 °C (120 minut),170 °C (60 minut) oraz 180 °C (30 minut)przedstawiono na Rycinie 5. Wpływ mocymikrofalowej na szerokość (ΔB pp) linii EPRdiazotanu izosorbitolu sterylizowanegow temperaturach 160 °C (120 minut), 170°C (60 minut) oraz 180 °C (30 minut) przedstawionona Rycinie 6.Amplituda linii EPR diazotanu izosorbitolusterylizowanego termicznie, niezależnieod temperatury i czasu sterylizacji,rośnie wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej(Ryc. 5). Nie obserwowano nasyceniamikrofalowego linii EPR (Ryc. 5).Oznacza to, że w próbkach testowanegoleku zachodzą szybkie procesy relaksacjispin-sieć.B1-B2 [mT]-0,1-0,15-0,2-0,25M/Mo160°C/120min.170°C/60min.180°C/30min.Ryc. 4. Zależność parametrów asymetrii A 1/A 2(a), A 1-A 2(b), B 1/B 2(c) orza B 1-B 2(d)widm EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanegow temperaturze 160 °C przez 120minut, 170 °C przez 60 minut i 180 °C przez30 minut od mocy mikrofalowej (M). M o–maksymalna moc mikrofalowa (70 mW).31

Farm Przegl Nauk, 2010, 5A [j.wzgl.]Szerokość linii EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanegotermicznie dla wszystkich stosowanych temperaturlekko rośnie wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej (Ryc. 5).Jest to zależność charakterystyczna dla wolnych rodnikówrozmieszczonych jednorodnie w próbce [11].DyskusjaPrzeprowadzone badania diazotanu izosorbitolu nieogrzewanegoi poddanego obróbce termicznej z zastosowaniemspektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznegowykazały, że analizowany lek wyjściowy nie jestparamagnetyczny, a lek sterylizowany termicznie niezależnieod warunków procesu posiada właściwości paramagnetyczne.Zgodnie z oczekiwaniami nie otrzymano widm EPRw przypadku leku niesterylizowanego. W zjawisku EPR polegającymna rezonansowym pochłanianiu promieniowaniamikrofalowego biorą udział jedynie niesparowane elektrony320,080,070,060,050,040,030,020,01DIAZOTAN IZOSORBITOLU00 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1(M/M o) 1/2160°C/120min.170°C/60min.180°C/30min.Ryc. 5. Wpływ mocy mikrofalowej (M) na amplitudę (A) linii EPR diazotanu izosorbitolusterylizowanego w temperaturze 160 °C przez 120 minut, 170°C przez60 minut i 180 °C przez 30 minut. M o– maksymalna moc mikrofalowa (70 mW).∆Bpp [mT]10,90,80,70,60,50,40,30,20,1DIAZOTAN IZOSORBITOLU00 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1(M/M o) 1/2160°C/120min.170°C/60min.180°C/30min.Ryc. 6. Wpływ mocy mikrofalowej (M) na szerokość (ΔB pp) linii EPR diazotanuizosorbitolu sterylizowanego w temperaturze 160 °C przez 120 minut, 170 °C przez60 minut i 180 °C przez 30 minut. M o– maksymalna moc mikrofalowa (70 mW).[11]. Struktura chemiczna diazotanuizosorbitolu pokazana na Rycinie1 [10] nie posiada niesparowanychelektronów.W wysokiej temperaturze dochodzido zerwania wiązań chemicznychw leku, co prowadzi dowytworzenia wolnych rodnikówi rejestracji widm EPR (Ryc. 3).Poziomy energetyczne niesparowanychelektronów wolnychrodników ulegają rozszczepieniuzeemanowskiemu w polu magnetycznymwytworzonym przez elektromagnes[11]. Po dostarczeniuenergii promieniowania mikrofalowegodo leku sterylizowanegoumieszczonego między biegunamielektromagnesu zachodzi rezonansowepochłanianie promieniowaniaelektromagnetycznego, elektronywolnych rodników są przenoszonena wyższe poziomy energetyczne,a następnie powracają na poziomypodstawowe w wyniku zjawisk relaksacji[11]. Rezonansowe pochłanianiemikrofal przez wolne rodnikileku pozwala określić lokalizacjęniesparowanych elektronów w wolnychrodnikach próbki, ich koncentracjęoraz właściwości.W przypadku diazotanu izosorbitolustwierdzono, że energia termicznaw temperaturze 160 °C jestjuż wystarczająca do wytworzeniawolnych rodników w leku (Ryc. 3,Tabela 1). Wraz ze wzrostem temperaturysterylizacji dostarczamypróbce więcej ciepła w jednostceczasu, powstaje więc większa ilośćwolnych rodników, jednakże wzrastarównocześnie prawdopodobieństwoich spotkania, a więc prawdopodobieństwo rekombinacji.Reakcje rekombinacji dużej ilości wolnych rodnikóww diazotanie izosorbitolu sterylizowanym w temperaturach170 °C i 180 °C prowadzą poprzez sparowanie elektronów dospadku koncentracji wolnych rodników w próbce (Tabela 1).Zjawisko spadku koncentracji wolnych rodników w diazotanieizosorbitolu ogrzewanym w temperaturach 170 °Ci 180 °C jest zdecydowanie korzystne dla procesu jego sterylizacji.Lek zawierający mniejsze ilości wolnych rodnikówbędzie powodował zdecydowanie mniejsze efekty ubocznew organizmie człowieka podczas farmakoterapii. Biorąc poduwagę wykonane w pracy analizy spektroskopowe diazotanuizosorbitolu sterylizowanego zgodnie z normami [8-9]w różnych warunkach można wskazać optymalne warunkisterylizacji tego leku. Zgodnie z norami [8-9] w diazotanieizosorbitolu sterylizowanym we wszystkich trzech analizowanychwarunkach (160 °C i 120 minut, 170 °C i 60 minutoraz 180 °C i 30 minut) nie występują mikroorganizmy,

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073a więc produkt jest sterylny. Jednakże optymalnymi warunkamisterylizacji diazotanu izosorbitolu jest ogrzewanieleku w temperaturze 180 °C w czasie 30 minut, ponieważ wtak otrzymanej próbce występuje najmniejsza koncentracjawolnych rodników (Tabela 1).W niniejszej pracy stwierdzono, że podczas przechowywaniadiazotanu izosorbitolu sterylizowanego termiczniezachodzą zmiany koncentracji wolnych rodników w leku(Tabela 1) oraz zmiany parametrów widm EPR przechowywanegoleku (Tabela 1). Zmiany te mogą być spowodowaneoddziaływaniami z tlenem.Badania EPR z ciągłym nasyceniem mikrofalowym liniiwykazały, że wolne rodniki w sterylizowanym termicznie diazotanieizosorbitolu są rozmieszczone jednorodnie. Obserwowanocharakterystyczne dla takiego rozmieszczenia wolnych rodnikóww próbce zależności amplitudy (Ryc. 5) i szerokości liniiEPR (Ryc. 6) od mocy mikrofalowej. Można więc stwierdzić, żeproces sterylizacji termicznej przeprowadzono prawidłowo, lekogrzewany był w całej swojej objętości równomiernie. Nasyceniemikrofalowe widm EPR można zaproponować jako test dosprawdzenia przebiegu procesu sterylizacji w próbce.We wszystkich próbkach analizowanego leku występujągłównie wolne rodniki z niesparowanym elektronem zlokalizowanymna atomie tlenu o charakterystycznych wysokichwartościach współczynnika rozszczepienia spektroskopowegog (1.9970-2.0082).W diazotanie izosorbitolu sterylizowanym w temperaturze160 °C (120 minut), 170 °C (60 minut) i 180 °C (30 minut) wolnerodniki są rozmieszczone blisko siebie. Rejestrowano szerokielinie EPR (Ryc. 3) charakterystyczne dla niewielkich odległościpomiędzy niesparowanymi elektronami, co daje silne oddziaływaniadipolowe spin-spin poszerzające widma EPR.W diazotanie izoserbitolu zachodzą szybkie procesyrelaksacji spin-sieć, ponieważ nie obserwowano nasyceniamikrofalowego linii EPR nawet przy mocy mikrofalowejwynoszącej 70 mW (Ryc. 5).Układ wolnych rodników diazotanu izosorbitolu sterylizowanegotermicznie ma charakter złożony, tzn. występujew leku kilka rodzajów wolnych rodników. Obserwowanozmiany parametrów kształtu linii EPR diazotanuizosorbitolu wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej (Ryc. 4).W przypadku próbki zawierającej kilka rodzajów wolnychrodników linie składowe pochodzące od poszczególnychgrup wolnych rodników zmieniają się z mocą mikrofalowąw odmienny sposób, co w efekcie daje zmianę kształtu sumarycznegowidma EPR ze wzrostem mocy mikrofalowej.Wyniki badań diazotanu izosorbitolu metodą EPR, którezostały przeprowadzone w niniejszej pracy poszerzyły wiedzęo wolnych rodnikach generowanych w procesie sterylizacjitermicznej substancji leczniczych. Po raz pierwszyzbadano wolne rodniki powstające w sterylizowanym termiczniediazotanie izosorbitolu. Zaproponowano spektroskopięEPR jako metodę przydatną do optymalizacji warunkówprocesu sterylizacji termicznej leków.WnioskiPrzeprowadzone badania diazotanu izosorbitolu z zastosowaniemspektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznegowykazały, że:1. Sterylizacja termiczna diazotanu izosorbitolu w temperaturach160 o C (120 minut), 170 o C (60 minut)oraz 180 o C (30 minut) prowadzi do generowaniawolnych rodników, a ich koncentracja w leku malejewraz ze wzrostem temperatury sterylizacji.2. Wykazano, że w sterylizowanym termicznie diazotanieizosorbitolu układ wolnych rodników ma charakterzłożony, wolne rodniki rozmieszczone są jednorodniezachodzą silne oddziaływania dipolowe orazszybkie procesy relaksacji spin-sieć.3. Spektroskopię EPR można zaproponować jako technikęprzydatną do optymalizacji warunków sterylizacjitermicznej diazotanu izosorbitolu.Praca wykonana w ramach badań statutowych (umowanr KNW-1-142/09) w Śląskim Uniwersytecie Medycznymw Katowicach.Piśmiennictwo1. Bartosz G. Druga twarz tlenu. Wydawnictwo naukowePWN. Warszawa 2006.2. Ramos P i wsp. Effect of heating at 180 o C on paramagneticproperties of diclofenac – EPR studies. Eng ofBiomater 2009; XII(87): 7-12.3. Ramos P, Pepliński P, Pilawa B. Free radicals in thermallysterilized verapamil. Eng of Biomater 2009;XII(89-91): 162-164.4. Krztoń i wsp. FT-IR and EPR studies of changes of chemicalstructure of ampicyline during thermal sterilization.Eng of Biomater 2009; XII(89-91): 153-156.5. Wilczyński S i wsp. Application of EPR spectroscopy toexamination of gamma-irradiated erythromycin. FarmPrzegl Nauk 2009; 9(56): 9-11.6. Jóźwiak Z, Bartosz G. Biofizyka. Wydawnictwo NaukowePWN. Warszawa 2005.7. Jaroszyk F. Biofizyka. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.Warszawa 2001.8. Farmakopea Polska, wydanie VIII. PTFarm. Warszawa2009.9. PN-EN 556. Sterylizacja wyrobów medycznych. Wymaganiawyrobów medycznych określanych jako sterylne.10. Zejca A. Chemia leków. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 2004.11. Wertz JE, Bolton JR. Electron Spin Resonance Theoryand Practical Applications. New York, London 1986.data otrzymania pracy: 24.02.2010 r.data akceptacji do druku: 13.05.2010 r.Adres do korespondencji:dr n. med. Paweł RamosKatedra i Zakład Biofizykiul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiectel. 792 280 882e-mail: pawelramos@sum.edu.pl33

Farm Przegl Nauk, 2010,5, 34-39Rozkład termiczny wybranych substancji pomocniczychstosowanych w technologii stałych postaci lekówThermal decomposition of selected excipientsused in solid dosage technologyBarbara Rojek, Marek WesołowskiKatedra i Zakład Chemii Analitycznej, Gdański Uniwersytet MedycznyStreszczenieMetody termoanalityczne znajdują coraz szersze zastosowaniew badaniach nad lekiem. Są niezastąpione jako cenneźródło informacji o temperaturach przemian fazowych,temperaturach rozkładu i produktach rozkładu, a ponadtoumożliwiają pomiar ilości ciepła biorącego udział w tychprzemianach. W związku z tym, celem pracy są badanianad rozkładem termicznym wybranych substancji pomocniczychstosowanych szeroko w technologii stałych postacileku. Badaniom poddano substancje, które znajdujązastosowanie głównie jako czynniki wiążące (glukoza,sorbitol, sacharoza, guma arabska), rozsadzające (celulozamikrokrystaliczna) i wypełniające (sacharoza, glukoza,glikokol). W efekcie badań przeprowadzonych za pomocąmetod analizy termicznej (DSC, DTA, TG) oraz termomikroskopiistwierdzono, że rozkład termiczny badanychsubstancji można przedstawić za pomocą schematu obejmującegotrzy etapy rozkładu. Najważniejsze procesycharakteryzujące badane substancje (dehydratacja, przemianykrystaliczne, topnienie), przebiegające w etapiepierwszym rozkładu, mogą być wykorzystane do identyfikacjii oceny ich jakości. Określone na podstawie krzywychtermoanalitycznych przemiany zachodzące w badanychsubstancjach w różnych temperaturach umożliwiająwyznaczenie granicznych wartości temperatur, poniżejktórych badane substancje można poddać obróbce technologicznejbez groźby wystąpienia niekorzystnych zmianich właściwości fizykochemicznych. Uzyskane wynikimogą być również pomocne w badaniu trwałości substancjipomocniczych i w wykrywaniu niezgodności z innymisubstancjami w fazie preformulacji.Słowa kluczowe: substancje pomocnicze, rozkład termiczny,metody termoanalityczne, DSC, DTA, TGAbstractThermoanalytical methods are applied widely nowadaysin the drug investigations. They are indispensable as a valuablesource of the information on temperatures of phasetransitions, temperatures and products of decomposition,as well as enables the measurement of heat amount takingpart in these transitions. Due to this, the aim of the work isinvestigation of thermal degradation of selected excipientsused widely in the technology of solid drug forms. Thestudies were conducted on the substances, which are mainlyused as binders (glucose, sorbitol, saccharose, arabicgum), disintegrators (microcrystalline cellulose) and fillers(saccharose, glucose, glycocoll). As an effect of the studiesperformed by the use of thermoanalytical methods (DSC,DTA, TG) and thermomicroscopy it was found that thethermal decomposition of the analyzed substances can beillustrated by the scheme comprising of three stages of thedegradation. The most important processes characterizingthe studied substances (dehydratation, crystalline transitions,melting) occurring in the first stage of decomposition,can be used for their identification and evaluation oftheir quality. Determined based on thermoanalytical curvestransitions occurring in the analyzed substances at differenttemperatures, enables the determination of temperature limits,below which the studied substances can be technologicallyprocessed without the threat of changing their physicochemicalproperties. The obtained results can be alsohelpful in the investigation of stability of excipients andfor the detection of incompatibility with other substancesin preformulation phase.Key words: excipients, thermal decomposition, thermoanalyticalmethods, DSC, DTA, TGWprowadzenieW Farmakopei Polskiej VII zamieszczono nową monografię,będącą tłumaczeniem monografii z Farmakopei Europejskiej5, która wprowadza oficjalnie w Polsce do badań nadlekiem metody analizy termicznej [1, 2]. Pod pojęciem analizytermicznej kryje się zespół technik instrumentalnych, którychzasada działania polega na pomiarze zmian wybranychwłaściwości fizycznych substancji w funkcji czasu lub temperatury,w warunkach kontrolowanego programu temperatury[3]. Pomiary termoanalityczne obejmują rejestrację zmianniektórych właściwości fizycznych substancji, prowadząc dookreślonej metody analizy termicznej, np.: pomiar różnicytemperatur – różnicowa analiza termiczna (ang. Differential34

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Thermal Analysis, DTA), entalpii – różnicowa kalorymetriaskaningowa (ang. Differential Scanning Calorimetry, DSC),masy – termograwimetria (ang. Thermogravimetry, TG) i jejróżniczkowa pochodna (ang. Differential ThermogravimetryDTG).Techniki analizy termicznej znajdują coraz szersze zastosowaniew badaniu złożonych procesów zachodzącychw fazie formowania oraz składowania produktów leczniczych[4, 5]. Najważniejsze z tych procesów to zachodzące z udziałemsubstancji wykorzystywanych w technologii stałych postacileków przemiany fazowe, takie jak topnienie, krystalizacja,polimorfizm oraz procesy rozkładu związane z trwałościąsubstancji przechowywanych w różnych warunkach doświadczeniai w zawierających je postaciach leku (drażetki, tabletki,granulaty, proszki). Ważnym obszarem zastosowań metodtermoanalitycznych w farmacji może być także jakościowai ilościowa kontrola składu preparatów farmaceutycznych.Istotnym zagadnieniem w technologii stałych postaci lekujest ponadto wykrywanie potencjalnych niezgodności międzyskładnikami leków, tj. określenie wzajemnej tolerancjipomiędzy substancjami leczniczymi i pomocniczymi używanymiw fazie preformulacji [6]. Niezgodności chemicznemogą być wynikiem hydrolizy, utleniania, redukcji czy racemizacji.Natomiast niezgodności fizyczne i fizykochemiczneobejmują takie zjawiska, jak np. absorpcja, adsorpcja, adhezja,dysocjacja, kompleksowanie, wytrącanie, wilgotnienie,rozpuszczanie, solubilizacja, solwatacja, rozdzielanie, pęcznienie[7-9].Biorąc powyższe pod uwagę, podjęto badania nad rozkłademtermicznym wybranych substancji pomocniczychstosowanych w technologii stałych postaci leku. O wyborzesubstancji do badań zdecydował fakt, że należą one do grupysubstratów najczęściej wykorzystywanych w praktyce farmaceutycznej.Poznanie charakterystyki termicznej substancjipomocniczych ułatwia prowadzenie badań związanychz oceną trwałości tych substancji, która wpływa na trwałośćotrzymywanych z ich udziałem produktów leczniczych,a także ułatwia identyfikację niezgodności z innymi substancjamiw fazie preformulacji.Materiały i metodyW pracy wykorzystano następujące substancje pomocnicze:glikokol (POCh, Gliwice, cz.d.a.), glukoza bezwodna(POCh, Gliwice, cz.), sorbitol (POCh, Gliwice, cz.), sacharoza(POCh, Gliwice, cz.d.a.), celuloza mikrokrystaliczna AvicelPH101 (FMC Corp. Europe N.V.), guma arabska (POCh,Gliwice, cz.).Krzywe DTA, TG i DTG rozkładu termicznego badanychsubstancji rejestrowano za pomocą derywatografu OD-103(MOM, Węgry). Umieszczone w zestawie czterech tygli talerzowycho średnicy 18,5 mm 200-mg odważki rozkładanychzwiązków ogrzewano z szybkością wzrostu temperatury 5 ºC/min w zakresie temperatur 20-700 ºC, w statycznej atmosferzepowietrza, stosując α-Al 2O 3jako substancję odniesienia.Pomiary kalorymetryczne wykonano przy użyciu aparatuDSC 822 e , typ heat flux, wyposażonego w naczynie Dewaraz ciekłym azotem (Mettler Toledo, Szwajcaria). Próbkio masie ok. 4 mg, umieszczone w szczelnie zamkniętym pokrywkąz dwoma otworkami tygielku aluminiowym o poj.40 μl, ogrzewano z szybkością wzrostu temperatury 10 ºC/minw zakresie temperatur 20-300 ºC, w atmosferze azotu przepływającegoz szybkością 70 ml/min. Próbkę referencyjną stanowiłszczelnie zamknięty pokrywką pusty tygielek o poj. 40 μl.Do wyznaczenia temperatur przemian fazowych i obserwacjizachowania się badanych substancji podczas ogrzewaniazastosowano mikroskop Olympus BX41 (Olympus, Japonia),wyposażony w stolik grzewczy Semic (Bioelektronika,Kraków). Badane próbki ogrzewano z szybkością wzrostutemperatury 5 °C/min w zakresie temperatur 20-350 ºC.Wyniki i dyskusjaWyniki badań rozkładu termicznego wybranych substancjipomocniczych (glikokolu, glukozy, sorbitolu, sacharozy,celulozy mikrokrystalicznej, gumy arabskiej), zestawionow tabelach I-III oraz przedstawiono graficznie na rycinach 1-3.Analiza danych zamieszczonych w tabeli I wskazuje, żebadane substancje to związki organiczne różniące się znaczniebudową chemiczną i masą cząsteczkową. Glikokol jestnajprostszym aminokwasem (glicyna, kwas aminooctowy),sorbitol – alkoholem heksahydroksylowym z grupy cukroli,natomiast pozostałe substancje pomocnicze są cukrami prostymi(glukoza), disacharydami (sacharoza) lub polisacharydami(celuloza mikrokrystaliczna), i w pewnym stopniuguma arabska, stanowiąca stężałą wydzielinę z pni i gałęzidrzew afrykańskich z rodzaju Acacia, której głównym składnikiemjest rozgałęziony polisacharyd arabina.Na podstawie danych literaturowych można stwierdzić,że badane substancje nie są odporne na działanie wyższychtemperatur [9-12]. Glukoza, sorbitol i sacharoza topią sięw przedziale temperatur 100-200 °C, po przekroczeniu temperatury200 °C topi się glikokol z równoczesnym rozkładem,natomiast w jeszcze wyższej temperaturze rozkładowiulega celuloza. W dostępnym piśmiennictwie nie znalezionodanych na temat zachowania się w wyższych temperaturachgumy arabskiej.Powyższe dane zweryfikowano śledząc za pomocą termomikroskopuzachowanie się badanych substancji pod wpływemtemperatury. Z zestawionych w tabeli I danych wynika,że wyznaczone wartości temperatur są w niektórych przypadkachrozbieżne z danymi z literatury. Przykładem jest glikokol,którego topnienie z rozkładem następuje w temperaturzeniższej, niż cytowana w Poradniku fizykochemicznym [11].Podobnie zachowuje się celuloza mikrokrystaliczna, którazaczyna także rozkładać się w temperaturze niższej, niż podanaw literaturze [12]. Z kolei glukoza topi się w temperaturzeo około 10 °C wyższej. Nie wykryto natomiast przemiankrystalicznych, które podano w piśmiennictwie dla sacharozy[11, 12].Wyniki analizy krzywych DTA, TG i DTG rozkładu termicznegoglikokolu, glukozy, sorbitolu, sacharozy, celulozymikrokrystalicznej i gumy arabskiej zestawiono w tabeli II.Dokładna analiza zakresów temperatur poszczególnych procesówtermicznych oraz wartości towarzyszących im ubytkówmasy prowadzi do wniosku, że można uogólnić przebiegrozkładu termicznego wszystkich badanych substancji, wyróżniająctrzy zasadnicze etapy.Etap I rozkładu obejmuje zakres temperatur, w którymw analizowanej substancji zachodzi dehydratacja, przemiana35

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Ryc. 1. Krzywe DTA, TG i DTG rozkładu termicznego analizowanych substancji pomocniczych: (a) glikokol, (b) glukoza,(c) sorbitol.Ryc. 2. Krzywe DTA, TG i DTG rozkładu termicznego analizowanych substancji pomocniczych: (a) sacharoza, (b) celulozamikrokrystaliczna, (c) guma arabska.krystaliczna lub topnienie. Brak ubytku masy na krzywych TGi DTG potwierdza obecność topnienia lub przemiany krystalicznej,natomiast procesowi dehydratacji towarzyszykilkuprocentowy ubytek masy na krzywej TG i pik endotermicznyna krzywej DTA. Z topnieniem substancji związanesą wysokie, wąskie i ostro zakończone piki DTA. W niektórychprzypadkach topnienie połączone jest z gwałtownymubytkiem masy, tj. towarzyszy mu rozkład termiczny rozpoczynającykolejny etap.W wyniku dalszego ogrzewania badanej substancji,w etapie II rozkładu następuje jej termiczna degradacja.W przypadku węglowodanów (glukoza, sacharoza), procesrozkładu określa się mianem karmelizacji.Obejmujeona następujące po sobie reakcje dehydratacji, kondensacjii polimeryzacji z utworzeniem produktu o brązowymkolorze. Karmelizacja zachodzi bez udziału tlenui jest procesem endotermicznym.W przypadku pozostałych związków, na krzywej DTAproces rozkładu potwierdza zespół nakładających się na siebiepików, zarówno endotermicznych jak i egzotermicznych,natomiast na krzywej TG, od kilkunastu do kilkudziesięciuprocent ubytku masy. W etapie tym tworzą się pośrednie36

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Ryc. 3. Krzywe DSC analizowanych substancji pomocniczych: (a) glikokol, (b) glukoza, (c) sorbitol, (d) sacharoza, (e) celulozamikrokrystaliczna, (f) guma arabska.Tab. I. Wyniki badań termomikroskopowych analizowanych substancji pomocniczychSubstancjapomocniczaGlikokolGlukozaSorbitolSacharozaWzór sumarycznyMasacząsteczkowaC 2H 5NO 275,07C 6H 12O 6180,16C 6H 14O 6182,17C 12H 22O 11342,30Dane literaturowe[°C]topnienie z rozkładem, 232-236 [9]topnienie z rozkładem, 262 [11]topnienie, 146; rozkład, > 200 [11]topnienie, 147 [12]topnienie formy metastabilnej, 93topnienie formy polimorficznej γ, 97,7 [10]topnienie formy amorficznej, 110-112 [10, 12]topnienie z rozkładem, 160-186karmelizacja, > 160 [10]krystalizacja, 170; topnienie, 184-185 [11]topnienie form: b, 169-170; a, 184-185 [12]Wyniki badańtermomikroskopowych[°C]topnienie, 240-243rozkład, > 243topnienie, 154-157karmelizacja, 183-188rozkład, > 250topnienie, 100-102parowanie, > 205topnienie, 184-187karmelizacja, 189-193rozkład, > 250Celulozamikrokrystaliczna(C 6H 10O 5) nrozkład, 260-270 [12] rozkład, > 247Guma arabska brak danych literaturowych rozkład, > 195produkty rozkładu termicznego, których strukturę chemicznąbardzo trudno jest ustalić z uwagi na wielokierunkowośćreakcji destrukcji termicznej badanych substancji.W etapie III produkty karmelizacji i rozkładu ulegająostatecznej destrukcji termicznej połączonej z całkowitymspalaniem skoksowanej pozostałości. Sumaryczny efektcieplny tego etapu jest egzotermiczny, co potwierdza rozległypik na krzywej DTA.Interpretacja krzywych DTA, TG i DTG wykazała, żenajbardziej charakterystyczne dla rozkładu termicznego badanychsubstancji okazały się efekty termiczne występującew zakresie temperatur niższych, w etapie I rozkładu. Obejmująone zakres temperatury topnienia badanej substancjioraz temperatur niższych niż temperatura topnienia. Obserwowanew tym zakresie charakterystyczne piki mogą byćszczególne przydatne podczas oceny właściwości substancjii produktów leczniczych występujących w fazie stałej.Z tego względu do analizy badanych substancji pomocniczychzastosowano technikę DSC. Ponieważ jest to przedewszystkim metoda analizy fazowej, krzywa DSC będzieodzwierciedlać zmiany w układzie faz w badanej próbcew warunkach liniowego wzrostu lub obniżania temperatury.37

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Tab. II. Wyniki analizy krzywych DTA, TG i DTG rozkładu termicznego badanych substancjiSubstancjapomocniczaEtapy rozkładuetap I etap II etap IIIZakres temperatur piku DTA [°C]; temperatura piku DTA [°C]Zakres temperatur etapu TG-DTG [°C]; temperatura piku DTG [°C], ubytek masy [%]Glikokol20-160; 60 a40-110; 55, (5,0)160-270; 200 a110-320; 200, (65,0)270-520; 290 a , 420 b , 460 b320-520; 410, (30,0)Glukoza20-150; 120 abrak ubytku masy150-205; 170 a20-195; 165, (20,0)205-320; 245 a , 290 b195-340; 230, (53,0)320-510; 450 b340-540; 430, (27,0)Sorbitol 60-180; 80 a 180-430; 265 a , 380 b80-700; 255, (93,0) > 700; (7,0)SacharozaCelulozamikrokrystalicznaGuma arabska30-130; 90 abrak ubytku masy20-120; 70 a20-120; 50, (4,5)40-160; 60 a20-125; 60, (11,0)a– pik endotermiczny, b – pik egzotermiczny130-160;140 a , 160-200; 170 a30-320; 170, (67,0)120-240; 200 abrak ubytku masy160-330; 260 b ,125-320; 230, (59,0)200-500; 220 a , 290b, 445 b320-500; 445, (33,0)240-360; 270 a , 310 b , 360-470; 420 b120-490; 265, (95,5)330-460; 390 b320-460: 370, (27,0) > 700; (3,0)Tabela III. Wyniki analizy DSC badanych substancji pomocniczychSubstancja pomocniczaMasa próbki[mg]Temperaturapoczątku piku[°C]Temperatura piku[°C]Ciepłoprzemiany[mJ]Ciepłowłaściwe[J/g]Glikokol 4,33 251,20 254,69 -4617,79 -1066,46Glukoza 4,30157,05213,85162,11219,40-933,41-1136,10-217,07-264,21Sorbitol 4,26 97,92 99,70 -824,94 -193,65Sacharoza 4,18Celuloza mikrokrystaliczna 4,17Guma arabska 4,20188,32201,69220,5227,56326,5125,80268,08190,87212,83227,2095,95341,88128,17308,74-529,74-29,35-431,56-398,87-721,28-1756,94625,53-126,73-7,02-103,24-95,65-185,90-374,61133,37DSC jest techniką, która może być szczególnie przydatna dowykrywania przemian energetycznych zachodzących podczasogrzewania lub chłodzenia substancji lub mieszaninysubstancji oraz do wyznaczania zmian entalpii, ciepła właściwegoi temperatur, przy których te przemiany zachodzą.Krzywe DSC badanych substancji zilustrowano na rycinie1, natomiast wyniki analizy krzywych zestawiono w tabeliIII. Interpretacja tych danych wskazała na ich dużą zgodnośćz danymi literaturowymi [13-15].WnioskiNa podstawie analiz wykonanych z użyciem metod analizytermicznej i termomikroskopii stwierdzono, że rozkładtermiczny badanych substancji pomocniczych: glikokolu,glukozy, sorbitolu, sacharozy, celulozy mikrokrystaliczneji gumy arabskiej, można przedstawić za pomocą schematuobejmującego trzy etapy rozkładu. Najważniejsze procesycharakteryzujące badane substancje, takie jak dehydratacja,przemiany krystaliczne czy topnienie, przebiegają w etapiepierwszym rozkładu. Odzwierciedlające te procesy charakterystyczneefekty termiczne mogą być wykorzystane dopotwierdzenia tożsamości analizowanych substancji oraz dooceny niektórych właściwości fizykochemicznych.Określenie na podstawie krzywych DSC, DTA i TG zachowaniasię badanych substancji w różnych temperaturachpozwala na wyznaczenie granicznych wartości temperatur,poniżej których analizowane substancje można poddać obróbcetechnologicznej bez groźby wystąpienia niekorzystnychzmian ich właściwości fizykochemicznych. Uzyskane38

Farm Przegl Nauk, 2010,5, 40-44Steroidy neuroaktywne jako modulatory receptorów GABAa– perspektywy zastosowania w terapiiNeuroactive steroids as modulators of GABAa receptors– perspectives for therapyAgata Świerk, Jan PacheckaKatedra i Zakład Biochemii i Chemii KlinicznejWydział Farmaceutyczny Warszawski Uniwersytet MedycznyStreszczenieDo grupy steroidów neuroaktywnych zaliczamy hormonysteroidowe produkowane w nadnerczach, jajnikachoraz jądrach, neuorosteroidy oraz steroidy syntetycznelub egzogenne. Wykazują one zdolność modulowaniafunkcji ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego.Odgrywają rolę w stanach fizjologicznych oraz patofizjologicznychpoprzez modulację szeregu receptorów, w tymreceptora GABAa. Odkryto dwa różne miejsca wiązaniasteroidów neuroaktywnych w obrębie receptora GABAa.Steroidy neuroaktywne w zakresie stężeń od 10 -8 do 10 -5mol/L działają jako pozytywne modulatory receptora. Natomiastw stężeniach od 10 -5 do 10 -3 mol/L są negatywnymimodulatorami receptora GABAa. Zaobserwowano, żepoziom steroidów neuroaktywnych podlega fluktuacjomw stanach patologicznych, które związane są z zaburzeniamitransmisji gabaergicznej. Na poziom steroidówneuroaktywnych wpływają również niektóre leki orazsubstancje psychoaktywne. Poznanie roli, zakresu stężeńfizjologicznych, mechanizmu działania steroidów neuroaktywnychpozwala na prowadzenie prób stosowania tychzwiązków w leczeniu padaczki, schizofrenii, depresji czyalkoholizmu. Ostatnie doniesienia literaturowe sugerująuzyskanie potencjalnych korzyści wynikających ze stosowaniasteroidów neuroaktywnych w terapii uzależnień.Badany jest zarówno ich wpływ na stan i stopień uzależnieniaoraz przebieg zespołu abstynencyjnego. Niestetydotychczas uzyskane wyniki nie są jednoznaczne. Dalszebadania mogą jednak doprowadzić do stosowania steroidówneuroaktywnych w praktyce klinicznej w leczeniuuzależnień i innych chorób.AbstractHormonal steroids synthesized in the adrenals and gonads,neurosteroids synthesized in the brain and syntheticor egzogenous steroids belong to the group of neuroactivesteroids. They have the ability to modulate the central andperipheral nervous system and play a crucial role in manyphysiological and pathophysiological states. Neuroactivesteroids influence many types of receptor, also GABAatype receptor. The latest researchs identified two specificbinding site on GABAa receptor. They can act as positiveallosteric modulators of GABAa receptor in the concentrationrange from 10 -8 to 10 -5 mol/L or as negative allostericmodulators of GABAa receptor in the concentration rangefrom 10 -5 to 10 -3 mol/L. It was observed that, the levelsof neuroactive steroids were altered in several disorders,whitch are also related to disturbances in the gabaergictransmission. Psychoactive drugs can also change theconcentration of neuroactive steroids. Getting to know therole, a physiological concentration, a mechanism of actionallows to try to apply these compounds in the treatmentof epilepsy, schizophrenia, depression or alcoholism. Thelatest researchs demonstrate that, neuroactive steroidsmight offer a new possibilities in drug dependence therapy.Researchers examine their impact on the course ofdrug dependence and the course of withdrawal syptoms.So far, the results obtained are not conclusive. However,in the future, may lead to the use of neuroactive steroids inclinical practice to treat dependence syndrome.Keywords: neurosteroids, drug dependence, GABA(A) ReceptorSłowa kluczowe: neurosteroidy, uzależnienie od leków,GABA(A) receptorWstępZespół uzależnienia wg WHO to kompleks zjawiskfizjologicznych, behawioralnych i poznawczych, wśródktórych przyjmowanie substancji dominuje nad innymizachowaniami, które miały dla pacjenta w przeszłościwiększą wartość [1]. W ostatnich latach powiązano pro-blem uzależnienia z poziomem steroidów neuroaktywnychw organizmie [2-4].Termin steroidy neuroaktywne obejmuje hormony steroidoweprodukowane obwodowo, neurosteroidy produkowanew mitochondriach neuronów i komórek glejowych,jak również steroidy syntetyczne lub egzogenne. Są to tezwiązki steroidowe, które wykazują zdolność do modulo-40

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073wania funkcji ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego[4].Źródłem steroidów obwodowych są nadnercza, jajnikioraz jądra [5], z których są one następnie transportowanez krwią i po przejściu przez barierę krew – mózg trafiają domózgu.Określenie neurosteroidy, wprowadzone w 1981 r.przez Baulieu, zarezerwowane jest tylko dla tych steroidów,które syntetyzowane są w mitochondriach neuronówi komórek glejowych [6]. Synteza ta przebiega de novoz cholesterolu lub z wykorzystaniem prekursorów hormonówsteroidowych powstałych na obwodzie [4, 7]. Baulieui współpracownicy [6], zaobserwowali występowaniesiarczanu dehydroepiandrosteronu (DHEAS) w mózgupo przeprowadzonej wcześniej gonadektomii oraz adrenalektomii.Stwierdzili także, że pregnenolon (PREG),dehydroepiandrosteron (DHEA), ich siarczany i estry lipidowewystępują w większym stężeniu w mózgu i w nerwachobwodowych niż w surowicy. Te dwie obserwacjedoprowadziły zespół Baulieu do wniosku, że steroidy neuroaktywnemuszą być syntetyzowane de novo w obrębieukładu nerwowego. Tylko substancje spełniające obydwapowyższe kryteria tj. mózg jako miejsce syntezy i różnicastężeń tkanki nerwowe vs surowica, są zaliczane do neurosteroidów.Steroidy syntetyczne lub egzogenne to grupasteroidów, która zostaje wprowadzona do organizmuz zewnątrz [4]. Od ponad 20 lat steroidy neuroaktywne sąprzedmiotem zainteresowania badaczy, ze względu na rolęjaką odgrywają w organizmie człowieka.Struktura steroidów neuroaktywnychSteroidy neuroaktywne pod względem strukturalnym sąpochodnymi pregnanu lub androstanu.Do grupy pochodnych pregnanu, zaliczamy kolejno:4-pregnen-3,20-dion (progesteron, P), 3β-OH-5-pregnen-20-on (PREG), siarczan pregnenolonu (PREGS),3α-OH-5β-pregnan-20-on (pregnanolon), 3α-hydroksy-5α-pregnan-20-on (allopregnanolon, ALLO), 3α, 21-dihydroksy-5α-pregnan-20-on (allotetrahydrodeoksykortykosteron,THDOC), dihydroksydeoksykortykosteron(DHDOC). Do drugiej grupy zaliczamy OH-androst-5-en-20-on (DHEA) oraz siarczan dehydroepiandrosteronu(DHEAS) [7].Rys. 2 Wzór androstanu.Wpływ steroidów neuroaktywnychna funkcje organizmuSteroidy neuroaktywne wywierają wpływ na funkcjonowanieorganizmu poprzez szereg receptorów. Są tom.in. receptory AMPA pobudzane przez kwas α–amino–3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowy, receptoryNMDA pobudzane przez kwas N-metylo-D-asparaginowy,receptory kainowe, receptory GABAa specyficzne dla kwasuγ-aminomasłowego czy receptory 5-HT 3specyficzne dlaserotoniny [7].Poziom steroidów neuroaktywnych, syntetyzowanychw organizmie, jest odpowiedni do modulowania receptoraGABAa. Stąd niedaleko już do wniosku, że związki te odgrywająznaczącą rolę w procesach fizjologicznych i patofizjologicznych.[8, 9]. Działanie steroidów neuroaktywnychjest wielokierunkowe. Są one odpowiedzialne za utrzymaniehomeostazy organizmu, są też zaangażowane w mechanizmypatofizjologiczne. Odgrywają istotną rolę w takich stanachfizjologicznych jak stres, ciąża, cykl jajnikowy, dojrzewanieczy starzenie się organizmu [10]. Zaangażowane są równieżw mechanizmy patofizjologiczne takie jak procesy neurodegeneracyjne,czy apoptoza [4].Poziom steroidów neuroaktywnychRys. 1. Wzór pregnanu.Poziom steroidów neuroaktywnych podlega fluktuacjomw różnych stanach chorobowych, które równocześnie wiążesię z zaburzeniami w transmisji gabaergicznej [8, 9, 11].Zaliczamy tu m.in. choroby neurodegeneracyjne, padaczkę,schizofrenię, depresję, stany lękowe jak również uzależnienieod leków [7, 10]. Przykładowo u chorych cierpiących nanerwicę lękową zaobserwowano w surowicy podwyższonestężenie PROG oraz DHEA [12].Za najbardziej rozpowszechnione steroidy w organizmieuważa się PREG oraz DHEA Poziom steroidów DHEAi DHEAS we krwi, w płynie mózgowo-rdzeniowym i w ślinieu człowieka wzrasta gwałtownie od 6-8 roku życia, aby41

Farm Przegl Nauk, 2010, 5osiągnąć najwyższe stężenie w wieku dorosłym. Te sameobserwacje poczyniono dla allopregnolonu oznaczanegow surowicy [13].Do tej pory nie wykazano ścisłej zależności pomiędzypoziomem prekursorów steroidów neuroaktywnych w surowicya ich stężeniem w obrębie tkanki mózgowej. Wiadomo,że 7-9-krotnie wyższe stężenia steroidów obserwuje sięw obrębie układu nerwowego w porównaniu z ich poziomemwe krwi. Korelacja stężenia steroidów neuroaktywnych wekrwi i w mózgu jest trudna ze względu na brak dostępnościmateriału do badań. [14].Dla niektórych steroidów neuroaktywnych ustalono wartościstężeń fizjologicznych. Stężenie w jakim występujenaturalnie steroid, bądź steroid podany z zewnątrz wpływana mechanizm oraz kierunek jego działania [15]. Zakres stężeńterapeutycznych pozytywnych modulatorów mieści sięw granicach 10 -8 do 10 -5 mol/L, natomiast działań negatywnychwynosi od 10 -5 do 10 -3 mol/L [16].Leki oraz substancje psychoaktywne takie jak etanol,nikotyna, kofeina, tetrahydrokanabinole, morfina, antydepresanty,olanzapina czy klozapina, podwyższają stężeniesteroidów neuroaktywnych [10]. U szczurów tetrahydrokanabinolei morfina powodują wzrost stężenia allopregnanolonuw mózgu, podczas gdy kokaina nie wywiera wpływuna jego poziom w mózgu. Natomiast zarówno tetrahydrokanabinolejak i kokaina podwyższają stężenie progesteronuw surowicy. Nie ma więc ścisłej korelacji między stężeniemprekursorów steroidów neuroaktywnych w surowicy a ichstężeniem w obrębie mózgu [17].Receptor GABAa a steroidy neuroaktywneReceptor GABAa jest ogniwem łączącym działanie szereguleków. Poprzez modulację tego receptora wywierająwpływ na organizm człowieka m.in. benzodiazepiny i barbiturany.Receptor GABAa zbudowany jest z pięciu podjednostekglikoproteinowych, które współtworzą centralny kanałjonowy dla anionów chlorkowych. Pozytywny modulatorpoprzez przyłączenie się do specyficznego miejsca, wywołujezmianę konformacji receptora, co w konsekwencjipowoduje napływ jonów chlorkowych do wnętrza neuronui jego miejscową hiperpolaryzację. Tym samym dochodzido zahamowania aktywności neuronu.Sklonowanie podjednostek α 1i β 1w latach 80–tych XXwieku dało początek badaniom, które doprowadziły do zidentyfikowaniaośmiu klas podjednostek receptora GABAa.Cztery z nich mają po kilka odmian izomerycznych. Wyróżniasię sześć izoform podjednostki α (1–6), trzy izoformypodjednostki β (1-3), γ (1-3), ρ (1-3) oraz po jednej podjednostceizoform δ, ε, θ, π. Daje to łączną liczbę 19 izoform,które zostały dotychczas poznane. Pomiędzy poszczególnymiklasami podjednostek obserwuje się 30%-40% homologiisekwencji aminokwasów, pomiędzy izoformami w obrębiejednej podklasy podobieństwo strukturalne wynosi 60-80%.Pomimo dużej liczby teoretycznych, możliwych kombinacjipodjednostek, wyróżnia się jedynie 20 do 30 izoform receptoraGABAa. Każdy typ, w zależności od składu podjednostkowegowykazuje specyficzną, charakterystyczną dlasiebie lokalizację w obrębie mózgu, a jego pobudzenie dajeodpowiednie efekty fizjologiczne i farmakologiczne. Receptoryzawierające podjednostki α1, α2, α3, α5 w połączeniuz podjednostką β oraz γ2 są najbardziej rozpowszechnionew obrębie mózgu. Około 60 % izoform stanowi podtypreceptora α1β2γ2 (tylko kilka regionów mózgu nie posiadatego typu receptora), 15-20% podtyp α2β3γ2, 10-15%podtyp α3βxγ2 [18]. Podjednostki te występują najczęściejw następujących proporcjach: dwie podjednostki α, dwiepodjednostki β oraz jedna podjednostka γ. Inne podtypystanowią mniejszy procent całej puli receptora GABAa, nieoznacza to jednak, że ich znaczenie dla funkcjonowania organizmujest mniej znaczące [9].Działanie modulatorów zależy od składu podjednostkowegoreceptora. Podjednostka α1 pośredniczy np. w wywołaniudziałań: uspokajającego, przeciwdrgawkowego orazamnezyjnego przez benzodiazepiny, natomiast podjednostkaα2 – anksjolitycznego i miorelaksacyjnego. Występowaniepodjednostki α4 czy α6 sprawia, że receptor jest niewrażliwyna działanie benzodiazepin.Steroidy neuroaktywne są zdolne do modulowania funkcjiwiększości podtypów receptora, nie wykazując selektywnościw stosunku do podjednostek receptora, dzięki czemuwykazują szerokie spektrum działania farmakologicznego.Wpływają na receptory zbudowane z podjednostek αβ, αβγ,czy αβδ. Najwyższe powinowactwo wykazują w stosunkudo receptorów αβδ [19].Modulatory receptora GABAa wywierają swe działaniepoprzez wpływ na prąd jonów chlorkowych w kanale receptora,czyli przewodnictwo, częstotliwość oraz czas otwarciakanału.Przykładowo, benzodiazepiny po przyłączeniu się domiejsca wiązania zwiększają powinowactwo GABA doreceptora, jak również zwiększają częstotliwość otwieraniakanału jonowego receptora. Benzodiazepiny wywierajądziałanie farmakologiczne tylko w obecności endogennegoGABA. Steroidy neuroaktywne wydłużają czas orazczęstotliwość otwierania kanału receptora.[20]. Zwiększająpowinowactwo GABA do receptora i mogą działać takżeniezależnie od obecności kwasu γ-aminomasłowego. Typdziałania zależny jest od miejsca przyłączenia się ligandu doreceptora. Po ponad 25 latach badań w przybliżeniu zostałpoznany mechanizm oddziaływania steroidów neuroaktywnychz receptorem GABAa. Miejsce wiązania zlokalizowanow obrębie podjednostki α, przyłączenie do tej podjednostkisteroidu neuroaktywnego wywołuje zmiany konformacyjnei zwiększa powinowactwo GABA do receptora. Natomiastpoprzez oddziaływanie cząsteczki steroidu neuroaktywnegow przestrzeni zlokalizowanej pomiędzy podjednostkami αi β dochodzi do bezpośredniej aktywacji receptora [11, 19].Fizjologiczne stężenie dla allopregnanolonu, zwiększającepowinowactwo GABA do receptora, wynosi 10 – 30 nmol/L.Przy stężeniu 100 µmol/L steroid może otworzyć kanałchlorkowy w nieobecności GABA [15]. Te same obserwacjepoczyniono dla THP i THPDOC [8].Ostatnio zaobserwowano wpływ podjednostki δ na łączeniesię steroidów neuroaktywnych z receptorem [19].Ani benzodiazepiny, ani steroidy neuroaktywne nie wpływająna przewodnictwo.Kierunek oraz mechanizm działania steroidów neuroaktywnychzależy m.in. od ich stężenia w tkance docelowej.42

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Przykładowo DHEA jest pozytywnym modulatorem receptoraGABAa w niskim stężeniu (nmol/L) w obrębie mózgu,lub modulatorem negatywnym gdy występuje w wyższymzakresie stężeń (μmol/L) [13].Receptory GABAa zawierające w swym składzie podjednostkiα i γ są wrażliwe zarówno na pozytywną jak i negatywnąmodulację przez steroidy neuroaktywne z grupą hydroksylowąw pozycji 3α. Jako związki aktywujące receptorGABAa wykazują działanie przeciwlękowe, uspokajające,nasenne, amnezyjne, analgetyczne, przeciwdrgawkowe orazmiorelaksacyjne. Zakres działania steroidów neuroaktywnychpokrywa się z wpływem benzodiazepin na organizmczłowieka. Wymagania strukturalne steroidów neuroaktywnychdla pozytywnej modulacji receptora GABAa to grupaOH w pozycji α przy C3 i grupa OH w pozycji α/β przy C5i C21 pierścienia A [5]. Do pozytywnych modulatorów zaliczamywięc 3α5α oraz 3α, 5β- zredukowane metabolity progesteronu(allopregnanolon, pregnanolon), dezoksykortykosteronu(DOC) (THDOC), dehydroepiandrosteronu (DHEA)(androstendion) i testosteronu [5, 10, 21]. Progesteron działanasennie, przeciwlękowo, amnezyjnie, przeciwdrgawkowo.Steroidy neuroaktywne będące negatywnymi modulatoramireceptora GABAa są odpowiedzialne za przeciwstawnedziałanie w stosunku do GABA i pozytywnych modulatorów,czyli powodują wystąpienie lęku, działają pobudzająco,drgawkotwórczo, zwiększają napięcie mięśni. Zaliczasię tu PREGS, DHEAS [21]. Zawierają one w swej strukturzegrupę OH w pozycji β przy C3 [8].Potencjalne korzyści terapeutyczneOstatnie doniesienia sugerują uzyskiwanie potencjalnychkorzyści zdrowotnych ze stosowania steroidów neuroaktywnychw terapii stwardnienia rozsianego, padaczki,schizofrenii, depresji lub alkoholizmu. Próby kliniczneobejmują użycie prekursorów pregnanolonu, progesteronu,czy syntetycznego ganaloksonu. Uważa się, że za działaniepregnenolonu w terapii schizofrenii odpowiada jegometabolit (3α, 5α) – 3 – hydroksypregnan – 20 – on (3α,5α – THP) [10].Przewlekłe podawanie steroidów neuroaktywnych takichjak 3α, 5α – THP, czy 3α, 5α – THDOC, oraz ichodstawianie przyczynia się do zwiększonej ekspresji podjednostkiα4 receptora GABAa [5]. To zaś jest przyczynąniewrażliwości receptora na benzodiazepiny, zwiększonejpobudliwości ośrodkowego układu nerwowego, oraz możetłumaczyć występowanie paradoksalnego efektu pobudzającegowywoływanego przez steroidy neuroaktywne działającejako pozytywne modulatory receptora GABAa.Interesujące są badania dotyczące poziomu endogennychsteroidów neuroaktywnych w przebiegu uzależnieniaod substancji psychoaktywnych, zastosowania egzogennychsteroidów w celu złagodzenia uzależnienia, objawów abstynencyjnych.Głównym objawem uzależnienia jest przymusprzyjmowania substancji psychoaktywnej, która może być,ale niekoniecznie, środkiem stosowanym w medycynie. Dośrodków tych zaliczamy między innymi alkohol, opioidy,kanabinoidy, środki uspakajające i hipnotyczne, kokainę,kofeinę. Chociaż już wiadomo, że długotrwała ekspozycjana morfinę czy benzodiazepiny skutkuje rozwojem tolerancjii uzależnieniem, to neurobiologiczne podstawy tych zjawisknie są w pełni poznane. Próby wychodzenia z uzależnieniamają dwa cele: po pierwsze osiągnięcie abstynencji, po drugiedługotrwałe lub ciągłe utrzymanie abstynencji, dziękitakiemu kierowaniu postępowaniem chorego, które pomożemu uniknąć nawrotu choroby. Próby te obejmują zazwyczajsubstytucję innym lekiem np. podawanie buprenorfinyw przypadku uzależnienia od morfiny czy diazepamu bądźklorazepatu w przypadku uzależnienia od innych benzodiazepin.Ostatnio bada się wpływ podawania egzogennych steroidówneuroaktywnych na przebieg uzależnienia i przebiegzespołu abstynencyjnego [2]. Główna uwaga skupiona jestna DHEA, być może ze względu na relatywnie największąjego ilość w organizmie w porównaniu z innymi steroidamineuroaktywnymi oraz na obniżanie zakończone sukcesemdążenia do zaspokojenia nałogu [2]. Istnieją doniesieniana temat roli DHEA w procesie uzależnienia oraz wychodzeniaz tego stanu. Zaobserwowano zależność pomiędzypoziomem DHEAS a skutecznością leczenia z uzależnieniaod kokainy. Lepsze wyniki leczenia uzyskano u pacjentówz wyższymi stężeniami endogennego DHEAS [3]. Przy stosowaniuDHEA w dawce 100 mg/dzień u pacjentów uzależnionychod heroiny, najlepsze efekty uzyskano u tych osób,które nie były uzależnione od innych substancji (kokaina,benzodiazepiny) oraz nie podejmowały wcześniej prób odstawieniaheroiny. U części leczonych podawanie DHEA nieprzynosiło korzyści, a wręcz przeciwnie stało się przyczynąpogarszenia stanu chorego. Należy jednak podkreślić, że badanianie uwzględniały różnic genetycznych i środowiskowych[2]. W innych badaniach zaobserwowano, że DHEASzapobiega rowojowi uzależnienia od morfiny [22].PerspektywyCały czas trwają badania nad steroidami neuroaktywnymi,ze szczególnym uwzględnieniem molekularnegomechanizmu i kierunku ich działania farmakologicznegooraz zakresem stężeń fizjologicznych. Poszukuje się nowychmetod analitycznych, które pozwolą na mniej czasochłonnyi bardziej precyzyjny i specyficzny pomiar stężeniasteroidów neuroaktywnych w tkankach i we krwi.Powyższe badania mogą w przyszłości doprowadzić dowykorzystania steroidów neuroaktywnych w praktyce klinicznejw leczeniu uzależnień i innych chorób układu nerwowego.Piśmiennictwo1. http://www.who.int/substance_abuse/terminology/definition1/en/index.html2. Maayan R i wsp. The effect of DHEA complementarytreatment on heroin addicts participating in a rehabilitationprogram: A preliminary study. Eur Neuropsychopharmacol.2008; 18: 406–413.3. Wilkins JN i wsp. DHEAS and POMS measures identifycocaine dependence treatment outcome. Psychoneuroendocrinology.2005; 20: 18–281.4. Melcangi RC, Garcia-Segura LM, Mensah-Nyagan AG.Neuroactive steroids: State of the art. And new perspectives.Cell.Mol. Life Sci. 2008; 65: 777–797.43

Farm Przegl Nauk, 2010, 55. Morrow AL. Recent developments in the significance andtherapeutic relevance of neuroactive steroids – Introductionto the special issue. Pharmacol Ther. 2007; 116: 1–6.6. Baulieu EE. Neurosteroids: a novel function of the brain.Psychoneuroendocrinology. 1998; 23 (8): 963-987.7. MacKenzie EM i wsp. The Relevance of NeuroactiveSteroids in Schizophrenia, Depression, and Anxiety Disorders.Cell Mol Neurobiol. 2007; 27 (5): 541–574.8. Dubrovsky BO. Steroids, neuroactive steroids andneurosteroids in psychopatology. Prog. Neuro-psychopharmacol.Biol. Psychiatry. 2005; 29: 169–192.9. Mitchel EA i wsp. Neurosteroid modulation of GABAareceptors: Molecular determinants and significance inhealth and disease. Neurochem Int. 2008; 52: 588–595.10. Porcu P i wsp. Simultaneus quantification of GABAergic3α,5α/3α,5β neuroactive steroids in human and ratserum. Steroids. 2009; 74: 463–473.11. Herd MB, Belleli D, Lambert JJ. Neurosteroid modulationof synaptic and extrasynaptic GABAa receptors.Pharmacol Ther. 2007; 116: 20–34.12. Brambilla F i wsp. Plasma concentrations of anxiolyticneuroactive steroids in men with panic disorder. PsychiatryResearch. 2005; 135: 18–190.13. Witt ED. Puberty, hormones, and sex differences inalcohol abuse and dependence. Neurotoxicol Teracol.2007; 29: 81–95.14. Schumacher M. Steroid hormones and neurosteroids innormal and pathological aging of nervous system. ProgNeurobiol. 2003; 71: 3–29.15. Smith SS. Withdrawal properties of a neuroactive steroid:implication for GABAa receptor gene regulationin the brain and anxiety behavior. Steroids. 2002; 67:51–528.16. Rupprecht R, Holsboer F. Neuroactive steroids: mechanismof action and neuropsychopharmacological perspectives.Trends Neurosci. 1999; 22: 410-416.17. Grobin Ach i wsp. Cortical 3α-hydroxy-5α-pregnan-20-one levels after acute administration of Δ9-tetrahydrocannabinol, cocaine and morphine. Psychopharmacology.2005; 179: 544–550.18. Mohler H. Molecular regulation of cognitive functionsand developmental plasticity: impact of GABAa receptors.J. Neurochem. 2007; 102: 1–12.19. Hosie AM i wsp. Conserved site for neurosteroid modulationof GABAa receptors. Neuropharmacology. 2009;56: 149–154.20. Mellon SH, Griffin LD. Neurosteroids: biochemistryand clinical significance. Trends Endocrinol Metab.2002; 13 (1): 35–43.21. Strous RD, Maayan R, Weigman A. The relevance ofneurosteroids to clinical psychiatry: From the laboratoryto the bedside. Eur. Neuropsychopharmacolog. 2005;16: 155–169.22. Ren X i wsp. A neuroactive steroid, dehydroepiandrosteronesulfate, prevents the development of morphinedependence and tolerance via c-fos expression linked tothe extracellular signal-regulated protein kinase. BehavBrain Res 2004; 152 (2): 243-250.data otrzymania pracy: 23.04.2010 r.data akceptacji do druku: 05.05.2010 r.Adres do korespondencji:mgr Agata ŚwierkKatedra i Zakład Biochemii i Chemii KlinicznejWydział Farmaceutyczny Warszawski Uniwersytet MedycznyWarszawa ul. Banacha 1tel. +48 22 572 07 68agata.swierk@poczta.fm44

Farm Przegl Nauk, 2010,5, 45-48copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Bivalirudin can change strategy in interventional cardiologyallowing one day discharge after elective percutaneouscoronary and peripheral interventionsBiwalirudyna może zmienić strategię w kardiologii interwencyjnejumożliwiając wykonanie wybranych przezskórnych zabiegów,zarówno wieńcowych jak i obwodowych, w trybie ambulatoryjnymBarbara K. Wiernek 1,2 , R. Stefan Kiesz 1,31San Antonio Endovascular & Heart Institute, San Antonio, TX2Medical University of Silesia, Department of Biophysics, Sosnowiec, Poland3The University of Texas Health Science Center at San Antonio, TXAbstractBivalirudin is a 20 amino acid polypeptide hirudin analogand one of the direct thrombin inhibitors. It has beenevaluated as an alternative to unfractionated and low-molecular-weightheparins in the settings of acute coronarysyndrome (ACS) and percutaneous coronary intervention(PCI). Bivalirudin displays bivalent and reversible bindingto the thrombin molecule, inhibiting its action. Resultsof multiple clinical trials to date suggest bivalirudin withprovisional IIb/IIIa antagonists provides consistent resultsacross the full spectrum of ACS, with similar or non-inferiorprotection from ischemic events and significantly reducesbleeding complications compared with heparin withglycoprotein (GP) IIb/IIIa inhibitors. Bivalirudin presentsthe unique pharmacokinetic profile, very quick onset andshort half-life what potentially can change interventionalcardiology and enable outpatient interventions on electivecases. This article reviews the use of bivalirudin and clinicaltrial outcomes to date.Key words: bivalirudin, direct thrombin inhibitor (DTI),acute coronary syndrome (ACS), percutaneous coronaryintervention (PCI)StreszczenieBiwalirudyna jest 20 aminokwasowym polipeptydowymanalogiem hirudyny i jednym z bezpośrednich swoistychinhibitorów trombiny. Stosowana jest jako alternatywadla niefrakcjonowanej i drobnocząsteczkowej heparynyw leczeniu ostrych zespołów wieńcowych oraz w czasieprzezskórnych interwencji wieńcowych. Biwalirudynawykazuje biwalentne i odwracalne wiązanie do cząsteczkitrombiny, hamując jej aktywność. Wyniki wielu najnowszychbadań klinicznych sugerują, że biwalirudynaz tymczasowym użyciem antagonistów IIb/IIIa zapewniaporównywalne wyniki w leczeniu ostrych zespołówwieńcowych, porównywalną ochronę przed niedokrwieniemoraz znacząco obniża ryzyko wystąpienia powikłańkrwotocznych w porównaniu do heparyny niefrakcjonowanejw połączeniu z inhibitorami glikoproteiny IIb/IIIa.Biwalirudyna posiada unikalny profil farmakokinetyczny,szybki początek działania oraz krótki okres połowicznegorozpadu, dzięki którym może teoretycznie zmienić obecnestandardy w kardiologii interwencyjnej i umożliwić wykonywaniezabiegów u określonej grupy pacjentów w trybieambulatoryjnym. Ten artykuł dokonuje przeglądu zastosowaniabiwalirudyny oraz obecnych wyników badań.Słowa kluczowe: biwalirudyna, bezpośrednie inhibitorytrombiny, ostry zespól wieńcowy (OZW), przeskórna interwencjawieńcowaDirect thrombin inhibitors (DTIs) such as bivalirudin,argatroban or lepirudin represent a new class of promisinganticoagulation agents, which provide an attractive alternativefor anticoagulation in the settings of acute coronarysyndrome (ACS) and percutaneous coronary interventions(PCI). These agents inhibit thrombin directly, acting to preventthrombin activation and generation [1].Bivalirudin (Angiox/Angiomax; The Medicines Company,Parsipanny, NJ) was approved for clinical use in US in December2000 as an alternative to heparin for patients with unstableangina during PCI, based primarily on the results of a randomizedstudy from 1994 [2]. In that study of 4312 patients, ischemicevents were decreased by 22% and hemorrhagic complicationsby 62% with bivalirudin compared to heparin [3].Bivalirudin is a synthetic, short 20-amino-acid polypeptide(Fig. 1) (a synthetic congener of the naturally occurringdrug hirudin - naturally occurring peptide found in the salivaof the medicinal leech Hirudo medicinalis) that interactswith both the active site and exosite 1 on thrombin.Once bound to thrombin, the bivalirudin molecule is slowly45

Farm Przegl Nauk, 2010, 5Fig 1. D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolyl-glycyl-glycyl-glycyl-glycyl-L-asparagyl-glycyl-L-aspartyl-L-phenylalanyl-Lglutamyl-L-glutamyl-L-isoleucyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-tyrosyl-L-leucinetrifluoroacetate (salt) hydrate[4].Fig 2. Bivalirudin Major Clinical Trials.HORIZONS AMI – Harmonizing Outcomes with RevascularIZatiON and Stents in Acute Myocardial Infarction Study;ACUITY – The Acute Catheterization and Urgent Intervention Triage strategY trial; BIAMI – Bivalirudin In the Managementof Patients with ST-Segment Elevation Acute Myocardial Infarction Undergoing Primary PCI; APPROVE – AngiomaxPeripheral Procedure Registry Of Vascular Events trial; ATBAT – Anticoagulant Therapy with Bivalirudin to Assistin the Performance of Percutaneous Coronary Intervention in Patients With Heparin-Induced Thrombocytopenia ; REPLA-CE-2 – Randomized Evaluation of PCI Linking Angiomax to Reduced Clinical Events part 2; CACHET – Comparison ofAbciximab Complications with Hirulog for Ischemic Events Trial; REPLACE-1 – Randomized Evaluation of PCI LinkingAngiomax to Reduced Clinical Events part 1; BAT – Bivalirudin Angioplasty Trial.cleaved by thrombin with consequent recovery of functionof the thrombin active site, but competitive inhibition withlow-affinity binding to the exosite 1 remains. Therefore,bivalirudin has several advantages over heparin, includinghigh specificity and potency for thrombin inhibition, independencefrom antithrombin for activity, inhibition of bothfree and clot-bound thrombin, lack of platelet activation,and no association with immune-mediated thrombocytopeniaand thrombosis or cross-reactivity with heparin inducedthrombocytopenia (HIT) antibodies [1].Several trials were published defining the role of bivalirudinand provisional glycoprotein IIb/IIIa inhibition ininterventional cardiology [1, 2, 5-19]. (Fig 2.)The Randomized Evaluation in PCI Linking Angiomaxto Reduced Clinical Events (REPLACE - 2) trial showed thatintraprocedural administration of bivalirudin with provisio-46

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073nal GP IIb/IIIa blockade provides similar protection fromacute ischemic events with significantly fewer hemorrhagiccomplications as a regimen of heparin plus planned GP IIb/IIIa inhibition during elective or urgent PCI [2, 12]. Majorin-hospital bleeding rates were significantly reduced withbivalirudin from 4.1% to 2.4% (p

Farm Przegl Nauk, 2010, 514. Stella J et al. The bivalirudin in the management of patientswith ST-segment elevation acute myocardial infarctionundergoing primary PCI (BIAMI) trial: in-hospital,30-day, and 6-month results. Cathet CardiovascInterv 2006; 67: 751.15. Stone GW et al. for the ACUITY Investigators. Bivalirudinfor patients with acute coronary syndromes. N EnglJ Med 2006; 355: 2203-2016.16. Manoukian SV et al. Impact of major bleeding on 30-day mortality and clinical outcomes in patients with acutecoronary syndromes: an analysis from the ACUITYTrial. J Am Coll Cardiol 2007; 49: 1362-1368.17. Stone GW et al. for the Acute Catheterization and UrgentIntervention Triage strategy (ACUITY) trial investigators.Bivalirudin in patients with acute coronary syndromesundergoing percutaneous coronary intervention: asubgroup analysis from the Acute Catheterization andUrgent Intervention Triage strategy (ACUITY) trial.Lancet 2007; 369: 907-919.18. White HD et al. Safety and efficacy of bivalirudin withand without glycoprotein IIb/IIIa inhibitors in patientswith acute coronary syndromes undergoing percutaneouscoronary intervention; 1-year results from theACUITY (Acute Catheterization and Urgent InterventionTriage strategY) trial. J Am Coll Cardiol 2008; 52:807-814.19. Stone GW et al. for the HORIZONS AMI trial investigators.Bivalirudin during primary PCI in acute myocardialinfarction. N Engl J Med 2008; 358: 2218-2230.20. Warkentin TE, Greinacher A, Koster A. Bivalirudin.Thromb Haemost 2008; 99: 830-839.21. Kiesz RS et al. The same day discharge after coronaryand peripheral percutaneous interventions. Bivalirudinand Catalyst II Wire System strategy (GO HOME Study).J Am Coll Cardiol 2009; 53: 55A.data otrzymania pracy: 10.03.2010 r.data akceptacji do druku: 12.05.2010 r.Corresponding author:Barbara Wiernekbwiernek@sbcglobal.nettel. 798 553 83948

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OFMANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewedtransdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicineand related sciences. The journal publishes conferencereports and materials, conference announcements, as well asletters to the Editor.2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printedand an electronic form. Electronic versions of articles are to besent to kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl or supplied onCD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagramsand figures) should be addressed to:Scientific Review in Pharmacy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Disk label should contain the first name(s) and surname(s)of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphicsshould be included in separate files. Do not paste pictures andgraphics to text files. The Editor advises to use Star Office,Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.3. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief.The Authors are encouraged to suggest their reviewers,however the final selection of a reviewer is up to the EditorialBoard. The Editor-in-Chief reserves the right to correct orabbreviate the text (after the Author’s approval).Authors are requested to resubmit the revised manuscriptwithin four weeks. Papers that are not resubmitted withinfour weeks will be treated as a new submission.The manuscript that has been rejected by the ScientificReview in Pharmacy should not be resubmitted.4. A cover letter should be included with the manuscript, containinga declaration that the manuscript has not been previouslypublished in print or electronic format and is not under considerationby another journal or electronic medium, signed by allthe Authors. It should also include written approval from thehead of the institution in which the study was conducted.5. All human and animal research will have obtained ethical consentfrom the local Bioethical or Ethical Committee.6. The material sent in and the review will remain among thedocumentation of the Board of Editors.7. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the wholeof the copyrights for the published papers (including the rightto publishing in print, on electronic media, such as CD-ROMdisks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries isallowed without any written permission of the Editor.8. Instructions for authors:8.1. Manuscript Page Setup• Paper: white, A4 format.• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.• Text: Double-spaced, one side of the page only.• Numbering: Insert page numbers at bottom right of eachpage.• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extraline space between paragraphs.• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,with one line above. Indent first line after a subhead. Use anextra line space between the subhead and the text.• Title or Heading of the article: boldface, on separateline.• Second-level subhead: boldface, on separate line.• Third-level subhead: italic, on separate line.8.2. Organization of Manuscript• Title page should include: submission date and Author(s)full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’full current affiliations (for papers with multiply authors,please enumerate the authors and their affiliations in thefollowing way: Author 1 , Author 2 , etc; 1 Affiliation, 2 Affiliation,etc.). Affiliations should contain the full name of the institution.One corresponding author must be designated forpapers with coauthors. At the bottom of the page the fullname, academic degrees/titles, and address of the correspondingauthor should be given, including the telephonenumber, fax number and/or e-mail address. If researchhas been funded, please indicate the source of funding(including grant index/symbol, grant agencies, corporations,or sponsors).• The second page should include an abstract (150-250words). The abstract must be self-contained, and must notrequire reference to the paper to be understood. The abstractshould present objectives and scope of the study orreasons for writing the paper. The methods and techniquesor approaches should be described only to the extent necessaryfor comprehension. The findings and conclusionsshould be concise and informative. The abstract shouldbe followed by the key words consistent with the MedicalSubject Headings Index Medicus, and should not containunfamiliar terms that are not defined, undefined acronymsand reference citations. Neither displayed equations orlists should appear in the abstract.• Body text should be organized as follows:original paper - introduction, material and methods descriptions,research results, discussion;review papers – free structure;case studies – introduction (motivation for the study), casedescriptions, discussion of the characteristic symptoms,treatment results etc.• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-whitephotographs) should be put into a separate envelope. Oneach figure there should be its number (Arabic numerals),the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.Figure captions should be placed on separate pages andnumbered consecutively using Arabic numerals. Previouslypublished visual materials should be supplied togetherwith the written consent of the Publisher for reprint.• Tables, each on a separate page, should be numberedusing Roman numerals and preceded by their captions.Table captions should be placed on separate pages, numberedusing Roman numerals.• The papers should not exceed the following limitations:original and review work – 10 pages and others – 5 pages.8.3. References to the works cited should be presented at theend of the paper and arranged according to the sequenceof citations in the body text. The acronyms for journal titlesshould be used according to Index Medicus. Each entry,starting with a new line, should be given a number andmust be presented as follows:• journal citation:Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:557-67.If there are more than three authors, the name of the firstone should be given, followed by an ,,et al” annotation.Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activity andglycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:97-102.• the specific chapter:Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. BiochemiaHarpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.Warszawa 1994, 59-69.• monograph:Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw2004.References to the works cited within the text should be numberedusing Arabic numerals and placed between brackets,e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations:original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliographyentries.49

Farm Przegl Nauk, 2010, 5REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowaneprace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe,z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych.Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na tematkonferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłaćw formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:Farmaceutyczny Przegląd Naukowy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:CMYK, rozdzielczość 300 dpi.3. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonychkażdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca sięautorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcjazastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniuz autorem).Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu,zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającymczterech tygodni. W przeciwnym raziepraca będzie traktowana jako nowa publikacja.Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta niemoże być ponownie przedkładany Redakcji FarmaceutycznegoPrzeglądu Naukowego.4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie byłauprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcjiinnego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawieraćrównież podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodęKierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczeniepublikacji w czasopiśmie.5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, któresą przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, musząmieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacjiRedakcji.7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskichdo wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, nanośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszczasię natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.8. Instrukcje dla autorów8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, nabiałym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnegoodstępu między kolejnymi wierszami.• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy odstrony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnymrogu.• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowychodstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównanedo lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstemnależy wprowadzić jeden odstęp.• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubionączcionką.• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochylonączcionką,8.2 Układ manuskryptu• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora-(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowychprzy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliacjękażdego z nich, w następujący sposób Autor 1 , Autor 2 ,…; 1 Afiliacja, 2 Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim,nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję,dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanychprosimy o wskazanie źródła finansowania (w tymnumery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lubsponsorów).• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będąceautonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczaćodnośników literaturowych. Streszczenie powinnozawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawoweprocedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych,metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Podstreszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w językupolskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject HeadingsIndex Medicus.• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,według następującego schematu:prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,dyskusja oraz wnioski;prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziałyi podrozdziały;prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby,charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe)powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane,opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać naoddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframiarabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane,należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy naponowną publikację.• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należyponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułamiumieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać naoddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframirzymskimi.• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinnawynosić 10, a pozostałych – 5 stron.8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowaniaw tekście pracy.Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z IndexMedicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,powinna być opatrzona numerem oraz zredagowanazgodnie z niżej podanym przykładem:• czasopismo naukowe:np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibroticdisorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podaćnazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activityand the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;331: 97-102.• wydawnictwo zbiorowe:np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: BiochemiaHarpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 1994, 59-69.• monografia:np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław2004.Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych,powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracachoryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do10 pozycji.50