Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073prawy DNA, co najczęściej prowadzi do śmierci komórkiw drodze apoptozy [3]. Z drugiej strony wiązanie cisplatynydo DNA uaktywnia cały szereg mechanizmów prowadzącychdo powstawania oporności i braku wrażliwości na tenlek. Za oporność na cisplatynę odpowiedzialny jest przedewszystkim niewystarczający transport do komórki [4]. Istniejądoniesienia o udziale w usuwaniu cisplatyny z komórkizależnych od ATP białek MDR1, MRP1, MRP2, MRP3,jednakże późniejsze prace przypisują funkcję usuwania tegoleku przede wszystkim białkom związanym z transportemmiedzi, ATP-azom ATP7A oraz ATP7B [5]. Również nadekspresjaglutationu oraz niektórych białek zawierającychgrupy tiolowe, jak metalotioneina, powoduje oporność nacisplatynę [6]. Wiązanie glutationu i cisplatyny jest katalizowaneprzez transferazy S-glutationowe, które zwiększającwłaściwości anionowe związku, zwiększają jego usuwaniez komórki poprzez zależną od ATP pompę S-koniugatów glutationu[7]. Oprócz niewystarczającej akumulacji cisplatynywewnątrz komórek, główną przyczyną braku wrażliwościnowotworu na ten lek są procesy związane z możliwościąnaprawy DNA oraz usuwaniem adduktów cisplatyna-DNA[8]. W odróżnieniu od niewrażliwych komórek wielu guzówwykazujących wzrost zdolności naprawczych polekowychuszkodzeń DNA, znaczna wrażliwość komórek, np. raka jądra,wynika z upośledzenia ich zdolności do naprawy DNA.Podstawowymi mechanizmami usuwającymi spowodowaneprzez cisplatynę uszkodzenia DNA są: naprawa przez wycinanienukleotydów (NER), naprawa przez wycinanie zasad(BER), naprawa źle sparowanych zasad (MMR) i naprawapęknięć DNA. Zwiększona tolerancja na wywołane przezcisplatynę uszkodzenia DNA może także wystąpić na skutekutraty funkcji szlaku MMR. Pochodna cisplatyny, Eloxatinnie wywołuje powstawania oporności, gdyż mechanizmjej akumulacji nie zależy w tak znacznym stopniu odtransportera miedzi CTR1 [9]. Ponadto połączenia tego lekuz DNA nie są rozpoznawane przez białka MMR, podczasgdy addukty cisplatyna - DNA są rozpoznawane przez białkaMSH2, MSH3 i MSH6. Gdy komórki podlegają kolejnymbezskutecznym cyklom naprawy DNA, poziom uszkodzeńpozostaje wystarczający do uruchomienia mechanizmówapoptozy. Kolejny z mechanizmów oporności związany jestz omijaniem podczas replikacji przez polimerazy DNA βi η miejsc w DNA, do których przyłączona jest cisplatyna[10]. Tolerancja na cisplatynę może również być wynikiemzmniejszonej ekspresji, albo utraty szlaków apoptozy, zarównowewnętrznego jak i zewnętrznego, na skutek zmienionejaktywności białek takich jak P53, anty- i proapoptotycznychbiałek rodziny BCL2 oraz JNK [11].W przedstawianej pracy, w celu pełniejszego wyjaśnieniamechanizmów molekularnych decydujących o wrażliwościkomórek nowotworowych na cisplatynę, poddaliśmy oceniezmiany profilu ekspresji genów kodujących białka uczestniczącew transporcie wielolekowym, syntezie glutationui metalotionein, naprawie DNA oraz zmniejszaniu aktywacjii hamowaniu indukcji szlaków apoptozy pod wpływem tegoleku. Do badań wykorzystaliśmy hodowane w warunkachlaboratoryjnych komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczkipromielocytarnej HL-60. Do analizy ekspresji genówzastosowano technikę mikromacierzy oligonukleotydowychHG-U133A (Affymetrix).Materiał i metodyHodowle komórkoweMateriał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkiejlinii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60.Komórki hodowano, zgodnie z zaleceniami ATCC, w standardowychwarunkach (w temperaturze 37°C, w atmosferze5% CO 2), w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (Gibco)z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS; Sigma),100 µg /ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma),2 mM glutaminy (Sigma), 1 mM pirogronianu sodu (Sigma)i 4,5 g/l glukozy. Po 48 godzinach inkubacji do hodowli dodawanoroztwór cisplatyny (Sigma) rozpuszczonej w DMSO(Sigma) tak, aby uzyskać stężenie 0,22 µg/ml, odpowiadającewartości ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle kontrolneprowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinachczysty DMSO, stosowany ze względu na ograniczoną rozpuszczalnośćcisplatyny. Po sześcio godzinnej inkubacji komórkizbierano i przygotowywano do ekstrakcji RNA.Ekstrakcja całkowitego RNARNA ekstrahowano z użyciem odczynnika TRIZOL(Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta.Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniemzestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). EkstraktyRNA oceniano jakościowo techniką elektroforezy w 1%żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny oraz ilościowoprzy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (PharmaciaBiotech).Analiza aktywności transkrypcyjnej genów technikąmikromacierzy oligonukleotydowychCałkowite RNA (8µg) zostało wykorzystane do syntezydwuniciowego cDNA (Gibco BRL SuperScript Choice system),które stanowiło matrycę do syntezy biotynylowanegocRNA (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacjibiotynylowanego cRNA przeprowadzono hybrydyzacjęz mikromacierzą Test3, a następnie po pozytywnej weryfikacjiz mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Znakowanieproduktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowokompleksem streptawidyna – fikoerytryna, znakowanymiprzeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciwkompleksowi streptawidyna – fikoerytryna zgodniez protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzyoligonukleotydowej HG–U133A w przewodniku GeneExpression Analysis Technical Manual (Affymetrix). Następniepłytki mikromacierzy odczytywano używając skaneraAgilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies).Otrzymane wyniki intensywności fluorescencjizapisano i zarchiwizowano w programie Microarray Suiteoraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych.Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzonopo normalizacji wyników w programie RMA Express polegającejna przekształceniu logarytmicznym wartości sygnałufluorescencji dla każdego transkryptu (log 2) wykorzystującprogramy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric, orazMicrosoft Excel. Wyodrębnienia grup genów związanych21