Zde - 2. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

P-42. ANALÝZA KINETICKÉHO PROFILU OXIDAČNÉHO POŠKODENIA MITOCHONDRIÍ.Kohutiar M. 1 , Wilhelm J. 21 Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN Motol; 2 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i.Školitel: prof. RNDr. Jiří Wilhelm, Ph.D.Úvod: Mitochondrie sú trvale vystavené oxidačnému stresu. Reaktívne formy kyslíka a dusíka alterujúbiomolekuly a tým menia fyziologické pochody prebiehajúce v bunke. Výskumy v nedávnej dobepopisujú signifikantný vplyv reaktívnych molekúl kyslíka a dusíka in vivo na rozvoj civilizačnýchochorení.Cíl: Cieľom našej práce je sledovať rozsah oxidačného poškodenia mitochondrií v čase po iniciáciiradikálových reakcií tert-butylhydroperoxidom (t-BuOOH) a peroxynitritom (PE).Materiál a metody: Experimetnálne sme izolovali mitochondrie z hovädzieho srdca. PE smesyntetizovali in situ v laboratóriu. Vzorky s obsahom proteínov 10 mg/ml sme paralelne inkubovali vrade koncentrácií t-BuOOH a PE (0,05 mM; 0,2mM; 0,5 mM; 1 mM; 2 mM a 4 mM). Zmeny smesledovali porovnaním s kontrolami bez prídavku oxidačného činidla. Produkty oxidácie sme stanovilireakciou s kyselinou tiobarbiturovou (TBA). Zmeny v množstve TBA-reaktívnych molekúl smeanalyzovali spektrofotometricky pri 532 nm.Následne sme previedli elektroforetické delenie proteínov v paralelne inkubovaných vzorkáchmetódou SDS-PAGE. Rozdelené proteíny sme vizualizovali striebrom a vyhodnotili kamerovýmsystémom denzitometricky.Výsledky: Vo všetkých vzorkách inkubovaných s PE sme zaznamenali zvýšenie absorbancie smaximom po 1 hodine pri koncentrácii PE 1 mM (vzostup o 452%). V 50 µM rade sme pozorovaliokamžité zvýšenie absorbancie v porovnaní s kontrolou (vzostup o 252%). Toto pozorovanie dokazujevysokú reaktivitu PE už pri nízkych koncentráciách rádovo zhodných s koncentráciami in vivo.Najvyššie absorbancie v t-BuOOH rade sme pozorovali pri koncentrácii 4 mM (vzostup o 816%) po 24h inkubácie a v identickom čase zníženie množstva TBA- reaktívnych molekúl v PE rade. Pozorovaniemůže byť v spojitosti s doposiaľ neznámymi reakciami PE s produktmi lipoperoxidácie. Elektroforézaproteínov potvrdila zmeny v kvantitatívnom zložení proteínov po 24 hodinách inkubácie. Zaujímavé je,že vysoké koncentrácie PE významne narušujú a menia zloženie proteínov vo vzorkách. Pozorovalisme degradáciu a kvantitatívne zníženie konkrétnych frakcií proteínov v analytoch na rozdiel odparalelných vzoriek inkubovaných s t-BuOOH.Závěr: Rozdiely v trendoch nameraných parametrov naznačujú variabilitu v chemizme reakcií avykazujú rozdielny charakter v závislosti na použitom oxidačnom činidle. PE posobí ako selektívnyoxidant významnejšie zasahujúci do integrity mitochondrií na rozdiel od t-BuOOH.Podpora projektu: Tato práce je podporována grantem GAČR P303/11/0298.74