Postepy nauk rolniczych - Instytucja Naukowa - Polska Akademia ...

Postepy ˛naukrolniczychAdvances in Agricultural Sciences4/2010Polska Akademia NaukWydział NaukRolniczych, Leśnychi WeterynaryjnychKwartalniknr 344 rok 62

Rada RedakcyjnaA. Grzywacz (przewodnicz¹cy),J. Haman, T. Krzymowski, J.J. LipaA. Rutkowski, F. Tomczak, M. Truszczyñski, J. WilkinRedakcjaA. Horuba³a (redaktor naczelny),J. Buliñski, A. Gawroñska-Kulesza, W. Józwiak, J. Zimny, T. ¯ebrowska,R. Suska (sekretarz redakcji)Adres Redakcji00-901 Warszawa, Pa³ac Kultury i Nauki, pokój 2102tel. 22 620 33 71, 22 656 64 66e-mail: Wydzial5@pan.plWydanie publikacji dofinansowane przez Ministra Nauki i Szkolnictwa Wy¿szego.Opracowanie redakcyjne, korekta i sk³ad — Danuta BoreckaPL ISSN 0032-5547Nak³ad 200 egz. Ark. wyd. 10. Ark. druk. 8,75.Druk — Warszawska Drukarnia Naukowa PAN,00-656 Warszawa, ul. Œniadeckich 8, tel./faks 22 628 87 77

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 3–8Profesor Jerzy Wa¿ny(1927 – 2010)

4 A. GrzywaczJerzy Wa¿ny urodzi³ siê 18 grudnia 1927 roku w Borys³awiu w ówczesnymwojewództwie lwowskim. Studia ukoñczy³ na Wydziale Leœnym SGGW w Warszawiew 1950 r., specjalizuj¹c siê w zakresie patologii i konserwacji drewna podkierunkiem prof. dr hab. Józefa Kochmana. Po uzyskaniu dyplomu uzupe³nia³ swojeprzygotowanie specjalistyczne na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego,w zakresie anatomii i cytologii drewna u ks. prof. dr Józefa Szulety oraz w zakresiemikrobiologii u prof. dr Kazimierza Basalika. Ju¿ podczas studiów J. Wa¿ny podj¹³w 1949 r. pracê w Instytucie Technologii Budowlanej, gdzie do 1956 r. prowadzi³prace badawcze w zakresie ochrony i konserwacji drewna w budownictwie. W latach1956–1978 pracowa³ pocz¹tkowo w Katedrze Fitopatologii SGGW, która organizacyjniewchodzi w sk³ad Wydzia³u Ogrodniczego, a nastêpnie w Zak³adzie FitopatologiiLeœnej i Konserwacji Drewna na Wydziale Leœnym SGGW. Prof. J. Wa¿ny by³twórc¹ i pierwszym kierownikiem tego Zak³adu, który od 1979 r. pod nazw¹ Zak³adu(Katedry) Ochrony Drewna funkcjonuje na Wydziale Technologii Drewna SGGW.Jerzy Wa¿ny stopieñ doktora nauk technicznych uzyska³ na Wydziale TechnologiiDrewna w 1957 r. na podstawie rozprawy „Wp³yw dzia³ania grzybów Meruliuslacrymans (WULF.) FR. iConiophora cerebella PERS. na fizyczne w³aœciwoœci niektórychgatunków drewna”. Stopieñ doktora habilitowanego nauk leœnych uzyska³w 1962 r. na Wydziale Leœnym SGGW na podstawie dorobku naukowego i rozprawy„Badania nad wp³ywem od¿ywiania mineralnego na wzrost grzybów Coniophoracerebella PERS.iMerulius lacrymans (WULF.)FR.” Tytu³ profesora nadzwyczajnegouzyska³ w 1969 r., a profesora zwyczajnego w 1976 r. Po 49 latach pracy naukowej,w 1998 r., Prof. J. Wa¿ny przyszed³ na emeryturê, choæ nadal pracowa³ w InstytucieTechnologii Drewna w Poznaniu oraz pe³ni³ wiele funkcji w organizacji nauki,szczególnie w Polskiej Akademii Nauk.Dorobek naukowy Prof. Jerzego Wa¿nego jest imponuj¹cy, bardzo wartoœciowyi interdyscyplinarny, obejmuje ponad 450 publikacji, w tym oko³o 300 o charakterzenaukowo-badawczym, z czego ponad 100 ukaza³o siê w czo³owych czasopismachzagranicznych, np. Wood Science and Technology, Wood and Fiber Science, Biodeterioration,Holzforschung, Material und Organismen, Holz als Roh-und Werkstoff,Chimia Dreviesiny. Opracowa³ lub uczestniczy³ w opracowaniu bardzo licznychinstrukcji, wytycznych i projektów dotycz¹cych szeroko rozumianej ochrony drewna,17 norm pañstwowych i bran¿owych dla badañ jakoœci œrodków ochrony drewna,7 patentów na impregnaty do drewna. Wa¿ne dla teorii i praktyki ochrony drewnaosi¹gniêcia zjedna³y Prof. Jerzemu Wa¿nemu wielkie uznanie u specjalistów orazsprawi³y, ¿e jego prace by³y i s¹ szeroko cytowane w polskim i miêdzynarodowympiœmiennictwie naukowym i podrêcznikowym. Badania dotyczy³y patologii i konserwacjidrewna w postaci surowca, drewna przerobionego oraz tworzyw drzewnych– w budowlach i konstrukcjach, w obiektach mieszkalnych, inwentarskich, zabytkowych,zarówno œwieckich, jak i sakralnych, w tym najwy¿szej rangi historycznejw kraju, a tak¿e diagnostyki, fizjologii, fizjografii oraz biologii i ekologii organizmów

Profesor Jerzy Wa¿ny (1927–2010)) 5niszcz¹cych drewno, g³ównie grzybów. Wiele miejsca poœwiêca³ badaniu wp³ywugrzybów na w³aœciwoœci drewna, metodom badañ jakoœci œrodków ochrony drewna,sposobom konserwacji. Prof. Jerzy Wa¿ny stosowa³ czêsto oryginalne i nowatorskiemetody badañ, dziêki czemu uzyskiwa³ nowe dane i informacje lub wkracza³ napionierskie obszary i zagadnienia patologii i konserwacji drewna. Na szczególnepodkreœlenie zas³uguje fakt niespotykanej pracowitoœci i pasji badawczej, cechuj¹cejGo w ca³ym okresie pracy naukowej.Wszystko to sk³ada³o siê na fakt, ¿e Prof. Jerzy Wa¿ny by³ uznawany za twórcêlicz¹cej siê w kraju i za granic¹ szko³y ochrony drewna i budowli.Na uznanie zas³uguje redakcja i wspó³autorstwo pierwszego w Polsce podrêcznika„Ochrona budynków przed korozj¹ biologiczn¹”, wydanego przez „Arkady”w 2001 r., nagrodzonego przez Ministerstwo Infrastruktury oraz wyró¿nionegonagrod¹ za najlepsz¹ ksi¹¿kê akademick¹ z zakresu techniki „Atena 2001”. Jakoszczególne osi¹gniêcia, wzbogacaj¹ce naukê w skali miêdzynarodowej uznaæ nale¿yopracowanie „Kompleksowe badania nad modernizacj¹ i optymalizacj¹ œwiatowychmetod toksykometrycznych ocen œrodków ochrony drewna”. Bardzo wa¿nym dlapraktyki konserwatorskiej by³o opracowanie, opatentowanie i wdro¿enie do produkcji4 nowoczesnych, proekologicznych œrodków ochrony drewna o powszechnymzastosowaniu, opartych na czwartorzêdowych zwi¹zkach amoniowe (preparaty solne).W okresie pracy na Wydziale Leœnym SGGW wspó³uczestniczy³ w badaniachwp³ywu przemys³owych zanieczyszczeñ powietrza na grzyby chorobotwórcze drzewleœnych; wp³ywu zanieczyszczeñ powietrza na zmiany naturalnej odpornoœci drewnana rozk³ad przez grzyby; mo¿liwoœci zastosowania fungicydów systematycznychwykorzystywanych w ochronie roœlin uprawnych w celach ochrony drewna i innych.W ostatnich latach ¿ycia interesowa³ siê mechanizmami dzia³ania nanobiocydówdla potrzeb ochrony drewna, we wszystkich zakresach jego zastosowania.Dzia³alnoœæ dydaktyczna Profesora jako wyk³adowcy na kursach i szkoleniachby³a bardzo bogata i ró¿norodna. Prowadzi³ zajêcia dydaktyczne na Wydziale Leœnymi Wydziale Technologii Drewna SGGW, na Wydziale Konserwacji i Restauracji Dzie³Sztuki Akademii Sztuk Piêknych w Warszawie oraz na kierunku etnologia Wydzia³uHistorycznego Uniwersytetu Warszawskiego. By³y to studia stacjonarne, zaocznei podyplomowe oraz doktoranckie. Wyk³ada³ ochronê i konserwacjê drewna, fitopatologiêleœn¹ z mikrobiologi¹, korozj¹ biologiczn¹ materia³ów, ochronê dzie³ sztukiludowej przed korozj¹ biologiczn¹, ochronê obiektów budowlanych i zabytkówdrewnianych. Na wyj¹tkowe podkreœlenie zas³uguje d³ugoletnia dzia³alnoœæ, jakowyk³adowcy na kursach i szkoleniach w Oœrodku Doskonalenia Kadr MinisterstwaGospodarki Komunalnej i Budownictwa we Wroc³awiu, a póŸniej dla potrzeb PolskiegoStowarzyszenia Mykologów Budownictwa i stowarzyszeñ bran¿owych wchodz¹cychw sk³ad Naczelnej Organizacji Technicznej.Prof. Jerzy Wa¿ny by³ promotorem 11 doktorantów, z których 5 zosta³o profesorami.Kierowa³ ok. 110 pracami magisterskimi na Wydziale Leœnym i Wydziale

6 A. GrzywaczTechnologii Drewna SGGW. By³ kilkadziesi¹t razy recenzentem rozpraw doktorskichi habilitacyjnych oraz wniosków do nadania tytu³u naukowego profesora lubzatrudnienia na stanowisku profesora w ró¿nych uczelniach i instytutach. W latach1978–1981 by³ dziekanem Wydzia³u Technologii Drewna, wieloletnim cz³onkiemSenatu SGGW oraz licznych komisji senackich i rektorskich. Szczególnie du¿ezas³ugi ma w pracy na rzecz Senackiej Komisji ds. Nauki.Prof. Jerzy Wa¿ny by³ inicjatorem i organizatorem Sympozjów Ochrony Drewna,poczynaj¹c od 1963 r., maj¹ one miejsce nadal w odstêpach dwuletnich, z udzia³empolskich i zagranicznych pracowników nauki oraz praktyków. Po sympozjach ukazuj¹siê zeszyty zawieraj¹ce wyg³oszone referaty i doniesienia. W trakcie trwaniasympozjów, które najczêœciej odbywa³y siê w Leœnym Zak³adzie DoœwiadczalnymSGGW w Rogowie ko³o Koluszek, mia³y miejsce wystawy publikacji naukowych,wydawnictw reklamowych, nowych œrodków ochrony drewna. Sympozja te sta³y siêŸród³em wiedzy, postêpu technicznego, inspiracji twórczej dla praktyki ochronyi konserwacji drewna w wielu dzia³ach gospodarki i aktywnoœci spo³ecznej.Prof. Jerzy Wa¿ny mia³ osi¹gniêcia naukowe – teoretyczne, ale równie¿ aplikacyjne.By³ wspó³twórc¹ koncepcji organizacyjnych, metod i œrodków podjêtych dlalikwidacji zagrzybienia budynków, co mia³o ogromne znaczenie w okresie powojennym,w szczególnoœci na terenach tzw. Ziem Odzyskanych. Wraz z zespo³emwykona³ przesz³o 9 tys. ekspertyz budynków i innych obiektów pora¿onych przezgrzyby rozk³adaj¹ce drewno i owady – techniczne szkodniki drewna. Pod kierunkiemProfesora dokonywano konserwacji drewna w bardzo licznych obiektach zabytkowych,np. Zamek Królewski w Warszawie, Pa³ace w Nieborowie i Wilanowie,liczne koœcio³y drewniane, obiekty w prawie wszystkich skansenach i muzeachbudownictwa ludowego w Polsce, w szczególnoœci sprawowa³ przez wiele lat,wspólnie z dr Micha³em Czajnikiem, sta³¹ opiekê konserwatorsk¹ nad MuzeumBudownictwa Ludowego w Sanoku oraz Muzeum Wsi Lubelskiej, By³ wielokrotniedoradc¹ i konsultantem praktycznym zagadnieñ konserwatorskich.Bardzo bogata by³a dzia³alnoœæ Prof. J. Wa¿nego w zakresie organizacji nauki.By³ wieloletnim cz³onkiem Polskiego Towarzystwa Leœnego, Polskiego TowarzystwaBotanicznego, Polskiego Towarzystwa Fitopatologicznego oraz Polskiego TowarzystwaMykologów Budownictwa, które nada³o Mu godnoœæ cz³onka honorowego.Przewodniczy³ Komitetowi Technicznemu nr 185 ds. Ochrony Drewna i Materia³ówDrewnopochodnych w Polskim Komitecie Normalizacyjnym, by³ cz³onkiem prezydiumKomitetu Trwa³oœci Budowli PZITB. Prof. J. Wa¿ny by³ cz³onkiem redakcjiczasopisma Wood Protection w Wielkiej Brytanii, przewodnicz¹cym Rady Programowejczasopisma Folia Forestalia Polonica, Ser.B–Drzewnictwo. By³ przewodnicz¹cymlub cz³onkiem licznych rad naukowych, komisji i zespo³ów w MinisterstwieLeœnictwa i Przemys³u Drzewnego, Ministerstwie Gospodarki Komunalnej,Ministerstwie Budownictwa i Przemys³u Materia³ów Budowlanych, Pracowni KonserwacjiZabytków, Fundacji Ochrony Zabytków, Oœrodka Badañ i Konserwacji

Profesor Jerzy Wa¿ny (1927–2010)) 7Zabytków, Instytutu Technologii Drewna oraz w innych organizacjach i stowarzyszeniachnaukowych.Wyj¹tkowo aktywny by³ w pracach dla dobra PAN. W latach 1995–2006 by³przewodnicz¹cym Komitetu Technologii Drewna PAN, od 1999 r. wiceprzewodnicz¹cymRady Upowszechniania Nauki przy Prezydium PAN, cz³onkiem KomisjiDyscyplinarnej przy Prezydium PAN, cz³onkiem Komisji Nagród Naukowych Wydzia³uNauk Rolniczych, Leœnych i Weterynaryjnych PAN.Prof. J. Wa¿ny zosta³ w 1991 r. wybrany cz³onkiem korespondentem PAN zawybitny wk³ad naukowy w rozwój drzewnictwa, a w szczególnoœci za przyczynienie siêdo wzrostu wiedzy w zakresie ochrony i konserwacji drewna i budowli, a tak¿e zapropozycje licznych zastosowañ aplikacyjnych. W 2004 r. zosta³ cz³onkiem rzeczywistymPAN. Autorytet i szacunek na arenie spo³ecznoœci miêdzynarodowej konserwatorówdrewna spowodowa³y, ¿e Profesor by³ od 1976 r. cz³onkiem InternationalAcademy of Wood Science z siedzib¹ we Wiedniu (IAWS), od 1995 r. cz³onkiem NewYork Academy of Science, od 1970 r. cz³onkiem za³o¿ycielem International ResearchGroup on Wood Protection (IRG), której to organizacji zosta³ w 2007 wybrany „HonoraryLife-Long Member”. Od 1971 r. wspó³pracowa³ w Working Group on Wood Protectionw ramach IUFRO (Miêdzynarodowa Unia Leœnych Organizacji Badawczych).Prof. J. Wa¿ny wielokrotnie wyje¿d¿a³ do licznych krajów jako „visiting professor”,np. Indii, Australii, Nowej Zelandii oraz jako „invited speaker” na konferencjei sympozja naukowe jako przewodnicz¹cy, moderator w sekcji lub autor g³ównego,wprowadzaj¹cego referatu. By³ uczestnikiem kilku œwiatowych kongresów IUFRO.Bardzo liczna jest grupa placówek naukowych polskich i za granic¹, z którymiutrzymywa³ sta³e kontakty i wspó³pracê naukow¹.Wysoka kultura osobista, ¿yczliwy stosunek do wspó³pracowników i studentów,wyj¹tkowo rozleg³a wiedza fachowa, oczytanie w zakresie najnowszej literaturynaukowej i bran¿owej sprawi³y, ¿e Prof. Jerzy Wa¿ny cieszy³ siê autorytetem i powa¿aniemwœród studentów, pracowników nauki, specjalistów – praktyków ochronydrewna, wœród najwybitniejszych naukowców naszego kraju. Dzia³alnoœæ Profesoraprzyczyni³a siê do powstania i rozwoju nowych dyscyplin naukowych – patologiii konserwacji drewna, mikologii i mikrobiologii budowlanej, korozji biologicznejmateria³ów i surowców przemys³owych.Za dzia³alnoœæ naukow¹, dydaktyczn¹ i organizatorsk¹ na rzecz nauki i spo³ecznegoruchu naukowego by³ wielokrotnie nagradzany i wyró¿niony, miêdzy innymiprzez Rektora SGGW; Ministra Nauki, Szkolnictwa Wy¿szego i Techniki; MinistraEdukacji Narodowej; Ministra Budownictwa; Ministra Gospodarki Komunalnej. By³odznaczony Krzy¿em Kawalerskim OOP, posiada³ odznaki Zas³u¿onego Dzia³aczaKultury, Zas³u¿onego dla Leœnictwa i Przemys³u Drzewnego, Zas³u¿onego dla OchronyŒrodowiska i Gospodarki Wodnej. W 1990 r. otrzyma³ znacz¹c¹ nagrodê miêdzynarodow¹„Ron Cockroft Aword” (Szwecja) od International Research on Wood Protection.Za wybitne osi¹gniêcia w dziedzinie konserwacji zabytków otrzyma³ medal

8 A. Grzywaczim. Bohdana Marconiego, przyznany przez ASP w Warszawie. W 2006 r. uzyska³nagrodê PZITB im. W³adys³awa Danileckiego za wybitne osi¹gniêcia w dziedzinietrwa³oœci i ochrony obiektów budowlanych przed korozj¹ biologiczn¹, a w 2006 r.medal im. Micha³a Oczapowskiego przyznany przez PAN za wybitny wk³ad w rozwójnauk leœnych (drzewnictwa). Wielokrotnie by³ nominowany za cykl prac nad toksycznoœci¹biocydów do zwalczania szkodliwych grzybów (rozk³adaj¹cych drewno) donagrody naukowej „Fundacji Marcus Wallenberg Prize w Szwecji. W 2009 r. zaca³okszta³t dzia³alnoœci naukowej uzyska³ Nagrodê Prezesa Rady Ministrów.Prof. J. Wa¿ny zmar³ nagle 23 sierpnia 2010 r. w Warszawie. Po nabo¿eñstwie¿a³obnym w koœciele œw. Katarzyny zosta³ pochowany 26 sierpnia 2010 r. na cmentarzuprzy ul. Wa³brzyskiej.Odszed³ od nas wybitny uczony, wychowawca wielu pokoleñ m³odzie¿y akademickiej,nauczyciel m³odych pracowników nauki. Nauki leœne – drzewnictwo ponios³yniepowetowan¹ stratê.Literatura[1] Babicki R. 2005. Prof. dr hab. Jerzy Wa¿ny cz³onkiem rzeczywistym Polskiej Akademii Nauk. Przemys³Drzewny, lipiec/sierpieñ: 48.[2] Lutomski K. 1997. Jubileusz Prof. dr hab. in¿. Jerzego Wa¿nego, cz³. korespondenta PAN, Materia³y IVSympozjum PSMB „Ochrona obiektów budowlanych przed korozj¹ biologiczn¹ i ogniem”. Szklarska Porêba:7–11.[3] Karyœ J. 2005. Profesor Jerzy Wa¿ny – laureat nagrody Komitetu Trwa³oœci Budowli PZITB w roku 2004.In¿ynieria i Budownictwo 1: 3.[4] Wa¿ny J., Kotowska W. (red.) 1990. Zak³ad Ochrony Drewna 1950–1990. Wydawnictwo SGGW–AR,Warszawa.[5] Teczka osobowa cz³onka PAN: Jerzy Wa¿ny (1991–2010).Andrzej Grzywacz,cz³. rzecz. PAN

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 9–18Optymalizacja u¿ytkowania powierzchni ziemi³agodzi procesy degradacji œrodowiskaJan SiutaInstytut Ochrony Œrodowiska00-548 Warszawa, ul. Krucza 5/11e-mail: siuta@ios.edu.plS³owa kluczowe: przeznaczenie ziemi, gleba, okrywa roœlinna, woda,krajobraz, degradacja œrodowiskaWprowadzenieGleba i szata roœlinna (biosfera l¹dowa) tworz¹ aktywny pomost miêdzy litosfer¹i atmosfer¹. Stanowi¹ o funkcjonowaniu przyziemnej czêœci atmosfery oraz o modyfikowaniubudowy i rzeŸby litosfery, a tak¿e o kr¹¿eniu wody miêdzy atmosfer¹,biosfer¹, litosfer¹ na obszarach l¹dowych.Naturalnie ukszta³towana gleba i szata roœlinna wykazuj¹ wzglêdn¹ stabilnoœæ(równowagê ekologiczn¹) w czasie. W strefach klimatu umiarkowanego ukszta³towa-³y siê zrównowa¿one ekosystemy glebowo-roœlinne i wodne, które stabilizowa³y(³agodzi³y) dynamikê i skutki zjawisk atmosferycznych. Postêpuj¹ce wylesianiei likwidowanie ekosystemów trawiastych oraz osuszanie ekosystemów mokrad³owychna rzecz rolniczego u¿ytkowania ziemi i na potrzeby infrastruktur technicznychzniekszta³ca coraz bardziej naturaln¹ pokrywê glebowo-roœlinn¹, ods³aniaj¹c powierzchnieziemi na destrukcyjne dzia³anie opadów atmosferycznych i wiatru, zarazemwp³ywaj¹c negatywnie na funkcjonowanie przyziemnej atmosfery.Rolnicze, osiedlowe, przemys³owe zagospodarowani gruntów stanowi dalekoid¹c¹ ingerencjê w œrodowiska przyrodnicze, nie tylko wskutek zniekszta³caniai pomniejszania biologicznie czynnej powierzchni ziemi, lecz tak¿e ze wzglêdu nawielorakie techniczne modyfikacje budowy litosfery oraz zabiegi agrotechnicznezwiêkszaj¹ce podatnoœæ gleby na erozyjne dzia³anie wody i wiatru.Antropogeniczne modyfikowanie powierzchni ziemi jest i bêdzie niezbêdne, alepostêp techniczny i cywilizacyjny musi respektowaæ ekologiczne wymogi ochronyi odnowy zasobów naturalnych (w tym ekologicznych). Wiedza fachowa, technologiei doœwiadczenia przoduj¹cych krajów umo¿liwiaj¹ opracowywanie i realizowanie

10 J. Siutatakich struktur przestrzennych u¿ytkowania ziemi, które chroni¹ œrodowisko przyrodniczeoraz zapewniaj¹ produkcjê ¿ywnoœci i komfort ekologiczny. Droga dochodzeniado wspomnianego celu w Polsce bêdzie jednak bardzo d³uga i wyboista. Decyduj¹o tym warunki obiektywne (g³ównie finansowe i zapóŸnienie) oraz subiektywne(niedostateczna wiedza i wola polityczna decydentów, niechêæ u¿ytkowników doinwestowania w przysz³oœæ, nadrzêdnoœæ krótkotrwa³ych korzyœci, niedostatecznaspo³eczna œwiadomoœæ potrzeby).Niezale¿nie od wymienionych trudnoœci istnieje koniecznoœæ niezw³ocznegoprzyst¹pienia do merytorycznej dyskusji, a nastêpnie do opracowania strategicznego(d³ugoterminowego) programu kompleksowej modernizacji (urz¹dzania) strukturprzestrzennych u¿ytkowania ziemi, ze szczególnym uwzglêdnieniem ochrony biologicznieczynnej powierzchni ziemi wraz z ograniczaniem zjawisk ekstremalnych.Bêdzie to wymaga³o weryfikacji fragmentarycznych uregulowañ i ustanowieniaprawa zintegrowanego, ujmuj¹cego wszystkie aspekty ochrony, kszta³towania i u¿ytkowaniapowierzchni ziemi (np. w gminie, rejonie).Wadliwe struktury u¿ytkowania ziemi nasilaj¹ procesy degradacji i ekstremalnezjawiska w œrodowisku, np.: Nadmierne wylesienie (na rzecz rolniczego u¿ytkowania) gleb piaskowych orazpozosta³ych na zboczach o du¿ych spadkach i pagórkach jest najwa¿niejszymczynnikiem wielorakich procesów degradacji œrodowiska, w tym malej¹cej efektywnoœciprodukcji roœlinnej. Bardzo du¿a przesi¹kliwoœæ gleb piaskowych powoduje,¿e wody opadowe przemieszczaj¹ siê szybko do warstw g³êbszych, sp³ywaj¹cdo przyleg³ych mokrade³ i cieków wód powierzchniowych. Ubóstwo sk³adników pokarmowych i wody gleb piaskowych oraz bardzo ma³a ichch³onnoœæ wzglêdem nawozów mineralnych uniemo¿liwiaj¹ zwarte pokryciei dobry wzrost roœlin uprawianych. Powierzchnia takiej ziemi jest wiêc niedostateczniechroniona przed erozj¹ wietrzn¹ nie tylko w stanie bezroœlinnym, lecztak¿e w pocz¹tkowej fazie wzrostu roœlin uprawy polowej. Orne u¿ytkowanie gleb bardzo podatnych na erozyjne dzia³anie opadów atmosferycznychskutkuje rozmywaniem (w tym pe³zaniem mas ziemnych) i zamulaniempowierzchni ziemi oraz gwa³townymi sp³ywami wody do ni¿ej po³o¿onych miejsci cieków wodnych. Rozmywy poziomu próchnicznego pomniejszaj¹ sukcesywnie ¿yznoœæ gleby,która jest coraz s³abiej chroniona (przez gorszy stan roœlin) przed destrukcyjnymdzia³aniem czynników atmosferycznych (wody, wiatru, wahañ temperatury).G³ównymi motorycznymi czynnikami wymienionych (oprócz wylesienia i likwidacjiekosystemów trawiastych) procesów degradacji s¹ struktury przestrzenne u¿ytkowaniaziemi i uprawy roœlin (agrotechnika), sieæ i jakoœæ dróg, melioracje wodne.Do najwiêkszych obszarów degradacji powierzchni ziemi zalicza siê:1) rolnicze nieefektywne gleby piaskowe, które powinny byæ zalesione;2) ma³o urodzajne gleby na erodowanych zboczach i pagórkach, które powinny byæzadarnione, zalesione, zadrzewione;

Optymalizacja u¿ytkowania powierzchni ziemi … 113) obszary o du¿ym nasileniu erozji w¹wozowej, wymagaj¹ce rekultywacji techniczno-biologiczneji racjonalnego zagospodarowania;4) obszary o bardzo du¿ym niedostatku trwa³ej szaty roœlinnej, wymagaj¹ce kompleksowejfitomelioracji;5) powierzchnie zdegradowane przez odkrywkow¹ eksploatacjê zasobów geologicznych,sk³adowanie odpadów komunalnych, przemys³owych i górniczychwymagaj¹ce rekultywacji i docelowego zagospodarowania.Specyficznym, bardzo z³o¿onym zagadnieniem jest kompleksowa restrukturyzacjau¿ytkowania terenów potencjalnie powodziowych i osuwiskowych.W warunkach klimatu umiarkowanego, jaki wystêpuje w Polsce, ka¿da powierzchniaziemi niezabudowana technicznie i naturalnie bezroœlinna powinna pe³niæfunkcje ekologiczne, niezale¿nie od sposobu jej u¿ytkowania. Ekologiczne funkcjepokrywy glebowo-roœlinnej s¹ wielorakie, zw³aszcza na terenach mieszkaniowych,rekreacyjnych, uzdrowiskowych, komunikacyjnych, przemys³owych.Szata roœlinna jest biologicznym pomostem pomiêdzy atmosfer¹ i litosfer¹.Chroni ona:1) powierzchniê ziemi przed niekorzystnym dzia³aniem czynników atmosferycznych;2) przyziemn¹ czêœæ atmosfery przed pyleniem powierzchni ziemi oraz stanowi o:a) kr¹¿eniu wody opadowej w ekosystemach l¹dowych,b) klimacie lokalnym,c) dynamice powietrza atmosferycznego i oczyszczaniu powietrza atmosferycznego.Efektywnoœæ ekologiczn¹ szaty roœlinnej mo¿na wyraziæ w postaci produkcjifitomasy z jednostki powierzchni. Ta zale¿y od jakoœci œrodowiska glebowego, w³aœciwoœciroœlin, zabiegów uprawowych i pielêgnacyjnych. W ekosystemach leœnych,zaroœlowych i trawiastych (zbli¿onych do naturalnych) szata roœlinna zale¿y g³ównie odjakoœci œrodowiska glebowego, bo ingerencja cz³owieka jest ma³a. Na gruntach ornychi na wszystkich pozosta³ych terenach o roœlinnoœci uprawianej zabiegi agrotechniczne(w tym pielêgnacyjne) ingeruj¹ pozytywnie lub negatywnie w œrodowisko glebowei produkcjê fitomasy, tym samym w przebieg wegetacji i produkcjê fitomasy. Rzeczw tym, aby odnoœne ingerencje by³y ekologicznie pozytywne nie tylko w krótkimczasie, lecz tak¿e w przysz³oœci. Niestety doraŸne korzyœci s¹ przedk³adane nadprzysz³e korzyœci ekologiczne i gospodarcze.Dotyczy to bardzo istotnych zagadnieñ:1) ochrony jakoœci gleb przed ró¿nymi formami degradacji,2) ulepszania w³aœciwoœci gleb,3) ulepszania struktury przestrzennej u¿ytkowania ziemi,4) fitomelioracji krajobrazu,5) rekultywacji terenów zdegradowanych.

12 J. SiutaStan i niezbêdne dzia³ania1. Zalesianie nieefektywnych gruntów ornych jest realizowane od pocz¹tkulat piêædziesi¹tych XX wieku. W roku 1946 lasy pokrywa³y 20,8% powierzchnikraju. W latach 1955–1970 lesistoœæ wzros³a z 23,7% do 27,3%, czyli o 3,6%. Takdu¿y wzrost lesistoœci zosta³ wymuszony przez obowi¹zkowe dostawy zbo¿a z ka¿degohektara gruntów ornych, ale wynika³ te¿ z potrzeby zalesienia rozwydmianychu¿ytków rolnych. W nastêpnym dwudziestoleciu (do 1990 r.) lesistoœæ wzros³a o 0,3%do 28,0% powierzchni kraju, a w latach 1991–2008 do 29,6%, czyli oko³o 0,1%rocznie. Œredni roczny wzrost lesistoœci w latach 1946–2008 wynosi 0,14%, czyli jestwiêkszy od œredniorocznego wzrostu (0,07%) pocz¹wszy od roku 1970.Potrzeby zalesienia rolniczo nieefektywnych gruntów ornych oszacowano dlaka¿dej gminy, przedstawiaj¹c je na mapie Polski w skali 1:1 000 000 [20]. Œrodkowedorzecze Wis³y i Warty (oko³o 50% powierzchni kraju) wykaza³o potrzeb¹ zalesienia10–30% (nawet 35%).Wed³ug Krajowego programu zwiêkszania lesistoœci [8] procentowy udzia³ lasówma wzrosn¹æ do 2020 roku do 30% powierzchni kraju oraz do 33% w 2050 roku.Niezadawalaj¹cy postêp w realizacji planowych zalesieñ Polityka Ekologiczna Pañstwa[15] uzasadni³a coraz ni¿sz¹ poda¿¹ gruntów do zalesienia. Teza ta budzi powa¿new¹tpliwoœci wobec stale postêpuj¹cego samosiewnego (dzikiego) zalesiania gruntówrolniczo nieefektywnych.Oszacowanie potrzeb i mo¿liwoœci zalesienia gruntów ornych przedstawionowariantowo [21]: minimalny 1746 tys. ha – lesistoœæ kraju wzroœnie do 33,6%, optymalny 3145 tys. ha – lesistoœæ kraju wzroœnie do 38,4%, maksymalny 4527 tys. ha – lesistoœæ kraju wzroœnie do 43,1%.Wymienione wskaŸniki wzrostu lesistoœci nie pomniejsz¹, lecz umo¿liwi¹ wydatnywzrost plonów z hektara oraz globalnej produkcji ¿ywnoœci, paszy i œrodków dlaprzemys³u rolno-spo¿ywczego.Statystyczne dane o procentowym udziale lasów i zadrzewieñ w kraju s¹ wyraŸniezani¿one, poniewa¿ du¿e powierzchnie gruntów nie uprawianych (od³oguj¹cych) oddawna zosta³y samosiewnie zalesione, zadrzewione i zakrzewione. Zwartoœæ i bardzoszybki wzrost samosiewnych brzóz nadaje im znamiona lasów naturalnych. W rejestrachewidencji gruntów tereny te widniej¹ nadal jako u¿ytki rolne.2. Erozja degraduje zasoby glebowo-roœlinne i zniekszta³ca kr¹¿enie wodyw œrodowisku przyrodniczym. Naturalne i antropogeniczne (g³ównie rolnicze) uwarunkowaniastanowi¹ o regionowym (obszarowym) wystêpowaniu i nasileniu erozji.Dotyczy to g³ównie erozji wodnej powierzchniowej, ¿³obinowej i w¹wozowej orazspe³zywania mas ziemnych ze zboczy o du¿ych spadkach. Zjawiska te s¹ dobrzerozpoznane i udokumentowane [4, 17, 26]. Znane s¹ tak¿e sposoby przeciwdzia³anieerozji oraz rekultywacji i zagospodarowania powierzchni zdegradowanych [5, 6, 25].

Optymalizacja u¿ytkowania powierzchni ziemi … 13Rzecz jednak w tym, ¿e nie mo¿na skutecznie przeciwdzia³aæ erozji i likwidowaæ jejskutków bez optymalizacji struktur przestrzennych oraz sposobów u¿ytkowaniaziemi [5, 25]. Wymaga to jednak ustanowienia zintegrowanego prawa, bardzo du¿ychnak³adów finansowych i technicznych, wykszta³cenia specjalistycznej kadry i sukcesywnejrealizacji celów. Koniecznoœæ ochrony zasobów glebowych, racjonalizacjagospodarki zasobami wód opadowych, ograniczania zjawisk ekstremalnych bêd¹wymusza³y przysz³oœciowe myœlenie i dzia³ania specjalistów, polityków, administracjiz poparciem ogó³u spo³eczeñstwa.3. Kwasowa degradacja gleby pogarsza warunki wzrostu roœlin oraz wielkoœæi jakoœæ plonów. Poœrednio pogarsza ekologiczne funkcjonowanie gleby i szatyroœlinnej, nasila powierzchniowy sp³yw wód opadowych, pomniejsza infiltracjê wódopadowych do gleby i wód gruntowych. Wapnowanie kwaœnych gleb rolniczych le¿ynie tylko w interesie producentów roœlin [2], lecz jest równie¿ korzystne dla funkcjonowaniabiologicznie czynnej powierzchni ziemi. Jest wiêc istotnym dzia³aniem narzecz ochrony œrodowiska, w tym zasobów wody opadowej i przyziemnej czêœciatmosfery.4. Zawartoœci i pionowe rozmieszczenie próchnicy w glebie s¹ wyrazem stanurozwoju i degradacji gleby, stanowi¹ bowiem o biologicznym, chemicznym i fizycznymfunkcjonowaniu ziemi u¿ytkowanej rolniczo. Oprócz zasobnoœci sk³adnikówpokarmowych, zawartoœæ i rozmieszczenie próchnicy decyduje o jakoœci strukturyglebowej, od której zale¿¹ miêdzy innymi:1) odpornoœæ (podatnoœæ) powierzchni ziemi na zaskorupianie i mechaniczne zagêszczanie,2) wymiana powietrza glebowego i atmosferycznego,3) wsi¹kanie wody opadowej do gleby,4) sp³ywy powierzchniowe wód opadowych,5) podatnoœæ na erozyjne dzia³anie wody i wiatru.Plonotwórcze walory próchnicy glebowej znano i doceniano od niepamiêtnychczasów, ale wielorakie jej funkcje w œrodowisku przyrodniczym s¹ dopiero ostatniopostrzegane i doceniane. Mineralne gleby orne w Polsce s¹ przewa¿nie ubogiew próchnicê. Dotyczy to procentowej zawartoœci w warstwie ornej, jak te¿ wyra¿onejw tonach na hektar [1, 3]. Niepokój budzi postêpuj¹cy ubytek zasobów próchnicyw glebach u¿ytkowanych rolniczo [9, 10], powodowany g³ównie przez:1) monokulturowe uprawy roœlin i nie przywracanie glebie mas roœlinnych,2) malej¹ce wytwarzanie i u¿ytkowanie obornika,3) energetyczne spalanie dostêpnych mas roœlinnych,4) deponowanie odpadów pochodzenia roœlinnego na sk³adowiskach.Potencjalnie du¿ym zagro¿eniem dla zasobów próchnicy i wody glebowej bêdzierealizacja programu wielkoobszarowych, monokulturowych upraw i energetycznegospalania mas roœlinnych. Bêdzie to kolidowa³o ze „strategi¹ ochrony gleby” przyjêt¹22 wrzeœnia 2006 r. przez Komisjê Europejsk¹ [7].

14 J. Siuta5. Postêpuj¹ca degradacja melioracji wodnych pogarsza warunki wzrostui plonowania roœlin oraz zwiêksza zagro¿enia powodziowe. W raporcie MRLiG¯z roku 1986 [12] napisano „szacuje siê, ¿e pilnej odbudowy i modernizacji wymagaj¹urz¹dzenia melioracyjne na obszarze oko³o 1 mln ha, znajduj¹ce siê przewa¿nie w zachodnieji pó³nocnej czêœci kraju …. Nie wykonano w pe³ni planowego zakresu konserwacjii eksploatacji melioracji wodnych z powodu niedostatku œrodków finansowych”.W Programie rozwoju melioracji do roku 2015 [13] „potrzeby konserwacji i modernizacjimelioracji oceniono na 2 680 tys. ha”. Œwiadczy to o szybko postêpuj¹cejdegradacji urz¹dzeñ melioracyjnych i œrodowiska glebowego. Wobec niemal ca³kowitegozaniechania renowacji i konserwacji systemów melioracyjnych przypuszczasiê, ¿e zaleg³oœci w tym zakresie s¹ znacznie wiêksze [23].W syntezie „Programu proekologicznego rozwoju wsi, rolnictwa i gospodarki¿ywnoœciowej do roku 2000 i w latach nastêpnych” opracowanej przez IERiG¯,IUNG, IMUZ na zlecenie Ministra Rolnictwa i Gospodarki ¯ywnoœciowej [11]przedstawiono z³o¿onoœæ i kontrowersyjnoœæ problematyki melioracji wodnych,wraz z barierami stagnacji. Stwierdzono miêdzy innymi „W tej sytuacji niezbêdne jestpowo³anie w latach 1998–2000 specjalnej komisji rz¹dowej lub komisji MRiG¯ doopracowania raportu o stanie urz¹dzeñ melioracji rolnych, ich funkcjonowania i znaczeniadla rolnictwa, a tak¿e ochrony œrodowiska …. Liczne, uzasadnione i nieuzasadnioneoceny melioracji wodnych … opublikowane w ostatnich latach uniemo¿liwiaj¹jednoznaczne okreœlenie kierunków gospodarki wodnej w glebach”.Brak niezbêdnych (pilnych) dzia³añ (chocia¿by programowych) ze strony organówpañstwowych budzi niepokój o ekologiczn¹ przysz³oœæ biologicznie czynnejpowierzchni ziemi. Do rozpoznania z³o¿onych zjawisk oraz ich skutków niezbêdne s¹stosowne badania, ale nie mniej wa¿ne jest rzetelne upowszechnienie wiedzy nabytej,a nie pozorowanej. Przeœwiadczenie o niecelowoœci i ma³ej efektywnoœci (nawetszkodliwoœci) drenowania gleb zrodzi³o siê po czêœci:1) z pope³nionych b³êdów w przesz³oœci (zw³aszcza na terenach mokrad³owych),2) z b³êdnego nazewnictwa – drenowanie to odwadnianie gleby,3) z braku odpowiedniego rozpoznania zagadnienia i upowszechniania b³êdnych(niby ekologicznych) proekologicznych pogl¹dów,4) niechêci do finansowania inwestycji, które rzekomo s³u¿¹ tylko producentomrolnym.Drena¿ poziomy gruntów zwiêz³ych u³atwia infiltracjê wody do g³êbszych warstw,poniewa¿ umo¿liwia wyp³yw do atmosfery powietrza glebowego wypieranego przezwsi¹kaj¹c¹ wodê [19]. To oddolne odpowietrzanie gleb zwiêz³ych (zawodnionych,namakanych powierzchniowo) stanowi g³ówny czynnik ekologicznej efektywnoœcidrena¿u, w tym wiêkszej retencji wody w profilu glebowym (rys. 1). £agodzi te¿skutki zjawisk powodziowych [19, 23].Agroekologiczn¹ efektywnoœæ drenowania gruntów ornych oceniono wstêpnie napodstawie danych statystycznych: udzia³u gruntów zdrenowanych, plonów 4 zbó¿oraz rzepaku i rzepiku, pocz¹wszy od roku 1975 z uwzglêdnieniem wskaŸników

Optymalizacja u¿ytkowania powierzchni ziemi … 15Rysunek 1. Migracja fazy gazowej wypieranej z gleb zdrenowanych i niezdrenowanychjakoœci gleb w poszczególnych województwach [19]. Wysokie plony roœlin i du¿eprocentowe udzia³y zdrenowanych gruntów rolnych wyraŸnie synchronizuj¹. Wyró¿-niaj¹ siê by³e województwa p³ockie, leszczyñskie, poznañskie, kaliskie, mimo i¿wystêpuj¹ w strefie najmniejszych opadów atmosferycznych. Œwiadczy to, ¿e drenowaniegleb zwiêz³ych nie pomniejsza, lecz zwiêksza retencjê wody oraz jej plonotwórcz¹efektywnoœæ. Nie stwierdzono wyraŸnej synchronizacji plonów roœlin zewskaŸnikami jakoœci gleb.6. Wadliwoœæ struktur przestrzennych i sposobów u¿ytkowania ziemi skutkuj¹wielorakimi zjawiskami degradacji œrodowiska, nasilaj¹c zjawiska ekstremalne.Dostosowywanie odnoœnych struktur do wymogów ochrony œrodowiska i potrzebgospodarczych jest niezbêdne [5, 6, 14, 18, 26]. Mimo ogólnospo³ecznej i pañstwowejinercji (w tym wzglêdzie) dzia³ania takie musz¹ byæ podjête w nieodleg³ym czasie, bow przeciwnym razie szkody ekologiczne i gospodarcze bêd¹ coraz bardziej przewy¿sza³ynak³ady niezbêdne na ulepszanie gospodarki w œrodowisku.Porównywanie polskiego gospodarowania terenami wiejskimi z przoduj¹cymikrajami Europy mobilizuje znawców zagadnienia do zabiegania o ustanowienie prawai podjêcie dzia³añ na rzecz kompleksowego urz¹dzania i u¿ytkowania terenówwiejskich. Przyk³adem tego by³o opracowanie (w Ministerstwie Rolnictwa i Gospodarki¯ywnoœciowej) projektu ustawy o urz¹dzaniu obszarów rolniczej przestrzeniprodukcyjnej (rok 1997). W uzasadnieniu napisano „Przystosowanie rolnictwa polskiegodo standardów europejskich oraz ustalenie warunków dla zwiêkszenia jegokonkurencyjnoœci w ramach Unii Europejskiej wymaga stworzenia podstaw prawnychdo podejmowania w Polsce w sposób planowy przebudowy rolnictwa z równoczesnymrozwojem obszarów wiejskich … projekt ustawy zawiera przepisy reguluj¹cezasady opracowywania i zatwierdzania planów urz¹dzenia rolniczej przestrzeni

16 J. SiutaRysunek 2. Potrzeby scaleñ gruntów wed³ug gmin w roku 1988; opracowano na podstawiedanych zamieszczonychw publikacji pt. „Obszary wiejskiei grunty rolnicze w Polsce – wynikibadañ ankietowych – 1988”, Wyd. Akademia Rolnicza we Wroc³awiuprodukcyjnej, stanowi¹cych podstawê do podejmowania niezbêdnych dzia³añ urz¹dzeniowychw ujêciu kompleksowym”. Ministerialny projekt ustawy (podobnie jak kilkainnych projektów) nie doczeka³ siê merytorycznej dyskusji i legislacji.Wed³ug Wocha i Nierubcy [25] „Kompleksowy (wielofunkcyjny) rozwój obszarówwiejskich wymaga zrealizowania co najmniej dziesiêciu skoordynowanychw czasie przedsiêwziêæ inwestycyjnych. Najbardziej istotne s¹ tu scalenia gruntów,melioracje wodne i przeciwerozyjne, zmiany w sposobie u¿ytkowania gruntów orazrozwój infrastruktury technicznej”. Wiadomo, ¿e s¹ to dzia³ania bardzo z³o¿onei kosztowne, wymagaj¹ce nie tylko uregulowañ prawnych, bardzo du¿ych nak³adówfinansowych i technicznych, lecz tak¿e wykwalifikowanej kadry. Dochodzenie dooczekiwanych celów bêdzie d³ugotrwa³e.

Optymalizacja u¿ytkowania powierzchni ziemi … 17Wnioski1. Likwidacja trwa³ej szaty roœlinnej, na rzecz roœlinnoœci zmiennej w czasie (sezonowej),ods³ania ziemiê na destrukcyjne dzia³ania czynników atmosferycznychoraz modyfikuje w³aœciwoœci i dynamikê przyziemnej czêœci atmosfery. Mechanicznauprawa ma niema³y udzia³ w modyfikowaniu wierzchniej warstwy glebyoraz jej podatnoœci na destrukcyjne dzia³anie opadów atmosferycznych i wiatru.2. Nasilenie wymienionych zjawisk zale¿y od wielu czynników, w tym g³ównie od:udzia³u powierzchni bez trwa³ej szaty roœlinnej, rzeŸby terenu, jakoœci pokrywyglebowej, wielkoœci i rozk³adu opadów atmosferycznych, struktury przestrzennejpól i roœlinnoœci uprawnej, mechanicznej uprawy, infrastruktury technicznej (drogi,melioracje, urz¹dzenia ochronne).3. W celu ograniczenia (w tym eliminowania) negatywnych zjawisk ekologicznychi gospodarczych na terenach niezurbanizowanych niezbêdne jest dostosowywaniestruktur przestrzennych i sposobów u¿ytkowania ziemi (w tym szaty roœlinnej)do warunków przyrodniczych z uwzglêdnieniem potrzeb spo³ecznoœci lokalnychi postêpu agrotechnicznego.4. Ustanowienie i realizacja zintegrowanego prawa w zakresie kompleksowegokszta³towania (urz¹dzania) i u¿ytkowania terenów niezurbanizowanych (na wzórkrajów przoduj¹cych) jest konieczne ze wzglêdów gospodarczych i ekologicznych,w tym dla ³agodzenia zjawisk ekstremalnych.Literatura[1] Adamczyk Z. 1966. Inwentaryzacja zasobów próchnicy w glebach ornych. Pam. Pu³. 22: 261–270.[2] Boguszewski W., Kac-Kacas M. 1966. Wapnowanie gleb. IUNG, seria P (12). Pu³awy: 119 ss.[3] Dobrzañski B., Siuta J., Strzemski M. Witek T., Zawadzki S. 1973. Zarys charakterystyki gleb Polski. Wyd.Geol. Warszawa: 87 ss.[4] IUNG 1992. Erozja wodna w fizjograficznych krainach Polski. Pam. Pu³. Sup. Do z. 101: 66 ss.[5] Józefaciuk Cz., Józefaciuk A. 1992. Specyfika urz¹dzania wsi o gruntach zagro¿onych erozj¹. Zesz. Prob. Post.Nauk Rol. 401: 218–229.[6] Józefaciuk A., Józefaciuk Cz. 1999. Ochrona gruntów przed erozj¹. Poradnik dla w³adz administracyjnychi samorz¹dowych oraz s³u¿b doradczych i u¿ytkowników gruntów. IUNG Pu³awy: 109 ss.[7] Komisja Europejska 2007. Ochrona gleby – nowa polityka dla UE.[8] Krajowy program zwiêkszania lesistoœci. Ministerstwo Œrodowiska. Warszawa 2003: 53 ss.[9] Maækowiak Cz. 1997. Bilans substancji organicznej w glebach Polski. Biuletyn Informacyjny IUNG 5.[10] Maækowiak Cz. 2000. Wp³yw doboru roœlin w zmianowaniu obornika i nawozów mineralnych na zawartoœæwêgla organicznego w glebie i produkcji ziemniaków. Nawozy i nawo¿enie. PTN-IUNG 4(5): 102–109.[11] Michna W. 1998. Program proekologicznego rozwoju wsi, rolnictwa i gospodarki ¿ywnoœciowej do 2015 roku.Synteza. IERiG¯, IUNG, IMUZ. Warszawa: 285 ss.[12] MRLiG¯ 1986. Realizacja rz¹dowego programu rozwoju melioracji oraz zaopatrzenia wsi i rolnictwa w wodê(raport). Warszawa.[13] MRiG¯ 1996. Program rozwoju melioracji do roku 2015. Warszawa.[14] Pijanowski Z 1992. Kszta³towanie przestrzeni wiejskiej w terenach górskich (na przyk³adzie wsi £apszeWy¿ne). Zesz. Prob. Post. Nauk Rol. 401: 203–218.[15] Polityka ekologiczna pañstwa w latach 2009–2012 z perspektyw¹ do roku 2016 (M.P. Nr 34, poz. 501 z dnia 25maja 2009 r.).

18 J. Siuta[16] Pondel H., Terelak H., Terelak T., Wilkos S. 1979. W³aœciwoœci chemiczne gleb uprawnych w Polsce. Pam.Pu³. Sup. Do z. 71: 189 ss.[17] Przeobra¿enia œrodowiska pod wp³ywem erozji 2002. Zesz. Prob. Post. Nauk Rol. 487: 397 ss.[18] Siuta J. 1974. Kszta³towanie przyrodniczych warunków rolnictwa w Polsce. PWN, Warszawa: 357 ss.[19] Siuta J. 2007. Ekologiczna rola regulacji stosunków wodnych w glebie. Wiad. Melioracyjne i £¹karskie 3:115–117.[20] Siuta J., Zieliñska A., Makowiecki K., Sroka L. 1987. potrzeby dolesieñ. Mapa Polski w skali 1:1 000 000. IOŒ,Warszawa.[21] Siuta J., ¯ukowski B. 2002. Ekologiczne podstawy racjonalizacji u¿ytkowania ziemi w Polsce. In¿. Ekol. 6: 18–30.[22] Siuta J., ¯ukowski B. 2008. Degradacja i rekultywacja ziemi w Polsce. IOŒ, Warszawa: 238 ss.[23] Siuta J., ¯ukowski B. 2009. Rozwój i potencjalne zagro¿enia agroekosystemów. Cz. II. Agroekologicznaefektywnoœæ drenowania gleb zwiêz³ych. Ochrona Œrodowiska i Zasobów Naturalnych 41: 596–613.[24] Siuta J., ¯ukowski B. 2010: Rozwój i potencjalne zagro¿enia agroekosystemów. Cz. III. Ocena efektywnoœciwapnowania gleb kwaœnych. Ochrona Œrodowiska i Zasobów Naturalnych 42: 109–121.[25] Wawer R., Nowocieñ E. 2006. Mapa erozji wodnej aktualnej w oparciu o CORINE Land Corer 2000. Pam. Pu³.142: 537–546.[26] Woch F., Nierubca M. 2001. Koncepcja kompleksowego rozwoju obszarów wiejskich Polski Wschodniej naprzyk³adzie gmin. Zesz. Towarzystwa Rozwoju Obszarów Wiejskich 3: 91–96.[27] Starker L. 1980. Erozja gleb a gospodarka wodna. Zesz. Zesz. Post. Nauk Rol. 401: 103–118.[28] Wybrane problemy kszta³towania krajobrazu w rozwoju obszarów wiejskich. 2001. Zesz. TROW 3: 114 ss.Land use optimization to mitigate processesof environmental degradationKey words: land use, soil, vegetal cover, water, landscape, environmentaldegradationSummarySoil and vegetal cover developed in the course of natural processes show a relativetimeless ecological equilibriume. Deforestation and elimination of grassland ecosystemsas well as drainage of wetland ecosystems for agricultural and technical infrastructurepurposes lead to deformation of natural vegetal cover, exposing land surfaceto destructive action of atmospheric precipitation and wind, thus affecting the functioningof atmosphere at Earth surface. If anthropogenic modification of the Earth surfacehas been and will be indispensable, technical and civilization advancing is importantto pay attention to ecological requirements of the maintenance and regeneration ofnatural resources. In order to limit (eliminate) the negative phenomena it is essentialthe space structures and land use patterns to be adjusted to natural conditions; at thesame time its necessary to take into account the needs of local communities and demandsof agro-technical progress. Laying down and implementation of integratedlaws in the sphere of maintenance and use of rural areas is of necessity for both, economicand ecological considerations.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 19–32Oszczêdne gospodarowanie wod¹koniecznym kryterium w hodowli roœlinKrystyna Rybka 1 , Grzegorz ¯urek 21 Zak³ad Biochemii i Fizjologii Roœlin2 Zak³ad Traw, Roœlin Motylkowatych i EnergetycznychInstytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin w Radzikowie, Pañstwowy Instytut Badawczy,05-870 B³oniee-mail: k.rybka@ihar.edu.pl g.¿urek@ihar.edu.plS³owa kluczowe: aparaty szparkowe, transpiracja, susza, wykorzystaniewodyWstêpKryterium odpornoœci roœlin na okresowo wystêpuj¹ce niedobory wody stanowiodpowiednia wysokoœæ plonu w warunkach suboptymalnego nawodnienia gleby. Jestto podstawowy warunek op³acalnoœci produkcji rolnej, gdy¿ w naszym kraju nawadnianiepól uprawnych dotyczy zaledwie 0,5% ogólnej powierzchni gruntów ornychi odbywa siê g³ównie w oparciu o system podsi¹kowy [24]. Jednak¿e coraz wyraŸniejzarysowuje siê koniecznoœæ podniesienia efektywnoœci wykorzystania wody przezroœliny uprawne, gdy¿ malej¹ce œwiatowe zasoby wodne wp³ywaj¹ na postêpuj¹cestepowienie ziemi. W wielu rejonach œwiata notuje siê zagro¿enie deficytami wodys³odkiej, wystêpuj¹cymi w sytuacjach, gdy proporcja zasobów pobranych do posiadanychprzekracza 20%. Dla Polski, wspó³czynnik ten wynosi 26,2% i wœród 35krajów europejskich plasuje nas na pi¹tym miejscu, za Macedoni¹, Niemcami,Hiszpani¹ i Bu³gari¹ (tab. 1).Kolejnym wskaŸnikiem, dokumentuj¹cym niekorzystne stosunki wodne w Polscejest Indeks Deficytu Wodnego (Water Poverty Index – WPI), który w odniesieniu donaszego kraju ma jedn¹ z najni¿szych w Europie wartoœci (tab. 1). Zasoby wodnePolski wynosz¹ jedynie ok. 203 km 3 i w przeliczeniu na jednego mieszkañca jest to ok.1 600 m 3 rocznie tzw. œrednich zasobów dyspozycyjnych. Wartoœæ ta jest znaczniemniejsza od œredniej dla Europy (ok. 10 000 m 3 ) i mo¿na j¹ porównaæ do zasobówwodnych Syrii, Somalii, Zimbabwe czy Hondurasu [16]. Deficyty wody, podobniejak i jej nadmiary s¹ wypadkow¹ nie tylko zjawisk atmosferycznych, ale równie¿

20 K. Rybka, G. ¯urekTabela 1. Zasoby i pobory wody s³odkiej w Europie w przeliczeniu na 1 mieszkañca oraz WPI*[wg 71]Kraj m 3 na mieszkañca rocznie % poborów Water Povertyzasobypoboryw zasobach Index 2002Finlandia 20857 479 2,3 78Islandia 566667 543 0,1 77Norwegia 81886 489 0,6 77Austria 9455 261 2,8 75Irlandia 12187 296 2,4 73Szwajcaria 7354 359 4,9 72Szwecja 19131 335 1,8 72Wielka Brytania 2449 163 6,7 72S³owacja 9276 337 3,6 71Holandia 5539 500 9,0 69S³owenia 16219 642 4,0 69Chorwacja 23161 164 0,7 68Francja 3343 674 20,2 68Grecja 6653 712 10,7 66Niemcy 1861 572 30,7 65Portugalia 6485 1125 17,3 65Hiszpania 2570 874 34,0 64Bu³garia 2797 1296 46,3 63Rosja 31764 527 1,7 63Belgia 1751 b.d. — 61Bia³oruœ 6014 278 4,6 61Dania 1099 238 21,7 61Republika Czeska 1290 250 19,4 61Wêgry 10353 763 7,4 61W³ochy 3289 771 23,4 61Rumunia 9837 1031 10,5 59Polska 1601 419 26,2 56Mo³dawia 2783 539 19,4 49Albania 13184 551 4,2 b.d.Boœnia i Hercegowina 9566 292 3,1 b.d.Estonia 9696 120 1,2 b.d.Litwa 7317 76 1,0 b.d.£otwa 15521 124 0,8 b.d.Macedonia 3137 936 29,8 b.d.Serbia i Czarnogóra 19815 1233 6,2 b.d.Ukraina 3066 755 24,6 b.d.Œrednio (bez Islandii**) 10686 534,7 11,9* WPI okreœla wp³yw braków i dostêpu do wody na populacjê ludzk¹. WPI zawiera siê miêdzy0 a 100, gdzie niskie wartoœci wskazuj¹ na wzglêdne ubóstwo wodne, a wysokie mówi¹o dostatecznym zaopatrzeniu w wodê. WskaŸnik ten liczony jest na podstawie 5 sk³adników:zasobów wodnych, dostêpu do nich oraz ich iloœci, ich wykorzystania oraz wp³ywu naœrodowisko.

Oszczêdne gospodarowanie wod¹ … 21niedostatecznej infrastruktury, m.in. braku zbiorników retencyjnych. Rozwi¹zanieproblemów ustabilizowanego dostêpu do wody i jej jakoœci jest jedynie kwesti¹ czasu,niezale¿n¹ od rozwa¿añ nad s³usznoœci¹ ich podejmowania [65]. Dla ochrony wódw obszarach rolniczych, oprócz poznania charakteru i zmiennoœci czynników decyduj¹cycho iloœci wody dostêpnej dla upraw w danym regionie kraju i w okreœlonejporze roku, istotne jest opracowanie kryteriów doboru rodzaju upraw, a zw³aszcza odmianw obrêbie gatunków tak, aby zoptymalizowaæ eksploatacjê zasobów wodnych.Celem obecnego przegl¹du jest rozwa¿enie czy, w œwietle osi¹gniêæ badañ nadfizjologicznymi i biochemicznymi podstawami odpornoœci na stres dehydratacyjny,celowe i konieczne jest poszukiwanie i wprowadzenie dodatkowego kryterium selekcyjnegodo hodowli roœlin, które przyczyni³oby siê do racjonalizacji wykorzystaniawody na terenach rolniczych i miejskich terenach zielonych, niezale¿nie od sezonowychfluktuacji pogody.WskaŸniki odpornoœci na suszêi oszczêdnego gospodarowania wod¹ przez roœlinyDeficyt wody w komórkach i tkankach indukuje zmiany biochemiczne i fizjologiczne,zaburzaj¹c funkcje ¿yciowe roœlin, prowadz¹c do zahamowania wzrostui rozwoju, a w przypadku d³ugotrwa³ego braku wody równie¿ do zamierania tkanek.W warunkach klimatu umiarkowanego na pó³kuli pó³nocnej, roœliny nara¿one s¹równoczeœnie na niedobory wody i towarzysz¹cy im stres œwietlny, gdy¿ susza jestczêsto zwi¹zana z d³ugotrwa³ymi wy¿ami, którym towarzysz¹ nie tylko brak opadów,latem – podwy¿szone, a zim¹ – obni¿one temperatury, lecz tak¿e wzmo¿one promieniowanieœwietlne wywo³ane brakiem zachmurzenia [36]. Stresy te dzia³aj¹c synergistyczniewywo³uj¹ szereg reakcji biochemicznych prowadz¹cych m.in. do zamykaniaaparatów szparkowych w celu zmniejszenia transpiracji [11, 41, 62, 73]. Zahamowaniuulega pobieranie dwutlenku wêgla, a inhibicja fotosyntezy obni¿a poziomdostêpnej energii chemicznej, gromadzonej w postaci ATP i NADPH, co wymuszaz kolei koniecznoœæ wyemitowania nadmiarów energii zaadsorbowanej przez antenychlorofilowe w postaci promieniowania cieplnego, fluorescencji lub opóŸnionejluminescencji chlorofilu. Nadmiar zaadsorbowanej energii fotosyntetycznie czynnej(ang. Photosyntetic Active Radiation – PAR), która nie mo¿e zostaæ przetworzona naenergiê chemiczn¹ lub bezpiecznie rozproszona (np. w cyklu ksantofilowym) powodujefotoinhibicjê fotosyntezy, której towarzyszy z kolei odwracalna destrukcjacentrum reakcji fotosystemu II (PS II), spowolnienie transportu elektronów w obufotosystemach i wzmo¿one powstawanie reaktywnych cz¹stek tlenu (ROS), takichjak tlen singletowy, rodnik wodorotlenowy oraz anionorodnik ponadtlenkowy [31,35, 40]. Fotoinhibicji towarzysz¹ z jednej strony zmiany w charakterze emisjifluorescencji (FL) i opóŸnionej luminescencji (OL) chlorofilu, a z drugiej urucha-

22 K. Rybka, G. ¯urekmiane s¹ reakcje detoksyfikacji ROS [5, 6, 29, 43]. Je¿eli poziom napromieniowaniaroœlin jest zbyt wysoki lub oddzia³ywanie silnego œwiat³a d³ugotrwa³e, a mechanizmyprzeciwutleniaj¹ce w komórce nie s¹ zdolne do zneutralizowania nadmiaru reaktywnegotlenu, to zostaje zapocz¹tkowany stres oksydacyjny, którego przejawem jestinicjacja szeregu niepo¿¹danych reakcji, jak np. utleniania sk³adników DNA, agregacjibia³ek, wolnorodnikowego utleniania lipidów w b³onach tylakoidowych, prowadz¹cychdo czêœciowej, lub nawet ca³kowitej i nieodwracalnej inhibicji kluczowychreakcji fotosyntezy oraz fotodestrukcji aparatu fotosyntetycznego [19, 42].Nastêpuje tak¿e fotoutlenianie barwników fotosyntetycznych, dezintegracja strukturkomórkowych i zak³ócenia w gospodarce wodnej ca³ej roœliny. Nastêpuje zahamowaniewzrostu, a w przypadku d³ugotrwa³ego braku wody – zamieranie tkanek [74].Wieloletnie badania umo¿liwi³y stwierdzenie, ¿e na poziomie biochemicznymroœliny o podwy¿szonej odpornoœci na stres suszy charakteryzuj¹ siê: 1) sprawniejszymrozpoznawaniem i d³ugodystansowym przekazywaniem sygna³ów (w tymABA) [14, 31, 39, 50, 66, 69]; 2) wydajniejszym systemem naprawy lub/i degradacjiuszkodzonych i ubikwitynylowanych bia³ek, na drodze proteolizy [22, 38, 70, 74];3) lepsz¹ ochron¹ b³on komórkowych przez osmoprotektanty [25, 66, 76]; 4) wystêpowaniem,oddzia³uj¹cych g³ównie z trehaloz¹, bia³ek LEA (ang. Late EmbryogenesisAbundance) [10, 21]. Roœliny lepiej toleruj¹ce stres suszy charakteryzuj¹ siêrównie¿ 5) mniejszymi zmianami w metabolizmie mitochondriów, w tym: aktywacji/intensyfikacjidrogi alternatywnego oddychania [3, 56, 74] oraz 6) bardziejustabilizowanym potencja³em oksydacyjno redukcyjnym tkanek, utrzymywanym naodpowiednim poziomie zarówno w skutek hamowania tempa powstawania aktywnychform tlenu, jak i sprawniejsz¹ ich inaktywacj¹ [19].Zmiany biochemiczne powoduj¹: 1) redukcjê potencja³u wody i aktywnoœcikomórkowej; 2) spadek turgoru prowadz¹cy do zmniejszenia objêtoœci komórek orazzwiêkszenia stê¿enia osmoprotektantów; 3) zmiany struktury makromoleku³ orazstosunków przestrzennych miêdzy kompartmentami komórkowymi; 4) spowolnieniewzrostu [27, 37, 46, 51, 53, 59]. Aby tolerowaæ stres suszy roœliny z jednej stronydostosowuj¹ swoj¹ gospodarkê wodn¹ do wzrastaj¹cego deficytu wody, a z drugiejstrony ograniczaj¹ transpiracjê i usprawniaj¹ pobieranie oraz przewodzenie wodypoprzez wytwarzanie rozwiniêtego systemu korzeniowego i zwiêkszenie powierzchniprzekroju naczyñ przewodz¹cych [51, 53, 68, 72]. Usprawnienie pobieraniai przewodzenia wody przez roœliny prowadzi do wyd³u¿enia okresu ich prze¿yciai przyczynia siê do wzrostu ca³kowitej iloœci wody transpirowanej przez roœlinê.Równolegle z tymi mechanizmami, jako skutek selekcji naturalnej b¹dŸ hodowlanej,wykszta³ci³y siê systemy unikania stresu suszy, wœród których istotn¹ rolê odgrywaj¹:1) synchronizacja tempa wzrostu, by unikn¹æ sezonowej suszy (w Polsce – wczesnoœæ,kie³kowanie w warunkach suszy glebowej/niskiego potencja³u wodnego);2) szybkie kie³kowanie i krzewienie w celu zacienienia gleby; 3) krótki okreswegetacji (roœliny koñcz¹ wegetacjê zanim nast¹pi susza), b¹dŸ przeciwnie – d³ugi

Oszczêdne gospodarowanie wod¹ … 23okres wegetacji (roœliny te zazwyczaj maj¹ d³u¿szy system korzeniowy; 4) szczelnoœæblaszki liœciowej (woski), by transpiracja zachodzi³a jedynie przez aparaty szparkowe,gdy¿ parowanie poza aparatami szparkowymi jest bezproduktywne z punktuwidzenia fotosyntezy; 5) zasychanie liœci i tym samym zmniejszenie zapotrzebowaniana wodê [75, 77].Literatura dotycz¹ca badañ biochemicznych i fizjologicznych jest podsumowywanaw pracach przegl¹dowych systematycznie publikowanych zarówno przez wiod¹cejak i mniej znane zespo³y badawcze [7, 14, 18, 19, 34, 44, 45, 52]. Fizjologicznei biochemiczne metody stosowane w badaniach odpornoœci roœlin na suszê zosta³yprzez nas omówione w przygotowywanym w³aœnie opracowaniu [48].Obecnie jesteœmy œwiadkami rozwoju metod identyfikacji i badania funkcjigenów opartych na wstêpnej analizie fenotypowej oraz nastêpuj¹cej po niej analiziemolekularnej mutantów uzyskiwanych na drodze mutagenezy chemicznej i insercyjnej[32, 47]. Œwiatowe zasoby mutantów insercyjnych, wykazuj¹cych nadekspresjêpojedynczego genu, w genomie roœliny modelowej – rzodkiewnika (Arabidopsisthaliana) dochodz¹ obecnie do 400 tys. Mutacje te obejmuj¹ przesz³o 30 tys. z ca³kowitejliczby 33 tys. genów Arabidopsis i mog¹ byæ znalezione np. poprzez bazêdanych utworzon¹ w Salk Institute w La Jola/San Diego w Kalifornii (http://signal.salk.edu/Source/AtTOME_Data_Source.html).Roœlin¹ modelow¹ dla zbó¿ jestry¿ (Oriza sativa). Ze wzglêdu na trudnoœci wynikaj¹ce z wiêkszego ni¿ u Arabidopsisgenomu (394 Mbp vs. 157 Mbp) oraz rozwijanym dopiero systemem masowegowytwarzania i gromadzenia mutantów insercyjnych, liczba dostêpnych mutantówry¿u wynosi ok. 200 tys., co stanowi mniej wiêcej po³owê liczebnoœci wymaganej dozapewnienia statystycznej pewnoœci wprowadzenia mutacji w ka¿dym genie [32, 33].Geny, których ekspresja indukowana jest przez stresy œrodowiskowe koduj¹ nie tylkometabolity i bia³ka niezbêdne w ochronie struktur komórkowych przed fizycznymii biochemicznymi skutkami malej¹cego potencja³u wodnego w tkankach, lecz równie¿cz¹steczki zwi¹zane ze szlakami przekazywania sygna³ów [20]. Wœród genówstrukturalnych znajduj¹ siê geny bia³ek: LEA (ang. Late Embryogenesis Abundant),Hsp (ang. Heat Shock Proteins): proliny, betainy glicynowej; geny osmoprotektantówcukrowych: mannitolu, trehalozy; geny bia³ek warunkuj¹cych prawid³ow¹ strukturêb³on komórkowych: np. desaturaz -3 i -6; geny enzymów modyfikuj¹cych bia³ka:proteinazy i proteazy, a tak¿e fosfatazy; geny enzymów degraduj¹cych cz¹steczkiROS (ang. Reactive Oxygen Species) i warunkuj¹cych prawid³owy potencja³ oksydacyjno-redukcyjnyw komórce: dysmutazy, katalazy, peroksydazy, reduktazy; czywreszcie geny transporterów komórkowych – akwaporyn. Wœród genów koduj¹cychprzekaŸniki sygna³ów znajduj¹ siê geny kinaz oraz czynników transkrypcyjnychkoduj¹cych bia³ka z rodzin: DREB (ang. Dehydration Response Elements Bindin),ERF (ang. Ethylene Responsive Transcription Factor), WRKY (czynniki transkrypcyjneo konserwatywnej sekwencji aminokwasów: WRKYGQK), MYB (ang.Myeloblastosis), bHLH (ang. Basic Helix Loop Helix), bZIP (ang. Basic Leucine

24 K. Rybka, G. ¯urekZipper Domain), NAC (czynniki transkrypcyjne o domenie wspólnej dla genówbia³ek Nam, Ataf1 and Cuc2) oraz geny koduj¹ce rodzinê bia³ek palca cynkowego[58]. W ostatnim okresie (od 23 lutego 2010 do 25 maja 2010) w Stanach Zjednoczonychzg³oszono 262 patenty dotycz¹ce suszy i odnajdywane przez has³o „drought”[67]. Wœród nich 73% stanowi³y roœliny transgeniczne, a resztê tzw. konstrukty genowe,które mog¹ byæ wykorzystane do transformacji roœlin w celu podniesienia ichodpornoœci na suszê, w tym patent z dnia 6 kwietnia 2010, korporacji Mendel Biotechnologyoraz Monsanto [12]. Zg³oszony konstrukt ma wprowadzaæ geny, które spowoduj¹u roœlin transgenicznych w porównaniu z wyjœciowymi wzrost plonów poprzezwyd³u¿enie czasu wegetacji, lepsze kie³kowanie, wiêksze zadarnienie, lepiej rozwiniêtysystem korzeniowy, tolerancjê stresu ch³odu i suszy, obni¿one przewodnictwoaparatów szparkowych, zmienion¹ proporcjê metabolizmu C/N i podniesion¹ odpornoœæna niski poziom azotu i fosforu w glebie.Osi¹gniêcia w zakresie badañ biochemicznych i fizjologicznych, a tak¿e genetykimolekularnej pozwoli³y na wytworzenie narzêdzi wspomagaj¹cych selekcjê roœlin,utrzymuj¹cych wysoki poziom plonowania w warunkach niedoboru wody [46, 49].Dlatego te¿ po zarysowaniu z³o¿onego problemu odpornoœci na suszê, w nastêpnymrozdziale przejdziemy do zagadnienia, którego omówienie jest g³ównym celemnaszego artyku³u. Wyka¿emy w nim, dlaczego ze wzrostem plonu w warunkach suszyczêœciej zwi¹zany jest nadmierny (i bardzo czêsto niepotrzebny) wzrost wykorzystaniazasobów wodnych. Wzrastaj¹ca iloœæ wody pobieranej przez roœliny uprawêpowoduje koniecznoœæ wprowadzenia dodatkowego kryterium selekcyjnego, takiegoby przy zachowaniu wysokich plonów obni¿yæ nak³ady wodne, czy to ze Ÿróde³naturalnych, czy te¿ w wielorakich systemach nawadniania upraw [1, 9, 46].Stres suszy a efektywne wykorzystanie wodyprzez roœliny uprawneProblem efektywnego wykorzystywania wody EUW (ang. Efficient Use ofWater) przez roœliny to de facto pytanie o minimaln¹ iloœæ wody potrzebn¹ nawytworzenie jednostki masy organicznej w obrêbie gatunku. Jego istota jest ró¿na odpojêcia wydajnoœci transpiracji TE (ang. Transpiration Efficiency) bêd¹cego, przyzdefiniowanych warunkach brzegowych, synonimem skutecznoœci/efektywnoœciwykorzystania wody WUE (ang. Water Use Eficciency), parametru mówi¹cegoo iloœci suchej masy wytworzonej przez roœlinê przy transpiracji 1 litra wody [9, 27,60]. Analizuj¹c wydajnoœæ transpiracji mo¿emy w obrêbie gatunku poszukiwaæ genotypówwytwarzaj¹cych maksymaln¹ iloœæ masy zielonej przy transpiracji jednegolitra wody, jednak¿e taki wskaŸnik nie jest przewa¿nie brany pod uwagê w pracachselekcyjnych. Zauwa¿ono, ¿e wspó³czesne kryteria selekcji roœlin w kierunku podniesieniaodpornoœci na suszê, promuj¹ roœliny „rozrzutne”, utrzymuj¹ce turgor w wa-

Oszczêdne gospodarowanie wod¹ … 25runkach suszy dziêki intensywniejszej transpiracji, czyli charakteryzuj¹ce siê mniejsz¹jej wydajnoœci¹. Zagadnienia iloœci wody transpirowanej przez roœliny zaczynaj¹wchodziæ w obszar zainteresowañ naukowców i hodowców [9].Z punktu widzenia efektywnego („oszczêdnego”) wykorzystywania wody w procesieasymilacji wêgla, transpiracja pozaszparkowa (zarówno kutikularna jak i przetchlinkowa)jest zjawiskiem niepo¿¹danym, zazwyczaj nie przekraczaj¹cym kilku dokilkunastu procent. Im ni¿sza jej wartoœæ, tym lepsze wykorzystanie wody [17].Dowiedziono, ¿e mo¿e ona stanowiæ dodatkowe kryterium w selekcji roœlin o podniesionejodpornoœci na suszê i ¿e selekcjê mo¿na prowadziæ ju¿ w fazie siewki, gdy¿iloœæ wosków, ograniczaj¹cych transpiracjê pozaszparkow¹, odk³adanych w warstwiekutikularnej jest zazwyczaj niezale¿na od wp³ywu warunków œrodowiskowych [2].Ju¿ w latach 60. i 70. ubieg³ego stulecia w pracach zespo³u profesora Strebeykidowiedziono, ¿e umiarkowane przymkniêcie aparatów szparkowych chroni roœlinêprzed zbêdnymi stratami wody, ale jeszcze nie hamuje dyfuzji dwutlenku wêglaw stopniu ograniczaj¹cym fotosyntezê. Zaobserwowano ograniczenie fotosyntezyw warunkach niedostatku wody u siewek kapusty, liœci buraka cukrowego i machorkidopiero wówczas, gdy szparki by³y prawie zamkniête. Zró¿nicowanie pomiêdzywielkoœciami cz¹steczek dwutlenku wêgla i wody (CO 2 >H 2 O) umo¿liwia roœlinieograniczenie transpiracji przy niezmienionym poziomie pobieranego CO 2 . U tejsamej roœliny, przy jednakowo rozwartych szparkach, w takich samych warunkachciœnienia i temperatury mo¿na zaobserwowaæ parowanie wody 40 razy wiêksze ni¿poch³anianie dwutlenku wêgla, gdy porównuje siê wartoœci wyra¿one w gramach,z kolei porównanie wielkoœci molowych uwidacznia ró¿nicê prawie 100-krotn¹ [64].Zale¿noœæ ruchów aparatów szparkowych od stê¿enia dwutlenku wêgla jest znanaprawie od stulecia, a od przesz³o czterdziestu lat wiemy o jej zwi¹zku z ABA[31]. Niemniej jednak dopiero ostatnie badania z wykorzystaniem mutantów pozwoli³y napog³êbienie wiedzy na temat mechanizmu rozwoju aparatów szparkowych [8], wp³ywuœwiat³a [54] oraz regulacji rozwarcia aparatu szparkowego zale¿nego od ABAi stê¿enia jonów [55]. Pod wp³ywem sygna³ów indukowanych przez bodŸce œrodowiskowew obrêbie liœcia, jak i sygna³ów przekazywanych z korzeni, aparaty szparkowew sposób ci¹g³y zamykaj¹ siê b¹dŸ otwieraj¹, co jest skutkiem przetwarzaniai integracji tych sygna³ów w odpowiedŸ fizjologiczn¹ na poziomie roœliny, w pierwszymrzêdzie poprzez regulacjê turgoru [31]. Zamykanie aparatów szparkowychmo¿e skutkowaæ wzrostem temperatury liœcia wywo³uj¹c, w niesprzyjaj¹cych warunkachpogodowych, stres temperaturowy. Jednak, poniewa¿ roœliny wykszta³ci³y wieleró¿nych mechanizmów ograniczania wp³ywu stresów abiotycznych, do którychnale¿y np. falowanie ³anu zbó¿ przy niewielkich nawet powiewach wiatru [23], tegozagadnienia równie¿ nie podejmujemy.Nestor hodowli odpornoœciowej roœlin profesor Abraham Blum w roku 2009analizowa³ znaczenie EUW oraz WUE, przeciwstawiaj¹c pojêcie efektywnego wykorzystywaniawody przez roœliny uprawne (wysokie EUW – zjawisko po¿¹dane

26 K. Rybka, G. ¯urekw kategoriach ochrony zasobów wodnych) pojêciu wydajnoœci transpiracji, tj. skutecznoœciwykorzystania wody (WUE wysokie – zjawisko niepo¿¹dane w kategoriachochrony zasobów wodnych) [9]. Autor ten zwraca uwagê, ¿e traktowanie wskaŸnikaWUE jako synonimu odpornoœci na stres suszy i tym samym wysokiego plonowaniaw warunkach niedoborów wody jest nieprawid³owe. Argumentacja autora oparta jestna równaniu Passioura: Y = WU × WUE × HI.W równaniu tym wielkoœæ plonu okreœla siê jako iloczyn iloœci zu¿ytej wody WU(ang. Water Use), efektywnoœci wykorzystania wody (tj. wydajnoœci transpiracjiwkgs.m.·l –1 H 2 O) WUE i indeksu plonowania HI (ang. Harvest Index). Równanie tojest wykorzystywane i dziœ przez wielu fizjologów i hodowców [45]. Rozwi¹zuj¹c je,mo¿na potraktowaæ wskaŸnik WUE jako iloraz biomasy i iloœci wody zu¿ytej do jejwyprodukowania (WUE = B/WU), co prowadzi do zale¿noœci Y = B × HI. Popodstawieniu w miejscu B algorytmu de Wita: B = mT/E 0 , plon jest wprost proporcjonalnydo transpiracji (Y T), gdy¿ wielkoœæ „m”, to sta³a o wartoœci bardzo zbli¿onejdla wielu gatunków C 3 , T – transpiracja, a E 0 to entalpia parowania wody. Tak wiêc,zgodnie z rozumowaniem Bluma [9], wzrost plonowania mo¿na osi¹gn¹æ podnosz¹ctranspiracjê (T).Nieco odmiennie przedstawiono to zagadnienie z punktu widzenia fizjologiiroœlin. W doœwiadczeniu szklarniowym dla 22 odmian bawe³ny stwierdzono istnienieujemnej korelacji miêdzy efektywnoœci¹ wykorzystania wody (WUE) a przewodnictwemepidermalnym liœcia [17]. Niemniej jednak analiza prezentowanych w pracywyników, ukazuje wystarczaj¹co du¿¹ zmiennoœæ w obrêbie badanych cech, abypodj¹æ próbê selekcji w poszukiwaniu osobników charakteryzuj¹cych siê niskimprzewodnictwem aparatów szparkowych i jednoczeœnie dobrym plonowaniem, zarównow warunkach optymalnych, jak i w czasie suszy (rys. 1). W omawianymdoœwiadczeniu, znaleziono roœliny plonuj¹ce na podobnym poziomie zarówno w warunkachkontrolnych jak i w warunkach suszy (7,30 vs. 7,20), a ró¿ni¹ce siê przewodnictwemaparatów szparkowych o prawie 50%, ze zmiennoœci¹ tej cechy ok. 30%.Fish i Earl [17] zestawiaj¹ równie¿ zmiennoœæ wspó³czynników transpiracjiu innych, ni¿ bawe³na, gatunków: 41% – orzeszki ziemne; 25% – sorgo; 32 oraz 17%– pszenica; 18% – soja; 11% – groch krowi (Vigna). Przegl¹d danych literaturowychdokonany przez Kemaniana i in. [30] wskazuje na prawie dwukrotn¹ rozpiêtoœæ TEu odmian jêczmienia (od 3,20 do 5,60g·kg –1 ) i trzykrotn¹ u odmian pszenicy (od 3,10do 9,21 g · kg –1 ). Tak¿e u kukurydzy, roœliny typu C 4 , a wiêc z natury „oszczêdniejszej”w gospodarowaniu wod¹ [28] stwierdzono du¿¹ zmiennoœæ TE (> 50%) [15].Prace opublikowane przez zespó³ prof. Strebeyki pozwalaj¹ na poœrednie wnioskowanieo efektywnoœci wykorzystywania wody przez roœliny uprawne. Zestawieniezale¿noœci wydajnoœci fotosyntezy od przelotowoœci szparek APC (ang. Air PassageCapacity) [63] w liœciach kapusty [4], rzepaku jarego [57] i buraków cukrowych [26]wskazuj¹ na du¿e zró¿nicowanie w zakresie wykorzystania wody przez roœlinyuprawne, zale¿ne od gatunku, natê¿enia promieniowania (mniejsze zró¿nicowanie

Oszczêdne gospodarowanie wod¹ … 27Rysunek 1. Wp³yw stresu suszy na zale¿noœæ miêdzy such¹ mas¹ [g] a przewodnictwemaparatów szparkowych [mmol × m –2 s –1 ] oraz WUE [g × l –1 ] dla 22 genotypów bawe³nyuprawianych w warunkach szklarniowych w warunkach kontrolnych oraz suszy [17, zmodyfikowano]przy niskim natê¿eniu), wieku liœcia oraz stopnia odwodnienia tkanek (wiêkszezró¿nicowanie przy mniejszym odwodnieniu). I tak, burak cukrowy zarówno w warunkachoptymalnego nawodnienia jak i warunkach stresu suszy nie przekraczaj¹cego40% WSD liœci (ang. Water Saturation Deficit) charakteryzuje siê bardzo du¿ymzró¿nicowaniem przewodnictwa (od 1 do 6 cm min –1 m –1 ) dla ka¿dego WSD z zakresu< 40% i wartoœciami niemierzalnymi dla WSD > 40% (rys. 2a). Wydajnoœæ fotosyntezyw zale¿noœci od przewodnictwa mo¿e wzrosn¹æ nawet przesz³o dwukrotniedla zadanego przewodnictwa (rys. 2b).Wed³ug danych Fisha i Earla [17] wykazano potencjaln¹ mo¿liwoœæ wprowadzeniadodatkowego kryterium selekcyjnego w celu wyodrêbniania roœlin oszczêdniegospodaruj¹cych wod¹. Wyniki innych autorów [4, 13, 26, 57, 63] równie¿ ukazuj¹potencja³ wewn¹trzgatunkowej zmiennoœci, który mo¿na wykorzystaæ w selekcjiodmian oszczêdnie gospodaruj¹cych wod¹. Wszystkie te prace koresponduj¹ z rozwa¿aniamiBluma i uprawomocniaj¹ w³¹czenie wskaŸników efektywnego wykorzystaniawody przez roœliny uprawne do programów hodowli odpornoœciowej,szczególnie odpornoœci na stres dehydratacyjny. Omówiona przez nas literaturawskazuje wyraŸnie, ¿e: „w poszukiwaniu metod poprawy plonowania pojawia siêkoniecznoœæ bardzo œcis³ej integracji badañ na ró¿nych poziomach organizacji ¿yciaroœlin. Dotyczy to œcis³ego wspó³dzia³ania: genetyków molekularnych, biochemikówi fizjologów roœlin oraz hodowców” [61].

28 K. Rybka, G. ¯urekRysunek 2. Zale¿noœæ przelotowoœci aparatów szparkowych – APC [cm min –1 mb –1 ] w liœciachburaka cukrowego od deficytu wodnego – WSD [%] (a) oraz zale¿noœæ wydajnoœci fotosyntezy[gC cm –2 min –1 ] od APC (b) [26; za zgod¹ Redakcji]PodsumowanieOszczêdne gospodarowanie wod¹ przez roœliny uprawne wymusza rozszerzeniekryteriów selekcyjnych o dodatkowy parametr, jakim jest wspó³czynnik transpiracjiroœlin. W obecnych programach hodowlanych genotypy wy¿ej plonuj¹ce w warunkachsuszy przewa¿nie charakteryzuj¹ siê wy¿szym przewodnictwem aparatów szparkowych,co oznacza wzrost zu¿ycia wody w procesie transpiracji i tym samym istotneobni¿enie wartoœci wspó³czynnika transpiracji TE [g l –1 ] [9]. Dlatego w³aœnie parametrniskiego przewodnictwa aparatów szparkowych przy zadanym poziomie plonowaniapowinien byæ nowym kryterium wprowadzonym do hodowli roœlin odpornych nasuszê. Zastosowanie tego wskaŸnika mo¿e promowaæ roœliny „oszczêdne” w korzystaniuz zasobów wodnych. Obserwowana zmiennoœæ wewn¹trzgatunkowa jestwystarczaj¹co du¿a, by podj¹æ skuteczn¹ selekcjê.PodziêkowanieDziêkujemy panu prof. dr hab. Andrzejowi Anio³owi, IHAR, za wskazanieproblemu, a pani prof. dr hab. Barbarze Zagdañskiej za jego dyskusjê.Literatura[1] Araus J., Slafer G., Royo C., Serret M. 2008. Breeding for yield potential and stress adaptation in cereals. Crit.Rev. Plant Sci. 27: 377–412.[2] Araus J, Febrero A, Vendrell P. 1991. Epidermal conductance in different parts of durum wheat grown underMediterranean conditions: the role of epicuticular waxes and stomata. Plant Cell Envionr. 14: 545–558.[3] Atkin O.K., Macherel D. 2009. The crucial role of plant mitochondria in orchestrating drought tolerance. Ann.Bot. 103: 581–597.

Oszczêdne gospodarowanie wod¹ … 29[4] Bac³awska-Krzemiñska Z. 1973. Influence of light, water deficit and age of plant on photosynthesis and airpassage capacity in leaves of Brassica oleracea L. var. capitata alba v. Ditmarska. Hod. Roœl. Aklim. Nas.(obecnie Plant Breed. Seed Sci.) 17: 303–328.[5] B¹czek-Kwinta R., Filek W., Grzesiak S., Hura T. 2006. The effect of soil drought and rehydratation on growth iantioxidative activity in flag leaves of triticale. Biol. Plantarum 50: 55–60.[6] Baker N.R. 2008. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant Biol. 59:89–113.[7] Bartels D., Sunkar R. 2005. Drought and salt tolerance in plants. Crit. Rev. Plant Sci. 24: 23–58.[8] Bergmann D.C., Sack F.D. 2007. Stomatal development. Annu. Rev. Plant Biol. 58: 163–81.[9] Blum A. 2009. Effective use of water (EUW) and not water-use efficiency (WUE) is the target of crop yieldimprovement under drought stress. Field Crops Res. 112: 119–123.[10] Caramelo J.J., Iusem N.D. 2009. When cells lose water: Lessons from biophysics and molecular biology. Prog.Biophys. Mol. Bio. 99: 1–6.[11] Chaerle L., Van Der Straeten D. 2007. Regulating plant water status by stomatal control. W: Jenks M.A.,Hasegawa P.M., Jain S.M., Advances in Molecular Breeding Toward Drought and Salt Tolerant Crops.Springer, Netherlis: 73–90.[12] Creelman R.A., Gutterson N., Ratcliffe O., Reuber T.L., Cerny R.E., Duff K.F.Z., Kjemtrup-Lovelace S.,Meister R., Petracek M., Xu Q. (Mendel Biotechnology Inc. CA (US), Monsanto Company SL, MO (US)) 2010.Yield and stress tolerance in transgenic plants. United States Patent US 7692067 B2.[13] Condon A.G., Richards R.A., Rebetzke G.J., Farquhar G.D. 2004. Breeding for high water-use efficiency. J.Exp. Bot. 55: 2447–2460.[14] Cutler S.R., Rodriguez P.L., Finkelstein R.R., Abrams S.R. 2010. Abscisic acid: Emergence of a core signalingnetwork. Annu. Rev. Plant Biol. 61: 651–679.[15] Du T., Kang S., Sun J., Zhang X., Zhang J. 2009. An improved water use efficiency of cereals under temporaland spatial deficit irrigation in north China. Agr. Water Manage. 97: 66–74.[16] FAO, Food and Agriculture Organization, 2003. Review of World Water Resources by Country. Water Reports,FAO, Rome, 23: 127 ss.[17] Fish D.A., Earl H.J. 2009. Water-Use Efficiency is negatively correlated with leaf epidermal conductance incotton (Gossypium spp.). Crop Sci. 49: 1409–1415.[18] Foyer C., Bloom A.J., Queval G., Noctor G. 2009. Photorespiratory metabolism: Genes, mutants, energetics,and redox signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 60: 455–487.[19] Foyer C., Noctor G.D. 2009. Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling, acclimation andpractical implications. Antioxid. Redox Sign. 11: 861–905.[20] Gosal S.S., Wani S.H., Kang M.S. 2009. Biotechnology and drought tolerance. J. Crop Improv. 23: 19–54.[21] Goyal K., Walton L.J., Tunnacliffe A. 2005. LEA proteins prevent protein aggregation due to water stress.Biochem. J. 388: 151–157.[22] Grudkowska M., Zagdañska B. 2004. Multifunctional role of plant cysteine proteinases. Acta Biochim. Pol. 51:609–624.[23] Grzywacz A. 2006. Emil Nalborczyk (1932–2006). Wspomnienie. Nauka 2/2006: 188–192.[24] GUS, G³ówny Urz¹d Statystyczny, 2009. Ochrona Œrodowiska. Informacje i opracowania statystyczne.Warszawa: 1–527. «www.stat.gov.pl».[25] Iturriaga G., Suárez R., Nova-Franco B. 2009. Trehalose metabolism: from osmoprotection to signaling. Int. J.Mol. Sci. 10: 3793–3810.[26] Jarecka M. 1973. Influence of light, water deficit and age of plant on photosynthesis and air passage capacity inleaves of sugar beet (Beta vulgaris var. Saccharifera). Hod. Roœl. Aklim. Nas. (obecnie Plant Breed. Seed Sci.)17: 329–357.[27] Kacperska A. 2002. Reakcje roœlin na abiotyczne czynniki stresowe. W: Kopcewicz J., Lewak S. (red.)Fizjologia roœlin. Warszawa: PWN: 612–678.[28] Kacperska A. 2002. Gospodarka wodna. W: Kopcewicz J., Lewak S., (red.) Fizjologia roœlin. Warszawa: PWN:192–227.[29] Kalaji M., £oboda T. 2010. Fluorescencja chlorofilu w badaniach stanu fizjologicznego roœlin. Warszawa:Wydawnictwo SGGW.[30] Kemanian A.R., Stöckle C.O., Huggins D.R. 2005. Transpiration-use efficiency of barley. Agr. ForestMeteorol. 130: 1–11.

30 K. Rybka, G. ¯urek[31] Kim T.-H., Bohmer M., Hu H., Nishimura N., Schroeder J.I. 2010. Guard cell signal transduction network:Advances in understiing Abscisic Acid, CO 2 , and Ca 2+ signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61: 561–591.[32] Kondou Y., Higuchi M., Matsui M. 2010. High-throughput characterization of plant gene functions by usinggain-of-function technology. Annu. Rev. Plant Biol. 61: 373–393.[33] Krishnan A., Guiderdoni E., An G., Hsing Y., Han C., Lee M.C., Yu S.-M., Upadhyaya N., Ramachiran S.,Zhang Q., Sundaresan V., Hirochika H., Leung H., Pereira A. 2009. Mutant resources in rice for functionalgenomics of the grasses. Plant Physiol. 149: 165–170.[34] Langridge P., Paltridge N., Fincher G. 2006. Functional genomics of abiotic stress tolerance in cereals. BriefFunct Genomic Proteomic 4: 343–354.[35] Logan B.A., Kornyeyev D., Hardison J., Holaday A.S. 2006. The role of antioxidant enzymes inphotoprotection. Photosynt. Res. 88: 119–132.[36] Lorenz H. 2005. Atlas Klimatu Polski. Instytut Meteorologii i Gospodarki Wodnej, Warszawa: 116 ss.[37] Maseda P.H., Ferniez R.J. 2006. Stay wet or else: three ways in which plants can adjust hydraulically to theirenvironment. J. Exp. Bot. 57: 3963–3977.[38] Miazek A., Zagdañska B. 2008. Involvement of exopeptidases in dehydration tolerance of spring wheatseedlings. Biol. Plantarum 52: 687–694.[39] Miyazono K., Miyakawa T., Sawano Y., Kubota K., Kang H., Asano A., Miyauchi Y., Takahashi M., Zhi Y.,Fujita Y., Yoshida T., Kodaira K., Yamaguchi-Shinozaki K., Tanokura M. 2009. Structural basis of abscisicacid signalling. Nature 462: 609–614.[40] Moradi F., Ismail A.M. 2007. Responses of photosynthesis, chlorophyll fluorescence i ROS-scavengingsystems to salt stress during seedling and reproductive stages in rice. Ann. Bot. 99: 1161–1173.[41] Morgan J.M. 1984. Osmoregulation and water stress in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 35: 299–319.[42] Mostowska A., GwóŸdŸ E.A. 1998. Reakcje aparatu fotosyntetycznego na stres oksydacyjny. Post. Biol. Kom.22: 43–63.[43] Murkowski A. 2002. Oddzia³ywanie czynników stresowych na luminescencjê chlorofilu w aparacie fotosyntetycznymroœlin uprawnych. Acta Agroph. 61: 1–158.[44] Noctor G., Paepe R.D., Foyer C. 2007. Mitochondrial redox biology and homeostasis in plants. Trends PlantSci. 12: 125–134.[45] Reynolds M., Tuberosa R. 2008. Translational research impacting on crop productivity in drought-proneenvironments. Curr. Opin. Plant Biol. 11: 171–179.[46] Richards R.A., Rebetzke G.J., Watt M., Condon A.G., Spielmeyer W., Dolferus R. 2010. Breeding for improvedwater productivity in temperate cereals: phenotyping, quantitative trait loci, markers and the selectionenvironment. Funct. Plant Biol. 37: 85–97.[47] Rybka K. 2009. TILLING i FOX-hunting: nowe metody analizy funkcjonalnej genów. Post. Biol. Kom. 36:539–554.[48] Rybka K., Or³owska R. 2010. Metody oceny odpornosci roslin na suszê. Monografia. Radzików InstytutHodowli i Aklimatyzacji Roœlin: w przygotowaniu.[49] Salekdeh G.H., Reynolds M., Bennett J., Boyer J. 2009. Conceptual framework for drought phenotyping duringmolecular breeding. Trends Plant Sci. 14: 488–496.[50] Santiago J., Rodrigues A., Saez A., Rubio S., Antoni R., Dupeux .F., Park S.-Y., Márquez J.A., Cutler S.R.,Rodriguez P.L. 2009. Modulation of drought resistance by the abscisic acid receptor PYL5 through inhibition ofclade: A PP2Cs. Plant J. 60: 575–588.[51] Schachtman D.P, Goodger J.Q.D. 2008. Chemical root to shoot signaling under drought. Trends Plant Sci. 13:281–287.[52] Shao H.-B., Chu L.-Y., Jaleel C.A., Manivannan P., Panneerselvam R., Shao M.-A. 2009. Understanding waterdeficit stress-induced changes in the basic metabolism of higher plants – biotechnologically and sustainablyimproving agriculture and the ecoenvironment in arid regions of the globe. Crit. Rev. Biotechnol. 29: 131–151.[53] Shao H.-B., Chu L.-Y., Jaleel C.A., Zhao C.-X. 2008. Water-deficit stress-induced anatomical changes inhigher plants. CR Biol. 331: 215–225.[54] Shinozaki K., Doi M., Assmann S.M., Kinoshita T. 2007. Light regulation of stomatal movement. Annu. Rev.Plant Biol. 58: 219–47[55] Sirichira C., Wasilewska A., Vlad F., Valon C., Leung J. 2009. The guard cell as a single-cell model towardsunderstiing drought tolerance and abscisic acid action. J. Exp. Bot. 60: 1439–63

Oszczêdne gospodarowanie wod¹ … 31[56] Skirycz A., De Bodt S., Obata T., De Clercq I., Claeys H., De Rycke R., Iriankaja M., Van Aken O., VanBreusegem F., Fernie A. R., Inze D. 2010. Developmental stage specificity and the role of mitochondrialmetabolism in the response of arabidopsis leaves to prolonged mild osmotic stress. Plant Physiol. 152: 226–244.[57] Skoœkiewicz K. 1973. Stomatal movements in summer rape Bronowski IHAR (Brassica napus L. ssp. oleifera(METZG) sinsk. F. Annu a Thel.) in dependence on the age of the leaf, water deficit, light intensity and CO 2concentration. Hod. Roœl. Aklim. Nas. (obecnie Plant Breed. Seed Sci.) 17: 359–385.[58] Somvanshi V. S. 2009. Patenting drought tolerance in organisms. Recent Patents on DNA & Gene Sequences 3:16–25.[59] Sreenivasulu N., Sopory S.K., Kavi Kishor P.B. 2007. Deciphering the regulatory mechanisms of abiotic stresstolerance in plants by genomic approaches. Gene 388: 1–13.[60] Starck Z. 2002. Fizjologiczne podstawy produktywnoœci roœlin. W: Kopcewicz J., Lewak S. (red.) Fizjologiaroœlin. Warszawa: wyd. PWN: 679–706.[61] Starck Z. 2009. Dystrybucja asymilatów kluczowym procesem determinuj¹cym plon. Post. Nauk Roln. 2:51–69.[62] Strebeyko P. 1966. Zmiany zawartoœci wody w tkankach roœlinnych jako miara wahañ bilansu wodnegow badaniach ekologicznych i rolniczych. Roczn. Nauk Roln. 91-A-3: 545–562.[63] Strebeyko P. 1973. Theoretical principles of gas exchange in plants. Hod. Roœl. Aklim. Nas. (obecnie PlantBreed. Seed Sci.) 17: 287–295.[64] Strebeyko P. 1976. Procesy biofizyczne w roœlinie. Warszawa: PWN: 257–258.[65] TPI, Turfgrass Producers International, 2010. Water Right – Conserving Our Water, Preserving Our Environment,The Lawn Institute, 2 East Main Street, East Dundee, IL 60118 USA,«http://www.turfgrasssod.org/publish/posts/71/water-right-publication».[66] Urano K., Maruyama K., Ogata Y., Morishita Y., Takeda M., Sakurai N., Suzuki H., Saito K., Shibata D.,Kobayashi M., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. 2009. Characterization of the ABA-regulated globalresponses to dehydration in Arabidopsis by metabolomics. Plant J. 57: 1065–1078.[67] US Patent Database: «http://patft1.uspto.gov/».[68] Wang P., Song C.-P. 2008. Guard-cell signalling for hydrogen peroxide and abscisic acid. New Phytol. 178:703–718.[69] Wilson P.B., Estavillo G.M., Field K.J., Pornsiriwong W., Carroll A.J., Howell K.A., Woo N.S., Lake J.A.,Smith S.M., Millar A.H., von Caemmerer S., Pogson B.J. 2009. The nucleotidase/phosphatase SAL1 isa negative regulator of drought tolerance in Arabidopsis. Plant J. 58: 299–317.[70] Wiœniewski K., Zagdañska B. 2001. Genotype-dependent proteolytic response of spring wheat to waterdeficiency. J. Exp. Bot. 52: 1455–1463.[71] World Resources Institute (2008), World Resources 2008: Roots of Resilience -Growing the Wealth of the Poor.World Resources Institute (WRI) we wspó³pracy z United Nations Development Programme, United NationsEnvironment Programme i World Bank. 2008. Washington, DC: 277 ss.[72] Xu Z., Zhou G. 2008. Responses of leaf stomatal density to water status and its relationship with photosynthesisin a grass. J. Exp. Bot. 59: 3317–3325.[73] Zagdañska B., Pacanowska A. 1979. Dehyderatation tolerance in spring wheat seeds. Biol. Plantarum 21:462–467.[74] Zagdañska B. 1997. Mechanizmy odpornoœci zbó¿ na suszê glebow¹: metabolizm energetyczny pszenicy jarejw nabywaniu odpornoœci. Biuletyn IHAR 203: 41–55.[75] Zagdañska B., Kozdój J. 1994. Water stress-induced changes in morphology and anatomy of flag leaf of springwheat. Acta Soc. Bot. Pol. 63: 61–66[76] Zhang J., Dell B., Conocono E., Waters I., Setter T., Appels R. 2009. Water deficits in wheat: fructanexohydrolase (1-FEH) mRNA expression i relationship to soluble carbohydrate concentrations in two varieties.New Phytol. 181: 843–850.[77] ¯urek G. 2006. Reakcja traw na niedobory wody – metody oceny i ich zastosowanie dla gatunków trawnikowych.Monografia. Radzików: Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin: 1–106.

32 K. Rybka, G. ¯urekEffective use of wateras an obligatory criterion in plant breedingSummaryKey words: stomata, transpiration, drought, water usageDestabilized water balance is difficult to be restored and periodical floods are unableto rebuild it. Improvement of efficiency in water usage in agriculture is possibleby the tightening of melioration systems, by the extension of retention reservoir netsand may be also supported by plant breeding methods. Taking into account the effectiveuse of water into breeding processes, new selection markers should be added todistinct individual plants which keep low respiration rate. Such cultivars should givegood yield along with maintaining low transpiration level in both: optimal andsub-optimal climatic conditions. Presently modern cultivars with improved droughtresistance retain proper turgor under stress conditions by more intense transpiration[9]. Unfortunately, more intense transpiration during the drought period is compatiblewith higher transpiration rate under the optimal weather conditions, what results inlarger amount of water evapotranspirating from the soil.In this review, reducing of water usage by crops has been discussed. Major attentionwas paid to the conductance trait of stomata as a marker suitable for selection ofplants which have good yield and lower transpiration.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 33–41Substancje aktywne stosowane w ochronieupraw ekologicznych i konwencjonalnychw œwietle aktualnych przepisówEwa Matyjaszczyk, Joanna SobczakZak³ad Ekspertyz i Opinii o Œrodkach Ochrony RoœlinInstytut Ochrony Roœlin – Pañstwowy Instytut Badawczy,ul. W. Wêgorka 20, 60-318 Poznañe-mail: E.Matyjaszczyk@ior.poznan.pl, J.Sobczak@ior.poznan.plS³owa kluczowe: Substancja aktywna, œrodki ochrony roœlin, dostêpnoœæ,PolskaWstêpPrzepisy dotycz¹ce ochrony roœlin w pañstwach cz³onkowskich Unii Europejskiejs¹ silnie zharmonizowane. W obowi¹zuj¹cej obecnie w Unii Europejskiej Dyrektywie91/414 dotycz¹cej wprowadzania œrodków ochrony roœlin do obrotu [1] podkreœlono, ¿eg³ównym jej celem nie jest poprawa poziomu produkcji rolniczej, ale zapewnieniebezpieczeñstwa ludzi i œrodowiska naturalnego. Liczba substancji aktywnych dopuszczonychdo stosowania w ochronie roœlin na terenie Unii Europejskiej od kilku lat systematyczniemaleje. Analizuj¹c nowe akty prawne dotycz¹ce ochrony roœlin, które wejd¹w ¿ycie od roku 2011 [2, 10] mo¿na stwierdziæ, ¿e wymagania dotycz¹ce rejestracjiœrodków ochrony roœlin (œ.o.r.) prawdopodobnie wzrosn¹, a liczba dostêpnych substancjiaktywnych bêdzie nadal mala³a. Rodzi to obawy o mo¿liwoœci ochrony wieluupraw, szczególnie ma³oobszarowych oraz obawy dotycz¹ce zwiêkszenia prawdopodobieñstwawystêpowania odpornoœci na dostêpne substancje aktywne.Ze wzglêdu na du¿y nacisk, jaki Unia Europejska k³adzie na bezpieczeñstwo¿ywnoœci wydawa³oby siê, ¿e spadek mo¿liwoœci ochrony nie powinien dotyczyæupraw ekologicznych poniewa¿ do stosowania w rolnictwie ekologicznym kwalifikujesiê tylko nieliczne œ.o.r. zawieraj¹ce wy³¹cznie substancje aktywne pochodzenia naturalnego.Po dok³adnej analizie sytuacji prawnej okazuje siê jednak, ¿e paradoksalniew najbli¿szych latach przewidywany jest znacz¹cy spadek liczby substancji aktywnychi preparatów zakwalifikowanych do stosowania w rolnictwie ekologicznym.

34 E. Matyjaszczyk, J. SobczakMateria³ i metodyDla celów niniejszej publikacji przeanalizowano obecnie obowi¹zuj¹ce w UniiEuropejskiej i w Polsce akty prawne dotycz¹ce ochrony roœlin w rolnictwiekonwencjonalnym i ekologicznym oraz nowe przepisy, których obowi¹zywanierozpocznie siê w roku 2011, a tak¿e wyniki unijnego przegl¹du substancji aktywnychœrodków ochrony roœlin. Szczegó³owej analizie poddano równie¿ rejestrœ.o.r. Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi (wed³ug stanu na 30.04.2009, czyli5 lat po przyst¹pieniu Polski do Unii Europejskiej) oraz decyzje o wycofaniu œ.o.r.ze stosowania i dopuszczeniu do obrotu handlowego wydane w okresie cz³onkostwaPolski w Unii Europejskiej (to jest od 01.05.2004 do 30.04.2009). Rejestrœ.o.r. dopuszczonych do obrotu zezwoleniem Ministra Rolnictwa i RozwojuWsi znajduje siê na stronie internetowej Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi«http://www.bip.minrol.gov.pl/DesktopDefault.aspx?TabOrgId=647&LangId=0» i jestpublicznie dostêpny, natomiast decyzje o wycofaniu i dopuszczeniu œ.o.r. do obrotuotrzymywano na bie¿¹co z Ministerstwa Rolnictwa.ród³em danych dotycz¹cych œ.o.r. zakwalifikowanych do stosowania w rolnictwieekologicznym jest strona internetowa Instytutu Ochrony Roœlin – Pañstwowego InstytutuBadawczego w Poznaniu «http://www.ior.poznan.pl/index.php?strona=19&wiecej=26»[4] (Instytut jest jednostk¹ upowa¿nion¹ do kwalifikowania œrodków ochrony roœlindo stosowania w rolnictwie ekologicznym w Polsce).WynikiNa liœcie œ.o.r. zarejestrowanych w Polsce zachodz¹ zmiany bêd¹ce skutkiemprzyst¹pienia Polski do Unii Europejskiej w dniu 01.05.2004. Od przyst¹pienia doUnii Europejskiej w Polsce widoczny jest systematyczny spadek liczby zarejestrowanychœrodków ochrony roœlin [6], z jednoczesnym ograniczaniem dostêpnych substancjiaktywnych oraz zakresów etykiet œrodków ponownie rejestrowanych. Œrodekochrony roœlin sk³ada siê zwykle z szeregu zwi¹zków chemicznych, ale g³ównymsk³adnikiem, odpowiedzialnym za dzia³anie œrodka jest substancja aktywna. UniaEuropejska przeprowadzi³a przegl¹d oko³o 1000 substancji aktywnych pod k¹tem ichbezpieczeñstwa dla zdrowia ludzi, zwierz¹t i œrodowiska naturalnego. W wyniku tegoprzegl¹du zdecydowana ich wiêkszoœæ (74%) zosta³a wyeliminowana ze stosowaniaw ochronie roœlin. Warto podkreœliæ, ¿e tylko niewielk¹ czeœæ substancji aktywnych(7%) wycofano z powodu negatywnej oceny. Wiêkszoœæ (67%) wycofano poniewa¿producenci agrochemikaliów nie zdecydowali siê pokryæ kosztów oceny i kosztówniezbêdnych badañ, które wynosi³y zazwyczaj powy¿ej 1 mln euro.Oczywiœcie nie wszystkie substancje aktywne wycofane ze stosowania w UniiEuropejskiej by³y zarejestrowane w Polsce, ponadto producenci substancji aktywnychstosowanych powszechnie w ochronie roœlin i sprzedawanych w du¿ych iloœ-

Substancje aktywne … 35ciach chêtnie pokrywali koszty oceny. Nale¿y równie¿ pamiêtaæ, ¿e ka¿dego roku narynek wprowadzane s¹ œ.o.r. zawieraj¹ce nowe substancje aktywne. Dlatego, abymówiæ o skutkach wycofañ, nale¿y przeanalizowaæ, jakie substancje aktywne zosta³ywycofane i wprowadzone do stosowania w Polsce.W tabeli 1 przedstawiono zmiany w dostêpnoœci substancji aktywnych œ.o.r.w analizowanym okresie pierwszych piêciu lat cz³onkostwa Polski w Unii Europejskiej.Stopniowe wycofywanie substancji aktywnych ze stosowania w Polscew analizowanym okresie by³o bezpoœrednim skutkiem decyzji podejmowanych naszczeblu unijnym.Tabela 1. Substancje aktywne zarejestrowane po raz pierwszy w Polsce oraz ca³kowiciewycofane ze stosowania w ochronie roœlin w Polsce w okresie 01.05.2004-30.04.2009RodzajsubstancjiNowo zarejestrowanesubstancje aktywneWycofanesubstancje aktywneFungicydy,Bakteriocydybenalaksyl-M, bentiowalikarb, boskalid,cyjazofamid, dimoksystrobina,*fenbukonazol, fluoksastrobina, fluopikolid,mandipropamid, metrafenon,*olej z pomarañczy, *paklobutrazol,piraklostrobina, proquinazid, protiokonazol,Pseudomonas chloraphis (16)aldehyd glutarowy, azakonazol, chitozan,cyprokonazol, czwartorzêdowy zwi¹zekamoniowy, dichlofluanid, dodyna, ekstraktz nasion i mi¹¿szu grejpfruta, formaldehyd,kwas borowy, lecytyna, metalaksyl,mychlobutanil, ofurace, oksadiksyl, oksynasalicylomiedziowa, prochloraz,procymidon, triadimefon, tridemorf,triforyny, winchlozolina (22)HerbicydyInsektycydy,AkarycydyInneaminopyralid, bifenoks, dimetenamid-P,petoksamid, pinoksaden, tembotrion (6)Cydia Pomonella Granulosis Virus,flonikamid, gamma-cyhalotryna,metaflumizon, spirodiklofen,*tau-fluwalinat (6)*2-metylo-3 buten-z-ol,1-metylocyklopropen, ekstrakt roœlinnyz alg Ecklonia maxima, F-myrcenol,ipsdienol, octan (ZE)-9,12 tetradekadienylu,olej lniany, polialkilenotlenekheptametylotrisiloksanu (8)alachlor, dichloroprop, fluoroglikofen,haloksyfop-R, imazetapyr, propachlor,setoksydym, symazyna, terbutyloazyna,trifluralina (10)amitraz, azynofos metylowy, benfurakarb,bromek metylu, buprofezyna, cyheksatyna,diazynon, fenitrotion, fenpropatryna,heksaflumuron, heksytiazoks, izofenfos,karbofuran, karbosulfan, malation,metomyl, oksydemeton metylowy,piperonylobutoksyd, pirydafention,propoksur, tebufenozid, tetradifon,tetrametryna, tiodikarb, triazamat,trichlorfon (26)2-metylo-3-buten-ol, Agrobacteriumradiobacter, aldehyd cynamonowy,brodifakum, chlorek choliny, dimetypina,fluroprimidol, metaldehyd, siarczanamonowy, streptomycyna, sulfid2-hydroksyetylowo-butylowy, tlenekwapnia (12)ród³o: Opracowanie w³asne.* Substancje aktywne nowo zarejestrowanych w Polsce œ.o.r., dla których zapad³a decyzjao niew³¹czaniu do Za³¹cznika I Dyrektywy 91/414 EWG i wycofaniu ze stosowania w ochronieroœlin na terenie Unii Europejskiej.

36 E. Matyjaszczyk, J. SobczakJak wynika z tabeli 1, w latach 2004–2009 w Polsce zarejestrowano 36 substancjiaktywnych œ.o.r., które wczeœniej nie by³y w naszym kraju stosowane w ochronieroœlin – przy czym dla 5 z nich (nazwy oznaczono w tabeli gwiazdkami) zapad³adecyzja o wycofania ze stosowania w Unii Europejskiej, czyli 31 z nich bêdziestosowanych w ochronie roœlin w Polsce (sytuacja prawna oleju z pomarañczy zosta³aomówiona dok³adniej w czêœci dotycz¹cej ochrony upraw ekologicznych). Najliczniejsz¹grupê wœród substancji nowo zarejestrowanych stanowi³y substancje przeznaczonedo zwalczania chorób, wchodz¹ce w sk³ad fungicydów. W tym samym okresiewydano decyzje o wycofaniu 70 substancji aktywnych, które przed przyst¹pieniem doUnii Europejskiej by³y stosowane w ochronie roœlin w Polsce, najliczniejsz¹ grupêwœród nich stanowi³y substancje przeznaczone do zwalczania szkodników. Oznaczato, ¿e liczba dostêpnych w Polsce dla rolnictwa substancji aktywnych œ.o.r. uleg³aznacznemu ograniczeniu. Ograniczenie dotyczy³o ka¿dej grupy œrodków: liczbasubstancji stosowanych w ochronie przed chorobami zmniejszy³a siê o 9, w ochronieprzed chwastami o 4, w ochronie przed szkodnikami a¿ o 21 i w ochronie przedpozosta³ymi organizmami szkodliwymi o 5.W rolnictwie ekologicznym w pierwszym rzêdzie powinno siê zapobiegaæ szkodomwyrz¹dzanym przez szkodniki, choroby i chwasty przez ochronê naturalnychwrogów, dobór odpowiednich gatunków i odmian roœlin uprawnych, stosowaniep³odozmianu, odpowiednich technik uprawy, a tak¿e metod termicznych. Gdy metodyte nie przynosz¹ w³aœciwych rezultatów mo¿na siêgaæ po œrodki ochrony roœlin, aletylko takie, które spe³niaj¹ kryteria odpowiednich aktów prawnych. Substancje, któremo¿na stosowaæ w ochronie upraw ekologicznych w Unii Europejskiej, zosta³ywymienione z podzia³em na grupy w za³¹czniku II do rozporz¹dzenia Rady nr889/2008 [8]. Oczywiœcie, z uwagi na specyfikê rolnictwa ekologicznego jest ichznacznie mniej ni¿ w rolnictwie konwencjonalnym.Do niedawna w Polsce mo¿liwe by³o stosowanie w rolnictwie ekologicznym,tylko i wy³¹cznie, tych dopuszczonych dla ochrony upraw ekologicznych przez UniêEuropejsk¹ substancji aktywnych, które wchodz¹ w sk³ad zarejestrowanych w Polsceœ.o.r. [11]. W roku 2009 polskie przepisy uleg³y zmianie [12]. Zgodnie z wymaganiamiunijnymi przedstawionymi w art. 16 Rozporz¹dzenia 834/2007 [9] w rolnictwieekologicznym mo¿na stosowaæ produkty i substancje niezakwalifikowane do stosowaniaw rolnictwie ekologicznym pod warunkiem przestrzegania celów i zasad rolnictwaekologicznego. W Polsce brak jest na razie rozporz¹dzeñ wykonawczychuœciœlaj¹cych te przepisy. Warto podkreœliæ, ¿e konsekwencje zastosowania nieodpowiednichpreparatów mog¹ byæ bardzo powa¿ne. W interesie rolników by³oby zatemjak najszybsze stworzenie krajowych wytycznych w tym zakresie.Do stosowania w rolnictwie ekologicznym w Polsce zakwalifikowano obecnie 15substancji aktywnych œ.o.r.: 9 s³u¿¹cych do ochrony przed chorobami, 3 s³u¿¹ceochronie przed szkodnikami, 1 – miazga czosnkowa stosowana zarówno w zwalczaniuchorób jak i szkodników oraz 2 stosowane w ochronie przed innymi organizmami

Substancje aktywne … 37szkodliwymi. Ze wzglêdu na brak firm, które zdecydowa³yby siê pokryæ koszty badañi oceny niektórych z tych substancji aktywnych zostan¹ one w najbli¿szych latachwycofane ze stosowania w ochronie roœlin na terenie Unii Europejskiej. Po ich wycofaniupozostanie 9 substancji aktywnych dopuszczonych do stosowania w rolnictwieekologicznym obecnych w œrodkach ochrony roœlin zarejestrowanych w Polsce.W ciekawej sytuacji prawnej jest olej z pomarañczy u¿ywany w ochronie przedchorobami. Wydano ju¿ decyzje dotycz¹c¹ wycofania tej substancji aktywnej zestosowania w ochronie roœlin. Jednak ostatnio jej producent dostarczy³ wymaganedokumenty i ocena tej substancji aktywnej zosta³a podjêta na nowo. Istnieje zatemmo¿liwoœæ, ¿e decyzja o wycofaniu zostanie w tym przypadku zmieniona. Wartorównie¿ zauwa¿yæ, ¿e mimo i¿ miazga czosnkowa zosta³a wycofana ze stosowaniaw Unii Europejskiej, to wyci¹g z czosnku (który formalnie stanowi inn¹ substancjêaktywn¹) mo¿e byæ nadal stosowany.Tabela 2. Substancje aktywne wchodz¹ce w sk³ad œrodków ochrony roœlin zakwalifikowanychdo stosowania w rolnictwie ekologicznym w PolsceRodzaj substancjiSubstancje aktywne w³¹czone doZa³¹cznika I Dyrektywy 91/414EWGFungicydy/ Bakteriocydy Coniothyrium minitans, miedŸ, ,Pythium oligandrum, siarka,wyci¹g z czosnkuInsektycydy/ Akarycydy Cydia pomonella Granulosis Virus,olej parafinowy CAS8042-47-5, spinosadSubstancje aktywne niew³¹czone do Za³¹cznika IDyrektywy 91/414 EWGchitozan, miazga czosnkowa,ekstrakt z grejpfruta, wyci¹g zsuszu zió³, olej z pomarañczymiazga czosnkowaInne piasek kwarcowy wyci¹g z tkanek roœlinród³o: opracowanie w³asne na podstawie wykazu œrodków ochrony roslin zakwalifikowanychdo stosowania w rolnictwie ekologicznym w Polsce Instytutu Ochrony Roœlin–PIB«http://www.ior.poznan.pl/index.php?strona=19».DyskusjaDane przedstawione powy¿ej wyraŸnie wskazuj¹ na fakt, i¿ liczba substancjiaktywnych stosowanych w ochronie roœlin w Polsce, zarówno w rolnictwie konwencjonalnymjak i ekologicznym w analizowanym okresie znacznie siê zmniejszy³a.Powodem, i w jednym i w drugim przypadku, by³ przegl¹d substancji aktywnychprzeprowadzony przez Komisjê Europejsk¹, którego celem by³o wyeliminowanie zestosowania substancji potencjalnie niebezpiecznych, a którego nieplanowanym skutkiemby³o wycofanie ze stosowania równie¿ substancji aktywnych stosowanychw niewielkich iloœciach, w przypadku których koszty przegl¹du by³y wy¿sze ni¿przewidywane zyski ze sprzeda¿y.W wyniku przegl¹du liczba substancji aktywnych œ.o.r. stosowanych w rolnictwiekonwencjonalnym w Unii Europejskiej zmniejszy³a siê o ponad 700. Jednak¿e

38 E. Matyjaszczyk, J. Sobczakw ostatnich latach wprowadzono do stosowania kilkadziesi¹t nowych substancjiaktywnych: nowoczeœniejszych, bezpieczniejszych i o nowych mechanizmach dzia-³ania. Zatem ogólna liczba substancji aktywnych dopuszczonych do stosowaniaw ochronie roœlin na terenie Unii Europejskiej wynosi obecnie 340, w tym 108herbicydów, 87 fungicydów, 64 insektycydy i 81 innych (miedzy innymi: atraktanty,repelenty, regulatory wzrostu, rodentycydy) [3]. Wszystkie te substancje mog¹ byæstosowane w ochronie upraw w Polsce, jednak warunkiem jest wykonanie badañskutecznoœci i przeprowadzenie procesu rejestracji œrodka ochrony roœlin zawieraj¹cegodan¹ substancjê.W Polsce liczba u¿ywanych w rolnictwie konwencjonalnym substancji aktywnych(po uwzglêdnieniu nowo wprowadzonych do stosowania) zmniejszy³a siê o 39.Analiza skutków malej¹cej liczby substancji aktywnych nie jest prosta. Mo¿na jednakwymieniæ co najmniej nastêpuj¹ce konsekwencje:1. Wycofanie substancji które mog³yby negatywnie wp³ywaæ na zdrowie ludzii zwierz¹t b¹dŸ na œrodowisko naturalne prawdopodobnie przyczyni siê dopoprawy stanu œrodowiska naturalnego w przysz³oœci.2. Zmniejszanie liczby substancji aktywnych powoduje zmiany na liœcie œ.o.r.Œrodki stosowane od lat i znane rolnikom s¹ wycofywane. Rolnicy potrzebuj¹doradztwa w kwestii mo¿liwoœci ich zast¹pienia.3. Zmniejszanie liczby substancji aktywnych ogranicza mo¿liwoœæ ich przemiennegostosowania celem zapobiegania odpornoœci. Problem trudnoœci w zapobieganiupowstawania odpornoœci w ró¿nym stopniu dotyczy ró¿nych zastosowañ.Nale¿y wyraŸnie stwierdziæ, ¿e obecnie nie wystêpuj¹ problemy w tworzeniuprogramów ochrony wiêkszoœci roœlin wielkoobszarowych [7], w tym uwzglêdniaj¹cychstrategiê zapobiegania odpornoœci. Ju¿ obecnie istniej¹ jednak problemyz ochron¹ roœlin ma³oobszarowych (patrz pkt 4).4. Problemy z ochron¹ roœlin ma³oobszarowych. Do tej grupy nale¿y m.in. wiêkszoœæwarzyw, owoce i zio³a. Uprawa tej grupy roœlin jest bardzo wa¿na dla Polskiponiewa¿ s¹ one uprawiane w tysi¹cach niewielkich gospodarstw i stanowi¹podstawê utrzymania wielu rodzin. Œrodki wycofywane, rejestrowane przed latyna podstawie dawnych przepisów uwzglêdnia³y w etykietach roœliny ma³oobszarowe,podczas gdy nowe – najczêœciej nie. Przyczyn¹ jest wysoki koszt badañ,które, nale¿y wykonaæ dla ka¿dej uprawy wpisywanej do etykiety. Ze wzglêdu nakoszty rejestracja niektórych zastosowañ jest nieop³acalna dla producentówœrodków. Niektóre roœliny ma³oobszarowe s¹ ju¿ obecnie pozbawione jakiejkolwiekchemicznej ochrony. Sytuacja ta mo¿e negatywnie wp³yn¹æ na produkcjêniektórych roœlin, a tak¿e spowodowaæ problemy socjalne.5. Wzrost cen œ.o.r. Zdaniem autorek istniej¹ tutaj trzy g³ówne przyczyny. Pierwszawynika z zasad dzia³ania wolnego rynku: spadek liczby zarejestrowanych œrodkówpowoduje zmniejszenie konkurencji na rynku i w sytuacji kiedy rolnicy niemaj¹ wyboru umo¿liwia producentom podnoszenie cen. Druga: producenci po-

Substancje aktywne … 39nieœli dodatkowe koszty zwi¹zane z ocen¹ substancji aktywnych. Koszty te(podobnie jak koszty produkcji, transportu czy magazynowania) bior¹ pod uwagêprzy ustalaniu ceny detalicznej œ.o.r., zatem mog¹ one wp³yn¹æ na (niewielkie!)podwy¿szenie cen preparatów, które s¹ od lat na rynku. Trzecia: W sytuacji kiedywycofane substancje aktywne s¹ zastêpowane nowymi substancjami producenciustalaj¹c cenê detaliczn¹ nowego œrodka bior¹ pod uwagê koszty poniesione nabadania nowej substancji aktywnej przed jej wprowadzeniem na rynek. Wartopodkreœliæ, ¿e s¹ one bardzo wysokie. Ceny preparatów zawieraj¹cych nowesubstancje aktywne s¹ zatem z regu³y wy¿sze ni¿ tych stosowanych od lat.Wycofywanie œrodków zakwalifikowanych do stosowania w rolnictwie ekologicznymz pewnoœci¹ zostanie negatywnie odebrane przez rolników poniewa¿zmniejszy i tak ju¿ stosunkowo w¹sk¹ listê œrodków zakwalifikowanych do ochronyupraw ekologicznych w Polsce. Trudno jednak ju¿ obecnie mówiæ o konsekwencjachz co najmniej dwóch powodów:1. Rolnictwo ekologiczne w znacznie mniejszym stopniu ni¿ konwencjonalne wymagastosowania œ.o.r., poniewa¿ gatunki i odmiany dobiera siê tutaj nie podk¹tem maksymalnego plonowania, ale w du¿ym stopniu odpornoœci na organizmyszkodliwe. Ponadto przez ochronê naturalnych wrogów i stosowanie p³odozmianuoraz odpowiednich technik uprawy, czêsto bardziej pracoch³onnych ni¿ w rolnictwiekonwencjonalnym, zapobiega siê szkodom wyrz¹dzanym przez szkodniki,choroby i chwasty.2. Obowi¹zuj¹ce obecnie w Unii Europejskiej prawo daje mo¿liwoœæ stosowaniaw rolnictwie ekologicznym produktów i substancji niezakwalifikowanych przezupowa¿nione instytucje, pod warunkiem przestrzegania celów i zasad rolnictwaekologicznego. W Polsce brak jest na razie rozporz¹dzeñ wykonawczych uœciœlaj¹cychte przepisy. Warto jednak podkreœliæ, ¿e jednostki certyfikuj¹ce powinnyczuwaæ nad stosowaniem ich z du¿¹ rozwag¹ i ostro¿noœci¹. W przypadkachw¹tpliwych powinny wystêpowaæ do jednostek administracji pañstwowej (np.Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi) o wydanie odpowiednich wytycznychlub te¿ na opracowanie stosownych aktów prawnych. Dla przyk³adu niektóreprodukty ¿ywnoœciowe mo¿na wykorzystaæ w ochronie roœlin, np. oleje jadalnemo¿na stosowaæ w ochronie przed szkodnikami. Przed oficjalnym zaleceniemrolnikom stosowania konkretnego oleju jadalnego w tym celu, dla zachowaniape³nej zgodnoœci z obowi¹zuj¹cym prawem, jednostka certyfikuj¹ca powinnawyst¹piæ do Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi o wydanie stosownej interpretacji.Warto podkreœliæ, ¿e w kilku przypadkach Ministerstwo Rolnictwawyda³o orzeczenie, ¿e dany produkt nie jest œrodkiem ochrony roœlin iwkonsekwencjinie podlega rejestracji.

40 E. Matyjaszczyk, J. SobczakWnioskiNa podstawie przedstawionych danych mo¿na stwierdziæ, ¿e liczba substancjiaktywnych stosowanych w ochronie roœlin na terenie Unii Europejskiej bardzo znaczniesiê zmniejszy³a (z ponad 1000 do 340). W Polsce wp³ywa to na wycofywanie ze stosowanialicznych œ.o.r. zarówno w rolnictwie konwencjonalnym, jak i ekologicznym.Wycofanie substancji potencjalnie niebezpiecznych najprawdopodobniej przyczynisiê do poprawy stanu œrodowiska naturalnego, nale¿y jednak podkreœliæ, ¿ewyst¹pi¹ równie¿ skutki negatywne. Za najpowa¿niejsze w warunkach polskichuznano wzrost zagro¿enia wykszta³ceniem przez organizmy szkodliwe odpornoœci nastosowane œrodki i problemy licznych producentów roœlin ma³oobszarowych.Ze wzglêdu na brak przepisów wykonawczych do nowych aktów prawnych,a tak¿e wynikaj¹ce z zasad rolnictwa ekologicznego sporadyczne stosowanie œ.o.r.trudno przewidzieæ skutki ograniczenia i tak ju¿ w¹skiej listy œrodków zakwalifikowanychdo stosowania w rolnictwie ekologicznym.Literatura[1] Dyrektywa Rady 91/414/EEC z 15 lipca 1991 r. dotycz¹ca wprowadzania do obrotu œrodków ochrony roœlin(Official Journal L 230, 19/08/1991 P. 0001 0032)[2] Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2009/128/WE z 21 paŸdziernika 2009 roku ustanawiaj¹ca ramywspólnotowego dzia³ania na rzecz zrównowa¿onego stosowania pestycydów (Dz. U. UE 24.11.2009 L309/71).[3] EU Pesticides Database, 2009«http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm?event=activesubstance.selection»[4] Instytut Ochrony Roslin – Pañstwowy Instytut Badawczy, 2009«http://www.ior.poznan.pl/index.php?strona=19»[5] Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi, 2009«http://www.bip.minrol.gov.pl/DesktopDefault.aspx?TabOrgId=647&LangId=0» (data dostêpu 30.03.2009)[6] Matyjaszczyk E. 2007. Stan aktualny dopuszczania œrodków ochrony roœlin do stosowania w rolnictwiekonwencjonalnym i ekologicznym w Polsce. Instytut Ochrony Roœlin: 338 ss.[7] Matyjaszczyk E. 2009. Konsekwencje zmian na liœcie œrodków ochrony roœlin dopuszczonych do obrotu i stosowaniaw Polsce dla wybranych roœlin uprawnych. Progress in Plant Protection 49(2): 492–499.[8] Rozporz¹dzenie Komisji (WE) nr 889/2008 z dnia z dnia 5 wrzeœnia 2008 r. ustanawiaj¹ce szczegó³owe zasadywdra¿ania rozporz¹dzenia Rady (WE) nr 834/2007. w sprawie produkcji ekologicznej i znakowania produktówekologicznych w odniesieniu do produkcji ekologicznej, znakowania i kontroli (Dz. U. UE 18.09.2008 L 250/1[9] Rozporz¹dzenie Rady (WE) nr 834/2007 z dnia 28 czerwca 2007 r. w sprawie produkcji ekologicznej i znakowaniaproduktów ekologicznych, uchylaj¹ce rozporz¹dzenie (EWG) nr 2092/91 (Dz. Urz. UE.L 2007 Nr189, poz. 1, ze zm.).[10] Rozporz¹dzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1107/2009 z 21 paŸdziernika 2009 r. dotycz¹cewprowadzenia do obrotu œrodków ochrony roœlin i uchylaj¹ce Dyrektywy Rady 79/117/EWG i 91/414/EWG(Dz. U. UE 24.11.2009 L 309/1).[11] Ustawa o rolnictwie ekologicznym z dnia 20 kwietnia 2004 Dz. U. nr 93 z 2004 r., poz. 897 i 898.[12] Ustawa o rolnictwie ekologicznym z dnia 25 czerwca 2009 r. (Dz. U. nr 116 z 2009 r., poz 975)

Substancje aktywne … 41Active substances appliedin protection of organic and conventional cropsin the light of current regulationsKeywords: active substance, plant protection products, availability, PolandSummaryThe availability of active substances used in plant protection in conventional andorganic farming in Poland was analyzed. It was found that as a result of the review ofactive substances, carried out in the European Union, the number of available activesubstances has significantly decreased. This resulted in withdrawal of numerous plantprotection products from use as well in organic as in conventional agriculture.The positive result of withdrawals of potentially dangerous substances is predictableimprovement of natural environment condition. The results which were regardedunder Polish conditions as the most negative for conventional agriculture are: probabilityof increased resistance in harmful organisms and the problems with smallacreagecrops protection.It was found that the effects of shrinking of the already narrow list of plant protectionproducts qualified for use in organic farming are difficult to predict.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 43–54Grzyb Cladobotryum dendroidesi jego wp³yw na uprawê pieczarkiJoanna Szumigaj-Tarnowska, Czes³aw ŒlusarskiInstytut Warzywnictwa im. E. Chroboczka w SkierniewicachSamodzielna Pracownia Grzybów Uprawnychul. Rybickiego 15/17, 96-100 Skierniewicee-mail: joanna.szumigaj@iwarz.plS³owa kluczowe: pieczarka dwuzarodnikowa, Agaricus bisporus,Cladobotryum dendroides, daktyliumWstêpPieczarka dwuzarodnikowa Agaricus bisporus LANGE (IMBACH) jest powszechnieuprawianym grzybem jadalnym na ca³ym œwiecie. Polska jest w czo³ówce producentówtych grzybów, zarówno w Europie, jak i na œwiecie. Produkcja pieczarki w krajudynamicznie wzrasta, o czym œwiadczy poziom eksportu – blisko 150 tys. ton w roku2009. Najwiêkszymi odbiorcami polskich pieczarek s¹: Holandia, Niemcy i Rosja.Nowe zaawansowane technologie uprawy pieczarki nie chroni¹ przed wystêpowaniemchorób grzybowych i bakteryjnych. Jedn¹ z wa¿niejszych gospodarczochorób pochodzenia grzybowego pieczarki jest daktylium, któr¹ wywo³uje grzybCladobotryum dendroides (BULL.) W. GAMS et HOOZE. (dawna nazwa Dactyliumdendroides) ze stadium doskona³ym – Hypomyces rosellus (ALB.etSCHW.)TUL. et C.TUL. [23, 28, 33, 41, 61]. Patogen ten jest rozpowszechniony w przyrodzie. Opróczpieczarki dwuzarodnikowej, pora¿a tak¿e pieczarkê Agaricus blazei MURRILL ss.Heinemann [4] oraz wiele gatunków wielkoowocnikowych podstawczaków Macromycetes,m.in. opieñkê miodow¹ Armillaria mellea (VAHL.:FR.)P.KARST. ss. lato. [59,60] czy boczniaka ostrygowatego Pleurotus ostreatus (JACQ.: FR.) P.KUMM. [70].Wyst¹pienie grzyba z rodzaju Cladobotryum na owocnikach pieczarki jestzwi¹zane ze znacznym zredukowaniem plonu, a nawet jego ca³kowit¹ utrat¹. Czêstowi¹¿e siê z koniecznoœci¹ przerwania uprawy ju¿ po drugim rzucie pieczarek [20, 45].

44 J. Szumigaj-Tarnowska, Cz. ŒlusarskiZarys historyczny chorobyPo raz pierwszy choroba daktylium zosta³a opisana w Stanach Zjednoczonychw latach 1936–1937 przez Sindena [64], a w Europie w 1939 przez Flachs [22].W latach szeœædziesi¹tych daktylium stanowi³o problem w Niemczech, zw³aszcza naterenie by³ej NRD. Do roku 1980 niszcz¹ce dzia³anie Cladobotryum spp. na pieczarkêby³o stosunkowo rzadko spotykane w pieczarkarniach i by³o ³atwo eliminowane pou¿yciu ró¿nych fungicydów. Wystêpowanie choroby czêsto wi¹zano z warunkamimeteorologicznymi, gdy¿ pojawia³a siê g³ównie w okresie ciep³ych i wilgotnych pórroku. Ponadto choroba wystêpowa³a g³ównie w uprawach prowadzonych w niewielkichpomieszczeniach [25, 26]. Najwiêksze problemy z daktylium rozpoczê³y siêna pocz¹tku lat 90. XX wieku w Europie i Australii, kiedy uros³y do rangi epidemii[19, 24, 29, 55]. Z badañ Potoènik i in. wynika, ¿e daktylium pojawia siê w pieczarkarniach2–3-krotnie czêœciej ni¿ sucha czy bia³a zgnilizna [54]. Istniej¹ tak¿edoniesienia o wystêpowaniu choroby w wielu krajach azjatyckich [5, 39, 49, 69].G³ówn¹ przyczyn¹ tego zjawiska by³ wzrost odpornoœci na powszechnie stosowane,przeciwko daktylium, fungicydy benzymidazolowe [8, 31]. W 2000 roku,w kilku zak³adach pieczarkarskich stanu Pensylwania, zidentyfikowano szczepC. dendroides Typ II , odporny na te zwi¹zki [7, 27]. Zainfekowanie uprawy przez tenizolat wywo³uje straty plonu rzêdu 45–72% [9].W Polsce charakterystykê daktylium przedstawi³ po II wojnie œwiatowej m.in.Bukowski [12]. Po wprowadzeniu fungicydu o nazwie Sporgon 50 WP (prochloraz-Mn)czasowo choroba przesta³a byæ groŸna. Niemniej obecnie istniej¹ zak³ady,w których wystêpuje ona w ka¿dym cyklu uprawowym. Zgodnie z danymi producentówstraty, jakie wywo³uje, mo¿na okreœliæ na 15–30%, a czêsto prowadzi doca³kowitej utraty plonu po II rzucie [20, 45]. Nie jest dotychczas jasne, czy nasilaniesiê wystêpowania choroby zwi¹zane jest z pierwotnym zainfekowaniem okrywy,zwiêkszon¹ wirulencj¹ patogena, odpornoœci¹ na fungicydy, niedostateczn¹ higien¹w pieczarkarni, czy te¿ mo¿e wynika ze wspó³dzia³ania wszystkich wymienionychczynników [18, 26, 30].Charakterystyka gatunku Cladobotryum dendroidesRodzaj Cladobotrym w literaturze mikologicznej pojawi³ siê ju¿ na pocz¹tku XIXwieku [50, 51], natomiast w latach 70. XX w. okreœlono jego formê p³ciow¹ [65].W œrodowisku naturalnym spotyka siê tak¿e inne gatunki tego grzyba, tj. Cladobotryummycophilum (OUDEM.) W. GAMS et HOOZE. (stadium doskona³e – Hypomyces odoratusG.R.W. ARNOLD)iCladobotryum varium NEES (stadium doskona³e – Hypomycesauriantus PLOWR.). Wymienione gatunki równie¿ mog¹ byæ przyczyn¹ daktylium,powoduj¹c podobne objawy chorobowe jak C. dendroides, jednak w przypadku C. variumnie obserwuje siê charakterystycznego ró¿owego zabarwienia kolonii [19, 47].

Grzyb Cladobotryum dendroides … 45Gatunkami odpowiedzialnymi za wywo³anie daktylium s¹ g³ównie C. dendroides,C. mycophilum i C. mycophilum Typ II [6, 19, 30, 42].C. dendroides, nale¿¹cy do workowców, wytwarza trzy typy zarodników: du¿e,jajowate, 1–4-komórkowe konidia o wymiarach 24–28 × 7–10 m, gruboœciennechlamydospory (przetrwalniki) oraz zarodniki workowe, powstaj¹ce w rubinowoczerwonychperytecjach. Najczêœciej powstaj¹ zarodniki konidialne, które rosn¹ nakoñcach rozga³êzionych konidioforów. Konidiofory maj¹ nieregularne zakoñczenia,gdy¿ po utworzeniu zarodnika rosn¹ dalej [30]. Zarodniki workowe s¹ wrzecionowate,dwu-, trzy- lub czterokomórkowe, pokryte ciemnymi, krótkimi wyrostkami.Nale¿y zaznaczyæ, ¿e zarodniki workowe oraz chlamydospory s¹ odporniejsze nawysokie temperatury oraz obni¿on¹ wilgotnoœæ powietrza ni¿ zarodniki konidialne[26, 29]. Grzyb mo¿e rozwijaæ siê w szerokim zakresie temperatur, tj. 10–33°C, i pH,tj. 3,0–8,0. Optymaln¹ temperatur¹ rozwoju dla tego gatunku jest 25°C przy pH 6,5 [9,14, 15, 16]. Wykazano równie¿, ¿e C. dendroides rozwija siê normalnie w temperaturze33°C, w 36°C tempo rozwoju grzybni zmniejsza siê, natomiast w 40°C wzrostnie nastêpuje. Grzybnia patogena ginie po godzinie przetrzymywania w 60°C,natomiast konidia gin¹ ju¿ po 30 minutach przybywania w temperaturze 46–50°C [13,61, 67]. Dar i Seth [13] badali wra¿liwoœæ grzybni i zarodników na temperaturêw stanie suchym i uwodnionym. W zawiesinie wodnej poddanej dzia³aniu temperatury39°C przez 60–120 min i w 36–39°C przez 20–360 min kie³kowanie zarodnikówzosta³o ograniczone w porównaniu z prób¹ kontroln¹. Temperatura letalna dla suchychzarodników by³a wy¿sza ni¿ dla konidiów w zawiesinie, gdy¿ te pierwszekie³kowa³y po przetrzymywaniu ich w 100°C przez 30 min; dopiero dalszy wzrosttemperatury i czasu jej dzia³ania powodowa³ ca³kowite zahamowanie kie³kowania[13]. Porównuj¹c wra¿liwoœæ zarodników konidialnych i workowych wykazano, i¿w stanie suchym przez ok. 50 dni przetrwa blisko 50% zarodników konidialnych,natomiast a¿ 80% zarodników workowych. Przy wysokiej wilgotnoœci zarodnikikonidialne zachowuj¹ 100% prze¿ywalnoœæ przez 7 dni, natomiast workowe a¿ przez4 miesi¹ce [19].Kolonie C. dendroides przyrastaj¹ w tempie 7–12 mm na dobê, tworz¹c du¿e,pocz¹tkowo bia³e, watowate, pozbawione zapachu kolonie o luŸnej strukturze. Grzybzarodnikuje ju¿ po 4 dniach, co objawia siê zmian¹ koloru kolonii na kremow¹. Po8–10 dniach, gdy grzyb wytwarza rubinowoczerwone perytecja, kolonie staj¹ siêpocz¹tkowo ró¿owe, a nastêpnie czerwone [32, 42, 55].Drugi gatunek patogenicznego grzyba z rodzaju Cladobotryum atakuj¹cegopieczarkê to C. mycophilum. Wytwarza on du¿e, septowane, najczêœciej dwukomórkowekonidia. Trzonek konidialny ma regularne zakoñczenie. Kolonie tego gatunkurosn¹ równie szybko jak poprzedni gatunek, tj. 13–16 mm na dobê. Ró¿nica miêdzytymi gatunkami polega na wytwarzaniu przez C. mycophilum wyczuwalnego zapachukamfory [30].

46 J. Szumigaj-Tarnowska, Cz. ŒlusarskiW uprawie pieczarki liczy siê jeszcze jeden szczep, który ma cechy, zarównoC. dendroides, jak i C. mycophilum. Konidia tego gatunku s¹ bowiem 3–4-komórkowe,natomiast trzonki konidialne s¹ proste i regularnie zakoñczone. Kolonie tegogrzyba rosn¹ szybciej, bo ok. 18–22 mm na dobê i nie wytwarzaj¹ zapachu. Cech¹,która znacz¹co wyró¿nia ten szczep, jest odpornoœæ na benzymidazol, której nie maj¹grzyby wczeœniej izolowane [30]. Grogan i Gaze [34] badali odpornoœæ tego szczepuna fungicydy benzymidazolowe i ostatecznie okreœlono go jako C. dendroides Typ II.Mimo ¿e grupa ta by³a genetycznie podobna do C. mycophillum, badania Grogan [30]wykaza³y, ¿e morfologicznie izolat ten by³ bardziej podobny do C. dendroides (3–4komórkowe konidia i brak zapachu kamfory). Z uwagi na podobieñstwo genetycznedo C. mycophilum trzeci patogen okreœlono jako C. mycophilum Typ II.McKay i in. w 1998 roku [46] wykazali, ¿e odpornoœæ grzybów Cladobotryumspp. na fungicydy benzymidazolowe wynika z mutacji 50 kodonu – tubuliny polegaj¹cejna podstawieniu grupy aminowej z tyrozyny do cysteiny [46]. McKay i in. [47]badali ponadto podobieñstwo filogenetyczne 43 izolatów Cladobotryum (m.in. C.dendroides, C. mycophilum, C. varium i C. asterophorum de HOOG). Analiza genetycznawymienionych gatunków Cladobotryum spp. wykaza³a, ¿e najbardziej powszechnympatogenem pieczarki jest C. mycophilum (36 izolatów). Sekwencja regionuITS ujawni³a podzia³ tych patogenów na trzy podgrupy, tj. dwie, które stanowi³yizolaty wra¿liwe na benzymidazol (izolaty z Irlandii, Wielkiej Brytanii, Australii,Kanady i USA) i jedn¹, która by³a odporna na ten fungicyd (z Irlandii i WielkiejBrytanii). Analiza RAPD grzybów odpornych na benzymidazol wykaza³a, ¿e by³yone podobne, natomiast izolaty wra¿liwe by³y bardziej zró¿nicowane. Wykazano, ¿egrupa C. mycophilum ró¿ni siê znacz¹co od pozosta³ych grup, chocia¿ wczeœniejszedoniesienia wskazywa³y na podobieñstwo miêdzy C. mycophilum i C. varium [47].W literaturze dotycz¹cej grzybów z rodzaju Cladobotryum spotyka siê informacjena temat mo¿liwoœci biosyntezy oksydazy galaktozowej przez te szczepy [40, 44, 48].Enzym ten nale¿y do oksydoreduktaz i uczestniczy w reakcji utleniania D-galaktozydo pochodnych aldehydowych przy udziale tlenu, który jest redukowany do nadtlenkuwodoru [63].Gatunek C. dendroides wytwarza zwi¹zki toksyczne, jakimi s¹ mikotoksyny [43,53]. Szczepy patogeniczne dla pieczarki mog¹ byæ zdolne do syntezy trichotecen, tj.deoksyniwalenolu (DON), 3-acetylodeoksyniwalenolu (ADON) oraz zearalenonu.Trichoteceny stanowi¹ najliczniejsz¹ grupê mikotoksyn, obejmuj¹c¹ ponad 180naturalnie wystêpuj¹cych zwi¹zków, a deoksyniwalenol (DON, womitoksyna) z racjipowszechnego wystêpowania i toksycznoœci jest uwa¿any za najwa¿niejsz¹ toksynêgrzybow¹. Dzia³anie toksyczne mikotoksyny DON na poziomie komórkowym, przejawiasiê w hamowaniu biosyntezy bia³ka, redukcji aktywnoœci enzymów, zaburzeniachw przepuszczalnoœci b³on cytoplazmatycznych, zaburzeniach w podzia³achkomórkowych oraz zaburzeniach w przebiegu cyklu komórkowego. Mo¿e równie¿indukowaæ zamieranie komórek na drodze nekrozy i apoptozy. Drug¹ wa¿n¹ miko-

Grzyb Cladobotryum dendroides … 47toksyn¹ wytwarzan¹ przez Cladobotryum spp. jest zearalenon (ZEA) o bardzo silnymdzia³aniu hormonalnym, g³ównie w stosunku do zwierz¹t [43, 53].Doniesienia o mo¿liwoœci syntetyzowania przez szczepy C. dendroides zwi¹zkówtypowych dla grzybów rodzaju Fusarium sprawi³y, ¿e pojawi³y siê propozycjeprzeniesienia gatunków z rodzaju Cladobotryum do rodzaju Fusarium [43, 52].Badania sk³adu pieczarek z upraw pora¿onych daktylium s¹ wiêc wa¿ne z punktuwidzenia zarówno jakoœci, jak i wartoœci od¿ywczych. Badania zmian sk³adu pieczarekpod wp³ywem daktylium prowadzi³ Dar [17], który wykaza³, ¿e takie grzyby zawiera³ywiêcej wody, kwasu askorbinowego i b³onnika. Pora¿one owocniki charakteryzowa³ysiê ni¿sz¹ zawartoœci¹ wêglowodanów, bia³ka i t³uszczów ni¿ zdrowapieczarka [17].Objawy chorobowe i warunki rozwoju daktyliumPieczarka mo¿e zostaæ zaatakowana w ka¿dej fazie rozwoju. Bardzo wa¿ne jestwczesne wykrycie pora¿enia, gdy¿ cech¹ grzybów z rodzaju Cladobotryum jest krótkiczas inkubacji [2, 10, 14, 16]. Badania wykazuj¹, ¿e czas ten wynosi 10–15 dni,w zale¿noœci od iloœci inoculum. Im wczeœniej nast¹pi zaka¿enie, tym silnej odbija siêna wygl¹dzie pieczarek i bardziej obni¿a plon [1, 9, 15, 55].Rozwój grzyba Cladobotryum sp. w uprawie pieczarki objawia siê tworzeniem naokrywie pocz¹tkowo bia³ej, watowatej grzybni. Po 8 dniach od zaka¿enia na okrywiepojawia siê ma³a kolonia (10–20 mm), która w miarê wzrostu zmienia barwê naró¿ow¹, a póŸniej fioletow¹ [1, 19, 55]. W pe³ni rozwiniêta grzybnia oplata pieczarki,tworz¹c pajêczynowaty nalot, a pora¿one owocniki ¿ó³kn¹, wiêdn¹ i gnij¹ [19, 33].Dar i Seth [15] wykazali, ¿e nasilenie objawów choroby zale¿y od terminu pora¿eniaokrywy, jak i od jej rodzaju. Zmiana materia³u wykorzystywanego do jej produkcjirównie¿ mo¿e mieæ wp³yw na pojawienie siê choroby. Doniesienia literaturowewskazuj¹, ¿e ciê¿ka okrywa sprzyja szybszemu rozwojowi choroby, natomiast niskiepH okrywy wp³ywa na zahamowanie infekcji. Rozwój choroby jest ponadto zwi¹zanyz wilgotnoœci¹ okrywy i szybkoœci¹ parowania. Wy¿sza wilgotnoœæ okrywy i mniejszaintensywnoœæ parowania sprzyja rozwojowi choroby [10, 14]. Tempo szerzeniasie choroby w du¿ym stopniu zale¿y te¿ od warunków panuj¹cych w hali uprawowej,tj. temperatury i wilgotnoœci powietrza [37].Kolonie grzyba powoduj¹cego daktylium mog¹ pojawiæ siê na okrywie ju¿ przedpierwszym rzutem pieczarek. S¹ wtedy widoczne jako ¿ó³tobr¹zowe lub szarobia³eniewielkie plamy, które szybko powiêkszaj¹ siê i gêstniej¹. Plamy na owocnikach mo-¿e wywo³aæ ju¿ niewielka liczba konidiów patogena, kiedy osi¹d¹ na wykszta³conychowocnikach [18, 19]. Pojawienie siê daktylium w pierwszym rzucie, skutkuje pora¿eniem20% owocników (wyst¹pienie m.in. plam), natomiast w kolejnym rzucieobserwuje siê pora¿enie uprawy blisko w 100% [1]. Rozwój choroby mo¿e siêrozpocz¹æ od pozostawionych po zbiorze resztek owocników pieczarki, gdy¿ plekten-

48 J. Szumigaj-Tarnowska, Cz. Œlusarskichyma pieczarki stanowi doskona³¹ po¿ywkê dla Cladobotryum spp. W przeciwieñstwiedo bia³ej i suchej zgnilizny grzyb ten ³atwo przerasta okrywê i tworzykolonie na jej powierzchni [29, 41, 42]. Pora¿enie zawi¹zków i ma³ych owocnikównajczêœciej skutkuje ca³kowitym pora¿eniem uprawy [9, 26, 36, 38].Jandaik i Guleria [37] wykazali, ¿e C. dendroides osi¹ga najszybszy wzrost(7,0–8,0 mm na dzieñ) w temperaturze 25°C i wilgotnoœci równej 90%, podczas gdynajwiêcej konidiów (1,2 · 10 3 ·cm –2 ) tworzy siê w temperaturze 25°C przy pH 6,0i wilgotnoœci 95%. Wraz ze zmniejszaniem wilgotnoœci zarodnikowanie patogenaspada, co nale¿y uwzglêdniæ w dzia³aniach zapobiegaj¹cych rozprzestrzenianiu siêchoroby w hali [19].Wp³yw liczby zarodników Cladobotryum spp. na rozwój daktylium badanowielokrotnie [1, 2, 36, 37]. W wyniku pora¿enia uprawy zarodnikami patogena,pierwsze objawy daktylium obserwuje siê po 12–15 dniach przy wysokim stê¿eniuzarodników wynosz¹cym 1,0 · 10 8 · m –2 , przy temperaturze pod³o¿a 20–23°Ci wilgotnoœci 65% [36]. Ponadto, wiêksze straty uprawowe (bo a¿ 76%) wystêpuj¹,gdy infekcji ulega okrywa, ni¿ w przypadku zainfekowania kompostu, kiedy stratywynosz¹ 61%. Jest to wynikiem lepszego przerastania okrywy przez C. dendroidesw porównaniu do szybkoœci przerastania pod³o¿a [9].ród³a infekcjiNaturalnym siedliskiem grzybów strzêpkowych, w tym chorobotwórczych, jestgleba i substraty organiczne. Dlatego czêsto nieodpowiednio pasteryzowane pod³o¿elub Ÿle odka¿ona i przygotowana okrywa s¹ czêstym Ÿród³em zaka¿enia [16, 20, 26].Konidia Cladobotryum spp. s¹ z ³atwoœci¹ przenoszone z ruchem powietrza na du¿eodleg³oœci. Najczêœciej przyczyn¹ rozsiewania zarodników s¹ sta³e czynnoœci wykonywanepodczas uprawy (podlewanie, zbiór oraz np. pokrywanie ognisk chorobowychbezpoœrednio sol¹) [1, 2, 19]. Wykazano, ¿e najwy¿sze stê¿enie konidiów w haliuprawowej odnotowuje siê po godzinie od podlewania. W wyniku traktowaniaskupisk daktylium sol¹, konidia rozprzestrzeniaj¹ siê na odleg³oœæ ponad 0,5 metra.Owady, ludzie (pracownicy zak³adu) i sprzêt u¿ywany w pieczarkarni s¹ równie¿Ÿród³em zaka¿enia. Ponadto woda œciekaj¹ca z zaka¿onych skrzyñ uprawowychmo¿e przenosiæ materia³ infekcyjny [1, 2]. Badania wykaza³y, ¿e konidia Cladobotryumspp. przenoszone s¹ na du¿e odleg³oœci przez muchówki oraz z nieodka¿onymipojemnikami do zbioru [1, 2, 18, 32]. Wentylatory pracuj¹ce w hali bardzo u³atwiaj¹rozprzestrzenianie zarodników patogena, jednak ich wy³¹czenie nie oznacza ca³kowitejochrony przed chorob¹. Natomiast wy³¹czenie wentylatorów jest wskazane, gdyusuwamy ogniska chorobowe, gdy¿ wtedy liczba rozsiewanych zarodników Cladobotryumspp. mo¿e siê zmniejszyæ a¿ o 75% [2].

Grzyb Cladobotryum dendroides … 49ZwalczanieKluczow¹ rolê w zwalczaniu daktylium odgrywa wczesne wykrycie i odpowiedniepostêpowanie z rozwijaj¹cym siê ogniskiem pora¿enia. Dobre oœwietlenie pozwalana szybkie wykrycie kolonii patogena. Ju¿ w chwili zauwa¿enia pierwszychobjawów, producent musi natychmiast podj¹æ dzia³ania w celu zahamowania rozprzestrzenianiasiê choroby. OpóŸnienie zwalczania patogena choæby o jeden dzieñ,mo¿e spowodowaæ du¿e straty plonu [20, 29, 32].Producenci pieczarek pora¿one miejsca traktuj¹ w ró¿ny sposób: pokrywaj¹ jewilgotn¹ serwetk¹ papierow¹ zanurzon¹ w œrodku dezynfekcyjnym, a potem posypuj¹sol¹ kuchenn¹, stosuj¹ tylko solenie, nakrywaj¹ plamê kubkiem plastikowym,który nastêpnie wciskaj¹ w okrywê i obsypuj¹ sol¹ [20]. Wykazano, ¿e podlewanie,zbiór i nieumiejêtne usuwanie kolonii daktylium u³atwia rozprzestrzenianie siêzarodników. Z tego wzglêdu kolonie te nakrywa siê najpierw materia³em papierowymnas¹czonym dezynfektantem, a nastêpnie pokrywa sol¹ kuchenn¹. Samo posypywaniesol¹ miejsc pora¿onych nie jest wskazane, gdy¿ wrêcz sprzyja rozsiewaniu siêzarodników [1, 2].W wyniku epidemicznego wyst¹pienia C. dendroides i C. mycophilum w WielkiejBrytanii w latach 1994–1995, Adie i Grogan [1] oraz Adie i in. [2] badali rozprzestrzenianiesiê konidiów Cladobotrtyum spp. Doœwiadczenia polega³y na sztucznyminfekowaniu uprawy pieczarki i oznaczaniu iloœci konidiów po standardowych zabiegachuprawowych. Liczebnoœæ zarodników badano przed zabiegiem (np. przedpodlewaniem) i po jego przeprowadzeniu. Zarodniki w wyniku poruszenia kolonii,unosi³y siê do góry i osiada³y w nowych miejscach. Po up³ywie godziny po pokryciusol¹ kolonii o ca³kowitej powierzchni 0,55 m 2 , najwy¿sze stê¿enie konidiów w powietrzuwynosi³o 2,5 · 10 4 ·m –3 . Wykazano, ¿e ponad 90% zarodników osiada naokrywie ju¿ w ci¹gu 15 minut niezale¿nie czy wentylatory s¹ w³¹czone, czy te¿ nie.W przypadku gdy wentylatory zosta³y wy³¹czone, 85% konidiów rozprzestrzeni³o siêna odleg³oœæ 0,5 m, a przy w³¹czonym wentylatorze dyspersja zarodników grzybazachodzi³a na odleg³oœæ 3 m [1, 2].W latach 90. XX wieku Cladobotryum spp. by³o zwalczane ró¿nymi fungicydami,tak¿e benzymidazolowymi. Niestety, powszechnoœæ stosowania tych œrodków spowodowa³apowstanie odpornoœci wœród izolatów Cladobotryum spp. [7, 8, 33, 47].W Anglii stosowano tak¿e œrodek o nazwie Dorado, zawieraj¹cy pyrifenoks, któryca³kowicie hamowa³ rozwój C. dendroides, jednak ze wzglêdu na toksycznoœæw stosunku do pieczarek zosta³ wycofany [35].Obecnie skutecznym fungicydem przeciwko daktylium jest Sporgon 50 WP, zawieraj¹cyjako substancjê czynn¹ prochloraz z manganem [21, 24, 54, 56, 68]. Du¿¹ skutecznoœci¹w zwalczaniu tej choroby charakteryzuje siê równie¿ chlorotalonil [45, 57].Grogan i Gaze [34] podjêli badania odpornoœci grzybów C. mycophilum i C. dendroidesTypu I i II, w odniesieniu do fungicydów zawieraj¹cych tiabendazol, benzy-

50 J. Szumigaj-Tarnowska, Cz. Œlusarskimidazol i prochloraz-Mn. Badania wykaza³y, ¿e ok. 70% izolatów charakteryzujewysoka odpornoœæ na tiabendazol (ED 50 200 mg · l –1 ) i s¹ to wy³¹cznie izolatyC. dendroides Typ II. Izolaty C. mycophilum, C. dendroides Typ I oraz 4 inne izolatyC. dendroides Typ II by³y ma³o odporne na ten zwi¹zek (ED 50 1–10 mg · l –1 ) [34].Odporne na tiabendazol izolaty C. dendroides Typ II by³y ma³o odporne na karbendazym(ED 50 w zakresie 2–10 mg · l –1 ), a izolaty które wykazywa³y s³ab¹ odpornoœæw stosunku do tiabendazolu by³y wra¿liwe na karbendazym (ED 50 1mg·l –1 ). WartoœæED 50 dla wszystkich izolatów w odniesieniu do prochlorazu-Mn by³a w zakresie od0,14 do 7,8 mg · l –1 . Odpornoœæ na benzymidazol by³a wiêc kluczowym czynnikiemwp³ywaj¹cym na epidemiczny rozwój daktylium, gdy¿ tylko 25% testowanychszczepów by³o wra¿liwych na ten fungicyd [34].Ponownie odpornoœæ szczepów Cladobotryum na fungicydy benzymidazoloweoraz prochloraz-Mn potwierdzi³a Grogan w 2006 roku [31]. W badaniach in vitrowykaza³a, ¿e jeden z badanych szczepów by³ wra¿liwy na benzymidazol. Ponadtokarbendazym hamowa³ rozwój choroby efektywniej ni¿ tiabendazol. Drugi izolat by³odporny na benzymidazol i równie¿ wysoce odporny na tiabendazol, ale wykaza³wra¿liwoœæ na karbendazym przy œrednim i wysokim jego stê¿eniu. Oba izolaty by³ywra¿liwe na prochloraz-Mn, gdy¿ zwi¹zek ten hamowa³ rozwój choroby w oko³o45–65% [31].Odpornoœæ grzybów Cladobotryum na fungicydy benzymidazolowe stanowidu¿y problem w ich zwalczaniu. McKay i in. [46, 47] podjêli badania genetycznezmierzaj¹ce do zbadania tego zjawiska. Analiza sekwencji nukleotydowej – tublinyizolatów odpornych na benzymidazol ujawni³a mutacjê kodonu 50, która powodowa³apodstawienie cysteiny w miejsce tyrozyny. Wykorzystanie metody PCR pozwoli³ona szybk¹ identyfikacjê izolatów odpornych i wra¿liwych na ten zwi¹zek.Badania dotycz¹ce wra¿liwoœci izolatów C. dendroides pochodz¹cych z pieczarkarniw Serbii w stosunku do szeœciu fungicydów (prochloraz-Mn, benzymidazol,karbendazym, tiofanat metylowy, cyprokonazol + karbendazym i flusilazol + karbendazym)prowadzili Potoènik i in. [54]. Wykazali oni s³ab¹ odpornoœæ izolatów nakarbendazym i benzymidazol, gdy¿ stê¿enie 2,0 mg · l –1 hamowa³o wzrost wiêkszoœciizolatów. Wartoœci ED 50 wynosi³y 0,14–0,97 mg · l –1 (benzymidazol) oraz 0,29–2,92mg·l –1 (karbendazym), podczas gdy Grogan i Gaze podali, ¿e ED 50 dla karbendazymujest w zakresie 2–10 mg · l –1 . Testowane izolaty wykaza³y wiêksz¹ odpornoœæ natiofanat metylowy, gdy¿ stê¿eniem hamuj¹cym rozwój Cladobotryum sp. by³o 55,0mg·l –1 , a wartoœci ED 50 kszta³towa³y siê w zakresie 6,53–12,1 mg · l –1 . Wysok¹wartoœæ grzybobójcz¹ mia³y równie¿ preparaty zawieraj¹ce cyprokonazol + karbendazymi flusilazol + karbendazym, jednak najbardziej toksyczny dla badanych izolatówby³ prochloraz-Mn. Jednak¿e wykazano, ¿e cyprokonazol + karbendazymi flusilazol + karbendazym by³y równie¿ toksyczne dla grzybni pieczarki. Potoèniki in. [54] zajmowali siê tak¿e badaniem wra¿liwoœci Cladobotryum spp. na iprodionw porównaniu do prochlorazu-Mn i karbendazymu. Wykazali du¿¹ wra¿liwoœæ bada-

Grzyb Cladobotryum dendroides … 51nych grzybów na iprodion, jednak nie wy¿sz¹ ni¿ dla prochlorazu-Mn. Badaniaaustralijskich badaczy ujawni³y tak¿e, ¿e najlepszym œrodkiem zwalczaj¹cym daktyliumjest prochloraz-Mn, gdy¿ wœród badanych izolatów pojawi³y siê odporne nakarbendazym i tiabendazol [3].Ze wzglêdu na coraz mniejsz¹ liczbê dostêpnych fungicydów przeznaczonych dostosowania w pieczarkarni, na du¿¹ uwagê zas³uguj¹ preparaty naturalne oparte nawyci¹gach roœlinnych. Potoènik i in. [58] badali skutecznoœæ grzybobójcz¹ œrodkazawieraj¹cego wyci¹g z olejku drzewa herbacianego w stosunku do C. dendroides.Stwierdzili du¿¹ efektywnoœæ badanego preparatu, na mo¿liwoœæ zast¹pienia syntetycznychzwi¹zków chemicznych, substancjami pochodzenia naturalnego.Wed³ug danych literaturowych istniej¹ szczepy bakterii z rodzaju Pseudomonasantagonistycznych do grzyba C. dendroides [11, 66]. Wykazano, ¿e wprowadzenie douprawy pieczarki, oprócz konidiów patogena, komórek bakterii P. fluorescens i P. putidaprzynosi korzystny efekt. Zebrano, odpowiednio, o 292,5 g i 240,0 g·m –2powierzchni ni¿ w próbie kontrolnej [66].PodsumowaniePraca przedstawia charakterystykê powszechnej choroby grzybowej pieczarkidwuzarodnikowej (Agaricus bisporus), jak¹ jest daktylium. Czynnikiem biologicznymwywo³uj¹cym infekcjê jest grzyb Cladobotryum dendroides (BULL.) W. GAMS etHOOZE. Typowymi objawami daktylium jest pajêczynowaty nalot grzybni patogenana okrywie, który bardzo szybko gêstnieje i pokrywa owocniki pieczarki. W pracyopisano optymalne warunki rozwoju choroby, Ÿród³a infekcji, a tak¿e sposoby zwalczaniai zapobiegania pora¿eniom. Wskazano na potrzebê przestrzegania higienyw zak³adzie, która jest podstawow¹ zasad¹ pozwalaj¹c¹ efektywnie walczyæ z chorobamigrzybowymi w pieczarkarni.Literatura[1] Adie B.T.T., Grogan H.M. 2000. The liberation of cobweb (Cladobotryum mycophilum) conidia withina mushroom crop. W: Science and Cultivation of Edible Fungi. Elliott T.J. (red.), Balkema, Rotterdam:365–372.[2] Adie B., Grogan H., Archer S., Mills P. 2006. Temporal and spatial dispersal of Cladobotryum conidia in thecontrolled environment of a mushroom growing room. Appl. Environ. Microbiol. 72: 7212–7217.[3] Allan J., Shah F.A., Khan I. 2008. Establishing a baseline for fungicide sensitivity of the major mushroompathogens in Australia. W: Science and Cultivation of Edible and Medicinal Fungi: Mushroom Science XVII.Proceedings of the 17th Congress of the International Society for Mushroom Science Cape Town, South Africa,20–24 V 2008: 565–569.[4] Andrade M.C.N., Kopytowski Filho J., Minhoni M.T.A., Coutinho L.N., Figueiredo M.B. 2007. Productivity,biological efficiency, and number of Agaricus blazei mushrooms grown in compost in the presence ofTrichoderma sp. and Chaetomium olivacearum contaminants. Brazilian J. Microbiol. 38: 243–247.[5] Asef M.R., Goltapeh E.M. 2002. Identification of fungicolous fungi of Iran. I. Cladobotryum species. Rostaniha3: 11–22.

52 J. Szumigaj-Tarnowska, Cz. Œlusarski[6] Back Ch.-G., Kim Y.-H., Jo W.-S., Chung H., Jung H.-Y. 2010. Cobweb disease on Agaricus bisporus byCladobotryum mycophilum in Korea. J. Gen. Plant Pathol. 73 (3): 232–235.[7] Beyer D.M., Kremser J.J. 2001. Possible development of fungicide resistance by cobweb diseases onmushrooms. Phytopathology 91: S8.[8] Beyer D.M., Kremser J.J. 2004. Evaluation of fungicide tolerance and control for three fungal diseases ofmushrooms. W: Science and Cultivation of Edible and Medicinal Fungi. Romaine, C.P., Keil, C.B., Rinker,D.L., Royse, D.J. (red.), Penn State University, USA: 421–429.[9] Bhatt N. 2003. Cobweb Disease of Agaricus bisporus: Incidence, losses and effective management. W: The FourthInternational Conference „Mushroom Biology and Mushroom Product”. Cuernavaca, Mexico, 20–23.04.2002.[10] Boiko O.A., Mel’nichuk M.D., Ivanova T.V. 2009. Spread, diagnosis and prevention of diseases of themushroom. Russian Agricultural Science 35 (2): 94–95.[11] Bora T., Ozaktan H. 2000. Biological control of some important mushroom diseases in Turkey by fluorescentPseudomonads. W: Science and Cultivation of Edible and Fungi. Griensven L.J.L.D. (red.), Balkema,Rotterdam: 689–694.[12] Bukowski T. 1969. Pieczarki. PWRiL, Warszawa: 158–162.[13] Dar G.M., Seth P.K. 1992. Determination of thermal sensitivity of Cladobotryum dendroides a major pathogenof Agaricus bisporus mushroom. Orissa J. Agricultural Research 5: 119–121.[14] Dar G.M., Seth P.K. 1992. Factors influencing cobweb disease of Agaricus bisporus caused by Cladobotryumdendroides. Indian J. Mycol. Plant Pathol. 22: 178–181.[15] Dar G.M., Seth P.K. 1992. Germination of Cladobotryum dendroides spores causing cobweb disease ofAgaricus bisporus. Indian J. Mycol. Plant Pathol. 22: 192.[16] Dar G.M., Seth P.K. 1992. Some preliminary studies on Cladobotryum dendroides causing cobweb disease ofcultivated mushroom. Plant Disease Research 7: 83–86.[17] Dar G.M. 1997. Biochemical changes in Agaricus bisporus during infection by Cladobotryum dendroides.Research and Development Reporter 14: 34–39.[18] Dar G.M. 2001. Dispersal studies on cobweb disease of cultivated white button mushroom. Appl. Biol. Res.3:41–43.[19] Desrumaux B. 2004. Cobweb disease: an overview. Champignonberichten 222: 3–9.[20] Dmowska E., Ignatowicz S., Lewandowski M., Maszkiewicz J., Szymañski J., Uliñski Z. 2006. Ochronapieczarki, Hortpress, Warszawa: 68–71.[21] Eicker A. 1987. A report on the use of prochloraz-manganese complex for controlling of major fungal pathogensof the cultivated mushroom (Agaricus bisporus) in South Africa. South African Journal of Botany 53(5):345–348.[22] Flachs K. 1939. Dactylium dendroides Bull. als Gelegenheitsparasit an Champignon. Praktische Blatter fûrPflanzenbau und Pflanenschutz 17: 6–12.[23] Fletcher J.T. 2002. Cobweb Disease, A New Challenge. Mushroom News 50: 20–25.[24] Fletcher J.T., Allan J., Seymour G., Godmersham P.S. 2004. Managing cobweb disease in Australia. The 16thInternational Society of Mushrooms Science Congress, Miami Beach, 14–17.03.2004: 26.[25] Fletcher J.T., Hims M.J., Hall R.J. 1983. The control of bubble diseases and cobweb disease of mushrooms withprochloraz. Plant Pathol. 32: 123–131.[26] Fltecher J.T., White P.F., Gaze R.H. 1989. Mushrooms: Pest and Disease Control. 2nd edition, Intercept,Andover, Hants, England: 58–63.[27] Forer L.B., Wuest P.J., Wagner V.R. 1974. Occurrence and economic impact of fungal diseases of mushroomsin Pennsylvania. Plant Disease Reporter 58: 987–991.[28] Gams W., Hoozemans A.C.M. 1970. Cladobotryum – Konidienformen von Hypomyces – Arten. Persoonia 6:95–110.[29] Gaze R. 1995. Dactylium or cobweb. Mushroom Journal 546: 23–27.[30] Grogan H. 2005. Cobweb confusion – coweb isolates explained. Mushroom Journal 660: 21–23.[31] Grogan H.M. 2006. Fungicide control of mushroom cobweb disease caused by Cladobotryum strains withdifferent benzimidazole resistance profiles. Pest Manag. Sci. 62: 153–56.[32] Grogan H.M. 2006. Some key issues for successful control. Mushroom Journal 672: 15–22.[33] Grogan H., Adie B. 2002. Cobweb disease of mushrooms. Mushroom Journal 87: 5–7.[34] Grogan H.M., Gaze R.H. 2000. Fungicide resistance among Cladobotryum spp. – causal agents of cobwebdisease of the edible mushroom Agaricus bisporus. Mycol. Res. 104: 357– 364.

Grzyb Cladobotryum dendroides … 53[35] Grogan H.M., Gaze R. 2002. The story of Dactylium Dorado. Mushroom Journal 627: 36–38.[36] Jandaik S., Guleria D.S., Parmar Y.S. 2004. Effect of Cladobotryum dendroides on the yield of Agaricusbisporus: Inoculum factors and timing of infection. W: Science and Cultivation of Edible and Medicinal Fungi.Romaine C.P., Keil C.B., Rinker D.L., Royse D.J. (red.), Penn State University, USA: 16: 503–505.[37] Jandaik S., Guleria D.S. 2004. Influence of cultural parameters on the growth and sporulation of Cladobotryumdendroides: the pathogen of cobweb on mushrooms. W: Science and Cultivation of Edible and Medicinal Fungi.Romaine C.P., Keil C.B., Rinker D.L., Royse D.J. (red.), Penn State University, USA: 16: 499–501.[38] Jandaik S., Guleria D.S. 2004. Yield loss in Agaricus bisporus releteted to inoculum level, infection stage andinocula types of Cladobotryum dendroides. The 16th International Society of Mushrooms Science Congress,14–17.03.2004, Miami Beach: 31–32.[39] Karaca G., Peksen. A. 2001. A study on the cultivation and diseases of mushroom in the Middle Black SeaRegion. Ondokuz Mays Universitesi, Ziraat Fakultesi Dergisi 16: 14–21.[40] Kelleher F.M., Dubbs S.B., Bhavanandan V.P. 1988. Purification of galactose oxidase from Dactyliumdendroides by affinity chromatography on melibiose-polyacrylamide. Arch. Biochem. Biophys. 263: 349–54.[41] Khanna P.K., Sodhi H.S., Kapoor S. 2003. Diseases of Agaricus bisporus and their management. Annu. Rev.Plant Pathol. 2: 163–205.[42] Lane C.R., Cooke R.C., Burden J.L. 2000. Ecophysiology of Dactylium dendroides – the casual agent ofcobweb mould. W: Science and Cultivation of Edible Fungi. Elliott T.J. (red.), Balkema, Rotterdam: 365–372.[43] Machado L.C., Kemmelmeier C. 2001. Identification of deoxynivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol and zearalenonein the galactose oxidase-producing fungus Dactylium dendroides. Mycopathologia 149 : 79–85.[44] Markus Z., Miller G., Avigad G. 1965. Effect of culture conditions on the production of D-galactose oxidase byDactylium dendroides. Appl. Microbiol. 13: 686–693.[45] Maszkiewicz J. 2001. Efficacy of chlorothalonil fungicide (Gwarant 500 SC) against wet bubble of champignon(Mycogone perniciosa), dry bubble of champignon (Verticillium fungicola) and dactylium (Dactylium dendroides).Veget. Crops Res. Bull. 55: 131–135.[46] McKay G.J., Egan D., Morris E., Brown A.E. 1998. Identification of benzimidazole resistance in Cladobotryumdendroides using a PCR methods. Mycol. Res. 102: 671–676.[47] McKay G.J., Egan D., Morris E., Scott C., Brown A.E. 1999. Genetic and morphological characterization ofCladobotryum species causing cobweb disease of mushrooms. Appl. Environ. Microbiol. 65: 606–610.[48] McPherson M.J., Ogel Z.B., Stevens C., Yadav K.D., Keen J.N., Knowles P.F. 1992. Galactose oxidase ofDactylium dendroides. Gene cloning and sequence analysis. J. Biol. Chem. 267: 8146–8152.[49] Mohammadi-Goltapeh E., Mohammadzadeh-Pasha E., Alizadeh A. 2000. Cobweb disease of white buttonmushroom Agaricus bisporus in Iran and its management. Appl. Entomol. Phytopathology 67: 41.[50] Nees von Esenbeck C.G.D. 1816. Das System der Pilze und Schwämme. Stahelschen Buchhandlung, Würtzburg,Germany: 86.[51] Nees von Esenbeck C.G.D. 1817. Das System der Pilze und Schwämme. Stahelschen Buchhandlung, Würtzburg,Germany: 329.[52] Ogel Z.B., Brayford D., McPherson M.J. 1994. Cellulose-triggered sporulation in the galactose oxidase-producingfungus Cladobotryum (Dactylium) dendroides NRRL 2903 and its re-identification as a species ofFusarium. Mycol. Res. 98: 474–480.[53] Pereira A.M., Kemmelmeier C. 2000. Productions of mycotoxins by galactose oxidase producing Fusariumusing different media. Brazilian J. Microbiol. 31: 129–134.[54] Potoènik I., Milijaševic S., Rekanoviæ E., Todoroviæ B., Stepanoviæ M. 2008. Sensitivity of Verticilliumfungicola var. fungicola, Mycogone perniciosa and Cladobotryum spp. to fungicides in Serbia. Science andCultivation of Edible and Medicinal Fungi: Mushroom Science XVII. Proceedings of the 17th Congress of theInternational Society for Mushroom Science Cape Town, South Africa, 20–24 V 2008: 615–627.[55] Potoènik I., Rekanoviæ E., Milijaševic S., Todoroviæ B., Stepanoviæ M. 2008. Morphological and pathogeniccharacteristic of the fungus Cladobotryum dendroides, the casual agent of cobweb disease of the cultivatedmushroom Agaricus bisporus in Serbia. Pestic. Phytomed. 23: 175–181.[56] Potoènik I., Vukojeviæ J., Stajiæ M., Rekanoviæ E., Milijaševic S., Todoroviæ B., Stepanoviæ M. 2009. In vitrotoxicity of selected fungicides from the groups of benzimidazoles and demathylation inhibitors to Cladobotryumdendroides and Agaricus bisporus. J. Environ. Sci. Health Part B. 44: 365–370.[57] Potoènik I., Vukojeviæ J., Stajiæ M., Rekanoviæ E., Milijaševic S., Stepanoviæ M., Todoroviæ B. 2009. Toxicityof fungicides with different modes of action to Cladobotryum dendroides and Agaricus bisporus. J. Environ.Sci. Health Part B. 44: 823–827.

54 J. Szumigaj-Tarnowska, Cz. Œlusarski[58] Potoènik I., Vukojeviæ J., Stajiæ M., Rekanoviæ E., Stepanoviæ M., Milijaševic S., Todoroviæ B. 2010. Toxicity ofbiofungicide Timorex 66 EC to Cladobotryum dendroides and Agaricus bisporus. Crop Protection 29: 290–294.[59] Raziq F., Fox R.T.V. 2006. The integrated control of Armillaria mellea. 1. Glasshouse experiments. Biol. Agric.Hortic 23: 225–234.[60] Raziq F., Fox R.T.V. 2006. The integrated control of Armillaria mellea. 2. Field experiments. Biol. Agric.Hortic. 23: 235–249.[61] Sharma S.R., Satish K. 2005. Determination of thermal death point of different mushroom moulds. W:Challenging problems in horticultural and forest pathology. Integrated plant disease management. Sharma R.C.,Sharma J.N. (red.), Solan, India: 349–353.[62] Sharma S.R., Satish K. 2006. Diseases of mushrooms and their management. W: Challenging problems inhorticultural and forest pathology. Integrated plant disease management. Sharma R.C., Sharma J.N. (red.),Solan, India: 13: 246–286.[63] Shatzman A.R., Kosman D. 1977. Regulation of galactose oxidase synthesis and secretion in Dactyliumdendroides: Effects of pH and culture density. J. Bacteriol. 130: 455–463.[64] Sinden J.W. 1956. Chloride of lime – Dactylium. MGA Bull. 73: 24.[65] Sinden J.W. 1971. Ecological control of pathogens and weed moulds in mushroom culture. Annu. Rev.Phytopathology 9: 411–432.[66] Singh M., Chaube H.S., Singh R.P. 2000. Effect of fluorescent pseudomonads on primordia formation, yieldand control of pathogenic fungi of Agaricus bisporus (LANGE) IMBACH. J. Mycol. Plant Pathol. 30: 313–326.[67] Zaayen A. Van, Rutjens A.J. 1981. Thermal death points for two Agaricus species and for the spores of somemajor pathogens. Mushroom Science 11: 393–402.[68] Zaayen A. van, Adrichem J.C.J. van. 1982. Prochloraz for control of fungal pathogens of cultivated mushrooms.Eur. J. Plant Pathol. 88: 203–213.[69] Zare R., Khabbaz-Jolfaei H. 2005. Fungi isolated from Agaricus bisporus in Teharan Province, with specialreference to Verticillium fungicola. Rostaniha 6: 5–7.[70] Ziombra M. 1994. Choroby i szkodniki boczniaka. BPP „Pieczarki” 2: 31– 36.Cladobotryum dendroides and its effecton cultivation of Agaricus bisporus mushroomsKey words: white button mushroom, Agaricus bisporus, Cladobotryumdendroides, cobwebSummaryThe characteristics of cobweb diseases of white button mushroom Agaricusbisporus LANGE (IMBACH) was described. The casual agents of the disease is pathogenicfungus Cladobotryum dendroides. White, webby mycelium of the pathogen onthe casing, which grows very fast and covers the mushrooms, is a typical symptom ofdisease. Optimal condition for disease development, infection sources and methods ofdisease control were also presented. The best method of reducing the risk of infectioncaused by Cladobotryum spp. is good hygiene in a mushroom growing room.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 55–65Alternaria solani – patogen pomidorai perspektywy hodowli odmian odpornychEl¿bieta U. Kozik, Izabela Ostrzy¿ek, Wojciech SzczechuraZak³ad Genetyki, Hodowli i BiotechnologiiInstytut Warzywnictwa im. Emila Chroboczka w Skierniewicachul. Rybickiego 15/17, 96-100 Skierniewicee-mail: elzbieta.kozik@iwarz.plS³owa kluczowe: Alternaria solani, alternarioza, pomidor, dziedziczenie,odpornoœæ, hodowla odpornoœciowa, testy odpornoœciWstêpAlternaria solani SORAUER powoduje du¿e straty gospodarcze w wielu krajach.W Polsce choroba jest szczególnie szkodliwa w uprawach polowych pomidora.Alternarioza jest najbardziej rozpowszechniona w regionach o czêstych, obfitychopadach deszczu, wysokiej wilgotnoœci powietrza i wysokiej temperaturze (24–29°C),zw³aszcza na glebach lekkich. Ciep³a i wilgotna pogoda latem sprzyja du¿emunasileniu choroby w rejonach, gdzie dodatkowo zalegaj¹ stosunkowo d³ugo i cykliczniemg³y, szczególnie w nocy.W Kanadzie, Indiach, USA i Nigerii straty plonów spowodowane pora¿eniemliœci roœlin pomidora siêgaj¹ do oko³o 80%, natomiast straty spowodowane pora¿eniemsiewek wynosz¹ w tych krajach 20–40% [8]. Alternarioza atakuje roœlinypomidora we wszystkich stadiach wzrostu. Pierwsze objawy mog¹ wyst¹piæ ju¿w fazie siewki i rozsady, a na owocach s¹ czêsto widoczne nawet w fazie zawi¹zków.Du¿e nasilenie choroby czêsto prowadzi do ca³kowitej defoliacji i zamierania roœlin.Pierwotnym Ÿród³em infekcji s¹ najczêœciej pora¿one nasiona oraz nie roz³o¿oneprzez 2–3 lata resztki roœlinne w wierzchniej warstwie gleby, na których zimujegrzybnia lub zarodniki przetrwalnikowe A. solani [4, 29]. W trakcie wegetacjizarodniki konidialne grzyba przenoszone s¹ z kroplami deszczu i z wiatrem [8].Rozwój choroby nastêpuje w zakresie temperatury 10–35°C (temperatura optymalna24–29°C) i zró¿nicowanej wilgotnoœci wzglêdnej powietrza.Szkodliwoœæ alternariozy pomidora zwi¹zana jest zarówno ze spadkiem plonuwskutek zniszczenia liœci przez grzyb, jak i bezpoœrednim pora¿eniem owoców.

56 E.U. Kozik, I. Ostrzy¿ek, W. SzczechuraA. solani atakuje roœliny z rodziny psiankowatych (Solanaceae), g³ównie: pomidora,ziemniaka, papryki i bak³a¿ana [8]. Obecnie najpowszechniej ochronê plantacji przedalternarioz¹ realizuje siê przez wykonywanie zabiegów chemicznego zaprawianianasion i przestrzeganie zmianowania. Natomiast po wyst¹pieniu pierwszych objawówchoroby stosowane jest opryskiwanie roœlin fungicydami. Jest to jednak metodakosztowna i mo¿e byæ nieefektywna w niesprzyjaj¹cych dla roœlin warunkach pogodowych.Potencjalnie najbardziej ekonomicznym rozwi¹zaniem by³oby uzyskanieodpornych odmian pomidora. Jest to zadanie wa¿ne zarówno z punktu widzeniaproducentów pomidora, jak i konsumentów, poniewa¿ uprawa odmian odpornych nachoroby pozwala na zmniejszenie zu¿ycia pestycydów, co ma szczególne znaczeniew uprawach prowadzonych systemami integrowanymi i ekologicznymi. Jednak¿epostêp w hodowli odpornoœciowej pomidora na alternariozê jest obecnie ograniczony.Istniej¹ wprawdzie Ÿród³a odpornoœci na chorobê wœród dzikich gatunkówLycopersicon, ale przeniesienie tej cechy do pomidora uprawnego jest trudne zewzglêdu na poligeniczne uwarunkowanie odpornoœci oraz jej powi¹zanie z niekorzystnymicechami u¿ytkowymi.Charakterystyka patogenaAlternaria solani nale¿y do grzybów mikosporowych, klasy: Hypomycetes, rzêdu:Moniliales, rodziny: Dematiaceae. Grzyby z rodzaju Alternaria na po¿ywcetworz¹ szybko rosn¹ce, p³askie, we³niste kolonie o kolorze szarobia³ym do oliwkowoczarnegoz rewersem br¹zowawym do czarnego. Konidiofory s¹ podzielone przegrodami,ciemnego koloru, rozga³êzione lub proste, zakoñczone ³añcuszkami konidiów.Grzyb wytwarza ¿ó³te, ochrowe, jasnobr¹zowe lub ciemnobrunatne konidia, o powierzchnig³adkiej, chropowatej albo kolczastej. Grzyby z rodzaju Alternaria s¹szeroko rozpowszechnione w glebie, powietrzu i martwym materiale organicznym,czêsto paso¿ytuj¹ na roœlinach. Niektóre gatunki s¹ saprotrofami, inne wyspecjalizowanymipaso¿ytami. Obok A. solani, jednym z najbardziej rozpowszechnionychw œrodowisku jest gatunek Alternaria alternata [14]. Jest to saprotrof, ale tak¿epatogen okolicznoœciowy i wspólnie z A. solani mo¿e powodowaæ choroby ró¿nychgatunków roœlin.Gatunek A. solani po raz pierwszy zosta³ opisany w 1882 roku przez Ellisa i Martina[cyt. 36]. Gatunek A. solani, wczeœniej znany jako A. porri f. sp. solani, charakteryzujesiê wieloj¹drzast¹ grzybni¹, heterokarioz¹ (w jednej komórce znajduj¹ siê genetyczniezró¿nicowane j¹dra). W komórkach A. solani wystêpuje du¿a zawartoœæ melaniny.Do zaka¿enia roœlin mo¿e dochodziæ trzema drogami: przez penetracjê epidermy,przez aparaty szparkowe oraz przez zranienia tkanki [16]. Warunkami infekcji s¹:temperatura 10–25°C oraz zwil¿ona powierzchnia liœcia przez kilkanaœcie godzin.A. solani optimum rozwoju osi¹ga w wysokiej wilgotnoœci wzglêdnej (90%) i wysokiejtemperaturze (24–29°C ). Objawy chorobowe widoczne s¹ ju¿ po 2–3 dniach

Alternaria solani – patogen pomidora … 57od infekcji, a wytwarzanie zarodników po dalszych 3–5 dniach. Ze wzglêdu na bardzokrótki cykl rozwoju grzyba wystêpuj¹ zaka¿enia policykliczne.Zaka¿enie roœlin odbywa siê przy udziale enzymów celulazy i galakturonazy oraztoksyn wytwarzanych przez A. solani. Grzyb ten wytwarza jedenaœcie toksyn, z którychnajwa¿niejsze to alternariol i solanopiron A, B oraz C. Alternariol produkowanyjest przez dojrzewaj¹ce zarodniki konidialne [25]. Opryskiwanie roœlin samymkwasem alternariowym nie powoduje efektu fitotoksycznego, jednak dodany dozawiesiny zarodników, u³atwia proces zaka¿enia i powoduje powiêkszanie siê nekrotycznychplam [19]. Stwierdzono, ¿e dodatkowym czynnikiem koniecznym do zapocz¹tkowaniainfekcji jest nietoksyczna substancja S1 identyfikowana w wodnejfrakcji po ekstrakcji chloroformem dojrzewaj¹cych zarodników [18]. Substancja S1dodana do niepatogenicznych zarodników A. alternata powoduje, ¿e grzyb ten stajesiê patogeniczny i wywo³uje nekrotyczne zmiany zarówno na pomidorach jak i ziemniakach.Dzia³anie solanopironu, drugiej najwa¿niejszej toksyny wytwarzanej przezA. solani, jak dot¹d nie jest poznane.Przeprowadzone badania molekularne metodami RAPD, AFLP oraz badaniaizoenzymatyczne dowodz¹, i¿ mimo braku rozmna¿ania p³ciowego u A. solani wystêpujewysoka zmiennoœæ genetyczna wœród izolatów patogena zarówno na roœlinach,jak i po¿ywkach. Izolaty ró¿ni¹ siê morfologi¹, fizjologi¹ i patogenicznoœci¹ [40].Ró¿nice w patogenicznoœci znaleziono nawet w obrêbie izolatów powsta³ych z poszczególnychkomórek jednego konidium [38]. W obrêbie A. solani nie wyodrêbnionodotychczas ras fizjologicznych.Stwierdzono du¿e zró¿nicowanie genetyczne izolatów pochodz¹cych z ró¿nychkrajów, natomiast znacznie mniejsze wœród izolatów w obrêbie jednego kraju [40].T³umaczy siê to mniejszymi odleg³oœciami rozprzestrzeniania patogena w obrêbietego samego kraju. Istotnym czynnikiem zró¿nicowania izolatów jest tak¿e szerokorozpowszechniony transport materia³u roœlinnego w obrêbie krajów oraz intensywnakontrola i restrykcyjne prawo obowi¹zuj¹ce przy przewo¿eniu roœlin miêdzy poszczególnymipañstwami.Aktualnie brak jest markerów molekularnych sprzê¿onych z ró¿nicuj¹cymi cechamifizjologicznymi, morfologicznymi i patogenicznoœci¹ grzyba A. solani. Du¿a ró¿norodnoœægenetyczna w populacji patogena rzutuje na ³atwe prze³amywanie odpornoœci,a tym samym t³umaczy brak odmian ca³kowicie odpornych na alternariozê.Objawy chorobowe na pomidorzeChoroba powodowana przez A. solani nazywana jest alternarioz¹. Jej objawywystêpuj¹ na ró¿nych nadziemnych czêœciach roœlin pomidora. Na liœciach i owocachpojawiaj¹ siê ma³e, brunatnoczarne plamy. Poniewa¿ na liœciach objawy chorobowewystêpuj¹ ju¿ we wczesnym stadium rozwoju roœlin, dlatego w jêzyku angielskimchoroba nosi nazwê „early blight”. Zmiany rozprzestrzeniaj¹ siê wraz ze starzeniem

58 E.U. Kozik, I. Ostrzy¿ek, W. Szczechuraroœliny. Œrednica plam wynosi 0,2–0,5 cm. Plamy te czêsto zlewaj¹ siê w wiêkszenekrozy z koncentrycznie i strefowo u³o¿onymi pierœcieniami. Wokó³ plam mog¹czasami powstawaæ koncentryczne ¿ó³te obwódki. Przy silnym pora¿eniu wystêpujeprzedwczesna defoliacja. Pora¿ane s¹ tak¿e kwiaty, szypu³ki kwiatowe, ogonkiliœciowe i owoce. Na owocach, najczêœciej tu¿ przy szypu³ce, powstaj¹ jasnobrunatneplamy przybieraj¹ce formê mniej lub bardziej wg³êbionej struktury, które z czasempokrywaj¹ siê fioletowoczarnym nalotem utworzonym z trzonków i zarodnikówkonidialnych. Silnie pora¿one owoce czêsto opadaj¹. M³odsze owoce s¹ bardziejpodatne ni¿ starsze.U podstawy zaka¿onej siewki (ang. collar rot) tworzy siê czarnobr¹zowa obr¹czka,która rozszerza siê sukcesywnie w miarê up³ywu czasu. Mo¿e to spowodowaæos³abienie wzrostu roœliny b¹dŸ jej zamarcie.Pora¿enie pêdów – zarówno na pêdzie g³ównym, jak i pêdach bocznych dojrza-³ych roœlin pojawiaj¹ siê ma³e, ciemnozielone, g³adkie, lekko zapadniête plamy (ang.stem lesion). Z czasem staj¹ siê wiêksze, br¹zowe i wyd³u¿one. Podobnie jak naliœciach mog¹ pojawiæ siê tak¿e koncentryczne obwódki [8].Du¿¹ podatnoœci¹ charakteryzuj¹ siê zwykle roœliny odmian wczesnych, samokoñcz¹cychoraz roœliny stare, os³abione i chore. Wiêksz¹ odpornoœæ wykazuj¹ natomiastroœliny m³ode odmian póŸnych o niezdeterminowanym wzroœcie [30]. Badaczet³umacz¹ to zjawisko wysok¹ zawartoœci¹ cukrów w tkankach m³odych roœlin, którehamuj¹ dzia³anie enzymów celulolitycznych grzyba [34]. Wydaje siê, ¿e du¿e znaczeniema tak¿e wiêksze stê¿enie glikoalkaloidów w m³odych tkankach. Solanina,chaconina i solanidyna powoduj¹ zahamowanie wzrostu A. solani in vitro [33].ród³a odpornoœci pomidora na alternariozêród³a odpornoœci znaleziono wœród dzikich gatunków pomidora. Najwy¿sz¹odpornoœci¹ liœci charakteryzuj¹ siê linie trzech gatunków: L. hirsutum (PI 127827, PI126445, PI 390514, PI 390662, PI 1390662, B 6013, LA2100, LA2124, LA2204, LA2650, PE36, LA2552, PE34, PE35, LA1366, PI365934, PI379014), a tak¿eL. peruvianum (PE33, PI390671, LA1292, LA1365, LA1910, LA1983, PI270435,PI365951, PI390665, LA1675, LA1929, LA2573, LA2581, PE31, PI251312, PI306811,PI390667) i L. pimpinellifolium (PI 365912, PI 390519, A 1921, L4394). Du¿¹odpornoœæ w fazie siewek stwierdzono u L. pimpinellifolium (87610005) i L. chilense(87610011), natomiast odpornoœæ pêdów wystêpuje miêdzy innymi u L. cheesmaniii L. minutum (87610006) [24, 32, 39, 8].Odpornoœæ ta jest jednak bardzo trudna do przeniesienia do uprawnych formpomidora ze wzglêdu na niekorzystne cechy u¿ytkowe linii dzikich (z³a jakoœæ i póŸnedojrzewanie owoców), które wprowadzane s¹ wraz z odpornoœci¹ [31]. Eliminowanietych niepo¿¹danych cech w procesie hodowli wp³ywa na obni¿anie poziomu odpornoœciw kolejnych pokoleniach hodowlanych. Prawdopodobnie jest to efektem blis-

Alternaria solani – patogen pomidora … 59kiej odleg³oœci miêdzy genami warunkuj¹cymi zarówno jakoœæ owocu, jak i ich póŸnedojrzewanie a genami odpornoœci. Mo¿e te¿ byæ to spowodowane efektem plejotropowym.Nash i Gardner [26, 27] wykorzystuj¹c L. hirsutum PI 126445 wyhodowalikilka póŸnych linii pomidora o niewielkich owocach i znacz¹cej gospodarczo tolerancjina alternariozê. Linie te stanowi³y komponenty rodzicielskie do mieszañców F1o ró¿nych cechach u¿ytkowych [15]. Jednym z tych mieszañców jest ‘Mountain Supreme’F1 (NC EBR-3 × NC EBR-4) – odmiana œrednio wczesna, charakteryzuj¹ca siêodpornymi ³odygami. Owoce tej odmiany s¹ owalne i symetryczne o kolorze czerwonym,wytrzyma³e na pêkanie i trwa³e w przechowywaniu. Drug¹ odmian¹ mieszañcow¹z tolerancj¹ na alternariozê jest ‘Plum Dandy’ (NC EBR-5 × NC EBR-6). Jest toodmiana samokoñcz¹ca, o du¿ym wigorze, czerwonych owocach i wysokim ploniewczesnym.Uzyskanie nowych linii pomidora odpornych na alternariozê stanowi nadalbardzo wa¿ny cel w hodowli odpornoœciowej.Genetyczne uwarunkowanie odpornoœciMechanizm genetycznego uwarunkowania odpornoœci na A. solani nie zosta³jeszcze w pe³ni poznany. Prowadzone s¹ intensywne prace na ten temat. Badania naddziedziczeniem odpornoœci na alternariozê z wykorzystaniem ró¿nych Ÿróde³ odpornoœciwskazuj¹, ¿e jest to cecha iloœciowa kontrolowana wielogenowo [8]. Foolad i in.[13] donosz¹, ¿e odpornoœæ na alternariozê nie opiera siê na modelu „gen na gen”w interakcji gospodarz–patogen. Klasyczne badania genetyczne ró¿nych Ÿróde³ odpornoœciwskazuj¹ na istnienie co najmniej dwóch genów o addytywnych, dominuj¹cychoraz epistatycznych efektach dzia³ania [3, 26]. Datar i Lonkar [10] donosz¹natomiast o jednogenowym, dominuj¹cym pod³o¿u dziedziczenia odpornoœci u Solanumhabrochaites PI 134417. Maeiro i in. [23] uzyskali w wyniku skrzy¿owania liniiodpornej i podatnej mieszañce F1 o poœrednim, w stosunku do rodzicielskich, stopniuodpornoœci na liœciow¹ postaæ alternariozy, co wskazuje na addytywny b¹dŸ czêœciowodominuj¹cy charakter dziedziczenia tej cechy. Badania Thirthamalappa i Lohithaswa[39] sugeruj¹ obecnoœæ recesywnych genów odpornoœci na tê postaæ alternariozy.Odpornoœæ siewek na alternariozê tak¿e wskazuje na model addytywny i dominuj¹cy,aczkolwiek geny dominuj¹ce wydaj¹ siê tu odgrywaæ wiêksz¹ rolê [24]. Jakdot¹d nie s¹ znane zale¿noœci miêdzy dziedziczeniem odpornoœci poszczególnychorganów (liœci, ³odyg, owoców i szyjki korzeniowej u siewek) na A. solani. Ponadtoistniej¹ przypuszczenia, i¿ odpornoœæ owoców pomidora na A. solani mo¿e dziedziczyæsiê niezale¿nie od odpornoœci na pora¿enie liœci, gdy¿ objawy te nie zawszewystêpuj¹ równoczeœnie [2].Wykorzystanie technik biologii molekularnej ze szczególnym uwzglêdnieniemmarkerów molekularnych mo¿e u³atwiæ okreœlenie lokalizacji genów lub QTL (ang.Quantative Trait Loci) na chromosomach, odpowiedzialnych za odpornoœæ na alter-

60 E.U. Kozik, I. Ostrzy¿ek, W. Szczechuranariozê oraz umo¿liwiæ wprowadzenie tej cechy do nowych odmian pomidora [12].Dotychczas znaleziono wiele QTL odpowiedzialnych za odpornoœæ jednak¿e wiêkszoœæz nich daje relatywnie ma³y efekt. Foolad i in. [12] jako pierwsi opracowali mapê QTLodpornoœci na alternariozê liœci i owoców. Wykorzystali oni Solanum habrochaites PI126445 jako Ÿród³o odpornoœci. Mapowanie QTL przeprowadzone zosta³o na pokoleniuBC1 i zwalidowane na populacji BC1S1. Zidentyfikowano 14 QTL, wyjaœniaj¹cych57% zmiennoœci fenotypowej. Dla wszystkich QTL allel warunkuj¹cy odpornoœæpochodzi³ z odpornej formy rodzicielskiej. Zhang i in. [43] stosuj¹c genotypowanieselektywne zidentyfikowali 7 QTL, z których jeden, pochodz¹cy od roœlinypodatnej, zlokalizowany by³ na chromosomie 3, natomiast szeœæ na chromosomach 4,5, 6, 8, 10 i 11 i pochodzi³y one od roœliny odpornej. Badania Chaerani [7] ujawni³yistnienie 6 QTL w pokoleniach F2 i F3 skrzy¿owañ L. arcanum LA2157 i L. esculentum.Wystêpowanie QTL odpowiedzialnych za odpornoœæ ³odyg, by³o analogicznezarówno w pokoleniu F2, jak i F3. Jednak¿e QTL warunkuj¹ce odpornoœæ liœcizosta³y znalezione w pokoleniu F2, natomiast nie zawsze by³y wykrywane w pokoleniuF3 i odwrotnie, co oznaczaæ mo¿e, i¿ s¹ one œrodowiskowo-specyficzne b¹dŸzale¿¹ od wieku roœliny. Autorzy zlokalizowali równie¿ 3 QTL odpowiedzialne zaodpornoœæ pêdów œciœle zwi¹zane z odpornoœci¹ liœci. Zaznaczyæ nale¿y, ¿e takiegeny odpornoœci mog¹ byæ nieefektywne w innych rejonach geograficznych, gdziemog¹ dominowaæ zarówno inne populacje A. solani, jak i inne warunki wzrostu roœlin.Jak dot¹d mapy QTL nie s¹ jeszcze wystarczaj¹co precyzyjne, a ich wykorzystaniew procesie hodowli nie daje pewnoœci uzyskania linii odpornych.Testowanie odpornoœciZe wzglêdu na wysokie zró¿nicowanie genetyczne patogena czêsto przygotowujesiê inokulum z kilku zmieszanych ze sob¹ izolatów. Inokulum mo¿e te¿ pochodziæz kultury jednozarodnikowej [6].Kultury patogena utrzymywane s¹ na ró¿nego typu po¿ywkach (CMA – agarowokukurydziana, LBA – agarowo fasolowa, MEA – agarowa z ekstraktem s³odowym,PDA – agarowo ziemniaczana, WA – agarowa z brzeczk¹, V8 juice agar – agarz sokiem wielowarzywnym) i na po¿ywkach zmodyfikowanych [8, 28, 35]. Alternariasolani czêsto nie wytwarza zarodników konidialnych w kulturach in vitro. Dlauzyskania zarodnikowania nale¿y przeprowadziæ indukcjê sporulacji. Do tego celumo¿na wykorzystaæ promieniowanie UV [37], œwiat³o fluorescencyjne [11,21], wprowadziækulturê w warunki suszy i wystawiæ na dzia³anie œwiat³a s³onecznego [1, 24].Najczêœciej kultury grzyba utrzymuje siê w dwunastogodzinnym fotoperiodziew temperaturze 21–24°C. W przypadku zastosowania do indukcji zarodnikowaniapromieniowania UV, œwiat³a fluorescencyjnego lub warunków suszy, czas uzyskaniapierwszych zarodników wynosi od 8 do 17 dni [1, 37, 11, 8]. Po uzyskaniu wystarczaj¹cegostopnia zarodnikowania przemywa siê kulturê grzyba wod¹ dejonizowan¹

Alternaria solani – patogen pomidora … 61z opcjonalnym dodaniem niewielkiej iloœci detergentu w celu zwiêkszenia wydajnoœciprocesu i delikatne zdrapuje za pomoc¹ szkie³ka mikroskopowego lub pêdzelka,a nastêpnie przefiltrowuje zawiesinê w celu usuniêcia pozosta³oœci grzybni. Ostatecznierozcieñcza siê mieszaninê do wymaganego stê¿enia. Stwierdzono ¿e najlepszeefekty sztucznej inokulacji uzyskuje siê przy stê¿eniu1×10 4 –1×10 5 konidiów w 1 mlzawiesiny.Shahin i Shepard [35] opracowali metodê pozwalaj¹c¹ na szybkie (4 do 6 dni)uzyskanie zarodnikowania grzyba. Polega ona na zastosowaniu ró¿nych po¿ywek dlahodowli kultury grzyba i do indukcji sporulacji. Kulturê patogena prowadzi siêpocz¹tkowo na po¿ywce PDA w 25°C, w ciemnoœci. Indukcji zarodnikowaniadokonuje siê 48–72 godziny póŸniej, ale przed uformowaniem powietrznej grzybni.Wycina siê wtedy 4 mm 2 bloczki po¿ywki przeroœniêtej przez grzybniê i przenosi je napo¿ywkêSopH7,4isk³adzie: 20 g sacharozy, 30 g CaCO 3 , 20 g agaru w 1 litrze wodydestylowanej. Bloczki zalewa siê steryln¹ wod¹ destylowan¹ tak, by zosta³y czêœciowopokryte. Przygotowany w ten sposób materia³ inkubuje siê przez 18–24 h w 18°C,w ciemnoœci. Na tym etapie zaczynaj¹ powstawaæ konidia, które po 48–72 h pokrywaj¹ju¿ ca³¹ powierzchniê po¿ywki, natomiast grzybnia wrasta w po¿ywkê S, co jestrównoznaczne z brakiem grzybni powietrznej. Efektu powstawania grzybni powietrznejnie eliminuj¹ inne metody. Tak przygotowane kultury grzyba przep³ukujesiê wod¹ destylowan¹, a nastêpnie przefiltrowywuje siê i rozcieñcza do wymaganegostê¿enia. Dla spowodowania powtórnej indukcji zarodnikowania kultury grzybaumieszcza siê ponownie w 18°C, w ciemnoœci. Metoda ta jest pracoch³onna i znacznaczêœæ badaczy do pozyskania konidiów kultury A. solani utrzymuje na po¿ywce V8w 12-godzinnym fotoperiodzie z zastosowaniem promieni UV.Stopieñ odpornoœci roœlin na alternariozê okreœla siê w testach szklarniowychi polowych. Wykonywane s¹ tak¿e testy listkowe, w których pojedyncze kropleinokulum nanosi siê na odciête listki pomidora umieszczone w komorze z podwy¿szon¹wilgotnoœci¹. Jako pierwszy taki test przeprowadzi³ Locke [20]. Czêœæbadaczy prowadz¹cych analizy t¹ metod¹ otrzyma³o jednak wyniki odmienne i niekoreluj¹cez rezultatami uzyskanymi innymi metodami [11, 22]. Zjawisko to t³umaczysiê nierównomiernym roz³o¿eniem hormonów i enzymów w listkach u³o¿onychw ró¿nych partiach roœliny. Zmodyfikowana procedura z zastosowaniem przemywanialistków w 10,7μM NAA lub 4,0 μM 2,4-D zwiêksza powtarzalnoœæ wyników[6]. Metoda ta zastosowana by³a na ziemniakach i nale¿a³oby przeprowadziæ analogicznetesty tak¿e na pomidorach, aby potwierdziæ ich przydatnoœæ.Testy szklarniowe przeprowadza siê na 4–5-tygodniowych roœlinach. Stosowanes¹ dwa sposoby inokulacji roœlin zawiesin¹ zarodników: poprzez opryskiwanie roœlinoraz nanoszenie kropli [7, 27]. Pierwsza z nich polega na opryskaniu roœlin zawiesin¹o stê¿eniu1×10 4 –1×10 6 konidióww1mlzapomoc¹ opryskiwacza i umieszczeniuroœlin siê w plastikowych komorach o wilgotnoœci wzglêdnej 100% z 12 godzinnymfotoperiodem i temperatur¹ 24/18°C – dzieñ/noc. Przed³u¿enie czasu inkubowania

62 E.U. Kozik, I. Ostrzy¿ek, W. Szczechuraroœlin w podwy¿szonej wilgotnoœci nie zwiêksza efektywnoœci inokulacji [42].W dniach od drugiego do pi¹tego po inokulacji otwiera siê komory wzrostu i wy³¹czanawil¿anie. Podwy¿szon¹ wilgotnoœæ stosuje siê tylko w nocy. Oceny zmian chorobowychdokonuje siê po siedmiu do dziesiêciu dniach po inokulacji. Mierzy siê wielkoœæplam zarówno na liœciach inokulowanych, jak i przylegaj¹cych oraz procent defoliacji.Natomiast w drugiej metodzie nanosi siê kroplê inokulum na górn¹ stronêtrzeciego apikalnego listka z liœcia górnej partii roœliny i mierzy wielkoœæ plampowsta³ych po inkubacji. Inokulum powinno zawieraæ dodatek agaru, by unikn¹æniekontrolowanego sp³yniêcia kropli. Badania porównawcze tych dwóch metodprzeprowadzone zosta³y przez Chaerani [7]. Stwierdzono, ¿e metody te s¹ powtarzalne,lecz metoda kroplowa jest dok³adniejsza i bardziej miarodajna. W doœwiadczeniachtych niektóre linie testowane obydwiema metodami dawa³y odmiennerezultaty. Stosowanie opryskiwania roœlin czêsto powoduje pora¿enie ogonkówliœciowych i opadanie liœci, co w konsekwencji uniemo¿liwia ocenê wielkoœci plam.Dziêki zastosowaniu obu metod mo¿na jednak zbadaæ wp³yw pora¿ania ogonkówliœciowych na stopieñ odpornoœci ca³ej roœliny. Wad¹ metody kroplowej jest jejczasoch³onnoœæ i pracoch³onnoœæ. Skale stosowane przez badaczy do okreœlenianasilenia objawów chorobowych na roœlinie s¹ zró¿nicowane. Poysa i Tu [32]zastosowali skalê 1–9, gdzie: 1 – brak symptomów chorobowych, 2 – kilka ma³ychuszkodzeñ, 3 – kilkanaœcie ma³ych uszkodzeñ,4–

Alternaria solani – patogen pomidora … 63niowych skalê oceny pora¿enia roœlin [11, 27]. Obserwacje zdrowotnoœci roœlin wykonujesiê co najmniej dwukrotnie w trakcie wegetacji, pocz¹wszy od 8 dnia po inokulacji.Oceniana jest tylko dolna czêœæ roœlin (do po³owy lub 1/3 wysokoœci roœliny), gdy¿powierzchnia pora¿enia dziesiêciu górnych liœci rzadko przekracza 2%. Stwierdzonote¿, ¿e dopiero przy 60% defoliacji zostaje zainfekowanych 10% owoców [5].PodsumowanieAlternarioza wywo³ywana przez Alternaria solani powoduje coraz wiêksze szkodyw uprawie pomidora w Europie, w tym równie¿ w Polsce. Wystêpuje wieleizolatów patogena ró¿norodnych pod wzglêdem chorobotwórczoœci. Chocia¿ znalezionowiele Ÿróde³ odpornoœci wœród dzikich gatunków rodzaju Lycopersicon, jednakci¹gle brakuje odpornych odmian u¿ytkowych ze wzglêdu na trudnoœci w ich wyhodowaniu.Jednym z g³ównych czynników powoduj¹cych te trudnoœci jest poligenicznewarunkowanie odpornoœci na alternariozê i niewyjaœnione jak dot¹d, œcis³ekorelacje genów odpornoœci z niekorzystnymi cechami morfologicznymi i fizjologicznymiu form donorowych. Trwaj¹ intensywne prace nad wyhodowaniem nowychodmian odpornych i dok³adniejszym poznaniem genetycznych uwarunkowañ odpornoœcipomidora na alternariozê.Literatura[1] Barksdale T.H. 1969. Resistance of tomato seedlings to early blight. Phytopathology 59: 443–446.[2] Barksdale T.H. 1971. Field evaluation for tomato to early blight resistance. Plant Dis. Rep. 55: 807–809.[3] Barksdale T.H., Stoner A.K. 1977. A study of the inheritance of tomato early blight resistance. Plant Dis. Rep.61: 63–65.[4] Basu P.K. 1971. Existence of chlamydospores of Alternaria porri f. sp. solani as overwintering propagules insoil. Phytopathology 61: 1347–1350.[5] Basu P.K. 1974. Measuring early blight, its progress and influence on fruit losses in nine tomato cultivars. Can.Plant Dis. Surv. 54: 45–51.[6] Bussey M.J., Stevenson W.R. 1991. A leaf disk assay for detecting resistance to early blight caused byAlternaria solani in juvenile potato plants. Plant Dis. 75: 385–390.[7] Chaerani R. 2006. Early blight resistance in tomato: screening and genetic study, Ph.D. thesis, WageningenUniversity.[8] Chaerani R.,Voorrips R.E. 2006. Tomato early blight (Alternaria solani) the patogen, genetics, and breeding forresistance. J. Gen. Plant Pathol. 72: 335–347.[9] Christ B.J. 1991. Effect of disease assessment method on ranking potato cultivars for resistance to early blight.Plant Dis. 75: 353–356.[10] Datar V.V, Lonkar S.G. 1985. Inherietance of resistance in tomato early blight. J. Mah. Agric. Univ. 10:357–358.[11] Foolad M.R., Ntahimpera N., Christ B.J. Lin G.Y. 2000. Comparison of field, greenhouse and detached-leafletevaluations of tomato germ plasm for early blight resistance. Plant Dis. 84: 967–972.[12] Foolad M.R., Zhang L.P., Khan A.A., Nino-Liu D., Lin G.Y. 2002. Identification of QTLs for early blight(Alternaria solani) resistance in tomato using backcross populations of Lycopersicon esculentum × Lycopersiconhirsutum cross. Theor. Appl. Genet. 104: 945–958.

64 E.U. Kozik, I. Ostrzy¿ek, W. Szczechura[13] Foolad M.R., Sharma A., Ashrafi H., Lin G.Y. 2005. Genetics of early blight resistance in tomato. ActaHorticulturae 695: 397–406.[14] Gilchrist D.G., Grogan R.G. 1975. Production and nature of host specific toxin from Alternaria alternata f.sp.lycopersici. Phytopathology 66: 165–171.[15] Gardner R.G., Shoemaker P.B. 1999. ‘Mountain Supreme’ early blight-resistant hybrid tomato and its parents,NC EBR-3 and NC EBR-4. HortScience 34: 745–746.[16] Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. 1996. Resistance gene-dependent plant defense responses. Plant Cell 8:1773–1791.[17] Henning R.G., Alexander L.J. 1959. Evidence of existence of physiologic races of Alternaria solani. Plant Dis.Rep. 43: 298–308.[18] Langsdorf G., Furuichi N., Doke N., Nishimura S. 1990. Investigations on Alternaria solani infections:detection of alternaric acid and a susceptibility-inducting factor in the spore-germination fluid of A. solani. J.Phytopatol. 128: 271–282.[19] Langsdorf G., Park P., Nishimura S. 1991. Investigations on Alternaria solani infections: effect of alternaricacid on the ultrastructure of tomato cells. Ann. Phytopath. Soc. Japan. 57: 32–40.[20] Locke S.B. 1948. A method for measuring resistance to defoliation diseases in tomato and other Lycopersicon.Phytopathology 38: 937–942.[21] Lukens R.J. 1960. Conidial production from filter paper cultures of Helminthosporium vagans and Alternariasolani. Phytopathology 50: 867–868.[22] Lynch D.R., Wastie R.L., Stewart H.E., Mackay G.R., Lyon G.D., Nachmias A. 1991. Screening for resistanceto early blight (Alternaria solani) in potato (Solanum tuberosum L.) using toxic metabolites produced by thefungus. Potato Res. 34: 297–304.[23] Maeiro M., Ng T.J., Barksdale T.H. 1990. Genetic resistance to early blight in tomato breeding linesHortScience 25: 344–346.[24] Maeiro M., Ng T.J., Barksdale T.H. 1990. Inheritance of collar rot resistance in tomato breeding lines C1943and NC EBR-2. Phytopathology 80: 1365–1368.[25] Maeiro M., Bean G.A., Ng T.J. 1991. Toxin production by Alternaria solani and its related phytotoxicity totomato breeding lines. Phytopathology 81: 1030–1033.[26] Nash A.F., Gardner R.G., 1988. Heritability of tomato early blight resistance derived from Lycopersiconhirsutum PI 12645. Plant Disease 72(3): 1030–1033.[27] Nash A.F., Gardner R.G., 1988. Tomato early blight resistance in a breeding line derived from Lycopersiconhirsutum PI 12645. J. Am. Soc. Hort. Sci. 113: 264–268.[28] Pashe J.S., Wharam C.M., Gudmestad N.C. 2004. Shift in sensitivity of Alternaria solani to QoI fungicides.Plant Dis. 88: 181–187.[29] Patterson C.L. 1991. Importance of chlamydospores as primary inoculum of Alternaria solani, incitant of collarrot and early blight on tomato. Plant Dis. 75: 274–278.[30] Pelletier J.R., Fry W.E. 1989. Characterization of resistance to early blight in three potato cultivars: incubationperiod, lesion expansion rate, and spore production. Phytopathology 79: 511–517.[31] Peralta I.E., Knapp S., Spooner D.M. 2005. New species of wild tomatoes (Solanum section Lycopersicon:Solanaceae) from Northern Peru. Sys Bot 30: 424–434.[32] Poysa V., Tu J.C. 1996. Response of cultivars and breeding lines of Lycopersicon spp. to Alternaria solani. Can.Plant Dis. Surv. 76: 5–8.[34] Sands D.C, Lukens R.J. 1974. Effect of glucose and adenosine phosphates on production extracellularcarbohydrases of Alternaria solani. Plant Physiol. 54: 666–669.[35] Shahin E.A., Shepard J.F. 1979. An efficient technique for inducting profuse sporulation of Alternaria species.Phytopathology 69 (6): 618–620.[36] Sherf A.F., Macnab A.A. 1986. Vegetable diseases and their control. John Wiley and Sons, New York, pp634–640.[33] Sinden S.L., Goth R.W., O’Bryen M.J. 1972. Effect of potato alcaloids on the growth of Alternaria solani andtheir possible role as resistance factors in potatoes. Phytophatology 63: 303–307.[37] Spletzer M.E., Enyedi A.J. 1999. Salicylic acid induces resistance to Alternaria solani in hydroponically growntomato. Phytopathology 89:722–727.[38] Stall R.E., Alexander L.J. 1957. Heterocaryotic variation in Alternaria solani. Phytopathology 47: 34.[39] Thirthamallappa, Lohithaswa H.C. 2000. Genetics of resistance to early blight (Alternaria solani SORAUER)intomato (Lycopersicon esculentum L.). Euphytica 113: 187–193.

Alternaria solani – patogen pomidora … 65[40] Van Der Waals J.E., Korsten L., Slippers B. 2004. Genetic diversity among Alternaria solani isolates frompotatoes in South Africa. Plant Dis. 88: 959–964.[41] Vloutoglou I. 1999, Evaluation of tomato cultivars and hybrids for resistance to Alternaria solani infection. Testof Agrochemicals and Cultivars 20: 48–49.[42] Vloutoglou I., Kalogerakis S.N. 2000. Effects of inoculum concentrations, wetness duration and plant age ondevelopment of early blight (Alternaria solani) and on shedding of leaves in tomato plants. Plant Pathol. 49:339–345.[43] Zhang L.P., Lin G.Y., Niño-Liu, Foolad M.R. 2003. Mapping QTLs conferring early blight (Alternaria solani)resistance in a Lycopersicon esculentum × L. hirsutum cross by selective genotyping. Mol. Breed. 12: 3–19.Alternaria solani – tomato pathogenand perspectives of breeding resistant cultivarsKey words: Alternaria solani, early blight, tomato, inheritance, resistance,breeding for resistance, resistance testsSummaryEarly blight, incited by Alternaria solani causes an increasing damage of tomatoplants in Europe, including Poland. There are many isolates of the pathogen diversifiedin terms of pathogenicity. Although many sources of resistance have been foundwithin wild species of Lycopersicon genus, but the development of cultivars with highlevels of resistance has been hampered by the lack of strong resistance in the cultivatedtomato. One of the main factors causing these difficulties is the conditionality ofpolygenic inheritance of the resistance to early blight and the close unexplained yetcorrelation of resistance genes with unfavorable physiological and morphologicaltraits from the donor parent. Intensive breeding programme is being carried out to obtainnew resistant cultivars and to gain a better knowledge on genetic basis controllingearly blight resistance in tomato.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 67–80Fruktany i ich wystêpowaniew roœlinach uprawnychEwa Cieœlik, Agnieszka SiembidaMa³opolskie Centrum Monitoringu i Atestacji ¯ywnoœciUniwersytetu Rolniczego im. H. Ko³³¹taja w Krakowieul. Balicka 122, 30-149 Krakówe-mail: rrciesli@cyf-kr.edu.plS³owa kluczowe: fruktany, sk³ad chemiczny, charakterystyka ich Ÿróde³WstêpPrawid³owe ¿ywienie jako jeden z elementów stylu ¿ycia warunkuje prawid³owefunkcjonowanie organizmu, a co za tym idzie dobry stan zdrowia cz³owieka. Podstawowarola ¿ywnoœci definiowana jako podtrzymywanie funkcji ¿yciowych poprzezdostarczanie energii i sk³adników od¿ywczych nie odpowiada jednak w pe³ni oczekiwaniomdzisiejszych konsumentów. Wzrasta wiêc zainteresowanie ¿ywnoœci¹ i jejwp³ywem na zdrowie cz³owieka, czego wyrazem jest poszukiwanie nowych, innowacyjnychsk³adników ¿ywnoœci, które oprócz zaspokojenia g³odu spe³niaj¹ dodatkowe,wa¿ne w fizjologii organizmu funkcje. Na ten fakt jako pierwsi zwrócili uwagê Japoñczycy,opracowuj¹c listê 11 sk³adników nadaj¹cym produktom status funkcjonalnoœci[9]. Wœród dodatków roœlinnych wykorzystywanych w produkcji ¿ywoœci funkcjonalnej– ¿ywnoœci sprzyjaj¹cej zdrowiu cz³owieka, wyprodukowanej z wykorzystaniemwiedzy o zale¿noœciach miêdzy pokarmem, jego sk³adnikami, a zdrowiem – jednoz czo³owych miejsc zajmuj¹ fruktany [10, 11]. Potwierdzeniem tego s¹ wynikidotychczasowych badañ ¿ywieniowych, wg których fruktany s¹ korzystnym substratemdla po¿¹danej flory bakteryjnej, szczególnie bifidobakterii, które metabolizuj¹fruktany do kwasów octowego i mlekowego w proporcji 3:2, czyli najkorzystniejszejdla przewodu pokarmowego cz³owieka. W ten sposób utrzymuj¹ w jeliciegrubym (okrê¿nicy) w³aœciwe pH oraz odpowiedni¹ iloœæ probiotyków, hamuj¹crozwój bakterii gnilnych i patogennych. Co wiêcej, dziêki zdolnoœci wi¹zania wodyzwiêkszaj¹ one objêtoœæ treœci pokarmowej i ka³u, wi¹¿¹ cholesterol i kwasy ¿ó³cioweograniczaj¹c dziêki temu ich wch³anianie przy jednoczesnym przyroœcie ich wydalaniaz ka³em. To z kolei powoduje obni¿enie poziomu trójglicerydów i cholesterolu

68 E. Cieœlik, A. Siembidaw surowicy krwi. Oprócz tych w³aœciwoœci, fruktany charakteryzuj¹ siê hipoglikemicznymdzia³aniem oraz korzystnym wp³ywem na absorpcjê wybranych sk³adnikówmineralnych z diety [9]. Ponadto, dziêki swoim w³aœciwoœciom fizykochemicznym,fruktany s¹ obecnie szeroko stosowane w przemyœle spo¿ywczym, pe³ni¹c wieleistotnych technologicznie funkcji, w tym m.in. substancji zagêszczaj¹cych, wype³niaj¹cych,emulguj¹cych, zastêpuj¹cych sacharozê lub glukozê oraz t³uszcze. Z tegowzglêdu dodaje siê je do fermentowanych produktów mlecznych, serów, czekolady,od¿ywek wspomagaj¹cych odchudzanie, batonów, lodów i ciastek [26].Struktura chemiczna fruktanówFruktany, nazywane inaczej polifruktozylocukrami, s¹ rozpuszczalnymi w wodziepolimerami zbudowanymi z jednostek -D-fruktofuranozy, po³¹czonych wi¹zaniami-(2,1) i/lub -(2,6)-glikozydowymi oraz z jednej, na ogó³ na koñcu redukuj¹cego³añcucha, cz¹steczki D-glukozy, po³¹czonej z jednostk¹ -D-fruktofuranozyza pomoc¹ wi¹zania -(1-2)-glikozydowego [46].W naturze wystêpuje piêæ ró¿nych grup fruktanów, które rozró¿nia siê zgodniez typem wystêpuj¹cych w ich strukturze po³¹czeñ oraz po³o¿eniem cz¹steczki glukozy.S¹ to [48, 61]:a) Inuliny – sk³adaj¹ce siê z jednego liniowego ³añcucha jednostek -D-fruktofuranozy,po³¹czonych wi¹zaniami -(2,1)-glikozydowymi. Wœród tych zwi¹zkówwyró¿nia siê [6]: oligofruktany (fruktooligosacharydy, FOS) o stopniu polimeryzacji (DP tj.iloœci jednostek -D-fruktofuranozy w ³añcuchu) od 3–10, które dziel¹ siê na:— krótko³añcuchowe o DP od 3–5,— d³ugo³añcuchowe o DP od 6–10, d³ugo³añcuchow¹ inulinê o DP od 10–60.b) Neoinuliny – sk³adaj¹ce siê z dwóch liniowych ³añcuchów jednostek -D-fruktofuranozy,po³¹czonych wi¹zaniami -(2,1)-glikozydowymi.c) Lewany (produkowane przez bakterie)/phlein (produkowane przez roœliny) –sk³adaj¹ce siê z jednego liniowego ³añcucha jednostek -D-fruktofuranozy, po-³¹czonych wi¹zaniami -(2,6)-glikozydowymi.d) Neolewany – sk³adaj¹ce siê z dwóch liniowych ³añcuchów jednostek -D-fruktofuranozy,po³¹czonych wi¹zaniami -(2,6)-glikozydowymi.e) Fruktany mieszane (ang. graminan) – zawieraj¹ce dwa typy wi¹zañ miêdzy jednostkami-D-fruktofuranozy, a mianowicie -(2,1)- oraz -(2,6)-glikozydowe.Wzory strukturalne poszczególnych grup fruktanów opracowali Ritsema i Smeekensw 2003 roku [45].

Fruktany i ich wystêpowanie … 69ród³a fruktanówFruktany s¹ szeroko rozpowszechnione wœród organizmów prokariotycznychoraz wy¿szych i ni¿szych roœlin. Odkryto, ¿e fruktany wytwarzane s¹ przez oko³o15% ró¿nych gatunków roœlin kwitn¹cych nale¿¹cych do gospodarczo wa¿nych rodzintj. Liliaceae, Asteraceae, Poaceae [28] oraz przez bakterie, g³ównie Streptococcusmutans, a tak¿e przez grzyby Aureobasidium pullulans i Aspergillus niger [45].Roœliny gromadz¹ fruktany w wakuolach, w postaci roztworów wodnych, najczêœciejw jadalnych czêœciach, tj. korzenie palowe u cykorii (Cichorium intybus L.),bulwy u dalii (Dahlia variabilis L.) lub te¿ cebulki u tulipanów (Tulipa gesneriana L.)i cebuli (Allium cepa L.). Wêglowodany te mog¹ byæ równie¿ gromadzone w niedojrza³ychnasionach oraz w komórkach wzrostowych (wegetatywnych) zbó¿ i traw.D³ugoœæ ³añcuchów roœlinnych fruktanów siêga od 10 do kilkudziesiêciu jednostek-D-fruktofuranozy. Jednak¿e roœliny syntetyzuj¹ i gromadz¹ fruktany, kiedy asymilacjanetto CO 2 przewy¿sza poziom wymagany dla ich normalnego wzrostu i rozwoju,po czym wykorzystuj¹ je podczas wzrostu po uprzedniej defoliacji oraz podczaswiosennego kie³kowania [9]. Ponadto wyniki licznych badañ wy³oni³y szereg czynnikówdeterminuj¹cych stê¿enie nie trawionych wêglowodanów w ró¿nych czêœciachroœlin. S¹ to: gatunek roœliny, czêœæ roœliny, stadium rozwoju (dojrza³oœci), warunkiœrodowiska, tj. temperatura (zw³aszcza podczas wzrostu korzeni i pêdów), intensywnoœænas³onecznienia i jego czas, a tak¿e dostêpnoœæ po¿ywienia i status wodny [7].Z kolei fruktany produkowane z udzia³em grzybów oraz bakterii maj¹ o wieled³u¿sze ³añcuchy, które mog¹ siêgaæ ponad 100 tys. jednostek -D-fruktofuranozy,zaœ DP fruktanów powsta³ych z ich udzia³em determinowany jest rodzajem szczepugrzybów i bakterii, a tak¿e rodzajem enzymów z grupy transferaz produkowanychprzez te mikroorganizmy [21]. Enzymy pochodzenia bakteryjnego odpowiedzialne s¹za syntezê fruktanów zwanych lewanami, enzymy zaœ produkowane przez grzybynitkowe i pleœnie odznaczaj¹ siê zdolnoœci¹ syntezy fruktooligosacharydów [31].Badania wykaza³y tak¿e, i¿ proces ich syntezy zachodzi szybko i bez udzia³u energiis³onecznej – z tego wzglêdu ich produktywnoœæ jest wiêksza ani¿eli skrobi [27].Charakterystyka poszczególnych rodzinoraz ich przedstawicieliRodzina AsteraceaeAstrowate (Asteraceae DUM.), dawniej z³o¿one (Compositae GIS.) – jest to rodzinaroœlin nale¿¹ca do rzêdu astrowców (Asterales). Jest ona jedn¹ z najliczniejszych rodzinroœlin naczyniowych oraz dwuliœciennych, obejmuj¹c¹ oko³o 30 tysiêcy gatunków [44].Fruktanami charakterystycznymi dla tej rodziny s¹ liniowe inuliny, za których syntezêodpowiedzialne s¹ dwa enzymy, a s¹ nimi [36]: 1-SST (sacharozo : sacharozo 1-frukto-

70 E. Cieœlik, A. Siembidazylotransferaza, EC 2.4.1.1.99), 1-FFT (fruktan : fruktan 1-fruktozylotransferaza,EC 2.4.1.100).Wœród przedstawicieli tej rodziny wystêpuj¹ m.in.: cykoria, topinambur, banany,mniszek pospolity (lekarski), ³opian wiêkszy, dalia, stokrotka, pio³un oraz namorzynowedrzewa tropikalne.Cykoria (Cichorium L.) – jest roœlin¹ zieln¹, która liczy 10 gatunków rosn¹cychw umiarkowanie ciep³ych strefach Europy, Azji i Afryki. W Polsce wystêpuj¹ dwagatunki, a mianowicie cykoria endywia (Cichorium endivia L.) bêd¹ca efemerofitemoraz cykoria podró¿nik (Cichorium intybus L.) bêd¹ca zadomowionym antropofitem[66]. Spoœród nich, szczególnie szeroko rozpowszechniona jest cykoria podró¿nik(Cichorum intybus), która roœnie miêdzy innymi na nieu¿ytkach, miedzachi pastwiskach. Nazywana jest czasem cykori¹ poln¹ lub dzik¹ b¹dŸ te¿ podró¿nikiemb³êkitnym lub ma³ym s³onecznikiem. W lecznictwie wykorzystuje siê zarówno jejususzone zielone czêœci roœlin oraz korzenie, a czasem tak¿e œwie¿e liœcie i kwiaty[47]. Istniej¹ dwie odmiany cykorii podró¿nik, a mianowicie: Cichorium intybus L.var. foliosum (odmiana liœciowa) oraz Cichorium intybus L. var. sativum (odmianakorzeniowa). Odmiana liœciowa jest stosowana do wyrobu sa³atek, odmiana korzeniowazaœ jest wykorzystywana w dwojaki sposób. Po pierwsze, jako dodatek do kawyzbo¿owej, po drugie zaœ w ¿ywieniu zwierz¹t gospodarskich, takich jak œwinia, koñ,ciele, brojler, kura noœna [57]. Badania przeprowadzone z udzia³em œwie¿ych korzenipalowych cykorii podró¿nik wykaza³y, ¿e oko³o 80% ich suchej masy ³¹czniestanowi¹ wêglowodany, w tym od 15 do 20% inuliny oraz od 5 do 10% oligofruktozy[20], których stopieñ polimeryzacji jest zmienny, gdy¿ zale¿y od warunków (stopniahydrolizy) przetwarzania korzeni palowych w celu pozyskania z nich fruktanów [30].Z kolei badanie Van Loo [57] dowiod³o, i¿ inulina wyekstrahowana z korzeni cykoriipodró¿nik zawiera w 30 do 50% ³añcuchy o œrednim DP równym 10, zaœ pozosta³e 50do 70% ³añcuchów jest d³u¿sze. W przypadku oligofruktozy, uzyskane rezultatywykazuj¹, i¿ jest ona ca³kowicie skomponowana z ³añcuchów o DP równym 10. Cowiêcej, dalsze badania wykaza³y, ¿e miejscem gromadzenia siê tych fruktanów s¹korzenie palowe, a tak¿e sok mleczny produkowany przez jej ³odygi [21].Topinambur (Helianthus tuberosus L.) nazywany równie¿ s³onecznikiem bulwiastymoraz jerozolimskim karczochem (ang. Jerusalem artichoke) – jest bylin¹wystêpuj¹c¹ dziko w Ameryce Pó³nocnej, w Polsce zaœ maj¹c¹ status kenofitu [66].Jest on blisko spokrewniony ze s³onecznikiem zwyczajnym (Helianthus annous L.),zaœ w zale¿noœci od odmiany, mo¿e osi¹gaæ od 2 do 4 m wysokoœci i rozwijaæ podobny,choæ mniejszy od s³onecznika zwyczajnego kwiatostan. W Polsce, w 1998 rokuzarejestrowano hodowlê 2 odmian, a mianowicie ‘Rubin’ (o ma³ych bulwach nieregularnegokszta³tu i fioletowej barwie) oraz ‘Albik’ (o du¿ych bulwach, maczugowatymkszta³cie i ¿ó³tej barwie). W póŸniejszych latach sta³y siê one przedmiotemlicznych badañ, m.in. w kierunku ustalenia ich sk³adu chemicznego. Sk³ad ten zale¿yod wielu czynników. Nale¿¹ do nich m.in.: odmiana, warunki uprawy i termin zbioru

Fruktany i ich wystêpowanie … 71[18]. Badanie w tym kierunku przeprowadzili Florkiewicz i in. [14], wykorzystuj¹cdwie polskie odmiany topinamburu pochodz¹ce z uprawy w Radzikowie. W materialeuzyskanym po zbiorze plonu jesieni¹ (w paŸdzierniku) oraz wiosn¹ (w marcu –po zimowym przechowywaniu w glebie), g³ównym sk³adnikiem zgromadzonymzarówno w bulwach i czêœciach nadziemnych tej roœliny, by³a inulina, przy czympoziom fruktanów w badanych bulwach waha³ siê w granicach 41,4–50,5 g · 100 g –1suchej masy. Dalsza analiza wykaza³a, ¿e istotnie statystycznie wiêcej tego sk³adnikazawiera³y bulwy zbierane jesieni¹ ni¿ bulwy zbierane po zimowym przechowywaniuw glebie. Z kolei nieistotne statystycznie ró¿nice zawartoœci fruktanów odnotowanow przypadku analizy zastosowania dwóch ró¿nych odmian hodowlanych bulw.Wyniki tego badania s¹ zgodne z rezultatami uzyskanymi przez Johna [24], któryponadto wykaza³, ¿e im póŸniejszy jest zbiór, tym mniejsza jest masa molekularnacz¹steczek fruktanów. Zjawisko to t³umaczy siê zachodz¹cym w okresie zimowaniadodatkowym wytwarzaniem œrednio³añcuchowych fruktanów i sacharozy – potrzebnejdo regulacji ciœnienia osmotycznego w komórce – na skutek niskiej temperatury.Wyniki badañ zaprezentowanych w czêœci dotycz¹cej bulw topinamburu, s¹ dowodemsilnego wp³ywu warunków klimatyczno-glebowych na zawartoœæ cukrów rozpuszczanychw wodzie, w ogólnej zawartoœci suchej masy w ich bulwach.Rodzina LiliaceaeLiliowate (Liliaceae JUSS.) – jest to rodzina roœlin nale¿¹ca do klasy jednoliœciennych.Wszystkie rodzaje i gatunki mo¿na spotkaæ wy³¹cznie na pó³kuli pó³nocnej.Wyró¿niaj¹ siê one posiadaniem cebuli w³aœciwej, czyli przekszta³conego, podziemnegopêdu o funkcji okrywaj¹cej (³uska zewnêtrzna) i spichrzowej (³uska wewnêtrzna)[44]. Fruktanami charakterystycznymi dla tej rodziny s¹ liniowe neoinuliny, za którychsyntezê odpowiedzialny jest enzym 6G-FFT (2,1-fruktan : 2,1-fruktan 1-fruktozylotransferaza,EC 2.4.1.243). Produktem jego aktywnoœci jest neokestoza (6G-fruktozylosacharoza)– trisacharyd bêd¹cy pierwszym przedstawicielem grupy neoinulin [45].Wœród przedstawicieli tej rodziny wystêpuj¹ m.in.: czosnek, cebula, por, szparag.Czosnek pospolity (Allium sativum L.) zwany inaczej zwyczajnym – jest bylin¹,w uprawie wystêpuj¹c¹ jako roœlina dwuletnia lub jednoroczna. Jest warzywem, przypraw¹i roœlin¹ lecznicz¹ znan¹ zwykle tylko pod nazw¹ rodzajow¹. Pochodzi z Azji,sk¹d rozprzestrzeniony zosta³ jako roœlina uprawna do Europy i pó³nocnej Afryki,z czasem trafi³ równie¿ na inne kontynenty [66]. Ju¿ od 1940 roku zaczêto badaæ sk³adpolisacharydów wystêpuj¹cych w czosnku. Shiomi [51] jako pierwszy dowiód³, ¿etypowymi fruktanami wystêpuj¹cymi w czosnku s¹ 1-kestoza i neokestoza. Nowszerezultaty badañ wskazuj¹ jednak, ¿e struktura fruktanów w czosnku opiera siê naneokestozie, ich œredni DP zaœ wynosi 50 [3]. Z kolei wg Gulewicz i in. [20] czosnekzawiera od 3–6% oligofruktozy oraz 9–16% inuliny. Rezultaty tych badañ spójniejednak dowodz¹, ¿e czosnek pospolity jest Ÿród³em fruktanów typu neoinulin, któregromadzone s¹ w jego z¹bkach, stanowi¹c ³¹cznie 75% ich suchej masy.

72 E. Cieœlik, A. SiembidaDo rodziny Liliaceae nale¿y równie¿ cebula zwyczajna (Allium cepa L.), zwanainaczej cebul¹ jadaln¹ czy te¿ czosnek cebul¹. Jest ona gatunkiem roœliny pochodz¹cymze Œrodkowej Azji [66], który zosta³ doceniony ju¿ ponad 1 tys. lat temu, nietylko ze wzglêdu na swoje walory smakowe i od¿ywcze, ale tak¿e dziêki w³aœciwoœciomleczniczym, które zosta³y potwierdzone przez nowoczesne nauki medyczne[19]. Badania wykaza³y, ¿e g³ówn¹ czêœci¹ (65–80%) suchej masy cebulek tej roœlinys¹ nie trawione wêglowodany, tj. fruktooligosacharydy (FOS) oraz cukry proste [13,39]. Œrednia zawartoœæ cukrów prostych kszta³tuje siê na poziomie: 28% (glukoza), 24%(fruktoza) i 10% (sacharoza), pozosta³¹ zaœ czêœæ suchej masy stanowi¹ FOS (ok. 18%)[4]. Jednak¿e w przypadku fruktozy, jej wy¿sze stê¿enia odnotowano w zewnêtrznychwarstwach cebulek, podczas gdy sacharoza i glukoza s¹ równo rozmieszczone wewszystkich warstwach [8]. Z kolei FOS, wykazuj¹ce ró¿ny stopieñ polimeryzacji, s¹g³ównym materia³em zapasowym w cebulkach tej roœliny [5]. Gromadz¹ siê onepodczas ich tworzenia, przy czym proces ten jest najintensywniejszy na etapiewzrostu i kie³kowania. Wœród FOS wyznaczono obecnoœæ: trisacharydów (DP 3) tj.:1-kestoza i neokestoza; tetrasacharydów (DP 4) tj.: nystoza, 1,6G-kestotetroza,1i6G-kestotetoza; pentosacharydów (DP 5) tj.: 1,1,1-kestopentoza, 1,1,6G-kestopentoza,1,1i6G-kestopentoza, 1i1,6G-kestopentoza oraz oligofruktozy i inuliny, którychstê¿enia stanowi³y odpowiednio 11%, 10%, 8%, 2–6% i 2–6% wobec ogólnej zawartoœcinie trawionych wêglowodanów w cebulkach tej roœliny [4, 20]. Niemniej jednak,DP fruktanów zawartych w cebulkach tej roœliny mo¿e siêgaæ od 3 do 15 [25], badaniezaœ Galdón i in. [15], wykaza³o ró¿nice w zawartoœci poszczególnych cukrówprostych, ca³kowitej zawartoœci fruktanów oraz stosunku stê¿enia fruktozy do stê¿eniaglukozy miêdzy poszczególnymi odmianami uprawnymi. Wyniki tego badania s¹zgodne z rezultatami poprzednio opublikowanych badañ m.in. Jaime i in. [23],O’Donoghue i in. [40] oraz Rodrígues i in. [49].Kolejnym przedstawicielem rodziny Liliaceae jest szparag dziki (Asparagusracemosus L.) nazywany równie¿ Satavar, Shatavari lub Shatamull [59]. Jest gatunkiembyliny, a zarazem jedynym przedstawicielem rodzaju Asparagus, który zawierajadalne czêœci w postaci m³odych pêdów, potocznie nazywanych szparagami. Wystêpujenaturalnie w obszarze œródziemnomorskim i na terenach przyleg³ych, przy czymg³ównym miejscem jego bytowania s¹ Indie i Himalaje. W Polsce roœnie w po³udniowejczêœci kraju. Preferuje gleby ¿wirowe i kamieniste, które wystêpuj¹ na terenachnizinnych, a tak¿e na zboczach gór [66]. Jednak¿e to jego bulwiaste korzenie(zwane inaczej korzeniami spichrzowymi) oraz k³¹cza s¹ cennym materia³em roœlinnympod wzglêdem zawartoœci fruktanów, których obecnoœæ oznaczono w ich wodnychwyci¹gach w iloœci ponad 15% fruktanów typu neoinulin [50], a wœród nichizokestozy i neokestozy oraz fruktanów o 3 ≤ DP ≤ 8 oraz 9 ≤ DP < 20 [52].

Fruktany i ich wystêpowanie … 73Rodzina PoaceaeWiechlinowate (Poaceae), wed³ug zaœ starszego nazewnictwa trawy (GramineaeJUSS.) – jest to rodzina roœlin, g³ównie zielnych, nale¿¹ca do klasy jednoliœciennych.W jej obrêbie wystêpuje oko³o 850 rodzajów i oko³o 11 tys. gatunków kosmopolitycznych.W Polsce wystêpuje ponad 150 gatunków traw. Stanowi ona g³ównykomponent roœlinnoœci stepowej, ³¹kowej i pastwiskowej. Nale¿¹ do niej równie¿wa¿ne roœliny uprawne, w tym zbo¿a [44]. Fruktanami charakterystycznymi dla tejrodziny s¹ liniowe lewany i neolewany oraz rozga³êzione fruktany typu mieszanego,za których syntezê odpowiedzialne s¹ enzymy tj.: 1-SST (sacharozo : sacharozo1-fruktozylotransferaza, EC 2.4.1.1.99), 6-SFT (sacharozo : fruktan 6- fruktozylotransferaza,EC 2.4.1.1.10), lewanosacharaza (lewan 2,6--D-fruktan) [45]. Jednak¿ezdolnoœæ do syntezy i gromadzenia rozpuszczalnych cukrów, skrobi i fruktanów, maj¹wy³¹cznie zimowe gatunki traw oraz owies bêd¹cy zbo¿em jarym, miejscem zaœgromadzenia siê tych wêglowodanów s¹ ich organy wegetatywne tj. ³odygi, liœciei owoce (ziarniaki) [7].Wœród przedstawicieli tej rodziny wystêpuj¹ m.in. pszenica, ¿yto, jêczmieñ,owies, tymotka, ¿ycica trwa³a, perz, stok³osa oraz kupkówka.Owies zwyczajny (Avena sativa L.) – jest gatunkiem zbó¿ uprawianym powszechniew strefie umiarkowanej Eurazji oraz Ameryki Pó³nocnej [67]. Badanie przeprowadzoneprzez Livingstona i in. [32] wykaza³o zawartoœæ bardzo z³o¿onej mieszaninyfruktanów, o DP mieszcz¹cym siê w przedziale od 5 do 10, która oparta jest natrisacharydzie neokestozie, u którego do obydwu ³añcuchów jednostek -D-fruktofuranozy,zarówno z wi¹zaniami (1–2) i (2–6)-glikozydowymi, przy³¹czona zostajekolejna jednostka -D-fruktofuranozy. Co wiêcej, wykazano ¿e g³ównymi fruktanamiwystêpuj¹cymi w organach wegetatywnych owsa s¹ FOS o DP 3, a s¹ nimi1-kestoza oraz 6G-kestoza (neokestoza). Z kolei, w obrêbie FOS o DP 4 wystêpuj¹1,1-ketotetroza (nystoza), 1,6G-ketotetroza, 6G,1-ketotetroza oraz 6G,6-ketotetroza.Oprócz tego, odkryto równie¿ FOS o DP 5, które wystêpuj¹ w postaci 7 ró¿-nych izomerów [22]. Dalsze badania Livingstona i in. [33] wykaza³y równie¿ odmiennerozmieszczenie ró¿nych typów wêglowodanów w zale¿noœci od analizowanejczêœci i odmiany roœliny oraz jej aklimatyzacji wobec niskich zimowych temperatur.Sk³onnoœæ do gromadzenia cukrów prostych oraz krótko³añcuchowych fruktanówo DP 5 w ww. warunkach odnotowano wy³¹cznie w przypadku owsa odmiany‘Wintok’. Co wiêcej, szybkoœæ ich gromadzenia siê by³a wiêksza w obszarze wierzcho³kowym(kompleksie merystemu) ani¿eli w ni¿szych czêœciach jej ³odygi. Rezultatówtakich nie odnotowano w przypadku najmniej odpornej na zimno odmiany owsajak¹ jest ‘Fulghum’. Wyniki tego badania s¹ zgodne z ogólnie przyjêt¹ tez¹ Trunovej[55], wed³ug której przyrost stê¿enia fruktanów w okreœlonych czêœciach roœlinypoci¹ga za sob¹ przyrost ich odpornoœci na mróz.

74 E. Cieœlik, A. Siembida¯yto zwyczajne (Secale cereale L.) – jest gatunkiem zbó¿ uprawianym w pó³nocno-wschodniejEuropie. Zosta³o rozpowszechnione jako jednoroczna roœlina ozima,rzadziej jara. Uprawiane jest na glebach lekkich [67]. Wykazano, ¿e g³ównymifruktanami wystêpuj¹cymi w organach wegetatywnych ¿yta s¹ FOS o DP 3, a s¹ nimi1-kestoza i 6-kestoza. Z kolei, w obrêbie FOS o DP 4 wystêpuj¹ 1,1-ketotetroza oraz1,6-ketotetroza [22].Pszenica zwyczajna (Triticum aestivum L.) – jest gatunkiem zbó¿, a zarazemkosmopolityczn¹ roœlin¹ uprawn¹, której najwiêksze uprawy znajduj¹ siê w Europie,wschodniej Azji oraz Indiach, obu Amerykach a tak¿e Australii. W uprawie wykorzystywanes¹ ró¿ne odmiany gatunków jarych jak i ozimych, w zale¿noœci od ichprzeznaczenia u¿ytkowego (np. odmiany jakoœciowe, chlebowe, na ciastka) [67].Liczne badania wykaza³y, ¿e w przypadku pszenicy, g³ównym czynnikiem determinuj¹cymstê¿enie fruktanów w ziarnach jest faza ich dojrza³oœci [37]. Potwierdzeniemtego s¹ wyniki badania Bancala i in. [2], w którym najwiêksz¹ zawartoœæ fruktanówodnotowano w jej niedojrza³ych ziarnach w okresie tzw. fazy mlecznej. Wed³ugWanga i Nobela [64], prawdopodobn¹ przyczyn¹ takiego rezultatu jest proceswype³niania niedojrza³ych ziaren pszenicy w zale¿noœci od zawartoœci wêgla pochodz¹cegoz dwóch Ÿróde³: aktualnej asymilacji i aktywacji rezerw zgromadzonychw ³odydze zarówno przed jak i po jej zakwitniêciu. Dowodz¹ temu tak¿e rezultatybadañ Paradiso i in. [40] oraz Van Loo i in. [56], w których wykazano, ¿e stê¿eniefruktanów zmniejsza siê ju¿ miêdzy drugim a trzecim tygodniem po zakwitniêciu³odygi pszenicy i wynosi zaledwie od 1 do 4%. Z kolei, Dahlqvist i Nilsson [12]w swym badaniu wyznaczyli sk³ad fruktanów zgromadzonych w ziarnach pszenicy.Wed³ug nich oko³o 30% stanowi¹ fruktany o DP 3, 13% fruktany o DP 4, 6% fruktanyo DP 5, 50% zaœ fruktany o DP 5. Wed³ug nowszych wyników badañ s¹ to g³ównie6-kestotrioza oraz fruktany typu mieszanego oparte na 1,6-kestotetrozie [27], którychg³ównym miejscem gromadzenia siê s¹ liœcie oraz wierzcho³kowe tkanki ³odyg wprzeciwieñstwie do jej ni¿szych czêœci, w których dominuj¹ g³ównie fruktany typuphlein, co jest zgodne z wynikami badania Bancala i in. [2]. Co wiêcej, badanie Yangai in. [65] wykaza³o, ¿e w wyniku procesu aklimatyzacji pszenicy, miejscemmagazynowania fruktanów staj¹ siê, oprócz liœci i tkanek wierzcho³kowych ³odyg,równie¿ tkanki ŸdŸb³a [1].Jêczmieñ zwyczajny (Hordeum vulgare L.) – jest gatunkiem zbó¿ uprawianymw Europie, Azji, Afryce, USA, Argentynie. W Polsce jest pospolit¹ roœlin¹ uprawn¹[68]. Wang i Tillberg [62, 63], jako pierwsi odkryli, ¿e miejscem gromadzenia siêfruktanów u jêczmienia s¹ liœcie. Badanie to wykaza³o równie¿, i¿ gromadzenieskrobi zachodzi³o po lub te¿ w mniejszym stopniu ni¿ akumulacja fruktanów. Z koleiWagner i in. [60] ustalili, ¿e stanowi¹ one 75% suchej masy liœci jêczmienia, podwzglêdem struktury zaœ zaliczane s¹ do mieszanego typu fruktanów [38]. Z koleiGulewicz i in. [20] podaj¹, ¿e zawartoœæ inuliny i oligofruktozy w ziarnach jêczmieniakszta³tuje siê na poziomie od 0,5 do 1,5%.

Fruktany i ich wystêpowanie … 75Rodzina AgavaceaeAgawowate (Agavaceace) – to rodzina roœlin nale¿¹cych do klasy okrytonasiennych,która obejmuje oko³o 247 gatunków sukulentów liœciowych lub drzew i którazaliczana jest do endemicznych (czyli wystêpuj¹cych na œciœle okreœlonym obszarze)na kontynencie Ameryki Po³udniowej. G³ównym przedstawicielem tej rodziny jestrodzaj Agave, którego ojczyzn¹ jest Meksyk [66]. Do czynników pozytywnie wp³ywaj¹cychna wzrost wszystkich gatunków agaw zalicza siê: ciep³y, œródziemnomorskiklimat oraz du¿¹ zawartoœæ soli wapnia i ¿elaza w glebie [42]. Roœliny te zbudowanes¹ z gruboszowatych bylin o skróconej ³odydze i grubych liœciach o kolczastychbrzegach, które zebrane s¹ w przyziemn¹ rozetê. Maj¹ one równie¿ liczne, niepozornekwiaty o ró¿nych barwach, w tym m.in. zielonkawej, ¿ó³tej lub brunatnej, którezebrane s¹ na szczycie tworz¹c wiechê lub k³os. Agawa jest sukulentem, poniewa¿kwitnie tylko raz (po kilkunastu lub kilkudziesiêciu latach ¿ycia), po czym wydajeowoce, a nastêpnie obumiera [44]. López i in. [34] przeprowadzili badanie, którewykaza³o, ¿e agawy wykorzystuj¹ metabolizm kwasowy gruboszowatych bylin (ang.Crasulaceam Acid Metabolism – CAM) dla wi¹zania CO 2 , dziêki temu podstawowymproduktem tej fotosyntezy s¹ fruktany. Pocz¹tkowo twierdzono, i¿ g³ównymmiejscem syntezy i gromadzenia siê fruktanów s¹ ³odygi agaw, jednak¿e badanieWanga i Nobla [64] dowiod³o, ¿e najwiêksze stê¿enia fruktanów wystêpuj¹ w naczyniowychtkankach ³yka agaw i s¹ prawie nieobecne zarówno w chlorenchymiei mi¹¿szu dojrza³ych liœci.Sk³ad chemiczny wszystkich gatunków agaw jest z³o¿ony i do chwili obecnej niedo koñca zidentyfikowany [17].Jednym z najbardziej znanych gatunków agaw jest Agave tequilana WEBER var.azul., który taksonomicznie zosta³ sklasyfikowany jako cz³onek grupy Ridigea.Wartym uwagi jest równie¿ fakt, ¿e oprócz odmiany „azul”, istnieje tak¿e szereginnych, w tym m.in. „azul listado”, „sigüin”, „moraleño”, „chato” lub „sahuayo”,„bermejo”, „zopilote”, „pata de mula” lub „criollo” i „mano larga” [16]. Jednak¿e toodmiana „azul” jest preferowana ju¿ od ponad 200 lat, z powodu jej stosunkowokrótkiego cyklu ¿ycia i du¿ej wydajnoœci gromadzenia fruktanów, które jako sk³adniksoku pozyskiwanego z jej rdzenia (tzw. piña) wykorzystywane s¹ do produkcji tequili,czyli najs³ynniejszej meksykañskiej wódki. Badanie López i in. [34] wykaza³o, ¿efruktany obecne w liœciach Agave tequilana WEBER var. azul. maj¹ stopieñ polimeryzacjirzêdu od 3 do 29 jednostek oraz ¿e nale¿¹ do fruktanów typu mieszanego orazagavins, a nie inulin, jak dotychczas myœlano. Z kolei, Mancilla-Margalli i López [35]dowiedli ró¿nic strukturalnych miêdzy fruktanami wystêpuj¹cymi w agawach gatunkuA. tequilana rosn¹cych w ró¿nych regionach œrodowiskowych. Ró¿norodnoœæ t¹wyt³umaczono faktem odmiennych mechanizmów adaptacji tych roœlin do trudnychwarunków œrodowiskowych, w których bytuj¹.Z kolei fruktany wyizolowane z Agava americana, rosn¹cej i uprawianej w Po³udniowejAfryce, s¹ obecnie stosowane do produkcji spirytusu. W trakcie badania struk-

76 E. Cieœlik, A. Siembidatury wêglowodanów rozpuszczalnych w wodzie w celu rozwoju i u³atwienia zastosowaniainnych dodatków wyci¹gowych, przebadano tak¿e strukturê fruktanów. Badanieto wykaza³o, ¿e cukrowce te maj¹ stopieñ polimeryzacji (DP) rzêdu od 6 do 50 jednostekoraz strukturê charakterystyczn¹ dla fruktanów typu mieszanego [43].W tabeli 1 przedstawiono zawartoœæ fruktanów w wybranych produktachspo¿ywczych.Tabela 1. Zawartoœæ fruktanów w wybranych produktach spo¿ywczych [Ÿród³o: 58]Produkty zawieraj¹ce fruktany Porcja produktu Zawartoœæ fruktanów [g]w 100 g produktu w 1 porcji produktuProdukty pszenne:otrêby 4 g 1,4–4,0 0,1chleb (bia³y) 2 kromki (65 g) 0,7–2,8 1,8makaron ugotowany 1 miseczka (165 g) 1,4–4,1 2,5pe³noziarniste p³atki œniadaniowe 1 miseczka (60 g) 0,8–3,2 1,9krakersy 2 sztuki (40 g) 0,8–3,4 1,4pieczywo chrupkie 2 kromki (30 g) 1,0–3,8 1,1Produkty ¿ytnie:m¹ka 100 g 0,5–1,0 0,1(100%) chleb ¿ytni 2 kromki (65 g) 0,35–0,63 0,4pieczywo chrupkie 2 kromki (30 g) 0,4–0,72 0,2Ziarna jêczmienia 100 g 0,3–0,7 0,7Cykoria korzeniowa (proszek) 0,5 szklanki (75 g) 35,7–47,6 30,4Napoje zawieraj¹ce wyci¹g z cykorii 1,5 ³y¿eczki (7 g) 35,7–47,6 3,0korzeniowej jako zamiennik kofeinyCebula 2 ³y¿ki (35 g) 1,1–10,1 2,1Por 0,5 miseczki (85 g) 3,0–10,0 5,6Szparagi 6 sztuk (90 g) 1,4–4,1 2,6Czosnek 1 z¹bek (3 g) 9,0–16,0 0,5G³ówka karczocha 1 œrednia (120 g) 2,0–6,8 5,5Topinambur (proszek) 0,5 szklanki (75 g) 16,0–20,0 15,0Banany 1 œredni (90 g) 0,3–0,7 0,6PodsumowanieW pracy przedstawiono przegl¹d najnowszego piœmiennictwa krajowego i zagranicznegodotycz¹cego charakterystyki fruktanów i Ÿróde³ ich wystêpowania.Zwrócono uwagê na wp³yw pewnych czynników na stê¿enie fruktanów w ró¿nychczêœciach tych roœlin oraz na ich strukturê chemiczn¹ w aspekcie mo¿liwoœci ichwykorzystania w przemyœle spo¿ywczym, chemicznym i farmaceutycznym – jako¿ywnoœci funkcjonalnej.

Fruktany i ich wystêpowanie … 77Literatura[1] Bancal P., Gaudillère J.P. 1989. Rate of accumulation of fructan oligomers in wheat seedlings (Triticumaestivum L.) during the early stages of chilling treatment. New Phytol. 112: 459–463.[2] Bancal P., Carpita N.C, Gaudillère J.P. 1992. Differences in fructan accumulated in induced and field-grownwheat plants: an elongation-trimming pathway for their synthesis. New Phytol. 120: 313–321.[3] Baumgartner S., Dax T. G., Praznik W., Falk H. 2000. Characterisation of the high-molecular weight fructanisolated from garlic (Allium sativum L.). Carbohydr. Res. 328(2): 177–183.[4] Benkeblia N., Onodera S., Shiomi N. 2004. Effect of gamma irradiation and temperature on fructans(fructooligosaccharides) of stored onion bulbs Allium cepa L. Food Chem. 87(3): 377–382.[5] Benkeblia N., Takahashi N., Ueno K., Onodera S., Shiomi N. 2005. Tetra- and penta-fructooligosaccharide(FOS) isomers assessment in onion bulb tissues: effect of temperature and storage time. Tetra. Assym. 16(1):33–37.[6] Bielecka M., Biedrzycka E., Majkowska A. 2002. Selection of probiotics and prebiotics for synbiotics andconfirmation of their in vivo effectiveness. Food Res. Inter. 35(2–3): 125–131.[7] Chatterton N.J., Watts K.A., Jensen K.B., Harrison P.A., Horton W.H. 2006. Nonstructural carbohydrates in oatforage. J. Nutr. 136: 2111–2113.[8] Chope G.A., Terry L.A., White P.J. 2007. The effect of the transition between controlled atmosphere and regularatmosphere storage on bulbs of onion cultivars SS1, Carlos and Renate. Post. Biol. Tech. 44: 228–239.[9] Cieœlik E., Prostak A., Pisulewski P.M. 2001. Funkcjonalne w³aœciwoœci fruktanów. ¯yw. Nauka. Technol.Jakoœæ 1(26): 5–13.[10] Cieœlik E. 2004. Cechy funkcjonalne ¿ywnoœci pochodzenia roœlinnego. VI Krajowe Warsztaty ¯ywieniowe,Postêpy w epidemiologii i ocenie ¿ywnoœci funkcjonalnej, Sesja I: 11–12.[11] Cieœlik E. 2005. Zawartoœæ azotanów (V) i azotanów (III) w bulwach topinamburu (Helianthus tuberosus L.).Zeszyty Naukowe Wy¿szej Szko³y Ekologii Nr kol. 1.[12] Dahlqvist A., Nillson U. 1984. Cereal fructosans: Part I – Isolation and characterization of fructosans fromwheat. Food Chem. 14: 103–112.[13] Darbyshire B., Henry R.J. 1978. The distribution of fructans in onions. New Phytol. 81: 29–34.[14] Florkiewicz A., Cieœlik E., Filipiak-Florkiewicz A. 2007. Wp³yw odmiany i terminu zbioru na sk³ad chemicznybulw topinamburu (Helianthus tuberosus L.). ¯yw. Nauka. Technol. Jakoœæ 3(52): 71–81.[15] Rodríguez Galdón B., Tascón Rodríguez C., Rodríguez Rodríguez E.M., Díaz Romero C. 2009. Fructans andmajor compounds in onion cultivars (Allium cepa). J. Food Comp. Anal. 22(1): 25–32.[16] Gil-Vega K., Díaz C., Nava-Cedillo A., Simpson J. 2006. AFLP analysis of Agave tequilana varietes. Plant Sci.170: 904–909.[17] Gi¿yñska M., Mat³awska I. 2007. Znaczenie gatunków z rodzaju Agawa. Herba Polonica 53(2).[18] Góral S. 1998. Zmiennoœæ morfologiczna i plonowanie wybranych klonów s³onecznika bulwiastego – topinambur(Helianthus tuberosus L). Hodowla Roœlin i Nasiennictwo 2: 6–11.[19] Griffiths G., Trueman L., Crowther T., Thomas B., Smith B. 2002. Onions – a global benefit to health. Phy. Res.16: 603–615.[20] Gulewicz P., Powa³owski S., Trojanowska K. 2003. Charakterystyka wa¿niejszych prebiotyków. ¯yw. Nauka.Technol. Jakoœæ 34(1 Supl.): 27–39.[21] Gupta A.K., Kaur N. 2001. Carbohydrate reserves in plants: synthesis and regulation developments in cropscience 26. Plant Sci. 161: 1183–1184.[22] Hincha D.K., Livingston D.P., Premakumar R., Zuther E., Obel N., Cacela C., Heyer A.G. 2007. Fructans fromoat and rye: Composition and effects on membrane stability during drying. Biochim. Biophys. Acta 1768:1611–1619.[23] Jaime L., Martín-Cabrejas M.A., Mollá E., López-Andréu F.J., Esteban R.M. 2001. Effect of storage on fructanand fructooligosaccharide of onion (Allium cepa L.). J. Agric. Food Chem. 49: 982–988.[24] John P. 1994. Control of fructan metabolism in the Compositae. Proc. of the International CompositaeConference, 111–119.[25] Kahane R., Vialle-Guérin E., Boukema I., Tzanoudakis D., Bellamy Ch., Chamaux Ch., Kik Ch. 2001. Changesin non-structural carbohydrate composition during bulbing in sweet and high-solid onions in field experiments.Environ. Exp. Bot. 45: 73–83.

78 E. Cieœlik, A. Siembida[26] Karczmarewicz E., Skorupa E., Lorenc S.R. 2002. Wp³yw probiotyków i prebiotyków na gospodarkê wapniowo-fosforanow¹i metabolizm kostny. Ped. Wspó³., Hepat. i ¯yw. Dziecka 4(1): 63–69.[27] Kawakami A., Yoshida M. 2005. Fructan: fructan 1-fructosyltransferase, a key enzyme for biosynthesis ofgraminan oligomers in hardened wheat. Planta 223: 90–104.[28] Kleessen B., Hartmann L., Blaut M. 2001. Oligofructose and long-chain inulin: influence on the gut microbialecology of rats associated with a human faecal flora. Br. J. Nutr. 86 (2): 291–300.[29] Knudsen K.E.B. 1997. Carbohydrate and lignin contents of plant materials used in animal feeding. Anim. FeedSci. Technol. 67: 319–338.[30] Kolida S., Gibson G.R. 2007. Prebiotic capacity of inulin-type fructans. J. Nutr. 137: 2503–2506.[31] Kubik C., Piasecka K., Anyszka A., Bielecki S. 2006. Polifruktany i fruktooligosacharydy (FOS) – wystêpowanie,otrzymywanie i zastosowanie. Biotech. 2(73): 103–116.[32] Livingston III DP, Knievel D.P., Gildow F.E. 1994. Fructan synthesis in oat. 1. Oligomer accumulation in stemsduring cold hardening and their in vitro synthesis in a crude enzyme extract. New Phytol. 127: 27–36.[33] Livingston D., Premakumar R., Tallury S.P. 2005. Carbohydrate concentrations in crown fractions from winteroat during hardening at sub-zero temperatures. Ann. Bot. 96: 331–335.[34] López M.G., Mancilla-Margalli N.A., Mendoza-Diaz G. 2003. Molecular structures of fructans from Agavetequilana WEBER var. azul. J. Agric. Food Chem. 51(27): 7835–7840.[35] Mancilla-Margalli N.A., López M.G. 2006. Water-soluble carbohydrates and fructan structure patterns fromAgave and Dasylirion species. J. Agric. Food Chem. 54: 7832–7839.[36] McCallum J., Clarke A., Pither-Joyce M. 2006. Genetic mapping of a major gene affecting onion bulb fructancontent. Theor. Appl. Genet. 112: 958–967.[37] Merendino N., D’Aquino M., Molinari R., De Gara L., Grazia M. D’Egidio, Paradiso A., Cecchini C., CorradiniC., Tomassi G. 2006. Chemical characterization and biological effects of immature durum wheat in rats. J.Cereal Sci. 43: 129–136.[38] Nagaraj V.J., Riedl R., Boller T., Wiemken A., Meyer A.D. 2001. Light and sugar regulation of the barleysucrose : fructan 6-fructosyltransferase promoter. J. Plant Physiol. 158: 1601–1607.[39] O’Donoghue E.M., Somerfield S.D., Shaw M., Bendall M., Hedderly D., Eason J. 2004. Evaluation ofcarbohydrates in Pukekohe Longkeeper and Grano cultivars of Allium cepa. J. Agric. Food Chem., 52:5383–5390.[40] Paradiso A., Cecchini C., de Pinto M.C., De Gara L., D’Egidio M.G. 2003. Fructans and vitamin C contents inimmature and mature kernels of Triticum durum and their wholemeal. Proceedings of Second InternationalWorkshop ‘Durum Wheat and Pasta Quality, Recent Achievements and New Trends’: 219–221.[41] Pozzo A.M.C., Abrameto M., Pellejero G., Aschkar G., Gil M.I., Van Konijnemburg A. 2005 Efecto del períodode conservación sobre algunas propiedades nutracéuticas y organolépticas en los bulbos de cultivares nacionalesde cebollas (Allium cepa L.) en el valle inferior de Río Negro. Revista Investigaciones Agropecuarias 34:115–130.[42] Praznik, W., Huber, A., and Cieœlik, E. 2004. Fructans: occurrence and applications in food. Chemical andFunctional Properties of Food Saccharides. CRS Press LLC, the USA.[43] Ravenscroft N., Cescutti P., Hearshaw M.A., Ramsout R., Rizzo R., Timme E.M. 2009. Structural analysis offructans from Agave americana grown in South Africa for spirit production. J. Agric. Food Chem. 57(10):3995–4003.[44] Reveal J.L. 1999. System of Classification, Plant Taxonomy, Department of Plant Biology. University ofMaryland.[45] Ritsema T., Smeekens S. 2003. Fructans: beneficial for plants and humans. Curr. Opin. Plant Biol. 6: 223–230.[46] Roberfroid M.B., Slavin J. 2000. Nondigestible oligosaccharides. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 40: 461–480.[47] Roberfroid M.B. 2000. Chicory fructooligosaccharides and the gastrointestinal tract. Nutrition 16(7/8):677–679.[48] Roberfroid M.B. 2007. Inulin-type fructans: Functional food ingredients. J. Nutr. 137: 2493–2502.[49] Rodrígues A.S., Fogliano V., Graziani G., Mendes S., Vale A.P., Gonçalves C. 2003. Nutritional value of onionregional varieties in Northwest Portugal. Elec. J. Environ. Agric. Food Chem. 2: 519–524.[50] Singh R.S., Dhaliwal Rajesh, Puri Munish 2006. Production of inulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1using root extract of Asparagus racemosus. Proc. Bioch. 41: 1703–1707.[51] Shiomi N. 1979. Isolation and identification of 1-kestose and neokestose from onion bulbs (Allium cepa).J. Faculty Agric. Hokkaido Uni. 58: 548–556.

Fruktany i ich wystêpowanie … 79[52] Shiomi N. 1992. Content of carbohydrate and activities of fructosylotransferase and invertase in asparagus rootsduring the frukctooligosaccharide- and fructopolysaccharide accumulating season. New Phytol. 122: 421–432.[53] Thakur M., Bhargava S., Dixit V.K. 2009. Effect of Asparagus racemosus on sexual dysfunction inhyperglycemic male rats. Pharmaceut. Biol. 47(5): 390–395.[54] Trafalska E., Grzybowska K. 2004. Probiotyki – alternatywa dla antybiotyków? Wiad. Lek. 57(9–10).[55] Trunova T.L. 1965. Light and temperature systems in the hardening of winter wheat and the significance ofoligosaccharides for frost resistance. Fiziol. Rast. 12: 70–77.[56] Van Loo J., Coussement P., de Leenheer L., Hoebregs H., Smits G. 1995. On the presence of inulin andoligofructose as natural ingredients in the western diet. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 35: 525–552.[57] Van Loo J. 2007. How chicory fructans contribute to zootechnical performance and well-being in livestock andcompanion Animals. J. Nutr. 137: 2594–2597.[58] Venter C.S. 2007. Prebiotics: an update. JFECS 35: 17–25.[59] Visavadiya N.P., Narasimhacharya R.L. 2005. Hypolipidemic and antioxidant activities of Asparagus racemosusin hypercholesteremic rats. Indian J. Pharm. Sci. 37(6): 376–380.[60] Wagner W., Keller F., Wiemken A. 1983. Fructan metabolism in cereals: induction in leaves and compartmentationin protoplasts and vacuoles. Z Pflanz. 112: 359–372.[61] Waleckx E., Gschaedler A., Colonna-Ceccaldi B., Monsun P. 2008. Hydrolysis of fructans from Agave tequilanaWEBER var. azul during the cooking step in a traditional tequila elaboration process. Food Chem. 108: 40–48.[62] Wang C., Tillberg J.E. 1996. Effects of nitrogen deficiency on accumulation of fructan and fructan metabolizingenzyme activities in sink and source leaves of barley (Hordeum vulgare). Physiol. Plant. 97: 339–345.[63] Wang C., Tillberg J.E. 1997. Effects of short-term phosphorus deficiency on carbohydrate storage in sink andsource leaves of (Hordeum vulgare). New Phytol. 136: 131–135.[64] Wang N., Nobel P.S. 1998. Phloem transport of fructans in the crassulacean acid metabolism species Agavedeserti. Plant Physiol. 116: 709–714.[65] Yang J., Zhang J., Wang Z., Zhu Q., Liu L. 2004. Activities of fructan- and sucrose-metabolizing enzymes inwheat stems subjected to water stress during grain filling. Planta 220: 331–343.[66] Zaj¹c A., Mirek Z., Piêkoœ-Mirkowa H., Zaj¹c M. 2002. Flowering plants and pteridophytes of Poland:a checklist. Krytyczna lista roœlin naczyniowych Polski. Instytut Botaniki PAN im. W³adys³awa Szaferaw Krakowie, ISBN 83-85444-83-1.[67] Zamudio D.M., Pinos-Rodríguez J.M., González S.S., Robinson P.H., García J.C. and Montañez O. 2009.Effects of Agave salmiana OTTO ex SALM-DYCK silage as forage on ruminal fermentation and growth in goats.Anim. Feed Sci. Technol. 148: 1–11.Fructans and their occurrence in cultivated plantsKey words: fructans, chemical composition, characterization of their sourcesSummaryFructans, or polyfructosylsucroses, are water-soluble polymers of fructose buildupon a -D-fructofuranosyl units linked to each other by (2-1) and/or -(2,6) bonds,meanwhile a glucose moiety may be linked to the reducing end of the chain by an-(1->2) bond.Five different groups of fructans are found in the nature and can be distinguishedaccording to the type of linkage in structure and the position of glucose moiety. Thesegroups consist of inulins, neoseries inulins, levans (produced by bacteria)/phleins(produced by plants), neoseries levans, and the mixed fructans group (graminan).

80 E. Cieœlik, A. SiembidaThe reason for the variety of fructans structures in plants is unknown, however,summing up the results of many studies, it was assumed that the central role is playedby factors such as: plant species, plant part, stage of development (mature) and environmentalconditions, including temperature (especially during the growth of rootsand shoots), the intensity of insolation and its time, and the availability of food and waterstatus.Characteristic fructans for Asteraceae DUM., formerly Compositae GIS. family arelinear inulin type fructan. Two enzymes are responsible for inulintype fructan synthesislike 1-SST, 1-FFT - for plants, and only one enzyme – fructosyltransferase – formost bacteria. Among the members of this family are: chicory, Jerusalem artichoke,bananas, common dandelion (medical), larger burdock, dahlia, daisy wormwood,tropical mangrove trees.Characteristic fructans for Liliaceae JUSS. family are linear neo inulin-typefructan. There is one enzyme responsible for neo inulin synthesis. This is 6G-FFT.Among members of this family are: garlic, onion, pore, asparagus.Characteristic fructans for Poaceace family are linear levane and neo levane andmixed fructans (graminan). Three enzymes are responsible for their synthesis: 1-SST,1-FFT, levansucrase. Among the members of this family are: wheat, rye, barley,oat, timothy, perennial ryegrass, wheatgrass, orchardgrass and bromegrass.The chemical composition of all species of agaves from the family Agavaceace isfolded and still not completely understood. To this family belong: Agave tequilanaWEBER var. azul., Agava forucroydes LEM., Agave salmiana, Agava Americana, inwhich found mixed fructans group (graminan) and agavins and not inulin, as it waspreviously thought. Of these, the economically important species for Mexican agroindustryis Agave tequilana WEBER var. azul not only because it is only one plant allowingto production of Mexico’s most famous vodka – tequila, but it is also becauseof a high content of fructans.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 81–90Wp³yw selenui niskocz¹steczkowych antyoksydantówna jakoœæ nasienia zwierz¹t gospodarskichZofia Luberda-Bieñkowska, Anna MajewskaKatedra Biochemii i Biotechnologii Zwierz¹t,Uniwersytet Warmiñsko-Mazurski w Olsztynie,ul. Oczapowskiego 5, 10-719 Olsztyne-mail: luberda@uwm.edu.plS³owa kluczowe: nasienie zwierz¹t, status antyoksydacyjny, selen,-tokoferol, kwas L-askorbinowy, glutationWstêpWartoœæ biologiczna nasienia zwierz¹t w du¿ym stopniu jest wyznaczana przezjego status antyoksydacyjny, czyli jego odpornoœæ na stres oksydacyjny. Mêskiekomórki rozrodcze s¹ zdolne do generowania reaktywnych form tlenu (RFT), którew niewielkich iloœciach s¹ niezbêdne dla zapewnienia prawid³owego przebiegu procesuzap³odnienia. Jednak¿e pojawienie siê tych metabolitów w nadmiarze wywo³ujestan okreœlany stresem oksydacyjnym. Stan ten pojawia siê wówczas, kiedy zostajezachwiana równowaga miêdzy systemami generuj¹cymi RFT, a antyoksydacyjnymimechanizmami obronnymi w komórce.Stres oksydacyjny jest jednym z g³ównych czynników odpowiedzialnych zazak³ócenie funkcji biologicznych nasienia. W wyniku peroksydatywnych uszkodzeñfosfolipidów b³onowych nastêpuje naruszenie integralnoœci plazmolemy, a w dalszejkolejnoœci uszkodzenie chromatyny plemników. Ulegaj¹ zak³óceniu procesy energetyczne.Obni¿a siê prze¿ywalnoœæ i ruchliwoœæ plemników, zarówno pod wzglêdemiloœciowym jak i jakoœciowym [14, 21]. Zak³óceniom mog¹ równie¿ ulegaæ ostatnieetapy procesu zap³odnienia w tym reakcja akrosomowa czy fuzja plemnik–oocyt [20].Prawid³owa homeostaza oksydacyjna komórek znajduj¹cych siê w uk³adach biologicznychwytwarzana jest przez ró¿ne systemy, które zapewniaj¹ odpowiednie poziomyRFT, niezbêdne do prawid³owego funkcjonowania komórek.

82 Z. Luberda-Bieñkowska, A. MajewskaDo podstawowego enzymatycznego systemu antyoksydacyjnego mêskich komórekrozrodczych mo¿na zaliczyæ dysmutazê ponadtlenkow¹, katalazê, reduktazêglutationow¹ czy peroksydazê glutationow¹, która w swej budowie zawiera selen.Powy¿sze systemy enzymatyczne s¹ wspierane przez niskocz¹steczkowe antyoksydantytakie jak m.in. -tokoferol, glutation czy kwas L-askorbinowy.Badania ostatnich lat wykaza³y, ¿e status antyoksydacyjny nasienia zwierz¹tmo¿na znacznie poprawiæ przez odpowiedni¹ suplementacjê diety. Celem prezentowanejpracy jest przegl¹d wspó³czesnego piœmiennictwa œwiatowego, dotycz¹cegowp³ywu suplementacji diety selenem i niskocz¹steczkowymi antyoksydantami nawskaŸniki rozrodcze nasienia, maj¹ce istotne znaczenie dla procesów reprodukcjizwierz¹t gospodarskich.Wp³yw selenuSuplementacja diety samców selenem wp³ywa pozytywnie zarówno na cechyjakoœciowe nasienia jak i jego wartoœæ biologiczn¹. W wielu badaniach wykazano, ¿e¿ywienie knurów selenem od 0,3 do 0,5 mg · kg –1 diety wp³ywa korzystnie na produkcjênasienia, ruchliwoœæ, morfologiê plemników oraz p³odnoœæ tych zwierz¹t[8, 13, 16, 17, 18]. Selen stymuluje tak¿e aktywnoœæ peroksydazy glutationowejw plazmie nasienia, plemnikach oraz j¹drach zwierz¹t. Wzrost aktywnoœci peroksydazyglutationowej – jednego z g³ównych enzymów antyoksydacyjnych – z koleiwzmacnia ochronê plemników przed stresem oksydacyjnym [13, 22].Niedobór selenu w ¿ywieniu zwierz¹t mo¿e prowadziæ do zaburzeñ strukturalnych ifunkcjonalnych ich materia³u genetycznego. W plemnikach knurów ¿ywionych diet¹niskoselenow¹ wystêpuj¹ uszkodzenia strukturalne mitochondriów. Znacznie obni¿asiê poziom ATP. Suplementacja diety selenem (0,5 mg · kg –1 ) skutecznie zapobiegauszkodzeniom morfologicznym struktur plemnikowych i pobudza syntezê energii, copozytywnie przek³ada siê na ruchliwoœæ omawianych gamet [18]. Pozytywny wp³ywselenu na morfologiê mêskich komórek rozrodczych wi¹¿e siê z jego funkcj¹ strukturaln¹,bowiem mikroelement ten jest sk³adnikiem selenoprotein w obszarze wstawkiplemnika. Przy odpowiedniej diecie selenowej wraz ze wzrostem jakoœci plemnikówroœnie ich zdolnoœæ zap³adniaj¹ca. Marin-Guzman i in. [16] wykazali, ¿e plemnikiknurów ¿ywionych selenem (0,5 mg · kg –1 ) maj¹ wiêksz¹ zdolnoœæ penetracji os³onyprzejrzystej oocytów podczas procesu zap³odnienia.Badania wielu autorów [11, 13, 16, 18] wykaza³y, ¿e znacznie korzystniejsze efektyw procesach reprodukcyjnych zwierz¹t uzyskuje siê przy zastosowaniu w ich ¿ywieniuzwierz¹t selenu ³¹cznie z witamin¹ E. Suplementacja diety knurów odpowiednimidawkami selenu w po³¹czeniu z t¹ witamin¹ wp³ywa korzystnie m.in. na koncentracjêi morfologiê plemników, integralnoœæ b³on komórkowych czy zdolnoœæ zap³adniaj¹c¹nasienia. Obserwacje te wykaza³y, ¿e oba te suplementy dzia³aj¹ synergistycznie z tym,¿e wiêksz¹ rolê przypisuje siê selenowi [16]. U m³odych knurów, którym zwiêkszonow kilogramie paszy zawartoœæ selenu dro¿d¿owego z 0,2 do 0,5 mg oraz witaminy E

Wp³yw selenu … 83Rysunek 1. Wybrane parametry nasienia knurów ¿ywionych diet¹ suplementowan¹ selenemi witamin¹ E; opracowanie w³asne wed³ug danych Ko³odziej i Jacyno [13]Wartoœci oznaczone literami a, b ró¿ni¹ siê statystycznie istotnie (p ≤ 0,05)Wartoœci oznaczone literami A, B ró¿ni¹ siê statystycznie istotnie (p ≤ 0,01)z 30 do 60 mg, odnotowano wy¿sz¹ koncentracjê plemników oraz ich ogóln¹ liczbêw ejakulacie w porównaniu z grup¹ kontroln¹. Jednoczeœnie obni¿y³ siê odsetek plemnikówz wadami morfologicznymi. Odnotowano tak¿e znaczny wzrost osmotycznejopornoœci b³on plemników (ORT – osmotic resistance test) (rys. 1). Kolejny wyznacznikintegralnoœci b³on komórkowych, a mianowicie „wyciek” aminotransferazy asparaginianowejz plemników do plazmy by³ równie¿ ni¿szy u wspomnianych zwierz¹t¿ywionych diet¹ z podwy¿szon¹ zawartoœci¹ selenu i witaminy E [13].Nale¿y podkreœliæ, ¿e nasienie knurów ¿ywionych diet¹ suplementowan¹ selenemcharakteryzuje siê lepszymi parametrami jakoœciowymi i biologicznymi podczasprzechowywania w stanie p³ynnym w porównaniu do nasienia osobników pozbawionychtego mikroelementu [8]. Warto równie¿ wspomnieæ o badaniach, w którychokreœlano wp³yw selenu aplikowanego zwierzêtom w formie iniekcji na wartoœæ ichmateria³u genetycznego. W badaniach na trykach wykazano, ¿e comiesiêczna iniekcjaselenu przez ca³y rok mia³a korzystny wp³yw na jakoœæ uzyskiwanego od nichnasienia, w tym koncentracji, ruchliwoœci czy morfologii plemników. Poza tymsystematyczne iniekcje tego pierwiastka spowodowa³y wyrównanie wy¿ej wymienionychparametrów jakoœciowych nasienia w ci¹gu roku [19]. Nale¿y równie¿nadmieniæ o badaniach, które nie potwierdzi³y pozytywnego efektu selenu na parametrynasienia. I tak dla przyk³adu Hawkes i in. [9] nie odnotowali wp³ywu suplementacjidiety selenem na jakoœæ nasienia mê¿czyzn, pomimo znacznego wzrostustê¿enia tego pierwiastka w surowicy krwi i plazmie nasienia badanych osobników.

84 Z. Luberda-Bieñkowska, A. MajewskaUdzia³ selenu w spermatogenezieStrategiczny dla procesów rozrodczych jest udzia³ selenu w procesie wytwarzaniai dojrzewania mêskich komórek rozrodczych. Selen bierze istotny udzia³ w powstawaniukomórek Sertoliego i komórek rozrodczych w rozwijaj¹cych siê j¹drach.Wykazano [4, 18], ¿e ju¿ we wczesnych etapach spermatogenezy Se zostaje w³¹czonydo selenoprotein wstawki plemnika.W interesuj¹cych badaniach Marin-Guzman i in. [17] okreœlali wp³yw selenu naproces spermatogenezy knurów w ró¿nym wieku. Badania przeprowadzono na knurach¿ywionych suplementowan¹ selenem pasz¹ (0,5 mg · kg –1 ) od momentu odsadzeniado osi¹gniêcia dojrza³oœci p³ciowej. Autorzy ci wykazali, ¿e knury w wieku 6,2miesiêcy, ¿ywione diet¹ z selenem w porównaniu z osobnikami kontrolnymi (bezselenu) charakteryzowa³y siê znacznie wy¿sz¹ liczb¹ komórek Sertoliego oraz spermatyd.Doros³e knury (18 miesiêcy) ¿ywione selenem charakteryzowa³y siê nieconi¿szym stopniem wzrostu populacji komórek Sertoliego i spermatyd ni¿ m³odeosobniki. Istotnie natomiast wzros³a liczba spermatocytów II rzêdu, a populacjaspermatocytów I rzêdu wykazywa³a tendencjê wzrostow¹. Badania te jednoznaczniewykaza³y, ¿e wp³yw Se na populacjê komórek Sertoliego by³ znacznie wy¿szy u knuróww wieku 6,2 miesiêcy ni¿ u osobników doros³ych. Je¿eli chodzi natomiast o rozwójkomórek rozrodczych to oddzia³ywanie selenu zaznacza siê bardziej u osobnikówdoros³ych.Marin-Guzman i in. [17] wykazali równie¿, ¿e Se u doros³ych knurów wywierazasadniczy wp³yw na ca³kowit¹ liczbê plemników w j¹drach. U m³odych osobników(5,4 i 6,2 miesiêcy) cytowani autorzy nie odnotowali takich zale¿noœci, a niewielkatendencja wzrostowa populacji tych komórek pojawi³a siê u knurów w wieku 9 miesiêcy.Dopiero u dojrza³ych p³ciowo knurów (18 miesiêcy) ca³kowita liczba plemnikóww j¹drach uleg³a znacznemu podwy¿szeniu. Prezentowane powy¿ej badaniapotwierdzi³y, ¿e selen jest niezbêdny zarówno na etapie ró¿nicowania komórekgametogenicznych w gonadzie mêskiej jak i u osobników doros³ych, gdzie wywierazasadniczy wp³yw na produkcjê nasienia.Wp³yw chemicznej formy selenu na parametry nasieniaBadania porównawcze [11] wykaza³y, ¿e o wiele lepsze efekty reprodukcyjneuzyskuje siê przy suplementacji diety samców selenem organicznym w postaci selenoaminokwasówni¿ selenem nieorganicznym w postaci seleninu sodu – Na 2 SeO 3 .Knury, których diety suplementowano organicznym selenem (0,2 i 0,4 mg · kg –1 ) orazwitamin¹ E (60 mg · kg –1 ) w porównaniu do knurów z grupy kontrolnej, ¿ywionychz dodatkiem 0,2 mg · kg –1 selenu nieorganicznego i 30 mg · kg –1 wit. E charakteryzowa³ysiê wy¿sz¹ koncentracj¹ plemników i ca³kowit¹ ich liczb¹ w ejakulacie orazwiêksz¹ objêtoœci¹ j¹der. Odsetek plemników z wadami morfologicznymi u wspom-

Wp³yw selenu … 85nianych zwierz¹t by³ znacznie ni¿szy, a wartoœæ testu ORT plasowa³a siê na wy¿szympoziomie. Suplementacja diety selenem organicznym jest bardziej efektywna w ochronieb³on plemnikowych ni¿ selenem w formie nieorganicznej. Œwiadczy o tym m.in.znacznie ni¿szy „wyciek” aminotransferazy asparaginianowej z mêskich komórekrozrodczych zwierz¹t ¿ywionych Se organicznym ni¿ zwierz¹t z grupy kontrolnej.Nale¿y równie¿ podkreœliæ, ¿e suplementacja diety knurów selenem organicznym(selenometionina) w iloœci 0,2 mg na 1 kg paszy znacznie poprawia parametrykinetyczne ruchu plemników i ich zdolnoœæ zap³adniaj¹c¹ podczas przechowywaniaw stanie p³ynnym w temperaturze 18°C w porównaniu do knurów ¿ywionychidentycznymi dawkami Se nieorganicznego [11].Podsumowuj¹c, korzystny wp³yw selenu na jakoœæ nasienia wynika przedewszystkim z jego trzech funkcji na poziomie molekularnym a mianowicie:1. Udzia³ w spermatogenezie (koncentracja, ca³kowita liczba plemników w ejakulacie).2. Udzia³ w budowie selenoprotein w obszarze wstawki plemnika (morfologia,ruchliwoœæ).3. Sk³adnik peroksydazy glutationowej w uk³adzie rozrodczym zwierz¹t (statusantyoksydacyjny nasienia).Wp³yw -tokoferolu-Tokoferol (witamina E) jest g³ównym rozpuszczalnym w t³uszczach antyoksydantemb³on komórkowych. Chroni fosfolipidy b³onowe przed peroksydacyjnymdzia³aniem wolnych rodników. Antyoksydacyjne dzia³anie -tokoferoli polega g³ówniena zmiataniu wtórnych wolnych rodników organicznych i terminacji reakcji peroksydacjilipidów.Suplementacja diety -tokoferolem poprzez redukcjê peroksydacji lipidów wzmacniaintegralnoœæ b³on komórkowych plemników i tym samym poprawia zdolnoœæ zap³adniaj¹c¹nasienia [3, 22, 23]. Odnotowano, ¿e siedmiotygodniowe doustne podawanieknurom octanu -tokoferolu (1000 IU na dzieñ) przyczyni³o siê do znacznegowzrostu liczby plemników w 1 cm 3 ejakulatu. Jednoczeœnie istotnie obni¿y³ siê poziomproduktów indukowanej peroksydacji lipidów w plazmie nasienia tych zwierz¹t[3]. Surai i in. [23] wykazali równie¿, ¿e wraz ze wzrostem zawartoœci -tokoferoluw dawce pokarmowej koguta (20, 200 i 1000 mg · kg –1 ) ulegaj¹ obni¿eniu wskaŸnikiindukowanej peroksydacji lipidów w nasieniu, mierzonej zawartoœci¹ TBARS –substancji reaguj¹cych z kwasem tiobarbiturowym (rys. 2). Cytowani autorzy odnotowalitak¿e, ¿e -tokoferol nie tylko znacznie obni¿a wra¿liwoœæ nasienia drobiu naperoksydacjê lipidów, ale tak¿e ju¿ w dawce od 20 mg · kg –1 wywiera wp³yw na statuswielonienasyconych d³ugo³añcuchowych kwasów t³uszczowych w fosfolipidach plemnikowych.Zawartoœæ wa¿nych funkcyjnie kwasów t³uszczowych – 20:4n:6 i 22:4n:6w tych lipidach by³a wysoce skorelowana z poziomem -tokoferolu w nasieniu. Takasuplementacja mia³a równie¿ wp³yw na przegrupowanie sk³adu procentowego po-

86 Z. Luberda-Bieñkowska, A. Majewskaszczególnych klas fosfolipidów plemnikowych. Wzros³a proporcjonalnie zawartoœæfosfatydyloetanoloamin, a zmala³a sfingomielin.Reasumuj¹c, -tokoferol wzmacnia status antyoksydacyjny nasienia poprzezdwa powi¹zane ze sob¹ mechanizmy. Pierwszym z nich jest ochrona przed peroksydacyjnymiuszkodzeniami struktur plemnikowych, drugim natomiast korzystnezmiany w profilu wielonienasyconych kwasów t³uszczowych fosfolipidów b³onkomórkowych plemników [23].Surai i in. [23] zaznaczaj¹ jednoczeœnie, ¿e poprawê statusu antyoksydacyjnegonasienia mo¿na uzyskaæ poprzez suplementacjê dawek ¿ywieniowych -tokoferolemtylko w relatywnie limitowanym zakresie. Dalsze zwiêkszanie tej witaminy w dieciezwierz¹t nie poprawia znacz¹co jakoœci nasienia, a wrêcz zbyt wysokie dawki tejwitaminy stosowane przez d³u¿szy czas mog¹ obni¿yæ zdolnoœæ reprodukcyjn¹ptaków. Potwierdzi³y to tak¿e badania Danikowskiego i in. [6], w których wykazano,¿e pod wp³ywem wysokich dawek – 100, 1000, 10 000 i 20 000 IU -tokoferolu · kg –1diety stosowanych przez 12 miesiêcy nastêpuje wzrost uszkodzeñ morfologicznychplemników oraz obni¿enie koncentracji i ca³kowitej liczby plemników w ejakulaciekoguta. Zawartoœæ -tokoferolu w nasieniu istotnie wzros³a, wraz ze wzrostem zawartoœcitej witaminy w paszy, jednoczeœnie zmala³ poziom produktów peroksydacjilipidów. Mimo wzrostu ochrony antyoksydacyjnej zastosowane w doœwiadczeniuwysokie dawki -tokoferolu wywiera³y negatywny wp³yw na zdolnoœæ zap³adniaj¹c¹nasienia kogutów.Wysokie dawki -tokoferolu (220 IU · kg –1 ) wp³ywaj¹ na obni¿enie stê¿enia prostaglandynyPGF 2 w gruczole prostaty i pêcherzykach nasiennych dojrza³ych knurówRysunek 2. Wp³yw diety kogutów suplementowanej -tokoferolem na wra¿liwoœæ nasieniawobec peroksydacji lipidów; opracowanie w³asne wed³ug danych Surai i in. [23]Wartoœci oznaczone liter¹ a ró¿ni¹ siê od grupy kontrolnej statystycznie istotnie (p 0,001)

Wp³yw selenu … 87[17]. Obni¿enie poziomu prostaglandyn w uk³adzie rozrodczym jest prawdopodobniewynikiem antyoksydacyjnego dzia³ania -tokoferolu, który mo¿e hamowaæ cyklooksygenazow¹peroksydacjê kwasu arachidonowego i syntezê kolejnych nadtlenkowychintermediatów [10].Wp³yw kwasu L-askorbinowego i glutationuKwas L-askorbinowy (witamina C) w wy¿szych stê¿eniach jest znacz¹cymantyoksydantem, w uk³adach biologicznych dziêki silnym w³aœciwoœciom redukcyjnym.Dostêpne dane dotycz¹ce wp³ywu kwasu L-askorbinowego na jakoœæ nasieniazwierz¹t nie s¹ spójne. U knurów nie odnotowano wp³ywu tej witaminy na koncentracjênasienia [1]. U królików, u których analizowano wp³yw kwasu L-askorbinowegoi -tokoferolu w dawkach odpowiednio: 1g·dcm –3 wody i 200 mg · kg –1 paszy najakoœæ nasienia i jego zdolnoœæ zap³adniaj¹c¹ wykazano, ¿e pojedyncza suplementacjatych witamin nie zmieni³a parametrów nasienia. Natomiast ³¹czne podanie obuantyoksydantów w tych samych iloœciach znacz¹co wp³ynê³o na parametry kinetyczneruchu plemników, w tym œredni¹ drogê przebyt¹ przez plemniki w jednostce czasu(z 57,09 do 60,73 μm · s –1 ), jednak¿e nie mia³o to wp³ywu na wskaŸnik zap³adnialnoœci[5]. Bardziej wyrazisty wp³yw kwasu L-askorbinowego na jakoœæ nasieniakrólików uzyskano podczas suplementacji wody do picia jeszcze wy¿szymi dawkamitej witaminy (1,5g·dcm –3 ) ³¹cznie z -tokoferolem (1g·dcm –3 ). Pod wp³ywem tychwitamin nast¹pi³a redukcja peroksydacji lipidów w plazmie nasienia. Dodatek antyoksydantówznacz¹co zwiêkszy³ objêtoœæ ejakulatów, koncentracjê nasienia, ogóln¹liczbê ruchliwych plemników przy jednoczesnym obni¿eniu liczby martwych i uszkodzonychmêskich komórek rozrodczych. Istotnie obni¿y³y siê w plazmie nasieniaaktywnoœci enzymów: aminotransferazy alaninowej, aminotransferazy asparaginianowejoraz dehydrogenazy mleczanowej, podczas gdy aktywnoœæ transferazy glutationowejuleg³a znacznemu wzrostowi [24]. Je¿eli chodzi o nasienie drobiu to nieodnotowano oddzia³ywania kwasu L-askorbinowego na podstawowe jego parametry.Suplementacja rozcieñczalnika do przechowywania nasienia indora w stanie p³ynnymwitamin¹ C w iloœciach 1–400 μg · cm –3 nie mia³a wp³ywu na takie cechy nasieniajak: ruchliwoœæ i prze¿ywalnoœæ plemników oraz integralnoœæ plazmolemy [7].Jednym z wa¿nych niskocz¹steczkowych antyoksydantów jest tripeptyd – glutation,który swoje w³aœciwoœci antyoksydacyjne zawdziêcza obecnoœci grupy tiolowej– SH. Peptyd ten wystêpuje zarówno w plemnikach jak i plazmie nasienia zwierz¹t.Podstawow¹ funkcj¹ glutationu jest ochrona komórek przed stresem oksydacyjnymspowodowanym w szczególnoœci peroksydacj¹ lipidów plazmolemy [15]. Jednoznaczniewykazano, ¿e peptyd ten hamuje procesy peroksydacji lipidów w plazmienasienia knura [3]. Wykazano równie¿, ¿e egzogenny glutation dodawany do inseminacyjnegomedium podczas zap³odnienia oocytów œwini in vitro poprzez swoje

88 Z. Luberda-Bieñkowska, A. Majewskaw³aœciwoœci „zmiatacza” wolnych rodników wp³ywa pozytywnie na proces zap³odnieniai wczesn¹ embriogenezê [2]. U buhaja wp³yw egzogennego glutationu nazap³odnienie in vitro zale¿y od jego stê¿enia w stosowanych mediach oraz od cechosobniczych dawcy nasienia [12].Wnioski1. Selen i niskocz¹steczkowe antyoksydanty wywieraj¹ pozytywny wp³yw na jakoœæi wartoœæ biologiczn¹ nasienia zwierz¹t gospodarskich z tym, ¿e wielkoœætych zmian zale¿y od rodzaju i dawki suplementu, a tak¿e od rasy i cech osobniczychzwierzêcia.2. Wzbogacenie diety ¿ywieniowej samców selenem skutkuje wzrostem liczbymêskich komórek rozrodczych. Poprawia ruchliwoœæ, morfologiê oraz zdolnoœæzap³adniaj¹c¹ plemników. Wp³ywa równie¿ na wzrost aktywnoœci peroksydazyglutationowej w nasieniu.3. Suplementacja diety zwierz¹t gospodarskich selenem organicznym w postaciselenoaminokwasów wp³ywa znacznie korzystniej na jakoœæ nasienia ni¿ Senieorganicznym.4. -Tokoferol wzmacnia status antyoksydacyjny nasienia poprzez funkcjê prewencyjn¹wobec peroksydacji lipidów w plemnikach i plazmie nasienia oraz korzystnywp³yw na status wielonienasyconych kwasów t³uszczowych w fosfolipidachplemnikowych.5. Najkorzystniejsze efekty rozrodcze uzyskuje siê je¿eli selen jest aplikowany³¹cznie z -tokoferolem.6. Glutation i kwas L-askorbinowy równie¿ wywieraj¹ pozytywny wp³yw na jakoœænasienia równie¿ poprzez swoje w³aœciwoœci antyoksydacyjne.Literatura[1] Audet I., Laforest J.P., Martineau G.P., Matte J.J. 2004. Effect of vitamin supplements on some aspects ofperformance, vitamin status, and semen quality in boars. J. Anim. Sci. 82: 626–633.[2] Boquest A.C., Abeydeera L.R., Wang W.H., Day B.N. 1999. Effect of adding reduced glutathione duringinsemination on the development of porcine embryos in vitro. Theriogenology 51: 1311–1319.[3] Brzeziñska-Œlebodziñska E., Œlebodziñski A.B., Pietras B., Wieczorek G. 1995. Antioxidant effect of vitamin Eand glutathione on lipid peroxidation in boar semen plasma. Biol. Trace Element Res. 47: 69–74.[4] Calvin H.J., Grosshans K., Musciant-Shikora S.R., Turner S.J. 1987. A developmental study of rat sperm andtestis selenoproteins. J. Reprod. Fertil. 81: 1–11.[5] Catellini C., Lattaioli P., Bernardini M. 1999. Effect of dietary supplementation with -tocopheryl acetate andascorbic acid on qualitative characteristics and fertilizing ability of rabbit semen. World Rabbit Sci. 7(4):217–220.[6] Danikowski S., Sallmann H.P., Halle I., Flachowsky G. 2002. Influence of high levels of vitamin E on semenparameters of cocks. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 86: 376–382.[7] Donoghue A.M., Donoghue D.J. 1997. Effects of water- and lipid-soluble antioxidants on turkey spermviability, membrane integrity, and motility during liquid storage. Poultry Sci. 76: 1440–1445.

Wp³yw selenu … 89[8] Estienne M.J., Harper A.F., Knighty W., Speight S. 2009. Enhanced fertility in boars fed diets supplementedwith Sel- Plex® selenium. Livestock Update, February, 1–7 Virginia Polytechnik Institute and State University,US.[9] Hawkes W.C., Alkan Z., Wong K. 2009. Selenium supplementation does not affect testicular seleniumstatus orsemen quality in North American men. J. Androl. 20 (5): 525–533.[10] Hope W.C., Dalton C., Machlin L.J., Filipski R.J., Vane F.M. 1975. Influence of dietary vitamin E onprostaglandin biosynthesis in rat blood. Prostaglandins 10: 557–571.[11] Jacyno E., Ko³odziej A., Kawêcka M., Kamyczek M., Pietruszka A., Elzanowski C. 2005. Reproductiveperformance of young boars receiving during their rearing inorganic or organic selenium + vitamin E in diets.Electron. J. Pol. Agric. Univ. 8(1): 1–8. «http://www.ejpau.media.pl/».[12] Kim I.H., Van-Langendonckt A., Van-Soom A., Vansoose G., Casi A.L., Hendriksen P.J.M. 1999. Effect ofexogenous glutathione on the in vitro fertilization of bovine oocytes. Theriogenology 52: 537–547.[13] Ko³odziej A., Jacyno E. 2004. Effect of dietary selenium and vitamin E supplementation on reproductiveperformance of young boars. Electron. J. Pol. Agric. Univ. 7(1): 1–8. «http://www.ejpau.media.pl/»[14] Luberda Z., Strze¿ek J. 1990. Wybrane aspekty peroksydacji lipidów w nasieniu. Post. Nauk Roln. 4/5/6:95–107.[15] Luberda Z. 2005. The role of glutathione in mammalian gametes. Reprod. Biol. 5(1): 5–17.[16] Marin-Guzman J., Mahan D.C., Chung Y.K., Pate J.L., Pope W.F. 1997. Effects of dietary selenium and vitaminE on boar performance and tissue responses, semen quality, and subsequent fertilization rates in mature gilts. J.Anim. Sci. 75: 2994–3003.[17] Marin-Guzman J., Mahan D.C., Pate J.L. 2000. Effect of dietary selenium and vitamin E on spermatogenicdevelopment in boars. J. Anim. Sci. 78: 1537–1543.[18] Marin-Guzman J., Mahan D.C., Whitmoyer R. 2000. Effect of dietary selenium and vitamin E on ultrastructureand ATP concentration of boar spermatozoa, and the efficacy of added sodium selenite in extended semen onsperm motility. J. Anim. Sci. 78: 1544–1550.[19] Seremak B. 1999. Wp³yw comiesiêcznych iniekcji selenu na jakoœæ nasienia tryków w ci¹gu roku. Fol. Univ.Agric. Stetin. 194 Zootechnica 37: 63–68.[20] Sikka S.C. 2001. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. Curr. Med. Chem. 8:851–862.[21] Strze¿ek J., £apkiewicz S., Lecewicz M. 1999. A note on antioxidant capacity of boar seminal plasma. Anim.Sci. Pap. Rep. 17(4): 181–188.[22] Surai P., Kostjuk I., Wishart G., Macpherson A., Speake B.K., Noble R.C., Inov I., Kutz E. 1997. Effect ofvitamin E and selenium supplementation of cockerel diets on glutathione peroxidase activity and lipidperoxidation susceptibility in sperm, testes, and liver. Biol. Trace Element Res. 64: 119–132.[23] Surai P., Kutz E., Wishart G. J., Noble R.C., Speake B.K. 1997. The relationship between the dietary provisionof - tocopherol and the concentration of this vitamin in the semen of chicken: effects on lipid composition andsusceptibility to peroxidation. J. Reprod. Fertil. 110: 47–51.[24] Yousef M.I., Abdallah G.A., Kamel K. I. 2003. Effect of ascorbic acid and vitamin E supplementation on semenquality and biochemical parameters of male rabbits. Anim. Reprod. Sci. 76(1–2): 99–111.

90 Z. Luberda-Bieñkowska, A. MajewskaEffect of selenium and low-molecular weightantioxidants on the semen quality of farm animalsKeywords: animals semen, antioxidant status, selenium, -tocopherol,L-ascorbic acid, glutathioneSummaryThis paper reviews recent results of research regarding the effect of selenium andseveral antioxidants on quality characteristics of farm animal semen. Administrationof selenium with -tocopherol significantly enhances the antioxidant status of semen.-Tocopherol plays a key role in protecting spermatozoa against lipid peroxidation.Selenium has a positive effect on the activity of glutathione peroxidase, which is oneof the antioxidant enzymes occurring in semen. Selenium is essential for normalspermatogenesis. The function of selenium is mediated by selenoproteins, which arestructural component of the sperm midpiece, and are required for normal sperm morphologyand motility. Furthermore, selenium is involved in sperm-egg fertilizationprocesses. The contributions of other antioxidants, such as L-ascorbic acid, andglutathione to the antioxidant defense system of the semen have been also addressed.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 91–104Ekspresja genu GnRHi genu receptora GnRH (GnRHR)w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym owcyw ró¿nych stanach fizjologicznych*Magdalena Ciechanowska 1 , Magdalena £apot 1 , Tadeusz Malewski 2 ,Krystyna Mateusiak 1 , Tomasz Misztal 1 , Franciszek Przekop 11 Instytut Fizjologii i ¯ywienia Zwierz¹t im. J. Kielanowskiego PAN, 05-110 Jab³onna,2 Muzeum i Instytut Zoologii PAN, Wilcza 3, 00-679 Warszawae-mail: m.ciechanowska@ifzz.pan.plS³owa kluczowe: owca, podwzgórze, przysadka, GnRH, mRNA GnRH,mRNAGnRHR, receptory: GABA A , -opioidowe, CRH,dopaminowe – DA-2WstêpNiep³odnoœæ, zak³ócenia procesów owulacji i sekrecji gonadotropin s¹ powa¿nymischorzeniami cywilizacyjnymi, stwarzaj¹cymi istotne problemy zarówno medycynieludzkiej jak i weterynaryjnej. Dotychczasowe badania nad rozrodem zwierz¹tprzyczyni³y siê przede wszystkim do wyjaœnienia neuroendokrynnych mechanizmówreguluj¹cych uwalnianie GnRH/LH w ró¿nych stanach fizjologicznych organizmu[26], tak¿e u zwierz¹t hodowlanych utrzymywanych w nieodpowiednich warunkachzootechnicznych (stresogennych), u których obserwowano nawet d³ugotrwa³e zaburzeniacykli estralnych [36]. Analiza ekspresji genu GnRH i genu receptora GnRH(GnRHR) w oœrodkowym uk³adzie nerwowym by³a tematem nielicznych tylko prac.Nie okreœlono jednoznacznie wspó³zale¿noœci, jakie zachodz¹ pomiêdzy poziomamimRNA GnRH i GnRHR w podwzgórzu ssaków.Wydawa³o siê wiêc, ¿e kompleksowa analiza procesów zaanga¿owanych w regulacjêsekrecji gonadotropin na poziomie molekularnym pozwalaj¹ca lepiej zrozumieæ*Za te badania autorzy otrzymali Dyplom Uznania Sekretarza V Wydzia³u Nauk Rolniczych,Leœnych i Weterynaryjnych PAN.

92 M. Ciechanowska i in.Rysunek1. Przekrój przez mózg owcy; czarnymi liniami zakreœlono analizowane struktury;POA – pole przedwzrokowe, AH – przednie podwzgórze, VM – brzuszno-przyœrodkowepodwzgórze, SME – szypu³a/wynios³oœæ poœrodkowa, TH – wzgórze, HD – podwzgórzegrzbietowe, MB – cia³a suteczkowatemechanizmy kontroluj¹ce uwalnianie GnRH z podwzgórza i sekrecjê gonadotropinz przedniego p³ata przysadki mózgowej, powinna byæ przedmiotem kolejnych badañ,zmierzaj¹cych do wyjaœnienia przyczyn zaburzeñ funkcji rozrodczych.Doœwiadczenia, których wyniki przedstawiono w tej pracy przeprowadzono nasamicach owiec rasy Merynos Polski, w ró¿nych okresach cyklu p³ciowego, a na ichwykonanie uzyskano uprzednio stosowne zezwolenia Lokalnej Komisji Etycznej.Poziomy ekspresji genów GnRH i GnRHR w wybranych strukturach obszaruprzedwzrokowo-podwzgórzowego (okolicy przedwzrokowej, przednim podwzgórzu,brzuszno-przyœrodkowym podwzgórzu, szypule/wynios³oœci poœrodkowej) [10] orazw przednim p³acie przysadki mózgowej (rys. 1) okreœlano przy u¿yciu technikiRT-PCR i/lub RT-PCR w czasie rzeczywistym (Real Time-PCR) i wyra¿ano wzglêdemgenu referencyjnego – dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH).Niniejsze doœwiadczenia stanowi³y pierwszy etap badañ molekularnych mechanizmówzaanga¿owanych w kontrolê sekrecji GnRH/LH u owcy, a maj¹c na uwadzetylko nieliczne istniej¹ce wyniki badañ nad ekspresj¹ genu GnRH w podwzgórzuowcy [19, 38] oraz brak informacji o ekspresji genu receptora GnRH w tej strukturzei jego ewentualnej funkcji w regulacji ekspresji genu GnRH w ró¿nych stanachfizjologicznych mia³y one charakter poznawczy.

Ekspresja genu GnRH … 93Ekspresja mRNA GnRH i mRNA GnRHR w uk³adziepodwzgórzowo-przysadkowym oraz sekrecja LHu anestralnych owiec i samic w cyklu estralnymRysunek 2. Schemat oddzia³ywañ uk³adów neuralnych zlokalizowanych w ró¿nych obszarachmózgu na aktywnoœæ sekrecyjn¹ GnRH/LH: + – aktywacja, – – hamowanie, PVN – j¹droprzykomorowe, CeA – jadro œrodkowe cia³a migda³owatego, EOP – uk³ad opioidergiczny, POA– pole przedwzrokowe, ARC – jadro ³ukowate, 5-HT – serotonina, CRH – kortykoliberyna, DYN– dynorfina, NE/E – uk³ad noradrenergiczny, POMC – uk³ad proopiomelanokortykotropowy,GABA – kwas γ-amino-mas³owy, DA – dopaminaW badaniach w³asnych wykazano po raz pierwszy obecnoœæ mRNA GnRHRw podwzgórzu owcy oraz okreœlono wspó³zale¿noœci miêdzy poziomami ekspresjiGnRH i GnRHR (rys. 3) a uwalnianiem LH w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowymw ró¿nych stanach fizjologicznych. Stwierdzono tak¿e, ¿e poziomy transkryptuobu genów zawsze by³y wy¿sze u owiec w fazie cia³ka ¿ó³tego i prawie zawsze w faziepêcherzykowej, ni¿ u osobników anestralnych. [10, 5, 9, 31] (rys. 3). Tak¿e poziomLH w surowicy krwi estralnych samic by³ istotnie wy¿szy ni¿ odnotowany u zwierz¹tw sezonowym anestrus.Badania nad neuroendokrynn¹ regulacj¹ sekrecji gonadotropin u owcy wykaza³y,¿e ró¿nice w sekrecji GnRH/LH w okresie rozrodczym i sezonie anestralnym s¹ powodowanezarówno zmianami aktywnoœci uk³adów neuralnych podwzgórza kontroluj¹cychuwalnianie GnRH (rys. 2), jak i zró¿nicowanym w poszczególnych stanach

94 M. Ciechanowska i in.Rysunek 3. Poziomy mRNA GnRH (A) i mRNA GnRHR (B) w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowymowiec anestralnych oraz w fazach: cia³ka ¿ó³tego i pêcherzykowej cyklu estralnegoLegenda: POA – okolica przedwzrokowa, AH – przednie podwzgórze, VM – brzuszno-przyœrodkowepodwzgórze, SME – szypu³a/wynios³oœæ poœrodkowa, AP – przedni p³at przysadkimózgowej.*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001.fizjologicznych wp³ywem tych uk³adów na aktywnoœæ neuronów gonadoliberyny [1,11, 16, 17, 25, 30, 41, 42, 45, 46]. Nasze obecne prace udokumentowa³y, ¿e regulacjauwalniania GnRH/LH mo¿e zachodziæ na poziomie genomowym i anga¿owaæ liczneoœrodkowe mechanizmy, odmienne w ró¿nych stanach fizjologicznych [9].

Ekspresja genu GnRH … 95Wp³yw stresu na ekspresjê mRNA GnRH i GnRHR orazsekrecjê LH w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym owiecw poszczególnych fazach cyklu p³ciowegoFizjologiczne wspó³zale¿noœci, charakterystyczne dla poszczególnych okresówcyklu rozrodczego, mog¹ jednak podlegaæ powa¿nym zaburzeniom u zwierz¹t poddanychdzia³aniu stresu. W omawianych doœwiadczeniach jako czynnik stresogennyzastosowano ³agodne impulsy pr¹du elektrycznego [9] przekazywane na przedniekoñczyny zwierzêcia z przerwami: przez 3 godziny podczas jednego dnia (streskrótkotrwa³y), lub przez 5 godzin dziennie przez 4 kolejne dni (stres o przed³u¿onymdzia³aniu). Wykazano, ¿e stres wywiera ró¿ny wp³yw na ekspresjê obu badanychgenów, a charakter obserwowanych zmian zale¿y od stanu fizjologicznego zwierzêciaoraz czasu oddzia³ywania bodŸca stresogennego (tab. 1). U owiec anestralnych zarównostres krótkotrwa³y, jak i stres o przed³u¿onym dzia³aniu powodowa³y wzrostpoziomów mRNA GnRH i mRNA GnRHR w podwzgórzu oraz mRNA GnRHRw przednim p³acie przysadki mózgowej. Wzrost sekrecji LH stwierdzono tylkou owiec poddanych krótkotrwa³emu dzia³aniu stresora [31].Tabela 1. Wp³yw krótkotrwa³ego i przed³u¿onego stresu* na poziomy mRNA GnRH i GnRHRw uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym oraz na stê¿enie LH w surowicy krwi anestralnychowiec (A) i samic w fazie pêcherzykowej cyklu estralnego (B)Obszar Stres krótkotrwa³y Stres przed³u¿onymRNA GnRH mRNA GnRHR mRNA GnRH mRNA GnRHRA B A B A B A BPOA ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ ↑AH ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓VM ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓SME nd nd ↑ ↑ nd nd ↑ ↓AP nd nd ↑ ↑ nd nd ↑ ↓A B A BLH ↑ ↑ — ↓* Czynnikiem stresogennym by³y ³agodne impulsy pr¹du elektrycznego o natê¿eniu 3 mAprzekazywane na przednie koñczyny zwierzêcia w ci¹gu 0,5 s., po których nastêpowa³a 1 s.przerwy. Po 20 min. dzia³anie stresora przerywano na 40 min., po których nastêpowa³o kolejne20 min. dra¿nienia; stres krótkotrwa³y: 3 godz. w ci¹gu 1 dnia (08:00–11:00); stres przed³u¿ony:5 godz. dziennie przez 4 kolejne dni (08:00–13:00); ↑ – podwy¿szenie poziomu, ↓ – obni¿eniepoziomu, — – brak istotnych zmian, nd – nie wykazano.GnRHR – receptor GnRH, POA – okolica przedwzrokowa, AH – przednie podwzgórze, VM –brzuszno-przyœrodkowe podwzgórze, SME – szypu³a/wynios³oœæ poœrodkowa AP – przednip³at przysadki mózgowej. Grupê kontroln¹ stanowi³y owce niestresowane.U owiec w fazie pêcherzykowej cyklu estralnego stres krótkotrwa³y podwy¿sza³poziom mRNA GnRH i mRNA GnRHR, natomiast stres o przed³u¿onym dzia³aniuobni¿a³ ekspresjê tych genów w podwzgórzu [10], z wyj¹tkiem genu GnRHRw okolicy przedwzrokowej, w której stwierdzono podwy¿szony poziom mRNAGnRHR. Podobny kierunek zmian poziomu ekspresji genu GnRH i genu GnRHR

96 M. Ciechanowska i in.w podwzgórzu ze zmianami uwalniania LH sugeruje, ¿e przed³u¿ony stres mo¿ezak³ócaæ procesy owulacji nie tylko przez zmiany uwalniania GnRH/LH w uk³adziepodwzgórzowo-przysadkowym, ale tak¿e poprzez zmiany biosyntezy GnRH orazaktywnych form receptora tego neurohormonu [10]. Dok³adne wyjaœnienie mechanizmówtego zjawiska wymaga dalszych badañ nad okreœleniem powi¹zañ, jakiezachodz¹ miêdzy poziomami pierwotnego transkryptu i mRNA cytoplazmatycznego,który podlega procesowi translacji.Wyniki badañ w³asnych sugeruj¹ ponadto, ¿e pod³o¿em zró¿nicowanych w odpowiedzina stres poziomów mRNA GnRH i GnRHR jest zmieniaj¹ca siê, w zale¿noœciod stanu fizjologicznego zwierzêcia, aktywnoœæ uk³adów neuralnych podwzgórza. Zatakim pogl¹dem przemawiaj¹ tak¿e obserwacje nad ekspresj¹ genów GnRH i GnRHRw podwzgórzu szczurów [23, 34, 44] poddanych czynnikom stresogennym.Z nielicznych doœwiadczeñ przeprowadzonych na szczurach wynika, ¿e podwzgórzoweuk³ady neuralne, które uczestnicz¹ w aktywacji lub hamowaniu uwalnianiaGnRH, moduluj¹ tak¿e ekspresjê genów GnRH i GnRHR [13, 22, 24, 25, 27–29,39, 43]. Dla bardziej wnikliwej analizy mechanizmów, poprzez które stres zak³ócasekrecjê gonadotropin i procesy owulacji u zwierz¹t, przeœledzono wp³yw uk³adówGABA-ergicznego, -endorfinergicznego i CRH-ergicznego na poziomy mRNAGnRH i mRNAGnRHR u owiec w fazie pêcherzykowej cyklu estralnego. W tym celudokonywano aktywacji lub blokowania receptorów GABA A -ergicznych, -opioidergicznych,CRH-ergicznych poprzez oœrodkowe infuzje ich specyficznych agonistówlub antagonistów. Ma³e dawki tych zwi¹zków by³y infundowane do III komorymózgu w sposób pulsacyjny przez 5 godzin dziennie podczas 3 kolejnych dni,pocz¹wszy od 14 dnia cyklu.Wp³yw aktywacji i zablokowania receptorów GABA Aw podwzgórzu na poziomy mRNA GnRH i mRNA GnRHRw uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym oraz na sekrecjê LHu owiec w fazie pêcherzykowej cyklu estralnegoWykazano, ¿e aktywacja receptorów GABA A poprzez dokomorowe infuzje muscimolu(specyficzny agonista receptorów GABA A ) powoduje istotne obni¿enie ekspresjimRNA GnRH i mRNA GnRHR w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowymoraz sekrecji LH z komórek gonadotropowych przedniego p³ata przysadki mózgowej[4]. Wzrost poziomów mRNA GnRH i mRNA GnRHR wyst¹pi³ natomiast u owiec,którym infundowano bikukulinê (specyficzny antagonista receptorów GABA A ) (tab. 2).U zwierz¹t tych stwierdzono tak¿e podwy¿szone stê¿enia LH w surowicy krwi [4].Uzyskane wyniki sugeruj¹, ¿e GABA dzia³aj¹c przez mechanizm GABA A -receptorowy,mo¿e hamowaæ uwalnianie GnRH/LH poprzez udzia³ w regulacji biosyntezyGnRH i GnRHR [4].

Ekspresja genu GnRH … 97Tabela 2. Wp³yw aktywacji lub blokowania receptorów µ-opioidowych (A), GABA A (B), CRH(C) na poziomy mRNA GnRH i GnRHR w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym oraz nastê¿enie LH w surowicy krwi owiec w fazie pêcherzykowej cyklu estralnego*A B C-endorfina nalokson muscimol bikukulina CRH antagonista CRHGnRH GnRHR GnRH GnRHR GnRH GnRHR GnRH GnRHR GnRH GnRHR GnRH GnRHRPOA — — AH — — —VM — — SME nd nd — nd nd nd nd AP nd nd — nd nd nd nd LH — *Infuzje do III komory mózgu przeprowadzano w sposób pulsacyjny, w odstêpach 40 min. przez5 godz. dziennie {08.00–13.00} podczas 3 kolejnych dni pocz¹wszy od 14 dnia cyklu estralnego{14–16 dzieñ}. Owce kontrolne otrzymywa³y 2 l p³ynu Ringera na minutê. Owcom doœwiadczalnyminfundowano odpowiednio: -endorpfinê, nalokson (antagonista receptorów -opioidowych),muscimol (agonista receptorów GABA A ), bikukulinê (antagonista receptorów GABA A )CRH lub antagonistê CRH (-helical CRH 9-41 ). Zwierzêta otrzymywa³y 20 µg odpowiedniegozwi¹zku na 1 ml p³ynu Ringera, a dawka wynosi³a 4 g dziennie na osobnika; w porównaniuz owcami kontrolnymi: – podwy¿szenie poziomu, – obni¿enie poziomu, — – brak istotnychzmian, nd – nie wykazano.GnRHR – receptor GnRH, POA – okolica przedwzrokowa, AH – przednie podwzgórze,VM – brzuszno-przyœrodkowe podwzgórze, SME – szypu³a/wynios³oœæ poœrodkowa AP – przednip³at przysadki mózgowej.Wp³yw dokomorowych infuzji -endorfiny lub naloksonuna ekspresjê mRNA GnRH i mRNA GnRHR w uk³adziepodwzgórzowo-przysadkowym oraz na sekrecjê LH u owiecw fazie pêcherzykowej cyklu estralnegoPodobnie jak muscimol, tak¿e -endorfina obni¿y³a poziomy mRNA GnRH wewszystkich analizowanych strukturach podwzgórza, co wskazuje, ¿e zarówno uk³ad-endorfinergiczny jak i GABA-ergiczny hamuj¹ sekrecjê gonadotropin w cykluestralnym, nie tylko przez obni¿enie uwalniania GnRH, ale tak¿e poprzez zahamowaniebiosyntezy tego hormonu. Aktywacja receptorów µ-opioidowych indukowa³a te¿ró¿ne zmiany poziomów transkryptu GnRHR w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym:wzrost poziomu mRNA GnRHR w okolicy przedwzrokowej, znaczne obni-¿enie wartoœci tego wskaŸnika w brzuszno-przyœrodkowym podwzgórzu/szypule wynios³oœcipoœrodkowej oraz w przednim p³acie przysadki mózgowej [7] (tab. 2).Wydaje siê zatem, ¿e hamowanie uwalniania GnRH przez -endorfinê w fazie pêcherzykowejcyklu zachodzi na poziomie genomowym, poprzez wp³yw tego neuromodulatorana biosyntezê GnRH i jego bia³ka receptorowego.

98 M. Ciechanowska i in.Infuzje antagonisty receptora -opioidowego (naloksonu) nie wp³ynê³y w sposóbistotny na poziomy transkryptu ¿adnego z badanych genów. Prawdopodobnie u¿ytaw niniejszych doœwiadczeniach dawka tego zwi¹zku by³a zbyt niska, aby skuteczniewy³¹czyæ aktywnoœæ opioidergiczn¹. Dane literaturowe wskazuj¹, ¿e wysokie dawkinaloksonu infundowane do III komory mózgu powoduj¹ wzrost sekrecji LH u owiec[33]. Interpretuj¹c brak wp³ywu naloksonu na uwalnianie LH nale¿y jednak uwzglêdniæfakt, ¿e u szczurów [20] i u owiec [16] w póŸnej fazie pêcherzykowej cykluestralnego, aktywnoœæ uk³adu -endorfinergicznego w brzuszno-przyœrodkowympodwzgórzu ulega drastycznemu obni¿eniu; w okresie, w którym dochodzi dofizjologicznego spadku aktywnoœci tego uk³adu, oddzia³ywanie antagonisty receptora-opioidowego mo¿e byæ ma³o skuteczne.Wp³yw CRH i antagonisty CRH na ekspresjê mRNA GnRHi mRNA GnRHR w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowymoraz na sekrecjê LH u owiecw fazie pêcherzykowej cyklu estralnegoMimo ¿e wp³yw uk³adu CRH-ergicznego na sekrecjê GnRH/gonadotropin by³intensywnie badany u ró¿nych gatunków zwierz¹t [3, 15, 35], dotychczas nie by³oinformacji o wp³ywie CRH na ekspresjê genu GnRH i genu receptora GnRH w uk³adziepodwzgórzowo-przysadkowym in vivo. Wyniki naszych badañ, przeprowadzonychna owcach w fazie pêcherzykowej cyklu estralnego, wykaza³y po raz pierwszy,¿e przed³u¿ona aktywacja receptorów CRH w podwzgórzu obni¿a poziomy mRNAGnRH w tej strukturze, natomiast zablokowanie tych receptorów zwiêksza ekspresjêgenu GnRH. Zarówno aktywacja jak i zablokowanie receptorów CRH wywiera³ytak¿e wp³yw na ekspresjê genu GnRHR w poszczególnych strukturach podwzgórzai gruczole przysadki. Infuzja CRH do III komory mózgu zwiêkszy³a poziom mRNAGnRHR w okolicy przedwzrokowej i zmniejszy³a wartoœci tego wskaŸnika w pozosta³ychobszarach. Zablokowanie receptorów CRH wywiera³o przeciwstawny wp³ywna poziomy transkryptu genu receptora w porównaniu z odnotowanym po ich aktywacji.Neuroendokrynne mechanizmy, które prowadz¹ do zró¿nicowanej ekspresjimRNA GnRHR w odpowiedzi na CRH nie s¹ znane. Wiadomo jednak, ¿e receptoryGnRH s¹ zlokalizowane w ró¿nych strukturach podwzgórza owcy, a ich wp³yw naekspresjê genu GnRH i/lub uwalnianie gonadoliberyny prawdopodobnie anga¿ujeprawdopodobnie obecne tam liczne uk³ady neuralne. Te obszarowo specyficznezmiany w poziomie ekspresji genu receptora mog¹ byæ wynikiem odmiennej w poszczególnychstrukturach lokalizacji GnRHR. Nie wykluczone bowiem, ¿e receptoryGnRH s¹ obecne na komórkach ró¿nych uk³adów neuralnych, wykazuj¹cych zró¿-nicowan¹ wra¿liwoœæ na CRH. Wydaje siê tak¿e, ¿e poziom ekspresji genu receptoramo¿e byæ w znacznej mierze zale¿ny od aferentnego dop³ywu sygna³ów z ró¿nychoœrodków podwzgórza do komórek wykazuj¹cych ekspresjê GnRHR.

Ekspresja genu GnRH … 99Zmniejszenie lub zwiêkszenie poziomów mRNA GnRHR w przednim p³acieprzysadki mózgowej pod wp³ywem CRH lub antagonisty CRH wydaj¹ siê byænastêpstwem odpowiednio zmniejszonego lub zwiêkszonego uwalniania GnRH z podwzgórza.Wyniki te sugeruj¹, ¿e obni¿ona lub wzmo¿ona sekrecja LH z przysadki poaktywacji lub zablokowaniu receptorów CRH w podwzgórzu jest zapocz¹tkowana napoziomie genomowym przez kompleksowe oddzia³ywanie CRH na ekspresjê genuGnRH i genu GnRHR.Wp³yw uk³adu dopaminergicznego na poziomy mRNAGnRH i mRNA GnRHR w uk³adziepodwzgórzowo-przysadkowym oraz na sekrecjê LHu anestralnych owiecU owcy, gatunku o sezonowym charakterze rozrodczym, stan anestralny indukowanywyd³u¿on¹ faz¹ œwietln¹ zwi¹zany jest przede wszystkim ze wzrostem aktywnoœciuk³adu dopaminergicznego w podwzgórzu, który w okresie d³ugiego dniawywiera hamuj¹cy wp³yw na uwalnianie GnRH/LH [1, 2, 12, 18, 46]. Badania w³asnedowodz¹, ¿e wzrostowi sekrecji LH po zablokowaniu receptorów dopaminergicznychDA-2 w podwzgórzu anestralnych owiec, towarzysz¹ istotne zmiany w ekspresjigenów GnRH i GnRHR [6]. Uzyskane wyniki sugeruj¹, ¿e obni¿enie sekrecji LHw sezonie anestralnym jest nastêpstwem nie tylko obni¿onego uwalniania GnRH, lecztak¿e zmniejszonej syntezy tego dekapeptydu. Zablokowanie receptora dopaminergicznegoDA-2 spowodowa³o obni¿enie poziomu mRNA GnRH w brzuszno-przyœrodkowympodwzgórzu. Wydaje siê jednak, ¿e nie by³o ono wynikiem zmniejszonejaktywnoœci transkrypcyjnej tego genu, lecz konsekwencj¹ wykorzystania transkryptuw procesie biosyntezy bia³ka oraz uwalniania hormonu z granul neurosekrecyjnychdo naczyñ wrotnych kr¹¿enia podwzgórzowo-przysadkowego. Potwierdzeniem s³usznoœcitakiego przypuszczenia jest odnotowany w niniejszych doœwiadczeniach istotnywzrost poziomu mRNA GnRHR w komórkach gonadotropowych przysadki.Wiadomo bowiem, ¿e poziom aktywnych form receptora b³onowego w gonadotropachdeterminuje zdolnoœæ odpowiedzi tych komórek na GnRH.Wydaje siê równie¿, ¿e obni¿enie poziomu mRNAGnRHR w brzuszno-przyœrodkowympodwzgórzu/szypule wynios³oœci poœrodkowej prowadzi do zmniejszonejbiosyntezy GnRHR; zmniejszenie gêstoœci aktywnych form receptora GnRH w tejstrukturze umo¿liwia prawdopodobnie umo¿liwia wzrost uwalniania GnRH. Zatakim pogl¹dem przemawia fakt, ¿e aktywacja GnRHR w brzuszno-przyœrodkowympodwzgórzu u szczurów prowadzi do zmniejszonego uwalniania GnRH z zakoñczeñaksonalnych GnRH w tej strukturze [14, 40]. Dokomorowe infuzje sulpirydu (specyficznyantagonista receptorów dopaminergicznych DA-2) stymulowa³y ekspresjêgenu GnRHR w okolicy przedwzrokowej i przednim podwzgórzu anestralnych owieci nie powodowa³y istotnych zmian poziomów mRNA GnRH w tych strukturach.Wyjaœnienie fizjologicznego znaczenia wspó³zale¿noœci miêdzy mRNA GnRHa mRNA GnRHR w tych obszarach wymaga jednak dalszych badañ.

100 M. Ciechanowska i in.Wp³yw dokomorowych infuzji ma³ych dawek GnRHna ekspresjê mRNA GnRH i mRNA GnRHR w uk³adziepodwzgórzowo-przysadkowym oraz na sekrecjê LHu anestralnych owiecWyniki badañ in vivo i in vitro wskazuj¹, ¿e podwzgórzowy GnRH poprzezmechanizm ultrakrótkiego ujemnego sprzê¿enia zwrotnego mo¿e hamowaæ uwalnianieGnRH z zakoñczeñ neuralnych w podwzgórzu szczurów [14, 40]. Brak jestpog³êbionych badañ nad wyjaœnieniem tego zjawiska na poziomie molekularnym.Pierwsze prace wykonane na anestralnych owcach wykaza³y, ¿e ma³e dawki GnRHinfundowane do III komory mózgu powoduj¹ podwy¿szenie poziomu mRNA GnRHw brzuszno przyœrodkowym podwzgórzu oraz mRNA GnRHR we wszystkich analizowanychstrukturach uk³adu podwzgórzowo-przysadkowego [32]. Ten wzrost ekspresjimRNA obu badanych genów, odnotowany w niniejszym uk³adzie doœwiadczalnym,mo¿e byæ zapowiedzi¹ wzmo¿onej biosyntezy GnRH i receptora tegoneurohormonu lub jedynie zwiêkszonej stabilnoœci transkryptów. Zmiany mRNAGnRH w brzuszno-przyœrodkowym podwzgórzu i mRNA GnRHR w brzuszno przyœrodkowympodwzgórzu/szypule wynios³oœci poœrodkowej po infuzji GnRH by³yprzeciwstawne do obserwowanych w tych strukturach po zablokowaniu receptoradopaminergicznego DA-2. Maj¹c na uwadze fakt, ¿e wy³¹czenie oœrodków dopaminergicznychzwiêkszy³o uwalnianie GnRH/LH, mo¿na przypuszczaæ, ¿e infundowanydokomorowo GnRH powoduje zmiany na poziomie genomowym, zmniejszaj¹cbiosyntezê GnRH i zwiêkszaj¹c syntezê GnRHR. Zwiêkszenie aktywnych form receptoraGnRH mo¿e wywieraæ hamuj¹cy wp³yw na uwalnianie GnRH w wynios³oœcipoœrodkowej. Potwierdzenie lub zaprzeczenie takiej sugestii wymaga jednak dalszychbadañ nad wp³ywem aktywacji i blokowania receptora GnRH w podwzgórzuw ró¿nych stanach fizjologicznych na poziomy mRNA GnRH i mRNA GnRHRw uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym owcy i uwalnianie GnRH/LH.PodsumowanieWyniki badañ nad regulacj¹ sekrecji gonadotropin na poziomie genomowymu owcy wykaza³y po raz pierwszy obecnoœæ mRNA GnRHR w ró¿nych strukturachpodwzgórza. Obecnoœæ transkryptu GnRH-R w podwzgórzu owcy mo¿e sugerowaæudzia³ receptora w regulacji biosyntezy GnRH w neuronach podwzgórza i/lub uwalnianianeurohormonu na ich zakoñczeniach. Wydaje siê bowiem, ¿e receptory GnRHs¹ obecne w ró¿nych strukturach podwzgórza owcy, a ich wp³yw na ekspresjê genuGnRH i/lub uwalnianie gonadoliberyny mo¿e anga¿owaæ obecne tam liczne uk³adyneuralne.

Ekspresja genu GnRH … 101Stwierdzono tak¿e, ¿e poziomy ekspresji genów GnRH i jego receptora w podwzgórzuoraz genu receptora GnRHR w przednim p³acie przysadki mózgowej zmieniaj¹siê w zale¿noœci od stanu fizjologicznego owiec. Stres w specyficzny sposóbmoduluje ekspresjê obu genów; wp³yw stresu zale¿y od fazy cyklu rozrodczego orazczasu oddzia³ywania bodŸca stresogennego.Uk³ady neuralne: GABA-ergiczny, -endorfinergiczny i CRH-ergiczny hamuj¹ceuwalnianie GnRH/LH w cyklu estralnym obni¿aj¹ tak¿e poziom mRNA genu GnRHw podwzgórzu i wp³ywaj¹, lecz w ró¿ny sposób, na ekspresjê genu receptora w tejstrukturze i w przednim p³acie przysadki mózgowej. Ta zró¿nicowana w poszczególnychobszarach podwzgórza ekspresja mRNA GnRHR mo¿e sugerowaæ, ¿ereceptory GnRH s¹ obecne w ró¿nych uk³adach neutralnych oraz ¿e poziom ekspresjigenu receptora mo¿e byæ w znacznej mierze zale¿ny od aferentnego dop³ywu sygna-³ów z ró¿nych oœrodków podwzgórza do komórek wykazuj¹cych ekspresjê GnRHR.Zmiany poziomów transkryptu dla GnRH i GnRHR w poszczególnych strukturachuk³adu podwzgórzowo-przysadkowego anestralnych owiec wywo³ane dzia³aniemantagonisty receptorów dopaminergicznych DA-2 oraz infuzjami niskich dawek GnRHwskazuj¹, ¿e wp³yw dopaminy i GnRH na aktywnoœæ wydzielnicz¹ uk³adu GnRH/LHw sezonowym anestrus mo¿e zachodziæ tak¿e na poziomie genomowym.Zró¿nicowana ekspresja genów zarówno GnRH jak i jego receptora, obserwowanaw poszczególnych strukturach podwzgórza badanych owiec mo¿e wynikaæz odmiennej aktywnoœci transkrypcyjnej tych genów, stabilnoœci/degradacji transkryptówi/lub poziomu biosyntezy GnRH i aktywnych form jego receptora.Literatura[1] Adams V.L., Goodman R.L., Salm A.K., Coolen L.M.,Karsch F.J., Lehman M.N. 2006. Morphologicalplasticity in the neural circuitry responsible for seasonal breeding in the ewe. Endocrinology 147: 4843–4851.[2] Bertrand F., Thiery J-C., Picard S., Malpaux B. 1999. Implication of DA-2 like dopaminergic receptors in themedian eminence during establishment of long-day of LH secretion in the ewe. J. Endocrinol. 163: 243–254.[3] Caraty A., Miller D.W., Delaleu B., Martin B. 1997. Stimulation of LH secretion in sheep by centraladministration of corticotrophin-releasing hormone. J. Reprod. Fertil. 111: 249–257.[4] Ciechanowska M., £apot M., Malewski T., Mateusiak K., Misztal T., Przekop F. 2008. Effect of GABA Areceptor modulation on the expression of GnRH gene and GnRH receptor (GnRH-R) gene in the hypothalamusand GnRH-R gene in the anterior pituitary gland of follicular phase ewes. Anim. Reprod. Sci. 111: 235–248.[5] Ciechanowska M., £apot M., Malewski T., Mateusiak K., Misztal T., Przekop F. 2008. Expression of the GnRHand GnRH receptor (GnRH-R) genes in the hypothalamus and GnRH-R gene in the anterior pituitary gland ofanestrous and luteal phase ewes. Anim. Reprod. Sci. 108: 345–355.[6] Ciechanowska M., £apot M., Malewski T., Mateusiak K., Misztal T., Przekop F. 2008. Implication ofdopaminergic system on GnRH and GnRH-R genes expression in the hypothalamus and GnRH-R geneexpression in the anterior pituitary gland of anestrous ewes. Exp. Clin. Endocrinol. Diab.116: 357–362.[7] Ciechanowska M., £apot M., Malewski T., Mateusiak K., Misztal T., Przekop F. 2008. The central of-endorphin and naloxone on the expression of GnRH gene and GnRH receptor (GnRH-R) gene in the anteriorpituitary gland in follicular phase ewes. Exp. Clin. Endocrinol. Diab. 116: 40–46.[8] Ciechanowska M., £apot M., Malewski T., Mateusiak K., Misztal T., Przekop F. The effects of CRF and itsantagonist on the expressionj of GnRH gene and GnRH receptor (GnRH-R) gene in the hypothalamus andGnRH-R in the anterior pituitary gland of follicular phase ewes. Neuroendocrinol. Let. (w druku).

102 M. Ciechanowska i in.[9] Ciechanowska M., £apot M., Malewski T., Mateusiak K., Przekop F. 2010. Neuroendocrine regulation ofGnRH release, and expression of GnRH and GnRH receptor (GnRH-R) genes in the hypothalamic-pituitaryunit. Reprod. Biol. 10: 85–124.[10] Ciechanowska M., £apot M., Malewski T., Misztal T., Mateusiak K., Przekop F. 2007. Effect of stress on theexpression of GnRH and GnRH receptor (GnRH-R) genes in the preoptic area-hypothalamus and GnRH-R genein the stalk/median eminence and anterior pituitary gland in the ewes during follicular phase of the estrous cycle.Acta Neurobiol. Exp. 67: 1–12.[11] Conover C.D., Kuljis R.O., Rabii J., Advis J.B. 1993. -endorphin regulation of luteinizing hormone-releasinghormone release at the median eminence in ewes: immunocytochemical and physiological evidence. Neuroendocrinology57: 1182–1195.[12] Curlevis J.D., Naylor A.M., Mac Neilly A.S. 1992. Evaluation of a possible role dopamine D 1 and D 2 receptorsin the steroid-dependent suppression of luteinizing hormone secretion in the seasonally anestrous ewes.Neuroendocrinology 3: 387–391.[13] Fueshko S.M., Key S., Wray S. 1998. Luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) neurons maintaining innasal explants decrease LHRH messenger ribonucleic acid levels after activation of GABA A receptors.Endocrinology 139: 2734–2740.[14] De Paolo L.V., King R.A., Corollo A.J. 1987. In vivo and in vitro examination of autoregulatory mechanism forluteinizing hormone-releasing hormone. Endocrinology 120: 272–279.[15] Dobson H., Ghuman S., Prabhakar S., Smith R. 2003. A conceptual model of the influence of stress on femalereproduction. Reproduction 125: 151–163.[16] Domañski E., Chomicka L.K., Ostrowska A., Gajewska A., Mateusiak K. 1991. Release of luteinizing hormonereleasing hormone, -endorphin and norepinephrine by the nucleus infundibularis-median eminence duringperiovulatory period in the sheep. Neuroendocrinology 54: 151–158.[17] Goodman R.J., Robinson J, E., Kendrick K.M., Dyer R.G. 1995. Is the inhibitory action of estradiol onluteinizing hormone pulse frequency in anestrous ewes mediated by noradrenergic neurons in the preoptic area?Neuroendocrinology 61: 284–292.[18] Goodman R.L., Thiery J.E., Delaleu B., Malpaux B. 2000. Estradiol increases multiunit activity in the A 15 areaof ewes exposed to inhibitory photoperiod. Biol. Reprod. 63: 1352–1357.[19] Harris T.G., Robinson J.E., Evans N.P., Skinner D.C., Herbison A.E. 1998. Gonadotropin-releasing hormonemessenger ribonucleic acid expression changes before the onset of the estradiol induced luteinizing hormonesurge in the ewe. Endocrinology 139: 57–64.[20] Herbison A.E. 1998. Multimodal influence of estrogen upon gonadotropin-releasing hormone neurons. Endocr.Rev. 19: 302–329.[21] Jansen H.T., Cutter C., Hardy S., Lehman M.N., Goodman R.L. 2003. Seasonal plasticity within the gonadotropin-releasinghormone system in the ewe: changes in identified GnRH inputs and glial association.Endocrinology 144: 3663–3676.[22] Kang S.M., Seong J.Y., Cho S., Cho H., Kim K. 1995. Acute increases of GABAergic neurotransmission exertsa stimulatory effect on GnRH gene expression in the preoptic/anterior hypothalamus area of ovariectomizedestrogen and progesterone treated adult female rats. Neuroendocrinology 61: 486–492.[23] Kang S.S., Kim S.R., Leonhardt S., Jarry H., Wuttke W., Kim K. 2000. Effect of interleukin-1 on gonadotropinreleasing hormone (GnRH) and GnRH receptor gene expression in castrated male rats. Neuroendocrinology 12:421–429.[24] Kim K., Lee B.J., Cho B.N., Kang S.S., Choi W.S., Park S.D., Lee C.C., Cho W.K., Wuttke W. 1994. Blockadeof the noradrenergic neurotransmission with diethylodithiocarbonic acid decreases the mRNA level of gonadotropin-releasinghormone in the hypothalamus of ovariectomized steroid treated prepubertal rats. Neuroendocrinology59: 539–544.[25] Kim K., Lim S., Cho B.N., Kang S.S., Lee B.J., Choi K.H., Chung C.H., Lee C.C., Cho W.K., Wuttke W. 1993.A partial blockade of catecholaminergic neurotransmission with 6-hydroxydopamine decreases mRNA level ofgonadotropin-releasing hormone in the male rat hypothalamus. Neuroendocrinology 58: 146–152.[26] Kochman K., Przekop F., Okrasa S. 2007. Oœrodkowa regulacja neuralna procesów rozrodczych w: „Fizjologicznaregulacja procesów rozrodczych samicy”. Krzymowski T. (red.) Wydawnictwo Uniwersytetu Warmiñsko-Mazurskiegow Olsztynie: 21–46[27] Leonhardt S., Seong J.Y., Kim K., Thorun J., Wuttke W. 1995. Activation of central GABA A but not GABA Breceptors rapidly reduces pituitary LH release and gene expression in the preoptic/anterior hypothalamic area ofovariectomized rat. Neuroendocrinology 61: 655–662.

Ekspresja genu GnRH … 103[28] Li S., Pelletier G. 1993. Chronic administration of muscimol and protobarbital decreases gonadotropin-releasinghormone mRNA levels in male rat hypothalamus determined by quantitative in situ hybridization. Neuroendocrinology58: 136–139.[29] Li S., Pelletier G. 1995. Inhibitory effect of the pential octadecaneuropeptide (ODN), on gonadotropin-releasinghormone gene expression in the male rat brain. NeuroReport 6: 1354–1356.[30] Lincoln G.A. 2002. Neuroendocrine regulation of seasonal gonadotropin and prolactin rhythms: lesson fromSoay ram model. Reproduction, Suppl. 59: 131–141.[31] £apot M., Ciechanowska M., Malewski T., Mateusiak K., Misztal T., Przekop F. 2007. The effect of stress onthe expression of GnRH and GnRH receptor genes in the discrete regions of the hytpothalamus and pituitary ofanestrous ewes. Reprod. Biol.7: 55–71.[32] £apot M., Ciechanowska M., Malewski T., Mateusiak K., Misztal T., Przekop F. 2008. Changes in mRNAGnRH and mRNA GnRH receptor (GnRH-R) levels in the hypothalamic-anterior pituitary unit of anestrousewes after infusion of GnRH into third cerebral ventricle. Reprod. Biol. 8: 149–161.[33] Misztal T., Romanowicz K., Barcikowski B. 2002. Effect of melatonin on daily LH secretion in intact andovariectomized ewes during the breeding season. Anim. Reprod. Sci. 69: 187–198.[34] Nappi R.E., Rivest S. 1997. Effect of immune and metabolic challenges on luteinizing hormone-releasinghormone neural system in cycling female rats: an evaluation at the transcriptional level. Endocrinology 138:1374–1384.[35] Polkowska J., Przekop F. 1997. The effect of corticotropin-releasing factor (CRF) on the gonadotropin-releasinghormone (GnRH) hypothalamic neuronal system during preovulatory period in the ewe. Acta Neurobiol.Exp. 57: 93–99.[36] Przekop F. 2007. Stres i jego wp³yw na procesy rozrodcze zwierz¹t. W: „Fizjologiczna regulacja procesówrozrodczych samicy”, Krzymowski T. (red.) Wydawnictwo Uniwersytetu Warmiñsko-Mazurskiego w Olsztynie:421–431.[37] Rivest S., Riwier C. 1995. The role of corticotropin-releasing factor and interleukin-1 in the regulations ofneurons controlling reproductive function. Endocr. Rev. 16: 177–199.[38] Robinson J.E., Healey A.E., Harris T.G., Messent E.A., Skinner D.C., Taylor J.A., Evans N.P. 2000. Thenegative feedback action of progesterone on luteinizing hormone release is not associated with changes inGnRH mRNA in neurons of rostral diencephalons in the rat. J. Endocrinol. 124: 285–289.[39] Roth C., Jung K., Kim K., Arias P., Moguilevsky J., Jarry H., Leonhardt S., Wuttke W. 1997. Involvement ofgamma amino butyric acid (GABA) in the postnatal function of the pulse generator as determined on the basis ofGnRH and GnRH-receptor gene expression in the hypothalamus and pituitary. Exp. Clin. Endocrinol. Diab.105: 353–358.[40] Sarkar D.K. 1987. In vitro secretion of LHRH in ovariectomized rats is regulated by a possible autofeedbackmechanism. Neuroendocrinology 45: 510–513.[41] Scott C.J., Cummis J.T., Clarke I.J. 1992. Effect on plasma luteinizing hormone levels of microinjection ofnorepinephrine and adrenaline into the septo-preoptic area of the brain of the ovariectomized ewes, changeswith season and chronic estrogen treatment. Journal of Neuroendocrinology 4: 131–141.[42] Scott C.J., Clarke I.J. 1993. Inhibition of luteinizing hormone secretion in ovariectomized ewes during thebreeding season by -aminobutyric acid (GABA) is mediated by GABA-A receptors but not GABA-Breceptors. Endocrinology 132: 1789–1796.[43] Seong J.Y., Jarry H., Kühnemuth S., Leonhardt S., Wuttke W. 1995. Effect of GABAergic compound ongonadotropin releasing hormone receptor gene expression in the rat. Endocrinology 136: 2587–2593.[44] Tanebe K., Nishijo A., Maraguchi A., Ono T. 2000. Effect of chronic stress on hypothalamic interleukin-1b,interleukin-2, and gonadotropin-releasing hormone gene expression in ovariectomized rats. J. Neuroendocrinol.12: 13–21.[45] Tomaszewska-Zaremba D., Przekop F. 2005. Effect of GABA B receptor modulation on gonadotropin-releasinghormone and -endorphin release, and on the catecholaminergic activity in the ventromedial hypothalamus-infundibularnucleus region of anestrous ewes. J. Neuroendocrinol. 17: 49–56.[46] Tortonese D.J. 1999. Interaction between hypothalamic dopaminergic and opioidergic systems in the photoperiodicregulation of pulsatile luteinizing hormone secretion in sheep. Endocrinology 140: 750–757.

104 M. Ciechanowska i in.Expression of the GnRH and GnRH receptor(GnRHR) genes in hypothalamus-pituitary systemof ewes during different physiological statesKey words: ewe, hypothalamus, pituitary, GnRH, mRNA GNRH, mRNAGnRHR, receptors: GABA A -ergic, -opioidergic, CRH-ergic,dopaminergic DA-2SummaryThis review is focused on the relationship between the neuroendocrine control ofGnRH/LH secretion and the expression of GnRH and GnRHR genes in the hypothalamic-pituitarysystem during different physiological states of animals and under thestress conditions. In this aspect we analyzed the role of several neurotransmitter/neurohormonesystems in the hypothalamus, i.e. the controlling of GnRH releaseand the expression of GnRH and GnRHR genes.The results obtained on sheep and rats showed that the expression of both genes insome physiological states is to a high degree related to LH secretion but not in others.The neural systems in the hypothalamus, which are involved in the suppression ofGnRH/LH secretion (-endorphinergic, GABA-ergic, CRH-ergic) in the cyclingewes, also inhibit GnRH mRNA expression in the hypothalamus. The infusion of-endorphin, muscimol (GABA A receptor agonist) and CRH decreases GnRH geneexpression. However, agonists and antagonists of -opioidergic, GABA A -ergic andCRH-ergic receptors affect in a specific way the expression of GnRHR gene in discreteareas of the hypothalamus of follicular phase ewes. Thus suggests, that theGnRHR genes of selected hypothalamic structures are located in different neural systems.In the anestrous ewes the increase of LH secretion was followed with the decreasein GnRH mRNA in the ventromedial hypothalamus and GnRHR mRNA in theventromedial hypothalamus/stalk-median eminence after the blockade of dopaminergicDA-2 receptors in the hypothalamus. It is likely that these events are related to anincrease in biosynthesis GnRH with concomitant decreased of GnRHR protein in thehypothalamus allowing to an increase in GnRH release. The increase of GnRH mRNAin the ventromedial hypothalamus after a prolonged infusion of small GnRH dosesinto the third cerebral ventricle suggests that the ultrashort loop of the negative feedbackaction of GnRH in the hypothalamus on the GnRH release is exerted at thegenomic level.Much more information is necessary to establish the precise manner in which severalneurotransmitter/neurohormone systems in the hypothalamus regulate GnRH andGnRHR genes expression and the role of GnRHR mRNAin GnRH gene expression.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 105–120Prawna ochrona odmian roœlinw Unii Europejskiej i USA – system sui generisTomasz Zimny 1 , S³awomir Sowa 21 Instytut Nauk Prawnych PAN, Zak³ad Prawa Prywatnego00-330 Warszawa; ul. Nowy Œwiat 72e-mail: tzimny@inp.pan.pl2 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin,Zak³ad Biotechnologii i Cytogenetyki RoœlinRadzików, 05-870 B³oniee-mail: s.sowa@ihar.edu.plS³owa kluczowe: odmiany roœlin, regulacje prawne, w³asnoœæ intelektualna,ochrona odmianWstêpPostêp biologiczny w rolnictwie uzale¿niony jest m.in. od efektywnie prowadzonejdzia³alnoœci hodowlanej. O ile hodowla roœlin prowadzona by³a praktycznieod czasów, gdy cz³owiek rozpocz¹³ uprawê, o tyle jako dzia³alnoœæ odrêbna, wyspecjalizowana,pojawi³a siê w XIX w. W przypadku odmian, których powstanie mo¿-liwe by³o dziêki wykorzystaniu œrodków publicznych kwestia op³acalnoœci samejdzia³alnoœci hodowlanej mog³a zejœæ na dalszy plan, a powsta³e w jej wyniku odmianymog³y byæ dostêpne powszechnie. Inaczej sytuacja kszta³towa³a i kszta³tuje siêw przypadku odmian wyhodowanych przez podmioty prywatne b¹dŸ dziêki ichœrodkom. W tym przypadku musi istnieæ mechanizm pozwalaj¹cy im na zwrotzainwestowanych funduszy. Œrodkiem s³u¿¹cym temu celowi by³o stworzenie systemuochrony odmian roœlin, który pozwala hodowcom na ograniczenie swobodywykorzystywania tworzonych przez nich odmian przez inne podmioty, a przedewszystkim pozwala im, przynajmniej teoretycznie, na pobieranie op³at od osóbwykorzystuj¹cych sk³adniki chronionych odmian. Pierwsze europejskie uregulowaniaw tym zakresie pojawi³y siê w latach 40. i 50. XX w. [18].Wraz z pojawieniem siê w hodowli roœlin nowych metod in¿ynierii genetyczneji biotechnologii zmianie zaczê³o ulegaæ równie¿ podejœcie urzêdów patentowych dokwestii ochrony odmian za pomoc¹ patentów. Doprowadzi³o to do sytuacji, w którejhodowcy mog¹, w pewnym zakresie, otaczaæ nowe odmiany tak¿e ochron¹ patentow¹.

106 T. Zimny, S. SowaMimo postêpuj¹cej harmonizacji, miêdzy regulacjami obowi¹zuj¹cymi w ró¿nychczêœciach globu, doszukaæ siê mo¿na szeregu istotnych ró¿nic, które rzutuj¹ na sytuacjêhodowców czy rolników. Ró¿nice takie, przek³adaj¹ce siê na zakres uprawnieñ przys³uguj¹cychwspomnianym grupom, wystêpuj¹ na przyk³ad miêdzy uregulowaniamiobowi¹zuj¹cymi w Stanach Zjednoczonych Ameryki i Unii Europejskiej.W ostatnich latach prawo w³asnoœci intelektualnej przesz³o kilka istotnych przemian.Polega³y one nie tylko na tym, ¿e ochron¹ zaczêto otaczaæ dobra do tej pory niechronione, ale równie¿ na tym, ¿e ochrona ta udzielana by³a w coraz wiêkszej liczbiekrajów. Ochrona w³asnoœci intelektualnej ma istotny wp³yw na rozwój danej ga³êzigospodarki. Z jednej strony mo¿e ów rozwój stymulowaæ zapewniaj¹c inwestorommo¿liwoœæ czerpania zysków z dokonanych inwestycji, z drugiej strony mo¿e tenrozwój hamowaæ, ograniczaj¹c przep³yw informacji czy mo¿liwoœæ wykorzystaniachronionych technologii [5].Obecnie mo¿na wyró¿niæ dwa g³ówne modele ochrony interesów hodowców.W ramach pierwszego z nich tworzy siê tzw. systemy sui generis, czyli systemyswoiste, tworzone specjalnie po to, aby chroniæ odmiany roœlin. Charakteryzuj¹ siêone szczególnym zestawem przes³anek udzielenia ochrony oraz szczególnym sposobemukszta³towania zakresu ochrony i praw hodowców. Drugim sposobem ochronyjest wykorzystanie systemu patentowego. Przepisy prawa patentowego modyfikujesiê na ogó³ w pewnym stopniu, aby lepiej nadawa³y siê do ochrony wynalazków,jakimi s¹ wynalazki biotechnologiczne. Zarówno przes³anki udzielenia ochrony, jaki jej zakres oparte s¹ na systemie ochrony patentowej. Oba modele ró¿ni¹ siê miêdzysob¹ zarówno pod wzglêdem przedmiotu ochrony, jak i jej zakresu.Art. 27.3 lit. b Porozumienia w sprawie Handlowych Aspektów Praw W³asnoœciIntelektualnej (TRIPS od ang. Trade Related Aspects of Intellectual Property Rights)nakazuje stronom wprowadzenie patentowego systemu ochrony odmian roœlin b¹dŸsystemu sui generis, b¹dŸ ich kombinacji. Systemy sui generis zosta³y zaprojektowanepo to, aby chroniæ interesy hodowcy za pomoc¹ prawa do odmiany. Dlatego te¿ aktyprawne implementuj¹ce taki system zawieraj¹ szereg regulacji odnosz¹cych siê bezpoœredniodo odmian roœlin, zarówno definiuj¹ przes³anki otaczania danej odmianyochron¹ (np. odrêbnoœæ, wyrównanie), jak i okreœlaj¹ sposoby stosowania tej ochrony.Najwa¿niejszy akt prawa miêdzynarodowego w dziedzinie ochrony odmian suigeneris – konwencja UPOV – do roku 1991 przewidywa³ zakaz otaczania odmianochron¹ podwójn¹, tzn. zarówno sui generis, jak i patentow¹. Liczne akty prawapatentowego (np. Konwencja o udzielaniu patentów europejskich – EPC) zawieraj¹wprost wyra¿ony zakaz patentowania odmian roœlin, w zwi¹zku z czym oferowanaprzez nie ochrona odmian jako takich nie jest mo¿liwa i mog¹ byæ one chronionepatentem tylko wtedy, gdy same nie stanowi¹ przedmiotu wynalazku.Niniejszy artyku³ zawiera przegl¹d podstawowych informacji dotycz¹cychochrony interesów hodowców za pomoc¹ praw swoistych, czyli przyznawanychw ramach systemów sui generis.

Prawna ochrona odmian roœlin … 107Konwencja UPOV [7]Podstawowym aktem prawa miêdzynarodowego, który reguluje kwestie ochronyodmian za pomoc¹ praw do odmiany jest Konwencja na rzecz ochrony nowychodmian roœlin (UPOV). Podpisano j¹ w Pary¿u w 1961 r., od tamtego czasu zosta³akilkakrotnie zmieniona, ostatnio w 1991 r. Celem tego aktu jest ochrona nowych odmianroœlin prawem w³asnoœci intelektualnej po to, aby wspieraæ postêp w rolnictwiepoprzez zachêcanie hodowców do tworzenia nowych odmian roœlin. Obecnie stronamikonwencji jest 65 podmiotów, w tym Unia Europejska 1 , Polska i USA.Zgodnie z treœci¹ konwencji, ka¿da ze stron, zobowi¹zana jest do stworzeniainstrumentów umo¿liwiaj¹cych hodowcom ubieganie siê o „prawo hodowcy”, czyliprawo, którego istota wyra¿a siê w tym, ¿e bez zgody hodowcy niedozwolone s¹nastêpuj¹ce dzia³ania dotycz¹ce materia³u do rozmno¿eñ (art. 14): wytwarzanie i rozmna¿anie, przygotowywanie do rozmno¿enia, oferowanie na sprzeda¿, sprzeda¿ lub inne sposoby wprowadzania na rynek eksport, import sk³adowanie w powy¿szych celach [3].Aby uzyskaæ tak¹ ochronê, hodowca 2 musi wytworzyæ odmianê charakteryzuj¹c¹siê nowoœci¹, odrêbnoœci¹, wyrównaniem i trwa³oœci¹. Zgodnie z treœci¹ konwencjiw jej ostatniej wersji ochron¹ mo¿na otoczyæ odmiany dowolnego gatunku, a wiêc nietylko wykorzystywane rolniczo.Hodowca mo¿e uzyskaæ prawo ochronne dla swojej odmiany je¿eli charakteryzujesiê ona nowoœci¹, odrêbnoœci¹, wyrównaniem i trwa³oœci¹. Odmiana zostajeuznana za now¹, jeœli w dniu sk³adania wniosku o przyznanie prawa hodowcymateria³ siewny lub plon roœliny danej odmiany nie zosta³ sprzedany lub w innysposób przekazany innej osobie przez hodowcê lub za jego zgod¹, do celów eksploatacjiodmiany na terytorium umawiaj¹cej siê strony, gdzie z³o¿ony zosta³ wniosek,przed up³ywem roku od daty z³o¿enia wniosku lub czterech (a w przypadku drzewi winoroœli – szeœciu) lat je¿eli wspomniane wprowadzenie na rynek mia³o miejscepoza terytorium pañstwa bêd¹cego stron¹ umowy. Oznacza to, ¿e hodowca, który12To, ¿e Unia Europejska jest stron¹ konwencji nie oznacza automatycznie, ¿e wszyscycz³onkowie UE przyst¹pili do konwencji. Istniej¹ kraje, które nie podpisa³y konwencjiUPOV, ale istnieje w nich system ochrony odmian wprowadzony przez prawo unijne.Zgodnie z art. 1 ust. iv konwencji hodowc¹ jest osoba, która wytworzy³a odmianê lub j¹odkry³a, osoba bêd¹ca pracodawc¹ lub zleceniodawc¹ takiej osoby, je¿eli przewiduje toustawodawstwo strony, a tak¿e nastêpcy prawni wymienionych osób.

108 T. Zimny, S. Sowachce zarejestrowaæ odmianê, co do zasady powinien to zrobiæ najpóŸniej w rok potym, gdy przekaza³ j¹ do eksploatacji.Odmianê uznaje siê za odrêbn¹, jeœli wyraŸnie odró¿nia siê od innych odmian,o których istnieniu powszechnie wiadomo w momencie sk³adania wniosku. Jednoczeœnie,z³o¿enie wniosku o przyznanie prawa ochronnego w dowolnym krajubêd¹cym stron¹ konwencji powoduje, ¿e staje siê ona odmian¹ „o której powszechniewiadomo” w myœl wspomnianego przepisu.Wyrównanie odmiany to cecha przejawiaj¹ca siê w tym, ¿e zale¿nie od ró¿nic,jakich mo¿na siê spodziewaæ ze wzglêdu na zmiennoœæ spodziewan¹ ze wzglêdu naszczególne w³aœciwoœci jej rozmna¿ania, odmiana jest wystarczaj¹co jednolita, jeœlichodzi o jej istotne cechy charakterystyczne [1].Trwa³oœæ odmiany stwierdza siê je¿eli jej istotne cechy pozostaj¹ niezmienione powielokrotnym rozmna¿aniu lub, w przypadku danego cyklu rozmna¿ania, pod koniecka¿dego takiego cyklu.Ochrona rozci¹ga siê równie¿ (z wyj¹tkiem zakazu eksportu, importu i sk³adowaniaw tych celach) na odmiany wywiedzione zasadniczo z innej odmiany, o ilechroniona odmiana nie jest równie¿ odmian¹ zasadniczo wywiedzion¹ 3 .Ponadto chronione s¹ te¿ odmiany, które nie ró¿ni¹ siê wyraŸnie od odmianychronionej oraz odmiany, których wytwarzanie wymaga powtarzalnego u¿ywaniaodmiany chronionej [15]. Innymi s³owy, prawo hodowcy chroni nie tylko konkretn¹odmianê, ale tak¿e np. uzyskiwane dziêki niej odmiany mieszañcowe.Prawo hodowcy mo¿e byæ przyznane na okres co najmniej 20 lat, a w przypadkudrzew i winoroœli – co najmniej 25 lat (art. 19 konwencji).Od generalnej zasady wprowadzanej przez prawo hodowcy istniej¹ jednak pewnewyj¹tki. Trzy z nich wprowadzane s¹ przez konwencjê obowi¹zkowo, zaœ wprowadzenieczwartego zosta³o pozostawione decyzji stron. Zgodnie z art. 15 konwencji,prawo hodowcy nie rozci¹ga siê na: dzia³ania prywatne, dokonywane w celach niekomercyjnych, dzia³ania dokonywane w celach eksperymentalnych, dzia³ania dokonywane w celu wyhodowania nowych odmian, z wyj¹tkiem odmianpochodnych, odmian nie odrêbnych od odmian chronionych oraz sk³adnikówodmian mieszañcowych. (tzw. przywilej hodowlany).3Odmianê uwa¿a siê za zasadniczo wywiedzion¹ z innej odmiany (zwanej „odmian¹macierzyst¹”), je¿eli: jest wywiedziona g³ównie z odmiany macierzystej lub z odmiany,która jest sama wywiedziona g³ównie z odmiany macierzystej, zachowuj¹c przejawzasadniczych w³aœciwoœci, które wynikaj¹ z genotypu lub kombinacji genotypów odmianymacierzystej odró¿nia siê wyraŸnie od odmiany macierzystej i pomijaj¹c ró¿nicewynikaj¹ce ze sposobu wywiedzenia, odpowiada odmianie macierzystej w przejawiezasadniczych w³aœciwoœci, które wynikaj¹ z genotypu lub kombinacji genotypów odmianymacierzystej. Odmian¹ zasadniczo wywiedzion¹ jest wiêc taka odmiana, która macechy odmiany macierzystej i niewiele siê od niej odró¿nia.

Prawna ochrona odmian roœlin … 109Ponadto konwencja przewiduje mo¿liwoœæ wprowadzenia przez pañstwa kolejnegowyj¹tku polegaj¹cego na zezwoleniu rolnikowi na zachowywanie czêœci zebranegoziarna w celu wysiania go na w³asnym polu w nastêpnym sezonie (przywilejfarmerski).Przywilej hodowlanyCelem wprowadzenia tego wyj¹tku od prawa do odmiany jest wspieranie postêpuw hodowli poprzez umo¿liwianie innym hodowcom pracy nad wytworzeniem nowychodmian przy wykorzystaniu ju¿ istniej¹cych. Wyj¹tek ten jest niezwykle wa¿nyz punktu widzenia hodowców, poniewa¿ w pewnym stopniu uniezale¿nia ich odposiadacza praw do odmiany, któr¹ wykorzystuj¹ w swoich pracach. Jednoczeœniestanowi on dosyæ silny wy³om w monopolu posiadacza praw do odmiany.Przywilej farmerski (odstêpstwo rolne)Zachowywanie nasion, b¹dŸ innych czêœci roœlin ze zbiorów, w celu wykorzystaniaich jako materia³u do rozmno¿eñ ma pod³o¿e nie tylko ekonomiczne (pozwalazaoszczêdziæ na op³atach licencyjnych), ale równie¿ uwarunkowane jest wzglêdamitradycji. Praktyka taka jest powszechna w wielu krajach i to od dawna. W zwi¹zkuz tym, w konwencji przewidziano mo¿liwoœæ wprowadzenia przepisów pozwalaj¹cychna zachowywanie materia³u rozmno¿eniowego w celu wykorzystania go wew³asnym gospodarstwie. Poniewa¿ jednak takie ograniczenie monopolu hodowcymo¿e istotnie godziæ w jego interesy ekonomiczne, konwencja nie obliguje stron dowprowadzenia tego przywileju, a ponadto pozwala im na wprowadzanie go w ograniczonymzakresie (np. jedynie odnoœnie do niektórych gatunków roœlin). Kwestiedotycz¹ce warunków, w jakich ów przywilej mo¿e byæ wykorzystywany przezrolników s¹ przedmiotem licznych sporów zostan¹ one szerzej omówione przy okazjianalizy przepisów UE.Wyczerpanie prawa do odmianyInstytucja wyczerpania prawa do odmiany w stosunku do materia³u wprowadzonegona rynek przez hodowcê lub za jego zgod¹ ma na celu umo¿liwienie obrotui swobodnego wykorzystania materia³u przez legalnego nabywcê. Zgodnie z art. 16konwencji, prawo do odmiany nie rozci¹ga siê na dzia³ania dotycz¹ce materia³u odmianychronionej, odmian pochodnych, odmian nieodrêbnych od odmian chronionychoraz sk³adników odmian mieszañcowych, je¿eli materia³ ten zosta³ wprowadzonyna rynek przez hodowcê lub za jego zgod¹, oraz na dzia³ania dotycz¹ce materia³uwywiedzionego z materia³u wprowadzonego na rynek chyba, ¿e dzia³ania te

110 T. Zimny, S. Sowamaj¹ na celu rozmna¿anie tej odmiany lub eksport do kraju, w którym nie podlega³abyona ochronie.Skutkiem rozwi¹zania przyjêtego w konwencji jest to, ¿e materia³ odmiany powprowadzeniu na rynek mo¿e byæ przedmiotem normalnego obrotu, równie¿ z wykorzystaniempoœredników w tym obrocie pod warunkiem, ¿e dzia³ania dotycz¹ce obrotunie maj¹ na celu rozmna¿ania samej odmiany, co w oczywisty sposób godzi³obyw interesy hodowcy. Zakaz eksportu materia³u do krajów, w których odmiana niepodlega³aby ochronie ma przede wszystkim na celu unikniêcie sytuacji, w którejprzepisy o ochronie odmian by³yby omijane w ten sposób, ¿e odmiana rozmna¿anaby³aby w innym kraju, wbrew woli hodowcy i z naruszeniem jego interesów.Stosunek konwencji UPOVdo uregulowañ krajowych b¹dŸ regionalnychPrzedstawiona konwencja obliguje strony do wprowadzenia przepisów, któreumo¿liwi³yby hodowcom uzyskiwanie praw chroni¹cych ich odmiany. W zwi¹zkuz tym akty prawne przyjête w tym zakresie przez strony konwencji oparte s¹ w du¿ejmierze na konwencji UPOV. Zawiera ona bowiem przepisy, które wyznaczaj¹ pewneminimalne warunki ochrony odmian. Przepisy wprowadzane w krajach bêd¹cych jejstronami nie mog¹ przyznawaæ ochrony s³abszej ni¿ okreœlana przez przepisykonwencji. Dotyczy to zarówno przepisów polskich jak i wspólnotowych, czyamerykañskich.Rozporz¹dzenie 2001/94/WEw sprawie wspólnotowego systemu ochrony odmian roœlin [11]Rozporz¹dzenie to wprowadzono w celu zharmonizowania przepisów o ochronieroœlin na terenie Unii Europejskiej. Jak mo¿na siê przekonaæ na podstawie lekturypreambu³y, zosta³o ono wprowadzone z uwzglêdnieniem zarówno konwencji UPOV,jak i porozumienia TRIPS, jak równie¿ EPC. Rozporz¹dzenie wprowadza europejskisystem ochrony odmian, bêd¹cy systemem sui generis. W zwi¹zku z tym, jegopostanowienia oparte s¹ w du¿ym stopniu na konwencji UPOV.Wspólnotowy system ochrony odmian roœlin istnieje równolegle do systemówochrony odmian istniej¹cych w poszczególnych krajach UE [6]. Nie oznacza tojednak, ¿e systemy te s¹ od siebie zupe³nie niezale¿ne. Z art. 92 Rozporz¹dzeniawynika bowiem, ¿e niedopuszczalna jest sytuacja, w której odmiana chronionaprawem wspólnotowym jednoczeœnie by³a chroniona prawem czy patentem krajowym.Otoczenie odmiany ochron¹ w ramach systemu wspólnotowego zamyka wiêcdrogê od ubiegania siê o przyznanie osobnego prawa ochronnego w poszczególnychpañstwach.

Prawna ochrona odmian roœlin … 111Zgodnie z art. 5.1 rozporz¹dzenia, przedmiotem wspólnotowego prawa ochronnegomog¹ byæ „Odmiany wszystkich botanicznych rodzajów i gatunków orazmieszañce miêdzy rodzajami i gatunkami”. Pojêcie „odmiana” oznacza zaœ „zbiorowoœæroœlin jednej botanicznej jednostki systematycznej najni¿szego znanego stopnia,któr¹, niezale¿nie od tego czy w pe³ni odpowiada warunkom przyznania prawa doodmian roœlin, mo¿na: okreœliæ na podstawie przejawianych w³aœciwoœci wynikaj¹cych z okreœlonegogenotypu lub kombinacji genotypów, odró¿niæ od ka¿dej innej zbiorowoœci roœlin na podstawie przejawiania co najmniejjednej wspomnianej w³aœciwoœci,uznaæ za jednostkê systematyczn¹ ze wzglêdu na jej w³aœciwoœæ rozmna¿ania siêbez zmian”.Definicja odmiany zawarta w rozporz¹dzeniu pokrywa siê w zasadzie z definicj¹zawart¹ w art. 1 pkt. vi. konwencji UPOV.W podobny sposób uregulowane zosta³y równie¿ kwestie zwi¹zane z zakresemuprawnieñ przys³uguj¹cych hodowcy 4 . Warto zauwa¿yæ, ¿e w rozporz¹dzniuzdecydowano siê na wprowadzenie przywileju farmerskiego. Z punktu widzenianiniejszego opracowania istotne bêdzie wspomnienie, ¿e autorzy rozporz¹dzeniazdecydowali siê na wprowadzenie przywileju farmerskiego.Ustawodawca europejski zdecydowa³ siê na wprowadzenie tego wyj¹tku odprawa ochronnego, w pewnym stopniu ograniczy³ jednak jego zastosowanie. Przedewszystkim, z przywileju farmerskiego skorzystaæ mog¹ jedynie rolnicy uprawiaj¹cyokreœlone w rozporz¹dzeniu gatunki roœlin 5 . Ponadto jedynie posiadacze ma³ychgospodarstw zwolnieni s¹ z obowi¹zku zap³aty wynagrodzenia posiadaczowi prawado odmiany. Pozostali rolnicy „obowi¹zani s¹ do zap³aty godziwego wynagrodzeniaposiadaczowi; wysokoœæ wynagrodzenia powinna byæ w rozs¹dnym stopniu ni¿szaod wysokoœci wynagrodzenia pobieranego w przypadku umowy licencyjnej naprodukcjê materia³u rozmno¿eniowego tej samej odmiany, na tym samym obszarze” 6 .456Zgodnie z art. 11 hodowc¹ jest osoba, która wyhodowa³a lub odkry³a i rozwinê³a odmianêlub jej nastêpca prawny. Natomiast to, czy za hodowcê bo¿e byæ uznany pracodawca lubzleceniodawca hodowcy zale¿y od przepisów krajowych.Zgodnie z art. 14.2 s¹ to wœród roœlin pastewnych: ciecierzyca pospolita, ³ubin ¿ó³ty,lucerna siewna, koniczyna aleksandryjska, koniczyna perska, groch zwyczajny, bobik,wyka siewna, rajgras w³oski; wœród zbó¿: owies zwyczajny, jêczmieñ. ry¿, kanar, ¿yto,pszen¿yto, pszenica, pszenica durum, orkisz; ponadto przywilej dotyczy ziemniaka orazroœlin oleistych i w³óknistych: rzepaku, rzepiku i lnu oleistego z wy³¹czeniem lnuw³óknistego.To, kogo mo¿na uznaæ za posiadacza ma³ego gospodarstwa zale¿y m.in. od gatunkuroœliny, któr¹ uprawia i mo¿liwoœci produkcyjnych gospodarstwa.

112 T. Zimny, S. SowaPojawia siê tu pytanie o to, jakie wynagrodzenie powinien uiœciæ rolnik, któryzawiera umowê z hodowc¹ i jak powinno byæ ono ustalone. Na to pytanie nie mo¿naudzieliæ jednoznacznej odpowiedzi. Zgodnie z art. 5.3 Rozporz¹dzenia 1768/95w sprawie ustanowienia przepisów wykonawczych w zakresie odstêpstwa rolnegoprzewidzianego w art. 14 ust. 3 rozporz¹dzenia Rady (WE) nr 2100/94 w sprawiewspólnotowego systemu ochrony odmian roœlin [13], „Poziom wynagrodzenia uwa¿asiê za ni¿szy w rozs¹dnym stopniu (…) je¿eli nie przekracza poziomu koniecznegodla ustanowienia b¹dŸ stabilizacji, jako czynnik ekonomiczny okreœlaj¹cy zakreskorzystania z odstêpstwa, racjonalnie zrównowa¿onej proporcji miêdzy korzystaniemz licencjonowanego materia³u rozmno¿eniowego a korzystaniem z materia³u zezbioru poszczególnych odmian objêtych wspólnotowym systemem ochrony odmianroœlin. Proporcjê tak¹ nale¿y uznaæ za racjonalnie zrównowa¿on¹, je¿eli zapewniaposiadaczowi odmiany otrzymywanie, w ca³oœci, prawnie uzasadnionego wynagrodzeniaz tytu³u ca³okszta³tu korzystania z jego odmiany.”Jak ³atwo zauwa¿yæ, przytoczony fragment jest niejasny i trudno wywieœæ z niegojakieœ konkretne dyrektywy okreœlania wysokoœci wynagrodzenia; nie pozwala on naprecyzyjne okreœlenie tej wysokoœci. Pewnych wskazówek mog¹ tu dostarczyæ inneprzepisy oraz orzecznictwo. Wysokoœæ wynagrodzenia za wykorzystanie materia³urozmno¿eniowego w ramach przywileju farmerskiego mo¿e byæ ustalona w umowiemiêdzy hodowc¹ a rolnikiem (wówczas strony maj¹ swobodê w jej okreœlaniu) b¹dŸte¿ na podstawie umów zawartych miêdzy organizacjami posiadaczy a rolnikami.Je¿eli takich umów nie zawarto, to wynagrodzenie powinno wynosiæ 50% (w niektórychprzypadkach 40%) kwot pobranych za licencjonowan¹ produkcjê materia³urozmno¿eniowego najni¿szej kategorii, kwalifikuj¹cego siê do urzêdowej certyfikacjiw odniesieniu do tej samej odmiany, na tym samym obszarze. W kwestii wynagrodzeñwypowiedzia³ siê równie¿ Trybuna³ Sprawiedliwoœci Wspólnot Europejskich w sprawieC-7/05 7 stwierdzaj¹c, ¿e wynagrodzenie rycza³towe wynosz¹ce 80% kwotypobieranej na tym samym obszarze z tytu u licencjonowanej produkcji materia³urozmno¿eniowego najni¿szej kategorii tej samej odmiany nie spe³nia wymogu,zgodnie z którym wynagrodzenie takie powinno byæ „znacz¹co ni¿sze” od kwotypobieranej za licencjonowan¹ produkcjê materia³u rozmno¿eniowego i aby okreœliæw³aœciw¹ stawkê nale¿y uwzglêdniæ sytuacjê danych odmian oraz sytuacjê rozpatrywanegoobszaru 8 .Mimo ¿e nie da siê jednoznacznie okreœliæ wysokoœci op³at za wykorzystywaniemateria³u rozmno¿eniowego w ramach przywileju farmerskiego, to jednak nale¿yzauwa¿yæ, ¿e poza drobnymi rolnikami wszyscy korzystaj¹cy z niego musz¹ zawykorzystanie materia³u uiœciæ jak¹œ op³atê. Ponadto, nale¿y zwróciæ uwagê na to, ¿e78Saatgut-Treuhandverwaltungs GmbH przeciwko Ulrichowi Deppemu i in., 2006/C 178/07.pkt. 28 uzasadnienia.

Prawna ochrona odmian roœlin … 113przywilej farmerski obejmuje materia³ jedynie niektórych gatunków roœlin i nie mo¿ebyæ rozci¹gany na odmiany innych gatunków. Poza tym przywilej ten pozwalajedynie na wykorzystywanie materia³u we w³asnym gospodarstwie, a wiêc niepozwala na udostêpnianie czy sprzedawanie go innym rolnikom.Rozporz¹dzenie 2100/94 przewiduje d³u¿sze okresy ochrony, ni¿ okresy minimalneokreœlone w UPOV. Podstawowy okres ochrony wynosi 25 lat dla odmianwiêkszoœci gatunków, oraz 30 lat dla odmian winoroœli, ziemniaków i drzew.Prawo ochronne przyznawane przez Wspólnotowy Urz¹d do spraw OdmianRoœlin chroni odmianê na terenie ca³ej Unii [2]. Do hodowcy nale¿y decyzja, czyzdecyduje siê na ochronê na podstawie przepisów krajowych, czy te¿ wyst¹pio wspólnotowe prawo ochronne. Nale¿y jednak pamiêtaæ, ¿e decyduj¹c siê naochronê za pomoc¹ prawa wspólnotowego, hodowca uzyskuje jednolit¹ ochronê naca³ym obszarze Unii, natomiast decyduj¹c siê na ochronê za pomoc¹ systemówkrajowych, mo¿e uzyskaæ ró¿ny stopieñ ochrony w ró¿nych krajach, natomiastw Grecji, na Malcie, na Cyprze i w Luksemburgu nie uzyska ochrony, gdy¿ tamkrajowe systemy ochrony odmian nie funkcjonuj¹. Ponadto, decyzja o ochroniew ró¿nych krajach osobno skutkowaæ bêdzie koniecznoœci¹ wnoszenia op³at zaochronê w ka¿dym z tych krajów. Do hodowcy nale¿y decyzja co do tego czy odmianêchroniæ za pomoc¹ systemów krajowych czy systemu wspólnotowego.Op³ata za wniosek wynosi obecnie 900 EUR. Do tej op³aty nale¿y doliczyæjeszcze op³aty za przygotowanie i przeprowadzenie badania technicznego w wysokoœcido 3000 EUR oraz coroczne op³aty za obowi¹zywanie prawa do danej odmiany,w wysokoœci 300 EUR rocznie [11].Dla porównania op³aty pobierane za uzyskanie polskiego prawa do odmianywynosz¹ maksymalnie 500 PLN za z³o¿enie wniosku, 700 PLN za ka¿dy sezonbadania odmiany, 100 PLN za przyznanie prawa oraz 400 PLN za ka¿dy rokobowi¹zywania prawa (w pierwszych 5 latach 200 PLN) [12]. Nale¿y tu jednakzwróciæ uwagê, ¿e prawo unijne gwarantuje ochronê w 27 krajach, zaœ prawo polskie– w Polsce.Amerykañski system sui generis,Ustawa o ochronie odmian roœlin(„Plant Variety Protection Act (PVPA)”)PVPA wprowadzono w USA w 1970 roku. W 1994 r. akt ten uleg³ istotnymzmianom. Jest to akt, który wprowadza system sui generis ochrony odmian roœlin naterytorium Stanów Zjednoczonych. Poniewa¿ USA równie¿ s¹ stron¹ UPOV, postanowieniatego aktu równie¿ zbli¿one s¹ do postanowieñ konwencji.Sprzeda¿ b¹dŸ oferowanie na sprzeda¿ materia³u siewnego roœliny dozwolonejest wy³¹cznie za zgod¹ posiadacza prawa do odmiany. Okres ochrony wynosi dla

114 T. Zimny, S. Sowawiêkszoœci gatunków 20 lat, natomiast w przypadku odmian winoroœli oraz drzew –25 lat.Co ciekawe, hodowca mo¿e wybraæ jeden z dwóch sposobów ochrony swojejodmiany. Pierwszy z nich polega na tym, ¿e do obrotu wprowadzany mo¿e byæ zarównocertyfikowany, jak i niecertyfikowany materia³ siewny danej odmiany. Skutkiemwyboru tego sposobu ochrony jest to, ¿e w razie naruszenia prawa do odmiany hodowcamo¿e wytoczyæ przeciwko naruszaj¹cemu jedynie powództwo cywilne.Drugi sposób polega na tym, ¿e do obrotu mo¿e byæ wprowadzany wy³¹czniecertyfikowany materia³ siewny. Rezultatem wyboru tej opcji jest to, ¿e naruszaj¹cyprawo do odmiany mo¿e równie¿ odpowiadaæ karnie za wprowadzanie do obrotumateria³u siewnego. Odpowiedzialnoœæ ta powstaje na podstawie przepisów federalnejustawy o nasiennictwie (Federal Seed Act).Lista mo¿liwych naruszeñ prawa do odmiany zawarta w art. 111 omawianegoaktu jest zbyt d³uga aby przytaczaæ j¹ w ca³oœci w niniejszym opracowaniu. Wymieniones¹ w niej m.in. takie dzia³ania, jak: sprzeda¿ czy oferowanie do sprzeda¿ymateria³u siewnego chronionej odmiany, dostarczanie materia³u siewnego innejosobie bez poinformowania jej, ¿e odmiana podlega ochronie na podstawie PVPA,rozmna¿anie, w celu sprzeda¿y materia³u, import lub eksport materia³u siewnego itd.Poniewa¿ zmiany w PVPA dokonane w 1994 r. mia³y na celu dostosowanie aktu dowymogów stawianych przez konwencjê UPOV, zakres dzia³añ, których nie wolnodokonywaæ bez zgody posiadacza prawa do odmiany zasadniczo pokrywa siê z zakresemwynikaj¹cym z Konwencji [8].PVPA przewiduje równie¿ mo¿liwoœæ stosowania przywileju farmerskiego, cowiêcej, art. 113 PVPA, w którym te kwestie zosta³y uregulowane nie przewiduje op³atza korzystanie z tego przywileju. Op³aty takie mog¹ byæ jednak wprowadzone przezinne prawo federalne lub stanowe.Przepisy polskieHodowcy polscy mog¹ oczywiœcie wnioskowaæ o przyznanie ich odmianieunijnego prawa ochronnego. Je¿eli z jakiejœ przyczyny hodowca nie jest zainteresowanyochron¹ danej odmiany na terenie ca³ej Unii, mo¿e on skorzystaæ z ochrony napodstawie przepisów krajowych w jednym, b¹dŸ wiêkszej liczbie pañstw.G³ównym polskim aktem prawnym reguluj¹cym kwestie ochrony odmian jestprzyjêta 2003 r. Ustawa o ochronie prawnej odmian [16]. Ustawa ta zosta³a wprowadzonado polskiego porz¹dku prawnego pod wp³ywem dostosowywania prawa polskiegodo prawa wspólnotowego, w zwi¹zku z czym jej uregulowania s¹ zbli¿one douregulowañ zawartych w rozporz¹dzeniu 2100/94/WE i konwencji UPOV. Ustawapolska funkcjonuje jako pewnego rodzaju alternatywa w stosunku do wspomnianegowy¿ej rozporz¹dzenia. Urzêdem zajmuj¹cym siê zarz¹dzaniem polskim systememochrony odmian (m.in. prowadzeniem ksiêgi odmian chronionych oraz badaniem

Prawna ochrona odmian roœlin … 115odrêbnoœci, wyrównania i trwa³oœci) jest Centralny Oœrodek Badania Odmian RoœlinUprawnych (COBORU).Zgodnie z ust. 6 art. 4 ustawy, „wy³¹cznego prawa nie przyznaje siê, je¿eliodmiana zosta³a zg³oszona do ochrony albo jest chroniona przez Wspólnotowy Urz¹dOchrony Odmian Roœlin” . Oznacza to, ¿e je¿eli dana odmiana podlega ochronieustalonej na podstawie przepisów rozporz¹dzenia 2100/94/WE, niemo¿liwe jestotoczenie jej ochron¹ na podstawie przepisów polskich.Ponadto ustawa polska ustala to, kto mo¿e byæ uznawany za hodowcê w tensposób, ¿e jest nim nie tylko ten, kto wyhodowa³ lub odkry³ odmianê i j¹ wyprowadzi ,ale pracodawca tego kogoœ i jego nastêpcy prawni. Je¿eli prawo do odmiany przys³ugujepracodawcy osoby, która odmianê odkry³a i wyprowadzi³a b¹dŸ wyhodowa³a,osobie takiej nale¿y siê wynagrodzenie za korzystanie z odmiany (art. 4a). Wprowadzenietakiej definicji hodowcy stanowi rozstrzygniêcie kwestii, któr¹ w rozporz¹dzeniu2100/94/WE 9 pozostawiono do rozstrzygniêcia pañstwom cz³onkowskim.Od prawa do odmiany istniej¹ wyj¹tki podobne, jak w przypadku rozporz¹dzeniawspólnotowego i konwencji UPOV. Nieco inaczej ni¿ w rozporz¹dzeniu zosta³ jednakuregulowany przywilej farmerski oraz kwestie odp³atnoœci za korzystanie z niego.Otó¿ zgodnie z art. 23 ustawy, „Posiadacz gruntów rolnych mo¿e, za op³at¹ uiszczan¹na rzecz hodowcy, u¿ywaæ materia³u ze zbioru jako materia³u siewnego odmianychronionej wy³¹cznym prawem”. Wyj¹tek ten dotyczy wy³¹cznie wymienionych wustawie gatunków:a) pszenicy zwyczajnej,b) ¿yta,c) jêczmienia,d) pszen¿yta,e) owsa,f) kukurydzy,g) rzepaku ozimego,h) ziemniaka.Ponadto, przywilej nie dotyczy odmian mieszañcowych i odmian powsta³ych zeswobodnego krzy¿owania siê linii gatunków obcopylnych (odmian syntetycznych).Katalog gatunków wymienionych w ustawie jest wiêc nieco inny, ni¿ zawartyw art. 14.2 rozporz¹dzenia 2100/94/WE, w zwi¹zku z czym, hodowca mo¿e zdecydowaæsiê na wybór polskiego systemu ochrony odmian, np. ze wzglêdu na chêæ unikniêciastosowania przywileju farmerskiego w stosunku do odmiany, któr¹ zamierzachroniæ.9Zgodnie z art. 11.4 rozporz¹dzenia „je¿eli hodowca jest pracownikiem, prawo do wspólnotowejochrony odmian roœlin okreœla prawo krajowe w³aœciwe dla stosunku pracy,w ramach którego wyhodowano lub odkryto i rozwiniêto odmianê”.

116 T. Zimny, S. SowaOprócz tego, inaczej zosta³a uregulowana kwestia odp³atnoœci za korzystaniez przywileju farmerskiego. Otó¿ zgodnie z ust. 3 art. 23, „posiadacz gruntów rolnycho powierzchni do 10 ha mo¿e u¿ywaæ materia³u ze zbioru odmiany chronionej wy-³¹cznym prawem, bêd¹cej odmian¹ roœlin, o których mowa w ust. 2 pkt 1, jakomateria³u siewnego bez koniecznoœci uiszczania op³aty na rzecz hodowcy.” Ustawodawcapolski uzale¿ni³, wiêc mo¿liwoœæ bezp³atnego stosowania przywileju farmerskiegowy³¹cznie od powierzchni gospodarstwa, nie zaœ od gatunku uprawianejroœliny i faktycznych mo¿liwoœci produkcyjnych gospodarstwa, jak to ma miejscew przypadku rozporz¹dzenia 2100/94/WE.Nale¿y tu jeszcze wspomnieæ, ¿e zgodnie z art. 37 Ustawy o ochronie prawnejodmian, naruszanie prawa do odmiany stanowi przestêpstwo zagro¿one kar¹ grzywny,ograniczenia wolnoœci b¹dŸ pozbawienia wolnoœci do roku. Taka sama kara groziza oznaczanie nazw¹ odmiany chronionej materia³u siewnego lub materia³u ze zbioruinnej lub nieznanej odmiany.Osoba naruszaj¹ca cudze prawo do odmiany (np. rolnik, który uprawia roœlinydanej odmiany bez uiszczenia op³aty licencyjnej b¹dŸ te¿ niezgodnie z zasadamikorzystania z przywileju farmerskiego) mo¿e siê liczyæ z tym, ¿e poniesie nie tylkoodpowiedzialnoœæ cywiln¹ za takie dzia³ania, ale tak¿e odpowiedzialnoœæ karn¹.Przestêpstwo naruszenia prawa do odmiany mo¿e pope³niæ ka¿da osoba, któraprowadzi okreœlone w ustawie dzia³ania, bez zgody posiadacza prawa do odmiany.Praktyczne aspekty prawnej ochrony odmian w PolsceRolnicy czêsto zapominaj¹, ¿e zgodnie z prawem wy³¹czne prawo hodowcyoznacza, ¿e jedynie hodowcy lub podmioty upowa¿nione mog¹ wytwarzaæ, rozmna-¿aæ, przygotowywaæ do rozmna¿ania, oferowaæ do sprzeda¿y, eksportowaæ, importowaæoraz bezp³atnie przekazywaæ materia³ siewny. Poniewa¿ wielu rolników ci¹glewysiewa nasiona z w³asnego rozmno¿enia udzia³ kwalifikowanego materia³u siewnegow 2009 roku w Polsce wynosi³ tylko 10% dla zbó¿ i 4,5% dla ziemniaków 10 . Dlaporównania w UE przeciêtny udzia³ kwalifikowanych nasion w zasiewach wynosiœrednio 55% dla zbó¿ i 40% dla ziemniaków [17]. Du¿ym problemem dla rynkunasiennego jest sta³e zmniejszanie siê zu¿ycia kwalifikatów w latach 1996–2009, coz kolei wp³ywa na bardzo d³ugi okres wymiany nasion siêgaj¹cy 10 lat dla zbó¿i ponad 20 dla ziemniaków. Sytuacja ta ma miejsce, mimo ¿e op³aty za wykorzystaniekwalifikowanego materia³u w Polsce s¹ niskie w porównaniu z op³atami w innychkrajach UE. Polskie hodowle roœlin rolniczych, chc¹c zmieniæ tê sytuacjê, utworzy³yw 2003 roku Agencjê Nasienn¹ Sp. z o.o., która reprezentuje je w sprawach dotycz¹cychkontroli obrotu materia³em nasiennym.10 Dane IERiG¯.

Prawna ochrona odmian roœlin … 117Dziêki wprowadzeniu dop³at do materia³u siewnego sytuacja na rynku nasionkwalifikowanych nieznacznie siê poprawi³a, jednak udzia³ krajowych odmian w powierzchnireprodukcyjnej stale spada. Spadek udzia³u krajowych odmian w rynkunasiennym w latach 2000–2008 by³ najwiêkszy w przypadku jêczmienia ozimegoz 74% do 18,1%, a przypadku pszenicy z 90% do 55,4% [9]. Rolnicy powinni byæœwiadomi, ¿e stosowanie materia³u kwalifikowanego nie tylko stanowi wa¿ne Ÿród³ofinansowania hodowli, ale jest równie¿ elementem innowacyjnoœci, czego efektemjest lepszy wynik finansowy dla rolnika (mniejsza norma wysiewu, wiêkszy plon,dop³ata z Agencji Rynku Rolnego). Pieni¹dze te w gospodarce rynkowej, w jakiejfunkcjonuj¹ dziœ firmy hodowlane s¹ podstaw¹ do wytwarzania postêpu biologicznego,dziêki któremu nowe, lepsze odmiany mog¹ byæ rejestrowane ka¿degoroku. Ponadto nielegalny obrót nasionami jest nie tylko niezgodny z prawem, alerównie¿ szkodliwy dla firm nasiennych, które s¹ odpowiedzialne za dostarczeniewysokiej jakoœci materia³u siewnego.Rolnicy zapominaj¹ równie¿, ¿e przywilej farmerski dotyczy w Polsce na ogó³gospodarstw o powierzchni poni¿ej 10 ha, a w przypadku odmian chronionychunijnym prawem do odmiany, gospodarstw o powierzchni poni¿ej 30 ha 11 . orazwybranych gatunków roœlin (pszenicy zwyczajnej, ¿yta, jêczmienia, pszen¿yta, owsa,kukurydzy, rzepaku ozimego oraz ziemniaka). Odstêpstwo nie dotyczy odmian mieszañcowychi odmian syntetycznych, czyli powsta³ych ze swobodnego krzy¿owaniasiê linii gatunków obcopylnych, takie nasiona wszyscy rolnicy musz¹ kupowaæ jakokwalifikowane. Poniewa¿ odstêpstwo rolne nie dotyczy równie¿ odmian chronionychinnych gatunków ni¿ wymienione wysiewanie nasion w³asnej produkcji takich gatunkówjest niedozwolone. Jednym z zadañ Agencji Nasiennej Sp. z o.o. jest ograniczeniebezprawnego wykorzystania nasion poprzez licencjonowanie produkcji materia³usiewnego, zbieranie danych dotycz¹cych wykorzystaniu materia³u ze zbiorów w³asnychoraz kontrolê korzystania z odstêpstwa rolnego. Agencja obecnie reprezentujetrzynaœcie firm hodowlanych. Op³aty za wykorzystanie materia³u z w³asnych zbioróws¹ ustawowo okreœlone dla ka¿dej odmiany i wynosz¹ 50% op³aty licencyjnej (odkilku do kilkunastu groszy za kilogram odmian zbó¿ do 5 PLN za 1 kg nasion odmianrzepaku). Obowi¹zkiem ka¿dego rolnika jest sprawdzenie czy dana odmiana jestchroniona oraz jakie s¹ wysokoœci op³at. Informacje takie mo¿na uzyskaæ w Agencji.Firmy hodowlane maja prawo ¿¹dania od rolnika informacji na temat wykorzystaniamateria³u ze zbioru 12 , dlatego rolnik jest zobowi¹zany do wype³nienia formularzawysy³anego przez Agencjê, nawet jeœli nie wykorzysta³ do siewu nasion ze zbioru.11 Jest to powierzchnia przybli¿ona, podawana przez Agencjê Nasienn¹ na podstawie danychdotycz¹cych œrednich plonów pszenicy. Zgodnie z przepisami rozporz¹dzenia 2001/94/WEto czy dany rolnik jest zwolniony z ponoszenia op³aty zale¿y od mo¿liwoœci produkcyjnychgospodarstwa nie zaœ wy³¹cznie od jego powierzchni.12 art. 23a Ustawy o ochronie odmian.

118 T. Zimny, S. SowaUdzielenie takiej informacji jest obowi¹zkiem, a uchylanie siê od przekazaniainformacji stanowi wykroczenie. Agencja wysy³a dwa formularze w zale¿noœci odtego czy wysiewa siê odmianê chronion¹ w Polsce (Agnas-1), czy za pomoc¹wspólnotowego prawa do odmiany (Agnas-2). Wype³nienie formularzy Agnas-1i Agnas-2 jest obowi¹zkiem ka¿dego rolnika, nawet jeœli nie otrzyma ich w danymroku od Agencji. Potrzebne informacje oraz wnioski znajduj¹ siê na stronach internetowych«www.agnas.pl».PodsumowanieSystemy sui generis maj¹ce na celu ochronê odmian by³y wprowadzane w ró¿-nych krajach ju¿ od lat 40. XX wieku. Od wejœcia w ¿ycie konwencji UPOV systemytego rodzaju w wielu krajach s¹ ze sob¹ w du¿ym stopniu zharmonizowane. Pomiêdzysystemami obowi¹zuj¹cymi w ró¿nych krajach wystêpuj¹ jednak pewne istotneró¿nice maj¹ce prze³o¿enie na faktyczny poziom ochrony praw hodowców, a co zatym idzie na ekonomiczne interesy zarówno hodowców jak i rolników.Ró¿nice te dotycz¹ zarówno zakresu jak i okresu ochrony. Zgodnie z konwencj¹UPOV, okres ochrony nie mo¿e byæ krótszy ni¿ 20 lat lub 25 lat odnoœnie do drzewi winoroœli. Takie okresy ochrony zosta³y te¿ wprowadzone w prawie amerykañskim.W prawie unijnym i prawie polskim okresy ochrony wyd³u¿ono do 25 i 30 lat (wprzypadku odmian winoroœli, drzew i ziemniaka).Prawo unijne oraz polskie przewiduj¹ ró¿ne ograniczenia przywilejufarmerskiego. Przywilej okreœlony w przepisach amerykañskich nie zawiera ograniczeñuzale¿nionych od gatunku uprawianej roœliny czy powierzchni gospodarstwa.Z drugiej jednak strony, poniewa¿ w USA mo¿na dosyæ ³atwo chroniæ odmianêzarówno za pomoc¹ systemu sui generis jak i prawa patentowego, który tam przywilejufarmerskiego nie przewiduje, w odniesieniu do wielu odmian rolnik po prostuz tego przywileju nie mo¿e skorzystaæ.Z kolei przepisy wspólnotowego rozporz¹dzenia 2100/94/WE ograniczaj¹ dosyæmocno mo¿liwoœæ skorzystania z przywileju farmerskiego przez rolnika i nak³adaj¹na niego obowi¹zek ponoszenia op³at (ni¿szych ni¿ op³aty licencyjne), ale rolnikbêdzie móg³ skorzystaæ z przywileju farmerskiego równie¿ wówczas, gdy uprawianeprzez niego roœliny chronione bêd¹ patentem. Podobnie sytuacja wygl¹da w Polscechocia¿ polskie przepisy zawieraj¹ inn¹ listê gatunków objêtych przywilejem farmerskimni¿ przepisy wspólnotowe.Nale¿y tu zwróciæ uwagê na fakt, ¿e prawo UE, w odró¿nieniu od polskiego, niepozwala na skorzystanie z przywileju rolnikom uprawiaj¹cym kukurydzê.Istotn¹ cech¹ polskiego prawodawstwa jest równie¿ uznanie wszelkich naruszeñprawa do odmiany za przestêpstwo œcigane z oskar¿enia publicznego.

Prawna ochrona odmian roœlin … 119Omówione wy¿ej uregulowania tworz¹ pewne ramy systemu ochrony prawhodowców. Osobn¹ kwesti¹ jest skutecznoœæ owych uregulowañ, a wiêc praktycznamo¿liwoœæ wyegzekwowania praw przez hodowcê. Mo¿liwoœci te uzale¿nione s¹od ca³ego szeregu czynników takich jak sprawnoœæ funkcjonowania systemu i s³u¿bza to odpowiedzialnych, œwiadomoœæ prawna hodowców i rolników itd. Nale¿yjednak podkreœliæ, ¿e op³aty wynikaj¹ce z ochrony praw hodowców s¹ wa¿nymŸród³o finansowania hodowli i s¹ konieczne do transferu postêpu biologicznego dopraktyki.Literatura[1] Felchner K., Jasiñska K., Lampart M., Marek D. 2009. Ustawa o ochronie prawnej odmian roœlin. Komentarz,K. Felchner (red.), Warszawa: 311 ss.[2] Gacek E.S. 2008. Ochrona prawna odmian roœlin (cz. I). Has³o Ogrodnicze 8: 16–17.[3] Gacek E.S. 2001. Plant variety protection and its implementation in Poland. Plant Breeding and Seed Science45, Supplement: 59–63.[4] Jackson J.A. 2005. Agricultural biotechnology and the privatization of genetic information. Implications forinnovation and equity. The Journal of World Intellectual Property 3(6): 825–848.[5] Kevles D.J. 2002. A history of patenting life in the United States with comparative attention to Europe andCanada. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities: 34 ss.[6] Kiewiet B. 2005. Plant variety protection in the European community. World Patent Information 27: 319–327.[7] Konwencja na rzecz ochrony nowych odmian roœlin (UPOV)«http://www.upov.int/en/publications/conventions/».[8] Kowalski S.P., Ebora R.V., Kryder R.D., Potter R.H. 2002. Transgenic crops, biotechnology and ownershiprights: what scientists need to know. The Plant Journal. 31(4): 417.[9] Marciniak K. 2008. Polska hodowla roœlin w 2008. Hodowla Roœlin i Nasiennictwo nr 4/2008: 14–19.[10] Porozumienie w sprawie Handlowych Aspektów Praw W³asnoœci Intelektualnej, za³¹cznik do porozumieniaw sprawie utworzenia Œwiatowej Organizacji Handlu (WTO), 1994 r.[11] Rozporz¹dzenie 2001/94/WE w sprawie wspólnotowego systemu ochrony odmian roœlin, OJ L 1994.227.1.[12] Rozporz¹dzenie 1238/95 w sprawie ustanowienia zasad wykonawczych stosowania rozporz¹dzenia Rady(WE) nr 2100/94 w odniesieniu do op³at na rzecz Wspólnotowego Urzêdu Odmian Roœlin, OJ L 1995.121.31.[13] Rozporz¹dzenie w sprawie op³at za z³o¿enie wniosku o przyznanie prawa do ochrony wyhodowanej alboodkrytej i wyprowadzonej odmiany, a tak¿e zarobkowego korzystania z niej, badanie odrêbnoœci, wyrównaniai trwa³oœci, przyznanie i utrzymywanie wy³¹cznego prawa, Dz. U. 2004.60.567.[14] Rozporz¹dzenie 1768/95 w sprawie ustanowienia przepisów wykonawczych w zakresie odstêpstwa rolnegoprzewidzianego w art. 14 ust. 3 rozporz¹dzenia Rady (WE) nr 2100/94 w sprawie wspólnotowego systemuochrony odmian roœlin, OJ L 1995.173.18.[15] Sechley K.A, Schroeder H. 2002. Intellectual property protection of plant biotechnology inventions. Trends inBiotechnology 20(11): 456–461.[16] Ustawa o ochronie prawnej odmian Dz. U. 2003.137.1300 z pózn. zm.[17] Wicki L. 2010. Poziom wykorzystania nosników postepu biologicznego w rolnictwie polskim w latach1996–2009 Roczniki Naukowe SERiA T. XII, z. 1: s. 251–256.[18] ¯akowska-Henzler H. 2006. Wynalazek Biotechnologiczny. Przedmiot patentu. Wydawnictwo NaukoweScholar, Warszawa: 396 ss.

120 T. Zimny, S. SowaLegal protection of plant varieties in the EuropeanUnion and the USA – sui generis systemKeywords: plant varieties, legal regulations, intellectual property, plantvariety protectionSummaryGenerally, one can distinguish two major systems of innovations’protection in thefield of plant breeding – the patent system and the so called sui generis system. The latterwas introduced on an international scale by the UPOV convention. The conventionallows breeders to obtain an exclusive right to their newly created variety, provided, itmeets the criteria of novelty, distinctness, uniformity and stability. Using protected varietymaterial in farming is usually connected with an obligation to pay royalties to thebreeder. Despite a worldwide process of harmonization, the regulations existing invarious countries still differ in some significant respects. This article describes the suigeneris systems in the USA and EU, points out to differences and also provides generalinformation on some practical aspects of plant variety protection in Poland.

Postêpy Nauk Rolniczych nr 4/2010: 121–131Biotesty w badaniach toksykologicznychi ekotoksykologicznych*£ukasz Sikorski, Barbara AdomasKatedra Ochrony Powietrza i Toksykologii Œrodowiska,Uniwersytet Warmiñsko-Mazurski w Olsztynie10-720 Olsztyn, R. Prawocheñskiego 17e-mail: badomas@uwm.edu.plS³owa kluczowe: biotesty, organizmy wskaŸnikowe, œrodowiskoWstêpObecnie wiele dziedzin nauk oceniaj¹cych œrodowisko naturalne stawia sobie zacel okreœlenie wp³ywu zanieczyszczeñ na wszystkich poziomach organizacji ¿ywejmaterii. Badania prowadzi siê, poczynaj¹c od okreœlenia przemian biochemicznychzachodz¹cych w komórce po ocenê zmian na poziomie ekosystemów, w którychodnotowuje siê zale¿noœæ efektu toksycznego od iloœci substancji chemicznej [59].Wspó³czesna wiedza poparta wspólnymi dzia³aniami specjalistów z wielu dziedzinnauki okreœla charakter i wp³yw zwi¹zków chemicznych obecnych w œrodowisku naorganizmy ¿ywe. Jednak nie jest w stanie scharakteryzowaæ wszystkich, bior¹c poduwagê ich du¿¹ liczbê, zró¿nicowanie stê¿eñ, wielkoœci cz¹steczkowe [33], czy choæbywysok¹ reaktywnoœæ szeroko rozpowszechnionych substancji niskocz¹steczkowych[29]. Kluczowe zadanie, jakie ma do spe³nienia toksykologia i ekotoksykologia,wi¹¿e siê z bezpoœredni¹ ocen¹ ryzyka wynikaj¹cego ze ska¿enia œrodowiska i dotyczym.in. tworzenia systemów klasyfikacji opartych na rosn¹cych poziomach toksycznoœci[48]. Do niedawna jedynymi metodami obrazuj¹cymi stan poszczególnychelementów œrodowiska by³y metody fizykochemiczne. Mimo ¿e badania te przyczyniaj¹siê do eliminacji niektórych substancji toksycznych [44, 63], nie charakteryzuj¹w sposób kompletny ich wp³ywu wobec testowanych gatunków. Analizy te informuj¹jedynie o poziomie zanieczyszczeñ, ale nie okreœlaj¹ wspó³dzia³ania badanych zwi¹z-*Praca wykona w ramach projektu badawczego nr N N305 270134 finansowanego przezMNiSZW.

122 £. Sikorski, B. Adomasków i ich bioaktywnoœci. Nie oceniaj¹ równie¿ zwi¹zków nie objêtych ramamiprawnymi w danym kraju. Badania takie niekiedy powoduj¹ myln¹ ocenê realnegozagro¿enia œrodowiska przyrodniczego [39, 48]. Do zagadnienia tego odnosz¹ siêrównie¿ Wolska i in. [63] analizuj¹c za³o¿enia do Europejskiej Dyrektywy Ramowejdotycz¹cej Wody (WFD – Water Framework Directive) [21]. Obserwacje prowadzonezgodnie ze schematem: pomiar ekspozycji – badanie procesów kumulacji i metabolizmuzanieczyszczeñ przez ¿ywe organizmy [44], sta³y siê podwalin¹ rozwojui opracowania metod badawczych, które nazwano biotestami.Biotest to standardowa procedura wskazuj¹ca wp³yw zanieczyszczeñ, b¹dŸ ichmieszanin wobec systemu biologicznego, jakim mo¿e byæ: organizm (roœlinny lubzwierzêcy), zespó³ organizmów czy wycinek ekosystemu (mezosystem, mikrosystem),z jednoczesnym okreœleniem sk³adu substancji i ich mo¿liwych interakcji [32, 33, 38,48, 53, 60]. Biotesty s¹ interdyscyplinarnym ujêciem odpowiedzi organizmów naobecnoœæ konkretnych substancji chemicznych, które w celu okreœlenia ich wp³ywuwykorzystuj¹ dziedziny naukowe takie jak np. fizjologia czy biochemia. Uzyskanywynik jednoznacznie stwierdza toksycznoœæ danej próby lub jej brak, w porównaniuz zachowaniem organizmu nie nara¿onego na dzia³anie wszystkich substancji chemicznychobecnych w analizowanej próbie [52]. Stosowanie w toksykologii i ekotoksykologiibadañ, w których rejestruje siê zmiany morfologiczne lub/i fizjologicznena poziomie komórkowym czy osobniczym, a niekiedy w konsekwencji œmieræbadanego organizmu, maj¹ na celu ochronê œrodowiska, co w sposób poœredniprzek³ada siê na ochronê ¿ycia i zdrowia populacji ludzkiej [30]. Ich teraŸniejszaforma oraz konstrukcja jest wypadkow¹ ponad dwudziestoletnich badañ nad biotestamii ich wykorzystaniem. Zaowocowa³o to standaryzacj¹ warunków ich przeprowadzania,obni¿eniem kosztów zwi¹zanych z samym badaniem, powszechn¹ dostêpnoœci¹kultur testowych [31], ujednoliceniem pomiarów oraz ich porównywalnoœci¹.Biotesty i ich zró¿nicowany podzia³Interdyscyplinarne metody analityczne oparte na materiale ¿ywym obrazuj¹ potencjalneobci¹¿enie próby przez zanieczyszczenie lub ich mieszaniny w zró¿nicowanychmatrycach œrodowiskowych. Mnogoœæ metod nastrêcza jednak wiele problemówz ich klasyfikacj¹ [33, 48]. Pierwotne klasyfikacje dotyczy³y uzyskania informacjio poziomie ska¿enia konkretnego elementu œrodowiska, wzglêdem miejscaprzeprowadzenia analizy. Prowadzi siê testy laboratoryjne oparte na wzorcowaniuprób w warunkach kontrolowanych, których wynik okreœla poziom toksycznoœci próbrzeczywistych. Ponadto badaniom poddaje siê konkretne próbki z poszczególnychelementów œrodowiska (m.in. woda, gleba, odcieki) i konfrontuje siê je wobec próbwzorcowych [33]. W porównawczych badaniach œrodowiska wodnego najlepiej jestwykorzystaæ ró¿ne metody i te same próby poddaæ testom z u¿yciem ró¿nychorganizmów w celu okreœlenia poziomu wra¿liwoœci testu i eliminacji b³êdów

Biotesty w badaniach toksykologicznych … 123wynikaj¹cych z oparcia badañ na jednym teœcie [32]. Kolejnym sposobem uwzglêdniaj¹cymmiejsce przeprowadzania testu jest analiza in situ, wykorzystuj¹ca odpowiedziorganizmów ¿yj¹cych w œrodowisku naturalnym [2, 33, 41]. Analiza tegorodzaju umo¿liwia sta³¹ wymianê medium, g³ównie wody, gdy badania przeprowadzasiê z u¿yciem ryb czy roœlin jako organizmu wskaŸnikowego i klasyfikuje siê je jakobiotest dynamiczny [23, 50, 54]. W przypadku gdy wymiana nastêpuje w okreœlonychodstêpach czasowych, biotest tego rodzaju definiowany jest jako pó³statyczny [7, 11,50]. Test statyczny zaœ charakteryzuje siê brakiem zastêpowania medium. W trakciebadania toksycznoœci, testowany pollutant o okreœlonym stê¿eniu zadaje siê tylko razna noœnik, którym mo¿e byæ woda, osad czy gleba [18, 33, 50].Analizy oparte na ocenie wp³ywu substancji na zmiany morfologiczne i fizjologiczneorganizmu wskaŸnikowego, z powodu szerokiego spektrum zró¿nicowaniametod, s¹ przyczyn¹ trudnoœci w zaklasyfikowaniu ich do konkretnej grupy badañtoksykologicznych. Jednym z podstawowych kryteriów praktyk analitycznych w toksykologiii ekotoksykologii jest element aktywny testu – czyli organizm w nimwykorzystywany. Wyró¿nia siê tu organizmy nale¿¹ce do królestw: roœlin, bakteriioraz zwierz¹t [33]. Biotesty oparte na analizie zmian w obrêbie organizmu roœlinnegozwane fitotestami dostarczaj¹ informacji o organizmach kluczowych dla danegoekosystemu, dziêki czemu okreœlaæ mo¿na jego stan oraz zaburzenia w przep³ywiematerii czy obiegu substancji. Baran i in. [3] definiuj¹ fitotoksycznoœæ jako sk³adow¹zaburzeñ w pobieraniu i transporcie nieodzownych mikro- i makroelementów, coskutkuje opóŸnionym kie³kowaniem nasion i wschodem roœlin oraz deformacjami iniedorozwojem okreœlonych ich czêœci [25]. Dziêki fitotestom uzyskuje siê konkretn¹wiedzê o wp³ywie badanego czynnika wystêpuj¹cego w œrodowisku. Fitotesty stosowanes¹ m.in. do oceny gleby [49] i wody [12, 13, 17] zanieczyszczonej m.in.œrodkami ochrony roœlin. Pomocne s¹ równie¿ w biomonitoringu [19], czy fitoremediacji[23]. W badaniach tych wykorzystuje siê wiele rodzajów roœlin, poczynaj¹c odglonów, wœród których najczêœciej stosuje siê do oceny prób wód s³odkich glonynale¿¹ce do gromady Chlorophyta: Selenastrum capricornutum, Scenedesmus quadricauda,S. subspicatus [33, 34, 50, 58, 63], do oceny zaœ wód s³onych i s³onawychz gromady Bacillariophyta: Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema costatum [33,45, 50, 58, 63]. Bardzo szeroko w pracach laboratoryjnych nad substancjami oraz ichakumulacj¹ wykorzystuje siê rzêsê wodn¹ [50], której gatunki Lemna minor oraz L.gibba s¹ najczêstszymi organizmami wskaŸnikowymi biotestu (Lemna Test). Mimoniespójnoœci w ocenie fitotoksycznoœci wody, czy œcieków za pomoc¹ tego organizmu[14], jest on czêsto wykorzystywany ze wzglêdu na szybk¹ odpowiedŸ biologiczn¹,³atwoœæ hodowli zgodn¹ z Rozporz¹dzeniem Komisji WE nr 761/2009 [51], szybkiprzyrost oraz mo¿liwoœæ oceny toksycznej zwi¹zków hydrofobowych – unosz¹cychsiê na powierzchni lustra wody [6, 9, 42]. Fitobioindykatorami s¹ równie¿ wy¿szeroœliny naczyniowe wœród których, wyró¿niæ mo¿na: Sorghum saccharatum, Lepidiumsativum czy Sinapis alba. Maj¹ one bardzo ma³e nasiona, a testy prowadzi siê

124 £. Sikorski, B. Adomasprzez 3 dni [20, 22]. Z powodzeniem do oceny gleby zanieczyszczonej sulfametazyn¹zastosowano nasiona roœlin motylkowatych (Lupinus luteus, Pisum sativum, Lensculinaris, Glycine max, Medicago sativa) wiêksze œrednio o 20 razy od zalecanychprzez producenta testu Phytotoxkit (MicroBio Test Inc., Belgium) [1, 22]. Obokoceny kie³kowania traw, kapustowatych, motylkowatych oraz zbó¿ w ocenie œrodowiskaglebowego, pod uwagê bierze siê tak¿e roœliny makrofityczne. Jednak skomplikowanahodowla roœlin makrofitycznych, a tak¿e d³ugi czas wzrostu oraz wymaganiazwi¹zane z zajmowan¹ przez nie powierzchni¹, eliminuj¹ je z powszechnego stosowaniaw biotestach [33].Dobór organizmów roœlinnych winien charakteryzowaæ dany ekosystem. Gatunkiroœlin dobiera siê bior¹c pod uwagê ich dostêpnoœæ, sposób hodowli, ³atwoœæ prowadzeniabadañ oraz biologiczn¹ wra¿liwoœæ na zwi¹zek b¹dŸ grupê zwi¹zków,potwierdzon¹ wielokrotnymi powtórzeniami [14, 33]. W tego typu badaniach niezmiernieistotna jest mo¿liwoœæ oceny toksycznoœci w cyklu wielopokoleniowym. Dlategowiêkszoœæ stosowanych fitotestów ma charakter chroniczny, czyli trwaj¹ d³u¿ej ani¿eli1/3 okresu przedprodukcyjnego [30]. Obecnie, na skutek d³ugoletnich prac z zakresuocen œrodowiskowych, badacze sk³aniaj¹ siê do wykorzystywania w eksperymentachgotowych kultur roœlinnych – mo¿liwych do zastosowania w laboratorium. Prowadz¹oni w³asn¹ hodowlê glonów, roœlin naczyniowych, lub wykorzystuj¹ gotowe wyselekcjonowanekultury w formie kryptobiotycznej, b¹dŸ liofilizatu, do³¹czane do mikrobiotestów,np. Algaltoxkit F TM , Phytotoxkit TM [22, 33, 48, 63].Podobnie dobór organizmów wygl¹da w badaniach ekotoksykologicznych opartychna wykorzystaniu bakterii jako czêœci aktywnej biotestu, gdzie obok w³asnychhodowli kolonii mikroorganizmów, najczêœciej testy te opiera siê na bakteriach w formieuœpionej do³¹czonych do odpowiedniego biotestu [33]. Gotowe kolonie bakteriipo raz pierwszy do³¹czono do biotestu (Microtox ® -SPT) w roku 1979, co da³omo¿liwoœæ wykorzystania go w dowolnym czasie oraz umo¿liwi³o wzglêdn¹ porównywalnoœæwyników badañ z oœrodkami naukowymi stosuj¹cymi ten sam rodzajanalizy [48, 63]. Obecnie w testach bakteryjnych (Microtox ® -SPT, LUMIStox,ToxAlert ® 100) najczêœciej badaniom poddaje siê bakterie z rodzaju Vibrio fischeri,posiadaj¹ce zdolnoœci luminescencyjne. Wp³yw zanieczyszczenia œrodowiska wyznaczasiê obserwuj¹c ograniczenia w emisji œwiat³a bakterii, w porównaniu z parametramiœwietlnymi bakterii nie poddanych ¿adnym nara¿eniom. Ograniczeniaw wielkoœci emisji bakterii œwiec¹cych, powodowane mog¹ byæ zachwianiami w metabolizmiekomórki, przerwaniem b³ony komórkowej czy wskutek dzia³alnoœci substancjiniepo¿¹danej [17, 33]. Biotesty oparte na pomiarze bioluminescencji bakteriiz rodzaju Vibrio fischeri pomocne s¹ w bioanalizach wody, œcieków, osadów czygleby oraz czêsto s¹ uzupe³nieniem biotestów typu Toxkit [17, 52, 63]. Do ocenytoksycznoœci chronicznej, np. leków weterynaryjnych, stosuje siê innowacyjny systemMARA ® (Microbial Assay for Risk Assessment). Test ten jako bioindykatorywykorzystuje dziesiêæ organizmów prokariotycznych – bakterii o ró¿nej taksonomii

Biotesty w badaniach toksykologicznych … 125oraz jeden organizm eukariotyczny – dro¿d¿e [43]. Wraz z rozwojem prac badawczychnad testami bakteryjnymi w obrocie komercyjnym pojawi³y siê takie testy,które nie tylko wykorzystuj¹ organizmy bakteryjne w celach opiniodawczych z zakresutoksycznoœci, czy genotoksycznoœci, test Ames’a, SOS-ChromoTest, z wykorzystaniemszczepów Salmonella typhimurium, Escherichia coli [26, 27], leczumo¿liwiaj¹ ich wykrycie, np. bakterii z rodzaju Legionella, odpowiedzialnych zazakaŸn¹ legioneliozê [5].Kolejn¹ grupê biotestów, które klasyfikuje siê ze wzglêdu na u¿yty materia³ badawczy,stanowi¹ testy zwierzêce, wskazuj¹ce zmiany morfologiczne, fizjologiczneczy genetyczne odleglejszych ogniw ³añcucha troficznego. Uzyskane w wyniku ichprzeprowadzenia odpowiedzi, mog¹ bezpoœrednio obrazowaæ stan zanieczyszczeniaœrodowiska naturalnego, procesy biomagnifikacji czy biotransformacji. Testy, w którychbioindykatorami s¹ zwierzêta stanowi¹ oko³o 10% ogó³u stosowanych biotestów[33]. S¹ narzêdziem wykorzystywanym w badaniach wskazuj¹cych jakoœæ podstawowychelementów œrodowiska oraz ich przekszta³ceñ antropogenicznych [10]. Dodatkowoorganizmy wy¿sze s¹ szczególnie przydatne w ocenach farmakologicznychi kosmetologicznych, umo¿liwiaj¹c badanie substancji czynnych zawartych w poszczególnychpreparatach, lekach czy kosmetykach [46, 47, 56]. W biotestach nazwierzêtach analizie poddaje siê gatunki charakteryzuj¹ce zarówno œrodowisko l¹dowejak i wodne. Do badañ wykorzystuje siê organizmy zró¿nicowanych ogniwtroficznych, pocz¹wszy od pierwotniaków, przez miêczaki, po strunowce. Do najlicznieju¿ytkowanych zwierz¹t w œrodowisku wodnym nale¿¹ rozwielitki – Daphnia sp.[50]; miêczaki, skorupiaki: Artemia salina, Ceriodaphnia dubia oraz wiele gatunkówryb, a wœród nich Lepomis macrochirus, czy Ictalarus punctatus. Stan pozosta³ychœrodowisk okreœlany jest na podstawie odpowiedzi organizmów takich jak: d¿d¿ownice– Eisenia foetida, œlimaki – Helix aspersa, skoczkonogi – Folsomia candida,bezkrêgowce, owady – Apis mellifera, ptaki oraz gryzonie [20, 33, 40, 50]. Zewzglêdu na komercyjn¹ dostêpnoœæ gotowych biotestów badaniom na zwierzêtachnajszerzej poddaje siê: skorupiaki bêd¹ce elementem testów Daphtoxkit F TM ,Thamnotoxkit F TM , Ostracodtoxkit F TM ; wrotki – Rototoxkit F TM , pierwotniaki –Prototoxkit F TM [4, 22, 29, 33, 34, 39, 48]. Tak wyposa¿one testy nosz¹ nazwêmikrobiotestów. S¹ to zestawy wyposa¿one w niezbêdne akcesoria do wyznaczaniapoziomu toksycznoœci prób. W sk³ad ka¿dego mikrobiotestu wchodzi element aktywnybiotestu, jakim jest ¿ywy organizm, gotowy do uruchomienia w ka¿dej chwili.Ocena toksykologiczna z wykorzystaniem takich testów pozwala na interkontynentalnekonfrontacje wyników. Ponadto dziêki do³¹czonym kulturom organizmów niewystêpuje potrzeba prowadzenia w³asnych hodowli. Oznaczenia przeprowadzoneprzy u¿yciu wymienionych testów charakteryzuje ni¿szy koszt badawczy, ani¿eli ichform konwencjonalnych, skraca siê te¿ czas odpowiedzi, a badania mo¿na prowadziædla prób o niewielkiej objêtoœci. Dodatkowo badacz uzyskuje mo¿liwoœæ pracy nakilku próbach jednoczeœnie [31, 33, 48, 63], co umo¿liwia zaplanowanie eksperymentuw formie baterii biotestów.

126 £. Sikorski, B. AdomasBateri¹ biotestów okreœla siê badanie toksykologiczne lub ekotoksykologiczneobejmuj¹ce wiêcej, ani¿eli tylko jeden gatunek organizmu wskaŸnikowego. Stosujesiê je w celu rozszerzenia badania okreœlonej substancji chemicznej na wiêksz¹ czêœæekosystemu, z uwzglêdnieniem bytuj¹cych tam organizmów wystêpuj¹cych w poszczególnychogniwach ³añcucha troficznego, w ci¹gu: producent – konsument –reducent [31, 33, 35]. Dziêki zastosowaniu baterii biotestów (Charatox, ThamnotoxkitF TM , Microtox ® -SPT) Manusadianas i in. [39] badaj¹c œcieki bytowo-gospodarczedowiedli, ¿e wynik uzyskany z pojedynczego biotestu, mo¿e byæ nieadekwatnydo faktycznego poziomu toksycznoœci próby. Autorzy wykorzystali dodatkowoinny organizm wskaŸnikowy, obrazuj¹cy stan próby zupe³nie inaczej, dziêki czemuuzyskali mo¿liwoœæ weryfikacji wczeœniejszych odpowiedzi oraz pe³niejsz¹ charakterystykêoddzia³ywañ.Analizy ekotoksykologiczne wraz z uzyskanymi dziêki nim rezultatami, odznaczaj¹siê swoistym zró¿nicowaniem. Czêsto ich celem jest okreœlenie samej letalnoœci,b¹dŸ wielkoœci efektów inhibicyjnych, wobec ró¿nych bioindykatorów po okreœlonymczasie ekspozycji. Wyznacza siê stê¿enia (Lethal Concentration – LC) b¹dŸdawki œmiertelne (Lethal Dose – LD), czêsto z uwzglêdnieniem najni¿szych, b¹dŸgranicznych poziomów nara¿enia (Lowest Observed Effect Concentration – LOEC,No Observable Effect Concentration – NOEC). Standardowo wobec wrotków i skorupiakówwodnych ustala siê wartoœci EC (Effect Concentration), czyli wyra¿on¹procentowo w danej grupie badawczej inhibicjê okreœlonej czynnoœci fizjologicznej,b¹dŸ biochemicznej. W testach wzrostowych zaœ bierze siê pod uwagê hamowanierozwoju zarówno roœlin, grzybów i biomasy glonów. Rozwój biotechnologii spowodowa³,¿e obok tych parametrów, du¿e znaczenie w badaniach toksykologicznychmaj¹ testy enzymatyczne okreœlaj¹ce inhibicje aktywnoœci jednego lub grupyenzymów katalizuj¹cych okreœlon¹ reakcje biochemiczn¹ [8, 52] oraz testygenotoksycznoœci [24, 34, 43, 64], okreœlaj¹ce zmiany genetyczne wywo³ane wp³ywemtoksykanta. Niekiedy toksykolodzy analizuj¹ parametry zwi¹zane z pobieraniemi gromadzeniem okreœlonych substancji w tkankach i narz¹dach, w zale¿noœciod czasu nara¿enia, które nosz¹ miano testów bioakumulacji [28, 61].Problematyka i kierunki rozwoju biotestówDynamiczny postêp ró¿nych ga³êzi nauki zajmuj¹cych siê ocen¹ œrodowiska przyu¿yciu organizmów wskaŸnikowych, sprawi³, ¿e biotesty sta³y siê kluczowym narzêdziemoceny wp³ywu substancji na organizm b¹dŸ ca³y ekosystem. Biotesty bowiembezpoœrednio opieraj¹ siê na odpowiedzi osobniczej b¹dŸ grupy organizmów charakterystycznychdla danego wycinka przyrody. Mimo ich skonkretyzowanej formy orazwypracowanych standaryzowanych metod, praca nad biotestami udowodni³a, ¿eobarczone s¹ wieloma b³êdami natury porównawczej, powtarzalnoœci, czy subiektywizmuw ocenie toksycznoœci. Wielu autorów [32, 62, 37] analizuj¹c uzyskane

Biotesty w badaniach toksykologicznych … 127wyniki, zauwa¿y³o szereg rozbie¿noœci w ocenie tego samego elementu œrodowiska,za pomoc¹ ró¿nych testów. Jako przyk³ad takich odchyleñ wskazaæ mo¿na badaniaporównuj¹ce próby pochodz¹ce z oligotroficznego stawu, z próbami wód zanieczyszczonychdla potrzeb analizy [32]. U¿ycie kilku testów: bioluminescencji wraz z analizamienzymatycznymi dowodzi ich rozbie¿noœci w ocenie poziomu zanieczyszczenia,a tym samym wskazuje na zasadnoœæ zastosowania w badaniach kilku testów.Badania oceniaj¹ce stan wód powierzchniowych zlokalizowanych wokó³ zak³aduprzemys³owego z wykorzystaniem ryb jako bioindykatora [62] dowodz¹, i¿ osobnikipochodz¹ce z ró¿nych hodowli mog¹ wykazywaæ ró¿n¹ wra¿liwoœæ, co w konfrontacjiz wynikami innych badaczy mo¿e byæ przyczyn¹ b³êdnej oceny.Testy toksykologiczne i ekotoksykologiczne czêsto skupiaj¹ siê jedynie na krótkimokresie nara¿enia, w którym pod uwagê nie s¹ brane czynniki takie jak: ca³ad³ugoœæ ¿ycia organizmu, kumulacyjna natura substancji chemicznych, dynamikapopulacji, zmiany sezonowe, narastanie toksycznoœci w czasie, estywacja, a szacujesiê jedynie tempo wzrostu, p³odnoœæ, czy œmiertelnoœæ [36, 45]. Przeprowadzonebadaniach z zastosowaniem metody analizy obrazu [37] zwracaj¹ uwagê na problemzwi¹zany z naoczn¹ obserwacj¹ uzyskanych wyników, gdzie ocena toksycznoœcimo¿e mieæ cechy subiektywnej oceny eksperymentatora. Natomiast Eberius i in. [14],w ocenie rzêsy wodnej jako szeroko stosowanego bioindykatora, zwracaj¹ uwagê najej nie zwi¹zane z wp³ywem toksykanta tempo wzrostu. Odnotowuj¹ wiêksz¹ stagnacjêorganizmu w pierwszych dniach eksperymentu, popart¹ analizami, polegaj¹cymina ró¿nym czasie startowym hodowli. Aby zapobiec wszelkim niespójnoœciomzwi¹zanym z badaniami laboratoryjnymi Komitet Toksykologii i OcenyCzynników Œrodowiskowych US National Research (NRC) opublikowa³ raport nazlecenie Amerykañskiej Agencji Ochrony Œrodowiska [55], w którym w¹tpliwoœciompoddaje testy przeprowadzane na zwierzêtach w odniesieniu do populacjiludzkiej. Ekstrapolowane wyniki tych doœwiadczeñ, nie zawsze mo¿na odnosiæ doorganizmu cz³owieka, co wiêcej dane te nie s¹ w stanie wykazaæ wp³ywu ró¿norodnychmieszanin chemikaliów czy dzia³ania synergistycznego. Komitet podejmujedzia³ania w kierunku opracowania szeregu nieinwazyjnych komputerowych metodanaliz oraz testów in vitro opartych na biologii cz³owieka – tak aby zapobiegaæocenom reakcji opartych na homogenicznych grupach zwierz¹t, w odniesieniu doheterogenicznych populacji ludzkich. Raport dowodzi, ¿e wiele obecnie stosowanychmetod testowania œrodowiska to metody czasoch³onne, wymagaj¹ce wysokich nak³adówfinansowych. Promuje metody obrazuj¹ce bezpoœrednie efekty toksycznew dawkach adekwatnych, na które nara¿ony jest organizm ludzki, tak by mo¿na by³oanalizowaæ zaburzenia na poziomie komórkowym i molekularnym. Postuluje wykorzystaniekomórek uzyskanych z tkanek oraz zmierza do zmiany paradygmatuprzeprowadzania doœwiadczeñ na zwierzêtach w stronê testów in vitro.

128 £. Sikorski, B. AdomasPodsumowanieTesty toksycznoœci i ekotoksycznoœci staj¹ siê dope³nieniem konwencjonalnychmetod analizy prób œrodowiskowych, opartych na badaniach fizykochemicznychwód, gleby czy œcieków. Metody chemiczne zawê¿aj¹ swe wyniki jedynie do informacjiiloœciowych i jakoœciowych rozmaitych form zanieczyszczeñ, bez mo¿liwoœcioszacowania bezpoœredniego wp³ywu na ¿ywy organizm. Zasadnoœæ prowadzeniabadañ dotycz¹cych oceny œrodowiska przyrodniczego z u¿yciem nowoczesnychmetod ocen toksycznoœci, doprowadzi³a do szeregu uaktualnieñ prawnych z zakresuochrony œrodowiska wielu krajów [15, 16, 51, 57]. Dziêki temu wiele stê¿eñ polutantów,dotychczas uwa¿anych za bezpieczne, uzyska³o charakter obci¹¿aj¹cy, a odpowiednieprzepisy nakazuj¹ ich eliminacje b¹dŸ obni¿enie w œrodowisku. Biotestyw porównaniu z konwencjonalnymi metodami umo¿liwiaj¹ relatywnie szybk¹ i tani¹metodê analizy. Natomiast po³¹czenie tych dwóch metod umo¿liwia ca³oœciow¹i szerok¹ charakterystykê toksykologiczn¹. W konsekwencji ochrona œrodowiskanaturalnego, w tym populacji ludzkiej, staje siê coraz bardziej efektywna, a dzia³aniazapobiegawcze podejmowane s¹ znacznie szybciej.Literatura[1] Adomas B., Piotrowicz-Cieslak A. 2008. Yellow lupin is a good bioindicator of soil contamination withsulfamethazine. Lupin for Health and Wealth. Proc. of the 12 th International Lupin Conference, Fremantle,Western Australia, 14–18 September 2008: 362–367.[2] Anderson B., Hunt J., Phillips B., Nicely P., Tjeerdema R., Martin M. 2004. A comparison of in situ andlaboratory toxicity tests with the estuarine amphipod Eohaustorius estuaries. Arch. Environ. Contam. Toxicol.46(1): 52–60.[3] Baran A., Jasiewicz C., Klimek A. 2008. Reakcja roœlin na toksyczn¹ zawartoœæ cynku i kadmu w glebie. Proc.of ECOpole 2(2): 417–422.[4] Belgis C., Persoone G., Blaise C. 2003. Cyst-based toxicity tests XVI––sensitivity comparison of the solidphase Heterocypris incongruens microbiotest with the Hyalella azteca and Chironomus riparius contact assayson freshwater sediments from Peninsula Harbour (Ontario, Canada). Chemosphere 52 (1): 95–101.[5] Benson R., Tang P., Fields B. 2000. Evaluation of the Binax urinary and Biotest urinary antigen kits fordetection of Legionnaires’ disease due to multiple serogroups and species of Legionella. J. Clin. Microbiol.38(7): 2763–2765.[6] Bieliñska M., Na³êcz-Jawecki G. 2009. Zanieczyszczenie œrodowiska przyrodniczego lekami. I: Ocenatoksycznoœci trzech fluorochinolonów dla rzêsy drobnej Lemna minor. Biul. Wydz. Farm. WUM 4: 24–30.[7] Blanck H., Porsbring T., Scholze M. 2003. (MOP/74) Predictability of the toxicity of metal(oid) mixtures tomarine periphyton communities. The Society of Environ. Toxicol. and Chem. EUROPE 2003.[8] Bundatsev A. 2005. A biotest based on an acetylcholinoesterase tissue preparation immobilized on paper. J.Anal. Chem. 60(12): 1155–1158.[9] Cleuvers M., Ratte T. 2002. Phytotoxicity of coloured substances: is Lemna Duckweed an alternative to thealgal growth inhibition test? Chemosphere 49: 9–15.[10] De la Torre F., Salibián A., Ferrari L. 2007. Assessment of the pollution impact on biomarkers of effect ofa freshwater fish. Chemosphere 46: 1582–1590.[11] De Liguoro M., Fioretto B., Poltronieri C., Gallina G. 2009. The toxicity of sulfamethazine to Dapnia magnaand its additivity to other veterinary sulfonamides and trimetroprim. Chemosphere 75: 1519–1524.[12] Dorgrloh M. 2005. Metamitron acute toxicity (96 hours) to rainbow trout in static test. Study Report BAYERAG, DOM 94031 (E 280 0882-8): 4–13.

Biotesty w badaniach toksykologicznych … 129[13] Drzewicz P., Na³êcz-Jawecki G., Gryz M., Sawicki J., Bojanowska-Czajka A., G³uszewski W., Kulisa K.,Wo³kowicz S., Trojanowicz M. 2004. Monitoring of toxicity Turing degradation of selected pesticides usingionizing radiation. Chemosphere 57: 135–145.[14] Eberius M., Mennicken G., Reuter I., Vandenhirtz J. 2002. Sensitivity of different growth inhibition test-just aquestion of mathematical calculation. Theory and practice for algae and duckweed. Ecotoxicology 11: 293–297.[15] European Commission, Council Directive of 4 May 1976 on pollution caused by certain dangerous substancesdischarged into the aquatic environment of the Community (76/464/EEC). Offic. J. Eur. Commun. L129 (1976) 23.[16] European Commission, Decision No 2455/2001/EC of the European Parliament and of the Council of 20November 2001 establishing the list of priority substances in the field of water policy and amending Directive2000/60/EC. Offic. J. Eur. Commun. L331 (2001) 1.[17] Fernández-Alba A.R., Hernando M.D., Piedra L., Chisti Y. 2002. Toxicity evaluation of single and mixedbiocides measured with acute toxicity bioassays. Anal. Chim. Acta 456: 303–312.[18] Hoffmann J., Hoffmann K., Borowiec M., Huculak M, Drwiêga J. 2009. Badania nad mo¿liwoœciamiwykorzystania w nawozach mineralno-organicznych odpadów z zak³adu zwi¹zków fosforowych. Proc. ofECOpole 3(2): 461–464.[19] Holgado R., Rowe J., Andersson S., Magnusson C. 2004. Electrophoresis biotest studies on some population ofcereal cyst nematode, Heterodera spp. (Tylenchida: Heteroidae). Nematology 6(6): 857–865.[20] http://www.cyf-kr.edu.pl/~uxlaskow/index_pl.html, (Ryszard Laskowski, Kurs Ekotoksykologia (WBNZ-690)).[21] http://www.kzgw.gov.pl/files/file/Materialy_i_Informacje/Dyrektywy_Unijne/Wodna/Ramowa%20Dyrektywa%20Wodna %20EN.pdf (in English).[22] http://www.tigret.pl/[23] Ignatowicz K. 2009. Badania rozpoznawcze mo¿liwoœci zastosowania fitoremediacji do ochrony terenówwokó³ mogilników pestycydowych. Œrodkowo-Pomorskie Towarzystwo Naukowe Ochrony Œrodowiska 11(73): 1007–1016.[24] Jha A. 2008. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay. Mutagenesis 23(3): 207–221.[25] Jin C., Chen Q., Sun R., Zhou Q., Liu J. 2009. Eco-toxic effects of sulfadiazine sodium, sulfamonomethoxinesodium and enrofloxacin on wheat, Chinese cabbage and tomato. Ecotoxicology 18(7): 878–885.[26] Jolibois B., Guerbet M. 2005. Efficacy of two wastewater treatment plants in removing genotoxins. Arch.Environ. Contam. Toxicol. 48: 289–295.[27] Jolibois B., Guerbet M. 2005. Evaluation of industrial, hospital and domestic wastewater genotoxicity with theSalmonella fluctuation test and the SOS chromotest. Mutat. Res. 565: 151–162.[28] Kahle J., Zauke G. 2002. Bioaccumulation of trace metals in the copepod Calanoides acutus from the WeddellSea (Antarctica): comparison of two-compartment and hyperbolic toxicokinetic models. Aquat. Toxicol.59(1–2): 115–135.[29] Kahru A., Dubourgier H-C., Blinowa I., Ivask A., Kasemets K. 2008. Biotests and Biosensors for ecotoxicologyof metal oxide nanoparticles. Sensors 8: 5153–5170.[30] Kaza M. 2006. Ocena toksycznoœci leków przy u¿yciu testów roœlinnych. Bioskop 3: 20–22.[31] Kaza M., Mankiewicz-Boczek J., Izydorczyk K., Sawicki J. 2007. Toxicity assessment of water samples fromrivers in central poland using a battery of microbiotests – a pilot study. Polish J. of Environ. Stud. 16(1): 81–89.[32] Kratasyuk V., Esimbekova E., Gladyshev M., Khromichek E., Kuznetsov A., Ivanova E. 2001. The usebioluminescent biotests for study of natural and laboratory aquatic ecosystems. Chemosphere 42: 909–915.[33] Kuczyñska A., Wolska L., Namieœnik J. 2003. Zastosowanie biotestów w badaniach œrodowiskowych.W: Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu œrodowiskowym. 2003. Namieœnik J., ChrzanowskiW., Szpinek P. (red.) Wyd. CEEAM, Gdañsk: 667–698.[34] Küster E., Dorusch F., Mei?ner B., Weiss H., Schüürmann G., Altenburger R. 2003. Toxizitätsreduktion durch(Grundwasser-) Sanierung? Erfolgskontrolle von In-situ-Grundwasser-Sanierungsverfahren mithilfe von kontinuierlichenund diskontinuierlichen Biotest. Grundwasser- Zeitschrift der Fachsektion Hydrogeologie 1: 32–40.[35] Kursa-Miko³ajczak M., Kuczyñska A., Wolska L., Namieœnik J. 2005. Biotest – nowe narzêdzie do kompleksowejoceny stanu œrodowiska. Analityka 2: 13–15.[36] Laskowski R. 1998. Why short-term bioassays are not meaningful- effects of persistent (Cd) vs. biodegradable(imidacloprid) chemicals on pea aphid (Acyrthosiphon pisum HARRIS). International Conference onEcotoxicology and Environmental Saefty, SECOTOX’98, Antalya, Turkey, 19–21 Oct. 1998.[37] Lewicki P., Mazur R. 2008. Zastosowanie metod analizy obrazu w testach toksycznoœci ostrej na Lymneastagnalis L. Krakowska Konferencja M³odych Uczonych 2008.

130 £. Sikorski, B. Adomas[38] Mantis I., Voutsa D., Samara C. 2005. Assessment of the environmental hazard from municipal and industrialwastewater treatment sludge by employing chemical and biological methods. Ecotoxicol. Environ. Saf. 62:397–407.[39] Manusadianas L., Balkelytė L., Sadauskas K., Blinova I., Põllumaa L., Kahru A., 2003. Ecotoxicological studyof Lithuanian and Estonian wastewaters: selection of the biotests, and correspondence between toxicity andchemical-based indices. Aquat. Toxicol. 63: 27–41.[40] Mazur R. 2008. Monitoring wybranych zanieczyszczeñ wód przy zastosowaniu nowych kryteriów ekotoksykologicznych,Praca Doktorska AGH Kraków.[41] McWilliam R., Baird D. 2002. Postexposure feeding depression: a new toxicity endpoint for use in laboratorystudies with Daphnia magna. Environ. Toxicol. Chem. 21(6): 1198–1205.[42] Mkandawire M., Taubert B., Dudel G. 2006. Limitations of growth-parameters in Lemna gibba bioassays forarsenic and uranium under variable phosphate availability. Ecotoxicol. Environ. Saf. 65: 118–128.[43] Na³êcz-Jawecki G., Piekarek A., Sawicki J. 2008. Zastosowanie testu bakteryjnego MARA do oceny ekotoksycznoœcileków. Ekotoksykologia w ochronie œrodowiska B. Ko³wzan i K. Grabas (red.). Wyd. PolskieZrzeszenie In¿ynierów i Techników Sanitarnych Oddzia³ Dolnoœl¹ski: 237–242.[44] Namieœnik J. 2003. Trendy w analityce i monitoringu œrodowiskowym. W: Nowe horyzonty i wyzwaniaw analityce i monitoringu œrodowiskowym. 2003. Namieœnik J., Chrzanowski W., Szpinek P. (red.). Wyd.CEEAM, Gdañsk: 1–32.[45] Nendza M. 2002. Inventory of marine biotest methods for the evaluation of dredged material and sediments.Chemosphere 48: 865–883.[46] Nigam P. 2009. Adverse reactions to cosmetics and methods of testing. Ind. J. Derm., Vener. Lepr. 75(1):10–19.[47] Park S., Choi K. 2008. Hazard assessment of commonly used agricultural antibiotics on an aquatic ecosystems.Ecotoxicology 17: 526–538.[48] Persoone G., Marsalek B., Blinowa I., Törökne A., Zarina D., Manusadianas L., Na³êcz-Jawecki G., Tofan L.,Stepanowa N., Tothova L., Kolar B. 2003. A practical and user-friendly toxicity classification system withmicrobiotests for natural waters and wastewaters. Environ. Toxicol. 18(6): 395–402.[49] Piotrowicz-Cieœlak A., Adomas B., Michalczyk D. 2010. Different glyphosate phytotoxicity to seeds andseedlings of selected plant species. Polish J. of Environ. Stud. 19(1): 123–129.[50] Polski Komitet Normalizacyjny. [On-line]. http://www.pkn.pl.[51] Rozporz¹dzenie Komisji (WE) nr 761/2009 z dnia 23 lipca 2009 r. zmieniaj¹ce, w celu dostosowania do postêputechnicznego, rozporz¹dzenie (WE) nr 440/2008 ustalaj¹ce metody badañ zgodnie z rozporz¹dzeniem (WE) nr1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleñ i stosowanychograniczeñ w zakresie chemikaliów (REACH) Tekst maj¹cy znaczenie dla EOG. 2009. Dziennik Urzêdowy L200, 24/08/2009 P. 0001-0094. Za³¹cznik VI.[52] Simeonov V., Wolska L., Kuczynska A., Gurwin J., Tsakovski S., Namiesnik J. 2007. Chemo-metric estimationof natural water samples using toxicity tests and physicochemical parameters. Critical Reviews in AnalyticalChemistry 37(2): 81–90.[53] Sosak-Œwiderska B. 2002. Mikrobiotesty w badaniach wody. Bioskop 2: 9–10.[54] Sundt R.C., Meier S., Jonsson G., Sanni S., Beyer J. 2009. Development of a laboratory exposure system usingmarine fish to carry out realistic effect studies with produced water discharged from offshore production. Mari.Pollut. Bull. 58(9): 1382–1388.[55] Toxicity Testing in the 21st century: A vision and a strategy. 2007. National Academies Press.[56] Tremblay L., Wratten S. 2002. Effects of ivermectin in dairy discharges on terrestrial and aquatic invertebrates.DOC Science Internal Series 67: 13.[57] Ustawa z dnia 11 stycznia 2001 r. o substancjach i preparatach chemicznych (Dz.U. Nr 11, poz. 84, z póŸn. zm.)[58] Wadhia K., Clive Thompson K. 2007. Low-cost ecotoxicity testing of environmental samples using microbiotestfor potential implementation of the Water Framework Directive. Trends Anal. Chem. 26(4): 300–307.[59] Walker C.H., Hopkin S.P., Silby R.M., Pekali D.B. 2002. Podstawy ekotoksykologii. Wyd. Naukowe PWN,Warszawa: 117–149.[60] Wang C., Wang Y., Kiefer F., Yediler A., Wang Z., Kettrup A. 2003. Ecotoxicological and chemicalcharacterization of selected treatment process effluents of municipal sewage treatment plant. Ecotoxicol.Environ. Saf. 56(2): 211–217.[61] Wojewódka D., Fit M. 2005. Ekotoksykologia – bezpieczeñstwo dla œrodowiska. Ekologia 1–2005.

Biotesty w badaniach toksykologicznych … 131[62] Wolska L., Miñkowski M., Kuczyñska A., Namieœnik J. 2003. Wykorzystanie testu toxalert do oceny stanu wódpowierzchniowych wokó³ zak³adu przemys³owego. Chemia i In¿ynieria Ekologiczna 10(6): 575–586.[63] Wolska L., Sagajdakow A., Kuczyñska A., Namieœnik J. 2007. Application of ecotoxicological studies inintegrated environmental monitoring: Possibilities and problems. Trends Anal. Chem. 26(4): 332–344.[64] Yamamoto Y., Rajbhandari N., Xiaohong L., Bergmann B., Nishimura Y., Stomp A-M. 2001. Genetictransformation of duckweed Lemna gibba and Lemna minor. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37(3): 349–353.Biotests in toxicological and ecotoxicologicalresearchKey words: biotest, bioindicator, environmentSummaryThe dynamic progress of science in the field of environment protection causedbiotests to become a crucial bioanalytical tool. The review presents current knowledgeon methods of ecotoxicological analyses based on exploiting them. It is an attempt tocomprehensive portray their diversified classification and advancement tendencies.The article discusses possibilities of using biotests to evaluate the degree of environmentpollution, as well as lists impediments and diagnostic inconsistencies. Modernanalysis methods are compared to the conventional ones, and selected legal aspectsare discussed.

Spis treœciProfesor Jerzy Wa¿ny (1927–2010) — A. Grzywacz ............. 3J. Siuta — Optymalizacja u¿ytkowania powierzchni ziemi³agodzi procesy degradacji œrodowiska ................... 9K. Rybka, G. ¯urek — Oszczêdne gospodarowanie wod¹ kryteriumkoniecznym w hodowli roœlin? ....................... 19E. Matyjaszczyk, J. Sobczak — Substancje aktywne stosowane w ochronieupraw ekologicznych i konwencjonalnych w œwietle aktualnych przepisów 33J. Szumigaj-Tarnowska, C. Œlusarski — Grzyb Cladobotryum dendroidesi jego wp³yw na uprawê pieczarki ..................... 43E.U. Kozik, I. Ostrzy¿ek, W. Szczechura — Alternaria solani – patogenpomidora i perspektywy hodowli odmian odpornych. ........... 55E. Cieœlik, A. Siembida — Fruktany i ich wystêpowanie w roœlinachuprawnych .................................. 67Z. Luberda-Bieñkowska, A. Majewska — Wp³yw selenu i niskocz¹steczkowychantyoksydantów na jakoœæ nasienia zwierz¹t gospodarskich . . . 81M. Ciechanowska, M. £apot, T. Malewski, K. Mateusiak, T. Misztal,F. Przekop — Ekspresja genu GnRH i genu receptora GnRH (GnRHR)w uk³adzie podwzgórzowo-przysadkowym owcy w ró¿nych stanachfizjologicznych ............................... 91T. Zimny, S. Sowa — Prawna ochrona odmian roœlin w Unii Europejskieji USA – system sui generis ......................... 105£. Sikorski, B. Adomas — Biotesty w badaniach toksykologicznychi ekotoksykologicznych. .......................... 121

ContentsProfessor Jerzy Wa¿ny (1927–2010) — A. Grzywacz ............. 3J. Siuta — Land use optimization to mitigate processes of environmental degradation................................... 9K. Rybka, G. ¯urek — Effective use of water as an obligatory criterion inplant breeding? ............................... 19E. Matyjaszczyk, J. Sobczak — Active substances applied in protection oforganic and conventional crops in the light of current regulations ..... 33J. Szumigaj-Tarnowska, C. Œlusarski — Cladobotryum dendroides and itseffect on cultivation of Agaricus bisporus mushrooms ........... 43E.U. Kozik, I. Ostrzy¿ek, W. Szczechura — Alternaria solani – tomatopathogen and perspectives of breeding resistant cultivars ......... 55E. Cieœlik, A. Siembida — Fructans and their occurrence in cultivated plants 67Z. Luberda-Bieñkowska, A. Majewska — Effect of selenium andlow-molecular weight antioxidants on the semen quality of farm animals . 81M. Ciechanowska, M. £apot, T. Malewski, K. Mateusiak, T. Misztal,F. Przekop — Expression of the GnRH and GnRH receptor (GnRHR)genes in hypothalamus-pituitary system of ewes during different physiologicalstates ................................. 91T. Zimny, S. Sowa — Legal protection of plant varieties in the EuropeanUnion and the USA – sui generis system .................. 105£. Sikorski, B. Adomas — Biotests in toxicological and ecotoxicological research.................................... 121