pełna wersja - pdf - Polimery w Medycynie

Polimery w Medycynie 2011, T. 41, Nr 1Poszukiwania polimerówze śladem molekularnymdo diagnostyki medyczneji analizy klinicznejPiotr Luliński*,Dorota Maciejewska,Dorota KlejnKatedra i Zakład Chemii Organicznej,Wydział Farmaceutyczny,Warszawski Uniwersytet MedycznyStreszczenieW pracy omówiono doniesienia literaturowez ostatnich lat, dotyczące badań polimerówze śladem molekularnym do celówdiagnostyki medycznej i analizy klinicznej.Omawiana grupa nowych i selektywnychmateriałów polimerowych może mieć potencjalnezastosowanie w monitorowaniu przebiegucukrzycy i chorób nowotworowych,w diagnostyce chorób nerek, serca i miażdżycyoraz w analizie krwi.Słowa kluczowe: polimery ze śladem molekularnym,diagnostyka medyczna, analizaklinicznaInvestigations of molecularlyimprinted polymers for medicaldiagnostics and clinical analysisSummaryThe review focuses on progress of molecularlyimprinted polymers for medical diagnosticsand clinical analysis. This class ofnew and selective polymeric materials couldfind future applications in monitoring ofdiabetes and tumors, in diagnostics of kidneyand heart diseases, arteriosclerosis or inblood analysis.Key words: molecularly imprinted polymers,medical diagnostics, clinical analysisWSTĘPPolimery ze śladem molekularnym (ang. molecularlyimprinted polymers) znalazły szerokie zastosowaniew naukach farmaceutycznych. Są wykorzystywanew procesach izolacji i zagęszczania analitów,jako selektywne adsorbenty w kolumnach chromatograficznychoraz w kolumienkach do esktrakcji dofazy stałej (SPE, ang. solid phase extraction). Stanowiąrównież część sensorową detektorów w ilościowymoznaczaniu wielu związków [1, 2].Proces tworzenia śladu molekularnego w matrycypolimeru składa się z trzech etapów (ryc. 1). Pierwszyetap obejmuje wytworzenie stabilnej strukturyprepolimeryzacyjnej, pomiędzy molekułą tworzącąślad (wzorcem) a monomerem funkcyjnym. Drugimetapem jest reakcja polimeryzacji przebiegająca najczęściejw obecności czynnika sieciującego. Ostatnietap polega na usunięciu wzorca z matrycy polimerowej[1]. Wzory związków chemicznych budującychmatrycę polimerów ze śladem molekularnym przedstawionona rycinie 2.Jednym z ciekawszych obszarów wykorzystaniapolimerów ze śladem molekularnym jest diagnosty-

4 PIOTR LULIŃSKI i inniRyc. 1. Schemat etapów procesutworzenia śladu molekularnegow matrycy polimerowejFig. 1. Scheme of imprintingprocess in the polymermatrixka i analiza kliniczna. Współczesna opieka medycznaoparta jest na olbrzymiej liczbie testów, mających nacelu wczesne rozpoznanie choroby lub/i monitorowaniejej przebiegu. Rośnie popyt na precyzyjne, taniei szybkie testy, a postęp technologiczny umożliwiarealizację tych potrzeb.Już od kilku lat obserwowany jest ciągły wzrostwartości światowego rynku diagnostycznego, któryobecnie jest szacowany na kilkadziesiąt miliardóweuro. Testy diagnostyczne są wykorzystywaneprzede wszystkim w leczeniu pacjentów cierpiącychna choroby układu krążenia i choroby nowotworowe,osób z niewydolnością układu moczowego orazchorych na cukrzycę. Wzrost liczby osób nadużywającychleki i uzależnionych od substancji psychoaktywnych,ogromnie zwiększył zapotrzebowanie natesty identyfikujące substancje toksyczne [3]. Rosnącewymagania ze strony pacjentów oraz personelumedycznego w stosunku do nowych generacji testówdotyczą ich miniaturyzacji, łatwości obsługi i szybkościotrzymywania wyników i stwarzają podstawydo rozwoju nowych technologii.Większość spośród obecnie stosowanych testówdiagnostycznych wykorzystuje naturalne enzymylub przeciwciała jako elementy sensorowe. Jednakżeta grupa testów posiada istotne ograniczenia wynikającez ich biostruktury. Są to: słaba odtwarzalność,niestabilność w czasie produkcji i problemy związaneze sterylizacją. Dużą nadzieję na przezwyciężenietych trudności wiąże się z polimerami ze śladem molekularnym.Dzięki wysokiej selektywności, wytrzymałościmechanicznej, termicznej i chemicznej oraztaniej preparatyce, omawiana klasa polimerów możestanowić nową generację materiałów do konstrukcjitestów diagnostycznych.MATERIAŁY POLIMEROWEW MONITOROWANIUPRZEBIEGU CUKRZYCYCukrzyca jest jedną z najbardziej rozpowszechnionychobecnie chorób. Objawia się zbyt wysokimpoziomem glukozy we krwi. Nie leczona cukrzycaprowadzi do poważnych powikłań, związanychz uszkodzeniem wielu narządów. Jednym ze wskaźnikówstężenia glukozy jest glikowana hemoglobinaHbA1c, która jest produktem nieenzymatycznej glikacjihemoglobiny. W wyniku połączenia cząsteczkiglukozy z wolną grupą aminową reszty waliny naN-końcu łańcucha β-hemoglobiny powstaje zasadaSchiffa, która następnie ulega przegrupowaniu tworzącstabilną ketoaminową pochodną hemoglobiny[4]. Glikacja jest procesem stopniowym i proporcjonalnymdo stopnia glikemii. Zawartość HbA1cjest zatem odzwierciedleniem średniego stężeniaglukozy we krwi w ciągu 120 dni czyli średniegoczasu życia erytrocytu. Olbrzymią zaletą oznaczaniapoziomu HbA1c jest brak ciągłego wahania stężenia,występujący podczas klasycznego pomiarustężenia glukozy we krwi. Ponadto glikowana hemoglobinapozwala ocenić ryzyko wystąpienia powikłańcukrzycy [5].

DIAGNOSTYKA MEDYCZNA5Ryc. 2. Wzory chemiczne monomerów funkcyjnych i czynników sieciujących powszechnie wykorzystywanychw syntezach polimerów ze śladem molekularnym: dimetakrylan glikolu etylenowego (a), trimetakrylan 2-etylo-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu(b), akrylamid (c), 2,6-bis(diakrylamido)pirydyna (d), 2,6-diamino-9-(3/4-winylobenzylo)puryna (e), diwinylobenzen (f), triakrylan pentaerytrytolu (g), metakrylamid (h), 4-winylopirydyna(i), metakrylan metylu (j), dimetakrylan glikolu tetraetylenowego (k), kwas metakrylowy (l), 1-winylo-2-pirolidon (m), N,N’-metylenobisakrylamid (n)Fig. 2. Chemical formulas of functional monomers and cross-linkers frequently used in syntheses of the imprintedpolymers: ethylene glycol dimethacrylate (a), trimethylolpropane trimethacrylate (b), acrylamide (c),2,6-bis(diacrylamide)pyridine (d), 2,6-diamine-9-(3/4-vinylbenzyl)purine (e), divinylbenzene (f), pentaerythritoltriacrylate (g), methacrylamide (h), 4-vinylpyridine (i), methyl methacrylate (j), tetraethylene glycol dimethacrylate(k), methacrylic acid (l), 1-vinyl-2-pyrrolidone (m), N,N’-methylenebisacrylamide (n)Najnowsze badania podkreślają zalety oznaczaniastężenia HbA1c w diagnostyce cukrzycy, w porównaniuz powszechnie stosowanym pomiaremglukozy [6]. Jednak określenie zawartości glikowanychprotein we krwi wymaga czułych i selektywnychmetod, dostosowanych do warunków diagnostykiklinicznej.Yamazaki i wsp. [7] opisali syntezę polimeru ześladem molekularnym β-D-fruktozylo-L-waliny. Polimerstanowił część powierzchni elektrody i służyłdo amperometrycznego oznaczania poziomu glikowanejhemoglobiny. Rycina 3 ilustruje proces otrzymywaniapolimeru molekularnie drukowanego β-Dfruktozylo-L-waliną.Autorzy zastosowali semi-kowalencyjną strategięsyntezy polimeru, w której struktura prepolimeryzacyjnapowstaje w reakcji chemicznej (wiązaniakowalencyjne), jak i poprzez oddziaływania międzycząsteczkowe(oddziaływania niekowalencyjne).W pierwszym etapie β-D-fruktozylo-L-walinę (wzorzec)połączyli z 4-winylofenyloboranem (monomerfunkcyjny) wiązaniem estrowym. Następnie sporządziliroztwór związku prepolimeryzacyjnego z 1-winyloimidazolem(drugim monomerem funkcyjnym,który pełnił również istotną rolę w procesach elektrochemicznych),umożliwiając powstanie oddziaływańmiędzycząsteczkowych. Następnie przeprowadzilipolimeryzację w bloku w obecności dimetakrylanu

6 PIOTR LULIŃSKI i inniRyc. 3. Schemat syntezypolimeru ze ślademmolekularnym β-D--fruktozylo-L-walinyFig. 3. Scheme of synthesisof β-D-fructosyl-L--valine imprinted polymerglikolu etylenowego (ryc. 2a), będącego czynnikiemsieciującym w środowisku metanolowo-wodnym,pełniącym rolę porogenu.Otrzymany polimer autorzy poddali obróbcemającej na celu otrzymanie ziaren o określonej wielkościpoprzez roztarcie, przesianie i sedymentację.Następnie z ziaren usunęli wzorzec, uwalniając trójwymiarowewnęki w matrycy polimeru, komplementarnedo wzorca. Syntezę ziaren polimeru kontrolnegoprowadzili w identycznych warunkach, ale bezwzorca czyli β-D-fruktozylo-L-waliny. Do pomiarówanalitycznych przygotowali pastę przez zmieszanieziaren polimeru, grafitu i parafiny, którą następnieumieścili w korpusie elektrody.β-D-Fruktozylo-L-walina została wybrana jakowzorzec, ponieważ stanowi składnik zarówno HbA1c,jak i produktu trawienia HbA1c przez proteazę. W celuokreślenia selektywności polimeru autorzy porównalizdolność adsorpcji różnych fruktozyloamin:β-D-fruktozylo-L-waliny, β-D-fruktozylo-ε-lizyny,β-D-fruktozylo-L-glicyny, β-D-fruktozylo-L-alaninyi β-D-fruktozylo-L-fenyloalaniny. Powinowactwoβ-D-fruktozylo-L-waliny do matrycy polimeru ześladem molekularnym było dwukrotnie większe, niżdo polimeru kontrolnego i wynosiło odpowiednio410 i 210 nmol/mg polimeru. Natomiast adsorpcjaβ-D-fruktozylo-ε-lizyny na polimerze ze śladem molekularnymi polimerze kontrolnym była porównywalna.Brak selektywności adsorpcji wytłumaczylimożliwością powstania nieselektywnych oddziaływań,pomiędzy resztą imidazolową obecną w matrycypolimeru a ugrupowaniem iminowym, którepowstaje po reakcji węglowodanu z aminokwasem.Autorzy zbadali również wpływ innych związkówobecnych we krwi na pomiar adsorpcji fruktozyloamin.Sorbitol oraz inne węglowodany zakłócałyoznaczenie potencjometryczne, w związku z tym konieczneokazało się wstępne przygotowanie próbekdo analiz. Istotnym czynnikiem ograniczającymzastosowanie omawianej metody, jest koszt β-Dfruktozylo-L-walinyużytej jako wzorzec w synteziepolimeru. Sode i wsp. [8] zaproponowali zastosowanieanalogu strukturalnego (N-metylo-L-waliny)podczas syntezy matrycy polimerowej. Użycie analogówstrukturalnych wzorców w procesie tworzeniaśladu molekularnego jest uzasadnione, jeżeli wzorzecjest przyczyną trudności syntetycznych, jest drogi lubotrzymany polimer ma służyć do analizy śladowychilości tej substancji. Unikamy w ten sposób zjawiskaciągłego uwalniania wzorca (analitu) z ziaren polimeru(ang. bleeding) podczas analiz, co mogłoby byćpowodem zawyżania wyników.Polimer ze śladem N-metylo-L-waliny stanowiłskładnik elektrody grafitowej i wykazywał podobną

DIAGNOSTYKA MEDYCZNAselektywność jak opisany przez Yamazaki i wsp [7].Próby uzyskania wyższej selektywności poprzez zastosowaniedwóch monomerów funkcyjnych, 1-winyloimidazolui alliloaminy, nie dały pożądanychefektów. Selektywny polimer ze śladem molekularnymβ-D-fruktozylo-L-waliny otrzymali Rajkumari wsp. [9]. Autorzy zastosowali wyłącznie kowalencyjnąstrategię otrzymania śladu molekularnegoi dodatkowo zbadali wpływ czynnika sieciującegona selektywnośc polimeru. β-D-Fruktozylowalino-O-bis(4-winylofenyloboran) poddali polimeryzacjiz dimetakrylanem glikolu etylenowego, lub z trimetakrylanem2-etylo-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu (ryc. 2b) w dwuskładnikowym roztworze toluen-acetonitryl.Polimer usieciowany dimetakrylanem glikoluetylenowego miał większą pojemność adsorpcji,ale charakteryzował się niższą selektywnością,natomiast usieciowany trimetakrylanen 2-etylo-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu wykazywałzarówno dużą selektywność, jak i wystarczającą pojemnośćadsorpcji. Autorzy zbadali wpływ niektórychparametrów procedury oznaczania analitu naotrzymywane wyniki, uzyskując optymalne wartościadsorpcji β-D-fruktozylo-L-waliny dla roztworówo pH = 11,4 i stężeniu 0,2 mmol/L. Obliczony współczynnikpowinowactwa do wzorca (ang. imprintingfactor), czyli stosunek ilości zaadsorbowanej na polimerzeze śladem molekularnym do ilości zaadsorbowanejna polimerze kontrolnym był wysoki i wynosił4,5. Ponadto autorzy przeprowadzili podstawoweanalizy stabilności termicznej otrzymanego polimerui jego morfologii, wykorzystując termograwimetrięi skaningową mikroskopię elektronową.Badania termograwimetryczne stwierdziły brakubytku masy matrycy polimerowej usieciowanej trimetakrylanem2-etylo-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu do temp. 250 o C. Mikrografy pokazały obrazziaren o nieregularnym kształcie i średnicy do 20μm. Omówione badania mogą wkrótce doprowadzićdo zastosowania polimeru ze śladem molekularnymβ-D-fruktozylo-L-waliny w diagnostyce medycznej.MATERIAŁY POLIMEROWEW ANALIZIE PRZEBIEGUCHORÓB NOWOTWOROWYCHJedną z najczęstszych przyczyn zgonów w ostatnichdziesięcioleciach są choroby nowotworowe.W chorobach nowotworowych komórki organizmudzielą się w sposób niekontrolowany. Ich wczesnerozpoznanie jest niezwykle istotne, gdyż daje możliwośćzastosowania właściwej i skutecznej terapii.Normalne i zmodyfikowane nukleozydy reprezentujągrupę potencjalnych biomarkerów w diagnostycenowotworów. Kwas rybonukleinowy, oprócz adenozyny,guanozyny, urydyny i cytydyny, zawiera okołosto modyfikowanych nukleozydów powstałychw wyniku procesów potranskrypcyjnych (ryc. 4), takichjak metylacja, hydroksylacja, redukcja, izomeryzacja,wprowadzenie grupy tiolowej [10]. Są to m. in.3-metylocytydyna (ryc. 4a), 5-metylocytydyna (ryc.4b), N 4 - acetylcytydyna (ryc. 4c) oraz pseudourydyna(ryc. 4d). Celem tych modyfikacji jest zwiększenieaktywności biologicznej kwasu rybonukleinowegow wielu procesach biochemicznych.Najintensywniejszej modyfikacji ulega transportującykwas rybonukleinowy (tRNA). Po zakończeniutranslacji kwas rybonukleinowy jest metabolizowanyi uwalnia nukleozydy. Modyfikowane nukleozydy niemogą być wykorzystane w syntezie de novo kwasu rybonukleinowego.Są usuwane z komórek jako produktykońcowe metabolizmu i z krwią trafiają do moczu.Wzrost wydalania modyfikowanych nukleozydówobserwuje się u pacjentów chorych na zespół nabytegoniedoboru odporności i niektóre nowotwory płuc,przełyku, piersi, jajnika oraz białaczkę i chłoniaki.Zwiększona zawartość modyfikowanych nukleozydóww moczu, sugeruje wzmożoną szybkośćprzemian metabolicznych tRNA w tkankach guza.Natomiast w niektórych nowotworach po zastosowaniuchemioterapii obserwowano szybki spadekpoziomu ekskrecji modyfikowanych nukleozydówi poziom ten był stały przez cały okres remisji choroby[11]. Określenie stężenia modyfikowanych nukleozydóww moczu może być zatem zarówno dobrąmetodą diagnostyczną jak i narzędziem ułatwiającymmonitorowanie terapii.Jégourel i wsp. [12] zsyntezowali polimer ze ślademmolekularnym 5-metylourydyny (ryc. 4e), jakomateriał umożliwiający selektywną adsorpcję nukleozydówpirymidynowych z moczu metodą SPE.W celu uzyskania polimeru o wysokiej selektywnościadsorpcji, autorzy zastosowali strategię semi-kowalencyjnątworzenia śladu molekularnego i wybrali najlepszypolimer spośród wielu otrzymanych z różnychmonomerów funkcyjnych i czynników sieciujących,np. z estru winylofenyloboranowego 5-metylourydynyi akrylamidu (ryc. 2c), 2,6-bis(akrylamido)pirydyny(ryc. 2d) lub 2,6-diamino-9-(3/4-winylobenzylo)puryny (ryc. 2e) i diwinylobenzenu (ryc. 2f), dimetakrylanuglikolu etylenowego, trimetakrylanu 2-etylo-2-(hydroksymetylo)propano-1,3-diolu lub triakrylanupentaerytrytolu (ryc. 2g).7

8 PIOTR LULIŃSKI i inniRyc. 4. Wzory chemiczne modyfikowanychnukleozydów: 3-metylocytydyna(a), 5-metylocytydyna (b), N 4 -acetylocytydyna(c), pseudourydyna (d),5-metylourydyna (e), 3’-deoksy-2’,3’-didehydrotymidyna(f)Fig. 4. Chemical formulas of modifiednucleosides: 3-methylcytidine (a),5-methylcytidine (b), N 4 -acetylcytidine(c), pseudouridine (d), 5-methyluridine(e), 3’-deoxy-2’,3’-didehydrothymidine(f)Autorzy ocenili zdolność polimerów do adsorpcjinaturalnych nukleozydów: cytydyny, urydyny,guanozyny, adenozyny oraz 3’-deoksy-2’,3’-didehydrotymidyny(ryc. 4f), tj. nukleozydu bez gruphydroksylowych w pozycjach 2’ i 3’.Inne spojrzenie na chorobę nowotworową, totraktowanie jej jako stan zaburzonego przekaźnictwasygnałów na poziomie molekularnym [13].Transdukcja sygnału zachodzi m. in. dzięki fosforylacjibądź defosforylacji odpowiednich reszt tyrozynowych,treoninowych i serynowych białek. Odwracalnafosforylacja białek reguluje takie procesyjak proliferacja, różnicowanie komórek, apoptoza,a zaburzona ekspresja i aktywność fosforylowanychna tyrozynie białek (hiperfosforylacja) towarzyszyzapoczątkowaniu i progresji nowotworu. Fosforylowanena tyrozynie białka, w tym kinazy tyrozynoweczy białka adaptorowe, zaangażowane są w procesprzerzutu nowotworu i mogą być wykorzystane jakomarkery w diagnostyce i leczeniu raka.Analiza takich związków jest jednak trudna,ze względu na ich bardzo niskie stężenia i brak odpowiednichtechnik zagęszczania [14]. Do tego celumogą być wykorzystywane polimery ze ślademmolekularnym białek. Jednakże synteza ich stwarzaproblemy, które nie mają znaczenia w przypadkucząsteczek wzorcowych o małej masie molowej. Białkasą rozpuszczalne w wodzie, podczas gdy najczęściejstosowana procedura syntezy polimeru zakładaużycie rozpuszczalników organicznych. Związkiwielkocząsteczkowe w ograniczony sposób penetrująsieć polimeru, co utrudnia ich dotarcie do wnękiadsorpcyjnej. Dodatkowo białka charakteryzują sięmobilnością konformacyjną, na którą wpływ majątemperatura i warunki polimeryzacji. Właściwąkonformację mogą zapewnić tylko zbliżone do naturalnychwarunki procesu tworzenia śladu molekularnego.Dotychczas zaproponowano kilka strategiiotrzymywania polimerów ze śladem molekularnymprotein, m. in. strategię zakładającą tworzenie śladumolekularnego fragmentu białka lub peptydu, czylikilku aminokwasów (ang. epitope imprinting), strategięzakładającą wykorzystanie możliwości chelatowaniai zakotwiczania w matrycy polimeru określonychaminokwasów występujących w strukturzebiałka (ang. metal-chelate approach), strategię wytrawianialub immobilizacji białka na powierzchni(ang. grafting/immobilising on surface) [15].Emgenbroich i wsp. [16] otrzymali polimer ześladem molekularnym fosforylowanej tyrozyny z zabezpieczonągrupą aminową i karboksylową (FmocpTyr-OMe).Miejsce wiążące dopasowali do fosforylowanegołańcucha bocznego peptydu. W tym celuużyli monomerów, będących pochodnymi mocznika:1,1’-[1,3-fenylenobis(metyleno)]bis[3-(4-winylofenylo)mocznika]lub N-3,5-bis(trifluorometylo)fenylo-N’-4-winylofenylomocznika(ryc. 5). Schemattworzenia śladu molekularnego fragmentu cząsteczkiw matrycy polimeru do adsorpcji fosforylowanychbiałek i sam proces adsorpcji, przedstawia rycina 6.Reakcja polimeryzacji prowadzona była w obecnościdimetakrylanu glikolu etylenowego i dodatkowegomonomeru funkcyjnego, metakrylamidu (ryc.2h), a jako porogenów użyto tetrahydrofuranu lubN,N’-dimetyloformamidu.Autorzy przedstawili bardzo dokładną charakterystykęotrzymanych polimerów, dokonując analizy

DIAGNOSTYKA MEDYCZNA9MATERIAŁY POLIMEROWEW DIAGNOSTYCE CHORÓB NEREKRyc. 5. Wzory chemiczne monomerów funkcyjnychpochodnych mocznika, 1,1’-[1,3-fenylenobis(metyleno)]bis[3-(4-winylofenylo)mocznika](a) i N-3,5-bis-(trifluorometylo)-fenylo-N’-4-winylofenylomocznika(b)Fig. 5. Chemical formulas of urea derivatives usedas the functional monomers, 1,1’-[1,3-phenylenebis(methylene)]bis[3-(4-vinylphenyl)urea] (a) and N-3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl-N’-4-vinylphenylurea (b)elementarnej i pomiarów strukturalnych z wykorzystaniemspektroskopii w podczerwieni, spektroskopiifotoelektronów X i spektroskopii magnetycznegorezonansu jądrowego, oraz badając morfologię (analizaporozymetryczna i pomiary przy użyciu skaningowejmikroskopii elektronowej). Ponadto, do oszacowaniaoptymalnej stechiometrii kompleksu prepolimeryzacyjnegoautorzy wykorzystali modelowaniemolekularne. Właściwości adsorpcyjne polimerówweryfikowali przy użyciu różnych technik chromatograficznychz detekcją opartą na spektrometrii mas.Selektywność polimeru określili badając zdolnośćdo adsorpcji krótkich peptydów z fosforylowaną tyrozyną,w obecności nadmiaru ich niefosforylowanychodpowiedników oraz innych fosforylowanychaminokwasów i peptydów, tj. seryny, angiotensynyi treoniny.Autorzy wykazali większe powinowactwo otrzymanegopolimeru do peptydów zawierających fragmentfosfotyrozynowy, niż do innych fosforylowanychpeptydów.Choroby nerek należą do grupy chorób bardzoczęsto diagnozowanych u pacjentów. Przewlekła niewydolnośćnerek jest jedną z nich. Jest to stan postępującegoniszczenia struktury tego narządu, prowadzącydo upośledzenia czynności nerek. Przewlekłaniewydolność nerek może się rozwijać w przebieguwielu chorób. Stężenie kreatyniny w surowicy krwijest najczęściej używanym w praktyce klinicznejwskaźnikiem funkcji nerek, a jej podwyższone poziomysą zapowiedzią przewlekłej niewydolności nerek.Kreatynina powstaje w wyniku nieenzymatycznegorozpadu fosforanu kreatyny w mięśniach, w ilościproporcjonalnej do masy mięśniowej (u zdrowegoczłowieka) i jest wydalana wyłącznie przez nerki(ryc. 7).Istotnym parametrem służącym do ocenyczynności nerek jest klirens kreatyniny, który jestmiarą przesączania kłębuszkowego, a oblicza się gona podstawie stężenia kreatyniny w surowicy krwii w moczu [17]. Obecnie stosowane metody oznaczaniastężenia kreatyniny w moczu, oparte są na spektrofotometrycznympomiarze powstałego w reakcjiJaffe’a kompleksu, jednakże bardzo często w pomiarzeprzeszkadzają występujące w moczu białka.W ostatniej dekadzie opracowano również inne metodyoznaczania kreatyniny np. elektrochemicznelub chromatograficzne [18, 19]. Z uwagi na ograniczonąselektywność faz stacjonarnych, stanowiącychwypełnienia kolumn chromatograficznych, poszukiwanienowych materiałów wydaje się uzasadnione.Hsieh i wsp. [20] otrzymali polimery do selektywnejekstrakcji kreatyniny z moczu, z których jedenbył kopolimerem 4-winylopirydyny (ryc. 2i) i diwinylobenzenu(KPB), zaś drugi był kopolimeremβ-cyklodekstryny i epichlorohydryny (KCE). Odpowiednio4-winylopirydyna lub β-cyklodekstryna tworzyłyniekowalencyjne oddziaływania z kreatyniną(wzorcem). Strukturę β-cyklodekstryny przedstawiarycina 8. Autorzy zbadali selektywność adsorpcji kreatyninyw mieszaninie z N-hydroksysukcynimidemoraz 2-pirolidonem. Stosunek adsorpcji kreatyninydo adsorpcji N-hydroksysukcynimidu był wysokii wyniósł 1,86 dla KCE oraz 1,51 dla KPB. Jeszczewyższe wartości adsorpcji uzyskali dla kreatyninyw stosunku do 2-pirolidonu (odpowiednio 2,34i 3,11).Autorzy oszacowali również wpływ obecnegow roztworze chlorku sodu na adsorpcję kreatyniny.Obecne w próbkach biologicznych kationy sodu powodująsupresję adsorpcji. Autorzy zaobserwowali

10 PIOTR LULIŃSKI i inniRyc. 6. Schemat tworzenia śladu molekularnego fragmentu cząsteczki w matrycy polimeruFig. 6. Scheme of epitope imprinting process in the polymer matrixwykazały możliwość aplikacji polimerów ze ślademmolekularnym kreatyniny w analizie klinicznej, jednakżeistotnym problemem okazała się stosunkowosłaba odtwarzalność złóż polimerowych.Ryc. 7. Wzór chemiczny kreatyninyFig. 7. Chemical formula of creatininezmniejszenie adsorpcji kreatyniny, jednakże obecnośćsoli nie wpływała na selektywność wychwytu.Na koniec autorzy przedstawili wyniki badania ekstrakcjido fazy stałej kreatyniny z ludzkiego osoczana KPB. Stężenie jej oznaczali metodą wysokosprawnejchromatografii cieczowej z detekcją UV. Pomimoznacznej złożoności materiału biologicznego polimeryselektywnie adsorbowały kreatyninę. WynikiMATERIAŁY POLIMEROWEW DIAGNOSTYCE I ANALIZIEKLINICZNEJ CHORÓB SERCAI MIAŻDŻYCYNiehigieniczny tryb życia, stres i nieprawidłoweodżywianie, to tylko niektóre czynniki ryzykachorób serca. Mioglobina jest hemoproteiną obecnąw mięśniach poprzecznie prążkowanych, zarównoszkieletowych jak i mięśnia sercowego. Jej podstawowąrolą jest magazynowanie tlenu. Mioglobina jestuwalniana do krwi w przypadku uszkodzenia tkan-

DIAGNOSTYKA MEDYCZNA11Ryc. 8. Wzór chemiczny β-cyklodekstrynyFig. 8. Chemical formula of β-cyclodextrinki mięśniowej lub zawale serca [21]. Jest wczesnymmarkerem wykorzystywanym w diagnozie ostregozawału mięśnia sercowego, pozwalającym na ocenęrozległości powstałych uszkodzeń [22].Lin i wsp. [23] zsyntezowali polimer z odciskiemmolekularnym mioglobiny w postaci cienkiego filmu.Synteza polimeru przebiegała w następującysposób. Autorzy przygotowali dwie płytki szklane.Jedna z nich tzw. przykrywająca (ang. cover glass) zostaładokładnie przemyta heksametylodisilazanem.Następnie została zanurzona na 2 godz. w roztworzemioglobiny o stężeniu 0,568 μmol/L i pH 7,4. Po wyjęciuzostała wysuszona w strumieniu azotu. W tensposób białko zostało immobilizowane na płytce.Druga płytka tzw. substratowa (ang. substrate glass)została najpierw pokryta warstwą poli(estru 3-trimetoksypropylosililowegokwasu metakrylowego), a następniemieszaniną zawierającą wybrany monomerfunkcyjny, czynnik sieciujący i inicjator. Obie płytkiwłaściwymi stronami zostały ze sobą zetknięte (ang.sandwich contact) i poddane działaniu promieni UV,w celu polimeryzacji warstwy zawierającej mieszaninęmonomerów. W czasie polimeryzacji powstał odciskmolekularny mioglobiny na płytce substratowej.Ostatnim etapem było rozdzielenie płytek i dokładneprzemycie płytki substratowej w celu usunięciawzorca.Omówiony proces tworzenia śladu molekularnegojest zwany procesem mikrokontaktowym (ang.micro-contact imprinting). Optymalizacja strukturyfilmu zakładała dobór monomeru funkcyjnego, którypowinien tworzyć silne oddziaływania z białkiemoraz dobór czynnika sieciującego słabo oddziałującegoz białkiem. W tym przypadku chodziło o redukcjęadsorpcji niespecyficznej. Autorzy wybrali metakrylanmetylu (ryc. 2j) jako monomer funkcyjny,gdyż on z rozważanej grupy kilkunastu monomerówtworzył najsilniejsze oddziaływania z mioglobiną.Czynnikiem sieciującym był dimetakrylan glikolutetrametylenowego (ryc. 2k), który praktycznie nieoddziaływał z mioglobiną. Istotnym punktem pracbył dobór odpowiednich warunków usuwania wzorcaz filmu po polimeryzacji.Autorzy scharakteryzowali otrzymaną matrycęstosując analizę Scatcharda oraz przedstawili mikrografypowierzchni warstwy, otrzymane przy użyciumikroskopii sił atomowych. Mikrografy potwierdziłyobecność w matrycy polimeru miejsc zdolnych adsorbowaćmioglobinę.Miażdżyca tętnic jest przewlekłą chorobą objawiającąsię zmianami zwyrodnieniowymi w błoniewewnętrznej i środkowej tętnic, na skutek gromadzeniasię cholesterolu i lipidów. Cholesterol jest steroidemznajdującym się w błonach komórkowych. Jeston także prekursorem w syntezie kwasów żółciowych,hormonów steroidowych i witaminy D. W procesietransportu cholesterolu w surowicy krwi uczestnicząlipoproteiny. Najważniejsze są LDL (ang. low densitylipoproteins) transportujące cholesterol do tkaneki HDL (ang. high density lipoproteins) transportującego do wątroby, gdzie ulega metabolizmowi [24]. Hipercholesterolemiajest przyczyną chorób sercowo-

12 PIOTR LULIŃSKI i inninaczyniowych i wiąże się z osłabieniem skurczoweji rozkurczowej funkcji serca. Podwyższony poziominnych niż HDL frakcji cholesterolu (ang. non-HDLcholesterol),związany jest ze zwiększonym ryzykiemwystąpienia choroby niedokrwiennej [25].Shi i wsp. [26] otrzymali polimer ze śladem molekularnymcholesterolu. Autorzy zastosowali strategięniekowalencyjną i otrzymali kompleks prepolimeryzacyjnypomiędzy cholesterolem i kwasemmetakrylowym (ryc. 2l). Następnie przeprowadzilipolimeryzację w bloku w obecności czynnika sieciującego,dimetakrylanu glikolu etylenowego w porogenie,którym był układ chloroform-toluen 7:1 v/v.Otrzymane ziarna polimerowe zostały wykorzystanejako faza stacjonarna w procesie ekstrakcji cholesteroludo fazy stałej.Niezwykle istotnym etapem badań była optymalizacjaprocedury SPE, która udowodniła aplikacyjnewłaściwości materiału. Autorzy zbadali wpływpolarności rozpuszczalnika na adsorpcję cholesteroluna etapie nałożenia. W zależności od polarnościroztworu zaobserwowali znacząco różną adsorpcję.Adsorpcja cholesterolu z etanolu była znikoma, z toluenubyła na poziomie 40-50%, a z heksanu wynosiła100%. Niestety zarówno na polimerze ze ślademmolekularnym jak i na polimerze kontrolnym wynosiłatyle samo.W celu uwypuklenia miejsc selektywnych w matrycypolimerowej, autorzy zoptymalizowali etapprzemycia. Zastosowali najpierw heksan, a potemroztwór toluenu i heksanu w stosunku 1:9 v/v. Takaprocedura przemycia spowodowała prawie całkowitądesorpcję cholesterolu z polimeru kontrolnego,a jednocześnie nie usunęła cholesterolu z polimeruze śladem molekularnym. Ostatni etap procedurySPE, czyli etap elucji, został również zoptymalizowany.Najlepszym eluentem okazał się roztwór o składziechloroform-etanol-kwas octowy 3:1:1 v/v, któryilościowo desorbował cholesterol z polimeru ze ślademmolekularnym. Selektywność złoża określonobadając adsorpcję estradiolu. Autorzy wykazali możliwośćwykorzystania polimeru do ekstrakcji cholesteroluz materiału biologicznego, takiego jak: mleko,mięso wieprzowe, mięso wołowe, krewetki, jajai ludzkie osocze.W analizie miażdżycy markerem może być teżfosfatydylocholina. Fosfatydylocholina (nazywanapotocznie lecytyną) należy do grupy glicerofosfolipidówi powstaje z połączenia kwasu fosfatydylowegoz resztą choliny. Jest najbardziej rozpowszechnionymw organizmie fosfolipidem oraz podstawowym składnikiembłon komórkowych, zwłaszcza ich warstwzewnętrznych [27]. Jest także głównym fosfolipidemsurowicy, stanowi bowiem integralną część lipoprotein.Zarówno w lipoproteinach HDL, jak i LDL stanowiponad 60% wszystkich fosfolipidów [28].Pegoraro i wsp. [29] otrzymali membranę ześladem fosfatydylocholiny, selektywnie rozpoznającąfosfolipidy na bazie kopolimeru polietylenu i alkoholupoliwinylowego. Właściwości otrzymanejmembrany zostały dokładnie zbadane przy użyciutechnik spektralnych, kalorymetrycznych i analizytermograwimetrycznej. Powierzchnię membranyzanalizowano stosując mikroskopię sił atomowych.Membrana wykazywała pięciokrotnie większą adsorpcjęfosfatydylocholiny niż membrana kontrolna.Jednocześnie selektywność adsorpcji fosfatydylocholinyw odniesieniu do adsorpcji związków o zbliżonejstrukturze, tj. fosfatydyloetanoloaminy i fosfatydyloinozytolubyła wysoka.MATERIAŁY POLIMEROWEW ANALIZIE KRWIHemoglobina jest białkiem syntetyzowanymw szpiku kostnym, obecnym w erytrocytach i odpowiedzialnymza transport tlenu do tkanek. Przy poziomiehemoglobiny we krwi poniżej normy, (

DIAGNOSTYKA MEDYCZNAErytrocyty posiadają na swojej powierzchni charakterystyczneantygeny A, B i H. Obecność odpowiednichantygenów jest niezwykle istotna podczasprzetaczania krwi. W medycynie transfuzyjnej w celuidentyfikacji odpowiedniej grupy krwi, wykorzystujesię przeciwciała immobilizowane na żelu dekstranowym.Jedynie niektóre z przeciwciał są w stanierozróżnić podgrupy A 1 i A 2 . Różnica pomiędzyoboma podgrupami polega na odmiennej strukturzepowierzchni erytrocytów i różnej gęstości odpowiednichantygenów (A 1 : 0,81 – 1,17 x 10 6 A-antygenóww erytrocycie, A 2 : 2,4 - 2,9 x 10 5 A-antygenów w erytrocycie)[33-35].Seifer i wsp. [36] otrzymali polimer ze ślademmolekularnym erytrocytu odpowiedniej podgrupy.Autorzy zastosowali mikrokontaktowy procestworzenia śladu molekularnego, opisany uprzedniow części dotyczącej tworzenia śladu mioglobiny.Najpierw przygotowali mieszaninę prepolimeryzacyjnązawierającą monomer funkcyjny, 1-winylo-2-pirolidon (ryc. 2m) oraz czynnik sieciujący, N,N’-metylenobisakrylamid (ryc. 2n) oraz odpowiedniinicjator reakcji polimeryzacji. Po krótkim czasieod momentu zainicjowania polimeryzacji przenieśliżelującą mieszaninę w postaci cienkiej warstwyna płytkę kwarcową i następnie umieścili na niejzagęszczone erytrocyty z krwi. Proces polimeryzacjibył kontynuowany przez następne 12 godz.Po usunięciu erytrocytów, płytki z cienką warstwąpolimeru ze śladem erytrocytów, posłużyły jakoczęść sensorowa bioczujnika krystalicznej nanowagikwarcowej.Istotnym problemem badawczym była optymalizacjaczasu żelowania mieszaniny polimeryzacyjnej.Przy zbyt szybkim naniesieniu erytrocytów nażel, ulegały one destrukcji w środowisku organicznychmonomerów, natomiast po zbyt długim czasiematryca była zbyt twarda, aby utworzył się w niejślad. Nawet w optymalnym czasie, który ustalono na1-5 minut, znaczna część erytrocytów ulegała całkowitejsedymentacji w matrycy, co uniemożliwiało ichpóźniejsze usunięcie. Przeprowadzone pomiary potwierdziłyjednak selektywność otrzymanej matrycywzględem podgrup A 1 i A 2 .PODSUMOWANIE13Polimery ze śladem molekularnym są nowymi,selektywnymi materiałami, które mogą znaleźćzastosowanie w diagnostyce medycznej i analizieklinicznej. Niniejsza praca przeglądowa ukazuje zaawansowanystopień badań nad wdrożeniem omawianychmateriałów do praktyki medycznej, w różnychobszarach diagnostyki i analizy klinicznej.LITERATURA[1] Luliński P.: Polimery ze śladem molekularnymw naukach farmaceutycznych. Cz. I. Podstawyprocesu tworzenia śladu molekularnego. Zastosowaniew syntezie leków i technologii postacileku. Polimery (2010), 11–12, 799–805.[2] Luliński P.: Polimery ze śladem molekularnymw naukach farmaceutycznych. Cz. II. Zastosowaniew analizie farmaceutycznej. Polimery(2011), 1, 3–10.[3] Piletsky S. A., Turner N. W., LaitenbergerP.: Molecularly imprinted polymers in clinicaldiagnostics – Future potential and existing problems.Medical Engineering and Physics (2006),28, 971–977.[4] Lapolla A., Traldi P., Fedele D.: Importanceof measuring products of non-enzymatic glycationof proteins. Clinical Biochemistry (2005),38, 103–115.[5] Sacks D. B.: Correlation between hemoglobinA1c (HbA1c) and average blood glucose: canHbA1c be reported as estimated blood glucoseconcentration? Journal of Diabetes Science andTechnology (2007), 1, 801–803.[6] Nathan D. M., Balkau B., Bonora E., Borch-Johnsen K., Buse J. B., Colaguiri S., DavidsonM. B., DeFronzo R., Genuth S., Holman R. R.,J. L., Kirkman S., Knowler W. C., Schatz D.,Shaw J., Sobngwi E., Steffes M., Vaccaro O.,Wareham N., Zinman B., Kahn R.: Internationalexpert committee report on the role of theA1c assay in the diagnosis of diabetes. DiabetesCare (2009), 32, 1327–1334.[7] Yamazaki T., Ohta S., Yanai Y., Sode K.:Molecular imprinting catalyst based artificialenzyme sensor for fructosylamines. AnalyticalLetters (2003), 36, 75–89.[8] Sode K., Ohta S., Yanai Y., Yamazaki T.: Constructionof a molecular imprinting catalyst usingtarget analogue template and its application foran amperometric fructosylamine sensor. Biosensorsand Bioelectronics (2003), 18, 1485–1490.[9] Rajkumar R., Warsinke A., Mohwald H.,Scheller F. W., Katterle M.: Developmentof fructosyl valine binding polymers by covalentimprinting. Biosensors and Bioelectronics(2007), 22, 3318–3325.

14 PIOTR LULIŃSKI i inni[10] Bullinger D., Neubauer H., Fehm T., LauferS., Gleiter C. H., Kammerer B.: Metabolic signatureof breast cancer cell line MCF-7: profilingof modified nucleosides via LC-IT MS coupling.BMC Biochemistry (2007), 8: 25.[11] Seidel A., Brunner S., Seidel P., Fritz G. I.,Herbarth O.: Modifies nucleosides: an accuratetumour maker for clinical diagnosis of cancer,early detection and therapy control. BritishJournal of Cancer (2006), 94, 1726–1733.[12] Jegourel D., Delepee R., Breton F., RollandA., Vidal R., Agrofoglio L. A.: Molecularlyimprinted polymer of 5-methyluridine forsolid-phase extraction of pyrimidine nucleosidecancer markers in urine. Bioorganic and MedicinalChemistry (2008), 16, 8932–8939.[13] Azuma K., Tanaka M., Uekita T., Inoue S.,Yokota J., Ouchi Y., Sakai R.: Tyrosine phosphorylationof paxillin affects the metastaticpotential of human osteosarcoma. Oncogene(2005), 24, 4754–4764.[14] Emgenbroich M., Borrelli C., Shinde S.,Lazraq I., Vilela F., Hall A. J., OxelbarkJ., De Lorenzi E., Courtois J., Simanova A.,Verhage J., Irgum K., Karim K., SellergrenB.: A phosphotyrosine – imprinted polymer receptorfor the recognition of tyrosine phosphorylatedpeptides. Chemistry A European Journal(2008), 14, 9516–9529.[15] Robinson-Bennett B. L., DeFord J., Diaz-ArrastiaC., Levine L., Wang H.-Q., HanniganE. V., Papaconstantinou J.: Implications of tyrosinephosphoproteomics in cervical carcinogenesis.Journal of Carcinogenesis (2008), 7: 2.[16] Bossi A., Bonini F., Turner A. P. F., PiletskyS. A.: Molecularly imprinted polymers for therecognition of proteins: the state of art. Biosensorsand Bioelectronics (2007), 22, 1131–1137.[17] Passos V. M. A., Barreto S. M., Lima-CostaM. F. F.: Detection of renal dysfunction based onserum creatinine levels in a Brazilian community.The Bambui health and ageing study. BrazilianJournal of Medical and Biological Research(2003), 36, 393–401.[18] Harlan R., Clarke W., Di Bussolo J. M., KozakM., Straseski J., Li Meany D.: An automatedturbulent flow liquid chromatography –isotope dilution mass spectrometry (LC-IDMS)method for quantitation of serum creatinine.Clinica Chimica Acta (2010), 411, 1728–1734.[19] Pandey P. C., Mishra A. P.: Novel potentiometricsensing of creatinine. Sensors and ActuatorsB (2004), 99, 230–235.[20] Hsieh R.-Y., Tsai H.-A., Syu M.-J. Designinga molecularly imprinted polymer as an artificialreceptor for the specific recognition of creatininiein serum. Biomaterials (2006), 27, 2083–1089.[21] Laurence A. S.: Serum myoglobin and creatinekinase following surgery. British Journal of Anaesthesia(2000), 84, 763–766.[22] Yamamoto M., Komiyama N., Koizumi T.,Nameki M., Yamamoto Y., Toyoda T., OkunoT., Tateno K., Sano K., Himi T., KuriyamaN., Namikawa S., Yokoyama M., Komuro I.:Usefulness of rapid quantitive measurement ofmyoglobin and troponin T in early diagnosis ofacute myocardial infarction. Circulation Journal(2004), 68, 639–644.[23] Lin H.-Y., Rick J., Chou T.-C.: Optimizing theformulation of a myoglobin molecularly imprintedthin-film polymer – formed using a micro-contactimprinting method. Biosensors andBioelectronics (2007), 22, 3293–3301.[24] Goldstein J. L., Brown M. S.: The LDL receptor.Arteriosclerosis, Thrombosis, and VascularBiology (2009), 29, 431–438.[25] Noda H., Iso H., Irie F., Sairenchi T., OhtakaE., Ohta H.: Association between nonhigh-densitylipoprotein cholesterol concentrationsand mortality from coronary heart diseaseamong Japanese men and women: the Ibarakiprefecture health study. Journal of Artherosclerosisand Thrombosis (2010), 17, 30–36.[26] Shi Y., Zhang J.-H., Shi D., Jiang M., Zhu Y.-X.,Mei S.-R., Zhou Y.-K., Dai K., Lu B.: Selectivesolid-phase extraction of cholesterol using molecularlyimprinted polymers and its applicationin different biological samples. Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis (2006), 42,549–555.[27] Higgins J. A.: The transverse distribution ofphospholipids in the membranes of Golgi subfractionsof rat hepatocytes. Biochemistry Journal(1984), 219, 261–272.[28] Yamamoto A.: Phospholipids and their fatty acidcomposition in hyperlipemia. Japanese Journalof Medicine (1975), 14, 104–106.[29] Pegoraro C., Silvestri D., Ciardelli G.,Cristallini C., Barbani N.: Molecularly imprintedpoly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranesfor the specific recognition of phospholipids.Biosensors and Bioelectronics (2008), 24,748–755.[30] van Straten A. H. M., Hamad M. A. S., vanZundert A. J., Martens E. J., Schonberger J.P. A. M., de Wolf A. M.: Preoperative hemoglo-

DIAGNOSTYKA MEDYCZNA15bin level as a predictor of survival after coronaryartery bypass grafting. Circulation (2009), 120,118–125.[31] Xing Y., Yan H., Dang S., Zhuoma B., Zhou X.,Wang D.: Hemoglobin levels and anemia evaluationduring pregnancy in the highlands of Tibet:a hospital based study. BMC Public Health(2009), 9: 336.[32] Guo T. Y., Xia Y. Q., Hao G. J., Song M. D.,Zhang B. H.: Adsorptive separation of hemoglobinby molecularly imprinted chitosan beads.Biomaterials (2004), 25, 5905–5912.[33] Bird G. W. G.: Relationship of the blood subgroupsA 1 , A 2 and A 1 B, A 2 B to haemagglutininspresent in the seeds of Dolichos biflorus. Nature(1952), 170, 674.[34] Economidou J., Hughes-Jones N. C., GardnerB.: Quantitive measurements concerningA and B antigens sites. Vox Sanguinis (1967), 12,321–328.· · · · · · · ·[35] Furukawa K., Clausen H., Hakomori S.-I.,Sakamoto J., Look K., Lundblad A., MattesM. J., Lloyd K. O.: Analysis of the specificity offive murine anti-blood group A monoclonal antibodies,including one that identifies type 3 andtype 4 determinants. Biochemistry (1985), 24,7820–7826.[36] Seifer A., Lieberzeit P., Jungbauer C., DickertF. L.: Synthetic receptors for selectively detectingerythrocyte ABO subgroups. AnalyticaChimica Acta (2009), 651, 215–219.Adres autorów:Katedra i Zakład Chemii OrganicznejWydział FarmaceutycznyWarszawski Uniwersytet Medycznyul. Banacha 1, 02-097 Warszawatel./faks +22 572 0643e-mail: piotr.lulinski@wum.edu.pl