Aktualności Nr 62 plik do pobrania (format pdf) - bioMérieux

Tabela 1. Liczba i rozkład wzrostu drobnoustrojów izolowanych z krwi od pacjentów Centrum Onkologii.Drobnoustrój Wzrost tylko Szybszy wzrost Równoczesny Wzrost tylko Szybszy wzrost Razemw butelce w butelce wzrost w obu w butelce w butelce L (%)tlenowej tlenowej butelkach beztlenowej beztlenowejT T>B T=B B B>TStaphylococcus 8 31 23 20 29 111 (16.7)aureusStaphylococcus 36 11 5 16 26 94 (14.2)koagulazo(-)Enterococcus sp. 9 4 7 8 28 56 (8.4)Streptococcus sp. 4 10 4 9 9 36 (5.4)Pałeczki Gram(-) 36 32 42 36 91 231 (34.8)z rodzinyEnterobacteriaceaePałeczki Gram(-) 67 6 1 - - 74 (11.1)niefermentująceInne 1 2 - 1 6 10 (1.5)Grzyby 36 3 - - - 39 (5.8)drdrożdżopodobneBeztlenowce: – – – 13 – 13 (1.9)Bacteroides sp. 8Fusobacterium sp. 4Micromonas micros 1Razem 191 99 82 103 189 664 (100)4W badaniach nie uwzględniono drobnoustrojów,które mogłyby stanowić zanieczyszczenie próbkikrwi: Corynebacterium sp. Propionibacteriumacnes, Bacillus sp. W przypadku gronkowców koagulazoujemnychuwzględniono szczepy izolowanekilkakrotnie z próbek krwi od jednego pacjenta lubszczepy izolowane z krwi i z końcówki cewnikawkłucia centralnego o identycznym profilu lekowrażliwościpochodzące od danego pacjenta. Odsetekdodatnich hodowli drobnoustrojów tylko wbutelce tlenowej stanowi 28.8%, w butelce beztlenowej15.5%, natomiast w obu butelkach stanowi55.7%.Tabela I przedstawia rozkład wzrostu drobnoustrojówwyhodowanych z posiewów krwi pobranej odpacjentów Centrum Onkologii – wzrost tylko w butelcetlenowej, w obu butelkach z uwzględnieniemtempa wzrostu oraz wzrost tylko w butelce beztlenowej.We wszystkich kombinacjach wzrost dla Staphylococcusaureus obserwowano w 16.7% przypadków,dla gronkowców koagulazoujemnych w14.2%, Enterococcus sp. w 8.4%, Streptococcussp. w 5.4%, pałeczek Gram(-) z rodziny Enterobacteriaceaew 34.8%. Pałeczki niefermentujące(Pseudomonas sp, Acinetobacter sp, Stenotrophomonasmaltophilia) izolowano z butelek tlenowychw 10% przypadków oraz w obubutelekach z uwzględnieniem tempa wzrostu w1.1%. Inne bakterie – Listeria monocytogenes –wzrost w butelce tlenowej obserwowano w 0.1%przypadków oraz w obu butelkach z uwzględnieniemtempa wzrostu w 1.2% , natomiast Haemophilusinfluenzae - wzrost w butelce beztlenowej w 0.1%.Wzrost bakterii beztlenowych (Bacteriodes sp.,Fusobacterium sp., Micromonas micros) obserwowanowyłącznie w butelce beztlenowej w 1.9%przypadków.Porównanie wzrostu drobnoustrojów izolowanychtylko w butelce tlenowej lub beztlenowej przedstawiarycina 2. W przypadku Staphylococcus aureuswzrost tego drobnoustroju stwierdzono w 20 butelkachbeztlenowych (18%) przy braku wzrostu w butelkachtlenowych i w 8 butelkach tlenowych(7.2%) przy braku wzrostu w butelkach beztlenowych.Bakterie z rodziny Enterobacteriaceae wyhodowanow 36 butelkach beztlenowych (15.5%)przy braku wzrostu w butelkach tlenowych i w 30butelkach tlenowych (12.9%) przy braku wzrostuw butelkach beztlenowych. Szczepy pałeczekGram(-) niefermentujących i grzyby drożdżopodobneizolowano z butelek tlenowych: odpowiednio- pałeczki Gram(-) 67 szczepów (90.5%), grzybydrożdżopodobne 36 szczepów (92.3%). Bakteriebeztlenowe stanowią 1.9% wszystkich wyhodowanychdrobnoustrojów.

nowość w ofercieZauważalny w ciągu ostatnich 10 lat postęp w diagnozowaniu i leczeniu wielujednostek chorobowych, zmiany w postępowaniu u pacjentów z podejrzeniemsepsy lub bakteriemii w przebiegu innych chorób, stawiają nowe wyzwania przedlaboratoriami mikrobiologicznymi. Ciągłe dążenie do skrócenia czasu uzyskaniawyniku posiewu, w tym posiewu krwi, jest kluczowym elementem, który wpływana możliwość podjęcia celowanej antybiotykoterapii, a co za tym idzie daje większeszanse na sukces terapeutyczny i skrócenie czasu pobytu pacjenta w szpitalu.Firma bioMérieux, majac już ponad 45 lat doświadczenia w dziedzinie diagnostykimikrobiologicznej, nieustannie rozwija swoją ofertę i dostosowuje ją dowciąż zmieniających się potrzeb laboratoriów. Co roku w naszej ofercie pojawiająsię nowe podłoża i testy diagnostyczne, które uzupełniają lub zastępują tewcześniej stosowane. Dlatego w najbliższym czasie pojawią się w naszej ofercienowe podłoża do systemuBacT/ALERT – FAN Plus,w których dotychczas stosowany czynnik neutralizujący substancje działające przeciwdrobnoustrojowow tym antybiotyki, komplement, lizozym i in., czyli węgiel aktywny,zastąpiono m.in. innowacyjnym suplementem dodawanym do podłożyokreślonym jako APB (Adsorbent polymeric beads –Kuleczki adsorbentu polimerowego).W grupie podłoży FAN Plus znajdą się butelki BacT/ALERT FA Plus i FN Plus,stosowane dla materiałów pobieranych od osób dorosłych, do hodowli drobnoustrojów,odpowiednio w warunkach tlenowych i beztlenowych, jak również butelkaBacT/Alert PF Plus dla próbek pochodzących od dzieci.Nowy skład podłoży, jak również zmodyfikowane algorytmyodczytu, przyniosły wiele korzyści dla diagnostykisepsy. Badania porównawcze wykazały zwiększenie odsetkahodowanych drobnoustrojów, skrócenie czasu uzyskaniawyniku dodatniego, jak również szerokie spektrumneutralizowanych antybiotyków. Dzięki specjalnej formuleAPB oraz dodatkowi innego związku, szybkiemu i efektywnemuwiązaniu podlegają zarówno niespolaryzowane,jak i naładowane dodatnio cząstki antybiotyków. Zastąpieniewęgla aktywnego umożliwia też wprowadzenie procedurywykonania bezpośredniej identyfikacjidrobnoustrojów wyhodowanych z dodatnich posiewówkrwi w butelkach BacT/ALERT przy użyciu systemów wykorzystującychmetodę spektrometrii masowej, jak równieżułatwia interpretację preparatów barwionych metodąGrama mniej doświadczonemu personelowi laboratorium.Nowe podłoża FAN Plus wraz z dostosowanym do nichoprogramowaniem systemów BacT/ALERT 3D są innowacyjnymrozwiązaniem stanowiącym kolejny etap wofercie bioMérieux służącej do diagnozowania sepsy.7

ocena produktuOcena chromogennego podłożachromID CARBA firmy bioMérieuxdr Anna Baraniak 1 , dr Dorota Żabicka 21 Zakład Mikrobiologii Molekularnej,Narodowy Instytut Leków w Warszawie.2 Zakład Mikrobiologii i Epidemiologii Klinicznej,Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD),Narodowy Instytut Leków w Warszawie8W ostatnich latach odnotowano pojawianie sięi szybkie rozprzestrzenianie pałeczek Gram-ujemnychniefermentujących i jelitowych z rodzinyEnterobacteriaceae opornych na karbapenemy,leki ostatniej szansy w leczeniu zakażeń wywołanychprzez te drobnoustroje. Oporność tamoże być spowodowana kilkoma mechanizmami,z których najniebezpieczniejszym jestprodukcja b-laktamaz hydrolizujących karbapenemy.Należą one głównie do dwóch rodzajów,tzw. metalo-b-laktamaz klasy B (MBL) i b-laktamazklasy A (np. KPC), chociaż należy równieżwspomnieć o trzeciej grupie tych enzymów – b-laktamazachklasy D (CHDL).Najwcześniej u bakterii chorobotwórczych zaobserwowanopojawienie się enzymów MBL. Pierwsze szczepyz nabytymi MBL zidentyfikowano pod koniec lat 1980.w Japonii u niefermentującej pałeczki Pseudomonasaeruginosa, a od drugiej połowy lat 90-tych obserwowanejest szybkie i efektywne ich rozprzestrzenianiesię na całym świecie. Natomiast pierwsze szczepypałeczek jelitowych z MBL obserwowano na DalekimWschodzie w połowie lat 90-tych, a od 2001 r. izolowanesą też w Europie. Najważniejszymi rodzinaminabytych MBL są enzymy IMP i VIM, występującezarówno u pałeczek niefermentujących, jak i jelitowych.W 2010 r. wielki rozgłos zyskała identyfikacjanowego rodzaju MBL – enzymu NDM-1.Najważniejsze karbapenemazy klasy A to enzymy z rodzinyKPC (ang.: Klebsiella pneumoniae carbapenemase).Szczepy KPC pojawiły się najpierw podkoniec lat 90-tych w USA, a w chwili obecnej obserwujesię ich niezwykle szybkie rozprzestrzenianie niemalna całym świecie, z szeregiem obszarówwystępowania endemicznego. Głównym producentemKPC jest K. pneumoniae, ale obecność tych enzymówstwierdzono już także u innych gatunkówEnterobacteriaceae (Klebsiella oxytoca, Escherichiacoli, Enterobacter sp., Citrobacter freundii, Serratiamarcescens, Salmonella enterica) oraz P. aeruginosai Acinetobacter baumannii.Trzecią grupę karbapenemaz stanowią enzymyCHDL. Zdecydowana większość znanych wariantówenzymów CHDL wytwarzana jest przez szczepy pałeczekniefermentujących (zwłaszcza Acinetobacter sp.).Należą do nich zarówno naturalne enzymy, charakterystycznedla określonych gatunków, jak i b-laktamazynabyte. Pierwszym i dotąd jedynym rodzajemnabytych CHDL obserwowanym tylko uEnterobacteriaceae, są enzymy typu OXA-48. Głównymproducentem b-laktamaz z grupy OXA-48 jestK. pneumoniae, ale obecność tych enzymów stwierdzasię także u innych gatunków Enterobacteriaceae,zwłaszcza E. coli i Enterobacter cloacae.Obserwowane szczepy pałeczek Gram-ujemnychwytwarzające karbapenemazy nagminnie wykazujątzw. wielooporność, czyli niewrażliwość na co najmniejtrzy grupy leków (ang. multi-drug resistant,MDR) lub rozszerzoną wielooporność, czyli wrażliwośćna nie więcej niż dwie grupy leków (ang.extensively drug-resistant, XDR), a pojawiają się teżwśród nich już szczepy oporne na wszystkie dostępneobecnie leki (ang. pandrug-resistant, PDR).Znaczące ograniczenie lub całkowity brak opcji terapeutycznychwobec tak istotnych czynników zakażeństanowi z oczywistych względów wielkie zagrożeniedla zdrowia publicznego. Zaliczone one zostały dogrupy „patogenów alarmowych” i dlatego ważna jestich niezwłoczna identyfikacja.Medyczne laboratoria mikrobiologiczne są zobowiązanedo wykrywania mechanizmu MBL, KPC orazOXA-48. Schemat wykrywania karbapenemaz wszczepach Enterobacteriaceae przedstawia się,zgodnie z rekomendacjami KORLD, następująco:1. Oznaczenie wrażliwości na trzy karbapenemy:imipenem, meropenem, ertapenem.2. Obniżenie wrażliwości in vitro na którykolwiek zkarbapenemów jest sygnałem do wykonania testówpotwierdzających.3. Testy w kierunku wykrycia MBL i KPC (testy przeprowadzasię równocześnie).4. Oznaczenie wrażliwości na temocylinę w kierunkuwykrycia OXA-48 (zastosowanie w przypadkuszczepu o obniżonej wrażliwości nakarbapenemy i MBL-, KPC-).Na rynku polskim pojawiło się podłoże chromogennechromID CARBA firmy bioMérieux przeznaczone dowykrywania i wstępnej identyfikacji izolatów bakteryjnychEnterobacteriaceae charakteryzujących się niewrażliwościąna karbapenemy. Ocena wzrostupałeczek jelitowych dokonywana jest na podstawie

Ponadto, wykrywano geny KPC za pomocą PCR[Yigit 2001].3. Wykrywanie OXA-48. Podstawową metodą fenotypowąbyło oznaczenie wrażliwości na temocylinę.Ponadto, wykrywano geny OXA-48 zapomocą PCR [Poirel 2004].Wśród izolatów z kolekcji MIKROBANK, 45 byłoopornych na karbapenemy (tabela 2). Oporność tawynikała z produkcji MBL (n=7), KPC (n=11) lubinnych mechanizmów oporności (n=27).Wszystkie analizowane izolaty oraz szczepy wzorcoweprzechowywano w bulionie TSB z dodatkiem 10% glicerolu,w stanie głębokiego zamrożenia, w temperaturze-70°C. Szczepy ożywiano przesiewając je dwukrotnie napodłożu agarowym z krwią CAB, inkubując hodowlęprzez noc w temperaturze 37°C, w warunkach tlenowych.Posiew na chromogenne podłoże chromIDCARBA wykonano zgodnie z zaleceniami producenta.Inkubację prowadzono w czasie 18-24 godz. w warunkachtlenowych w temperaturze 35ºC ± 1ºC. Kontrolęwłaściwości odżywczych badanego podłoża chromogennegochromID CARBA przeprowadzono z użyciemszczepów wzorcowych: K. pneumoniae ATCCBAA-1705 (kontrola dodatnia, szczep KPC+),K. pneumoniae ATCC 700603 (kontrola ujemna,szczep wrażliwy na karbapenemy) i E. coli ATCC 25922(kontrola ujemna, szczep wrażliwy na karbapenemy).10WynikiPo 24 godz. na podłożu chromogennym chromIDCARBA uzyskano wzrost bakterii niewrażliwych nakarbapenemy w postaci kolonii o charakterystycznymzabarwieniu (omówione we Wstępie).Wyniki uzyskane dla szczepów wzorcowych przedstawionow tabeli 3 oraz rycinie 1. Referencyjnyszczep K. pnemoniae ATCC BAA-1705 (producentb-laktamazy KPC) użyty do kontroli badanego podłoża,wyrósł w postaci niebiesko-szarych kolonii.Szczepy kontrolne wrażliwe na karbapenemy nie wyrosłyna podłożu chromID CARBA.Wyniki uzyskane dla pozostałych szczepów z kolekcjiATCC przedstawiono w tabeli 3. Żaden z badanychszczepów nieTabela 3. Charakterystyka wzrostu szczepów wzorcowych z kolekcji ATCC na podłożuchromID CARBA agar.Szczep wzorcowy wrażliwy (S) / oporny (R) Wzrost na podłożuna karbapenemy chromID CARBAWzrost Kolor koloniiSzczepy użyte do kontroli podłożaK. pnemoniae ATCC BAA-1705 R 1 +++ niebiesko-szaryE. coli ATCC 25922 S - -K. pnemoniae ATCC 700603 S - -Pałeczki z rodziny EnterobacteriaceaeE. coli ATCC 35218 S - -S. typhimurium ATCC 14028 S - -P. mirabilis ATCC 7002 S - -Pałeczki niefermentująceP. aeruginosa ATCC 27853 S - -A. baumannii ATCC 19606 S - -Bakterie Gram-dodatnieS. aureus ATCC 29213 S - -S. aureus ATCC 25923 S - -S. aureus ATCC 43300 R 2 - -S. epidermidis ATCC 14990 S - -E. faecalis ATCC 51299 S - -E. faecalis ATCC 29212 S - -GrzybyC. albicans ATCC 14053 - - -+++ bardzo dobry wzrost- brak wzrostu1 szczep oporny na karbapenemy dzięki wytwarzaniu karbapenemazy KPC.2 MRSA – szczep S. aureus oporny na metycylinę.wyrósł na badanympodłożu.Wyniki uzyskane dlaszczepów z kolekcjiMIKROBANK przedstawionow tabeli 4oraz rycinie 1.Oporne na karbapenemyszczepy pałeczekGram-ujemnychz kolekcji MIKROBANK(n=42) wyrosły natestowanym podłożuchromogennym wpostaci kolonii o kolorze:niebiesko-szarymlub niebiesko-zielonym(K. pneumoniae,K. oxytoca, S. marcescens,E. cloacae),bordowym (E. coli)oraz brązowym(P. aeruginosa).Z 3. szczepów bakteriiGram-dodatnich zkolekcji MIKROBANKopornych na karbapenemy,tylko jeden,Enterococcus faeciumEFM-VR1(VanA), wyrósł na testowanympodłożuw postaci drobnych,turkusowych kolonii.Szczepy wrażliwe nakarbapenemy nie wyrosłyna podłożuchromID CARBA.

Rycina 1. Charakterystyka wzrostu szczepów z kolekcji MIKROBANK oraz szczepu wzorcowego K. pnemoniaeATCC BAA-1705 na podłożu chromIDTM CARBA agar.E. coli MBL+ E. coli KPC+K. pneumoniae KPC+ K. pneumoniae MBL+K. pnemoniae ATCC BAA-1705 (KPC+) K. oxytoca KPC+E. faecium EFM-VR1 (VanA) E. cloaceae oporny na karbapenemy (MBL-, KPC-)11S. marcescens MBL+ P. aeruginosa MBL+Mieszanina szczepów: E. coli (KPC+), E. faecalis (VanA), K. pneumoniae (KPC+)

Tabela 4. Charakterystyka wzrostu szczepów z kolekcji MIKROBANK na podłożuchromID CARBA agar.Szczep wzorcowy wrażliwy (S) / oporny (R) Wzrost na podłożuna karbapenemychromID CARBA12Wzrost Kolor koloniiPałeczki z rodziny EnterobacteriaceaeK. pnemoniae (7) R 1 +++ niebiesko-szaryK. pnemoniae (20) R 2 +++ niebiesko-szaryK. pnemoniae (2) R 3 +++ niebiesko-szaryK. pnemoniae (6) S - -K. oxytoca (1) R 1 +++ niebiesko-szaryK. oxytoca (1) R 3 +++ niebiesko-szaryK. oxytoca (1) S - -E. coli (3) R 1 +++ bordowyE. coli (1) R 2 +++ bordowyE. coli (1) S - -E. cloacae (1) R 3 +++ niebiesko-zielonyE. cloacae (3) R 2 +++ niebiesko-zielonyE. cloacae (3) S - -S. marcescens (2) R 3 +++ niebiesko-zielonyS. marcescens (1) S - -C. freundii (1) S - -Pałeczki niefermentująceP. aeruginosa (1) R 3 +++ brązowyBakterie Gram-dodatnieS. aureus (2) R 4 - -E. faecium (1) S - -E. faecium (1) R 5 +++ turkusowy+++ bardzo dobry wzrost- brak wzrostu1 szczep oporny na karbapenemy dzięki wytwarzaniu karbapenemazy KPC.2 szczep oporny na karbapenemy dzięki wytwarzaniu innych mechanizmów oporności (zmiany przepuszczalnościosłon komórkowych/aktywne wypompowywanie leku oraz produkcja innych b-laktamaz, np. AmpC, ESBL).3 szczep oporny na karbapenemy dzięki wytwarzaniu karbapenemazy MBL.4 MRSA – szczep S. aureus oporny na metycylinę.5 szczep oporny na ampicylinę i imipenem.Podsumowanie1. Na podłożu chromID TM CARBA wyrosły szczepypałeczek z rodziny Enterobacteriaceae orazP. aeruginosa oporne na karbapenemy z różnymimechanizmami oporności (produkcja karbapenemazMBL, KPC; zmiany w przepuszczalnościosłon komórkowych, aktywne wypompowywanieleku oraz produkcja na wysokim poziomie innychb-laktamaz, np. AmpC, ESBL).2. Oporne na karbapenemy szczepy rosły w postacipojedynczych, o charakterystycznym zabarwieniukolonii bakteryjnych, umożliwiającym wstępnąidentyfikację izolatu.3. Wrażliwe na karbapenemyszczepy pałeczek Gramujemnychnie rosły na podłożuchromID CARBA.4. Izolaty Staphylococcus sp.oraz Candida albicans nierosły na podłożu chromIDCARBA.5. Izolaty Enterococcus sp. wrażliwena karbapenemy nierosły na podłożu chromIDCARBA.6. E. faecium EFM-VR1 (VanA), szczep oporny na ampicylinęoraz imipenem, rósł na podłożu chromIDCARBA w postaci drobnych, turkusowych kolonii.WniosekSelektywne podłoże chromID CARBA może byćwykorzystywane przez laboratoria mikrobiologicznewe wstępnej diagnostyce mikrobiologicznej. Napodłożu chromID CARBA firmy bioMérieux rosnątylko oporne na karbapenemy szczepy w postacibarwnych (rozróżniających niektóre grupy bakterii)kolonii.

nowości w ofercieCampylobacter jest uważany w Europie za jedną z częstszychprzyczyn infekcji przewodu pokarmowego. Niestety w Polscejego wykrywalność pozostaje na bardzo niskim poziomie,a liczba wykonywanych w tym kierunku badań jest niewystarczająca.Kampylobakteriozę u ludzi wywołują głównie termotolerancyjnegatunki Campylobacter takie jak C. jejuni, C. coli, C. lari oraz C. fetus.Wprowadzane właśnie do oferty bioMeriéux nowe podłożeCASA (Campylobacter Selective Agar)to wybiórcze podłoże chromogenne do wykrywaniai oceny ilościowej Campylobacter. Umożliwia onobadanie w kierunku termotolerancyjnych gatunkówCampylobacter w żywności oraz materiałachklinicznych. Materiałem do badań od pacjentówjest płynny kał posiewany bezpośrednio lub pozawieszeniu w soli fizologicznej.Na podłożu CASA większość gatunkówCampylobacter rośnie w postaci czerwonychkolonii po 24 - 48 godzinnej inkubacji w temperaturze37±1° lub 42±1°C. Wzrost innychbakterii, drożdży i pleśni jest hamowany przezspecjalnie opracowany zestaw antybiotyków.CASANr kat. AEB520270 – 20 płytek o średnicy 90 mmCRYO-BEADSWychodząc naprzeciw potrzebom laboratoriów mikrobiologicznych, które muszą sprostaćkonieczności bankowania drobnoustrojów, bioMeriéux wprowadza do swojej oferty nowyprodukt - Cryo-beads, umożliwiający przechowywanie szczepów w stanie zamrożenia.System Cryo-beads stanowią probówki zawierające kulki służące do przechowywania szczepóww temperaturze zamrażarki od –20°C do –80°C. Metoda ta pozwala na zabezpieczeniewszystkich typów szczepów drobnoustrojów (szczepy wzorcowe, własne kolekcjeszczepów, szczepy wymagające dalszej diagnostyki…). Czas przechowywania jest zależnyod drobnoustroju np. dla E. coli i S. aureus są to 3 lata.Każdy zestaw zawiera 64 probówki z korkami w czterech różnych kolorach, ułatwiającymioznakowanie przechowywanych szczepów. Wstawione są one do pudełka kartonowego,które może być jednocześnie statywem wkładanym z probówkami do zamrażarki. W każdejprobówce znajduje się 25 kulek zatopionych w hypertonicznym roztworze konserwującym,do których mogą przylegać drobnoustroje.13Cryo-BeadsNr kat. AEB 400100 – 64 probówki po 25 kulek

EtestyEtest do wykrywania MBLmgr Barbara Stefankowska-FułekWarszawa14Wprowadzenie karbapenemów w latatach 80-tychXX wieku do praktyki klinicznej stało się wielkąszansą w leczeniu zakażeń spowodowanychprzez bakterie oporne na antybiotyki b-laktamowe.Cechy charakterystyczne karbapenemówtakie jak: bardzo szerokie spektrum działania(bakterie tlenowe i beztlenowe), szybkie działaniebakteriobójcze oraz wysoka oporność nadziałanie większości b-laktamaz stały się przyczynązbyt częstego stosowania tej grupy leków.Uznano je antybiotykami z wyboru w leczeniuzakażeń, których czynnikiem etiologicznym byłypałeczki gram ujemne oporne na penicyliny i cefalosporyny.Karbapenemy to grupa antybiotykówb-laktamowych, pochodnych tienamycyny,strukturą chemiczną przypominają penicyliny.W lecznictwie znajdują się obecnie cztery związkio budowie karbapenemów, starsze – imipenemi meropenem, nowsze – ertapenem i doripenem.Różnią się miedzy sobą aktywnością wobec różnychgrup drobnoustrojów, a także stabilnościąwobec ludzkiej dehydrogenazy nerkowej. Imipenemjest rozkładany przez ten enzym i musi byćstosowany z cilastatyną, inhibitorem dehydrogenazyw stosunku 1:1.Oporność na karbapenemyStosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działaniastało się jedną z przyczyn selekcjonowania opornościbakterii. Dotyczy to również karbapenemów,powszechne ich nadużywanie doprowadziło do selekcjiszczepów wykazujących różne mechanizmyoporności na tę grupę leków, szczególnie u bakteriiGram-ujemnych. Do najczęstszych mechanizmówoporności należą: zmiany struktury białek PBP, do których karbapenemywykazują powinowactwo; zaburzenia transportu polegające na utracie białekporynowych D2, przez które karbapenemy sątransportowane do komórki; aktywne wypompowywanie karbapenemów z komórki(efflux); synteza b-laktamaz chromosomalnych lub plazmidowych,enzymów hydrolizujących karbapenemy.Wymienione mechanizmy oporności mogą występowaćpojedynczo, jak również współistnieć wdanym szczepie, co daje ogromne możliwości powstawaniaszczepów opornych krzyżowo nie tylkona karbapenemy czy inne b-laktamy, ale również napozostałe, dostępne antybiotyki.W ostatnich latach szczególne zagrożenie dla terapiizakażeń stanowi wytwarzanie przez bakterie Gramujemneb-laktamaz rozkładających karbapenemy.Należą do nich karbapenemazy:klasy A, w tym KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase),produkowane przez Enterobacteriaceae,Pseudomonas spp., Acinetobacter spp.;klasy B – MBL (metallo-b-laktamase);Klasy D – CHDL (carbapenem-hydrolysing Class Db-laktamase).Klasy A i B produkowane są przez Enterobacteriaceae,Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., klasaD przez Enterobacteriaceae i Acinetobacter spp.Karbapenemazy klasy B - MBLDo wielu groźnych mechanizmów oporności, w tymdo MBL, zdążyliśmy się już przyzwyczaić. Ostatnioszczególny niepokój i zainteresowanie budząszczepy z KPC i OXA-48, które są nowym zagrożeniemklinicznym i epidemiologicznym. Należy jednakpamiętać, że mechanizm MBL jest nadal niemniej groźny, głównie ze względu na łatwość rozprzestrzenianiasię wśród drobnoustrojów należącychdo poważnych patogenów człowieka. Sprzyja temuobecność genów kodujących enzymy na plazmidachkoniugacyjnych, dlatego tak łatwo rozprzestrzeniająsię pomiędzy szczepami bakterii.MBL (metallo-b-laktamase)Większość b-laktamaz jest enzymami serynowymitzn. że w centrum aktywnym mają aminokwas – serynę.MBL posiadają specyficzną strukturę i mechanizmdziałania. Nazwa metalo-b-laktamazy pochodziod kofaktorów reakcji hydrolizy b-laktamów, którymisą jony cynku lub kadmu.Hydrolizują one prawie wszystkie antybiotyki b-laktamowe:penicyliny, cefalosporyny z cefamycynamiwłącznie oraz karbapenemy. Aktywność in vitro wykazujejedynie aztreonam, aczkolwiek jego skutecznośćkliniczna nie jest udokumentowana. (Prof. Gospodarek).W odróżnieniu od b-laktamaz serynowych metalo-b-laktamazynie są hamowane przez klasyczneinhibitory b-laktamaz takie, jak kwas klawulanowy, sulbaktamczy tazobaktam. Natomiast naturalnymi ich inhibitoramisą związki chelatujące metale, takie jak EDTAczy kwas 2-merkaptopropionowy.

Rodzaje oporności MBLMechanizm MBL kodowany jest na genach bla, któretworzą trzy grupy strukturalno-ewolucyjne B1, B2,B3. Geny oporności są zlokalizowane w chromosomachi/lub w elementach ruchomych jak plazmidy,transpozony i integrony. Geny MBL są zlokalizowanenajczęściej wewnątrz integronów, głównie klasy A,nierzadko z innymi genami oporności. Występujątakże często w obrębie aktywnych transpozonów, np.u Bacteroides spp. nośnikiem genu jest ruchomytranspozon Tn1296.Oporność na antybiotyki, w tym również związana zprodukcją metalo-b-laktamaz, może być wrodzonalub nabyta.Oporność chromosomalnaOporność związana z chromosomalnym DNA powstajew wyniku mutacji czyli spontanicznej zmianysekwencji DNA oraz transformacji obcogatunkowegoDNA. Chromosomalnie kodowane MBL to enzymynaturalne, swoiste dla określonego gatunku bakterii,produkowane przez większość pałeczek Gram ujemnych,w tym szczepów klinicznie istotnych, takich, jak:Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus,Bacteroides spp., najczęściej B. fragilis, Aeromonas spp.,Chryseobacterium spp.Oporność plazmidowaMetalo-b-laktamazy kodowane na plazmidach są toenzymy nabyte. Nabyte MBL należą do grupy B1, aze względu na różnorodność strukturalno-ewolucyjnądzielą się na 10 rodzin: IMP, VIM, SPM, GIM, SIM,KHM, AIM, DIM, IND, NDM. Enzymy te dominująwśród pałeczek niefermentujących: Pseudomonas spp,najczęściej P. aeruginosa i P. putida, Acinetobacter spp.Burkhoderia cepacia, A. xylosoxidans, B. diminuta.Pojawiają się też coraz częściej u pałeczek z rodzinyEnterobacteriaceae najczęściej u K. pneumoniae,S. marcescens, E. cloacae i inne [2, 3, 5, 6- pracaprof. Gniadkowskiego].EpidemiologiaGeny kodujące MBL znajdujące się na plazmidachkoniugacyjnych mogą być przekazywane horyzontalnie,jak i klonalnie. Z tego względu nabyte MBLcharakteryzują się niezwykłą łatwością rozprzestrzenianiasię pomiędzy szczepami bakterii, nie tylko wobrębie gatunku, ale także między gatunkami i rodzajami.Pierwszy szczep wytwarzający nabytą MBL wykryto wJaponii w 1988 r. i był to Pseudomonas aeruginosa[1]. Od tego czasu, a zwłaszcza od drugiej połowylat 1990 odnotowuje się pojawianie i rozprzestrzenianieszczepów MBL-dodatnich w wielu krajach [2,3, 4]. Najczęściej występują rodziny IMP i VIM. W1991r. opisano szczep Pseudomonas aeruginosaMBL+ IMP-1, który charakteryzował się ogromnympotencjałem rozprzestrzeniania się. W latach 1996-1997 badania epidemiologiczne wykazały szczepyIMP-1 u Seratia marcescens. Początkowo szczepyIMP-1 występowały tylko w Japonii, w szybkim czasierozprzestrzeniły się na Dalekim Wschodzie, dotyczyłoto również pałeczek Enterobacteriaceae, wlatach 1999-2000, na Tajwanie wyhodowano 17.szczepów Klebsiella pnieumoniae IMP-8. Pierwszyeuropejski szczep MBL+ wyizolowano po raz pierwszywe Włoszech w 1995r., był to IMP-2 u Acinetobacterbaumanii. Również w Europie po raz pierwszy opisanorodzinę VIM (od VIM-1 do VIM-3) u Pseudomonasaeruginosa i Acinetobacter spp. W 2001 roku wyhodowanoPseudomonas aeruginosa VIM-1 w dziewięciuszpitalach w Grecji. W latach 2001-2009rozprzestrzeniał się szczep Klebsiella pnieumoniaeVIM-1, który okazał się szczepem epidemicznym.We Francji w 2004 roku pojawił się podobny szczep,z tym, że jeszcze dodatkowo posiadał ESBL SHV-5.Generalnie MBL wśród Acinetobacter spp. występujerzadziej niż wśród Pseudomonas spp., zdarzałysię jednak przypadki epidemii w różnych krajacheuropejskich. Krajem, który ma największe problemyz MBL wśród Acinetobacter spp., jest KoreaPołudniowa.Kliniczne i diagnostyczne implikacje MBLProblem oporności związany z karbapenemazą klasyB jest ogromny na całym świecie. Wrodzony mechanizmMBL jest mniejszym zagrożeniem niż nabytyi stanowi jeden z najgroźniejszych mechanizmówoporności wśród pałeczek Gram ujemnych zarównoniefermentujących, jak i Enterobacteriaceae.Ogromne zróżnicowanie wariantów MBL nabytego i poziomówekspresji tego mechanizmu, od poziomuwysokiego do niskiego, skutkuje niezwykłą różnorodnościąoporności, w tym obniżoną wrażliwościąna karbapenemy, a także na penicyliny i cefalosporyny.Stwarza to ogromne niebezpieczeństwo dużychbłędów w rutynowych badaniach lekowrażliwościin vitro u producentów MBL - wyniki fałszywej wrażliwościna bazie kryteriów interpretacyjnych CLSI czyEUCAST.Błędy terapeutyczne – leczenie karbapenemamizakażeń spowodowanych przez szczepy o obniżonejwrażliwości, powodują nie tylko przedłużeniehospitalizacji i narastanie kosztów, ale ogromnywzrost odsetka śmiertelności wśród chorych, główniena oddziałach OIT.Należy również pamiętać, iż metalo-b-laktamazomtowarzyszą często inne mechanizmy oporności nab-laktamy, zwłaszcza u pałeczek niefermentujących(obniżenie przepuszczalności osłon molekularnych,wypompowywanie antybiotyku, inne b-laktamazy np.ESBL itp.). W kosekwencji zostają wykluczonewszystkie opcje terapeutyczne wśród antybiotykówb-laktamowych.Sprawę komplikuje jeszcze fakt, iż geny opornościMBL mogą znajdować się się na tych samych elementachruchomych co geny oporności na inne15

16grupy antybiotyków. Powoduje to oporność krzyżowąi do całości obrazu dołącza się wielooporność: naaminoglikozydy, fluorochinolony, tetracykliny i kotrimoksazol.Niefementujące – charakteryzują się wysoką różnorodnościąekspresji mechanizmu MBL, jednakwśród Pseudomonas spp. stopień oporności jestwyższy niż wśród Acinetobacter spp. Nawet jeśliszczep charakteryzuje się niskim poziomem karbapenemazMBL, to ze względu na obecność innychmechanizmów, staje się on wysoce oporny na karbapenemyi inne antybiotyki b-laktamowe, co więcejnabywa wielooporność.Enterobacteriaceae – często szczepy MBL+ wykazująwrażliwość in vitro na karbapenemy, natomiastoporność na ampicylinę, cefoksytynę, ceftazydym. WPolsce szczepy MBL+ charakteryzują się wyraźną opornościąna karbapenemy, a zatem powstaje pytanie codo metodyki wykrywania MBL. Czy potrafimy wykryćmetodami rutynowymi mechanizm MBL u szczepówo niskim poziomie oporności lub wrażliwych na karbapenemy.„Wierzchołek góry lodowej” [Gniadkowski].Tak złożony obraz wielooporności stawia olbrzymie wyzwaniakliniczne, diagnostyczne i epidemiologiczne.Pojawiające się nowe mechanizmy oporności oraz koniecznośćindywidualnego podejścia do terapii antybiotykoweju pacjenta uwydatniają potrzebę ścisłejwspółpracy lekarzy, mikrobiologów i epidemiologów.Celem jest nie tylko efektywna, celowana antybiotykoterapia,ale również skuteczne interwencje zespołówds. kontroli zakażeń, zapobiegające rozprzestrzenianiusię szczepów wieloopornych.W tym układzie rysuje się ogromna rola laboratoriummikrobiologicznego, aby uzyskać i dostarczyć wiarygodnewyniki badań, wykrywających i potwierdzającychtrudne mechanizmy oporności. Okazuje się, że jednametoda fenotypowa nie wystarcza, używane metodymuszą być zróżnicowane dla poszczególnych gatunkówdrobnoustrojów i mechanizmów oporności.Wskazania do wykonania testu na obecność MBL1. Szczepy Pseudomonas aeruginosa oporne lub oobniżonej wrażliwości na karbapenemy i wysoceoporne na tikarcylinę, samą lub z kwasem klawulanowym.2. Szczepy Acinetobacter spp. i inne Pseudomonas spp.o obniżonej wrażliwości na karbapenemy3. Szczepy Enterobacteriaceae, niezależnie odwzoru oporności, zwłaszcza w krajach, w którychstwierdza się MBL w tej grupie.4. Wszystkie przypadki niepowodzeń terapeutycznychpo zastosowaniu karbapenemów.5. Szczepy Izolowane od pacjentów z OIT oraz odinnych grup wysokiego ryzyka.Diagnostyka MBLZróżnicowanie metod wykrywających MBL u pałeczekGram ujemnych jest szczególnie istotne zewzględu na wzajemne nakładanie się i maskowanieposzczególnych mechanizmów oporności, a co zatym idzie pewne ograniczenia rutynowych metod.Testy do wykrywania cefalosporynaz MBLI. Metoda referencyjna – spektrofotometryczneoznaczenie hydrolizy imipenemu w ekstrakciebiałkowym z badanego szczepu, z EDTA lub bez.II. Metody genotypowe – wykrywające geny MBL1. PCR,2. Testy komercyjne, wykrywające geny bla IMPi bla VIP.III. Testy skreeningowe – profil wartości MIC1. Niefermentujące – niewrażliwość na karbapenemyi oporność na tikarcylinę z kwasemklawulanowym lub ceftazydym, zgodnie z kryteriamiEUCAST.MIC mg/L EUCAST 2012Ps. aeruginosa Acinetobacter spp.S # R. S # R.Doripenem 1 4 1 4Imipenem 4 8 2 8Meropenem 2 8 2 8Tikarcylina z kwasem 16 16 IE IEklawulanowymCeftazydym 8 6 - -2. Enterobacteriacea – obniżona wrażliwość nakarbapenemy, zgodnie z kryteriami EUCASTMIC mg/L EUCAST 2012S # R.Doripenem 1 4Ertapenem 0,5 1Imipenem 2 8Meropenem 2 8Należy pamiętać, że podobnie jak w przypadku wykrywaniainnych b-laktamaz (ESBL, AmpC) testyskreeningowe mogą dawać wyniki fałszywie ujemnena podstawie wartości granicznych EUCASTI i nie wykrywaćmechanizmu MBL, co prowadzi do niepowodzeńterapeutycznych.IV. Metody fenotypowe – polegają na wykrywaniusynergizmu działania antybiotyku i inhibitora MBL1. Dyfuzyjno-krążkowea. Test zbliżeniowy z zastosowaniem inhibitorówMBL – EDTA lub 2-MPA (kwas 2-merkaptopropionowy).Krążek z inhibitoremkładzie się w odległości 2 cm od środkówkrążków z imipenemem 10µg i ceftazydymem30µg. Wyraźne powiększenie strefwokół krążków z antybiotykami od stronykrążka z inhibitorem świadczy o produkcjiMBL.b. Test kombinowany wg EUCAST – mierzysię strefy zahamowania wzrostu wokół

krążka z samym imipenemem i krążka zimipenemem, na który nakropiono odpowiedniąilość EDTA. Wynik dodatni – strefajest o 5 mm wokół krążka z EDTA.Należy pamiętać, że podobnie jak w przypadkuwykrywania innych b-laktamaz (ESBL, AmpC)metody d-k mają ograniczoną czułość i mogądawać wyniki wątpliwe lub fałszywie ujemne –niskie inokulum może nie wykryć MBL na niskimpoziomie.2. Zmodyfikowany test Hodge’a (MHT) wgEUCAST – na płytce wykonuje się posiewszczepu wzorcowego E. coli ATCC 25922, następniew środku płytki nakłada się krążek zimipenemem, dalej posiew promienistyszczepu badanego od krążka do brzegówpłytki. Wynik dodatni – charakterystyczny „liśćkoniczyny” – podrastanie szczepu wzorcowegodo krążka z antybiotykiem do wzdłużlinii posiewu szczepu badanego.3. Etest ® MBLEtest ® do wykrywania MBLOd wielu lat technika Etest ® jest sprawdzoną i uznanąmetodą do wykrywania lub potwierdzania trudnychmechanizmów oporności u pałeczek Gram ujemnych.Etest ® MBL – Imipenem/Imipenem + EDTA(IP/IPI) jest uznany na świecie jak bardzo czuła metodadetekcji metalo-b-kaktamaz MBL.We wszystkich przypadkach zasada metody Etest ®jest oparta na kryterium CLSI – redukcja wartościMIC antybiotyku b-laktamowego (cefalosporyny, karbapenemu)o co najmniej 3 logarytmiczne rozcieńczeniaw obecności specyficznego inhibitora.Zasada metody Etest ® do wykrywania MBL jest identycznajak ESBL i AmpC : Redukcja wartości MIC imipenemu w obecnościinhibitora, którym w tym przypadku jest EDTA. Po jednej stronie paska jest gradient stężeń - 7rozcieńczeń imipenemu, po drugiej stronie paska– 7 rozcieńczeń imipenemu z EDTA (IP/IPI). Słały poziom EDTA optymalizuje wykrycie MBL.Konfiguracja metody Etest ® MBLImipenem + EDTA (IPI)Imipenem (IP)Stężenie IP 4 – 256 mg/LStężenie IPI 1 – 64 mg/L plus stałe stężenie EDTAInterpretacja badania Etest ® do wykrywania MBL jestidentyczna, jak ESBL i AmpC : IP/IPI 8 Deformacja elipsy lub strefa fantomowaJMBL+Przykład :IP = 16, IPI # 1IP/IPI $ 16 S MBL +Ważne!Wartość MIC imipenemu z paska Etest ® MBL niejest równoznaczna z wartością MIC imipenemuze standardowego paska Etest ® IP. Nie może byćtraktowana jako rzeczywista wartość MIC, będącapodstawą interpretacji wrażliwości i dawkowanialeku.Strefa fantomowa S MBL +Interpretacja klinicznaSzczepy MBL+ powinno się kwalifikować, bez względuna antybiogram, jako jedne z potencjalnie najgroźniejszychpatogenów bakteryjnych.Zgodnie z wytycznymi CLSI wykrycie oporności MBLwykluczało stosowanie penicylin, cefalosporyn i karbapenemów,bez względu na wynik wrażliwości. Jedynąopcją terapeutyczną pozostawała kolistyna.Coraz więcej jednak danych wskazuje, że skutecznośćkliniczna w dużym stopniu zależna jest od MICi podanej dawki, mimo produkcji enzymu. Stąd wnowych wytycznych EUCAST dokonano zmian dopuszczającstosowanie dotychczas wykluczonychprzez CLSI antybiotyków w przypadku uzyskaniawrażliwości na te antybiotyki.W Polsce zalecenia EUCAST nakazują raportować rezultatyoznaczenia lekowrażliwości szczepu, zgodniez uzyskanymi wynikami. Wykrywanie b-laktamazm.in. MBL wykonuje się wyłącznie do celów epidemiologicznychi kontroli zakażeń.W ostatnim czasie oba komitety na tyle zaostrzyłykryteria oceny wrażliwości pałeczek Gram ujemnychna karbapenemy, że większość szczepów MBL+ powinnosię automatycznie klasyfikować jako szczepyniewrażliwe na te antybiotyki.Ocena metody Etest ® MBL w piśmiennictwieJedną z wielu prac naukowych oceniających metodęEtest ® MBL jest publikacja z 2002 roku „Evaluationof a New Etest ® for Detecting Metallo-b-Lactamasesin Routine Clinical Testing” – Timothy R. Walsh, Anne17

Bolmstrom, Anette Qwarnstrom, and Ana Gales. Wpracy tej przebadano 130 szczepów bakterii Gramujemnych, tlenowych i beztlenowych, z których 83szczepy były producentami MBL. Oceniono zdolnośćwykrywania MBL techniką Etest ® IP/IPI na różnychpodłożach do badania lekowrażliwości i porównanoz metodami referencyjnymi: biochemicznymi (hydrolizaimipenemu w ekstrakcie białkowym w obecnościEDTA) i genetycznymi (PCR przy użyciuswoistych primerów dla IMP-1, L1, CcrA i bla B/C). Dlawiększości szczepów wartości MIC imipenemu były$ 4 mg/L, z wyjątkiem Aeromonas spp., dla którychMIC był # 2mg/L.Wyniki przedstawiono w tabeli 1.stron paska, a interpretacja może stać się niemiarodajna.Wychodząc na przeciw problemom diagnostycznym,firma wprowadza na rynek nowy produktdo wykrywania MBL wśród Enterobacteriacea, pasekEtest ® MP/MPI (pasek z gradientem meropenemui meropenemu z inhibitorem EDTA.Konfiguracja metody Etest ® MBLMeropenem + EDTA (MPI)Meropenem (MP)Stężenie MP 0,125 – 8 mg/LStężenie MPI 0,032 – 2 mg/L plus stałe stężenie EDTATABELA 1. Korelacja metody Etest® MBL z metodami referencyjnymi.Drobnoustrój (n) Liczba wyników Typ b-laktamazy Swoistość % b Czułość % cMBL (-)MBL (+) aAcinetobacter spp. (9) 6 3 IMP-1 100 100Chryseomonas spp. (28) 8 20 BlaB/IND-1 86 85E. coli (1) 1 0 TEM 100 NR dK. pneumoniae (4) 4 0 TEM ESBL 100 NRP. aeruginosa (14) 13 1 IMP-1 100 100P. mirabilis (3) 3 0 MIR-1 100 NRSeratia spp. (10) 2 8 IMP-1 100 100S. maltophilia (43) 2 41 L1 95 95S. spiritivorum (3) 3 0 NR e 100 100B. fragilis grupa (15) 5 100 CcrA 100 100Wszystkie (130) 47 83 95 94a Dodatni w metodach referencyjnychb Liczba szczepów MBL (-), które zostały prawidłowo oznaczone metodą Etest® MBLc Liczba szczepów MBL (+), które zostały prawidłowo oznaczone metodą Etest® MBLd NR, nor relevant (fenotyp b-laktamaz, inny niż MBL)e ND, nie oznaczone18Wnioski z publikacji1. Etest ® MBL, IP + EDTA (IP/IPI) jest najlepsząkombinacją dla detekcji mechanizmu opornościMBL dla bakterii Gram ujemnych, tlenowych i beztlenowych.2. Największą czułość dla wykrywania MBL ma agarMueller-Hinton, nie należy używać agaru Isosensitestze względu na zbyt niski poziom jonów Zn.3. Etest ® MBL jest metodą dokładną i powtarzalną,akceptowalną techniką wykrywania fenotypu MBL.Etest ® MBL z meropenemem (MP/MPI)Metoda Etest ® MBLz imipenemem musi być stosowanabardzo ostrożnie dla pałeczek z rodziny Enterobacteriacea,gdyż wykazują one często niskipoziom oporności ,a nawet wrażliwość na imipenem.Stąd elipsy zahamowania wzrostu są długie,poza zakresem wartości na pasku, zlewają się z obuPrzykład :MP . 8, MPI = 0,0321MP/MPI $ 250 S MBL +Ważne!Wartość MIC meropenemu z paska Etest ® MBLnie jest równoznaczna z wartością MIC meropenemuze standardowego paska Etest ® MP. Niemoże być traktowana jako rzeczywista wartośćMIC , będąca podstawą interpretacji wrażliwościi dawkowania leku.

Strefa fantomowa S MBL +Deformacja elipsy S MBL +z punktu widzenia diagnostyki, antybiotykoterapii,epidemiologii i farmakoekonomiki. W laboratoriachmikrobiologicznych ważne jest zastosowanie wiarygodnychmetod identyfikacji i badania lekooporności,w tym detekcji mechanizmu MBL, zwłaszcza na niskimpoziomie i w nosicielstwie. Niezwykle istotnejest natychmiastowe podjęcie działań interwencyjnych,wdrożenie procedur zakażeń szpitalnych, abyograniczyć rozprzestrzenianie się szczepów MBL+.Niewątpliwie należy ograniczyć stosowanie małoskutecznych w takim przypadku karbapenemów i innychantybiotyków b-laktamowych. Przedłużające sięniepowodzenia terapeutyczne są czasochłonne i znaczniepodnoszą koszty hospitalizacji pacjenta, szczególniew przypadku ciężkich zakażeń. Alternatywneopcje terapeutyczne, leczenie skojarzone oraz zmianaTABELA 2. Wartości referencyjne szczepów kontrolnych dla metody Etest ® MBL.Szczep kontrolnyMIC (mg/L)Imipenem Imipenem +EDTA Meropenem Meropenem +EDTA(IP) (IPI) (MP) (MPI)P. aeruginosaATCC ® 27853 MBL (-) # 4 1 – 4 - -S. maltophiliaATCC ® 13636 MBL (+) 64 – 256 1 – 4 - -K. pneumoniaeATCC ® 700603 MBL (-) - - , 0,125 , 0,032 – 0,064K. pneumoniaeATCC ® BAA-2146 MBL (+) - - $ 8 0,064 – 0,5PodsumowanieWykrywanie obecności mechanizmów oporności, wtym również MBL jest niezwykle istotne dla szpitalasposobów dawkowania, na podstawie wartości MICi parametrów PK/PD antybiotyków wydają się byćpewną nadzieją na przełamanie narastającej opornościdrobnoustrojów.19

mikrobiologiaNowe karty antybiogramowe VITEK 2i VITEK 2 Compact do oznaczanialekowrażliwości pałeczek Gram-ujemnychdr Dorota Żabicka 1 , dr Elżbieta Stefaniuk 1,21 Narodowy Instytut Leków, Warszawa2 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa20Zespół ekspertów powołany przez firmę bioMérieuxw ramach Forum VITEK 2w składzie:– dr Krzysztof Burdynowski z WojewódzkiegoCentrum Medycznego w Opolu,– dr Krzysztof Golec ze Szpitala Wojewódzkiego nr 2w Rzeszowie,– dr Robert Kuthan z Warszawskiego UniwersytetuMedycznego,– mgr Ewa Młodzińska z Centralnego OśrodkaBadań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznejw Warszawie,– mgr Anna Mól ze Szpitala Klinicznego im. PrzemienieniaPańskiego w Poznaniu,– dr Dorota Olszańska z Samodzielnego PublicznegoSzpitala Klinicznego Akademii Medycznejw Białymstoku,– mgr Małgorzata Skałkowska z WojewódzkiegoSzpitala Specjalistycznego im. L. Rydygiera w Krakowie,– dr Elżbieta Stefaniuk z Narodowego InstytutuLeków w Warszawie i Centralnego Ośrodka BadańJakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej w Warszawie,– mgr Małgorzata Szarata ze Szpitala Wojewódzkiw Poznaniuwe współpracy z Krajowym Ośrodkiem Referencyjnymds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowym InstytutemLeków, reprezentowanym przez dr DorotęŻabicką opracował skład antybiotyków do oznaczanialekowrażliwości pałeczek Gram-ujemnych w nowychkartach do systemów VITEK 2 i VITEK 2 Compact.Zaproponowane karty uzyskały aprobatę KonsultantaKrajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiejprof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz.Zakresy stężeń antybiotyków w kartach są zgodne zobowiązującymi rekomendacjami EUCAST. Karty zostałyprzygotowane specjalnie na rynek polski i sądostępne w ofercie firmy bioMérieux od czerwca2012 roku: Karta AST-N258 - do oznaczania lekowrażliwościGram-ujemnych pałeczek fermentujących wyhodowanychz moczu Karta AST-N259 - do oznaczania lekowrażliwościGram-ujemnych pałeczek fermentujących wyhodowanychz materiałów innych niż mocz Karta AST-N260 - do oznaczania lekowrażliwościGram-ujemnych pałeczek niefermentujących wyhodowanychze wszystkich materiałów.Ideą zmian było zaproponowanie takiego składu antybiotykóww poszczególnych kartach, odpowiadającegoaktualnym rekomendacjom terapeutycznymi diagnostycznym w Polsce, który umożliwi zastosowanietych samych kart do oznaczania lekowrażliwościdrobnoustrojów izolowanych zarówno odpacjentów hospitalizowanych jak i ambulatoryjnychw różnych grupach wiekowych. Wprowadzenie jednakowychkart antybiogramowych do diagnostyki mikrobiologicznejdla obu grup pacjentów (szpitalnychi pozaszpitalnych) będzie korzystne ze względów organizacyjnychi ekonomicznych, pozwoli także nauproszczenie procedur wewnętrznej kontroli jakościw laboratoriach mikrobiologicznych.Omówienie poszczególnychnowo wprowadzanych kartKarta AST-N258 do oznaczania lekowrażliwościGram-ujemnych pałeczek fermentującychwyhodowanych z moczuW zestawie antybiotyków w tej karcie znalazły się lekistosowane w zakażeniach dróg moczowych u pacjentówambulatoryjnych, takie jak: ampicylina, amoksycylina-kwasklawulanowy, cefaleksyna, nitrofurantoina,norfloksacyna, ciprofloksacyna i trimetoprim-sulfametoksazol.Obok leków typowo stosowanych w lecznictwiezamkniętym, takich jak amikacyna, gentamycyna,piperacylina-tazobaktam, ceftazydym, imipenem dodanodrugi lek z grupy cefalosporyn III generacji – cefotaksymoraz ertapenem, jako najczulszy wskaźnikpojawiającej się oporności na karbapenemy.Karta AST-N259 – do oznaczanialekowrażliwości Gram-ujemnych pałeczekfermentujących wyhodowanych z materiałówinnych niż moczKarta ta zawiera zestaw leków stosowanych główniew lecznictwie zamkniętym. Spektrum lekówprzeciwdrobnoustrojowych (włącznie z kolistyną itigecykliną) pozwala na ustalenie właściwej terapii

w przypadkuwystępowaniaważnych z punktuwidzenia epidemiologicznegomechanizmówopornościna antybiotyki b-laktamowe,takich jak ESBL, MBL i KPC,W składzie leków nie uwzględnionoampicyliny, gdyż w świetle aktualnychrekomendacji terapeutycznychma ona ograniczone stosowanie w lecznictwiezamkniętym w leczeniu zakażeń wywoływanychprzez pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae(patrz: komentarz poniżej).Karta AST-N260 – do oznaczania lekowrażliwościGram-ujemnych pałeczek niefermentującychwyhodowanych ze wszystkich materiałówKarta zawiera zestaw antybiotyków, które mogą byćstosowane zarówno w zakażeniach dróg moczowychjak i w zakażeniach innych układów, w tym w zakażeniachinwazyjnych. Uwzględniono w niej wszystkieaktywne wobec pałeczek niefermentującychantybiotyki b-laktamowe, wszystkie stosowane leki zgrupy aminoglikozydów, a także leki nowowprowadzanedo terapii takie jak kolistyna i lewofloksacyna.Komentarz dotyczący aminopenicylindla pałeczek Gram-ujemnych fermentującychW karcie do sytemu Vitek 2 AST-N258do oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojówizolowanych z posiewów moczu zostałauwzględniona ampicylina w zakresiestężeń 2-32 mg/L.Zgodnie z rekomendacjami EUCAST i „StanowiskiemZespołu ds. oznaczania lekowrażliwości zgodnie z zaleceniamiEUCAST w sprawie wartości granicznychaminopenicylin i aminopenicylin z inhibitorami b-laktamazdla pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, 10kwietnia 2012 roku” izolaty z moczu bakterii należącychdo gatunków Eschericha coli i Proteus mirabilissą klasyfikowane jako: wrażliwe na ampicylinę i amoksycylinę, jeśli MICampicyliny ≤8 mg/L; oporne na ampicylinę i amoksycylinę, jeśli MICampicyliny >8 mg/L.Ampicylina nie została natomiast włączona do zestawuantybiotyków w karcie do sytemu Vitek 2AST-N259 dla bakterii Gram-ujemnych fermentującychizolowanych z materiałów innych niż mocz.Brak ampicyliny w tej karcie wynika z faktu, że stosowanieaminopenicylin w leczeniu zakażeń wywoływanychprzez bakterie z rodziny Enterobacteriaceaejest bardzo ograniczone i ma zastosowanie jedyniedo leczeniazakażeń drógmoczowych u wybranychgrup pacjentów (źródło: „Kucers’ The Use of Antibiotics,6th Edition”, 2010).Brak rekomendacji do stosowania aminopenicylin wzakażeniach innych niż zakażenia dróg moczowych,a zwłaszcza w zakażeniach inwazyjnych wywoływanychprzez pałeczki Enterobacteriaceae, wynika międzyinnymi z wysokiego odsetka szczepów E.coliniewrażliwych na aminopenicyliny. Dane sieci EARS-Net w Polsce z roku 2010 wskazują, że 60% izolatówE.coli z posiewów krwi charakteryzuje sięopornością na aminopenicyliny, z wartościami MICampicyliny ≥32 mg/L (dane własne). Należy równieżpamiętać, że zakażenia u pacjentów hospitalizowanychczęściej są wywoływane przez pałeczkiz rodziny Enterobacteriaceae należące do gatunkówwykazujących naturalną oporność na aminopenicylinytakich jak: Klebsiella sp., Citrobacter sp.,Enterobacter sp., Hafnia alvei, Morganella morganii,Proteus vulgaris, Proteus penneri, Providencia sp.,Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica. Dla izolatówz tych gatunków nie należy oznaczać wrażliwościna ampicylinę/amoksycylinę, a jeśli oznaczanolekowrażliwość, to w raporcie z badania mikrobiologicznegodla ampicyliny/amoksycyliny należy podaćwynik „oporny”.Obecnie, zgodnie z rekomendacjami EUCAST i „StanowiskiemZespołu ds. oznaczania lekowrażliwościzgodnie z zaleceniami EUCAST w sprawie wartościgranicznych aminopenicylin i aminopenicylin z inhibitoramib-laktamaz dla pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae,10 kwietnia 2012 roku” izolatywszystkich gatunków pałeczek z rodziny Enterobacteriaceaehodowane z zakażeń innych niż zakażeniadróg moczowych są uznawane za: wrażliwe na ampicylinę i amoksycylinę, jeśli MICampicyliny ≤0,5 mg/L; średniowrażliwe na ampicylinę i amoksycylinę,jeśli MIC ampicyliny >0,5 mg/L i ≤8 mg/L;21

Ryc. 1. Dystrybucja wartości MIC ampicyliny dlaEscherichia coli (źródło www.eucast.org). oporne na ampicylinę i amoksycylinę, jeśli MICampicyliny >8 mg/L.Ryc. 2. Dystrybucja wartości MIC amoksycyliny dlaEscherichia coli (źródło www.eucast.org).Analiza rozkładu wartości MIC ampicyliny dla szczepówdzikich, bez mechanizmów oporności wskazuje,że ogromna większość izolatów E. coli (84%szczepów w bazie EUCAST strona internetowawww.eucast.org) charakteryzuje się wartościami MICw zakresie 2-4 mg/L, natomiast epidemiologicznawartość graniczna ECOFF=8 mg/L. Wartość MIC≤0,5 mg/L jest stwierdzane dla 0,4% izolatów, awartość MIC ≤1,0 mg/L jedynie dla 7,5% izolatów(Ryc. 1). Podobnie wygląda rozkład wartości MICdla E. coli i amoksycyliny (Ryc. 2).W uzasadnionych, wyjątkowych przypadkach, gdyważne jest oznaczenie MIC ampicyliny dla izolatuE.coli lub P. mirabilis z materiałów innych niż posiewmoczu możliwe jest oznaczenie wartości MIC badanegoszczepu metodą dyfuzji z paska z gradientemantybiotyku lub zastosowanie karty przeznaczonejdla izolatów z posiewów moczu z zakresem stężeńampicyliny 2-32 mg/L. Potrzeba oznaczenia MICampicyliny dla izolatów z rodziny Enterobacteriaceaebyła zgłaszana zwłaszcza przez laboratoria wykonująceposiewy krwi od noworodków. Należy jednakżepamiętać, że w przypadku podejrzenia sepsy u noworodkówstosuje się leczenie skojarzone ampicylinąlub cefalosporyną III generacji (cefotaksym) z aminoglikozydem,gentamycyną lub amikacyną, gdzie ampicylinajest stosowana ze względu na aktywność wobecStreptococcus sp. grupy B, Listeria monocytogenes,E. faecalis i P. mirabilis, natomiast aminoglikozydjest stosowany w celu objęcia terapią również pałeczekE. coli, Klebsiella sp. i P. aeruginosa (źródło:„Kucers’ The Use of Antibiotics, 6th Edition”,2010).22

(nr kat. 30308) Wynik jakościowy: dodatni lub ujemny,bez tzw. „szarej strefy” Kalibracja wykonywana co 28 dni W zestawie 60 testów wraz z kalibratoremi kontrolami Czas badania: 40 minut

iologia molekularnaEkspert w diagnostyce wirusologicznejMolekularna diagnostykawirusowych infekcjidróg oddechowychmgr Adam NowickiOstre infekcje oddechowe odpowiedzialne za liczne przypadki hospitalizacjisą powodowane głównie przez patogeny wirusowe. Najpoważniejszei potencjalnie zagrażające życiu choroby układu oddechowego występujągłównie u małych dzieci, ludzi starszych, osób z immunosupresją orazw stanach osłabienia odporności (np. choroby przewlekłe, nowotwory,pacjenci intensywnej opieki medycznej). Postawienie szybkiej i pewnejdiagnozy jest kluczowe dla prawidłowego leczenia i zapobiegania rozprzestrzenianiusię choroby. Ze względu na podobne symptomy chorobowe, potrzebnesą odpowiednie testy do prawidłowego diagnozowania czynników infekcyjnych.Linia testów ARGENE MWS r-gene ® (Multi Well System) oferuje kompletne,certyfikowane CE-IVD zestawy do detekcji patogenów DNA i RNA,oparte na technologii Real Time PCR.24W skład MWS r-gene ® wchodzą następujące testy: Influenza A/B r-gene ® RSV/hMPV r-gene ® Rhino & EV/Cc r-gene ® AdV/ hBoV r-gene ® Chla/Myco pneumo r-gene ® Legionella/Cc r-gene ®Każdy z testów zawiera zestaw starterów skierowanych przeciwko dwómpatogenom. Ponadto dzięki uproszczonej procedurze wykonania możliwejest wykrycie 11. patogenów oddechowych z jednej pobranej od pacjentapróbki w ciągu 1,5 h po izolacji kwasów nukleinowych.

Wirusowe infekcje dróg oddechowych charakteryzują się znaczną sezonowościąJesień Zima Wiosna latoRhinovirusAdVM. pneumoInf AInf BhMPVRSV A&BPIV 1&2PIV 3Chcąc efektywnie diagnozować pacjentów z infekcjami dróg oddechowych, niemożemy zapominać o sezonowości występowania patogenów oddechowych.Planując badanie, powinniśmy brać pod uwagę prawdopodobieństwo wykryciawirusa w poszczególnych porach roku, a test którym się posługujemy, musidawać możliwość dostosowania się do tych zamian. Nasza oferta pozwala dobraćodpowiednie zestawy testów do aktualnych Państwa potrzeb: możliwe jest zarównowykonanie testu na obecność pojedynczego wirusa, jak też kilku wirusówjednocześnie. Niezależnie od konfiguracji badanie wykonywane jest w 1,5 h odwyizolowania materiału genetycznego!Testy ARGENE MWS r-gene ® dostępne są w postacigotowych do użycia zestawów, niewymagającychzakupu dodatkowych odczynników. Zostały onezwalidowane z większością dostępnychna rynku aparatów Real Time PCR,a ich procedury pozwalają na automatyzacjęprocesu izolacji DNA/RNA(EasyMAG i inne aparaty).25Zachęcamy do zapoznania się z pełnymkatalogiem testów ARGENEpod adresem:http://www.argene.com/e_catalogue

XXVII ZjazdPolskiego Towarzystwa Mikrobiologów„Drobnoustroje bez granic”Sesja satelitarna firmy bioMérieux PolskaPostęp technologiczny a potrzeby pacjentaPrzewodniczące sesji:prof. dr hab. n. med. Waleria Hryniewiczdr n. med. Elżbieta Stefaniuk11.30 – 12.00 dr Anna Baraniak, WarszawaNowe wyzwanie mikrobiologii – karbapenemazy2612.00 – 12.30 dr n. med. Elżbieta Stefaniuk, WarszawaZastosowanie technologii MALDI-TOFF w diagnostycemikrobiologicznej12.30 – 13.00 dr n. med. Jacek Kalisz, ŁódźWpływ nowej technologii na zmianę procedur w laboratoriummikrobiologicznym13.00 – 13.30 dr hab. n. med. Marek Szczepański, BiałystokZastosowanie metody genotypowania w dochodzeniachepidemiologicznych7 września 2012Aula C Collegium AnatomicumLublin, ul Jaczewskiego 4godz.11.30 do 13.30

www.biomerieux.plmgr Marta Warowny,bioMérieux Polska Sp. z o.o.Na stronie internetowej www.biomerieux.pl znajdąPaństwo kilka nowych informacji.W zakładce „Nasze produkty” pojawiły się informacjena temat nowych produktów dostępnych w ofercie:linii produktów Argene, podłożach: dwudzielnymagar ESBL, agar RPMI, agar Brucella oraz teścieVIDAS HCV.W centrum uwagi na stronie głównej znajdują się informacjedotyczące jubileuszu dwudziestolecia firmybioMérieux Polska. Specjalnie z tej okazji przygotowanezostało jubileuszowe wydanie Aktualności bioMérieux,które opisuje działania firmy bioMérieux na rynku polskimna przestrzeni ostatnich 20 lat. Aktualności dostępnesą w formie pliku PDF.W zakładce „Szkolenia” umieszczony został harmonogramszkoleń organizowanych przez naszą firmęna rok 2012. Są one prowadzone przez najlepszychspecjalistów w danej dziedzinie. Niejednokrotnie programszkolenia uwzględnia część praktyczną, podczasktórej uczestnicy mogą samodzielnie wykonać oznaczenia.Każdy uczestnik szkolenia otrzymuje materiałyoraz certyfikat świadczący o jego ukończeniu.Szkolenia przeznaczone dla diagnostów laboratoryjnychzgłaszane są do Krajowej Izby DiagnostówLaboratoryjnych w celu przyznania punktów edukacyjnych.Szkolenia odbywają się w siedzibie firmyw Warszawie mieszczącej się przy ul. Żeromskiego17 w godz.10.00 – 16.00.Ośrodkiem Referencyjnym ds. LekowrażliwościDrobnoustrojów, Narodowym Instytutem Leków, reprezentowanymprzez Panią dr Dorotę Żabicką.Zapraszamy wszystkich Państwa do odwiedzenia naszejstrony internetowej www.biomerieux.pl.Od początku roku 2012 w zakładce „ObsługaKlienta” dostępne są książeczki edukacyjne w wersjielektronicznej. Można je pobrać w formie pliku PDF,a następnie zapisać na własnym dysku. Książeczkiedukacyjne przeznaczone są dla lekarzy, diagnostówlaboratoryjnych, pielęgniarek oraz pacjentów. Dostarczająone praktycznych informacji z zakresu diagnostykiw wybranych dziedzinach medycyny.27W zakładce „Z ostatniej chwili” umieszczone zostałyinformacje na temat zmiany kart antybiogramowychdo systemów VITEK 2 i VITEK 2 compact. Nowekarty zostały specjalnie przygotowane pod kątem potrzebpolskiego rynku oraz wytycznych KrajowegoOśrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów.Ponadto nowe karty uzyskały aprobatęKonsultanta Krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiejPanią prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz.Skład kart został ustalony przez zespół ekspertów powołanyprzez firmę bioMérieux Polska w ramachForum VITEK 2 oraz we współpracy z Krajowym

KOMPLEKSOWA OFERTA SZYBKIEJ IDENTYFIKACJIORAZ OZNACZENIA LEKOWRAŻLIWOŚCIDROBNOUSTROJÓWSzybka identyfikacjadrobnoustrojówmetodą spektrometriimasowej MALDI-TOFOprogramowaniepośredniczące MYLABezpośredni podglądwyników i funkcjonalnośćzarządzania informacjąIdentyfikacja i oznaczanie lekowrażliwościdrobnoustrojów oraz wykrywaniemechanizmów oporności