Zde - 2. lékařská fakulta - Univerzita Karlova

13. PROFILOVÁNÍ BUNĚK DĚTSKÉ AKUTNÍ LEUKEMIE POMOCÍ INOVATIVNÍ METODYAFINITNÍ PROTEOMIKYČerná D. 1 Kanderová V. 1 , Stuchlý J. 1 , Fišer K. 1 , Wu W. 2 , Holm A. 2 , Hrušák O. 1 , Lund-Johansen F. 2 ,Kalina T. 11 CLIP-Cytometrie, Klinika dětské hematologie a onkologie 2.LF UK a FN Motol Praha; 2 Department ofHaematology, Rikshospitalet, OsloŠkolitel: Doc. MUDr. Tomáš Kalina, PhD.Úvod: Akutní leukémie (AL) je nejčastější malignitou dětského věku charakteristická množstvímaberací na úrovni DNA, mRNA i proteinů. Současný výzkum leukemií je zaměřen převážně nasledování mutací na úrovni DNA, funkční důsledky těchto změn na buněčné úrovni však objasněnynejsou. Spojníkem mezi genovou expresí a buněčnou fyziologií jsou proteiny, proto se v současnédobě věnuje mnoho úsilí vývoji efektivnějších a senzitivnějších nástrojů, které mohou pomoci v hledánínových prognostických znaků na úrovni proteinů.Cíl: Naším cílem je pomocí nové SEC-MAP technologie (Size-exclusion Chromatography -Microsphere-based Affinity Proteomics) zjistit míru exprese či aktivace (např. fosforylace) molekuldiferenciálně exprimovaných v jednotlivých subtypech AL s ohledem na buněčný typ (B, T, myelo),genotyp (fúzní geny, aneuploidie) a časnou odpověď na léčbu detekovanou jako minimální reziduálnínemoc (MRN).Materiál a metody: SEC-MAP je soubor 1728 populací fluorescenčně značených latexovýchmikrokuliček, z nichž každá nese protilátky proti různým lidským proteinům. Z buněk izolujememembránové, cytoplasmatické a jaderné proteiny pomocí detergentů, značíme je biotinem arozdělujeme pomocí gelové chromatografie na 24 frakcí. Tyto následně inkubujeme s mikrokuličkamiSEC-MAP a vazbu detekujeme pomocí fluorescenčně značeného streptavidinu na průtokovémcytometru.Výsledky: Doposud jsme vyšetřili expresi cytoplasmatických (n=980) a membránových (a DNAvazebných)(n=769) proteinů u 69 diagnostických vzorků AL. Díky schopnosti SEC-MAP rozlišitproteiny dle velikosti (hydrodynamického poloměru) jsme zjistili proteolýzu u 12 vzorků, které jsmenásledně z analýzy vyřadili. Analýzu výsledků jsme provedli pomocí automatického softwaruvytvořeném v R-project. Pro normalizaci dat proteinové exprese jsme použili normalizaci loess běžněpoužívanou při mRNA expresním profilování. Takto jsme identifikovali 77 proteinů (např. SH2D1A,FAS, LAT, KIT, CD72) diferenciálně exprimovaných mezi jednotlivými kategoriemi AL. Zjistili jsmenapř. vyšší expresi cAMP-dependentní proteinkinázy PRKACA u TEL-AML1 pozitivních AL. Vsoučasné době data verifikujeme pomocí jiných proteomických metod, např. WB.Závěr: Protože detekujeme nejen expresi proteinů, ale také jejich velikost, přítomnost v komplexu alokalizaci v buňce, řadí se tak SEC-MAP k novým metodám funkční proteomiky kombinující kapacituDNA microarrays a dostupnost průtokové cytometrie v „high-throughput“ hodnocení leukemickýchvzorků.Podpora projektu: GAUK 596912, NT/13462, P302/12/G101, UNCE 20401221