Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2010, 7A.B.0 0.1 15 50Kamptotecyna [μM]NF-κBβ-aktynaRyc. 3. (A) Ocena ekspresji czynnika NF-κB w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóryludzkiej inkubowanych w obecności różnych stężeń kamptotecyny (B) ekspresja β-aktynyw ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w obecności różnychstężeń kamptotecyny.A.B.0 20 60 240Czas [min]NF-κBβ-aktynaRyc. 4. Ekspresja NF-κB (A) i β-aktyny (B) w zależności od czasu inkubacji w ekstrakcie komórkowymfibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w pożywce hodowlanej z dodatkiem50 mM kamptotecyny.integrynowego w homogenaciefibroblastów skóryludzkiej poddanych działaniukamptotecyny. Badanieprzeprowadzono metodą„Western-immunoblot”.Jednocześnie przeprowadzonoanalizę β-aktyny metodą„Western-immunoblot”w celu stwierdzenia kontroliilości nanoszonego białka.Wykazano większą zdolnośćdo wiązania przeciwciałprzeciwko podjednostceβ 1receptora integrynowegohomogenatów komórek inkubowanychz CPT w porównaniudo homogenatówkomórek kontrolnych (Ryc.5). Wskazuje to, iż kamptotecynapobudza ekspresjęreceptora β 1-integrynowegow hodowli fibroblastówskóry ludzkiej.DyskusjaA.B.porównaniu do biosyntezy kolagenu zachodzącej w komórkachrosnących w pożywce hodowlanej bez CPT (kontrola).Zaobserwowano hamowanie biosyntezy kolagenu proporcjonalnedo użytych stężeń alkaloidu. Uzyskane wyniki wskazują,że CPT jest inhibitorem biosyntezy kolagenu w hodowlifibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej.Jednym z czynników odpowiedzialnych za hamowaniebiosyntezy tego białka jest NF-κB. Oceniono ekspresjęNF-κB w hodowli fibroblastów inkubowanych w obecnościróżnych stężeń kamptotecyny. Wynik tego doświadczeniaprzedstawia Ryc. 3. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnikaNF-κB zależny od użytego stężenia kamptotecyny.W celu potwierdzenia poprawności wykonania doświadczeniawykonano jednocześnie analizę „Western-immunoblot”β-aktyny. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnika NFκBw hodowli fibroblastów w zależności od czasu inkubacjiz kamptotecyną. Najwyższą ekspresję zaobserwowanopo 4 godzinach inkubacji (Ryc. 4) W regulacji aktywnościNF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej ważną funkcję pełnipodjednostka β 1receptora integrynowego powierzchnikomórki. Z tego powodu oceniono ekspresję receptora β 1-360 0.1 15 50Kamptotecyna [μM]Ryc. 5. (A) Ekspresja receptora β 1-integrynowego w fibroblastach kontrolnych oraz inkubowanychz CPT w różnych stężeniach. (B) Ekspresja β-aktyny w fibroblastach kontrolnychoraz inkubowanych z CPT w różnych stężeniach.receptorPomimo znacznegoβ 1- integrynowy postępu jaki dokonał sięw wyjaśnieniu mechanizmówregulujących metabo-β-aktynalizm kolagenu, wciąż brakujeskutecznej terapii zaburzeńkolagenu z tkanki łącznej.Kolagen jest najobficiejwystępującym białkiemmacierzy pozakomórkowejssaków. Odpowiada on zautrzymanie prawidłowejstruktury i integralności tkanki łącznej, odgrywa też ważnarolę w interakcji z receptorami integrynowymi powierzchnikomórek, regulujących wiele procesów fizjologicznychi patologicznych: reorganizację cytoszkieletu, transport jonów,metabolizm lipidów, aktywację kinaz, ekspresję genów,regulację cyklu komórkowego, procesy różnicowaniai wzrostu komórek nowotworowych jak również inwazyjnośćkomórek nowotworowych. Z tego względu wszelkiezmiany w procesach biosyntezy i degradacji kolagenu mająpotencjalny wpływ na metabolizm komórkowy [32].Badania zespołu Czuwary-Ładykowskiej wskazujące, żekamptotecyna silnie hamuje biosyntezę kolagenu, nie wyjaśniłyjednak mechanizmu inhibitorowego działania CPT.Ten przeciwnowotworowy związek zwany „fazowo specyficznym”może modulować cykl komórkowy, wpływającna replikację DNA (fazę S), a dokładniej na stabilizowaniekompleksu DNA – topoizomeraza I (enzym biorący udziałw replikacji, zmniejszający naprężenia nici DNA) i hamowanieprzesuwania się widełek replikacyjnych. Zjawisko tozatrzymuje cykl w fazie S, co może prowadzić do licznychmutacji, a w efekcie do śmierci komórki [35].