Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Miesięcznikcopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Farmaceutycznywww.fpn.sum.edu.plCena 24,50 złPrzegląd NaukowyIC Value - Current 4,55MNiSW 6ROK VII (XI)Nr 6/2010 (65)Scientific Review in PharmacyProleki w terapii nowotworów.Część III. Proleki polimeroweCzy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcegodla porównania jego aktywności metabolicznejz aktywnością ludzkiego cytochromu P450w badaniach in vivo lub in vitro?Część III – rzeczywistośćLasery oraz ich zastosowanie w medycynie i farmacji0Potencjalna rola czynników genetycznychi mechanizmów epigenetycznych w dużej depresjiISSN 1425-507321latWpływ niedoboru glukozy na syntezęi degradację kolagenuw komórkach raka sutka linii MCF7Kwas mefenamowy i jego proleki0Technika pirolizy i mikroskopii sił atomowychw badaniu struktury syntetycznej melaniny z tyrozynyi naturalnej melaniny z Sepia officinalis 1

6Nr 6 / 2010Spis treściProleki w terapii nowotworów. Część III. Proleki polimerowe 0 14Prodrugs in cancer therapy. Part III. Polymeric prodrugsCzy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcegodla porównania jego aktywności metabolicznej z aktywnością ludzkiego cytochromu P450w badaniach in vivo lub in vitro? Część III – rzeczywistość0 19Is there an animal model for a human cytochrome P450 activityin in vivo and in vitro investigations? Part III – reality0Lasery oraz ich zastosowanie w medycynie i farmacji0 24Lasers and their application in medicine and pharmacyPotential role of genetic and epigenetic factors 0in major depressive disorder 0 32Potencjalna rola czynników genetycznychi mechanizmów epigenetycznych w dużej depresji0The effect of glucose deficiency on collagen synthesisand degradation in breast cancer MCF7 cells 36Wpływ niedoboru glukozy na syntezę i degradację kolagenu 0w komórkach raka sutka linii MCF70Kwas mefenamowy i jego proleki0 42Mefenamic acid and its prodrugs0Technika pirolizy i mikroskopii sił atomowychw badaniu struktury syntetycznej melaniny z tyrozynyi naturalnej melaniny z Sepia officinalis0 46Pyrolysis and atomic force microscopy in structural studiesof synthetic tyrosine-melanin and natural melanin from Sepia officinalis

Lisbon, Portugal and talk about“Pharmacy’s Exploratory Journey”28AUG-02SEPTSPECIALPROGRAMMEforFirst TimersNetwork and connect with pharmacists and pharmaceuticalscientists at the 70 th FIP Congress!The chance to meet colleagues from every corner of the globe is yoursat the FIP World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.The FIP Congress is the leading international event offering diverselearning opportunities for those active within all areas of pharmacy.The latest trends highlighting innovative and interesting topics will bediscussed under the main theme of From Molecule to Medicine toMaximising Outcomes – Pharmacy’s Exploratory Journey. Participantswill be engaged in such issues as the current and future status ofpharmacy practice; science and practice throughout the supply chainand collaborative approaches to care.The FIP Congress is the ONLY truly global event of its kind. Join us andbecome a part of our growing network at the FIP Congress in Lisbon.We’re waiting to meet you!70 th FIP World Congress of Pharmacyand Pharmaceutical Scienceswww.fip.org/lisbon2010

Farm Przegl Nauk, 2010,6, 14-18Proleki w terapii nowotworów. Część III. Proleki polimeroweProdrugs in cancer therapy. Part III. Polymeric prodrugsAndrzej Stańczak, Marta SzumilakZakład Farmacji Szpitalnej Wydziału FarmaceutycznegoUniwersytetu Medycznego w ŁodziStreszczenieWiększość stosowanych obecnie leków przeciwnowotworowychcharakteryzuje wysoka toksyczność systemowai brak wybiórczości względem tkanki nowotworowej.Jednym ze sposobów zwiększania skuteczności terapiii ograniczania jej toksyczności jest projektowanie proleków.Nowoczesne proleki tzw. Tumor Activated Prodrugsprojektuje się w oparciu o ciągle rosnącą wiedzę na tematbudowy i funkcji tkanki nowotworowej. Szereg jej cechnp. hipoksja, obecność specyficznych antygenów bądźreceptorów, czy wadliwy system naczyniowy, stanowipunkt uchwytu umożliwiający selektywne dostarczeniei aktywację proleku w obrębie guza. Niniejsza praca stanowiprzegląd wiedzy na temat proleków polimerowych,opisuje podstawy ich działania oraz zalety i ograniczeniaposzczególnych typów nośników makromolekularnych.Słowa kluczowe: proleki, leki przeciwnowotworowe, nośnikimakromolekularne, koniugaty polimer-lek, celowanytransport pasywnyAbstractMost currently used anticancer drugs are characterized byhigh systemic toxicity and lack of tumor selectivity. Oneway to increase effectiveness of treatment and reduce itstoxicity is prodrug design. Advanced prodrugs so-calledTumor Activated Prodrugs are designed on the basis ofever-growing knowledge of the structure and function oftumor tissue. Several of its features such as: presence ofspecific antigens or receptors, vascular system failure orhypoxia can be the targets allowing the selective deliveryand activation of prodrugs within the tumor. This workprovides an overview with polymeric prodrugs, describesbasis of their action as well as advantages and limitationsof particular types of macromolecular carriers.Key words: prodrugs, anticancer drugs, macromolecularcarriers, polymer-drug conjugates, passive targetingWprowadzenieKoniugaty makrocząsteczkowe tzw. proleki polimeroweang. polymeric prodrugs są to połączenia leków lubbiałek z nośnikami makrocząsteczkowymi, którymi mogąbyć zarówno polimery naturalne, jak i syntetyczne. Połączeniate charakteryzują się zwiększoną rozpuszczalnościąw wodzie w porównaniu z lekiem macierzystym, co pozwalana znaczne zwiększenie biodostępności. Lek w formiekoniugatu z polimerem jest chroniony przed zbyt wczesnąinaktywacją w krwiobiegu, charakteryzuje się zmienionymprofilem biodystrybucji w kierunku większej kumulacjiw tkance nowotworowej, a w przypadku białek obniżoną immunogennością.Ta strategia pozwala na efektywniejsze wykorzystaniejuż istniejących leków przeciwnowotworowych:np. doksorubicyny, metotreksatu, kamptotecyny, paklitakselu,czy kompleksów platyny, poprzez znaczące ulepszenieich profilu farmakokinetycznego i farmakologicznego,a w konsekwencji znaczne obniżenie toksyczności systemowej[1-4].W 1975 roku, Ringsdorf i wsp., jako pierwsi zaproponowaliwykorzystanie makrocząsteczek, jako nośników dlaniskocząsteczkowych leków. Model, który stworzyli, zbudowanyjest ze szkieletu polimerowego, w którym możnawyróżnić trzy obszary: pierwszy zawiera ugrupowania modyfikującerozpuszczalność koniugatu, w drugim znajdujesię właściwy lek przyłączony za pośrednictwem biodegradowalnegołącznika warunkującego stabilność koniugatuna etapie biodystrybucji i uwolnienie aktywnego lekuwewnątrz komórki nowotworowej, zaś w trzecim regioniedominują cząsteczki odpowiedzialne za rozpoznanie komórekdocelowych tzw. cząsteczki tropowe (rys. 1) [1, 2,4-7].Makromolekularny nośnik leku powinien być rozpuszczalnyw wodzie, nietoksyczny, nieimmunogenny, biokompatybilnyi nie kumulować się w organizmie. Stosuje sięzarówno polimery syntetyczne: polietylenoglikol (PEG),N-(2-hydroksypropylo)metakrylamid (HPMA), polimerkwasu glutaminowego (PGA) jak i naturalne np. dekstrany[1-4, 6, 8].Koniugaty mogą być dostarczane do tkanki nowotworowejna drodze transportu aktywnego lub biernego. W przypadkutransportu aktywnego w obszarze odpowiedzialnymza rozpoznanie komórek docelowych muszą znajdować sięelementy np. przeciwciało lub antygen (cukry, białka, peptydy),wybiórczo wiążące się z receptorami lub antygenamiwystępującymi na powierzchni komórek nowotworowych[1, 2].14

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Ryc. 1. Model Ringsdorfa.W przypadku koniugatów makromolekularnych lekówprzeciwnowotworowych częściej wykorzystuje się transportpasywny [1]. Wynika to z unikalnej budowy naczyń krwionośnychzaopatrujących guza w tlen i składniki odżywcze.Nieprawidłowy przebieg neoangiogenezy prowadzi doformowania nieregularnych naczyń krwionośnych o krętymprzebiegu, których ściany często charakteryzuje brakwarstwy mięśni gładkich, nieprawidłowa budowa komórekokołonaczyniowych oraz warstwa śródbłonka z licznymiposzerzonymi przestrzeniami międzykomórkowymi, któreumożliwiają migrację makromolekuł do tkanki nowotworowej(ekstrawazacja), co jest niemożliwe w prawidłowychtkankach o zwartej budowie śródbłonka. Nadmierna przepuszczalnośćbariery śródbłonkowej, w połączeniu z upośledzonymdrenażem limfatycznym tkanki nowotworowej,powoduje obniżenie klirensu leku z tkanki nowotworoweji prowadzi do kumulacji makrocząsteczek w guzie. Zjawiskoto nosi nazwę efektu zwiększonej przepuszczalności naczyńi zatrzymania (ang. Enhanced Vascular Permeabilityand Retention Effect - EPR effect) i po raz pierwszy zostałoudokumentowane przez Maedę i wsp. [4, 6, 9].Terapia koniugatami makrocząsteczkowymi ma swojeograniczenia wynikające z budowy i rozmiaru guza. Nie jestskuteczna w przypadku małych, nieunaczynionych ogniskprzerzutowych oraz dużych guzów zawierających nieunaczynioneobszary martwicze [1, 6].Nie bez znaczenia jest również wielkość makrocząsteczek.Znaczący efekt EPR zaobserwowano w przypadkucząsteczek o masie większej niż 20kDa. Masa cząsteczkowapreparatu ma również istotny wpływ na biologiczny okrespółtrwania koniugatu. Jeśli jest wyższa od progu nerkowego(40kDa), ze względu na obniżony klirens nerkowy, znaczniewydłuża się okres przebywania koniugatu w krwiobiegu.Należy jednak pamiętać, że przekroczenie progu nerkowego(40kDa) jest możliwe tylko dla polimerów biodegradowalnychnp. PGA i wykluczone w przypadku polimerów nieulegającychdegradacji w ustroju np. kopolimerów HPMAi PEG [3]. Innymi czynnikami mającymi istotny wpływ nabiodystrybucję koniugatów makrocząsteczkowych są: charakterchemiczny polimeru, jego kształt oraz konformacja,jaką przyjmuje w środowisku wodnym [1].Po dotarciu koniugatu w obręb guza następuje uwolnienieaktywnego leku cytotoksycznego. Proces ten może zachodzićzewnątrz lub wewnątrzkomórkowo i opiera się nadegradacji nośnika lub zerwaniu wiązania pomiędzy nośnikiemi lekiem. W zależnościod budowy łącznika może byćto niespecyficzna hydroliza zależnaod pH, bądź specyficznyproces enzymolizy [1, 6, 8].Przekształcenie lekuo małej masie cząsteczkowejw koniugat nośnik-lek znaczącozmienia sposób dostarczanialeku do komórki, ponieważduży rozmiar makrocząsteczkiuniemożliwia swobodną dyfuzję.Makromolekuły wnikajądo komórki na drodze endocytozy.Uwalnianie substancjiczynnej może nastąpić pod wpływem licznych enzymówlizosomalnych (esteraz, proteaz, lipaz) (szlak lizosomotropowy)lub na etapie endosomu (szlak endosomotropowy)[1, 6]. Transportowanie koniugatów wewnątrz endosomówskutkuje uwalnianiem aktywnego leku w obszarze perinuklearnym(okołojądrowym), dzięki czemu znacznie zwiększasię prawdopodobieństwo jego oddziaływania na DNAjądra, niż możliwość rozpoznania cząsteczki przez glikoproteinęP i usunięcia jej z komórki, co zmniejsza ryzykowykształcenia się oporności wielolekowej [2, 10].Koniugaty HPMAKopolimery N-(2-hydroksypropylo)metaakrylamidu(HPMA) są niebiodegradowalnymi, rozpuszczalnymiw wodzie nośnikami o masie cząsteczkowej ok. 30kDa, abyumożliwić ich eliminację przez nerki. Niskocząsteczkowylek jest połączony ze szkieletem polimeru za pośrednictwembiodegradowalnego łańcucha peptydowego o budowie Gly-Phe-Leu-Gly, który został zaprojektowany, aby zapewnićstabilność koniugatu w układzie krążenia i umożliwić szybkieuwolnienie aktywnego leku za pośrednictwem proteazlizosomalnych wewnątrz komórek nowotworowych. Koniugatykopolimeru HPMA ze związkami cyto-toksycznymimogą zawierać również ligandy tropowe (cukry, białka,przeciwciała), aby zapewnić wybiórczy transport do określonychkomórek nowotworowych. Jeśli brak jest cząsteczektropowych, wybiórcza akumulacja makrocząsteczkiw guzie jest osiągana za pośrednictwem opisanego wyżejefektu EPR [1, 5, 7].Wykazano, że koniugaty z kopolimerem HPMA przezwyciężająistniejącą oporność wielolekową. Zapobiegajątakże tworzeniu się oporności na lek w trakcie powtarzanejchemioterapii, w przeciwieństwie do małocząsteczkowychleków przeciwnowotworowych, które często oporność wywołują.Ponadto dzięki unikalnemu procesowi transportu downętrza komórki wewnątrz organelli ograniczonych błonamikomórkowymi, chronią związki przeciwnowotworoweprzed działaniem enzymów detoksyfikujących, systemówantyoksydacyjnych i innych niespecyficznych procesówobrony komórkowej. Koniugaty HPMA mają także zdolnośćaktywowania szlaku apoptozy i nekrozy w komórkachnowotworowych [2, 10].Pierwszym testowanym klinicznie koniugatem nośnikpolimerowy-lek był właśnie koniugat HPMA z doksorubi-15

Farm Przegl Nauk, 2010, 6cyną (PK1). Przedkliniczne badania in vivo, wykonywanena różnych modelach zwierzęcych, wykazały zwiększonąefektywność doksorubicyny związanej z polimerem od wolnegoleku macierzystego [11, 12].Ze względu na obiecujące wyniki badań in vivo PK1,jako pierwszy koniugat wszedł do badań klinicznychw 1994 roku. W I fazie badań wykazano, że maksymalnadawka tolerowana doksorubicyny w postaci związanejz nośnikiem wynosi 320 mg/m 2 powierzchni ciała. Mimotak wysokiej dawki nie obserwowano charakterystycznejdla doksorubicyny kardiotoksyczności [4, 6, 13]. Wykazanotakże skuteczność koniugatu w leczeniu nowotworówopornych na chemioterapię (niedrobnokomórkowego rakapłuc, raka okrężnicy i raka piersi opornego na antracykliny)[4, 13, 14]. Badania II fazy opublikowane w 2002 roku niepotwierdziły aktywności PK1 u pacjentów z rakiem okrężnicy,ale uzyskano częściową odpowiedź u pacjentów z rakiempiersi i niedrobnokomórkowym rakiem płuc [4, 15].Innym przykładem koniugatu HPMA z doksorubicynąjest pochodna PK2, którą dodatkowo wzbogaconoo cząsteczki galaktozaminy, rozpoznawane przez receptoryasjaloglikoproteinowe, występujące na powierzchni hepatocytów.Koniugat ten został zaprojektowany w celu leczeniapierwotnego raka wątrobowokomórkowego i jest jedynymtestowanym klinicznie preparatem zawierającym ugrupowanietropowe odpowiedzialne za rozpoznawanie komórekdocelowych (celowany transport aktywny) [4, 6, 15, 16].MAG-CPT jest koniugatem HPMA z kamptotecyną,w którym CPT jest połączona z polimerem wiązaniem estrowym.Został on zaprojektowany, aby podnieść rozpuszczalnośćmacierzystego leku w wodzie, a także zwiększyćstabilność pierścienia laktonowego (poprzez zablokowaniegrupy hydroksylowej w pozycji C20, którego otwieraniew warunkach fizjologicznych prowadziło do utraty aktywnościkamptotecyny i preferencyjne jej wiązanie z albuminamiosocza [15]. Mimo obiecujących wyników badań przedklinicznych,koniugat MAG-CPT w I fazie badań klinicznychwykazywał ograniczoną aktywność przeciwnowotworową,przy znaczącej cytotoksyczności, która wynikała prawdopodobniez braku preferencyjnego gromadzenia się koniugatuw tkance nowotworowej i zbyt dużej labilności wiązania estrowego,umożliwiającej uwolnienie macierzystego leku naetapie dystrybucji. Badania prowadzone przez Schoemakerai wsp. wykazały znaczną toksyczność koniugatu względempęcherza moczowego oraz objawy ciężkiego uszkodzenianerek przy wyższych stężeniach MAG-CPT we krwi [17].Wyniki badań zadecydowały o zaprzestaniu dalszych badańz udziałem tego leku [4, 6, 15, 18].Obiecujące wyniki otrzymano dla koniugatów HPMAz pochodnymi platyny: AP5280 i AP5346. W AP5346(ProLindac), DACH-Platynian (aktywna część oksaliplatyny)jest połączony z polimerem, wrażliwym nazmiany pH wiązaniem chelatowym. Pierwszorzędowymmiejscem wiążącym resztę DACH-platynianowąjest kwas aminomalonowy połączony z monomeremmetaakrylamidowym za pośrednictwem trzech resztglicyny [1, 3, 4]. ProLindac uwalnia platynę ze znaczniewiększą szybkością w lekko kwaśnym środowiskuprzestrzeni zewnątrzkomórkowej, wokół hipoksycznejtkanki nowotworowej lub wewnątrz endosomówi jest stabilny w fizjologicznym pH. W badaniach klinicznychI fazy koniugat wywołał częściową odpowiedź u pacjentówz czerniakiem przerzutowym i opornym na związkiplatyny rakiem jajnika. Stabilizacja nastąpiła u pacjentówz czerniakiem, rakiem jajnika i przełyku [15, 19].Koniugaty polietylenoglikoliPolimery polietylenoglikolu, otrzymywane w reakcjipolimeryzacji tlenku etylenu, mają charakter amfifilowy,rozpuszczają się zarówno w wodzie jak i w rozpuszczalnikachorganicznych. W zależności od stopnia polimeryzacjiotrzymuje się polimery o zróżnicowanej masie cząsteczkowej,które są nietoksyczne i mogą być wydalone z moczemlub żółcią. Najczęściej używane w projektowaniu prolekówsą monometoksypolietylenoglikole lub dihydroksypolietylenoglikole[2, 20].Polietylenoglikole znacznie zwiększają rozpuszczalnośćw wodzie małych cząsteczek, a zatem poprawiają ich biodostępność.Efektywność koniugatu zależy w dużej mierzeod charakteru i stabilności wiązania pomiędzy polimeremi lekiem. Wadą tych polimerów jest mała ilość miejsc wiążącychlek, niezwiększająca się przy wydłużaniu długości łańcucha.Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jestwprowadzenie do polimeru cząsteczek aminokwasów dikarboksylowychnp. kwasu asparaginowego, co pozwala napodwojenie liczby miejsc wiążących i znaczne zwiększeniedawki dostarczanego do komórek nowotworowych leku macierzystego.Przykładem są tu tetra i oktamery PEG-ara-C,czyli koniugaty polietylenoglikolu z arabinozydem cytozynypołączonych kowalencyjnie za pośrednictwem łącznikao budowie H 2N-[CH 2-CH 2-O] 2-H [2,20,21,22]. Niestety zewzględu na trudności występujące na etapie syntezy do tejpory żaden z koniugatów tzw. multi-armPEG nie wszedł dobadań klinicznych [21].Koniugaty PEG-białkoPo raz pierwszy polietylenoglikol wykorzystano w celumodyfikacji właściwości immunologicznych surowiczej albuminywołu (bovine serum albumine BSA). Metoda PE-Gylowania białek, opisana przez Abuchowskiego, Davisai wsp. w 1977 roku [23], pozwoliła na znaczną poprawęwartości terapeutycznej i właściwości farmakokinetycznychbiałek, bowiem pozwoliła wyeliminować szereg ich niepożądanychcech, takich jak krótki okres półtrwania (zbytszybki klirens nerkowy), niestabilność i immunogenność.Wykazano, że cząsteczki polimeru tworzą powłokę dookołacząsteczki proteiny, która znacznie utrudnia lub uniemożliwiawywołanie odpowiedzi immunologicznej oraz chronibiałko przed rozkładem proteolitycznym lub uwięźnięciemw sieć cystern, kanalików i pęcherzyków siateczki śródplazmatycznej[4, 20, 21, 24].Sztandarowym przykładem wykorzystania PEG dozwiększania wartości terapeutycznej cennej i stosowanejw lecznictwie proteiny jest PEGylowana L-asparaginaza(Oncospar), zaaprobowana przez FDA w 1994 roku.Wykazano, że lek jest równie skuteczny w terapiiostrej białaczki limfoblastycznej, jak macierzysta L-asparaginaza(enzym produkowany przez E. coli i stosowanyw lecznictwie od lat 60-tych ubiegłego wieku16

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073[25,26]), jednak nie wywołuje tak nasilonej odpowiedziimmunologicznej i jest skuteczny także u pacjentów,u których zaobserwowano nadwrażliwość namacierzysty enzym. Ponadto charakteryzuje się wydłużonymokresem półtrwania (15 dni) w porównaniuz L-asparaginazą (24 godziny), co znacznie usprawniadawkowanie i czyni je mniej kłopotliwym dla pacjentów.W 2006 roku, FDA zaaprobowało stosowanie Oncosparu,jako leku pierwszego rzutu w ostrej białaczce limfoblastycznejw skojarzonej terapii wielolekowej [20,21].Mówiąc o pegylowanych proteinach nie należy pominąćinterferonu α-2b (PEG-INTRON), interferonu α-2a(PEGASYS) oraz ludzkiego czynnika stymulującegopowstawanie kolonii granulocytów GCSF (Neulasta).PEG-INTRON i PEGASYS dopuszczono do leczeniawielu chorób [6, 26]. Trwają badania kliniczne z zastosowaniemtych leków u pacjentów chorych na czerniakai raka nerki [4, 6]. Neulasta ma ugruntowaną pozycjęw leczeniu ciężkiej neutropenii będącej następstwem chemioterapii[4, 6, 26].Koniugaty PEG-związek małocząsteczkowyKoniugaty, w których nośnikiem makromolekularnymjest polietylenoglikol, podlegające ocenie klinicznej, to połączeniatego polimeru z m. in. małocząsteczkowymi lekamipochodnymi kamptotecyny, irinotekanem, paklitakselemi docetakselem [21].PEGAMOTECAN (Enzon Pharmaceuticals) jest prolekiemzbudowanym z dwóch cząsteczek kamptotecyny połączonychwiązaniem estrowym poprzez grupy hydroksylowew pozycji C20 z dwiema resztami karboksylowymi polietylenoglikolu(40kDa). Zablokowanie grupy hydroksylowejw pozycji C20 znacznie zwiększa stabilność pierścienia laktonowegoE kamptotecyny, który warunkuje jej aktywność.Ponadto koniugat charakteryzuje dłuższy okres półtrwaniai lepsza rozpuszczalność w środowisku wodnym. W badaniachprzedklinicznych Pegamotecan wykazywał znaczącąaktywność cytotoksyczną. W badaniach klinicznych II fazyna pacjentach z rakiem żołądka i przełyku Pegamotecan byłdobrze tolerowany, z niższą częstotliwością występowaniadziałań niepożądanych w porównaniu z irinotekanem,jednak profil toksykologiczny był bardzo podobny do lekumacierzystego, co wskazywało na zbyt szybką hydrolizę invivo wiązania estrowego pomiędzy cząsteczką kamptotecynyi polietylenoglikolu. Zaniechano dalszych badań nad tymkoniugatem ze względu na znacznie lepsze wyniki otrzymanedla innej pochodnej kamptotecyny SN38 [21].EZN-2208 to koniugat pochodnej kamptotecyny SN38z czteroramiennym polietylenoglikolem o masie 40kDa,w którym cząsteczki SN38 połączone są poprzez grupęhydroksylową w pozycji C20 za pośrednictwem łącznikaglicynowego. Rozgałęzienie cząsteczki polimeru istotniezwiększa ilość miejsc wiążących leku w porównaniuz Pegamotecanem, a także istotnie polepsza rozpuszczalnośćcząsteczki macierzystej. Pochodna ta wykazywałaobiecującą aktywność przeciwnowotworową zarówno invitro, jak i in vivo, znacznie wydłużony okres półtrwaniai zwiększoną zdolność kumulacji w tkance nowotworowej.Koniugat wykazywał aktywność przeciwnowotworowątakże u zwierząt, które wykształciły oporność na irinotekan[21, 27]. Po tak zachęcających wynikach badań przedklinicznychEZN-2208 wszedł do badań klinicznych I fazy[21].Koniugaty kwasu poliglutaminowegoCiekawą i bardzo obiecująca grupą koniugatów są proleki,w których nośnik stanowi polimer kwasu glutaminowego.W odróżnieniu od innych polimerów syntetycznych,zbudowany jest z reszt występującego naturalnie kwasuL-glutaminowego połączonych wiązaniami amidowymi,a nie wiązaniami węgiel-węgiel, co powoduje, że jest onbiodegradowalny. Ponadto, każdy mer posiada wolną grupękarboksylową, która w fizjologicznym pH jest zjonizowanai czyni polimer rozpuszczalnym w wodzie. Biodegradowalnośćpolimeru kwasu glutaminowego umożliwia wykorzystywaniemakromolekuł o masie cząsteczkowej wyższejod progu nerkowego. Spośród licznych zsyntetyzowanychkoniugatów tego polimeru z różnymi lekami przeciwnowotworowymim. in. doksorubicyną, daunorubicyną, cyklofosfamidem,melfalanem, mitomycyną C, intensywnymbadaniom klinicznym poddano koniugat z paklitakselem(Xyotax) [1, 4, 15, 28].CT-2103 (Xyotax, Opaxio) jest koniugatem, w którymszkielet stanowi biodegradowalny polimer kwasu glutaminowegopołączony z cząsteczkami paklitakselu wiązaniemestrowym poprzez jego grupę hydroksylową w pozycji 2’.Lek uwalniany jest głównie na drodze enzymatycznej w endocytachpod wpływem lizosomalnej katepsyny B (którejpodwyższony poziom często notuje się w tkankach nowotworowych).Badania przedkliniczne na różnych modelachzwierzęcych wykazały znaczną poprawę rozpuszczalnościmacierzystego paklitakselu i dzięki temu podwyższenie jegobiodostępności i wybiórczości względem tkanek nowotworowych(kumulacja w tkance nowotworowej dzięki efektowiEPR), co skutkowało obniżeniem toksyczności wobeczdrowych tkanek [4, 28].We wczesnych badaniach klinicznych CT-2103 wywołałodpowiedź u znacznej liczby pacjentów cierpiących na różnerodzaje nowotworów. Wyniki badań klinicznych III fazy wskazująna wysoką efektywność tego leku w leczeniu pacjentówz niedrobnokomórkowym rakiem płuc [6]. Istnieją także doniesieniao wykorzystaniu preparatu, jako środka uwrażliwiającegona radioterapię u pacjentów z rakiem przełyku i żołądka[6, 29]. Lek jest obecnie w III fazie badań klinicznych, jakoterapia podtrzymująca u pacjentów z rakiem jajnika, którzy odpowiedzielina terapię pierwszego rzutu [29].PodsumowanieZastosowanie nośników makromolekularnych w projektowaniuproleków leków przeciwnowotworowych jest stosunkowonową, lecz bardzo obiecującą metodą zwiększaniawybiórczości chemioterapii. Liczne badania prowadzonez udziałem koniugatów polimer-lek wskazują na ogromnypotencjał charakteryzujący tę grupę proleków, dający nadziejęna znaczne obniżenie toksyczności systemowej oddawna stosowanych w lecznictwie, cennych leków przeciwnowotworowych.17

Farm Przegl Nauk, 2010, 6Praca finansowana przez Uniwersytet Medycznyw Łodzi w ramach prac własnych nr 502-13-702Piśmiennictwo1. Kratz F i wsp. Prodrugs strategies in anticancer chemotherapy.Chem Med Chem 2007; 3: 20-53.2. Khandare J, Minko T. Polymer-drug conjugates: Progressin polymeric prodrugs. Prog Polym Sci 2006; 31:359-397.3. Avendano C, Menendez CJ. Medicinal Chemistry ofAnticancer Drugs. Elsevier B.V. Oxford 2008.4. Duncan R. Polymer conjugates as anticancer nanomedicines.Nature Rev Cancer 2006; 6: 688-701.5. Elvira C i wsp. Covalent Polymer-Drug Conjugates.Molecules 2005; 10: 114-125.6. Nevozhay D i wsp. Współczesny stan badań nad koniugatamii innymi systemami dostarczania leków wleczeniu schorzeń nowotworowych i innych jednostekchorobowych. Post Hig Med Dośw 2007; 61: 350-360.7. Duncan R. Polymer conjugates for tumor targeting andintracytoplasmic delivery. The EPR effect as a commongateway? PSTT 1999; 2: 441-449.8. Ulbrich K, Šubr V. Polymeric anticancer drugs with pHcontrolledactivation. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56:1023-1050.9. Maeda H i wsp. Tumor vascular permeability and theEPR effect in macromolecular therapeutics: a review. JControl Rel 2000; 65: 271-284.10. Kopeček J. Water soluble polymers in tumor targeteddelivery. J Control Rel 2001; 74: 147-158.11. Duncan R i wsp. Preclinical evaluation of polymerbounddoxorubicin. J Control Rel 1992; 19: 331-346.12. Minko T. Kopečková P. Kopeček J. Chronic exposureto HPMA copolymer-bound adriamycin does not inducemulti drug resistance in a human ovarian carcinoma cellline. J Control Rel 1999; 59: 133-148.13. Vasey PA i wsp. Phase I clinical and pharmacokineticstudy of PK1 [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamidecopolymer doxorubicin]: first member of a new classof chemotherapeutic agents. Drug-polymer conjugates.Clin Cancer Res 1999; 5: 83-94.14. Thomson AH i wsp. Population pharmacokinetics inphase I drug development: a phase I study of PK1 in patientswith solid tumors. Br J Cancer 1999; 81: 99-107.15. Li Ch, Wallace S. Polymer-drug conjugates: Recent developmentin clinical oncology. Adv Drug Deliv Rev2008; 60: 886-898.16. Seymour LW. Hepatic Drug Targeting: Phase I Evaluationof Polymer-Bound Doxorubicin J Clin Oncol 2002;20: 1668-1676.17. Schoemaker NE i wsp. A phase I and pharmacokineticstudy of MAG-CPT, a water soluble polymer conjugateof camptothecin. Br J Cancer 2002; 87: 608-614.18. Bisset D i wsp. Phase I and pharmacokinetic study ofMAG-CPT (PNU166148): a polymeric derivative ofcamptothecin (CPT). Br J Cancer 2004; 91: 50-55.19. http://www.accesspharma.com ProLindac Fact Sheet 2009.20. Greenwald RB i wsp. Effective drug delivery by PEGylateddrug conjugates. Adv Drug Deliv Rev 2003; 55: 217-250.21. Pasut G, Veronese FM. PEG conjugates in clinical developmentor use as anticancer agents: an overview.Adv Drug Deliv Rev 2009; 61: 1177-1188.22. Choe YH i wsp. Anticancer drug delivery systems:Multi-loaded N 4 -acylpoly(ethylenr glycol) prodrugs ofara-C. II. Efficacy in ascites and solid tumors. J ControlRel 2002; 79: 55-70.23. Abuchowski A i wsp. Alteration of immunological propertiesof bovine serum albumin by covalent attachment ofpolyethylene glycol. J Biol Chem 1997; 252: 3578-3581.24. Greenwald RB. PEG drugs: an overview. J Control Rel2001; 74: 159-171.25. Graham ML. Pegaspargase: a review of clinical studies.Adv Drug Deliv Rev 2003; 55: 1293–1302.26. Brunton LL, Lazo JS, Parker KL. Goodman&Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics. Mc Graw-Hill, USA 2006.27. Sapra P i wsp. Novel delivery of SN-38 markedly inhibitstumor growth in xenografts including a Camptothecin-11refractory model. Clin Cancer Res 2008; 14: 1888-1896.28. Li Ch. Poly(L-glutamic acid)–anticancer drug conjugates.Adv Drug Deliv Rev 2002; 54: 695–713.29. www.celltherapeutics.com Opaxio (Xyotax) Fact Sheet2009.data otrzymania pracy: 15.02.2010 r.data akceptacji do druku: 09.04.2010 r.Adres do korespondencji:Andrzej StańczakZakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego UM w Łodzi,ul. Muszyńskiego 1, 91-151 Łódź;tel.: +48 42 677 92 52e-mail: andrzej.stanczak@umed.lodz.pl18

Farm Przegl Nauk, 2010,6, 19-23copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Czy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcegodla porównania jego aktywności metabolicznej z aktywnościąludzkiego cytochromu P450 w badaniach in vivo lub in vitro?Część III – rzeczywistośćIs there an animal model for a human cytochrome P450 activityin in vivo and in vitro investigations? Part III – realityAndrzej PlewkaZakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet MedycznyStreszczeniePorównanie międzygatunkowe, które jak się wydaje jestniezbędne, musi zostać przeprowadzone ze względu nadwa powody. Po pierwsze, w organizmie ludzkim międzyosobnikami występują różnice indywidualne pomiędzyizoformami CYP, jako fenotypowa konsekwencja polimorfizmugenetycznego. Po drugie, jeśli nawet podziałCYP na podrodziny opiera się na sekwencji aminokwasowej,to wysokie podobieństwo w tej sekwencji nie pociągaza sobą podobnej aktywności enzymatycznej izoformcytochromu P450. Ponadto, różne CYP mogą katalizowaćtakie same reakcje. Profile inhibicji z jednej strony byłyokreślane za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwkoróżnym izoformom cytochromu P450, jak też przypomocy chemicznych inhibitorów takich jak, furafilina,α-naftoflawon, sulfafenazol, chinidyna, chinina, dietyloditiokarbaminian,ketokonazol i inne. Wyniki wykazująduże rozbieżności międzygatunkowe w aktywnościachenzymatycznych, jak i w sposobie wpływu selektywnychinhibitorów P450 na metabolizm różnych związkóww mikrosomach ocenianych zwierząt.AbstractThe inter-specific comparison seems indispensable fortwo reasons. First, human individuals differ between eachother in CYP isoforms, as a phenotypic consequence ofthe genetic polymorphism. Second, even if division ofCYP into subfamilies reflects amino acid sequences, ahigh similarity of the sequence is not equivalent to similarenzymatic activity of the cytochrome P450 isoforms.Moreover, various CYP may catalyze the same reactions.Inhibition profiles were defined using, on one hand, antibodiesspecific for various isoforms of cytochrome P450and, on the other, chemical inhibitors, such as furafylline,α‐naphthoflavone, sulphaphenazole, quinidine, quinine,diethyldithiocarbamate, ketoconazole and other. Summingup, the results demonstrated extensive inter-specificdivergences in enzymatic activities as well as in the waysin which selective inhibitors of P450 affect metabolism ofvarious compounds in microsomes of evaluated animals.Key words: animals species, human, enzyme activities,kinetic parameters, inhibition, cytochrome P450, CYPSłowa kluczowe: gatunek zwierząt, człowiek, aktywnośćenzymatyczna, parametry kinetyczne, inhibicja, cytochromP450, CYPProfile inhibicjiPomysł badania inhibicji jest konsekwencją opublikowanegoartykułu przez zespół Newtona i wsp. [1] po to,aby ułatwić porównanie wyników w dostępnej literaturze.Trzeba podkreślić, iż dla człowieka używa się substratówi inhibitorów specyficznych dla jednego izoenzymu cytochromuP450. W związku z tym można oczekiwać skutecznegozahamowania aktywności metabolicznej w mikrosomachwątroby ludzkiej. U zwierząt badania inhibicjiprzeprowadzone są na izoformach o podobnej lub niższejaktywności katalitycznej niż u człowieka. Zatem skutecznegohamowania można oczekiwać, jeżeli izoenzym homologicznydo przypisywanego dla aktywności określonegosubstratu-markera jest odpowiedzialny za tę aktywność.Furafilina, inhibitor CYP1A2 [2, 3] o znanym mechanizmiedziałania, powoduje przy bardzo niskim stężeniu(l µM) 80% zahamowanie aktywności O-deetylazy fenacetynyw ludzkich mikrosomach wątrobowych [4]. Newtoni wsp. [1] potwierdzili to doniesienie. Wiadomo, że w ludz-19

Farm Przegl Nauk, 2010, 6kiej wątrobie nie ma znamiennej konstytutywnej ilości CYP1A1. Z tego powodu całkowite zahamowanie aktywnościO-deetylazy fenacetyny można uzyskać u ludzi używającfurafiliny. Przy najwyższym badanym stężeniu (100 µM),furafilina hamowała aktywność tej deetylazy u psa i koniaodpowiednio o 90% i 65%, podczas gdy u kota aktywnośćta nie została praktycznie zahamowana. Może to oznaczać,że podczas gdy enzym homologiczny z CYP1A2 odgrywaważną rolę w metabolizmie fenacetyny u psa i konia, innyizoenzym może być również zaangażowany w proces. Tenostatni wniosek wydaje się być przyczyną stabilnej aktywnościO-deetylazy fenacetyny w mikrosomach wątrobykota.Przeciwciało monoklonalne, które rozpoznaje ludzkiCYP 2A6 skutecznie hamuje aktywność 7-hydroksylazykumaryny u człowieka, psa i konia. U kota doszło do zahamowania70% tej aktywności przy inkubacji aż ze 100µg przeciwciała. Całkowite zahamowanie aktywnościw mikrosomach wątroby u człowieka, psa i konia wskazujena to, że enzym podobny do CYP2A6 lub reagujący krzyżowoz przeciwciałami monoklonalnymi jest odpowiedzialnyza wyżej wymienioną aktywność. Odnosząc powyższewnioski do obserwacji aktywności u kota, wskazuje się nafakt, że skoro zahamowanie jest niepełne to w proces zaangażowanyjest inny izoenzym.Poziom aktywności hydroksylazy tolbutamidu jest zbytmały w mikrosomach psa i kota by uzyskać wystarczającedane ilościowe do badania hamowania. Z tego powodu sulfafenazol(inhibitor tej hydroksylazy) nie może być używanyu tych gatunków zwierząt jako rozpoznawalny markerinhibicji P4502C9. Sulfafenazol powoduje odpowiednio80% i tylko 40% hamowanie aktywności tej hydroksylazyu człowieka i konia, dopiero przy 100 µM inhibitora. Newtoni wsp. [1] donoszą, że 100 µM sulfafenazol hamuje aktywnośćhydroksylazy tolbutamidu w ludzkich mikrosomacho 80%, co wykazano również w innym laboratorium [4].Aktywność hydroksylazy tolbutamidu obserwowana u konianie była całkowicie hamowana przez sulfafenazol i copowiedziano wcześniej, nie może być tłumaczona przezwpływ innych izoenzymów odpowiedzialnych za aktywność.Tranylcypromina, inhibitor CYP2C19 [5], powoduje całkowitąsupresję aktywności 4’-hydroksylazy S-mefenytoinyu wielu gatunków zwierząt. W związku z tym, izoenzymwysoce homologiczny z CYP2C19 może być odpowiedzialnyza metabolizm S-mefenytoiny w mikrosomach innychzwierząt, w tym psa, kota i konia.Wpływu chinidyny, silnego inhibitora CYP2D6, nieodnotowano na aktywność markerową u konia. Interpretacjawyników stała się trudniejsza odkąd aktywnośćO-demetylazy dekstrometorfanu u konia okazała się wyższaw porównaniu do człowieka. Chinidyna powodujezahamowanie 80% aktywności tej O-deetylazy u człowiekaprzy stężeniu rzędu l µM, podczas gdy przy 100µM spowodowała tylko 60% zahamowanie w mikrosomachwątroby psa i kota. Interpretacja danych w badaniuhamowania może być trudna u gatunków zwierząt,u których słabo poznano cytochrom P450. Odnosi sięto szczególnie do CYP2D6 gdzie odnotowano różnicemiędzygatunkowe w zależności od warunków hamowania.Dla przykładu, odnotowano, iż CYP2D1 szczurama 70% homologii z ludzkim CYP2D6 [6] i obagatunki mają podobną specyficzność substratową [7,8]. Chinina jest silnym inhibitorem CYP2D1 szczura,w przeciwieństwie do jej stereoizomeru, który jest właściwydla ludzkiego CYP2D6 [9].Specyficzny inhibitor CYP2E1 – dietyloditiokarbaminian,powoduje zahamowanie aktywności 6-hydroksylazychlorzoksazonu odpowiednio o 80%, 60%, 40% i 40%w mikrosomach człowieka, psa, kota i konia dla dawki100 µM inhibitora. Newton i wsp. [1] podają podobny zakreshamowania aktywności 6-hydroksylazy chlorzoksazonuza pomocą dietyloditiokarbaminianu w mikrosomachczłowieka. Zahamowanie aktywności w pewnym zakresieu wszystkich gatunków wskazuje, że enzym ten podobny doludzkiego P4502E1 może odgrywać istotną rolę w aktywności6-hydroksylazy chlorzoksazonu u konia, psa i kota.Ponieważ zahamowanie jest niepełne prawdopodobnie inneenzymy biorą udział w reakcji.Troleandomycyna jest podstawowym inhibitorem ludzkiegoCP3A4, zależnym od NADPH. Newton i wsp. [1] podajązahamowanie 80% aktywności 6β-hydroksylazy testosteronuw mikrosomach człowieka przez troleandomycynęw stężeniu 10 µM inhibitora. W laboratorium Chauret i wsp.[4], aktywność tej hydroksylazy u człowieka była zahamowanao 80% w stosunku do aktywności u psa, przy stężeniutroleandomycyny większym niż 10 µM. Pokrywa się toz badaniami prowadzonymi w innych laboratoriach [10-12], których autorzy donoszą, że troleandomy cyna możehamować aktywność 6β-hydroksylazy testosteronu u psa.Hydroksylacja testosteronu była tylko częściowo zahamowanau kota (40%) i konia (20%) przy stężeniu 100 µMtroleandomycyny.Badania te, jakkolwiek trudne i czasochłonne są niezwykleważne dla klinicznej oceny przydatności wielu nowychsubstancji, które mogą zostać wprowadzone do farmakologiiczłowieka. Ich wstępna selekcja na gruncie wpływu toksykologicznegona organizm żywy daje lepsze nadzieje nakońcowe badania kliniczne [13, 14].Próba ekstrapolacji gatunek zwierzęcia– człowiekPod koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wiekuGuengerich [15] zaproponował sugerowane, nieobowiązującecztery grupy „katalitycznego zachowania” izoformcytochromu P450 w odniesieniu do ekstrapolacji gatunkowej:1. Podrodziny cytochromu P450, w których gatunkowaekstrapolacja wydaje się być wysoka, odnoszą się doCYP2E1.2. Podrodziny cytochromu P450, w których wymaganejest trochę ostrożności w ekstrapolacji, odnoszą siędo CYP1A1, 1A2 i 4A.3. Podrodziny cytochromu P450, w których wskazanejest więcej ostrożności w ekstrapolacji, odnoszą siędo CYP2D i 3A.4. Duże problemy w ekstrapolacji, odnoszą się do CY-P2A, 2B i 2C.20

Aktywności P450 do:7-Etoksyrezorufina,fenacetynaKumarynaPrzeciwciało, inhibitorchemicznyPrzeciwciałodla ludzkiego CYP1A/2Furafilinaα-NaftoflawonPrzeciwciałodla ludzkiego 2A6Przeciwciałodla szczurzego 2B1/2Przeciwciałodla szczurzego 2C9copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tab. I. Przewidywanie gatunków zwierząt najbardziej porównywalnych z człowiekiem pod względem cytochromów P450(zmodyfikowane, na podstawie [13, 14, 16])7-EtoksykumarynaTolbutamid,diklofenakMefenytoinaBufuralol,dekstrametorfanChlorzoksazonTestosteronKwas laurynowySulfafenazolPrzeciwciałodla szczurzego 2C19TranylcypraminaPrzeciwciało dlaszczurzego 2D6ChinidynaChininaPrzeciwciało dlaszczurzego 2E1DietyloditiokarbaminianPrzeciwciało dlaszczurzego 3A2KetokonazolPrzeciwciało dlaszczurzego 4A1Profil inhibicjinajbardziej zbliżonydo ludzkiegoMysz, królik, świniaMysz, pies, końMysz, królik, świniaMałpa, świnia, pies,końAktywnośćenzymatycznanajbardziej zbliżonado człowiekaMysz, szczur, królik,świnia, małpa, pies,kot?, koń?Królik, małpa, świniaGatuneknajbardziejzbliżonydo człowiekaMysz, królik, świniaMałpa, świnia- Mysz Mysz-Małpa, świnia, koń,pies?-Pies, kot, szczur,małpa, królikSzczur, małpa,Pies, kotUmiarkowanainhibicja u psa; słaba uszczura, małpySzczurMałpaPies- Bez dużych różnicmiędzygatunkowychPies?, kot?Mysz, samiec szczuraMysz, samiec szczura,świnia, małpaBez dużych różnicmiędzygatunkowychMysz, samiecszczura, królik,świnia, małpa, pies?,kot?Bez dużych różnicmiędzygatunkowychSzczur?MałpaPies, szczur, małpaBez dużych różnicmiędzygatunkowychMysz, samiecszczuraŚwinia, małpaBez dużych różnicmiędzygatunkowychTa klasyfikacja nie jest ścisła, ale daje podstawy dowzględnie wiarygodnej oceny aktywności enzymatyczneji oceny izoenzymów cytochromu P450 podczas porównawczejanalizy międzygatunkowej. W laboratorium Bogaardsai wsp. [16] użyto innego podejścia do tego problemu.Ich celem nie było uszeregowanie podrodzin cytochromuP450 względem ekstrapolacji gatunkowej, ale przewidzenie,które gatunki są najbardziej zbliżone do człowiekapod względem podrodzin P450. W oparciu o parametrykinetyczne oraz aktywności enzymów i profile inhibicji,nie stwierdzono dużych różnic pomiędzy gatunkami zwierzątdla 6-hydroksylazy chlorzoksazonu i 12-hydroksylazykwasu laurynowego. Dla O-dealkilazy 7-etoksyrezorufiny,1’-hydroksylazy bufuralolu i 6β-hydroksylazy testosteronu– trzy lub cztery z badanych gatunków zwierząt zostaływybrane jako najbardziej zbliżone do człowieka, podczasgdy dla O-deetylacji fenacetyny, 7-hydroksylazy kumaryny,O-dealkilazy 7-etoksy-4-trifluorometylokumarynyi 4’-hydroksylazy S-mefenytoiny tylko jeden lub dwa ga-tunki z badanych zwierząt były wystarczająco podobnedo człowieka. Dla metabolizmu diklofenaku nie ustalonożadnej wiarygodnej prognozy. Jeśli wyniki zgrupowanew tabeli I miałyby posłużyć do zaklasyfikowania do powyżejwymienionych czterech grup to:- CYP2E i CYP4A należałyby do grupy pierwszej,- CYP2A, CYP2B i CYP2C do grupy czwartej,- CYP1A, CYP2D i CYP3A do grupy drugiej lub trzeciej.Stąd też, ogólnie rzecz ujmując, wyniki zebrane z tabeli Isą zgodne z klasyfikacją zaproponowaną przez Guengericha[15].PodsumowaniePodsumowując, żaden z gatunków zwierząt domowychnie wykazywał podobieństwa do człowieka odnośnie wydajnościróżnych inhibitorów. Na ogół aktywności metabo-21

Farm Przegl Nauk, 2010, 6liczne u kota były słabiej hamowane niż u innych gatunków,nawet przy wyższych stężeniach. Warto odnotować,iż niespecyficzne hamowanie izoform cytochromu P450można zaobserwować przy dużych stężeniach specyficznychinhibitorów. Powinno brać się to pod uwagę, gdy hamowaniezachodzi wyłącznie przy wysokim stężeniu inhibitora.Dla przykładu stwierdzono, że wiele specyficznychinhibitorów użytych w badaniach (furafilina, chinidyna,dietyloditiokarbaminian i troleandomycyna) może spowodowaćzahamowanie do 20% aktywności innych CYP przyzastosowaniu wyższego stężenia [1].Można z tego wywnioskować, iż występują duże różnicemiędzygatunkowe w reakcjach in vitro zależnych odcytochromu P450 w mikrosomach wątroby szczura, myszy,królika, małpy, psa, kota i konia. Występuje zmiennośćw aktywności metabolicznej specyficznych markerówkatalitycznych cytochromu P450, jak również różnice wsposobie działania specyficznych inhibitorów na różneaktywności katalityczne izoform cytochromu P450. Biorącpod uwagę ograniczoną liczbę dostępnych danych natemat cytochromów P450 u zwierząt domowych, włączającpowinowactwo substratów i inhibitorów, wynikidotychczasowych badań można wykorzystać, jako wskazówkiw przyszłych poszukiwaniach. Z danych uzyskanychw tych badaniach jasno wynika, że nowe związkichemiczne testowane na zwierzętach powinny byćbadane in vitro pod kątem ich profilu metabolicznegou wszystkich zwierząt doświadczalnych w przypadkuwyraźnie zaznaczonych międzygatunkowych odmiennościmetabolicznych. Tego typu badanie powinno wskazaćwszystkie możliwe in vivo przemiany metaboliczne potencjalnychleków, nawet na wczesnym etapie badaniaklinicznego.Kończąc, niewiele badań zostało zaprojektowanychw celu scharakteryzowania izoenzymów cytochromuP450 lub enzymatycznych aktywności markerowych cytochromówP450 u różnych gatunków zwierząt, aby dostarczyćdodatkowych ważnych informacji odnoszącychsię do porównawczego metabolizmu międzygatunkowego.Wyniki tych badań zostały użyte do wybrania gatunkunajbardziej podobnego do człowieka dla każdego izoenzymu(aktywności) P450. Jeżeli wiemy, który z ludzkichizoenzymów cytochromu P450 jest zaangażowanyw metabolizm określonej substancji chemicznej, danez tabeli I powinny być uważane za użyteczne narzędziedo wybrania najbardziej odpowiedniego gatunku dla eksperymentówin vitro i in vivo. W ten sposób badania tedają nadzieję na uzyskanie dodatkowych ważnych informacjidotyczących międzygatunkowego metabolizmu porównawczego.Wnioski1. Wykazano, że praktycznie żadne z badanych gatunkówzwierząt nie było podobne do człowiekawe wszystkich badanych aktywnościach enzymatycznychizoform cytochromu P450. U każdego zgatunków jedynie kilka z pośród aktywności CYPmoże być rozważane jako porównywalne do człowieka.2. Odkąd wiadomo, które izoenzymy cytochromuP450 biorą udział w metabolizmie związków chemicznych,dane porównawcze przedstawione w tymopracowaniu mogą być użyte do wybrania zwierzęcianajbardziej zbliżonego do człowieka w badaniachin vitro i in vivo.Piśmiennictwo1. Newton DJ, Wang RW, Lu AYH. Cytochrome P450 inhibitors:evaluation of specificities in the in vitro metabolismof therapeutic agents by human liver microsomes.Drug Metab Dispos 1995; 23: 154-158.2. Kunze KL, Trager WF. Isoform-selective mechanism-basedinhibition of human cytochrome P4501A2 by furafylline. Chem Res Toxicol 1993; 6:649-656.3. Murray S i wsp. Inhibition of human CYP1A2 activityin vitro by methylxanthines: potent competitive inhibitionby 8-phenyltheophylline. Xenobiotica 2001;31:135-151.4. Chauret N i wsp. In vitro comparison of cytochromeP450-mediated metabolic activities in human,dog, cat, and horse. Drug Metab Dispos 1997; 25:1130-1136.5. Wienkers LC i wsp. Formation of (R)-8-hydroxywarfarinin human liver microsomes. A new metabolic markerfor the (S)-mephenytoin hydroxylase, P4502C19. DrugMetab Dispos 1996; 24: 610-614.6. Soucek P, Gut I. Cytochromes P-450 in rats: structures,functions, properties and relevant human forms. Xenobiotica1992; 22: 83-103.7. Nedelcheva V, Gut I. P450 in the rat and man: methodsof investigation, substrate specificities and relevance tocancer. Xenobiotica 1994; 24: 1151-1175.8. Dracínska H i wsp. Oxidative detoxication of carcinogenic2-nitroanisole by human, rat and rabbit cytochromeP450. Neuro Endocrinol Lett 2006; 27 Suppl2: 9-13.9. Granvil CP i wsp. 4-Hydroxylation of debrisoquineby human CYP1A1 and its inhibition by quinidineand quinine. J Pharmacol Exp Ther 2002; 301:1025-1032.10. Ciaccio PJ, Halpert JR. Characterization of a phenobarbital-inducible dog liver cytochrome P450 structurally relatedto rat and human enzymes of the P450IIIA (steroid inducible)gene subfamily. Arch Biochem Biophys 1989; 284:284-299.11. Jayyosi Z i wsp. Catalytic and immunochemical characterizationof cytochrome P450 isozyme induction in dogliver. Fundam Appl Toxicol 1996; 31: 95-102.12. Eguchi K i wsp. Quantitation of cytochrome P450 enzymes(CYP1A1/2, 2B11, 2C21 and 3A12) in dog livermicrosomes by enzyme-linked immunosorbent assay.Xenobiotica 1996; 26: 755-763.13. Michalets EL. Update: clinically significant cytochromeP450 drug interactions. Pharmacotherapy. 1998;18: 84-112.14. Tredger JM, Stoll S. Cytochromes P450 – their impacton drug treatment. Hospital Pharm. 2002; 9: 167-173.22

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507315. Guengerich FP. Comparisons of catalytic selectivityof cytochrome P450 subfamily enzymes fromdifferent species. Chem Biol Interact 1997; 106:161-182.16. Bogaards JJ i wsp. Determining the best animal modelfor human cytochrome P450 activities: a comparison ofmouse, rat, rabbit, dog, micropig, monkey and man. Xenobiotica2000; 30: 1131-1152.data otrzymania pracy: 23.02.2010 r.data akceptacji do druku: 25.05.2010 r.Adres do korespondencji:dr hab. Andrzej PlewkaZakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny,41-200 Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30tel.: +48 32 364 14 30e-mail: aplewka@sum.edu.pl23

Farm Przegl Nauk, 2010,6, 24-31Lasery oraz ich zastosowanie w medycynie i farmacjiLasers and their application in medicine and pharmacyAnna Krzeszewska, Magdalena ZdybelKatedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachStreszczenieŚwiatło laserowe powstaje w wyniku wymuszonej emisjipromieniowania. Wiązka laserowa posiada charakterystycznewłaściwości takie jak: monochromatyczność,koherentność, dużą intensywność oraz małą rozbieżnośćkątową, które odpowiadają za specyficzne oddziaływaniepromieniowania laserowego z tkanką. Celem pracy jestzaprezentowanie zastosowań laserów w medycynie i farmacji,omówienie zasad działania laserów oraz oddziaływańpromieniowania laserowego z tkanką. Naświetlanietkanek światłem laserowym małej mocy powoduje podwyższenieich temperatury, czemu towarzyszy poprawaukrwienia i pobudzenie procesów metabolicznych (efektbiostymulacyjny). Wtórnymi efektami są zminimalizowaniebólu i przyspieszenie gojenia uszkodzeń tkanki. Światłolaserowe o większej mocy wywołuje w tkance efektyfototermiczne. Tego typu naświetlanie doprowadza dofotokoagulacji lub fotoablacji. W pracy zaprezentowanolasery różniące się ośrodkiem czynnym, który stanowićmoże ciało stałe, ciecz, gaz lub półprzewodnik. Omówionourządzenia laserowe pracujące w trybie ciągłym orazemitujące impulsy świetlne z określoną częstotliwością.Zastosowanie laserów w medycynie i farmacji jest bardzoszerokie. Z uwagi na ograniczenie krwawienia, umożliwieniebardzo precyzyjnego cięcia, zmniejszenie bólu czyprzyspieszenie gojenia ran lasery coraz częściej wykorzystywanesą w chirurgii, dermatologii, okulistyce, stomatologii,laryngologii i neurologii. Biostymulujące działanielasera wpływa korzystnie na efekty lecznicze farmakoterapii.Wiele badań poświęconych jest również terapii fotodynamicznejPDT polegającej na naświetlaniu wiązkąświatła laserowego tkanki, która wcześniej zakumulowałazwiązek światłouczulający. Naświetlenie komórek światłemo określonej długości fali prowadzi do przejścia fotouczulaczaw stan wzbudzony, co w konsekwencji prowadzido zniszczenia tkanki zmienionej chorobowo. Terapiętę stosuje się głównie w leczeniu nowotworów.AbstractLaser light is formed by stimulated emission of radiation.Light emitted by lasers have many characteristic propertiesas monochromaticity, coherence, high intensity, and itfalls parallelly in strictly definite direction, what is responsiblefor specific interactions with tissues. The aim of thiswork is to present many kind of laser applications in medicineand pharmacy, describe basic of lasers and laser interactionswith tissues. Low level laser therapy that is biostimulationinduced increase of temperature, improve ofblood circulation and stimulation of metabolic processes.High level laser therapy induced fotothermal effects. Thatkind of laser radiation causes fotoablation and fotocoagulationin this part of tissue. Lasers may work continuouslyor they may emit impulses of light with definite frequency.Many kind of material like solid, liquid, semiconductor orgas can be used as laser active center. There are knowna lot of laser applications in medicine and pharmacy. Onaccount of bleeding reduction, possibility of precise cut,guarantee of better visibility during operation, decreaseof pain and acceleration of injury healing lasers are oftenused in surgery, dermatology, ophthalmology, stomatology,laryngology and neurology. Laser biostimulation effectson therapeutical results of pharmacotherapy. Nowadaysmany of research are concentrated on photodynamictherapy. That treatment use laser light to activate the fotosensitivecompound which is accumulated in pathologicaltissue. Laser radiation causes activation of this substancewhat destroys treated tissue. Mainly that kind of therapyis used to cancer treatment.Keywords: laser, laserotherapy, biostimulation, photosensitizersSłowa kluczowe: laser, laseroterapia, biostymulacja, fotouczulaczeLaser to urządzenie, w którym uzyskuje się wzmocnieniepromieniowania elektromagnetycznego w wyniku emisjiwymuszonej. Od pierwszych liter powyższej definicjiw języku angielskim pochodzi nazwa lasera – Light Amplificationby Stimulated Emission of Radiation [1].Wśród oddziaływań promieniowania elektromagnetycznegoz materią wyróżnić można trzy zjawiska: absorpcję,emisję spontaniczną i emisję wymuszoną. Działanie laseraopiera się na zdolności atomów do absorbowania i emitowaniaenergii. Absorpcja polega na pochłonięciu energii24

Ryc. 1. Zjawisko emisji wymuszonej. E – energia, hν = E 1– E 0.Ryc. 2. Budowa lasera wg [2].z jednoczesnym przejściem atomu na wyższy poziom energetyczny(poziom wzbudzony) [1, 2]. W związku z tym, że każdyukład dąży do osiągnięcia jak najniższej energii, wzbudzonyatom w krótkim czasie przechodzi z powrotem na swój poziompodstawowy i uwalnia energię, którą wcześniej zaabsorbował.Jest to tak zwany proces emisji spontanicznej [1, 2]. Do emisjiwymuszonej (Ryc. 1) dochodzi wówczas, gdy na atom znajdującysię w stanie wzbudzenia zadziała foton o energii równejróżnicy energii pomiędzy jego stanem podstawowym a stanemwzbudzonym. Podczas tego procesu powstaje dwa razy więcejfotonów niż podczas emisji spontanicznej [2, 3].Budowa i działanie laseracopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Zapoczątkowanie akcji laserowej wymaga nie tylko zaistnieniaprocesu emisji wymuszonej. Konieczne jest takżeto, by proces ten pojawiał się z większą częstotliwościąniż absorpcja i emisja spontaniczna [2, 3]. W środowiskunaturalnym atomy dążą do przebywania na poziomie podstawowym,a więc w stanie o najniższej energii. W układachz przewagą atomów w stanie podstawowym przeważająprocesy absorpcji energii [2, 4]. Aby zapoczątkowaćakcję laserową należy dostarczyć układowi energii, a więcdoprowadzić do stanu, w którym przeważać będą atomyw stanie wzbudzonym, co spowoduje, że będzie on emitowałwięcej energii niż absorbował. Stan ten zwany jest układemantyboltzmannowskim. Uzyskuje się go najczęściejpoprzez pompowanie optyczne, które prowadzi do inwersjiobsadzeń poziomów energetycznych [1, 2, 4].Pompowanie optyczne oprócz istnienia stanu podstawowegoi stanu wzbudzonego atomu, wykorzystuje dodatkowystan energetyczny. Znajduje się on nad stanem wzbudzonymi charakteryzuje się bardzo krótkim czasem trwania [2]. Podczaspompowania optycznego dochodzido dostarczenia do układu energii, któraumożliwia przeniesienie znajdującychsię na poziomie podstawowym atomówna poziom niestabilny, czemu towarzyszypochłonięcie energii [1, 3]. W związkuz tym, że stan ten jest nietrwały następujebardzo szybkie samoistne przejście atomówna poziom wzbudzony, na którymmogą one pozostawać przez dłuższy czas.Poziom niestabilny stanu energetycznegonazywany jest też pasmem pompowania[2]. Ciągłe napromieniowywanie układuz zewnątrz pozwala uzyskać układ,w którym przeważają atomy w staniewzbudzonym, czyli wspomnianą wcześniejinwersję obsadzeń [4]. Inwersjęobsadzeń powoduje przeniesienie ponadpołowy atomów układu na poziom wzbudzony.Opisany wyżej układ energetycznyw związku z ilością wykorzystanychw nim poziomów energetycznych określanyjest jako schemat trójpoziomowy[2, 3].Często stosowany jest też schematczteropoziomowy wykorzystujący dwaenergetyczne poziomy wzbudzone atomu[2-4]. To właśnie przejścia pomiędzy tymi poziomamidoprowadzają do powstania akcji laserowej. Jest to możliwe,gdy niższy z nich leży dostatecznie wysoko nad poziomempodstawowym atomu. Pozwala to znacznie zwiększyćefektywność inwersji obsadzeń bez konieczności ciągłegodostarczania energii do układu [2, 4].Inwersja obsadzeń nie jest jednak jedynym warunkiemkoniecznym do wywołania akcji laserowej. W związkuz tym, że w układzie występują straty energii należy doprowadzićdo stanu, w którym wzmocnienie promieniowaniabędzie na tyle duże, aby wszystkie te straty przewyższało [2,4]. Osiągnięcie tego celu umożliwia umieszczenie ośrodkaczynnego lasera w rezonatorze optycznym. Jest to specjalnakomora, którą tworzą zazwyczaj dwa zwierciadła umieszczoneprostopadle do osi rezonatora [2, 4].Odbicia promieniowania od zwierciadeł powodują dodatniesprzężenie zwrotne prowadzące do wzrostu gęstościpromieniowania wymuszającego oraz do przedłużenia drogijego oddziaływania z atomami ośrodka czynnego lasera.Rezonator optyczny umożliwia w ten sposób przekroczenietak zwanego progu generacji światła laserowego. Próg tenokreśla ilość energii potrzebnej do wytworzenia przez laserpromieniowania [3-5].W laserach wyróżniamy trzy podstawowe elementy(Ryc. 2): komorę rezonatora optycznego, układ pompujący,czyli źródło wzbudzenia (termiczne, elektryczne, radioaktywnelub chemiczne) oraz ośrodek czynny (gaz, ciecz, ciałostałe lub półprzewodnik) [2].Wytwarzane przez laser światło w przeciwieństwie doświatła zwykłego jest wiązką uporządkowanych i spójnychpromieni, którą cechuje duża intensywność [2, 3]. Światłoto jest monochromatyczne, a więc szerokość tworzonegoprzez nie widma jest bardzo mała. Promienie tworzące25

Farm Przegl Nauk, 2010, 6wiązkę laserową są względem siebie równoległe, rozchodząsię w ściśle określonym kierunku [2]. Rozbieżność wiązkijest niewielka, a średnica tworzonej przez nią plamki ulegapraktycznie niewidocznym zmianom wraz ze wzrostem odległościod lasera. Wiązka powstała w laserze jest koherentna,co oznacza, że fale promieniowania są spójne zarównow czasie jak i przestrzeni [2-4].Oddziaływanie światła laserowego z tkankąGłównymi czynnikami wpływającymi na efekt jaki promieniowanielaserowe wywołuje w tkance są: właściwościtkanki, parametry wiązki lasera i czas w jakim stosowanajest ekspozycja [1, 4, 5]. Promieniowanie laserowe, którymnaświetlana jest tkanka może zostać przez nią pochłonięte,może się od niej odbić lub rozproszyć. Stopień, w jakim tetrzy zjawiska wystąpią zależy od rodzaju tkanki. Wpływ nato ma między innymi obecność w tkance związków, takichjak hemoglobina i melanina, które są fotoakceptorami [1].Duże znaczenie ma także unaczynienie tkanki, jej uwodnieniei struktura powierzchni [1, 2]. Głębokość wnikaniaświatła laserowego w tkankę zależy natomiast od długościfali elektromagnetycznej emitowanej przez laser [1].Jedną z najbardziej wykorzystywanych w medycyniewłaściwości światła laserowego jest nagrzewanie tkanek[1, 3, 4]. Wzrost temperatury tkanki oznacza wzrost ruchówdrgających jej cząsteczek. Ogrzanie tkanek powoduje wzmożonąproliferację komórek, stymulację syntezy i uwalnianiesubstancji biologicznie czynnych wykazujących pozytywnywpływ na działanie organizmu [1, 4].Efekty fotobiologiczne związane z działaniem na tkankęlaserów małej mocy, mieszczącej się w przedziale pomiędzy1 mW a 6 mW prowadzą na skutek podniesienia temperaturydo pobudzenia procesów metabolicznych [1, 4, 5].Na skutek biostymulacji światłem laserowym dochodzi dozwiększenia przepływu krwi, co umożliwia przyspieszeniewymiany elektrolitów pomiędzy komórkami. Naczynialimfatyczne ulegają rozszerzeniu, co ułatwia i przyspieszaprzepływ chłonki. Skutkiem biostymulacyjnego działanialaserów jest także zwiększenie ilości erytrocytów i stymulacjaszpiku kostnego. Zauważalny jest wpływ promieniowanialaserowego na układ immunologiczny, polegający naregulacji jego działania [3, 5, 6]. W przypadku koniecznościobniżenia aktywności układu, co ma miejsce w chorobachwynikających z autoimmunoagresji dochodzi do immunosupresjiobjawiającej się głównie spadkiem ilości przeciwciałi zmniejszeniem ilości limfocytów T [3, 7].W wyniku naświetlania laserami małej mocy dochodzitakże do zmian w układzie krzepnięcia. Zmiany te polegająna skróceniu czasu krwawienia, krzepnięcia, a także obniżeniuilości fibrynogenu, co ma szczególnie pozytywneznaczenie w przebiegu leczenia trudno gojących się ran [8].Promieniowanie laserowe małej mocy podwyższa zdolnościregeneracyjne naświetlonej tkanki, co umożliwia szybszei łatwiejsze gojenie się ran, oparzeń, owrzodzeń czy złamań.Działanie to ma związek z wpływem światła laserowegona przyspieszenie podziałów komórkowych [1, 8, 9].W przypadku takich komórek jak keratynocyty, obserwujesię wzmożoną ruchliwość prowadzącą do ich przesunięciaw miejsce uszkodzonej tkanki [1, 3, 4, 5]. Natomiast fibroblastyreagują wzrostem syntezy kolagenu, DNA i poszerzeniemszorstkiej siateczki endoplazmatycznej. Częściej takżeulegają one przekształceniu w miofibroblasty, co dodatkowoma bardzo duże znaczenie przy formowaniu blizny, ponieważw znaczącym stopniu podnosi jej wytrzymałość mechaniczną[5, 8, 9].Promieniowanie laserowe małej mocy oddziałuje równieżna enzymy prowadząc do ich aktywacji, unieczynnienialub reaktywacji [1, 2, 4, 8-10]. W efekcie biostymulacji normalizujesię także potencjał błony komórkowej, zmianomulegają jej przewodnictwo elektryczne i przenikalność orazwłaściwości adhezyjne. Aktywowaniu ulega także aparatgenetyczny, co skutkuje zwiększeniem syntezy DNA, RNAi białek, a także wzrostem produkcji ATP [1, 3, 4].Laseroterapia nie pozostaje także bez wpływu na stężenieinnych substancji biologicznie czynnych organizmu.W jej wyniku dochodzi do zwiększenia stężenia adrenaliny,noradrenaliny, histaminy czy serotoniny [1, 4, 6]. Na skutekobniżenia przewodnictwa we włóknach czuciowych, a takżepobudzenia wydzielania β-endorfin i zmian przewodnictwaw synapsach dochodzi do wywołania efektu przeciwbólowego[1, 3, 4]. Działanie przeciwbólowe zaliczane jest dodziałań wtórnych biostymulacji laserowej. Innym tego rodzajudziałaniem jest efekt przeciwzapalny, który umożliwionyjest rozszerzeniem naczyń krwionośnych, ułatwieniemwytworzenia krążenia obocznego, przyspieszeniemwchłaniania obrzęków i wysięków, poprawą mikrokrążeniai stymulacją migracji makrofagów [4, 6].Efekty biologiczne biostymulacji laserowej pojawiająsię w czasie od kilku sekund do kilku godzin po naświetlaniu.Na efekty kliniczne potrzeba nawet kilku dni. W czasiepomiędzy zaabsorbowaniem promieniowania a pierwszymipozytywnymi jego objawami zachodzi szereg opisanychwcześniej procesów zarówno na poziomie subkomórkowym,komórkowym, jak i tkankowym [1, 3, 4, 5, 8].Efekty biostymulacyjne prowadzą do miejscowego podniesieniatemperatury tkanki o 0,5 do 1 º C. Dalszy wzrosttemperatury powoduje efekt fototermiczny [1, 2]. Pierwszymjego stopniem jest fotohipertermia, która ma miejsceprzy nagrzewaniu sięgającym od 37 º C do 60 º C. W przedzialetemperatur pomiędzy 43-60 º C dochodzi do uszkodzeniabłon komórkowych i częściowej denaturacji enzymów [1,2, 4]. Jest to jednak proces odwracalny pod warunkiem, żenie przekroczy kilku minut. Temperatura od 60 º C do 80 º Cprowadzi do fotokoagulacji. Dochodzi w tym przypadkudo trwałej denaturacji białek enzymatycznych i strukturalnych,co jest bezpośrednim efektem zerwania wiązań stabilizującychkonformację przestrzenną makromolekuł [1, 3].W przypadku dalszego naświetlania i osiągnięcia przeztkankę temperatury sięgającej 100 º C dochodzi do nieodwracalnejdenaturacji DNA [1]. Denaturacja cieplna przebiegastopnio wo, a różne cząsteczki ulegają jej w różnej temperaturze.Im dłużej tkanka jest naświetlana tym większy jestodsetek denaturowanych struktur [3, 4].Powyżej 300 º C w naświetlanej tkance dochodzi do fotopirolizy,czyli odparowania wszystkich składników komórkiznajdujących się w stanie stałym [1, 2]. W medycynie zastosowanieznajduje fotowaporyzacja tkanek wiązką laserowąpolegająca na ich cięciu i separacji przestrzennej związanejz szybkim odparowaniem wody [1, 2, 4].26

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tab. I. Podział laserów uwzględniający rodzaj ośrodka czynnego.Zestawiono wg [1, 2]OŚRODEKPRZYKŁAD LASERACZYNNYlaser rubinowylaser yagowy (YAG)CIAŁO STAŁE laser neodymowo-yagowy (Nd:YAG)laser erbowo-yagowy (Er:YAG)laser aleksandrytowyCIECZ laser barwnikowylaser helowo-neonowy (He-Ne)laser dwutlenkowęglowy (CO 2)GAZlaser argonowylaser azotowylaser ekscymerowyNiszczenie tkanki wywołuje także efekt jonizacji cząsteczekna skutek naświetlania ich krótkimi impulsami o dużejgęstości mocy. Tego typu naświetlanie doprowadza dofotoablacji tkanki i powstania fal uderzeniowych w niestabilnej,zjonizowanej plazmie, która charakteryzuje się dużąkoncentracją naładowanych cząstek w postaci dodatnich jonówi swobodnych elek tronów posiadających różne energiekinetyczne [1]. W plazmie tej rozchodzą się fale uderzenioweprowadzące do fotofragmentacji, a przy wyższych gęstościachenergii do fotorozerwania tkanek [1, 2, 5]. Zjawiskoto ma charakter mikrowybuchu. Na skutek fotojonizacjitkanka jest rozrywana w wyniku działania ciśnieniowych faluderzeniowych, kawitacji [1, 2, 3]. Z efektem fotojonizacjizwiązany jest efekt fotochemiczny, który polega na rozrywaniuwiązań chemicznych bez towarzyszącego temu zjawiskunagrzewania tkanek [1, 4].Podział laserówBiorąc pod uwagę między innymi moc promieniowania,modulację pracy, długość fali oraz rodzaj ośrodka czynnegolasery podzielić można na kilka grup.W zależności od mocy generowanego promieniowania,która w decydujący sposób wpływa na efekty, jakie promieniowanielaserowe wywoła w tkankach, lasery dzieli się na urządzeniamałej mocy (od 1 mW do 6 mW), średniej mocy (od7 mW do 500 mW) i dużej mocy (powyżej 500 mW) [2, 3].Urządzenia laserowe mogą pracować w trybie ciągłymoraz impulsowym. Podczas modulacji ciągłej natężeniei moc wytwarzanej wiązki jest stała w czasie. Praca laserówimpulsowych polega natomiast na wytwarzaniu powtarzającychsię impulsów. Częstotliwość ich wytwarzania możebyć bardzo różna i waha się w granicach od 1 Hz do 10 000Hz [2, 4].Długość fali emitowanej przez lasery zależy od użytegoośrodka czynnego. Lasery mogą wytwarzać promieniowanieo długości fali poniżej 400 nm (nadfiolet), w zakresie od400 nm do 780 nm (pasmo widzialne) oraz powyżej 780 nm(podczerwień) [2, 3].Ośrodki czynne stosowane w laserach mogą mieć takżeróżną postać (Tab. I). W przypadku zastosowania ciałastałego dochodzi do aktywacji atomów znajdujących sięw nim domieszek metali. Lasery te pracować mogą w sposóbciągły, natomiast emitowana przez nie wiązka charakteryzujesię małą spójnością [2, 3]. Najczęściej używanymi laseramitego typu są lasery, w którym ośrodek czynny stanowigranat itrowo-aluminiowy domieszkowany neodymem. Odangielskiej nazwy tego minerału określane są one skrótemYAG (yttrium-aluminium garnet), a pompowanie odbywasię w nich za pomocą światła o bardzo dużym natężeniu.Wśród materiałów granat YAG wyróżnia się bardzo dobrymiwłaściwościami związanymi przede wszystkim z tym,że posiada on niski próg wzbudzenia, co ułatwia zapoczątkowanieakcji laserowej [2, 4]. Równie często używanymlaserem jest laser neodymowy, w którym ośrodek czynnystanowi pręt szklany z domieszką trójtlenku neodymu. Laserten pracuje emitując impulsy o długości fali 1060 nm,czyli znajdujące się w widmie podczerwieni. Pręty ze szkłaneodymowego mają długość od kilku do kilkunastu mm,a do wywołania w nich inwersji obsadzeń używa się lampbłyskowych [2]. Spośród laserów neodymowych najczęściejużywany jest laser neodymowo-yagowy (Nd:YAG), w którymjony neodymu wbudowane są w granat itrowo-aluminiowy[3].Ośrodkiem czynnym mogą być również ciekłe związkiorganiczne lub nieorganiczne, które mają charakter specyficznychkompleksów. Jest tak w przypadku laserów chelatowychczy barwnikowych. Pompowanie w tych laserachnastępuje w wyniku wzbudzenia optycznego lub wywołaniareakcji chemicznych [2, 5]. Laser barwnikowy to laser,w którym ośrodek czynny stanowi roztwór barwnika pozostającyw stanie ciekłym. Możliwość zastosowania jakoośrodka czynnego różnego rodzaju barwników daje możliwośćwytwarzania przez lasery barwnikowe różnych długościfali. Najpopularniejszymi barwnikami stosowanymiw laserach są fluoresceina, rodamina G6 i rodamina B [2, 4].Ośrodkiem czynnym lasera może być także dioda, czylizłącze półprzewodnikowe. Najczęściej zbudowane jest onoz arsenku galu. Pompowanie optyczne zachodzi w wynikuprzepływu prądu przez półprzewodnik [2]. Półprzewodnikisą ciałami stałymi, których przewodnictwo elektryczne jestznacznie mniejsze niż przewodnictwo metali, ale znaczniewiększe niż przewodnictwo dielektryków. Wśród najczęściejużywanych półprzewodników wymienić należy kryształygermanu, krzemu, galu, indu, antracenu czy piranu [2,3, 5].Ośrodek czynny w laserach stanowić mogą także atomyhelu, neonu, jony gazów szlachetnych: argonu, ksenonuczy kryptonu oraz dwutlenek węgla. Zastosowanie znajdujątakże pary metali w gazie szlachetnym. Do pompowaniaw powyższych laserach gazowych dochodzi na drodze wyładowańelektrycznych [2, 3, 5]. W medycynie spośród laserówgazowych najczęściej stosowany jest laser CO 2. Możeon pracować zarówno w trybie ciągłym, jak i impulsowym.Bardzo znamienny jest fakt, że laser ten charakteryzuje sięnajwiększą sprawnością energetyczną i najwyższą mocą zewszystkich urządzeń laserowych. Ośrodek czynny stanowiw nim mieszanka gazów CO 2, neonu i helu w proporcjach1:1,3:7,7 [2]. Zaznaczyć jednak należy, że w tym przypadkuto dwutlenek węgla jest gazem aktywnym [2, 3]. Kolejnymbardzo często stosowanym laserem gazowym jest laser helowo-neonowy(He-Ne). W tego rodzaju laserach ośrodekaktywny stanowi neon znajdujący się wraz z helem w pro-27

Farm Przegl Nauk, 2010, 6porcji 1:10 w szklanej rurze, w której znajdują się takżeelektrody [2]. Pompowanie zachodzi na skutek emisji przezkatodę elektronów, których ruch do anody przyspieszany jestna skutek różnicy potencjałów panującej pomiędzy dwomaelektrodami. W konsekwencji dochodzi do wielokrotnychzderzeń elektronów z atomami ośrodka czynnego, co powodujeich wzbudzenie do wyższych stanów energetycznych[2, 3, 5].Zastosowanie laserów w medycynie i farmacjiSkonstruowanie przez Maimana w 1960 roku pierwszegolasera, a następnie wykorzystanie przez Goldmana laserarubinowego w leczeniu zmian naczyniakowatych zapoczątkowałorozwój laseroterapii [1]. Od tego momentu corazpowszechniej wykorzystuje się laser w różnych dziedzinachmedycyny: chirurgii, dermatologii, okulistyce, stomatologiioraz w diagnostyce i terapii fotodynamicznej. Zastosowanielaserów w medycynie znacznie ułatwiło pracę lekarzy,zmniejszyło występowanie efektów niepożądanych, jakrównież skróciło czas powrotu pacjenta do zdrowia [1, 11].W chirurgii podczas zabiegów i operacji do cięcia tkanekstosowany jest laser CO 2i Nd:YAG, natomiast do koagulacjiNd:YAG i argonowy. Cięcie tkanek za pomocą laserówminimalizuje utratę krwi [1]. Ma to związek z tym, że podczasjego wykonywania w przeciwieństwie do tradycyjnychmetod chirurgicznych dochodzi do niewielkiego otwarcianaczyń krwionośnych [1, 11]. Przy odpowiednim doborzelasera możliwe jest także bardzo precyzyjne cięcie tkanki,przy jednoczesnym ograniczeniu głębokości penetracjiwiązki laserowej, co zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanekotaczających. Przewaga lasera nad tradycyjnymi metodamipolega także na zapewnieniu idealnej widoczności pola zabiegowego[3, 5, 11].Lasery bardzo często wykorzystywane są przy zabiegach,podczas których szczególnie ważne jest ograniczeniedo minimum wycinanych tkanek. Ma to miejsce na przykładpodczas zabiegów i operacji urologicznych, takich jak usuwanieguzów czy wszelkiego rodzaju ingerencje chirurgicznenerki [1]. Ze względu na precyzję oraz ograniczenie polakrwawienia lasery stosowane są do koagulacji nowotworówneurologicznych: glejaków, oponiaków, nerwiaków. Stosujesię je również w przypadku, gdy guzy te są już przerzutami[1, 4].Cięcie wiązką laserową wykorzystywane jest takżew pneumologii. Metodą tą wykonuje się rekanalizację drógoddechowych, usuwa ciała obce, koaguluje źródła krwawieniaz układu oddechowego [1, 4].W laryngologii laserowo usuwa się polipy, wykonuje sięredukcję przerostu małżowiny usznej, czy zrostów błonyśluzowej. W przypadku zabiegów w obrębie górnych drógoddechowych szczególne znaczenie ma ograniczenie wielkościurazu oraz szybkość wykonania cięcia i zakończeniaingerencji chirurgicznej. Konieczna jest natychmiastowahemostaza w obrębie naczyń krwionośnych i limfatycznychoraz utrzymanie jałowości rany [1].Koagulacja i cięcie laserowe umożliwia endoskopowezamknięcie krwawiących tkanek układu pokarmowego,jakie występują na przykład przy chorobie wrzodowej żołądka,dwunastnicy czy żylakach przełyku. Podobnie jestw ginekologii. Lasery tnące i koagulujące wykorzystywanesą przy laparoskopii ginekologicznej w celu zniwelowaniazrostów i innych przyczyn niedrożności jajowodów i macicy,często powodujących niepłodność [1, 4].Zastosowanie laserów w dermatologii jest bardzo rozległe[11-16]. Przy ich pomocy przeprowadza się odmładzanieskóry LSR (z ang. laser skin resurfacing) oraz leczy bliznypotrądzikowe [12]. Efektu tego dokonuje się przez spowodowaniemikrouszkodzeń cieplnych, unikając opóźnionegogojenia i bliznowacenia powstałych ran. W celu odmłodzeniaskóry wykorzystuje się pracujący pulsacyjnie laserCO 2oraz laser erbowo-yagowy (Er:YAG) emitujący wiązkęo długości fali wynoszącej 2940 nm. Bardzo często też stosujesię ich kombinację. W tym przypadku laser Er:YAGwykorzystywany jest do likwidacji uszkodzeń powstałychpo wcześniejszym naświetlaniu laserem CO 2[12].Za pomocą laserów można także usuwać tatuaż [12].W tym celu wykorzystuje się głównie lasery CO 2i Nd:YAGwysyłające krótkie impulsy o bardzo dużej mocy. Pomimotego, że lasery są w tym przypadku najbardziej zalecanąmetodą należy zaznaczyć, że usunięcie barwnika ze skórymoże nie być całkowicie możliwe [12-14].Dermatologiczne zastosowanie laserów to także usuwaniewłókniaków miękkich [12] i redukcja rhinophyma– najbardziej zaawansowanego stadium trądziku różowatego[15]. Najczęściej jednak lasery w dermatologii stosowanesą do usuwania zmian barwnikowych, naczyniowych, blizn,a nawet bliznowców [12, 16]. Zmiany barwnikowe, w którychwykorzystuje się laseroterapię to przede wszystkim plamysoczewicowate, plamy typu cafe au lait, piegi i znamiona.W związku z tym, że melanina charakteryzuje się szerokimspektrum pochłaniania światła do przeprowadzenia zabiegumoże być użyty prawie każdy rodzaj lasera. Należy zaznaczyćjednak, że w przypadku tak silnie działających urządzeńjak na przykład laser CO 2powodzenie zabiegu zależyod wprawy przeprowadzającego [12]. Zmiany naczyniowenatomiast, takie jak rozszerzone naczynia krwionośne czynaczyniaki leczone są przy pomocy lasera Nd:YAG, laseradiodowego oraz pulsacyjnego lasera barwnikowego [16].W okulistyce natomiast zastosowanie znalazły laseryekscymerowe, argonowe, kryptonowe, Er:YAG oraz półprzewodnikowe[1]. Dzięki nim można dokonać punktowejkoagulacji, nacięcia czy fotoablacji tkanki poddanej naświetlaniu.Okulistycznych jednostek chorobowych leczonychprzy użyciu lasera jest wiele. Wśród najczęściej występującychwymienić należy cysty i zrosty, jaskrę, zaćmę,odwarstwienie siatkówki, retinopatię cukrzycową, a takżeróżnego rodzaju schorzenia naczyniowe [1, 17]. Zastosowanielaserów w okulistyce sprowadza się do koagulacji,nacinania oraz fotoablacji. Laser umożliwia doprowadzeniepromieniowania do gałki ocznej, zogniskowanie go na siatkówceoraz innych miejscach wewnątrz oka bez ingerencjichirurgicznej [1, 17].Lasery używane są również przy zabiegach z zakresuchirurgii refrakcyjnej oka, której głównym celem jest doprowadzeniedo uzyskania prawidłowego stosunku pomiędzydługością gałki ocznej, a mocą jej ośrodków optycznych [1,17]. Możliwe jest to poprzez zmodyfikowanie zewnętrznejosłonki gałki oraz tkanki wewnątrzgałkowej. Jeśli każdyz pozostałych elementów funkcjonalnych oka działa popraw-28

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073nie bezpośrednim efektem po zabiegu jest znaczna poprawawidzenia przez pacjenta [17]. Na początku rozwoju chirurgiirefrakcyjnej oka do zabiegów używano głównie laser CO 2.Jednak w związku z efektami niepożądanymi zrezygnowanoz nich i obecnie stosuje się pracujące impulsowo laseryekscymerowe emitujące wiązkę o długości fali 193 nm. Impulsyz jakimi wiązka jest emitowana trwają od 10 ns do20 ns. Promieniowanie tych laserów wnika do rogówki nagłębokość 1μm doprowadzając do fotoablacji tkanki. W celudodatkowego zwiększenia precyzji do laserów stosowanychw tego rodzaju zabiegach wbudowuje się system umożliwiającyśledzenie mimowolnych ruchów gałki ocznej, które nieulegają zniwelowaniu nawet po zastosowaniu znieczuleniamiejscowego [1].Bardzo szerokie zastosowanie lasery znalazły takżew stomatologii. Najczęściej używa się laserów małej i średniejmocy wykazujących działanie przeciwbólowe i przeciwzapalne.W stomatologii do cięcia, odparowywania i koagulacjitkanek stosuje się także lasery dużej mocy. Najczęściejużywane są lasery CO 2, Nd:YAG i Er:YAG [1, 18]. LaserCO 2stosuje się w chirurgii jamy ustnej. Używa się go do cięciatkanek miękkich, ale także do nadtapiania powierzchniowychwarstw szkliwa. Ze względu na znaczne ograniczeniekrwawienia podczas zabiegu, użycie lasera CO 2szczególniekorzystne jest w przypadku pacjentów z zaburzeniamikrzepnięcia, a także gdy rozległość wykonywanego zabiegujest duża. Stomatologiczny laser Nd:YAG emitujący wiązkęfali o długości 1064 nm posiada bardzo elastyczny i giętkiświatłowód, który pozwala na dotarcie światła laserowegodo każdego miejsca w jamie ustnej [1, 18]. W związkuz powyższym wykorzystywany jest do sterylizacji podczasleczenia kanałowego. Wynikiem tego jest ograniczenie dominimum ryzyka infekcji. Laser Nd:YAG bardzo częstoużywany jest również w leczeniu nadwrażliwości zębów,a także w celu przygotowania ubytku do wypełnienia [1,18]. Laser Er:YAG emituje falę o długości 2940 nm, którajest najsilniej absorbowana przez twardą tkankę zęba. Laserten emituje impulsy o częstotliwości od 1 Hz do 10 Hzi doprowadza do powstania w tkance mikrowybuchów, którepowodują jej zniszczenie [1, 2, 18].Główną korzyścią, jaka wynika z zastosowania laseróww stomatologii jest ograniczenie krwawienia podczaszabiegów, co jednocześnie minimalizuje ból i dyskomforttowarzyszący interwencjom stomatologicznym,a także umożliwia znaczne zwiększenie pola widzeniastomatologa. Charakterystyczne jest też to, że uszkodzeniatkanek wytworzone przez lasery podczas tegorodzaju zabiegów goją się bardzo szybko i nie ulegająbliznowaceniu [1].Biostymulacja w stomatologii wykorzystywana jestgłównie w leczeniu chorób błony śluzowej, szczękościsku,znieczuleniu. Zmniejszenie stanów zapalnych w takich chorobachjak ropnie, obrzęki, opryszczka wargowa czy zapaleniemiazgi uzyskuje się poprzez naświetlanie laserami małejmocy. W ten sam sposób uzyskuje się również przyspieszeniegojenia ran po ekstrakcji zęba [18].Należy zaznaczyć, iż laseroterapia może stosowana byćjako podstawowa forma leczenia lub jako leczenie uzupełniające.Można ją również łączyć z farmakoterapią. W tymostatnim przypadku biostymulujące działanie lasera spotęgowaćmoże korzystny efekt, jaki spowoduje zażycie leków[2].Ważnym zastosowaniem laserów, z którym obecniewiąże się duże nadzieje jest również terapia fotodynamicznaPDT (z ang. photodynamic therapy) [1, 19-31]. Jest tometoda wybiórczego niszczenia komórek nowotworowychw wyniku cytotoksycznego działania reaktywnych formtlenu, powstających w komórkach pod wpływem działaniapromieniowania laserowego na fotouczulacz (fotosensybilizator)[1, 20, 22].W PDT wykorzystywana jest zdolność związkówfotouczulających do selektywnej kumulacji w tkankachchorobowo zmienionych. W związku z tym, że fotosensybilizatoryzmieniają swoje właściwości pod wpływemnaświetlania tylko konkretną długością fali elektromagnetycznej,dla każdego fotouczulacza dobiera się odpowiednieźródło światła emitujące wiązkę, która będziew jak największym stopniu przez niego absorbowana[1, 20-23]. Do najczęściej stosowanych fotouczulaczynależą pochodne porfiryn takie jak Photofrin II, kwas5-aminolewulinowy (ALA), a także chloriny i ftalocyjaniny[1, 20]. Energia naświetlania powoduje jedyniewzbudzenie związku światłoczułego, nie niszcząc jednocześnietkanki, na którą działa [1, 20].Rodzaj mechanizmu reakcji fotodynamicznej jest zależnyod stężenia tlenu w tkance poddanej naświetlaniu [1].Wyróżnić można dwa mechanizmy, jednak dla każdegoz nich punktem wyjścia jest wzbudzony stan fotouczulacza.W obu przypadkach końcowym efektem jest powstaniewysokoreaktywnych form tlenowych [1, 20, 21]. Kiedypoziom tlenu w tkance jest niski dochodzi do przekazaniawodoru lub elektronu pomiędzy zaktywowaną cząsteczkąfotosensybilizatora a chorą tkanką. Prowadzi to do powstaniaw tkance reakcji fotochemicznej, której efektem jest powstanierodników nadtlenkowych. Rodniki te inicjują łańcuchowąreakcję wolnorodnikową doprowadzając tym samymdo utlenienia i następującego później zniszczenia tkanki.Szczególną rolę odgrywają tutaj reaktywne związki takiejak nadtlenek wodoru czy rodnik hydroksylowy [21]. Jeżelinatomiast stężenie tlenu w tkance jest wysokie dochodzi doprzekazania energii bezpośrednio ze wzbudzonego fotosensybilizatorado cząsteczki tlenu. W ten sposób dochodzi dopowstania wysokoreaktywnego tlenu singletowego [1, 21].W kolejnym etapie dochodzi do zapoczątkowania ciągu reakcji,które są charakterystyczne także dla opisanego wcześniejmechanizmu reakcji fotodynamicznej zachodzącejw przypadku niskiej zawartości tlenu w tkance [1, 20, 21].W terapii fotodynamicznej szczególnie ważne jest to, żewzbudzony fotosensybilizator po oddaniu nadmiaru energiiwraca do stanu podstawowego, dzięki czemu zdolny jest dorozpoczęcia całego procesu reakcji fotochemicznej od nowa[19]. Może on kolejny raz zaabsorbować energię, a oddającją doprowadzić do powstania nowych reaktywnych formtlenowych. W konsekwencji wystąpienia szeregu reakcjiw procesie PDT dochodzi do utlenienia biomolekuł, któretracą swe właściwości fizjologiczne. Bezpośrednim następstwemtych zjawisk są zaburzenia działania komórek poddanychnaświetlaniu, prowadzące do ich zniszczenia [1, 19].W związku z tym, że obecnie stosowane fotouczulaczemaksimum absorpcji fal elektromagnetycznych posiadają29

Farm Przegl Nauk, 2010, 6w przedziale 630-690 nm, terapia fotodynamiczna najbardziejskuteczna jest w przypadku guzów nowotworowycho wymiarach do kilku centymetrów [1, 24-27]. Ograniczenieto ma to związek z tym, że fale o takiej długości mogąwnikać w tkankę tylko na taką głębokość [1].Zastosowanie terapii fotodynamicznej jest bardzo szerokie[1, 19]. Wykorzystywana jest ona w leczeniu nowotworówszyi, głowy, przełyku, układu oddechowego, żołądkaczy pęcherza moczowego [1, 24-27]. Z bardzo dobrymiefektami terapię fotodynamiczną stosuje się w przypadkuzmian nowotworowych skóry (rak podstawnokomórkowy,płaskonabłonkowy i kolczystokomórkowy), a takżew następujących schorzeniach: brodawki zwykłe, brodawkipłaskie czy brodawki stóp [1, 12, 28]. Bardzo obiecująceefekty daje też zastosowanie PDT w leczeniu czerniaka, którycharakteryzuje się szybkim wzrostem i wykazuje bardzoniewielką podatność na inne leczenie. Za pomocą terapiifotodynamicznej doprowadza się do dezintegracji strukturwewnątrzkomórkowych. Badania in vivo wykazały, iż popodaniu fotouczulacza i naświetlaniu laserem dochodzi douszkodzenia DNA czerniaka i zniszczenia jego komórek nadrodze apoptozy [29].Bardzo dobre rezultaty daje też zastosowanie PDTw leczeniu łuszczycy, czy przewlekłego tocznia rumieniowego[30]. Jednak w przypadku chorób autoimmunologicznychbadania wykazały, że terapia fotodynamiczna niemoże być jedynym sposobem leczeniem, gdyż poprawiaona tylko stan pacjenta, nie powodując całkowitego wyleczenia[1, 30].Właściwości związków fotouczulających poza terapiąfotodynamiczną stosowaną głównie w leczeniu nowotworów,wykorzystuje się także w diagnostyce fotodynamicznejPDD (ang. photodynamic diagnosis) [1, 31]. Metoda taumożliwia określenie rozmiaru oraz stopnia zaawansowaniazmian chorobowych. Podobnie jak w przypadku terapii fotodynamicznejw PDD wykorzystywane jest zjawisko kumulowaniasię fotosensybilizatora w tkance patologiczniezmienionej. Jednak podstawą tego rodzaju diagnostyki jestzdolność świecenia fotouczulacza wystawionego na działaniepromieniowania o odpowiedniej długości fali [25,31].Biorąc pod uwagę właściwości promieniowania laserowegooraz ich wpływ na organizm człowieka, lasery sąniewątpliwie bardzo ważnym i szeroko wykorzystywanymźródłem promieniowania elektromagnetycznego. Nieustannyrozwój techniki laserowej w ciągu ostatnich 50 lat spowodował,iż lasery znalazły zastosowanie w medycyniei farmacji. Obecnie prowadzi się badania nad nowymi możliwościamilaseroterapii oraz dobiera parametry pracy laseraw taki sposób, aby spektrum jego zastosowania było corazszersze.Piśmiennictwo1.2.3.Podbielska H, Sieroń A, Stręk W. Diagnostyka i terapiafotodynamiczna. Urban & Partner. Wrocław 2004.Ziętek B. Lasery. Wydawnictwo Naukowe UniwersytetuMikołaja Kopernika. Toruń 2008.Straburzyńska-Lupa A, Straburzyński G. Fizjoterapia.Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 2007.4. Peng Q i wsp. Lasers in medicine. Rep Prog Phys 2008;71: 1-28.5. Taradaj J, Sieroń A, Jarzębski M. Fizykoterapia w praktyce.Elamed. Katowice 2010.6. Stadler I i wsp. In vitro effects of low-level laser irradiationat 660 nm on peripheral blood lymphocytes. LasersSurg Med 2000; 27: 255–261.7. Pyszora A, Adamczyk A. Zastosowanie niskoenergetycznegopromieniowania laserowego w leczeniu bólu.Pol Med Paliat 2005; 4(3): 127-132.8. Gao X, Xing D. Molecular mechanisms of cell proliferationinduced by low power laser irradiation. J BiomedSci 2009; 16(1): 4-9.9. Moore P i wsp. Effect of wavelength on low-intensitylaser irradiation-stimulated cell proliferation in vitro.Lasers Surg Med 2005; 36(1): 8-12.10. Murakami S i wsp. Effect of laser irradiation on enzymeactivity. Jpn J Appl Phys 2005; 44: 8216-8218.11. Goldberg D. Legal issues in laser operation. Clin Dermatol2006; 24: 56-59.12. Lanigan SW. Lasery w dermatologii. Czelej. Lublin2005.13. Bernstein EF. Laser treatment of tattoos. Clin Dermatol2006; 24: 43-55.14. Kontoes P i wsp. Hair induction after laser-assisted hairremoval and its treatment. J Am Acad Dermatol 2006;54(1): 64-67.15. Kiedrowicz M i wsp. Zastosowanie laseroterapii w leczeniurhinophyma. Dermatol Klin 2009; 11(3): 150-152.16. Siewiera IP, Wysocki MS, Łątkowski IT. Zastosowanielaserów w chirurgii plastycznej – lasery naczyniowe.Wiad Lek 2007; 60(3–4): 178–184.17. Grabska-Liberek I. Red. Chirurgia refrakcyjna. ElsevierUrban & Partner. Wrocław 2007.18. Gaczek A. Laser Erbowy Er:YAG w zastosowaniachstomatologicznych. Wady i zalety oraz warunki stosowania.Nowa Stomatol 2000; 1-2: 26-29.19. MacCormack MA. Photodynamic therapy in dermatology:an update on applications and outcomes. SeminCutan Med Surg 2008; 27(1): 52-62.20. Kübler AC. Photodynamic therapy. Med Laser Appl2005; 20: 37-45.21. Nowis D i wsp. Direct tumor damage mechanisms ofphotodynamic therapy. Acta Biochim Pol 2005; 52(2):339-352.22. Mang TS. Dosimetric concepts for PDT. PhotodiagnosisPhotodyn Ther 2008; 5(3): 217-223.23. Sieroń A. Fotodynamiczna diagnostyka i terapia nowotworówjako struktur dysypatywnych. Alma Mater MiesUniw Jegiell 2009; 110-111: 90-91.24. Gerber-Leszczyszyn H, Ziółkowski P. Terapia fotodynamicznanowotworów głowy i szyi. Dent Med Probl2003; 40(2): 217–219.25. Peszyński-Drews C, Wojtczak M, Rykała J. Fotodynamicznadiagnostyka i terapia pierwotnych powierzchniowychnowotworów skóry - doświadczenia własne.Dermatol Estet 2008; 5 (58): 112-116.26. Rykała J i wsp. Pierwotne nowotwory skóry - wynikiterapii fotodynamicznej. Post Dermatol Alergol 2009;26(4): 194-196.30

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507327. Sieroń A i wsp. Application of photodynamic therapy inthe treatment of premalignant and malignant changes ofhead and neck. Wiad Lek 2008; 61(10-12): 283-287.28. Polak-Pacholczyk I i wsp. Metoda fotodynamiczna(ALA-PDT) w leczeniu brodawek zwykłych, płaskich istóp. Post Dermatol Alergol 2008; 25(4): 143–150.29. Wawrzuta A i wsp. Czy terapia fotodynamiczna możebyć zastosowana do leczenia czerniaka? Przegl Dermatol2009; 96: 240-243.30. Fernandez-Guarino M i wsp. Toczeń rumieniowatyprzewlekły: dobra reakcja na zastosowanie terapii fotodynamicznej.Dermatologica 2008; 7: 22-26.31. Peszyński-Drews C i wsp. Lasery i laseroterapia odA do Z: ”F”- fotodynamiczna metoda w rozpoznaniui leczeniu pierwotnych powierzchniowych nowotworówskóry. Dermatol Estet 2008; 2 (55): 132-134.data otrzymania pracy: 11.03.2010 r.data akceptacji do druku: 24.05.2010 r.Adres do korespondencji:dr n. med. Magdalena ZdybelŚląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachKatedra i Zakład Biofizyki,ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiectel.: +48 32 364 11 62,e-mail: mzdybel@sum.edu.pl31

Farm Przegl Nauk, 2010,6, 32-35Potential role of genetic and epigenetic factorsin major depressive disorderPotencjalna rola czynników genetycznychi mechanizmów epigenetycznych w dużej depresjiHanna Najgebauer 1 , Daniel Barański 1 , Andrzej Jarnuczak 2 , Paulina Borkowska 1 , Jan Kowalski 11Department of Medical Genetics, Medical University of Silesia2University of GlasgowAbstractMajor depressive disorder (MDD) is a heterogeneous disordercaused by a complex interaction of a large numberof genetic and non-genetic factors as well as epigeneticprocesses. Extensive studies have identified several polymorphismsin genes encoding for serotonin transporter(SERT), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), monoamineoxidase (MAO), tryptophan hydroxylase (TPH)and glucocorticoid receptor (GR) which could be associatedwith susceptibility to MDD. We review these polymorphismsand discuss the role of epigenetic mechanismsin the etiopathology of MDD.Key words: major depressive disorder, serotonin transporter,brain-derived neurotrophic factor, monoamineoxidase, tryptophan hydroxylase, glucocorticoid receptor,epigenetic mechanisms, polymorphismStreszczenieDepresja to wieloczynnikowa choroba wywołana przezzłożone oddziaływania między dużą liczbą czynnikówgenetycznych, niegenetycznych a także procesy epigenetyczne.Polimorfizmy w genach kodujących: transporterserotoniny (SERT), neurotrofowy czynnik pochodzeniamózgowego (BDNF), oksydaze monoaminową (MAO),hydroksylaze tryptofanu (TPH) oraz receptor glukokortykoidowy(GR) mogą być związane ze zwiększonym ryzykiemzachorowania na depresję. W artykule dokonanoprzeglądu piśmiennictwa dotyczącego powyższych polimorfizmóworaz omówiono rolę mechanizmów epigenetycznychw złożonej etiopatologii depresji.Słowa kluczowe: duża depresja, transporter serotoniny,neurotropowy czynnik pochodzenia nerwowego, oksydazamonoaminowa, hydroksylaza tryptofanu, receptorglukokortykoidowy, mechanizmy epigenetyczne, polimorfizmIntroductionMDD is classified as a mood disorder by the Diagnosticand Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV), witha lifetime risk of 10%–30% for women and 7%–15% formen [1]. MDD is a heterogeneous disorder with a highlyvariable course, that reflect alterations in cognitive, psychomotorand emotional processes. Affected individuals differremarkably regarding the profile of clinical features, severityand course of illness as well as their response to drugtreatment and reintegration efforts [2].MDD is characterized by enduring sadness, anhedonia,guilt, low self-esteem, disturbed sleep, disturbed appetite,low energy, poor concentration and suicidal thoughts. Thesesymptoms should last for at least two weeks and have tointerfere considerably with work and family relations.MDD is caused by a complex interaction of a large numberof genetic and non-genetic factors, each with a relativelysmall contribution to the disorder. Currently no single geneticor environmental factor can account for more than 5%of the variance between depressed and normal subjects. Theheritability is estimated at 37% [3]. Some forms of depressionmay have a higher heritability than others. First degreerelatives of MDD patients have a 2- to 3-fold increased riskof MDD compared to the general population [2].Serotonin transporter (SERT)The most common subject of genetic and pharmacologicstudies is the serotonin transporter (SERT), which is involvedin etiology and pathophysiology of depression. Theserotonin transporter participates in the reuptake of serotonin(5-Hydroxytryptamine (5-HT)) at brain synapses, while serotoninappears to be crucial factor in the development ofemotional circuitry in the brain. Furthermore the serotonintransporter consists a target for the first line treatment fordepression what is demonstrated by the efficacy of selectivereuptake inhibitor drugs [4].The promoter activity of the human serotonin transportergene, located on 17q11.2, is modified by sequence elementswithin proximal 5’ regulatory region, designated the 5-HTTgene-linked polymorphic region (5-HTTLPR). This commonfunctional polymorphism has been shown to affecttranscription of the SERT gene and subsequent availabilityof the 5-HTT [5]. The 5-HTTLPR short allele s has reducedtranscriptional efficiency compared with the long allele l,32

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073and individuals carrying the s allele tend to have elevatedtrait anxiety. It has further been shown that this associationappears as a function of stressful life events and carriers of sallele may be especially vulnerable to depression when understress [6].It must be noticed that the 80% occupancy of the serotonintransporter with the Selective Serotonin Reuptake Inhibitors(SSRI) treatment is therapeutically useful. It has alsobeen reported that the serotonin transporter is allostericallymodulated by some SSRIs [7], thereby indicating a possiblerole for 5HTTLPR in treatment efficacy. Specifically, twocopies of ss, as well as heterozygous ls genotype, has demonstrateda poorer response to SSRI treatment, which hasbeen replicated by the study on the efficacy and tolerabilityof mirtazapine and paroxetine, which reported that the s alleleis associated with a poor outcome after treatment withSSRI [8]. On the contrary studies undertaken among Koreanand Japanese population reported that the s allele was associatedwith more favorable treatment outcomes [9].Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Neurotrophins are one of the epigenetic factors that mayinfluence the development and survival of neurons in thecentral nervous system. One of the most important membersof the neurotrophin family is brain-derived neurotrophicfactor (BDNF). BDNF exerts various important effects onthe nervous system. Preclinical and clinical study results indicatethat BDNF could be involved in depression as well asin the mechanism of action of antidepressants [10]. Other resultsalso demonstrate that several types of stressors regulatethe expression of this common factor in the brain [11]. TheBDNF gene has a complex genetic structure with seven upstreamexons and one coding exon that give rise to multiplesplice variants, each controlled by distinct promoters.Various polymorphisms are present in the human BDNFgene for example the Val66Met substitution. This polymorphismmay be connected to adult anxiety and mood disorders,possibly through effects on brain circuitry function. TheMet-BDNF allele carriers seem to have altered hipocampalmorphologic structure and are more susceptible to depressionthan non-carriers. That may be because the Met alleleresults in disrupted intracellular packaging and reduced depolarization-inducedsecretion of BDNF [12]. Human studiesinvestigating an association of the Met allele with neuropsychiatricdisorders have not produced consistent results. A recentstudy suggests that the Val66Met polymorphism affectsregulation of the HPA axis in depressed patients. In anotherstudy on the anxious and depressed adolescents there was noevidence of the association between BDNF variants and brainactivity [13]. In addition, results of animal studies have shownthe hippocampus involvement in brain development and plasticityand that reduced BDNF levels in the brain are associatedwith depressive states in animal models [14].Monoamine oxidase (MAO)Monoamine oxidase (MAO) is a mitochondrial outermembrane enzyme involved in degradation of biogenicamines, including neurotransmitters. Two forms of this catabolicenzyme, MAOA and MAOB, are found in the brain.Studies of the MAOA, mapped to the short arm of Xchromosome, in relation of MDD have mainly focused ona variable-number-tandem-repeat (VNTR) polymorphism inthe promoter region of MAOA. The polymorphic repetitivesequence, which is located 1.2 kbp upstream of the ATGcodon, consists of 30-bp repeated sequence present in 2, 3,3.5, 4 or 5 repeats (R). Sabol et al. [15] showed that alleleswith 3.5 (3.5R) or 4 (4R) copies of the repeat sequence aretranscripted more efficiently than those with 3 (3R) or 5(5R) copies of the repeat. Consequently the 4R carriers whohave higher central MAOA activity are likely to have lowercentral serotonin levels than those of 3R carriers.Although there are many results of studies indicating no associationbetween MAOA-uVNTR gene polymorphism and majordepression [16], there are also some positive correlations.The strong implications from this association appearwhen the treatment response is concerned. On the contraryto the research conducted on the MAOA-uVNTR genotypegroups in Japanese MDD patients, the study on larger Chinesepopulation indicates that various alleles of MAOAgene have influence on a treatment response [17]. Specifically,the higher expression allele (4R) seems to be morevulnerable to depression and have poorer antidepressantoutcomes.Tryptophan Hydroxylase (TPH)Tryptophan hydroxylase (TPH) is the rate limiting enzymeimplicated in the synthesis of serotonin. TPH existsin two isoforms: TPH1 and TPH2 (chromosomal locus ofthe human TPH2 gene, located to 12q15). TPH2 is predominantlyexpressed in the brain stem, while the classical TPHgene, TPH1, is expressed in the gut, pineal gland, spleen,and thymus.. The best-known TPH1 variants are two: 218A/C and779A/C of intron 7. The evidence of the association betweenTPH1 218A/C polymorphism and antidepressant responseis inconsistent. TPH1 218A/C polymorphism has been suggestedto modulate the antidepressant activity; the A-allelehas been associated with poorer response to SSRI-antidepressants[18]. In one study it was associated with the riskand severity of MDD and its treatment response. CC genotypewas associated with the increased risk and lower probabilityof responding to treatment. The results of that studyalso suggest that patients with treatment-resistant MDD maycarry a heavier genetic load than those who respond wellto regular SSRI treatment [19]. Pooley et al. [20] demonstratedthat deliberate self-harm is associated with some allelicvariations in the tryptophan hydroxylase gene, namelyloci on TPH1 promoter – 7180T/G, 7065C/T, 6526A/G and5806G/T were diagnosed, and 6526A/G had a close relationshipwith suicidal behaviour. Turecki et al. [21] detected,that haplotype 6526G, 5806T, 218C TPH 1 was more commonamong people attempting suicide. In investigationsconducted by Liu et al. [22] on Europeans no relationshipwas observed among haplotype 218A/C and suicidal tendencies.In other studies, no significant association betweenTPH1 218A/C nor TPH1 779A/C polymorphism and antidepressanttreatment response has been found [23].33

Farm Przegl Nauk, 2010, 6Psychiatric 5-HT research now mainly focuses on TPH2.Numerous studies have identified associations of SNPs inthe human TPH2 gene with psychiatric diseases [24]. Forexample: three non-synonymous SNPs severely impairTPH2 enzymatic activity by causing the amino acid substitutionsP206S (757C/T; exon 6), W303R (907C/T; exon 7),and R441H (1322G/A) also known as 1463G/A; exon 11[25]. Moreover, since we are now in knowledge of the alternativesplicing and editing that governs TPH2 activity thisgene is an excellent subject for future investigations.Glucocorticoid Receptor (GR)A hyperfunction of the hypothalamic–pituitary–adrenal(HPA) axis is one of the best-documented neurophysiologicalchanges in major depression. The glucocorticoid receptor(GR), a regulator of the (HPA) axis, is thought to be a keyelement of MDD neurobiology. The GR hypothesis focuseson the GR resistance that may be caused by genetic alternationin the GR [26].The GR gene is located on chromosome 5q31–32 withthe coding region being formed by exon 2–9. The “classic”GR-protein consists of 777 amino acids with a molecularmass of 94 kD. Promoter region lies at the 5’ end of exon 2,and is found to be highly complex. Numerous genetic polymorphismsand mutations, within the GR gene have beendescribed. For our purposes the SNPs associated with clinicalphenotype are relevant.Arg23Lys polymorphism (also called the “ER22/23EKpolymorphism”) consists of two completely linked SNPsin codons 22 and 23 in exon 2. Only the change in codon23 (AGG to AAG) results in Arg to Lys change. The minorA allele has an estimated frequency of around 4%. Evidencethat ER22/23EK-carriers had an increased risk of developinga major depressive episode was found. In additionER22/23EK carriers, showed a significantly faster clinicalresponse to antidepressant therapy as well as a trend towardbetter cognitive functioning during depression [26].Asn363Ser (exon 2) leads to an Asn to Ser change atcodon 363. Studies have demonstrated that the Asn363SerSNP regulates a novel set of genes with several of the regulatedgenes supporting a potential role for this GR polymorphismin human diseases [27].The term BclI denominates a SNP located 647 bp insidethe intron 2 and is a C to G nucleotide change [26]. It is locatedoutside the coding region but it is possible that it is linkedto functionally relevant variations in the promoter region or3’ untranslated region of the GR gene [28]. Wust et al. [28]reported that the BclI genotype GG was associated with a diminishedcortisol response. BclI heterozygotes and homozygotes(GG) exhibited a trend toward lower ACTH responses,compared with wild-type subjects. This was the first reportdocumenting an impact of GR gene polymorphisms on cortisol(and perhaps ACTH) responses to psychosocial stress.Epigenetic mechanisms in depressionEpigenetic mechanisms, which regulate gene activitywithout altering the DNA code are often involved in neurogenesis,neuronal plasticity, learning and memory, andcognitive dysfunction thus may help explain some of thecomplexity of mental illnesses.Epigenetic processes, which are essential for normal cellulardevelopment and differentiation and allow the longtermregulation of gene function through nonmutagenicmechanisms, can be influenced by exposure to a range ofexternal environmental factors, either globally or at specificloci. One such environmental factor that can confer a predispositionto depression is a maternal behaviour. It has beenshowed that increased maternal care in rodents causes anepigenetic change in the promoter region of the glucocorticoid- receptor gene. Offspring of high- nurturing mothersare less anxious, have attenuated corticosterone responsesto stress and display increased expression of glucocorticoidreceptor (GR) mRNA and protein in the hippocampus whencompared to offspring of low-nurturing mothers [29]. The upregulationof GR mRNA specifically involves the alternativelyspliced variant GR17. The promoter that drives expression ofthis variant is brain specific, and contains a binding consensussequence for nerve growth factor inducible factor A (NGFI-A),the expression of which is upregulated in the offspring of highnurturingmothers. A study found that offspring of low-nurturingmothers have increased methylation at the NGFI-A consensussequence region of the GR17 promoter [30].Chronic social defeat stress is another environmentalfactor that alters gene expression, particularly of BDNF, inan animal model of depression via histone tail modificationsand DNA methylation. Chronic defeat stress in mice inducessustained downregulation of the expression of two splicevariants of BDNF, BDNFIII and BDNFIV, in the hippocampus.These changes are reversed only after chronic treatmentwith the antidepressant imipramine [31].Alternating remission and relapse are commonly observedin MDD. These variations in disease course are consistentwith the dynamic shifting that occurs in the epigeneticregulation of gene expression. It is believed that epigeneticmodifications represent a dynamic molecular mechanismthat allows an organism to respond and adapt to its currentenvironment via changes in gene activity.ConclusionIt would be tempting to clasify MDD in terms of distinctgenes and their SNPs, or even as a multifactorial andpolygenic disorder. However the clinical data do not fall intosuch neat categories. It should be taken into considerationthat SNPs do not act in isolation but are part of haplotypes.Practically, this means that specific properties ascribed toa certain SNP allele are in reality the result of this allelecombined with specific alleles of other SNPs on the samehaplotype. MDD is likely to have a number of other causes,including environmental and epigenetic factors.In this review we concentrated on looking at evidence ofpurely genetic factors and their relative impact. And indeedthe role of a number of genes have been confirmed. Possiblythe most frustrating feature of many studies is that they havenot produced consistent results, with many findings contradictingeach other. At best this field is patchy and furtherstudies with larger samples or better methodology will berequired to fully confirm positive or lack of associations.34

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073References1. Blendy JA. The role of CREB in depression and antidepressanttreatment. Biol Psychiatry 2006; 59:1144–1150.2. Lesch KP. Gene–environment interaction and the geneticsof depression. J Psychiatry Neurosci 2004; 29:174-184.3. Sullivan PF i wsp. Genetic epidemiology of major depression:review and meta-analysis. Am J Psychiatry2000; 157: 1552–1562.4. Nemeroff CB, Owens MJ. Treatment of mood disorders.Nat Neurosci 2002; 5: 1068–1070.5. Lesch KP i wsp. Association of anxiety-related traitswith a polymorphism in the serotonin transporter generegulatory region. Science 1996; 274: 1527-1531.6. Caspi A i wsp. Influence of life stress on depression:moderation by a polymorphism in the 5-HTT gene.Science 2003; 301: 386-389.7. Kennedy SH, Andersen HF, Lam RW. Efficacy of escitalopramin the treatment of major depressive disordercompared with convential selective serotonin reuptakeinhibitors and venlafaxine XR: A meta-analysis. J PsychiatryNeurosci 2006; 31: 122-131.8. Murphy GM i wsp. A effects of the serotonin transportergene promoter polymorphism on mirtazapineand paroxetine efficacy and adverse events in geriatricmajor depression. Arch Gen Psychiatry 2004; 61:1163–1169.9. Yoshida K i wsp. Influence of the serotonin transportergene linked polymorphic region on the antidepressantresponse to fluvoxamine in Japanese depressed patients.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2002; 26:383–386.10. Shirayama Y i wsp. Brain-derived neurotrophic factorproduces antidepressant effects in behavioral models ofdepression. J Neurosci 2002; 22: 3251-3261.11. Vaidya VA, Terwilliger RMZ, Duman RS. Role of5HT2A receptors in the stress induced downregulationof brain-derived neurotrophic factor expression in therat hippocampus. Neurosci Lett 1999; 262: 1-4.12. Gorman JM, Mathew S, Goplan J. Neurobiology of earlylife stress: nonhuman primate models. Semin ClinNeuropsychiatry 2002; 7: 96-103.13. Lau JY i wsp. BDNF gene polymorphism (Val66Met)predicts amygdala and anterior hippocampus responsesto emotional faces in anxious and depressed adolescents.Neuroimage 2009.14. Nibuya M, Morinobu S, Duman RS. Regulation ofBDNF and trkB mRNA in rat brain by chronic electroconvulsiveseizure and antidepressant drug treatments.J Neurosci 1995; 15: 7539-7547.data otrzymania pracy: 18.03.2010 r.data akceptacji do druku: 17.05.2010 r.15. Sabol SZ, Hu S, Hamer D. A functional polymorphismin the monoamine oxidase A gene promoter. Hum Genet1998; 103: 273–279.16. Syagailo YV i wsp. Association analysis of the functionalmonoamine oxidase A gene promoter polymorphism in psychiatricdisorders. Am J Med Genet 2001; 105: 168-171.17. Yu YWY. Association study of a monoamine oxidase Agene promoter polymorphism with major depressive disorderand antidepressant response. Neuropsychopharmacology2005; 30: 1719–1723.18. Serretti A i wsp. Tryptophan hydroxylase gene associatedwith paroxetine antidepressant activity. Eur Neuropsychopharmacol2001; 11: 375–380.19. Viikki M i wsp. TPH1 218A/C polymorphism is associatedwith major depressive disorder and its treatmentresponse. Neurosci Lett 2010; 468: 80–84.20. Pooley EC i wsp. Deliberate self- harm is associated withallelic variation in the tryptophan hydroxylase gene (TPHA779C), but not with polymorphisms in five other serotonergicgenes. Psychol Med 2003; 33: 775-783.21. Turecki G i wsp. TPH and suicidal behavior: a study insuicide completers. Mol Psychiatry 2001; 6: 98-102.22. Liu X i wsp. Association of TPH1 with suicidal behaviorand psychiatric disorders in the Chinese population.J Med Genet 2006; 43: 95-200.23. Peters EJ i wsp. Investigation of serotonin-related genesin antidepressant response. Mol Psychiatry 2004; 9:879–889.24. Harvey M i wsp. Support for the involvement of TPH2gene in affective disorders. Mol Psychiatry 2004; 9:980–981.25. Cichon S i wsp. Brain specific tryptophan hydroxylase 2(TPH2): a functional Pro206Ser substitution and variationin the 59-region are associated with bipolar affectivedisorder. Hum Mol Genet 2008; 17: 87–97.26. Claes S. Glucocorticoid receptor polymorphisms in majordepression. Ann N Y Acad Sci 2009; 1179: 216-28.27. Jewell CM, Cidlowski JA. Molecular evidence for alink between the N363S glucocorticoid receptor polymorphismand altered gene expression. J Clin EndocrinolMetab 2007; 92: 3268–3277.28. Wust S i wsp. Common polymorphisms in the glucocorticoidreceptor gene are associated with adrenocorticalresponses to psychosocial stress. J Clin Endocrinol Metab2004; 89: 565–573.29. Meaney MJ, Szyf M. Maternal care as a model for experience-dependentchromatin plasticity? Trends Neurosci2005; 28: 456–463.30. Weaver IC i wsp. Epigenetic programming by maternalbehavior. Nat Neurosci 2004; 7: 847- 54.31. Truss M i wsp. Transcriptional control by steroid hormones.J Steroid Biochem Mol Biol 1992; 41: 241-248.Corresponding author:Paulina BorkowskaKatedra i Zakład Genetyki MedycznejŚląski Uniwersytet Medyczny w Katowicachul. Ostrogórska 30, 41-200 Sosnowiectel.: +48 32 364 14 01e-mail: paubor85@gmail.com35

Farm Przegl Nauk, 2010,6, 36-41The effect of glucose deficiency on collagen synthesisand degradation in breast cancer MCF7 cellsWpływ niedoboru glukozy na syntezę i degradację kolagenuw komórkach raka sutka linii MCF7Marzanna Cechowska-Pasko, Rafał KrętowskiDepartment of Pharmaceutical BiochemistryMedical University of Białystok, Białystok, PolandAbstractGlucose is the main energetic substrate for tumour cells.We decided to study the effect of glucose deprivation oncollagen synthesis and degradation in breast cancer MCF7cells. The incorporation of radiolabeled proline into collagenase-sensitiveand hydroxyproline-containing proteinswas used as an index of collagen synthesis, whereas pulse-chasetechnique was employed to evaluate the degradationof newly synthesised proteins. We demonstrated thatMCF7 cells incubated in a high glucose medium synthesiseddetectable amount of collagenous proteins. Most ofthem occurred in the cell layer. A shortage of glucose resultedin about 30% reduction in synthesis of collagenousproteins remaining in the cell layer. The pulse-chase experimentsdemonstrated that the reduced amount of newlysynthesised collagen was protected against intracellulardegradation. Proportionally less collagen was degradedin cultures incubated in low glucose than in high glucosemedia.Keywords: collagen degradation; collagen synthesis; glucosedeprivation; MCF7 cellsStreszczenieGlukoza jest głównym substratem energetycznym wykorzystywanymprzez komórki nowotworowe. Zdecydowanoocenić wpływ niedoboru glukozy na syntezę i degradacjękolagenu w komórkach raka sutka linii MCF7.Syntezę kolagenu zbadano na podstawie oceny wbudowywaniaradioaktywnej proliny do białek wrażliwych nakolagenazę oraz białek zawierających hydroksyprolinę,podczas gdy degradację nowopowstałego białka ocenionoprzy pomocy techniki „pulse-chase”. Wykazano, że komórkiMCF7 inkubowane w medium o wysokim stężeniuglukozy syntetyzują kolagen. Niedobór glukozy spowodowałobniżenie syntezy białek kolagenowych o około30%. Badania „pulse-chase” wykazały, że obniżona ilośćnowo zsyntetyzowanego kolagenu była chroniona przedwewnątrzkomórkową degradacją. Proporcjonalnie mniejkolagenu zostało zdegradowane w hodowlach komórekpozbawionych glukozy w porównaniu do inkubowanychw medium o wysokim stężeniu glukozy.Słowa kluczowe: degradacja kolagenu, synteza kolagenu,niedobór glukozy, MCF7IntroductionThe extracellular matrix (ECM), including basement membranes(BM), is a complex network of interacting molecules suchas collagens of several types, glycoproteins, proteoglycans andelastin. This matrix, in addition to acting as a scaffold that stabilizesthe physical structure of tissues, regulates vital cell processes[1, 2]. In normal mammary gland tissue BM is a continuous layerthat separates epithelial cells from the surrounding stroma. Collagensare the main components of BM. They are the first proteinsthat must be degraded in order to start the neopastic cell invasion.It has beeen described that type IV collagen plays an importantrole in cell adhesion and migration, erk tyrosine phosphorylationand activation of matrix metalloproteinases [3-5].It was described in our previous paper that glucose deprivationresulted in a marked decrease in collagen contentin fibroblast cultures [6]. As we recently reported, this phenomenonis a result of decreased synthesis and enhanceddegradation of newly synthesised collagen [7].It is commonly known that the oncogenesis process altersmany functions of a transformed cell. For instance SVvirus-transformedcells lose their ability to produce collagen[8]. In contrast to fibroblasts and other mesenchyme–derivedcells, the epithelial cells are poor producers of collagen(except collagen IV). It is of interest that oncogenesisconverts the human mammary epithelial cells into collagenproducing cells; MCF7 [9, 10].Glucose is the main energy substrate for tumour cells;therefore we decided to study the effect of glucose deprivationon collagen synthesis in breast cancer MCF 7 cells.Materials and methodsReagentsThe DMEM was provided by Invitrogen (San Diego,USA). Passive lysis buffer (Promega, Madison, USA), highlypurified bacterial collagenase (type VII) were purchasedfrom Sigma (St Louis, USA), as were most other chemicals36

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073and buffers used. [2,3,4,5– 3 H] L-proline was obtained fromHartmann Analytic (Braunschweig, Germany).Cell culturesBreast cancer MCF7 cells were maintained in Dulbecco’smodified Eagle’s medium (DMEM), containing glucoseat 4.5 mg/ml (high glucose DMEM) supplemented with10% heat-inactivated foetal calf serum (FCS), 2 mM L-glutamine, penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml) in a 5 % CO 2incubator, at 37 O C. Cells were cultured inCostar flasks and subconfluent cultures were detached with0.05% trypsin, 0.02% EDTA in calcium-free phosphatebufferedsaline, counted in hemocytometers. 5 x 10 5 cellswere seeded in six-well plates in 2 ml of growth medium andincubated for 3 days in the high glucose DMEM. In theseconditions the cultured cells reached 70-80% confluency.After this time the medium was removed and replaced with2 ml of the fresh DMEM (without calf serum):1. the high glucose DMEM contained 4.5 mg of glucoseper ml (25mM),2. the low glucose DMEM contained 0.5 mg of glucoseper ml (2.8 mM).Each was supplemented with [2,3,4,5– 3 H] L-proline,ascorbate (50 µg/ml), 2 mM L-glutamine, penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml). The incubation was continuedfor 12, 24, 48 hours. The MCF7 cells did not divideduring the incubation in serum-free medium. No increasein cell density was observed in this period. After incubationthe culture media were removed, the cell layers werewashed with PBS and submitted to the action of lysis buffer.It allowed the separation of the cells and extracellular matrixfrom the bottom of culture vessels and their suspension inthe buffer.Determination of radioactive hydroxyprolineCell lysate or incubation medium was submitted to hydrolysisin 6 M HCl, at 100 O C, for 16 h. The hydrolysateswere evaporated to dryness in a rotary glass evaporator. Thedried residues were dissolved in 1 ml of 2M HCl and submittedto chromatography on a column (1 x 9 cm), containingDowex 50W, equilibrated and eluted with 2M HCl. Such aprocedure made it possible to separate [ 3 H]-hydroxyprolinefrom [ 3 H]-proline [14]. The amounts of radioactive hydroxyprolinewere counted in a scintillation counter.Pulse-chase experimentThe confluent cell cultures were incubated for 48 h withradioactive proline as described in the Experimental Procedure.The medium was removed, the cell layer was washedwith PBS and incubated in high and low glucose media(without serum), containing non-labelled 10 mM proline(“0” time) for 4 h. After this time the cells were lysed, celllysates were submitted to filtration assay (to measure totalprotein) or to the determination of collagenase-sensitive proteinsand hydroxyproline-containing proteins. The decreasein the amounts of total, collagen- sensitive and hydroxyproline-containingproteins was calculated.Filtration AssayEach hydrophilic Durapore membrane (0.65-µm poresize) was soaked with 250µl of 25% TCA. The cell lysatesand culture media were treated with 50% TCA (final TCAconcentrations 25%) and next incubated at 4 o C for 1h. Theformed precipitate was collected on the filter membranesand separated from the supernatant using a vacuum sourceattached to the 1225 Sampling Manifold (Millipore). Toremove all unincorporated [ 3 H]-proline, the filters werewashed 3 times with 5 ml of 10% TCA by vacuum-filtrationthrough the membrane. After removing the underdrain anddrying, the membranes were then punched out into scintillationvials and the filter-bound radioactivity was quantifiedby liquid scintillation counting [11, 12].The assay of collagenase-sensitive proteinThe collagenase-sensitive protein was measured usingthe method described by Petrkofsky and Diegelman [13].The cell lysates and culture media were treated with highpurity bacterial collagenases (type VII-Sigma). N-ethylmaleimidewas applied as an inhibitor of unspecific proteolyticactivity associated with collagenase. The amount of newlysynthesised collagen was expressed in dpm of [ 3 H]-proline,incorporated into protein susceptible to the action of bacterialcollagenases [13].Fig. 1. The effect of glucose deprivation on the incorporationof [ 3 H]-L-proline into proteins: (A) secreted to culture medium,(B) remaining in the cell layer and (C) total proteins inMCF7 cells incubated in high glucose (H) and low glucose(L) DMEM for 12 h, 24 h and 48 h. Mean values from 3 experiments± SD are presented. * p

Farm Przegl Nauk, 2010, 6into proteins synthesised in MCF7 cells. The time dependentrelation of this inhibitory effect of glucose shortage wasobserved. In the case of cultures incubated for 12 h onlya slight decrease of proline incorporation was apparent,whereas after 24-48 h such an effect was more evident. Thecells incubated in low glucose medium synthesised almost50% less radioactive proteins than those grown in high glucosemedium (Fig. 1A, B, C).Fig. 2 shows that the cells incubated in high glucose mediumsynthesised detectable amounts of collagenase-sensitiveproteins. Most of them remained bound to the cell layer(Fig. 2A). Only a small part of them was secreted into theculture medium (Fig. 2B). The quantities of these proteinsgrew about 3 times if incubation was prolonged from 12 to48 h (Fig. 2A, B, C).Fig. 2. The effect of glucose deprivation on the incorporationof [ 3 H]-L-proline into collagenase-sensitive proteins:(A) secreted to culture medium, (B) remaining in the celllayer and (C) total collagenase-sensitive proteins in MCF7cells incubated in high glucose (H) and low glucose (L)DMEM for 12 h, 24 h and 48 h. Mean values from 3 experiments± SD are presented. * p

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Fig. 4. Pulse-chase labelling of total (A), collagenase-sensitive proteins (B) and hydroxyproline-containing proteins with[ 3 H]-L-proline. MCF7 cells were incubated in high glucose (H) and low glucose (L) DMEM for 48 h and the label waschased for additional 4 h. Mean values ± SD are presented. * p< 0.05.The shortage of glucose resulted in about 30% reductionin synthesis of collagenase-sensitive proteins, both those secretedinto culture medium and remaining in the cell layer(Fig. 2A, B, C).Fig. 3 shows that MCF7 cells incubated in high glucosemedium synthesised detectable amounts of hydroxyprolinecontainingproteins secreted into the culture medium (Fig. 3A)and remaining bound to the cell layer (Fig. 3B). The quantitiesof hydroxyproline-containing proteins grew above twiceif incubation was prolonged from 12 to 48 h (Fig. 3A, B, C).As in the previous case the shortage of glucose resultedin about 25-30% reduction in synthesis of hydroxyprolinecontainingproteins, both those secreted into culture mediumand remaining in the cell layer (Fig. 3A, B, C).In order to measure protein degradation in chase period,the amounts of radioactive proteins incorporated in pulsephase were taken as 100%. The disappearance of radioactivetrace from these proteins was treated an index of newlysynthesised protein degradation.In contrast to our expectation the amount of total radioactiveprotein did not decrease in chase phase, even furtherincrease in radioactive proline incorporation has been observed.It seems that the intracellular pool of radioactiveproline (accumulated in pulse period) allowed continuingprotein synthesis in 4h chase phase (Fig. 4A).In contrast to total protein a degradation of collagen hasbeen observed. The amount of degraded collagen dependedon the presence of glucose in culture media. In cultures incubatedin high glucose medium the proportional amounts ofnewly synthesised collagenase-sensitive protein decreasedin chase period to about 89% of the value incorporated inpulse period, whereas the rest (about 11%) was degraded. Alower degradation of collagen was observed in cultures incubatedin low glucose medium. About 96% of pulse periodnewly synthesised collagenase-sensitive protein was foundafter the 4h chase period. Only 4% of this protein was degradedin this time (Fig. 4B).The degradation of newly synthesised hydroxyprolinecontainingprotein also depended on the presence of glucosein culture media. In those incubated in high glucose medium,the proportional amounts of radioactive hydroxyprolinedecreased in chase period over 50% of initial value, whereas39

Farm Przegl Nauk, 2010, 6the rest (above 50%) was degraded. A lower degradation ofhydroxyproline-containing protein was observed in culturesincubated in low glucose medium. About 90% of this protein,synthesised in pulse phase, was found after the 4h chaseperiod. Only 10% of newly synthesised hydroxyproline-containingprotein was degraded in the chase phase (Fig. 4C).DiscussionIt is well known that collagen is the major human proteinwhich contains hydroxyproline and (in contrast to otherproteins) it is specifically digested by bacterial collagenase.For this reason the incorporation of radiolabeled prolineinto collagenase-sensitive and hydroxyproline-containingprotein is used as an index of collagen synthesis, whereaspulse-chase technique allows evaluating the degradation ofnewly synthesised protein [15].It was decided to study the effect of glucose deprivationon total protein/ collagen synthesis and degradationin MCF7 cell cultures. We demonstrated that MCF7 cellsincubated in high glucose DMEM synthesised detectableamounts of collagenous proteins. They constituted a few percent of total radioactive proteins. Most of them remainedbound to the cell layer, whereas the rest were secreted intothe culture medium.The shortage of glucose resulted in about 50% decreasein the synthesis of total and collagenase-sensitive protein,and about 30% reduction of hydroxyproline-containing proteinsynthesis.We did not observe a degradation of newly synthesisedtotal radioactive proteins in chase period. Even further incorporationof [ 3 H]-proline was apparent. We think that highamount of radioactive proline accumulated by the cells duringpulse period allowed them to prolong protein synthesisin chase phase.In contrast to that the degradation of collagenase-sensitiveand hydroxyproline-containing proteins in chase perioddepended on the presence of glucose in culture medium. Despitethe fact that the cells incubated in low glucose mediumsynthesised less collagen in pulse period, they protectednewly synthesised collagen against degradation in chasephase. Proportionally less collagen was degraded in culturesincubated in low glucose than in high glucose media.According to us, the mechanism of decreased collagensynthesis in our experimental conditions is connected withenergetic disturbances. No doubt the shortage of glucose- the main energy substrate in culture medium - decreasesATP-formation and reduces all energy-requiring anabolicprocesses within the cells. It is more difficult to explain whyglucose deprivation results in protection of the newly synthesisedcollagen against intracellular degradation.The endoplasmic reticulum (ER) is an organelle wheresecretory or membrane proteins are synthesised. Approximatelyone-third of all cellular proteins are translocated intothe lumen of the ER, where post-translational modification,folding and oligomerisation of nascent proteins occur beforethey are translocated to their final destination. Properfolding allows translocation of protein molecules to specificsubcellular compartments, extracellular matrix or to biologicalfluids [16-18].The folding process is regulated by a group of proteins, referredto as chaperones [19]. ER molecular chaperones and foldingenzymes associate with the newly synthesised, unfolded and/or incompletely glycosylated proteins to prevent their aggregationand help them to fold and assemble correctly [16, 18].It is known that collagen folding depends on the hydroxylationof prolyl residues to achieve sufficient amounts ofhydroxyprolyl residues to form a stable triple helical structure.Properly folded collagen is secreted extracellularly andserves as a substrate in the process of fibrogenesis. Underhydroxylatedcollagen is unable to form a stable triple helicalstructure and cannot be secreted from the synthesising cell.It is degraded by the intracellular proteolytic system [20].Many stress conditions, such as glucose deprivation, reducesthe folding process which results in the accumulationof unfolded/misfolded proteins within the cell [21, 22]. Theaccumulation of unfolded proteins activates the so called“unfolded protein response”, which enhances cell survivalby limiting the accumulation of unfolded or misfolded proteinsin the ER [21, 22]. Molecular chaperones are inducedin these conditions, bind to unfolded/misfolded proteins,and help them to be folded or refolded correctly [23].Several authors have reported that glucose deprivationresults in stimulation of protein degradation [24, 25] and thatoxygen or glucose deprivation increases free radicals, whichin turn, oxidise proteins that are recognized and actively degradedby proteasomes [25]. It is apparent from our resultsthat collagen (at least in our experimental conditions) is protectedagainst proteolysis, induced by glucose-deprivation.We suggest that chaperons protect newly synthesised intracellularproteins against degradation. Despite glucose shortageinhibits collagen synthesis; the increased expression ofchaperons may reduce the degradation of newly synthesisedprotein and protect the cell culture against a massive loss ofcollagen.References1. McClay DR, Ettensohn CA. Cell adhesion in morphogenesis.Annu Rev Cell Biol 1987; 3: 319–345.2. McDonald JA. Extracellular matrix assembly. AnnuRev Cell Biol 1988; 4: 183– 207.3. Sanders MA, Basson MD. Collagen IV-dependent ERKactivation in human Caco-2 intestinal epithelial cellsrequires focal adhesion kinase. J Biol Chem 2000; 75:38040–38047.4. Tzinia AK et al. Effects of collagen IV on neuroblastomacell matrix-related functions. Exp Cell Res 2002;274 :169–177.5. Hodgson L, Henderson AJ, Dong C. Melanoma cell migrationto type IV collagen requires activation of NFkappaB.Oncogene 2003; 22: 98– 108.6. Cechowska-Pasko M, Pałka J, Bańkowski E. Glucosedepletedmedium reduces the collagen content of humanskin fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2007;05: 79-85.7. Cechowska-Pasko M, Surażyński A, Bańkowski E.The effect of glucose deprivation on collagen synthesisin fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2009; 327:211-218.40

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50738. Bańkowski E et al. Decrease of collagen biosynthesisability of rat kidney fibroblasts transformed with SV--40virus. Mol Cell Biochem 1978; 20: 77-83.9. Wołczyński S et al. Estrogenic and antiestrogenic effectsof raloxifene on collagen metabolism in breastcancer MCF-7 cells. Gynecol Endocrinol 2001; 15:225-233.10. Dąbrowska M et al. Potential role of beta 1 integrin andcollagen biosynthesis in estrogen-dependent reductionof apoptosis in tamoxifen-treated breast cancer cells.Gynecol Obstet Invest 2001; 51: 248-253.11. Koyano Y, Hämmerle H, Mollenhauer J. Analysis of 3 H-proline-labeled protein by rapid filtration in multiwellplates for the study of collagen metabolism. Biotechniques1997; 22: 706-716.12. Fenwick SA et al. 96-well plate-based method for totalcollagen analysis of cell cultures. Biotechniques 2001;30: 1010-1014.13. Peterkofsky B, Diegelmann R. Use of a mixture of proteinase-freecollagenases for the specific assay of radioactivecollagen in the presence of other proteins. Biochemistry1971; 10: 988-994.14. Schneir M, Ramamurthy N, Golub L. Skin collagenmetabolism in the streptozotocin-induced diabeticrat. Enhanced catabolism of collagen formed bothbefore and during the diabetic state. Diabetes 1982;31: 426-431.15. Bateman JF, Lamande’ SR, Ramshaw JAM. Collagen SuperfamilyIn: Wayne D Comper, editor. Extracellular matix.Molecular Components and Interactions, vol 2. HarwoodAcademic Publishers: Melbourne Australia, 1996, 22-67.16. Little E et al. The glucose-regulated proteins (GRP78and GRP94): functions, gene regulation, and applications.Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1994; 4: 1-18.17. Ellgaard L, Molinari M, Helenius A. Setting the standards:quality control in the secretory pathway. Science1999; 286 :1882-1888.18. Shen Y, Meunier L, Hendershot LM. Identification andcharacterization of a novel endoplasmic reticulum (ER)DnaJ homologue, which stimulates ATPase activity ofBiP in vitro and is induced by ER stress. J Biol Chem2002; 277: 15947-15956.19. Gething MJ, Sambrook JF. Protein folding in the cell.Nature. 1992; 355: 33–45.20. Harding HP et al. Transcriptional and translational controlin the mammalian unfolded protein response. AnnuRev Cell Dev Biol 2002; 18: 575-599.21. Miyagi T et al. Antitumor effect of reduction of 150-kDa oxygen-regulated protein expression in human prostatecancer cells. Mol Urol 2001; 5: 79-80.22. Kaufman RJ et al. The unfolded protein response in nutrientsensing and differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol2002; 3: 411-421.23. Heacock CS, Sutherland RM. Induction characteristicsof oxygen regulated proteins. Int. J. Radiat. Oncol BiolPhys 1986; 12: 1287-1290.24. Libby P, O’Brien KV. The role of protein breakdown ingrowth, quiescence, and starvation of vascular smoothmuscle cells. J Cell Physiol 1984; 118: 317-323.25. Weih M et al. Proteolysis of oxidized proteins after oxygenglucosedeprivation in rat cortical neurons is mediated by theproteasome. J Cereb Blood Flow Metab 2001; 21: 1090-1096.data otrzymania pracy: 08.04.2010 r.data akceptacji do druku: 20.05.2010 r.Address for correspondence:Marzanna Cechowska-Pasko, PhD,Department of Pharmaceutical Biochemistry,Medical University of Białystok,Mickiewicza 2A, 15-089 Białystok, Polandtel.: +48 85 748 56 91e-mail: mapasko@gmail.com41

Farm Przegl Nauk, 2010,6, 42-45Kwas mefenamowy i jego prolekiMefenamic acid and its prodrugsJoanna Borowiecka, Marta KozłowskaZakład Środków Zapachowych,Katedra Kosmetologii,Wydział FarmaceutycznyUniwersytet Medyczny w ŁodziStreszczenieKwas mefenamowy należy do grupy niesteroidowychleków przeciwzapalnych (NLPZ), jest pochodną kwasuantranilowego. Popularnie jest wykorzystywany w terapiichorób reumatycznych i artretycznych. W Polsce jest lekiemfarmakopealnym (Farmakopea Polska VIII), jednakjego stosowanie jest ograniczone, gdyż po podaniu doustnympowoduje szereg efektów niepożądanych, głównieze strony układu pokarmowego. Eksperymentalnie otrzymanowiele pochodnych kwasu mefenamowego o budowiejonowej, estrów i tioestrów, będących potencjalnymiprolekami. Rezultaty badań in vitro i in vivo określiły ichlepsze parametry fizykochemiczne, farmakokinetycznei zredukowane działanie uboczne w porównaniu z lekiemmacierzystym. Otrzymane dotychczas pochodne kwasumefenamowego nie znalazły zastosowania w lecznictwie.Dane literaturowe wskazują na celowość poszukiwanianowych połączeń leku, które mogą być wykorzystane dopodania na skórę, eliminując niepożądane efekty po doustnympodaniu kwasu mefenamowego.Słowa kluczowe: kwas mefenamowy, fenamaty, pochodnekwasu mefenamowegoAbstractMefenamic acid which belongs to a group of non-steroidalanti-inflammatory drugs (NSAID-s) is N-anthranilic acidderivative. It`s commonly used in the treatment of rheumaticand arthritic diseases. In Poland mefenamic acid isa pharmacopeic drug (Polish Pharmacopoeia VIII), but itsaplication is limited, since its oral administration results innumerous adverse effects, mainly gastrointestinal. A widerange of mefenamic acid derivatives of, ion, esters or thioesterstructure which are potential prodrugs, were obtainedexperimentally. The results of in vitro and in vivo studiesindicated their better physicochemical and pharmacokineticparameters and reduced side effects in comparisonwith the parental drug. So far mefenamic acid derivativeshaven’t found application in medicine. Literature datapoint toward synthesis of new mefenamic acid combinations,which can be administered on the skin, eliminatingthe adverse effects occurring after its oral administration.Keywords: mefenamic acid, fenamates, mefenamic acidderivativesKwas mefenamowyKwas mefenamowy, syn. Acidum Mefenamicum jestśrodkiem leczniczym należącym do N-arylowych pochodnychkwasu antranilowego, określanych, jako fenamaty,w grupie niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ).Nazwę mefenamic acid (MA) wprowadziło AmerykańskieStowarzyszenie Medyczne (American Medical Assiociation)do Farmakopei Amerykańskiej i Światowej OrganizacjiZdrowia (WHO) [1]. W grupie fenamatów, MA jest lekiemnajczęściej stosowanym w terapii doraźnej i krótkotrwałej,nieprzekraczającej tygodnia, przez dłuższy czas możebyć stosowany w wybranych sytuacjach klinicznych [2].Rezultaty badań in vivo wskazują na jego silniejsze działanieprzeciwzapalne od fenylbutazonu [1]. Obecność grupykarboksylowej zwiększa jego powinowactwo do tkanek objętychodczynem zapalnym i wzmaga działanie przeciwzapalne[3]. Kwas mefenamowy nieselektywnie hamuje obydwieformy izoenzymów cyklooksygenazy (lek pierwszejgeneracji): konstytutywną COX-1 i indukowaną COX-2,odpowiedzialnych za prawidłowe przemiany kwasu arachidonowego[4]. Po podaniu dochodzi do zablokowaniadostępu arachidonianu do centrum aktywnego obydwu cyklooksygenaz(COX-1 i COX-2). Powoduje to jednoczesnezahamowanie syntezy prostaglandyn (PG) w trakcie trwaniaprocesu zapalnego, jak również w warunkach fizjologicznych,prowadząc do szeregu działań niepożądanych [5].W ostatnim czasie stwierdzono, że MA słabo hamuje cyklooksygenazęCOX-2, utleniającą kwas arachidonowy,ale silnie przeciwdziała utlenianiu 2-arachidonyloglicerolu(2-AG) [6]. W 2009 roku wykazano eksperymentalnie w badaniachelektrofizjologicznych, że MA jest użyteczny, jakolek blokujący kanał chlorkowy, oraz że wpływa na funkcjewielu białek, będących składnikiem ośrodkowego układunerwowego ssaków [7].Kwas mefenamowy, czyli kwas: N-(2,3-dimetylofenylo)aminobenzoesowy, N-(2,3-ksylilo)-antranilowy otrzymywanyjest w procesie kondensacji kwasu antranilowego42

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073z 3-bromo-o-ksylenem lub (na skalę przemysłową) kwasu2-halogenobenzoesowego z 2,3-ksylidyną [1]. Występujew dwóch odmianach polimorficznych, w postaci białegolub żółtawozielonego drobnokrystalicznego proszku (t.t.230-231 °C). Kwas średniej mocy (pKa = 4.2), praktycznienierozpuszczalny w wodzie (0,0041g/100cm 3 w temperaturze25°C, a 0,008g/100cm 3 w temperaturze 37°C),trudno rozpuszcza się w etanolu, eterze dietylowymi chloroformie [8, 9]. Lek (MA) stosowany jest w preparatachprostych i złożonych w formie: czopków, tabletek, tabletekpowlekanych i zawiesin. Dobrze wchłania się z układu pokarmowego.Podawany jest doustnie w dawce jednorazowej:0,25 – 0,5g (dawka max. 0,5g) oraz drogą doodbytniczą,w dawce jednorazowej 0,5g (dawka max. 0,5g). Maksymalnestężenie we krwi, podany doustnie w formie tabletek, MAosiąga po 2 godzinach (w 96% wiąże się z białkami osocza),a działanie przeciwbólowe po godzinie, utrzymującesię od 3 do 6 godzin. Metabolizowany jest w wątrobie, gdzieulega przemianie do pochodnych 3-hydroksymetylowychi 3-karboksylowych, wydalanych z moczem (50%) i kałem(20%) w ciągu 48 godzin (T 0,5- 1,7 h). Wykorzystywanyjest w terapii bólu o różnej etiologii: w chorobach reumatoidalnych- bóle kręgosłupa, reumatoidalne zapalenie stawów(RZS), zwyrodnienie stawów, zapaleniu korzeni nerwowych(rwa kulszowa), bólu pourazowym, mięśniowym,po ekstrakcji zębów, w bolesnej miesiączce, po zabiegachchirurgicznych i porodzie [4]. Łagodzi on występowanieneurotoksycznych objawów choroby Alzheimera, dodatkowozmniejszając wydzielanie tlenku azotu [10, 11].Działania niepożądane po podaniu kwasu mefenamowegoSłaba rozpuszczalność MA przyczynia się do szeregudziałań niepożądanych, występujących w trakcie jego stosowania,takich jak: wysypka, nudności oraz wymioty prowadzącedo zmniejszenia dostępności biologicznej. Celemosiągnięcia oczekiwanego stężenia terapeutycznego we krwikonieczne jest podanie większej dawki leku, co nasila jegodziałanie niepożądane [12]. Ogranicza to jego stosowanie,pomimo dużej skuteczności w leczeniu stanów zapalnychi choroby zwyrodnieniowej stawów oraz ostrych atakówdny moczanowej [5]. Powoduje on zaburzenia głównie zestrony układu pokarmowego, takie jak: bóle brzucha i zaburzeniażołądkowo – jelitowe. Dochodzić może do uszkodzeniabłony śluzowej żołądka, perforacji, nadżerek z tendencjądo krwawień, zmian zapalnych błony śluzowej górnego odcinkaprzewodu pokarmowego. Uszkodzenia górnego odcinkaukładu pokarmowego są wypadkową bezpośredniegoi miejscowego działania drażniącego spowodowanegoprzez wolną grupę karboksylową oraz miejscowej inhibicjiochronnego działania prostaglandyn, powodowanej hamowaniemCOX-1, na śluzówkę żołądka. Po podaniu MA obserwowanowystąpienie zapalenia i uszkodzenia wątroby[4]. Jedną z metod zmniejszenia działania niepożądanegojest wbudowanie do struktury leku grupy funkcyjnej lubzwiązku chemicznego, który w wyniku biotransformacjiw organizmie uwalnia substancję macierzystą [13].Długotrwałe przyjmowanie MA powoduje obniżenie stężeniaprotrombiny, upośledzenie krzepnięcia krwi i odwracalnąniedokrwistość hemolityczną [5]. Przewlekłe stosowanieprowadzi do nieprawidłowej czynności nerek, objawiającejsię bolesnym oddawaniem moczu, krwiomoczemi hiponatremią. Efektem ubocznym po doustnym podaniuMA są reakcje alergiczne, takie jak: wysypka, obrzęk twarzy,krtani i obrzęk naczynioruchowy, wykwity skórne,gorączka, rumień wielopostaciowy, martwica toksyczno –rozpływna. Wśród pacjentów leczonych MA obserwowanoobjawy niepożądane, np. nadmierne pocenie, senność lubbezsenność, nerwowość, bóle i zawroty głowy, ból ucha,zaburzenia widzenia (związane z przemijającą niezdolnościąrozróżniania kolorów), duszność, kołatanie serca,spadek ciśnienia tętniczego i hiperglikemię [2, 4]. Objawyniepożądane po podaniu doustnym mogą być zmniejszoneprzez zwiększenie jego rozpuszczalności, co doprowadzido poprawy biodostępności i umożliwi stosowanie mniejszychdawek [12].Interakcje kwasu mefenamowegoKwas mefenamowy wykazuje szereg ważnych podwzględem terapeutycznym interakcji z często stosowanymilekami. Przykładowo, wzmaga działanie doustnychleków przeciwcukrzycowych i przeciwzakrzepowych,a stosowany łącznie z kortykosteroidami zwiększa ryzykowystąpienia działań niepożądanych ze strony układupokarmowego. Nasila także toksyczne działanie niektórychleków przeciwnowotworowych, np.: metotreksatui winkrystyny. Podany łącznie z lekami hipotensyjnymii diuretykami osłabia ich działanie. Powoduje zwiększeniezapotrzebowania na insulinę u pacjentów z cukrzycąinsulinozależną [4]. Lek daje interakcje z preparatami litu,stosowanymi m.in. w chorobie maniakalno – depresyjnej,zmniejszając klirens nerkowy tego pierwiastka. Wywołujeintoksykacje organizmu i objawy niepożądane, typowe dlazatrucia litem [14].Przeciwwskazania do stosowania kwasu mefenamowegoPrzeciwwskazaniem do stosowania MA jest:• Choroba alergiczna, szczególnie astma oskrzelowa,ostry nieżyt i polipy nosa oraz obrzęk naczynioruchowyi reakcje uczuleniowe po podaniu innych NLPZ• Choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy, niewydolnośćnerek, uszkodzenia i niewydolność wątrobyoraz ostre i przewlekłe zapalenie jelit• Stosowanie MA należy rozważyć u pacjentów:w podeszłym wieku, osłabionych, z chorobą wrzodową(w wywiadzie) oraz z niewyrównaną niewydolnościąserca i przyjmujących diuretyki• Kobietom w okresie ciąży i karmiących piersią nienależy podawać MA (lek przenika do mleka matki)• Podawanie MA nie jest wskazane do 14 roku życiaoraz pacjentom z chorobą Stilla [4].Pochodne kwasu mefenamowegoCelem zmniejszenia licznych niepożądanych działańMA otrzymano wiele pochodnych na drodze modyfikacjichemicznej jego cząsteczki. Uwagę skupiono na synteziepochodnych bioodwracalnych, które ulegają biokonwersjido leku macierzystego bez zmiany profilu farmakokinetycznego,o zmniejszonych skutkach niepożądanych i korzystniejszychwłaściwościach fizykochemicznych, takich jak43

Farm Przegl Nauk, 2010, 6rozpuszczalność i przenikanie przez błonę komórkową– potencjalnych proleków. Jedną z dróg zmniejszenianiepożądanego działania MA jest zablokowanie w jegocząsteczce grupy karboksylowej wiązaniem amidowym,estrowym, lub przeprowadzenie w formę zjonizowaną.Potencjalne proleki MA o budowie jonowej, takie jak:sól sodowa, potasowa, cholinowa oraz połączenia kompleksowez alkoholoaminami (propanolo-, dietanoloitrietanoloaminą), amidowe, estrowe i tioestrowe pochodne,charakteryzują się lepszymi parametrami fizykochemicznymii farmakokinetycznymi niż lek macierzysty [15-18].Estrowe pochodne kwasu mefenamowegoEstrowe pochodne MA otrzymywane są standardowąmetodą syntezy dla tych połączeń, wykorzystującą doblokowania grupy karboksylowej następujące związki:alkohole, halogenopochodne i alkoksyhalogenopochodne[19]. Związki łatwo są hydrolizowane w organizmiedo wolnego kwasu przez esterazy. Zablokowanie polarnejgrupy karboksylowej w budowie cząsteczki MA resztamiarylowymi dostarczyło proleków o budowie diestrówacyloksyetylowych, wchłaniających się lepiej przez błonylipidowe. Związki są trwałe w środowisku enzymatycznymi nieenzymatycznym, a ich hydroliza do leku macierzystegojest ilościowa [17]. Otrzymane w ostatnim czasie glicerydoweestry MA mają wyższą aktywność przeciwzapalną, a ichaktywność przeciwbólowa jest porównywalna do leku macierzystego(badania in vivo na szczurach). Charakteryzująsię zwiększoną biodostępnością, przy jednoczesnym zredukowaniudziałania ulcerogennego w porównaniu z lekiemmacierzystym [19]. Tantishaiyakul i wsp. wbudowaliw cząsteczkę MA funkcję gwajakolu, wiązaniem estrowym(wiązanie labilne). Gwajakol, podobnie jak leki grupy NLPZ,hamuje syntezę prostaglandyn, lecz w przeciwieństwie donich, nie wykazuje działania ulcerogennego. Uzyskany prolekMA z gwajakolem jest stabilny w środowisku sztucznegosoku żołądkowego i środowisku zasadowym, trwaływ roztworach wodnych (pH 1.0 - 10), oraz łatwo ulega hydroliziew preparatach enzymatycznych [20]. Cykliczne estryMA (z pierścieniem oksazolu) mają silniejsze działanie przeciwbólowei przeciwzapalne oraz podwyższone właściwościlipofilne w porównaniu do leku macierzystego. Rezultatybadań (in vitro) przenikania przez warstwę rogową naskórkaokreśliły, że ich przenikalność jest pięciokrotnie wyższaw porównaniu do MA [21]. Polepszenie właściwości fizykochemicznych,obniżenie toksyczności i wzrost działania przeciwbólowegoi przeciwzapalnego większości estrów MApowoduje, że jego estrowe pochodne mogą być potencjalnymiprolekami.Kompleksy kwasu mefenamowegoWyniki badań fizykochemicznych i farmakokinetycznychkompleksów MA z alkoholoaminami (dietanolo-,trietanolo- i propanoloaminą) dowiodły, że są one potencjalnymiprolekami MA do aplikacji na skórę [15, 22].W ostatnim czasie Derle i wsp. (2008) otrzymali proleki MAo budowie kompleksów z β-cyklodekstryną i stwierdzili ichlepszą rozpuszczalność oraz obniżone właściwości ulcerogenne[23]. W roku 2009 Kovala – Demertzi i wsp. prowadzilibadania biologiczne kompleksów MA z metalami,takimi jak: Mn (II), Co(II), Ni(II), Cu(II) i Zn(II). Wynikiwykazały, że kompleksy z Mn(II) mają wyższą aktywnośćantyoksydacyjną, kompleksy z Zn(II) silniejsze działanieprzeciwzapalne niż MA podany w takiej samej dawce,a kompleks z Cu(II) - aktywność przeciwnowotworowąporównywalną do cisplatyny (badania na liniach komórkowych),a badania porównawcze (na soi) określiły silniejszyod MA efekt hamowania lipooksygenazy (LOX),β-glukuronidazy i trypsyny przez jego kompleksy [24].Jonowe pochodne kwasu mefenamowegoJedną z alternatywnych dróg polepszenia właściwościfizykochemicznych, takich jak rozpuszczalność i stopieńrozpuszczalności, było otrzymanie pochodnych MA o budowiejonowej w formie soli: sodowej, potasowej i cholinowej[15]. Wymienione sole charakteryzują się lepsząrozpuszczalnością w wodzie (5g/100 cm 3 w temperaturze25°C) niż MA (0,0041g/100cm 3 w temperaturze 25°C) [25].Sól sodową MA w skojarzeniu ze streptomycyną (w postaci0,1% płukanek oraz 0,3% past i mazi), wykorzystanow leczeniu chorób przyzębia, głównie do regeneracji tkankiprzyzębnej, a zastosowana w formie 0,5% wlewów dotchawicznych,w terapii gruźlicy i przewlekłych nieswoistychchorobach płuc (badania na ludziach) [26, 27]. Od 2007roku prowadzone są badania nad możliwością zastosowaniasoli sodowej MA w formie tabletek. Preparat zawierający272,8 mg soli sodowej (równoważna ilość 250 mg MA)szybciej rozpuszcza się w sztucznym soku żołądkowym(90% po 15 minutach) i może być użyty jako potencjalnyprolek [25]. Sole potasowa i cholinowa MA, podobnie jaksól sodowa, charakteryzują się lepszymi właściwościami fizykochemicznymii lepszym profilem farmakokinetycznymw porównaniu do leku macierzystego. Wyniki badań invivo (na zwierzętach doświadczalnych) określiły, że jonowepochodne MA mogą być użyteczne jako środki przeciwreumatyczne,przeciwartretyczne i przeciwzapalne[16]. Otrzymane połączenia MA o budowie estrów, tioestrów,diestrów, kompleksów i soli nie są stosowane jakoproleki.Praca finansowana z tematu Uniwersytetu Medycznegow Łodzi nr: 502-13-337Piśmiennictwo1.2.3.4.5.Winder CV i wsp. Anti-inflammatory, antipyretic andantinociceptive properties of N-(2,3-xylyl)-anthranilicacid (mefenamic acid). J Pharmacol Exp Ther 1962;138: 405-413.Pharmindex Kompendium Leków. Wyd. Medimedia,Warszawa 2005.Gumułka W. Niesteroidowe leki przeciwzapalne –wybrane zagadnienia. Farmacja Polska 1996; 52:10-18.Podlewski J, Chwalibogowska – Podlewska A. LekiWspółczesnej terapii. wyd. Medicinal Tribune PolskaSp. z o.o., Warszawa 2009.Rang HP, Dale MM. Farmakologia kliniczna. Wyd. I,wyd. Czelej Sp. z o.o., Lublin 2001.44

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50736. Prusakiewicz JJ i wsp. Differential sensitivity and mechanismof inhibition of COX-2 oxygenation of arachidonicacid and 2-arachidonylglycerol by ibuprofen andmefenamic acid. Biochem 2009; 48: 7353-7355.7. Habjan S, Vandenberg RJ. Modulation of glutamate andglycine transporters by niflumic, flufenamic and mefenamicacids. Neurochem Res 2009; 34:1738-1747.8. Farmakopea Polska VIII, 2008.9. Kato F i wsp. Kinetic study of the transformation of mefenamicacid polymorphs in various solvents and underhigh humidity conditions. Int J Pharm 2006; 321: 18-26.10. Joo Y. Mefenamic acid shows neuroprotective effectsand improves cognitive impairment in in vitro and invivo Alzheimer`s disease models. Mol Pharmacol 2006;69: 76-84.11. Khansari PS, Halliwell RF. Evidence for neuroprotectionby the fenamate NSAID, mefenamic acid. NeurochemInt 2009; 55: 683 - 688.12. Pop MM i wsp. Crystal structure of the inclusion complexof β-cyclodextrin with mefenamic acid from highresolution-powder synchrotron powder – diffractiondata in combination with molecular mechanics calculations.Acta Crystallogr B 2002; 58:1036-1043.13. Whitehouse W, Rainsford KD. Estrification of acidicanti-inflammatory drugs suppresses their gastrotoxicitywithout adversely affecting their anti-inflammatory activityin rats. J Pharm Pharmacol 1980; 32: 795-796.14. Danion JM i wsp. Interaction between non–steroidalanti-inflammatory agents and lithium salts. Encephale1987; 13: 255-260.15. Fang L i wsp. Physicochemical and crystallographiccharacterization of mefenamic acid complexes withalkanoloamines. J Pharm Sci 2004; 93: 144 – 154.16. Kruszyński R i wsp. Structure and properties of the sodium,potassium and calcium salts of 2-(2,3-dimethylphenyl)aminobenzoic acid. J Mol Structure 2010; 970: 79-89.17. Venuti MC i wsp. Synthesis and biological evaluationof omega-(N,N,N-trialkylammonium)alkyl esters andtioesters of carboxylic acid non-steroidal anti-inflammatoryagents. Pharm Res 1989; 6: 867-873.data otrzymania pracy: 10.05.2010 r.data akceptacji do druku: 08.06.2010 r.18. Jilani JA i wsp. Synthesis and evaluation of some acyloxyethylmefenamates as possible prodrugs. Acta PharmHung 1997; 67: 99-104.19. Khan MSY, Akhter M. Gliceride derivatives as potentialprodrugs: synthesis, biological activity and kineticstudies of gliceride derivatives of mefenamic acid.Pharmazie 2005; 60: 110-114.20. Tantishaiyakul V i wsp. Characterization of mefenamicacid – guaiacol ester: stability and transportacross Caco-2 cell monolayyers. Pharm Res 2002;19:1013-1017.21. Schwenker G, Jianbing C. 1,2-dihydro-3,1-benzoxazin-4-oneand 4-H-1,2-dihydro-pyrido[2,3-d]-[1,3]-oxazin-4-one derivatives as potential prodrugs. PartIII: Permeability through excised human skin in vitro.Arch Pharm (Weinheim Ger) 1991; 324: 821-825.22. Fang L i wsp. The use of complexation with alkanolaminesto facilitate skin permeation of mefenamic acid. IntJ Pharm 2003; 27, 262: 13 – 22.23. Derle DV i wsp. In vitro and in vivo evaluation of mefenamicacid and its complexes with β-cyclodextrinand HP-β-cyclodextrin. Asian J Pharm 2008; 1:30–34.24. Kovala – Demertzi D i wsp. Anti-oxidant, in vitro, invivo anti-inflammatory activity and antiproliferativeactivity of mefenamic acid and its metal complexeswith manganese (II), cobalt (II), nickel (II), copper (II)and zinc (II). J Enzyme Inhib Med Chem 2009; 24:742-752.25. Bani–Jaber A i wsp. Sodium mefenamate as a solutionfor the formulation and dissolution problem of mefenamicacid. Chem Pharm Bull 2007; 55: 1136-1140.26. Fursa VT: Use of mefenamine sodium salt in the combinedtherapy of periodontal diseases. Med Sestra 1986;45: 51-52.27. Filippova ES, Petrova IE. Functional change in externalrespiration in the use of sodium salt of mefenamine onpulmonary tuberculosis patients. Vrach Delo 1987; 7:110-112.Adres do korespondencji:Joanna BorowieckaZakład Środków Zapachowych U.M. w Łodziul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódźtel.: +48 42 677 91 43e-mail: joanna.borowiecka@umed.lodz.pl45

Farm Przegl Nauk, 2010,6, 46-52Technika pirolizy i mikroskopii sił atomowychw badaniu struktury syntetycznej melaniny z tyrozynyi naturalnej melaniny z Sepia officinalisPyrolysis and atomic force microscopy in structural studiesof synthetic tyrosine-melanin and natural melaninfrom Sepia officinalisEwa Chodurek 1 , Sławomir Kurkiewicz 2 , Artur Turek 1 , Andrzej Marcinkowski 3 , Barbara Trzebicka 3 ,Anna Dzierżęga-Lęcznar 2 , Krystyna Stępień 2 , Zofia Dzierżewicz 11Katedra i Zakład Biofarmacji,2Katedra i Zakład Analizy Instrumentalnej,Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach3Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych, Polska Akademia Nauk, ZabrzeStreszczenieDokładna struktura chemiczna melanin wciąż nie jest dokońca poznana. Wynika to między innymi z silnych połączeńwęgiel-węgiel pomiędzy jednostkami monomerycznymibudującymi dany pigment. W niniejszej pracy w celuuzyskania dodatkowych informacji na temat budowy polimerówmelaninowych wykorzystano nowoczesne metodybadawcze takie jak: pirolizę połączoną z chromatografiągazową i spektrometrią mas (Py-GC/MS) oraz mikroskopięsił atomowych (AFM). Badaniom poddano syntetycznąmelaninę otrzymaną z tyrozyny (Tyr-melaninę) oraz naturalnąmelaninę z Sepia officinalis (sepiomelaninę), stanowiącemodel ludzkiego pigmentu eumelaninowego. Wynikipracy uwidaczniają różnice strukturalne pomiędzy Tyr-melaninąa sepiomelaniną i wskazują, że skład chemiczny zależyprzede wszystkim od rodzaju substratu oraz warunkóww jakich te pigmenty powstają.Słowa kluczowe: Tyr-melanina, sepiomelanina, piroliza,termochemoliza, mikroskopia sił atomowychAbstractChemical structure of melanin pigments is still not recognizedaccurately. This is largely due to strong carboncarbonbonds between melanin monomer units. In this study,the modern research methods, i.e. pyrolysis connectedwith gas chromatography and mass spectrometry (Py-GC/MS), and atomic force microscopy (AFM) were used toget some additional structural information on melanin polymers.Two models of human eumelanin pigment werestudied, namely: synthetic melanin obtained from tyrosine(Tyr-melanin) and natural melanin from Sepia officinalis(sepiomelanin). The results revealed structural differencesbetween Tyr-melanin and sepiomelanin, and indicatedthat chemical composition of melanin depends eventuallyupon its precursor type and specific conditions underwhich the pigment has been formed.Key words: Tyr-melanin, sepiomelanin, pyrolysis, thermochemolysis,atomic force microscopeWstępMelaniny są barwnikami występującymi zarównow świecie roślin, jak i zwierząt. Należą do grupy polimorficznychi wielofunkcyjnych polimerów [1-3]. Ilość i typmelaniny w skórze, tęczówce, włosach decyduje o ich zabarwieniu[4, 5]. Melaniny pochodzenia zwierzęcego możnapodzielić na dwie główne grupy: nierozpuszczalne brązowo-czarnepigmenty – eumelaniny i rozpuszczalne w wodorotlenkachżółto-pomarańczowe feomelaniny [6, 7].Bardzo ważnym momentem w historii badań nad melaninąbyło określenie przez Bertranda w 1886 roku, żeprekursorem melaniny jest tyrozyna [8]. Pomimo faktu,że melanina została opisana ponad 100 lat temu, to jednakjej skład chemiczny i strukturalny nadal nie jest w pełnipoznany [9, 10]. Trudności te wynikają między innymi zfaktu, że jest ona prawie nierozpuszczalna, bardzo trudnoizoluje się ją oraz oczyszcza z białkowych i lipidowychkomponentów melanosomu. Ustalono, że eumelaninaskłada się głównie z jednostek indolowych i pirolowych,natomiast feomelanina zawiera przede wszystkim jednostkibenzotiazynowe i benzotiazolowe [11-13]. Jednakże,w rzeczywistości naturalne melaniny to kopolimery zawierającew różnych proporcjach eumelaninę i feomelaninę [14,15].W badaniach właściwości fizykochemicznych melaninzaleca się stosowanie dostępnego komercyjnie i dobrzescharakteryzowanego preparatu melaninowego, co umożli-46

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073wia badaczom wzajemne porównywanie wyników. Melaninyotrzymane z woreczków atramentowych mątwy (Sepiaofficinalis) i guzów czerniaka złośliwego (melanoma malignum)są powszechnie używanymi modelami naturalnycheumelanin [16, 17]. Ze względu na specyficzne właściwościnaturalnego pigmentu w badaniach biochemicznychi fizjologicznych często wykorzystuje się syntetyczne melaniny,otrzymane z takich prekursorów, jak: tyrozyna, 3,4-dihydroksyfenyloalanina(DOPA), 5,6-dihydroksyindol (DHI)i kwas 5,6‐dihydroksyindolo-2-karboksylowy (DHICA) [4,18-19].Celem pracy było wykorzystanie techniki pirolizy i termochemolizyw różnicowaniu profili pirolitycznych syntetycznejmelaniny z tyrozyny i melaniny naturalnej z Sepiaofficinalis oraz obrazowanie i charakterystyka nanostrukturybadanych biopolimerów za pomocą mikroskopii sił atomowych.Materiał i metodyW badaniach wykorzystano komercyjnie dostępne wzorcepigmentu eumelaninowego:- syntetyczną melaninę otrzymaną z tyrozyny w obecnościH 2O 2(SIGMA)- naturalną melaninę z Sepia officinalis (SIGMA).Piroliza i termochemoliza w badaniu struktury modelowycheumelaninDo degradacji biopolimerów melaninowych wykorzystanopirolizer firmy Pye Unicam bezpośrednio zainstalowanydo układu GC-MS.Melaninę w ilości 50 µg nanoszono na drut ferromagnetycznyo średnicy 0,5 mm i długości 10 cm, o temperaturzeCurie 770 °C. Proces pirolizy prowadzono w atmosferzehelu, który pełnił także rolę gazu nośnego w rozdziale chromatograficznym.Temperatura komory pirolizera wynosiła220 °C, a czas trwania pirolizy 8 sekund.W technice termochemolizy dodatkowo na drut pirolitycznypo nałożeniu melaniny wprowadzano 5 µl 10% wodorotlenkutetrametyloamoniowego (TMAH) jako czynnikametylującego.W celu rozdzielenia produktów pirolizy i termochemolizymelanin zastosowano chromatograf gazowy modelHP 5890 seria II firmy Hewlett Packard. Produktytermicznej degradacji melanin rozdzielono na kolumniekapilarnej Rtx ® - 5MS (firmy Restek) o wymiarach:długość 60 m, średnica wewnętrzna 0,32 mm, grubośćfilmu 0,5 µm. Szybkość przepływu gazu nośnego wynosiła1,8 cm 3 /min. Analizę chromatograficzną prowadzonowykorzystując programowane ogrzewanie kolumny(początkowa temperatura 40 o C była utrzymywana przez5 min., następnie wzrastała z prędkością 10 o C/min do220 o C).Identyfikacji produktów pirolizy i termochemolizymelanin po ich rozdziale chromatograficznym dokonanoprzy użyciu spektrometru mas model HP 5989A firmyHewlett Packard. Temperatura źródła jonów wynosiła200 °C, a kwadrupola 100 °C. Jonizację prowadzonostrumieniem elektronów przy standartowej energii70 eV.Obrazowanie nanostruktury modelowych eumelanin zapomocą AFMObrazowanie nanostruktury biopolimerów melaninowychprowadzono za pomocą mikroskopii sił atomowych(ang. Atomic force microscopy – AFM) przy użyciu zestawuNanoScope III d MultiMode (di-Veeco, CA). Badaniate przeprowadzono w Centrum Materiałów Polimerowychi Węglowych Polskiej Akademii Nauk w Zabrzu.Próbki melanin nanoszono w formie suchego zmikronizowanegoproszku na szklane krążki. Skanowanie powierzchnipolimerów odbywało się w temperaturze pokojowejw powietrzu przy użyciu skanera piezoelektrycznego10 µm. W tym celu zastosowano ostrze wykonane z krzemu(Model TESP, Veeco, CA). Częstotliwość skanowania wynosiła1 Hz. Badania topografii naniesionych próbek wykonanotechniką przerywanego kontaktu (ang. tapping mode).Do analizy obrazów AFM wykorzystano oprogramowanieWsxM 4.0 (Nanotec Electronica, Spain) [20]. Każdorazowouzyskiwano dwa rodzaje obrazów „Height” i „Deflection”.Obraz „Height” pozwala na określenie topografii badanegobiopolimeru, natomiast obraz „Deflection” umożliwia bezpośredniąobserwację cech morfologicznych.WynikiNa ryc. 1A przedstawiono chromatogram produktówtermicznej degradacji wzorca melaniny otrzymanej z tyrozynyw obecności nadtlenku wodoru (Tyr-melaniny). Łatwozauważyć, że w obrazie chromatograficznym Tyr-melaninywśród produktów pirolizy dominuje związek o czasie retencji9,43 min, zidentyfikowany jako pirydyna. Dodatkowopod względem ilościowym wyróżniają się: kwas octowy(5,22 min), 3 (4)-pirydynokarbonitryle (15,41 i 16,12 min).W mniejszych ilościach wykryto: benzen (7,07 min), pirol(9,70 min), toluen (10,09 min), fenol (15,37 min), benzoni-Ryc. 1. Chromatogram rozdziału produktów (A) pirolizy,(B) termochemolizy Tyr-melaniny.47

Farm Przegl Nauk, 2010, 6Ryc. 2. Chromatogram rozdziału produktów (A) pirolizy,(B) termochemolizy melaniny z Sepia officinalis.tryl (15,71 min) oraz 3,4-pirydynodikarbonyloimid (24,03min). Zaobserwowano także nieznaczny udział produktuo czasie retencji 17,35 min, którego nie udało się zidentyfikować.Znacznie bogatszy profil pirolityczny (ryc. 1B) charakteryzujeTyr-melaninę poddaną termochemolizie w obecnościTMAH. Analizując pirogramy (ryc. 1A-B) można zauważyć,że do wspólnych produktów pirolizy i termochemolizyTyr-melaniny należą: kwas octowy, benzen, pirydyna, pirol,fenol i benzonitryl. Zaobserwowano, że podczas termochemolizyTyr-melaniny zwiększa się udział metylowych pochodnychpirolu: 1-metylopirol (9,30 min), 2-metylopirol(12,02 min) oraz pirydyny: 4-metylopirydyna (12,90min). Dodatkowo stwierdzono obecność 1-metylo-2,5-pirolidynodionu (17,75 min), estru metylowego kwasu pirydynokarboksylowego(18,32 min) oraz estrudimetylowego kwasu pirydynokarboksylowego(25,22 min), których nie wykryto podczas pirolizytej melaniny. W pirogramie Tyr-melaninypoddanej termochemolizie pojawiło się więcejproduktów niezidentyfikowanych (11,13; 16,55;30,02 min), pochodzących prawdopodobniez termicznej degradacji TMAH.Na ryc. 2A przedstawiono chromatogramproduktów termicznej degradacji naturalnegowzorca eumelaniny-sepiomelaniny. W obraziechromatograficznym sepiomelaniny wśród produktówpirolizy dominują związki o czasachretencji 9.40 i 9,71 min, zidentyfikowane jakopirydyna oraz pirol. Dodatkowo pod względemilościowym wyróżniają się: toluen (10,10 min),3 (2)-metylopirole (12,05 min, 12,31 min), fenol(15,37 min) oraz indol (21,56 min). W mniejszychilościach wykryto: kwas octowy (5,19min), benzen (7,06 min), styren (13,49 min),484-metylofenol (17,32 min), benzylonitryl (18,78 min) oraz3-metyloindol (23,06 min). Zaobserwowano także nieznacznyudział produktów o czasach retencji 8,96 i 11,13 min, którychnie udało się zidentyfikować. Zastosowanie termochemolizy(ryc. 2B), podobnie jak w przypadku Tyr-melaniny, pozwoliłona uzyskanie większej liczby produktów w formiemetylowych pochodnych. Dodatkowo w końcowym odcinkutego pirogramu (25‐35 min) pojawiły się związki, któreprawdopodobnie mogą pochodzić z rozpadu lipidów. Są toestry metylowe kwasów tłuszczowych: tetradekanowego(27,18 min), heksadekanowego (30,08 min), oktadekanowego(33,97 min) oraz n-alkeny: 1-heksadeken (25,80 min)i 1-oktadeken (30,48 min).Z przedstawionego na ryc. 3 zestawienia produktów pirolizyi termochemolizy Tyr‐melaniny i sepiomelaniny wynika,że zawartość procentowa produktów badanych melaninzależy od źródła pochodzenia barwnika oraz warunkówsyntezy. Wśród składników pirolizatu i termochemolizatuotrzymanego z Tyr-melaniny dominują pochodne pirydyny,natomiast w profilu pirolitycznym melaniny wyizolowanejz Sepia officinalis dominują pochodne pirolu. Dodatkowow profilu badanych melanin stwierdzono obecność pochodnychbenzenu i fenolu. Natomiast wśród produktów pirolizyi termochemolizy Tyr-melaniny nie wykryto indolu i jegopochodnych. Poza tym tylko w wyniku termochemolizy sepiomelaninyotrzymano produkty pochodzenia lipidowego,tj.: estry metylowe kwasów tłuszczowych. Przedstawionezestawienie relacji ilościowych między grupami głównychproduktów pirolizy i termochemolizy prowadzonej w obecnościTMAH badanych melanin dowodzi o znacznym zróżnicowaniuich profili pirolitycznych.Różnice pomiędzy syntetyczną Tyr-melaniną a naturalnąsepiomelaniną zaobserwowano również podczas analizyobrazów uzyskanych za pomocą mikroskopii sił atomowych(AFM).Obrazy AFM „Deflection” i „Height 2D” dostępnegohandlowo wzorca syntetycznej eumelaniny uzyskane przezskanowanie powierzchni o wielkości 3 μm x 3 μm ujawniajągranulkowatą strukturę tego biopolimeru. Obrazy pokazująRyc. 3. Analiza porównawcza produktów pirolizy i termochemolizy Tyrmelaninyi sepiomelaniny (nz - związki niezidentyfikowane).

Ryc. 4. Granulkowata nanostruktura melaniny syntetycznej otrzymanej z tyrozyny. Obrazyuzyskane za pomoca AFM: A - obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „Height3D”. Obszar skanowanej powierzchni próbki (3 μm x 3 μm).Ryc. 5. Granulki melaniny syntetycznej otrzymanej tyrozyny. Obrazy uzyskane za pomocąAFM: A – obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „Height 3D”. Obszarskanowanej powierzchni próbki (1 μm x 1 μm).Ryc. 6. Obrazy uzyskane za pomocą AFM melaniny otrzymanej z Sepia officinalis:A – obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „Height 3D”. Obszar skanowanejpowierzchni próbki (3 μm x 3 μm).Ryc. 7. Filamenty melaniny otrzymanej z Sepia officinalis. Obrazy uzyskane za pomocąAFM: A – obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „Height 3D”. Obszarskanowanej powierzchni próbki (1 μm x 1 μm).copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073granulki różnej wielkości, pojedyncze, dobrze wyodrębnione.Natomiast nie obserwowano agregacji granulek w bardziejzłożone elementy (ryc. 4A i 4B). Wykonanie skanowaniapowierzchni o wymiarze1 μm x 1 μm pozwoliło nauzyskanie większego powiększeniabadanego polimeru.Obrazy AFM „Deflection”i „Height 2D”(ryc. 5A i 5B)ujawniają małe zróżnicowaniemorfologiczne melaniny.Poszczególne granulki mimoróżnych rozmiarów posiadająpodobny kształt i wszystkie sąjednostronnie zwężone. Scharakteryzowaneobrazy „D2”(ryc. 4A, 4B, 5A i 5B) w pełnikorespondują z trójwymiarowymiobrazami (ryc. 4C i 5C).Trójwymiarowe obrazy badanejmelaniny ukazują ponadtoróżnice wielkości pomiędzygranulkami. W szczególnościzjawisko to jest widocznew przypadku obserwacjiprowadzonych przy obrazieo mniejszym powiększeniu(ryc. 4C) uzyskanym przezskanowanie powierzchnio wielkości (3 μm x 3 μm). Naszczególną uwagę zasługujefakt, że większość granulekjest podobnej wysokości, tylkopojedyncze grudki są większeod pozostałych. Uzyskanystożkowaty kształt na obrazach„Height 3D” (ryc. 4C i 5C) dlaposzczególnych granulek jestwynikiem skanowania powierzchnipolimeru.Zaobserwowano istotneróżnice w obrazie AFMmelaniny naturalnej uzyskanejz Sepia officinalis(ryc. 6 i 7) w porównaniuz obrazami uzyskanymi dlamelaniny syntetycznej (ryc.4 i 5). Struktura melaninyuzyskanej z Sepia officinalisujawnia dwie różne formymorfologiczne. Pierwsząstanowi bryła nieforemna.Jest to pojedynczy elemento wyraźnym zarysie i stosunkowogładkiej powierzchni(ryc. 6A-B). Jest on wyraźniewyodrębniony z badanejpowierzchni (6C). Skanowanieobszaru o wielkości1.0 µm x 1.0 µm pozwoliłona obserwację bardziej złożonej nanostruktury. Obserwujesię podłużne dobrze wyodrębnione filamenty tworzącebardziej złożone elementy. Uzyskane obrazy „Deflecton”49

Farm Przegl Nauk, 2010, 6i „Height 2D” (ryc. 7A i 7B) ukazują wyraźne trzy filametyo porównywalnej długości, ułożone równolegledo siebie i powiązane ze sobą. Trójwymiarowa strukturaprzedstawiona na obrazie „Height D3” (ryc. 7C) przedstawiatrzy filamenty położone w dwóch płaszczyznach.Są one wyraźnie wyodrębnione z powierzchni. Dwawiększe filamenty położone są bezpośrednio na badanejpowierzchni. Na największym filamencie położony jesttrzeci najmniejszy wykazujący kontury odrębności.DyskusjaDo niedawna wnioskowanie o strukturze melanin opierałosię głównie o metody chemicznej degradacji [21]. Niestetymetody te mają kilka ograniczeń, takich jak: słaba powtarzalność,niedostateczna wydajność produktów degradacjioraz możliwość powstawania artefaktów podczas reakcjidegradacyjnych [22].Metodą z powodzeniem wykorzystywaną do badaniastruktury zarówno syntetycznych jak i naturalnych melaninjest piroliza połączona z chromatografią gazowąi spektrometrią mas (Py-GC/MS) [23, 24] oraz termochemoliza[25, 26]. Technika pirolizy polega na wykorzystaniuwysokiej temperatury z zakresu 500-800 °C w celutermicznego rozkładu badanej próbki, a następnie rozdzialepowstałych produktów za pomocą chromatografiigazowej i ich identyfikacji na podstawie widm masowychtechniką spektrometrii mas. Produkty termicznej degradacjiodzwierciedlają w dużym stopniu strukturę analizowanegobiopolimeru, ponieważ jak wykazano, ryzyko pojawieniasię artefaktów w trakcie pirolizy jest względnieniskie [27]. Natomiast modyfikacją pirolizy jest technikatermochemolizy polegająca na dodaniu do badanej próbyodczynnika derywatyzującego, a następnie umieszczeniuanalizowanej próby w komorze pirolizera i analizie metodąGC/MS. Z danych literaturowych wynika, że powszechniestosowanymi odczynnikami derywatyzującymi są: wodorotlenektetrametyloamoniowy, wodorotlenek tetrabutyloamoniowy,wodorotlenek fenylotrimetyloamoniowy, wodorotlenek(m‐trifluorometylofenylo)-trimetyloamoniowy[27].W niniejszej pracy badano strukturę syntetycznych oraznaturalnych melanin metodą pirolizy i termochemolizy.Analizie poddano wzorzec syntetycznej eumelaniny otrzymanejz tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru oraz wzorzecnaturalnej melaniny z Sepia officinalis.Doniesienia literaturowe wskazują, że sposób polimeryzacji,a tym samym ostateczna struktura melanin, zależy odwarunków syntezy [24, 28].Badania techniką Py-GC/MS i Py-GC/MS w obecnościTMAH wykazały, że Tyr-melanina otrzymana w wynikuutlenienia tyrozyny nadtlenkiem wodoru różni się strukturalnieod DOPA‐melaniny otrzymanej w wyniku autooksydacyjnejpolimeryzacji 3,4-dihydroksyfenyloalaniny [24].W pirolizatach Tyr-melaniny dominującym produktem byłapirydyna i jej alkilowe pochodne. Fakt, że wśród produktówpirolizy i termochemolizy Tyr‐melaniny stwierdzononiższą sumaryczną zawartość piroli oraz że nie wykrytoindolu i jego pochodnych w porównaniu z DOPA-melaniną,może świadczyć o dużym udziale niezcyklizowanychjednostek tyrozynowych w strukturze analizowanego polimeru.Badania oparte na metodach chemicznej degradacjiwykazały, że melaniny naturalne są wysoce heterogennymipolimerami złożonymi z różnych jednostek monomerycznych,w tym głównie z jednostek DHI i DHICAoraz z jednostek pirolowych [29]. Hydroliza zasadowapoprzedzona utlenianiem sepiomelaniny nadtlenkiemwodoru, pozwoliła na uzyskanie kwasów pirolowych:głównie: kwasu pirolo-2,3,5-trikarboksylowego orazw mniejszych ilościach kwasu pirolo-2,3‐dikarboksylowegoi kwasu pirolo-2,3,4,5-tetrakarboksylowego [9,30]. Sugeruje się jednak, że kwas pirolotetrakarboksylowyjest sztucznie wytwarzany w środowisku zasadowym podczaschemicznej degradacji melaniny z Sepia officinalis.Natomiast alkaliczne stapianie sepiomelaniny pozwoliłona identyfikację wśród produktów degradacji DHI jak iDHICA, jednak w niewielkich ilościach i dlatego próbywykorzystania tej reakcji do ilościowego oznaczeniaeumelanin w tkankach pigmentowanych zakończyły sięniepowodzeniem [21].W prezentowanej pracy dokonano analizy sepiomelaninytechniką pirolizy i termochemolizy. Dominującym produktemtermolizy tego wzorca eumelaninowego był pirol,co jest zgodne z wynikami chemicznej analizy sepiomelaniny[9]. W melaninie tej wykazano obecność markerowychproduktów pochodzenia eumelaninowego (benzenu, pirolu,pirydyny, fenolu, indolu i ich alkilowych pochodnych). Ponadtow profilu pirolitycznym melaniny z Sepia officinalispoddanej termochemolizie, stwierdzono obecność estrówmetylowych kwasów tłuszczowych, które prawdopodobniepochodzą z degradacji lipidów. Liczne badania wskazują,że melaniny pochodzenia naturalnego są silnie związanez białkami i lipidami komórkowymi [23, 25]. Sugeruje to, iżzastosowana procedura izolacji melaniny z Sepia officinalisnie prowadzi do całkowitego oczyszczenia pigmentu z komponentylipidowej.Obecnie coraz częściej do badania struktury makromolekuł(białek, peptydów, kwasów nukleinowych, polimeróworaz biopolimerów) wykorzystuje się nowoczesną metodęmikroskopii sił atomowych (AFM) umożliwiającą zarównoanalizę topografii powierzchni, jak i badanie właściwościtych związków. Do zalet metody AFM należą: wysoka rozdzielczośćobrazu badanego materiału, zdolność do generowaniatrójwymiarowego obrazu oraz minimalizacja pracoiczasochłonności przygotowania biomateriału do analizy.Technika AFM umożliwia obrazowanie badanego materiałuzarówno w warunkach in situ jak i w środowisku wodnym[31].Clancy i Simon [32] metodą skaningowej mikroskopiielektronowej (SEM) wykazali, że dominującą strukturąsepiomelaniny są agregaty złożone z pojedynczychcząstek o średnicy 100- 200 nm. Natomiast metoda AFMuwidoczniła, że cząstki tworzące agregaty nie stanowiąpodstawowej jednostki strukturalnej melaniny z Sepiaofficinalis, ale są zbudowane z wielu mniejszych elementów[33]. Potwierdzają to również wyniki prezentowanejpracy, w której podczas analizy nanostruktury naturalnejsepiomealniny wykazano złożoność struktury analizowanegofilamentu.50

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Nosfinger i wsp., [34] wykazali brak podobieństwastrukturalnego pomiędzy eumelaniną z Sepia officinalis orazsyntetyczną eumelaniną.Wyniki niniejszej pracy również wskazują na różnicestrukturalne pomiędzy Tyr-melaniną a melaniną z Sepiaofficinalis. Wydaje się, że te różnice mogą wynikać z odmiennegosposobu powstawania analizowanych polimerów.Syntetyczną Tyr-melaninę otrzymano w wyniku chemicznegoutleniania tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru,a więc w warunkach, które mogą prowadzić do oksydacyjnejdegradacji powstającego pigmentu. Natomiast melanogenezazachodząca w woreczku atramentowym mątwy jestzłożonym procesem enzymatycznym, którego ostatecznyefekt zależy od różnych czynników zarówno zewnątrz- jak iwewnątrzkomórkowych [35].Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medycznyw Katowicach (grant nr KNW-2-128/09).Piśmiennictwo1. Riley P. Melanogenesis and melanoma. Pigment CellRes 2003; 16: 548-552.2. Liu Y, Simon JD. Metal–ion interactions and the structuralorganization of Sepia eumelanin. Pigment Cell Res2005; 18: 42-48.3. Tran L, Powell B, Meredith P. Chemical and structuraldisorder in eumelanins: a possible explanationfor broadband absorbance. Biophys J 2006;90: 743-752.4. Cano M i wsp. Magnetic properties of synthetic eumelanin-preliminaryresults. Photochem Photobiol 2008; 84:627-631.5. Ito S, Wakamatsu K. Quantitative analysis of eumelaninand pheomelanin in humans, mice, and other animals:a comparative review. Pigment Cell Res 2003;16: 523-531.6. Bennett DC. Ultraviolet wave bands and melanoma initiation.Pigment Cell Res 2008; 21: 520-524.7. Wakamatsu K i wsp. Characterization of melanin inhuman iridal and choroidal melanocytes from eyeswith various colored irides. Pigment Cell Res 2008;21: 97-105.8. Ito S. A chemist’s view of melanogenesis. Pigment CellRes 2003; 16: 230-236.9. Ward W i wsp. Quantification of naturally occurringpyrrole acids in melanosomes. Photochem Photobiol2008; 84: 700-705.10. Bush WD i wsp. Neuromelanins isolated from differentregions of the human brain exhibit a common surfacephotoionization threshold. Photochem Photobiol 2009;85: 387-390.11. Wilczek A, Kondoh H, Mishima Y. Composition ofmammalian eumelanins: analyses of DHICA-derivedunits in pigments from hair and melanoma cells. PigmentCell Res 1996; 9: 63-67.12. Lamoreux L, Wakamatsu K, Ito S. Interaction of majorcoat color gene functions in mice as studied by chemicalanalysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment CellRes 2001; 14: 23-31.13. Nighswander-Rempel S i wsp. Time-resolved and steadystatefluorescence spectroscopy of eumelanin and indolicpolymers. Photochem Photobiol 2007; 83: 1449-1454.14. Ito S, Wakamatsu K, Ozeki H. Chemical analysis of melaninsand its application to the study of the regulation ofmelanogenesis. Pigment Cell Res 2000; 13: 103-109.15. Ito S, Wakamatsu K. Chemistry of mixed melanogenesis-pivotalroles of dopaquinon. Photochem Photobiol2008; 84: 582-592.16. Liu Y i wsp. Ion-exchange and adsorption of Fe(III) bySepia melanin. Pigment Cell Res 2004; 17: 262–269.17. Seagle B i wsp. Photoprotection of human retinal pigmentepithelium cells against blue light-induced apoptosisby melanin free radicals from Sepia officinalis.Proc Natl Acad Sci 2006; 103: 16644-16648.18. Lawrie K, Meredith P, McGeary R. Synthesis and polymerizationstudies of organic-soluble eumelanins. PhotochemPhotobiol 2008; 84: 632-638.19. Nighswander-Rempel S i wsp. Solvochromic effectsin model eumelanin compounds. Photochem Photobiol2008; 84: 620-626.20. Horcas I i wsp. WSXM: a software for scanning probemicroscopy and a tool for nanotechnology. Rev Sci Instrum2007; 013705.21. Wakamatsu K, Ito I. Advanced chemical methods inmelanin determination. Pigment Cell Res 2002; 15:174-183.22. Ito S. Advances in chemical analysis of melanins. W:The pigmentary system: physiology and pathophysiology.Red. Nordlund JJ i wsp. Oxford University Press.New York 1998, 439-450.23. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. Structural investigations ofneuromelanin by pyrolysis-gas chromatography/massspectrometry. J Neural Transm 2006; 113: 729-734.24. Chodurek E i wsp. Różnicowanie profili pirolitycznychDOPA-melanin metodą GC/MS. Ann Acad Med Siles2007; 61: 106-112.25. Chodurek E i wsp. Termochemolysis as the useful metodto assess the purity of melanin isolated from the humanmelanoma malignum. Acta Pol Pharm 2008; 65:731-734.26. Stepień K i wsp. Melanin from epidermal human melanocytes:study by pyrolytic GC/MS. J Am Soc MassSpectrom 2009; 20: 464-468.27. Moldoveanu S. Pyrolysis GC/MS, present and future(recent past and present needs). J Microcolumn Separ2000; 13: 102-105.28. Bertazzo A i wsp. Application of matrix-assisted laserdesorption/ionization mass spectrometry to the detectionof melanins formed from Dopa and dopamine. JMass Spectrom 1999; 34: 922-929.29. Prota G. Melanins and melanogenesis. Academic Press.San Diego 1992.30. Ito S, Fujita K. Microanalysis of eumelanin and pheomelaninin hair and melanomas by chemical degradationand liquid chromatography. Anal Biochem 1985;144: 527-536.31. Ikai A i wsp. The world of nanobiomechanics: Mechanicalimaging and measurement by atomic force microscopy.Elsevier Science 2008; 48-87.51

Farm Przegl Nauk, 2010, 632. Clancy C, Simon J. Ultrastructural organization ofeumelanin from Sepia officinalis measurmed byatomic force microscopy. Biochemistry 2001; 40:13353-13360.33. Liu Y, Simon DJ. Isolation and biophysical studies ofnatural eumelanins: applications of imaging technologiesand ultrafast spectroscopy. Pigment Cell Res 2003;16: 606-618.34. Nofsinger J, Forest S, Eibest L, Gold K, Simon J. Probingthe building blocks of eumelanins using scanningelectron microscopy. Pigment Cell Res 2000;13: 179-184.35. Palumbo A. Melanogenesis in the Ink Gland of Sepiaofficinalis. Pigment Cell Res 2003; 16: 517-522.data otrzymania pracy: 24.05.2010 r.data akceptacji do druku: 02.06.2010 r.Adres do korespondencji:dr Ewa ChodurekKatedra i Zakład BiofarmacjiWydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląski Uniwersytet Medyczny41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1e-mail: echodurek@sum.edu.pl52

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OFMANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewedtransdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicineand related sciences. The journal publishes conferencereports and materials, conference announcements, as well asletters to the Editor.2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printedand an electronic form. Electronic versions of articles are to besent to kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl or supplied onCD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagramsand figures) should be addressed to:Scientific Review in Pharmacy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Disk label should contain the first name(s) and surname(s)of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphicsshould be included in separate files. Do not paste pictures andgraphics to text files. The Editor advises to use Star Office,Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.3. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief.The Authors are encouraged to suggest their reviewers,however the final selection of a reviewer is up to the EditorialBoard. The Editor-in-Chief reserves the right to correct orabbreviate the text (after the Author’s approval).Authors are requested to resubmit the revised manuscriptwithin four weeks. Papers that are not resubmitted withinfour weeks will be treated as a new submission.The manuscript that has been rejected by the ScientificReview in Pharmacy should not be resubmitted.4. A cover letter should be included with the manuscript, containinga declaration that the manuscript has not been previouslypublished in print or electronic format and is not under considerationby another journal or electronic medium, signed by allthe Authors. It should also include written approval from thehead of the institution in which the study was conducted.5. All human and animal research will have obtained ethical consentfrom the local Bioethical or Ethical Committee.6. The material sent in and the review will remain among thedocumentation of the Board of Editors.7. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the wholeof the copyrights for the published papers (including the rightto publishing in print, on electronic media, such as CD-ROMdisks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries isallowed without any written permission of the Editor.8. Instructions for authors:8.1. Manuscript Page Setup• Paper: white, A4 format.• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.• Text: Double-spaced, one side of the page only.• Numbering: Insert page numbers at bottom right of eachpage.• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extraline space between paragraphs.• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,with one line above. Indent first line after a subhead. Use anextra line space between the subhead and the text.• Title or Heading of the article: boldface, on separateline.• Second-level subhead: boldface, on separate line.• Third-level subhead: italic, on separate line.8.2. Organization of Manuscript• Title page should include: submission date and Author(s)full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’full current affiliations (for papers with multiply authors,please enumerate the authors and their affiliations in thefollowing way: Author 1 , Author 2 , etc; 1 Affiliation, 2 Affiliation,etc.). Affiliations should contain the full name of the institution.One corresponding author must be designated forpapers with coauthors. At the bottom of the page the fullname, academic degrees/titles, and address of the correspondingauthor should be given, including the telephonenumber, fax number and/or e-mail address. If researchhas been funded, please indicate the source of funding(including grant index/symbol, grant agencies, corporations,or sponsors).• The second page should include an abstract (150-250words). The abstract must be self-contained, and must notrequire reference to the paper to be understood. The abstractshould present objectives and scope of the study orreasons for writing the paper. The methods and techniquesor approaches should be described only to the extent necessaryfor comprehension. The findings and conclusionsshould be concise and informative. The abstract shouldbe followed by the key words consistent with the MedicalSubject Headings Index Medicus, and should not containunfamiliar terms that are not defined, undefined acronymsand reference citations. Neither displayed equations orlists should appear in the abstract.• Body text should be organized as follows:original paper - introduction, material and methods descriptions,research results, discussion;review papers – free structure;case studies – introduction (motivation for the study), casedescriptions, discussion of the characteristic symptoms,treatment results etc.• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-whitephotographs) should be put into a separate envelope. Oneach figure there should be its number (Arabic numerals),the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.Figure captions should be placed on separate pages andnumbered consecutively using Arabic numerals. Previouslypublished visual materials should be supplied togetherwith the written consent of the Publisher for reprint.• Tables, each on a separate page, should be numberedusing Roman numerals and preceded by their captions.Table captions should be placed on separate pages, numberedusing Roman numerals.• The papers should not exceed the following limitations:original and review work – 10 pages and others – 5 pages.8.3. References to the works cited should be presented at theend of the paper and arranged according to the sequenceof citations in the body text. The acronyms for journal titlesshould be used according to Index Medicus. Each entry,starting with a new line, should be given a number andmust be presented as follows:• journal citation:Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:557-67.If there are more than three authors, the name of the firstone should be given, followed by an ,,et al” annotation.Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activity andglycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:97-102.• the specific chapter:Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. BiochemiaHarpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.Warszawa 1994, 59-69.• monograph:Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw2004.References to the works cited within the text should be numberedusing Arabic numerals and placed between brackets,e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations:original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliographyentries.53

Farm Przegl Nauk, 2010, 6REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowaneprace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe,z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych.Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na tematkonferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłaćw formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:Farmaceutyczny Przegląd Naukowy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:CMYK, rozdzielczość 300 dpi.3. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonychkażdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca sięautorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcjazastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniuz autorem).Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu,zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającymczterech tygodni. W przeciwnym raziepraca będzie traktowana jako nowa publikacja.Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta niemoże być ponownie przedkładany Redakcji FarmaceutycznegoPrzeglądu Naukowego.4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie byłauprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcjiinnego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawieraćrównież podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodęKierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczeniepublikacji w czasopiśmie.5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, któresą przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, musząmieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacjiRedakcji.7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskichdo wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, nanośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszczasię natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.8. Instrukcje dla autorów8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, nabiałym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnegoodstępu między kolejnymi wierszami.• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy odstrony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnymrogu.• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowychodstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównanedo lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstemnależy wprowadzić jeden odstęp.• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubionączcionką.• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochylonączcionką,8.2 Układ manuskryptu• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora-(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowychprzy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliacjękażdego z nich, w następujący sposób Autor 1 , Autor 2 ,…; 1 Afiliacja, 2 Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim,nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję,dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanychprosimy o wskazanie źródła finansowania (w tymnumery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lubsponsorów).• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będąceautonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczaćodnośników literaturowych. Streszczenie powinnozawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawoweprocedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych,metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Podstreszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w językupolskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject HeadingsIndex Medicus.• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,według następującego schematu:prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,dyskusja oraz wnioski;prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziałyi podrozdziały;prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby,charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe)powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane,opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać naoddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframiarabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane,należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy naponowną publikację.• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należyponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułamiumieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać naoddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframirzymskimi.• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinnawynosić 10, a pozostałych – 5 stron.8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowaniaw tekście pracy.Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z IndexMedicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,powinna być opatrzona numerem oraz zredagowanazgodnie z niżej podanym przykładem:• czasopismo naukowe:np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibroticdisorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podaćnazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activityand the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;331: 97-102.• wydawnictwo zbiorowe:np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: BiochemiaHarpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 1994, 59-69.• monografia:np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław2004.Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych,powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracachoryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do10 pozycji.54