Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2009,11z powstawaniem oporności na lek dokonano korzystającz bazy danych Affymetrix NetAffx Analysis Center(http://www.affymetrix.com/ analysis/index.affx) po wpisaniukwerend: drug resistance, cisplatin resistance, drugtransport, glutathione, metallothionein, SLC, MDR, DNArepair oraz anti-apoptosis. Sumaryczny zbiór 770 sond stanowiłpodstawę do poszukiwania genów różnicujących. Z grupy22283 sond mRNA, obecnych na mikromacierzy HG-U133A,wyfiltrowano za pomocą arkusza programu Gnumeric sygnałyfluorescencji charakteryzujące ekspresję wybranych transkryptówzwiązanych z powstawaniem oporności na cisplatynę.Porównując sygnały fluorescencji sond zarejestrowanedla komórek kontrolnych oraz komórek eksponowanych nacisplatynę, wyznaczono zbiory, tzw. genów różnicującycho ekspresji różniącej się, co najmniej, ± 2SLR.WynikiAnalizę profilu ekspresji genów, kodujących białkazwiązane powstawaniem w komórkach HL-60 oporności nacisplatynę, poprzedzono porównaniem raportów wygenerowanychw programie Microarray Suite Affymetrix bezpośredniopo odczycie sygnałów fluorescencji na mikromacierzy.Prawidłowy rozkład znormalizowanych sygnałów fluorescencji(RMA Express) był podstawą do zakwalifikowaniamikromacierzy do dalszych analiz. Za pomocą programuGnumeric, z grupy 22283 mRNA obecnych na mikromacierzyHGU133A, wyselekcjonowano sygnały fluorescencji770 transkryptów związanych z powstawaniem oporności.Wyznaczono parametr SLR (signal log ratio) wskazującywielokrotność różnicy sygnału fluorescencji, wyodrębnionozbiór genów różnicujących transkryptomy komórek HL-60kontrolnych oraz eksponowanych na cisplatynę.Wykonane analizy pozwoliły na stwierdzenie, że w komórkachHL-60 eksponowanych na cisplatynę w porównaniudo komórek kontrolnych w największym stopniu stymulowanajest ekspresja genów TOP2A, TOP1, KRAS, BIK,BAX, TFAM, GTSE1, CASP6, AP1S1 i BNIP3L. Genami,których ekspresja została najbardziej zahamowana, okazałysię SLC7A11, CD70, MTF1, ABCC3, FAS oraz SLC2A3.Szczegółowe dane uwzględniające nazwy sond, symbolegenów, nazwy kodowanych białek, oraz wartości SLR dlatranskryptów różnicujących zestawiono w tabeli I. Genyte pełnią bardzo istotne funkcje w procesach powstawaniaoporności na lek.DyskusjaZjawisko wytwarzania przez komórki nowotworoweróżnych mechanizmów obronnych stanowi jeden z głównychproblemów we współczesnej terapii przeciwnowotworowej.Oporność nowotworów niewrażliwych na cisplatynęwynika najczęściej z niewystarczającej akumulacjitego leku w komórce [12, 13]. Cisplatyna jest związkiemo znacznej polarności, co powoduje, że przenika do komórekznacznie wolniej niż większość niskocząsteczkowychleków przeciwnowotworowych. Wchłanianie cisplatynyzależy od stężenia jonów sodu i potasu, pH oraz obecnościczynników redukujących. Oprócz dyfuzji biernej, transportcisplatyny do wnętrza komórki zachodzi z udziałem białektransportujących, kanałów jonowych oraz przezbłonowegotransportera miedzi CTR1. Zarówno miedź jak i cisplatyna,w zakresie stężeń występujących fizjologicznie w organizmieoraz podczas terapii, powodują obniżenie poziomuCTR1 poprzez makropinocytozę i degradację z udziałemproteasomów [5]. Kolejną przyczyną powstawania opornościkomórek nowotworowych jest zmieniony transportleków przeciwnowotworowych przez MDR-1, nadrodzinębiałek transportujących zależnych od ATP, oraz inne białkaoporności wielolekowej [12]. W przedstawianej pracy zaobserwowanoobniżony poziom ekspresji ABCC3. Gen tenkoduje białko ABCC3 - kanalikularne białko 2 związanez opornością wielolekową (canalicular multispecific organicanion transporter 2; MRP3) należące do nadrodziny błonowychbiałek transportowych zależnych od ATP. Białka techarakteryzują się znacznym polimorfizmem i powszechniewystępują w komórkach nowotworowych [14]. Innym genem,którego ekspresja w komórkach HL-60 pod wpływemcisplatyny uległa obniżeniu, jest SLC2A3 kodujący błonowebiałka rodziny SLC2A, które są odpowiedzialne za transportzwiązków polarnych [15]. Chociaż udział tego przenośnikaw transporcie cisplatyny do komórek nie został dotychczasopisany, nie można wykluczyć, że zaobserwowana w naszycheksperymentach zmniejszona ekspresja tego genu jestwynikiem odpowiedzi komórki mającej na celu obniżeniestężenia cisplatyny w cytoplazmie.Przyczyną oporności na cisplatynę jest również podwyższonestężenie w cytoplazmie związków zawierającychgrupę tiolową, takich jak glutation czy metalotioneiny, któreunieczynniają cisplatynę na skutek wiązania platyny i siarki[6, 13]. Zwiększone stężenie metalotionein w komórkachmysich powoduje 4-krotne, a w ludzkich komórkach rakajajnika 7-krotne zwiększenie oporności na cisplatynę. Komórkiraka jajnika wykazują ujemną korelację poziomuglutationu oraz wrażliwości na cisplatynę. Badania dwóchlinii komórek raka jajnika, wywodzących się od tego samegopacjenta, wyizolowanych przed terapią i po zastosowaniucisplatyny wykazały 2,9 –krotny wzrost aktywności transferazglutationowych, które katalizują sprzęganie glutationuz cisplatyną [16]. Ponadto, udowodniono, że wytworzoneaddukty cisplatyna-glutation są usuwane z komórki poprzezzależną od ATP pompę S-koniugatów glutationu. Jużw 1994 roku Ishikawa i wsp. wykazali, że oporności białaczkipromielocytarnej HL-60 towarzyszy zwiększonaekspresja zależnej od ATP pompy S-koniugatów glutationu(MRP1 lub MRP2) [7]. W cytoplazmie, glutation przyłączasię do cisplatyny, a w jądrze do adduktów cisplatyny z DNA,uniemożliwiając w ten sposób utworzenie potencjalnie cytotoksycznychwiązań krzyżowych w DNA [17]. Rezultatynaszych eksperymentów pokazują, że w komórkach HL-60eksponowanych na cisplatynę ulega obniżeniu ekspresjagenu SLC7A11, kodującego specyficzne białko transportowecystyna/glutaminian uczestniczące w transporcie anionowejformy cystyny do komórek. Ponieważ bardzo niska ekspresjatego białka na powierzchni niektórych komórek (m.in.limfocytów) przy obniżonej dostępności cysteiny skutkujespowolnieniem syntezy glutationu, można się spodziewać,że obniżenie ekspresji SLC7A11, świadczy o braku pierwotnejoporności związanej z nadmierną syntezą glutationuw badanych komórkach [18]. Udział metalotionein w de-22