12.07.2015 Views

Zde - 2. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

Zde - 2. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

Zde - 2. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

SHOW MORE
SHOW LESS

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

P-30. ADENO-ASOCIOVANÝ VIRUS JAKO VEKTOR PRO KOMBINOVANÝ PŘENOSIMUNOSTIMULAČNÍCH A SEBEVRAŽEDNÝCH GENŮ - 1+KK PRO TŘÍČLENNOU RODINU?Jinoch P. 1 , Rittich. Š 1, 3 , Vonka V. 3 , Goetz P. 21 Exbio Praha; 2 Ústav biologie a lékařské genetiky <strong>2.</strong> LF UK; 3 Ústav hematologie a krevní transfuzeŠkolitel: Prof. MUDr. Goetz Petr, CSc.Úvod: Genová terapie využívá dva přístupy k léčbě nádorů, buď se snaží přenosem genu zničitnádorové buňky anebo opravit pro nádor specifický genový defekt. Přímé ničení buněk nádoru lzedosáhnout vnesením sebevražedných genů, které činí nádorovou buňku citlivou k jinak netoxickýmlátkám. Účinek lze posílit indukcí protinádorové imunitní odpovědi vnesením genů pro imunostimulačnímolekuly. Kombinovaný přístup klade nároky na přenosovou kapacitu vektoru, proto jsou častopoužívány bicistronické expresní kazety a fúzní geny.Cíl: Vytvořit expresní kazetu pro adeno-asociovaný vektor, která by obsahovala geny pro thymidinkinázu herpes simplex a pro podjednotky interleukinu-12, aniž by byla překročena maximální kapacituvektoru (5,2 kbp). Porovnali jsme účinnost exprese genů z prvního a druhého místa v biscistronickéexpresní kazetě a biologickou účinnost fúzního genu pro polyprotein obsahující obě podjednotkyinterleukinu-12 spojené sekvencí pro rozštěpení řetězce buněčnou endoproteázou furinem.Materiál a metody: Sestrojili jsme plazmidové DNA obsahující bicistronické expresní kazety s genempro gfp a genem pro thymidin kinázu viru herpes simplex. Po transfekci plazmidové DNA do buněkjsme ověřovali expresi gfp ve fluorescenčním mikroskopu a expresi thymidin kinázy pěstováním buněkv selekčním mediu.Sestrojili jsme fúzní gen pro polypeptidový řetězec obsahující obě podjednotky interleukinu-1<strong>2.</strong>Expresi proteinu jsme ověřili transfekcí plazmidové DNA do buněk a detekcí proteinu v kultivačnímmediu metodou ELISA. Štepení polypeptidu buněčnou endoproteázou jsme ověřovali pomocí westernblotu s imunodetekcí interleukinu-1<strong>2.</strong> Biologickou aktivitu fúzního interleukinu jsme ověřovalischopností stimulovat proliferaci aktivovaných lymfocytů.Výsledky: Bicistronické expresní kazety obsahující virové IRES dovolují společnou expresi dvou genůz jedné mRNA pod kontrolou jednoho promotoru. Translace druhého genu v pořadí je výrazněoslabena.Exprimovaný fúzní protein obsahující obě podjednotky interleukinu-12 byl sekretován převážně vnerozštěpené formě. Důvodem pro nekompletní štěpení mohl být nedokonalý sekvenční motiv proendoproteázu. Biologická aktivita exprimovaného proteinu byla ve srovnání s nativním interleukinemsnížena.Závěr: Sestrojili jsme sérii plazmidů pro přípravu adeno-asociovaných vektorů obsahujícísebevražedný gen a geny pro imunostimulační molekuly. Plazmidy byly použity v dalšíchexperimentech pro přípravu vektorů ke genové modifikaci nádorových buněk.62

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!