Sborník 2009 - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

6. seminář – Pivovarství a kvasné technologie 2009, 2.-3.4.2009, ÚKCHB, VŠCHT Praha___________________________________________________________________________Oxidativní stres a apoptóza u kvasinky Pichia pastorisSkalický Jan, Linhová Michaela, Branská BarboraÚstav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT PrahaCílem této práce bylo ověření a optimalizace metodik detekce reaktivníchkyslíkových částic (ROS) a sledování apoptózy u kvasinky Pichia pastoris svyužitím selektivního fluorescenčního značení a následné mikroskopické acytometrické analýzy.První část práce byla zaměřena na nalezení podmínek oxidativního stresu azavedení metodik detekce ROS pomocí vybraných fluorescenčních sond (2´,7´dichlorodihydrofluoresceindiacetátu, dihydroethidia a dihydrorhodaminu 123).Oxidativní stres byl u buněk vyvoláván přídavkem různých koncentracíperoxidu vodíku. Nejprve byly nalezeny podmínky účinně vyvolávajícíoxidativní stres bez usmrcení buněk (0,1 mol.l-1 H2O2 působící na buňkyv exponenciální fázi růstu po dobu 1 hodiny), které byly následně použityk proměření závislosti fluorescenční odezvy na čase inkubace a koncentracipřidaných sond. Na základě získaných dat byl stanoven interval značení na 15minut a koncentrace přidaného barviva 10 μg.ml-1 pro všechny testovanéfluorescenční sondy.Ve druhé části byla sledována akumulace ROS v průběhu kultivací na různýchuhlíkatých substrátech; konkrétně glukose, glycerolu a methanolu. Zatímco vexponenciální fázi růstu byly na jednotlivých substrátech naměřené rozdíly vintracelulární koncentraci reaktivních kyslíkových částic nevýznamné, vestacionární fázi růstu bylo možné pozorovat zvýšení fluorescenční odezvyzejména u buněk rostoucích na methanolu.Třetí část práce byla věnována detekci apoptózy, kdy byly apoptické buňkyznačeny annexinem V-FITC na základě externalizace fosfatidylserinu na vnějšístranu cytoplazmatické membrány, zatímco nekrotické buňky s porušenýmimembránami byly značeny propidium jodidem. Ke zpřístupněnícytoplazmatické membrány musely být nejprve připraveny protoplastyenzymatickým odstraněním buněčné stěny pomocí lytikasy. Optimalizacemnožství lytikasy a doby jejího působení byla provedena na základěspektrofotometrické a mikroskopické kontroly.V závěru byly zavedené metodiky využity ke sledování akumulace ROS a jejichvlivu na indukci apoptózy v průběhu vsádkových kultivací, přičemž bylpotvrzen vliv stárnutí populace na akumulaci ROS a indukci apoptózy.Akumulaci ROS bylo možné sledovat od 2 týdne kultivace, první buňky značenéannexinem V-FITC byly pozorovány u 3 týdny staré kultury.