02. Testovi-i-toksicnosti - Raka Web

UNIVERZITET U NIŠUPRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTETODSEK ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJUEKOTOKSIKOLOGIJA:Testovi toksičnosti

Testovi toksičnosti• Svi testovi toksicnosti se baziraju načinjenici da odgovor živih bića nadelovanje toksičnih materija zavisi od doze(nivoa izloženosti) toksičnih agenasa• Toksična delovanja mogu biti letalna isubletalna (promene u rastu, razvoju,razmnožavanju, ponašanju itd.)

Testovi toksičnosti• Delovanje otrova zavisi od njegovekoncentracije i / ili dužine trajanja• Većinu otrova, ako su u veoma niskimkoncentracijama i ako deluju kratkotrajno,normalni homeostatski organizmi susposobni da savladaju, pa se otrovizlučuje iz organizma i ne dolazi dooštećenja

• Veće koncentracije i duža izloženostotrovu mogu izazvati određenereverzibilne fiziološke promene, štorezultira u kratkotrajnom narušavanjupojedinih funkcija• Pri još višim koncentracijama i dužemtrajanju otrova dostiže se kritična faza kaddolazi do trajnih oštećenja• Veoma visoke koncentracije i dugotrovanje dovode do smrti organizma

Testovi toksičnosti• U testovima toksičnosti, uglavnom seodređuje letalna koncentracija kojauzrokuje smrtnost 50% testiranihorganizama u toku 48h (48h LC 50 )• Testovima toksičnosti može se odrediti iefektivna koncentracija, , odnosnokoncentracija toksikanta koja kod 50% testorganizama izaziva neprirodne reakcije uodređenom vremenu (EC 50 )

Testovi toksičnosti - Podela• Prema trajanju:1.Akutni testovi toksičnosti2.Subhronični testovi toksičnosti3.Hronični testovi toksičnosti• Izbor testa zavisi od vrste toksičnematerije i test organizma

Testovi toksičnosti - Podela• Prema načinuvršenja:1. Statični2. Polustatični3. Protočni• Prema nameni (svrsi)vršenja:1. Test procene kvalitetaefluenata2. Test relativneosetljivosti3. Test brzine rasta4. Test bioakumulacije

Izbor test organizama• Prilikom izbora test organizama uzima se u obzirsledeće:1. Osetljivost na materijal ili sredinske faktore koji se razmatraju2. Geografska rasprostranjenost, brojnost i raspoloživost tokom godine3. Ekonomičnost i ekološka važnost na lokalnom i nacionalnom nivou4. Upotrebljivost za metode kultura ili metode odgajanja ili održavanjapod laboratorijskim uslovima5. Poznavanje njihovog načina života i neophodnih sredinskih uslova6. Njihovo opšte zdravstveno stanje i otpornost na parazite i bolesti

Izbor test organizama• Izbor testnih organizama u velikoj meri zavisi od toga štaje svrha samog testa i od mogućnosti laboratorije u kojojse test vrši• Važno je i poznavanje ponašanja, načina ishrane,razmnožavanja i životnog ciklusa, rasprostranjenosti uistraživanom području i ekološko značenje odabranevrste• Od toksikanata najčešće se ispituju aromatičniugljikovodonici, fenol, pentahlorofenolat, metali i dr.• Prati se mortalitet životinja, promene u njihovomponašanju, histopatološke i fiziološke promene njihovogorganizma

Preliminarni test• Kad se izvode testovi sa toksičnim materijamanepoznate toksičnosti, skoro uvek je neophodnoizvesti preliminarni test i odrediti koncentracijekoje će se upotrebiti u izvođenju konačnog testatoksičnosti• Za preliminarni test postavlja se niz koji činekontrola i tri koncentracije, svaka sa po tri do petživotinja• Koncentracije se biraju u nizu tako da suudaljene sa velikim razmakom vrednosti (npr.0,01, 0,1, 1,0, 10, 100 mg/L ili ppm)

Konačan test• Za određivanje LC 50 primeren broj test-životinjatreba podvrgnuti najmanje pet koncentracijazagađivača ili efluenta u geometrijskoj progresiji(tj. sled koncentracija treba da bude takav da jeodnos koncentracije prema prethodnoj uvekjednak (npr. 0,62, 1,25, 2,5, 5, 10 ppm)• Upotreba više od pet koncentracija može pružitidodatne podatke i omogućiti uže izračunavanjegranica sigurnosti oko srednje koncentracije

Konačan test• Da bi se mogle izračunati prihvatljive granicesigurnosti za LC 50 definitivni test treba zadovoljitiove kriterijume:1. Svaka koncentracija testirane materije mora bitibarem 50% veća od iduće veće koncentracije(npr. 3,75, 7,5, 15, 30, 60 ppm)2. Treba uključiti koncentracije u kojima je manjeod 35% test-životinja uginulo ili u kojima sepojavljuju efekti koji se posmatraju, ikoncentracije u kojima je više od 65% životinjauginulo ili je na njima uočen toksični efekat

Testovi akutne toksičnosti• Kratkotrajni testovi koji imaju za cilj dautrvde efekat toksične materija u kratkomvremenskom periodu• Prvenstvena je svrha tih testova da seprocijeni koncentracija toksikanta u testukoja je letalna za 50% organizamaodređene vrste unutar određenogvremenskog razdoblja (obično 24, 48, 72ili 96 sati)

Testovi akutne toksičnosti• Test se postavlja tako da se grupe organizamaodređene vrste izvrgavaju progresivno svevećim koncentracijama toksikanta i da se pratiodređena reakcija koja se može lakokvantifikovati (reakcija tipa sve ili ništa)• Test se obično izvodi uz korišćenje pet različitihkoncentracija i jednom kontrolnom, sa 10-20organizama po koncentraciji

Test akutne toksičnosti za ribe• Princip testa: Ribe se izlažu ispitivanoj supstanci koja je dodatavodi (statički, semi-statički i protočnitest) u opsegu koncentracija uperiodu od 96 sati.• Posmatra se: mortalitet na svaka 24 sata.sunčanica, kalifornijska pastrmka, šaran, ribazebra, belica...100%0%kontrola56%32%18%10%serija razblaženja za test toksičnosti industrijskog efluenta

Test akutne toksičnosti za ribe- zapažanja posle 1 sataKoncentracijacija izloženi živi mrtvi % mortalitet% efluenta100% 10 8 2 20%56% 10 8 2 20%32% 10 9 1 10%18% 10 10 0 0%10% 10 10 0 0%0% 10 10 0 0%

Doza-odgovorodgovor% mortaliteta100501h00 25 50 75procenat efluenta

% mortalitetaDoza-odgovor odgovor vs. vreme10048 h24 h506 h1 h00 25 50 75procenat efluenta (v/v)

Doza-odgovor odgovor vs. vreme% mortaliteta10048 h24 h5048 hLC 5024 hLC 506 hLC 506 h1 h00 25 50 75procenat efluenta (v/v)

Testovi akutne toksičnosti• Ispitivano je ispoljavanjeakutne toksičnosticijanida kod velikogindijskog sarana Labeorohita• 96-časovne vrednostiLC 50 za natrijum-cijanid,cink-cijanid i bakar-cijanidkod L. rohita su bile 0.32mg/L 0.35 mg/L, i 1.1mg/L• Mortalitet L. rohita prirazličitim konc. natrijumcijanida

Testovi akutne toksičnostiMortalitet L. rohitapri različitim konc.cink-cijanidacijanidaMortalitet L. rohitapri različitim konc.bakar-cijanida

Hronični testovi toksičnosti• U slučajevima kada se ispituje delovanjenovih materija i upoređuje osetljivostrazličitih vrsta, došlo se do zaključka da jeza potpunije razumevanje toksikološkihefekata, potrebno vršiti testove narazličitim stupnjevima biološkeorganizacije i uključiti subhronične ihronične testove toksičnosti

Hronični testovi toksičnosti• Cilj ovih testova je da se odredi toksičnostdate supstance posmatrajući promene ufunkcionisanju živih bica, tako što seorganizmi izlažu ispitivanom agensukontinuirano kroz duži vremenski period• Hronični testovi toksičnosti procenjujusubletalni efekat toksikanata nareprodukciju, rast i ponašanje

Ekotoksikološki testovi na Daphniavrstama• Test reprodukcije Daphniamagna (21 dan)Princip testa: Mlade ženke vrsteDaphnia magna (vodene buve)stare manje od 24 sata izložu seispitivanoj supsatnci koja sedodaje u vodu u različitimkontrolakoncentracijama.kontrolarastvaračarastućekoncentracije

Hronični testovi toksičnosti• Dafnia magna• 21-d test preživljavanjai reprodukcije• Standardna metoda zaprocenu hroničnetoksičnosti polutanatau akvatičnimsistemima

Hronični testovi toksičnostiPreživljavanje i reprodukcija tokom 14. i 21. danatestiranja

Ekotoksikološki testovi na algama• Test inhibicije rasta algi (72h)kontrolaNOECPrincip testa: Kulture algi saeksponencijalnim rastom se izlažurazličitim koncentracijama ispitivanesupstance tokom nekoliko generacijapod definisanim uslovima.rastući opseg koncentracijaDizajn: medijum obogaćenhranljivim materijamakontrolisani eksperimentalni uslovi:početna gustina ćelija, temperatura,pH, kvalitet i intenzitet svetlosti

Ekotoksikološki testovi na algama• Posmatra se: inhibicijarasta• Meri se: gustina ćelija(br. ćel/mL) na svaka24h-mikroskopsko brojanje-indirektna tehnika(spektrofotometrijskametoda ili brojaččestica).

Klasifikacija prema toksičnosti zaorganizme u vodiOrganizamEkspozicija(h)KriterijumKoncentracija(mg/L)R50Ribe 96 EC-50< 1Dafnije 48 EC-50< 1Alge 72 IC-50< 1veoma toksičanR51Ribe 96 EC-50> 1 - < 10Dafnije 48 EC-50> 1 - < 10Alge 72 IC-50> 1 - < 10toksičanR52Ribe 96 EC-50> 10 - < 100Dafnije 48 EC-50> 10 - < 100Alge 72 IC-50> 10 - < 100štetan

Test toksičnosti na pticamaAnasplatyrhynchos(divlja patka)Princip testa: ptice konzumirajuhranu u kojoj se nalazerazličite koncentracijeispitivane supstanceDizajn testa: minimum 5 različitihkoncentracija+2 kontrolnegrupeTip studije: 5 danaPosmatrani efekat: mortalitetRezultati se izražavaju kao: LD 50Colinus virginianus(beloglavaprepelica)Colinus coturix(japanska prepelica)

Test toksičnosti na pticama-tumačenjerezultataKlasifikacija prema akutnoj toksičnosti zapticeStepen toksičnostiLD 50(mg/kg)Veoma toksičan za ptice < 25Toksičan za ptice 25-200Štetan za ptice 200-2000Nije toksičan za ptice >2000

Test reprodukcije pticaPrincip testa: ptice kozumirajuhranu u kojoj se nalaze različitekoncentracije ispitivanesupstance (20 nedelja), nakonizleganja iz sakupljenih jajaposmatraju se mladunci ptica (2nedelje)Dizajn testa: 3 različitekoncetracije+2 kontrolne grupePosmatrani efekti: produkcijajaja, tvrdoća ljuske, stepenizlegana mladunaca iz jaja,vijabilnost mladunaca,...Rezultati se izražavaju kao:NOEC

Allium testIspitivanje toksičnosti vode zapićeAllium cepa, 48hPrincip testa: Po 5 lukovica se postavljau pojedinačne epruvete (kontrola,ispitivana voda, razblaženja: 1:1 i 1:5Posmatrani efekti: inhibicija rastakorenčićaUZORAK K D 1:1 1:5U1NX%% inhibicije = 100% - % rasta korenčića u odnosu na kontrolu