Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farmaceutycznycopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073www.fpn.sum.edu.plCena 24,50 złMiesięcznikPrzegląd NaukowyIC Value - Current 4,55MNiSW 6ROK VII (XI)Nr 7/2010 (66)Scientific Review in PharmacyCzynniki ryzyka niekorzystnych zdarzeń sercowychu chorych z przewlekłą skurczowąniewydolnością sercaProleki w terapii nowotworów.Część IV. Proleki aktywowane hipoksją 0Metylacja DNA – główny znacznik epigenetyczny komórkiPorost islandzki – związki czynne, aktywność biologicznaPorównanie skuteczności czynników silanizującychw analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnychtechniką GC/MS21Czynnik NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiejpoddanych działaniu kamptotecynyISSN 1425-5073latSubstancje biologicznie aktywne i leczniczeobecne w wybranych gatunkach koniczyn1

Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:Prof. dr hab. Krystyna OlczykAdres redakcji / Editorial Adress:ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / PolandTel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax. + 48 32 364 11 58E-mail: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl6Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific BoardPrzewodniczący / Head:Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - SosnowiecCzłonkowie / Members:Prof. dr hab. Edward Bańkowski - BiałystokProf. dr Karmela Barišić - Zagreb, ChorwacjaProf. dr hab. Jerzy Brandys - KrakówProf. dr Vitalis Briedis - Kaunas, LitwaProf. dr hab. Elżbieta Brzezińska - ŁódźProf. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, HiszpaniaProf. dr. Lionel Buéno - Toulouse, FrancjaProf. dr hab. Kazimierz Głowniak - LublinProf. dr hab. Edmund Grześkowiak - PoznańProf. dr Filiz Hincal - Ankara, TurcjaProf. dr. Michael Horowitz - Adelaide, AustraliaProf. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, AustriaSekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary:Dr n. med. Robert D. WojtyczkaE-mail: fpn@kwiecinski.plProf. dr hab. Renata Jachowicz - KrakówProf. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - LublinProf. dr hab. Krzysztof Jonderko - SosnowiecProf. dr hab. Marcin Kamiński - KatowiceProf. dr Vesna Kuntić - Belgrade, SerbiaProf. dr hab. Jan Pachecka - WarszawaProf. dr hab. Jerzy Pałka - BiałystokProf. dr hab. Janusz Pluta - WrocławProf. dr hab. Janusz Solski - LublinProf. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, JaponiaProf. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, FrancjaProf. dr hab. Marek Wesołowski - GdańskProf. dr Mira Zečević - Belgrade, SerbiaCzłonkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:Dr n. farm. Paweł OlczykDr n. biol. Małgorzata KępaMgr Anna SzeremetaMgr Agnieszka Jura – PółtorakDr n. hum. Anna KierczakMgr inż. Marcin ChabiorPrzemysław JędrusikWydawca / Publisher:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego21latAdres Wydawcy / Publisher Adress:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Polandtel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor:Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy PartykaE-mail: agnieszka.romanska@kwiecinski.plNakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copiesFarmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego.Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawachz 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowanianadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodąwydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcjanie odpowiada.All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyrightlaws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves therights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprintsare allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible foradvertisements and reader letters.

Zdj. Zygmunt WieczorekSzanowni Państwo,Koleżanki i Koledzy,Drodzy CzytelnicyNadeszły długo oczekiwane wakacje, za oknem bezchmurneniebo i upały, a do Farmaceutycznego PrzegląduNaukowego napływają kolejne publikacje, co świadczyo zainteresowaniu Autorów i Czytelników naszym czasopismem,dając także nadzieję na dalszy jego rozwóji umocnienie na rynku wydawniczym. Również i KolegiumRedakcyjne intensywnie pracuje, nie ustając w działaniachna rzecz podwyższania jakości procedur redakcyjnych i wydawniczych.Nasi wspaniali Informatycy opracowali systemelektronicznej rejestracji Autorów przesyłanych publikacji,umożliwiający zarazem Autorom ciągłą weryfikację statusuprzedłożonych prac. Już niebawem, po niezbędnym przetestowaniu,system zostanie wprowadzony, a konieczne informacje,wraz z instrukcją, znajdą Państwo na stronie internetowejczasopisma.W bieżącym numerze Farmaceutycznego Przeglądu Naukowegoznajdą Państwo artykuły o zróżnicowanej tematycebadawczej, począwszy od prac o charakterze klinicznymdo tych z zakresu farmakologii, biochemii farmaceutycznej,analizy instrumentalnej i terapii monitorowanej czy farmakognozji.To bogactwo tematyki przedstawianej na łamachnaszego czasopisma stanowi o jego wartości, tak bardzocennej dla szerokiego grona adresatów tych prac.Tradycyjnie anonsujemy także nadchodzącą konferencję.Tym razem informujemy o Europejskim Sympozjump.t.: “Central European Symposium on PharmaceuticalTechnology – the Most Exciting European Scientific Eventin Fall 2010”, którego miejscem jest Graz (Austria), a któreodbędzie się w dniach 16 – 18 wrzesień br. Szanowni Państwo,polecam lekturę zamieszczonych w niniejszym numerzeprac i polecam nasze czasopismo jako źródło wiedzyo Państwa osiągnięciach, oraz jako platformę integrującącałe nasze środowisko.Życzę pełni wakacyjnego relaksu, dołączając jak zawszeserdeczne pozdrowienia,Redaktor NaczelnyProf. dr hab. Krystyna Olczyk

6Nr 7 / 2010Spis treściRisk factors of adverse cardiac eventsin patients with chronic systolic heart failure0 10Czynniki ryzyka niekorzystnych zdarzeń sercowychu chorych z przewlekłą skurczową niewydolnością serca0Proleki w terapii nowotworów.Część IV. Proleki aktywowane hipoksją0 15Prodrugs in cancer therapy.Part IV. Hypoxia activated prodrugs0Metylacja DNA – główny znacznik epigenetyczny komórki0 20DNA Methylation – a major epigenetic marker of the cell0Porost islandzki – związki czynne, aktywność biologiczna 23Iceland Moss – active compounds, biological propertiesPorównanie skuteczności czynników silanizującychw analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MS0 28Comparison of the Efficiency of Silylating Agents in GC/MS Analysisof Non-steroidal Anti-inflammatory DrugsCzynnik NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiejpoddanych działaniu kamptotecyny0 33NF-κB factor in human skin fibroblasts treated with camptothecinSubstancje biologicznie aktywne i leczniczeobecne w wybranych gatunkach koniczyn 39Biologically active and therapeutic substances from Trifolium species

TUGraz2 nd AnnouncementCall for Papers© Graz TourismusKarl-Franzens-University,Graz University of Technology andResearch Center Pharmaceutical Engineeringare organising the:8 th Central European Symposiumon Pharmaceutical TechnologySatellite Symposium:4 th International Graz Congressfor Pharmaceutical EngineeringSeptember 16-18, 2010Graz, Austriawww.cespt2010.org

Central European Symposium onPharmaceutical Technology - the MostExciting European Scientific Event in Fall 2010© Graz TourismusGrazThe Conference CityWithawellestablishedreputationforbeingalivelyplaceofculture,Graz becamethe first city in Austria to gain the accolade of being the European Capital ofCulture in 2003. The unique flair of the metropolis by the river Mur wasinstrumentalinassuringthesuccessoftheCulturalCapitalproject– whichiswhyGrazcontinuestorefertoitselftodayasthe‘culturalcapital’.Anunderstandabletitleinviewofitsuniqueprogramme ofevents.The History of CESPTInthelate1980s,theinitiativeforCentralEuropeanscientificmeetingsdealingwithpharmaceuticaltechnologyaroseasaresultofthelongstandingcollaborationbetweenthelaboratoriesforpharmaceuticaltechnologyofthefacultiesofpharmacyinTrieste,ItalyandLjubljana,Slovenia.Threeroundtablemeetings,entitledAlpe Adria SeminarsonPharmaceuticalTechnology,wereheld.Asaresultofthisinitiativethe1st CentralEuropeanSymposiumonPharmaceuticalTechnology(CESPT) washeldinOctober1995inBled,SloveniaunderthepatronageofEUFEPS.Twosubsequentevents,in1997and1999weresuccessfullyorganizedinPortoroz,Slovenia.LaterCESPTconferencesfollowedinHungaryandAustria,thelastmeetingin2008waslocatedinLjubljana,thecapitalcityofSlovenia.Morethan200contributionswerepresentedand theconferencewasaccompaniedbyaSatelliteSymposiumentitledChallengesandOpportunitiesinMultiparticulate DrugDelivery.AspecialissueofInternationalJournalofPharmaceuticswaspublishedfromthisgreatevent.Satellite Symposium:4 th International Graz Congress for Pharmaceutical EngineeringFortheforthtime,theInternationalGrazCongressforPharmaceuticalEngineeringwillfocusonrecentdevelopmentsintheareasofQualitybyDesign,continuousprocessing,processunderstanding,modelling,pharmaceuticalnanotechnologyandnewprocessanalyticaltechnology(PAT).TogetherwithCESPTtheSatelliteSymposiumfunctionsnotonlyasaplatformtopresentresearchresults,butalsotoinitiatecooperations onaninternationallevel.More Information:www.cespt2010.orgKey Note Speakers:IztokGrabnar,Ljubljana,SloveniaPeterKleinebudde,Düsseldorf,GermanySteveHammond,Pfizer,USAKlausLanger,Münster,GermanyClausMichaelLehr,Saarbrücken,GermanyWolfgangG.Kreyling,HelmholtzZentrumMünchen,GermanyThomasRades,Dunedin,NewZealandGezaRegdon,Szeged,HungaryBarbaraRothenRutishauser,BernSwitzerlandJonathanPKSeville,Coventry,UKFrantisekStepanek, London,UKWernerWeitschies,Greifswald,GermanyAlexanderYarin,Chicago,USAWelookforwardtomeetingyouinGrazin2010!

Call for PapersWe cordially invite you to submit papers on the following topics:• ContinuousManufacturing• Materials,ConstitutiveBehavior,StructuringMethods,StructureFunctionalityRelations• QualitybyDesignStrategiesandTheirImpactontheApprovalProcess• NewProcessAnalyticalTechnology• AdvancesinPowderProcessing• RationalDesignofNovelFormulations• BiopharmaceuticalsManufacturing• Nano andMicroDeliverySystems• SafetyofNanomaterials• GeneandProteinDeliverySystems• Biomaterials• NovelDosageForms• ModifiedDrugRelease• DrugTargeting• DrugDissolution,Absorption,MetabolismandMembraneTransport• Bioavailability,Bioequivalence,Biosimilarity• Pharmacokinetics,Pharmacodynamics andEfficacyofDrugDeliverySystemsParticipantsareinvitedtosubmitabstractsonlinefororalorposterpresentationsbeforeApril30,2010.Abstractsmust conform tothe template (http://www.cespt2010.org/kongress_en/documents/TemplateCESPT.doc),they havetobe written inEnglishandmust be submitted online.AllacceptedabstractswillbepublishedinaspecialissueofScientia Pharmaceutica.Notification of acceptance:Authors willbe notified about the acceptance oftheir abstract andthe type ofpresentation (oralor poster)by June 30,2010.Acceptance ofyour abstract constitutes your commitment toattend andpresent your work.Presentations:Oralpresentations willbe held after the plenary lectures.The timelimit for oralcontribution willbe 20minutesincluding discussion.Posterswillbe exhibited during the Symposium.The panels for the poster presentation are ofthe following size:height150cm,width 90cm.Registration:EarlyRegistration LateRegistration(until30thJune,2010) (after30thJune,2010)Academic,Industry € 390 € 440Students* € 170 € 220SocialProgram € 40 € 40*Studentsarerequestedtosendascannedcopyoftheconfirmationletteroftheirstudentstatussignedbytheheadoftheinstitute/dean.Feesincludeadmissiontothescientific/exhibition,coffeebreaks,lunches,conferencereceptionandsymposiumdocumentationconsistingofadetailedprintedprogram andanUSBStickcontainingallabstracts.Thesocialprogramincludesaconferencedinner.Paymentcanbemadebycreditcardonly.Scientific Committee:Prof.Dr.IstvánAntal,Budapest,HungaryProf.Dr.Ubaldo Conte,Pavia,ItalyProf.Dr.DominiqueDuchene,FranceProf.Dr.AlexanderT.Florence,UnitedKingdomProf.Dr.JelenaFilipoviGri,Zagreb,CroatiaProf.Dr.PeterKleinebudde,Düsseldorf,GermanyProf.Dr.JörgKreuter,Frankfurt,GermanyExhibition:Prof.Dr.Julijana Kristl,Ljubljana,SloveniaProf.Dr.MiloslavaRabišková,Brno,CzechRepublicProf.Dr.StaneSri,Ljubljana,SloveniaProf.Dr.HelmutViernstein,Vienna,AustriaProf.Dr.ZuzanaVitková,Bratislava,SlovakiaTheSymposiumwillbeaccompaniedbyanindustrialexhibitionof productsandtechnologies.Weinviteyoutotaketheopportunitytopresentyourcompanyanddevelopmentachievements.ForfurtherInformation,pleasecontactRoswitha.Schober@tugraz.atMore Information:www.cespt2010.org

Location:TheKarlFranzensUniversity,locatedinGraz,Austria,isthesecondlargestandsecondoldestuniversityinAustria.Address: Universitätsplatz 3A8010GrazWWW http://www.unigraz.atAccomodation:Forhotels,roomsandhighlightsoftheCityofGraz,whichislocatedclosetooneofthemostbeautifulwineregionsinEurope,pleasevisit:http://www.graztourismus.at/Important dates:Symposiumdates: 16.18.9.2010 AbstractSubmission: 30.4.2010SatelliteSymposium: 16.17.9.2010 AbstractAcceptance: 30.6.2010Registration:Availableonlinehttp://www.cespt2010.orgImportant addresses:PresidentoftheSymposiumUniv.Prof.Dr.AndreasZimmerKarlFranzensUniversityGrazEmail:Andreas.Zimmer@unigraz.atCoPresidentoftheSymposiumUniv.Prof.Dr.Aleš MrharUniversityofLjubljanaEmail:Ales.Mrhar@ffa.unilj.siOrganising Institutions:PresidentoftheSatelliteSymposiumUniv.Prof.Dr.JohannesKhinastGrazUniversityofTechnologyInst.forProcessandParticleEngineeringPhone:+43(316)8737464FAX:+43(316)8737963Email:Khinast@tugraz.atSecretaryoftheSymposiumDr.EvaRobleggKarlFranzensUniversityGrazInst.ofPharmaceuticalSciencesPhone:+43(316)3808889FAX:+43(316)3809100Email:Eva.Roblegg@unigraz.atKarlFranzensUniversityGrazTUGrazGrazUniversityofTechnologyResearchCenterPharmaceuticalEngineeringCo-sponsoring and supporting Organisations & Societies:APV,InternationalAssociationforPharmaceutical Technology,GermanyA.D.R.I.T.E.L.F.Associazione Docenti eRicercatori Italiani diTecnologie eLegislazione Farmaceutiche,ItalyBioNanoNet ResearchAssociationAustriaControlled ReleaseSocietyGermanLoacal ChapterCzechPharmaceutical SocietyCzechRepublicEuropeanFederation forPharmaceutical SciencesHFD,Croatian Pharmaceutical SocietyCroatiaSFD,Slovenian Pharmaceutical SocietySloveniaHSPS,Hungarian Societyfor Pharmaceutical SciencesHungariaÖPhG,ÖsterreichischePharmazeutischeGesellschaftAustriaMFD,Macedonian Pharmaceutical AssiciationMacedoniaSFS,Slovak Pharmaceutical SocietySlovakiaPharmaceutical SocietyofSerbiaSerbiaPolish Pharmaceutical SocietyPolandAssociationofPharmacists ofthe Federation ofBosnia andHerzegovinaFor more information please visit our websitewww.cespt2010.org

Farm Przegl Nauk, 2010,7, 10-14Risk factors of adverse cardiac eventsin patients with chronic systolic heart failureCzynniki ryzyka niekorzystnych zdarzeń sercowychu chorych z przewlekłą skurczową niewydolnością sercaAleksander Owczarek 1 , Bożena Szyguła-Jurkiewicz 2 , Krzysztof Helewski 3 ,Karolina Klimaszewska 4 , Romuald Wojnicz 31Division of Statistics in Sosnowiec, Medical University of Silesia, Katowice, Poland2III Department of Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland3Department of Histology & Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland4Student Scientific Society, III Department of Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, PolandAbstractChronic heart failure (HF) is an arising important medicalproblem. Apart from neuroendocrine system activation,it is also characterized by an inflammatory component.Pro-inflammatory cytokines exacerbate haemodynamicabnormalities, exert direct toxic effects on the heart andcontribute to cachexia. A prospective study has been accomplishedin the group of 164 patients with stable systolicheart failure in order to investigate the association betweenhypercoagulability, inflammation, NT-pro BNP and theclinical outcome. Major adverse cardiac event (MACE)experienced 43.3% of patients. Independent inflammatoryrelatedrisk factors of MACE in patients with HF are plasmalevels of: high sensitivity C-reactive protein, fibrinogen,D-dimers and NT-pro BNP.Key words: high sensitivity C-reactive protein, heart failure,risk factors, MACEStreszczeniePrzewlekła niewydolność serca (HF) stanowi istotny problemmedyczny. Oprócz aktywacji układu współczulnego,niewydolność serca charakteryzuje się również zwiększonąaktywnością układu odpornościowego. Krążące wekrwi cytokiny prozapalne nasilają zaburzenia hemodynamiczne,wywierają bezpośredni toksyczny wpływ na sercei wtórnie przyczyniają się do wyniszczenia organizmupacjenta. W celu oceny związku między czynnikami odzwierciedlającymiaktywność układu immunologicznego,krzepnięcia oraz NT-pro BNP a rokowaniem odległym,przeprowadzono badanie prospektywne w grupie 164pacjentów ze stabilną skurczową niewydolnością serca.U 43.3% pacjentów wystąpiło niekorzystne zdarzeniesercowe (MACE). Niezależnymi czynnikami związanymize zwiększonym ryzykiem wystąpienia MACEu tych chorych okazały się stężenia w surowicy: białkaC-reaktywnego wysokiej czułości, fibrynogenu,D-dimerów i NT-pro BNP.Słowa kluczowe: białko C-reaktywne wysokiej czułości,niewydolność serca, czynniki ryzyka, niekorzystne zdarzeniesercowo-naczyniowe (MACE)IntroductionCardiovascular diseases are the leading cause of morbidity,disability and premature mortality in developedcountries. Chronic heart failure (HF) is an arising importantmedical problem. It accounts for at least 5% of admissionsto general medical and geriatric wards and for almost 2% ofthe total healthcare expenditure (dependent on the country)[1]. It has been estimated that only in Europe HF affects 10million people [2]. Most common causes of HF are: coronaryartery disease leading to myocardial infarction (systolicdysfunction), hypertension and valvular heart disease, infections,‘idiopathic’ dilated and alcoholic cardiomyopathy[3].Heart failure is a clinical syndrome resulting from astructural and functional cardiac disorder. It impairs the abilityof the ventricle to fill with or eject blood according tothe needs of the body, or precludes it from doing so in theabsence of increased filling pressures. It is a multisystemdisorder which is characterized by abnormalities of cardiac,skeletal muscles as well as renal function, stimulation ofthe sympathetic nervous system and a complex pattern ofneurohormonal changes [4]. Figure 1 presents the overviewof main pathophysiology pathways in HF. As heart failureadvances there is a relative decline in the counter regulatoryeffects of endogenous vasodilators such as: nitric oxide,prostaglandin, bradykinin, atrial and brain natriureticpeptides (ANP, BNP). Other factors that play a role in thepathogenesis of HF include: the endothelin and adenosinereceptor systems, vasopressin, pro-inflammatory cytokines10

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073(mainly: tumour necrosis factor alpha TNF-α, C-reactiveprotein CRP, interleukin IL-1 and IL-6) [3, 5].Apart from neuroendocrine system activation, heart failureis characterized by an inflammatory component. Themechanisms of inflammation play an important role in theprocess of left ventricular remodelling including structuraland functional changes of the myocardium which are notonly in part responsible for the development of symptomsbut also for the disease progression. Pro-inflammatory cytokinesexacerbate haemodynamic abnormalities, exert directtoxic effects on the heart and contribute to cachexia [6].Also, it has been reported that inflammation is strictly correlatedwith clotting activation which has clinical relevanceto HF [7].The aim of this study was to investigate the associationbetween hypercoagulability, inflammation, NT-pro BNPand the clinical outcome – MACE (rehospitalisation, death,heart transplantation), in patients with chronic systolic heartfailure.Materials and methodsA prospective study has been accomplished in the groupof 164 patients (mostly man – 83.54%) with stable systolicheart failure, selected according to criteria of inclusionand exclusion. According to the European Guidelines forheart failure management, all patients – at least during threemonths before hospital admission, were treated with angiotensineconverting enzyme inhibitor (Captopril) or angiotensinereceptor antagonist (ARA), β‐blocker (metoprololCR or carvedilol) in maximal tolerated doses and with patientfitted doses of digoxine, spironolactone and furosemide[8]. The study protocol was accepted by the Bioethical Committeeof Silesian Medical University in Katowice: NN-043-10/95 and NN-6501-158/I/06/07; the patients gave theirconscious consent to participate in the study.Inclusion criteria:stable systolic heart failure – increased left ventricularend–diastolic diameter LVEDd>57mm and reduced leftventricular ejection fraction LVEF

Farm Przegl Nauk, 2010, 7mal distribution or the U Mann‐Whitney test for unpairedvariables without normal distribution. The univariate Coxproportional hazard analysis defined MACE hazard ratiosin the 3-year follow-up. All variables found statistically significantin the univariate analysis (p

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Fig. 2. Kaplan-Meier survival estimate for HF patients.patients with CRP levels higher than 0.9 mg/dL were identifiedascandidates for earlier hospitalization than those withlower level of CRP. Higher levels of CRP were also relatedto higher rates of mortality [12]. Huang et al. examined 72patients with HF and found that CRP level higher than 5.38mg/L was an independent significant predictor of MACE(hazard ratio in Cox analysis HR=2.91; p

Farm Przegl Nauk, 2010, 73. McMurray JJ, Pfeffer MA. Heart failure. The Lancet,2005; 365: 1877-1886.4. Jackson G, Gibbs CR, Davies MK, Lip GYH. ABC ofheart failure. Patophysiology, 2000; 320: 167-170.5. Matsumori A. Role of inflammation in heart failure. IntJ Cardiol, 2008; 125: 10-11.6. Anker SD, van Haeling S. Inflammatory mediators inchronic heart failure: an overview. Heart, 2004; 90:464-470.7. Marucci R et al. Markers of hypercoagulability and inflammationpredict mortality in patients with heart failure.J Thromb Haemost, 2006; 4: 1017-1022.8. The Task Force on Heart Failure of the European Societyof Cardiology (ESC) developed in collaborationwith the Heart Failure Association of the ESC (HFA).ESC Guidelines Desk Reference. Compendium ofabridged ESC guidelines, 2008; Section XV, Heart Failure:313-338.9. Anand IS et al. C-reactive protein in heart failure: prognosticvalue and the effect of valsartan. Circulation,2005; 112: 1428-1434.10. Guliz K, Gokhan E, Kilic T, et al. Elevated level of highsensitivity C-reactive protein is important in determiningprognosis in chronic heart failure. Med Sci Monit,2010; 16(3): 156‐161.11. Alonso‐Martinez JL, Llorente‐Diez B, Echegaray‐AgaraM, et al. C‐reactive protein as a predictor of improvementand readmission in heart failure. Eur J Hear Fail,2002; 4: 331‐336.12. El-Menyar A. Cytokines and Myocardial Dysfunction:State of the Art. J Card Fail, 2008; 14: 61-74.13. Huang WP, Yin WH, Jen HL, et al. C-reactive proteinlevels in chronic congestive heart failure. Acta CardiolSin, 2004; 20: 7-14.14. Olsson LG, Swedberg K, Cleland J, Spark PA, KomajdaM, Metra M, et al. Prognostic importance of plasma NTproBNP in chronic heart failure in patients treated witha beta-blocker: results from the Carvedilol Or MetoprololEuropean Trial (COMET) trial. Eur J Heart Fail,2007; 9(8): 795-801.15. Richard M, Troughton RW. NT-proBNP in heart failure:therapy decisions and monitoring. Eur J Heart Fail,2004; 6: 351-354.16. Jourdain P, Jondeau G, Funck F, Gueffet P, Le HellocoA, Donal E, et al. Plasma brain natriuretic peptide-guidedtherapy to improve outcome in heart failure. JACC,2007; 49(16): 1733-1739.17. Lamblin N, Mouquet F, Hennache B, Joel D, Susen S,Bauters Ch, et al. High-sensitivity C-reactive protein: potentialadjunct for risk stratification in patients with stablecongestive heart failure. Eur Jeart J, 2005; 26: 2245-2250.18. Alehagen U, Dahlstrom U, Lindahl TL, et al. ElevatedD‐dimer level is an independent risk factor for cardiovasculardeath in out‐patients with symptoms compatible withheart failure. Thromb Haemost, 2004; 92: 1250-1258.19. Kannel WB, D’Agostino RB, Belanger AJ. Update onfibrinogen as a cardiovascular risk factor. Ann Epidemiol,1992; 2(4): 457-66.20. Witte KKA, et al. Fibrinogen synthesis is increased incachectic patients with chronic heart failure. Int J Cardiol,2008; 129(3): 363-367.21. Ferketich AK, Binkley PF. Heart failure and inflammation:results from the third national health and nutritionexamination survey (NHANES III). Cardiac Failure,2004; 10(4): 93.22. Hoffmeister A, et al. Plasma viscosity and fibrinogen inrelation to haemodynamic findings in chronic congestiveheart failure. Eur J Heart Fail, 1999; 1: 293-295.data otrzymania pracy: 15.02.2010 r.data akceptacji do druku: 21.06.2010 r.Corresponding author:Eng. Aleksander Owczarek, Ph.D.Division of Statistics, Department of Instrumental AnalysisMedical University of Silesia30 Ostrogórska S.41-200 SosnowiecMobile: +48 0 501 357 068tel.: +48 32 364 13 32e-mail: aowczarek@sum.edu.pl14

Farm Przegl Nauk, 2010,7, 15-19copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Proleki w terapii nowotworów.Część IV. Proleki aktywowane hipoksjąProdrugs in cancer therapy.Part IV. Hypoxia activated prodrugsAndrzej Stańczak, Marta SzumilakZakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w ŁodziStreszczenieWiększość stosowanych obecnie leków przeciwnowotworowychcharakteryzuje wysoka toksyczność systemowai brak wybiórczości względem tkanki nowotworowej.Jednym ze sposobów zwiększania skuteczności terapiii ograniczania jej toksyczności jest projektowanie proleków.Nowoczesne proleki przeciwnowotworowe tzw. TumorActivated Prodrugs projektuje się w oparciu o ciąglerosnącą wiedzę na temat budowy i funkcji tkanki nowotworowej.Szereg jej cech np. hipoksja, obecność specyficznychantygenów, bądź receptorów, czy wadliwy systemnaczyniowy, stanowi punkt uchwytu umożliwiającyselektywne dostarczenie i aktywację proleku w obrębieguza. Poniższy artykuł skupia się na prolekach aktywowanychhipoksją, które podlegają bioredukcyjnej aktywacjiza pośrednictwem specyficznych enzymów obecnychw niedotlenionych komórkach nowotworowych. W obrębietej grupy proleków wyróżnia się: chinony, związkio strukturze N-tlenku oraz związki nitroaromatyczne.Słowa kluczowe: proleki, leki przeciwnowotworowe,proleki aktywowane hipoksją, reduktaza NADPH:CYP450AbstractMost currently used anticancer drugs are characterizedby high systemic toxicity and lack of tumor selectivity.One way to increase effectiveness of treatment and reduceits toxicity is prodrug design. Advanced anticancer prodrugsso-called Tumor Activated Prodrugs are designed onthe basis of ever-growing knowledge of the structure andfunction of tumor tissue. Several of its features such as:hypoxia presence of specific antigens or receptors, vascularsystem failure or can be the targets allowing the selectivedelivery and activation of prodrugs within the tumor.This work describes active targeting strategy which isbased on differences in cell surface antigen or receptor expressionbetween normal and tumor tissue. The followingarticle focuses on hypoxia-activated prodrugs which arebioreductively activated via particular enzymes present inhypoxic tumor cells. This group of prodrugs include: quinones,N-oxides and nitroaromatics.Key words: prodrugs, anticancer drugs, hypoxia activatedprodrugs, NADPH:CYP450 reductaseWprowadzenieKomórki guzów litych często charakteryzuje znaczneniedotlenienie. Wynika ono ze źle wykształconego, nieefektywnegosystemu naczyniowego, który nie jest w stanie zapewnićkomórkom nowotworowym odpowiedniej podażytlenu i składników odżywczych. Niedotlenienie guza stanowiistotny problem z punktu widzenia efektywności terapiii przyszłych rokowań. Stanowi sygnał do ekspresji genówzaangażowanych w progresję procesu nowotworowego(m. in. nasilenie procesu angiogenezy), zwiększa częstośćmutacji i ryzyko przerzutów. Niedotlenione komórki guzówlitych są oporne na radioterapię, ponieważ jej efekt cytotoksycznyzależy od obecności tlenu w komórce. Klasycznachemioterapia także jest często nieskuteczna. Czynnikamiodpowiedzialnymi za oporność na chemioterapię są m. in.zbyt duża odległość od naczyń krwionośnych, które dostarczająleki (co uniemożliwia osiągnięcie stężenia terapeutycznegow miejscu działania), obniżone tempo podziałówkomórkowych (wynikające po części z niedostatecznej po-daży składników odżywczych), utrata wrażliwości na apoptozęaktywowaną białkiem p53 oraz up-regulacja genów zaangażowanychw powstawanie oporności wielolekowej np.genów kodujących glikoproteinę P [1-4].Jednak hipoksja stanowi także unikalna cechę komórekguzów litych, odróżniającą je od większości komórekzdrowych i może stanowić dogodny punkt uchwytu terapiicelowanej, po raz pierwszy zaproponowanej na początku lat70-tych przez zespół prof. Sartorell’ego. Większość prolekówaktywowanych hipoksją podlega bioredukcyjnej aktywacjiza pośrednictwem specyficznych enzymów obecnychw niedotlenionych komórkach. Uwolnienie aktywnego lekumoże nastąpić także pod wpływem niskiego pH, będącegoefektem gromadzenia się produktów przemiany materiiw obrębie guza [1-4].Warunkiem wybiórczego działania proleków na komórkihipoksyczne jest ich wysokie powinowactwo do reduktazkatalizujących przeniesienie jednego elektronu. Mechanizmselektywnej aktywacji obejmuje kilka etapów: w pierwszym(odwracalnym) (rys. 1A) następuje przeniesienie jednego15

Farm Przegl Nauk, 2010, 7Ryc. 1. Mechanizm selektywnej bioredukcyjnej aktywacji proleków.elektronu i powstaje produkt przejściowy, który w warunkachtlenowych, panujących w zdrowych komórkach, jestprzekształcany z powrotem do nieaktywnego proleku, zaśw warunkach niedoboru tlenu następują dalsze etapy jegoredukcji do cytotoksycznego metabolitu (rys. 1B). Jeśliprolek ma także powinowactwo do reduktaz, takich jak DTdiaforaza(DTD), katalizujących jednoczesne przeniesieniedwóch elektronów, wówczas jego selektywność wobec komórekhipoksycznych zostaje znacznie upośledzona, bowiemnie jest możliwa reoksydacja produktu przejściowegow warunkach tlenowych do nieaktywnego proleku [1-5].Z punktu widzenia budowy chemicznej, w obrębie prolekówaktywowanych hipoksją wyróżnia się pochodne chinonu,związki o strukturze N-tlenku, oraz związki nitroaromatyczne.Chinony16Pierwszym lekiem z tej grupy, stosowanym w terapiinowotworów, była mitomycyna C (1) (rys. 2). Początkowowykorzystywano jej właściwości alkilujące. Dalsze badaniawykazały, że niedotlenienie komórek przyspiesza jej aktywację,która odbywa się pod wpływem reduktazy NADPH/cytochrom P450 (CPR). Powstający anionorodnik semichinonuposiada zdolność tworzenia wiązań kowalencyjnychz DNA, co skutkuje działaniem cytotoksycznym wobec komóreknowotworowych. Warto zauważyć, że rodnik semichinonuw warunkach tlenowych ulega reoksydacji do chinonu,co powinno czynić go selektywnym wobec komórekhipoksycznych. Niestety związek ten ulega również bioredukcyjnejaktywacji przez reduktazy aktywne w warunkachtlenowych np. DT-diaforazę (DTD), co negatywnie wpływana selektywność tego związku wobec komórek hipoksycznych[6, 7].Dalsze poszukiwania związków selektywnych wobeckomórek hipoksycznych doprowadziły do otrzymania porfiromycyny(2) (rys. 2), etylowanej pochodnej mitomycynyC, która w badaniach przedklinicznych wykazywała znaczniezwiększoną cytotoksyczność wobec komórek hipoksycznych,wynikającą ze zmniejszonego powinowactwa wobecDTD, preferencyjnej aktywacji przez reduktazy przenoszącejeden elektron oraz zwiększonego wychwytu przez komórkihipoksyczne. Badania kliniczne mające na celu porównanieaktywności porfiromycyny i mitomycyny C, w połączeniuze standardową radioterapią, nie wykazały korzyści ze stosowaniaporfiomycyny, co spowodowało zaniechanie dalszychbadań nad jej wykorzystaniem w terapii nowotworów [6].Innym przedstawicielem tej grupy związków jest apazichinon(EO9) (3) (rys. 2), pochodna indolochinonu,aktywowana w warunkach hipoksji pod wpływemCPR. Związek ten jest także substratem dla DTD,co może mieć negatywny wpływ na selektywnośćEO9. Mechanizm działania apazichinonu polegana uszkadzaniu struktury DNA przez powstającyw wyniku redukcji rodnik EO9. Badania klinicznez udziałem tego związku wykazały jego niską toksycznośćwobec komórek szpiku kostnego, krótkiokres półtrwania i niską zdolność penetracji w głąbguza, co niekorzystnie odbiło się na jego aktywnościprzeciwnowotworowej. Ze względu na niekorzystnyprofil farmakokinetyczny tej substancji, efekt terapeutycznyzostał osiągnięty dopiero w chwili jego bezpośredniego podaniado komórek nowotworowych [6-9].Bioredukcyjne właściwości chinonów zostały także użytew konstruowaniu cząsteczek uwalniających, w wyniku redukcji,związki alkilujące. Przykładem może być tutaj prolek(4) (rys. 2), który w wyniku laktonizacji zredukowanejformy hydrochinonu uwalnia cząsteczkę melfalanu [3].Związki o strukturze N-tlenkuJednym z przedstawicieli tej grupy związków jest antrachinonAQ4N (banoksantron) (5) (rys. 3), zawierającydwa alifatyczne ugrupowania N-tlenkowe. Związek ten jestw warunkach hipoksji redukowany do metabolitu AQ4, analogumitoksantronu, o wysokim powinowactwie do DNAi zdolność inhibicji aktywności topoizomerazy II. Związekulega bioaktywacji głównie pod wpływem enzymów cytochromuP450 m. in. CYP1A1, CYP2B6 i CYP3A4 [3, 6,11, 10].Banoksantron badany in vivo, jako pojedynczy lek niewywierał znaczącego efektu przeciwnowotworowego. Wywołaniew komórkach efektu hipoksji znacznie nasiliło jegoaktywność cytotoksyczną [11]. Zastosowanie terapii łączonejz naświetlaniem lub innymi chemioterapeutykami, takimijak: cyklofosfamid, cisplatyna, czy tiotepa także powodowałoznaczną inhibicję wzrostu komórek nowotworowych [6,Ryc. 2. Pochodne chinonu jako proleki.

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Ryc. 3. Proleki o strukturze N-tlenku.7, 11, 12]. Badania kliniczne wykazały niską toksycznośćsystemową tego związku (wynikającą z braku aktywnościwobec komórek normotlenowych) oraz korzystne właściwościfarmakokinetyczne [13]. Cenną cechą tego prolekuokazała się zdolność przenikania przez barierę krew-mózg,co pozwala wykorzystać ten związek w terapii celowanejnowotworów mózgu [6, 7].Przykładem N-tlenku heteroaromatycznego jest tirapazamina(6) (rys. 3). Od lat 80-tych stanowi związek wiodącyw grupie proleków aktywowanych hipoksją. Wykazujewysoką selektywność wobec komórek o niskim stężeniutlenu. W pierwszej fazie aktywacji ulega jednoelektrodowejredukcji pod wpływem CPR do rodnika tirapazaminy, któryw warunkach tlenowych ulega reoksydacji do nietoksycznejpierwotnej formy proleku, zaś w warunkach niedoboru tlenuulega dalszym przemianom, w wyniku których powstająrodniki uszkadzające DNA. TPZ ulega aktywacji w warunkachznacznie słabszego niedotlenienia, co czyni ją aktywnącytotoksycznie wobec komórek, w których poziom hipoksjijest niewystarczający do bioaktywacji innych związkówbioredukcyjnych, ale powoduje ich oporność na radioterapię[6]. Jednakże krótki okres półtrwania rodnika, a także jegoniska zdolność dyfuzji do otaczających komórek hamujepowstawanie „bystander effect” [2, 6, 7] i czyni komórkianoksyczne opornymi na TPZ (TPZ nie dociera do nich, ponieważjest szybciej aktywowana w komórkach o wyższymstężeniu tlenu) [6, 14].TPZ uwrażliwia komórki nowotworowe na radioterapię[15], a także nasila działanie przeciwnowotworowe innychchemioterapeutyków, takich jak: cisplatyna, melfalan, cyklofosfamid,karmustyna, bleomycyna, doksorubicyna, taksol,karboplatyna, paklitaksel i 5-fluorocytozyna [16-19].Badania kliniczne z udziałem TPZ są prowadzone od 1994roku. Najczęściej notowanym działaniem niepożądanymbyła neutropenia. Niehematologiczne objawy toksycznościTPZ obejmowały: nudności, wymioty, biegunkę i wysypkę[6, 7]. Fazy II i III badań klinicznych obejmowały badaniecytotoksyczności TPZ wobec szerokiej gamy nowotworóww skojarzeniu z innymi chemioterapeutykami (cisplatyną,winorelbiną, 5-fluorocytozyną, gemcytabiną, paklitakselem,karboplatyną) i radioterapią. Dla przykładu badania III fazyTPZ w kombinacji z cisplatyną, na pacjentach z zaawansowanymniedrobnokomórkowym rakiem płuc, wykazałyznacznie silniejszą odpowiedź komórek nowotworowych naleczenie i co istotne, zwiększało szansę pacjentów na przeżycie[20].Tirapazamina jest także wykorzystywana jako prolekw konstruowaniu strategii GDEPT regulowanej hipoksją.Koncepcja zakłada dostarczenie, za pośrednictwem wektoraadenowirusowego, enzymu kodującego reduktazę P450,którego ekspresja jest regulowana stężeniem czynnikawzbudzanego hipoksją HIF-1. (HIF-1 to czynnik transkrypcyjny,który w warunkach hipoksji indukuje transkrypcjęszeregu genów, przez co reguluje różne procesy biologiczne,odpowiedzialne za przystosowanie się komórki dowarunków obniżonego stężenia tlenu [21]) Tym samym whipoksycznych komórkach nowotworowych, za pośrednictwemHIF-1, następuje nasilona ekspresja genu kodującegoenzym, co w konsekwencji prowadzi do znacznego wzmożeniabioredukcyjnej aktywacji proleku (TPZ) i powstawaniatoksycznych metabolitów [22].Związki nitroaromatycznePochodne 2-nitroimidazolu są grupą związków o selektywnymwobec komórek hipoksycznych mechanizmie działania.W warunkach niedotlenienia ulegają nieodwracalnej,wieloetapowej bioredukcji do aktywnych produktów,które mają zdolność niszczenia komórek nowotworowych.Pierwszy etap tego procesu (jednoelektronowa redukcja)jest w warunkach normotlenowych odwracalny, co czyni tęgrupę leków wybiórczymi wobec komórek hipoksycznych[6, 7].Pierwszym związkiem z tej grupy był misonidazol (7)(rys 4), który miał zdolność uwrażliwiania tkanki nowotworowejna radioterapię. Wykazano, że nasilał on działaniecytotoksyczne promieniowania nawet wówczas, gdypodawany był po naświetlaniu komórek nowotworowych,co wykluczało go, jako związek uwrażliwiający na radioterapięi wskazywało na inny mechanizm działania związanyz hipoksją komórek nowotworowych. Dalsze badaniaw obrębie tej grupy związków doprowadziły do otrzymaniaRSU1069 (8) (rys. 4), dwufunkcyjnego związku alkilującegoaktywowanego przez reduktazę P450R, o właściwościachuwrażliwiających komórki nowotworowe naradioterapię, który został wycofany z dalszych badań zewzględu na wysoką cytotoksyczność wobec układu pokarmowego[6, 7].Ciekawą grupą związków o właściwościach bioredukcyjnychsą pochodne iperytu dinitrobenzamidu. Przedstawicielemtej grupy związków jest CB1954, 5-(1-azyrydynylo)-2,4-dinitrobenzamid (9) (rys. 5), wykorzystywany jakoprolek w strategii VDEPT. Związek ten, w przeciwieństwiedo gancyklowiru i 5-fluorouracylu, jest aktywny wobeckomórek niedzielących się. Pod wpływem nitroreduktazyRyc. 4. Wybrane pochodne 2-nitroimidazolu.17

Farm Przegl Nauk, 2010, 7Ryc. 5. Szlak przemian CB1954.E. coli (NTR), kodowanej przez gen nfsB, dostarczany dokomórek nowotworowych za pośrednictwem wektora retrowirusowegolub adenowirusowego, ulega redukcji do pochodnejhydroksyloaminy (10) (rys. 5), z której w wynikudalszych przemian metabolicznych powstaje dwufunkcyjnyczynnik alkilujący 5-(1-azyrydynylo)-4-N-acetoksy-2-nitrobenzamid (11) (rys. 5), powodujący letalne uszkodzeniaDNA komórek nowotworowych. Istotną cechą metabolitujest jego zdolność dyfuzji do komórek sąsiadujących,w których nie nastąpiła ekspresja genu kodującego NTR(bystander effect). Nie mniej istotny jest fakt, że nie istniejeludzki homolog nitroreduktazy bakteryjnej, zaś CB1954 niejest dobrym substratem dla ludzkiej DT-diaforazy, co czyniten związek wybiórczym wobec komórek wykazującychekspresję genu kodującego nitroreduktazę [6, 7, 23, 24].PodsumowanieOstatnie lata przyniosły znaczący postęp prac nad prolekamiaktywowanymi hipoksją. Nieustannie prowadzi siębadania mające na celu dokładne poznanie procesów zachodzącychw niedotlenionej komórce nowotworowej, któresłużą zwiększaniu siły i wybiórczości działania już istniejącychproleków, a także stanowią podstawę projektowanianowych o ulepszonym profilu terapeutycznym. Najbardziejobiecującym związkiem tej grupy wydaje się tirapazamina,która podlega obecnie intensywnym badaniom klinicznym.Piśmiennictwo1.2.3.4.5.6.7.Brown JM, Wilson WR. Exploiting Tumour Hypoxia InCancer Treatment. Nature Rev 2004; 4: 4437-4447.Denny WA. The role of hypoxia-activated prodrugs incancer therapy. Lancet Oncol 2000; 1: 25-29.Avendano C, Menendez CJ. Medicinal Chemistry ofAnticancer Drugs. Elsevier B.V. Oxford 2008.Melillo G. Targeting hypoxia cell signaling for cancertherapy. Cancer Met Rev 2007; 26: 341–352.Wang B, Siahaan T, Soltero R. Drug delivery: Principlesand Applications. John Wiley & Sons Inc. Hoboken,New Jersey 2005.McKeown SR, Cowen R L, Williams KJ. BioreductiveDrugs: from Concept to Clinic. Clin Oncol 2007; 19:427-442.Błaszczak-Świątkiewicz K, Mikiciuk-Olasik E. Rolahipoksji w postępach w diagnostyce i terapii chorób nowotworowych.Wiad Chem 2008; 62: 1066-1089.8. Liia D. i wsp. Stability experiments in human urine withEO9 (apaziquone): A novel anticancer agent for the intravesicaltreatment of bladder cancer. J Pharm BiomedAnal 2007; 43: 285–292.9. Schellens JHM i wsp. Phase I and Pharmacologic Studyof the Novel Indoloquinone Bioreductive Alkylating CytotoxicDrug E09. J Natl Cancer Inst 1994; 86: 906-912.10. Loadman PM i wsp. A Preclinical Pharmacokinetic Studyof The Bioreductive Drug AQ4N. Drug Metab Disp2001; 29: 422–426.11. Patterson LH, McKeown SR. AQ4N: a new approachto hypoxia activated cancer chemotherapy. Br J Cancer2000; 83: 1589–1593.12. Patterson LH i wsp. Enhancement of chemotherapy andradiotherapy of murine tumours by AQ4N, a bioreductivelyactivated antitumor agent. Br J Cancer 2000; 82:1984–1990.13. Lalani AS i wsp. Selective Tumor Targeting by the HypoxiaActivated Prodrug AQ4N Blocks Tumor Growthand Metastasis in Preclinical Models of Pancreatic Cancer.Clin Cancer Res 2007; 13:2216-2225.14.15.16.17.18.19.20.Hicks KO i wsp. Multicellular Resistance to Tirapazamineis Due to Restricted Extravascular Transport:A Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Study in HT29Multicellular Layer Cultures. Cancer Res 2003; 63:5970–5977.Sum BG i wsp. Tirapazamine-induced Cytotoxicity andDNA Damage in Transplanted Tumors: Relationship toTumor Hypoxia. Cancer Res 1997; 57: 2922-2928.Holden SA i wsp. Enhancement of Alkylating AgentActivity by SR-4233 in the FSaIIC Muraine Fibrosarcoma.J Natl Cancer Inst 1992; 84: 187–193.Dorie MJ, Brown JM. Tumor-specific, schedule-depen-dent interaction between Tirapazamine (SR 4233) andCisplatin. Cancer Res 1993; 53: 4633-4636.Langmuir VK. i wsp. Synergistic Interaction betweenTirapazamine and Cyclophosphamide in Human BreastCancer Xenografts Cancer Res 1994; 54: 2845-2847.Emmenegger U. Low-Dose Metronomic Daily Cyclo-phosphamide and Weekly Tirapazamine: A Well-ToleratedCombination Regimen with Enhanced EfficacyThat Exploits Tumor Hypoxia. Cancer Res 2006; 66,1664-1674.Talbot D. Tirapazamine Plus Cisplatin Versus Cisplatinin Advanced Non–Small-Cell Lung Cancer: A Reportof the International CATAPULT I Study Group. J ClinOncol 2000; 18: 1351-1359.18

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507321. Mantur M, Wojszel J. Cząsteczki adhezyjne oraz ichudział w procesie zapalnym i nowotworowym. PolMerk Lek 2008; 24: 177-180.22. Md.Taufiq-Ur-Rahman Tirapazamine and gene-directedenzyme prodrug therapy of cancer. Indian J Pharmacol2004; 36: 332.23. McNeish IA i wsp. Gene directed enzyme prodrug therapyfor cancer. Adv Drug Deliv Rev 1997; 26: 173–184.24. Chung-Faye G. Virus-directed, Enzyme Prodrug Therapywith Nitroimidazole Reductase: A Phase I and PharmacokineticStudy of its Prodrug, CB1954. Clin CancerRes. 2001; 7: 2662-2668.data otrzymania pracy: 15.02.2010r.data akceptacji do druku: 9.04.2010r.Adres do korespondencji:Andrzej StańczakZakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego UM w Łodzi,ul. Muszyńskiego 1, 91-151 Łódźtel. 0 42 677 92 52e-mail: andrzej.stanczak@umed.lodz.pl19

Farm Przegl Nauk, 2010,7, 20-22Metylacja DNA – główny znacznik epigenetyczny komórkiDNA Methylation – a major epigenetic marker of the cellOlga Smagacz, Aleksandra Moździerz, Anna Rzepecka-Stojko, Jerzy Stojko,Małgorzata Juszko-Piekut, Magdalena Wyszyńska, Justyna KaźmierczakZakład Higieny, Bioanalizy i Badania ŚrodowiskaWydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachStreszczenieProcesy epigenetyczne wpływają na ekspresję genów nienaruszając sekwencji DNA. Do podstawowych modyfikacjiepigenetycznych, obok zmian struktury chromatyny,zaliczana jest metylacja DNA. Metylacja DNA jest procesemprzyłączania grup metylowych do atomu węglacytozyny, w obrębie dinukleotydu CpG. Produktem tejreakcji jest 5-metylocytozyna, nazywana czasem piątympodstawowym składnikiem DNA. W ustalaniu wzoru metylacjiudział biorą enzymy z grupy metylotransferaz. Wwarunkach fizjologicznych 70-80% dinukleotydów CpGzawiera grupę metylową. Istnieją również regiony, którena wszystkich etapach rozwoju i we wszystkich typachtkanek są chronione przed metylacją - wyspy CpG. Konsekwencjązmian informacji epigenetycznej są zaburzeniaw transkrypcji i syntezie białka, będące czynnikami mającymiudział w patogenezie wielu chorób. Defekty metylacjiDNA są zmianami odwracalnymi. Można zatem poprzezcelowaną aktywację bądź inhibicję regulować poziom ekspresjigenów. Zmapowanie miejsc metylacji DNA i poznaniemechanizmów współtowarzyszących temu procesowidaje nadzieję na znalezienie technik umożliwiających leczeniechorób nowotworowych, schorzeń o podłożu alergicznym,immunologicznym czy - jak wskazują najnowszebadania - być może także tych, o podłożu genetycznym.Słowa kluczowe: epigenetyka, metylacja DNA,5-metylocytozyna, wyspy CpGAbstractEpigenetic processes influence gene expression withoutaltering DNA sequence. DNA methylation, togetherwith chromatin remodelling, forms the basis for epigeneticmodification. DNA methylation denotes addition ofmethyl groups to the cytosine carbon atom within CpGdinucleotide. It results in formation of 5-Methylcytosine,also referred to as 5 th basic DNA element. Enzymes ofmethyltransferase group contribute to methylation patternsset-up. In physiological environment 70-80% ofCpG dinucleotide have methyl groups. There are also regions,so called CpG Islands, which are protected frommethylation in all types of tissues. Alterations in epigeneticinformation result in abnormalities in transcriptionand protein synthesis, which contributes to pathogenesisin a variety of diseases.DNA methylation defects are reversible changes. Therefore,by intentional activation or inhibition, it is possibleto regulate gene expression. Mapping of DNA methylationregions and identifying the mechanism accompanyingthis process raise hopes for finding new treatmenttechniques for cancerous diseases, allergy and immunityrelateddiseases and possibly, as recent studies has shown,for genetic disorders.Key words: epigenetics, DNA methylation, 5-methylcytosine,CpG islandsMetylacja DNA obok przebudowy struktury chromatyny,indukowanej zmianami w obrębie białek histonowych,zaliczana jest do podstawowych mechanizmów epigenetycznych.Owe mechanizmy umożliwiają dziedziczenie, mimoiż nie towarzyszą im zmiany w układzie nukleotydów DNA.W odróżnieniu od zmian o podłożu genetycznym, epigenezacharakteryzuje się odwracalnością [1]. Obecnie trwająbadania, mające na celu wykorzystanie tej właściwości,a tym samym dające nadzieje na odkrycie nowych metod terapeutycznych.Prawdopodobnie miałyby one zastosowaniew leczeniu chorób alergicznych, immunologicznych, metabolicznych,a przede wszystkim chorób nowotworowych[1-3].Pierwszym zjawiskiem o podłożu epigenetycznym, ukazującymzłożoność tego procesu, było odkrycie H. J. Műlleraz 1930 roku. Obiektem badań była linia Drosophila,której oczy zabarwione były w sposób mozaikowy. Odpowiedzialnyza tę cechę, okazał się gen, który co pewien czasulegał spontanicznej inaktywacji, ale co istotne, bez zmianw sekwencji DNA. Ponadto, jeśli ów proces raz zaistniał,gen pigmentu pozostał nieaktywny we wszystkich komórkachpotomnych [4].Proces metylacji DNAJedną z cech wyróżniających eukariotyczne DNA, jeststosunkowo wysoka zawartość 5-metylocytozyny, produktureakcji metylacji kwasu deoksyrybonukleinowego.20

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50735-metylocytozyna jest nazywana piątym składnikiemDNA, obok adeniny, guaniny, cytozyny oraz tyminy [5].Grupa metylowa, składająca się z węgla, trzech atomówwodoru oraz jednego elektronu, ma silne powinowactwo dozasady pirymidynowej DNA – cytozyny. Specyficzne enzymy,należące do metylotransferaz katalizują reakcję przyłączeniagrupy metylowej do węgla w pozycji 5 pierścieniacytozyny w obrębie dinukleotydu CpG. Enzymami tymi są:DNMT1, DNMT3a oraz DNMT3b (DNMT- DNA Methyl-Transferase) [3, 6-8]. Dwa ostatnie ustalają wzór metylacjiw czasie embriogenezy [3]. Donorem grup metylowychw powyższej reakcji jest S-adenozylometionina (SAM) [7].W ustalaniu wzoru metylacji, biorą udział również demetylazy,enzymy odłączające potrzebne grupy ze składnikówpokarmowych w nie bogatych [3, 7, 9].Zmetylowana cytozyna tworząca regularne wiązania wodorowetypu Watsona-Cricka, rozproszona jest niemal w całymgenomie [1, 3]. Istnieją jednak sekwencje DNA, bogatew dinukleotydy CpG, które nie ulegają metylacji. Miejscatakie, zwane wyspami CpG, zlokalizowane są w regionachpromotorowych genów mających znaczenie dla podstawowychfunkcji komórki. W genomie człowieka stwierdzonookoło 29000 wysp CpG (1-2% całego genomu) [1, 3, 7, 10,11]. Prawidłowe komórki posiadają mechanizmy chroniącewyspy przed metylacją. Działają one na wszystkich etapachrozwoju i we wszystkich typach komórek. Jeżeli mechanizmytakie ulegną zaburzeniu, wówczas następują istotnezmiany w profilu metylacji DNA.Zmiany stopnia metylacji DNACzynniki mutagenne, a także stres, głównie oksydacyjnymogą doprowadzić do dramatycznych w skutkach transformacji,tj. zwiększenia bądź zmniejszenia stopnia metylacji[2, 5, 11]. Pierwsza zmiana, czyli hipermetylacja, dotyczyzazwyczaj metylacji wysp CpG, które w zdrowym genomienie ulegają temu procesowi. Konsekwencją jest „wyciszenie”funkcji genów [1, 3, 7]. W przypadku nowotworówzjawisku temu ulegają geny supresorowe, czyli geny, którychprawidłowe produkty ograniczają tempo podziałów komórkowych[1, 3]. Ponadto w wyniku nadmiernej metylacjiwysp CpG, dochodzić może do wystąpienia mutacji punktowychCG do TG. 5-metylocytozyna wykazuje bowiemwiększą skłonność do spontanicznej deaminacji w tyminę,aniżeli cytozyna w formie niezmetylowanej [3, 5, 11].Z kolei w przypadku hipometylacji obserwujemy globalneobniżenie metylacji regionów normalnie podlegających tejreakcji. Ten rodzaj zmian epigenetycznych skojarzony bywaz demetylacją regionów promotorowych onkogenów [1, 3].Wyniki przeprowadzonych dotychczas badań wykazały korelacjęmiędzy stopniem metylacji a występowaniem nowotworówmózgu. Ilość 5-metylocytozyny jest odwrotnie proporcjonalnado stopnia złośliwości guzów mózgu [5].Rola metylacji DNAZmiany o podłożu epigenetycznym zachodzą już u organizmówprokariotycznych, przy czym dotyczą trzech typówmetylacji. Produktami tego procesu, obok 5-metylocytozynysą N-metylocytozyna oraz N-metyloadenina [12]. Na podstawieidentyfikacji miejsc przyłączania grup metylowychw genomie bakterii, stwierdzono, że metylacja uczestniczyw fundamentalnych procesach komórkowych. Bierze udziałw kierowaniu cyklem komórkowym oraz replikacji DNA,reguluje poziom ekspresji genów, wreszcie jest czynnikiemumożliwiającym odróżnienie własnego DNA od obcego[12, 13].Szacuje się, że u ssaków około 5% wszystkich cytozynjest trwale zmetylowanych. U roślin poziom tego procesujest znacznie wyższy i sięga nawet 30%. Z kolei u bezkręgowcówmetylacja obejmuje znacznie mniejszą część chromatyny,a u niektórych z nich jak u Drosophila melanogasternie zachodzi w ogóle [6, 13].Zdolność wyciszania bądź pobudzania poszczególnychgenów, jest szczególnie istotna w okresie rozwoju embrionalnegoorganizmu. A zaznaczyć należy, że we wczesnychfazach rozwojowych, genom przechodzi zmiany profilu metylacji.W zygocie niemal wszystkie niegenetyczne zapisy sąusuwane. Dopiero w piątym miesiącu płód generuje nowykod epigenetyczny, w tym już ostateczny wzór metylacjiDNA [4, 7, 8]. Jednakże w trakcie odtwarzania epigenomuzdarzają się błędy. Dowodem na to może być brak współwystępowaniachorób u bliźniąt jednojajowych. Mimo iż bliźniętamają identyczną sekwencję DNA, to często obserwujesię ujawnienie choroby o podłożu genetycznym (np. chorobaafektywna dwubiegunowa, schizofrenia) tylko u jednegoz nich. Do zmian w zapisie epigenomu dochodzi takżew okresie rozwoju i starzenia się organizmu [4, 8].Dowodem przemawiającym o wadze procesów epigenetycznychsą także wyniki badań, przeprowadzonych na embrionalnychkomórkach macierzystych, którym wyłączonojeden z enzymów odpowiedzialnych za przyłączanie grupymetylowej do cytozyny. Spowodowało to uaktywnienie sięwielu transpozonów, doprowadzając tym samym do dziesięciokrotnegowzrostu mutacji w badanych komórkach [8, 9].Pożywienie a zmiany epigenetyczneTę silną zależność potwierdziły badania przeprowadzonena myszach agouti (o brązowozłotym umaszczeniu). Jednejz grup ciężarnych myszy podawano pokarm standardowy –około 60% ich potomstwa miało jasną sierść. Druga grupakarmiona była paszą bogatą w kobalaminę, kwas foliowyi inne źródła grup metylowych, co spowodowało nasilenieprocesu metylacji DNA. To wystarczyło, aby młode myszymiały ciemnobrązowe futro i nie ujawniały predyspozycji dootyłości, cukrzycy i raka. Zatem kobalamina, kwas foliowy,cholina czy betaina poprzez dostarczenie grup metylowych,zarówno do syntezy DNA, jak i zachowania już ustalonegowzoru metylacji, pełnią fundamentalną rolę w utrzymaniustabilności tej struktury. Brak w diecie kwasu foliowego powodujeakumulację uracylu, który wbudowując się w miejscetyminy, zaburza prawidłową sekwencje i w konsekwencjiprowadzić może nawet do złamania chromosomu. Wrazz kobalaminą odpowiada on również za prawidłową syntezętyminy, a także przemianę homocysteiny w metioninę. Skutkiemnagromadzenia się homocysteiny jest wzrost ryzykawystąpienia chorób naczyniowych i nieprawidłowości rozwojowychoraz neurologicznych [2, 9]. Wykazano równieżciekawą zależność pomiędzy produktami zawierającymi21

Farm Przegl Nauk, 2010, 7znaczne ilości flawonoidów (zielona herbata, owoce granatu),a ich farmakologicznym działaniem w przypadku choróbcywilizacyjnych. Ma to związek z antyoksydacyjnymdziałaniem. Niszcząc reaktywne formy tlenu, nie dopuszczajądo zmian we wzorze epigenetycznym [9].Przyszłość modyfikacji epigenomuWiele czynników zewnętrznych, jak środowisko, rodzajpokarmu, styl życia, wpływa na zmiany stopnia metylacjiDNA, co w konsekwencji prowadzi do rozwoju licznychchorób. Już sama sytuacja głodu powodować może hipermetylację.I przeciwnie, u otyłych pacjentów zachodzi generalnahipometylacja DNA. Kolejnym przykładem jest zaobserwowanyspadek metylacji u chorych na arteriosklerozęczy insulino-oporną cukrzycę typu II [2].Wzór metylacji jest znakomitym markerem dokompleksowej diagnostyki wielu chorób. Za pomocą5-metylocytozyny możemy aktywować bądź inhibowaćekspresję odpowiednich genów [1-3]. Metylowany DNAbudzi również spore zainteresowanie z diagnostycznegopunktu widzenia – jest molekułą stabilną i łatwo wykrywanązarówno w osoczu, jak i plwocinie [2, 3]. Badania dowiodły,że poziom tego epigenetycznego znacznika jest bardzo podobnyw DNA tkanki zmienionej jak i krwi, dzięki czemumonitorowanie procesów chorobowych stanie się znacznieszybsze i łatwiejsze [11].Epigenetyczna „terapia” skuteczna jest nie tylko u rozwijającychsię organizmów, ale i w późniejszych etapachżycia. Przyczyną rozwoju pewnych typów raka jelita grubegoczy płuc, nie są jak przypuszczano zmutowane geny(niektóre komórki nowotworowe mają przecież prawidłowykod genetyczny), ale zaburzenia stopnia metylacji. Odkrycieto jest więc tym cenniejsze, że metylacja w przeciwieństwiedo mutacji jest procesem odwracalnym [1, 3]. Pewnenadzieje wiąże się z wykorzystaniem substancji mającychzdolność znoszenia nieprawidłowej metylacji. Działanietakie wykazuje niestosowana w Polsce - decytabina, a takżeprokaina - powszechnie stosowana w anestezjologii.Decytabina jest analogiem cytozyny, która pomimo wysokiejtoksyczności, u niektórych pacjentów z zaawansowanąbiałaczką, powoduje śmierć 99,9% komórek rakowych[6, 7, 14].Piśmiennictwo1. Jabłońska J, Jesionek-Kupnicka D. Zmiany epigenetycznew nowotworach. Onkologia Polska 2004; 7, 4:181-185.2. Szpecht-Potocka A. Zdrowy i chory „gorset” DNA,czyli medyczne aspekty epigenetyki. Kosmos - problemynauk biologicznych 2004; 53: 281-293.3. Rahden-Staroń I, Grosicka E. Epigenetyczne mechanizmykancerogenezy. Medycyna Dydaktyka Wychowanie2006; 38: 20-26.4. Wierzbicki A. Dziedziczenie epigenetyczne. Kosmos -problemy nauk biologicznych 2004; 3-4: 271-280.5. Barciszewska A i wsp. Wpływ przechowywania tkaneknowotworowych na zawartość 5-metylocytozyny wDNA guzów mózgu. Neuroskop 2006; 8: 160-162.6. Kieć-Wilk B. Rola metylacji DNA w etiopatogenezie choróbukładu krążenia. Kardiologia Polska 2010; 68: 202-207.7. Issa J. Epidemiology and Molecular Genetics. LeukemiaConferences, October 30-31, 2000.8. Sanz L i wsp. Genome – wide DNA demethylation inmammals. Genome Biology 2010; 11: 110.9. Felsenfeld G, Groudine M. Controlling the Double Helix.Nature 2003; 421: 448-453.10. Issa J. Epigenetic Variation and Human Disease. J Nutr2002; 132(8): 2388-2392.11. Barciszewska A i wsp. Analiza całkowitej zawartości5-metylocytozyny w DNA z tkanek i krwi pacjentówpacjentów guzami mózgu. Neuroskop 2005; 7: 39-43.12. Bart A i wsp. Direct detection of methylation in genomicDNA. Nucl Ac Res 2005; 33: 1-6.13. Jones P, Takai D. The role of DNA methylation in mammalianepigenetics. Science 2001; 293: 1068-1070.14. Gil L, Komarnicki M. Nowe metody farmakoterapiiostrej białaczki szpikowej. Współczesna Onkologia2007; 11(4): 181-185.data otrzymania pracy: 04.03.2010 r.data akceptacji do druku: 16.06.2010 r.Adres do korespondencji:Aleksandra MoździerzZakład Higieny, Bioanalizy i Badania Środowiska SUM41-200 Sosnowiecul. Kasztanowa 3atel/fax: 32 269 98 25amozdzierz@sum.edu.pl22

Farm Przegl Nauk, 2010,7, 23-27copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Porost islandzki – związki czynne, aktywność biologicznaIceland Moss – active compounds, biological propertiesElżbieta Studzińska-Sroka, Wiesława BylkaKatedra i Zakład Farmakognozji Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w PoznaniuStreszczenieCetraria islandica, porost rozpowszechniony na obszarachpółnocnej Europy i Azji, był od dawna wykorzystywanyprzez zamieszkującą te tereny ludność. Doceniano nie tylkowalory lecznicze zbieranej plechy, lecz także jej wartośćjako pożywienia. Poniższa praca jest przeglądem wiadomościna temat porostu islandzkiego. Główne związkiwyizolowane z tarczownicy islandzkiej to: polisacharydy(lichenina i izolichenina), depsydony: kwas fumaroprotocetrarowy,cetrarowy oraz α-metyleno-γ-lakton: kwasprotolichesterynowy. Badania prowadzone w warunkachin vitro i in vivo wykazały: immunomodulujące, przeciwzapalne,przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, antyproliferacyjne,cytotoksyczne, antyoksydacyjne właściwościzwiązków obecnych w C. islandica. Stopień toksycznościsurowca oceniany w badaniach na zwierzętach, zależał odprocentowego udziału plechy porostu w ich diecie orazod jej przygotowania. W artykule przedstawiono informacjena temat preparatów z surowca wykorzystywanychw lecznictwie, bezpieczeństwa ich stosowania oraz możliwychdziałań niepożądanych. Przebadane w testach klinicznychpreparaty z porostu islandzkiego były dobrzetolerowane przez stosujących je pacjentów.Słowa kluczowe: Cetraria islandica, porost islandzki, badania,związki, aktywnośćAbstractCetraria islandica, lichen that occurs especially in areaof Nothern Europe and Asia was used by local inhabitantsfrom a very long time. Not only medical propertiesof thallus but also its nutritive values were appreciated.This work is a review of present-day knowledge concerningIceland moss. The main compounds isolated fromC. islandica are: polysaccharides (lichenin and isolichenin),depsidones: fumaroprotocetraric acid, cetraricacid and α-methylene-γ-lactone: protolichesterinic acid.Biological activity of compounds present in C. islandicawas confirmed. Studies carried out in vitro and in vivoshowed immunomodulating, antiinflammatory, antibacterial,antiviral, antiproliferative, cytotoxic and antioxidativeproperties of lichens active compounds. Iceland mosstoxicity was tested on animals and depended on preparationand percentage content of thallus in the diet. In the paperinformation concerning commercial products containing lichen,safety od their usage and possible adverse effects arepresented. Commercial products containing C. islandicaexamined in clinical tests were well tolerated by patients.Key words: Cetraria islandica, lichen islandicus, study,compounds, activityWstępTarczownica islandzka (Cetraria islandica (L.) Ach.)to porost z rodzaju płucnic (Cetraria) [1]. Występuje napółkuli północnej (Azja, Europa, Ameryka), aż po rejonyarktyczne. W Polsce C. islandica rośnie na niżu, w suchychlasach sosnowych, na skałach w górach oraz na innych ubogichsiedliskach. Jest to gatunek objęty w Polsce częściowąochroną prawną [1-4].Opis gatunkuCetraria islandica jest porostem naziemnym o krzaczkowatej,silnie rozgałęzionej plesze, której orzęsione brzegisą podwinięte do wewnątrz. Porost osiąga wysokość do 15cm. Górna powierzchnia plechy ma zielone lub brunatnezabarwienie, dolna jest białawo-brązowawa. Wygląd C. islandicamoże nieznacznie ulegać zmianie, w zależności odpanującej wilgotności. Sucha plecha jest sztywna i krucha,zwilżona staje się giętka i elastyczna [2, 4]. Surowiec leczniczy(porost islandzki) stanowią całe lub pocięte plechyC. islandica [4, 5].Dawniej…Porost islandzki, znany głównie w Skandynawii i Rosji,znajdował zastosowanie jako pokarm (zwłaszcza w okresachgłodu) oraz jako surowiec leczniczy. W celach spożywczychplechę C. islandica wykorzystywano do robienia mąki,z której pieczono chleb. Porost używano także do wyrobusłodyczy. Podczas II wojny światowej Rosjanie stosowalipłucnicę jako surowiec do przygotowywania gęstego syropuprzypominającego melasę. Aby uzyskać surowiec pozbawionygorzkiego smaku, związanego z obecnością kwasówporostowych, rozdrobnioną plechę C. islandica moczonoprzez 24 godziny w roztworze o odczynie alkalicznym [6].W medycynie ludowej C. islandica stosowana była:w leczeniu nieżytu górnych dróg oddechowych, jako środek23

Farm Przegl Nauk, 2010, 7szenie wydzielania soków trawiennych, co drażni uszkodzonąbłonę śluzową przewodu pokarmowego. Stosowaniepreparatów z C. islandica może zmniejszyć wchłanianieprzyjmowanych równocześnie leków [28]. Nie ma danychna temat stosowania preparatów z surowca w okresie ciążyi karmienia piersią, dlatego według ogólnie przyjętych zasad,nie zaleca się ich stosowania w tym okresie bez wskazańlekarza [8, 13].Porost islandzki w preparatachW polskich aptekach dostępne są preparaty zawierającewyciągi z porostu islandzkiego. Do bardziej znanych należyzaliczyć tabletki z serii „Isla” (Isla-Moos ® , Isla-Mint ® , Isla-Cassis ® ). Preparat można stosować profilaktycznie, w celuochrony śluzówki przed podrażnieniami spowodowanymiwpływem szkodliwych czynników zewnętrznych, takich jaksuche powietrze czy klimatyzacja. Ponadto ssanie tabletekz porostem islandzkim zaleca się osobom narażonym na silneobciążenie strun głosowych oraz w przypadku chrypki.Według zaleceń producenta nie ma przeciwwskazań do stosowaniapreparatu u kobiet w ciąży i kobiet karmiących orazu dzieci.Wśród innych preparatów do ssania można wymienić tabletkiAciv-Angidin, zawierające wyciąg z porostu islandzkiegooraz olejek z mięty pieprzowej. Według zaleceń producentamożna podawać go dzieciom już od 4 roku życia.Porost islandzki jest także zawarty w preparacie Pectosol.Specyfik zawiera płynne wyciągi etanolowe nie tylkoz porostu islandzkiego, lecz również z innych surowcówleczniczych (ziele tymianku, korzeń mydlnicy, ziele hyzopu).Krople Pectosol zaleca się w stanach zapalnych i nieżyciedróg oddechowych, suchym kaszlu, a także w utrudnionymodkrztuszaniu wydzieliny. Preparat nie powinienbyć zażywany razem z lekami blokującymi odruch kaszlu.W przypadku chorych cierpiących na astmę oskrzelowąPectosol można stosować tylko w wyjątkowych przypadkach.Zawartość alkoholu wyklucza podawanie preparatudzieciom do 6 roku życia.PodsumowanieWiele gatunków porostów było wykorzystywanychw medycynie ludowej, lecz tylko C. islandica jako najlepiejprzebadana, znalazła szersze zastosowanie w preparatachfarmaceutycznych. Porost islandzki zalecany jest główniew leczeniu schorzeń górnych dróg oddechowych orazw przypadku zaburzeń trawiennych. Dane piśmiennictwawskazują na znacznie większy potencjał leczniczy surowca,gdyż jak wynika z badań laboratoryjnych, tarczownicaislandzka i zawarte w niej związki posiadają aktywność:przeciwbakteryjną, przeciwwirusową, cytotoksyczną, antyproliferacyjną,antyoksydacyjną oraz immunomodulującą.Wykorzystanie w terapii wszystkich stwierdzonych w badaniachwłaściwości porostu islandzkiego, wymaga przeprowadzeniabadań klinicznych potwierdzających skutecznośći bezpieczeństwo stosowania surowca.Piśmiennictwo1. Fałtynowicz W. The lichens, lichenicolous and alliedfungi of Poland. An annotated checklist. Krytyczna listaporostów i grzybów naporostowych Polski. Szafer Instituteof Botany, Polish Academy of Sciences. Kraków2003, 72-75.2. Strzelecka H, Kowalski J. Encyklopedia zielarstwai ziołolecznictwa. PWN. Warszawa 2000, 556-557.3. Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 9 lipca2004 roku w sprawie gatunków dziko występującychgrzybów objętych ochroną (Dz. U. nr 168, poz. 1765).4. European Pharmacopoeia V, vol. 2. Council of Europe.Strasbourg 2004, 1787.5. Farmakopea Polska VIII, t. 2. Warszawa 2008,2162-2163.6. Blumenthal M (red.). Herbal Medicine. Expanded CommissionE Monographs. Integrative Medicine Communications.Newton 2000, 212-214.7. Huneck S, Yoshimura I. Identification of lichen substances.Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg 1996.8. Bradley P. British Herbal Compendium. A Handbookof scientific information on widely used plant drugs.BHMA British Herbal Medicine Association. Bournemouth2006, 223-227.9. Gudjónsdottir GA, Ingólfsdóttir K. Quantitative determinationof protolichesterinic and fumarprotocetraricacids in Cetraria islandica by high-performanceliquid chromatography. J Chromatogr A 1997;757: 303-306.10. Kohlmünzer S. Farmakognozja. Podręcznik dla studentówfarmacji. PZWL, Warszawa 2007, 94.11. Wichtl M (red.). Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals.A Handbook for Practice on a Scientific Basis.Medpharm Scientific Publishers. Stuttgart 2004, 338-341.12. Bylka W, Studzińska E. Aktywność immunostymulującaporostów. W: Współczesne zagrożenia zdrowotne.Red. Skopińska-Różewska E, Siwicki AK. EDYCJA.Olsztyn 2009, 231-342.13. ESCOP Monographs. The Scientific Foundation forHerbal Medicinal Products. Thieme. New York 2003,286-289.14. Olafsdóttir ES, Ingólfsdóttir K. Polysaccharides fromLichens: Structural Characteristics and Biological Activity.Planta Med 2001; 67: 199-208.15. Stepanenko LS i wsp. Quinones of Cetraria islandica.Phytochemstry 1997; 46: 565-568.16. Ingólfsdóttir K i wsp. Immunologically active polysaccharidesfrom Cetraria islandica. Planta Med 1994; 60:527-531.17. Olafsdóttir ES i wsp. Immunologically active (1→3)-(1→4)-α-D-glucan from Cetraria islandica. Phytomedicine1999a; 6: 33-39.18. Kumar KCS, Müller K. Lichen metabolites. 1. Inhibitoryaction against leukotriene B 4biosynthesis by a nonredoxmechanism. J Nat Prod 1999; 62: 817-820.19. Pengsuparp T i wsp. Mechanistic evaluation of newplant-derived compounds that inhibit HIV-1 reversetranscriptase. J Nat Prod 1995; 58: 1024-1031.26

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507320. Ingólfsdóttir K i wsp. In Vitro Susceptilibility of Helicobacterpylori to Protolichesterinic Acid from the LichenCetraria islandica. Antimicrob Agents Chemother1997; 41: 215-217.21. Ögmundsdóttir HM i wsp. Anti-proliferative effects oflichen-derived inhibitors of 5-lipoxygenase on malignantcell-lines and mitogen-stimulated lymphocytes. JPharm Pharmacol 1998; 50: 107-115.22. Müller K. Pharmaceutically relevant metabolites fromlichens. Appl Microbiol Biotechnol 2001; 56: 9-16.23. Studzińska E, Witkowska-Banaszczak E, Bylka W.Związki biologicznie aktywne porostów. Herba Pol2008; 54: 80-88.24. Gülçin I i wsp. Determination of antioxidant activity oflichen Cetraria islandica (L.) Ach. J Ethnopharmacol2002; 79: 325-329.25. Ingólfsdóttir K, Jurcic K, Wagner H. Immunomodulatingpolysaccharides from aqueous extracts of Icelandmoss. Phytomedicine 1998; 5: 333-339.26. Smyrga M, Saito H. Effect of selected thallophytic glucanson learning behaviour and short-term potentiation.Phytother Res 2000; 14: 153-155.27. Huovinen K, Jaakkola T. Lichen islandicus and the ChernobylFallout In Finland. Planta Med 1991; 57: A24.28. Wynn SG, Fougère B. Veterinary herbal medicine. MosbyElsevier. Missouri 2007, 201.data otrzymania pracy: 11.05.2010 r.data akceptacji do druku: 16.06.2010 r.Adres do korespondencji:prof. UM dr hab. Wiesława BylkaKatedra i Zakład FarmakognozjiUniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniuul. Święcickiego 4, 60-781 Poznańtel.: +48 61 854 67 09faks: +48 61 854 67 01e-mail: wieslawabylka@tlen.pl27

Farm Przegl Nauk, 2010,7, 28-32Porównanie skuteczności czynników silanizujących w analizieniesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MSComparison of the Efficiency of Silylating Agents in GC/MS Analysisof Non-steroidal Anti-inflammatory DrugsSławomir Kurkiewicz, Anna Dzierżęga-Lęcznar, Krystyna StępieńKatedra Analizy Instrumentalnej Wydziału Farmaceutycznegoz Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w KatowicachStreszczenieSilanizacja polarnych grup funkcyjnych jest jedną z metodderywatyzacyjnych, których przeprowadzenie jestniezbędne w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych(NLPZ) z zastosowaniem chromatografii gazowejsprzężonej ze spektrometrią mas. W pracy poddanoocenie możliwość wykorzystania różnych odczynnikówsilanizujących do oznaczania ibuprofenu, paracetamolu,flurbiprofenu, naproksenu, ketoprofenu i kwasu mefenamowegotechniką GC/MS. Pod wpływem BSA, BSTFA,HMDS i MSTFA otrzymano pochodne trimetylosililoweanalizowanych NLPZ, natomiast po zastosowaniu MTB-STFA - pochodne tert-butylodimetylosililowe. Identyfikacjitrimetylosililopochodnych dokonano na podstawieporównania ich widm mas z widmami bibliotecznymi,natomiast pochodne tert-butylodimetylosililowe zidentyfikowanopoprzez interpretację otrzymanych widm. Zoptymalizowanowarunki rozdziału chromatograficznegosililopochodnych NLPZ i wykonano krzywe kalibracyjnedo ich oznaczania. Z przeprowadzonych badań wynika, żewszystkie testowane odczynniki wprowadzające ugrupowaniatrimetylosililowe można z powodzeniem wykorzystać dooznaczania ibuprofenu, flurbiprofenu, naproksenu, kwasumefenamowego i ketoprofenu techniką GC/MS, przy czymich skuteczność derywatyzacyjna jest porównywalna, a uzyskanekrzywe wzorcowe charakteryzują się zbliżonymi parametrami.BSA i HMDS nie są polecane do derywatyzacjiparacetamolu. Oznaczanie testowanych leków w postaci pochodnychtert‐butylodimetylosililowych jest korzystniejszez uwagi na wyższą czułość metody oraz na znacznie większąodporność tych związków na ślady wody, ale wymagaznacznego wydłużenia czasu analizy GC/MS.AbstractSilylation of polar functional groups is one of the derivatizationmethods that are indispensable in the analysis ofnon-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) by GC/MS. In this study, the potential utility of various silylationreagents in GC/MS determination of ibuprofen, paracetamol,flurbiprofen, naproxen, ketoprofen and mefenamicacid was evaluated. Treatment with BSA, BSTFA, HMDSand MSTFA caused trimethylsilylation of the analyzedNSAIDs, while the use of MTBSTFA led to the formationof their tert-butyldimethylsilyl derivatives. Trimethylsilylderivatives of the drugs were identified by comparison oftheir mass spectra with the library standards. To establishthe identity of tert-butyldimethylsilyl derivatives, the interpretationof the recorded spectra was performed. Theconditions of GC separations of the obtained silyl derivativesof the studied NSAIDs were optimized, and the calibrationcurves were plotted. It was found that all the testedtrimethylsilylation reagents may be successfully appliedfor GC/MS determination of ibuprofen, flurbiprofen,naproxen, mefenamic acid and ketoprofen, with comparableefficiency, sensitivity and linearity. BSA and HMDSare not recommended for paracetamol derivatization. Determinationof the studied drugs as tert-butyldimethylsilylderivatives is more beneficial due to higher sensitivity ofthe method and much more resistance of the derivatives tothe hydrolytic effects of moisture, but significant extendingof GC/MS analysis is required.Key words: GC/MS, silylation, non-steroidal anti-inflammatorydrugs, NSAIDsSłowa kluczowe: GC/MS, silanizacja, niesteroidowe lekiprzeciwzapalne, NLPZWstępW celu oznaczenia niesteroidowych leków przeciwzapalnych(NLPZ) techniką chromatografii gazowej należy nadrodze derywatyzacji przeprowadzić je w mniej polarne pochodneposiadające wyższą lotność i stabilność termiczną.W procesie derywatyzacji następuje wymiana atomu wodoruzwiązanego z heteroatomem na taką grupę funkcyjną,która nie tworzy wiązań wodorowych [1]. W analizie NLPZnajczęściej do tego celu stosuje się metylację lub silanizację28

[2-5]. Obecnie na rynku mamy szeroki wybór odczynnikówderywatyzujących, które tworzą pochodne trimetylosililowe(TMS). Odczynniki te różnią się aktywnością względemróżnych grup funkcyjnych. W analizowanych lekach najłatwiejpodstawieniu ulega wodór w grupie hydroksylowej,a najtrudniej w grupie amidowej, dlatego zdolność derywatyzacjigrupy amidowej może być dowodem wysokiejreaktywności danego odczynnika silanizującego. Reakcjasilanizacji zachodzi z reguły łatwo i szybko, zazwyczaj niewymaga katalizatora, a nadmiar odczynnika derywatyzującegoz uwagi na wysoką lotność opuszcza kolumnę wraz zrozpuszczalnikiem na początku analizy [6]. Pochodne TMSsą wrażliwe na wilgoć: śladowe ilości wody powodują ichhydrolizę, co może w znaczny sposób obniżyć czułość metody.Ma to szczególne znaczenie w analizie prób pochodzeniabiologicznego, które zazwyczaj są izolowane z wodnegośrodowiska. W celu uniknięcia tej niedogodności można stosowaćderywatyzację do pochodnych tert‐butylodimetylosililowych(TBDMS). Chociaż pochodne te powstają trudniej,charakteryzują się znacznie większą odpornością na hydrolizę[7, 8]. Ponadto, z uwagi na większą masę cząsteczkową,zwiększa się czułość ich detekcji przy zastosowaniujako detektora spektrometru mas z jonizacją elektronową [9,10]. Ze względu na swoje zalety, pochodne TBDMS zostaływykorzystane w międzylaboratoryjnych, obejmującychdziewięć krajów, badaniach zawartości NLPZ w wodachrzecznych i ściekach [11, 12]Celem prezentowanej pracy było porównanie skutecznościderywatyzacyjnej odczynników silanizujących prowadzącychdo otrzymania pochodnych TMS i TBDMS wybranychNLPZ oraz wyznaczenie krzywych kalibracyjnychdo oznaczeń ilościowych.Materiały i metodyAnalizie poddano roztwory wzorcowe NLPZ w dichlorometanie,zawierające ibuprofen, flurbiprofen, ketoprofen,kwas mefenamowy, naproksen oraz paracetamol. Stężeniakażdego z leków w określonym roztworze były identycznei wynosiły 10, 20, 30 i 50 ng/μl. Jako wzorzec wewnętrznyzastosowano oktadekan, którego stężenie w każdym roztworzewynosiło 25 ng/μl. Wszystkie stosowane leki, oktadekanoraz dichlorometan zakupiono w firmie Sigma‐Aldrich.W celu otrzymania pochodnychtrimetylosililowych zastosowanoodczynniki derywatyzujące: N,Obis-trimetylosililoacetamid(BSA),N,O‐bis‐trimetylosililo-trifluoroacetamid(BSTFA), heksametylodisiloksan(HMDS) - firmy Supelco orazN-metylo-N-trimetylosililotrifluoroacetamid(MSTFA) - produkcji Macherey& Nagel. Pochodne tert‐butylodimetylosililoweotrzymanowykorzystując N‐metylo‐N‐(tert‐butylodimetylosililo)trifluoroacetamid(MTBSTFA) z 1% dodatkiemkatalizatora tert‐butylodimetylo‐sililochlorku(TMCS) firmy Sigma-Aldrich.copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073W celu derywatyzacji, 100 μl analizowanych roztworówwzorcowych NLPZ umieszczono w szklanych fiolkach(2ml) i dodano taką samą objętość odczynnika silanizującego.Następnie fiolki szczelnie zamknięto i ogrzewanoprzez godzinę w temperaturze 70 o C. Po schłodzeniupróbek, poddano je analizie techniką GC/MS. AnalizyGC/MS wykonano stosując chromatograf gazowy Agilentserii 6890 sprzężony ze spektrometrem mas AgilentNetwork 5973 i automatycznym podajnikiem próbek7683 firmy Agilent Technologies. Wykorzystano dozownik„bezpośredniego wprowadzania na zimną kolumnę”(„Cool on column”) z elektroniczną kontrolą ciśnienia,którego temperatura w trybie pracy „Track Oven” wynosiła3 o C więcej niż temperatura pieca chromatograficznego.Jako gaz nośny zastosowano hel o szybkości przepływu2,6 ml/min. Temperatura linii transferowej wprowadzającejkolumnę chromatograficzną bezpośrednio doźródła jonów spektrometru mas wynosiła 230 ºC. Analizowanezwiązki jonizowano strumieniem elektronówo energii 70 eV. Źródło jonów w spektrometrze utrzymywanow temperaturze 230 ºC, a kwadrupol w 150 ºC.Spektrometr pracował w trybie zbierania pełnego widma(full scan), monitorując masy 70-400 j.m.a. Do interpretacjiwidm mas wykorzystano ósme wydanie bibliotekiwidm mas Wiley’a oraz bibliotekę NIST/EPA 2008.Zastosowano następujące programy temperaturowe piecachromatograficznego:– dla rozdziału pochodnych TMS: temperatura początkowa40 o C utrzymywana była przez 1min, następniezastosowano wzrost temperatury z prędkością 20 o C/min do 160 o C i od 160 o C z prędkością 5 o C/mindo temp. 205 o C, którą utrzymywano przez 10 min,dalej temperatura z prędkością 3 o C/min wzrastała do270 o C.– dla rozdziału pochodnych TBDMS: temperaturapoczątkowa 50 o C utrzymywana była przez 1min,następnie zastosowano wzrost temperatury z prędkością20 o C/min do 130 o C i od 130 o C z prędkością2 o C/min do temp. 205 o C, którą utrzymywano przez10 min, dalej temperatura z prędkością 3 o C/minwzrastała do 280 o C.Ryc. 1. Porównanie skuteczności derywatyzacyjnej różnych odczynników silanizującychwzględem ibuprofenu, kwasu mefenamowego, flurbiprofenu, naproksenui ketoprofenu (20 ng/µl). Powierzchnię pików znormalizowano względem wzorcawewnętrznego.29

Farm Przegl Nauk, 2010, 7Wyniki i dyskusjaRyc. 4. Widmo mas i schemat fragmentacji estru tert‐butylodimetylosililowegoibuprofenu.Ryc. 2. Porównanie pól powierzchni pików ibuprofenu poprzeprowadzeniu do pochodnej TMS przy użyciu BSTFAi pochodnej TBDMS za pomocą MTBSTFA. Pola powierzchnipików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego.Ryc. 3. Porównanie sumy pól powierzchni pików pochodnychmono- i di- paracetamolu po przeprowadzeniu do pochodnejTMS przy użyciu BSTFA i pochodnej TBDMS zapomocą MTBSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowanowzględem wzorca wewnętrznego.Ryc. 5. Krzywa kalibracyjna do oznaczania flurbiprofenuw postaci pochodnych TMS i TBDMS otrzymanych w obecnościodpowiednio BSTFA i MTBSTFA. Pola powierzchnipików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego.W celu dobrania najlepszego odczynnika derywatyzującegotestowano kilka najpopularniejszych związków silanizujących:BSA, BSTFA, HMDS i MSTFA, które prowadządo otrzymania pochodnych TMS oraz MTBSTFA, którytworzy pochodne TBDMS.Wszystkie odczynniki silanizujące prowadzące do otrzymaniapochodnych TMS ibuprofenu, flurbiprofenu, naproksenu,kwasu mefanamowego i ketoprofenu charakteryzowałapodobna skuteczność derywatyzacyjna. Bez względu nastosowany odczynnik derywatyzujący, uzyskano porównywalnepowierzchnie pików odpowiadających sililopochodnymanalizowanych leków. Każdy z tych leków posiadagrupę karboksylową, której wodór stosunkowo łatwo ulegawymianie na ugrupowanie sililowe. Na rycinie 1 przedstawionoporównanie skuteczności derywatyzacyjnej wybranychzwiązków silanizujących względem ibuprofenu, kwasumefenamowego, flurbiprofenu, naproksenu i ketoprofenu.Natomiast w przypadku paracetamolu, jeden z aktywnychwodorów ulegających podstawieniu pochodzi z grupyhydroksylowej, a drugi znajduje się przy atomie azotugrupy amidowej. W wyniku derywatyzacji pod wpływemwiększości zastosowanych odczynników otrzymano disililopochodnątego leku. Wyjątek stanowił HMDS, którypraktycznie nie wykazuje reaktywności w stosunku do grupamidowych. We wszystkich mieszaninach poderywatyzacyjnychzidentyfikowano ponadto mono-O-sililopochodnąparacetamolu, natomiast nie stwierdzono obecności mono-N-sililopochodnej.Najefektywniejszym odczynnikiemderywatyzującym, dzięki któremu uzyskano najwięcej pochodnejdi-TMS, okazał się BSTFA, natomiast najsłabszymdziałaniem wykazał się HMDS. W tym przypadku wykrytotylko pochodną mono-TMS o charakterze eteru oraz rozmytypik niezderywatyzowanego paracetamolu. BSA, pomimowysokiej skuteczności derywatyzacyjnej, ze względu na dodatkowyprodukt, który powstaje z jego rozkładu, nie jestpolecany do oznaczania paracetamolu. Produkt ten ma podobnyczas retencji do pochodnej di-TMS paracetamolu, comoże prowadzić do zafałszowania wyników ilościowych.Na rycinie 2 przedstawiono porównanie pól powierzchnipików ibuprofenu po przeprowadzeniu do pochodnej TMSprzy użyciu BSTFA i pochodnej TBDMS za pomocą MTB-STFA. Niemal dla wszystkich oznaczanych leków pochodnetert-butylodimetylosililowe charakteryzowały się większąintensywnością pików chromatograficznych. Wyjątek stano-30

Tab. 1. Wartości m/z jonów molekularnych oraz jonów wynikających z odczepieniarodnika tert-butylowego, charakterystyczne dla pochodnych TBDMS analizowanychlekówwiło najniższe stężenie paracetamolu, przy którym powstajągłównie mono pochodne, zarówno TMS, jak i TBDMS(Ryc. 3). Wraz ze wzrostem stężenia leku obserwowanostopniowy przyrost stężenia pochodnej di- w mieszaniniepoderywatyzacyjnej. W celu ilościowego oznaczenia paracetamolunależy uwzględnić obie jego pochodne .Ponieważ w komercyjnie dostępnych bibliotekach (8edycja biblioteki Wiley’a i NBS/EPA 2008) nie ma widmpochodnych TBDMS oznaczanych leków, ich identyfikacjidokonano na podstawie interpretacji zarejestrowanychwidm mas. Na rycinie 4 przedstawiono widmo mas i schematfragmentacji tert‐butylodimetylosililowej pochodnejibuprofenu. W zastosowanych warunkach jonizacji jon molekularnym/z 320 jest na tyle nietrwały, że zarejestrowanogo tylko w śladowych ilościach. Zarejestrowano natomiastjon [(CH 3) 2CHCH 2C 6H 4CHCH 3] + przy m/z 161 charakterystycznydla ibuprofenu bez względu na typ jego pochodnej.Pik główny o wartości m/z 263 wynika z odczepienia rodnikatert‐butylowego (M‐57) i jest typowy dla w wszystkichtert‐butylodimetylosililowych pochodnych analizowanychleków [9, 13]. W widmach tych pochodnych zawsze obserwujesię również jon przy m/z 73 odpowiadający [Si(CH 3) 3] + ,który jest charakterystyczny także dla pochodnych trimetylosililowych,oraz towarzyszący mu jon o wartości m/z 75.W podobny sposób były interpretowane widma tert‐butylodimetylosililowychpochodnych pozostałych leków. W tabeli1 przedstawiono masy cząsteczkowe tych pochodnych,jony wynikające z odczepienia rodnika tert-butylowego orazich względne intensywności w otrzymanych widmach.W celu oznaczenia analizowanych leków zoptymalizowanoproces rozdziału chromatograficznego. Najkorzystniejszerozdziały uzyskano na 60 m kolumnie typu HP-5 (95%polidimetylosiloksanu, 5% bifenylu). Niestety program,który zastosowano do rozdziału trimetylosililopochodnychw przypadku pochodnych TBDMS okazał się nieodpowiedni,głównie z powodu niecałkowitego rozdziału estrów ketoprofenui kwasu mefenamowego. Z tego względu koniecznebyło zastosowanie łagodniejszego narostu temperaturowegoi wydłużenie czasu analizy z 36 do 60 minut.Skuteczność odczynników zastosowanych do derywatyzacjipotwierdzają krzywe kalibracyjne wykonane dla wszystkichoznaczanych leków. W przypadku pochodnych TMS charakteryzująsię one wysokim współczynnikiem korelacji linioweji niemal identycznym nachyleniem dla każdego z leków. Krzywekalibracyjne uzyskane za pomocą MTBSTFA charakteryzujecopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Jon główny [M-57]Pochodna TBDMSJon molekularny M +m/z intensywność m/zIbuprofen 320 ślady 263Flurbiprofen 358 ślady 301Naproksen 344 10% 287Kwas mefenamowy 355 65% 298Ketoprofen 368 ślady 311Paracetamol (mono) 265 40% 208Paracetamol (di) 379 10% 322równie wysoka korelacja liniowa, natomiastwartości ich współczynników kierunkowych„a” są wyraźnie wyższe, cowskazuje na lepszą czułość metody. Narycinie 5 przedstawiono przykładowekrzywe kalibracyjne pochodnych TMS iTBDMS otrzymane dla flurbiprofenu.WnioskiWszystkie testowane odczynnikisilanizujące, które tworzą pochodneTMS można z powodzeniem wykorzystaćdo oznaczania ibuprofenu,flurbiprofenu, naproksenu, kwasumefenamowego i ketoprofenu techniką GC/MS, przyczym ich skuteczność derywatyzacyjna jest porównywalna.HMDS i BSA nie są polecane do derywatyzacji paracetamolu.Oznaczanie testowanych leków w postaci pochodnychtert‐butylodimetylosililowych jest korzystniejsze z uwagina wyższą czułość metody oraz na znacznie większą odpornośćtych związków na ślady wody, ale wymaga znacznegowydłużenia czasu analizy GC.Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medycznyw Katowicach (grant nr KNW-2-151/09).Piśmiennictwo1. Namieśnik J, Chrzanowski W, Szpinek P. Nowe horyzontyi wyzwania w analityce i monitoringu środowiska.Centrum Doskonałości Analityki i MonitoringuŚrodowiskowego, Gdańsk 2003.2. Maurer HH. Systematic toxicological analysis proceduresfor acidic drugs and/or metabolites relevant to clinicaland forensic toxicology and/or doping control. JChromatogr B 1999; 733: 3-25.3. Polettini A. Systematic toxicological analysis of drugsand poisons in biosamples by hyphenated chromatographicand spectroscopic techniques. J Chromatogr B1999; 733: 47-63.4. Kurkiewicz S i wsp. Derywatyzacja “on-line” w oznaczaniuibuprofenu i naproksenu techniką GC/MS. FarmPrzegl Nauk 2008; 3: 22-24.5. Kurkiewicz S, Dzierżęga-Lęcznar A, Stępień K. Wodorotlenektrimetylosulfoniowy jako czynnik derywatyzującyw analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych technikąGC/MS. Farm Przegl Nauk 2008; 11-12: 38-41.6. Kosjek T, Heath E, Krbavcic A. Determination of nonsteroidalanti-inflammatory drug (NSAIDs) residues inwater samples. Environ Int 2005; 31: 679-685.7. Knapp DR. Handbook of Analytical Derivatization Reactions.Wiley. Chichester 1979.8. Farré M, Petrovic M, Barceló D. Recently developed GC/MS and LC/MS methods for determining NSAIDs in watersamples. Anal Bioanal Chem 2007; 387: 1203-1214.9. Rodríguez I i wsp. Determination of acidic drugs in sewagewater by gas chromatography-mass spectrometryas tert.-butyldimethylsilyl derivatives. J Chromatogr A2003; 985: 265-274.31

Farm Przegl Nauk, 2010, 710. Carpinteiro JB i wsp. Application of strategic samplecomposition to the screening of anti-inflammatorydrugs in water samples using solid-phase microextraction.Anal Chim Acta 2004; 524: 63-71.11. Heath E i wsp. Second interlaboratory exercise on nonsteroidalanti-inflammatory drug analysis in environmentalaqueous samples. Talanta 2010; 81: 1189-1196.12. Farre M i wsp. First interlaboratory exercise on non-steroidalanti-inflammatory drugs analysis in environmentalsamples. Talanta 2008; 76: 580-590.13. Kyoung-Rae K, Hye-Ran Y. Rapid screening for acidicnon-steroidal anti-inflammatory drugs in urine by gaschromatography mass spectrometry in the selected-ionmonitoring mode. J Chromatogr B 1996; 682: 55-66.data otrzymania pracy: 24.05.2010 r.data akceptacji do druku: 08.06.2010 r.Adres do korespondencji:dr n. farm. Sławomir KurkiewiczKatedra Analizy Instrumentalnej Wydziału Farmaceutycznegoz Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicachul. Narcyzów 1, 41-200 Sosnowiectel: +48 32 364 1053e-mail: slawek@sum.edu.pl32

Farm Przegl Nauk, 2010,7, 33-38copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Czynnik NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiejpoddanych działaniu kamptotecynyNF-κB factor in human skin fibroblasts treated with camptothecinEwa Kłosińska – Szmurło, Wojciech Miltyk, Arkadiusz Surażyński, Joanna Dondziło, Jerzy PałkaKatedra Chemii, Analizy i Technologii Środków LeczniczychUniwersytet Medyczny w BiałymstokuStreszczenieMechanizm inhibitorowego działania kamptotecyny nabiosyntezę kolagenu nie jest w pełni wyjaśniony. Z niniejszychbadań wynika, iż kamptotecyna (CPT) hamuje biosyntezękolagenu oraz pobudza aktywność prolidazy, enzymuktóry odgrywa ważną rolę w biosyntezie kolagenu –hydrolizuje imidodipeptydy dostarczając wolną L-prolinędo procesu biosyntezy tego białka. Aktywność prolidazyi biosyntezę kolagenu regulują receptory β 1-integrynowe.Wykazano, że ekspresja podjednostki β 1receptora integrynowegowzrasta w fibroblastach inkubowanych z CPT,w porównaniu do komórek kontrolnych. Wykazano także,że CPT pobudza ekspresję czynnika NF-κB (odpowiadającegoza hamowanie ekspresji genów kolagenu) w sposóbzależny od użytego stężenia i od czasu inkubacji. Różnicapomiędzy wzrostem aktywności prolidazy, a obniżeniembiosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniuCPT może wynikać zatem z przewagi inhibitorowegodziałania NF-κB na ekspresję genów kolagenu nad pobudzającymdziałaniem MAP-kinaz na aktywność prolidazy.Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działaniakamptotecyny na biosyntezę kolagenu może posłużyćjako model badawczy do poszukiwania nowych lekówstosowanych w terapii zwłóknienia narządów.Słowa kluczowe: kamptotecyna, kolagen, fibroblasty,NFκBAbstractAlthough, camptothecin (CPT) is considered as a potentialanticancer agent acting through inhibition of topoisomeraseI, the mechanism of its effect on collagen metabolismis not known. The present study was undertakento evaluate the mechanism of CPT - induced deregulationof collagen metabolism in cultured human skin fibroblast.It has been found that CPT strongly induced inhibition ofcollagen biosynthesis. The mechanism of this phenomenonwas found to be independent of prolidase activity,an enzyme that plays an important role in enhancement ofcollagen biosynthesis at post-translational level. In fact,the enzyme activity was found to be stimulated by CPT.Increase in the enzyme activity was accompanied by increasein the expression of β 1integrin receptor and someβ 1integrin-dependent signaling proteins, Sos, MAPK andtranscription factor NF-κB. Since at least in some celltypes activation of β 1integrin induces NF-κB and thistranscription factor is involved in inhibition of collagengene transcription, therefore the mechanism of CPT-dependentinhibition of collagen biosynthesis may be relatedto β 1integrin-dependent stimulation of NF-κB. The datasuggest that CPT induces inhibition of collagen biosynthesisin cultured human skin fibroblasts by stimulation ofNF-κB signaling.Key words: camptothecin, collagen, fibroblasts, NFκBWstępBadania nad metabolizmem kolagenu stanowią jedenz głównych kierunków badań nad chorobami tkanki łącznej.Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w wyjaśnieniumechanizmów regulujących metabolizm kolagenu, wciążbrakuje skutecznej terapii zwłóknienia narządów.Jednym z czynników hamujących biosyntezę kolagenujest kamptotecyna. Mechanizm tego procesu nie jest w pełnipoznany. Kamptotecyna jest alkaloidem chinolinowym,wykazującym właściwości antymitotyczne [1, 2]. Udowodniono,że najwyższą aktywność cytotoksyczną wykazujeona w stosunku do komórek znajdujących się w fazieprzedpodziałowej cyklu komórkowego [3, 4]. Faza S cyklukomórkowego u szybko dzielących się komórek takich jakkomórki nowotworowe trwa dłużej niż w przypadku komórekprawidłowych i dlatego komórki rakowe są niszczonez dużo większą skutecznością niż komórki prawidłowe[5-7]. Z tego powodu, pochodne tego alkaloidu znalazły zastosowaniew terapii przeciwnowotworowej [8, 9].NF-κB to rodzina jądrowych czynników aktywującychtranskrypcję genów, obejmująca grupę regulatorów kontrolicyklu komórkowego, wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej,procesów zapalnych, apoptozy i onkogenezy.Czynniki te, w zależności od typu bodźca mają zdolnośćdo dimeryzacji [7, 10-12]. Najdokładniej scharakteryzowanymheterodimerem jest p50/p65 stanowiący produkt genuNF-κB1 i RelA [13-19]. Rodzina NF-κB odpowiada za aktywacjętranskrypcji genów w odpowiedzi na sygnał pochodzącyze środowiska pozakomórkowego, wywołany obec-33

Farm Przegl Nauk, 2010, 7nością: cytokin (np. TNF-α), mitogenów (np. anti-CD2, anti-CD3), bakterii (endotoksyny Staphylococcus aureus, Mycobacteriumtuberculosis), wirusów (np. HTLV-1, HBV), leków (np.cykloheksamid) i innych czynników np. stresu oksydacyjnegoczy związków przeciwnowotworowych [19-25]. AktywacjaNF-κB zachodzi w ciągu kilku minut po ekspozycji na czynnikindukujący, zatem nie wymaga syntezy białek de novo. Procesten polega na fosforylacji IκB (inhibitora NF-kB) co prowadzido ich ubikwitynacji i oddysocjowania od NF-κB. AktywnyNF-κB ulega translokacji z cytoplazmy do jądra komórkowego,gdzie pobudza transkrypcję odpowiednich genów [26-28].Wpływ kamptotecyny na ekspresję NF-κB nie jestznany. Wysunięto przypuszczenie, że potencjalnym punktemuchwytu inhibitorowego działania tego alkaloiduna biosyntezę kolagenu może być czynnik transkrypcyjnyNF-κB. Ocenie poddano ekspresję NF-κB, receptoraβ 1-integrynowego oraz biosyntezę kolagenu w fibroblastachskóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny.Materiały i metodyMateriałyL-prolina, kolagenaza bakteryjna typu VII, trypsyna, pożywkaDMEM, kamptotecyna - Sigma, USA, płodowa surowicabydlęca – Gibco, USA, L-5[ 3 H] prolina (28 Ci/mmol), Amersham,U.K. Przeciwciała poliklonalne królicze przeciw NFκB,β-aktynie, receptorowi β1-integrynowemu, przeciwciała drugorzędoweznakowane fosfatazą, Santa Gruz, USA. Fibroblasty –American Type Culture Collection, Rockville, USA.MetodyPrzygotowanie hodowli fibroblastów.Fibroblasty skóry ludzkiej hodowano w DMEM z dodatkiem10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/lglutaminy, 50 µg/ml penicyliny, 50 µg/ml streptomycynyw temperaturze 37 o C, w atmosferze 5 % CO 2. Fibroblastyprzenoszono z butelek „Costar” do 6 oczkowych płytek„Costar” stosując bufor fosforanowy z dodatkiem0,05 % trypsyny i 0,02 % EDTA. Komórki liczono w hemocytometrzei przenoszono w ilości 1x10 5 komórek na oczkow 1 ml pożywki hodowlanej. Pożywkę hodowlaną wymienianona świeżą, co 48 godzin. Fibroblasty osiągały stan inhibicjikontaktowej w 6 dniu wzrostu. W większości przypadkówkomórki takie użyto do dalszych doświadczeń. Do badańużywano komórek pomiędzy 8 i 14 pasażem. Fibroblastyw stanie inhibicji kontaktowej płukano trzykrotnie 0,15 mol/lNaCl, zawieszano w 0,15 mol/l NaCl i wirowano przy obrotach200 x g, a supernatant odrzucono. Następnie, odwirowanekomórki zawieszono w 0,3 ml 0,05 mol/l buforu Tris-HClo pH 7,8 i poddano działaniu ultradźwięków trzykrotnie po10 sekund w temp. 0 o C. Próby wirowano przy 16.000 x g wtemp. 0 o C przez 30 minut. W uzyskanym supernatancie oznaczonobiałko i użyto do dalszych doświadczeń.Test cytotoksycznościPomiar cytotoksyczności przeprowadzono według metodyopisanej przez Carmichael’a [29]. Oceniono żywotnośćkomórek przy użyciu soli tetrazolinowej (MTT). W żywychkomórkach barwnik ten ulega konwersji do purpurowegoformazonu pod wpływem mitochondrialnych dehydrogenaz.W martwych komórkach konwersja ta nie zachodzi.Komórki w stanie inhibicji kontaktowej inkubowano w pożywcezawierającej równe stężenia badanego związku przez24 godziny w inkubatorze z CO 2w temp. 37 o C. Następniepodłoże usunięto, komórki przepłukano 3 x 1 ml PBS, dodano1 ml PBS oraz 50µl MTT o stężeniu 5 mg/ml i kontynuowanoinkubację przez 4 godziny. Po tym czasie usuniętomedium i dodano do komórek 1 ml 0,1 mol/l kwasu solnegow absolutnym izopropanolu. Po ok. 10 minutach, w lizaciekomórek mierzono absorbancję przy 570 nm i 630 nm. Odwartości absorbancji przy 570 nm odjęto wartość absorbancjitła (630nm). Różnicę wartości absorbancji uzyskanąw hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Posłużyłaona za wartość porównawczą względem komórek inkubowanychw obecności kamptotecyny. Przeżywalność tychkomórek przedstawiono jako procent wartości kontrolnej.Oznaczanie zawartości białkaBiałko zawarte w supernatancie homogenatów komórkowychoznaczano metodą Lowry i wsp. [30].Elektroforetyczny rozdział białek na żelu poliakrylamidowymz SDSBadane próby zawierające 20 µg białka rozpuszczonow buforze 0,125 mol/l Tris-HCl o pH 6,8 zawierającym 3 %SDS, 20 % glicerol i 0,1 % błękit bromofenolowy. Próbkipoddano rozdziałowi elektroforetycznemu na żelu poliakryloamidowymzłożonym z 10 % żelu zagęszczającego(zawierającego 0,4 % SDS, 1,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH8,8) i 6 % żelu rozdzielającego (zawierającego 0,4 % SDS,0,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH 6,8) w buforze elektrodowymzawierającym 1,92 mol/l glicyny, 0,25 mol/l Tris i 1 % SDS.Doświadczenie prowadzono przy natężeniu prądu 100 mAna żel przez godzinę w temperaturze pokojowej.Analiza białek metodą „Western immunoblot”Po rozdziale elektroforetycznym żele zrównoważono5 minutową inkubacją w 20 % (v/v) metanolowym roztworze,który zawierał 25 mmol/l Tris i 0,2 mol/l glicyny. Białkazostały przetransferowane na nitrocelulozę o porach 0,2 µmz użyciem zestawu LKB 2117 Multiphor II, pod wpływemnapięcia 100 mA w ciągu 1 godziny, zgodnie z metodą opisanąw podręczniku dołączonym do aparatu. Niespecyficznewiązania nitrocelulozy zablokowano poddając ją działaniu5 % roztworu beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinęw temperaturze pokojowej, wolno mieszając. Następnienitrocelulozę inkubowano z poliklonalnym przeciwciałemprzeciw NF-κB lub polikolnalnym przeciwciałem przeciwreceptorowi β 1-integrynowemu lub poliklonalnalnym przeciwciałemprzeciw β-aktynie w 5 % roztworze mleka beztłuszczowegow TBS-T o stężeniu 1:3000 przez 24 godzinyw temperaturze pokojowej. Po inkubacji nitrocelulozę płukanow roztworze TBS-T (1x15 minut, 2x10 minut) wolno mieszając.W celu wykrycia analizowanych białek dodano drugie34

Cytotoksyczność[% wartości kontrolnej]120100806040200przeciwciało przeciw króliczej Fc IgG, znakowane fosfatazą alkalicznąw stężeniu 1:5000 w TBS-T i poddano inkubacji przez 30minut, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę delikatnie płukanoTBS-T (5x10 minut) i poddano działaniu odczynnika Sigma–Fast BCIP/NBT aby wybarwić immunoreaktywne białko.Pomiar biosyntezy kolagenu0 0,1 15 50Kamptotecyna [µM]Ryc. 1. Ocena przeżywalności fibroblastów skóry ludzkiej poddanychdziałaniu kamptotecyny (CPT). Komórki inkubowano przez 24 godzinyw pożywce z dodatkiem różnych stężeń CPT. Przedstawiono wartościśrednie ± S.D.Wbudowywanie 5[ 3 H]-proliny[dpm x 10 -3 / mg białka]353025201510500 0,1 15 50Kamptotecyna [µM]Ryc. 2. Biosynteza kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiejw stanie inhibicji kontaktowej inkubowanych przez 24 godziny w pożywcez dodatkiem 0,1, 15, 50 µ M CPT. Przedstawiono wartości średnie± S.D.Pomiar biosyntezy kolagenu wykonano według metodyopisanej przez Peterkofsky i wsp. [31]. Fibroblastycopyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej wpożywce przez 24 godziny z dodatkiem 5[ 3 H]-proliny (5 µCi/ml, 28 Ci/mmol). Komórki dwukrotnieprzemyto 1 ml DPBS z 10 mmol/l proliny,następnie zawieszono je w 1,5 ml DPBSz 10 mmol/l proliny. Zawiesinę komórek poddanohomogenizacji ultradźwiękami (3 x 20 s wtemp. 0 o C). Białka zawarte w homogenatachwytrącono przez dodanie 1,5 ml 20% TCA z 20mmol/l proliną. Po 5 minutach wytrącone białkaodwirowano (1000 x g w temp. 4 o C przez 10minut), supernatant odrzucono, a osad rozpuszczonow 0,6 ml 0,2 mol/l NaOH. Pobierano po 2próby po 0,2 ml lizatu. Każdą próbę zobojętnianoprzez dodanie 0,16 ml 0,15 mol/l HCl i 0,1 ml1 mol/l Tris-HCl o pH 7,2, a następnie dodano20 µl 62,5 mmol/l N-etylomaleimidu (NEM), 10µl CaCl 2oraz 10 µl DPBS z kolagenazą o stężeniu1 mg/ml (próba badana) lub bez kolagenazy(próba kontrolna). Próby inkubowano przez 90minut w temperaturze 37 o C. Następnie dodano0,5 ml zimnego 10% TCA i chłodzono przez 5minut w temperaturze 0 o C. Po 5 minutach próbyodwirowano, a supernatant przeniesiono dofiolek scyntylacyjnych z 4 ml płynu scyntylacyjnego.Ilość powstałego kolagenu wyrażonow dpm 5[ 3 H]-proliny wbudowanej do białekpodatnych na działanie kolagenazy bakteryjnej,w przeliczeniu na µg białka.Analiza statystycznWyniki poddano analizie statystycznej. Obliczonośrednie arytmetyczne z poszczególnychpomiarów i odchylenia standardowe oraz dokonanoanalizy statystycznej przy użyciu testu „t” –studenta. Za istotne statystycznie przyjęto różnicepomiędzy średnimi przy poziomie ufności p

Farm Przegl Nauk, 2010, 7A.B.0 0.1 15 50Kamptotecyna [μM]NF-κBβ-aktynaRyc. 3. (A) Ocena ekspresji czynnika NF-κB w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóryludzkiej inkubowanych w obecności różnych stężeń kamptotecyny (B) ekspresja β-aktynyw ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w obecności różnychstężeń kamptotecyny.A.B.0 20 60 240Czas [min]NF-κBβ-aktynaRyc. 4. Ekspresja NF-κB (A) i β-aktyny (B) w zależności od czasu inkubacji w ekstrakcie komórkowymfibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w pożywce hodowlanej z dodatkiem50 mM kamptotecyny.integrynowego w homogenaciefibroblastów skóryludzkiej poddanych działaniukamptotecyny. Badanieprzeprowadzono metodą„Western-immunoblot”.Jednocześnie przeprowadzonoanalizę β-aktyny metodą„Western-immunoblot”w celu stwierdzenia kontroliilości nanoszonego białka.Wykazano większą zdolnośćdo wiązania przeciwciałprzeciwko podjednostceβ 1receptora integrynowegohomogenatów komórek inkubowanychz CPT w porównaniudo homogenatówkomórek kontrolnych (Ryc.5). Wskazuje to, iż kamptotecynapobudza ekspresjęreceptora β 1-integrynowegow hodowli fibroblastówskóry ludzkiej.DyskusjaA.B.porównaniu do biosyntezy kolagenu zachodzącej w komórkachrosnących w pożywce hodowlanej bez CPT (kontrola).Zaobserwowano hamowanie biosyntezy kolagenu proporcjonalnedo użytych stężeń alkaloidu. Uzyskane wyniki wskazują,że CPT jest inhibitorem biosyntezy kolagenu w hodowlifibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej.Jednym z czynników odpowiedzialnych za hamowaniebiosyntezy tego białka jest NF-κB. Oceniono ekspresjęNF-κB w hodowli fibroblastów inkubowanych w obecnościróżnych stężeń kamptotecyny. Wynik tego doświadczeniaprzedstawia Ryc. 3. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnikaNF-κB zależny od użytego stężenia kamptotecyny.W celu potwierdzenia poprawności wykonania doświadczeniawykonano jednocześnie analizę „Western-immunoblot”β-aktyny. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnika NFκBw hodowli fibroblastów w zależności od czasu inkubacjiz kamptotecyną. Najwyższą ekspresję zaobserwowanopo 4 godzinach inkubacji (Ryc. 4) W regulacji aktywnościNF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej ważną funkcję pełnipodjednostka β 1receptora integrynowego powierzchnikomórki. Z tego powodu oceniono ekspresję receptora β 1-360 0.1 15 50Kamptotecyna [μM]Ryc. 5. (A) Ekspresja receptora β 1-integrynowego w fibroblastach kontrolnych oraz inkubowanychz CPT w różnych stężeniach. (B) Ekspresja β-aktyny w fibroblastach kontrolnychoraz inkubowanych z CPT w różnych stężeniach.receptorPomimo znacznegoβ 1- integrynowy postępu jaki dokonał sięw wyjaśnieniu mechanizmówregulujących metabo-β-aktynalizm kolagenu, wciąż brakujeskutecznej terapii zaburzeńkolagenu z tkanki łącznej.Kolagen jest najobficiejwystępującym białkiemmacierzy pozakomórkowejssaków. Odpowiada on zautrzymanie prawidłowejstruktury i integralności tkanki łącznej, odgrywa też ważnarolę w interakcji z receptorami integrynowymi powierzchnikomórek, regulujących wiele procesów fizjologicznychi patologicznych: reorganizację cytoszkieletu, transport jonów,metabolizm lipidów, aktywację kinaz, ekspresję genów,regulację cyklu komórkowego, procesy różnicowaniai wzrostu komórek nowotworowych jak również inwazyjnośćkomórek nowotworowych. Z tego względu wszelkiezmiany w procesach biosyntezy i degradacji kolagenu mająpotencjalny wpływ na metabolizm komórkowy [32].Badania zespołu Czuwary-Ładykowskiej wskazujące, żekamptotecyna silnie hamuje biosyntezę kolagenu, nie wyjaśniłyjednak mechanizmu inhibitorowego działania CPT.Ten przeciwnowotworowy związek zwany „fazowo specyficznym”może modulować cykl komórkowy, wpływającna replikację DNA (fazę S), a dokładniej na stabilizowaniekompleksu DNA – topoizomeraza I (enzym biorący udziałw replikacji, zmniejszający naprężenia nici DNA) i hamowanieprzesuwania się widełek replikacyjnych. Zjawisko tozatrzymuje cykl w fazie S, co może prowadzić do licznychmutacji, a w efekcie do śmierci komórki [35].

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Z przeprowadzonych doświadczeń wynika, iż kamptotecynahamuje biosyntezę kolagenu proporcjonalnie do użytychstężeń. Związek ten jednocześnie pobudza aktywnośćprolidazy (dane nie prezentowane). Rozbieżność międzyzwiększoną aktywnością prolidazy a zahamowaniem biosyntezykolagenu nasunęła przypuszczenie, że hamowaniebiosyntezy kolagenu może wynikać z indukcji innych mechanizmów.Z badań tych, wynikło również, że w regulacjęaktywności prolidazy i biosyntezy kolagenu zaangażowanesą receptory β 1-integrynowe [32].Ligandem receptorów β 1-integrynowych jest kolagen.Interakcja kolagenu z receptorem integrynowym inicjujekaskadę wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego. Pobudzonyreceptor β 1-integrynowy wywołuje autofosforylacjękinazy białkowej FAK, która następnie oddziaływuje z białkamiadaptorowymi Grb i Src, poprzez białka Shc i Shr. Ta interreakcjapozwala na aktywację kaskady białek Sos, Ras, Raf,a następnie kinaz MAP: ERK 1i ERK 2, które indukują czynnikitranskrypcyjne, regulujące ekspresję wielu genów biorącychudział w regulacji wzrostu komórek i ich różnicowaniu [33].Oceniono ekspresję receptora β 1-integrynowego w homogenaciefibroblastów skóry ludzkiej poddanych działaniukamptotecyny. Badanie przeprowadzono metodą „Westernimmunoblot”.Badanie wykazało większą zdolność do wiązaniaprzeciwciał przeciwko podjednostce β 1receptora integrynowegohomogenatów komórek inkubowanych z CPTw porównaniu do komórek kontrolnych. Wskazuje to, iżkamptotecyna pobudza ekspresję receptora β 1-integrynowegow hodowli fibroblastów skóry ludzkiej.Przeprowadzone badania wykazały, że kamptotecynapobudza ekspresję zarówno receptora β 1-integrynowegojak i czynnika NF-κB. Ekspresja czynnika jądrowegoNF-κB wzrasta proporcjonalnie do użytych stężeń CPT i czasuinkubacji, w porównaniu do komórek kontrolnych. NFκBindukuje transkrypcję genów w odpowiedzi na sygnał zzewnątrz komórki wywoływany przez cytokiny (np. TNFα),mitogeny, bakterie, wirusy, leki (np. cykloheksamid), światłoUV, stres oksydacyjny, związki przeciwnowotworowe[17, 19, 20, 22]. W niektórych typach komórek zwiększonaekspresja NF-κB może zachodzić pod wpływem sygnału generowanegoprzez receptor β 1-integrynowy [34].W niniejszej pracy wykazano, że ekspresja podjednostkireceptora β 1integrynowego powierzchni komórki wzrastaw fibroblastach skóry ludzkiej inkubowanych z CPT,w porównaniu do komórek kontrolnych. Stymulacja tegoreceptora indukuje NF-κB, który odpowiada za hamowanieekspresji genów kolagenu oraz pobudza kinazę MAP regulującąaktywność prolidazy. NF-κB i MAPK oddziaływająmiędzy sobą na zasadzie konkurencji [32]. Zahamowaniegenów kolagenu przez NF-κB uniemożliwia biosyntezę tegobiałka. Zatem nasilenie aktywności prolidazy pobudzającejbiosyntezę kolagenu na etapie posttranslacyjnym, a obniżeniembiosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniuCPT nie równoważy inhibitorowego działania NF-κBna ekspresję genów kolagenu.Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działaniakamptotecyny poprzez receptory β 1-integrynowe i NF-κBna biosyntezę kolagenu może służyć jako model badawczydo poszukiwania nowych leków stosowanych w terapii choróbzwiązanych z zaburzeniami metabolizmu kolagenu.Piśmiennictwo1. Kruszewski S. Zastosowanie zjawisk fotoluminescencjiw badaniach farmaceutycznych oraz w terapii i diagnostyceprzeciwnowotworowej. Zakład Fizyki Medycznej;CM UMK, Wiadomości Akademickie Nr 19.2. Wink M, van Wyk B. Rośliny lecznicze świata. Ilustrowanyprzewodnik naukowy. Briza Publications2004, 76.3. Kruszewski S, Burke T. Właściwości analogów kamptotecyny– obiecujących inhibitorów topoizomerazy I,oznaczonych metodą spektroskopii fluorescencyjnej.Polish J Med Phys & Eng. 2002; 8(3): 183-192.4. Wall M i wsp. Plant antitumor agents. The isolation andstructure of camptothecin, a novel alkaloidal leukemiaand tumor inhibitor from Camptotheca acuminate. J AmChem Soc. 1996; 88: 3888-90.5. Kohn K, Pommier Y. Molecular and Biological Determinantsof the Cytotoxic Actions of Camptothecins.Ann NY Acad Sci. 2000; 922: 11-26.6. Liu L i wsp. Mechanism of Action of Camptothecin.Ann NY Acad Sci. 2000; 922: 1-10.7. Yamamoto Y, Gaynor R. I-κB kinases: key regulatorsof the NF-κB pathway. Trends Biochem Sci 2004; 29:72-79.8. Omyła - Staszewska J, Deptała A. Inhibitory topoizomerazyI – unikalna grupa leków przeciwnowotworowych.Współcz Onkol 2003. 7; 1: 45-53.9. Pommier Y. Eucaryotic DNA topoisomerase I: Genomegatekeeper and its intruders camptothecins. Semin Oncol.1996; 23: 3-12.10. Karin M, Ben - Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquination:the control of NF-κB activity. Ann Rev Immunol.2000; 18: 621-663.11. Li Z i wsp. Genetic dissection of antigen receptor induced– NF-κB activation. Mol Immunol 2004; 41:701-714.12. McKay L, Cidlowski J. Molecular control of immune/inflammatory responses: interactions between NF-κBand steroid receptor – signaling pathway. EndocrinolRev 1999; 20: 435-459.13. Boland MP i wsp. Danarubicin activates NF-κB andinduces NF-κB – dependent gene expression in HL-60 promyelocytic and Jurkat T lymphoma cells. J BiolChem 1997; 272: 12952-12957.14. Chen F i wsp. New insights into the role of NuclearFactor-κB in Cell Growth Regulation. Am J Pathol2001; 159: 387-393.15. Ghosh S i wsp. NF-κB and Rel proteins: evolutionarilyconserved mediators of immune responses. Ann RevImmunol 1998; 16: 225-260.16. Ji GZ i wsp. Role of transforming growth factor-β1-smad signal transduction pathway in patients with hepatocellularcarcinoma. World J Gastroenterol 2006; Jan28; 12(4): 644-648.17. Lisowska K, Witkowski J. Viral Strategies in Modulationof NF-κB. Activity Arch Immun Ther Exp, 2003,51, 367-375.18. Pahl HL. Activators and target genes of Rel /NF-κBtranscription factors. Oncogene 1999; 18: 6853-6858.37

Farm Przegl Nauk, 2010, 719. Wang CY i wsp. NF-κB antiapoptosis: induction ofTRAF1 and TRAF2 and cIAP1 and cIAP2 to suppresscaspase-8 activation. Science 1998; 281: 1680-1685.20. Starska K, Łukomski M. Regulacja Cyklu Komórkowego,Procesu Apoptozy, Wydzielania Cytokin i CząsteczekAdhezyjnych w Limfocytach T i innych KomórkachKrwi Obwodowej oraz w Komórkach Nowotworowychw Mechanizmie Aktywacji toll-like receptors (TLRs) iRodziny Cząsteczek Transkrypcyjnego Czynnika JądrowegoNF-κB. Post Biol Kom 2006; 33, (4): 621-634.21. Baeuerle PA, Baltimore D. NF-κB: Ten years after. Cell1996; 87: 13-18.22. Gilmore TD i wsp. Rel/ NF-κB/I-κB proteins and cancer.Oncogene 1996; 13: 1367-1374.23. Carson J i wsp. Pharmacogenomic Identification of Targetsfor Adjuvant Therapy with the Topoisomerase PoisonCamptothecin. Cancer Res 2004; 64: 2096-2104.24. Piret B, Piette J. Topoisomerase poisons activate thetranscription factor NF-κB in ACH-2 and CEM cells.Nucleic Acids Research 1996; 24: 4242-4248.25. Qiao L i wsp. Constitutive activation of NF-κB in humanhepatocellular carcinoma: evidence of a cytoprotectiverole. Hum Gene Ther 2006 Mar; 17(3): 280-290.26. Ruland J, Mak TW. From antigen to activation: specificsignal transduction pathways linking antigen receptorsto NF-κB. Semin Immunol 2003; 15: 177-183.27. Rutkowski R i wsp. Właściwości biologiczne czynnikatranskrypcji jądrowej NF-κB. Alergia Astma Immunologia,2005; 10(3): 125-131.28. Deptala A i wsp. Simple assay of activation of nuclearfactor – κB by laser scanning cytometry (LSC). Cytometry1998; 33: 376-381.29. Carmichael J i wsp. Evaluation of a tetrazolium-basedsemiautomated colorimetric assay: assessment of radiosensitivity.Cancer Res 1987; 47(4): 943-6.30. Lowry I i wsp. Protein measurement with the Folin phenolreagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275.31. Oyamada I i wsp. Scorbutic and fasted guinea pig seracontain an insulin-like growth factor I-reversible inhibitorof proteoglycan and collagen synthesis in chickembryo chondrocytes and adult human skin fibroblasts.Arch. Biochem. Biophys. 1990; 276(1): 85-93.32. Miltyk W i wsp. Prolidase independent mechanism ofcamptothecin – induced inhibition of collagen biosynthesisin cultured human skin fibroblasts. J. Biochem.2007; 141(2): 287-292.33. Ciesielska E. Inhibitory topoizomerazy I – nowa klasaleków przeciwnowotworowych. Post Biol Kom 1998;25(4): 613-632.34. Pałka J. Farmakoterapia nowotworów. Inhibitory angiogenezy.Farmacja Regionu Północno-Wschodniego.2006; 1(49): 25.35. Friedland JC i wsp. α 6β 4-integrin activates Rac – dependentp21-activated kinase 1 to drive NF-κB – dependentresistance to apoptosis in 3D mammary acini. J Cell Sci2007; 120 (Pt 20): 3700-12.data otrzymania pracy: 29.04.2010 r.data akceptacji do druku: 01.07.2010 r.Adres do korespondencji:Wojciech MiltykSamodzielna Pracownia Analizy LekówKatedra Chemii, Analizy i Technologii Środków LeczniczychUniwersytet Medyczny w Białymstoku15-089 Białystok, ul. Jana Kilińskiego 1tel. +48 85 748 57 06, e-mail: wmiltyk@umwb.edu.pl38

Farm Przegl Nauk, 2010,7, 39-43copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Substancje biologicznie aktywne i lecznicze obecnew wybranych gatunkach koniczynBiologically active and therapeutic substances from Trifolium speciesJoanna Kołodziejczyk, Beata Olas, Barbara WachowiczKatedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet ŁódzkiStreszczenieZ roku na rok rośnie zainteresowanie różnorodnymi roślinami,jako źródłem substancji o korzystnym, a zarazemleczniczym działaniu. Z medycznego punktu widzenia,zainteresowanie gatunkami zaliczanymi do rodzaju Trifoliumpoczątkowo wynikało z zawartości izoflawonówo aktywności fitoestrogenowej. Większość gatunków koniczynnależących do rodzaju Trifolium nie została jeszczejak do tej pory scharakteryzowana pod względemchemicznym. Wiadomo jednak, że koniczyny zawierająszereg związków o potencjalnej aktywności biologicznej,takich jak flawonoidy, saponiny, clovamid orazinne polifenole. Najbardziej znana koniczyna czerwona(T. pratense) jest od dawna stosowana w medycynie tradycyjnejw leczeniu schorzeń dermatologicznych, zaburzeńoddechowych (kaszel, astma), a nawet w leczeniu nowotworów.W medycynie współczesnej ekstrakty z tej koniczynysą źródłem fitoestrogenów wchodzących w składwielu preparatów łagodzących dolegliwości związanez menopauzą. Prezentowana praca stanowi przegląd dostępnychinformacji dotyczących biologicznej aktywnościzwiązków zawartych w wybranych gatunkach konicznyi ich potencjalnego zastosowania w profilaktyce i leczeniuróżnych chorób.WstępAbstractThe growing scientific interest in herbal bioactive substancesyields new information about various specieswith remarkable medical importance. Trifolium specieswere originally identified to possess estrogenic activity,because of their content of isoflavones. Therefore theseplants have been studied mainly in respect to the phytoestrogens,however their beneficial properties may be alsoattributed to other biologically active substances presentin these herbs. The majority of Trifolium species have notbeen characterized phytochemically, however the mainconstituents of the most common clovers have been established- they are a source of various compounds suchas flavonoids, saponins, clovamides and other phenoliccompounds. Red clover (Trifolium pratense) has been traditionallyused in the treatment of chronic skin diseases,cancer and respiratory problems (e.g. whooping cough,asthma). Currently, it is an ingredient of various dietarysupplements and herbal medicines, consuming as alternativesto estrogen replacement therapy. This review presentsthe available data on the biological actions of variousclovers and their potential using in prophylaxis or clinicalroutine.Rodzaj Trifolium (z rodziny bobowatych (Fabaceae))obejmuje około 300 gatunków koniczyn. Część z nich jestod dawna znana i stosowana w medycynie tradycyjnej wielukultur, jednak większość gatunków nie została jak do tejpory zbadana pod względem zawartości składników o potencjalnejaktywności biologicznej. Najwięcej jest danychdotyczących gatunków koniczyn wykorzystywanych w rolnictwie,takich jak. T. pratense (koniczyna czerwona), T. repens(koniczyna biała), T. resupinatum (koniczyna skręconawiększa), T. incarnatum (koniczyna krwistoczerwona), a takżekilku innych popularnych gatunków: T. hybridum (koniczynabiałoróżowa), T. pannonicum (koniczyna pannońska),T. subterraneum (koniczyna perska), T. fragiferum (koniczynarozdęta), w których zidentyfikowano saponiny, izoflawonoidyi inne związki fenolowe [1, 2]. Najlepiej poznana,koniczyna czerwona (koniczyna łąkowa, kądziołka, T. pratense)jest uważana w medycynie ludowej za lek ziołowypomocny w zaburzeniach hormonalnych (również zaburzeniachzwiązanych z menopauzą) i towarzyszących im bólachpiersi, dolegliwościach układu oddechowego (kaszel,astma), środek moczopędny i przeciwobrzękowy, a takżewspomagający leczenie nowotworów [3-5]. W lecznictwieludowym stosowane jest ziele koniczyny czerwonej – Trifoliirubri herba i kwiat koniczyny czerwonej - Trifolii rubri flos,zebrane w początkowym okresie zakwitania rośliny i wysuszoneszybko w warunkach naturalnych lub w suszarniachw temperaturze 35 ˚C. Oba surowce zawierają różne flawonoidy,antocyjany, kwasy fenolowe czy garbniki. W Polscebardzo pospolitym gatunkiem jest także koniczyna biała(koniczyna rozesłana, T. repens), której ziele, jak i kwiat sąstosowane w lecznictwie ludowym. Ziele oraz kwiat koniczynybiałej jest dobrym źródłem garbników, flawonoidów.Zawierają też małe ilości olejku. Garbniki zawarte w wyciąguz ziela działają przeciwbiegunkowo, natomiast kwiat jestskładnikiem mieszanek przeciwreumatycznych [6].Poszczególne gatunki koniczyn różnią się jednak bardzoznacznie pod względem zawartości poszczególnychsubstancji o aktywności biologicznej, a większość z tych39

Farm Przegl Nauk, 2010, 7Ryc. 1. Izoflawony obecne w koniczynach (A)i 17-β-estradiol (B).roślin nie została jeszcze scharakteryzowana chemiczniei biochemicznie. Prezentowana praca stanowi przegląd dostępnychdanych literaturowych na temat aktywności biologicznej,oraz potencjalnego zastosowania profilaktycznegoi leczniczego związków obecnych w znanych (lub dopieropoznawanych) gatunkach koniczyn i uzyskiwanych z nichekstraktach.Substancje biologicznie aktywne obecnew różnych gatunkach z rodzaju TrifoliumFlawonoidy i izoflawonyIzoflawony stanowią grupę flawonoidów wykazującychpodobieństwo strukturalne do estrogenów, co umożliwiaim wiązanie się do receptorów dla tych hormonówi regulację ekspresji określonych genów. Wyróżnia siędwa podstawowe typy receptorów estrogenowych: ER-αi ER-β, które są kodowane przez różne geny i ulegająekspresji w różnych regionach organizmu. Fitoestrogenyze względu na podobieństwo do 17-β-estradiolu (Ryc. 1.)wiążą się głównie do receptorów ER-β. Dostępne danewskazują, że dieta bogata w składniki roślinne o działaniuestrogenowym może ograniczać dolegliwości związanez menopauzą, zmniejszać częstość występowania osteoporozy,chorób układu krążenia i nowotworów hormono-zależnych[7]. Ekstrakty z roślin o wysokiej zawartościizoflawonów (głównie genisteiny, daidzeiny, biochaninyA i formononetyny), uzyskiwane m.in. z koniczynyczerwonej stosowane są do zmniejszania dolegliwościtowarzyszących menopauzie [8]. Wykazano ponadto, żeizoflawony obecne w koniczynie czerwonej i soi stymulująśródbłonek do wydzielania prostacykliny, ważnegoczynnika rozkurczającego naczynie krwionośne, zmniejszającegociśnienie krwi i hamującego agregację płytekkrwi [9].Oleszek i wsp. [10] przeanalizowali 57 gatunków koniczyn,analizując je pod względem zawartości różnych związkówfenolowych, takich jak fenolokwasy, izoflawony i inneflawonoidy oraz clovamid i jego pochodne. Pod względemzawartości izoflawonów, w badaniach tych uwagę zwracają3 gatunki Trifolium: T. heldreichianum, T. scabrum orazT. subterraneum, zawierający ok. 7-9% tych związkóww suchej masie. Stężenie izoflawonów w innych badanychgatunkach koniczyn również było wysokie, ale porównywalnez koniczyną czerwoną (T. pratense), która jest uznanymźródłem tych związków. Badania Polasek i wsp. [11] wykazałynatomiast, że obiecującym źródłem izoflawonów mogąbyć także T. pallescens i T. alpinum (koniczyna alpejska).Oprócz fitoestrogenów, koniczyny zawierają równieżinne związki zaliczane do flawonoidów, m.in. kwercetynęi kempferol [12, 13], wykazujące różnorodną aktywnośćbiologiczną. Kwercetyna jest związkiem o stwierdzonejaktywności antyoksydacyjnej. Polifenol ten jest zmiataczemreaktywnych form tlenu i azotu, m.in. nadtlenoazotynui rodnika hydroksylowego [14]. Wykazano jej istotną rolęw przeciwdziałaniu peroksydacji lipidów, a także właściwościchelatujące. Dostępne dane wskazują również, żezwiązek ten jest szczególnie skuteczny w przeciwdziałaniuuszkodzeniom powodowanym przez alkohol (etanol).Stwierdzono, że kwercetyna chroni wątrobę przed stresemoksydacyjnym zarówno poprzez zmiatanie rodników nadtlenkowych,jak i pośrednio, powodując wzrost poziomuglutationu (GSH), ważnego endogennego antyoksydanta[15, 16]. Kempferol jest jednym z głównych aktywnych biologicznieskładników, obecnych w wielu ziołach wykorzystywanychod wieków w tradycyjnej medycynie chińskiej.Kempferol wykazuje działanie antyoksydacyjne, a BadaniaXu i wsp. wskazują również na jego korzystny wpływ naukład krążenia, ponieważ posiada działanie rozkurczająceścianę naczynia krwionośnego [17].Koniczyny zawierają również istotne dla zdrowia człowiekazwiązki, takie jak proantocyjanidyny, w tym katechiny.Katechiny stanowią grupę związków o działaniu przeciwmiażdżycowym,wynikającym m.in. z ich przeciwutleniającej,antypłytkowej i przeciwzapalnej aktywności. Związkite zapobiegają utlenianiu LDL efektywniej niż α-tokoferol,a poprzez hamowanie aktywacji płytek krwi mogą działaćprzeciwzakrzepowo [18]. (-)-Epikatechina jest uważana zaważny egzogenny antyoksydant chroniący komórki przeduszkodzeniami wywołanymi działaniem nadtlenoazotynu,reaktywnej formy tlenu o silnym działaniu utleniającymi nitrującym [19].SaponinySaponiny posiadają bardzo zróżnicowane właściwościbiochemiczne i biologiczne. Mogą nadawać słodki lub gorzkismak roślinom, posiadają także właściwości emulgujące,co wykorzystuje się m.in. w przemyśle kosmetycznymi farmaceutycznym [20]. Są trujące dla zwierząt zmiennocieplnych,natomiast ich działanie toksyczne w stosunkudo zwierząt stałocieplnych jest znikome, co może wynikaćze słabej przyswajalności tych substancji przy podawaniudrogą pokarmową. Ekstrakty z wielu roślin zawierające saponinysą stosowane od dawna w medycynie ludowej wielukultur [21]. Wiadomo, że związki te wykazują właściwościhemolityczne. Saponiny są detergentami, mogą więc powodowaćniszczenie błony erytrocytów, ich pękanie i wyciekhemoglobiny [22]. Stwierdzono także ich przeciwzapalnedziałanie [23-25].40

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Możliwości zastosowania roślinz rodzaju Trifolium w profilaktycei leczeniu różnych choróbDziałanie fitoestrogenoweSzczególną uwagę zwraca się na zawarte w koniczynachizoflawonoidy ze względu na ich aktywność estrogenową.Liczne badania wskazują, że fitoestrogeny są pomocnew terapii zaburzeń związanych z menopauzą, mogą takżeznacząco obniżać ryzyko choroby wieńcowej i nowotworówhormonozależnych, takich jak rak piersi, czy gruczołukrokowego [26]. Dlatego też preparaty roślinne zawierająceizoflawony stanowią składnik wielu suplementów i produktówwspomagających leczenie. Ponieważ głównym źródłemtych związków oprócz nasion soi jest koniczyna czerwona,zwraca się coraz większą uwagę na tę i inne rośliny należącedo rodzaju Trifolium. W liściach i łodydze koniczynyczerwonej wykazano obecność 31 związków o charakterzeizoflawonów, w korzeniu 25, a w kwiatach 26 [27]. Koniczynata jest źródłem m.in. formononetyny, biochaniny A,daidzeiny i genisteiny [28, 29]. Pojawia się coraz więcej danychdotyczących zastosowania suplementacji tych substancjiw profilaktyce niektórych nowotworów i chorób układukrążenia. Badana kliniczne wskazują, że 4-tygodniowa terapiaizoflawonami z koniczyny czerwonej powoduje wzrostpoziomu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) u kobiet[30]. Badania nad przeciwnowotworowym działaniem fitoestrogenówzawartych w koniczynie czerwonej wskazują,że mogą mieć one istotne znaczenie w hamowaniu postępuzmian nowotworowych. Nie stwierdzono ponadto występowaniaskutków ubocznych, charakterystycznych dlaterapii estrogenowej stosowanej w raku prostaty, a więczwiększenia potencjału prokoagulacyjnego krwi i aktywacjipłytek krwi, prowadzących do powikłań zakrzepowo-zatorowych[31]. Ekstrakt z koniczyny czerwonej posiada takżewłaściwości antyangiogenne i przeciwzapalne, co zwiększajego wartość terapeutyczną jako potencjalnego lekuw chemoprewencji nowotworów i innych chorób związanychz przewlekłym stanem zapalnym [32]. Stwierdzonoteż, że ekstrakt z koniczyny czerwonej działa przeciwmiażdżycowopoprzez zmniejszenie ekspresji białek adhezyjnychICAM-1 i VCAM-1 na leukocytach, co ograniczaich przyleganie do śródbłonka [33]. Genisteina obecnaw różnych koniczynach, wykazuje aktywność przeciwnowotworową,wynikającą ze zdolności wpływania na funkcjonowaniereceptorów estrogenowych, kinaz tyrozynowychi topoizomerazy. Przeciwnowotworowe działanie genisteinypotwierdzono w badaniach nad rakiem prostaty i piersi.Wykorzystanie hodowli komórkowych pozwoliło wykazać,że izoflawon ten wykazuje działanie antyproliferacyjne zarównow stosunku do komórek estrogenozależnych, jak i estrogenoniezależnych[34]. Biochanina A natomiast posiadawłaściwości przeciwzapalne, które mogą mieć zastosowaniew zapobieganiu chorobom neurodegeneracyjnym. Stwierdzono,że poprzez hamowanie aktywacji komórek mikroglejui generowania czynników prozapalnych, związek tenchroni neurony dopaminergiczne przed uszkodzeniami wywołanymiprzez lipopolisacharyd bakteryjny (LPS) [35].Zarówno bogaty w izoflawony ekstrakt z koniczyny czerwonej,jak i fitohormony genisteina oraz biochanina A mogąmieć również działanie lecznicze w terapii zespołu metabolicznego,z uwagi na zdolność wiązania się do receptora γaktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARγ)[36]. Zespół metaboliczny obejmuje szereg czynników,takich jak otyłość, podwyższone stężenie trójglicerydówwe krwi ≥150 mg/dl, obniżone stężenie HDL-cholesterolu(mężczyźni < 40 mg/dl, kobiety < 50 mg/dl), ciśnienie tętnicze≥130/≥85 mmHg oraz glikemia na czczo ≥100 mg/dl.Jednoczesne występowanie już 2-3 tych zaburzeń wiąże sięze zwiększeniem ryzyka rozwoju miażdżycy, cukrzycy typu2 i powikłań sercowo-naczyniowych [37]. Główną fizjologicznąrolą receptora PPARγ jest regulacja transkrypcji genówdla białek biorących udział w różnicowaniu adipocytówi w metabolizmie lipidów. Poza regulacją gospodarki lipidowej,receptor PPARγ reguluje także przemiany węglowodanów.Aktywatory receptora pobudzają glikolizęi zmniejszanie glukoneogenezy w hepatocytach, regulują poziominsuliny i zmniejszają ciśnienie tętnicze [38]. Ekstraktz koniczyny czerwonej, genisteina, biochanina A oraz ichmetabolity są ligandami aktywującymi PPARγ. Z tegowzględu sugeruje się możliwość ich leczniczego zastosowaniajako czynnika ograniczającego część procesów patologicznychskładających się na zespół metaboliczny [36].Aktywność antyoksydacyjnaBadania nad zawartością związków biologicznie aktywnychw roślinach należących do rodzaju Trifolium wskazująna dużą zawartość związków polifenolowych o dobrze jużznanej lub badanej aktywności antyoksydacyjnej. Wykazanom.in., że kwiaty koniczyny białej są źródłem wielu polifenolio aktywności przeciwutleniającej, takich jak kwercetyna,galokatechina, epigalokatechina, kempferol i inne [39]. Zawartaw koniczynie czerwonej formonetyna, oprócz aktywnościestrogenowej może być efektywnym antyoksydantem.Wykazano, że fitohormon ten przeciwdziała skutkom stresuoksydacyjnego. W badaniach in vivo na zwierzętach, podawanieformonetyny powodowało zmniejszenie peroksydacjilipidów oraz wzrost aktywności głównych enzymówantyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD),katalazy oraz peroksydazy glutationowej zawierającej selenocysteinę(GSH-Px) [40]. Sabudak i wsp. [41] jako pierwsistwierdzili, że również T. resupinatum posiada przeciwutleniającei przeciwzapalne właściwości. Zaobserwowalioni, że ekstrakt z tej rośliny efektywnie chroni lipidy przezperoksydacją, co prawdopodobnie związane jest ze zmiataniemwolnych rodników przez zawarte w nim flawonoidy.Autorzy podkreślają także biologiczną aktywność triterpenówsaponin, związków o bardzo zróżnicowanej aktywności,obejmującej działanie przeciwzapalne, antyalergicznei przeciwnowotworowe.Również inny, dotąd mało znany gatunek – T. pallidumwydaje się być obiecującym źródłem fitozwiązków o działaniuleczniczym. Nadziemne części tej koniczyny opróczizoflawonów, kwasów fenolowych i flawonoidów zawierająduże ilości clovamidu - 13 mg/g suchej masy. T. pallidumjest najzasobniejszą w ten związek rośliną poznaną do tejpory. Właściwości tego gatunku dopiero zaczynają być badane,jak dotąd nie ma żadnej polskojęzycznej nazwy dla41

Farm Przegl Nauk, 2010, 7Ryc. 2. Struktura: clovamidu (A), kwasu kawowego (B)i kwasu rozmarynowego (C).tej koniczyny. Występuje ona w Europie, zachodniej Azjii Północnej Afryce. T. pallidum przebadano jedynie podwzględem zawartości związków fenolowych. Clovamid(N-kawoilo-L-DOPA) jest pochodną kwasu kawowego,a pod względem struktury jest bardzo podobny do kwasurozmarynowego (Ryc. 2.), związków o właściwościach antyoksydacycjnych[42]. Po raz pierwszy zidentyfikowanogo w koniczynie czerwonej [43]. Dotychczas dla celów naukowychclovamid izolowano z ziaren kakaowca. W różnorodnychbadaniach wykazano zdolność tego związku doneutralizacji wolnych rodników przewyższającą zdolnościkwasu galusowego i kwercetyny [44, 45]. Pochodne clovamidutakże wykazują właściwości antyoksydacyjne, zbliżonea nawet większe w porównaniu do znanych przeciwutleniaczy- kwasu askorbinowego i α-tokoferolu. Szczególniesilne działanie chroniące lipidy przed utlenianiem wykazałyester metylowy N-kawoilo-L-tyrozyny i ester alkilowy N-kawoilo-L-dihydroksyfenyloalaniny[46].Piśmiennictwo1. Sakamoto S, Kfuji S, Kuroyanag, M, Ueno A, Sekita S.Saponins from Trifolium repens. Phytochemistry 1992;31: 1773-1777.2. Stochmal A, Oleszek W. The changes of cyanogenicglucosides in white clover (Trifolium repens L.) duringthe growing season. J Agric Food Chem 1997; 11:4333–4336.3. Red clover (Trifolium pratense). In: Coates P, BlackmanM, Cragg G, et al., eds. Encyclopedia of Dietary Supplements.New York, NY: Marcel Dekker; 2005: 587-602.4. Tice JA, Ettinger B, Ensrud K. i wsp. Phytoestrogensupplements for the treatment of hot flashes: the IsoflavoneClover Extract (ICE) study. J Am Med Assoc2003; 290(2): 207-214.5. Fugh-Berman A, Kronenberg F. Red clover (Trifoliumpratense) for menopausal women: current state ofknowledge. Menopause. 2001; 8(5): 333-337.6. Strzelecka H, Kowalsi J. Encyklopedia zielarstwa i ziołolecznictwa.Wyd. naukowe PWN Warszawa 2000,wyd. 1, 242-243.7. Kurzer MS, Xu X. Dietary phytoestrogens. Annu RevNutr 1997; 17: 353-381.8. Occhiuto F, Zangla G, Samperi S, Palumbo DR, Pino A,De PasqualeR, Circosta C. The phytoestrogenic isoflavonesfrom Trifolium pratense L. (Red clover) protectshuman cortical neurons from glutamate toxicity. Phytomedicine2008; 15: 676-682.9. García-Martínez MC, Hermenegildo C, Tarín JJ, CanoA. Phytoestrogens increase the capacity of serum to stimulateprostacyclin release in human endothelial cells.Acta Obstet Gynecol Scand 2003; 82(8): 705-710.10. Oleszek W, Stochmal A, Janda B. Concentration of isoflavonesand other phenolics in the aerial parts of Trifoliumspecies. J Agri Food Chem 2007; 55: 8095-8100.11. Polasek J, Queiroz EF, Hostettmann K. On-line identificationof phenolic compounds of Trifolium species usingHPLC-UVMS and post-column UV-derivatisation. PhytochemAnal 2007; 18: 13-23.12. Isik E, Sabudak T, Oksuz S. Flavonoids from Trifoliumresupinatum var. microcephalum. Chemistry of NaturalCompounds 2007; 43(5): 506-507.13. Sharaf M. Chemical constituents from the seeds of Trifoliumalexandrinum. Nat Prod Res 2008; 22(18): 1620-3162.14. Boots AW, Haenen GR, Bast A. Health effects of quercetin:from antioxidant to nutraceutical. Eur J Pharmacol2008; 585(2-3): 325-337.15. Molina MF, Sanchez-Reus I, Iglesias I, Benedi J. Quercetin,a flavonoid antioxidant, prevents and protectsagainst ethanol-induced oxidative stress in mouse liver.Biol Pharm Bull 2003; 26(10): 1398-1402.16. Bischoff SC. Quercetin: potentials in the prevention andtherapy of disease. Curr Opin Clin Nutr Metab Care2008; 11(6): 733-340.17. Xu YC, Yeung DKY, Man RYK, Leung SWS. Kaempferolenhances endothelium-independent and dependentrelaxation in the porcine coronary artery. Mol Cell Biochem2006; 287: 61-67.18. Auger C, Al-Awwadi N, Bornet A i wsp. Catechins andprocyanidins in Mediterranean diets. Food Res Int 2004;37: 233-245.19. Schroeder P, Klotz L-O, Sies H. Amphiphilic propertiesof (-)-epicatechin and their significance for protectionof cell against peroxynitrite. Biochem Biophys ResCommun 2003; 307: 69-73.20. Vincken J-P, Heng L, de Groot A, Gruppen H. Saponins,classification and occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry2007; 68: 275-297.21. Sparg SG, Light ME, van Staden J. Biological activitiesand distribution of plant saponins. J Ethnopharmacol2004; 94: 219-243.22. Baumann E, Stoya G, Völkner A, Richter W, LemkeC, Linss W. Hemolysis of human erythrocytes with saponinaffects the membrane structure. Acta Histochem2000; 102: 21-35.23. Just MJ, Recio MC, Giner RM, Cuéllar MJ, MañezS, Bilia AR, Rios J-L. Anti- inflammatory activity ofunusual lupane saponins from Bupleurum fruticescens.Planta Med 1998; 64: 404-407.24. Navarro P, Giner RM, Recio MC, Máñez S, Cerdá-Nicolas M., Rios JL. In vivo anti-inflammatory activityof saponins from Bupleurum rotundifolium. Life Sci 68;1199–1206.42

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-507325. Sirtori CR. Aescin: Pharmacology, pharmacokinetics andtherapeutic profile. Pharmacol Res 2001; 44: 183-193.26. Adlercreutz H, Mazur W. Phytoestrogens and Westerndiseases. Ann Med 1997; 29: 95-120.27. Wu Q, Wang M, Simon JE. Determination of isoflavonesin red clover and related species by high-performanceliquid chromatography combined with ultraviolet andmass spectrometric detection. J Chromatogr A 2003;1016: 195-209.28. Liu J, Burdette JE, Xu H, Gu C, van Breemen RB, BhatKP, Booth N i wsp. Evaluation of estrogenic activity ofplant extracts for the potential treatment of menopausalsymptoms, J Agri Food Chem 2001; 49: 2472-2479.29. Beck V, Unterrieder E, Krenn L, Kubelka W, JungbauerA.Comparison of hormonal activity (estrogen, androgenand progestin) of standardized plant extracts for largescale use in hormone replacement therapy. J SteroidBiochem Mol Biol 2003; 84: 259-268.30. Campbell MJ, Woodside JV, Honour JW, Morton MS,Leathem AJC. Effect of red clover-derived isoflavonesupplementation on insulin-like growth factor, lipid andantioxidant status in healthy female volunteers: a pilotstudy. Eur J Clin Nutr 2004; 58: 173-179.31. Jarred RA, Keikha M, Dowling C, McPherson SJ, Clare AM,Husband AJ, Pedersen JS, Frydenberg M, Risbridger GP. Inductionof apoptosis in low to moderate-grade human prostatecarcinoma by red clover-derived dietary isoflavones. CancerEpidemiol Biomarkers Prev 2002; 11: 1689-1696.32. Krenn L, Paper DH. Inhibition of angiogenesis and inflammationby an extract of red clover (Trifolium pratenseL.). Phytomedicine 2009; 16:1083-1088.33. Simoncini T, Garibaldi S, Fu XD, Pisaneschi S, BegliuominiS, Baldacci C, Lenzi E, Goglia L, Giretti MS,Genazzani AR Effects of phytoestrogens derived fromred clover on atherogenic adhesion molecules in humanendothelial cells. Menopause 2008; 15(3): 542-550.34. Grynkiewicz G, Achmatowicz O, Pucko W. Bioaktywnyizoflawon genisteina - perspektywy zastosowań medycznych.Post Fitoter 2000; 3:15-20.35. Chena H-Q, Jin Z-Y, Li G-H. Biochanin A protects dopaminergicneurons against lipopolysaccharide-induceddamage through inhibition of microglia activationand proinflammatory factors generation. Neurosci Lett2007; 417: 112-117.36. Mueller M, Jungbauer A. Red clover extract: a putativesource for simultaneous treatment of menopausal disordersand the metabolic syndrome. Menopause 2008;15(6): 1120-1131.37. Wożakowska-Kapłon B, Bartkowiak R, Stępień A. Zespółmetaboliczny – epidemia naszych czasów, nowadefinicja, cele działań prewencyjnych i leczniczych.Przew Lek 2005; 6: 32-38.38. Gacka M, Adamiec R. Nadciśnienie tętnicze a funkcjareceptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomówγ. Arterial Hypertension 2003; 7: 281-285.39. Foo LY, Lu Y, Molan AL, Wood DR, McNabb WC. Thephenols and prodelphinidins of white clover flowers.Phytochemistry 2000; 54: 539-548.40. Mu H, Bai Y-H, Wang S-T, Zhu Z-M, Zhang Y-W. Researchon antioxidant effects and estrogenic effect of formononetinfrom Trifolium pratense (red clover). Phytomedicine2009; 16: 314-319.41. Sabudak T, Dokmeci D, Ozyigit F, Isik E, Aydogdu N.Antiinflammatory and Antioxidant Activities of Trifoliumresupinatum var. microcephalum extracts. Asian JChem 2008; 20: 1491-1496.42. Shahidi F, Chandrasekara A. Hydroxycinnamates andtheir in vitro and in vivo antioxidant activities. PhytochemRev (2010) 9: 147–170.43. Szajwaj B, Stochmal A, Mołdoch J, Janda B, OleszekW. Preparative isolation of clovamide from Trifoliumpallidum aerial plants. Bioactive Plant Compounds- Structural and Applicative Aspects 2009;56: 10-11.44. Arlorio M, Locatelli M, Travaglia F, Coïsson J-D,Del Grosso E, Minassi A, Appendino G, Martelli A.Roasting impact on the contents of clovamide (Ncaffeoyl-L-DOPA)and the antioxidant activity of cocoabeans (Theobroma cacao L.). Food Chem 2008;106: 967-975.45. Sanbongi C, Osakabe N, Natsume M, Takizawa T,Gomi S, Osawa T. Antioxidative polyphenols isolatedfrom Theobroma cacao. J Agric Food Chem 1998; 46:454-457.46. Ley JP, Bertram HJ. Synthesis of lipophilic clovamidederivatives and their antioxidative potential againstlipid peroxidation. J Agric Food Chem 2003; 51:4596-4602.data otrzymania pracy: 21.06.2010 r.data akceptacji do druku: 29.06.2010 r.Adres do korespondencji:Joanna KołodziejczykKatedra Biochemii OgólnejUniwersytet Łódzkiul. Banacha 12/16, 90-237 Łódźtel. +48 42 635 44 82,e-mail: joannak@biol.uni.lodz.pl43

Farm Przegl Nauk, 2010, 7INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OFMANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewedtransdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicineand related sciences. The journal publishes conferencereports and materials, conference announcements, as well asletters to the Editor.2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printedand an electronic form. Electronic versions of articles are to besent to kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl or supplied onCD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagramsand figures) should be addressed to:Scientific Review in Pharmacy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Disk label should contain the first name(s) and surname(s)of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphicsshould be included in separate files. Do not paste pictures andgraphics to text files. The Editor advises to use Star Office,Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.3. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief.The Authors are encouraged to suggest their reviewers,however the final selection of a reviewer is up to the EditorialBoard. The Editor-in-Chief reserves the right to correct orabbreviate the text (after the Author’s approval).Authors are requested to resubmit the revised manuscriptwithin four weeks. Papers that are not resubmitted withinfour weeks will be treated as a new submission.The manuscript that has been rejected by the ScientificReview in Pharmacy should not be resubmitted.4. A cover letter should be included with the manuscript, containinga declaration that the manuscript has not been previouslypublished in print or electronic format and is not under considerationby another journal or electronic medium, signed by allthe Authors. It should also include written approval from thehead of the institution in which the study was conducted.5. All human and animal research will have obtained ethical consentfrom the local Bioethical or Ethical Committee.6. The material sent in and the review will remain among thedocumentation of the Board of Editors.7. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the wholeof the copyrights for the published papers (including the rightto publishing in print, on electronic media, such as CD-ROMdisks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries isallowed without any written permission of the Editor.8. Instructions for authors:8.1. Manuscript Page Setup• Paper: white, A4 format.• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.• Text: Double-spaced, one side of the page only.• Numbering: Insert page numbers at bottom right of eachpage.• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extraline space between paragraphs.• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,with one line above. Indent first line after a subhead. Use anextra line space between the subhead and the text.• Title or Heading of the article: boldface, on separateline.• Second-level subhead: boldface, on separate line.• Third-level subhead: italic, on separate line.8.2. Organization of Manuscript• Title page should include: submission date and Author(s)full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’full current affiliations (for papers with multiply authors,please enumerate the authors and their affiliations in thefollowing way: Author 1 , Author 2 , etc; 1 Affiliation, 2 Affiliation,etc.). Affiliations should contain the full name of the institution.One corresponding author must be designated forpapers with coauthors. At the bottom of the page the fullname, academic degrees/titles, and address of the correspondingauthor should be given, including the telephonenumber, fax number and/or e-mail address. If researchhas been funded, please indicate the source of funding(including grant index/symbol, grant agencies, corporations,or sponsors).• The second page should include an abstract (150-250words). The abstract must be self-contained, and must notrequire reference to the paper to be understood. The abstractshould present objectives and scope of the study orreasons for writing the paper. The methods and techniquesor approaches should be described only to the extent necessaryfor comprehension. The findings and conclusionsshould be concise and informative. The abstract shouldbe followed by the key words consistent with the MedicalSubject Headings Index Medicus, and should not containunfamiliar terms that are not defined, undefined acronymsand reference citations. Neither displayed equations orlists should appear in the abstract.• Body text should be organized as follows:original paper - introduction, material and methods descriptions,research results, discussion;review papers – free structure;case studies – introduction (motivation for the study), casedescriptions, discussion of the characteristic symptoms,treatment results etc.• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-whitephotographs) should be put into a separate envelope. Oneach figure there should be its number (Arabic numerals),the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.Figure captions should be placed on separate pages andnumbered consecutively using Arabic numerals. Previouslypublished visual materials should be supplied togetherwith the written consent of the Publisher for reprint.• Tables, each on a separate page, should be numberedusing Roman numerals and preceded by their captions.Table captions should be placed on separate pages, numberedusing Roman numerals.• The papers should not exceed the following limitations:original and review work – 10 pages and others – 5 pages.8.3. References to the works cited should be presented at theend of the paper and arranged according to the sequenceof citations in the body text. The acronyms for journal titlesshould be used according to Index Medicus. Each entry,starting with a new line, should be given a number andmust be presented as follows:• journal citation:Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:557-67.If there are more than three authors, the name of the firstone should be given, followed by an ,,et al” annotation.Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activity andglycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:97-102.• the specific chapter:Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. BiochemiaHarpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.Warszawa 1994, 59-69.• monograph:Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw2004.References to the works cited within the text should be numberedusing Arabic numerals and placed between brackets,e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations:original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliographyentries.44

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowaneprace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe,z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych.Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na tematkonferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłaćw formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:Farmaceutyczny Przegląd Naukowy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:CMYK, rozdzielczość 300 dpi.3. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonychkażdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca sięautorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcjazastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniuz autorem).Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu,zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającymczterech tygodni. W przeciwnym raziepraca będzie traktowana jako nowa publikacja.Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta niemoże być ponownie przedkładany Redakcji FarmaceutycznegoPrzeglądu Naukowego.4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie byłauprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcjiinnego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawieraćrównież podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodęKierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczeniepublikacji w czasopiśmie.5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, któresą przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, musząmieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacjiRedakcji.7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskichdo wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, nanośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszczasię natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.8. Instrukcje dla autorów8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, nabiałym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnegoodstępu między kolejnymi wierszami.• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy odstrony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnymrogu.• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowychodstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównanedo lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstemnależy wprowadzić jeden odstęp.• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubionączcionką.• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochylonączcionką,8.2 Układ manuskryptu• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora-(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowychprzy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliacjękażdego z nich, w następujący sposób Autor 1 , Autor 2 ,…; 1 Afiliacja, 2 Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim,nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję,dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanychprosimy o wskazanie źródła finansowania (w tymnumery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lubsponsorów).• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będąceautonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczaćodnośników literaturowych. Streszczenie powinnozawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawoweprocedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych,metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Podstreszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w językupolskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject HeadingsIndex Medicus.• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,według następującego schematu:prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,dyskusja oraz wnioski;prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziałyi podrozdziały;prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby,charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe)powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane,opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać naoddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframiarabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane,należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy naponowną publikację.• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należyponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułamiumieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać naoddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframirzymskimi.• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinnawynosić 10, a pozostałych – 5 stron.8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowaniaw tekście pracy.Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z IndexMedicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,powinna być opatrzona numerem oraz zredagowanazgodnie z niżej podanym przykładem:• czasopismo naukowe:np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibroticdisorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podaćnazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activityand the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;331: 97-102.• wydawnictwo zbiorowe:np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: BiochemiaHarpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 1994, 59-69.• monografia:np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław2004.Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych,powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracachoryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do10 pozycji.45

WYDAWCA6PRENUMERATAProsimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literamii dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeratyotrzymają Państwo po około 2 tygodniachod dokonania wpłaty.Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeratyi Kolportażu:Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-BiałaTEL. 033 817 38 99Nr rachunku odbiorcy:0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158ODBIORCA:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/274 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............Nr rachunku odbiorcy:0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158ODBIORCA:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/274 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............