Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2010, 7nością: cytokin (np. TNF-α), mitogenów (np. anti-CD2, anti-CD3), bakterii (endotoksyny Staphylococcus aureus, Mycobacteriumtuberculosis), wirusów (np. HTLV-1, HBV), leków (np.cykloheksamid) i innych czynników np. stresu oksydacyjnegoczy związków przeciwnowotworowych [19-25]. AktywacjaNF-κB zachodzi w ciągu kilku minut po ekspozycji na czynnikindukujący, zatem nie wymaga syntezy białek de novo. Procesten polega na fosforylacji IκB (inhibitora NF-kB) co prowadzido ich ubikwitynacji i oddysocjowania od NF-κB. AktywnyNF-κB ulega translokacji z cytoplazmy do jądra komórkowego,gdzie pobudza transkrypcję odpowiednich genów [26-28].Wpływ kamptotecyny na ekspresję NF-κB nie jestznany. Wysunięto przypuszczenie, że potencjalnym punktemuchwytu inhibitorowego działania tego alkaloiduna biosyntezę kolagenu może być czynnik transkrypcyjnyNF-κB. Ocenie poddano ekspresję NF-κB, receptoraβ 1-integrynowego oraz biosyntezę kolagenu w fibroblastachskóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny.Materiały i metodyMateriałyL-prolina, kolagenaza bakteryjna typu VII, trypsyna, pożywkaDMEM, kamptotecyna - Sigma, USA, płodowa surowicabydlęca – Gibco, USA, L-5[ 3 H] prolina (28 Ci/mmol), Amersham,U.K. Przeciwciała poliklonalne królicze przeciw NFκB,β-aktynie, receptorowi β1-integrynowemu, przeciwciała drugorzędoweznakowane fosfatazą, Santa Gruz, USA. Fibroblasty –American Type Culture Collection, Rockville, USA.MetodyPrzygotowanie hodowli fibroblastów.Fibroblasty skóry ludzkiej hodowano w DMEM z dodatkiem10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/lglutaminy, 50 µg/ml penicyliny, 50 µg/ml streptomycynyw temperaturze 37 o C, w atmosferze 5 % CO 2. Fibroblastyprzenoszono z butelek „Costar” do 6 oczkowych płytek„Costar” stosując bufor fosforanowy z dodatkiem0,05 % trypsyny i 0,02 % EDTA. Komórki liczono w hemocytometrzei przenoszono w ilości 1x10 5 komórek na oczkow 1 ml pożywki hodowlanej. Pożywkę hodowlaną wymienianona świeżą, co 48 godzin. Fibroblasty osiągały stan inhibicjikontaktowej w 6 dniu wzrostu. W większości przypadkówkomórki takie użyto do dalszych doświadczeń. Do badańużywano komórek pomiędzy 8 i 14 pasażem. Fibroblastyw stanie inhibicji kontaktowej płukano trzykrotnie 0,15 mol/lNaCl, zawieszano w 0,15 mol/l NaCl i wirowano przy obrotach200 x g, a supernatant odrzucono. Następnie, odwirowanekomórki zawieszono w 0,3 ml 0,05 mol/l buforu Tris-HClo pH 7,8 i poddano działaniu ultradźwięków trzykrotnie po10 sekund w temp. 0 o C. Próby wirowano przy 16.000 x g wtemp. 0 o C przez 30 minut. W uzyskanym supernatancie oznaczonobiałko i użyto do dalszych doświadczeń.Test cytotoksycznościPomiar cytotoksyczności przeprowadzono według metodyopisanej przez Carmichael’a [29]. Oceniono żywotnośćkomórek przy użyciu soli tetrazolinowej (MTT). W żywychkomórkach barwnik ten ulega konwersji do purpurowegoformazonu pod wpływem mitochondrialnych dehydrogenaz.W martwych komórkach konwersja ta nie zachodzi.Komórki w stanie inhibicji kontaktowej inkubowano w pożywcezawierającej równe stężenia badanego związku przez24 godziny w inkubatorze z CO 2w temp. 37 o C. Następniepodłoże usunięto, komórki przepłukano 3 x 1 ml PBS, dodano1 ml PBS oraz 50µl MTT o stężeniu 5 mg/ml i kontynuowanoinkubację przez 4 godziny. Po tym czasie usuniętomedium i dodano do komórek 1 ml 0,1 mol/l kwasu solnegow absolutnym izopropanolu. Po ok. 10 minutach, w lizaciekomórek mierzono absorbancję przy 570 nm i 630 nm. Odwartości absorbancji przy 570 nm odjęto wartość absorbancjitła (630nm). Różnicę wartości absorbancji uzyskanąw hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Posłużyłaona za wartość porównawczą względem komórek inkubowanychw obecności kamptotecyny. Przeżywalność tychkomórek przedstawiono jako procent wartości kontrolnej.Oznaczanie zawartości białkaBiałko zawarte w supernatancie homogenatów komórkowychoznaczano metodą Lowry i wsp. [30].Elektroforetyczny rozdział białek na żelu poliakrylamidowymz SDSBadane próby zawierające 20 µg białka rozpuszczonow buforze 0,125 mol/l Tris-HCl o pH 6,8 zawierającym 3 %SDS, 20 % glicerol i 0,1 % błękit bromofenolowy. Próbkipoddano rozdziałowi elektroforetycznemu na żelu poliakryloamidowymzłożonym z 10 % żelu zagęszczającego(zawierającego 0,4 % SDS, 1,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH8,8) i 6 % żelu rozdzielającego (zawierającego 0,4 % SDS,0,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH 6,8) w buforze elektrodowymzawierającym 1,92 mol/l glicyny, 0,25 mol/l Tris i 1 % SDS.Doświadczenie prowadzono przy natężeniu prądu 100 mAna żel przez godzinę w temperaturze pokojowej.Analiza białek metodą „Western immunoblot”Po rozdziale elektroforetycznym żele zrównoważono5 minutową inkubacją w 20 % (v/v) metanolowym roztworze,który zawierał 25 mmol/l Tris i 0,2 mol/l glicyny. Białkazostały przetransferowane na nitrocelulozę o porach 0,2 µmz użyciem zestawu LKB 2117 Multiphor II, pod wpływemnapięcia 100 mA w ciągu 1 godziny, zgodnie z metodą opisanąw podręczniku dołączonym do aparatu. Niespecyficznewiązania nitrocelulozy zablokowano poddając ją działaniu5 % roztworu beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinęw temperaturze pokojowej, wolno mieszając. Następnienitrocelulozę inkubowano z poliklonalnym przeciwciałemprzeciw NF-κB lub polikolnalnym przeciwciałem przeciwreceptorowi β 1-integrynowemu lub poliklonalnalnym przeciwciałemprzeciw β-aktynie w 5 % roztworze mleka beztłuszczowegow TBS-T o stężeniu 1:3000 przez 24 godzinyw temperaturze pokojowej. Po inkubacji nitrocelulozę płukanow roztworze TBS-T (1x15 minut, 2x10 minut) wolno mieszając.W celu wykrycia analizowanych białek dodano drugie34