genetyka molekularna w badaniach europejskich głuszcowatych ...

W latach 1990. białkowe markerymolekularne zastąpiono markerami DNA. Zadecydowałoo tym kilka czynników, utrudniających bądź uniemożliwiających zarówno analizę polimorfizmubiałek, jak i interpretację uzyskiwanych wyników. Po pierwsze, allozymycharakteryzują się niewielkim polimorfizmem. Schreiber et al. (1998) wśród 38 analizowanychbiałek u 95 cietrzewi znaleźli zaledwie 3 loci polimorficzne (tab. 1). Poziom heterozygotyczności,jednej z głównych miar zmienności genetycznej, przyjmuje w przypadkuallozymów bardzo niskie wartości, nieprzekraczające u głuszcowatych 10%, dlatego zmiennośćgenetyczna i zróżnicowanie genetyczne, mogą być w przypadku analizy białek niedoszacowane.Przyczynia się do tego degeneracja kodu genetycznego (zjawisko polegające natym, że większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden kodon) i tzw. podstawieniasynonimiczne (mutacje punktowe, prowadzące do powstania nowego kodonuodpowiadającemu aminokwasowi kodowanemu przez kodon niezmutowany). Powodujeto, że allozymy nie odzwierciedlają całego bogactwa zmienności obecnego w materiale genetycznym(Nei 1987). Niezwykle ważnym czynnikiem ograniczającym zastosowaniebiałkowych markerów molekularnych jest także wąskie spektrum rodzajów próbek, w którychmożna je analizować. Zazwyczaj wykorzystuje się do tych celów przyżyciowo pobieranąkrew lub zamrożone tkanki. Taki sposób zbioru prób jest często niemożliwywprzypadku gatunków zagrożonych i nielicznych (np. głuszec i cietrzew w wielu krajach Europy)lub prowadzących skryty tryb życia, a ponadto wymaga skomplikowanego zabezpieczaniai przechowywania próbek, co zazwyczaj jest trudne w warunkach terenowych.Badania oparte na analizach DNAŹródła DNA i molekularne markery DNAPostęp w opracowywaniu metod szybkiej i efektywnej analizy DNA zadecydował o niezwykleintensywnym wykorzystywaniu metod genetyki molekularnej w badaniach ekologicznych.Łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. PCR), powszechnie stosowana w laboratoriachmolekularnych od początku lat 1990., a także automatyzacja procesu sekwencjonowaniaDNA, wydatnie usprawniły charakteryzowanie poziomu zmienności genetycznej oraz identyfikacjęw genomach nowych markerów molekularnych (Pilot 2005, Rutkowski 2005a).Możliwa stała się także izolacja materiału genetycznego z tzw. prób nieinwazyjnych, pozyskiwanychbez bezpośredniego kontaktu ze zwierzęciem. Są to na przykład odchody, pióra,resztki jaj, a u ssaków także mocz i sierść – ważne źródła DNA w przypadku gatunków rzadkich,objętych całkowitą ochroną lub trudnych do schwytania (Pilot 2005).W przypadku głuszcowatych, jako źródło materiału genetycznego wykorzystuje się tkankiupolowanych osobników (Caizergues et al. 2003a, b; Liukkonen-Anttila et al. 2004), krewpobieraną przyżyciowo od schwytanych ptaków (Höglund et al. 1999, Piertney et al. 1999)czy nieinwazyjnie pozyskiwane pióra (Segelbacher & Storch 2002, Segelbacher et al. 2003,Rutkowski et al. 2005b) i odchody(Rutkowski et al. 2005a, b; Jagołkowska-Tkaczuk et al.2005).Genetyczne badania głuszcowatych opierają się obecnie na dwóch głównych klasachmarkerów DNA: sekwencjach mikrosatelitarnych i hiperzmiennym regionie DNA mitochondrialnego(tzw. pętli D, ang. D-loop). Sekwencje mikrosatelitarne to wysoce polimorficzneobszaryDNA jądrowego, składające się z tandemowych powtórzeń krótkiejsekwencji nukleotydowej (tzw. motywu nukleotydowego). W danej populacji w określonymlocus może występować od kilku do kilkunastu różnych form (alleli) danego markera mikrosatelitarnego.Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych wynika z różnic w liczbie powtórzeńdanego motywu nukleotydowego. Markery te dziedziczą się zgodnie z prawami262