POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

POSTĘPY CHROMATOGRAFIIPraca zbiorowa pod redakcjąBronisława K. GłodaMonografie nr 111WYDAWNICTWOAKADEMII PODLASKIEJSIEDLCE 2009

Komitet Wydawniczy:Zofia Chyra-Rolicz (przewodnicząca), Stanisław Jaczyński, MirosławJakubiak, Iwona Kiersztyn, Marek Kucharski, Ryszard Mojak, RyszardRosa, Janina Skrzyczyńska, Stanisław Socha, Janusz Toruński,Izabela Trzpil, Janusz Uchmański, Hanna Wadas-Woźny, AndrzejWiśniewski, Krystyna Wojtczuk, Kazimierz ŻegnałekKomitet Redakcyjny (recenzenci):Tadeusz Dzido – Lublin, Bronisław K. Głód – Siedlce, Marian Kamiński– Gdańsk, Teresa Kowalska – Katowice, Mieczysław Sajewicz – Katowice,Andrzej Stołyhwo – Warszawa, Monika E. Waksmundzka-Hajnos– Lublin, Zygfryd Witkiewicz – Kielce, Paweł Zarzycki – KoszalinŻaden fragment tej publikacji nie może być reprodukowany, umieszczany w systemach przechowywaniainformacji lub przekazywany w jakiejkolwiek formie – elektronicznej, mechanicznej,fotokopii czy innych reprodukcji – bez zgody posiadacza praw autorskich.© Copyright by Wydawnictwo Akademii Podlaskiej, Siedlce 2009Monografie nr 111PL ISSN 0860-2719Wydawnictwo Akademii Podlaskiej08-110 Siedlce, ul. Bema 1, tel. (025) 643 15 20e-mail: wydawnictwo@ap.siedlce.plwww.wydawnictwo.ap.siedlce.plWyd. I. Format B-5.Ark. wyd. 7,2. Ark. druk. 8,6.Łamanie: Zofia Chudek (Wydawnictwo AP)2

SPIS TREŚCIPrzedmowa.................................................................................................... 5Piotr M. Słomkiewicz, Zygfryd WitkiewiczDozownik laserowy do dozowania próbek ciekłych do kolumnpakowanych w chromatografii gazowej.......................................................... 7Bronisław K. Głód, Paweł Piszcz, Tomasz Zieliński, Paweł ZarzyckiZastosowanie HPLC w badaniach choroby Parkinsona .............................. 15Monika AsztemborskaZastosowanie metod separacyjnych w badaniu enancjomeryzacji.............. 33Bronisław K. Głód, Paweł Piszcz, Iwona Kiersztyn,Anna Lamert, Paweł ZarzyckiZastosowanie HPLC do oznaczania wolnych rodników, antyoksydantóworaz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego.......................................... 41Józef RzepaOznaczanie leków i pestycydów w wodach powierzchniowych ................... 67Marian KamińskiPreparatywna i procesowa chromatografia cieczowa .................................. 79Daniel Jastrzębski, Grażyna Romanik, Marcin M. Kamiński, MaciejTrznadel, Anita Skrzypczak, Aleksandra Królicka, Marian KamińskiKolumnowa chromatografia cieczowa w rozdzielaniu i analizie peptydówi białek......................................................................................................... 1133

PRZEDMOWAPostępy Chromatografii to pierwsza z cyklu monografia poświęconanajnowszym trendom w chromatografii, wydana przy okazji organizowanychPodlaskich Spotkań Chromatograficznych. Adresowana jest przede wszystkimdo pracowników nauki, studentów oraz wszystkich, którzy na co dzieńzajmują się chromatografią. Autorzy zawarli w tej pozycji praktyczne przykładyzastosowań z zakresu różnych dziedzin chromatografii.Pragniemy podziękować wszystkim, którzy przyczynili się do powstaniatej książki oraz chcemy zachęcić innych, aby w przyszłości stali sięwspółautorami kolejnych wydań.KOMITET REDAKCYJNY

Piotr M. SŁOMKIEWICZ 1 , Zygfryd WITKIEWICZ 1,2,31)Instytut Chemii, Uniwersytet Jana Kochanowskiego, Kielce,2)COBRABiD, Warszawa,3)Instytut Chemii, Wojskowa Akademia Techniczna, WarszawaDOZOWNIK LASEROWY DO DOZOWANIAPRÓBEK CIEKŁYCH DO KOLUMN PAKOWANYCHW CHROMATOGRAFII GAZOWEJOpisano dozownik umożliwiający dozowanie próbek ciekłych do kolumn pakowanychw chromatografii gazowej. Dozowane próbki są bardzo szybko odparowywane zapomocą promienia laserowego w kontrolowanych warunkach.WPROWADZENIEDozowanie ciekłych próbek do chromatografów gazowych polega nawstrzykiwaniu cieczy za pomocą mikrostrzykawki do ogrzewanej komory dozownika,który znajduje się bezpośrednio przed kolumną chromatograficzną.W wyniku tego próbka ulega odparowaniu w przepływającym przez komoręgazie nośnym i jej pary wraz z tym gazem są wprowadzane do kolumny.Konstrukcje komór dozowników, służących do odparowywania ciekłychpróbek, powinny spełniać dwa podstawowe warunki. Powinny charakteryzowaćsię krótkim czasem odparowania, czyli bardzo szybko dostarczaćciepło potrzebne do odparowania próbki oraz mieć taką budowę, żeby rozcieńczaniepar próbki gazem nośnym było możliwie najmniejsze. Warunki tesą konieczne, albowiem początkowa szerokość pasma próbki w gazie nośnymmierzona w jednostkach czasu ma wpływ na rozdzielanie i rozmywaniepików chromatograficznych rejestrowanych u wylotu kolumny. Opróczspełnienia tych podstawowych warunków minimalizacji początkowej szerokościpasma sprzyja minimalizacja wielkości dozowanej próbki.Dozowanie cieczy o wysokiej temperaturze wrzenia powoduje chwiloweobniżenie temperatury strumienia gazu nośnego i komory dozownika.W wyniku tego zmniejsza się prędkość odparowywania próbki i w rezultacieprowadzi to do znacznego rozcieńczenia gazem nośnym par cieczy dopływającychdo kolumny. Próbka dopływa do kolumny w postaci szerokiego,rozmytego gazem nośnym pasma i rozdzielenie pików chromatograficznychmoże nie być zadowalające. Efekt ten jest szczególnie wyraźny, gdy jest dozowanamieszanina dwóch cieczy znacznie różniących się temperaturąwrzenia. Wówczas pik składnika o wysokiej temperaturze wrzenia jestznacznie bardziej rozmyty w porównaniu z pikiem składnika o niższej temperaturzewrzenia.7

W niniejszym artykule opisano dozownik do chromatografii, w którymdo odparowania ciekłej próbki wykorzystuje się energię światła laserowego.Zaletą tego rozwiązania jest natychmiastowe, krótkotrwałe odparowywaniepróbki. Możliwa jest przy tym regulacja mocy światła laserowego i czasu nagrzewaniapróbki w trakcie odparowywania, tak, aby uzyskać wąski prostokątnykształt impulsu odparowywanej próbki. Dozownik ten przeznaczonygłownie do dozowania próbek o wysokich temperaturach wrzenia do kolumnpakowanych [1,2].DOZOWNIK PRÓBEK O WYSOKIEJ TEMPERATURZE WRZENIADO KOLUMN PAKOWANYCHDozownik ma kształt walca (rys. 1), jego korpus 1 jest wykonany zestali kwasoodpornej. Wewnątrz korpusu znajduje się cylindryczna ogrzewanakomora 2. Komorę 2 od góry zamyka pokrywa 3, w której umieszczonokwarcową szybkę 4, przez którą do jej wnętrza przechodzi promień światłalaserowego 5. Do komory 2 jest doprowadzany gaz nośny przez wlot górny6 lub wlot dolny 7. Gaz nośny przez przyłącze 8 wpływa do kolumny chromatograficznej.Wlot dolny 7 służy do zasilania kolumny chromatograficznejgazem nośnym z pominięciem komory 2 dozownika. Wlot górny 6 służy dozasilania gazem nośnym komory 2 poprzez dysze 9 umieszczone w pierścieniu,który znajduje się w górnej części komory 2. Dysze rozdzielająstrumień gazu nośnego na kilka strumieni, co ułatwia tworzenie się laminarnegoprzepływu gazu nośnego w całym przekroju komory 2 niezależnie odszybkości przepływu i ciśnienia gazu nośnego. Dzięki temu unika się zawirowańi „martwych stref”, co mogłoby niekorzystnie wpływać na kształt pasmapoczątkowego wprowadzanej próbki.945231261011141378151Rys. 1. Dozownik próbek o wysokiej temperaturzewrzenia do kolumn pakowanych:1 – korpus, 2 – komora, 3 – pokrywa,4 – szybka kwarcowa, 5 – promień światłalaserowego, 6 – wlot górny, 7 – wlot dolny,8 - przyłącze kolumny chromatograficznej,9 – dysze w pierścieniu, 10 – pojemnikpróbki, 11 – śruba regulacyjna, 12 – membrana,13 – oprawa, 14 – nakrętka,15 – grzałka elektryczna8

W komorze 2 znajduje się pojemnik próbki 10, który jest umieszczonyna osi promienia światła laserowego. Regulacji położenia pojemnika próbki10 na osi promienia światła laserowego dokonuje się za pomocą mikrometrycznejśruby regulacyjnej 11. Przekłuwając igłą mikrostrzykawki membranę12 z gumy silikonowej umieszczonej w oprawie 13 z nakrętką 14 wprowadzasię próbkę cieczy do pojemnika próbki 10. Oprawa 13 i nakrętka 14 mają radiatory,aby chronić membranę 12 przed nadmierną temperaturą. Korpusdozownika 1 jest ogrzewany i termostatowany grzałką elektryczną 15. Pojemnikpróbki 10 znajduje się na osi wylotu kanalika, przez który przechodziigła mikrostrzykawki po przekłuciu membrany dozownika. Wprowadzana igłaprzechodzi przez boczny otwór 16 (rys. 2) w pojemniku próbki 10 i opiera sięo przeciwległą ściankę. Wówczas można wstrzyknąć próbkę cieczy do zagłębienia17 w pojemniku próbki 10. Takie rozwiązanie zapewnia prawidłowenapełnianie pojemnika próbki 10 i chroni wlot kolumny chromatograficznejprzed przypadkowym skapnięciem ciekłej próbki. Zastosowanie otworu 16na igłę mikrostrzykawki z boku pojemnika próbki 10 ułatwia odtwarzalnośćwprowadzania próbki do pojemnika w trakcie wykonywania wielokrotnychdozowań podczas rutynowych analiz.16 17111018Rys. 2. Układ pojemnika próbki:10 – pojemnik próbki, 11 – śruba regulacyjna, 16 – otwór doprowadzeniaigły mikrostrzykawki, 17 – zagłębienie, 18 – złącze termoparyNa dnie zagłębienia 17 znajduje się złącze termopary 18. Termoparasłuży do kontroli temperatury próbki w trakcie jej odparowywania promieniemświatła laserowego. Możliwe jest wykonanie wstępnej charakterystyki zależnościtemperatury nagrzewania pojemnika próbki 10 od mocy wiązki laseroweji czasu naświetlania. Umieszczenie termopary 18 na dnie pojemnikapróbki 10 pozwala precyzyjnie mierzyć temperaturę w punkcie odparowywaniapróbki, dzięki czemu można uniknąć silnego przegrzania, które możedoprowadzić do rozkładu termicznego jej składników.Na rys. 3 przedstawiono schemat podłączenia dozownika z chromatografemgazowym. W trakcie wprowadzania mikrostrzykawką próbki cieczydo dozownika gaz nośny, którego wielkość strumienia reguluje się za pomocązaworu iglicowego 19, przepływa przez otwarty zawór elektromagnetyczny20 do wlotu 7 dozownika i wypływa przez przyłącze 8 do kolumny chromatograficznej.Równocześnie jest zamknięty zawór elektromagnetyczny 21i gaz nośny omija komorę 2. Zastosowanie dwóch torów gazowych pozwalana wstrzymanie przepływu gazu przez komorę 2 dozownika w trakcie wprowadzaniapróbki do pojemnika 10. Dzięki temu unika się porywania niewiel-9

kich ilości par (szczególnie składników analizowanej mieszaniny o niższychtemperaturach wrzenia) przez gaz nośny przed rozpoczęciem właściwegoprocesu odparowywania. Po wprowadzeniu próbki do pojemnika 10, zamykasię zawór elektromagnetyczny 20 i otwiera się zawór elektromagnetyczny21. Wówczas gaz nośny zaczyna przypływać przez komorę 2. W tym momenciewłącza się laser 23 i promień światła laserowego pada na zagłębienie17 w pojemniku próbki 10 i znajdująca się w zagłębieniu 17 ciecz zostajegwałtownie odparowana.Temperaturę procesu odparowywania można odczytać na miernikutemperatury 24, który jest podłączony do termopary 18. Regulując moc promienialaserowego, można kontrolować temperaturę, w jakiej odbywa sięodparowywanie próbki cieczy. W ten sposób można uzyskać dużą szybkośćodparowywania próbki, a jednocześnie uniknąć jej silnego przegrzania, któremogłoby być przyczyną termicznego rozkładu składników próbki. Pary próbkiwraz z gazem nośnym przepływają do kolumny chromatograficznej.2223216210181724207198Rys. 3. Schemat połączeń gazowych dozownika do kolumn pakowanych: 2 – komora, 6 – wlotgórny, 7 – wlot dolny, 8 – przyłącze kolumny chromatograficznej, 10 – pojemnik próbki,17 – zagłębienie, 18 – czujnik temperatury, 19 – zawór iglicowy, 20, 21, 22 – zawór elektromagnetyczny,23 – laser, 24 – miernik temperaturyMożliwe jest także usuwanie rozpuszczalnika z wprowadzonej próbkido pojemnika 10 przez zamknięcie zaworu elektromagnetycznego 21i otwarcie zaworów elektromagnetycznych 20 i 22. Wówczas gaz nośny za-10

czyna przypływać przez komorę 2 i wypływa z parami rozpuszczalnika przezzawór elektromagnetyczny 22 na zewnątrz dozownika.DOZOWNIK LASEROWY A DOZOWNIK KLASYCZNYW opisywanym dozowniku laserowym zastosowano laser argonowyfirmy Spectra Physics o ciągłej lub impulsowej oraz o regulowanej długościi mocy wiązki światła. Działanie tego dozownika porównano ze zwykłym dozownikiemchromatografu gazowego Chrom 5.2napięcie [mV]10 2 4 6 8 10czas [min]Rys. 4. Porównanie kształtu piku. Kolumna 0,5 m, średnica wewnętrzna 2 mm wypełniona granulkamiszklanymi 60/80 mesh, temperatura kolumny 280 0 C, detektor (FID) 280 0 C, 0,3 μl olejuparafinowego. 1 – pik otrzymany za pomocą dozownika klasycznego, temperatura dozownika280 0 C, 2 – pik otrzymany za pomocą dozownika - laser argonowy λ=514,5 nm, 5WNa rysunku 4 przedstawiono przykładowe kształty pików chromatograficznychotrzymanych po dozowaniu próbki oleju parafinowego do dozownikaklasycznego i laserowego w tych samych warunkach. Pik otrzymany z dozownikalaserowego jest mniej rozmyty w porównaniu z pikiem otrzymanymprzy użyciu dozownika klasycznego. Obliczony za pomocą programu Origin[3] narost piku otrzymanego przy użyciu dozownika laserowego wynosi0,07 mV/s, a narost piku otrzymanego przy użyciu dozownika klasycznego0,3 mV/s.11

123A23Bnapięcie [mV]napięcie [mV]0 1 2 3 4 5 6czas [min]0 1 2 3 4 5 6czas [min]Rys. 5. Chromatogram fenantrenu (2) i antracenu (3) w toluenie (1). Kolumna 1,6% SP-301 naSupelcoporcie 100/200 o długości 2,5 m i średnicy wewnętrznej 3 mm. Temperatura kolumnyi detektora (FID) 275 o C, gaz nośny azot 20 cm 3 /min. A – dozownik klasyczny temperatura260 o C, B – dozownik - laser argonowy 514,5 nm, 10WRysunek 5 przedstawia dwa chromatogramy fenantrenu i antracenuw toluenie. Chromatogram otrzymany przy użyciu dozownika klasycznego(rys. 5A) przedstawia nakładanie się piku rozpuszczalnika na piki fenantrenui antracenu. Natomiast dozownik laserowy umożliwia wstępne odparowanietoluenu z dozownika a następnie szybkie odparowanie fenantrenu i antracenuza pomocą wiązki laserowej do kolumny chromatograficznej. W wynikutego otrzymane WWA są lepiej rozdzielone.AB12napięcie [mV]napięcie [mV]30 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20czas [min]0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20czas [min]12

4Cnapięcie [mV]3Rys. 6. Chromatogramy metanolu z zastosowaniem dozownika laserowego o różnych długościachfali i mocy wiązki. A – laser argonowy λ=514,5 nm, 5W, B - laser argonowy λ=351,5 nm,3W, C - laser argonowy λ=351,5 impuls 50 W. Kolumna chromatograficzna o długości 2,5 mi średnicy wewnętrznej 3 mm z Porapakiem Q 80/100 mesh, temperatura kolumny 160 o C,przepływ gazu nośnego (azot) 50 cm 3 /min, temperatura detektora (TCD) 160 o C. 1 – metanol,2 – metan, 3 – woda, 4 – wodórW zależności od użytej do odparowywania energii wiązki laserowejjest możliwa zmiana chemicznej postaci wprowadzanej próbki. Przedstawionoto na przykładzie chromatografowania metanolu. Dozowanie z użyciemniewielkiej energii wiązki laserowej metanolu do kolumny wypełnionej PorapakiemQ daje pojedynczy pik (rys. 6A). Zwiększenie energii wiązki sprawia,że następuje rozkład cząsteczki metanolu na metan i wodę i na chromatografieobserwuje się dwa piki (rys. 6B). Przy znacznym zwiększeniu energiiwiązki, możliwy jest także rozkład metanu, na węgiel i wodór, i wówczas obserwujesię dwa piki wodoru i wody (rys. 6C). Węgiel pozostaje w dozowniku.WNIOSKI0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20czas [min]1. Zastosowanie dozownika laserowego do kolumn pakowanych w chromatografiigazowej umożliwia zmniejszenie rozmycia pasma początkowegoi pików składników dozowanej próbki.2. Dozownik laserowy pozwala wstępnie odparować rozpuszczalnik i następnieza pomocą wiązki laserowej odparować wysokowrzące składnikipróbki.3. Stosowanie wiązki laserowej o zróżnicowanej energii pozwala nie tylkoodparować próbkę, ale także rozkładać anality na części składowe. Takiepostępowanie może być przydatne w chromatografii gazowej z detektoremmasowym.13

LITERATURA1. P.M. Słomkiewicz, Dozownik do chromatografu gazowego, zwłaszczado próbek o wysokiej temperaturze wrzenia, PL - 192882, (5 stycznia2007).2. P.M. Słomkiewicz, Z. Witkiewicz, Dozowniki laserowe w chromatografiigazowej, Aparatura Badawcza i Dydaktyczna, 11/4(2006)264 – 272.3. Origin User`s Manual, Microcal Software. Inc., Northampton MA, USA.14

Bronisław K. GŁÓD 1 , Paweł PISZCZ 1 , Tomasz ZIELIŃSKI 1 ,Paweł ZARZYCKI 21)Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaskaul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlcee-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.pl2)Zakład Toksykologiii Bioanalityki, Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,Politechnika Koszalińska, ul. Śniadeckich 2, 75-453 KoszalinZASTOSOWANIE HPLC W BADANIACHCHOROBY PARKINSONAW pracy przedstawiono podstawowe informacje o chorobie Parkinsona. Omówionozastosowanie HPLC w oznaczaniu profilu dziennego leków stosowanych w jej leczeniu,oznaczaniu całkowitego potencjału antyoksydacyjnego oraz ich korelacje z testemWebstera i natężeniem tremoru.PODSTAWOWE INFORMACJE O CHOROBIE PARKINSONAPierwszy opis klinicznych objawów choroby Parkinsona (ChP) pochodziz egipskich papirusów z XIII wieku p.n.e. W czasach nowożytnych chorobęponownie opisał w 1817 roku brytyjski lekarza Johna Parkinsona w artykuleAn Essay on the Shaking Palsy.ChP spowodowana jest niewydolnością pozapiramidowego układu ruchowego.Głównym procesem patologicznym jest postępujące zwyrodnienieneuronów dopaminergicznych w warstwie zbitej istoty czarnej [1]. Podobniedo choroby Alzheimera należy do grupy chorób zwyrodnieniowych układunerwowego. Ma charakter przewlekły, a jej objawy pogłębiają się wrazz rozwojem choroby. Na ChP choruje prawie 1,5% populacji powyżej 65 rokużycia. Jest więc bardzo ważnym problemem nie tylko medycznym, alei społecznym [1]. Dotyka ona w podobnym stopniu różnych ludzi, bez względuna ich płeć, zamożność, pochodzenie społeczne i geograficzne. Klinicznieobjawia się ona spowolnieniem ruchowym, sztywnością mięśni i drżeniemspoczynkowym.Udział wolnych rodników w ChP nie jest całkowicie wyjaśniony. Istotaczarna ma duże tempo metabolizmu, dlatego też charakteryzuje się wysokązawartością utleniaczy przy jednoczesnym niskim stężeniem antyoksydantów.Nawet niewielki stres oksydacyjny może z łatwością zniszczyć jej naturalnąobronę powodując powstanie wolnych rodników tlenowych, które zewzględu na przeważające stężenie utleniaczy utrzymują powstający stres,a także zapoczątkowują apoptozę neuronów dopaminergicznych przejawiającąsię obniżoną zawartością cytochromu c w mitochondriach komórek nerwowychzaatakowanych chorobą. Zmniejsza to aktywność mitochondrialne-15

go kompleksu I. Powoduje to zmniejszenie ilości wytwarzanej energii, obniżenieilości stężenia antyutleniaczy oraz wzrost tempa powstawania wolnychrodników i nasilenie procesów utlenienia. O tym, że w istocie czarnej w ogóledochodzi do stresu oksydacyjnego świadczą zwiększone ilości dialdehydumalonowego będącego końcowym produktem peroksydacji lipidów, a takżezmniejszenie ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych [2].Osobnym zagadnieniem są zmiany stężenia zarówno rodników jaki antyoksydantów we krwi chorego. Spowodowane są one z jednej stronyzwiększonym metabolizmem, spowodowanym m.in. charakterystycznymdrżeniem kończyn, przyczyniającym się do produkcji rodników. Z drugiej zaśpodawane pacjentom jako leki aminy katecholowe są antyoksydantami.Zniszczenie komórek nerwowych istoty czarnej zmniejsza wydzielaniedopaminy, neuroprzekaźnika chemicznego odpowiedzialnego za transmisjęsygnałów pomiędzy istotą czarną, a ciałem prążkowanym w kresomózgowiu.Sygnały przekazywane z istoty czarnej są odpowiedzialne za zależne od naszejwoli ruchy, które dzięki prawidłowemu przekaźnictwu są płynne i przebiegająbez zakłóceń. Jeśli zniszczeniu ulegnie ponad 80% komórek produkującychdopaminę, zostaje utracona zdolność kontroli nad takim typemruchów. Przyczyna zwyrodnienia komórek istoty czarnej nie jest dokładnieznana. Jedną z hipotez jest mechanizm wolnorodnikowy. Inne mówią o toksynach,czynnikach genetycznych (szczególnie mitochondrialnych) czy ekscytotoksyczności(nadprodukcji dopaminy).Dominującym, chociaż nie jedynym zaburzeniem w chorobie Parkinsonajest przedwczesne, postępujące zwyrodnienie neuronów dopaminoergicznych.Wynikiem tego jest obniżenie stężenia dopaminy i jej metabolitów,a także spadek aktywności enzymów związanych z jej syntezą. Opracowanezostały trzy główne strategie w walce z tą chorobą (i) uzupełnić niedobór dopaminy,(ii) zahamować proces jej rozkładu w mózgu oraz (iii) dostarczyć organizmowisubstancje, które działają podobnie do dopaminy.Najprostszym sposobem leczenia tego schorzenia byłoby zastosowaniepierwszej z wymienionych strategii, czyli podanie dopaminy. Dopaminajednakże nie przekracza bariery krew – mózg. Z tego względu najprostszymobecnie sposobem leczenia tej choroby jest podawanie bezpośredniego jejprekursora – L-dopy (lewodopy), zdolnej przechodzić przez barierę krew –mózg.Wprawdzie wprowadzenie L-dopy było przełomem w walce z chorobąParkinsona jednakże, niestety nie zapobiega ona obumieraniu komórek produkującychdopaminę. Z tego względu próbuje się zastosować drugą z wymienionychwcześniej strategii – zahamować procesy przemiany dopaminyw inne substancje, stosując np. inhibitor enzymu MAO-B (monoaminooksydazyB) odpowiedzialnego za rozkład dopaminy (rys. 1). Stymulację układudopaminoergicznego można uzyskać poprzez zwiększenie produkcji endogennejdopaminy w układzie nigro-strialnym przez zablokowanie jej metabolizmulub przez bezpośrednią stymulację receptora dopaminoergicznego [3].16

Rys. 1. Metabolizm dopaminyL-dopa po raz pierwszy została zastosowana w leczeniu choroby Parkinsonana początku lat 60. Dziś L-dopa jest uznawana jako „złoty standard”leczenia [4]. Jest najsilniejszym lekiem przeciwparkinsonowskim, jedynym,który jest skuteczny w każdym stadium zaawansowania choroby. Podwzględem chemicznym jest to lewoskrętna 3,4-dihydroksy-L-fenyloalanina,bezpośredni prekursor dopaminy przechodzący przez barierę krew-mózg.Powstaje ona w ustroju z egzogennej tyrozyny (przy udziale hydroksylazy tyrozynowej)i ulega przemianie do dopaminy przy pomocy dekarboksylazyaromatycznych aminokwasów (rys. 1).Pod wpływem katecholo-O-metylotransferazy (COMT) L-dopa metabolizowanajest do 3-metoksy-DOPA (3-OMD) (na rys. 1 etap ten został pominięty).Dopamina natomiast może być metabolizowana zgodnie z trzemaszlakami (rys. 1). Pierwszy przebiega przez kwas dihydroksyfenylooctowy(DOPAC), katalizowany przez monoaminooksydazę (MAO), do kwasu homowanilinowego(HVA) katalizowanego przez COMT. W drugim natomiastpod wpływem COMT dopamina jest metabolizowana do 3-metoksytyraminy(3-MT), a następnie również do HVA pod wpływem MAO. Z wyjątkiemdopaminy, pozostałe metabolity L-dopy są farmakologicznie nieaktywne.Oba szlaki metabolizmu występują zarówno w narządach obwodowych,jak i w mózgu. Trzeci szlak prowadzi do powstania hormonów i dlatego niebędzie szerzej omawiany.Mimo wieloletniego już stosowania L-dopy mechanizm jej działaniabudzi wiele niejasności. Według klasycznej hipotezy egzogenna L-dopapodana doustnie zostaje wchłonięta w jelicie cienkim i poprzez systemtransportu dużych aminokwasów (LNAA) szybko trafia do innych tkaneki przekracza barierę krew – mózg, gdzie jest wychwytywana przez neurony17

dopaminoergiczne i tam poddawana działaniu dekarboksylazy aromatycznychaminokwasów i dopiero jako dopamina uwalniana do synapsy. Na obwodzie,a także w śluzówce przewodu pokarmowego L-dopa ulega takżeszybkiej dekarboksylacji. Dlatego też w narządach obwodowych powstająduże ilości dopaminy nieprzechodzącej do mózgu, a tylko niewielka ilośćL-dopy (ok. 1-3%) przedostaje się przez barierę wykazując działanie terapeutyczne.Zależy to od wielu czynników m.in. od zawartości białka w dieciei czasu przejścia przez żołądek. Aby wyeliminować szybką zmianę L-dopaw dopaminę już w błonie śluzowej żołądka, a tym samym zwiększyć jej możliwośćdotarcia do mózgu, doustne preparaty zawierają inhibitory obwodowejdekarboksylazy, karbidopę lub benserazyd. Pośrednio zwiększa to przenikanieL-dopy do mózgu i pozwala na znaczną redukcję dawki leku i jegoobwodowe działanie niepożądane takie jak nudności, wymioty i spadki ciśnienia[3].Wprowadzenie L-dopy do lecznictwa spowodowało wyraźny spadekśmiertelności chorych. Dane epidemiologiczne sugerują, że chorzy z dobrzeleczoną chorobą Parkinsona mają szansę żyć równie długo jak ich zdrowirówieśnicy. Tłumaczy się ono zarówno zmniejszeniem śmiertelnych powikłańz unieruchomienia, jak i neuroprotekcyjnym działaniem L-dopy [5]. W ostatnichlatach badania eksperymentalne zaczęły dostarczać jednak coraz więcejdanych na to, że L-dopa może być toksyczna dla neuronów dopaminoergicznych.W skojarzeniu z wolnorodnikową hipotezą etiopatogenezy chorobyParkinsona oraz z faktem występowania ruchowych objawów niepożądanychpo długotrwałym podaniu L-dopa problem jej toksycznego działaniawzbudza duży niepokój. Mimo intensywnie prowadzonych badań nadal nieudało się ostatecznie ustalić ani uzyskać jednoznacznych dowodów na to,że L-dopa w dawkach terapeutycznych powoduje śmierć komórek nerwowych.U chorych słabo reagujących na leczenie farmakologiczne stosuje sięleczenie chirurgiczne. Czynione są także próby wszczepienia stymulatorów,które pozwolą modelować aktywność upośledzonych struktur mózgu.FARMAKOKINETYKA AMIN KATECHOLOWYCH0,8*c [μM]0,4#00 1 2 3 4czas [h]Rys. 2. Zmiany stężenia L-dopy w surowicy pacjentów z chorobą Parkinsona przed podaniemleku, po godzinie, dwóch, trzech i pięciu po podaniu preparatu.* p

Dopamina, której niedobór w części zbitej istoty czarnej jest czynnikiemwyzwalającym objawy choroby Parkinsona, należy do amin katecholowych.Ponieważ jednak nie przedostaje się przez barierę krew-mózg, dlategoteż wprowadzona do krążenia obwodowego nie daje efektuterapeutycznego. Uzyskuje się go jednak poprzez podanie bezpośredniegoprekursora dopaminy – L-dopy, która należy także do amin katecholowych.Przedostający się do mózgu tylko niewielki procent (1-3%) jest często niewystarczającądawką do uzyskania efektów terapeutycznych. Z kolei zwiększeniepodawanej dawki powoduje szereg niepożądanych objawów. Okazałosię, że równoczesne podawanie L-dopy z inhibitorami dekarboksylazyaromatycznych aminokwasów, zwiększa jej biodostępność poprzez zmniejszeniejej obwodowego metabolizmu. L-dopę, jak i inne aminy katecholowe,można w surowicy oznaczać stosując HPLC z detekcją amperometryczną.Maksymalne stężenie L-dopy w surowicy występuje po ok. godzinie od chwilizażycia leku (rys. 2 [6]) [6-8]. Po 90 min. stężenie L-dopy w surowicy jestśladowe. W leczeniu niezwykle istotna jest więc optymalizacja dawki. Zarównozbyt niskie jak i zbyt wysokie stężenia leku skazują pacjenta na niepowodzeniew trakcie terapii. Niskie stężenia mogą być następstwem zaburzeńwchłaniania L-dopy z przewodu pokarmowego, wysokie natomiastmogą osiągać wartości dawki toksycznej. Przeprowadzone badania potwierdzają,że maksymalne L-dopy stężenie występuje po około godziny od zażyciapreparatu. Zmiany stężenia L-dopy po godzinie, dwóch, trzech i pięciuw stosunku do godziny zerowej są statystycznie znamienne. Zmiany stężeniaL-dopy powinny mieć odzwierciedlenie w zmniejszeniu drżenia, głównegoobjawu parkinsonizmu, a także na poprawę parametrów fizjologicznychokreślanych za pomocą testu Webstera. Maksymalne stężenie karbidopy(rys. 3 [6]) występuje także po godzinie od podania preparatu, po czymzmniejsza się, ale po trzeciej godzinie ponownie wzrasta. Pomimo podobnejdynamiki współczynnik korelacji pomiędzy karbidopą, a grupą nierozdzielonychreduktorów jest bardzo niski.98c [μM] 7650 1 2 3 5t [h]Rys. 3. Farmakodynamika karbidopy. Zmiany stężenia karbidopy w surowicy pacjentów z chorobąParkinsona. Pozostałe warunki jak na rys. 2. * p

WŁASNOŚCI ANTYOKSYDACYJNE AMIN KATECHOLOWYCHW literaturze można znaleźć sprzeczne informacje na temat dopaminy.Z jednej strony dopamina przyczynia się do stresu oksydacyjnego,z drugiej zaś ma właściwości antyoksydacyjne. Zarówno enzymatyczne utlenianiedopaminy przy udziale MAO B jak i jej samoutlenianie prowadzą dopowstania nadtlenku wodoru, będącego źródłem najbardziej reaktywnegowolnego rodnika – hydroksylowego. Tak więc, metabolizm dopaminy prowadzido powstania uszkodzeń w komórkach nerwowych oraz ich śmierciw procesie apoptozy. System dopaminowy broni się przed skutkami deficytuneuromediatora zwiększając jego metabolizm. Przeprowadzone pośmiertniebadania w mózgach parkinsoników wykazały specyficzne, wielokrotne nasileniemetabolizmu w strukturach układu pozapiramidowego. Zwiększony metabolizmdopaminy, powoduje zwiększoną produkcję nadtlenku wodorui rodnika hydoksylowego. Zwiększone uwalnianie, wychwyt i presynaptycznymetabolizm dopaminy może przyczyniać się do postępującej destrukcji neuronówobserwowanej w chorobie Parkinsona. Powstający nadmiar rodnikówjest przyczyną wzmożonej peroksydacji lipidów, co w konsekwencji prowadzido indukcji procesu apoptozy. Podobną rolę pełnią produkty metabolizmudopaminy (np.: 6-hydroksydopamina).Rys. 4. Anty- i prooksydacyjne właściwości dopaminy w stosunku do rodników hydroksylowychIstnieje kilka mechanizmów, które z jednej strony nadają dopaminiewłaściwości prooksydacyjne: zdolność redukcji żelaza (III) do żelaza (II)i samoutlenianie dopaminy do pochodnej chinonowej. Z drugiej zaś stronydopamina wykazuje właściwości antyoksydacyjne dzięki obecności grupy20

katecholowej oraz kompleksowaniu żelaza (II), uniemożliwiającemu zajściereakcji Fentona.Stosując chromatograficzną metodę oznaczania całkowitego potencjałuantyoksydacyjnego (CPA) przebadano własności dopaminy w stosunkudo rodników hydroksylowych [6]. Rodniki hydroksylowe, które generowanow reakcji analogicznej do Fentona, pułapkowano kwasem p-hydroksybenzoesowym.Gdy do układu, zawierającego dopaminę, dodawano ADP(rys. 4B), który katalizuje reakcję redukując żelazo z +3 stopnia utlenienia na+2 pik kwasu 3,4-DHBA (którego wysokość świadczyła o właściwościachprooksydacyjnych dopaminy) był niższy w stosunku do kontroli (rys. 4A), którazawierała wodę zamiast dopaminy. Wynik ten był spowodowany tym, żegdy w układzie reakcyjnym znajdowała się, dopamina wygenerowane rodnikihydroksylowe reagowały zarówno z pHBA jak i dopaminą. Otrzymane wynikisugerują, że dopamina jest słabym zmiataczem rodników hydroksylowych.Brak ADP w układzie powodował, że pik chromatograficzny pochodzący od3,4-DHBA był znacznie niższy niż w obecności ADP (rys. 4C). Oznacza to,że reduktor w mieszaninie jest niezbędny, aby stale zapewniona była obecnośćżelaza (II). W końcu, gdy do układu zawierającego dopaminę nie dodanoADP wielkość piku 3,4-DHBA była większa niż w układzie bez ADPi bez dopaminy (rys. 4D). Oznacza to, że dopamina przejęła rolę reduktoraFe 3+ do Fe 2+ . Doświadczenie to potwierdziło sugestie, że w zależności odwarunków dopamina może z antyoksydanta stać się oksydantem (rys. 5).Ponadto metoda ta pozwoliła ustalić jeden z prawdopodobnie kilku istniejącychmechanizmów prooksydacyjnego działania dopaminy.4030((–) ADP(+) ADPh [nA] 201000 50 100 150 200C [μM]Rys. 5. Wpływ stężenia dopaminy nazmiany wysokości pików chromatograficznych3,4-DHBA. Zmniejszenie wysokościoznacza antyoksydacyjne działaniebadanego związku21

Autooksydacja amin katecholowych może zachodzić nie tylko podwpływem enzymów czy jonów metali, ale także pod wpływem tlenu w powietrzu.Okazało się, że z amin katecholowych obecnych w lekach antyparkinsonowskichnajszybciej samoutlenianiu ulegał benserazyd, najwolniej zaśL-dopa (rys. 6). Oznacza to, że za zmianę barwy rozpuszczonego w wodzieleku odpowiada samoutlenianie benserazydu (inhibitora), zaś spadek stężeniasubstancji czynnej w postaci L-dopy jest nieznaczny.Rys. 6. Zmiany stężenia amin katecholowych w zależności od czasu ich przechowywaniaw temp. 25ºCHIPERMETABOLIZM W CHOROBIE PARKINSONA, TREMORI JEGO POMIARDrżenia są najbardziej istotnym elementem symptomatologii i diagnostykiwielu chorób układu pozapiramidowego (w tym również parkinsonizmui choroby Parkinsona). Wykorzystywane są zarówno w rozpoznawaniu wieluchorób, dla których drżenie jest objawem typowym, jak i w diagnostyce różnicowej,w której badane są charakterystyki różnych rodzajów drgań. Warunkiemszerszego ich wykorzystania jest udoskonalenie metod pomiaru odpowiednichcharakterystyk, powiązanie wyników ich pomiaru z konkretnymijednostkami chorobowymi, na podstawie uzyskanych rozkładów prawdopodobieństwa,a następnie przypisanie im odpowiednich procedur terapeutycznych.Ze względu na coraz częstsze występowania schorzeń układu pozapiramidowegowydaje się to bardzo istotne. Oryginalne urządzenie tego22

typu skonstruowano w Instytucie Elektroniki WAT we współpracy z KlinikąNeurologii CSK WAM. Pozwala ono na podniesienie efektywności diagnozyschorzenia, przyspieszenie rozpoznania, a więc i wcześniejsze rozpoczęcieleczenia. Podnosi to standard życia jednostek i zmniejsza całościowe kosztyleczenia populacji.Przy nadmiernych wydatkach energetycznych w organizmie następujeszereg zmian metabolicznych, wśród nich niedostateczna podaż glukozyw mięśniach i konieczność glukoneogenezy. Zjawiska te prowadzą do utlenianiaaminokwasów i nasilenia zużycia tlenu [9]. Objawy wyniszczenia i wychudzeniaciała – typowe dla parkinsoników, są bezpośrednimi dowodamidługotrwałego występowania u chorych hipermetabolizmu prowadzącego doujemnego bilansu energetycznego. Wartość energetyczna spożywanej dietynie pokrywa wówczas w pełni wydatków energetycznych, w wyniku, czegopoczątkowo spalany jest tłuszcz zapasowy, a następnie białka mięśniowe.Zwiększony wydatek energetyczny powoduje również uszkodzenie układudopaminoergicznego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) powodująceuogólnione zaburzenia metabolizmu energetycznego ustroju. Parkinsonicyczęsto wykazują hypertermię i znaczną potliwość. Przyczyną tego może byćzablokowanie ośrodkowych receptorów dopaminoergicznych, a konsekwencjądodatkowy wydatek energetyczny [10]. Drżenie (tremor) może mieć charakterfizjologiczny, stanowiąc przejaw działania układu pozapiramidowego,który jest najlepiej wykształconym układem generowania ruchów mimowolnychw okresie noworodkowym i niemowlęcym, a także odruchów bardziejzłożonych. Mogą być także przejawem patologicznym i być skutkiem nieprawidłowychimpulsów z jądra czerwiennego i wzgórzomózgowia, jakw chorobie Parkinsona [11-13].Drżenia możemy charakteryzować za pomocą rozmaitych parametrów:lokalizacji, regularności występowania, stopnia nasilenia, wpływuczynników wewnętrznych, wpływu czynników środowiskowych, częstotliwości,amplitudy, energii całkowitej czy widma. Ostatnie cztery parametry sąmierzalne w sposób obiektywny. Ich wartości są powiązane z wymienionymiwcześniej czynnikami. Lokalizacja drżenia ma oczywisty wpływ na amplitudę.Części ciała odleglejsze od jego osi mają większą amplitudę niż częściciała bliskie osi. Z kolei podparcie (a więc, fizycznie rzecz biorąc, przesunięcieosi ruchu w kierunku obwodowym) zmniejsza amplitudę drżenia, o ile niewiąże się z powstaniem dodatkowych napięć spowodowanych wymuszonym(czyli nie fizjologicznym) ułożeniem. Regularność i częstość występowaniawiążą się z amplitudą i energią drżenia. Włókno mięśniowe po wykonaniuok. 80 drgań traci większość lub nawet całość ATP i wskutek tego nie możeprzez pewien czas wykonywać ruchów. Tak więc regularność i duża częstotliwośćdrżeń powoduje, przynajmniej okresowo, spadek amplitudy i energiisygnału. Nasilenie drżenia jest niespecyficznym wskaźnikiem obejmującymtakie jego składowe jak lokalizacja, regularność, częstotliwość i charakterystykawidmowa. Jego stosowanie jest związane z brakiem możliwości dokładnegopomiary pewnych charakterystyk obiektywnych; wydaje się, żeśrednia energia na ustaloną jednostkę czasu (być może wraz z charaktery-23

styką amplitudową) byłaby rzetelnym i wystarczającym miernikiem tegowskaźnika. Czynniki wewnętrzne i zewnętrzne mogą w rozmaity sposóbwpływać na mierzalne parametry drżenia. Mogą je także wywoływać (drżeniespowodowane chłodem, tzw. dreszcze) lub znosić (ustępowanie u alkoholikadrżenia po wypisu alkoholu). Mogą także modyfikować jego charakterystyki.Z kolei oczywisty jest wpływ czynników wewnętrznych nawystępowanie i intensywność drżeń. Łączny wpływ tych czynników na obrazdrżeń jest złożony i niejednoznaczny. W zakresie mierzalnych charakterystykdrżenia najczęściej stosowaną jest częstotliwość. W zależności od niejdzielimy je na następujące pasma:- 1,5 – 3 Hz: pasmo drżeń ataktycznych, dotyczących główniegłowy i tułowia, spotykanych w chorobach demielizacyjnych;- 4 – 5 Hz: pasmo najbardziej nieokreślone, drżenia postawneo częstotliwości 4 Hz występują w przypadkach uszkodzeniamóżdżku lub jądra czerwiennego, w przypadku drżenia spoczynkowegojest identyfikowane jako symptom choroby Parkinsona(drżenie postawne i spoczynkowe różni się amplitudą);- 6 Hz: pasmo drżeń głównie kończyn; a także drżeń zamiarowychi klonicznych (np. klonus typowy dla uszkodzeń drogi pozapiramidowejma częstotliwość 6 Hz);- 8 – 12 Hz: pasmo drżeń o rozmaitej etiologii, tak fizjologicznejjak i patologicznej, np. z powodu udarów mózgu, zwyrodnieniaoraz neuropatii obwodowych.Inną mierzalną charakterystyką drżenia jest amplituda. Jej pomiar, zewzględu na jej niewielką wartość, zazwyczaj wymaga specjalnej aparaturypomiarowej i wobec tego nie jest ona dokładnie opisana w funkcji rodzajuschorzenia. Wykazuje się wyraźną zmiennością w zależności od pory dnia,wpływu stosowanych leków, pozycji ciała badanego, a także rozmaitychczynników wewnętrznych i zewnętrznych, w związku z czym jej opisoweokreślenie jest trudne.Drżenia samoistne (ET) są uważane za łagodną, skąpo-objawowąchorobę układu nerwowego. Charakteryzują się częstotliwością 6 – 11 Hzi amplitudą 25 – 600 μV. Najczęściej spotykanym wyrazem tej choroby jestdrżenie głosu. Mogą także występować równolegle inne objawy, jak drżenierąk czy głowy, sporadycznie także innych części ciała. W zakresie drżeń patologicznychdzieli się je przede wszystkim w zależności od funkcji piramidowegoukładu ruchowego, odpowiedzialnego za ruchy dowolne. Funkcje teto spoczynek, pozycja wyjściowa do ruchu zamierzonego oraz ruch zamierzony(dowolny) odpowiednio do tego wyróżnia się (i) drżenie spoczynkowe,(ii) drżenie pozycyjne i (iii) drżenie zamiarowe. Drżenie spoczynkowe stałosię podstawą definicji przez Jamesa Parkinsona choroby, nazywanej dzisiajjego nazwiskiem. Polega na występowaniu w pozycji spoczynku drżeń,ustępujących po rozpoczęciu ruchów czynnych. Drżenia te występują wyłącznew trakcie czuwania i pojawiają się po przebudzeniu przy próbie wykonaniapierwszych ruchów dowolnych. Ich amplituda zależy od stopnia zaawansowaniachoroby, a także od czynników zewnętrznych i wewnętrznych24

takich jak zmęczenie czy stres. Drżenie pozycyjne jest wywoływane ustawieniemkończyn, powodującym napinanie się pewnych grup mięśniowych.Może mieć charakter fizjologiczny, zwłaszcza u ludzi starszych lub w przypadkuniewygodnej pozycji – głównie kończyn – występować jako tzw. drżeniepozycyjne fizjologiczne (u sportowców bywa obiektem odrębnych badań).Jest także typowe dla choroby Parkinsona i innych choróbzwyrodnieniowych. Występuje jednak również w przypadku zaburzeń o zupełnieodmiennej etiologii, jak alkoholowe zaburzenie pracy wątroby czynadczynność tarczycy. Drżenie zamiarowe jest związane z wykonywaniemruchów dowolnych. Odznacza się niską częstotliwością (3 – 5 Hz) oraz narastającąw czasie amplitudą. Jest wyraźniejsze w bliskości osi ciała. Opróczchoroby Parkinsona może wskazywać na wrodzone procesy zwyrodnieniowe,zatrucia metaboliczne, zaburzenia funkcji wątroby i nerek, stwardnienierozsiane.Rys. 7. Sfygmograf Petersena oraz tambur EschneraZe względu na obiektywny, tj. mierzalny, charakter drżeń próby ichpomiaru miały miejsce już w XIX wieku [15]. Mimo niezbyt wyszukanej technikiprace takich uczonych jak Charcot i Vulpian we Francji czy Petersen,Dana i Eschner w Stanach Zjednoczonych pozwoliły na realizację pierwszychbadań mierzalnych charakterystyk drżeń. Aparatami, stosowanymipierwotnie w innych badaniach, a następnie do celu pomiarów drżeń byłysfygmograf oraz tambur (rys. 7). Pierwszy z nich działał na zasadzie mechanicznej,drugi – pneumatycznej. Rozwój techniki spowodował, że obecniezostały one zastąpione przez nowocześniejsze systemy elektroniczne,w pełni skomputeryzowane.Równolegle z pomiarami drżenia przeprowadza się także badania fizjologicznechorych za pomocą testu Webstera. Składa się on z oceny10 parametrów fizjologicznych, np. trudności z poruszaniem się czy z mówieniem.Stosuje się przy tym czterostopniową całkowitoliczbową skalę porządkową,od 0 (brak objawów negatywnych) do 3 (bardzo duże ich nasilenie).Wynik testu jest sumą tych dziesięciu ocen. Ponieważ drżeniepowiązane jest z wynikiem testu Webstera (im większe drżenia tym gorsze25

samopoczucie badanego, a więc wyższy wynik testu), dlatego też test tenwykonuje się kilka minut po pomiarze drżenia [16].Poprawa stanu pacjentów powinna się zatem wyrażać zarówno w poprawieparametrów fizjologicznych mierzonych testem Webstera jaki zmniejszoną mocą drżenia. W trakcie badań, prowadzonych w ramach wieloośrodkowegozespołu badawczego podjęliśmy próbę powiązania wymienionychwyżej płaszczyzn. Wykonywano równocześnie ilościowe badaniastanu fizycznego pacjenta: klinicznie oceny drżenia, parametrów chemicznych:stężenie L-dopy w surowicy i pomiaru CPA oraz parametrów fizjologicznych(trudności w wykonywaniu podstawowych czynności, objawy patologicznefunkcjonowania organizmu itp.). Pomiary w zakresie wymienionychwskaźników były wykonywane równolegle (rys. 8). Pozwoliło to określić korelacjemiedzy nimi. Wyniki eksperymentalnych badań dowodzą, że występujeefekt przesunięcia w czasie maksymalnego zmniejszenia mocy drżeniaw odniesieniu do czasu uzyskania maksymalnego stężenia L-dopy w surowicy.Przesunięcie to wynika z faktu metabolizmu (absorbcji w układzie trawiennym,przekraczanie bariery krew- mózg i jej konwersji do dopaminy)L-dopy i upływu czasu, po którym L-dopa wywiera swój terapeutyczny efekt(rys. 2). W przypadku korelacji między testem Webstera, mocą drżeniai CPA badania wykazały, że podobnie jak w przypadku L-dopy występujeefekt przesunięcia między osiąganym maksymalnym CPA a poprawą parametrówfizjologicznych i mocą drżenia. Przesunięcie to spowodowane jesttakże metabolizmem L-dopy. Uzyskanie efektu terapeutycznego w postaciuzupełnienia deficytu dopaminy, poprawy samopoczucia pacjentów i zmniejszeniemocy drżenia jest wynikiem działania farmakologicznego L-dopyi wymaga upływu czasu. Nie stwierdzono natomiast korelacji pomiędzy CPA,a pozostałymi parametrami. Brak korelacji wynika z braku zależności pomiędzyzmianami CPA, a stężeniem L-dopy w surowicy.c L-dopy [μM]0,60,50,40,30,20,100 1 2 3 4 5czas od podania L-dopy [h]0,00040,00030,00020,00010moc drżenia [W]Rys. 8. Dynamika zmian stężenia L-dopy i mocy drżenia u pacjentów z chorobą Parkinsona26

CPA SUROWICY KRWI PACJENTÓW Z CHOROBĄ PARKINSONACałkowity Potencjał Antyoksydacyjny (CPA) jest miarą zdolności antyoksydacyjnychpróbek biologicznych, w szczególności krwi. W literaturze[17] można znaleźć opisy oznaczania rodników hydroksylowych metodą pułapkispinowej polegającej na wprowadzeniu do materiału biologicznegowzględnie nietoksycznych związków aromatycznych i oznaczania produktówich reakcji z rodnikiem. Wygenerowane, w reakcji Fentona, rodniki hydroksylowereagują zarówno ze związkami obecnymi we krwi jak i detektorem. Wysokośćpiku chromatograficznego produktu reakcji detektora z rodnikiem zależyod ilości antyoksydantów obecnych w badanym materiale i ichreaktywności. Miarą CPA jest zmniejszenie się wysokości tego piku podwpływem próbki. W przypadku surowicy krwi parkinsoników obserwowanoefekt odwrotny, wzrost wysokości tego piku (rys. 9). Uzyskane wyniki sugerują,że surowica posiada właściwości prooksydacyjne w stosunku do rodnikówhydroksylowych, czyli generuje rodniki. Największym CPP (CałkowityPotencjał Prooksydacyjny) cechowała się surowica pobrana od pacjentówpo godzinie od podania L-dopy czyli w czasie gdy stężenie L-dopy w surowicyu pacjentów było największe (rys. 2). Prawdopodobnie istnieje kilka mechanizmóww wyniku których powstaje zwiększona ilość wolnych rodników.W surowicy występuje szereg niskocząsteczkowych antyoksydantów (np.kwas askorbinowy), które z jednej strony zmiatają wolne rodniki, z drugiejzaś mogą redukować żelazo z +3 na +2 stopień utlenienia, dzięki czemu zapewnionyjest stały dopływ żelaza(II) (reakcja Fentona) i wzrost stężeniarodników. Powstałe w reakcji Fentona Fe(III) jest utleniaczem, mogącymzwiększać CPP. Podobnie zachowują się obecne w surowicy aminy katecholowe.Utlenianie ich prowadzi do powstania semichinonów, rodnikówperoksylowych i anionorodnika ponadtlenkowego.-0,1czas [h]0 1 2 3 5CPA[min]-0,3-0,5-0,7*Rys. 9. CPA surowicy parkinsoników, leczonych substytucyjnie L-dopą, w stosunku do rodnikówhydroksylowych. Wykres przedstawia wartości średnie z pięciu pomiarów w trzech powtórzeniach± błąd standardowy (SEM), * p

W warunkach fizjologicznych żelazo i miedź występujące w surowicyzwiązane są z białkami takimi jak celuroplazmina czy transferryna. W wynikuprzebiegu procesów patologicznych jony tych metali zostają oddzielone odbiałek [17] i tym samym w wyniku reakcji Fentona i Habera – Weissa generowaćrodniki hydroksylowe. Istnieją sugestie, że stężnie rodników hydroksylowychw surowicy pacjentów z chorobą Parkinsona jest znacznie wyższyniż u zdrowych ludzi. Prooksydacyjne właściwości surowicy pacjentów z chorobaParkinsona mogą mieć także inne podłoże. Sugeruje się [18], że obniżonestężenia ubichinonu, α-tokoferolu, askorbinianu i glutationu przyczyniasię do pogłębienia istniejącego już stresu oksydacyjnego u chorych w wynikuzaburzeń równowagi pro- i antyoksydacyjnej. Dodatkowo sam metabolizmL-dopy przez enzym MAO-B prowadzi także do zwiększonej generacjireaktywnych form tlenu. Zwiększoną jej autooksydację w surowicy zaobserwowanou pacjentów u których stosowano monoterapię L-dopą, w stosunkudo zdrowych ludzi i pacjentów u których L-dopa nie była zastosowana.Prawdopodobnie zwiększone stężenie L-dopy w surowicy było przyczynąwzmożonej jej autooksydacji, podczas której generowane są wolne rodniki.Prooksydacyjne właściwości mogą wynikać także z obecności w surowicyniezidentyfikowanych jeszcze prooksydantów generujących w pośredni sposóbrodniki hydroksylowe [18-20]. Rolę nadmienionego, niezidentyfikowanegooksydanta może pełnić żelazo lub miedź.CPA[μMTroloks]400300200100* *#01 2 3 4 5czas [h]Rys. 10. CPA surowicy parkinsoników, leczonych substytucyjnie L-dopą, w stosunku do rodnikówperoksylowych. .* p

mo wyższych stężeń w surowicy enzymów antyoksydacyjnych (SOD, katalaza)zaobserwowano wzrost stężenia produktów reakcji wolnorodnikowych,MDA/TBARS, i spadek wartości CPA. Potwierdza to hipotezę, że u pacjentówz chorobami neurodegeneracyjnymi deficyt enzymów zmiatających wolnerodniki w mózgu jest kompensowany zwiększonymi ich stężeniami w surowicy.Oznacza to, że u chorych system antyoksydacyjny nie działa taksprawnie jak u zdrowych ludzi, a zwiększone stężenia enzymów w surowicysą jednym z etapów obrony organizmu przed powstającym stresem oksydacyjnymw mózgu. W wyniku wzmożonego stresu oksydacyjnego u chorychpo pewnym czasie powstają mechanizmy adaptacyjne przeciwdziałającenadmiernemu powstawaniu rodników.Reasumując, CPA, odniesione do rodników peroksylowych (wyznaczonytradycyjną metodą fotometryczną), pacjentów z chorobą Parkinsonajest mniejszy niż u osób zdrowych. Z drugiej strony wyznaczony chromatograficznieCPA odniesiony do rodników hydroksylowych jest większy od grupykontrolnej (podobny efekt zaobserwowano w stosunku do tlenku azotu).Oznacza to, że pomiary chromatograficzne dostarczają dodatkowych, istotnychinformacji, pozwalających lepiej zrozumieć stres oksydacyjny, tym bardziej,że odnoszą się one do najbardziej reaktywnego rodnika hydroksylowego.CPA odniesione do rodników peroksylowych zmieniało się (rys. 10)wprost proporcjonalnie do zmian karbidopy w surowicy (rys. 3). CPA odniesionedo rodników hydroksylowych zmieniało się (rys. 9) odwrotnie proporcjonalniedo zmian L-dopy w surowicy (rys. 2).L-dopakarbidopakarbidowabiałkaantyoksydantytycałkowity CPACPAczas[h]400350300250200150100500Rys. 11. CPA surowicy, obrazujące wpływ poszczególnych składnikówPomiary chromatograficzne przydatne były również w interpretacjizmian wyznaczanego fotometrycznie CPA odniesionego do rodników peroksylowych(rys. 11). Pozwoliły one na wyznaczenie stężeń leków we krwi pacjentów.Po przemnożeniu tych stężeń przez odpowiadające im CPA można29

yło wyznaczyć udział składników surowicy w jej CPA (rys. 11). Okazało się,że maksymalne stężenie L-dopy w surowicy było zbyt niskie, aby mogłoznacząco wpływać na zmiany CPA. Prawdopodobnie L-dopa wykazuje tylkoefekt farmakologiczny, natomiast wpływ jej na zmiany CPA jest nieznaczny.Największy udział w CPA mają antyoksydanty niskocząsteczkowe (w tymkwas moczowy). CPA chorych był niższy od ludzi zdrowych głównie z powoduniższego CPA białek (rys. 12). Zmiany CPA skorelowane są ze zmianamistężeń L-dopy i tremoru (rys. 13).CPA [μ MTroloks]6004002000CPA całkowityantyoksydantybiałkachorzyzdrowiCPARys. 12. Porównanie udziału antyoksydantów i białek w całkowitym CPA, odniesionym do rodnikówperoksylowych, u ludzi zdrowych i parkinsoników leczonych substytucyjnie L-dopą, przedpodaniem lekupacjenci38015CPA [μM[ MTroloks]]moc drżenia [μM]moc drżenia [ W]350320290260141312Nw2300 1 2 3 4 5czas od podania L-dopy [h]11Rys. 13. Dynamika zmian CPA (•), wartości punktów w skali Webstera (•), mocy drżenia (▲)30

LITERATURA1. C. Courderot-masuyer, F. Dallozo, V. Maupoil, L. Rochette, Fundam.Clin. Pharmacol., 13(1999)535.2. F. Visioli, C. Galli, Anal. Biochem., 249(1997)244.3. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal. (Warszawa), 47(2002)399.4. D.R. Dufield, G.S. Wilson, R.S. Glass, C. Schoneich, J. Pharm. Sci.,93(2004)1122.5. T.W. Yu, C.N. Ong, Anal. Biochem., 275(1999)217.6. B.K. Głód, K. Stańczyk, Acta Chromatogr., 15(2005)276.7. T. Yakabe, H. Yoshida, H. Nohta, M. Yamaguchi, Anal. Sci.,18(2002)1375.8. K. Stańczyk, praca mag., SGGW 2004.9. G. Bartosz, M. Bartosz, Acta Biochim. Pol., 46(1999)23.10. I.N. Popov, G. Lewin, Free Radic. Biol. Med., 17(1991)267.11. B.A. Collingham, M.A. Barrand, J. Pharm. Pharmacol., 28(1976)356.12. U.S von Euler, Pharmacol. Rev., 6(1954)15.13. G.R. Kelman Applied Cardivascular Physiology, Butterworths, London1971.14. M. Jouvet, Science, 163(1969)32.15. A.M. Krustulovic, The current state of the art. in the analysis of catecholamines,Chemistry Deparment Manhattanville College Purchase, NewYork 1999.16. Y. Kondo, M. Ohnishi, M. Kawaguchi, J. Agr. Ford. Chem., 47(1999)1781.17. M.A. Raggi, V. Pucci, C. Sabbioni, S. Furlanetto, G. Gerra, J. Sep. Sci.,24(2001)275.18. B.K. Głód, P.R. Haddad, Czapski G.A., Trends Anal. Chem., 19(2000)492--497.19. P. Kumarathasan, R. Vincent, J. Chromatogr. A, 987(2003)349.20. P.T. Kissinger, C.S. Bruntlett, R.E. Shoup, Life Sci., 28(1981)455.21. H. Wang, J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)612.31

Monika ASZTEMBORSKAInstytut Chemii Fizycznej PANul. Kasprzaka 44/52, 01-224 WarszawaZASTOSOWANIE METOD SEPARACYJNYCHW BADANIU ENANCJOMERYZACJIWPROWADZENIEZwiązki chiralne są w naturze bardzo powszechne. Najbardziej istotnedla życia biopolimery tj. białka i DNA są zbudowane z chiralnych aminokwasówi cukrów.Wiele innych substancji należących do grupy flawonoidów, alkaloidów,terpenoidów i steroidów jest związkami optycznie czynnymi. Co ciekawszewiększość z tych naturalnych substancji jest biosyntezowana tylko w postacijednej z dwu możliwych form. O takich związkach mówi się, że są homochiralne.Homochiralne są peptydy i DNA zbudowane z L-aminokwasówi D-cukrów. Flawanony syntezowane w świecie roślinnym są lewoskrętne.Taki wysoki stopień homochiralności w żywych organizmach jest entropowoniekorzystny. Proces racemizacji homochiralnej substancji prowadzido wzrostu entropii systemu. Tak więc wraz ze śmiercią organizmu homochiralnesubstancje powinny racemizować powodując wzrost nieuporządkowaniasystemu.W zależności od struktury chiralnej biomolekuły proces racemizacjimoże być bardzo szybki jak w przypadku atropiny [1] lub wystarczająco powolnyjak w przypadku kwasu aspartamowego [2] aby być użytecznymw wyznaczaniu wieku organizmów. Czasami jest też tak, że cząsteczka zostajerozłożona lub zdegradowana zanim ulegnie racemizacji.Innym istotnym problemem związanym ze związkami chiralnymi jestfakt, że dwa enancjomery chiralnej substancji chociaż tak podobne podwzględem budowy chemicznej mogą mieć drastycznie różną aktywność biologiczną.Nie jest to szczególnie dziwne gdy uświadomimy sobie, że organizmyżywe zbudowane z chiralnych białek i cukrów stanowią chiralne środowiskorozróżniające dwa enancjomery tej samej substancji. Szczególnie istotne jestto w przypadku leków. Znanych jest wiele chiralnych substancji farmakologicznychz których tylko jeden z enancjomerów ma właściwości lecznicze,drugi w najlepszym przypadku może być nieaktywny a w najgorszym może sięokazać toksyczny. Np. atropina jest komercyjnie dostępna jako mieszaninaracemiczna (DL-hioscyamina) jednakże tylko L-hioscyamina ma aktywnośćfarmakologiczną. D-hioscyamina jest nieefektywna i powstaje jako produkt racemizacjipodczas ekstrakcji L-hioscyaminy z surowców roślinnych.Znajomość stabilności konfiguracyjnej substancji staje się więc koniecznościągdy chodzi o rejestrację chiralnych leków. Instytucje rządowe33

dopuszczające leki jak np. FDA nie tylko kontrolują sprzedaż leków racemicznychale wymagają jednoznacznych danych na temat konfiguracyjnejstabilności czystych enancjomerów. W konsekwencji producenci leków sązobowiązani do oszacowania stereochemicznej trwałości enancjomerówi zbadania ich potencjalnej podatności na konwersję.Z drugiej strony znajomość szybkości reakcji enancjomeryzacji substancjiwystępujących naturalnie może być wykorzystana praktycznie do sprawdzaniajakości, stopnia świeżości i zafałszowań produktów spożywczych.Stopień racemizacji aminokwasów w białkach zębów (głównie jest tokwas aspartamowy) jest np. wykorzystywany do oznaczenia wieku denataw naukach sądowych [3, 4]. Jest on również wykorzystywany w oznaczaniuwieku próbek archeologicznych i geochemicznych [5, 6]. Ma również zastosowaniew paleotermometrii [7].Znajomość barier racemizacji substancji chiralnych może więc byćistotna z punktu widzenia zastosowań praktycznych.DEFINICJEPrzez enancjomeryzację rozumiemy mikroskopowy proces odwracalnejinterkonwersji enancjomerów.Rk enantk enantRacemizacja to z kolei makroskopowy proces nieodwracalnej transformacjienancjomerycznie wzbogaconej lub czystej próbki do mieszaniny racemicznej.SRk racrack racSPrzy czym stała szybkości racemizacji jest dwukrotnie większa od stałejszybkości enancjomeryzacji (k enant =2k rac ). Można to wytłumaczyć w ten sposób,że na każdą cząsteczkę (-) utworzoną z cząsteczki (+) dwie molekułyulegają racemizacji, jako, że utworzona w ten sposób cząsteczka (-) równoważyskręcalność optyczną innej nie przekształconej cząsteczki (+).Diastereomeryzacja to z kolei molekularny proces transformacji jednego diastereomeruw drugi, przy czym stałe szybkości diastereomeryzacji nie sąsobie równe (k diastAB ≠k diastBA )Diast Ak diastABk diastBADiast BDo badania kinetyki enancjomeryzacji i diastereomeryzacji substancjimożna stosować wiele różnych metod m.in. polarymetria, dichroizm kołowy34

(CD), dyspersja zdolności skręcającej (ORD), protonowy rezonans magnetyczny1 H-NMR [8].Wśród tych metod istotne miejsce zajmują metody chromatograficzne(wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia gazowa) oraz metodyelektroforezy kapilarnej, które ogólnie można nazwać analitycznymi metodamiseparacyjnymi. Ze względu na pewne uproszczenia czasami obietechniki będą określane jako techniki chromatograficzne, chociaż metodaelektroforezy kapilarnej zasadniczo zalicza się do technik elektromigracyjnych.Metody separacyjne służące do badania barier enancjomeryzcji możnaw zasadzie podzielić na dynamiczne metody separacyjne [9-13] i metodyseparacyjne z zatrzymanym przepływem (stopped-flow) [14-16].Wykorzystanie metod separacyjnych do wyznaczania barier enancjomeryzacjilabilnych enancjomerów zapoczątkowano w latach 80-tych ubiegłegowieku wraz z rozwojem enancjoselektywnych metod separacyjnych.Oba rodzaje metod zostały opisane w pracach przeglądowych [17, 18].Przy pomocy DHPLC można mierzyć bariery enancjomeryzacji w granicach65-105 kJ/mol, DGC 70-130 kJ/mol, natomiast przy pomocySFMDGC 70-180 kJ/mol a SFMDCE 100-130 kJ/mol.DYNAMICZNE METODY SEPARACYJNEChromatografia dynamiczna jest definiowana jako metoda służąca dobadania procesów odwracalnej interkonwersji zachodzących w czasie chromatografowania.Została ona wykorzystana do wyznaczania barier enancjomeryzacji.W chromatografii enancjoselektywnej szybka interkonwersja enancjomerówpowoduje tworzenie się plateau pomiędzy rozdzielonymi pikami.Przy dostatecznie szybkiej reakcji obserwuje się nakładanie się pików.20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5 29.0MinutesRys. 1. Przykładowy chromatogram z widocznym plateau tworzącym się pomiędzy rozdzielanymienancjomerami35

W przypadku przeprowadzania analizy enancjoselektywnej zjawiskate są niepożądane i stanowią komplikacje, które likwiduje się poprzez dodatekmodyfikatora organicznego bądź zmianę chiralnej fazy stacjonarnej.W dynamicznej chromatografii natomiast charakterystyczny profil piku nietylko stanowi źródło diagnostyczne zachodzącego w kolumnie procesu interkonwersjienancjomerów ale jest warunkiem do ilościowego wyznaczeniabariery enancjomeryzacji.Stałe szybkości oraz bariery enancjomeryzacji wyznacza się poprzezporównanie symulowanych komputerowo profilów elucji z uzyskanymi eksperymentalniechromatogramami [19, 20].Rys. 2. Schemat równowag zachodzących w kolumnie w czasie procesu chromatograficznegoOdwracalna pseudo-pierwszorzędowa reakcja enancjomeryzacji nakolumnie przebiega z różnymi stałymi szybkości k s w fazie stacjonarnej i k mw fazie ruchomej. Dla enancjomerów stałe szybkości reakcji enancjomeryzacjiw achiralnej fazie ruchomej są jednakowe dla obu enancjomerów.W chiralnej fazie stacjonarnej sytuacja się zmienia stałe szybkości enancjomeryzacjisą różne dla obu enancjomerów z uwagi na tworzenie się diasteromerycznychkompleksów pomiędzy rozdzielanymi enancjomerami i chiralnymselektorem. Nie obserwujemy jednak w rezultacie enancjomerycznegowzbogacenia próbki gdyż enancjomer który reaguje wolniej przebywa dłużejw fazie stacjonarnej.K S i K R są współczynnikami podziału enancjomerów R i S pomiędzyfazę ruchomą i stacjonarną.Z danych chromatograficznych możemy wyliczyć pozorne stałe szybkościenancjomeryzacji, które są średnimi ważonymi stałych szybkości w faziestacjonarnej i ruchomej. Stałe szybkości w fazie ruchomej można wyznaczyćniezależnie za pomocą innych metod.Dynamiczna chromatografia gazowa [21-23], dynamiczna chromatografiacieczowa [24-27], dynamiczna elektroforeza kapilarna oraz micelarnaelektrokinetyczna chromatografia cieczowa [28, 29] jak również dynamicznachromatografia w stanie nadkrytycznym [30] zostały wykorzystane do wyznaczaniabarier enancjomeryzacji wielu stereolabilnych związków.36

METODY SEPARACYJNE Z ZATRZYMANYM PRZEPŁYWEMW metodach chromatograficznych z zatrzymanym przepływem racemicznamieszanina jest wstępnie rozdzielana na kolumnie z fazą chiralnąw temperaturze, w której nie obserwuje się procesu enancjomeryzacji.W momencie gdy wiadomo, że enancjomery zostały rozdzielone zostaje zatrzymanyprzepływ fazy ruchomej i kolumna jest ogrzewana w określonejtemperaturze przez określony czas. Następuje wtedy enancjomeryzacjarozdzielonych pików w środowisku chiralnym. Następnie schładza się kolumnędo temperatury analizy, przywraca się przepływ fazy ruchomej i kontynuujesię analizę. Na uzyskanym chromatogramie oprócz rozdzielonychenancjomerów pojawiają się dodatkowe piki pochodzące z ulegającychenancjomeryzacji rozdzielonych związków.353025RS[mV]2015105SR00 10 20 30 40 50[min]Rys. 3. Przykładowy chromatogram rozdzielania enancjomerów otrzymany za pomocą chromatografiiz zatrzymanym przepływemW metodach chromatografii wielowymiarowej z zatrzymanym przepływem,racemiczna mieszanina jest wstępnie rozdzielana na chiralnej faziestacjonarnej, następnie jeden z enancjomerów jest kierowany do achiralnejkolumny reakcyjnej gdzie podczas podgrzewania następuje enancjomeryzacjaw achiralnym środowisku. Potem zenancjomeryzowana próbka jest kierowanana drugą chiralną kolumnę w celu rozdzielana jej na enancjomery.Zaletą tej metody jest to, że enancjomeryzacja zachodzi w warunkach achiralnegootoczenia a nie w środowisku chiralnym.37

pompaHPLCkolumna chiralnakolumnareakcyjnadetektor80.0060.00[mV]40.00pompaHPLC20.000.00kolumnareakcyjna[mV]1086420-20.00 5.00 10.00 15.00[m in]kolumna chiralna0 5 10 15 20 25[m in ]detektorRys. 4. Schemat wielowymiarowej chromatografii cieczowej z zatrzymanym przepływemParametry kinetyczne reakcji enancjomeryzacji i diastereomeryzacjiniestabilnych stereoizomerów zostały również wyznaczone za pomocą metodseparacyjnych z zatrzymanym przepływem, m. in. chromatografii cieczowejz zatrzymanym przepływem [31] oraz dwuwymiarowej chromatografiigazowej z zatrzymanym przepływem [32].PODSUMOWANIEPodsumowując można powiedzieć, że obydwie metody znajdują zastosowaniedo wyznaczania barier enancjomeryzacji. Pierwsza z nich toznaczy chromatografia dynamiczna wymaga bardziej skomplikowanych obróbkimatematycznej i symulacji komputerowej za to nie wymaga dodatkowegosprzętu chromatograficznego. W przypadku metody z zatrzymanymprzepływem wymagana jest bardziej skomplikowana aparatura za to sameobliczenia są proste.Obie metody posiadają wiele zalet:• nie wymagają substancji optycznie czystych lub wzbogaconych, racematwystarcza do badań,• wymagana jest bardzo mała ilość próbki ok. 10 -8 g,• zanieczyszczenia są na ogół oddzielone od próbki na kolumniew związku z tym nie przeszkadzają,• w przypadku GC mogą być badane próbki gazowe lub też bardzolotne,38

• pomiary mogą być prowadzone w szerokim zakresie dobrze kontrolowanejtemperatury,• metody są szybkie, proste a wyniki są powtarzalne.Jednak metody chromatograficzne nie składają się z samych zalet.Podstawową wadą tych metod jest to, że konieczne jest do ich zastosowaniauzyskanie bardzo dobrego rozdzielenia enancjomerów co oczywiście w wieluprzypadkach jest sprawą trudną. Tam gdzie rozdzielenie enancjomerówjest wystarczające do określenia czystości optycznej niekoniecznie jest wystarczającedo wyznaczenia bariery enancjomeryzacji.LITERATURA1. A. Huhtikangas, T. Lehtola, R. Virtanen, P. Peura, Finn. Chem. Lett.,5(1982)63.2. S. Ritz, H. Schütz, J. Forensic Sci., 38(1993)633.3. S. Ohtani, K. Yamamoto, J. Forensic Sci., 36(1991)792.4. E. Waite, M. Collins, S. Ritz-Time, H. Schutz, C. Cattaneo, H. Borrman,Forensic Sci. Int., 103(1999)113.5. G. Goodfriend, M. Kashgarian, M. Harasevych, Cosmochim. Acta,59(1995)1125.6. M. Collins, E. Waite, A. van Duin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B,354(1999)51.7. G. Miller, J. Magee, A. Jull, Nature, 385(1997)241.8. M. Reist, B. Testa, P.-A. Carrupt, Enantiomer, 2(1997)147.9. J. Veciana, M. Crespo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30(1991)74.10. F. Gasparrini, D. Misiti, M. Pierini, C. Villani, Tetrahedron Assym.,8(1997)2069.11. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Org. Chem., 64(1999)1483.12. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Anal. Chem., 72(2000)2758.13. F. Gasparrini, M. Pierini, C. Villani, J. Org. Chem., 68(2003)3173.14. K. Rossen, J. Sager, Y. Sun, Chem. Commun., 1(1998)115.15. S. Reich, O. Trapp, V. Schurig, J. Chromatogr. A, 892(2000)487.16. O. Trapp, G. Schoetz, V. Schurig, J. Pharm. Biomed. Anal.,27(2002)497.17. J. Krupcik, P. Oswald, P. Majek, P. Sandra, D.W. Armstrong, J. Chromatogr.A, 1000(2003)779.18. Ch. Wolf, Chem. Soc. Rev., 34(2005)595.19. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529.20. O. Trapp, V. Schurig, Chirality, 14(2002)465.21. W. Bürkle, H. Karfunkel, V. Schurig, J. Chromatogr., 288(1984)1.22. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529.23. D. Hochmuth, W. König, Tetrahedron Asymmetry, 10(1999)1089.24. T. Nishikawa, Y. Hayashi, S. Suzuki, H, Kubo, H. Ohtani, J. Chromatogr.A, 767(1997)93.39

25. K. Lorenz, E. Yashima, Y. Okamoto, Angew. Chem. Int. Ed.,37(1998)1922.26. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 2(1999)1587.27. J. Oxelbark, S. Claeson, S. Allenmark, Enantiomer, 5(2000)413.28. D. Wistuba, O Trapp, N. Gel-Moreto, R. Galensa, V. Schurig, Anal.Chem., 78(2006)3424.29. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Enantiomer, 5(2000)391.30. Ch. Wolf, W. Pirkle, Ch. Welch, D. Hochmuth, W.A. König, G.-L. Chee,J. Charlton, J. Org. Chem., 62(1997)5208.31. M. Asztemborska, J. Żukowski, J. Chromatogr. A, 1134(2006)95.32. Ph. Marriott, K. Aryusuk, R. Shellie, D. Ryan, K. Krisnangkura, V. Schurig,O. Trapp, J. Chromatogr. A, 1033(2004)135.40

Bronisław K. GŁÓD 1 , Paweł PISZCZ 1 , Iwona KIERSZTYN 1 ,Anna LAMERT 1 , Paweł ZARZYCKI 21)Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaskaul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlcee-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.pl2)Zakład Toksykologii i Bioanalityki, Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,Politechnika Koszalińska, ul. Śniadeckich 2, 75-453 KoszalinZASTOSOWANIE HPLC DO OZNACZANIAWOLNYCH RODNIKÓW, ANTYOKSYDANTÓWORAZ CAŁKOWITEGO POTENCJAŁUANTYOKSYDACYJNEGOW pracy przedstawiono podstawowe informacje o wolnych rodnikach, ich wytwarzanie,oddziaływanie z podstawowymi składnikami organizmów żywych, udział w wielustanach chorobowych, a także starzeniu organizmu. Ponadto omówiono metodyoznaczania wolnych rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnegoza pomocą HPLC.INFORMACJE PODSTAWOWETlen jest pierwiastkiem bardzo rozpowszechnionym na Ziemi. Odpowiadaza mniej więcej jedną czwartą jej masy. W dolnych warstwach atmosferyobjętościowa zawartość tlenu wynosi 21%. Pierwotna atmosfera ziemskabyła mieszaniną gazów o właściwościach redukujących. Wolny tlenw postaci cząsteczkowej pojawił się w niej wraz z rozwojem pierwszych organizmówfotosyntezujących, ok. 2 miliardów lat temu. Rozpuszczając sięw wodzie był on niezbędnym czynnikiem powstania i rozwoju organizmówwyższych. Znacznie wyższa niż w wodzie jest jego rozpuszczalność w rozpuszczalnikachorganicznych, co wpływa na lokalizację rodników tlenowychw hydrofobowych częściach błon biologicznych. W organizmach aerobowychznaczna część pobieranego tlenu wykorzystywana jest jako akceptorelektronów. Takie enzymy jak dioksygenaza tryptofanowa i oksydaza ksantynowakatalizują reakcje utleniania polegające na przenoszeniu pojedynczychelektronów z substratów na cząsteczkę tlenu. W trakcie redukcji tlenuwytwarzane są tzw. reaktywne formy tlenu (ang. ROS - reactive oxygen species).Jest to pojecie szersze, gdyż oprócz wolnych rodników zalicza się donich m.in. wzbudzony tlen singletowy i nadtlenek wodoru. Wolne rodniki zaśsą to atomy, cząsteczki (lub ich fragmenty) bądź też jony posiadające niesparowaneelektrony, nadające im własności paramagnetyczne.41

Tlen, chociaż jest konieczny do życia, paradoksalnie ma on jednocześniedziałanie toksyczne dla organizmów żywych [1, 2]. Przykładowo, oddychanieczystym tlenem przez dłużej niż 48 godzin prowadzi do śmierci.Olbrzymia jego większość wykorzystywana jest jako akceptor elektronóww komórkowych procesach energetycznych. Tym niemniej, w trakcie redukcji,niewielka część tlenu przekształcana jest w reaktywne formy tlenu, doktórych zalicza się również rodniki tlenowe. Ocenia się, że do ROS przekształcanejest 1÷4% tlenu zużywanego przez organizm człowieka [3]. Przydziennym jego zużyciu wynoszącym ok. 10 l oznacza to wytworzenie ok.4,5÷18 mmoli rodników. Jest to ilość znaczna, zwłaszcza, jeśli uwzględni sięfakt, że wiele uszkodzeń wolnorodnikowych ma tendencję do gromadzeniasię w organizmach żywych. W żywym organizmie wolne rodniki są wytwarzanew warunkach zarówno fizjologicznych jak i patologicznych. W warunkachfizjologicznych nie gromadzą się w tkankach gdyż są stale unieczynniane,„zmiatane” przez miejscowe mechanizmy antyoksydacyjne.W patologicznych mogą prowadzić do degeneracji i obumierania komórek [1].Kolejnym paradoksem tlenowym jest fakt, że chociaż obecnie powszechniewiadomo, że tlen w nadmiarze jest szkodliwy to jednakże nie maspójnej teorii tłumaczącej, który z rodników jest za tę toksyczność odpowiedzialny[2]. Wspomniany, paradoks tlenowy na tym się nie kończy. Okazałosię, że niektóre wolne rodniki pełnią istotne funkcje fizjologiczne, np. inhibitorówniektórych enzymów [4]. Do tego można dodać dalsze paradoksy. Niejasnyjest wpływ rodników na przebieg niektórych zmian patologicznych, jakmiażdżycy [5] czy choroby Alzheimera [6]. Często występują nawet kłopotyz odpowiedzią na pytanie czy rodniki są przyczyną czy skutkiem owychzmian. Jeszcze większe problemy sprawia odpowiedź na pytanie czy podawanieantyoksydantów zapobiega tym zmianom [7, 8]. Wynika z tego, żechoć jest to tematyka bardzo szeroko ostatnio dyskutowana to jej podstawoweproblemy są wciąż nierozwiązane.WYTWARZANIE RODNIKÓWWystępowanie reaktywnych form tlenu jest charakterystyczne nie tylkodla organizmów żywych. W warstwach przypowierzchniowych naturalnychzbiorników wodnych ich stężenie jest znacznie większe niż we wnętrzu organizmówżywych, gdzie mogą się przedostawać. Najprostszym zaś rodnikiem(dokładnie – birodnikiem w stanie trypletowym) jest tlen atmosferycznyktórym oddychamy.Wolne rodniki mogą być indukowane in vitro i in vivo przez różneczynniki: promieniowanie jonizujące, ultrafioletowe, widzialne i podczerwoneoraz wszelkie reakcje utleniania i redukcji. Do reakcji tych zaliczyć możnaautooksydację tioli, katecholamin, flawin i hydrochinonów oraz niektóre reakcjeenzymatyczne, np. oksydazy ksantynowej, dysmutazy ponadtlenkowejstymulującej mitochondrialny system transportu elektronów, oksydazy cytochromowejP-450 i b-5 systemu mikrosomalnego.42

Rys. 1. Schemat transportu elektronów, tworzenia ATP oraz utlenianie zredukowanegokoenzymu Q wraz z towarzyszącą mu redukcją cytochromu bRodniki mogą również generować pobudzone komórki fagocytujące(makrofagi, monocyty i granulocyty) podczas tzw. wybuchu oddechowego.W tym przypadku odgrywają one pozytywną rolę. Jednakże długotrwałe ichwytwarzanie (np. w przewlekłych stanach zapalnych) ma działanie kancerogenne.W błonach komórkowych tworzą się one głównie w wyniku metabolizmukwasu arachidonowego przy udziale cyklooksygenazy i lipooksygenazy.Z czynników zewnętrznych wymienić można przykładowo fenacytynę czy teżparakwat oraz cały szereg leków (haloperidol, salsolinol, cytostatyki itp.).Najważniejszym generatorem wolnych rodników wydaje się być mitochondrialnyłańcuch oddechowy (rys. 1). Należy sobie również zdać sprawę z tego,że w komórkach żywych zwierząt i roślin wolne rodniki są stale obecnejako konieczny etap przejściowy przebiegu szeregu reakcji.TLEN I PRODUKTY JEGO REDUKCJICząsteczki o spinach połówkowych opisuje statystyka Fermiego-Diraca.Zgodnie z funkcją rozkładu prawdopodobieństwo występowania elektronu(fermionu) wzrasta ze spadkiem energii nie przekraczając 1. To znaczy, żew danym stanie energetycznym określonym energią, pędem oraz spinem możeznajdować się tylko jeden elektron. Rozkład elektronów w cząsteczce tlenui produktach jego redukcji przedstawiono na rys. 2. W stanie podstawowymtlen występuje jako dwurodnik trypletowy, co tłumaczy jego względnie dużąreaktywność ale jednocześnie stosunkowo małą, jak na rodnik.43

σ2∗pπ * 2pπ 2pσ 2psingletowy O21Δ g O2singletowy O21 +ΣgO2anionorodnik.-ponadtlenkowy O 2jonnadtlenkowy O 22-tlen atomowyσ2∗sσ 2sσ1∗sσ 1sstan podstawowy3O ΣgO (tryplet)2 2ΔgΟ ΣgΟ1 1 +2 292 kJ 155 kJ3 e .−g_ e _ e _e _2 2 2 2 2Σ Ο Ο Η Ο ΟΗ Η ΟH +ΗΟ.2Rys. 2. Rozkład elektronów na orbitalach tlenu i produktach jego redukcji.- orbital molekularny, * - orbitale antywiążące, ↑↓ - spiny elektronoweW stanie wzbudzonym tlen występuje w postaci singletu. Jego stężeniew cytoplazmie jest na poziomie 10 -15 M, podczas gdy tlenu trypletowego10 -5 M. Wyróżniamy dwa stany singletowe - delta i sigma. Czas życia tlenuw stanie 1 Σg + O 2 (antyrównoległe spiny na różnych orbitalach) w roztworachwodnych wynosi 10 -11 s, zaś tlenu delta 1 ΔgO 2 – 10 -6 s. W gazach czasy tewynoszą odpowiednio 12 s i 45 min.Pierwszym produktem redukcji tlenu jest anionorodnik ponadtlenkowy(O 2 •- ) i jego zprotonowana forma – rodnik nadhydroksylowy (HO 2•). W roku1954 Gershman, Gilbert i Fridovich wysunęli hipotezę, że za toksycznośćtlenu odpowiedzialny jest właśnie anionorodnik ponadtlenkowy. Niestety,okazało się, że jest on wprawdzie bardzo reaktywny ale jednocześnie krótko-żyjącyoraz mało reaktywny w środowisku aprotycznym i w stosunku doaminokwasów i kwasów tłuszczowych. Rodnik nadhydroksylowy jest znaczniesilniejszym utleniaczem niż anionorodnik ponadtlenkowy. Sugeruje sięnawet [9], że za szkodliwe działanie tlenu i uszkadzanie błon komórkowychodpowiedzialny jest układ rodników O 2·- /HO 2·, a nie rodnik hydroksylowy.HO 2· charakteryzuje się długim czasem życia przez co może dyfundować ondo sąsiednich struktur komórkowych. Przy pH fizjologicznym 7,4 ok. 1%anionorodnika występuje w postaci zhydratowanej (pK a = 4,88). W wynikuprzebiegu reakcji dysmutacji oba te rodniki wytwarzają nadtlenek wodoru.W obecności jonów metali grup przejściowych (żelaza i miedzi) nadtlenekwodoru ulega rozpadowi z wytworzeniem reaktywnego rodnika hydroksylowego,zgodnie z reakcją opisaną po raz pierwszy w roku 1884 przezFentona:+2 + n3+(n+1) +- •(1) Fe (M ) + H O = Fe (M ) + OH + OH.22Utleniony metal może zostać następnie zredukowany, co oznacza, że pełnion rolę katalizatora:44

•−3+2+(2) Fe + O2= Fe + O2.W sumie obie reakcje przedstawia się jako reakcję Habera-Weissa (1934 r.):(3)O•-- •2+ H2O2= O2+ OH + OH .Bez katalizatora (jonów metali) reakcja (3) przebiega bardzo wolno. Znacznieprzyśpiesza ją niewielka nawet obecność żelaza na plus drugim stopniuutlenienia. Żelazo trójwartościowe również może ją katalizować gdyż jestono łatwo redukowalne w organizmie, np. w obecności kwasu askorbinowego,cysteiny lub glutationu. Przyśpieszają ją również niektóre kompleksy(EDTA, cytrynian). Kompleksy te mogą przyśpieszać jego utlenianie gdyżeliminują konieczność zmiany jego powłoki hydratacyjnej. W świetle powyższegoproblematyczne jest podawanie żelaza w postaci kompleksu z askorbinianemi EDTA, stosowane przez niektóre firmy farmaceutyczne.Powstały w reakcjach (1 - 3) rodnik hydroksylowy jest wyjątkowo reaktywny.Wchodzi on w reakcje z wieloma związkami organicznymi (addycja,substytucja wolnorodnikowa, przenoszenie elektronów). Rodnik ten jest bardzosłabym kwasem, uwalniając alkaliczny jon nadtlenkowy O - . Jego staładysocjacji porównywalna jest ze stałą nadtlenku wodoru i wynosi 11,85. Niepenetruje on jednak komórki. Reaguje tylko z cząsteczkami obecnymiw bezpośrednim ich sąsiedztwie, np. z jonem węglanowym tworząc rodnikwęglanowy będący silnym reduktorem.Bardzo intensywnie badanym ostatnio rodnikiem jest tlenek azotu.Jest to związek wyjątkowo ciekawy gdyż, z jednej strony, jest on poszukiwanymod dawna śródbłonkowym czynnikiem rozluźniającym (ang. EDRF - endothelialderived relaxing factor), neurotransmiterem i zmiataczem wolnychrodników (przez to związkiem antykancerogennym). Z drugiej strony, będącsam wolnym rodnikiem, jest on również neurotoksyczny, kancerogennyi może wytwarzać inne wolne rodniki.Tlenek azotu jest zmiataczem anionorodnika ponadtlenkowego,a w szczególności skutecznym (silniejszym niż witamina E) przeciw utleniaczemlipidów. Co ciekawe, po przejściu do nadtlenoazotynu z przeciwutleniaczastaje się on silnym utleniaczem. Nadtlenoazotyn utlenia grupy tiolowereszt tryptofanowych i metionylowych w białkach (powoduje to ich fragmentacje),indukuje powstawanie grup karbonylowych, nitruje reszty tyrozylowe,utlenia kwasy nukleinowe i lipidy. Te oddziaływania z biologicznie czynnymizwiązkami mają aspekt pozytywny, mianowicie – antykancerogenny, chociażmechanizm jego działania jest nieznany. Związany jest on m.in. z blokadąreduktazy rybonukleinowej, co uniemożliwia wytwarzanie DNA i podział komóreknowotworowych. Z drugiej strony nitrozuje on aminy drugorzędowedo toksycznych, rakotwórczych N-nitrozoamin. Tlenek azotu oddziaływujerównież z centrami Fe-S różnych białek tworząc klastery nitrozylowe. Jest oninhibitorem enzymów mitochondrialnych, akonitazy i kompleksu I (NADPH -oksydorektuza ubichinowa).45

Rozpuszczalność tlenku azotu w wodzie wynosi 1,8⋅10 -3 M, a stężeniew komórce jest rzędu 3⋅10 -6 M, okres półtrwania w wodzie od 4 min do3 godzin, we krwi 0,1 sek., a w tkankach 3 - 30 sek. W komórce wytwarzanyjest podczas utleniania (w obecności NADPH jako donora elektronów) przezsyntazę tlenku azotu (NOS), zależną od cytochromu P-450, argininy do cytrulinyi NO. Jest on następnie szybko degradowany z powodu reakcji z tlenem,dwutlenkiem azotu i anionorodnikiem ponadtlenkowym. Zmiatającanionorodnik wytwarza anion peroksyazotawy, będący silnym utleniaczemi rozpadającym się na dwa rodniki, hydroksylowy i dwutlenek azotu. Wytwarzająone z małą szybkością azotany i azotyny.Cytotoksyczność tlenku azotu wywołują anion peroksyazotawy i powstającyz jego rozpadu rodnik hydroksylowy. Oddziaływają one m.in. z lipidami,DNA i wpływają na mitochondrialne kanały wapniowe (oddziaływaniena kompleksy żelaza w błonie mitochondrialnej). Uszkodzenia DNA aktywująpoli(ADP-rybozo)polimerazę, PARP. Enzym ten odpowiedzialny jest zaenergetyczną śmierć komórki poprzez zużywanie ATP podczas naprawyuszkodzonego DNA. Jego nadprodukcja jest przyczyną śmierci neuronówpodczas zawałów naczyniowych, w chorobie Huntingtona i Alzheimera.NO jest też neurotransmiterem w obwodowym układzie nerwowym(sercowo-naczyniowym, płciowo-moczowym, oddechowym i trawiennym).Przykładowo, kontroluje on rozkurcz mięśni jelit podczas ruchów perystaltycznychi rozkurcz mięśni ciał jamistych ułatwiających napływ krwi do prąciapodczas erekcji oraz rozkurcz mięśni naczyń krwionośnych. To ostatnie powodujespadek ciśnienia krwi. Dlatego chorym na serce podawana jest nitrogliceryna,metabolizowana w organizmie do NO. eNOS z komórek śródbłonkaaktywowany jest przez kompleks Ca 2+ -kalmodulina, tworzący się po wniknięciujonów wapnia do wnętrza komórki. Otwarcie kanałów jonowych następujepo związaniu przez receptory powierzchniowe np. acetylocholiny. NO dyfundujedo wnętrza naczynia krwionośnego i jako czynnik EDRF do komórekmięśni gładkich. Uaktywnia cyklazę guanylową, cGMP, fosforylację proteintransportujących jony wapnia (spadek ich stężenia) przez kinazę białkową, coprowadzi do rozkurczu. Podobny efekt dają S-nitrozole, [Fe(CN) 5 (NO)] 2- ,[Fe 4 S 4 (NO) 7 ] - , organiczne azotyny i azotany, np. nitrogliceryna.WPŁYW WOLNYCH RODNIKÓW NA PODSTAWOWE SKŁADNIKIKOMÓREKWolne rodniki reagują w zasadzie ze wszystkimi składnikami komórek.Największe uszkodzenia powodują w lipidach, białkach i DNA. Z organellikomórkowych najbardziej narażone na atak wolnych rodników są mitochondria.Ich uszkodzenie prowadzić może nawet do śmierci komórek.Należy w tym miejscu zaznaczyć, że mimo ich negatywnego wpływuna organizmy żywe, wolne rodniki są koniecznymi etapami przejściowymiprzebiegu szeregu reakcji biochemicznych, jak też mają szereg działań pozytywnych.Przykładowo wspomnieć tu można o tym, że szereg enzymów46

eperujących DNA (polimerazy) aktywowanych jest wolnymi rodnikami, częstoindukowanych światłem. Rodniki umożliwiają również spełnianie funkcjibiologicznych cyklazie guanylynowej (receptor NO aktywujący cGMP, PKGi fosforylujący NOS), oksydazie glukozy, S-transferazie glutationu. Wolnerodniki są również stosowane w terapii nowotworów – tlenek azotu oraz wytwarzaneprzez promieniowanie rodniki hydroksylowe. Duże ilości wolnychrodników wytwarzają również pobudzone komórki fagocytujące (granulocyty,monocyty i makrofagi) w trakcie tzw. – wybuchu oddechowego.Wyjątkowo aktywnym organem, zużywającym ponad 20% dostarczanegoorganizmowi tlenu, jest mózg. Jest on również szczególnie narażonyna uszkodzenia wolnorodnikowe gdyż w dużym stężeniu występują w nimwielonienasycone kwasy (PUFA) i żelazo, a w małym - antyutleniacze. Maon ponadto małe możliwości wiązania metali i nie posiada możliwości regeneracjineuronów. Ich nadmierne stężenie wpływa na starzenie się mózgu,jest przejawem choroby Alzheimer’a i syndromu Downa.Wolne rodniki odgrywają też ważną rolę w wielu teoriach procesu starzenia.Sam proces starzenia nie jest obecnie dokładnie poznany. Prawdopodobniestarzenie się związane jest w jakiś sposób ze zmianami genetycznymi.Nawet nieśmiertelne organizmy musiały umierać z przyczyn losowych.Dlatego nie przekazywały one swojemu potomstwu cech umożliwiającychzwalczanie chorób starczych. 2 000 lat temu przewidywana długość życiaczłowieka wynosiła 19 lat. Oznacza to, że geny które byłyby korzystnew wieku 50 lat nie były wówczas przekazywane. Chociaż więc starzenie niejest korzystne z punktu widzenia poszczególnej jednostki to nie było ewolucyjnegonacisku jeżeli tylko nieliczne jednostki dożywały wieku sędziwego.Jak wiadomo wolne rodniki rodniki oddziaływają z DNA. Trudno jest jednakżejednoznacznie stwierdzić ich wpływ na rozwój ewolucjny. Wraz z rozwojem,„program” genetyczny coraz to bardziej komplikował się, a przez to byłbardziej narażony na uszkodzenia. Tym można wytłumaczyć dlaczego znanesą nieśmiertelne organizmy jednokomórkowe, a nie np. ludzie. W latachpięćdziesiątych L. Hayflick i P. Moorhead wysunęli koncepcję o ograniczonejliczbie podziałów komórki diploidalnej i występowaniu tzw. limitu Hayflicka.Zauważono w tym przypadku ścisłą korelację między oczekiwaną długościążycia różnych organizmów, a ich limitem Hayflicka. Tę teorię jest wyjątkowotrudno połączyć z wolno-rodnikową teorią starzenia. Ostatnio sugeruje sięjednakże, że limit Hayflicka zależy również od środowiska w którym przebywakomórka. Mogłoby to oznaczać udział wolnych rodników w starzeniu, tymbardziej, że zaobserwowano, że komórki pochodzące od organizmów długożyjącychsą bardziej odporne na ich ataki. Faktycznie udało się wydłużyćdługość życia nicieni poprzez zamianę jednego z genów zwiększającą jegofunkcje anty-oksydacyjne.ZMIATACZE WOLNYCH RODNIKÓW I ANTYUTLENIACZEOrganizmy żywe w trakcie ewolucji wytworzyły szereg mechanizmówzapobiegających lub naprawiających uszkodzenia powstałe wskutek działa-47

nia wolnych rodników. Dlatego nie gromadzą się one w tkankach gdyż sąstale unieczynniane, „zmiatane” przez miejscowe mechanizmy antyoksydacyjne.Bardzo często stanowią one niedostateczną ochronę i co więcej, ichefektywność maleje z wiekiem. Generalnie można je podzielić na systemynaprawcze białek, lipidów i DNA oraz antyutleniacze enzymatyczne lub nieenzymatyczne,jak to zostało zestawione poniżej.Rys. 3. Równowaga oksydacyjna1. Systemy naprawcze1.1. Naprawa białek - proteinazy (odcinają utlenione białka), proteazy(tną produkty aktywności proteinaz), peptazy (tną produkty aktywnościproteaz na aminokwasy).1.2. Naprawa lipidów - fosfolipazy (usuwają utleniane fragmenty lipidówz błon), acetylotransferazy (wymieniają kwasy tłuszczowe oddzieloneod lipidów), peroksydaza glutationowa i transferaza (wspomagająnaprawę utlenionych kwasów tłuszczowych).1.3. Naprawa DNA - egzo- i endonukleazy (usuwają zniszczone fragmentyDNA), glikozylazy i polimerazy (wypełniają ubytki powstałe podziałaniu nukleaz), ligazy (łączą naprawione fragmenty).2. Antyutleniacze (zmiatacze wolnych rodników)2.1. Enzymatyczne48

2.1.1. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) – składa się ona z dwóchdimerów o M = 32000, każdy zawiera Cu(II) i Zn(II), przy czymmiedź znajduje się w centrum katalicznym, a cynk pełni rolęstrukturalną. Występuje w cytozolu i mitochongriach (magnezo-zależna).Katalizuje dysmutację anionorodnika ponadtlenkowegow nadtlenek wodoru, powodując obniżenie jego stężeniado poziomu poniżej 10 -11 M. Wstrzyknięta do chorejtkanki z przewlekłym stanem zapalnym powoduje szybkie jejwyleczenie. Daje to lepsze wyniki leczenia reumatyzmu niżdotychczasowa terapia polegająca na naświetlaniu, powodującawzrost stężenia rodników i tylko przejściową ulgę.2.1.2. Katalaza (M = 240 000) - składa się z 4 podjednostek, każdazawiera grupę hemową z wysokospinowym żelazem Fe(III).Jest reaktywna w peroksyzomach, obniża stężenie nadtlenkuwodoru. Osłabienie funkcji SOD i katalazy jest przyczynąszybkiego starzenia się. Przy ich prawidłowym rozwoju człowiekmógłby, prawdopodobnie, żyć znacznie dłużej.2.1.3. Peroksydaza glutationowa (M = 90 000) zawiera atom selenu,stąd niektórzy mylnie zaliczają selen do antyutleniaczy. Występujew mitochondriach i cytozolu, redukuje hydronadtenki organicznei nadtlenek wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego.2.1.4. Ceruloplazmina - niebieska miedzioproteina występującaw surowicy krwi (M = 132000; 7,8 jonów Cu(II)). Katalizujeona utlenianie jonów żelaza, przez co zapobiega tworzeniu sięrodników hydroksylowych, likwiduje anionorodnik ponadtlenkowy.Mniej reaktywna od SOD, nie wytwarza nadtlenku wodoru.W przeciwieństwie do SOD jest zewnątrzkomórkowaw układzie krążenia.2.2. Nieenzymatyczne2.2.1. Witamina E i beta-karoten – reagując z wolnymi rodnikami wytwarzajątrwałe rodniki oddziaływujące następnie z witaminąC. Jako rozpuszczalne w tłuszczach chronią głownie błonyplazmatyczne. Usuwają NO 2 . chroniąc płuca przed dymem tytoniowym.2.2.2. Witamina C – reduktor zaangażowany w reakcje hydroksylacji(tworzenie hydroksyproliny w kolagenie). Chelatuje metale,w tym żelazo. Chroni witaminy A i E przed utlenianiem. Reagujez wolnymi rodnikami w cytoplaźmie. Działa antyutleniającowspólnie z witaminą E.2.2.3. Kwas moczowy – likwiduje rodniki w cytoplaźmie. Jest onkońcowym produktem metabolizmu puryny u człowieka i naczelnych.Jego duże stężenie (> 0,5 mM) u naczelnych tłumaczyich dużą żywotność.2.2.4. Chelatory metali (transferyna, laktoferyna, w tym białkowe:hemoglobina, mioglobina, ferrodyksyna) – zapobiegają katalizowaniureakcji utleniania przez żelazo i miedź Zaliczyć moż-49

na do nich również poliaminy biogenne (spermina) – produktymetabolizmu (podobnie do NO) argininy.2.2.5. Związki zawierające grupy sulfhydrylowe -SH (cysteina, cysteamina,glutation).2.2.6. Kwas liponowy (tiooktanowy) – lek podawany diabetykom(normalizuje poziom cukru we krwi). Usuwa z organizmu metaleciężkie (Fe, Cu) i toksyczne (Cd, Pb, Hg). Ostatnio okazałosię, że regeneruje on system nerwowy i wątrobę oraz spowalniarozwój wirusa HIV, choroby Parkinsona i Alzheimera.Wiąże się to z jego silnym działaniem antyutleniającym (zarównow wodzie jak i w tłuszczach) oraz z ochroną przed rozkłademwitamin C i E.2.2.7. Melatonina – hormon wytwarzany w szyszynce. Ponieważ zanikaona z wiekiem stąd wysunięto koncepcję, że podawaniemelatoniny może zapobiec, a nawet odwrócić procesy starzenia.Faktycznie, w roku 1994r. Pierpaoli i Regalson przedłużylimaksymalną długość życia myszy (z 23 do 28 miesięcy) poprzezpodawanie im melatoniny w pożywieniu lub przeszczepszyszynki. Działanie melatoniny nie jest dokładnie poznane.Wiadomo, że jest ona 15 razy silniejszym antyutleniaczem niżwitamina E. Jest stężenie (10 -9 M) jest jednakże za małe, abymogła ona skutecznie usuwać wolne rodniki. Problematycznawydaje się również możliwość „bezkarnej” kuracji hormonalnej.Wiąże się to z wysuniętą jeszcze w latach dwudziestych,przez Steinacha, koncepcją, według której główną przyczynąstarzenia jest niedobór hormonów. Spektakularne wyniki okazałysię bardzo niekorzystne w dłuższym okresie czasu.2.2.8. Koenzym Q 10 (ubichinon) – występuje w komórkowym układzieoddychania, na wewnętrznej membranie mitochondrióworaz w cytoplaźmie w połączeniu z lipoproteinami. Chroniprzed utlenianiem lipidów.2.2.9. Fito-związki – zmiatacze rodników pochodzenia roślinnego(polifenole, flawonoidy, antocyjany, proantocyjanidy, pytoestrogeny).CAŁKOWITY POTENCJAŁ ANTYOKSYDACYJNYW literaturze można znaleźć opisy wielu metod oznaczania zarównoposzczególnych wolnych rodników [32-54] jak też antyoksydantów [32,54-57]. Wolne rodniki wytwarzane są w trakcie przebiegu całego łańcuchaprzemian. W rezultacie dochodzi do wytworzenia wielu rodników o różnejtrwałości i reaktywności. Istnieje, więc potrzeba oznaczania sumarycznej ilościwolnych rodników lub stresu oksydacyjnego spowodowanego przez nie[41, 42, 51-53]. Z drugiej strony w trakcie przebiegu zmian patologicznychzmieniają się stężenia różnych antyoksydantów. Spowodowane jest to50

z jednej strony ich zużywaniem się w czasie reakcji z wolnymi rodnikami,z drugiej zaś akcją obronną organizmu. Okazało się, że oznaczanie sumarycznegostężenia wszystkich antyoksydantów często lepiej pozwala ocenićpoziom mocy antyoksydacyjnej badanego układu biologicznego niż oznaczaniestężenia poszczególnych antyoksydantów osobno [58-67]. Obie tewielkości, tzn. stres oksydacyjny i całkowity potencjał antyoksydacyjny, są zesobą ściśle powiązane, a nawet czasami, utożsamiane [67]. M.in. zmianastężenia antyoksydantów w surowicy krwi pozwala badać wpływ wolnychrodników na przebieg szeregu stanów patologicznych [68-70]. Okazało się,że współdziałanie między różnymi antyoksydantami daje większą protekcjęniż związki te osobno. Przykładowo, wymienić tu można synergizm glutationuregenerującego askorbinian [71], czy askorbinianu regenerujacegoα-tokoferol [27, 72]. Te zdolności zmiatania rodników w literaturze definiowanei nazywane są bardzo różnorodnie (ang. TAC – total antioxidant capacity,FRAP – ferric reducing ability of plasma, TRAP – total peroxyl radicaltrapping antioxidant parameter, TRAP – total redox antioxidant potential,ORAC – oxygen radical absorbance capacity, TEAC – Trolox-equivalent antioxidantcapacity czy TAR – total antioxidant reactivity) [59, 64, 73]. W opracowaniustosujemy skrót CPA pochodzący od terminu - całkowity potencjałantyoksydacyjny.Za przybliżoną miarą stresu oksydacyjnego jest stężenie najbardziejreaktywnych rodników - hydroksylowych. Ponieważ są one wyjątkowo nietrwałedlatego do ich oznaczania stosuje się metodę pułapki spinowej. Metodata polega na wprowadzeniu do materiału biologicznego względnie nietoksycznychzwiązków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji(substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym.Jako pułapkę spinową wykorzystuje się naturalnie występującą fenyloalaninę,kwas tereftalowy [74] lub egzogenne pochodne aspiryny. Produkty ichreakcji z rodnikiem hydroksylowym oznaczane są chromatograficznie.Chromatografia może być również zastosowana do pomiaru CPA.Wówczas układ pomiarowy zawiera badany związek lub próbkę biologicznąoraz będący pułapką spinową „detektor” (np. kwas p-hydroksybenzoesowy)[75]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostają w reakcji analogicznej doFentona, w układzie żelazo (II), nadtlenek wodoru i ADP [76, 77]. Rodniki tesą zmiatane zarówno przez detektor jak i badaną próbkę. Jeśli próbka charakteryzujesię większą reaktywnością z rodnikami wówczas spowoduje tozmniejszenie wysokości piku chromatograficznego produktu reakcji detektoraz rodnikiem. Umożliwia to porównanie mocy zmiatania rodników hydroksylowychprzez różne próbki.Rodniki są wytwarzane m.in. pod wpływem działania promieniowaniaelektromagnetycznego na niektóre związki. Podczas reakcji odwrotnej, np.rekombinacji rodników lipidowych dochodzi do wydzielenia kwantu promieniowaniaelektromagnetycznego (chemiluminescencji). Dzięki temu metodąchemiluminescencji można badać niestabilne rodniki lipidowe, niemożliwedo bezpośredniej ich analizy, nawet w żywym materiale biologicznym [78].Inna metoda polega na dodaniu do badanego układu związku tworzącego51

trwały rodnik, możliwy do oznaczenia fotometrycznego [62, 64] lub za pomocąelektronowego rezonansu paramagnetycznego [79, 80]. Olbrzymia większośćrodników mających istotne znaczenie biologiczne jest utleniaczami.Dlatego też sumaryczne stężenie rodników niskocząsteczkowych możnaoznaczać metodami elektrochemicznymi [81, 82].Oddzielną grupę technik oznaczania stresu oksydacyjnego jest analizaniektórych związków naturalnie występujących w układach biologicznych.Zaliczyć do tego można oznaczanie sumarycznego stężenia tioli [99, 100],stosunku stężeń glutationu do jego utlenionej postaci [101, 102] czy kwasuaskorbinowego do dehydroaskorbinowego [103]. Wolne rodniki reagująpraktycznie z wszystkimi związkami biologicznie aktywnymi. Najbardziejistotne są ich oddziaływania z DNA, białkami i lipidami. Produkty tych reakcjisłużą do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych związków [104]. Uszkodzeniewolnorodnikowe białek mierzone jest stopniem przereagowania tyrozynyw bityrozynę lub stężeniem grup karbonylowych [105]. Znanych jest ponad20 wolnorodnikowych uszkodzeń zasad purynowych i pirymidynowych.Wśród istotnych wskaźników uszkodzenia kwasów nukleinowych wyróżnićnależy 8-okyguaninę i 8-oksyadeninę i 8-hydroksy-2-deoksyguanozynę[106]. Inne podejście polega na określeniu aktywności enzymu reperującegonici DNA, Poli-ADP-rybozy [107]. Najwięcej prac poświęconych jest jednakokreśleniu stopnia peroksydacji lipidów [60, 108]. W tym przypadku oznaczasię dialdehyd malonowy (MDA) [108, 109], 4-hydroksy-2-nonenal [110],oksysterole [111], hydroksynadtlenki [112] czy też sprzężone dieny [113].Ostatnio stwierdzono, że izomery prostaglandyny F 2 są również wskaźnikamigeneracji wolnych rodników i peroksydacji lipidów. F 2 -izoprostany(w szczególności 8-epiPGF 2α ) powstają przede wszystkim w procesie peroksydacjikwasu arachidonowego i eikozanoidów (prostoglandyny, leukotrienyi tromboksany) [114-117].Jednym z pierwszych oznaczeń aktywności antyoksydacyjnej byławprowadzona w Instytucie Fizyki Chemicznej byłego ZSRR w Moskwie metodapolegająca na ocenie wpływu ekstraktów tkanek otrzymanych w wynikudziałania rozpuszczalników organicznych na utlenianie nienasyconego kwasutłuszczowego w standardowych warunkach (przedmuchiwanie tlenem,stała temperatura 37°C). Jeśli w ekstrakcie znajdowały się antyoksydanty,utlenianie kwasu tłuszczowego (monitorowane przez jodometryczny pomiarzawartości nadtlenków) rozpoczynało się z opóźnieniem, po czasie indukcji,który był zależny od sumarycznego stężenia antyoksydantów. Metoda ta pozwalałana oznaczenie zawartości antyoksydantów hydrofobowych i zdolnychdo oddziaływania z hydrofobowym kwasem tłuszczowym. Wraz z rozwojemnauki powstały coraz to nowocześniejsze i bardziej czułe metodyoznaczania CPA. Większość tych metod opiera się na tej samej zasadzie.Utleniacz inicjuje reakcję której przebieg można łatwo śledzić, np. fotometrycznie.Obecność antyoksydantów w próbce spowalnia reakcję utleniania,a mierzony parametr (np. czas indukcji) charakteryzujący to spowolnieniejest miarą zawartości antyoksydantów w próbce [118].52

Jednym z najpowszechniejszych oznaczeń jest TAS (Total AntioxidantStatus), zaproponowane przez Rice-Evans [118]. Opiera się ono na następującejzasadzie. W środowisku reakcji znajduje się 2,2’-azynobis--(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian) (ABTS), nadtlenek wodoru i peroksydazalub mioglobina działająca jako pseudoenzym. Peroksydaza katalizujereakcje jednoelektronowego utleniania ABST przez nadtlenek wodoru.W wyniku reakcji powstaje kationorodnik ABTS .+ charakteryzujący się zielononiebieskąbarwą. Im więcej antyoksydantów znajduje się w środowiskureakcji tym wolniej powstaje zielone zabarwienie i tym jest ono słabsze. Zahamowaniezielenienia próbki mierzonego spektrofotometrycznie po określonymczasie inkubacji jest miarą zawartości przeciwutleniaczy w próbce.Metoda ta ma wiele wad, jednak jej ogromną zaletą jest wykonanie oznaczeńw ściśle określonych warunkach, gdyż zestaw odczynników do przeprowadzeniatestu jest powszechnie dostępny [118].Rys. 4. Schemat pomiaru całkowitego potencjału antyoksydacyjnego metodą fotometryczną.1 – hipotetyczna zmiana sygnału przy braku próbki w mieszaninie reakcyjnej, 2 – przebiegrzeczywistej zmiany sygnału w obecności próbki charakteryzującej się dużo większą stałąszybkości reakcji z rodnikiem niż „detektor” i 3 – stałą szybkości reakcji porównywalną z nimPomiar CPA jest szczególnie często stosowany do badań skomplikowanychpróbek biologicznych, głównie surowicy lub osocza krwi [59-67].Oparty on jest na fotometrycznym pomiarze wytworzonych trwałych rodników[62, 99] lub redukcji żelaza przez składniki surowicy [60]. Najczęściejjednak wykorzystuje się metodę opartą o generację rodników wskutek termicznegorozpadu związków dwuazowych, najczęściej AAPH (2,2-diazobis-(2-amidinopropano)-dihydrochlorek). Początkowo AAPH rozpada się samorzutniena dwa rodniki alkilowe, które następnie reagując z tlenem wytwarzająrodniki ponadtlenkowe. Powstałe rodniki monitoruje się za pomocą tzw.detektora, tzn. związku, który po przereagowaniu z rodnikami zmienia sygnałluminescencyjny [63], fluorometryczny [59, 119] lub fotometryczny [61, 65].Miarą potencjału antyoksydacyjnego jest czas opóźnienia krzywej obrazują-53

cej zmiany stężenia detektora lub produktu jego reakcji w czasie (rys. 4). Toprzesunięcie spowodowane jest tym, że antyoksydanty zawarte w próbcenie dopuszczają do reakcji rodnika z detektorem. Stąd podstawowym wymogiemtej metody jest, aby reakcja próbki z rodnikiem była znacznie szybszaod analogicznej reakcji detektora.Duża ilość metod pomiaru CPA powoduje, że ten sam materiał mierzonyza pomocą różnych metod może dawać odmienne wyniki. W celuujednolicenia wyników w większości przypadków stosuje się przeliczanie ichna jeden ze standardów, przeważnie stężenie Troloksu, syntetycznego, rozpuszczalnegow wodzie analogu witaminy E.CHROMATOGRAFICZNY POMIAR STRESU OKSYDACYJNEGOCPA jest odwrotnie skorelowany z inną sumaryczną wielkością, mianowicieze stresem oksydacyjnym. Pośrednią grupę technik oznaczaniastresu oksydacyjnego jest analiza niektórych związków naturalnie występującychw układach biologicznych. Zaliczyć do tego można oznaczanie sumarycznegostężenia tioli, stosunku stężeń glutationu do jego utlenionej postaciczy kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego. Wolne rodniki reagująz praktycznie wszystkimi związkami biologicznie aktywnymi (najbardziejistotne są ich oddziaływania z DNA, białkami i lipidami). Produkty tych reakcjisłużą do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych związków. Ponieważ sąone nietrwałe ich bezpośrednie oznaczanie w próbkach materiału biologicznego(np. w osoczu, czy w homogenatach tkankowych) nie jest zazwyczajmożliwe, dlatego też pośrednią metodą oznaczania stresu oksydacyjnegojest analiza produktów tych reakcji. Uszkodzenie wolnorodnikowe białekmierzone jest stopniem przereagowania tyrozyny w bityrozynę lub stężeniemgrup karbonylowych. Znanych jest ponad 20 wolnorodnikowych uszkodzeńzasad purynowych i pirymidynowych. Wśród istotnych wskaźników uszkodzeniakwasów nukleinowych wyróżnić należy 8-okyguaninę i 8-oksyadeninęi 8-hydroksy-2-deoksyguanozynę. Inne podejście polega na określeniu aktywnościenzymu reperującego nici DNA, poli-ADP-rybozy. Wydaje się, żew chwili obecnej największe zainteresowanie wzbudza określenie stopniaperoksydacji lipidów. Oznaczanymi produktami ich peroksydacji jest dialdehydmalonowy (MDA) [7], 4-hydroksy-2-nonenal (HNO), oksysterole (7α-,7β-, 24, 25- i 27-hydroksycholesterol oraz epoksycholesterol [8a]), hydroksynadtlenki,sprzężone dieny czy też ostatnio intensywnie badane izomeryprostaglandyny F 2 . F 2 -izoprostany (w szczególności 8-epiPGF 2α ) powstająprzede wszystkim w procesie peroksydacji kwasu arachidonowego i eikozanoidów(prostoglandyny, leukotrieny i tromboksany).Produktami peroksydacji, głównie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych(PUFA), są aldehydy, hydroksynadtlenki i ketony, a ich produktemkońcowym jest dialdehyd malonowy (MDA). Pomiar jego stężenia jest powszechnieuznawany za miarę wolnorodnikowego uszkodzenia lipidów [7].Najczęściej stosuje się do tego, ze względu na prostotę obsługi i wysoką54

czułość, test kwasu tiobarbiturowego, TBA [7]. Niestety test TBA jest wysoceniespecyficzny i trudny do zastosowania w próbkach biologicznych. Dodatniwynik otrzymuje się także z cukrami, niektórymi aminokwasami, kwasamiżółciowymi, alkenami, alkadienami, itp. Pewne udoskonalenie uzyskano stosującchromatografię w układzie faz odwróconych z detekcją fluorometryczną[10, 11] lub fotometryczną przy długości fali 535 nm [13-16]. W tym przypadkuderywatyzacja (kwasem tiobarbiturowym) wpływa zarówno narozdział, jak i na detekcję. Ciągle jednak etap derywatyzacji związany z opisanąniejednoznacznością, jest wymagany. Metodę tę próbowano zmodyfikowaćstosując derywatyzację 2,4-dinitrofenylohydrazyną [17-19] lub diaminonaftalenem[20] z detekcją fotometryczną przy 310 nm. Etapderywatyzacji usunięto stosując tzw. chromatografię par jonowych [21, 22](dialdehyd jest kwasem i dlatego jest on słabo zatrzymywany na fazieRP-18). Detekcja fotometryczna przy 267 nm pozwala na jednoczesną analizęMDA z dwoma powszechnie występującymi w surowicy krwi antyoksydantami,tzn. kwasem askorbinowym i moczowym. Na rysunku 5 przedstawionoanalogiczny chromatogram uzyskany metodą chromatografiiwykluczania jonowego (jest to technika predysponowana do rozdziału słabychkwasów), takich jak MDA (pK a ~4.5) [23]. Porównany on zostałz chromatogramem uzyskanym po derywatyzacji MDA.AAAUA267nmMDAB535nm20 minRys. 5. Chromatogram jonowo-wykluczający 100 μM kwasu (AA) – askorbinowego,(UA) – moczowego, (MDA) – dialdehydumalonylowego i - 25 μM MDA . TBA (dolny wykres).Warunki: kolumna – 300x7.8 mm I.D. TSK-GEL SCH(H + ) (TosoHaas); faza ruchoma:(A) - 3 mM H 2 SO 4 , 3 mM TBABr, 5% ACN, temp. – 40°C; (B) – 1 mM H 2 SO 4 , 15% ACN,temp. – 20°C; detektor UV-267/535 nm55

Rodniki hydroksylowe są wyjątkowo reaktywne. Dlatego też są stosunkowoczęsto oznaczane i pośrednio świadczą o całkowitym stresie oksydacyjnym.Ponieważ są one wyjątkowo nietrwałe, do ich oznaczania stosujesię metodę pułapki spinowej. Polega ona na wprowadzeniu do materiału biologicznegowzględnie nietoksycznych związków aromatycznych i oznaczaniuproduktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiemhydroksylowym. Jako pułapkę spinową wykorzystuje się naturalnie występującąfenyloalaninę, kwas tereftalowy lub egzogenne pochodne aspiryny.W przypadku fenyloalaniny (D-izomer) jej produktami reakcji z rodnikamihydroksylowymi są tyrozyny [24]. Produkty ich reakcji z rodnikiem hydroksylowymoznaczane są chromatograficznie.Aspiryna (kwas o-acetylosalicylowy) jest lekiem powszechnie stosowanymm.in. przy leczeniu stanów zapalnych i złogów naczyń krwionośnych.W organizmach jest ona bardzo szybko hydrolizowana do kwasu salicylowego(rys. 9). Kwas ten w warunkach fizjologicznego pH = 7,4 reagujez rodnikami hydroksylowymi dając trzy produkty reakcji: kwasy 2,3- (49%)i 2,5-dihydroksybenzoesowe (40%) (DHBA) oraz o-katechol (11%). Pułapkowanierodników hydroksylowych kwasem salicylowym zostało wielokrotnieopisane w literaturze [24]. Kwas ten (ok. 5 mM) wprowadzany jest dootrzewnowolub stereotaktycznie dokomorowo do komory mózgowej. Stężenie2,5-DHBA może być powiązane ze stężeniem cytochromu P-450. Zmianystężenia 2,3-DHBA są zaś bezpośrednio powiązane ze zmianami stężeniarodników hydroksylowych. Kwasy te oznaczane są zwykle chromatograficzniew układzie faz odwróconych [25], jak przedstawiono to na rys. 6.Rys. 6. HPLC chromatogram 1 mM standardów kwasów (1) - 2,5-,(2) - 2,3-dihydroksybenzoesowych oraz (3) - kwasu salicylowego. Warunki chromatograficzne:kolumna - 250x4 mm śr. wew. Zorbax ODS 5 μm (Knauer); faza ruchoma - bufor octanowocytrynianowypH = 4,3, 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA, 5% MeOH, 3 mM TBAP; temp. - 20ºC;szybkość przepływu - 0,9 ml/min; detektor - UV-205 nm56

Pułapka salicylanowa posiada szereg wad [26]:a) problematyczne jest oznaczanie kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowegogdyż może on występować endogennie, np. wskutek działaniacytochromu P-450,b) czułość układu jest zmniejszona na skutek tworzenia się dwóch produktówreakcji,c) pochodne aspiryny mogą występować w pożywieniu, a jej nieuzasadnionepodawanie wpływa na stany zapalne.Aby uniknąć tych trudności SteMarie i wsp. zaproponowali zastąpienie salicylanówkwasem p-hydroksybenzoesowym [26]. Chociaż kwasy te oznaczaćmożna fotometrycznie to zwykle stosuje się znacznie bardziej czułą (1 pg dlaDHBA, 100 pg dla kwasu salicylowego) detekcję elektrochemiczną (elektrodapracująca: węgiel szklisty; 0,8 V vs Ag/AgCl) [25].Rys. 7. Chromatogram jonowo-wykluczający kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowego oraz kwasup-hydroksybenzoesowego. Warunki chromatograficzne: kolumna - 300x7,8 mm śr. wew.TSK-GEL SCX(H + ) (TosoHaas); faza ruchoma - 1 mM H 2 SO 4 , 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA,13% ACN; detektor elektrochemicznyRys. 8. Hydrodynamiczne woltamogramy 1 mM kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowegoi p-hydrosybenzoesowego. Warunki chromatograficzne jak na rysunku powyżej57

COOHOCOCH3aspirynahydrolizaCOOHCOC 6H 9O6OHCOOHOHkwas salicylowyOHOHsalicyloacyloglukoronidOH2,3-DHBACOOHCO 2OC 6H 9O6COOHOHsalicylofenyloglukoronidCONHCH 2CO 2HOHOHOHHO2,5-DHBAkwas salicylurowyRys. 9. Metabolity i produkty reakcji ataku rodnika hydroksylowego na kwas salicylowyCHROMATOGRAFICZNY POMIAR CAŁKOWITEGO POTENCJAŁUANTYOKSYDACYJNEGOCOOHCOOHOHOHOHOHRys. 10. Reakcja pułapkowania rodnika hydroksylowego kwasem p-hydroksybenzoesowym,w wyniku której powstaje kwas 3,4-dihydroksybenzoesowyPonieważ rodnik hydroksylowy jest najbardziej reaktywny z całej kaskadyrodników jego oznaczanie pozwala uzyskać informacje o całkowitymstresie oksydacyjnym. Rodniki hydroksylowe są wyjątkowo nietrwałe dlategodo ich oznaczania stosuje się metodę pułapki spinowej. Polega ona nawprowadzeniu do materiału biologicznego względnie nietoksycznych związ-58

ków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowalub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym. Jako pułapkę spinowąwykorzystuje się m.in. naturalnie występującą fenyloalaninę, kwas tereftalowy,egzogenne pochodne aspiryny oraz, przedstawiony na rys. 10,kwas p-hydroksybenzoesowy (p-HBA) [25]. Kwasy hydroksybenzoesowemogą być oznaczane metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowejw układzie faz odwróconych z detekcja elektrochemiczną (węgiel szklisty;0,8 V vs Ag/AgCl).W tym miejscu warto zauważyć, że salicylany, czy szerzej hydroksybenzoesany,(np.: aspiryna - kwas o-acetylosalicylowy) występują w wieluroślinach. Wykorzystanie, z powodzeniem, tej grupy związków jako pułapkirodnika hydroksylowego udowadnia, że oprócz własności przeciwzapalnychzwiązki te w organizmie mogą pełnić również rolę antyoksydantów.Rys. 11. Porównanie potencjał antyoksydacyjny metanolu, etanolu i dimetyosulfotlenku. Rodnikihydroksylowe zostały wygenerowane w układzie (ADP/Fe(II)/H 2 O 2, ) i pułapkowane kwasemp-hydroksybenzoesowym w obecności badanych rozpuszczalników o stężeniu 0.1%. Produktreakcji (kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy) był oznaczany z zastosowaniem chromatografiiwykluczania jonowego. Próbka kontrolna nie zawierała antyoksydantów, dlatego wysokośćjej piku chromatograficznego przyjęto za 100%Rys. 12. Prównanie potencjału antyoksydacyjny poliamin biogennych (AGM – agmatyny,PUT – putrescyny, SPD – spermidyny i SPE – sperminy). Warunki jak na rys. 1159

W statycznej, chromatograficznej metodzie pomiaru całkowitego potencjałuantyoksydacyjnego układ pomiarowy zawiera badany związek lubpróbkę biologiczną oraz będący pułapką spinową „detektor” (np. kwasp-hydroksybenzoesowy) [28]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostająw reakcji analogicznej do Fentona, w układzie żelazo (II), nadtlenek wodorui ADP [29]. Rodniki te są zmiatane zarówno przez detektor jak i badanąpróbkę. Jeśli próbka charakteryzuje się większą reaktywnością z rodnikamiwówczas spowoduje to zmniejszenie wysokości piku chromatograficznegoproduktu reakcji detektora z rodnikiem. Umożliwia to porównanie mocy zmiataniarodników hydroksylowych przez różne próbki. Okazało się, że tak wyznaczonypotencjał antyoksydacyjny skorelowany jest ze stałymi szybkościreakcji rodnika hydroksylowego z badanymi związkami.Na rys. 11 pokazano wysokości pików chromatograficznych uzyskanychw obecności niektórych rozpuszczalników organicznych (metanolu,etanolu i dimetylosulfotlenku – DMSO) w odniesieniu do próbki kontrolnej(wytworzony rodnik+detektor) [28]. Zmniejszenie wysokości pików wskazujena to, że rozpuszczalniki te zmiatają rodniki hydroksylowe. Może to tłumaczyćprotekcyjne własności DMSO obserwowane w czasie stresu oksydacyjnegomózgu [30, 31]. Obserwowane zmniejszenie wysokości pikówchromatograficznych dihydroksybenzoesanów jest proporcjonalne do stężeniapróbki, ale także i jej własności. Ta ostatnia jest prawdopodobnie zależnaod wartości stałej szybkości reakcji próbki z rodnikiem hydroksylowym.Stałe szybkości wynoszą 8.3 x 10 8 , 2.2 x 10 9 i 7.0 x 10 9 mol L -1 s -1 odpowiedniodla metanolu, etanolu i DMSO.Podobne zależności uzyskane dla poliamin biogennych, putrescyny,spermidyny, sperminy i agmatyny przedstawiono na rys. 12 [11]. Związki tepełnią istotną rolę we wszystkich żywych organizmach, m.in. we wzrościei replikacji komórek. Poza tym pełnią rolę antagonistów niektórych kationów(takich jak K + , Mg 2+ czy Ca 2+ ) i antyoksydantów [12]. Jako substancje smakowei zapachowe występują m.in. w winie, herbacie, grzybach, jabłkach itd.Pełnią one rolę też antygenów w komórkach niektórych bakterii, nowotworów,pasożytów i grzybów chorobotwórczych. Dlatego sugeruje się, że picieherbaty ma działanie antykancerogenne gdyż pobudza to aktywność komórekukładu odpornościowego i wzrost produkcji np. interferonu gamma.Zmiany ich stężenia obserwowano w czasie ischemii i reperfuzji. Kontrowersjewzbudza w dalszym ciągu czy ich wytwarzanie ma w tym przypadkudziałanie neurotoksyczne czy neuroprotekcyjne [13]. Z przedstawionego rysunkuwynika, że poliaminy są zmiataczami wolnych rodników. Podobnie doopisanych wcześniej rozpuszczalników organicznych ich potencjał antyoksydacyjnyproporcjonalny jest do stałych szybkości ich reakcji z rodnikiemhydroksylowym (wynoszą one odpowiednio 1.1 x 10 8 , 1.2 x 10 8 i 1.3 x 10 8mol L -1 s -1 ). Mechanizm zmiatania rodników w tym przypadku oparty jestgłównie na kompleksowaniu jonów żelaza, co zapobiega przebiegowi reakcjiFentona, a nie na konkurencyjnej reakcji z jonami hydroksylowymi.Ostatnio dużym zainteresowaniem cieszą się naturalne antyoksydantydo których zalicza się występujące w roślinach barwniki – flawonoidy w tym60

antocyjany. Do tych ostatnich należy m.in. barwnik C3G (3-O-β-D glukozydcyjnidyny) oraz jego aglikol – cyjanidyna. Są to związki powszechnie występującew warzywach i owocach. Duże ilości antocyjanów zawierają owoceo niebieskim bądź fioletowym zabarwieniu. Wyizolowano je m.in. z czerwoneji czarnej fasoli. Uważane są one za potencjalne wymiatacze wolnychrodników tlenowych in vivo [14]. W szczególności dużo antocyjanów zawartychjest w aronii czarnej (Aronia melanocarpa) [14-16]. W literaturze możnaznaleźć liczne opisy ich neuro- i cytoprotekcyjnego działania, m.in. w chorobieAlzheimera, udarze mózgu, zawale serca itp. [14]. Ekstrakt z owocówaronii jak i zawarte w niej antocyjany charakteryzują się silnymi własnościamiantyoksydacyjnymi. Okazało się jednakże, że nie zmieniał on potencjałuantyoksydacyjnego osocza krwi, co oznacza, że związki te nie są wchłanianez przewodu pokarmowego. Wyjaśnieniem tego paradoksu może okazaćsię sugestia Tsudy i wsp., że cyjanidyna zawarta w aronii ulega w organizmachżywych alglikolizacji, a następnie jest metabolizowana do kwasu3,4-dihydroksybenzoesowego (3,4-DHBA) (rys. 13), jak wynika z badań silnegozmiatacza rodników peroksylowych.OHHHOO +HOOOOHOHHORys. 13. Przypuszczalny schemat metabolizmu cyjanidynyWedług tradycji w roku 2737 p.n.e. cesarzowi Chen Nung wpadł dowody listek herbaty. Odtąd datują się początki znajomości zdrowotnegodziałania różnych herbat, które około XVI wieku przybyły do Europy. Spośródprzebadanych i przedstawionych na rys. 14 [120] fotometrycznych wartościCPA wynika, że najsilniej wolne rodniki są zmiatane przez ekstraktz herbaty zielonej. Na uwagę zasługuje też fakt zupełnego braku zmiataniawolnych rodników przez napój herbaciany Green Tea & Lychee. Sugerujesię, że tymi aktywnymi antyoksydantami występującymi w herbacie sązwiązki z grupy flawonoidów. Podobne wyniki uzyskane zostały z zastosowaniemmetody analogicznej do opisanej powyżej chromatograficznej(rys. 15). Różnica polegała na detekcji z zastosowaniem spektroskopii ma-61

sowej. Warto zwrócić w tym przypadku uwagę na silne własności zmiatającemelatoniny, zupełnie nieaktywnej w stosunku do rodników peroksylowych.Rys. 14. Całkowity potencjał antyoksydacyjny, odniesiony do rodników peroksylowych,niektórych ekstraktów ziołowych o stężeniu początkowym 1 mg/ml: ekstraktu z herbaty zielonej,aronii, pycnogenol, ekstraktu z herbaty czerwonej, imbiru oraz napoju herbacianegoGreen Tea & LycheeRys. 15. Całkowity potencjał antyoksydacyjny ekstraktów ziołowych, melatoniny orazβ-amyloidu. Rodnik generowany – hydroksylowy, metoda pomiaru – MSLITERATURA1. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem.,19(2000)492.2. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.3. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617.4. W. Droge, Physiol. Rev., 82(2002)47.5. T. Kulawik, R. Gil, P. Grieb, B.K. Głód, Probl. Lekar., 41(2002)393.6. G. Benzi, A. Noretti, Neurobiol. Aging, 16(1995)661.62

7. B.K. Głód, J.C. Kowalski, J. Liquid Chromatogr. & Rel. Technol.,27(2004)2733-2742.8. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439.8a. S. Dzeletovic, O. Breuer, E. Lund, U. Diczfalusy, Anal. Biochem.,225(1995)73-80.9. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.10. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)664.11. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal. (Warsaw), 47(2002)399.12. H.C. Ha, J.D. Yager, P.A. Woster, R.A Casero, Biochem. Biophys. Res.Commun., 244(1998)298.13. E. Lövaas, Medical Hyphoteses, 45(1995)59.14. T. Tsuda, F. Horio, T. Osawa, BioFactors, 13(2000)133.15. R. Salvayre, P. Braquet, T.H. Perruchot, L. Douste-Blazy, Proc. Internat.Bioflavan. Symp., Munch 1981, str. 437-442.16. Y.L. Hong, S.L. Yeh, C.Y. Chang, M.L. Hu, Clin. Biochem.,33(2000)619-625.17. J. Pilz, I. Meineke, C.H. Gleiter, J. Chromatogr. B, 742(200)315-325.18. R. Bakalova, M. Mileva, C. Kotsev, V. Bardarov, S. Ribarov, MethodFind. Exp. Clin., 22(2001)267-269.19. F. Fenaille, P. Mottier, R.J. Turesky, S. Ali, P.A. Guy, J. Chromatogr. A,921(2001)237-245.20. P.J. Steghens, A.L. van Kappel, I. Denis, C. Collombel, Free Radic.Biol. Med., 31(2001)242-249.21. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett.,200(1995)69-72.22. A.W. Bull, L.J. Marnet, Analyt. Biochem., 149(1985)284-290.23. B.K. Głód, Neurochem. Res., 22(1997)1237-1248.24. T. Obata, H. Hosokawa, Y. Yamanaka, Comp. Biochem. Physiol.,106(1997)629-634.25. B.K. Głód, G.A. Czapski, Zastosowanie HPLC do Badania Reakcji Wolnorodnikowychw Układach Biologicznych [w] Chromatographic Methodsin the Analysis of Food and Ecotoxicology, Wyd. UMCS, Lublin1999, 11-15.26. Ste-Marie L., Boismenu D., Vachon L. and Montgomery J., Anal. Biochem.,241(1996)67.27. A.P. Diplock, Med. Biol., 62(1984)78-80.28. B.K. Głód, R. Greib, Chem. Anal., 47(2002)399-407.29. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Methods,10(1984)221.30. J.W. Phillis, A.Y. Estevez, M.H. O'Regan, Neurosci. Lett.,244(1998)109-111.31. A. Bishayee, H.Z. Hill, D. Stein, D.V. Rao, R.W. Howell, Radiation Res.,155(2001)335-344.32. B. Kamińska, M. Stańczyk, Post. Biol. Kom., 25 sup.11(1998)15.33. A. Friedman, Acta. Neurol. Scand., 89(1994)258.34. S. Ball, Chemia szarych komórek, Medyk, Warszawa 2003.63

35. W. Pakszys, B.K. Głód, P.P. Liberski, A. Klimek, red., Postępy w rozpoznawaniui monitorowanym klinimetrycznie leczeniu choroby Parkinsonai parkinsonizmu, Medical Communications, Warszawa 2004.36. A. Szczudlik, Choroba Parkinsona, XVI Zimowa Szkoła Instytutu FarmakologiiPAN, Mogilany 1999.37. H. Ehringer, O. Hornykiewicz, Klin. Wochenschr., 38(1960)1236.38. E.S. Tolosa, Clin. Neuropharm., 21 sup.1(1998)S1-S4.39. J. Cederbaum, Clin. Pharmacokinet., 13(1987)141.40. G.C. Cotzias, M.H. Van Woert, L.M. Schiffer, N. Engl. J. Med.,276(1967)374.41. Y. Agid, T.Chasa, D.Marschen, Lancet, 351(1998)851.42. C.W. Olanow, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)13.43. P.G. Jenner, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)3.44. H.S. Markus, M. Cox, A.M. Tomkins, Clinical Science, 83(1992)199.45. W. Pakszys, Neurol. Neurochir. Pol., 6(1971)837.46. M.D. Yahr, Autonomic Dysfuncion in Parkinson Dis. Rev., 1, 2(1989).47. D.J. Lanska, Ch.G. Goetz, T.A. Chmura, Movement Disorders,16(2001)736.48. K. Kwiatos, Pomiar i analiza drżeń kończyn człowieka, rozprawa doktorskana Wydziale Elektroniki WAT 2000.49. P. Jenner, C.W. Olanow, Neurology., 47(1996)161.50. D.T. Dexter, C.J. Carter, F.R. Wells, F. Javoy-Agid, J. Neurochem.,52(1989)381.51. J. Garthwaite, Tren. Neurosci., 14(1991)60.52. U. Pinkernell, S. Effekemann, U. Karst, Anal. Chem., 69(1997)3623.53. M. Gu, M.T. Gash, J.M. Cooper, G.K. Wenning, S.E. Daniel, N.P. Quinn,C.D. Marsden, A.H.V. Schapira, Ann. Neurol., 44(1997)418.54. T. Obata, Toxicol. Lett., 132(2002)83.55. T. Singer, A.J. Trevor, N. Castagnoli, Trend Biochem. Sci.,12(1987)266.56. J.W. Langston, Life Sci., 36(1985)201.57. E. Sofic, P. Riederer, H. Heinsen, H. Beckmann, G.P. Reynolds, G. Hebenstreit,J. Neural. Trans., 74(1988)199.58. E. Sofic, W. Paulus, K. Jellinger, P. Riederer, J. Neurochem.,56(1991)978.59. C. Buhmann, S. Arlt, A. Kontush, T. Moller-Bertram, S. Sperber,M. Oechsner, M. Stuerenburg, U. Beisiegel, Neurobiol. Disease,15(2004)160.60. A.N. Basma, E.J. Morris, W.J. Nicklas, H.M. Geller, J. Neurochem.,64(1995)825.61. D.G. Graham, Mol. Pharmacol., 14(1978)633.62. S.T. Spencer, T. Parker, W.D. Bennet, Neuroreport, 5(1994)1009.63. E. Martignoni, F. Blandini, L. Godi, S. Desideri, C. Pacchetti, F. Mancini,G. Nappi, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)428.64. J.W. Miller, J. Selhub, J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 21(1996)241.64

65. M. Tanaka, A. Sotomatsu, H. Kanai, S. Hirai, J. Neurol. Sci.,101(1991)198.66. Y. Agid, Neurology, 43(1998)145.67. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.RF. Haddad, TrAC, Trends Anal. Chem.,19(2000)492.68. E. Miętkiewski, Kurs wykładów fizjologii człowieka, wyd. 2, PZWL, Warszawa,1969.69. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.70. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617.71. B. Halliwell, Lancet, 355(2000)1179.72. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439.73. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.74. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)1.75. B.K. Głód, J. Strosznajder, Wolne rodniki w starzeniu się mózgui innych procesach biologicznych, w Mózg a starzenie (M.J. Mossakowski,J. Strosznajder, red.), Oświata UN-O, Warszawa 2001.76. P.G. Osborne, K. Yamamoto, J. Chromatogr. B, 707(1998)3.77. B. Halliwell, H. Kaur, M. Ingelman-Sundeberg, Free Radical Biol. Med.,10(1991)439.78. B.K. Głód, Neurochem. Res., 22(1997)1237.79. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem.,19(2000)492.80. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal., (Warsaw), 47(2002)399.81. A. Rehman, M. Whiteman, B. Halliwell, British J. Pharmacol.,122(1997)1702.82. G. Ellis, I. Adatia, M. Yazdanpanah, S.K. Makela, Clin. Biochem.,31(1998)195.83. T-K. Lin and C-C. Lai, J. Chromatogr., 227(1982)369.84. B.K. Głód, W. Hilgier, J. Strosznajder, J. Albrecht, Chem. Anal.,(Warsaw), 45(2000)27.85. P.M. Abuja, R. Albertini, Clin. Chim. Acta, 306(2001)1.86. A. Ghiselli, M. Serafini, G. Maiani, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi, Free Rad.Biol. Med., 18(1995)29.87. M. Carlberg, J. Neurosci. Meth., 52(1994)165.88. K. Kostner, S. Bayai, M. Jansen, G. Khoschsorur, W.H. Horl, G. Maurer,B. Winklhofer-Roob, K. Derfler, Clin. Chim. Acta, 288(1999)21.89. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett.,200(1995)69.90. I.N. Acworth, B. Bailey, The Handbook of Oxidative Metabolism, ESAInc. 1995.91. C.A. Rice-Evans, Free Rad. Res., 33(2000)59.92. M. Valkonen, T. Kuusi, J. Lipid Res., 38(1997)823.93. N. J. Miller, C. Rice-Evans, M.J. Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Clin.Scie., 84(1993)407.94. E. Lissi, M. Salim-Hanna, C. Pascual, M.D. del Castillo, Free Rad. Biol.Med., 18(1995)153.65

95. A. Ghiselli, M. Serafini, F. Natella, C. Saccini, Free Rad. Biol. Med.,29(2000)1106.96. F. Tubaro, A. Ghiselli, P. Rapuzzi, M. Maiorino, F. Ursini, Free Rad.Biol. Med., 24(1998)1228.97. A. Krasowska, D. Rosiak, K. Szkapiak, M. Łukasiewicz, Curr. TopicsBiophys., 24(2000)89.98. H. Wang. J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)612.99. D. Genser, M-H. Kang, H. Vogelsang, I. Elmadta, Europ. J. Clin. Nutrit.,53(1999)675.100. E.C. Tsai, I.B. Hirsh, J.D. Brunzell, A. Chait, Diabetes, 43(1994)1010.101. E. Ali, Zesz. Nauk. Uniw. Jag., Prace Biol. Molek., 11(1985)139.102. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295.103. L. Ste-Marie, D. Boismenu, L. Vachon, J. Montgomery, Anal. Biochem.,241(1996)67.104. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Meth.,10(1984)221.105. B.J. Tabner, S. Turnbull, O.M.A. El-Agnaf, D. Allsop, Free Rad. Biol.Med., 32(2002)1076.106. B.K. Głód, K.I. Stańczak, A. Woźniak, A. Walendzik, W. Pakszys, CPS:analchem/0306002.107. M.M. Tarpey, I. Fridovich, Circ. Res., 89(2001)224.108. S. Chevion, E.M. Berry, N. Kitrossky, R. Kohen, Free Rad. Biol. Med.,22(1997)411.109. R. Kohen, E. Vellaichamy, J. Hrbac, I. Gati, O. Tirosh, R. Kohen, FreeRad. Biol. Med., 28(2000)547.110. G.L. Ellman, Arch. Biochem, Biophys., 82(1959)70.111. E. Bald, w The XXVI th Sci. Symp. “Chromatogr. Met. Invest. Org.Comp.”, Katowice-Szczyrk 5-6.06.2002.112. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295.113. M. Asensi, J. Sastre, F.V. Pallardo, A. Lloret, M. Lehnor, J.G. Asuction,Met. Enzymol., 295(1999)267.114. K.P. Miltor, T. Dzialosynski, S.E. Sanford, J.R. Trevithicle, Curr. EyeRes., 16(1997)564.115. A.T. Diplock, Free Rad. Res., 33(2000)521.116. W.A. Pryor, T. Strickland, D.F. Church, J. Am. Chem. Soc.,110(1988)2224.117. T. Doba, G.W. Burton, K.U. Ingold, Biochim. Biophys. Acta,835(1985)298.118. G. Cao, H.M. Alessioo, R.G. Cutler, Free Radic. Biol. Med.,14(1993)303.119. G. Cao, R.G. Cutler, Arch. Biochem. Biophys., 320(1995)106.120. K. Głód, K. Stańczak, A. Woźniak, W. Pakszys, Farmac. Pol.,49(2003)S26-S30.66

Józef RZEPAInstytut Chemii, Zakład Chemii Ogólnej i ChromatografiiUniwersytet Śląski w KatowicachOZNACZANIE LEKÓW I PESTYCYDÓWW WODACH POWIERZCHNIOWYCHWSTĘPKażdego roku tysiące ton leków są produkowane i następnie zużywanew medycynie i weterynarii. Znaczna ich część przedostaje się do wódpowierzchniowych w formie niezmienionej. Badania nad obecnością lekówi ich metabolitów prowadzone są od lat 90. XX wieku między innymi w EuropieZachodniej (Niemcy [2], Grecja, Szwajcaria [3]) oraz Ameryce Południowej(Brazylia [4]), dotyczyły leków stosowanych w medycynie i weterynarii. [5]Głównym źródłem zanieczyszczeń środowiska wodnego farmaceutykami sągospodarstwa domowe oraz szpitale. [6] Leki zażywane przez chorych nieulegają całkowicie metabolizmowi w ich organizmach i wraz z moczem lubkałem trafiają do systemu kanalizacji, a stamtąd kierowane są do oczyszczalniścieków. Oprócz gospodarstw i szpitali źródłami zanieczyszczeń sąrównież zakłady farmaceutyczne, a także farmy zwierząt hodowlanych,gdzie profilaktycznie podaje się w paszy antybiotyki i bakteriostatyki (sulfonamidy),aby uchronić zwierzęta hodowlane przed ewentualnymi infekcjami.[3] Farmaceutyki, które wraz ze ściekami przedostają się do miejskichoczyszczalni ścieków, nie są całkowicie usuwane w procesach biologicznegooczyszczania. [2], [4]Ze względu na swoje właściwości farmaceutyki nie są eliminowanez wód w procesach samooczyszczania, a dodatkowo mają zdolności do kumulacjiw tkankach organizmów wyższych, przez co stanowić mogą bezpośredniezagrożenie dla ich zdrowia lub życia. Szerokie, wręcz nadmiernestosowanie leków przeciwbólowych z grupy fenoksykwasów np. ibuprofenu,potęgowane jeszcze nachalną reklamą w mediach prowadzi do wzrostu ichstężenia we wszystkich elementach środowiska.MIGRACJA LEKÓW W ŚRODOWISKULeki odznaczają się dużą polarnością i niską adsorpcją w mule i glebie,co jest przyczyną coraz większego zanieczyszczenia wód powierzchniowychi gruntowych. Oczyszczalnie ścieków nie dysponują technologiąumożliwiającą wyeliminowanie zanieczyszczeń tego typu. Każdy środek zanieczyszczającyśrodowisko musi być sklasyfikowany i umieszczony w normach.Jest to jeden z powodów rozwoju coraz to czulszych metod analitycz-67

nych umożliwiających oznaczanie farmaceutyków w wodnych matrycach [8].Drogi migracji leków w środowisku przedstawia rysunek 1.Rys. 1. Drogi migracji leków w środowisku [7]Przedmiotem badań było oznaczanie leków kwaśnych i neutralnych w wodachpowierzchniowych w rzekach zlewni górnej Wisły i górnej Odry, płynącychna obszarze Górnego Śląska.IbuprofenCH 3OHCH 3OH 3C68

KetoprofenOOOHCH 3NaproksenCH 3H 3COOHOKarbamazepina i metabolit imminostilbenN H 2NOHNDiklofenaki jego metabolit 1,3-dihydro-1-(2,6 dichlorofenylo)indol-2-onOHClHNClOClNOClW trakcie prowadzonych badań oznaczano także niektóre pestycydy,które izolowano wraz z oznaczanymi lekami. Były to: triazyny: atrazyna i symazyna,chlorofenoksykwasy: 2,4-D, MCPA i mekoprop oraz pyretroidy: cypermetrynai lambdacyhalotryna.69

W monitoringu wód powierzchniowych, których poziom w punktach poborupróbek jest zmienny często w szerokim zakresie, konieczna jest znajomośćilości przepływającej wody lub posiadanie innego punktu odniesienia.W czasie monitoringu oczyszczalni ścieków stwierdzono, że w wodach zrzutowychz tych instalacji najbardziej stabilnym zanieczyszczeniem i możliwymdo oznaczania w tej samej procedurze analitycznej, jest kofeina.RUDA Śl. SIEMIANOWICE PANEWNIKI ŻORY GLIWICE100009000800070006000ng/l500040003000200010000I/02V/02IX/02XI/02I/03III/03V/03VII/03IX/03XI/03I/04III/04V/04VII/04IX/04XI/04I/05III/05V/05VII/05IX/05DateRys. 2. Zawartość kofeiny w wodach zrzutowych (oczyszczonych) wybranych oczyszczalniścieków w latach 2002-2005Śląsk jest regionem silnie zurbanizowanym i większość ścieków komunalnychjest oczyszczana. Można więc przyjąć, że ilość kofeiny wprowadzanejdo wód powierzchniowych jest w przybliżeniu stała. Jako wartość odnośnikowązawartości kofeiny w punkcie poboru przyjęto średnią z 12 oznaczeńz próbek pobieranych co miesiąc. Wartość ta jest na pewno obarczonaznacznym błędem, ale pozwala na porównanie zawartości leków w wodziew wybranych przedziałach czasowych.PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZYPróbki wody pobierano co miesiąc do butelek z ciemnego szkła. Dopróbek dodawano 15 izopropanolu. Następnie próbki sączono i przy użyciuHCl wyrównywano pH do wartości pH = 4. Wprawdzie najlepsza efektywnośćekstrakcji leków do fazy stałej jest przy pH = 2 (około 88-94%), ale ilośćekstrahowanej kofeiny jest rzędu zaledwie kilku procent. Przy pH = 4 efektywnośćekstrakcji kofeiny jest 33-35%.Do ekstrakcji do fazy stałej używano kolumienek 6 ml/100 mg BakerBondspe C18 Polar Plus (J.T. Baker) kondycjonowanych heksanem 3x3 ml, acetonem1x3 ml, metanolem 2x3 ml i dejonizowaną wodą 2x3 ml. Ekstrakcjępróbek wody (500-1000 ml) prowadzono pod próżnią z prędkością8-10 ml/min. Następnie kolumienki przemywano wodą (2x1 ml) i suszono70

w strumieniu azotu. Anality eluowano mieszaniną metanolu i acetonu (1:1)– 4x0,5 ml.Uzyskany ekstrakt odparowywano azotem do sucha i substancje kwaśne estryfikowanometanolowym roztworem HCl (temp. 60 0 C). W późniejszych badaniachstosowano silylowanie tych związków odczynnikiem sililującymBESTFA + TMCS w pirydynie (temp. 60 0 C).Po przereagowaniu uzupełniano objętość próbki do 0,5 ml i analizowanochromatograficznie.WARUNKI ANALIZY CHROMATOGRAFICZNEJAnalizy prowadzono w chromatografie GC Trace z detektorem masowymMS Trace Finnigan (ThermoQuest) and autosamplerem CombiPAL (CTC).Kolumny kapilarne: MDN – 5S 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm (Supelco)DB – 5ms 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm (J&W)Prekolumna: 3 m x 0.32 mm,Injector: 280 0 C splitless,Objętość dozowanej próbki: 1 µl. Gaz nośny: hel p = 100 kPa.Termostat: izotermicznie – 100 0 C (3 min), program: 100 0 C – 280 0 C(15 0 /min), 280 0 C – 15 min.Detektor MS: Interface – 280 0 C. Źródło jonów EI: 250 0 C. Energia jonizacji:70eV,Analizę ilościową prowadzono z wykorzystaniem techniki pojedynczego jonu(SIM) charakterystycznego dla oznaczanego związku, pozwalającej naoznaczenie ich stężenia rzędu kilku ng/l.WYNIKI BADAŃW wynikach przedstawiono jedynie część wyników ilustrujących podstawowezaobserwowane prawidłowości. Analizę ilościową prowadzonow oparciu o kalibrację wykonaną dla wybranych jonów (SIM), charakterystycznychdla oznaczanego leku czy pestycydu. Na rysunku 3 przedstawionochromatogram (TIC) ekstraktu próbki wody i chromatogramy SIM wybranychjonów ibuprofenu.71

RT: 4.01 - 19.97IntensityIntensity10050080000600004000020000030000200001000004.26 5.25 6.65 7.524.26 5.954.54 5.838.378.3711.5912.79 16.14 16.559.83 11.1816.7513.54 15.5517.8710.728.947.5214.616.66 8.84 9.86 11.59 13.36 16.65 17.31 18.378.377.148.73 9.05 11.59 12.41 14.84 15.56 16.67 16.97 19.356 8 10 12 14 16 18Time (min)NL:1.05E6TIC MSGCZAG02NL:8.56E4m/z=160.5-161.5MS GCZAG02NL:3.52E4m/z=205.5-206.5MS GCZAG02Rys. 3. Chromatogram (TIC) próbki wody pobranej z Wisły na wlocie do jeziora Goczałkowickiego(styczeń 2005), oraz chromatogramy pojedynczych jonów (SIM) m/z=161 i m/z=206,charakterystycznych dla ibuprofenuNa wykresach (rysunek 4) przedstawiono wyniki uzyskane w przeciągu czterechlat dla ibuprofenu, ketoprofenu, diklofenaku i karbamazepiny w wybranychpunktach poboru próbek na Wiśle i jej dopływach. W Największychilościach w wodach powierzchniowych występuje ibuprofen – lek przeciwbólowydostępny bez recepty i szeroko stosowany. Najistotniejszy jest jednakfakt, że jego ilość w wodach powierzchniowych wykazuje ciągły wzrost. Największeprzyrosty procentowe obserwowano jednak w przypadku ketoprofenu.Podobną prawidłowość wykazuje też diklofenak. Karbamazepina jest lekiemstosowanym pomocniczo w wielu chorobach i jego ilości – najniższe,nie wykazuje tendencji wzrostu.72

Rys. 4. Maksymalne stężenia wybranych leków w latach 2002-2005 w wybranych punktach poboruw zlewni rzeki Wisły. Punkty poboru: 1 - Rzeka WISŁA (Strumień), 2 - Rzeka WISŁA(Goczałkowice), 3 - Rzeka PSZCZYNKA, 4 - Rzeka CZ. PRZEMSZA (Siewierz), 5 - RzekaCZ. PRZEMSZA (Przeczyce), 6 - Rzeka CZ. PRZEMSZA (Sosnowiec), 7 - Rzeka RAWA(ujście), 8 - Rzeka BRYNICA (ujście), 9 - Rzeka B. Przemsza (ujście), 10 - RzekaCZ. PRZEMSZA (ujście), 11 - Rzeka WISŁA (Babice)74

Ciekawą rolę pełnią zbiorniki wodne na rzekach. Stężenie leków na wlocierzeki do jeziora jest zdecydowanie wyższe niż na wylocie z jeziora. Następujewięc istotny spadek stężenia leków w zbiornikach wodnych, choć nie jestpewne, że ulegają one w nich przemianom chemicznym, czy też jest to efektsorpcji na osadach dennych. Na rysunku 5 przedstawiono ten efekt dla ibuprofenu.Rys. 5. Zawartość ibuprofenu na wlocie i wylocie do jeziora Goczałkowickiego i jezioraw PrzeczycachOznaczane pestycydy występują w wodach powierzchniowych okresowo, cowiąże się z cyklem prac polowych i intensywnością opadów. Na rysunku 6przedstawiono wyniki monitoringu triazyn i 2,4-D w wybranych punktach poboruw zlewni Odry. Są to wyniki maksymalne pojawiające się zwykle naprzełomie lata i jesieni. W punktach poboru 7 i 8 widoczny jest efekt znacznegospadku stężenia oznaczanych pestycydów w wodzie na wylocie z jezioraDzierżno. Efekt ten opisano wcześniej także w przypadku oznaczanychleków. Co charakterystyczne, atrazyna i inne triazyny od wielu lat są wycofanez użycia w rolnictwie. Ich ciągłą obecność w wodach powierzchniowychmożna tłumaczyć trwałością triazyn w środowisku lub, co nie wykluczone,wykorzystywaniem starych zapasów.75

Rys. 6. Maksymalne stężenia pestycydów – sumy triazyn i 2,4-D w wybranych punktach poboruzlewni rzeki Odry. Punkt poboru próbki: 1 - ODRA(granica), 2 - Rzeka RUDA (Żory), 3 - RzekaRUDA (ujście do Odry), 4 - Rzeka BIERAWKA (ujście), 5 - Rzeka KLODNICA (Ligota),6 - Rzeka KŁODNICA (Bielszowice), 7 - Jezioro DZIERZNO (wlot), 8 - Jezioro DZIERZNO(wylot), 9 - ODRA (Kanał Gliwicki)76

Stosowana w badaniach procedura analityczna jest pracochłonna, ale pozwoliłana uzyskanie wiarygodnych wyników. Nie sprawdziły się w badaniachekstrakcji do fazy stałej SPE tzw. speediski, pozwalające wprawdziena duże skrócenie czasu ekstrakcji spe, ale powodujące duży rozrzut wyników.Uzyskiwane chromatogramy ekstraktów były często bardzo bogatei nastręczały kłopoty z pełnym rozdziałem oznaczanych analitów od obecnychw ekstrakcie zanieczyszczeń. Dlatego zastosowanie detektora masowegoi analiza z wykorzystaniem monitorowania pojedynczego jonu (SIM)pozwoliła na ominięcie problemów z niecałkowitym rozdziałem składnikówpróbki.LITERATURA1. Rodriguez I., Quintana J.B., Carpinteiro J., Carro A.M., Lorenzo R.A., CelaR.: „Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography-massspectrometry as tert.-butyldimethylsilyl derivatives”, 2002,265-274.2. F. Sacher, F.T. Lange, H.-J. Brauch, J. Blankenhorn, 2001; “Pharmaceuticalsin groundwaters. Analitical methods and results of a monitoringprogram in Boden – Württemberg, Germany”; Journal of ChromatographyA, Vol. 938, pp. 199-210.3. V.Koutsouba, Th. Heberer, B. Fuhrmann, K. Schmidt-Baumler, D. Tsipi,A. Hiskia, 2003; “Determination of polar pharmaceuticals in sewage waterof Greece by gas – chromatography – mass spectrometry”; Chemosphere,Vol. 51, pp. 69-75.4. M. Stumpf, T. Ternes, R.-D. Wilken, S.V. Rodrigues, W. Bauman, 1999;“Polar drug residues in sewage I natural waters in the state of Rio dr Janerio,Brazil”; Science of Total Environment, Vol. 225, pp. 135-141.5. M.A. Soliman, J.A. Pedersen, J.H. Suffet, 2004; “Rapid gas chromatography– mass spectrometry screening method for human pharmaceuticals,hormones, antioxidants and plasticizers in water”; Journal of ChromatographyA, Vol. 1029, pp. 223-237.6. S. Weigel, U. Berger, E. Jensen, R. Kallenborn, H. Thoresen, H. Hühnerfuss,2004; “Determination of selected pharmaceuticals and caffeine insewage and seawater from Tromsø/Norway with emphasis on ibuprofenand its metabolites”; Chemosphere, Vol. 56, pp 583-592.7. Ternes Th.A., Occurrence of drugs in German sewage treatment plantsand rivers. Water research. 1998, 32, 3245-3260.77

Marian KAMIŃSKIPolitechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, 80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12,e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl.; tel: 601-40-18-24, (058) 347-17-29PREPARATYWNA I PROCESOWACHROMATOGRAFIA CIECZOWAWPROWADZENIENiniejszy artykuł monograficzny został pomyślany jako swego rodzajupodręcznik i przewodnik optymalnego stosowania kolumnowej elucyjnejchromatografii cieczowej w skali preparatywnej lub procesowej do rozdzielaniamieszanin substancji, lub grup substancji. Może też być pomocny w pracachnad optymalizacją warunków preparatywnego stosowania kolumnowejelucyjnej chromatografii gazowej oraz z eluentem nadkrytycznym, ponieważwiele ogólnych reguł jest wspólnych dla optymalnego stosowania wszystkichtechnik chromatografii w skali preparatywnej. Oczywiście, chromatografiagazowa, lub z eluentem nadkrytycznym, tak w skali analitycznej, jak i preparatywnejposiada wiele specyficznych cech i właściwości. Stąd tylko niektórez opisanych dalej zasad optymalnego stosowania preparatywnej i procesowejchromatografii cieczowej jest wspólnych dla innych technik preparatywnegostosowania chromatografii.Chromatografia w sprzężeniu z detekcją to niezastąpione technikianalityczne o ogromnym i ciągle rosnącym zakresie zastosowań. Przedewszystkim, jednak, jest to ważna grupa technik rozdzielania, które mogą służyćdo otrzymywania użytkowych ilości czystych substancji ze złożonychmieszanin. Istnieją takie problemy separacyjne, których rozwiązanie jest dotychczasmożliwe tylko z wykorzystaniem chromatografii. Wówczas chromatografiajest niezastąpiona. Istnieje wiele innych problemów rozdzielczych,które można „rozwiązać” innymi technikami rozdzielania, takimi jak, ekstrakcjaprzeciwprądowa, metody strącania, membranowe i inne oraz ich kombinacje.Często okazuje się, że chromatografia jest bardziej efektywną od innych,techniką uzyskania użytkowych ilości substancji. Jest tak nie tylkowtedy, gdy można zastosować warunki symulacji przemieszczania złoża(Simulated Moving Bed) i otrzymywać produkt w sposób ciągły, ale także,w przypadku periodycznego wykorzystywania tej techniki rozdzielania.Należy na wstępie podkreślić, że proces rozdzielania i otrzymywaniasubstancji czystych, z wykorzystaniem chromatografii, jest tym bardziej efektywny,im wyższa jest selektywność zastosowanego układu rozdzielczego,a w przypadku chromatografii cieczowej, im mniejsze zapewni się straty eluentu,tzn., im większy będzie stopień zawracanie eluentu do ponownegorozdzielania. Stąd, m.in., należy unikać stosowania warunków elucji gradientowejw przypadku wykorzystywania chromatografii cieczowej do otrzymy-79

wania substancji, zwłaszcza, w skali procesowej, ponieważ to zawsze podrażałączne koszty.Warto też zwrócić uwagę, że doświadczenia ostatnich lat wykazały, iższczególnie efektywną ekonomicznie techniką rozdzielania i otrzymywaniasubstancji w skali preparatywnej i procesowej jest chromatografia z eluentemnadkrytycznym (P-SFC). Jednakże, można tą techniką rozdzielać tylkosubstancje trwałe termicznie oraz nisko i średnio polarne. Rozdzielanie substancjiwysoko polarnych napotyka na trudności związane z koniecznościąstosowania polarnego modyfikatora cieczy nadkrytycznej.W konsekwencji chromatografia cieczowa w skali preparatywnej lubprocesowej (P-LC, albo P-HPLC) jest obecnie powszechnie i szeroko stosowanątechniką rozdzielania i otrzymywania czystych substancji i to nie tylkow laboratoriach, do uzyskiwania wzorców i niewielkich ilości określonychzwiązków chemicznych dla mikrosyntez, czy zbadania właściwości nowo odkrytychlub zsyntetyzowanych indywiduów chemicznych, ale także w skaliprocesowej, do produkcji, np., insuliny, antybiotyków peptydowych, hormonów,glikozydów i innych substancji aktywnych biologicznie, w tym, leków itp.GŁÓWNE OBSZARY ZASTOSOWAŃ CHROMATOGRAFII W SKALIPREPARATYWNEJ I PROCESOWEJChromatografia w zastosowaniu do otrzymywania czystych substancjima dwie nazwy:- chromatografia preparatywna, gdy ilości otrzymywanych substancji sąniewielkie i otrzymywanie ma charakter sporadyczny;- chromatografia procesowa (produkcyjna, przemysłowa), gdy proces prowadzonyjest systematycznie, w sposób cykliczny lub ciągły, a ilość produktujest znacznie większa (np. otrzymywanie leku, produktu handlowego itp.).Od początku stosowania chromatografii technika ta była wykorzystywanadwukierunkowo: jako technika analityczna i jako sposób na wydzieleniez mieszaniny interesującego składnika (lub składników) mieszaniny.Przez wiele lat, w okresie poprzedzającym automatyzację i mikroprocesory,detekcja, analityka ilościowa, a także preparatyka, z zastosowaniem chromatografiicieczowej, opierała się na stosowaniu szklanej kolumny, wypełnionejsorbentem i zbieraniu kolejnych frakcji eluatu, ich analizie typowymitechnikami analitycznymi, np. spektrofotometrycznie, czy refraktometrią.Analityk musiał często użyć do analizy całą ilość wydzielonej substancji,szczególnie, w przypadku wykonywania analizy śladowej, albo wydzielaniaskładników występujących w bardzo niskich zawartościach. Im lepsze uzyskiwałrozdzielenie od składników towarzyszących, tym wynik był bardziejrzetelny. Na tym etapie rozwoju chromatografii granica pomiędzy chromatografią,jako techniką analityczną, czy służącą do otrzymywania czystychsubstancji nie była wyraźna. Wprowadzenie detektorów przepływowych i rejestratorów,a później komputerów, wyraźnie rozdzieliło te dwa obszary zastosowańchromatografii.80

W chromatografii analitycznej celem jest uzyskanie rozdzielenia interesujących(czasem wszystkich) substancji w jak najkrótszym czasie, z rozdzielczościąR = ok. 1. Dąży się do zmniejszenia skali procesu i oszczędnościdrogich składników eluentu przez zmniejszenie wymiarów kolumny,zwłaszcza średnicy, dbając równocześnie o jak najwyższą sprawność rozdzielania.Stosuje się niewielkie objętości roztworu dozowanej mieszaniny,by obniżyć do minimum tzw. rozmycie poza-kolumnowe. Ze względu na wysokączułość współczesnych detektorów ilość dozowanej próbki może byćbardzo mała (poza przypadkami analityki śladowej) i eluat traktowany jestjako ściek, który zostaje poddany utylizacji.W skali preparatywnej, lub procesowej stosuje się, natomiast, kolumnyo dużych średnicach i wysokie natężenia przepływu eluentu.Chromatografia w zastosowaniu preparatywnym jest powszechnieuważana za szczególnie efektywną technikę rozdzielania wieloskładnikowychmieszanin w celu otrzymywanie czystych substancji do zastosowańbadawczych lub mikrosyntez, gdy problem rozdzielczy należy do trudnych,lub bardzo trudnych, gdy możliwy do osiągnięcia współczynnik rozdzieleniainteresującej nas substancji i pasm towarzyszących jest niższy od 1.05.Również, w skali procesowej znajduje coraz więcej zastosowań do otrzymywaniasubstancji w ilości nawet do kilkudziesięciu kilogramów na dobę.Szczególnie, w nowoczesnym przemyśle farmaceutycznym można dzisiajspotkać hale produkcyjne, gdzie znajdują się, wyłącznie, kolumny chromatograficznei ich oprzyrządowanie w postaci pomp eluentu, pomp dozującychwsad, zbiorników, kolektorów frakcji, urządzeń do wzbogacania frakcji eluatuw postaci odparowywaczy próżniowych, lub membranowych wymiennikówmasy oraz urządzeń do izolacji substancji w postaci krystalicznej z frakcjieluatu.Najważniejsze dziedziny preparatywnych i procesowych zastosowańchromatografii to:- izolacja produktów biotechnologii, szczególnie białek i enzymów, polisacharydów,fosfolipidów, określonych fragmentów DNA, lub RNA itp.;- izolacja produktów naturalnych pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego,- izolacja produktów oraz zanieczyszczeń powstałych podczas syntezy leków(farmaceutyków, składników kosmetyków itp.),- izolacja lantanowców i transuranowców,- izolacja użytkowych ilości substancji do badań i mikrosyntez w zakresiechemii organicznej, biochemii, mikrobiologii itp.,- izolacja izomerów optycznych.TECHNIKI I MECHANIZMY CHROMATOGRAFII UŻYWANEW ZASTOSOWANIACH PREPARATYWNYCH ORAZ NAJWAŻNIEJSZEZASADY POWIĘKSZANIA SKALI ROZDZIELANIATechniki chromatograficzne stosowane w skali preparatywnej i procesowej to:- Kolumnowa, elucyjna chromatografia cieczowa (P-LC, lub P-HPLC) – największyzakres preparatywnych i procesowych zastosowań chromatografii,81

- Kolumnowa, elucyjna chromatografia gazowa (P-GC) – zastosowaniagłównie do izolacji substancji zapachowych i składników olejków eterycznych,- Kolumnowa, elucyjna chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym(P-SFC), najbardziej efektywna ekonomicznie domena zastosowańchromatografii preparatywnej i procesowej, ale wiąże sie z wielomatrudnościami metodycznymi i technicznymi,- „Flush Chromatography” (F-LC) – technika podobna do cienkowarstwowej,ale realizowana w kolumnie, wypełnionej niezwilżonym sorbentem,z wykorzystaniem wymuszonego, albo niewymuszonego przepływu eluentu,- Planarna (cienkowarstwowa) preparatywna chromatografia cieczowa(P-TLC), przydatna do otrzymywania bardzo niewielkich ilości substancji.Do celów preparatywnych wykorzystywane są wszystkie poznanechromatograficzne mechanizmy rozdzielcze i wszystkie znane układy chromatograficzne.Wykorzystuje się chromatografię adsorpcyjną w układzie faznormalnych (NP) i odwróconych (RP), chromatografię oddziaływań hydrofilowych(HILIC), chromatografię jonowymienną (IEC), mechanizmy sita molekularnegoi sączenia molekularnego (GPC/SEC), chromatografię powinowactwa(AC), mechanizm oddziaływań hydrofobowych (HIC) itd.Wykorzystuje się te same rodzaje wypełnienia kolumny, jak w chromatografiianalitycznej, ale najczęściej o nieco większych ziarnach oraz jednorazowodozuje możliwie jak największą ilość mieszaniny komponentów dokolumny, w przeliczeniu na masę wypełnienia, tzn., dąży się do uzyskiwaniamaksymalnego, możliwy do zastosowania stopnia przeładowania kolumny(sorbentu). To warunkuje jak najwyższą wydajność otrzymywania substancji.Na rys. 1 zamieszczono przykłady chromatogramów, uzyskanychz zastosowaniem kolumn analitycznych, pełniących w tym przypadku funkcjękolumn modelowych, otrzymane, w warunkach braku przeładowania kolumnyoraz w warunkach różnego stopnia przeładowania stężeniowego, alboobjętościowego, w układach faz odwróconych i normalnych. Warunki rozdzielaniaoraz masy substancji w roztworach dozowanych do kolumnypodano w opisie rysunku.W komentarzu do tego rysunku warto dodać, że szczególne korzyści w zastosowaniachpreparatywnych, daje stosowanie warunków dynamicznie generowanejfazy stacjonarnej w układach faz normalnych, tzn., z zastosowanienp. porowatego żelu krzemionkowego, jako sorbentu i mieszaninynierozpuszczalnego w wodzie nisko polarnego rozpuszczalnika organicznego(chlorku metylenu, etylenu, chloroformu, eteru di-etylowego, MTBE, octanumetylu, etylu itp.), w mieszaninie z niewielką ilością rozpuszczalnika polarnego,rozpuszczalnego w wodzie (metanolu, etanolu, acetonitrylu,dioksanu itp.) oraz z niewielkim dodatkiem wody do eluentu - o stężeniu bliskimstężeniu nasycenia, ale nieco niższym. Takie warunki są bardzo przydatnedo rozdzielania glikozydów, alkaloidów itp. substancji (patrz chromatogramyna rys. 1 a i a’) i są szczególnie korzystne, pod względemmaksymalizacji produktywności kolumny.82

Rys. 1. Zestawienie typowych chromatogramów, ilustrujących różne warunki rozdzielania mieszanin tych samych substancji bez i w warunkachprzeładowania kolumny, otrzymane z zastosowaniem kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej w skali modelowej orazw warunkach liniowej odpowiedzi detektora – praca nad doborem optymalnych warunków rozdzielania. Szczegółowy opis rysunku na kolejnejstronie83

Przykłady a, a’, b, b’, c, c’ dotyczą optymalnych warunków rozdzielania z przeładowaniem stężeniowym,natomiast, przykłady d – f dotyczą rozdzielania substancji w niekorzystnych układachchromatograficznych lub w warunkach znikomej rozpuszczalności w eluencie (koniecznestosowanie przeładowania objętościowego).a, a’ – rozdzielanie lanatozydów A (LA), B (LB), C (LC) z odpadu poprodukcyjnego, powstałegopodczas otrzymywania lanatozydu C z zastosowaniem ekstrakcji p-prądowej. Przykład wykorzystywaniachromatografii podziałowej z dynamicznie generowaną fazą stacjonarną dla rutynowegootrzymywania substancji. a: ⎯⎯ warunki przeładowania (2·10 -3 g mix /g morb ); - - - warunkibraku przeładowania („analityczne”); a’: warunki dolnej granicy przeładowania stężeniowego(2·10 -3 g mix /g morb );Warunki chromatogr.: kolumna 800x6 mm i.d., Kieselgel SI 60 40-63 um (Merck), eluent:CH 2 Cl 2 :CH 3 OH:H 2 O 92:8:0,2 V/V, w = 5 ml/min, detektor UV-254 (KABiD), czułość –1,28 AU/FS (oprócz - - -: 0,08 AU/FS).b, b’ – rozdzielanie „modelowej” mieszaniny o (oNA), m (mNA), p (pNA)-nitroaniliny w warunkachchromatografii adsorpcyjnej; b: ⎯⎯ warunki przeładowania stężeniowego(6·10 -3 g mix /g morb ), - - - warunki „analityczne” (6·10 -3 g mix /g morb ), b’: warunki dolnej granicy przeładowania(2·10 -3 g mix /g morb );Warunki chromatograficzne: kolumna 100x4 mm i.d., Lichrosorb SI 60 5 um, eluent: n-heptan –dioksan 8:2 V/V, 1 ml/min, detektor UV 280 nm (Knauer), długość drogi optycznej 0,4 mm, czułość– b: ⎯⎯ 2,56 AU/FS, - - - 0,08 AU/FS, b’: 0,16 AU/FS.c, c’: rozdzielanie modelowej mieszaniny estrów CH 3 -, C 2 H 5 -, C 3 H 7 -kwasu 40H benzoesowegow układzie faz odwróconych (RP18); c: ⎯⎯ warunki przeładowania stężeniowego(10 -2 g mix /g morb ), - - - warunki „analityczne” (10 -5 g mix /g morb ); c’: warunki dolnej granicy przeładowaniastężeniowego (2x10 -4g mix /g morb ); Warunki chromatograficzne: kolumna 120x4 mm i.d.,Nucleosil RP18 7 um, eluent: CH 3 OH - H 2 O 1:1 V/V, 1 ml/min, detektor UV 280 nm, długośćdrogi opt. 0,4 mm (Knauer), czułość - c: ⎯⎯ 2,56 AU/FS, - - - 0,08 AU/FS, c’: 0,32 AU/FS.d – rozdzielanie estrów kwasu 4-OH benzoesowego: C 3 H 7 - (1), C 2 H 5 - (2), CH 3 - (3) w układziefaz normalnych na żelu krzemionkowym Lichrosorb SI 60 5 um – kolumna 250x4 mm i.d., eluent:heptan – dioksan 8:2 V/V, 2 ml/min, 256 nm; ⎯⎯ warunki granicy przeładowania stężeniowego,- - - warunki „analityczne”;e, f – rozdzielanie o, m, p – nitroaniliny (patrz rys. 1b, b’) w układzie faz odwróconych: NucleosilC18 7 μm, kolumna 120x4 mm, eluent: CH 3 OH - H 2 O 1:1 V/V, 2 ml/min, e – warunki granicyprzeładowania stężeniowego, f – warunki „analityczne”;g – rozdzielanie benzenu (c i = 2 mg/ml, pik 1) i naftalenu (c i = 0,2 mg/ml, pik 2) w warunkachznikomej rozpuszczalności substancji w eluencie: ⎯⎯ obj. dozowania 2 ml, warunki typowegoprzeładowania objętościowego, - - - obj. dozow. 20 μm warunki „analityczne”; kolumna: NucleosilC18 7 μm, 250x4 mm i.d., 1 ml/min; W przypadku chromatogramów d-f detektor UV254 nm, droga opt. 0,4 mm.Najczęściej optymalne warunki rozdzielania w skali preparatywnej,a szczególnie w skali procesowej dobiera się z zastosowaniem kolumnymodelowej. Dotyczy to doboru selektywności układu chromatograficznego,sprawności rozdzielania - wielkość ziaren wypełnienia, długości kolumny,prędkości przepływu eluentu, możliwego do osiągnięcia stopnia przeładowaniasorbentu oraz położenia na chromatogramie punktów zbierania frakcjiitp. parametrów decydujących o efektywności rozdzielania i zbierania frakcjieluatu oraz o czystości otrzymywanego produktu. Funkcję kolumny modelowejpełni często kolumna analityczna, albo semi-preparatywna o średnicydc = 4 - 8 mm, jednak, nie jest to optymalne, ponieważ kolumna modelowapowinna być wypełniona nie tylko tego samego typu sorbentem, jak preparatywna,ale tym samym sorbentem, także w zakresie wielkości ziaren orazpowinna być tej samej długości, jak kolumna preparatywna, albo procesowa.Następnie można w sposób bardzo prosty dokonać powiększenia skali roz-84

dzielania, przechodząc do stosowania kolumny o odpowiednio większejśrednicy, nie zmieniając ani sorbentu, ani długości kolumny. Średnicę kolumnypreparatywnej, konieczną do uzyskania potrzebnej wydajności rozdzielania,oblicza się wówczas, zakładając odpowiednie zwiększenie objętościdozowanej mieszaniny substancji rozdzielanych oraz natężeniaprzepływu eluentu, proporcjonalnie do stopnia zwiększenia pola przekrojupoprzecznego wypełnienia kolumny preparatywnej lub procesowej i modelowej.Na rys. 2 naszkicowano schematycznie opisaną powyżej zasadę postępowaniaw związku z doborem optymalnych warunków rozdzielania substancjiw skali preparatywnej, albo procesowej.Rys. 2. Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielaniaw celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej.M – skala modelowa rozdzielania, P – skala preparatywna i procesowa rozdzielaniaWarto też zwrócić uwagę, że w prawie wszystkich w/w domenach zastosowańchromatografii - szczególnie, gdy trzeba rozdzielać tylko dwiesubstancje i gdy nie jest konieczne stosowanie elucji gradientowej - jestmożliwe wykonywanie rozdzielania w warunkach procesu ciągłego (SMB).Polega on na równoczesnej pracy ośmiu do kilkunastu kolumn, z odpowiednimprzesunięciem fazy rozdzielania w każdej z nich. Roztwór rozdzielanychsubstancji („wsad”) i eluent („ekstrahent”), wprowadza się w sposób ciągłyoraz w sposób ciągły odbiera się składnik A (o niższej retencji – „ekstrakt)i składnik B (o wyższej retencji – „rafinat”). Odpowiednie miejsca doprowadzania/ odbioru w/w strumieni są okresowo zmieniane przez odpowiednisystem sterowania komputerowego. W konsekwencji frakcje eluentu, zawierająceposzczególne rozdzielane substancje są zbierane bez przerwy. W takichprzypadkach okazuje się, że chromatografia może być najbardziej opłacalnaekonomicznie ze wszystkich technik rozdzielania, możliwychpotencjalnie do stosowania.85

ZJAWISKA PRZEŁADOWANIA KOLUMNY (POWIERZCHNISORPCYJNEJ) I ICH EFEKTYWNE WYKORZYSTANIE W WARUNKACHCHROMATOGRAFII PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJRóżnica warunków preparatywnych, w porównaniu do warunkówchromatografii analitycznej, polega na konieczności wykorzystania w maksymalnymstopniu powierzchni sorpcyjnej, lub fazy stacjonarnej. Im wyższyudaje się osiągnąć stopień przeładowania kolumny, tym bardziej efektywnyekonomicznie jest proces rozdzielczy. Przy czym, rozdzielanie jest szczególnieefektywne, gdy można uzyskać warunki silnego przeładowania stężeniowegokolumny. Istnieje wówczas możliwość rozdzielania jednorazowo dook. 10 -2 g mieszaniny rozdzielanych substancji / g sorbentu typu żel krzemionkowylub chemicznie modyfikowany żel krzemionkowy i uzyskiwanieproduktu o czystości powyżej 99.99 %. Może to, jednak, mieć miejsce tylkowtedy, gdy rozpuszczalność rozdzielanych substancji w eluencie jest dostateczniewysoka oraz, gdy kolumna o wysokiej sprawności (wysokiej liczbiepółek teoretycznych), wypełniona techniką zawiesinową na mokro, albo namokro - techniką dynamicznej kompresji aksjalnej (DAC), jest wykorzystywanaw warunkach „niekończonej średnicy). Wówczas piki chromatograficznesą kształtu zbliżonego do trójkąta prostokątnego, którego prawy dolnywierzchołek leży w punkcie retencji, jaka by została uzyskana w warunkachbraku przeładowania (analitycznych - patrz rys. 1 a, b, c).W przypadku niskiej rozpuszczalności rozdzielanych substancji w eluenciemożliwe jest uzyskanie jedynie przeładowania objętościowego. Niemożna wówczas osiągnąć tak wysokiej efektywności ekonomicznej rozdzielania– teoretycznie, nawet 50 razy mniejszą, niż w warunkach przeładowaniastężeniowego. Piki chromatograficzne mają, wówczas, kształt zbliżonydo prostokąta, co jest spowodowane koniecznością dozowania dużych objętościroztworu substancji rozdzielanych o stosunkowo niskim stężeniu (patrzrys. 1g).W przypadku trudnych, lub bardzo trudnych problemów separacyjnych(współczynnik selektywności α zbliżony do 1.01), Dąży się również do prowadzeniarozdzielania w warunkach przeładowania kolumny, lecz w praktycekonieczne jest poprzestanie na dozowaniu jednorazowo do kolumny tylkotakiej ilości mieszaniny substancji rozdzielanych, aby nie przekraczać granicyliniowości odpowiedniej izotermy sorpcji (w praktyce do ok. 5.10 -4 g/g sorbentutypu żel krzemionkowy i fazy stacjonarne związane do powierzchni żelukrzemionkowego). W przeciwnym razie strefy rozdzielanych substancjinakładają się na siebie wzajemnie i czystość rozdzielanych substancji będzieniewielka. Wówczas efektywność ekonomiczna separacji też pozostajeniewielka (patrz rys. 1 d, e).Opisane powyżej reguły mają bezpośredni związek ze zjawiskamisorpcji substancji rozdzielanych na powierzchni wypełnienia kolumny i z rodzajemizotermy sorpcji. Najczęściej izoterma sorpcji ma w warunkachchromatografii, w tym, cieczowej - charakter izotermy Langmuira, Zdarzająsię też bardzo korzystne dla wydajności rozdzielania, przypadki, sorpcji wie-86

lowarstwowej, gdy charakter izotermy sorpcji jest wklęsły (typu „S”). Narys. 3. zamieszczono zestawienie różnych warunków rozdzielania, wykorzystywanychw chromatografii preparatywnej przy niewielkim i znacznym stopniuprzeładowania kolumny oraz rodzaje spotykanych izoterm sorpcji i związekzakresu stężenia w roztworze dozowanym do kolumny z zakresemizotermy sorpcji oraz kształtem pików i zmianą retencji substancji w porównaniudo warunków braku przeładowania (warunków „analitycznych”).W podpisie pod rysunkiem zamieszczono dodatkowe wyjaśnienia.Rys. 3.Część I: Zestawienie form pików chromatograficznych dla pojedynczej substancji eluowanejw kolumnie chromatograficznej, w zależności od typu przeładowania kolumny (po lewej stroniecyfr odniesienia naszkicowano profile stężenia w chwili dozowania roztworu substancji eluowanejdo kolumny).Oznaczenia: 1 – brak przeładowania kolumny, 2 – dolna granica przeładowania danego typu,3 – typowy przykład przeładowania danego typu;Część II: Kształty i zakresy izoterm sorpcji odpowiednie dla pików chromatograficznych zamieszczonychpowyżej (linią pogrubioną zaznaczono zakresy izoterm sorpcji charakterystycznedla danego typu przeładowania kolumny);Część III: Zestawienie charakteru typowych chromatogramów otrzymanych w przypadku rozdzielaniadwóch substancji w warunkach danego typu przeładowania kolumny, odpowiednio:z zachowaniem warunku Rs=1 (środka części fragmentu III – piki rozdzielane praktycznie dopoziomu linii bazowej) i po zwiększeniu ilości substancji wprowadzonej do kolumny (piki częściowo„nałożone” wzajemnie). W górnym fragmencie cz.III naszkicowano odpowiednie chromatogramyotrzymane w warunkach braku przeładowania (tzw. „warunkach analitycznych”);87

ZASADY OPTYMALNEGO STOSOWANIA PREPARATYWNEJI PROCESOWEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJParametry opisujące wydajność i produktywność kolumnyWydajność kolumny definiuje się jako masę interesującej nas substancji,otrzymywaną w jednostce czasu (1):R h = Q r / t c (1)Produktywność kolumny w chromatografii preparatywnej i procesowejjest definiowana najogólniej w ten sposób, że jest obliczana da jednostkiprzekroju poprzecznego wypełnienia kolumny (2). To pozwala porównywaćefektywność rozdzielania tych samych substancji z zastosowaniem kolumno różnych wymiarach, a wartość maksymalna oznacza optimum generalne.W każdym przypadku obliczenia oraz porównywanie wyników jest wykonywanedla warunków otrzymywania produktu o takiej samej czystości:P tQQr*iQit A= [ckg2h * m] (2)P t - wydajność wyrażona jako masa substancji otrzymana w ciągu jednostkiczasu i dlajednostki powierzchni przekroju kolumny;Q i - masa substancji wprowadzona do kolumny;Q r - masa substancji o czystości (p) , otrzymana z kolumny;t c - czas trwania procesu rozdzielania (w warunkach repetycyjnego dozowania– czas trwania jednego etapu rozdzielania);A - powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny A = Πd c 2 /4 ;WyrażenieQQrinazwane jest stopniem odzysku.Przedstawione wyrażenia uwzględnia stronę „korzyści”. Do strony„koszty”, należą koszty związane ze bezpowrotnym zużyciem składnikóweluentu (jeśli ma miejsce), usuwaniem składników eluentu z frakcji eluatui odzyskiem eluentu, cena kolumny i urządzeń pomocniczych, koszty robociznyitd.Optymalne przeładowanie kolumny w warunkach pracy preparatywnejjest najczęściej takie, aby wartość R między izolowaną substancją, a najbliższymi„zanieczyszczeniami”, widocznymi na chromatogramie wynosiła ok. 1.W warunkach rozdzielania procesowego korzystne jest stosowanie wyższegostopnia przeładowania, utrzymując R na optymalnym poziomie (częstook. 0.75) i „wycinając” oraz zawracając do ponownego rozdzielania, odpo-88

wiednie między-frakcje. Trzeba dodać, że eksperymentalne określenieoptymalnej wartości R oraz punktów zbierania frakcji, zapewniającychotrzymanie maksymalnej produktywności kolumny i wymaganej czystościproduktu jest bardzo pracochłonne. Jeżeli nie dysponujemy odpowiednimpoprawnym komputerowym modelem rozdzielania, warto to wykonać doświadczalnetylko wtedy, gdy optymalizuje się przeładowanie kolumny i zbieraniefrakcji dla warunków procesowego rozdzielania i dla produkcji substancji.Dla sporadycznego wykonywania rozdzielania preparatywnego,znacznie bardziej celowe jest jednorazowe dozowanie takiej objętości możliwiestężonej mieszaniny substancji, by otrzymywać R ok. 1 i zbierać całyzakres pików interesujących nas substancji widocznych na chromatogramie.Zasadę doboru optymalnej ilości jednorazowo dozowanej do kolumnymieszaniny substancji w warunkach chromatografii preparatywnej, albo procesowejzilustrowano na rys. 4.Do parametrów, które mają istotny wpływ na wydajność preparatywnego,albo procesowego rozdzielania należą: ilość dozowanej substancji(Vi * Ci), średnica kolumny (dc), długość wypełnienia kolumny (Lc), natężenieprzepływu eluentu (w), powierzchnia właściwa materiału stanowiącegowypełnienie kolumny (F), wielkość ziaren wypełnienia (dp), wartość współczynnikaretencji substancji izolowanej (ki) i współczynnika retencji ostatniegopiku (kn). Wpływ każdego z tych parametrów na wydajność rozdzielaniawymaga oddzielnego omówienia.Ilość dozowanej substancjiIlość dozowanej substancji (m i ) określona jest iloczynem objętości (V i )i stężenia izolowanej substancji (c i ):m i = V i * c i (3)Rys. 4. Ilustracja zasady określania ilości substancji dozowanych jednorazowo do kolumny orazwyznaczania punktów zbierania frakcji w warunkach chromatografii procesowej89

- przeładowanie objętościoweW chromatografii analitycznej próbka jest dozowana w taki sposób,aby ze wzrostem dozowanej ilości m i rosła tylko wysokość piku. Aby spełnićten warunek objętość próbki nie powinna przekroczyć około ¼ szerokościpiku (wyrażonej w jednostkach objętości), mierzonej przy podstawie piku,a stężenie nie powinno być większe niż 10 -4 g substancji na g wypełnieniakolumny.Zwiększenie objętości dozowania (bez wzrostu stężenia – warunkiprzeładowania objętościowego), powoduje wzrost wysokości i szerokości piku.Jeżeli objętość przekroczy graniczną wartość, dalszy wzrost powodujewyłącznie poszerzenia pasm. W takim przypadku stężenie substancji w eluacieobserwowane jako wysokość piku nie zmienia się (pojawi się „odcinek”piku o stałej wysokości). Objętość, od której obserwuje się pik z plateau wynosiokoło 6 odchyleń standardowych piku otrzymanego po dozowaniupróbki analitycznej, tj. o znikomej objętości i niskim stężeniu.Wzrost szerokości piku będący wynikiem dużej objętości dozowaniaodbywa się poprzez wzrost objętości elucji opadającej części piku, podczasgdy położenie frontu piku nie ulega zmianie i odpowiada położeniu pikuw warunkach chromatografii analitycznej i nie zależy od retencji substancjiani jej rodzaju. Maksymalną objętość, którą można dozować w celu zwiększeniawydajności procesu można oszacować z chromatogramu, otrzymanegodla próbki analitycznej. Jest to, zmierzona na poziomie linii podstawoweji wyrażona w jednostkach objętości - odległość pomiędzy pikamisubstancji, które są celem rozdzielania.- przeładowanie stężenioweWzrost stężenia substancji w próbce dozowanej do kolumny (przy zachowaniumałej objętości dozowania (V i )), powoduje poszerzenie pasma,a kształt pików zależy od rodzaju izotermy sorpcji (patrz rys. 3 oraz 1 i 4), aletakże od stopnia nieliniowości odpowiedzi detektora. Zależności retencji odkształtu izotermy sorpcji przedstawiono schematycznie na rys 3, a dla pikówotrzymywanych w praktyce, na rys. 1.Adsorpcja substancji z roztworów w układach ciecz - ciało stałe najczęściejprzebiega wg izotermy Langmuira. W nieliniowym zakresie tej izotermy,dla wysokiego stężenia substancji, wartość współczynnika retencji (k)maleje ze wzrostem stężenia, tzn., że ta część pasma, gdzie jest wyższestężenie wędruje szybciej. Pasmo staje się niesymetryczne, w kształcie trójkąta,ze stromym frontem. Wzrost stężenia próbki powoduje wzrost wysokościmaksimum piku i poszerzenie pasma przez zmniejszenie objętość elucjifrontu. Tył piku pozostaje w przybliżeniu w tym samym miejscu, jak dla pikuanalitycznego.Zwiększanie wydajności procesu rozdzielania preparatywnego poprzezwzrost stężenia roztworu dozowanego jest bardziej korzystne, niż zachowywanieprzeładowania objętościowego (ze względu na większe stęże-90

nie substancji w eluacie, można uzyskać ponad 50-cio krotny wzrost wydajnościkolumny). Ograniczeniem jest rozpuszczalność składnikówrozdzielanej mieszaniny w eluencie, która z reguły maleje ze wzrostem retencjirozdzielanego składnika.Powyższe stwierdzenia są poprawne, przy założeniu, że rozpuszczalnikiemroztworu dozowanego do kolumny jest eluent (albo ciecz o początkowymskładzie, w przypadku elucji gradientowej) oraz gdy lepkość roztworudozowanego jest niewiele wyższa od lepkości eluentu. Gdy rozpuszczalnikiemjest ciecz o wyższej sile elucyjnej niż eluent i/albo roztwór dozowanyjest bardzo lepki, to ze wzrostem stężenia roztworu dozowanego do kolumnychromatograficznej mogą być związane dodatkowe problemy, powodującew konsekwencji różnego typu zniekształcenia pików chromatograficznych.Efekty te zilustrowano na rys. 5.Rys. 5. Zestawienie zaobserwowanych w praktyce rodzajów zniekształceń pikówchromatograficznych w warunkach chromatografii preparatywnej z uwzględnieniem warunków,gdy inna ciecz niż faza ruchoma pełni rolę rozpuszczalnika dla sporządzenia roztworudozowanego do kolumnyOznaczenia:a – kształt piku w warunkach górnej granicy braku przeładowaniaa 1 – naturalny kształt piku w warunkach przeładowania objętościowegob – naturalny kształt piku w warunkach przeładowania stężeniowegob 1 – zniekształcenie piku spowodowane zbyt wysoką różnicą lepkości i napięć powierzchniowychmiędzy roztworem dozowanym do kolumn i eluentemb 2 – zniekształcenie piku w sytuacji niedostatecznej rozpuszczalności substancji rozdzielonejw eluencie – przypadek „wypadania oleju” podczas dozowaniab 3 – zniekształcenie piku w sytuacji niedostatecznej rozpuszczalności substancji rozdzielonejw eluencie – przypadek „wypadania kryształów” podczas dozowania- kształt piku bez przeładowania, lub w warunkach górnej granicy braku przeładowania orazusytuowanie piku w tych warunkachc – naturalny kształt piku w warunkach izotermy sorpcji typu „s” (dość rzadki, lecz korzystnyprzypadek w praktyce)c s , c m – stężenia substancji rozdzielanej odpowiednio: w fazie stacjonarnej (s) i ruchomej (m) jakooznaczenia osi odpowiednich izoterm sorpcji naszkicowanych w pobliżu odpowiadającym impikom chromatograficznym91

Średnica kolumnyNajbardziej celowe jest powiększanie skali rozdzielania substancji z zastosowaniemkolumn tej samej długości, wypełnionych tym samym sorbentem,z zachowaniem tego samego układu chromatograficznego i warunków pełnegopodobieństwa fizycznego. Zwiększeniu powinna, więc, ulec tylko średnicakolumny. Wydajność otrzymywania produktu wzrośnie proporcjonalniedo zmiany powierzchni przekroju poprzecznego kolumny, a więc proporcjonalniedo drugiej potęgi zmiany średnicy kolumny z modelowej do preparatywnej.dm2= m1*(4)d2c22c1m2, m1- masy substancji, dozowanych, odpowiednio, do kolumny o średnicydc2i dc1;Według tej samej proporcji należy również zwiększyć natężenie przepływueluentu, a więc, odpowiednio wzrośnie zużycie eluentu. Natomiast, liniowaprędkość przepływu eluentu powinna być zachowana bez zmiany. Nie powinienteż zmienić się czas rozdzielania, położenie punktów zbierania frakcjina chromatogramie, sprawność kolumny, ani ciśnienie pompowania eluentu.Pod warunkiem, jednak, opanowania umiejętności uzyskiwania takiej samejsprawności kolumny modelowej i preparatywnej lub procesowej, co nie zawszejest łatwe do osiągnięcia, choć z pewnością możliwe. Zależność wydajnościi niektórych innych parametrów procesu rozdzielania w funkcji średnicykolumny, pozostają wtedy zgodne z wyrażeniem (4). Zależność (4) dotyczytakże zmiany wydajności otrzymywania substancji (R i ), objętości dozowania(Vi) i natężenia przepływu eluentu (w).Długość kolumnyWraz z długością kolumny (L c ) proporcjonalnie rośnie masa wypełnienia,lecz liczba półek teoretycznych jest proporcjonalna do Lc, stądw dłuższej kolumnie pasma substancji są bezwzględnie bardziej rozmyte,ale względnie - mniej. Wzrost długości kolumny powoduje też zwiększenieoporów przepływu (ΔP), co, w przypadku ograniczenia maksymalnego ciśnieniapracy aparatury preparatywnej lub procesowej może uniemożliwićuzyskanie optymalnego natężenia przepływu eluentu.Istnieje najmniejsza, krytyczna długość kolumny (Lc min ), wypełnionejokreślonym sorbentem, a w istocie najmniejsza liczba tzw. półek teoretycznychkolumny (N min ), która warunkuje minimalny konieczny stopień rozdzieleniainteresujących nas substancji, wzajemnie od siebie, albo od niepożą-92

danych składników. Zwiększenie długości kolumny, powyżej tej krytycznej,minimalnej długości, jest bardzo korzystne i celowe, zwłaszcza, gdy jednocześniemożna zwiększać wartość liniowej prędkości przepływu eluentu (u).Umożliwia to znaczne zwiększenie wydajności rozdzielania. Zależność produktywnościkolumny (P t ) od jej długości (Lc), otrzymana w warunkach stałejprędkości liniowej eluentu (u) jest, jednak, nieliniowa. Osiąga się optymalnądługość kolumny - znacznie większą, niż potrzebna do rozdzielania analitycznego,w warunkach bez przeładowania, jednak dalsze zwiększanie długościkolumny jest już niecelowe. Dla warunków zachowania stałej wartościprędkości przepływu eluentu zilustrowano to na rys. 6, pokazującym u górywykresy zależności produktywności kolumny od długości wypełnienia,otrzymane na podstawie równań uzyskanych teoretycznie przez Hupe i Lauera,oraz poniżej, wykresy uzyskane doświadczalne, podczas pracy nadoptymalizacją warunków otrzymywania lantozydu C z ekstraktów suszuz brunatnicy wełnistej.Rys. 6. Zależność produktywności czasowej (P t ) kolumny chromatograficznej od długości (Lc)kolumny w warunkach stałej prędkości przepływu eluentu. Krzywe a, b, c, d, zostały uzyskanew wyniku obliczeń teoretycznych przez Hupe i Lauera, odpowiednio, dla wypełnień o wielkościziaren dp = 5, 7, 10, 32.5 μm, a krzywe 1, 2, 3, podczas badań nad optymalizacją warunkówotrzymywania lanatozydu C z ekstraktu suszu z brunatnicy wełnistej dla kolumn wypełnionychżelem krzemionkowym o średnich wielkościach ziaren, odpowiednio: 10, 45, i 102 μm93

Średnica ziaren wypełnienia kolumnyŚrednica ziaren wypełnienia ma zasadniczy wpływ na sprawność kolumny.Krytyczną, minimalną liczbę półek teoretycznych, niezbędną do preparatywnegorozdzielenia mieszaniny substancji można osiągnąć zmieniającdługość kolumny, albo / i średnicę ziaren wypełnienia kolumny. Przy zmianieskali procesu rozdzielania w warunkach przeładowania objętościowego,L cważna jest nie tyle sama długość kolumny L c , lecz stosunekd 2p , tj. proporcjadługości kolumny do kwadratu średnicy ziaren wypełnienia. W warunkachprzeładowania stężeniowego korzystne jest jednoczesne zmniejszanie wielkościziaren wypełnienia oraz długości kolumny, jednak, zachowanie stałejLcwartości proporcji nie jest wówczas optymalną regułą. Bardziej korzystnejest zastosowanie o ok. 30% dłuższej kolumny, niż to wynika z obliczenia2dpotrzymanego na podstawie tej reguły. Zachowując te proporcje oraz zwiększającjednocześnie prędkość przepływu eluentu, można uzyskać znaczącywzrost wydajności rozdzielania preparatywnego lub procesowego, z zachowaniemstałej czystości produktu.Można generalnie stwierdzić, że zmniejszanie wielkości ziaren wypełnieniakolumny preparatywnej (dp) jest zawsze bardzo korzystne dla uzyskiwaniawzrostu wydajności procesu rozdzielania oraz czystości otrzymywanychsubstancji i jest tym bardziej celowe, im trudniejszy jest problemrozdzielczy (im mniejsze wartości α). Ograniczeniem może być, jednak,maksymalna wartość ciśnienia (ΔP max ), jakie można zastosować do rozdzielania.Optymalną wielkość ziaren wypełnienia kolumny preparatywnej lubprocesowej można określić jako wartość w zakresie 10-25 mikrometrów i jestona tym niższa, im trudniejszy jest problem rozdzielczy (im niższa wartość αw warunkach bez przeładowania kolumny).W przypadku rozdzielania substancji makromolekularnych, ich bardzoniekorzystna kinetyka dyfuzji (niskie wartości współczynników dyfuzji) powodują,że zwiększanie liniowej prędkości przepływu jest niekorzystne i prowadzido znacznego względnego poszerzenia pików. Wówczas zmniejszaniewielkości ziaren wypełnienia i, jeśli to możliwe z jednoczesnym zwiększaniemtemperatury pracy kolumny, w zasadniczym stopniu poprawia rozdzielczośćR i umożliwia zwiększanie przeładowania, a stąd i wydajności orazproduktywności kolumny.Prędkość przepływu fazy ruchomejWzrost prędkości przepływu fazy ruchomej powyżej prędkości optymalnejdla zależności H=f(u), powoduje zmniejszenie czasu trwania rozdzielaniai tym samym wzrost wydajności kolumny. Wpływa, jednak, ujemnie nasprawność rozdzielania, powodując poszerzenie pasm. To, przy założonejczystości wydzielanej substancji, wymusza konieczność zmniejszenia masy94

dozowanej próbki albo zmniejszenie objętości zbieranych frakcji. Spadeksprawności kolumny powoduje też zmniejszenie stężenia substancji w eluaciewypływającym z kolumny. Należy, jednocześnie, brać pod uwagę ograniczenia,wynikające z możliwości uzyskana odpowiednio wysokiego ciśnieniapompowania eluentu na wlocie do kolumny oraz ograniczonąwytrzymałość mechaniczną kolumny i jej wypełnienia.Bez uwzględniania ograniczeń wytrzymałościowych, zależność produktywnościkolumny (P t ) od szybkości przepływu eluentu (u) nie jest liniowai posiada maksimum, którego wartość jest tym wyższa im mniejsze są ziarnawypełnienia kolumny (dp). Dalsze zwiększanie prędkości eluentu jest nieopłacalnei z wielu powodów niekorzystne. Zilustrowano to na rys. 7 pokazującymu góry wykresy zależności, otrzymanych na podstawie równań otrzymanychteoretycznie przez Hupe i Lauera oraz poniżej - krzywe, otrzymanena podstawie wyników uzyskanych doświadczalne podczas pracy nad optymalizacjąwarunków otrzymywania lantozydu C z ekstraktów suszu brunatnicywełnistej.Rys. 7. Zależność produktywności czasowej kolumn chromatograficznych wypełnionychsorbentem o różnych wielkościach ziaren od prędkości przepływu eluentu. Krzywe teoretycznewzięto z pracy Hupe i Lauera Krzywe eksperymentalne otrzymano podczas badańnad doborem optymalnych warunków procesu otrzymywania lanatozydu C.Oznaczenia: a, b – dp = 102 μm, Lc odpowiednio: 800 mm (a) i 1600 mm (b);c, d, e – dp = 50 μm, Lc odpowiednio: 400, 800 i 1200 mm; f – dp = 10 μm, Lc = 250 mm95

RetencjaSilna retencja składników mieszaniny jest niekorzystna ze względu nanadmierne zużycie eluentu, a przede wszystkim wzrost czasu rozdzielania.Jednakże, dla dwóch substancji o różnej retencji, względnie wolniej rośnieszerokość pasma wraz z ilością dozowanej substancji dla pików o większejretencji, niż dla substancji o niższej wartości k. Optymalna wartość współczynnikaretencji (k) dla pierwszego rozdzielanego składnika mieszaninydwóch substancji nie powinna przekraczać 2-3, a dla ostatniego powinnabyć większa od 2-3, ale nie wyższa niż ok. 12 [3].Maksymalizacja selektywności, czyli wartości α, ma najważniejszeznaczenie dla maksymalizacji wydajności rozdzielnia substancji w chromatografiipreparatywnej lub procesowej, niezależnie od stosowanej technikichromatograficznej.Korzystne jest stosowanie sorbentów o dużej powierzchni właściwej(o ziarnach wypełnienia całkowicie porowatych, albo posiadających nieporowate„jądro”, o bardzo niewielkiej średnicy.Odkrycie ostatnio technologii otrzymywania, tzw., monolitycznych wypełnieńkolumn HPLC o bardzo niskiej wartości impedancji rozdzielania jestszczególnie ważne dla rozwoju wykorzystania chromatografii cieczowejw skali preparatywnej i procesowej. Tego typu kolumny umożliwiają otrzymywaniezasadniczo wyższych wydajności preparatywnego rozdzielaniasubstancji o niewysokich masach cząsteczkowych, niż kolumny „klasyczne”,wypełnione ziarnistym sorbentem.Optymalne warunki preparatywnego albo procesowego otrzymywaniasubstancjiPodsumowując przedstawione powyżej reguły optymalizacji warunkówpreparatywnego lub procesowego rozdzielania substancji z wykorzystaniemchromatografii cieczowej, można podać następujące ogólne zasadymaksymalizacji wydajności:- W przypadku rozdzielania substancji o niskich masach cząsteczkowych,w układach chromatograficznych, charakteryzujących się dobrą kinetyką zjawisksorpcji – desorpcji oraz, gdy ograniczeniem nie jest dopuszczalne ciśnieniepompowania eluentu, najbardziej korzystne jest stosowanie stosunkowowysokosprawnych kolumn preparatywnych o optymalnej długości, tymwyższej im większa jest wielkość ziaren wypełnienia kolumny oraz zasadniczodłuższych, niż wynosiłaby konieczna długość kolumny analitycznej, wypełnionychsorbentem typu HPLC, o małych ziarnach wypełnienia. Jeśli tomożliwe, należy stosować wysokosprawne kolumny monolityczne. Jednocześnienależy stosować stosunkowo wysoką, prędkość przepływu eluentu,której optymalna wartość zależy od wielkości ziaren wypełnienia kolumny(dp), znacznie wyższą od prędkości optymalnej dla zależności H=f(u).96

- W przypadku rozdzielania substancji o wysokich masach molekularnych,albo w przypadku bardzo trudnych problemów rozdzielczych, należy stosowaćkolumny o maksymalnej możliwej do osiągnięcia sprawności, jednak liniowaprędkość przepływu eluentu, szczególnie dla rozdzielania substancjimakromolekularnych powinna być zbliżona do optymalnej dla zależnościH=f(u), a więc stosunkowo bardzo niska i w tych warunkach produktywnośćkolumny jest też względnie niska.- Gdy kinetyka zjawisk sorpcji – desorpcji jest niekorzystna, np. w warunkachchromatografii jonowymiennej, celowe jest stosowanie kolumn, wypełnionychsorbentem o większych ziarnach (25-40 mikrometrów). Konieczne jestwówczas również stosowanie stosunkowo niskich, optymalnych, prędkościprzepływu eluentu, jednak wyższych od prędkości optymalnych wg zależnościH=f(u). Wówczas nie jest możliwe otrzymanie tak wysokiej produktywnościkolumny, jak w warunkach opisanych na początku.- W każdym przypadku, korzystne jest stosowanie dla celów preparatywnychsorbentów o wysokiej powierzchni właściwej oraz zachowanie niezbyt wysokichwartości k, pierwszej z rozdzielanych substancji i wartości k poniżejok. 12 dla ostatniej substancji eluowanej z kolumny.- Stosowanie elucji stopniowej, w celu skrócenia ogólnego czasu elucji (czasujednego etapu rozdzielania), bywa niezbędne. Należy, jednak, wówczaswykonywać reaktywację powierzchni wypełnienia kolumny, co najczęściejwymaga zastosowania eluentu o początkowym składzie w ilości co najmniej7 objętości martwych kolumny. Bardziej korzystne, niż elucja skokowa, jeststosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie preparatywnej, alboprocesowej. Zapewnia to długotrwałe utrzymywanie stałej aktywności powierzchnisorpcyjnej oraz produktywności kolumny, przy minimalnym zużyciueluentu.- Stosowanie elucji gradientowej nie jest korzystne. W przypadku rozdzielaniapeptydów i białek, albo w warunkach chromatografii oddziaływań hydrofobowych,jest jednak, konieczne. Powoduje, w porównaniu do warunkówelucji izokratycznej, obniżenie efektywności procesu otrzymywania substancjiz powodu zwiększenia czasu trwania jednego etapu rozdzielania o czasreaktywacji kolumny/ Powoduje istotny wzrost kosztów repetycyjnego otrzymywaniasubstancji, tym większy im wyższa jest cena eluentu, wyższy kosztodzysku eluentu i im większa część eluentu ulega utracie (nie może zostaćzawrócona do procesu).97

OPERACJE JEDNOSTKOWE I TECHNOLOGIA ROZDZIELANIAI OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI Z ZASTOSOWANIEMPREPARATYWNEJ LUB PROCESOWEJ CHROMATOGRAFIICIECZOWEJNa rys. 8 przedstawiono operacje jednostkowe, z których składa się technologiaotrzymywania substancji z zastosowaniem chromatografii cieczowej.Rys. 8. Schemat technologiczny procesu otrzymywania substancji z wykorzystaniemchromatografii cieczowej procesowej lub preparatywnej98

Na rys. 9 i 10 pokazano przykłady schematów ideowych układu aparatów,odpowiednio: do chromatografii preparatywnej (rys. 9) i do chromatografiiw skali procesowej (rys. 10).Rys. 9. Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego – sterowanego komputerem– gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z 1 ... Z 24 ), z możliwościąrecyrkulacji części eluentu oraz z podwójnym systemem automatycznie kontrolowanegodozowania roztworu substancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnymnapełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lub dozowanie dużych objętościpoprzez zawory Z 2 i Z 3 ), oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przeciekóweluentu. Znaczenie symboli (które nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej):P – pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej, Z – zawory (A – D: programowanie składueluenta, 1 – 10: sterowania przebiegiem procesu separacji, 11 – 24: kolekcji frakcji);MSP – moduł sterowania pompą, MSWE – moduł sterowania „niskociśnieniowym” systememgradientowym, MSZ – moduł sterowania zaworami, MK – moduł komunikacji z użytkownikiemi wzajemnej koordynacji programów, obsługi awarii oraz kontroli warunków pracy kolumn (moduło nadrzędnych priorytetach, może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadańw przypadku bezawaryjnej pracy aparatu, a w przyszłości ewentualne wyeliminowanie koniecznościstosowania komputera) – obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemukomputerowi99

Rys. 10. Schemat ideowy chromatografu preparatywnego w dużej skali separacji lub chromatografuprocesowego. Oznaczenia: A, B, C – składniki eluentu i odpowiednie zbiorniki;SR – roztwór rozdzielonych i odpowiedni zbiornik; P1 – pompa główna z programowaniemskładu eluentu; P2 – pompa dozująca roztwór substancji rozdzielonych (P1 i P2 włączonaalternatywa); Gr – programator i sterownik programu elucji, K – kolumna PLC, D – detektor;R – „restryktor”, K.Fr – sterownik kolektora frakcji, ZA, ZB, ZC – zawory proporcjonujące,1, 2, 3, 4 – zawory kolektora frakcji, F – filtry ssawne, Śc – ściek100

Rys. 11. Schematy ideowe różnych rozwiązań technicznych dozowania wsadu w chromatografiipreparatywnej lub procesowejNa rys. 12 zamieszczono przykład chromatogramu otrzymanego w czasiejednego etapu repetycyjnego rozdzielania zanieczyszczonej mieszaniny lanatozydówA, B, i C w warunkach chromatografii procesowej – produkcja lanatozyduC (LC) z metanolowego ekstraktu z suszu zioła - brunatnica wełnista(digitalis lanata), z wykorzystaniem kolumny chromatograficznejo średnicy wypełnienia: 150 mm.ZLALBLC∼0 10 20 305 1 2 3 4 5 1[min]Rys. 12. Przykład chromatogramu uzyskanego w czasie trwania jednego etapu cyklicznej izolacjilanatozydu C z odpadu produkcyjnego z wykorzystaniem kolumny 800x150 mm, wypełnionejżelem krzemionkowym 60A d p =50μm (N o =1600); Warunki: Eluent – CH 2 Cl 2 / CH 3 OH / H 2 O92:8:0,2 v/v, natężenie przepływu 2200 ml/min, ciśn. 26 bar, temperatura pokojowa, detektorUV 254nm. Poniżej osi czasu podano numery zbiorników, gdzie zostają kierowane frakcje101

Na rys. 13 pokazano kilka chromatogramów otrzymanych bez przeładowaniakolumny (w warunkach „analitycznych – piki gaussowskie) i w warunkachprzeładowania stężeniowego (piki pozostałe), otrzymane z przekroczeniemliniowości zakresu odpowiedzi detektora UV, jak i zastosowaniemkilku sposobów postępowania dla uniknięcia przekroczenia liniowego zakresuwskazań detektora - bardzo mała droga optyczna – 2 mm, a nawet0.5 mm, i / albo wybór długości fali o niskich wartościach absorbancji molowejrozdzielanych substancji – 220 nm, albo 290 nm, zamiast 250 nm.Rys. 13 Przykłady kilku chromatogramów uzyskanych dla tych samych ilości estrów kwasu4OH benzoesowego rozdzielanych w warunkach typowego przeładowania stężenia kolumny,z wyjątkiem gaussowskich pików narysowanych linią cienką ciągłą, które dotyczą braku przeładowania;W warunkach przeładowania stężenia zastosowano następujące warunki detekcji:280 nm, 2,56 AU/FS, kuweta 10 mm280 nm, 1.28 AU/FS, kuweta 0,5 mm254 nm, 1.28 AU/FS, kuweta 0,5 mmZamieszczone ilustracje i podpisy pod nimi, umożliwiają uzyskanieogólnej orientacji w zakresie stosowanych operacji jednostkowych i alternatywnychsposobów ich realizacji w praktyce w chromatografii cieczowejw skali preparatywnej lub procesowej. Opis bardziej szczegółowy przekraczaramy tego opracowania. Zainteresowany czytelnik powinien skorzystać zespecjalistycznej literatury, albo z bardziej obszernego podręcznika na tematpreparatywnej i procesowej chromatografii cieczowej.KOLUMNY DO CHROMATOGRAFII PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ– WYMAGANIA I ZASADY ICH SPEŁNIENIA W PRAKTYCEKolumny do chromatografii preparatywnej są zawsze bardziej skomplikowanejkonstrukcji, niż do kolumny do chromatografii analitycznej. Jed-102

nakże, w kolumnach preparatywnych zachodzą takie same zjawiska fizykochemicznei hydrodynamiczne jak w kolumnach analitycznych. Dotyczy tozasad opisu retencji i selektywności układu chromatograficznego, a takżezjawisk decydujących o sprawności rozdzielania i wpływających na liczbępółek teoretycznych kolumny, z zastrzeżeniem, konieczności rozpatrywania,w obu wypadkach, warunków przekroczenia zakresu liniowości izotermysorpcji, tzn. rozpatrywania warunków przeładowania kolumny.W związku z wykorzystywaniem do celów preparatywnych i procesowychkolumn o znacznie większej średnicy niż kolumny analityczne pojawiająsię dodatkowe trudności oraz problemy. Jednym z nich jest koniecznośćzapewnienia równomiernego rozprowadzenia roztworu rozdzielanych substancjioraz eluentu na całym przekroju poprzecznym wypełnienia kolumnyi takiego samego odbierania eluatu opuszczającego kolumnę. Musi to zapewnićoptymalna konstrukcja głowic - rozprowadzających eluent na powierzchniwarstwy wypełnienia kolumny i zbierających eluat z powierzchnizłoża kolumny.Istnieje wiele konstrukcji preparatywnych kolumn chromatograficznych,w których powyższe wymagania zostały w różny sposób - najczęściejpoprawnie - rozwiązane. Na rys. 14 zamieszczono kilka przykładów schematówbudowy kolumn chromatograficznych, stosowanych do preparatywnego,albo procesowego rozdzielania substancji, a w opisie rysunku zamieszczonopotrzebne wyjaśnienia.Ważny problem, to zapewnienie długookresowej stabilności wypełnieniakolumny, gdy stosunek średnicy kolumny i średnicy ziarna wypełnieniaczęsto jest większy od 1000, a nawet 10000, a ziarna wypełnienia są wyjątkowomałych rozmiarów. W tych warunkach oddziaływania ścian - stabilizującestrukturę złoża w kolumnie, tak ważne w reaktorach chemicznych z wypełnieniem,albo także w kolumnach analitycznych - w kolumnachprocesowych i preparatywnych praktycznie nie ma miejsca. W tej sytuacjiszczególne znaczenie ma poprawne, równomierne i zwarte (ale nie nadmierniezwarte) upakowanie kolumny. Wykorzystywane są też dodatkowo,specjalne sposoby stabilizacji struktury złoża w czasie rozdzielania, takie jaktzw. „dynamiczna kompresja aksjalna” (DAC), lub kompresja „aksjalno--radialna”, lub ma miejsce kompresja złoża w kolumnie za pomocą mechanizmuśrubowego, niekiedy z zastosowaniem sprężyn regulujących siłę dociskuprzesuwnej głowicy (patrz rys. 14).Poprawne działanie głowicy wlotowej - wprowadzającej ciecz do kolumnyi wylotowej, wyprowadzającej eluat z kolumny oraz charakter profiluprzepływu cieczy w warstwie wypełnienia kolumny preparatywnej, lub procesowej,zależny od właściwości złoża (promieniowego rozkładu porowatościmiędzy-ziarnowej i promieniowego rozkładu ziaren pod względem wielkości,i ma decydujący wpływ na szerokość i kształt pików chromatograficznychotrzymywanych z zastosowaniem kolumny preparatywnej, bądź procesowej,niezależnie od stopnia przeładowania kolumny. Sprawność kolumny mierzonaliczbą półek teoretycznych (N), nie powinna zależeć od średnicy kolumny.Tylko wówczas może mieć miejsce całkowite podobieństwo warunków103

fizycznych i hydrodynamicznych w kolumnie modelowej i preparatywnej lubprocesowej. Na wlocie do obu kolumn i na wylocie i na wylocie z nich, powinnomieć miejsce, odpowiednio, równomierne rozprowadzanie cieczy nacały przekrój poprzeczny wypełnienia / równomierne zbieranie z całegoprzekroju poprzecznego wypełnienia kolumny. Zasadnicze znaczenie ma takisposób wypełniania kolumny, aby profil prędkości przepływu cieczy w całymprzekroju poprzecznym kolumny i wzdłuż całej długości wypełnienia, byłpłaski, tzn. „tłokowy”, a także taki sposób wprowadzania strefy dozowanej dokolumny, aby już na początku nie było zniekształcenia, którego nie możnazmienić w czasie trwania elucji.A. B. C.D.E. F.Rys. 14. Zasady budowy i działania ważniejszych typów kolumn i głowic dystrybucyjnychdo preparatywnej i procesowej chromatografii cieczowejTypy kolumn (ciąg dalszy opisu rys. 14.): A – kolumna z nieruchomymi głowicami; B – kolumnaz co najmniej jedną głowicą przesuwną, dociskaną śrubami lub poprzez połączenie gwintowenakrętki (10) z korpusem (7); C – kolumna z co najmniej jedną głowicą dociskaną do złożaz wykorzystaniem siłownika hydraulicznego lub pneumatycznego, tzn. kolumna wyposażonaw tzw. „system dynamicznej kompresji aksjalnej złoża (DAC)”; D – kolumna o elastycznych ścianachwyposażona w system promieniowej kompresji złoża (patent f-my Waters); F – kolumnao radialno-aksjalnej kompresji złoża,Typy głowic dystrybucyjnych: A, B, C – głowice z wolną przestrzenią dystrybucyjną w formiestożka o kącie wierzchołkowym 140-165 o (patent f-my Amicon); E – jedna z uproszczonychform typoszeregu głowic dystrybucyjnych opracowanych w Politechnice Gdańskiej,Oznaczenia: 1 – przewód doprowadzający eluent lub roztwór dozowany, 2 – korpus głowicy,3- uszczelka główna, 4 – przestrzeń dystrybucyjna, 4’ – wkładka dystrybucyjna z systememrowków poziomych i poprzecznych otworków, 5 – spiek porowaty lub „tkanina” z drutu kwasoodpornego,6 – materiał wypełnienia kolumny, 7, 7’ – korpus kolumny, odpowiednio: rura kwasoodpornalub z elastycznego chemoodpornego tworzywa sztucznego, 8 – siatka tkana ze stosunkowogrubego drutu (0,3-1,0 mm) lub wkładka z rowkami zapewniającymi promieniowyrozpływ cieczy w głowicy, 9 – tuleja dystansowa, 10 – nakrętka lub pokrywa dociskana śrubami,11 – korpus siłownika hydraulicznego lub pneumatycznego, 12 – trzpień tłoczyska, 13 – tłoczysko,14 – płyn tłoczący104

Można stwierdzić, że w praktyce, większość niepowodzeń preparatywnegostosowania chromatografii cieczowej jest spowodowane nieumiejętnościązapewnienia tłokowego profilu przepływu eluentu w kolumnie orazwystarczającej stabilności mechanicznej wypełnienia kolumny. Na rysunku15 pokazano związek kształtu pików chromatograficznych z profilem przepływueluentu w kolumnie. Strefy substancji są w każdym przypadku rozdzielnew przestrzeni wypełnienia kolumny. Jednakże na wylocie z kolumnytylko tłokowy profil przepływu zapewnia całkowite rozdzielenie. W przypadkuprofilu nie tłokowego, dowolnego typu, na wylocie z kolumny następuje„wtórne” wymieszanie stref rozdzielonych w kolumnie.Rys. 15. Ilustracja uzasadniająca konieczność istnienia tłokowego (płaskiego) profilu przepływucieczy w przestrzeni wypełnienia kolumny preparatywnej oraz pokazująca niekorzystny wpływzniekształcenia stref w kolumnie z p-tu widzenia wymagań, co do czystości substancji:a) Kolumna charakteryzująca się tłokowym profilem przepływu eluentu;b) Kolumna o niższej przepuszczalności w rejonie przyściennym niż w pobliżu osi – półprzekrój;c) Kolumna o wyższej przepuszczalności w rejonie w przyściennym niż w pobliżu osi – półprzekrójRys. 16. Zestawienie odpowiadających sobie chromatogramów otrzymanych w warunkach brakuprzeładowania – a, b, c oraz w warunkach typowego przeładowania stężeniowego – a’, b’, c’z wykorzystaniem kolumny analitycznej (120x4 mm i.d.) – a, a’ oraz preparatywnej(120x32 mm i.d.) – b, b’; c, c’105

Nie opanowany do końca problem stanowi też występowanie nie wyjaśnionegodotychczas w pełni, efektu tzw. „ogonowania” pików przy linii bazowej- przy „podstawie” pików po stronie zstępującej - w przypadku większościkomercyjnych kolumn preparatywnych HPLC, wypełnionychmetodami „na mokro”. Tego typu zniekształcenie pików skutkuje otrzymywaniemmniej czystych substancji, jak by to było możliwe, gdyby efektu tegonie było. Na rys. 16 i 17 zilustrowano ten problem oraz pokazano, że najbardziejefektywnym sposobem uniknięcia jego skutków, jest stosowanie kolumnypreparatywnej HPLC, w warunkach tzw. nieskończonej średnicy. Takierozwiązanie zaproponowanych przed laty Knox dla kolumn analitycznychi semi-preparatywnych, charakteryzujących się niekorzystnym profilem przepływueluentu w rejonie przyściennym wypełnienia kolumny. Stosowanie warunkównieskończonej średnicy wiąże się ze zmniejszeniem wydajności kolumny,ale jest ono, tym mniejsze, im większa jest średnica kolumny i immniejsza jest wielkość ziaren wypełnienia.EluentwEluentlub próbkaw2 1d liw = w 1 + w2w 1w 2= const.[ ]mlminS =2w1d1≅ 2w + w d1 2 cd cwd-2icRys. 17. Model optymalnego wykorzystania kolumny preparatywnej w warunkach nieskończonejśrednicy z ograniczeniem penetracji przez substancje eluowane strefy przyściennejw kolumnie o grubości „i”Wypełnienie kolumn: Nucleosil C18 7 μm; Kolumny wypełnianie na mokrosposobami stosowanymi dla kolumn komercyjnych; b, b’ - kolumna preparatywnabyła eksploatowana w sposób „klasyczny”, tzn. z wykorzystaniem całejpowierzchni przekroju poprzecznego dla rozdzielania; c, c’ – ta sama kolumnastosowana w optymalnym wykorzystaniem warunków nieskończonej106

średnicy (s=76%). Na chromatogramach b’ i c’ oznaczono zakresy zbieraniafrakcji eluentu, poddanych następnie analizie. Substancje rozdzielane: estrykwasu 4 OH benzoesowego, masa substancji dozowanych do kolumnyw warunkach przeładowania stężeniowego: ester etylowy – 95 mg, ester etylowy120 mg, ester propylowy 137 mg, masa substancji dozowanych do kolumnyanalitycznej ok. 60 razy mniejsza niż do kolumny preparatywnej; eluent:CH 3 OH – H 2 O 1:1 V/V, w=0,97 ml/min (d c =4 mm) oraz w=58 ml/min(d c =32 mm) (74 bar), detektor UV 280 nm, czułość 1,28 AU/FS, kuwetao drodze optycznej 0,5 mm.W przypadku wypełnień o wielkości ziaren ponad ok. 25 mikrometrów,kolumny można napełniać na sucho, stosując, np. metodę udarową (udarowaniekolumny w pionie, przy bardzo niewielkiej intensywności, jest bardziejkorzystne od udarów intensywnych). W przypadku stosowania wypełnieńo ziarnach poniżej ok. 25 mikrometrów, nie można w sposób zadowalającywypełnić kolumn chromatograficznych metodami „na sucho” i konieczne jeststosowanie metod „na mokro” z wykorzystaniem zawiesiny wypełnieniaw odpowiednio dobranej cieczy. Często stosuje się pompowanie cieczy, albojej wytłaczanie za pomocą tłoka, tworząc wypełnienie kolumny w czasie filtracjizłoża, narastającego na powierzchni głowicy odbiorczej kolumny, albopompując zawiesinę z zastosowaniem jednej z głowic umieszczonych w kolumnie.Na rys. 18 przedstawiono przykłady wyników badania związku międzyprofilem przepływu cieczy w preparatywnej kolumnie do chromatografii cieczowej,warunkami wypełniania kolumny i występowaniem tzw. efektu autosegregacjiziaren wypełnienia kolumny pod względem wielkości. Widać, żetakże wówczas, gdy nie występuje auto-segregacja ziaren pod względemwielkości, może mieć miejsce nie-tłokowy profil przepływu cieczy w kolumniei zniekształcenie pików chromatograficznych, a w konsekwencji zmniejszeniewydajności kolumny i czystości otrzymywanych substancji. Widać też, żeprzyczyną efektu „ogonowania” pików w przypadku kolumn preparatywnychHPLC, wypełnionych „na mokro” nie jest zjawisko „auto-segregacji” ziarenwypełnienia w kolumnie. Widać również, że stosowanie warunków nieskończonejśrednicy może skutkować otrzymywaniem czystych substancji tylkowtedy, gdy przyczyną problemu jest „ogonowanie” pików.107

Rys. 18. Przykłady reprezentowanych rezultatów uzyskanych podczas doboru optymalnych warunkówwypełnienia kolumn preparatywnych o średnicy 32-52 mm, wykonanych z zastosowaniemmieszaniny dwóch różnobarwnych frakcji żelu krzemionkowego o zakresie wielkości ziaren22 do 45 μm (frakcja bezbarwna: 22 do 35 μm i frakcja zabarwiona: 30 do 45 μm)z uwzględnieniem kształtów stref barwnika Sudan I „zatrzymanego” w przekroju poprzecznymwypełnienia kolumny oraz odpowiadające tym kolumnom kształty pików chromatograficznychna chromatogramach testowych.Warunki wypełniania kolumn: A, B, C – wypełnianie na sucho metodą udarową z równomiernymdoprowadzeniem sorbentu do kolumny podczas wypełniania w warunkach, odpowiednio:A – optymalnych (prędkość narostu złoża podczas wypełniania (u ι - ok. 1 cm/min) – cyfrą „1”oznaczono wygląd przekroju wypełnienia obserwowany również niekiedy w optymalnie wypełnionejkolumnie),B – przy zbyt szybkim doprowadzaniu sorbentu do kolumny (u ι - ok. 3 cm/min),C – przy zbyt powolnym doprowadzaniu sorbentu do kolumny (u ι - ok. 0,22 cm/min),D, D’, E – wypełnianie kolumny na mokro, odpowiednio: metodą filtracyjną lub tłokową w warunkachoptymalnych (przykłady D, D’) i sedymentacyjno-wibracyjną (przykład E), (w przypadkuD’ zastosowano głowicę dystrybucyjną zapewniającą realizację warunków nieskończonej średnicyw kolumnie (S=50%) wypełnionej w tych samych warunkach jak w przykładzie D). Długościwarstwy wypełnienia w kolumnach: 15-25 cmNa rys. 19 pokazano schematycznie kilka alternatywnych sposobówwypełniania „na mokro” kolumn preparatywnych HPLC. Warto zwrócić uwagęna metodę pokazaną na rys. 19b, nie tyle dlatego, że jest oryginalna i autornie spotkał w literaturze propozycji jej stosowania, ale przede wszystkimdlatego, że jest prosta w realizacji, bardzo skuteczna w praktyce i może zostaćzastosowana w każdym laboratorium, które ma możliwość wykonaniaw warsztacie mechanicznym kilku prostych metalowych elementów oraz po-108

siada jakąkolwiek pompę, mającą ograniczenie maksymalnego ciśnieniapompowania. Schemat a dotyczy procedur postępowania realizowanychnajczęściej przez producentów kolumn. Schemat b, to stosowanie „tłoka”uszczelnionego względem ściany kolumny, oddzielającego zawiesinę wypełnieniaod medium tłoczącego, którym może być sprężone powietrze(w istocie pompa stało-ciśnieniowa). Schemat c dotyczy metodyki zalecanejdo wypełniania na mokro kolumn preparatywnych sorbentami o wielkościziaren powyżej 20 mikrometrów, z zastosowaniem zasysania cieczy tworzącejzawiesinę.Rys. 19. Zestawienie schematów instalacji do badań „kombinowanych” metod wypełnienia kolumnpreparatywnych HPLC i MPLC na mokro,a) Kombinacja metody zawiesinowej z wibracjami lub udarowaniem zespołu kolumna – zbiornikz zawiesinąb) Kombinacja metody dynamicznej kompresji aksjalnej z zastosowaniem „pływającego” tłokaz wibracjami lub udarowaniemc) Udarowanie albo wibrowanie zespołu kolumn – zbiornik z zawiesiną, albo wykorzystanie wibratorapogrążalnego – z jednoczesnym zasysaniem cieczy tworzącej zawiesinęElementy 1-13 powtarzają się na rysunku b w całości, natomiast na rysunku c nie stosowanoelementów 1-4 oraz 10 i głowicy górnej 11.Oznaczenia:1 – zbiornik z cieczą konsolidującą „L”, 2 – pompa wodna tłokowa, (w=const = 0-1 l/min lubP=const: 0-300 bar), 3 – zawiesina „s”, 6 – kolumna, 7- uchwyt suwliwy, 8 – łącznik i uszczelnienie,9 – kabel uziemiający, 10 – post-kolumna wstępnie częściowo wypełniona na sucho(dp=60 μm), 11, 11’ – głowice wylotowa i wlotowa, 12 – przewód wlotowy (rurka), 13, 13’ – cylindermiarowy lub zbiornik próżniowy, 14 – „pływający tłok”W – wzbudnik wibracji wraz z czujnikiem wibracji i oscyloskopem, T - urządzenie udarowaniakolumn [31], B – łaźnia ultradźwiękowa, WP – pogrążalny wzbudnik ultradźwiękowy109

LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA (pozycje w posiadaniu Biblioteki WydziałuChemicznego PG, w przypadku niektórych pozycji - istnieją na rynku nowszewydania)w języku angielskim1. L.R Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glajch, “Practical HPLC Method Development”,Willey, New York, NY, 1998.,2. J. Cazes (ed), “Encyclopedia of Chromatography”, Marcel Dekker, New,York, 2001.,3. P. Jandera, J. Churacek, “Gradient Elution in Column Liquid Chromatography”,Elsevier, Amsterdam, 1985.,4. O. Mikes, “HPLC, of Biopolimers and Biooligomers”, Elsevier, Amsterdam,1988.,5. J.W. Dolan, L.R. Snyder, “Troubleshooting LC Systems”, HumanaPress, Clifton, New York, 1989.,6. K. Hostettman, A. Morston, “Preparative Chromatography – Techniques,Applications“, Springer Verlag, 1998.,7. H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer, “Thin-Layer Chromatography– Reagents and Detection Methods”, vol. 1a – Physical and ChemicalDetection Methods: Fundamentals, Reagents, VCH Publishers, Weinheim,1990.,8. D. M. Ruthven, “Encyclopedia of Separation Technology”, vol. 1-2,J. Willey. 1997.,9. A.S. Grandisson (ed), M.J. Lewis (ed), “Separation Processes in theFood and Biotechnology Industries – Principles and Applications”,Woodhoed Publ. Ltd., Camridge, England, 1998,10. V. R. Mayer, “Practical High-Performace Liquid Chromatography”, JohnWiley and Sons, Chichester, 1994w języku polskim1. Z. Witkiewicz, „Podstawy chromatografii”, wyd. II, a szczególnie III,WNT, Warszawa, odpowiednio: 1992, 2000, 2005.2. D. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka. „Chromatografia żelowa”,PWN, Warszawa, 1989.3. R. Rosset, H. Kołodziejczyk, “Współczesna chromatografia cieczowa -ćwiczenia i zadania”, PWN, Warszawa 2001.4. B. Walczak, J, Śliwiok, „Wysokosprawna chromatografia cieczowa(HPLC)”, Skrypty Uniwersytetu Śląskiego, skrypt nr 429, UniwersytetŚląski, Katowice 1989.5. Z. Witkiewicz, „Nowe kierunki w chromatografii”, WNT, Warszawa 1988.6. M. Kamiński, „Problemy stosowania kolumnowej chromatografii cieczowej,jako metody otrzymywania substancji”, rozprawa habilitacyjna, PolitechnikaGdańska, Gdańsk, 1992.110

Pozycje o znaczeniu historycznym, ale opisane zasady teoretyczne są nadalaktualne i przydatne dla zrozumienia zjawisk:7. R.J. Hamilton, P.A. Sewell, „Wysokosprawna chromatografia cieczowa”,PWN, 1982.8. J.S. Kowalczyk (ed.), „Podstawy podziałowej i adsorpcyjnej chromatografiicieczowej”, Wrocław, Warszawa, Kraków, Gdańsk, Zakład Narodowyim. Ossolińskich, Wydawnictwo Polskiej Akademii Nauk, Ossolineum,1973.9. A. Zlatkis (ed), V. Pretorius, (ed), „Preparatywna chromatografia gazowa”,WNT, Warszawa 1975.10. L. R. Snyder, “Prioncipless of Adsorpition Chromatography”, MercelDekker, Nowy York, 196811. E. Stahl, “Thin-Layer Chromatography – A Laboratory Handbook”,Springer, Berlin, wydanie drugie 1969.12. J.J. Kirkland (praca zbiorowa), „Współczesna chromatografia cieczowa”,PWN, Warszawa, 1976LITERATURA ŹRÓDŁOWA1. Bildingmayer B.A., Preparative Liquid Cromatography , (P.D. McDonaldEd), Elsevier, Amsterdam, 1987.2. Hostettman K., Preparative Chromatographic Technics: Applications inNatural Product Isolation, Springer - Verlag, 1986.3. Scaven M.D. and Hammond P.M., J.Chem. Tech. Biotechnol. 46, 85(1989).4. Jones K., Chromatographia, 25, 437, 443, 547, 577 (1988).5. Kamiński M., Rozprawa habilitacyjna, Politechnika Gdańska, WydziałChemiczny,Gdańsk 1992.6. Knox J.H., Pyper H. M., J. Chromatogr. 363 , 1 (1986).7. Cox G.B., Snyder L.R. and Dolan L.W., J. Chromatogr., 484, 409, 425,483, (1989).8. Wawrzynowicz T., Soczewiński E. and Czapińska K., Chromatographia,20, 223 (1985).9. Soczewiński E, Czapińska K. and Wawrzynowicz T., Separ. Sci., 22,210 (1987),10. Verzele M., de Conink M., Vinderogel J. and Develee C., J. Chromatogr.,450, 47 (1988).11. Katti A. and Guiochon G., Anal. Chem. 61, 982 (1989).12. Proceedings of the 9th International Symposium “Preparative and IndustrialChromatography” PREP-92, 6-8 April, 1992 Nancy, France.,13. Kamiński M., Śledzińska B. and J. Klawiter., J. Chromatogr., 367, 45(1986).111

14. Hupe K.P. and Lauer H.H., J. Chromatogr., 203, 41 (1981).15. Guiochon G., J.Chromatogr., 185, 3 (1979).16. Klawiter J., Kamiński M. and Kowalczyk J.S., J. Chromatogr., 243, 207(1982).17. Leutert Th. von Arx E., J. Chromatogr., 292, 33 (1984).18. Kamiński M., Reusch J.F., Preparative Chromatography, 1(4), 367(1992).19. Kamiński M., Reusch J.F., J. Chromatogr., 356, 47 (1986).20. Coq B., Cretier G., Rocca J.L. and Portlhault M., J. Chromatogr. Sci.,19, 1 (1981).21. Martin C.W., Shalon Y., LC-GC 5, 23 (1985).22. M. Kamiński, Proceedengs of the 17 th International Symposium on“Column Liquid Chromatography - HPLC’93”, GDCh, Hamburg, May9-14, 1993, vol. 1,2.23. Snyder L.R., Cox G.B and Antle P.E., Chromatographia, 24, 82 (1987).24. Kamiński M., J. Chromatogr., 589, 61 (1991).25. Goddings J.C., Dynamics of Chromatography, Marcel Dekker, NewYork, 1965.26. Wroński S., Molga E., Chem. Eng. Process, 22, 123 (1987).27. Knox J.H., J. Chromatogr. Sci., 15, 352 (1977).28. Carbonell R.D. and Mc Coy B.L., Chem. Eng. J., 9, 115 (1975).29. Francotte E., Junker-Buchheit A., J. Chromatogr., 576, 1 (1992).30. Unger K.K., Proceedings of “HPLC’93”, Hamburg May 1993,31. Godbille E., Devaux P., J. Chromatogr., 122, 317 (1976).32. Collin H., Hilaireau P., de Tounemire J., LC-GC, 3, 40 (1990).33. Kamiński M. , Klawiter J., Kowalczyk J.S., J. Chromatogr., 243, 225(1982).,34. Kozak M.W., Davis E.J., Jour. Coll Interface Sci., 127, 497 (1989), 129,166 (1989).35. Głód B., Thesis, IChF Wa-wa 1985.36. Kamiński M., Reusch J.F., J. Chromatogr., 436, 367 (1988).112

Daniel JASTRZĘBSKI 1,2 , Grażyna ROMANIK 1 , Marcin M. KAMIŃSKI 3 ,Maciej TRZNADEL 1 , Anita SKRZYPCZAK 1 , Aleksandra KRÓLICKA 4 ,Marian KAMIŃSKI 11)Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, Katedra Chemii Analitycznej, 80-954 Gdańsk2)Zakłady Farmaceutyczne „POLPHARMA” S.A., Kontrola Jakości JB Pharma,83-200 Starogard Gdański3)Tumor Immunology Program, German Cancer Research Center (DKFZ), ImmunogeneticsDivision (D030), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany4)Intercollegiate Faculty of Biotechnology, University of Gdańsk and Medical Universityof Gdańsk, Kładki 24, 80-822 Gdańsk, PolandKOLUMNOWA CHROMATOGRAFIA CIECZOWAW ROZDZIELANIU I ANALIZIE PEPTYDÓWI BIAŁEKSzybka ekspansja zastosowań peptydów i białek w biochemii i w medycynie,stymuluje ogromny wzrost zainteresowania metodami rozdzielania peptydów. Elektroforezażelowa i kapilarna to najczęściej dotychczas wykorzystywane metody rozdzielaniapeptydów i białek, w celach identyfikacyjnych i analitycznych. Metody te niesą jednak przydatne do otrzymywania użytkowych ilości tych substancji. ObecnieHPLC jest najistotniejszą metodą oczyszczania i otrzymywania peptydów i białek.Ponadto techniki HPLC znajdują coraz większe zastosowanie w rozwijającej się proteomice.W pracy dokonano przeglądu najważniejszych technik chromatografii cieczowej,metod oraz procedur stosowanych do rozdzielania peptydów i białek jakrównież obecnych trendów w tym obszarzeSłowa kluczowePeptydy, białka, proteomika, chromatografia cieczowa, rozdzielanieWPROWADZENIEPeptydy i białka mają ogromne znaczenie w organizmach żywych jakoenzymy, hormony, przeciwciała i inne składniki komórek, tkanek i płynów fizjologicznych.Niektóre peptydy wykazują także aktywność antybiotycznąoraz jako źródło antybiotyków peptydowych znajdują się w obszarze zainteresowańbadaczy w ostatnich latach [1-4].Potrzeba uzupełniania braków określonych peptydów i białek w organizmie,albo stosowania antybiotyków lub innych leków peptydowych, pociągaza sobą konieczność otrzymywania tych substancji w formie biologicznieaktywnej. Najczęściej, wymagana jest równocześnie, bardzo wysoka czy-113

stość izolowanych substancji. Peptydy i białka można otrzymać w sposóbtradycyjny, wyodrębniając je z tkanek zwierzęcych (w tym ludzkich), a niekiedyz roślin. W ostatnich latach rośnie znaczenie chemicznych, a szczególniebiotechnologicznych metod syntezy peptydów i białek.Dobór metody rozdzielania peptydów i białek od zanieczyszczeń,a następnie takich warunków wyodrębniania, które zapewniają otrzymanieproduktu o najwyższej aktywności biologicznej, stanowi z reguły trudny problemrozdzielczy i technologiczny. Najczęściej łatwiejsze jest opracowaniemetodyki oznaczania zawartości izolowanych substancji w poszczególnychetapach syntezy, czy biosyntezy. Jednak, rozwiązanie każdego z tych problemówwymaga z reguły znacznego nakładu pracy eksperymentalnej.Wśród różnych metod rozdzielania peptydów i białek, dominująceznaczenie identyfikacyjne oraz analityczne posiadają metody elektroforetyczne[5]. Ważne i rosnące znaczenie posiada też wysokosprawna chromatografiacieczowa (HPLC). Dla przykładu kolumnowa chromatografia cieczowabardzo często stosowana jest w przemyśle farmaceutycznym doizolowania peptydów i białek na dużą skale.Obecnie, do rozdzielania białek i peptydów metodami chromatografiicieczowej wykorzystywane są praktycznie wszystkie układy chromatograficzne.Stosowana jest chromatografia żelowa (GPC - gel permeation chromatography,albo SEC – size exclusion chromatography) [6,7], chromatografiajonowymienna (IEC – ion exchange chromatography) [8,9], z chromatografiąwykluczania jonowego (ion exclusion chromatography), włącznie.Chromatografia w układzie faz odwróconych (RP-HPLC) jak i chromatografiaoddziaływań hydrofobowych (HIC) są bardzo często stosowane do rozdzielaniabiałek o wysokiej masie molekularnej. Nawet chromatografia adsorpcyjnaw układzie faz normalnych (NP-HPLC – normal phase high performancechromatography), szczególnie, z chemicznie związaną faząstacjonarną w układzie oddziaływań hydrofilowych (HILIC). W dodatku, szerokiezastosowanie znajdują metody chromatografii powinowactwa (AffinityChromatography – AC), jako odrębna grupa metod separacyjnych o szczególniewysokiej selektywności i specyficzności [10,11].W literaturze można znaleźć wiele procedur dotyczących rozdzielaniakonkretnych peptydów, białek i innych substancji, stanowiących zanieczyszczenia.Nie opracowano, jednak, dotąd takich uogólnionych reguł, któreumożliwiałyby dobór optymalnych warunków rozdzielania zależnie od pierwszo-i wyżej - rzędowej struktury peptydów i białek. Analiza literatury, prezentującejprocedury rozdzielania peptydów i białek z zastosowaniem chromatografiicieczowej, pozwala zauważyć pewne dominujące kierunkipostępowania i uogólnione zasady doboru najkorzystniejszych warunkówrozdzielania tych substancji.W pracy przedstawiono najczęściej stosowane sposoby wpływania naselektywność i sprawność układu w przypadku najważniejszych metod rozdzielaniapeptydów i białek z wykorzystaniem elucyjnej chromatografii cieczowej.114

Publikacja opisuje zjawiska, efekty oraz oddziaływania towarzyszące procesomchromatografii cieczowej oraz możliwości wpływania na retencje peptydówi białek, jak również na selektywność rozdzielania. Przedstawiono równieżodpowiednie przykłady procedur rozdzielania.Peptydy i białka są, jak wiadomo, kwasami i zasadami. W strukturzecząsteczki złożonej z ‘n’ aminokwasów występuje n-1 wiązań peptydowych.Często w cząsteczkach tych substancji występują też często tzw. mostki disiarczkoweoraz wewnętrzne wiązania wodorowe, determinujących drugoitrzecio- rzędową strukturę molekuły. Obecność aminokwasów zawierającychhydrofobowe fragmenty wpływa na wzrost ogólnej hydrofobowości cząsteczkipeptydu lub białka. W zależności od pH rozpuszczalnika cząsteczkipeptydów i białek mogą ulegać kilku ważnym procesom. W pH wyższym odpunktu izoelektrycznego może mieć miejsce dysocjacja protonu od zewnętrznejgrupy karboksylowej. Co więcej, w pH poniżej punktu izoelektrycznegomoże mieć miejsce protonowanie n-terminalnej grupy aminowej.Przy pH bliskim punktowi izoelektrycznemu następuje szczególnie silne obniżenierozpuszczalności peptydu.W zależności od pH eluentu i jego kompozycji (np. modyfikatory eluentupowodujące powstanie par jonowych, sole, modyfikatory) peptydyi białka podlegać następującym procesom:- dysocjacji elektrolitycznej,- tworzeniu par jonowych z innymi peptydami oraz z jonowymidodatkami do eluentu,- pozornemu spadkowi hydrofobowości peptydów i białek na częścipowierzchni przy stężeniu soli bliskiemu „punktu wysolenia”,- solwatacji przez akceptory protonów lub kwasy,- formowaniu się agregatów białek (dimerów i trimerów).Wszystkie te zjawiska mają wpływ na zachowanie się cząsteczek peptydówi białek w roztworach oraz na ich oddziaływania z fazą stacjonarnąw różnych układach chromatograficznych.Na retencję i stopień rozdzielenia peptydów i białek ma wpływ szeregparametrów układu chromatograficznego, takich, jak: typ powierzchni sorpcyjneji uboczne oddziaływania na powierzchni sorbentu, rodzaj liganduzwiązanego z sorbentem, powierzchnia właściwa fazy stacjonarnej, wielkośći porowatość ziaren wypełnienia kolumny, a także, skład, pH, temperatura,prędkość przepływu eluentu, oddziaływania dodatkowych składników eluentunp. stężenie soli w eluencie, przebieg programu elucji i inne parametry,w tym nawet ciśnienie podczas rozdzielania [12].W tabeli 1 przedstawiono przykłady często wykorzystywanych warunkówstosowania chromatografii cieczowej do rozdzielania peptydów / białekw różnych układach chromatograficznych. Dane te mogą być przydatne dlawstępnego doboru warunków przy rozwiązywaniu problemów rozdzielczych,dotyczących peptydów i białek.Najczęściej stosowane są układy faz odwróconych oraz chromatografiajonowymienna. Jednakże, wstępna separacja wykonywana jest z wykorzystaniemchromatografii żelowej (GPC) lub chromatografia wykluczania115

(SEC). Ostatnio, do tego celu wykorzystuje się „twarde” sorbenty typu DIOL,szczególnie te, których struktura porowata bazuje ma „matrycy” z porowategodi-tlenku cyrkonu, albo di-tlenku tytanu. Ponadto, HIC a w szczególnościAC stosowane są do rozdzielania i izolowania peptydów i białek.Dodatkowo, w przypadku rozdzielania białek o dużej masie molekularnejJanzen et al. [13] wprowadzili do użytku sorbenty typu tentacle. Takie sorbentychronią przed zbytnim zaburzeniem struktury rozdzielanych białeki obniżeniem aktywności (trwała, nieodwracalna denaturacja)Tabela 1. Przykłady praktycznego zastosowania HPLC do rozdzielania peptydówi białek wraz z warunkami chromatograficznymi116

ROZDZIELANIE PEPTYDÓW I BIAŁEK W UKŁADACHFAZ ODWRÓCONYCHMetody RP-HPLC są powszechnie stosowane do rozdzielania peptydówi białek w szczególności do celów analitycznych, a także w proteomice.Rozdzielanie peptydów i białek w układach faz odwróconych odbywa się napowierzchni fazy stacjonarnej o określonym stopniu hydrofobowości [18],z zastosowaniem sorbentów typu C18, C8, C4 (C5, C6), C2, fenyl, alkilofenyl,alkilonitryl i inne. Z reguły rozdzielanie peptydów i białek przeprowadzasię w warunkach elucji gradientowej. Faza ruchoma bardzo często zawierawodę i acetonitryl z dodatekiem kwasu trifluorooctowego (TFA), zarównow eluencie A (niższe stężenie acetonitrylu 5 – 25%) jak i w eluencie B (wyższestężenie acetonitrylu 75 – 95%).Rozdzielane cząsteczki peptydów i białek są złożone z różnych aminokwasów(hydrofobowych lub hydrofilowych), ułożonych w zróżnicowanejkombinacji. Retencja zależy od wynikowej hydrofobowości rozdzielanychcząsteczek, albo ich solwatów, tzn. zarówno od struktury i rozkładu hydrofobowościw cząsteczkach, jak i od hydrofobowości solwatów istniejącychw równowadze ze składnikami eluentu.Podczas rozdzielania dużych cząsteczek polipeptydów i białekw układach faz odwróconych dość często obserwowane są niekorzystneprzypadki zmian konformacyjnych łańcucha aminokwasowego [24] i w konsekwencjidenaturacja produktu [25]. Nie polarna faza stacjonarna, organicznafaza ruchoma i kwaśne, albo alkaliczne dodatki do fazy ruchomej(kwas trifluorooctowy (TFA) lub inny, albo amina) – to czynniki mające potencjalnedziałanie denaturujące, a nawet hydrolityczne. Denaturacja objawiasię najczęściej zmianą, retencji substancji, a hydroliza - zwiększeniemilości pików. Aby uniknąć hydrolizy trzeba kontrolować pH i temperaturę rozdzielania[26]. Denaturacji można, także uniknąć przez dodatek do eluentusoli stabilizujących strukturę białka (np. NaCl, AcNa, (NH 4 ) 2 SO 4 ). Trzeba się,jednak, liczyć się z tym, że taki dodatek często modyfikuje retencję substancji[15].Najczęściej do rozdzielania peptydów i białek w układach faz odwróconychsą stosowane sorbenty siloksanowe modyfikowane grupami alkilowymi,fenylowymi i difenylowymi Wśród grup alkilowych najczęściej wykorzystujesię grupę butylową (C4), kolejno pentylową (C5) i oktylową (C8).Wiele jest też zastosowań oktadecylowych (C18) faz stacjonarnych. Rys. 1przedstawia przykład rozdzielania 9 białek w kolumnie wypełnionej sorbentemtypu C5, [27], a chromatogram na rys. 2 to przykład rozdzielania 8 peptydówi białek z wykorzystaniem kolumny C8.117

51243678 90 2 4 6 8 10 12 14 16Rys. 1. Rezultat rozdzielania mieszaniny peptydów z zastosowaniem kolumny C5 Discovery ®BIO Wide Pore, 150x4,6 mm(5μm). Eluenty: A-H 2 O :AcCN :PFPA (kwas penta fluoropropionowy)81 :19 :0,1, B-H 2 O :AcCN :PFPA 62 :38 :0,1. Program elucji: 0-19 min 0-100% B,v=1,0 ml/min, T=30 0 C. Detekcja UV 215 nm; 1 - Arg8-Vassopressin, 2 - Bradykinin fragment 1-5,3 - Oxytocin, 4 - Met-Enkephalin, 5 - Luteinizing Hormone, 6 - Leu-Enkephalin, 7 - Bradykinin,8 - Bombesin, 9 - Substancja P [34]Rys. 2. Przykład rozdzielania peptydów i białek z zastosowaniem kolumny C8. Kolumna: YMC8Octyl S-5 120A column, 250x4,6 mm (5μm); Eluent: A-0,1% TFA, B-AcCN; Program elucji:0-30 min 20-50% B, v=1,0 ml/min; Detekcja UV 200 nm; Rozdzielane substancje: 1 - Bradykinin,2 - Met-Enkephalin, 3 - Angiotensin I, 4 - Leu-Enkephalin, 5 - Substance P, 6 - Insulin,7 - Lysozome, 8 - Myoglobin [35]118

Głównym ograniczeniem stosowania kolumn z chemicznie modyfikowanymwypełnieniem siloksanowym jest ograniczone pH fazy ruchomej.Stosowane pH powinno być bezpieczne dla wiązań grup funkcyjnych z żelemkrzemionkowym i nie powodać ich hydrolizy (typowo 2 - 8.5, a skrajnie1,5-10, w przypadku specjalnie opracowanych faz stacjonarnych [28]).Okazjonalnie stosowane są wypełnienia polimerowe oparte o kopolimerstyrenu-diwinylobenzenu, albo poli-metakrylan alkilu. Do powierzchnisorpcyjnej najczęściej dodatkowo związane są cząsteczki oktadekanu (C18)[29, 30]. Ostatnio, mimo wysokiej ceny, rośnie znaczenie polimerowych sorbentów.Powodem jest ich trwałość w szerokim zakresie pH od 0,8 – 13,5.Brak wolnych grup siloksanowych poprawia symetrię pików i w konsekwencjisprawność rozdzielania [29, 30]. Wadą kolumn wypełnionych polimerowymisorbentami są niskie prędkości przepływu, jakie powinno się stosować podczasrozdzielania substancji o wysokich masach cząsteczkowych. Zbyt dużeprędkości przepływu prowadzą do otrzymywania nadmiernie poszerzonychpików, szczególnie, pików substancji silnie hydrofobowych i w szczególnościo wysokiej masie molekularnej. Jest to wynikiem niekorzystnej kinetyki procesówsorpcji / desorpcji spowodowanej tendencją do rozpuszczania sięcząsteczek rozdzielanych substancji w powierzchniowej warstwie niepolarnegosorbentu i bardzo małej dyfuzji dużych molekuł.Sporadycznie stosowane są inne wypełnienia, np. sorbenty siloksanowemodyfikowane równocześnie grupami C8 i hydrofilowymi grupami –COOH, pochodzącymi z nienasyconych kwasów karboksylowych, albo specyficzniemodyfikowane sorbenty siloksanowe o podwyższonej stabilnościmechanicznej i chemicznej [31].Długość łańcucha alkilowego ma istotny wpływ na selektywność rozdzielaniapeptydów i białek. Z jednej strony River i współpracownicy [32]stwierdzili, że krótkie kolumny wypełnione polisiloksanem modyfikowanymC4 sprawdzają się najlepiej w rozdzielaniu dużych peptydów i białek. NatomiastHartman i współpracownicy [33] udowodnili przydatność kolumn siloksanowychmodyfikowanych C8 do rozdzielania naturalnych i syntetycznychpeptydów oraz niewielkich białek posiadających charakter hydrofilowy.W przypadku polipeptydów, szczególnie, jeśli zawierają w łańcuchu pierścieniearomatyczne, skuteczne okazują się kolumny siloksanowe modyfikowanegrupami difenylowymi [32].Kolumny siloksanowe modyfikowane grupami oktadecylowymi (C18),o małych średnicach porów, są najskuteczniejsze do rozdzielania małych,hydrofilowych peptydów i fragmentów białek złożonych z 2-10 aminokwasów[32]. Przy czym do rozdzielania peptydów w zastosowaniu do proteomikistosuje się, coraz częściej, tzw. kolumny mikropakowane (o średnicy1-1,5 mm) lub sorbent typu CSP (Core Surface Particles) jak również częstostosowane są kolumny monolityczne. Kolumny te zapewniają bardzo wysokąsprawność i szybkość rozdzielania (do 350 tys. półek teoretycznych nametr długości wypełnienia kolumny).Fazy stacjonarne, zawierające krótkie alifatyczne łańcuchy, umożliwiająskuteczne rozdzielanie silnie hydrofobowych peptydów i białek, a posiada-119

jące długie łańcuchy alkilowe, są odpowiedniejsze do rozdzielania cząsteko charakterze mniej hydrofobowym [34].Wskazane jest, aby sorbenty o modyfikowanej chemicznie powierzchnisorpcyjnej były zabezpieczone przed oddziaływaniem resztkowych gruphydroksylowych z fazą ruchomą, tzn. aby miały tzw. „end-capping” - zastąpieniewolnych grup OH grupami OCH 3 , albo poprzez silanizację. Polepszato symetrię pików, a stąd stopień rozdzielenia w przypadku mniejszych peptydówi umożliwia wysoki stopień odzysku w przypadku białek [35].Szeroko badany był wpływ rozkładu wielkości ziaren i porowatościwypełnienia kolumny na rozdzielanie peptydów i białek [36]. Stwierdzonowpływ takich parametrów jak rozmiar i kształt ziaren, średnica i kształt poróworaz powierzchnia wymiany masy. W zależności od wielkości rozdzielanychpeptydów i białek, dobiera się złoże o odpowiednich średnicach porów. I tak,dla małych peptydów (do 10 aminokwasów) Krstulovic i Brown [37] zalecająkolumny z wypełnieniem o średnicy porów do 60Å. Dla średnich peptydów(10-30 aminokwasów) i małych białek najskuteczniejsze są kolumny o średnicyporów 100Å, 120Å i 150Å. Natomiast dla większych peptydów (ponad30 aminokwasów) i dla białek polecają sorbenty o porach 300Å i większych.Tweeten i Tweeten [29] stwierdzili w przypadku kolumn wypełnionychmakroporowatym poli -styrenem-diwinylobenzenem, że dalszy wzrost wielkościporów (do 1000Å) nie wpływa na polepszenie retencji białek o dużejmasie cząsteczkowej (do 335 kD). W celu maksymalizacji sprawności kolumnydo zastosowań analitycznych wykorzystuje się sorbenty o małychziarnach (o średnicy 5 i 3 μm), a nawet coraz częściej, wspomniane wyżej,nieporowate sorbenty o średnicy ziarna 1 μm. Wtedy stosowane kolumnymogą mieć nawet tylko 10 mm długości [21]. Jednakże, najczęściej stosujesię kolumny o długościach 125, 150 i 250 mm. Przy czym, im mniejsza wielkośćziaren sorbentu, tym krótsza może być kolumna. Obecnie duże zainteresowaniebudzą tzw. monolityczne kolumny o porowatym wypełnieniu zajmującychcałą objętość kolumny. Charakteryzują się one szczególnie niskimiwartościami tzw. impedancji rozdzielania [38]. Bez wątpienia w najbliższymczasie kolumny monolityczne będą powszechnie stosowane.ELUENTY, MODYFIKATORY ELUENTU I PROGRAMY ELUCJISTOSOWANE W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCHW układach faz odwróconych głównym czynnikiem wpływającym naretencję jest zawartość organicznych składników w eluencie, takich jak acetonitryl(AcCN), metanol (MeOH), etanol (EtOH), izopropanol (iPrOH), tetrahydrofuran(THF), czy dioxan (DX) [39]. Dodatkowo, w celu optymalizacjiwarunków rozdzielania należy wpływać na retencję substancji o charakterzezarówno kwaśnym jak i zasadowym, do których należą peptydy i białka, poprzezdodatek kwaśnego lub zasadowego modyfikatora do eluentu.Rozdzielanie peptydów i białek najczęściej przeprowadza się w warunkachelucji gradientowej. Program zmian stężenia organicznego składni-120

ka eluentu (AcCN, MeOH) ustala się w zakresie od 10-25% v/v do 75-90% v/v,dodając do eluentu A i B modyfikatora zmieniającego pH eluentu i cofającegodysocjację kwasowo-zasadową, w konsekwencji modyfikującego hydrofobowośći polarność cząsteczek peptydów / białek.Najczęściej wykorzystywanym organicznym składnikiem eluentu jestacetonitryl. Powodem tego jest jego wysoka transparentność przy niskichdługościach fali w zakresie UV. Ponadto jego niska lepkość oraz wysoka lotność,która ułatwia dalszą izolację produktu [40]. Rozpuszczalność peptydówi białek jest, także lepsza w acetonitrylu niż w innych organicznychskładnikach eluentu, stosowanych w RP-HPLC.Znacznie rzadziej wykorzystywane są alkohole. Niekiedy stosuje sięizopropanol, aby zwiększyć rozpuszczalność w fazie ruchomej solwatów dużychpeptydów i białek [41]. Użycie izopropanolu lub jego mieszaniny z acetonitrylem(w proporcji od 1:2 do 2:1) jest uzasadnione w przypadku rozdzielaniapeptydów i białek stosunkowo bardzo hydrofobowych. Izopropanol,jako rozpuszczalnik o wyższej sile elucyjnej w układach faz odwróconych odAcCN, silniej oddziałuje z centrami alkilo - siloksanowymi sorbentu [42] niżnp. metanol.Najczęściej stosowaną szybkością narostu objętościowego udziałuskładnika organicznego do rozdzielania peptydów i białek jest 2-5%/min.Zbyt wolny narost stężenia hydrofobowego składnika eluentu może powodowaćzbytnie rozcieńczenie otrzymywanych frakcji eluatu [43]. Końcowestężenie rozpuszczalnika organicznego w programie elucji nie powinno prowadzićdo całkowitego usunięcia wody z kolumny. Utrudniałoby to doprowadzaniefazy stacjonarnej do równowagi z początkowym eluentem. To możeprowadzić do braku powtarzalności retencji peptydów i białek, szczególniewcześnie eluowanych substancji. Najczęściej nie przekracza się 95% substancjiorganicznej w eluencie.Natężenie przepływu fazy ruchomej przez kolumnę klasycznie pakowanąo średnicy 4-4,6 mm jest rzędu 0,8-2,0 ml/min oraz dla kolumny monolitycznejaż do 5 ml/min. Od natężenia przepływu zależy sprawność rozdzielaniaoraz ciśnienie na wlocie do kolumny. Bylina i współpracownicyzauważyli wpływ ciśnienia panującego w kolumnie na retencję podczas rozdzielaniainsuliny w warunkach izokratycznych [12]. Wzrost ciśnienia w kolumnieo 1 bar powodował wzrost czasu retencji białka o 1-5 s. Ostatnio Guiochoni współpracownicy [44] potwierdzili występowanie tych efektówi podjęli próby ich wyjaśnienia. Najważniejsze modyfikatory fazy ruchomej,stosowane w układach faz odwróconych, zestawiono w tabeli 2.121

Tabela 2. Modyfikatory fazy ruchomej najczęściej stosowane w układach fazodwróconychH 3 PO 4 i jego sole(np.(NH 4 ) 3 PO 4 )HFBA (kwasheksa fluoro butyrowy)HCOOH,CH 3 COOH,HClModyfikator Działanie (korzystne i niekorzystne) LiteraturaKwaśneKwas trójchlorooctowy(TFA)- Eliminuje jonizację ewentualnych wolnych grup siloksanowych;- Cofa dysocjację grupy karboksylowej na „C-końcu” aminokwasu,co zwiększa hydrofobowość tej części peptydu;- Powoduje wzrost polarności cząsteczki przez tworzeniekationu R-NH + 3 na „N-końcu” peptydu [52];- Dostarcza anionów CF 3 COO - , które stanowią przeciwjondla „N-końcowego” kationu amoniowego tworząc z nim paręjonową;- Powoduje solwatację wiązań peptydowych, co ma znaczenieszczególnie przy dużych peptydach i białkach;- Podwyższa absorpcję światła przez eluent przy niskichdługościach fali światła w przypadku detekcji UV [53] - pogarszagranicę oznaczalności związku;- Najczęściej stosowane stężenie 0,05 - 0,13% (v/v), stężenieponiżej 0,075% może prowadzić do poszerzenia pików iobniżonej retencji peptydów, a powyżej 0,1% do hydrolizywiązań fazy stacjonarnej z powierzchnią żelu krzemionko-[44-46]wego;- Obniżenie retencji peptydów (w porównaniu do dodatkuTFA, czy do braku H 3 PO 4 lub jego soli);[40]- Działanie podobne do TFA, jednak mniej selektywne; [41], [47]- Działanie podobne do TFA, jednak mniej selektywne;- Kwas solny powoduje jedynie protonowanie grupy karboksylowej„C-końca” peptydu bez tworzenia pary jonowej na„N-końcu” związku;- Pewne podwyższenie retencji, ale wpływ na retencjęmniejszy niż H 3 PO 4 ;ZasadoweNH 4 HCO 3 - Podwyższa pH i zmienia nieco hydrofobowość peptydu /białka;CH 3 COONH 4 - Działanie podobne do NH 4 HCO 3 [50, 51]Trójetyloamina(TEA)- Dodawana jednocześnie z H 3 PO 4 lub HCOOH w celu [52, 53]zmiany pH;- Blokuje wolne grupy hydroksylowe sorbentu, co możeprzyczynić się do polepszenia kształtu pików;[46][41]Wszystkie modyfikatory wymienione w tabeli 2 zmieniają pH eluentui hydrofobowość cząsteczek rozdzielanych substancji przez solwatacje i tworzeniepar jonowych. Modyfikatory kwaśne mają na celu zmniejszenie stopniakwaśnej dysocjacji peptydu, a dodatki zasadowe eliminują protonowanieterminalnych grup NH 2 i powodują dysocjację grupy karboksylowej.122

ROZDZIELANIE PEPTYDÓW I BIAŁEKW UKŁADACH JONOWYMIENNYCHW chromatografii jonowymiennej jest zasadą, że substancje posiadająceładunek elektryczny są rozdzielane na kolumnie, która ma na powierzchnisorpcyjnej odwrotny ładunek elektryczny do substancji rozdzielanych.Grupy jonowe wymieniacza jonowego są kowalencyjnie wiązanez powierzchnią sorbentu i ich ładunki elektryczne są kompensowane przezjony obecne w eluencie (buforze). Po wprowadzeniu próbki do kolumny centrajonowe słabo związane z eluentem, ulegają wymianie na jony substancjirozdzielanych. Wykorzystuje się okoliczność, że peptydy i białka mogą posiadaćzarówno ładunek dodatni, jak ujemny w zależności od pH buforu.Podczas stosowania buforów o charakterze kwaśnym, peptydy występująw postaci kationów (zahamowanie dysocjacji grup karboksylowych i sprotonowaniegrup aminowych oraz najbardziej polarnych grup NH 2 w połączeniachpeptydowych). W przypadku stosowania buforów zasadowych, peptydyi białka występują w postaci anionów (sprotonowane grupy aminowe sązasadami wiążącymi grupy hydroksylowe, a grupy karboksylowe są zdysocjowane,albo tworzą pary jonowe ze sprotonowanymi kationami zasadowychdodatków). Netto dodatni lub ujemny elektryczny ładunek peptydu /białka umożliwia jego związanie z odpowiednimi centrami fazy stacjonarnej.Z zastosowaniem gradientu soli lub niekiedy, dodatkowo zmiany pH buforu,powoduje się stopniową elucję substancji związanych z powierzchnią wymieniaczajonowego.Na retencję peptydów i białek w warunkach chromatografii jonowymiennejwpływają głównie cztery czynniki: siła jonowa eluentu, jego pH i powierzchniawłaściwa wymieniacza jonowego (gęstość obsadzenia molekułamiwymieniacza jonowego), a także rozkład wielkości porów adsorbentu.Zwiększając siłę jonową eluentu obniżamy retencję peptydów i białekw przypadku obu wymieniaczy, kationowych i anionowych. Zwiększając pHbuforu obniżamy retencję na kationitach, a podwyższamy na anionitachi odwrotnie - zmniejszając pH buforu podwyższamy retencje na kationitach,a obniżamy na anionitach. Poszerzenie zakresu średnic porów w stosunkudo hydrodynamicznej średnicy cząsteczek rozdzielanych białek przyczyniasię do podwyższenia retencji w przypadku stosowania kationitów [19]i prawdopodobnie także w przypadku anionitów.Wzrost stopnia obsadzenia powierzchni jonitu grupami jonowymiennymiwpływa, oczywiście, na wzrost retencji w konkretnych warunkach rozdzielania.Jednak, do rozdzielania peptydów i białek w warunkach chromatografiielucyjnej nie są zalecane wymieniacze jonowe o bardzo wysokimstopniu nasycenia powierzchni sorpcyjnej grupami jonowymiennymi, w przeciwieństwiedo chromatografii jonowymiennej w warunkach selektywnejsorpcji – desorpcji jonowymiennej, gdy pojemność jonowa wymieniacza jonowegopowinna być możliwie jak najwyższa.W zależności od właściwości rozdzielanych peptydów / białek, dobierasię odpowiedni wymieniacz jonowy. Stosuje się wiele rodzajów kolumn jo-123

nowymiennych, równorzędnie kationowymienne i anionowymienne. Obawymieniacze jonowe mogą być stosowane w wariantach słabym i mocnym.W przypadku mocnych wymieniaczy jonowych wszystkie grupy funkcyjne sąw szerokim zakresie pH w postaci zjonizowanej i powinowactwo jonowe kolumnyjest mało zależne od pH eluentu, ale retencja peptydów od pH eluentuzależy silnie, ponieważ w zależności od pH ich cząsteczki są w różnymstopniu zjonizowane.Jako kationity stosowane są kolumny ze związanymi na powierzchnisorpcyjnej ligandami alkilo-, albo arylo- sulfonowymi: R-SO 3 - (mocne wymieniacze,np. Fractogel SO 3 , Cellufine sulfate, SP), karboksylowymi R-COO -(słabe wymieniacze, np. Fractogel COO, Toyopearl), a także inne polimeryo słabo kwaśnych grupach funkcyjnych, takie, jak Sepharoza czy Spherodex[19,55,56]. Na rys. 3 przedstawiono przykład rozdzielania 6 peptydów z zastosowaniemkolumny kationowymiennej.Rys. 3. Przykład rozdzielania małych peptydów z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej.Kolumna: Vydac 400VHP5410, 100x4,6 mm (5 μm); Eluenty: A – 20 mM TEAP in 50%AcCN, pH 2; B - 100 mM NaClO 4 in A; Program elucji: 0 - 50 min, 0 - 100% B, v=1,0 ml/min,Detekcja: UV 220 nm; 1 - Oxytocin, 2 - Eledoisin related peptide, 3 - Neurotensin,4 - Angiotensin II, 5 - Bradykinin, 6 - Angiotensin I [56]Jako anionity stosowane są kolumny o ligandach w postaci grup alkilo-,albo arylo- amoniowych, np. mocny wymieniacz z grupami trimetyloaminoetylowymi(TMAE), średnio mocny wymieniacz z grupami dietyloaminoetylowymi(DEAE), oraz słaby wymieniacz z grupami dimetyloaminoetylowymi(DMAE) [55,57]. Ligandy jonowymienne najczęściej osadzone są na matrycy,którą może być kopolimer styrenu-divinylobenzenu, żywica syntetyczna,poliwęglowodany, poliamidy, a niekiedy polimery nieorganiczne. Na rys. 4zamieszczono przykład wyników rozdzielania czterech białek w kolumnieanionowymiennej.124

Rys. 4. Przykład rozdzielania białek za pomocą chromatografii anionowymiennej Kolumna:Vydac 300VHP575, 50x7,5 mm (5 μm); Eluenty: A- 10 mM kwas CHES-2-(-cykloheksyloamino)etanosulfonowy / TEA, pH 9,53; B- 0,5 M NaCl w A; Program elucji: 0 - 20 min, 0 - 100% B,1 - Bovine carbonic anhydrase (pl 7,3), 2 - Conalbumin (pl 6; 6,3; 6,6), 3 - Ovalbumin (pl 4,7),4 - Soybean trypsin inhibitor (pl 4,5) [56]W przypadku większości komercyjnie stosowanych kolumn jonowymiennych,stosunkowo małe grupy jonowymienne znajdują się na powierzchnisorbentu. W takim przypadku tylko pojedyncze, ewentualnie kilkajonowych grup peptydu / białka zostaje związane ze złożem, z powoduograniczeń przestrzennych. W wymieniaczach jonowych o ruchomych ligandach(tzw. „tentacle”), łańcuchy cząsteczek wymieniacza jonowego są kowalencyjniezwiązane z matrycą. Są to liniowe łańcuchy polimerowe z rozłożonymiwzdłuż łańcucha grupami jonowymiennymi. Ilość grup jonowymiennychjest znacznie większa niż na powierzchni „klasycznego” wymieniaczai w konsekwencji znacząco wzrasta pojemność takich wymieniaczy wobecpeptydów i białek. Elastyczność ruchomych ligandów wymieniacza powodujedodatkowo, że mogą się one wiązać do cząsteczek białek bez odkształceniacząsteczek tych ostatnich. Ma to szczególne znaczenie dla uniknięciadenaturacji w trakcie rozdzielania białek o dużych masach molekularnych.Podczas rozdzielania peptydów i białek z użyciem chromatografii jonowymiennejregułą jest stosowanie krótkich kolumn o dużych średnicach.Zalecane są kolumny o długościach od 5 cm (szczególnie w metodach sorpcyjno- desorpcyjnych) do 25 cm (dla warunków jonowymiennej chromatografiielucyjnej) i o średnicach 5-26 mm lub wyższych.125

UKŁADY ADSORPCYJNE I ADSORPCYJNO-JONOWYMIENNEFAZ NORMALNYCHUkłady chromatograficzne faz normalnych nie znajdują tak szerokiegozastosowania do rozdzielania peptydów i białek jak układy faz odwróconychi jonowymienne. Yoshida i Okada [23] wykonali badania przydatności dorozdzielania peptydów kilku różnych wypełnień w układach faz normalnych.Stwierdzili przydatność kolumn wypełnionych związanym z żelem krzemionkowymsorbentem amidowym i diolem w warunkach elucji gradientowejAcCN – H 2 O, z rosnącym udziałem wody w trakcie programu elucji i z zastosowaniemkwaśnych modyfikatorów fazy ruchomej (TFA albo TFA+TEA),zwiększających retencję peptydów (rys. 5 – porównanie rozdzielania 10 peptydówna kolumnie amidowej i diolowej z różnymi dodatkami do eluentu)[23]. Odrzucili kolumny napełnione sorbentem aminowym (NH 2 ) i nitrylowym(CN) jako nieprzydatne do rozdzielania peptydów oraz kolumny z żelemkrzemionkowym jako powodujące obniżenie stopnia odzysku peptydów [23].Jednakże, należy zaznaczyć, że zastosowane warunki rozdzielaniaw wyżej wymienionych badaniach uniemożliwiają przeważanie efektu adsorpcyjnegomechanizmu charakterystycznego dla NP-HPLC. Zastosowaniebardzo polarnego eluentu prowadzi do mechanizmu rozdzielania charakterystycznegodla Chromatografii Oddziaływań Hydrofilowych (HILIC).Do rozdzielania białek i peptydów zastosowano też z powodzeniemkolumny wypełnione hydroksyapatytem, wykorzystując jednocześnie adsorpcyjnei słabe jonowymienne oddziaływania.126

Rys. 5. Porównanie rozdzielania peptydów na kolumnie aminowej (I) i DIOL (II) z innymi dodatkamido eluentów [23] Kolumna I - TSK gel Amide-80 250x4.6 mm, Kolumna II – TSK gel OH-120 250x4,6 mm; Eluent: (A) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0,1% TFA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.1%TFA (B) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0.1% TFA+TEA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.1% TFA+TEA;(C) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0.2% TFA+TEA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.2% TFA+TEA; Programelucji: 70 min liniowo gradient H 2 O od 3 to 45% (0.6% H 2 O/min), T=40 0 C, v=1.0 ml/min.Detekcja UV 215 nm; 1 - FY, 2-FGGF, 3 - FLEEI, 4 - DYMGWMDP-NH 2 , 5 - NFTYGGF,6 - AGSE, 7 - WAGGDASGE, 8 - YGGFMTSQKSQTPLVT, 9 - ASTTTNYT,10 - VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILI-RLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEM *)( * )M-homoserine)127

CHROMATOGRAFIA ŻELOWAChromatografia wykluczania (SEC), zwana również chromatografiążelową (GPC), znajduje ogromne zastosowanie w separacji peptydówi białek oraz do odsalania. Bazuje na wykorzystaniu różnicy wielkościi kształtu, a w konsekwencji różnic w wartości efektywnego promienia hydrodynamicznegorozdzielanych substancji. Molekuły o różnych rozmiarachw różnym stopniu penetrują pory sorbentu. Małe cząsteczki są w większymstopniu zatrzymywane w kolumnie, a duże są szybciej eluowane. SEC mazastosowanie do rozdzielania peptydów i białek o masie molowej w zakresie2 do 1000 kDa. Technika ta może być stosowana do wyznaczania masy molowejbiałek. Jednak nie tylko masa cząsteczkowa, ale również kształt cząsteczkibiałka oraz oddziaływania sorpcyjne, trudne do całkowitego wyeliminowaniamają wpływ na retencję, dlatego też konieczna jest starannakalibracja przy użyciu odpowiednich białek kalibracyjnych.Dużego znaczenia nabierają, ostatnio, złoża SEC wykonane w technologiiruchomych ligandów, „tentacle” (podobnie jak w przypadku złóż jonowymiennych).Rozmiary porów i ich rozkład gwarantują rozdzielenie białekzgodnie z wielkością i kształtem cząsteczek. „Dynamiczne” ligandy uniemożliwiająmałym cząsteczkom wniknięcie wewnątrz porów, a większe molekułymają utrudnioną głębszą penetrację [57].SEC jest szczególnie użyteczna jako początkowy etap frakcjonowania,do izolacji dużych ilości zanieczyszczeń, lub jako końcowy etap rozdzielaniaoczyszczonych białek, tzw. „polishing step”.Należy też zwrócić uwagę na szczególną przydatność chromatografiiżelowej do odsalania peptydów i białek. Do tego celu stosuje się często, ciąglejeszcze, tzw. miękkie sita molekularne. Coraz większe znaczenie mają„twarde” wypełnienia kolumn w tych zastosowaniach, takie jak DIOL [58],a także szkła porowate o zdezaktywowanej powierzchni (rys. 6 – przykładanalizy mieszaniny białek z wykorzystaniem GPC-DIOL).128

Rys 6. A. Przykład rozdzielania białek na kolumnie DIOL. Kolumna: BioGPC - DIOL 250, 300x10 mm (5μm); Eluent: 10 mMNaH2PO4 + 300 mM NaCl, pH 7,2; w=0,5 ml/min, Detekcja UV 280 nm. B. Krzywa kalibracyjna białek na kolumnie GF450 [56]129

CHROMATOGRAFIA ODDZIAŁYWAŃ HYDROFOBOWYCH(HIC – HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY)Należy zwrócić też uwagę na duże znaczenie chromatografii oddziaływańhydrofobowych (HIC), zarówno do wstępnego monitorowania składubiałkowego badanego materiału biologicznego, jak i do zastosowań preparatywnych[59,60]. Proces rozdzielania opiera się na hydrofobowych oddziaływaniachpomiędzy hydrofobowym ligandem związanym z fazą stacjonarnąa niepolarnym regionem na powierzchni biomolekuły. Te hydrofobowe oddziaływaniasą zwiększane przez obecność soli w eluencie, powoduje onaodsłonięcie hydrofobowej części białka przez zakłócenie ułożenia cząsteczekwody wokół białka [61].Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowychto sorbenty typu C3-, C4-, C5-, albo C6- wiązane najczęściej z sieciowanąagarozą lub syntetycznym kopolimerem o odpowiednim zakresiewielkości porów (300 A, albo większe). Proces rozdzielania wykonuje sięprzy malejącym gradiencie stężenia soli podczas elucji (rys. 7). Rodzaj solii jej stężenie znacząco wpływa na oddziaływania hydrofobowe pomiędzybiałkiem a hydrofobowym adsorbentem.Jednakże, stężenie soli stosowane podczas rozdzielenia powinno byćnieznacznie niższe od „punktu wysalania” cząsteczki białka. Co więcej szeregHofmeistera zestawia sole według zdolności wysalania białka:(NH 4 ) 2 SO 4 > KH 2 PO 4 > Na 2 HPO 4 > Na 2 SO 4 > CH 3 COOK> CH 3 COONa> NaCl.Rys. 7. Rozdzielanie 1. Cytochromu c, 2. Mioglobiny, 3. β-Laktoglobuliny, 4. Rybonukleazy A,5. Lizozymu, 6. α-Chymotrypsyny, 7. Chymotrypsynogenu A; na kolumnie YMC-Pack HIC4,6x250 mm; Eluent: A – 2.0 M (NH 4 ) 2 SO 4 + 0.1 M KH 2 PO 4 pH 6,8; B – 0.1 M KH 2 PO 4pH 6,8; Program elucji: 0-100% B w 30 min; v=1.0 ml/min. Detekcja UV 254 nm; [60]Temperatura i pH buforu również wpływają na oddziaływania białekz fazą stacjonarną. Ze wzrostem temperatury wzrasta retencja białka [63],wpływ pH na białko jest bardziej złożony. Przypuszczalnie oddziaływania130

hydrofobowe są silniejsze, gdy pH buforu znajduje się blisko punktu izoelektrycznegobiałka [64]. Główną zaletą chromatografii oddziaływań hydrofobowych(HIC) do rozdzielania białek i peptydów jest zachowanie aktywnościbiologicznej cząsteczek przez co rozdzielanie jest mniej destrukcyjne niżw przypadku układu faz odwróconych (RP-HPLC). Jednakże, nie wszystkiebiałka obecne w badanej próbce zawsze zostają rozdzielone, zatem niemożna metody HIC traktować jako „panaceum separacyjne”. Należy zawszeją brać pod uwagę, gdy konieczne jest rozdzielanie białek i peptydów o wysokichmasach molekularnych (powyżej 50 tys. Daltonów).CHROMATOGRAFIA WIELOWYMIAROWAObecnie, identyfikacja i oznaczanie białek w złożonych mieszaninachbiałkowych jak w przypadku analizy proteomu komórkowego jest częstoosiągana poprzez połączenie różnych metod separacyjnych takich jak SEC,IEC, RP-HLC lub innych technik chromatograficznych [65, 66]. Wykorzystaniejednego mechanizmu separacji jest bardzo często niewystarczające.Sprawność separacji może zostać polepszona poprzez połączenie różnychrodzajów kolumn chromatograficznych bądź poprzez wykorzystanie różnychkonfiguracji analitycznych. Najczęściej wielowymiarowa separacja obejmujedwie bądź więcej techniki rozdzielania podczas jednej analizy.Podstawowe wymagania zostały początkowo zasugerowane w pracyGiddings’a na temat wielowymiarowej separacji białek [67]. Dla dwuwymiarowejseparacji można zastosować chromatografię jonowymienną (zazwyczajkationowymienną) [68, 69], SEC lub chromatografię powinowactwa [70,71] w połączeniu z RP-HPLC. Opiteck i inni [72,73] połączyli chromatografięz silnym wymieniaczem kationowym lub SEC z RP-HPLC by frakcjonowaćcałkowite lizaty bakterii Escherichia coli. W przybliżeniu wyizolowano 450białek. Identyfikacja 14 z nich była przeprowadzona przy użyciu spektrometriimas (MS) i sekwencjonowania Edmana.PROTEOMIKAProteomika jest nowo powstającą dziedziną naukową. Jej celem sąbadania w dużej skali nad składem białek, ich charakterystyką (na przykładmodyfikacje posttranslacyjne) i oddziaływania pomiędzy białkami (równieżz innymi biomolekułami takimi jak lipidy bądź kwasy nukleinowe) w żywychkomórkach bądź całych organizmach. W proteomice podczas badań złożonamieszanina białkowa musi zostać rozdzielona na pojedyncze białka (lubokreślone grupy białek) zanim zostanie strawiona do formy peptydów w celuumożliwienia identyfikacji MS (ryc. 8).W badaniach w proteomice często stosowana jest dwuwymiarowaelektroforeza żelowa jako wstępna technika do frakcjonowania, jak równieżdo określania masy molekularnej i punktu izoelektrycznego rozdzielonych131

związków. Połączenie elektroforezy kapilarnej z chromatografią w układziefaz odwróconych jest również ważne. Chromatografia cieczowa jest używanagłównie w celu identyfikacji i oznaczania peptydów o małej masie, którebardzo trudno rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej. Co więcej do rozdzielaniapeptydów i białek za pomocą HPLC często wykorzystuje się połączeniez spektrometrem mas (HPLC-MS) bądź z tandemowym spektrometremmas (HPLC-MS/MS). Techniki te są wykorzystywane w proteomice doidentyfikacji białek i oznaczania ich struktury. Określenie struktury bądź identyfikacjadanego białka jest osiągana poprzez trawienie trypsyną w dokładniekontrolowanych warunkach (tworzenie map peptydowych po trawieniutrypsyną), a następnie przez ustalanie rodzaju wygenerowanych w ten sposóbpeptydów i ich wzajemnych proporcji.Rys. 8. Ogólny schemat przedstawiający przebieg procesu analizyw proteomice materiału biologicznego132

Rozdzielanie chromatograficzne strawionych peptydów jest prowadzonez zastosowaniem kolumnowej chromatografii cieczowej w warunkachelucji gradientowej. Tak zwane wielowymiarowe układy chromatograficznez systemem przełączania kolumn są często wykorzystywane. Na rysunku 9chromatogram obrazuje przykład rozdzielania peptydów uzyskanych z kazeinypo trawieniu trypsyną [74]. Produkty strawienia służą jako „odcisk palca”analizowanego białka.Poprzez połączenie stworzonych map peptydowych po trawieniutrypsyną z odpowiednimi bazami danych biolodzy i biotechnolodzy niedawnouzyskali bardzo skuteczne narzędzie identyfikacji oparte na technikachHPLC i MS.Rys. 9. Przykład rozdzielania peptydów powstałych po trawieniu trypsyną kazeiny na kolumnieJupiter proteo 90 Å column [72]CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA(AFFINITY CHROMATOGRAPHY)Bardzo szerokie zastosowanie do rozdzielania białek znajdują szczególnieselektywne metody chromatografii powinowactwa (Affinity Chromatography).Ta technika jest przede wszystkim wykorzystywana do specyficznychzastosowań i do białek o konkretnych właściwościach. Jedynie tzw.chromatografia metalopowinowactwa [10,75] ma dość ogólne zastosowaniedo rozdzielania białek i peptydów posiadających atomy siarki w cząsteczce.W innych zastosowaniach chromatografii powinowactwa metody postępowaniasą często zależne od enzymatycznych lub koenzymatycznych właściwościwyodrębnianych białek. Mimo stosowania nazwy „chromatografia powinowactwa”,metody powinowactwa winny być raczej zaliczane do grupymetod selektywnej chemisorpcji niż do metod chromatograficznych. Chromatografiapowinowactwa zostanie szerzej omówiona w następnej pracy.133

METODY DETEKCJI W CHROMATOGRAFII PEPTYDÓW I BIAŁEKDo oznaczania obecności i stężenia peptydów i białek w eluacie wypływającymz kolumny chromatograficznej wykorzystywane są najczęściejdetektory spektrofotometryczne w zakresie nadfioletu UV, albo w zakresiewidzialnym VIS. Oznaczenie białek i peptydów może zostać ułatwione pozastosowaniu tzw. derywatyzacji postkolumnowej ninhydryną. Detektory UVstosuje się w zakresie 215 nm, gdy rozdzielane peptydy zawierają jedyniechromofory pochodzące od wiązań peptydowych. Gdy w cząsteczkach peptydówzwarte są struktury aromatyczne, albo mostki disiarczkowe, wykorzystujesię wyższe długości fali (260-280 nm).Gdy rozdzielane peptydy / białka występują w śladowych stężeniachwykorzystuje się fluorescencję stosując detektor fluoroescencyjny FLD. Zjawiskofluorescencji może zostać wykorzystane do oznaczania i identyfikacjipeptydów i białek dzięki postkolumnowemu, albo prekolumnowemu zastosowaniuodczynnika derywatyzującego). Jako odczynniki derywatyzującestosuje się różne związki lub mieszaniny związków, np. kwas jodooctowyz aldehydem o-ftalowym i 2-merkaptoetanolem [76], 6-aminoquinolyl-N--hydroksysuccinimidyl carbamate, czy dialdehyd o-ftalowy [16]. Detektoryfluorescencyjne są bardzo specyficzne wiele razy czulsze od detektorówspektrofotometrycznych.Coraz powszechniej wykorzystywane są spektrometry mas w połączeniuz kolumnową chromatografią cieczową (LC-MS lub przeważniez tandemowym spektrometrem mas LC-MS-MS) szczególnie do detekcjii oznaczenia masy molekularnej małych peptydów i fragmentów białek o niskimstężeniu w badanej próbce [77], szczególnie w burzliwie rozwijającejsię proteomice. Zastosowanie w analityce śladowych zawartości peptydówznajdują też detektory elektrochemiczne [78].PODSUMOWANIEPrzez wiele lat wykorzystywania chromatografii cieczowej do rozdzielaniapeptydów i białek udało się opracować szereg metod rozdzielania tychsubstancji i różnych sposobów wpływania na ich retencję. Dotychczas niesformułowano ogólnych reguł racjonalnego doboru warunków rozdzielaniaw zależności od struktury cząsteczek rozdzielanych peptydów i białek. Elektroforezażelowa nie jest odpowiednią techniką do separacji peptydów o niskichmasach molekularnych, a elektroforeza kapilarna nie jest do końcawdrożona do zastosowań dla peptydów i białek, a szczególnie nie jest przydatnado zastosowań preparatywnych.W konsekwencji metody chromatografii cieczowej pozostają jedynąuniwersalną metodą rozdzielania wszystkich mieszanin peptydów i białek.Metody chromatografii cieczowej są szczególnie przydatnymi narzędziamido rozdzielania i oznaczania peptydów i białek, a szczególnie peptydówo niskich masach cząsteczkowych, co więcej są nieocenione w procesie roz-134

dzielania tych substancji w skali preparatywnej i przy ich przemysłowej produkcji.Jednakże z powodu skomplikowanej budowy białek, ich zachowaniepodczas procesu rozdzielania bywa często dalekie od reguł i poglądów.Próba opracowania ogólnych reguł zależności retencji tych substancjiod warunków rozdzielania w wybranych układach chromatograficznych jestprzedmiotem aktualnie prowadzonych badań autorów niniejszej pracy.LITERATURA[1] M. Zasloff, Nature, 415 (2002) 389.[2] T. Ganz, R.I. Lehrer, Curr Opin Hematol., 9 (2002) 18.[3] W. Kamysz, M. Okrój and J. Łukasiak, Acta Biochim. Pol., 50 (2003) 461.[4] K. Conceicao, K. Konno, M. Richardson, M.M. Antoniazzi, C. Jared,S. Daffre, A.C.M. Camargo, D.C. Pimenta, Peptides, 27 (2006) 3092.[5] T.V. Popa, C.T. Mant, R.S. Hodges, J. Chromatogr. A, 1111 (2006) 192.[6] J. Amiot, L. Germain, S. Turgeon, M. Lemay, C. Ory-Salam, F.A. Auger,Int. Dairy J., 14 (2004) 619.[7] G.B. Irvine, J. Biochem. Bioph. Meth., 56 (2003) 233.[8] W. Warren, N.E. Astephen, T.E. Wheat, J. Chromatogr. A, 512 (1990) 13.[9] X. Chen, L. Hu, X. Su, L. Kong, M. Ye, H. Zou, J. Pharmaceut. Biomed.,40 (2006) 559.[10] W.-C. Lee, K.H. Lee, Anal. Biochem., 324 (2004) 1.[11] A. Cecilia A. Roque, C. R. Lowe, Biotechnol. Adv., 24 (2006) 17.[12] A. Bylina, M. Ulanowicz, Chem. Anal.-Warsaw, 43 (1998) 955.[13] R. Janzen, K.K. Unger, W. Müller, M.T.W. Hearn, J. Chromatogr., 522(1990) 77.[14] B. De Collongue-Poyet, C. Vidal-Madjar, B. Sebille, K.K. Unger,J. Chromatogr. B, 664 (1995) 155.[15] J.L.M. McNay, J.P. O’Connell, E.J. Fernandez, Biotechnol. Bioeng.,76 (3) (2001) 233.[16] A.B.P. Van Kuilenburg, A.E.M. Stroomer, G.J. Peters, A.H. Van Gennip,J. Chromatogr. B, 759 (2001) 51.[17] F. Moffat, P. Senkans, D. Ricketts, J. Chromatogr. A, 891 (2000) 235.[18] G. Bordin, F. Cordeiro Raposo, B. De la Calle, A.R. Rodriguez,J. Chromatogr. A, 928 (2001) 63.[19] P. DePhillips, A.M. Lenhoff, J. Chromatogr. A, 933 (2001) 57.[20] F. Lesignoli, A. Germini, R. Carradini, S. Sforza, G. Galaverna, A. Dossena,R. Marchelli, J. Chromatogr. A, 922 (2001) 177.[21] D. Josić, H. Horn, P. Schulz, H. Schwinn, L. Britsch, J. Chromatogr.A, 796 (1998) 289.[22] G. Iberer, H. Schwinn, D. Josić, A. Jungbauer, A. Buchacher, J. Chromatogr.A, 921 (2001) 15.[23] T. Yoshida, T. Okada, J. Chromatogr. A, 840 (1999) 1.[24] J.L.M. McNay, E.J. Fernandez, Biotechnol. Bioeng., 76 (3) (2001) 224.135

[25] S.U. Sane, S.M. Cramer, T.M. Przybycien, J. Chromatogr. A, 849(1999) 149.[26] V. Sanz-Nebot, I. Toro, J. Barbosa, J. Chromatogr. A, 870 (2000) 335;[27] the Reporter – Discovery BIO.[28] YMC INC. – “Liquid Chromatography Product Guide”.[29] K.A. Tweeten, T.N. Tweeten, J. Chromatogr., 359 (1986) 111.[30] J.K. Swadesh, J. Chromatogr., 512 (1990) 315.[31] Y. Shen, X. Shao, K. O’Neill, J.S. Bradshaw, M.L.Lee, J. Chromatogr.A, 866 (2000) 1.[32] J. River, R. McClintock, R. Galyean, H. Anderson, J. Chromatogr., 288(1984) 303.[33] P.A. Hartman, J.D. Stodola, G.C. Harbour, J.G. Hoodegheide, J. Chromatogr.,360 (1986) 385.[34] N.H.C. Cooke, B.G. Archer, M.J. O’Hare, E.C. Nice, M. Capp, J. Chromatogr.,255 (1983) 115.[35] G.B. Cox, J. Chromatogr. A, 656 (1993) 353.[36] W.S. Hancock (Editor), “Handbook of HPLC for the Separation of AminoAcids, Peptides and Proteins”, Vol. II, CRC Press, Boca Raton, Florida,1986.[37] A.M. Krstulovic, P.R. Brown, “RP HPLC. Theory, Practice and BiomedicalApplications”, John Wiley and Sons, New York, 1982.[38] N. Ishizuka, H. Kobayashi, H. Minakuchi, K. Nakanishi, K. Hirao, K. Hosoya,T. Ikegami, N. Tanaka, J. Chromatogr. A, 960 (2002) 85.[39] J.P. Boissel, H. Wajcman, H. Fabritius, R. Cabanes, D. Labie, Biochim.Biophys. Acta., 670 (1981) 203.[40] D. Corradini, LC-GC int., 9 (1996) 732.[41] J. Sugihara, T. Imamura, T. Imoto, T.H.J. Huisman, Biochim. Biophys.Acta., 669 (1981) 105.[42] N.H.C. Cooke, B.G. Archer, M.J. O’Hare, E.C. Nice, M. Capp, J. Chromatogr.,255 (1983) 115.[43] C.A. Bishop, W.S. Hancock, S.O. Brennan, R.W. Carrel, M.T.W. Hearn,J. Liq. Chromatogr., 599 (1981) 4.[44] P. Szabelski, A. Cavazzani, K. Kaczmarski, X. Liu, J. Van Horn, G. Guiochon,J. Chromatogr. A, 950 (2002) 41.[45] C.L. Stevenson, M.M. Tan, J. Pept. Res., 55 (2000) 129.[46] Y. Chen, A.R. Mehok, C.T. Mant, R.S. Hodges, J. Chromatogr. A, 1043(2004) 9.[47] W.S. Hancock, C.A. Bishop, R.L. Prestidge, M.T. Hearn, Anal. Biochem.,89 (1978) 203.[48] D.M. Abercrombie, Anal. Biochem., 125 (1982) 395.[49] J.L. Glajch, J.J. Kirkland, J. Kohler, J. Chromatorgr., 384 (1987) 81.[50] B. Grego, F. Lambrou, M.T.W. Hearn, J. Chromatogr., 266 (1983) 89.[51] H. Ishikawa, H. Tamaoki, J. Ferment. Bioeng., 82 (1996) 140.[52] K. Stachowiak, J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 1758.[53] K. Larsson, W. Hermann, P. Moller, D. Sanchez, J. Chromatogr., 450(1988) 71.136

[54] W.S. Hancock, J.T. Sparrow, J. Chromatogr., 206 (1981) 71.[55] M.A. Stadalius, L.R. Snyder, J. Berus, LC-GC, 6(6) (1988) 494.[56] Vydac – “2000/2001 HPLC Columns and Bulk Media”.[57] S-I. Wu, J. Frenz, LC GC, 6 (11) (1993) 684.[58] Aglient – “ZORBAX BioSeries GF-450 column”.[59] M.E. Lienqueo, A. Mahn, J.C. Salgado, J.A. Asenjo, J. Chromatogr. B,849 (2007) 53.[60] J.A. Queiroz , C.T. Tomaz, J.M.S. Cabral, J. Biotechnol., 87 (2001) 143.[61] A. Mahn, J.A. Asenjo, Biotechnol. Adv., 23 (2005) 359.[62] YMC INC. – “Pack HIC Columns”.[63] J.Chen, Y. Sun, J. Chromatogr. A, 992 (2003) 29.[64] S. Hjerten, J. Rosengren, S. Pahlman, J. Chromatogr., 101 (1974) 281.[65] C.T. Tomaz, J.A. Queiroz, Biotechnol. Lett., 26 (2004) 223.[66] I. Neverova, J.E. Van Eyk, J. Chromatogr. B, 815 (2005) 51.[67] A.J. Link, Trends Biotechnol., 20 (2002) 12.[68] J.C. Giddings, Anal. Chem., 56 (1984) 1258A.[69] D. Wall, M. Kachman, S. Gong, R. Hinderer, S. Pavus, D. Misek,S. Hauash, D. Lubman, Anal. Chem., 72 (2000) 1099.[70] D. Wolter, M.P. Washburn, J.R. Yates III, Anal. Chem., 73 (2001) 5683.[71] L. Giggs, C. Sioma, F.E, Reginier, J. Chromatogr. A, 924 (2001) 359.[72] G.J. Opiteck, K.C. Lewis, J.W. Jorgenson, R.J. Anderegg, Anal. Chem.,69 (1997) 1518.[73] G.J. Opiteck, S.M. Ramirez, J.W. Jorgenson, M.A. Moseley III, Anal.Biochem., 258 (1998) 349.[74] Jupiter – “HPLC columns for the proteomic era”.[75] C. Roesli, G. Elia, D. Neri, Clin. Biochem., 37 (2004) 579.[76] N.E. Labrou, J. Chromatogr. B, 790 (2003) 67.[77] Y.V. Tcherkas, A.D. Denisenko, J. Chromatogr. A, 913 (2001) 309.[78] W.A. Kleinman, J.P. Richie Jr., Biochem. Pharmacol., 60 (2000) 19.137