Zde - 2. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

P-67. NTH1 A STRUKTURNÍ POZADÍ JEJÍ AKTIVACE PROTEINEM BMH1Macáková E. 1 , Kopecká M. 1 , Man P. 2 , ObšilováV. 11 Fyziologický ústav, Akademie věd České republiky, v.v.i.,Praha; 2 Mikrobiologický ústav, Akademievěd České republiky, v.v.i.,PrahaŠkolitel: RNDr. Veronika Obšilová, Ph.D.Úvod: Neutrální trehalasa 1 (Nth1) je kvasničný enzym (EC 3.2.1.28) z rodiny hydrolas, kterýhydrolyzuje trehalosu na dvě molekuly glukosy. Trehalosa (1-α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranosid)je zásobní metabolit, který hraje důležitou úlohu při buněčném stresu. Jak bylo dříve zjištěno, Nth1 jeaktivováno kvasničnými isoformami 14-3-3 proteinů, Bmh1 a Bmh2, se kterými interaguje pomocífosforylovaného N-konce, což bylo potvrzeno limitovanou proteolýzou. Nth1 je fosforylována pomocíPKA a vytváří s Bmh komplex v poměru 1:2. Pomocí bodové mutagenese a enzymových kinetickýchměření byly určeny jako fosforylační místa na N-konci serin60 a serin83. Ke studiu strukturních změnpři interakci Nth1 a Bmh1 byly použity metody H/D výměna a chemické zesíťovací reakce spřažené ahmotnostní spektrometrií.Cíl: Objasnit mechanismus aktivace Nth1 kvasničnými 14-3-3 proteiny z hlediska strukturních změn,ke kterým na proteinech dochází.Materiál a metody: Proteiny jsou exprimovány v Escherichia coli BL21(DE3) buňkách (BMH1 a BMH2proteiny) a v Rosettách (NTH1) jako fúzní proteiny (s afinitní kotvou His-tag na N-konci). Purifikačníprotokoly umožňující přípravu proteinů jsou vyvinuty. Exprimované proteiny jsou purifikovány použitímafinitní chromatografie a gelové permeační filtrace, jejich čistota je monitorována užitím SDS-PAGE.Samotná měření se provádějí na MBÚ AV ČR na přístroji Bruker APEX-Q FTMS.Výsledky: Strukturní změny Nth1 a Bmh1 při aktivaci Nth1 byly zjišťovány pomocí H/D výměny achemických zesíťovacích reakcí spolu s hmotnostní spektrometrií. Z naměřených dat vyplývá, že vobou proteinech dochází v komplexu ke strukturním změnám. U Nth1 je ovlivněno několik oblastí,zejména v okolí aktivního centra enzymu, kde dochází nejspíše k jeho zpřístupnění, protože jinak jeskryté uvnitř molekuly. Při vazbě na Nth1 je u Bmh1 ovlivněno také mnoho oblastí, a to nejen vazebnýžlábek, kam se váže fosforylovaný N-konec Nth1, ale také ostatní části a povrch molekuly.Závěr: Ačkoli stále zůstává mnoho nejasností, na které je třeba se zaměřit v budoucnu, tato měřeníukázala detailní pohled na způsob aktivace Nth1 pomocí Bmh1 z hlediska strukturních změn proteinů.Podpora projektu: Tato práce je sponzorována grantem P207/11/0455 Grantové agentury Českérepubliky.99