Zde - 2. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

P-06. ÚLOHA BMH PROTEINŮ V REGULACI ENZYMOVÉ AKTIVITY KVASNIČNÉ NEUTRÁLNÍTREHALASYVeisova, D. 1,2 , Macakova, E. 1,2 , Rezabkova, L. 1,3 , Sulc, M. 4,5 , Vacha, P. 1,3 , Sychrova, H. 1 , Obsil, T. 1,3 ,Obsilova, V. 11 Fyziologický ústav AV ČR, Praha; 2 2. lékařská fakulta UK, Praha; 3 Přírodovědecká fakulta UK,katedra Fyzikální a makromolekulární chemie, Praha; 4 Mikrobiologický ústav AV ČR, Praha;5 Přírodovědecká fakulta UK, katedra Biochemie, PrahaŠkolitel: RNDr. Veronika Obšilová, Ph.D.Úvod: Neutrální trehalasa 1 (Nth1, E.C. 3.2.1.28) je enzym patřící do skupiny hydrolas, který zajišťujedegradaci neredukujícího disacharidu trehalosy na dvě molekuly glukosy. Trehalosa je v buňcenahromaděna jako přirozená odpověď na stresové situace. V roce 2008 bylo zjištěno, že kvasničnéisoformy Bmh1 a Bmh2 tvoří komplexy s Nth1. Šlo o první případ regulace enzymové aktivity pomocíkvasničných isoforem 14-3-3 proteinů. Obě kvasničné isoformy jsou zodpovědné za kompletníenzymovou aktivitu Nth1 po fosforylaci PKA in vitro. Interakci Bmh proteinů s Nth1 zprostředkujevazba závislá na fosforylaci.Cíl: Cílem projektu je porozumění strukturní podstaty regulace aktivity enzymu Nth1 prostřednictvímvazby Bmh1 a Bmh2 proteinů. Metabolismus trehalosy je základní složkou odpovědi na stres vbuňkách kvasinek. Objasnění mechanismů regulace aktivity Nth1, poskytuje velmi důležitou informacitýkající se mechanismu jak funkce 14-3-3 proteinu, tak i regulace aktivity Nth1 v kvasinkách.Materiál a metody: Hlavními metodami, které byly použity pro studium této úlohy, byly cílenámutageneze, studium enzymové kinetiky, limitovaná proteolýza a analytická ultracentrifugace.Výsledky: Metoda sedimentační analýzy a kinetická měření potvrzují, že obě kvasničné 14-3-3isoformy tvoří stabilní komplexy s fosforylovanou Nth1 a touto vazbou významně zvyšují jejíenzymovou aktivitu, navíc Bmh proteiny významně zvyšují enzymovou aktivitu v porovnání s Ca2+.Provedení limitované proteolýzy potvrdilo, že Bmh proteiny interagují s N-koncem Nth1, ve kterémjsou obsaženy vazebné motivy a že v komplexu pNth1/Bmh chrání Bmh N-konec Nth1 předproteolytickou degradací. Kinetické studie v pokusech in vitro naznačují, že fosforylační místa vhodnápro vazbu s kvasničnými 14-3-3 proteiny se nacházejí na pozicích Ser20, Ser21, Ser60 a Ser83 a žePKA fosforyluje Nth1 právě na těchto čtyřech pozicích. Pro vazbu Bmh s Nth1 jsou důležitá zejménafosforylační místa na pozicích Ser60 a Ser83. S těmito výsledky korespondují i experimentyprovedené in vivo.Závěr: Významem projektu je studium vlastností 14-3-3 proteinů, které se vyskytují ve všecheukaryotických organismech a regulují řadu klíčových biologických dějů v buňce, jako jsou regulacebuněčného cyklu, přenosu signálu, apoptózy, jsou úzce spjaty s procesem rakoviny a objevují se i vsouvislosti s některými neurodegenerativními onemocněními. Tímto projektem se podílíme navysvětlení mechanismu aktivace enzymu Nth1 prostřednictvím Bmh proteinů.Podpora projektu: Grantová agentura UK (Grant 350111)38