genetyka molekularna w badaniach europejskich głuszcowatych ...

Mendla, a dany osobnik może być homozygotą (dwa takie same allele w locus) lub heterozygotą(dwa różne allele w locus) pod względem danej sekwencji mikrosatelitarnej (Rutkowski2005b).Wysoki polimorfizm oraz łatwość analizysprawiają, że markerymikrosatelitarne są jednymz najpopularniejszych obecnie narzędzi molekularnych w badaniach ekologicznych.Wykorzystuje się je m. in. jako wskaźniki zmienności genetycznej, do identyfikacji osobniczejczy analiz rodzicielstwa. Poziom zmienności genetycznej wyznacza się na podstawiedwóch głównych parametrów: liczby alleli występujących w danym locus mikrosatelitarnym(tzw. różnorodność alleliczna, oznaczana zazwyczaj symbolem A) i udziałem loci heterozygotycznychw całkowitej liczbie loci badanych (heterozygotyczność obserwowana, oznaczanazazwyczaj symbolem H O). Im wyższe wartości tych parametrów, tym wyższazmienność genetyczna populacji. Na podstawie markerów mikrosatelitarnych wyznaczanejest także zróżnicowanie genetyczne między populacjami. W tym przypadku wykorzystujesię przede wszystkim tzw. współczynnik utrwalenia F STsensu Weir i Cockerham (1984).Przyjmuje on wartości od 0 do 1. F ST< 0,05 wskazuje na bardzo małe lub brak zróżnicowaniagenetycznego między populacjami, wartości 0,05–0,15 sugerują małe zróżnicowaniegenetyczne, 0,15–0,25 średnie, a F ST> 0,25 dokumentuje już duże zróżnicowanie genetyczne,świadczące o braku przepływu genów między populacjami.Mitochondrialne DNA jest odrębną od jądrowego frakcją genomu. Występuje w strukturachkomórkowych – mitochondriach i ma formę kolistej cząsteczki. Mitochondrialne DNAdziedziczy się w linii matczynej, tzn. potomstwo otrzymuje tę frakcję genomu tylko po matce.W efekcie w mitochondriach danego osobnika występuje tylko jedna forma DNA. Corazczęstsze są jednak doniesienia o zjawisku tzw. heteroplazmii, czyli występowaniu więcej niżjednej formyDNA mitochondrialnego w komórkach jednego osobnika (np. Kvist et al.2003, Abbott et al. 2005). Ta frakcja genomu z regułynie podlega rekombinacji (choć i wtym przypadku zdarzają się wyjątki, przegląd w Rokas et al. 2003), dlatego też w przypadkuDNA mitochondrialnego nie mówimy o genotypie, ale o haplotypie – grupie genów, któredziedziczą się wspólnie.Mitochondrialny DNA jest bardzo często wykorzystywany w molekularnych badaniachna poziomie populacyjnym. Decyduje o tym kilka czynników. Po pierwsze, specyfika środowiskapanującego w mitochondriach (wysokie stężenie wolnych rodników powstających wprocesach oksydacyjnych i mających właściwości mutagenne), jak i pewne cechy genomumitochondrialnego (brak efektywnych procesów naprawy błędów zachodzących w czasiereplikacji) sprawiają, że jest to forma DNA mutująca bardzo szybko. W związku z tym w danejpopulacji lub grupie osobników występuje od kilku do kilkunastu różnych haplotypów.Poszczególne haplotypy różnią się zazwyczaj pojedynczymi nukleotydami, ponieważ większośćzmian zachodzących w DNA mitochondrialnym to mutacje punktowe, a większe delecjelub insercje są niezwykle rzadkie. Prosty schemat dziedziczenia, brak rekombinacji iprzewaga mutacji punktowych umożliwiają śledzenie sposobu, w jaki różnicowały się poszczególnehaplotypy. W jednym mitochondrium występuje od kilku do kilkunastu cząsteczekDNA, natomiast w jednej komórce nawet do kilkuset mitochondriów. W związku ztym liczba cząsteczek DNA mitochondrialnego znacznie przewyższa liczbę cząsteczek DNAjądrowego. Jest to istotny fakt w przypadku pobierania prób nieinwazyjnych, szczególniebardzo starych lub poddanych długoterminowym działaniom czynników uszkadzającychDNA – łatwiej jest określić w takich próbach sekwencję wybranego fragmentu DNA mitochondrialnegoniż prawidłowygenotyp osobnika na podstawie markerów DNA jądrowego.W badaniach głuszcowatych wykorzystywany jest obecnie fragment hiperzmiennego regionuDNA mitochondrialnego, tzw. pętli D (Lucchini et al. 2001). Analiza sekwencji umo-263