Biosenzory

BiosenzoryHelena Uhrová

• L.C.Clarc, článek o O 2 elektrodě, 1956• 1962, symposium v New Yorku• oxidoredukční enzym glukózooxidáza byluchycen na dialyzační membránu a s ní nakyslíkovou elektrodu - enzymová elektroda

→První biosenzor• glukózooxidáza katalyzuje reakci→• glukóza + O 2 kyselina glukonová + H 2 O 2• Úbytek kyslíku - úměrný koncentraci glukózy –byl měřen kyslíkovou elektrodou

První komerční senzor• Stanovení glukózy přímo v krvi• Na principu úbytku kyslíku – první model1974• 1973 – Yellow Springa InstrumentCompany – ampérometrické měřenívzniklého peroxidu vodíku

Definice biosenzoru• Citlivé analytické zařízení převádějící fyzikálnínebo chemický signál na jiný, lépe měřitelný.Rozpoznávací část tvoří prvek biologickéhopůvodu.• Biosenzor je složen z bioreceptoru apřevodníku. Obě složky integrovány v jednomsenzoru.

BioreceptoryBiomolekuly rozpoznávají analytický cíl:• Enzymy• Protilátky• Receptorové bílkoviny• Mikroorganismy• Nukleové kyseliny• Rostlinné a zvířecí tkáně

enzymy• Nejúčinnější katalyzátory s vysokou strukturníspecifitou –katalyzují přeměnu jedné látky,ostatní ignorují• Vysoká enzymová aktivita - nutné udrženívhodné teploty a pH prostředí• Z izolovaných enzymů je jen několik set jevhodných pro komerční užití v senzorech

• Velmi často se užívají oxidoreduktázy,katalyzující oxidaci (odnímání elektronů) neboredukci (dodávání elektronů) enzymovéhosubstrátu.• Oxidoreduktázy jsou spojeny selektrochemickými procesy, jejich přeměnu jesnadnější sledovat elektrochemickou detekcí.Reálným problémem je ale přenos elektronůz/na aktivní místa.

protilátky• tvoří okolo 20% veškerých bílkovin plasmy ajsou souhrnně označovány jako imunoglobiny• Nejjednodušší protilátky-„molekuly tvaru Y“s dvěma identickými vazebnými místy proantigen• základní strukturní jednotka složena ze 4 řetězců– 2 lehkých a 2 těžkých• reversibilně se váží se specifickým antigenem

eceptorové bílkoviny• molekuly se specifickou afinitou k hormonům,protilátkám, enzymům a dalším biologickyaktivním látkám• nejčastěji vázány na membrány• chuťové receptory, čichové receptory ifotoreceptory očí

mikroorganismy• Bakterie• Kvasinky• Plísně• Rychlé rozmnožování• Odolnost• Přizpůsobivost• Široká škála živin

nukleové kyseliny• Využití k identifikaci :• jiné DNA• jiné RNA• některých mutagenů• Próba: obsahuje imobilizovanoujednovláknovou DNA s určité sekvenci –hybridizace s komplementární sekvencí- hledanáDNA zůstane navázána

Nevýhody:rostlinné a zvířecí tkáně• Buňky s omezenou funkcí• Obtížná manipulace• Nesnadná a drahá kultivace mimo mateřskýorganismus• Nutnost dodržování životních podmínekVýhoda: biologická odpověď podobná jako uživého organismu

skladba biosenzorů– analyt– bioreakční (rozpoznávací)vrstva– převodník– elektronická jednotka– výstupní signál

Konstrukce biosenzorů• volba vhodné imobilizační techniky• imobilizace biologického materiálu do pevnéhomateriálu• připojení detekčního zařízení (závisí na povazesignálu, který dává biologický materiál)• připojení záznamového zařízení

membrány• Slouží:• k ochraně před usazeninami• K eliminaci interferencí• Ke kontrole operačního režimubiosenzorů

elektrochemické převodníky• využívá je nejvíce senzorů- pro konstrukční jednoduchost- a dobrou cenu• s úspěchem využívány pro stanoveníorganických látek v potravinách

Dělení převodníků i biosenzorůpodle metody detekce• Potenciometrické biosenzory• Ampérometrické biosenzory• Konduktometricko/impedimetrickýchbiosenzory

Potenciometrické biosenzory• vyžadují měření potenciálu při nulovém proudu• potenciál je úměrný logartimu koncentracestanovované látky• Využívají např. iontově selektivních elektrodk stanovení změn koncentrace vybraných iontů(např.H + ).

• složeny z ISE kombinované s imobilizovanýmenzymem- v ISE je generovaný elektrodovýpotenciál úměrný logaritmu koncentrace analytu.• koncentrace závisí na potenciálu EERTnF⎡ aaox= E0 + ln ⎢ ⎥• Nevýhody:velký odpor, ⎣ redrozbitnost, ⎦ erozivita acitlivost na kapacitu pufrů při měření roztoků.⎤

Konduktometricko/impedimetrickéStanovují• změny v konduktanci• změny v impedancibiosenzoryv důsledku změn vyvolaných v daném prostředí nábojiNevyžadují referenční eldu (tenkovrstvé technologie), jsoudobře kompatibilní s elektrickými obvody apočítačovým rozhraním

Využívají• měření světlaOptické biosenzory• změn optických vlastností biomateriálů• ( barva opticky nebo spektrofotometricky)• fluorescenční spektroskopie• luminiscence• optická vlákna – nanesená vrstva produkujesvětelné signály nebo je mění

Piezoelektrické biosenzory• Využívají vibrace v elektrickém poli které semění s tloušťkou krystalu• Výhody: nízká cena, rychlá odezva• Nevýhody: vysoká citlivost na vnější podmínky(vlhkost vzdúchu)• DNA čipy – Si matrice v pravidelné mřížceimobilizovány různé sekvence DNA –fluorescenčně vyfotografován – analýzou lzeurčit sekvenci

imunosenzory• Savčí buňky – zdroj protilátek• Senzory detekují i stopová množství• Modifikované protilátky – navěšenáfluorescenční nebo enzymová značka• Vymývací krok• ELISA - o analyt soutěží volná a imobilizovanáprotilátka – kvantitativní stanovení analytu

Biosenzory s povrchovou plazmovou rezonancí• na rozhraní kov - dielektrikum vzniká přitotálním odrazu světla opticko-elektrický jev• při určitém úhlu (max. přenos energie světla naplasmony - elektrony atomů kovu v povrchovévrstvě) klesne intenzita odraženého světla• modifikace kovové vrstvy komplexemprotilátka-antigen – posun rezonančníhomaxima

Kalometrické biosenzory• Změny teploty při biochemické reakci• Přesná čidla nárůstu teploty – nejsou častá

Analogově-číslicové převodníky

Charakteristiky převodníků• Rozlišovací schopnost převodníku - dána počtemrozlišitelných úrovní analogového signálu. (Pro n-bitovýbinární převodník je to 2 n úrovní, pro m-místnýdekadický převodník je to 10 m úrovní).• Krok kvantování (citlivost převodníku) - nejmenšírozlišitelná velikost analogové veličiny - rozdíl dvouhodnot analogové veličiny, při kterých nastává přechodod jednoho kódového slova k druhému

• Chyba kvantování je maximální rozdíl mezihodnotou analogové veličiny a hodnotouodpovídající danému kódovému slovu -obvyklepolovina kroku kvantování.• Rychlost převodníku se určuje počtem převodůza jednotku času.• Kód převodníku - v jakém kódu převodníkpracuje (nejčastěji přímý binární kód a binárnědekadickýtzv. BCD-kód)

Přesnost převodníku• Součtová (aditivní) chyba je nezávislá nahodnotě analogového signálu a je pro celýrozsah konstantní. Je způsobená např.posunutím nuly, chybou kvantování apod.• Součinová (multiplikativní) chyba závisí nahodnotě analogového signálu a je způsobenáchybou zesílení analogových částí a nelinearitoupřevodníku.

• Stabilita převodníku vyjadřuje stálost vlastnostípřevodníku při působení různých rušivých vlivů,jako je teplota, čas, vlhkost apo

Číslicově-analogové převodníky• převádí vstupní slovo na analogovou veličinu(napětí nebo proud), která je přímo úměrnávstupní informaci.• Vstupní slovo je číslo, které vyjadřuje okamžitouhodnotu určité veličiny a sestává z určitéhopočtu bitů.• Pro vyjádření tohoto čísla se používá nejčastějipřirozeného binárního kódu nebo kódu BCD.

Analogově-číslicové převodníky• Analogově-číslicový převod lze rozdělit na třizákladní fáze: vzorkování, kvantování akódování.analogovýsignálvýstupníslovoVZORKOVÁNÍKVANTOVÁNÍKÓDOVÁNÍ

vzorkování

Metody imobilizace• K převodníku musí být připojen selektivníelement. Existuje několik klasických metod:• Adsorpce na povrchu• Mikrozapouzdření –záchyt v gelové matrici,pastě nebo polymeru mezi dvěma membránami

• Záchyt – selektivní element je zachycen v gelovématrici, pastě nebo polymeru – velmi populárnímetoda.• Kovalentní vazba – jsou vytvořeny chemickékovalentní vazby mezi selektivní složkou apřevodníkem.• Příčné vazby – selektivní složka je chemickyvázána dvojfunkčním činidlem k převodníku.Často se užívá v kombinaci s metodamiadsorpce či mikrozapouzření.

CO OD SENZORŮ POŽADUJEME• Selektivitu• Citlivost• Přesnost• Dobu odpovědi• Ralaxační čas• Životnost• Pracovní podmínky• Cenová dostupnost

Uplatnění biosenzorů v praxi• farmakologie a v medicína• monitorování škodlivin životního prostředí• Zemědělství• armáda• fermentační procesy• Off-line: ve vzdálených laboratořích s významnou dobou zdržení• Off-line: drobné kontroly s krátkou dobou zdržení• On-line: monitorování i kontrola probíhající v reálním čase

Problémy• není možná jejich sterilace• pracují jen v limitovaném rozsahu koncentraceanalytu• při použití enzymů se obvykle liší optimálníprovozní pH enzymu od pH prostředí.