Predavanje 03 (doc. dr. sc. S. Milardović) - ZOAK FKIT

Biosenzor za glukozu s heksacianoferatnim katalitičkimslojem• Glukoza + GOD (FAD) glukolakton + GOD (FADH 2)• O 2+ GOD(FADH 2) H 2O 2+ GOD(FAD)• H 2O 2+ 2 Fe(CN)4-6+ 2H + →2H 2O + 2Fe(CN)3-6• 2Fe(CN)3 -6+ e - →2 Fe(CN)4-6ELEKTRODA ENZIMSKI SLOJ OTOPINAglukoza glukoza otopinaglukoza + GOD (FAD) glukolakton + GOD (FADH 2)(+2)Fe(CN) 4-6(+3)3-Fe(CN) 6-+2eH 2 O 2H 2 OO 2

Shematski prikaz rada enzimskogbiosenzoraA oxA redM redM oxe -electrode

ENZIMSKA KINETIKA• Michaelis-Menten: enzimska reakcija nastaje reakcijomenzima i supstrata: nastajanje enzimsko-supstratnogkompleksa• Osnovne pretpostavke Michaelis-Mentenove kinetike :• 1. Reakcija je prvog reda ukoliko su koncentracijesupstrata relativno niske• 2. Ukoliko koncentracija supstrata kontinuirano raste, redreakcije za supstrat postupno pada od 1 do 0• 3. Brzina reakcije je proporcionalna ukupnoj koncentracijienzima

• Michaelis-Menten: enzimska reakcija nastaje reakcijom enzima isupstrata: nastajanje enzimsko-supstratnog kompleksaE + Sk 1ES (1)k 2• Enzimsko-supstratni kompleks se razlaže na produkt P i oslobađase enzimESk 3E + P (2)k 4

• Maksimalna brzina enzimske reakcije je postignuta kada je enzimzasićen supstratom :karakteristična veličina za svaki enzim i njegovsupstrat• K mvrijednost - odnos konstanti brzina nastajanja i razlaganjeENZIM-SUPSTRATNOG kompleksa• K m=k2k1++k3k4• eksperimentalno je nemoguće utvrditi nastajanje E-S kompleksa odslobodnog enzima i produkta reakcije P- doprinos k 4( jako mala)može se zanemaritiK m=k 2 + k3k1

• Vrijednost K mse određuje eksperimentalno: mjerenje brzinenastajanja produkata kao funkcije poznatih koncentracijasupstrata.• Brzina nastajanja ES kompleksa proporcionalana je koncentracijislobodnog enzima(·[E] - [ES]) i koncentraciji supstrata premaizrazu 1.v =d ( ES )= k 1( [E]- [ES]) ·[S]dt• a prema izrazu 2• -d ( ES )dt= k 2([ES] + k 3[ES] - oznaćava smanjenjekoncentracije ES kompleksa

U ravnoteži se izjednačuju brzine nastajanja i nestajanja ESkompleksak 1( [E]- [ES]) ·[S] = k 2([ES] + k 3[ES]k 2 + k3( [E]- [ES]) ·[S]) / [ES] = = Kk 1 m• Za ravnotežnu koncentraciju ES kompleksadobivamo izraz:[ES]=[E].[S]Km + [S]

Brzina koja se eksperimentalno mjeri je brzinanastajanja produkta P i iznosiv = k 3·[ES]• Uvrštavanjem u prethodnu jednadžbu dobiva seizraz:v = k 3[E].[S]Km + [S]

Maksimalna brzina je proporcionalana prisutnojkoncentraciji enzima:• V max= k 3 ·[E]• i zamjenom u prethodnom izrazu k 3s• V max/ [E] dobiva se•• v =V max[ES]Km + [S]: Michaelis – Mentonova jednadžba

Ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentracijisupstrata

•• U trenutku kada je brzina enzimske reakcije jednaka polovicimaksimalne brzine kemijske rekcije, koncentracija nastalogkompleksa ES i regeneriranog enzima E su jednake, te se izrazmože prikazati:• c (S) polovica maksimalne brzine= K m• Konstanta K m -Michaelis-ova konstanta• 10 -2 i 10 -6 mol/L.• Visoke vrijednosti Michaelis-ove konstante ukazuju na visokekoncentracije supstrata potrebnih za postizanje poluzasićenja(SLABA SELEKTIVNOST ENZIMA PREMA SUPSTRATU).

• ako se na grafičkom prikazu nađe onakoncentracija supstrata kod koje je postignuta½ maksimalne brzine (V max)v = V max/ 2 =V max[ES]Km + [S]½ =[S]Km + ·[S]dobiva se:K m= [S]

Lineweaver-Burkovatransformirana jednadžba• Recipročna vrijednost Michael-Mentonova izrazaKm 1 1 1* + =v c(S)v vmaxmax

Wilson i Shu predložili su metodu za određivanjeMichaelisove konstante enzimski kataliziranih reakcijaI1max+c1(S)*KImmax=1Is• -I sravnotežna vrijednost struje• - c[S] je pripadajuća vrijednost koncentracije supstrata• - I maxje maksimalna vrijednost struje koja se možeizmjeriti biosenzorom.• 1/v = f(1/c[S]) je linearan.• - odsječak na ordinati odgovara vrijednosti 1/I max• - odsječak na apscisi odgovara vrijednosti -1/K m.

Amperometrijski enzimski senzori• -produkt enzimske reakcije se reducira ilioksidira na površini elektrode• O + ne - →R• - struja je proporcionalna koncentracijioksidiranog ili reduciranog oblika• - određena je Faradayevim zakonom:I = z* F *dndt

dndt= D* A*dndl• -D difuzijski koeficijent• -je gradijent promjene količine tvari.• Povezivanjem Fickovog i Faradayevog zakonadolazi se do izraza za struju :I = z* F* A* D *cl

•- A -površina elektrode•- debljina difuzijskog sloja.• SVE OVO VRIJEDI ZA PROCESE KOJI SUKONTROLIRANI DIFUZIJOM (MJEŠANJEELEKTROLITA I NASTRUJAVANJEELEKTROAKTIVNE TVARI NA PLANARNOJPOVRŠINI)• I – granična difuzijska struja (zbroj katodne ianodne struje)

Potencijal brze elektrokemijske reakcije može seprikazati Nernstovom jednadžbom:E = E 0 +RTZFlnCo*foCr*frako se koncentracija oksidiranog i reduciranog oblika redoks paraizračuna iz izraza za graničnu difuzijsku struju E dobiva oblik:E = E 0 +RTzFln +lo−IIRTZFlnDr*foDo*fr

•za slučaj D r= D oi f o= f rdobiva se• E = E 0 +RTzFlnlo−IIkada je I = I o/2 tada je E = E ½tj poluvalni potencijal =standardnom potencijalu.

NERAVNOTEŽNI UVJETI•-NEMA MJEŠANJA OTOPINE•-DIFUZIJSKI SLOJ SE VREMENOMPOMIČE UNUTAR OTOPINE (RASTETIJEKOM ELEKTROKEMIJSKE REAKCIJE)• ZBIVANJA SE ODVIJAJU NA PLANARNOJPOVRŠINI ELEKTRODE

DIFUZIJA ELEKTROAKRIVNE TVARI SE OPISUJEDRUGIM FICKOVIM ZAKONOM• DIFERENCIJALNA JEDNADŽBA - IMA VIŠERJEŠENJA OVISNO O GRANIČNIM UVJETIMAIZRAZ ZA IZRAČUNAVANJE KONCENTRACIJE OVISI OPARAMETRU x i t

• Uvrštavanjem u izraz za struju dobiva se:Cottrell-ova jednadžba

Ponašanje biosenzora

Za enzimske biosenzore kod kojih je enzimska reakcijanajsporiji proces Lineweaver-Burkov prikaz je linearan, itada je odziv senzora kontroliran enzimskom reakcijom:dndt=v=vKmaxm* c(S)+ c(S)odziv biosenzora tada jeI=IKmaxm* c(S)+ c(S)

THE END