pl_elfo.pdf
pl_elfo.pdf
pl_elfo.pdf
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
uvod k praktickym<br />
cvicením<br />
petra lavríková
• praktická cvičení<br />
• odběr krvi<br />
• centrifugace<br />
• ELFO<br />
• krevní <strong>pl</strong>azma<br />
agenda
praktická cvičení<br />
• fáze laboratorního testování<br />
a) preanalytická: příprava a spracování<br />
vzorků před vlastnou laboratorní anal!zou<br />
(příprava pacienta, odběr, uchováváni,<br />
transport, spracování před anal!zou)<br />
b) analytická: testování vzorku<br />
c) postanalytická: odečítaní a interpretace<br />
" v!sledků
praktická cvičení<br />
• příprava pacienta<br />
• dieta (vět#ina odberů nalačno)<br />
• poloha při odběre<br />
• fyzická záte$<br />
• stres<br />
• vliv léků
odber krve<br />
• ! v$dy rukavice - ka$d! materiál mů$e b!t<br />
infekční<br />
• náber krve<br />
a) srá$ení (10min) -> sérum (<strong>pl</strong>azma bez faktorů srá$ení) +<br />
srazenina<br />
b) + potisrá$livé činidlo -> <strong>pl</strong>azma (obohacená o ióny z<br />
činidla) + usadzené krvinky (sedimnetace)<br />
• protisrá$livé činidla: citrát, oxalát, EDTA, heparin<br />
• b!vají naadsorobvané na stěne skoumavky<br />
• často vychytávají Ca 2+ ióny
centrifugace<br />
• proces oddelení částic pomocí odstredivé síly<br />
• F = mrw2<br />
• často slou$í k ur!chlení sedimentace (při ní se částice rozdelují podle své<br />
hustoty vlivem gravitace)<br />
• rozdelení závisí na velikosti částic, ich tvaru, hustote,<br />
viskozite média, rychlosti rotoru<br />
• RPM (revolutions per minutes): r!chlost otáček (čím<br />
je vy##í, t!m bude rozdelení rychlej#í)<br />
•nastavením stejné hodnoty rpm v centrifugách o<br />
různém poloměru nedosáhneme stejné odstředivé<br />
síly
•<br />
centrifugace<br />
RCF (relative centrifugation force): udává kolikrát je<br />
odstredivé zrychlení vy##í, ne$ tíhové zrychlení g<br />
(udává se v násobcích g; g= 9,81m/s 2 )<br />
• RCF = RPM2 .f.r<br />
• r - poloměr rotoru v cm<br />
• f - propočítavací faktor (1,12.10 -5 )<br />
• důle$ité je vyvá$ení centrifugy<br />
• rotor: fixn! nebo v!kyvn!
centrifugace<br />
• centrifugy:<br />
• nízrychlostní: rpm do 6000, rcf do 7300g<br />
• mikrohematokritové: 11 a$ 15 000 rpm<br />
• ultracentrifugy - rotor pracuje vo vákuu (zamedzí se<br />
brzdení vzduchem a zahřívání), chlazené<br />
rpm 10 a$ 100 000, rcf do 178 000g<br />
• na stočení krvi: 10 min. při 1000g
centrifugace<br />
1. preparativní centrifugace<br />
• separace částic od kvapalní fáze<br />
• získáme: sediment (pelleta, pevná fáze) a supernatant<br />
(kvapalní fáze)<br />
• př. frakčná/ diferenciální centrifugace<br />
• slou$í k separaci buněčn!ch organel (při nejni$#í rcf se usadí nejte$#í část<br />
organel - jadrá + části buňek; supernatant se zleje a znovu se stočí při<br />
vy##í rcf - frakce bohatá na MIT; opět se stočí supernatant - mikrozomální<br />
frakce (části ER s enz!mami); ostane frakce bohatá na ribozómy)
centrifugace<br />
2. analytická centrifugace<br />
• slou$í k měření fyzikálních vlastností sedimentujících<br />
částic (sedimentačn! koeficient, molekulová hmotnost)<br />
• pou$ívají se optimálne ultacentrifugy<br />
• částice sú počas centrifugace sledovány optick!m<br />
systémem (měří zákal nebo absorbanci)
ELFO<br />
• analytická metoda zalo$ená na pohybu částic vlivem<br />
vnej#ího elektrického pole (tvořeného<br />
•<br />
stejnosměrn!m proudem)<br />
r!chlost migrace závisí na:<br />
• velikosti, tvaru a náboji částic<br />
• napětí<br />
• anion – negativně nabitá částice, pohybuje se k anodě (+)<br />
• kation – positivně nabitá částice, pohybuje se ke katodě (-)<br />
• amfolyt – látka, která mů$e mít pozitivni či negativní, ale té$<br />
nulov! náboj, v závislosti na podmínkách (pH) - př. proteiny
1. volná ELFO<br />
ELFO<br />
• separace probíhá jen v kvapalní fáze (pufru) bez účasti<br />
nosného média<br />
• bez trení (-> mů$ou byt pou$it! vy##í napětí [20 000 a$ 30<br />
000 V] -> je rychlej#í)<br />
• př. kapilární elektroforeze (v kapiláře)<br />
2. ELFO na nosičích<br />
• obvykle při 70 - 100 V<br />
• nosič: papír, gél (agaróza - přírodní; polyarkrylamid -<br />
syntetick!, různá velikost pórů)
ELFO<br />
• proteiny v sére (vy#e 300 druhů) se na agaróze rozdelí na 5<br />
(resp. 6) frakcí, na polyakrylamide na 25<br />
• SDS- PAGE (sodium dodecylsuphate polyacryl gel <strong>elfo</strong>) - SDS<br />
působí jako detergent (vá$e sa na proteiny, denaturuje ich a<br />
oddelí jednotliv! podjednotky) -> v#echny jsou na jednotku<br />
hmontnosti nabité rovnak!m nábojem -> separace probíha jen<br />
na základe molekulov! hmotnosti
• Parametry ovlivňující separaci<br />
ELFO<br />
• pH - mění náboj analytu a tím i jeho pohyblivost, mů$e měnit strukturu<br />
analytu (denaturace, disociace)<br />
• iontová síla - mění napětí či proud; zv!#ení iont. síly obvykle sní$í migrační<br />
rychlost a způsobí zahřívání systému<br />
• te<strong>pl</strong>ota - nízká T sni$uje difúzi, ale také migrační rychlost, nemá vliv na<br />
rozli#ení; vysoká T mů$e denaturovat proteiny<br />
• proud - příli# vysok! proud způsobí přehřátí systému<br />
• napětí - migrační rychlost je přímo úměrná napětí<br />
• čas - rozli#ení (vzájemné oddělení prou$ků) roste lineárně s časem, rozmytí<br />
prou$ků (difúze) roste se čtvercem času<br />
• médium - hlavními faktory, které ovlivňují migrační rychlosti jsou<br />
endoosmóza a velikost pórů nosiče
• průběh separace<br />
1. a<strong>pl</strong>ikace vzorku<br />
ELFO<br />
2. nastavení vhodného napětí nebo proudu (gelová <strong>elfo</strong> - cca 70 V, kapilární <strong>elfo</strong><br />
cca 20 000 V)<br />
3. zvolení separačního času: řádově minuty (gelová <strong>elfo</strong> sérov!ch proteinů trvá<br />
přibli$ně 30 min)<br />
4. při elektroforéze na nosičích je nezbytná fixace dělen!ch slo$ek a jejich<br />
následné obarvení (při kapilární <strong>elfo</strong> je detekce on-line, obdobně jako u<br />
HPLC)<br />
5. vyhodnocení: kvalitativní (srovnání se standardy); kvantitativní (<strong>elfo</strong> na<br />
nosičích - densitometricky)
• vyu$ití<br />
ELFO<br />
• separace proteinů séra, izoenzymů, NK<br />
• imunoelektroforéza
• frakce<br />
• albumín (60%)<br />
krevní <strong>pl</strong>azma<br />
• alfa-1 (3%) - alfa-1antitripsín, orozomukoid<br />
• alfa-2 (9%) - alfa-2makroglobulín, haptoglobín<br />
• beta (12%) - transferín, C3 slo$ka kom<strong>pl</strong>ementu<br />
• gama (16%) - Ig (IgG, IgA, IgM)
krevní <strong>pl</strong>azma<br />
• a$ 300 druhů (hlavně glykoproteiny- kromě<br />
albuminu); 60 - 80g/l<br />
• tvořeny (asi 25g/den) převa$ne v játrech (kromě Ig-<br />
<strong>pl</strong>azmocyty), příp. jin!mi buňkami (beta-2<br />
mikroglobulín)<br />
• odbourávany v játrech, ledvinách (v moči
krevní <strong>pl</strong>azma<br />
• lymfa: slo$ením připomíná <strong>pl</strong>azmu, no obsahuje<br />
obecně méňe prot. (závisí odkud teče)<br />
• likvor: a$ 200x méně prot. ako v <strong>pl</strong>azme (150-400mg/<br />
l)<br />
• patologické tekutiny: transsudát (přefiltrován; 30g/l)
• funkce:<br />
krevní <strong>pl</strong>azma<br />
• udr$ování objemu <strong>pl</strong>azmy (onkotick! tlak) - při poklesu<br />
vznikají edémy<br />
• transportní funkce - vá$ou látky<br />
• udr$ování izohydrie (pufry)<br />
• imunitní funkce (Ig, kom<strong>pl</strong>ement)<br />
• účast na koagulaci a fibrinol!ze
• sní$ení:<br />
• po#kození jater<br />
krevní <strong>pl</strong>azma<br />
• nutriční deficit, nedostatek AMK<br />
• diabetes<br />
• alkoholizmus<br />
• zv!#ení:<br />
• zánět<br />
• hyperthyroidizmus, zv!#ení GH<br />
• deficit Fe<br />
• klonální produkce (nádorová onemocnění)
• dělení podle funkce:<br />
krevní <strong>pl</strong>azma<br />
• transportní (transferín,ceruro<strong>pl</strong>azmín)<br />
• obranné (Ig, kom<strong>pl</strong>ement)<br />
• signální<br />
• enzymy,...<br />
• dělení klinicky:<br />
• kardiomarkry<br />
• tumormarkry<br />
• reaktanty akutní fáze<br />
• hormóny<br />
• cytokíny<br />
• buněčné enzymy
sérové proteiny - <strong>elfo</strong><br />
http://pro2services.com/Lectures/Winter/Proteins/protelec.gif
Change language