ゾウリムシ繊毛打制御の分子機構の解析 Analysis ... - 日本原生動物学会

Jpn. J. Protozool. Vol. 42, No. 1. (2009)25ゾウリムシ 繊 毛 打 制 御 の 分 子 機 構 の 解 析過 能 由 佳 1 , 井 上 桂 那 子 1 ,Jean Cohen 2 ,France Koll 2 , 堀 学2,3 ( 1 山 口 大 学 理 学 部 自 然 情 報 科学 科 , 2 Centre de Génétique Moléculaire, CNRS, France., 3 山 口 大 学 大 学 院 理 工 学 研 究 科 )Analysis of molecular mechanisms of ciliary beat regulation in ParameciumYuka KANO 1 , Kanako INOUE 1 , Jean COHEN 2 , France KOLL 2 and Manabu HORI 2,3 ( 1 Departmentof Bioscience, Faculty of Science, Yamaguchi University., 2 Centre de Génétique Moléculaire, CNRS,France., 3 Graduate School of Environmental Science and Engineering, Yamaguchi University)SUMMARYRadial spokes and dynein arms are major ciliary structures, and it assumed that they have important roles for motilityof cilia. In fact, there are several reports that defects of these structures lead to abnormal motility. However, the functionsof individual proteins composing these structures are still unknown. We attempted to analyze phenotypes of knockdowncells in which particular proteins were silenced with the RNAi feeding method. First, we identified six genes encodingradial spoke proteins, both by comparative genomics and proteomics. Of the six genes, three are highly identical to radialspoke head protein of Tetrahymena and Chlamydomonas. Silencing of Paramecium radial spoke head like 1 (PtRSHL1)led to increased swimming speed, but silencing of PtRSHL2 resulted in decreased swimming speed and a reduced rate ofgrowth. However, silencing both genes results in high sensitivity to Ca 2+ ion. Silencing PtRSHL3 did not give definitephenotypic changes. Five genes encoding inner dynein arm components were also found from ciliary proteomics. Parameciuminner dynein arm intermediate chain 1(PtIC1)-silenced cells are motile but swim forward slowly. However, theydid not exhibit backward swimming under KCl and BaCl 2 treatment. This result suggests that PtIC1 might be the switchfor ciliary reversal induced by internal Ca 2+ increase.[ 目 的 ] ラジアルスポークタンパク 質 は、「9+2 構造 」をもつ 繊 毛 や 鞭 毛 には 不 可 欠 なタンパク 質 が 複雑 に 結 合 した 複 合 体 である。 周 辺 微 小 管 から 突 き 出しており、 中 心 対 微 小 管 と 相 互 作 用 すると 考 えられ、ラジアルスポークを 欠 損 すると 繊 毛 や 鞭 毛 に 異常 な 行 動 起 こることがヒトやクラミドモナスで 分かっている。また、 内 腕 ダイニンも、 巨 大 なタンパク 質 複 合 体 であり、 繊 毛 ・ 鞭 毛 の 屈 曲 に 必 要 である。また、 繊 毛 打 や 鞭 毛 打 の 波 形 の 大 きさと 形 を 決 定 することも 報 告 されている。しかし、これらの 複 合 体を 構 成 する 個 々のタンパク 質 の 機 能 については、 不明 な 点 が 多 い。 我 々は、 機 能 ゲノミクスとして 個 々の 繊 毛 タンパク 質 の 機 能 を 解 析 することを 目 的 に 本研 究 を 行 っている。[ 方 法 ] 食 餌 によるRNAi: target 遺 伝 子 のcoding regionの 一 部 をPCR により 増 幅 し、プラスミドLitmus28iにクローニングする。 塩 基 配 列 の 確 認 後 、発 現 用 大 腸 菌 HT115に 形 質 転 換 し、LB/amp 培 地 で 終夜 培 養 する。これを 新 しいLB/amp 培 地 に 植 菌 し、OD0.4まで 培 養 する。そこへIPTGを 加 えて 更 に3 時 間培 養 し、2 本 鎖 RNAの 発 現 を 誘 導 する。 低 速 遠 心 による 集 菌 後 、OD0.25になるようにIPTGを 含 むBHB/amp培 地 に 再 懸 濁 する。このBHB 培 地 に、 適 度 な 飢 餓 状態 の 若 いゾウリムシを 植 えて 食 餌 させた。遊 泳 速 度 : 暗 視 野 照 明 下 で 細 胞 を 自 由 に 泳 がせ、その 遊 泳 軌 跡 を 定 時 間 露 光 で 撮 影 し、ImageJを 用 いて 数 値 化 した。イオン 刺 激 に 対 する 反 応 : 30 mM KCl 及 び 10 mMBaCl 2 溶 液 に 細 胞 を 移 し、 後 方 遊 泳 を 続 けた 時 間 を 計測 した。[ 結 果 と 考 察 ]ラジアルスポークタンパク 質 (RSP)ラジアルスポークは、 中 心 対 微 小 管 と 接 触 する 部位 にラージアルスポークヘッドと 呼 ばれる 構 造 をもつ。このラジアルスポークヘッドを 構 成 するタンパク 質 のホモログがP. tetraureliaでは3つ(PtRSHL1~3) 見つかっており、PtRSHL2のサイレンシングでは、 繊毛 が 短 くなる 傾 向 があり、 繊 毛 運 動 は 起 こるが、 遊泳 はほぼ 停 止 した。また 増 殖 速 度 もコントロールの半 分 ほどに 低 下 した。しかし、PtRSHL1のサイレンシングでは、 遊 泳 速 度 が 約 1.5 倍 にまで 上 昇 し、 大 きく 螺 旋 を 描 くような 遊 泳 を 示 した。これらPtRSHL1,2のサイレンシングは、 遊 泳 速 度 に 関 して、 逆 の 形 質が 現 れたにも 関 わらず、KClやBaCl 2 に 対 しては、 過剰 反 応 を 示 し、Ca 2+ イオン 高 感 受 性 になることがわかった。 一 方 、PtRSHL3のサイレンシングでは、 遊泳 速 度 がわずかに 低 下 したが、その 他 の 表 現 型 に 大きな 変 化 は 見 られなかった。内 腕 ダイニン (IDA)内 腕 ダイニンは 繊 毛 ・ 鞭 毛 の 屈 曲 に 必 要 であり、 繊 毛打 や 鞭 毛 打 の 波 形 の 大 きさや 形 の 制 御 に 関 係 することが 報 告 されている。ゾウリムシの 内 腕 ダイニン 中