postupci za liječenje angiogeneze, rasta tumora i metastaza

HR P20041146 A2Kombinirana terapija51015U izumu se također razmatra primjena CO zajedno s najmanje jednim tretmanom, npr. kemoterapijom, zračenjem,imunoterapijom, genskom terapijom, i/ili operacijom, a za liječenje ovdje opisanih poremećaja i stanja (npr. raka). Npr.CO se može dati pacijentu upotrebom bilo koje ovdje opisane metode u kombinaciji s operacijom kojom se uklanjakancerozno tkivo iz pacijenta. Alternativno ili dodatno, ovdje opisani postupci se mogu dati u kombinaciji skemoterapijom. Kemoterapija može uključivati primjenu bilo koje vrste slijedećih spojeva: alkilirajuća sredstva,antimetabolite, npr. antagoniste folata, antagoniste purina i/ili pirimidina; biljne otrove, npr. vinka alkaloide (npr.paklitaksel) i podofilotoksine; antibiotike, npr. doksorubicin, bleomicin i/ili mitomicin; nitrozoureu; anorganske ione,npr. cisplatin; modifikatore biološkog odgovora, npr. tumor nekrozis faktor-α (TNF-α) i interferon; enzime, npr.asparaginazu; proteinske toksine konjugirane za ciljne spojeve; i hormone, npr. tamoksifen, leuprolid, flutamid imegestrol. Alternativno ili dodatno, ovdje opisani tretmani se mogu primijeniti u kombinaciji sa zračenjem, npr.γ-zračenjem, neutronskim zrakama, elektronskim zrakama, i/ili radioaktivnim izotopima. Alternativno ili dodatno, ovdjeopisani tretmani se mogu primijeniti u kombinaciji s imunoterapijom, npr. davanjem specifičnih stanica, tumorskihantigena, i/ili antitumorskih antitijela. Alternativno ili dodatno, ovdje opisani tretmani se mogu primijeniti u kombinacijis genskom terapijom, npr. davanjem DNA kodirajućih tumorskih antigena i/ili citokina. Postupci za liječenje raka, npr.operacija, kemoterapija, imunoterapija i zračenje, su detaljno opisani u The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,17. izdanje, Dio 11, Poglavlja 143 i 144, a taj sadržaj je u potpunosti ovdje obuhvaćen kao referenca.20 Izum je dijelom ilustriran slijedećim primjerima koji ne ograničavaju izum na bilo koji način.Primjer 1. CO inhibira rast tumora i stanica raka, i in vivo i in vitro, te inhibira angiogenezu2530354045505560ŽivotinjeZa istraživanja humanih tumora su korištene ženke SCID miševa (težine 20 do 30 g), kupljene od Taconic (WhitePlains, NY), koje su puštene da se aklimatiziraju 1 tjedan prije pokusa. Za istraživanja tumora glodavaca korišteni sumužjaci CBA i C57B1/6 miševa (težine 25 do 30 g), kupljeni od Jackson Labs (Bar Harbor, ME) i pušteni da seaklimatiziraju 1 tjedan prije pokusa.Stanične linijeZa ovdje opisana istraživanja su korištene humana stanična linija adenokarcinoma označena A459, stanična linija AC29iz mezotelioma glodavaca i humana stanična linija raka kolona HCT.Izlaganje COStanične kulture i miševi su izlagani CO pri koncentraciji od 250 ppm. Ukratko, 1% CO u zraku se miješa sa zrakom(21% kisika) u cilindru za miješanje od nehrđajućeg čelika, i zatim se uvodi u 3.70 ft 3 staklenu komoru za izlaganje pribrzini protoka 12 L/min. Za kontinuirano mjerenje CO u komori, korišten je CO analizator (Intrescan, Chatsworth, CA).Koncentracije CO su cijelo vrijeme održavane na 250 ppm. Miševi i kulture stanica su smješteni u komoru za izlaganjeprema potrebi.Općeniti postupciOd R&D Svstems su kupljeni ELISA setovi za VEGF razine, i korišteni prema uputama proizvođača.Imunobojenje je izvedeno za utvrđivanje ekspresije proteina pomoću standardnih metoda poznatih u struci. Antitijela sukupljena od Santa Cruz, StressGen and Cell Signaling.Za istraživanja inkorporacije [ 3 H] timidina, stanice su preko noći izgladnjele u serumu, a zatim su stimulirane s 20%seruma koji sadrži 5mCi/ml [ 3 H] timidina (New England Nuclear, Boston, MA), [ 3 H] timidin inkorporacija je mjerenascintilacijskom spektroskopijom.CO inhibira rast stanica raka in vitroHumane i mišje stanične linije raka su korištene za ispitivanje učinaka CO na brzine rasta stanica u kulturi. Humanestanice adenokarcinoma (A459), stanice mezotelioma miševa (AC29), i A549 i AC29 stanice transformiranehemoksigenaza-1 (HO-1) genom (koji uzrokuje da stanice pojačano proizvode HO-1), izložene su niskim razinama CO(250 ppm) u kulturi. Rađene su krivulje rasta kroz 4 dana. Stanice koje su bile izložene CO uz zrak, pokazale su obrazacrasta sličan stanicama koje prekomjerno ekspresiraju HO-1, npr. smanjenje broja stanica 40% u tri dana (podaci nisuprikazani), u odnosu na kontrole. Ovi smanjeni brojevi nisu zbog toksičnosti jer je sličnost postignuta s vremenom i to uznatno smanjenoj brzini.Slika 1 je krivulja rasta u 6 dana i pokazuje da CO inhibira proliferaciju stanica raka mezotelioma glodavaca AC29. Na5. dan su CO-izložene stanice maknute iz atmosfere koja sadrži CO, nakon čega je opažena proliferacija normalnebrzine.11