Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Cytotoksyczność[% wartości kontrolnej]120100806040200przeciwciało przeciw króliczej Fc IgG, znakowane fosfatazą alkalicznąw stężeniu 1:5000 w TBS-T i poddano inkubacji przez 30minut, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę delikatnie płukanoTBS-T (5x10 minut) i poddano działaniu odczynnika Sigma–Fast BCIP/NBT aby wybarwić immunoreaktywne białko.Pomiar biosyntezy kolagenu0 0,1 15 50Kamptotecyna [µM]Ryc. 1. Ocena przeżywalności fibroblastów skóry ludzkiej poddanychdziałaniu kamptotecyny (CPT). Komórki inkubowano przez 24 godzinyw pożywce z dodatkiem różnych stężeń CPT. Przedstawiono wartościśrednie ± S.D.Wbudowywanie 5[ 3 H]-proliny[dpm x 10 -3 / mg białka]353025201510500 0,1 15 50Kamptotecyna [µM]Ryc. 2. Biosynteza kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiejw stanie inhibicji kontaktowej inkubowanych przez 24 godziny w pożywcez dodatkiem 0,1, 15, 50 µ M CPT. Przedstawiono wartości średnie± S.D.Pomiar biosyntezy kolagenu wykonano według metodyopisanej przez Peterkofsky i wsp. [31]. Fibroblastycopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej wpożywce przez 24 godziny z dodatkiem 5[ 3 H]-proliny (5 µCi/ml, 28 Ci/mmol). Komórki dwukrotnieprzemyto 1 ml DPBS z 10 mmol/l proliny,następnie zawieszono je w 1,5 ml DPBSz 10 mmol/l proliny. Zawiesinę komórek poddanohomogenizacji ultradźwiękami (3 x 20 s wtemp. 0 o C). Białka zawarte w homogenatachwytrącono przez dodanie 1,5 ml 20% TCA z 20mmol/l proliną. Po 5 minutach wytrącone białkaodwirowano (1000 x g w temp. 4 o C przez 10minut), supernatant odrzucono, a osad rozpuszczonow 0,6 ml 0,2 mol/l NaOH. Pobierano po 2próby po 0,2 ml lizatu. Każdą próbę zobojętnianoprzez dodanie 0,16 ml 0,15 mol/l HCl i 0,1 ml1 mol/l Tris-HCl o pH 7,2, a następnie dodano20 µl 62,5 mmol/l N-etylomaleimidu (NEM), 10µl CaCl 2oraz 10 µl DPBS z kolagenazą o stężeniu1 mg/ml (próba badana) lub bez kolagenazy(próba kontrolna). Próby inkubowano przez 90minut w temperaturze 37 o C. Następnie dodano0,5 ml zimnego 10% TCA i chłodzono przez 5minut w temperaturze 0 o C. Po 5 minutach próbyodwirowano, a supernatant przeniesiono dofiolek scyntylacyjnych z 4 ml płynu scyntylacyjnego.Ilość powstałego kolagenu wyrażonow dpm 5[ 3 H]-proliny wbudowanej do białekpodatnych na działanie kolagenazy bakteryjnej,w przeliczeniu na µg białka.Analiza statystycznWyniki poddano analizie statystycznej. Obliczonośrednie arytmetyczne z poszczególnychpomiarów i odchylenia standardowe oraz dokonanoanalizy statystycznej przy użyciu testu „t” –studenta. Za istotne statystycznie przyjęto różnicepomiędzy średnimi przy poziomie ufności p