Aktualności bioMérieux nr 44 plik do pobrania (format pdf)

iologia molekularnaNASBA – wykrywanie kwasów nukleinowychprzez amplifikacje RNA i DNAdr Piotr GrabarczykPracownia Biologii MolekularnejZakład Immunologii Hematologicznej i TransfuzjologicznejInstytut Hematologii i TransfuzjologiiMetody analizy kwasów nukleinowych oparte na ichamplifikacji (namnażaniu) przyczyniły się do ogromnegopostępu w diagnostyce m.in. czynników zakaźnych.Powszechnie znana jest metoda PCR (ang.polymerase chain reaction). Celem obecnej pracyjest przedstawienie podstaw molekularnych, charakterystykioraz omówienie przykładów zastosowaniametody NASBA - bardzo użytecznej, lecz stosunkowomało znanej w naszym kraju technologii.NASBA (ang. nucleic acid sequence-based amplification)została opracowana pod koniec lat osiemdziesiątych,po raz pierwszy do celów diagnostycznychużyto jej w 1991 do wykrywania RNA wirusa HIV (8).Od tego czasu z powodzeniem była stosowana zarównodo konstruowania komercyjnych testów diagnostycznych,jak i jako narzędzie badawcze wlaboratoriach naukowych.Podstawy molekularne technologii NASBANASBA oparta jest na namnażaniu (amplifkacji) RNA.Proces ten musi być poprzedzony izolacją kwasównukleinowych z materiału biologicznego. Zazwyczajdo tego celu stosowana jest metoda wykorzystującatechnologię Boom’a, która polega na lizie z wykorzystaniemizotiocjanianu guanidyny, po której prowadzonejest nieselektywne wiązanie kwasównukleinowych do złoża krzemionkowego. Proceduryte umożliwiają izolację z dużej objętości surowicy/osocza.Izolacja z dużej objętości materiału pozwalaosiągnąć wysoką czułość badania. Badaniamożna wykonać z każdego rodzaju materiału m.in. zpełnej krwi, z płynu mózgowo- rdzeniowego, kału,BAL-u, różnego materiału biopsyjnego (10, 14, 17).Najłatwiej można wystandaryzować badania surowicyi osocza i ten typ materiału jest najczęściej wykorzystywanyw badaniach różnego rodzaju zakażeń.Oczyszczone kwasy nukleinowe są eluowane zezłoża krzemionkowego buforem i dodawane do mieszaninyreakcyjnej.W mieszaninie reakcyjnej znajdują się dwa odpowiedniodobrane startery (ang. primers) - krótkie oligonukleotydowejednoniciowe fragmenty DNA oraztrzy białka enzymatyczne. Reakcja zachodzi w środowiskuodpowiedniego buforu oraz w obecności (deoksy)rybonukleotydów,które są konieczne dowydłużania primerów i tworzenia produktu amplifikacjitzw. amplikonów. Primer 1 flankujący na końcu 3’amplifikowaną sekwencję posiada dwie części: jedną- komplementarną do namnażanej sekwencji i drugą,zawierającą dodatkowo sekwencję promotora (część5’). Taka konstrukcja primera powoduje wydłużeniepowstających w trakcie amplifikacji dwuniciowych amplikonówo sekwencje promotora rozpoznawaną przezpolimerazę RNA T7. Primer 2 jest skierowany dokońca 5’ badanej sekwencji. Do namnażania kwasównukleinowych wykorzystywane są enzymy uczestniczącein vivo w procesie replikacji: odwrotna transkryptaza(AMV-RT), polimeraza RNA bakteriofaga T7oraz RNaza H. Pierwsze z białek ma aktywność polimerazyDNA, która wydłużając primer syntetyzuje jednonicioweDNA na matrycy RNA, RNaza H degradujeRNA w hybrydach RNA:DNA, zaś polimeraza RNA bakteriofagaT7 wiąże się ze ściśle określonymi sekwencjaminukleotydowymi promotora zakodowanymi wdwuniciowym DNA i z takiej matrycy syntetyzuje zdużą wydajnością cząsteczki RNA.Proces amplifikacji ma charakter izotermiczny i zachodziw stałej temperaturze 41 0 C. Składa się zdwóch faz - niecyklicznej oraz cyklicznej (rycina 1).W pierwszej z nich primer 1 przyłącza się swoiście,na zasadzie komplementarności do odpowiedniejsekwencji RNA wirusowego, następnie do jegokońca 3’ przyłącza się AMV RT i na matrycy RNAsyntetyzowane jest cDNA (ang. complementaryDNA) - powstaje hybryda RNA:DNA. RNaza H hydrolizujewirusowe RNA (badane) w powstałymkompleksie. Do cząsteczki cDNA przyłącza się primer2 i odwrotna transkryptaza syntetyzuje drugą nićDNA. Wówczas zostaje odtworzona dwuniciowa sekwencjapromotora dla polimerazy T7 zapisana wdodatkowej części primera 1 (21).Powstałe w fazie niecyklicznej cząsteczki dwuniciowegoDNA kodujące m.in. sekwencje promotora dlapolimerazy T7 są teraz matrycami dla etapu cyklicznego.Polimeraza T7 rozpoznaje specyficzną dwuniciowąsekwencję promotora i rozpoczyna syntezęRNA. Wydajność tego procesu jest bardzo duża - zkażdej matrycowej cząsteczki DNA powstaje 100-1000 kopii RNA. Primer 2 wiąże się z powstałymRNA i odwrotna transkryptaza syntetyzuje cDNA, ponowniepowstaje hybryda RNA:DNA, w której RNAzaH degraduje RNA. Następnie syntetyzowana jestkomplementarna nić DNA z odtworzonym promotorem,dzięki czemu dwuniciowe DNA ponowniestaje się substratem dla polimerazy T7 (21).

Faza liniowaFaza cyklicznaRNaza Hodwrotna transkryptazaprimer 1RNaza H41 0 Cprimer 1odwrotna transkryptaza41 0 Cprimer 2odwrotna transkryptazaprimer 2T7 RNA polymerasetranskrypcjaodwrotna transkryptazaPolimeraza RNA T7transkrypcjaamplikonyRycina 1. Schemat przebiegu amplifikacji RNA metodą NASBAWarto podkreślić, że o ile w pierwszych latach po opracowaniutechnologii NASBA możliwe było jej wykorzystaniejedynie do namnażania/wykrywania RNA toobecnie metoda ta jest z powodzeniem wykorzystywanatakże do detekcji DNA. Jest to możliwedzięki modyfikacji fazy liniowej (rycina 2). Polega onana wprowadzeniu dodatkowych inkubacji oraz dodaniuenzymu restrykcyjnego Sal-1. W czasie wstępnejinkubacji (5 min, 45 0 C) następuje przecięcie matrycowego(badanego) DNA enzymem restrykcyjnym.Cięcie to ma charakter swoisty i następuje w ściśleokreślonym miejscu krótkiej (6bp) sekwencji. W trakcienastępnego etapu polegającego na 5 minutowejinkubacji w temperaturze 95 0 C następuje denaturacjamatrycowego dwuniciowego DNA. Po zmniejszeniutemperatury do 41 0 C, do przeciętego jednoniciowegoDNA przyłącza się primer 1 (w części 3’komplementarnydo matrycy, a w części 5’ posiadający sekwencjępromotora dla polimerazy T7). Odwrotna transkryptazarozpoznaje wolny koniec 3’ w dwuniciowym fragmencieDNA i wydłuża go, wypełniając nierównekońce na matrycy sekwencji zawartej w primerze.W ten sposób zostaje odtworzona dwuniciowa sekwencjapromotora dla polimerazy T7, która z matrycowegoDNA produkuje z wysoką wydajnościącząsteczki RNA będące substratem dla fazy cyklicznej.Miejsce cięcia Sal –15’3’15 min 41 0 CPozycja cięcia Sal – 1 G TCGAC3’5’5’3’3’5’15 min w 95 0 Cdenaturacja DNA, inaktywacjaenzymu restrykcyjnego5’5’3’3’P1P13’5’5’3’41 0 Cprzyłączanie Primera 1„wypełnianie”końca z promotorem dla T75’3’P15’3’Synteza RNA na matrycyDNA przez T7 PolimerazęRycina 2. Schemat przebiegu fazy liniowej wykrywania DNA metodą NASBA

Wykrywanie produktu NASBAW ciągu 1,5h izotermicznej reakcji liczba cząsteczekfragmentu kwasów nukleinowych zostaje zwielokrotniona10 14 razy. Do wykrywania powstałych amplikonówwykorzystywane są specjalnie skonstruowanesondy molekularne tzw. molecular beacons (rycina 3).Sondy tego typu są oligonukleotydowymi fragmentamiDNA tworzącymi strukturę pętli oraz rdzenia.Rdzeń (stem sequence) ma charakter dwuniciowegoDNA o długości 6-7 bp, którego końce wyznakowanesą dwoma cząsteczkami – barwnikiem fluorescencyjnymoraz tzw. wygaszaczem. Cząsteczka wygaszacza,gdy znajduje się blisko barwnika fluorescencyjnego zapobiegaemisji sygnału fluorescencyjnego przez pochłanianieenergii wzbudzenia i przetwarzanie jej wenergię cieplną. Sekwencja pętli (ang. loop) ma długości20-25 nt. i jest komplementarna względem sekwencji,do której wykrycia została zaprojektowanasonda(tj. do amplikonu). Po przyłączeniu się do amplikonu,struktura sondy ulega otwarciu. Odległośćmiędzy barwnikiem fluorescencyjnym, a „wygaszaczem”zwiększa się i możliwa staje się emisja fluorescencji.Pomiar fluorescencji dokonywany jest w czasierzeczywistym (real-time) metodą elektrochemiluminescencji(ECL) (11, 21).jest wyznakowany innym rodzajem barwnika, coumożliwia jednoczesną specyficzną detekcję sygnałudla RNA badanego i kontrolnego. Obie sondy znajdująsię w mieszaninie reakcyjnej od momentu rozpoczęciaamplifikacji. Wraz z amplifikacją RNA wirusai kalibratora dochodzi do jednoczesnej emisji sygnałufluorescencji będącej wynikiem detekcji amplikonów(15). Na podstawie analizy profilów fluorescencji dlaRNA wirusa oraz kalibratora rejestrowanych w czasierzeczywistym określana jest ilość badanych kwasównukleinowych (rycina 4).ZnormalizowanafluoroscencjaŚlepa próbakalibratorpróbkaWynik negatywny0 15 30 45 0 15 30 45czas (min)200 4001000WygaszaczBarwnik fluorescencyjnyRdzeńpętlahybrygyzacja sondy0 15 30 450 15 30 45 0 15 30 454 000 10 00040 000Rycina 3. Budowa oraz działanie sondy typumolecular beacons10Sondy mogą być znakowane różnymi barwnikami(różna długość emitowanych fal), co pozwala na prowadzeniereakcji w formacie multipleks i równoczesnewykrywanie nawet kilku różnych sekwencji.Stwarza to możliwość stosowania kontroli wewnętrznejdodawanej przed izolacją do badanejpróbki. Jej amplifikacja i hybrydyzacja produktu jejamplifikacji z sondą pozwala kontrolować ekstrakcjękwasów nukleinowych, proces amplifikacji oraz detekcję.Dodatkowo pełni funkcję wewnętrznego standarduilościowego (kalibratora). Przykładowo, wbadaniu RNA HIV-1 dodawana jest stała ilość kontroliwewnętrznej (IC). Sekwencja RNA IC różni sięod RNA wirusowego jedynie we fragmencie odpowiedzialnymza hybrydyzację z sondą na etapie wykrywaniaamplikonów. Wtedy też są używane dwarodzaje sond - każda z inną sekwencją pętli: komplementarnądo produktu namnażania RNA HIV-1lub kalibratorów/IC. Każdy z dwóch rodzajów sond0 15 30 45100 0000 15 30 450 15 30 45 0 15 30 45Wynik Negatywny0 15 30 45Rycina 4. Ocena ilości kwasów nukleinowychmetodą NASBA

Amplifikacja oraz detekcji kwasów nukleinowych sondamimolekularnymi typu molecular beacons odbywasię automatycznie w aparacie NucliSENS EasyQ. Wysoka wydajność zastosowanych reakcji enzymatycznychumożliwia uzyskanie wyniku w krótkimczasie, dla 48 próbek od 1,5 do 3 godzin.Zastosowanie NASBAProces amplifikacji metodą NASBA i detekcja amplikonówodbywa się w jednej probówce, bez koniecznościjej otwierania, co upraszcza procedurę ijednocześnie ogranicza prawdopodobieństwo kontaminacjiproduktem namnażania kwasów nukleinowych(11). Dzięki temu technologia ta może byćwykorzystywana do prowadzenia rutynowych badańczynników zakaźnych na dużą skalę w laboratoriachklinicznych. Przykładem jest komercyjny test przeznaczonydo ilościowych badań wirusa HIV-1. Testynowej generacji charakteryzują się porównywalnąz testami opartymi na reakcji PCR czułością, precyzjąi zakresem liniowości odczytu ilości wirusa (50-3x10 6IU RNA HIV/ml). Badanie metodą NASBA pozwalana wiarygodne określenie ilości wszystkich podtypówgrupy M, odmian należących do grupy O oraz formzrekombinowanych. Monitorowanie zakażenia wirusemHIV-1 pozwala na ocenę przebiegu zakażeniai efektywności stosowanego leczenia (15).W oparciu o technologie NASBA opracowano szeregkomercyjnych testów umożliwiających zarównoocenę ilościową wirusów RNA (HIV), jak i DNA (HPV,enterowirusy, hMPV, RSV, HSV). Opracowywane sąkolejne testy do badania wirusów hepatotropowychHCV (5) i HBV.Warto podkreślić także możliwość opracowywaniawłasnych testów, które mogą być wykorzystywanedo celów badawczych lub diagnostycznych. Dostępnyjest specjalny zestaw do projektowania testówzawierający wszystkie niezbędne odczynniki doamplifikacji za wyjątkiem primerów i sond, które należyzaprojektować uwzględniając sekwencje, któremają być badane.Testy typu „home made” są wykorzystywana dodiagnozowania aktywnego zakażenia wirusem CMVi jego monitorowania (ilościowe oznaczanie RNApp67 wirusa CMV) (16). W przypadku osób z obniżonąodpornością (np. osoby zakażene HIV, chorzypo przeszczepach) aktywne zakażenie CMV początkowobezobjawowe, ostatecznie może zakończyć sięnawet śmiercią. W niektórych ośrodkach regularnebadanie RNA CMV tą metodą stało się rutynowympostępowaniem u osób z grupy wysokiego ryzykaobjawowego zakażenia/reaktywacji CMV (20).NASBA stosowana jest także do badania transkryptówRNA onkogenów E6/E7 ludzkiego wirusa papilomyw celu identyfikacji przewlekle zakażonychkobiet, u których istnieje zwiększone ryzyko wystąpieniaw przyszłości choroby nowotworowej mającejzwiązek z zakażeniem tym wirusem (18).Omówione wcześniej cechy metody pozwalają np.na jednoczesne badanie w formacie multipleks wieluenterowirusów w różnorodnym materiale klinicznym(np. w płynie mózgowo-rdzeniowym, w materialepobranym z dróg oddechowych, w kale)(3, 10) orazw potencjalnie zakażonym pożywieniu, takim jakmięso i warzywa (6). W laboratoriach biologii molekularnejw krótkim czasie możliwe jest projektowanietestu opartego na tej technologii do wykrywania nowychczynników zakaźnych. Przykładem jest szybkieopracowanie testów diagnostycznych do wykrywaniaSARS-CoV (coronawirus wywołujący SARS)(7)oraz wirusa ptasiej grypy (2).Oprócz diagnostyki wirusologicznej NASBA jest wykorzystywanaz powodzeniem do diagnostyki innychczynników zakaźnych, takich jak bakterie i pasożyty.W przypadku tych pierwszych zazwyczaj projektowanesą primery oraz sondy skierowane do rRNA.NASBA była stosowana do diagnostyki Plasmodiumfalciparum (pasożyt wywołujący malarię 19), szereguczynników zakaźnych powodujących chorobyukładu oddechowego (Mycoplasma pneumoniae,Chlamydophila pneumonia(13), Legionellaspp(12). W przypadku ich diagnostyki istotna jestmożliwość badania materiału pochodzącego z drógoddechowych. Badana jest także woda na obecnośćbakterii przecinkowca wywołujacego cholerę (Vibriocholerae) (4).Rośnie zainteresowanie zastosowaniem tej technologiiw diagnostyce onkologicznej. Możliwe jest bowiemwykorzystanie jej do oceny ekspresji ludzkiegoRNA (9, 17) oraz mutacji typu SNP (ang. single nucleotidepolymorphism)(1).NASBA jest technologią, która sprawdziła się w diagnostycezakażeń wirusowych. Może być wykorzystywanado badania innych czynników zakaźnych,a także w innych dziedzinach diagnostyki wymagającejanalizy kwasów nukleinowych. Nowe możliwościstwarza obecnie stosowany format odczytu w czasierzeczywistym, który pozwala oceniać ilościowo badanekwasy nukleinowe.Piśmiennictwo u Autora11

Oryginalne podłożeGRANADA agar14W latach 70-tych w USA zakażenia perinatalne paciorkowcamigrupy B (PGB) stały się główną przyczynązakażeń i zgonów noworodków. W tamtychczasach zakażenia te cechowała wysoka śmietrelność,wynosząca nawet 50%. Wprowadzenie okołoporodowejprofilaktyki antybiotykowej u kobietzakażonych PGB, zapobiegło wystąpieniu jawnej postacichoroby w 1. tygodniu życia dzieci. Zakażenienajczęściej następuje w czasie porodu co staje sięprzyczyną zgonów noworodków.S. agalactiae jest odpowiedzialny za ciężkie infekcjeu noworodków (zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych,sepsa, ). Wykrycie go ma szczególne znaczeniew zapobieganiu, leczeniu i monitorowaniuzakażeń.Wykonanie posiewu z wymazu z pochwy i odbytu wkierunku PGB w zaawansowanej ciąży pozwala zidentyfikowaćkobiety, u których istnieje ryzyko przeniesieniazakażenia na rodzące się dziecko.W rekomendacjach CDC, zaleca się wykonaniebadania u kobiet ciężarnych pomiędzy 35 a 37tygodniem ciąży.Agar Granada jest wybiórczym podłożem do badańprzesiewowych i bezpośredniej identyfikacji Streptococcusagalactiae przeprowadzanychw materiałach klinicznych pobranych od kobietw ciąży i noworodków. Po raz pierwszy podłożezostało opisane przez dr De La Rosa i in.Agar Granada jest oparty o oryginalny skład opisanyprzez dr De La Rosa i pozwala na bezpośrednią identyfikacjęStreptococcus agalactiae, który na tym podłożurośnie w postacie kolonii w kolorze odpomarańczowego do czerwonego.:Mieszanina wybiórcza hamuje wzrost większościbakterii Gram-ujemnych i drożdżaków.Próbkę do badań może stanowić materiał pobranyz pochwy lub mocz od kobiety ciężarnej, albo popłuczynyżołądkowe od noworodka.Materiał posiewasię bezpośrednio na agar lub też po namnożeniuw bulionie Todd Hewitta z antybiotykami. Inkubacjaposianego podłoża w temp. 33 – 37°C przez 18-24godziny w warunkach beztlenowych.

mikrobiologiaPodłoże chromogenne chromID MRSAfirmy bioMérieux – badania własneprof. dr hab. Stefania Giedrys-Kalemba, dr Marlena Zienkiewicz, mgr Katarzyna KopronKatedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej w SzczecinieWprowadzenieNarastanie oporności bakterii na antybiotyki i rozprzestrzenianiesię wieloopornych szczepów w środowiskustało się jednym z istotnych wyzwańmedycyny XXI wieku, a także zagrożeń w dziedziniezdrowia publicznego. Znalazło to odzwierciedleniew obowiązujących aktach prawnych. W myśl ustawyz 6 września 2001 r. o chorobach zakaźnych i zakażeniachi dalszych w tym zakresie rozporządzeniachMinistra Zdrowia, istnieje obowiązekwykonywania badań niezbędnych do rozpoznaniazakażenia i identyfikacji patogennych drobnoustrojów,rejestracji zakażeń zakładowych oraz przekazywaniaorganom Państwowej Inspekcji Sanitarnejraportów o zakażeniach, zachorowaniach, zgonachoraz o drobnoustrojach chorobotwórczych o szczególnejzjadliwości lub oporności, zaliczanych do tzw.drobnoustrojów alarmowych. Należą do nichszczepy MRSA, VISA, VRSA, VRE, Enterobacteriaceaeprodukujące ESBL, oporne na karbapenemyPseudomonas i Acinetobacter i inne. Gwarancjąuzyskania wiarygodnych danych klinicznych i epidemiologicznychsą prawidłowo wykonane badaniamikrobiologiczne, zaś szybka identyfikacja czynnikaetiologicznego zakażenia, ognisk epidemicznych//endemicznych czy zagrożeń związanych z obecnościąpatogenów alarmowych u nosicieli stanowiistotny element ograniczenia rozprzestrzeniania sięszczepów wieloopornych w środowisku. Daje równieżmożliwość oceny stanu epidemiologicznegow zakresie oddziału, szpitala, regionu, kraju.Meticylinooporne gronkowce złociste – MRSA sązaliczane do ważniejszych patogenów alarmowychi stanowią jeden z istotnych problemów, z jakimi borykasię codziennie większość szpitali. Oporność nameticylinę jest związana z obecnością genu mecA,zlokalizowanego w kasecie genowej (SCCmec - 5typów), odpowiedzialnego za wytwarzanie nowegobiałka wiążącego penicylinę (PBP2a lub PBP2’)o małym powinowactwie do antybiotyków beta--laktamowych. MRSA, wywołują szereg zakażeńo wysokiej zachorowalności i śmiertelności, zarównou chorych hospitalizowanych jak i pozaszpitalnych.Za zakażenia szpitalne najczęściej odpowiedzialnesą tzw. HA-MRSA (hospital aquired), szczepy wielooporneco najmniej na trzy grupy antybiotyków, selekcjonującesię klonalnie w środowisku szpitalnym.Szczepy CA-MRSA (community aquired) stanowiągenetycznie odrębną grupę. Cechuje je większawrażliwość na inne grupy antybiotyków, wytwarzanieleukocydyny oraz obecność kasety SCCmecIV lubSCCmecV. Ich mobilność umożliwia prawdopodobnieprzekazywanie genu mecA szczepom MSSA w środowiskupozaszpitalnym. Fenotyp ekspresji opornościna meticylinę jest niejednorodny. U szczepówHA-MRSA zwykle obserwuje się homogenną oporność,gdzie większość lub wszystkie komórki danejpopulacji są oporne na meticylinę. Heterogennaoporność (nieliczne komórki wykazują oporność) występujeobecnie częściej wśród szczepów CA-MRSAi stwarzać może więcej problemów diagnostycznych.Kluczową rolę w epidemiologii i patogenezie zakażeńgronkowcowych odgrywa nosicielstwo S. aureusw nosie. Występowanie nosicielstwa gronkowców,jest zróżnicowane w zależności od badanej populacji:20-50%, w tym szczepów MRSA 1-3%. Większyodsetek nosicielstwa MRSA obserwuje się wśród pracownikówsłużby zdrowia, odpowiedzialnych częstoza zakażenia endemiczne występujące na oddziale.Nosicielstwo MRSA u pacjenta sprzyja zakażeniu endogennemutym samym szczepem, może on byćtakże źródłem zakażenia dla innych chorych.Identyfikacja i izolacja zakażonych lub skolonizowanychchorych oraz badania przesiewowe w kierunkunosicielstwa MRSA przy przyjęciu do szpitala, atakże wśród personelu to najbardziej skuteczny sposóbkontroli zakażeń MRSA. Do wykrywania i szybkiejidentyfikacji szczepów MRSA w różnych materiałachklinicznych wykorzystywane jest podłoże chromIDMRSA firmy bioMerieux. Podłoże zawiera wybiórcząmieszaninę różnych bogatych w substancje odżywczepeptonów, antybiotyk cefoksytynę oraz substratchromogenny a-glukonidazę. Szczepy MRSA poprzezujawnienie aktywności a-glukonidazy tworzązielone kolonie. Podłoże jest selektywne wobecGram-ujemnych bakterii, enterokoków, meticylinowrażliwychgronkowców oraz drożdżaków.Cel badańOcena przydatności podłoża chromogennegochromID MRSA do wykrycia nosicielstwa MRSAw nosie oraz do potwierdzenia oporności na meticylinęu meticylinoopornych szczepów gronkowcówpochodzących z własnej kolekcji.Materiał i metodyA. Nosicielstwo MRSA zbadano u 116 chorych sukcesywnieprzyjmowanych do zabiegów, w tym95% stanowiły zabiegi planowe, na oddziały chi-

urgii: naczyniowej, onkologicznej, transplantacyjneji kardiochirurgii. Wymazy z przedsionka nosapobierano w dniu przyjęcia, posiewano na oddzielnegotowe płytki agarowe: chromID MRSAoraz Columbia z dodatkiem 5% krwi baraniej(bioMerieux). Podłoża inkubowano w temp.35 o C przykrywką do dołu w warunkach tlenowych.Hodowle na podłożu chromIDMRSA oceniano po 18-24 godzinach inkubacjizgodnie z zaleceniami producenta.W przypadku wyniku ujemnego na podłożuchromID MRSA (brak wzrostu lub brak zabarwienia)inkubację przedłużano do 48 godz. Porównywanowyniki posiewów otrzymanychrównolegle na obu podłożach, identyfikację koloniiprowadzono wg ogólnie przyjętych standardów.B. Dodatkowo potwierdzenie oporności na metycylinęna podłożu chromID MRSA oceniono w stosunkudo 125 szczepów gronkowcówpochodzących z własnej kolekcji zidentyfikowanychwcześniej jako oporne na meticylinę: MRSAkoagulazo-dodatnie – 55, MRSA koagulazoujemne- 36, MRSA CF-ujemne – 11, S. haemolyticus– 23. Oporność na meticylinę byłazweryfikowana testem na obecność białka PBP2a(PBP2’) – Slidex MRSA Detection (bioMerieux)oraz metodą PCR – wykrycie genu mecA. Wszystkieszczepy MRSA koagulazo-ujemne posiadałygen warunkujący wytwarzanie koagulazy – coa.Szczepy MRSA należały do wieloopornych, aczkolwiekwykazywały zróżnicowaną oporność naantybiotyki. W większości były oporne na makrolidy,aminoglikozydy i chinolony, wszystkie byływrażliwe na wankomycynę; fenotyp opornościwskazuje na przynależność do HA-MRSA. Kontrolęwłaściwości odżywczych podłoża sprawdzanoprzy użyciu szczepu S. aureus ATCC 43300 (kontroladodatnia) i S. aureus ATCC 29213 (kontrolaujemna).Próbka badana(wymaz z nosa, gardła, krocza, pachwin, pach, skóry)inkubacja 8-24 godzinychromID MRSAposiew bezpośrednietap namnożenia8Kolonie zielone =identyfikacja MRSAJeśli wynik badania jestnegatywny nalezy przeprowadzićdodatkową inkubację przez kolejne 24 godzinychromID MRSAKolonie zielone =identyfikacja MRSAJeśli wynik badania jestnegatywny nalezy przeprowadzićdodatkową inkubacjęprzez kolejne 24 godziny

Wyniki i omówienieNosicielstwa szczepu MRSA nie stwierdzono u żadnegoze 116 zbadanych chorych. U 15 (13%) osóbwykryto nosicielstwo gronkowców MSSA (meticylinowrażliwe).Wzrost szczepów MSSA obserwowanojedynie na podłożu agarowym Columbia z 5 % krwiąbaranią; żaden ze szczepów MSSA nie wyrósł napodłożu chromID MRSA. Brak wzrostu szczepówMSSA na agarze chromID MRSA potwierdzają równieżinni badacze.Wzrost innych niż MRSA bakterii na podłożu chromIDMRSA stwierdzono w 47 (40%) przypadkach.W 26 były to meticylinooporne S. epidermidis, któretworzyły dość duże biało-jasnozielonkawe kolonie, wpozostałych 21, jako małe kolonie, o zróżnicowanymodcieniu koloru białego, izolowanokoagulazo-ujemne gronkowce,mikrokoki, dyfteroidy oraz niechorobotwórczeNeisseria spp.Wyniki nasze są zgodne z doniesieniami innych autorów,którzy podają, że niektóre gronkowce koagulazo-ujemnemogą tworzyć na podłożu chromIDMRSA blado zielone kolonie, jak również Bacillus,Gram-ujemne pałeczki czy szczepy ESBL; kolonie temają jednak inny wygląd.Wszystkie szczepy MRSA (100%) pochodzące z kolekcji,niezależnie od indywidualnych właściwościbiologicznych (koagulazo-dodatnie, koagulazoujemne,CF-ujemne) wyrosły na podłożu chromIDMRSA w postaci charakterystycznych zielonych koloniipo 24 godzinach inkubacji; tylko 3 szczepy wyrosłypóźniej, po 48 godzinach. Z koleimeticylinooporne S. haemolyticus, pochodzące zwłasnej kolekcji wyrosły po 24 godzinach na podłożuchromID MRSA w postaci białych kolonii, co potwierdzaspecyficzność podłoża jedynie w stosunkudo szczepów MRSA i jego przydatność szczególniew badaniach skryningowych MRSA.Doniesienia z literatury podają jednak, żeniektóre szczepy S. aureus, nie posiadającegenu mecA, a wykazujące nadprodukcjępenicylinazy mogą tworzyć napodłożu chromID MRSA charakterystycznezielone kolonie; wymaga to dodatkowejweryfikacji szczepu. Natomiastszczepy posiadające gen mecA, ale charakteryzującesię niską wartością MIC dla cefoksytyny(≤ 4 mg/l) mogą nie wyrosnąć na tympodłożu.inkubacja 8-24 godzinyinkubacja 8-24 godzinyWnioski1. Podłoże chromID MRSA jest przydatnym podłożemchromogennym służącym do wykrywaniai identyfikacji metycylinoopornych S. aureus(MRSA) o dużej czułości i swoistości.2. Umożliwia szybkie i bezpośrednie wykrycieszczepów MRSA, dających charakterystyczne zielonezabarwienie.3. Wzrost innych drobnoustrojów jest w większościprzyhamowany lub występuje w postaci jasnozielonkawychlub białych kolonii, łatwych do różnicowaniaz koloniami MRSA.4. Podłoże chromID MRSA powinno być włączonedo badań przesiewowych w kierunku nosicielstwaMRSA u personelu i chorych przyjmowanychszczególnie na oddziały chirurgiczne, IToraz do zabiegów planowych, a także do zestawurutynowych podłoży stosowanych do posiewówmateriałów klinicznych pochodzącychod chorych z czynnikami ryzyka zakażenia MRSA.5. Szybkie wykrycie MRSA u chorego lub nosicielai wdrożenie odpowiednich procedur izolacji, leczenialub eradykacji umożliwia skuteczniejszynadzór nad patogenami alarmowymi i lepsząkontrolę zakażeń szpitalnych; w efekcie prowadzićbędzie do ograniczenia rozprzestrzenianiasię szczepów MRSA w danym środowisku.Piśmiennictwo u Autorów

NOWOŚĆ !!Konelab PRIME 301. Selektywny wieloparametrowy analizator typu random access2. Wydajność: 300 oznaczeń fotometrycznych na godzinę, z przystawką ISE 480 oznaczeń na godzinę3. Możliwość oznaczania: substratów enzymów elektrolitów w module ISE :sód, potas, chlorki, wapń zjonizowany, pH, lit pierwiastków białek specyficznych leków – terapia monitorowana (TDM) środków uzależniających (DoA)4. Możliwość zaprogramowania do 500 parametrów (testy fotometryczne, testy kalkulacyjne, testy zewnętrzne,profile diagnostyczne, możliwość pracy w systemie „autorefleks”)5. Metody pomiaru: metody kolorymetryczne metody turbidymetryczne metody potencjometrii bezpośredniej reakcje punktu końcowego reakcje kinetyczne reakcje liniowe i nieliniowe6. Źródło światła: lampa halogenowa (zakres długości fali 340-700 mm)7. Pomiar mono i bichromatyczny8. Odczynniki objętość odczynnika od 2 do 250 µl - średnio 150 µl na test 45 pozycji na odczynniki system chłodzenia odczynników (temp. 4 - 8°C) możliwość stosowania do czterech odczynników na jeden test monitorowanie zużycia odczynników system automatycznej kontroli jakości dla nowej butelki odczynnika detektor poziomu odczynnika wewnętrzny czytnik kodów paskowych dla odczynników29. Próbki: Objętość próbki (surowica, osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy) od 1 do 120 µl, średnio 2-15 µl, dla ISE 50µl 84 pozycje na próbki pacjentów możliwość ciągłego ładowania próbek możliwość wykonywania badań pilnych, bez przerywania ciągłości pracy analizatora, stały dostęp do 6 pozycjiSTAT detektor poziomu próbki automatyczna detekcja mikroskrzepów w badanej próbce system chłodzenia próbek pobieranie materiału do badań z naczynek 0,5 i 2 ml lub z probówek 5 ml, 7 ml i 10 ml próbki rutynowe, pilne i priorytetowe wewnętrzny czytnik kodów paskowych dla próbek pacjentów10. Kalibracja: kalibracja liniowa i nieliniowa automatyczne rozcieńczanie stężonych standardów 20 chłodzonych pozycji na surowice kalibracyjne

Wieloparametrowyanalizator biochemiczny11. Kontrola jakości: kontrola jakości w czasie rzeczywistym graficzna prezentacja wyników kontroli jakości proste i złożone reguły Westgarda dzienne i zbiorcze raporty kontrolne 19 chłodzonych pozycji na surowice kontrolne12. Automatyczne ładowanie kuwet zapewniające ciągłość pracy analizatora na min. 2 godz. (600 kuwet w automatycznymzmieniaczu), możliwość ciągłego uzupełniania kuwet13. Statystyka liczby wykonywanych badań, archiwum danych o pacjentach i wynikach badań, archiwum krzywych kalibracyjnych,zbiorczy raport dziennej listy roboczej wraz z wynikami badań14. Zintegrowany z analizatorem komputer Pentium IV R PC, drukarka zewnętrzna laserowa, oprogramowanie w środowiskuWindows XP - program graficzny, wprowadzanie danych o próbkach i odczynnikach za pomocą kodu paskowego,monitora dotykowego (typu tauch screen) lub klawiatury15. Możliwość włączenia analizatora w sieć komputerową szpitala (RS 232)16. Oprogramowanie w języku polskim2

usługi w ofercieUsługi w oferciefirmy bioMérieux Polska221. Odczyt profilu identyfikacyjnego drobnoustrojówz użyciem testów API/IDUsługa skierowana jest do użytkowników testówAPI/ID, którzy nie posiadają aktualnych książekkodów (przypominamy o konieczności okresowegoich uaktualniania) czy programu apiWEB®. PracownikDziału Obsługi Klienta po otrzymaniu cyfrowegoprofilu odczytuje wynik identyfikacji (posługując sięzawsze aktualną bazą danych) i w ciągu max 2 godzinwysyła go pod wskazany przez Zamawiającegoadres/fax/e-mail.2. Szkolenia z obsługi aparatów oferowanychprzez bioMerieux PolskaW przypadku stwierdzenia przez laboratorium potrzebyprzeprowadzenia szkolenia w zakresie obsługiaparatu, szkolenia uzupełniającego (np. w wynikuzmiany personelu laboratorium) lub szkolenia natemat wykonywania badań z wykorzystaniem odczynnikówi systemów oferowanych przez firmę bio-Merieux Polska oraz interpretacji wyników, nasispecjaliści ds. produktów pozostają do dyspozycji.Szkolenia są organizowane w laboratorium w siedzibienaszej firmy w Warszawie lub w miejscu wskazanymprzez użytkownika.3. Szkolenia edukacyjne z zakresu mikrobiologiiprzemysłowej oraz diagnostyki laboratoryjnejOdpowiadając na potrzeby rynku firma organizujetzw. szkolenia edukacyjne, które pozwalają na poszerzaniewiedzy i podnoszenie kwalifikacji.Wykładowcami są osoby nie związane z firmą -uznane autorytety naukowe, długoletni praktycy, specjaliściw danej dziedzinie.Dotychczas zorganizowaliśmy m.in. szkolenia natemat:„Diagnostyka mikrobiologiczna żywności”„Walidacja metod mikrobiologicznych i szacowanieniepewności wyników”„Warsztaty - kontrola jakości badań biochemicznych”Jesteśmy otwarci na wszelkie sugestie dotyczące tematówszkoleń edukacyjnych.Jednocześnie informujemy, że uczestnicy szkoleń zzakresu diagnostyki laboratoryjnej uzyskują punktyedukacyjne przyznawane przez Krajową Izbę DiagnostówLaboratoryjnych.4. Usługi serwisu technicznego - przeglądy,konserwacje, naprawyDbając o jakość i komfort Państwa pracy, nasi specjaliścids. technicznych są do Państwa dyspozycji wkażdej chwili telefonicznie w dni robocze oraz, jeślizaistnieje pilna potrzeba wykonania naprawy, wciągu 1-48 godz. od chwili zgłoszenia.Przeglądy i konserwacje są niezbędną czynnością,która powinna być wykonywana regularnie wg zaleceńproducenta aparatów. Po wykonaniu przegląduprzedstawiciel firmy przygotowuje protokół przeglądutechnicznego i walidacji oraz certyfikat jakości i bezpieczeństwaurządzenia medycznego potwierdzającyprawidłowe działanie aparatu.Brak ważnego przeglądu uniemożliwia rozstrzygnięciereklamacji aparatu lub odczynników na korzyśćużytkownika.Po okresie gwarancji oferujemy podpisanie umowyna usługi serwisu technicznego. Oferujemy 3 typyumów: 1/ obejmujące tylko przeglądy, 2/ obejmująceprzeglądy i jedną naprawę w ciągu roku, 3/ pełnegoryzyka (pełna obsługa serwisowa).Podpisanie umowy gwarantuje: Atrakcyjne rabaty na ceny usług i części zamiennych Priorytet naprawy/przeglądu (użytkownik zpodpisaną umową jest obsługiwany w pierwszejkolejności) Możliwość kontaktu z serwisem także w dniwolne od pracy (weekendy, święta) Wydłużona gwarancja na wykonaną usługę iwymienione części Możliwość zaplanowania wydatków na obsługętechniczną aparatu – istotne przy tworzeniubudżetu laboratoriumSzczegółowych informacjio oferowanych usługach udzielaDział Obsługi Klientatel. 022 569 85 85fax 022 569 85 56e-mail: dok@eu.biomerieux.comDział Serwisu Technicznegotel. 022 569 85 90fax 022 569 85 54e-mail: serwis@eu.biomerieux.com

mikrobiologiaLaboratoryjna kontrola jakościpodłoży mikrobiologicznychdr Elżbieta Stefaniuk 1,21 Narodowy Instytut Leków w Warszawie2 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej w WarszawiePodłoża wzrostowe odgrywają zasadniczą rolę wpracy każdego laboratorium mikrobiologicznego. Sąone powszechnie stosowane do izolowania, identyfikowaniaoraz oznaczania lekowrażliwości różnychczynników etiologicznych zakażeń. Większość laboratoriówmikrobiologicznych przygotowuje we własnymzakresie podłoża przeznaczone zarówno dodiagnostyki rutynowej, jak też do celów naukowych.Podstawą zapewnienia dobrej jakości podłoży umożliwiającychotrzymywanie satysfakcjonujących wyników,jest system zarządzania jakością. Laboratoriumpowinno bezwzględnie stosować ściśle określonekryteria przygotowywania wszelkiego rodzaju podłożymikrobiologicznych.Celem niniejszej pracy jest przedstawienie zasadkontroli jakości podłoży mikrobiologicznych zuwzględnieniem testów możliwych do wykonania wtym zakresie. Kontrola jakości podłoży do oznaczanialekowrażliwości została omówiona w jednym z poprzednichzeszytów Aktualności bioMérieux, tak więcniniejsza praca ograniczy się do podłoży wzrostowychstosowanych w diagnostyce mikrobiologicznej.Procedury kontroli jakości podłoży zostały podzielonena różne sekcje w zależności od parametrów, którewymagają oceny.Klasyfikacji podłoży mikrobiologicznych dokonuje sięw oparciu o różne kryteria, m.in.:1. skład podłoża – podłoża na bazie składników naturalnych,podłoża syntetyczne2. konsystencja – podłoża stałe, półpłynnei płynne3. zastosowanie – podłoża namnażające,różnicujące, wybiórcze, wybiórczo-różnicujące,transportowe, do przechowywania izolatów4. pochodzenie – podłoża komercyjne na płytkach,w probówkach, w butelkach oraz podłoża przygotowywanew laboratorium poprzez połączeniekilku składnikówDo podstawowych składników podłoży mikrobiologicznychnależą:1. składniki odżywcze budulcowe i energetyczne2. składniki wybiórcze pozwalające na wzrost określonychdrobnoustrojów3. składniki różnicujące4. wskaźniki obecne w podłożu lub dodawanedo podłoża po wzroście drobnoustrojów5. składniki mineralne i sole stabilizujące pH, zapewniająceodpowiednie ciśnienie osmotyczne6. składniki decydujące o konsystencji podłoża7. czynniki wzrostowe8. wodaDo czynników odpowiedzialnych za jakość podłożymikrobiologicznych należą:1. jakość poszczególnych składników2. skład jakościowy i ilościowy3. przestrzeganie odpowiednich procedurprzygotowania4. jałowość5. sposób pakowania6. sposób przechowywania i transportuKontrola jakości podłoża mikrobiologicznegopowinna więc obejmować:1. kontrole o charakterze ogólnyma. kontrolę właściwości fizycznych: wyglądzewnętrzny, barwa, przejrzystość, konsystencja,wilgotność, gładkość powierzchni,grubość warstwy agarowej i/lub objętośćrozlanego podłoża, zawartość wody,odczyn pHb. kontrolę jałowości2. kontrolę o charakterze szczegółowym(jakościową i ilościową kontrolęmikrobiologiczną):a. żyzność (cecha umożliwiająca zapewnieniedrobnoustrojom optymalnych warunkówwzrostowych),b. selektywność (cecha podłoża umożliwiającaprowadzenie badań z zastosowaniem substancjihamujących wzrost części drobnoustrojów,by ułatwić wzrost innym)c. własności podłoży pozwalające na wstępnąocenę cech biochemicznych lub/i fiziologicznychdrobnoustrojów.Kryteria oceny składników podłożymikrobiologicznychJakość podłoży zależy bezpośrednio od jakości podstawowychsurowców użytych do ich przygotowania.Najważniejszym surowcem używanym do produkcjipożywek jest woda. Należy w tym celu stosowaćwodę destylowaną lub dejonizowaną lub otrzymywanąmetodą odwróconej osmozy. Woda powinnabyć wolna od substancji hamujących wzrost drobnoustrojów(jony miedzi) i substancji toksycznych.23

24Woda powinna być także kontrolowana pod kątempH oraz przewodnictwa. Przewodnictwo wody powinnowynosić poniżej 15 µS/cm (mikroSiemens/cm),zaś odczyn pH powinien mieścić się wzakresie 7,5 do 5,5. Ważnym czynnikiem dla podłożyprzygotowywanych i wylewanych w laboratoriachjest także jakość płytek Petriego, materiał zjakiego są wykonane oraz sposób ich sterylizacji. Jeślilaboratorium używa płytki szklane, powinny być toszkło borokrzemianowe, gdyż szkło sodowe powodujewypłukiwanie związków alkalicznych do podłożymikrobiologicznych.Najważniejszym składnikiem dodawanym do podłożyjest krew, a jej jakość decyduje o wyglądzie iprzydatności podłoży zawierających w swoim składziekrew. Przed przygotowaniem podłoża należyskrupulatnie sprawdzić jałowość, homogenność, lepkośći kolor krwi. Wszystkie inne składniki podłożymikrobiologicznych, w tym odczynniki chemicznepowinny być odpowiednie do celów mikrobiologicznychi charakteryzować się czystością analityczną.Kryteria sterylizacjiProces sterylizacji podłoży mikrobiologicznych odgrywaistotną rolę w zapewnieniu odpowiedniej jakościpodłoży stosowanych w laboratoriummikrobiologicznym. Zasadniczo sterylizacje podłożyprzygotowywanych w laboratorium wykonuje się poprzezautoklawowanie. Czas autoklawowania orazilość sterylizowanego podłoża powinny być ściśleokreślone, a przyjęte zasady bezwzględnie przestrzegane.Optymalizacja procesu ogrzewania ograniczado minimum termiczną degradację podłożalub niepożądane reakcje pomiędzy poszczególnymiskładnikami. Objętość podłoża mikrobiologicznegopoddawanego sterylizacji nie powinna być zbyt duża,maksymalnie powinna wynosić dwa litry. Warunkiprocesu sterylizacji powinny być regularnie i rygorystyczniekontrolowane z użyciem różnego rodzajuwskaźników fizycznych, biologicznych i chemicznych.Kontrola parametrów fizycznychKażdą partię przygotowanego podłoża mikrobiologicznegonależy kontrolować pod kątem grubościwarstwy podłoża na płytce Petriego lub objętości wprobówkach, braku pęcherzyków powietrza, gładkiejpowierzchni agaru bez pęknięć i widocznej krystalizacjipodłoża. Ocena tych parametrów dokonywanajest wizualnie, a jej wyniki powinny zostać zapisanew odpowiednim dokumencie. Niezwykle istotnymparametrem fizycznym podłoża mikrobiologicznegojest odczyn pH, którego wartość należy monitorowaćprzed i po autoklawowaniu podłoża.Kontrola wzrostu na podłożachmikrobiologicznychDla oceny jakości podłoży w zależności od ich przeznaczeniastosuje się ocenę wzrostową z zastosowaniemodpowiednich drobnoustrojów i ocenywzrostu ilościowej, półilościowej i jakościowej. Dlametod ilościowych zaleca się stosowanie specjalnejpożywki referencyjnej, przy ocenie ilościowej ipółilościowej. Stosowanie pożywki referencyjnej pomagaw interpretacji wyniku. Kontrola wzrostu drobnoustrojówna podłożach wzrostowych ma na celuwykazanie, czy wzrost na danym podłożu jest dostatecznieszybki i obfity, czy drobnoustroje na badanympodłożu przybierają postać kolonii ocharakterystycznym, niezmiennym wyglądzie, czyreakcje biochemiczne zachodzące podczas wzrostudrobnoustroju są łatwe do określenia i odpowiedniedla danego drobnoustroju. Badaniewłaściwości odżywczych podłoża zarówno stałegojak i płynnego należy przeprowadzić z zastosowaniemodpowiednich drobnoustrojów o ściśle określonychwymaganiach odżywczych i odpowiednich,ściśle określonych szczepów wzorcowych.qqqqBadanie żyzności podłoża stałego wg zaleceńCLSI (NCCLS) – dokumentu M22-A2;Na badane podłoże nanieść i rozprowadzić10 µl 100-krotnego rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnejodpowiedniego drobnoustrojuo gęstości 0,5 McFarlanda. Następnie posianepodłoże należy inkubować 16-20 godzinw temperaturze 35°C w warunkach tlenowych.Drobnoustroje dobrze rosnące powinny wykazywaćwzrost zlewny.Badanie żyzności podłoża stałego wg normyEN ISO 11133 „Guidelines on preparation andproduction of culture media”;kryterium oceny stanowi współczynnik żyznościPR (ang. productivity ratio):PR=Ns/Nogdzie Ns oznacza całkowitą liczbę jednostek tworzącychkolonie (CFU) danego szczepuna podłożu testowanym; No – całkowitą liczbęjednostek tworzących kolonie danego szczepuna podłożu referencyjnym.Współczynnik żyzności dla drobnoustrojówo specyficznych wymaganiach wzrostowych ipodłoży nieselektywnych powinien być większyod 0,7, zaś w przypadku podłoży selektywnychpowinien wynosić co najmniej 0,1.Ocena wybiórczości (selektywności) podłożastałego wg zaleceń CLSI (NCCLS) – dokumentuM22-A2;Na badane podłoże należy nanieść i rozprowadzić10 µl 10-krotnego rozcieńczenia zawiesinyokreślonego szczepu wzorcowego o gęstości 0.5McFarlanda. Posiane podłoże należy inkubować16-20 godzin w temperaturze 35°Cw warunkach tlenowych, a następnie ocenić podkątem obecności lub braku wzrostu..Ocena wybiórczości (selektywności) podłożastałego wg normy EN ISO 11133;Określa się współczynnik selektywności SF (ang.selective factor) będący różnicą pomiędzy najwyższymrozcieńczeniem wykazującym wzrost

qqprzynajmniej 10 jednostek tworzących kolonie(CFU) na podłożu referencyjnym (Do) a najwyższymrozcieńczeniem wykazującym analogicznywzrost na podłożu badanym (Ds.).SF= Do-DsWspółczynnik selektywności SF wyrażany jestw jednostkach Log10 i dla drobnoustrojów niespecyficznychna podłożu selektywnympowinien wynosić co najmniej 2.Ocena współczynnika wzrostu GI (ang. growthindex) dla podłoża stałegoDla oceny żyzności – wzrost szczepu specyficznegopowinien wykazywać wszystkie typowecechy, a współczynnik wzrostu drobnoustrojówspecyficznych powinien być większy od 6(GI spec > 6).Dla oceny selektywności – wzrost szczepu niespecyficznegopowinien zostać częściowo lubcałkowicie zahamowany. Współczynnik wzrostudrobnoustroju niespecyficznego powinien byćniższy od 6 (GI niespec < 6).Ocena żyzności i selektywności podłoży płynnychDo oceny wykorzystuje się metody ilościowe,półilościowe i jakościowe:- metoda ilościowa – dla drobnoustrojów specyficznychwspółczynnik żyzności wynosi PR>0,1,przy minimalnej gęstości 10 6 -10 8 CFU/ml, natomiastwskaźnik selektywności dla drobnoustrojówniespecyficznych SF≥2, przy minimalnejgęstości 10 4 CFU/ml- metoda półilościowa – dla drobnoustrojówspecyficznych po przesiewie na selektywnepodłoże agarowe wskaźnik żyzności PR>10,współczynnik wzrostu GI>6. Dla drobnoustrojówniespecyficznych po przesiewie na nieselektywnepodłoże agarowe wskaźnik żyznościPR

obecność strątów 1. przekroczona temperatura sterylizacji i/lub rozpuszczania,przegrzanie podłoża2. zmiana uwodnienia podłoża3. zanieczyszczona woda i/lub szkłotoksyczność 1. przekroczenie temperatury grzania podczas sterylizacjii/lub rozpuszczania (spalenie)ubogi wzrost 1. zanieczyszczona woda i/lub szkło2. zmiana uwodnienia podłoża, degradacja podłoża3. niedokładne odważenie poszczególnych składników podłoża4. niedokładne wymieszanie składników podłoża5. przegrzanie podłożaniska selektywność 1. zanieczyszczona woda i/lub szkło2. niedokładne odważenie poszczególnych składników podłoża3. niedokładne wymieszanie składników podłoża4. degradacja podłoża5. zmiana warunków ogrzewania podłoża26Szczepy drobnoustrojów do kontroli jakościpodłoży mikrobiologicznychJak wspomniano powyżej, kontrolę laboratoryjnąpodłoży mikrobiologicznych przeprowadza się woparciu o cechy charakterystyczne wybranych szczepówwzorcowych drobnoustrojów. Zestaw szczepówkontrolnych powinien obejmować szczepy referencyjnepochodzące z uznanych światowych bądź europejskichkolekcji szczepów wzorcowych, takich jakATCC (American Type Culture Collection), DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen), NCTC (National Collection of Type Culture,Wielka Brytania) itp.. Dodatkowo, wskazane jest,aby laboratorium dysponowało własnymi szczepamiodniesienia, izolatami z materiałów klinicznych opracowywanychw danym laboratorium, jak równieższczepami z międzylaboratoryjnych badań porównawczych.Wszystkie drobnoustroje włączane dobazy szczepów odniesienia powinny być wcześniejdobrze scharakteryzowane, a cechy charakterystyczneodpowiednio udokumentowane.Zestawy szczepów kontrolnych (wzorcowych, odniesienia)powinny zawierać szczepy umożliwiająceprzeprowadzenie oceny jakości istotnych parametrówpodłoży mikrobiologicznych używanych w diagnostycezakażeń. Zestaw powinien obejmowaćzarówno szczepy dobrze, jak i słabo rosnące,szczepy, których wzrost na danym podłożu jest częściowolub całkowicie hamowany oraz szczepy określanemianem „kontroli ujemnej”.Wszystkie szczepy wzorcowe używane w laboratoriumpowinny być odpowiednio przechowywane, wwarunkach i na podłożach zapewniających stabilnośćcech charakterystycznych i uniemożliwiających zanieczyszczenieinną florą bakteryjną czy grzybiczą.Laboratoryjna kontrola jakości komercyjnychpodłoży mikrobiologicznychZadaniem laboratorium w zakresie kontroli jakościpodłoży mikrobiologicznych gotowych do użycia, dostarczanychprzez producenta jest:– ocena warunków transportu podłoża z uwzględnieniemtemperatury, szczelności opakowania,sposobu oznakowania),– wizualna ocena szczelności opakowania– ocena kompletności informacji zawartej w przekazanejdokumentacji (ulotka informacyjna, etykiety,certyfikaty jakości)Producent zobowiązany jest do podania w dokumentacjipodłoża mikrobiologicznego następującychinformacji:1. dane producenta, nazwa, adres2. nazwa, kod i numer katalogowy podłoża3. seria (data produkcji/numer partii)4. data ważności5. warunki przechowywania (temperatura, dostępświatła)6. skład jakościowy i ilościowy podłoża7. wartość odczynu pH podłoża przed użyciem8. zastosowanie i opis działania9. sposób użycia10. ostrzeżenia , zagrożenia zdrowotne, zalecaneśrodki ostrożności11. sposób unieszkodliwianiaCertyfikat jakości podłoża mikrobiologicznego dostarczanegoprzez producenta, gotowego do użyciapowinien uwzględniać cechy fizykochemiczne i mikrobiologicznepodłoża (pH, wygląd, konsystencję,żyzność, selektywność, cechy biochemiczno-fizjologicznedrobnoustrojów testowych przeznaczonychdo kontroli danego podłoża).Przedstawione w pracy zasady kontroli jakości podłożymikrobiologicznych przygotowywanych w laboratoriumwskazują na szereg istotnych zagadnień, którychniespełnienie może stanowić o nieprawidłowej diagnostycemikrobiologicznej. Laboratorium, które niejest w stanie sprostać wymaganiom zarówno zaleceńjak i różnego typu norm międzynarodowych, odnoszącychsię do zapewnienia jakości przygotowywanychprzez laboratoria podłoży mikrobiologicznych, powinnopodjąć decyzję o stosowaniu do diagnostykigotowych podłoży mikrobiologicznych wysokiej jakości,pod warunkiem zaopatrywania się w nie u sprawdzonychi renomowanych producentów.

www.biomerieux.plZapraszamy na firmową stronę internetowąbioMérieux Polska, gdzie w Dziale „Wiadomości”zamieszczamy informacje o nowościach w oferciefirmy.Z przyjemnością informujemy, iż oferta firmy bio-Mérieux została rozszerzona o nowy produkt -Granada Agar, który jest wybiórczym podłożemdo badań przesiewowych i bezpośredniej identyfikacjiStreptococcus agalactiae przeprowadzanychw materiałach klinicznych pobranych odkobiet w ciąży i noworodków. Granada Agar jestoparty o oryginalny skład opisany przez dr De LaRosa i pozwala na bezpośrednią identyfikacjęStreptococcus agalactiae, który na tym podłożurośnie w postaci kolonii w kolorze od pomarańczowegodo czerwonego.Mieszanina wybiórcza hamuje wzrost większościbakterii Gram-ujemnych i drożdżaków.Informujemy również o wprowadzeniu nowegotestu:VIKIA® Strepto A (nr kat. 31114), który jest szybkimtestem do jakościowego wykrywania antygenu paciorkowcówgrupy A wg Lancefield, w wymazach z gardła,opartym na metodzie immunochromatograficznej(ICT). Może być stosowany jako element diagnostykizakażeń wywoływanych przez paciorkowce grupy A,które są częstą przyczyną zapaleń gardła u dzieci wwieku od 3 miesięcy do 5 lat, a także młodzieży i dorosłych.Do naszej oferty został wprowadzony nowy produkt„Usługi”, na temat których informacje możnaznaleźć na stronie internetowej bioMérieux Polska,w dziale „Wiadomości”.Są tam zamieszczone informacje nt. usług:1. Odczyt profilu identyfikacyjnego drobnoustrojówz użyciem testów API/ID - usługa skierowana doużytkowników testów API/ID, którzy nie posiadająaktualnych książek czy programu apiWEB.2. Szkolenia z obsługi aparatów oferowanych przezbioMérieux Polska3. Szkolenia edukacyjne z zakresu mikrobiologiiprzemysłowej oraz diagnostyki4. Usługi serwisu technicznego - przeglądy, konserwacje,naprawy27Zapraszamy również do zapoznania się z wiadomościami o działalności firmy bioMérieux, które zamieszczanesą w Dziale „Informacje Prasowe”.Na stronie www.biomerieux.pl/informacje prasowe znajdują się informacje nt. udziału firmy bioMérieux S.A.w Konferencji HAI - pierwszym Światowym Forum Zakażeń Związanych z Ochroną Zdrowia.Zakażenia wewnątrzszpitalne stanowią ważny problem zdrowia publicznego a przeciwdziałanie im jest wyzwaniemdla przyszłości. Stanowi ono także sedno naszej strategii