Nowoczesna diagnostyka medyczna oraz biosensory w medycynie ...

RAPORT (prof. dr hab. Jakub Gołąb)Nowoczesna diagnostyka medyczna oraz biosensory w medycynieImmunoglobuliny (przeciwciała) są najważniejszymi cząsteczkami układuodpornościowego. Mają one zdolność swoistego (specyficznego) łączenia się zantygenem i są najważniejszym składnikiem wielu testów diagnostycznych. Z tegopowodu znajomość ich budowy, właściwości i powstawania jest niezbędna dozrozumienia zasad działania tych testów oraz do opracowywania nowych rozwiązańtechnologicznych.BUDOWA PRZECIWCIAŁPrzeciwciała są zbudowane z czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch lekkich(L, z ang. light) oraz dwóch ciężkich (H, z ang. heavy). Każdy łańcuch lekki jestkowalencyjnie połączony z łańcuchem ciężkim wiązaniami dwusiarczkowymi.Wyodrębnia się dwa warianty łańcuchów lekkich: typ κ (kappa) i typ λ (lambda), któresą kodowane przez odrębne geny i różnią się sekwencją aminokwasów w regionachnie uczestniczących w wiązaniu antygenów. Istnieje również pięć różnych typówłańcuchów ciężkich: α (alfa), δ (delta), ε (epsilon), γ (gamma) oraz µ (mi). Wzależności od typu łańcucha ciężkiego występującego w przeciwciele wyróżnia siępięć klas: IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM. Ponadto, w zależności od drobnych różnic wbudowie łańcuchów ciężkich w obrębie tej samej klasy wyodrębnia się podklasyprzeciwciał, na przykład: IgA1 i IgA2 lub IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgD, IgE oraz IgMwystępują tylko w jednej klasie. Niektóre przeciwciała mogą występować w postacimonomerycznej (dwa łańcuchy ciężkie oraz dwa lekkie) bądź w polimerycznej (kilka1

Fab Fcczterołańcuchowych przeciwciał połączonych w duży kompleks poprzez dodatkowyłańcuch łączący J). Przeciwciała IgM mogą występować jako penatamery lubheksamery, natomiast IgA w wydzielinach śluzowo-surowiczych jest przeważniedimerem lub tetramerem.łańcuch lekkiS-SS -SłańcuchciężkiS-SS-SRyc. Schemat budowy przeciwciałaW łańcuchach lekkich i ciężkich przeciwciała można wyróżnić części stałe (C,z ang. constant) oraz części zmienne (V, z ang. variable). Części zmienne jednegołańcucha ciężkiego oraz jednego łańcucha lekkiego tworzą tak zwany fragmentwiążący antygen (Fab, z ang. fragment antigen binding). Każde monomeryczneprzeciwciało ma dwa fragmenty Fab i w związku z tym może wiązać jednocześniedwa antygeny. Część fragmentu Fab, która bezpośrednio kontaktuje się z antygenemnazywa się paratopem. Paratop jest przestrzennie dopasowany do determinantyantygenowej, czyli epitopu. Znacznie większy fragment przeciwciała, nieuczestniczący w wiązaniu antygenu, to tak zwany fragment Fc.Specyficzność w wiązaniu antygenu wynika z konformacji przestrzennejregionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich. Konfiguracja przestrzenna2

natomiast jest rezultatem sekwencji aminokwasów w tych częściach łańcuchów.Części zmienne wchodzące w skład fragmentu Fab przeciwciała są różne dlaprzeciwciał wiążących różne epitopy, części stałe natomiast są identyczne dlawszystkich przeciwciał danej klasy, ewentualnie podklasy. Należy w tym miejscudodać, że jeden antygen może mieć wiele epitopów (identycznych lub zupełnieodmiennych) i w związku z tym może być wiązany przez więcej niż jednoprzeciwciało. Niemniej istnieją również antygeny jednoepitopowe (zazwyczaj bardzomałe). Do wykrywania takich antygenów nie nadają się standardowe testydiagnostyczne takie jak ELISA i jej odmiany.Istnieją również tak zwane przeciwciała wielospecyficzne (polispecyficzne,polireaktywne). Mogą one wiązać więcej niż jeden antygen, choć zazwyczajantygeny te są do siebie bardzo zbliżone strukturalnie. Większośćwielospecyficznych przeciwciał należy do klasy IgM.W obrębie części zmiennej każdego łańcucha wyodrębnia się 3 regionyhiperzmienne i przylegające do nich 4 regiony zrębowe (z ang. frame regions – FR).Regiony te określają specyficzność danego przeciwciała i to one właśnie tworząparatop. Niekiedy określane są one jako regiony determinujące dopasowanie (z ang.complementarity determining regions – CDR). Są to tak zwane "gorące" miejsca (hotspots) immunoglobulin.Możliwe jest związanie dwóch różnych, bardzo małych epitopów przez jednomiejsce wiążące antygen przeciwciała. Bardzo małe antygeny mogą byż całkowicielub częściowo zagłębione we fragmencie Fab przeciwciała. W większości wypadkówjednak powierzchnia kontaktu antygenu z przeciwciałem jest rozciągnięta i bardziejpłaska, choć zawiera liczne pofałdowania.Charakterystyczne dla przeciwciał jest występowanie powtarzających sięsekwencji aminokwasowych określanych jako domeny (najczęściej domeny3

immunoglobulinowe). Obejmują one 100-110 aminokwasów spiętychmostkamidwusiarczkowymi. W obrębie łańcuchów lekkich wyróżniamy dwie takie domeny.Części stałe łańcuchów ciężkich w IgA, IgG i IgD zawierają natomiast po 3 domeny,a w IgE i IgM po cztery domeny. N-końcowa domena łańcuchów lekkich i ciężkich(tworząca fragment Fab) określana jest jako domena V (z ang. variable), ponieważjest zmienna, w zależności od specyficzności przeciwciała. natomiast pozostałedomeny immunoglobulinowe są niezmienne i bywają określane jako domeny C (zang. constant). Domenty immunoglobulinowe są charakterystycznym elementemstrukturalnym wielu białek, szczególnie tych, które znajdują się w błonie komórkowej.Dotychczas poznano kilkaset białek mających takie domenty i określane sa onewspólnie jako białka (cząsteczki) immunoglobulinopodobne. Wszystkieimmunoglobuliny zawierają przyłączone łańcuchy cukrowe.KLASY IMMUNOGLOBULINIgAPrzeciwciała tej klasy są wytwarzane w największej ilości w organizmie człowieka(50-130 mg/kg). Większość IgA jest wytwarzana w obrębie błon sluzowych iprzechodzi do wydzielin śluzowo-surowiczych. Dlatego stężenie tych przeciwciał wekrwi (w osoczu) jest mniejsze niż IgG. IgA w osoczu to przeważnie przeciwciała wformie monomerycznej (80-90% to IgA1), natomiast w wydzielinach takich jak ślina,łzy, pot, wydzieliny gruczołów przewodu pokarmowego, dróg oddechowych i drógmoczowych IgA występuje w formie dimerów i tetramerów, połączonych łańcuchem Joraz dodatkowo związanych z tak zwanym fragmentem wydzielniczym (IgA1 i IgA2po mniej więcej 50%). Są to tak zwane wydzielnicze IgA czyli S-IgA (secretory IgA).4

IgDZe względu na niskie stężenie w osoczy przeciwciała tej klasy są najsłabiej poznane.Nie wiadomo jaka funkcje pełnia w organizmie. Wytwarzane są głównie przezniekatywowane (dziewicze, to znaczy takie, które nie zetknęły się jeszcze zantygenem) limfocyty B i są wbudowane w ich błonę komórkową, gdzie pełnią rolęimmunoglobulin powierzchniowych.IgEPrzeciwciała tej klasy uczestniczą przede wszystkim w odporności przeciwwielokomórkowym pasożytom. Na powierzchni komórek tucznych oraz eozynofilówznajdują sie odpowiednie receptory dla tych przeciwciał. Komórki tuczne wiążą dużeilości wolnych IgE (to znaczy nie wiążących antygenu) i z tego powodu stężenie tychprzeciwciał w osoczu jest bardzo niskie (najniższe spośród wszystkich klas). Poprzyłączeniu antygenu do IgE, receptor na powierzchni komórki tucznej (FcεRI)przekazuje sygnały aktywujące tę komórkę, co prowadzi do jej degranulacji(uwolnienia zawartości ziaren magazynujących liczne mediatory pro-zapalne, międzyinnymi histaminę). Związanie antygenu na powierzchni pasożyta oraz połączenie zreceptorem dla fragmentu Fc na powierzchni eozynofila(FcεRII) aktywuje tękomórkę do cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC, z ang.antibody dependent cellular cytotoxicity). Przeciwciała IgE uczestniczą w zjawiskachnadwrażliwości typu I (alergiach). Przeciwciała IgE nie aktywują układu dopełniacza.IgGPrzeciwciała IgG osiągają w osoczu człowieka największe stężenie. Wyróżnia się 4podklasy tych przeciwciał. Wszystkie mają region zawiasowy, a w IgG3 jest onbardzo długi i zawiera aż 11 wiązań dwusiarczkowych łączących łańcuchy ciężkie.5

Na powierzchni wielu komórek układu odpornościowego znajdują sięreceptory dla fragmentu Fc przeciwciał tej klasy (Fc R). Dzięki nim komórki te,określane jako komórki K (z ang. killers czyli zabójcy), są zdolne do zabicia komórekopłaszczonych przez IgG w wyniku cytotoksyczności komórkowej zależnej odprzeciwciał (np. komórek nowotworowych, zakażonych przez wirusy). Ponadtokomórki fagocytujące (żerne), takie jak neutrofile i makrofagi, dzięki obecności na ichpowierzchni Fc R, mogą fagocytować komórki i cząsteczki opłaszczoneprzeciwciałami. Proces ten nazywany jest immunofagocytozą. IgG mogą równieżaktywować układ dopełniacza.IgMPrzeciwciała tej klasy mają na ogół małe powinowactwo do antygenów i wpoczątkowej fazie odpowiedzi przeciwzakaźnej są to często przeciwciałapolispecyficzne. Są zawsze wytwarzane jako pierwsza klasa przeciwciał wodpowiedzi pierwotnej (pierwszy kontakt organizmu z antygenem) i dopiero pokilku/kilkunastu dniach są "wymieniane" na przeciwciała innych klas (IgG, IgA lubIgE). Mimo małego powinowactwa do antygenu przeciwciała te, będace główniepentamerami mogą wiązać jednocześnie aż do 10 epitopów, co sprawia, że siławiązania takiego wielowartościowego (wieloepitopowego) antygenu jest duża. Zewzględu na bliskie sąsiedztwo pięciu fragmentów Fc takiego pentameru, przeciwciałaIgM 100-400 razy efektywniej aktywują dopełniacz niż IgG. Bardzo niewielki odsetekIgM występuje w postaci heksamerów lub monomerów.Wartościowość, powinowactwo, awidnośćLiczba determinant antygenowych, które może związać cząsteczka przeciwciałanazywana jest wartościowością. Immunoglobuliny IgG, IgD i IgE, mające po dwa6

miejsca wiążące antygen, są 2-wartościowe, IgA 2-, 4- lub nawet 8-wartościowe (wzależności od tego czy są mono-, di- czy tetramerem), natomiast IgM są 10- lub 12-wartościowe.Siła z jaką wiązana jest pojedyncza determinanta antygenowa przezprzeciwciało nazywamy powinowacwem. Przeciwciała wiążące te same antygeny, anawet te same epitopy mogą różnić się siłą wiązania. Powinowactwo przeciwciała doantygenu jest tym większe im bardziej obie te cząsteczki są do siebie dopasowane.W wiązaniu antygeny z przeciwciałem uczestniczą: siły elektrostatyczne, wiązaniawodorowe, oddziaływania hydrofobowe oraz siły Van der Waalsa.Pojedynczy antygen ma zazwyczaj wiele epitopów. W związku z tym, wtrakcie odpowiedzi immunologicznej może powstac wiele różnych przeciwciałwiążących się z tym samym antygenem (z różnymi jego determinantamiantygenowymi). Siła wiązania takiego wieloepitopowego (wielowartościowego)antygenu przez różne przeciwciała zależy oczywiście od siły wiązania poszczególymepitopów przez przeciwciała, ale nie jest ich prostą sumą. Siłę tę określa sie niekiedyjako zachłanność lub awidność (z ang. avidity).Kompleksy immunologiczneKompleksy immunologiczne tworzą się wówczas, gdy antygen i przeciwciało odużym powinowactwie znajdą się w roztworze w odpowiednich proporcjach.ponieważ zazwyczaj antygen zawiera wiele epitopów, a przeciwciało ma co najmniejdwa miejsca wiążące, nic dziwnego, że jeżeli obydwa składniki znajdą się wodpowiednich proporcjach, to mogą się tworzyć nawet bardzo duże kompleksyzawierające wiele cząsteczek antygenu i przeciwciał. W określonych warunkachkompleksy immunologiczne maja zdolność do wytrącania się, precypitacji, co dawniejpowszechnie wykorzystywano w diagnostyce. Obecnie metody immonoprecypitacji7

są wykorzystywane znacznie rzadziej, choć nadal są one podstawą wielu testówserologicznych (np. oznaczanie grup krwi).POWSTAWANIE PRZECIWCIAŁGeny immunoglobulinoweGenom człowieka obejmuje około 24 tysięcy genów. jedynie część z nich kodujeprzeciwciała. Dlatego przez dziesiątki lat naukowców nurtowało pytanie w jakisposób możliwe jest wytwarzanie miliardów różnorodnych białek (przeciwciał) zniewielkiej puli genów. Powstało wiele teorii próbujących wytłumaczyć to zjawisko, aodpowiedź pojawiła sie dopiero w latach 70-tych, gdy poznano budowę locus(miejsca w genomie), w którym znajdują się genu kodujące przeciwciała.Geny dla łańcuchów ciężkich przeciwciał znajdują się w obrębie 14chromosomu i są ułożone w następujący sposób: najpierw (w kierunku 5' nici DNA)zlokalizowanych jest sto kilkadziesiąt segmentów genów V (niekiedy określanychrównież genami V), za nimi znajduje sie około 30 segmentów D, 6 segmentów J.Następnie znajdują sie segmenty C. Każdy segment genowy koduje jedynie częśćprzeciwciała. Segmenty V, D oraz J kodują część zmienną przeciwciała, natomiastsegmenty C część stałą. Taki układ segmentów genów nazywamy układemzarodkowym. Geny w tej postaci nie ulęgają ekspresji i są obecne w genomie każdejkomórki człowieka. Jedynie w komórkach szpiku, które zaczynają różnicować się wkierunku limfocytów B dochodzi do rozpoczęcia określonych zjawisk prowadzącychdo wytworzenia ostatecznej postaci genu kodującego przeciwciało. Jest to zjawiskowyjątkowe w organizmie człowieka, bowiem w jego trakcie dochodzi donieodwracalnych zmian w budowie genomu komórki.Podobne zjawiska mają miejsce w obrębie miejsc kodujących łańcuchy lekkie8

przeciwciał. Ogólna struktura locus dla łańcucha lekkiegoktóre znajduje się wchromosomie 2 człowieka, jest dość podobna do locus genów dla łańcuchaciężkiego. W kierunku 3' od segmentów V leży kilka segmentów J, a dalej pojedynczygen C. Ułożenie genów dla łańcucha lekkiego(chromosom 22 czlowieka) jestodmienne od ułożenia genów dla pozostałych łańcuchów immunoglobulinowych.Geny J i C występują w kilku kompleksach. Każdy z nich składa się z jednegosegmentu J w bliskim sąsiedztwie jednego segmentu C. Cztery spośród tychkompleksów mogą ulegać ekspresji i dlatego wyróżniamy cztery podstawoweodmiany izotypowe łańcuchów .Poniżej omówione zostaną jedynie zjawiska mające miejsce w trakcietworzenia ostatecznego genu dla łańcucha ciężkiego. W procesie tym zainicjowanazostaje tak zwana rearanżacja genów immunoglobulinowych. Polega ona na tym, żepod wpływem działania określonych enzymów zbliżone do siebie zostają: jedenspośród stu kilkudziesięciu segmentów V, jeden spośród około 30 segmentów D,jeden spośród 6 segmentów J. Najpierw dochodzi do połączenia jednego zsegmentów D z jednym z segmentów J, a dopiero w następnym etapie powstałejsekwencji DJ z jednym z segmentów V. Dzięki istnieniu wielu wariantów genów V, D iJ w genomie, przypadkowe łączenie się ich w drodze rekombinacji wielokrotniezwiększa liczbę wariantów części zmiennych. Rekombinacja zachodzi najczęściejprzez wypętlenie i delecję, prowadząc w efekcie do powstania kolistego DNA.Przypadkowe łączenie się różnych segmentów V, D, J nie wystarcza jednak,żeby wytworzyć miliardy kombinacji. Rzeczywiście okazuje się, że zmiennośćkombinacyjna nie jest jedynym źródłem różnorodności przeciwciał. Z jednegozestawu segmentów genów np. V105, D18, J5 może bowiem powstać bardzo wieleróżnych kompleksów VDJ, a zatem wiele odmiennych, różniących sięspecyficznością różnych przeciwciał. Jest to możliwie dzięki istnieniu zjawiska9

określanego jako zmienność na złączach. Jest to zmienność między V i D orazmiędzy D i J. Polega ona na tym, że podczas tworzenia się złącza kodującegodochodzi zarówno do usunięcia (delecji) pewnej liczby nukleotydów (do 20), jak i dowstawienia (insercji) nowych nukleotydów (od 1 do 15). Wycinanie i wstawianienowych nukleotydów zachodzi zupełnie bezmatrycowo, co jest zjawiskiemunikatowym,bowiem prowadzi do powstania "nowych genów", których do tej pory niebyło.Przypuszcza się, że zmienność na złączach wynikająca z usuwania idołączania nukleotydów zwiększa liczbę wariantów DJ około 10 razy i wariantów VDJo dalsze 10 razy. Liczba wariantów konkretnego zestawu genów VDJ wzrasta więc ookoło 100 razy.Dodatkowym czynnikiem zwiększającym różnorodność przeciwciał są takzwane mutacje somatyczne zachodzące w rekombinowanym genieimmunoglobulinowym. Są to najczęściej mutacje punktowe, rzadziej delecje, insercjelub konwersje. Występują one głównie w sekwencjach kodujących regionyhiperzmienne. Do mutacji somatycznych dochodzi najczęściej poza szpikiem,podczas stymulowanej przez antygen proliferacji i różnicowania limfocytów B wkomórki efektorowe. Jedną mutację obserwuje się na 1000 par zasad w ciągujednego cyklu komórkowego, a więc częstotliwość tych mutacji jest olbrzymia, bo aż100-krotnie większa niż w komórkach spoczynkowych i pierwotnie pobudzonychlimfocytach B i aż około milion razy większa niż w innych komórkach. Dlatego określasię je czasem jako hipermutacja. Wynikiem tych mutacji jest wymiana około 1%nukleotydów w genach dla części zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich. Dzięki nimliczba różnych wariantów przeciwciał rośnie o wiele rzędów wielkości.Potencjalna liczba różnych wariantów przeciwciał, nie uwzględniając mutacjizachodzących w trakcie odpowiedzi immunologicznej, wynosi około 10 10 -10 11 .10

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNEOpracowanie w latach 70-tych metod produkcji i izolacji przeciwciał monoklonalnychprzez Milsteina i Köhlera, za co otrzymali w 1984 roku nagrodę Nobla w dziedziniemedycyny było niewątpliwie przełomem w medycynie. Przeciwciała monoklonalnewykorzystywane są zarówno w diagnostyce i leczeniu wielu chorób człowieka. Stałysie również podstawowym narzędziem pracy wielu naukowców.Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnychMetoda produkcji przeciwciał monoklonalnych opracowana przez Milsteina i Köhleradotyczyła przeciwciał mysich. Nadal są to najczęściej wykorzystywane przeciwciała,choć ze względu na swoja immunogenność (u człowieka rozwija się odpowiedźimmunologiczna przeciwko obcogatunkowemu białku) są już coraz rzadziejstosowane w terapii. Metoda syntezy tych przeciwciał polega na fuzji limfocytów Bwytwarzających swoiste przeciwciała i komórek szpiczaka (nowotworu wywodzącegosię z szeregu rozwojowego limfocytów B). Swoistość przeciwciał wytwarzanych przeztak otrzymaną hybrydę określa limfocyt B, z którego ona powstała. Komórkaszpiczaka będąc komórką nowotworową, nadaje hybrydzie "nieśmiertelność",umożliwiającą nieograniczenie długą hodowlę in vitro.Limfocyty B wykorzystywane do fuzji uzyskuje sie od zwierząt, które sąimmunizowane (uczulane) określonym antygenem. W kilkanaście dni po immunizacjize śledziony myszy izoluje sie limfocyty, które hybrydyzowane są następnie zkomórkami szpiczaka. Oczywiście w wyniku przypadkowych fuzji powstaje wieleróżnych hybryd, wytwarzających przeciwciała o różnorodnych specyficznościach.Dlatego w następnym etapie selekcjonuje sie jedynie hybrydy wytwarzające11

pożądane przeciwciała.Jak wspomniano zastosowanie całkowicie mysich przeciwciał monoklonalnychu ludzi wiązało się z poważnym ryzykiem powikłań, w tym nawet poważnych reakcjiuczuleniowych, prowadzących do anafilaksji. Dlatego przy pomocy metod inżynieriigenetycznej konstruowane są geny immunoglobulinowe, których część V pochodziod myszy, a część C od człowieka. Takie przeciwciała nazwane są chimerycznymi.Aby jeszcze bardziej zmniejszyć immunogenność przeciwciał modyfikuje sie geny wtaki sposób aby jedynie sekwencje kodujące regiony hiperzmienne pochodziły odmyszy, a reszta genu od człowieka. Zmodyfikowane w ten sposób genyimmunoglobulinowe można wówczas wstawić do ustalonych linii komórek ssaków,np. komórek CHO (z ang. chinese hamster ovary), w których dojdzie do ich ekspresjiPrzeciwciała, których tylko regiony hiperzmienne pochodzą od myszy, a pozostałesekwencje od człowieka nazywane są humanizowanymi (“uczłowieczonymi”) (ryc.3.24). Przeciwciała chimeryczne składają się w około 75% z sekwencji ludzkich,natomiast humanizowane w około 95%. Te drugie nadal są w pewnym stopniuimmunogenne.Dzięki inżynierii genetycznej możliwe jest również tworzenie przeciwciałmonoklonalnych w pełni ludzkich. Uzyskuje sie je dzięki możliwości tworzeniazwierząt transgenicznych lub używając tak zwanej techniki „phage display”. Metoda"phage display" polega na wbudowaniu genów dla części zmiennych łańcuchówlekkich i ciężkich do genomu faga włókienkowego, co prowadzi do ekspresjikodowanych białek na powierzchni faga. Fagi wiążące dzięki tym zabiegomodpowiedni antygen można izolować, po namnożeniu w komórkach bakterii, nakolumnach opłaszczonych tym antygenem. Można w ten sposób in vitro imitowaćselekcję limfocytów B zachodzącą w trakcie odpowiedzi immunologicznej in vivo.Technika produkcji PM ludzkich w oparciu o zwierzęta transgeniczne (przede12

wszystkim myszy) polega na wprowadzeniu ludzkich genów immunoglobulinowychdo embrionalnych komórek macierzystych myszy po uprzednim zablokowaniu ichwłasnych genów dla immunoglobulin.Immunokoniugaty zawierające przeciwciała monoklonalnePrzeciwciała monoklonalne można odpowiednio „uzbrajać” lub "wyposażać", tak bywzmocnić ich funkcje efektorowe lub zmodyfikować ich właściwości. Niektórespośród takich immunokoniugatów znalazły zastosowanie w klinice. Do przeciwciałmonoklonalnych można dołączać: radioizotopy, toksyny, leki, cytokiny, enzymy,fluorochromy.Zastosowania przeciwciał monoklonalnych w diagnostycePrzeciwciała monoklonalne są stosowane powszechnie w biologii molekularnej.najczęściej są to przeciwciała mysie. Stosuje się je w takich technikach, jakimmunohistochemia, Western blotting, cytometria przepływowa – do identyfikacjicząsteczek docelowych i ekspresji białek w tkankach lub na poziomie komórek.Przeciwciała monoklonalne usprawniają również diagnostykę choróbzakaźnych. Dysponując przeciwciałami przeciw określonym mikroorganizmommożna skrócić czas potrzebny do wykrywania ich obecności z kilku dni nawet dokilku minut.Przeciwciała monoklonalne są używane do wykrywania i określania stężeńleków, hormonów, enzymów, nawet jeżeli występują one w bardzo małych ilościachw płynach tkankowych. Znalazły zastosowanie w teście radioimmunologicznym(RIA), za którego opracowanie Yalow dostała w 1977 roku nagrodę Nobla, a także –obecnie stosowanym powszechnie – teście immunoenzymatycznym (ELISA).Niektóre przeciwciała monoklonalne lub ich pochodne są stosowane bądź13

testowane w celach diagnostycznych w radiologii. na przykład wyznakowanytechnetem 99m fragment Fab rozpoznający antygen CEA - arcitumomab,wykorzystywany do lokalizowania przerzutów nowotworów. Wyznakowanytechnetem 99m fragment F(ab’) 2 - sulesomab stosowany jest natomiast doidentyfikacji nacieków neutrofilów w zapaleniu kości i szpiku. Znakowany indem 111fragment Fab rozpoznający miozynę - imciromab pentetate jest stosowany wdiagnozowaniu zawału serca.TESTY DIAGNOSTYCZNE WYKORZYSTUJĄCE PRZECIWCIAŁAELISAELISA (z ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest jednym z najważniejszych ibardzo czułych testów wykorzystywanych w celu określenia stężenia określonegoantygenu w badanej próbce (np. surowicy, płynie mózgowo-rdzeniowym, wysięku,moczu). Metoda ta jest bardzo czuła, relatywnie prosta, umożliwia analizę bardzodużej liczby próbek w tym samym czasie i można ją zautomatyzować. Istniejekilkadziesiąt odmian testu ELISA, jednak wszystkie polegają na dość podobnychzasadach. Dwie najważniejsze odmiany określane są jako bezpośrednia i pośredniaELISA. Pośrednia ELISA jest często wykorzystywana w celu wykrycia obecności wsurowicy przeciwciał przeciw określonym antygenom drobnoustroju. W tym celustudzienki płytki 96-studzienkowej pokrywa się drobnoustrojami, ich lizatami,oczyszczonymi lub rekombinowanymi antygenami drobnoustrojów. Następnie dostudzienek dodaje się rozcieńczoną surowicę chorego. Jeśli są w niej obecneprzeciwciała wówczas stabilnie przyczepia sie one do odpowiednich antygenów,trwale opłaszczających studzienkę. Niezwiązane przeciwciała surowicy odpłukuje sięodpowiednimi buforami. Następnie do studzienek dodawany jest roztwór przeciwciał14

drugorzędowych, rozpoznających fragmenty Fc przeciwciał określonej klasy (testsłuży nie tylko do określenia obecności i stężenia przeciwciał, ale również ich klasy).Drugorzędowe przeciwciała są skoniugowane z enzymem. Następnie dodaje siesubstrat enzymu, który zostaje przekształcony w barwnik. Przy użyciuspektrofotometru odczytuje się absorbancję światła o określonej długości fali wkażdej z badanych studzienek. Intensywność reakcji barwnej jest proporcjonalna dostężenia przeciwciał związanych do antygenów. W wypadku użycia radioizotopówwykorzystuje sie metod autoradiografii.Pośrednia ELISA służy do wykrywania obecności antygenów w badanymmateriale. Tym razem dno studzienek opłaszczane jest określonymi przeciwciałamimonoklonalnymi, o znanej specyficzności. Do studzienek dodawana jest następniesurowica (lub inny badany materiał), a po jej odpłukaniu dodawane są przeciwciaładrugorzędowe rozpoznające inny epitop w obrębie tego samego antygenu.Drugorzędowe przeciwciała mogą być od razu skoniugowane z enzymem bądź zradioizotopem, ale w celu zwiększenia czułości testu można też użyć przeciwciałnieskoniugowanych. Wymaga to przeprowadzenia dodatkowego etapu - dodaniaskoniugowanych z enzymem przeciwciał trzeciorzędowych, rozpoznających fragmentFc przeciwciał drugorzędowych. Taka reakcja określana jest kanapkową.Pewną odmianą jest tak zwana kompetytywna ELISA. Umożliwia onapominięcie jednego etapu płukania w teście bezpośrednim (skrócenie procedury) ipolega na jednoczasowym dodaniu do studzienki zarówno surowicy (w którejwykrywamy przeciwciała) jak i gotowych, skoniugowanych z enzymem, przeciwciałmonoklonalnym rozpoznających antygen opłaszczający dno studzienek. Przeciwciałasurowicy oraz monoklonalne konkurują o miejsce wiązania. Niezwiązaneprzeciwciała są odpłukiwane a następnie wywoływana jest reakcja barwna. Jeśli wsurowicy nie było przeciwciał rozpoznających antygen opłaszczony na dnie15

studzienki, wówczas rozwinie sie reakcja barwna. Im większe jednak było stężenieprzeciwciał w surowicy, tym reakcja barwna będzie słabiej rozwinięta.Testy radioimmunologiczneTesty radioimmunologiczne są wykonywane analogicznie do ELISA z tym, zezamiast enzymu do przeciwciał doczepione są radioizotopy, a odczyt odbywa sięprzy wykorzystaniu metod autoradiografii. Choć testy radioimmunologiczne sąstarsze od ELISA to obecnie wykorzystuje sie je coraz rzadziej ze względu nabezpieczeństwo.Western blottingJedną z podstawowych metod wykorzystujących przeciwciała w diagnostyce jestWestern blotting. Jest to metoda składająca się z wielu etapów, jest dość złożona i ztego powodu rzadko wykorzystywana w klinicznej diagnostyce. Niemniej jest bardzospecyficzna i daje jednoznaczne rezultaty. Z tego powodu bywa wykorzystywanajako ostateczne potwierdzenie diagnozy (np. w zakażeniu HIV).Aby wykryć obecność określonego antygenu w badanej próbce (krew, tkanka)należy ją najpierw rozdrobnić oraz uzyskać jednorodną zawiesinę białek (oraz innychskładników komórkowych). Tak przygotowany "lizat" jest następnie rozdzielany wprocesie elektroforezy, najczęściej w żelu poliakrylamidowym. Białka układają się wżelu głównie zgodnie ze swoją masą cząsteczkową (białka lekkie migrują w żeluszybciej). Dodatkowo niewielki wpływ na migrację białek ma ich ładunek elektryczny,który może sie zmieniać np. w wyniku ich modyfikacji w komórkach (np. dołączeniegrup cukrowych lub lipidów). Ze względu na małą trwałość galaretowatego żelurozdzielone białka przenoszone są na inne, bardziej trwałe podłoże w procesieokreślanym jako transfer. Takim podłożem są najczęściej błony nitrocelulozowe lub16

wykonane z PVDF (polifluorek wynilidenu). Na błonach tych można następnieprzeprowadzić reakcje immunochemiczne. Polegają one na zanurzeniu błony wroztworze zawierającym określone przeciwciała. Zazwyczaj są to "czyste"przeciwciała, to znaczy nie skoniugowane z inna cząsteczką. Po odpłukaniuprzeciwciał, które nie związały się z antygenami, błonę umieszcza się w innymroztworze, zawierającym przeciwciała rozpoznające fragmenty Fc przeciwciałwiążących antygeny doczepione do rozdzielonych białek. Te drugorzędoweprzeciwciała mogą być skoniugowane z peroksydazą chrzanową lub z fosfatazązasadową. Rzadziej wykorzystuje sie inne znaczniki - fluorochromy lub radioizotopy.Cytometria przepływowaJednym z przełomów w diagnostyce wielu chorób człowieka było opracowanie metodwykrywania antygenów powierzchniowych, czyli cząsteczek znajdujących się pozewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej komórek człowieka. Metoda służąca dotego celu określana jest jako cytometria przepływowa, a proces określaniaantygenów powierzchniowych to immunofenotypowanie. W cytometriiwykorzystywane są przeciwciała monoklonalne, wyznakowane odpowiednimifluorochromami (najczęściej FITC oraz PE). Przeciwciała te "znakują", czylirozpoznają określone cząsteczki powierzchniowe, na przykład komórek krwi.Następnie zawiesinę komórek analizuje się ilościowo przy użyciu cytometruprzepływowego. Jest to urządzenie, które zasysa komórki, układające się w liniowystrumień (jedna komórka za drugą) w procesie ogniskowania hydrodynamicznego.Strumień ten jest następnie przecinany przez wiązki świateł laserowych, którewzbudzają fluorescencję i docierają poprzez układ odpowiednich soczewek izwierciadeł do odpowiednich detektorów. Analiza umożliwia określenie wielkości iziarnistości komórek oraz obecność cząsteczek, do których specyficznie przyczepiły17

się przeciwciała wyznakowane fluorochromami. Dzięki temu w przeciągu kilkukilkunastuminut możemy ocenić dziesiątki tysięcy komórek znajdujących się wbadanej mieszaninie. Ta metoda diagnostyczna wykorzystywana jest przedewszystkim w hematologii. Umożliwia ona określenie fenotypu komórekbiałaczkowych lub chłoniaków, co ma znaczenie prognostyczne i wpływ na wybórleczenia. Cytometria przepływowa wykorzystywana jest również w diagnostycechorób zakaźnych (np. określenie zaawansowania AIDS), w diagnostyce niedoborówimmunologicznych, napadowej nocnej hemoglobinurii oraz w badaniach naukowych.Opracowano również metody "permeabilizowania komórek" (zwiększaniaprzepuszczalności błony komórkowej), co umożliwia wykrywanie antygenówwewnątrzkomórkowych, takich jak cytokiny czy czynniki wzrostu. Stosują na przykładsondy nukleotydowe wyznakowane fluorochromami można również badać ekspresjęokreślonych genów w komórkach.Współczesne cytometry przepływowe umożliwiają nie tylko detekcjęantygenów powierzchniowych, ale również odpowiednie segregowanie komórekzawierających określone antygeny do odpowiednich probówek. Proces ten określanyjest jako sortowanie.ImmunohistochemiaKolejną metodą diagnostyczna jest immunohistochemia. Polega ona na wykrywaniuokreślonych antygenów w skrawkach tkankowych uzyskanych po utrwaleniu lub zamrożeniutkanki pobranej od chorego. Utrwalone tkanki są zatapiane w parafinie, co umożliwia ichcięcie przy użyciu mikrotomów na cienkie plasterki (skrawki) o grubości nawet kilkumikrometrów. Skrawki są następnie "przyklejane" do szkiełek mikroskopowych, po czymprzeprowadzana jest inkubacja z przeciwciałami. Przeciwciała wykorzystywane wimmunohistochemii najczęściej skoniugowane są z enzymami, takimi jak peroksydazachrzanowa lub fosfataza zasadowa. Po odpowiednim odpłakaniu przeciwciał, które nie18

przyczepiły się do antygenów do preparatów dodawane są substraty enzymów. Powstającystrąt barwnika przyczepia się w miejscu, w którym doszło do rozpoznania określonegoantygenu. Istnieje wiele odmian immunohistochemii. Jeśli wykorzystywane są pojedynczekomórki (np. krwi), to analogiczna metoda wykrywania antygenów na tych komórkachokreślana jest jako immunocytochemia. Zamiast enzymów do przeciwciał mogą byćdoczepiane fluorochromy. Mówimy wówczas o badaniach immunofluorescencyjnych.Immunohistochemia dostarcza nam natychmiastowych informacji nie tylko oobecności antygenu w badanej tkance, ale również umożliwia ustalenie jego lokalizacji wtkance. Immunohistochemia jest metodą półilościową. Nie można przy jej użyciu precyzyjnieokreślić ilości wytwarzanego białka. Ponadto, na jednym skrawku można zazwyczajprzeprowadzić tylko jedna reakcję immunocytochemiczną (wykrycie jednego antygenu).Pewnym postępem w diagnostyce jest opracowanie metod mikromacierzy tkankowych. Zzatopionego w parafinie bloku tkankowego wycinane są walcowate bloki tkanki, którenastępnie zatapiane są w specjalnie skonstruowanym podłożu. Uzyskany w ten sposóbbloczek zawiera kilkanaście do kilkudziesięciu walcowatych fragmentów tkanek ułożonychrównolegle do siebie. Poprzeczne cięcie takiego bloczka umożliwia uzyskanie setekskrawków zawierających po kilkanaście-kilkadziesiąt powtórzeń tej samej tkanki. Istniejąodpowiednie zrobotyzowane urządzenia, które w ciągu kilkunastu godzin mogąprzeprowadzić setki reakcji immunohistochemicznych na uzyskanych skrawkach. Dziękitemu możemy oceniać obecność setek antygenów w tym samym materiale pobranych odchorego. Metody immunohistochemiczne są najczęściej wykorzystywane w diagnostycenowotworów (określanie typu oraz stopnia zróżnicowania nowotworu) co ma znaczenieprognostyczne oraz wpływa na wybór leczenia.Mikromacierze białkoweOpisane powyżej metody diagnostyczne w głównej mierze służą wykrywaniu obecności i/lubstężenia w badanym materiale biologicznym pojedynczych białek. Mikromacierze białkoweumożliwiają identyfikację setek, a nawet tysięcy białek w jednej próbce. Zasady analizy sąanalogiczne, jak w wypadku testów ELISA. Zasadnicza różnica polega na tym, ze podłoże19

wykorzystywane do wykonania mikromacierzy opłaszczone jest nie pojedynczym antygenemlub przeciwciałem, ale znacznie większą ich liczbą. Podłoża te są oczywiście wykonane zodmiennych materiałów, a proces pokrywania zazwyczaj wykonywany jest przezzautomatyzowane roboty. Dzięki temu konkretne białko (np. przeciwciało) nakładane jest nabardzo niewielkiej powierzchni macierzy. W rezultacie na płytce o powierzchni kilku cm 2rozmieszczonych zostaje bardzo dużo określonych białek. Lokalizacja każdego z tych białekjest znana. Jeśli więc na mikromacierz nałożony zostanie odpowiednio przygotowanymateriał biologiczny (np. surowica), to obecne w niej białka będą mogły specyficznieprzyłączyć się do osadzonych na mikromacierzy przeciwciał. Po odpłukaniu niezwiązanychbiałek na mikromacierz nakładana jest mieszanina wszystkich wykorzystanych do jejprzygotowania przeciwciał, tym razem znakowanych fluorochromem. W punkciemikromacierzy, w których doszło do utworzenia "kanapki" składającej się z przeciwciałpierwotnych, rozpoznawanych przez nie białek oraz przeciwciał wtórnych pojawi sięfluorescencja, którą można wykryć przy użyciu czułego skanera fluorescencji.Pismiennictwo:1. Plested JS, Coull PA, Gidney MA. ELISA. Methods Mol Med. 2003;71:243-61.2. Itoh K, Suzuki T. Antibody-guided selection using capture-sandwich ELISA. MethodsMol Biol. 2002;178:195-9.3. True LD. Quality control in molecular immunohistochemistry. Histochem Cell Biol.2008 Sep;130(3):473-80.4. Bussolati G, Leonardo E. Technical pitfalls potentially affecting diagnoses inimmunohistochemistry. J Clin Pathol. 2008 Nov;61(11):1184-92.5. He M, Stoevesandt O, Taussig MJ. In situ synthesis of protein arrays. Curr OpinBiotechnol. 2008 Feb;19(1):4-9.6. Wingren C, Borrebaeck CA. Progress in miniaturization of protein arrays--a stepcloser to high-density nanoarrays. Drug Discov Today. 2007 Oct;12(19-20):813-9.Epub 2007 Sep 18. Review.20

7. Reid JD, Parker CE, Borchers CH. Protein arrays for biomarker discovery. Curr OpinMol Ther. 2007 Jun;9(3):216-21.8. Camp RL, Neumeister V, Rimm DL. A decade of tissue microarrays: progress in thediscovery and validation of cancer biomarkers. J Clin Oncol. 2008 Dec 1;26(34):5630-7.9. Bentzen SM, Buffa FM, Wilson GD. Multiple biomarker tissue microarrays:bioinformatics and practical approaches. Cancer Metastasis Rev. 2008Sep;27(3):481-94.10. Voduc D, Kenney C, Nielsen TO. Tissue microarrays in clinical oncology. SeminRadiat Oncol. 2008 Apr;18(2):89-97.11. Moloney M, Shreffler WG. Basic science for the practicing physician: flow cytometryand cell sorting. Ann Allergy Asthma Immunol. 2008 Nov;101(5):544-9.12. Ibrahim SF, van den Engh G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem EngBiotechnol. 2007;106:19-39.13. Donnenberg AD, Donnenberg VS. Rare-event analysis in flow cytometry. Clin LabMed. 2007 Sep;27(3):627-5214. Wang W, Singh S, Zeng DL, King K, Nema S. Antibody structure, instability, andformulation. J Pharm Sci. 2007 Jan;96(1):1-26.15. Braden BC, Goldman ER, Mariuzza RA, Poljak RJ. Anatomy of an antibody molecule:structure, kinetics, thermodynamics and mutational studies of the antilysozymeantibody D1.3. Immunol Rev. 1998 Jun;163:45-57.16. Li Z, Woo CJ, Iglesias-Ussel MD, Ronai D, Scharff MD. The generation of antibodydiversity through somatic hypermutation and class switch recombination. Genes Dev.2004 Jan 1;18(1):1-11.17. Weiner LM, Dhodapkar MV, Ferrone S. Monoclonal antibodies for cancerimmunotherapy. Lancet. 2009 Mar 21;373(9668):1033-40.18. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W, Stoklosa T. Immunologia V wyd, 2007, PWN21