Pokaż caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy
Pokaż caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy
Pokaż caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<strong>Farmaceutyczny</strong>www.fpn.info.plCena 24,50 złPISMO POD PATRONATEMPrzeglądWYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU<strong>Naukowy</strong>MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66MNiSW 4ROK VI (X)Nr 9/2009 (56)MiesięcznikScientific Review in PharmacyApplication of EPR Spectroscopyto Examinationof Gamma-irradiated ErythromycinModelowe postacie wybranych środkówznieczulenia miejscowego.Cz. I. Charakterystyka postaci farmaceutycznej0Neurotoksyczność leków– stale aktualny problem farmakoterapiiPrzeciwnowotworoweoraz cytotoksyczne działanie propolisu 0Obserwacje kliniczne zwierząt 0w badaniach toksykometrycznychLudzkie topoizomerazy jako cel komórkowy 0współczesnej chemioterapiIISSN 1425-5073Wpływ łącznego stosowania leku Ukraini Metotreksatu na niektóre parametrybiochemiczne w surowicy krwi myszy 1świadczące o funkcji nerek 0
<strong>Farmaceutyczny</strong>PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACHMiesięcznikPrzegląd <strong>Naukowy</strong>Scientific Review in PharmacyIndex Copernicus 3,66MNiSW 4Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:Prof. dr hab. Krystyna OlczykAdres redakcji / Editorial Adress:ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / PolandTel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax. + 48 32 364 11 58E-mail: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.plKonsultacyjna Rada Naukowa / Scientific BoardPrzewodniczący / Head:Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - SosnowiecCzłonkowie / Members:Prof. dr hab. Edward Bańkowski - BiałystokProf. dr Karmela Barišić - Zagreb, ChorwacjaProf. dr hab. Jerzy Brandys - KrakówProf. dr Vitalis Briedis - Kaunas, LitwaProf. dr hab. Elżbieta Brzezińska - ŁódźProf. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, HiszpaniaProf. dr. Lionel Buéno - Toulouse, FrancjaProf. dr hab. Kazimierz Głowniak - LublinProf. dr hab. Edmund Grześkowiak - PoznańProf. dr Filiz Hincal - Ankara, TurcjaProf. dr. Michael Horowitz - Adelaide, AustraliaProf. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, AustriaSekretarz <strong>Naukowy</strong> / Scientific Board Secretary:Dr n. med. Robert D. WojtyczkaE-mail: fpn@kwiecinski.plProf. dr hab. Renata Jachowicz - KrakówProf. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - LublinProf. dr hab. Krzysztof Jonderko - SosnowiecProf. dr hab. Marcin Kamiński - KatowiceProf. dr Vesna Kuntić - Belgrade, SerbiaProf. dr hab. Jan Pachecka - WarszawaProf. dr hab. Jerzy Pałka - BiałystokProf. dr hab. Janusz Pluta - WrocławProf. dr hab. Janusz Solski - LublinProf. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, JaponiaProf. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, FrancjaProf. dr hab. Marek Wesołowski - GdańskProf. dr Mira Zečević - Belgrade, SerbiaCzłonkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:Dr n. farm. Paweł OlczykDr n. biol. Małgorzata KępaMgr Anna SzeremetaMgr Agnieszka Jura – PółtorakDr n. hum. Anna KierczakWydawca / Publisher:Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoAdres Wydawcy / Publisher Adress:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Polandtel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor:Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy PartykaE-mail: agnieszka.romanska@kwiecinski.plNakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies<strong>Farmaceutyczny</strong> Przegląd <strong>Naukowy</strong> jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego.Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawachz 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowanianadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodąwydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcjanie odpowiada.All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyrightlaws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves therights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprintsare allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible foradvertisements and reader letters.
Zdj. Zygmunt WieczorekSzanowni Państwo,Koleżanki i Koledzy,Drodzy CzytelnicyW ślad za poprzednim <strong>numer</strong>em FarmaceutycznegoPrzeglądu Naukowego, do którego nie tak dawno przygotowywałamparę słów tytułem wstępu, zaproszenia i zachęceniaPaństwa do lektury jego zawartości, już pojawia siękolejny <strong>numer</strong> czasopisma, a ja już donoszę o ważnych wydarzeniachnaukowych z życia polskiej farmacji.Tradycyjnie, na wstępie informujemy o wydarzeniachnaukowych, jakimi są Zjazdy, Konferencje czy Sympozja,krajowe i zagraniczne. I tak, miło mi Państwa powiadomić,iż już niebawem, bowiem 3 grudnia br., w Sali KonferencyjnejNaczelnej Izby Lekarskiej, w Warszawie, przy ulicySobieskiego 110, odbędzie się Konferencja z cyklu „Zawodymedyczne na ziemiach polskich w XIX i XX wieku”,zatytułowana „Zawód lekarza na ziemiach polskich w XIXi XX wieku”. Pomysłodawcą i niezawodnym Organizatoremcyklicznych Konferencji z wymienionego zakresu jestPani dr hab. Bożena Urbanek, Kierownik Katedry NaukSpołecznych, Wydziału Farmaceutycznego Śląskiego UniwersytetuMedycznego w Katowicach. Pierwsza z Konferencjiomawianego cyklu odbyła się w 2004 roku i nosiłatytuł: „Zawód położnej na ziemiach polskich w XIX i XX”.Kolejna, pod tytułem „Zawód farmaceuty na ziemiach polskichw XIX i XX wieku” odbyła się w dwa lata później, zaśnastępna – zorganizowana w 2008 roku, nosiła tytuł „Zawódpielęgniarki na ziemiach polskich w XIX i XX wieku”.Gratulujemy Pani Docent inwencji, oraz konsekwencjii niezwykłego zaangażowania w promowanie wiedzy o najistotniejszychwydarzeniach z życia wybitnych przedstawicieliwymienionych zawodów medycznych na przestrzeniminionych lat. Dziękujemy za zapisywanie kolejnych kartnaszej historii.Na szczególną także uwagę zasługuje Przedsięwzięcie,organizowane przez Sekcję Studencką Polskiego TowarzystwaFarmaceutycznego – Młoda Farmacja, działającą przyWydziale <strong>Farmaceutyczny</strong>m w Bydgoszczy. Przedsięwzięcieto, III Ogólnopolski Kongres <strong>Naukowy</strong> Młodej Farmacji– Bydgoszcz 2009, obejmować będzie wykłady i dyskusjeprowadzone przez nauczycieli akademickich, stanowiąceplatformę do wymiany poglądów i sposobność do zdobyciaprzez studentów wiedzy i nowych, naukowych doświadczeń.W czasie Kongresu odbędzie się także Konkurs studenckichprac naukowych. Z pewnością pojawią się takżeprace z zakresu opieki farmaceutycznej. Umiejętność stosowaniawiedzy z tej właśnie dziedziny nauk farmaceutycznych,na co dzień, jest powinnością każdego, zatrudnionegow aptece farmaceuty. Do rzetelnego krzewienia tej wiedzyprzygotowują się nasze Wydziały Farmaceutyczne, a nowestandardy edukacyjne, uwzględniające w kształceniu przeddyplomowymprzedmiot opieka farmaceutyczna, czekają naakceptację przez Radę Główną Szkolnictwa Wyższego.A w naszym bieżącym <strong>numer</strong>ze – artykuły z różnychośrodków naukowych w Polsce. Zapraszam serdecznie doich lektury.Zapraszam w dalszym ciągu, już tradycyjnie, nieustająco,Autorów prac – na łamy Farmaceutycznego PrzegląduNaukowego. Publikujemy prace szybko, a nasze możliwościwydawnicze – zważywszy, iż <strong>FPN</strong> jest miesięcznikiem, sąznaczne.W oczekiwaniu na Państwa prace, z życzeniami owocnejlektury,załączam jesienne, serdeczne pozdrowienia,Redaktor NaczelnyProf. dr hab. Krystyna Olczyk
<strong>Farmaceutyczny</strong>PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACHMiesięcznikPrzegląd <strong>Naukowy</strong>Scientific Review in PharmacyNr 9 / 2009Index Copernicus 3,66MNiSW 4Spis treściApplication of EPR spectroscopy to examinationof gamma-irradiated erythromycin0 8Zastosowanie spektroskopii EPR 0do badań gamma-napromieniowanej erytromycynyModelowe postacie wybranych środków znieczulenia miejscowego.Cz. I. Charakterystyka postaci farmaceutycznej0 12Model drug formulations of selected of local anesthetics.Part I.The characterization of the drug formulationNeurotoksyczność leków– stale aktualny problem farmakoterapii0 18Drug neurotoxicity– current problem of pharmacotherapyPrzeciwnowotworowe oraz cytotoksyczne działanie propolisu 0 22The anticancer and cytotoxic activity of propolisObserwacje kliniczne zwierząt 0w badaniach toksykometrycznych0 25Clinical observations of animals in toxicometric studiesLudzkie topoizomerazy jako cel komórkowy 0współczesnej chemioterapii0 30Human topoisomerases as a cellular target of current chemotherapy0Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain i Metotreksatuna niektóre parametry biochemiczne w surowicy krwi myszy świadczące o funkcji nerek0 34Effect of simultaneous treatment with Ukraine and Methotrexateon some biochemical parameters of mice serum indicating 0on kidney function
Zawód lekarzana ziemiach polskichw XIX i XX wieku3 grudnia 2009 godz. 10:00Sala konferencyjnaNaczelnej Izby Lekarskiejw Warszawie, ul. Sobieskiego 110
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Konferencja na tematZawód lekarza naziemiach polskichw XIX i XX w.(w siedzibie NaczelnejIzby Lekarskiej)Zakład Historii Medycyny i Farmacji Katedry NaukSpołecznych Śląskiego Uniwersytetu Medycznego uprzejmiezawiadamia a zarazem zaprasza na konferencję z cykluZawody medyczne na ziemiach polskich w XIX i XXw., poświęconą tym razem Zawodowi lekarza na ziemiachpolskich w XIX i XX w. Współorganizatorem konferencji,która, odbędzie się 3 grudnia 2009r w Naczelnej IzbieLekarskiej w Warszawie jest Instytut Historii NaukiPAN, Naczelna i Okręgowe Izby Lekarskie (stolicy i Mazowsza).Podczas trwania konferencji będzie mała miejscepromocja publikacji pod podanym powyżej tematem.W programie przewidziano referaty związane z rozwojemprofesji lekarza w dwóch ostatnich stuleciach. Szczegółowozaś kształceniem, doskonaleniem zawodowym, kształtowaniemsię poszczególnych specjalności, statusem społeczno-prawnyma także warunkami socjalno- bytowymiw tym okresie. Pragniemy także pokazać zmieniający sięna przestrzeni stulecia warsztat pracy lekarza wybranychspecjalności w tym chirurga czy rentgenologa. Prezentowanetreści referatów opracowano na bazie różnorodnychźródeł w tym czasopiśmiennictwa lekarskiego, archiwaliów,w tym niejednokrotnie unikatowych a nawet osobistychwspomnień czy listów, zebranych w całym kraju. Przedmiotemnaszych penetracji są ziemie polskie wszystkich zaborów,okresu II Rzeczypospolitej a następnie czasów PRL.W konferencji uczestniczyć będą historycy, historycy - medycyny,lekarze z całego kraju i zagranicy.Pragniemy dodać, że konferencja została także wpisanaw obchody 200 lecia istnienia warszawskiego WydziałuLekarskiego, który także przejął opiekę naukową nadkonferencją. Tegoroczna jest piątą z cyklu organizowanąprzez Zakład Historii Medycyny i Farmacji ŚląskiegoUniwersytetu Medycznego. Przeprowadzone do tej porypoświęcone zostały następującym zawodom medycznym:zawodowi akuszerki – położnej; aptekarza –farmaceuty;dentysty – lekarza stomatologa. Ostatnia dotyczyła zawodupielęgniarki w XIX i XX w. i miała miejsce 15 września2008r., w Senacie RP. Owocem wszystkich wspomnianychkonferencji są tematyczne opracowania do nabyciaw Zakładzie Historii Medycyny i Farmacji ŚUM lubInstytucie Historii Nauki PAN.Serdecznie zapraszamywszystkich zainteresowanych,Dr hab. n. hum. Bożena UrbanekSpis treści (Konferencja pt. Zawód lekarzana ziemiach polskich w XIX i XX w.)Bożena Urbanek – Wstęp1. Anita Magowska- Lekarze na Wileńszczyźnie w I połowieXIX w.2. Walentyna, Krystyna Korpalska – Lekarze w rejencji bydgoskiejna przełomie XIX i XX wieku.3. Bożena Urbanek- Specjaliści w Królestwie Polskimw II połowie XIX w. do czasów I wojny światowej,w doniesieniach polskiej prasy medycznej (ze szczególnymuwzględnieniem Warszawy).4. Anna Marek – Urządzenie i wyposażenie sal operacyjnychw szpitalach warszawskich od początku XX w. do 1939 r.5. Maria Kempa, Kobiety lekarzami.6. Ewa Szmaj, Pierwsze kobiety – dermatolodzy zainteresowanisprawami kosmetyki na ziemiach polskich.7. Hanna Bojczuk – Medycy warszawskiego pogotowia ratunkowego(1897 –1939).8. Elżbieta Więckowska - Ogólna charakterystyka grupy zawodowejlekarzy II Rzeczypospolitej.9. Agnieszka Bukowska – Powstanie i działalność izb lekarskich.10. Andrzej Felchner - Lekarze wojskowi w armii II Rzeczypospolitej.11. Robert Gawkowski -Lekarze akademiccy w służbie sportuw 20- leciu .12. Grzegorz Mart – Metody i narzędzia propagandy higienymiędzywojnia.13. Joanna Majchrzyk Mikuła - Lekarze szkolni w Polscew latach 1918-1939.14. Małgorzata Marcysiak -Opieka lekarska w województwielwowskim od 1929 do 1939.15. Sylwia Kuźma- Markowska – Działacze ruchu ŚwiadomegoMacierzyństwa w latach 30. XX w.16. Jerzy Janiuk - Sylwetki lekarzy we wczesnych (1931-1939)utworach M. Choromańskiego17. Janina Fetlińska – Wkład lekarzy w rozwój społeczny i kulturalnyBieżunia.18. Jarosław Wanecki - W szpitalach płockich w latach 1939-1983.19. Wiesława Wardziak –Praca na rzecz jeńców wojennychpodczas IIwojny światowej. Działalność dr Henryka Grabowskiego20. Marcin Leśniewski – Akademickie środowisko Wilna połowyXX w.21. Magdalena Paciorek - Wizerunek lekarza w polskim filmiefabularnym.22. Maria Lipińska – W zwierciadle „Służby Zdrowia”, w latach1945-1956.23. Jacek Tomasz Persa, s. Aneta Krawczyk - Kościół, władza,lekarze w okresie PRL –u.24. Joanna Warmuzińska-Wnuk Lekarze Górnego Śląskaw medycynie XX w25. Jarosław Wanecki - Okręgowa Izba lekarska w Płocku od1989 do 2009.26. Ewa Blacha, Monika Warszawska – Udział lekarzaw eksperymencie lekarskim, eksperymencie medycznym naprzełomie XX wieku.7
Farm Przegl Nauk, 2009,9, 8-11Application of EPR spectroscopy to examinationof gamma-irradiated erythromycinZastosowanie spektroskopii EPRdo badań gamma-napromieniowanej erytromycynySławomir Wilczyński 1 , Barbara Pilawa 1 , Marta Ptaszkiewicz 2 , Ewa Pierzchała 3 , Jan Swakoń 2 , Paweł Olko 21Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach2Zakład Fizyki Radiacyjnej i Dozymetrii, Instytut Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie3Zakład Medycyny Estetycznej, Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachAbstractEPR spectra of erythromycin after gamma-irradiation byusing a 60 Co source at a dose of 25 kGy were analysed. Irradiationwas done in THERATRON 780E. Spectroscopicmeasurements were performed by the use of an X-band(9.3 GHz) EPR spectrometer with magnetic modulation of100 kHz. Concentration of paramagnetic centers after irradiationin the studied drug was 5x10 19 spin/g and its valuedecreases with increasing time of storage. Influence of microwavepower in the range of 0.7-70 mW on amplitudesand linewidths of the erythromycin’s lines was evaluated.The EPR lines saturated at lower microwave powers whenstorage time increased. Increase of spin-lattice relaxationtime in gamma-irradiated erythromycin points out that itsmolecular structure changes during storage.Key words: paramagnetic centers, EPR, microwave saturation,gamma-irradiation, erythromycinStreszczenieAnalizie poddano widma EPR gamma napromieniowanejerytromycyny. Próbki zostały gamma napromieniowanedawką 25 kGy przy użyciu aparatu THERATRON780E zawierającego izotop kobaltu 60 Co. Pomiary spektroskopowezostały przeprowadzone przy użyciu spektrometruEPR na pasmo X (9.3 GHz) z modulacją polamagnetycznego wynoszącą 100 kHz. Koncentracja centrówparamagnetycznych w badanym leku wynosiła5 x 10 19 spin/g a wartość ta spadała wraz z czasem przechowywaniapróbki. Analizowano wpływ mocy mikrofalowejw zakresie 0.7-70 mW na amplitudę i szerokość linii EPRerytromycyny. Wraz z czasem przechowywania próbki linieEPR nasycają się dla niższych mocy mikrofalowych. Przyspieszenieczasu relaksacji spin-sieć wskazuje na zmianyw strukturze chemicznej leku podczas jego przechowywania.Słowa kluczowe: centra paramagnetyczne, EPR, nasyceniemikrofalowe, promieniowanie gamma, erytromycyna1. IntroductionIn the last years drug sterilization by gamma-irradiationis very active investigate, because there are a lot of advantagesof this method: high penetrating power (drugs can besterilize in their final containers), low chemical reactivity,isothermal character of the gamma-rays, and radiosensitivityof microorganism [1]. The knowledge about formationof paramagnetic centers in drugs during radiosterilization isstill not enough. There is known EPR studies of gammairradiateddrugs [2-11], but a lot of antibiotics were not examinedso far. Paramagnetic centers in radiosterilized antibioticsmay be responsible for toxic effects in organism.In this work we examined radiosterilized antibiotic,which is often used in dermatology [12-14]. The aim of thiswork was to study concentrations of paramagnetic centersand spin-lattice interactions in gamma-irradiated erythromycin.Evolution of paramagnetic centers during storage ofthis antibiotic after irradiation was described. We comparedmicrowave saturation of erythromycin’s EPR spectra fordifferent times after samples irradiation.2. Material and Methods2.1. Sample CharacterizationRadiosterilized erythromycin was studied. Chemicalstructure of its molecule is presented in Figure 1 [14]. Erythromycinis a macrolide antibiotic produced from a strain ofactinomycetes Saccaropolyspora erythraea. It interferes8
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073EPR spectra of erythromycin in solid state at room temperaturewere obtained as first-derivative curves. The measurementswe performed by the use of an X-band (9.3 GHz)electron paramagnetic resonance spectrometer with magneticmodulation of 100 kHz. Microwave frequency wasmeasured with MCM 101 recorder.We used ultramarine as the reference for paramagneticcenters concentration. Additionally we measured for ultramarineand for sample EPR signals of the second reference-aruby crystal.Concentration of paramagnetic centers in the sample wascalculated as follow:with protein synthesis in sensitive bacterial cells [12-14]. Erythromycin binds to the 23S rRNA molecule inthe 50S of the bacterial ribosome, blocking the exit of thegrowing peptide chain thus inhibiting the translocationof peptides. Erthromycin is active against aerobic andanaerobic gram-positive cocci, Mycoplasma pneumoniae,Legionella and Bordetells pertussis. Erythromycinis also used for skin infections. Erthromycin is availablein enteric - coated tablets, slow release capsules, oralsuspensions, ophthalmic solutions, ointments, gels andinjections [12]. Paramagnetic centers may be importantin radiosterilized erythromycin existing in gels or injections.In this work erythromycin tablets were irradiated witha 60 Co source. On the basis of Polish and European Norms[15] of radiosterilization erythromycin was given a dose of25 kGy.2.2. EPR MeasurementsFig. 1. Chemical structure oferythromycin [14].N = n u[W uA ru/P u][P p/(W pA rpm p],where: n u- amount of paramagnetic centers in reference(ultramarine); P u, P p- areas under the absorption curve forultramarine and sample, respectively; W u, W p- receiver gainfor ultramarine, and sample, respectively; A ru, A rp- receivergains for ultramarine, and sample, respectively; m p- mass ofthe sample. Double integration was done for calculation ofarea under the absorption curves.Changes of integral intensity of erythromycin’s EPRline with increasing time of storage after irradiation wereanalyzed. Concentration of paramagnetic centers is proportionalto integral intensity.Influence of microwave power from 0.7 to 70 mW onamplitudes and linewidths of EPR spectra was examined.Correlations between parameters of EPR lines and microwavepower let us to determine type of paramagnetic centersdistribution in the sample. Decrease of EPR amplitudes andbroadening of EPR lines are characteristic for their homogenousdistribution in sample [16]. For inhomogeneous distributionamplitudes do not change with microwave powerafter reaching the maximum and linewidths remain constantindependently of microwave power [16]. We compared microwavesaturation of erythromycin’s EPR lines at 1, 9, and 37days after gamma-irradiation. Changes in microwave saturationof EPR lines reflect changes of chemical structure of sample.3. ResultsFig. 2. EPR spectra of gamma-irradiated erythromycin for times afterirradiation: 3, 5, 10, and 15 days. The data are presented for attenuationof 15 dB.EPR spectra were not obtained for the original erythromycin,while strong paramagnetism characterized thestudied gamma-irradiated antibiotic. For gamma-irradiatederythromycin we observed complex EPR spectra. ExemplaryEPR spectra of erythromycin for 3, 5, 10, and 15 days afterirradiation are compared in Figure 2. Paramagnetic centersconcentration after 3 hours from irradiation was 5x10 19spin/g. The amount of paramagnetic centers in erythromycindepends on storage time. Change of integral intensities oferythromycin’s EPR line with increasing time after sampleirradiation is presented in Figure 3. The integral intensitystrongly decreases during several days after irradiation.From 10 days after radiosterilization only slow decrease oferythromycin’s EPR intensity we detected. The examinedgamma-sterilized antibiotic sample remains paramagneticeven after 80 days of storage.Lineshape of the analysed EPR spectra strongly dependson microwave power. Influence of microwave power onerythromycin’s EPR spectra 3 hours after drug irradiationis shown in Figure 4. Complex character of the spectra isnot so visible at higher microwave powers (attenuation: 0.5dB).9
Farm Przegl Nauk, 2009,9Fig. 3. Changes of integral intensity of erythromycin’s EPR line withincreasing time of storage after gamma-irradiation.Fig. 4. Influence of microwave poweron EPR spectra of gamma-irradiatederythromycin. The spectra were measured3 hours after irradiation withattenuations 15, 10, 5 and 0.5 dB.Influence of microwavepower on amplitudesand linewidths ofEPR spectra of erythromycinafter 1, 9, and 37days of gamma-irradiationis presented in Figures5 and 6, respectively.Amplitudes rise withincreasing of microwavepower and decrease forhigher microwave powervalue (Fig. 5). A weakbroadening of EPR lineswith increasing of microwavepower was observed(Fig. 6). Correlations inFigures 5 and 6 are typicalfor homogenous distributionof paramagneticcenters in the sample, sogamma-irradiation formsparamagnetic centers inwhole tablet.While unirradiatederythromycin presentsno EPR signal, for gamma-irradiatedsampleswas observed complexEPR spectrum (Fig. 2).Lineshape of the EPRspectra changes with microwavepower (Fig. 4)and with storage time (Fig. 2). Complex shape of resonanceabsorption curve indicates the presence of more than onetype of free radical species induced by gamma radiation inerythromycin. For the studied drug we obtained apparentg value of 2.0033. Unpaired electrons in free radicals inirradiated erythromycin are probably localized on oxygenatoms. It seems that glicoside bounds are especially sensitivefor gamma irradiation. Probably rupturing of glicosidebounds forms oxygen free radicals in gamma-irradiatederythromycin.Free radicals in gamma-irradiated erythromycin are notstable (Fig. 3). The number of free radicals decay was observed.Decrease of integral intensity of erythromycin’s EPRline/free radicals concentration is caused by interactions withoxygen molecules in the sample environment. This effect isthe most intensive during the first stage after sterilization. Itcan be concluded that radiosterilized erythromycin should beused in therapy after several days from gamma-irradiation.Radiosterilized antibiotic should contain the lowest amountof free radicals. Free radicals of sterilized antibiotic may beresponsible for toxic effects in organism stimulated by theirreactions with different biological structures.Continuous microwave saturation of gamma-irradiatederythromycin’s EPR lines indicates that slow spin-lattice relaxationprocesses occur in this sample (Fig. 5). EPR linesof the gamma-irradiated erythromycin saturate at low microwavepowers independly on time after irradiation (Fig.5). EPR lines of the antibiotic saturate at lower microwavepower for longer storage times.Microwave saturation of EPR lines we examined to checkthe hypothesis about changes of erythromycin’s chemicalstructure during storage. Time evolution of molecular struc-Fig. 5. Influence of microwave power on amplitudes of EPR lines oferythromycin for 1, 9, and 37 days after gamma-irradiation. M o– totalmicrowave power (70 mW) produced by klystron, M – microwavepower used during the measurement.Fig. 6. Influence of microwave power on linewidths of EPR lines oferythromycin for 1, 9, and 37 days after gamma-irradiation. M o– totalmicrowave power (70 mW) produced by klystron, M – microwavepower used during the measurement.10
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073ture and paramagnetic centers system in sterilized drug may beresponsible for negative interactions in organism. As result theefficiency of erythromycin may be considerably lower.4. ConclusionsApplication of EPR spectroscopy to examination ofgamma-irradiated erythromycin indicates that: 1) Paramagneticcenters homogenously distributed in tablet are formedduring gamma-irradiation of erythromycin. 2) Paramagneticcenters in irradiated erythromycin are not stable. 3) Slowspin-lattice relaxation processes exist in irradiated erythromycin.4) Spin-lattice relaxation time increases with increasingof storage time of the drug what indicates changesof its chemical structure.References1. Basly JP, Basly I, Bernard M. Influence of radiationtreatment on doubutamine. Int J Pharm 1998; 170: 265-269.2. Basly JP, Longy I, Bernard M. ESR identification of radiosterilizedpharmaceuticals: latamoxef and ceftriaxone.Int J Pharm 1997: 158, 241-245.3. Basly JP, Basly I, Bernard M. ESR spectroscopy appliedto the study of pharmaceuticals radiosterylization: cefoperazone.J Pharm Biomed Anal 1998; 17: 871-875.4. Gibella M i wsp. Electron spin resonance of some irradiatedpharmaceuticals. Rad Phys Chem 2000; 58: 69 -76.5. Varshney L, Dodke PB. Radiation effect studies on anticancerdrugs, cyclophosphamide and doxorubicin for radiationsterilization. Rad Phys Chem 2004; 71: 1103-1111.6. Fauconnet AL, Basly JP, Berdard M. Gamma radiationinduced effects on isoproterenol. Int J Pharm 1996; 144:123-125.7. Basly JP, Basly I, Bernard M. Electron spin resonanceidentification of irradiated ascorbic acid: Dosimetry andinfluence of powder fineness. Anal Chim Acta 1998;372: 373-378.8. Onori S i wsp. ESR identification of irradiated antibiotics:cephalosporins. Appl Rad Isotop 1996; 47: 1569-1572.9. Basly JP, Doroux J, Bernard M. Radiosterylization dosimetryby ESR spectroscopy: application to terbutaline.Int J Pharm 1996; 142: 247-249.10. Yurus S, Ozbey T, Korkmaz M. ESR investigation ofgamma irradiated sulbactam sodium. J Pharm BiomedAnal 2004; 35: 971-978.11. Katušin – Ražem B i wsp. Radiation sterilization of ketoprofen.Rad Phys Chem 2005; 73: 111-116.12. Kostowski W, Herman ZS. Red. Farmakologia. Podstawyfarmakologii. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa2003.13. Janiec W, Krupińska J. Red. Farmakodynamika. Podręcznikdla studentów farmacji. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 2002.14. Zejc A, Gorczyca M. Red. Chemia leków. WydawnictwoLekarskie PZWL. Warszawa 2002.15. Polish Norm PN-EN 552, Warszawa 1999.16. Wertz JE, Bolton JR. Electron Spin Resonance. ElementaryTheory and Practical Applications. Chapman andHall. New York, London 1986.Adres do korespondencji:dr n. farm. Sławomir Wilczyńskitel. 507 169 625, (32) 364 11 72e-mail: swilczynski@sum.edu.pl11
Farm Przegl Nauk, 2009,9 12-17Modelowe postacie wybranych środków znieczulenia miejscowego.Cz. I. Charakterystyka postaci farmaceutycznejModel drug formulations of selected of local anesthetics.Part I. The characterization of the drug formulationMonika Balcerkiewicz 1 , Edmund Grześkowiak 1 ,Pascal Le Corre 2 , Maja Ratajczak-Enselme 2 , Karol Szlufik 11Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i BiofarmacjiUniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu2Laboratoire de Pharmacie Galenique et Biopharmacie Université de RennesStreszczenieO skuteczności i przydatności terapeutycznej lekuw dużym stopniu decyduje jego postać farmaceutyczna.Zastosowanie leku w nowoczesnej postaci pozwala namodyfikację farmakokinetyki substancji leczniczej, cozazwyczaj skutkuje zwiększeniem skuteczności i bezpieczeństwastosowania leku. W celu zmniejszenia ryzykawystąpienia działań niepożądanych oraz modyfikacjidziałania farmakologicznego leków z grupy środkówznieczulenia miejscowego zadowalające rezultaty w badaniachprzedklinicznych przyniosło wykorzystanie mikrosferpolimerowych.Celem niniejszej pracy była charakterystyka modelowejpostaci mikrosfer polimerowych z inkorporowanym środkiemznieczulenia miejscowego oraz ocena przydatnościich dalszego wykorzystania w planowanych badaniachprzedklinicznych.Otrzymane w procesie suszenia rozpyłowego mikrosferyz inkorporowaną substancją leczniczą tj. bupiwakainąi ropiwakainą, poddano badaniu, które polegałona charakterystyce powierzchni mikrosfer, ocenie wydajnościprodukcji i stopnia inkorporacji oraz pomiarzeskumulowanej ilości substancji leczniczej uwolnionejz mikrosfer w ustalonych przedziałach czasowych.Wyniki oceny modelowej postaci farmaceutycznej invitro, wykazały przydatność zastosowania otrzymanychmikrosfer z inkorporowaną substancją lecznicząw planowanych badaniach przedklinicznych.Słowa kluczowe: mikrosfery, PLGA, leki miejscowoznieczulające, bupiwakaina, ropiwakainaWstępObecnie w centrum zainteresowania technologii postacileku znajdują się nośniki leku o wielkości rzędu nanoimikrometrów. Wiele z nich znalazło zastosowanie w lecznictwie,dzięki czemu urzeczywistniona została idea lekuwielokopartmentowego. Wśród nich znajdują się liposomy,emulsje submikronowe oraz nano- i mikrosfery polimerowe[1, 2].AbstractIt is known that the efficacy and the therapeutic usefulnessof medicine depend on its formulation. The application ofmedicine in a modern dosage form allows the modificationof active ingredient release, what results in significantreduction of side effect risk and in prolongation of thetherapeutic effect. To reduce the risk of side effects andto modify drug activity satisfactory results were obtainedwith the use of polymer microspheres.The aim of the study was the characterization of the modelingdrug formulation of polymeric microspheres withthe local anaesthetic and evaluation of the usefulness oftheir further utilization in planned preclinical research onthe ground results evaluation in in vitro studies.As result of the study three types of microspheres withincorporated local anaesthetics i.e. bupivacaine and ropivacainewere prepared using nebulizationas as a method.Prepared drug formulations were characterized by measurementof the accumulative quantity of active ingredientreleased from investigated microspheres and qualificationof the surface of microspheres, to the evaluation of theoutput rate and the degree the incorporation.Results of the evaluation of the modeling drug formulationin in vitro studies showed the usefulness of preparedmicrospheres with incorporated drug in planned preclinicalresearches with the animal model.Key words: microspheres, PLGA, local anaesthetics,bupivacaine, ropivacaineNano- i mikrosfery stanowią wielozbiornikowy systemleku o charakterze matrycowym. Są to monolityczne,kuliste cząstki o porowatej powierzchni i średnicyod 1 do 500 μm (nie przekraczającej zazwyczaj kilkudziesięciumikrometrów) dla mikrosfer (ryc. 1, 2) oraz nie większejniż 1 µm dla nanosfer. Matryce nano- oraz mikrosfer stanowiąróżnego rodzaju polimery naturalne bądź syntetyczneoraz lipidy, w których inkorporowana lub rozpuszczona jestsubstancja lecznicza [3, 4].12
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Jak dotąd najszersze zastosowanie w lecznictwie znalazłymikrosfery wykorzystujące biodegradowalne, syntetycznepolimery kwasu polimlekowego oraz kopolimery kwasumlekowego i glikolowego (PLGA). Ich średnica wynosizwykle od 10 do 50 μm, co pozwala na podskórne i domięśniowepodanie leku w tej postaci. Nanocząstki, ze względuna swoje rozmiary, mogą być również podane dożylnie, np.bezpośrednio do tkanki nowotworowej celem wywołaniachemoembolizacji [1, 4].Metody otrzymywania mikrosfer dobierane są w zależnościod zastosowanej matrycy oraz właściwości inkorporowanejw niej substancji leczniczej [5].Zwykle dąży się do maksymalnego zamykania substancjiw mikrosferach w warunkach, które gwarantują trwałośćsubstancji leczniczej w procesie inkorporacji. Efektywnośćinkorporacji jest jednak zmienna i zależy od rodzaju zastosowanejmetody otrzymywania mikrosfer. Dodatkowe trudnościnatury technologicznej stwarza konieczność uzyskaniamikrosfer o powtarzalnych parametrach, zapewniającychinkorporowanie leku w odpowiedniej dawce oraz właściwyprofil uwalniania [4].Substancja lecznicza z matrycy polimerowej uwalnianajest zazwyczaj powierzchniowo, w efekcie powierzchniowejerozji matrycy polimerowej i jednoczesnej dyfuzji leku.Ryc. 1. Mikrosfery - obraz z mikroskopu elektronowego [16]substancja leczniczamatryca polimerowaRyc. 2. Schemat struktury wewnętrznej mikrocząstek o budowie matrycowejTabela I. Właściwości i czas degradacji polimerów [7]Typ polimeru Tg (Cº) Czas degradacjiPGA 35 ~ 40 2-3 miesiącePLA (L forma) 60 ~ 65 > 2 latPLA (D i L forma) 50 ~ 60 12-16 miesięcyPLGA 45 ~ 55 1-6 miesięcyCzas uwalniania substancji leczniczej jest różny (od 1 do 4miesięcy) i zależy od rodzaju użytego polimeru (tab. I).Tempo hydrolizy łańcuchów polimerowych w największymstopniu zależy od pH i temperatury, dlategow warunkach in vivo obserwuje się minimalne różnice prędkościrozpadu mikrosfer aplikowanych różnymi drogami.W przypadku poliestrów hydroliza enzymatyczna odgrywaniewielką rolę w procesie rozpadu, większą natomiast dlaamorficznych odmian polimerów [6].Ogromne znaczenie w technologii nowych postaci lekumają właściwości substancji pomocniczych wykorzystywanychw ich otrzymywaniu. Biozgodność substancji, z którychwykonywane są matryce mikrosfer, decyduje o bezpieczeństwiestosowania tych postaci leku. Wieloletnie doświadczeniekliniczne oraz liczne badania potwierdziły przydatnośćpolimerów hydroksykwasów jako materiału implantacyjnego.Mikrosfery wykonane z polimerów mlekowego (PLA),glikolowego (PGA) oraz kopolimerów PLGA są całkowiciebioresorbowalne i bardzo dobrze tolerowane przez organizm.Mogą powodować łagodny odczyn tkankowy, jednakbez miejscowego i uogólnionego stanu zapalnego [7].Mikrosfery stanowiąc układy mikrokompartmentoweznalazły zastosowanie głównie jako pozajelitowe formy lekuo przedłużonym i kontrolowanym uwalnianiu. W zależnościod wielkości cząstek możliwe jest podanie ich różnymi drogami.Zawieszone w odpowiednim środowisku mikrosfery wielkości1-8 μm lub mniejsze od 1 μm, tzw. nanosfery, są odpowiedniedo podania dożylnego, mikrosfery o wielkości cząstek10-150 μm mogą być podane podskórnie lub domięśniowo,zaś o średnicy 100-500 μm mogą służyć do chemoembolizacjinaczyń [1, 8].Nanosfery, czyli cząstki o wielkości poniżej 1 μm sątestowane jako potencjalne nośniki stosowanych doustnieleków peptydowych. Wyniki badań potwierdziły penetracjęmikrocząstek o średnicy 200-500 nm w głąb błony śluzowejprzewodu pokarmowego, zapewniającą ochronę leku przeddziałaniem enzymów proteolitycznych oraz soku żołądkowego[1, 8].Zmodyfikowany profil uwalniania substancji leczniczejz mikrosfer sprawia, że mogą one stanowić korzystny systemdozowania leku w leczeniu chorób przewlekłych, a takżedla leków charakteryzujących się małą biodostępnościąpo podaniu doustnym, bądź krótkim biologicznym okresempółtrwania [9]. Szczególne cechy biofarmaceutyczne sprawiają,że mikrosfery zapewniają dłuższy czas uwalnianiasubstancji leczniczej niż zawiesiny czy roztwory o zwiększonejlepkości, a w porównaniu z implantami dodatkowoich przewaga polega na możliwości iniekcyjnej aplikacjibez ingerencji chirurgicznej [10].Wiele podawanych w formie mikrosfer substancji leczniczychzostało pozytywnie ocenionych w doświadczeniach13
Farm Przegl Nauk, 2009,9Tabela II. Preparaty farmaceutyczne stosowane w postaci mikrosfer polimerowych [13, 18]Preparat(Producent)Lupron-Depot ®(Tap)SubstancjaleczniczaleuprorelinaTyp mikrosfer Zastosowanie Czas działaniaPLA; PLGAendometrioza, nowotwórprostaty12, 16 tyg.Risperdal ® Consta ® (Janssen) rysperydon PLGA schizofrenia 2 tyg.Vivitrol ®(Cephalon & Alkermes)naltrekson PLGA uzależnienie alkoholowe 4 tyg.Sandostatin LAR ® (Novartis) oktreotyd PLGA akromegalia 4 tyg.Nutropin Depot ® (Genentech) somatropina PLGA zaburzenia wzrostu 2, 4 tyg.Trelstar Depot ®(Watson Pharma)tryptorelinaPLGAendometrioza,nowotwór prostaty4 tyg.Somatuline PR ®(Beaufour Ipsen)Suprecur MP ®(Aventis)lanreotyd PLGA akromegalia 14 dnibuserelina PLGA endometrioza 4 tyg.na zwierzętach lub badaniach klinicznych, wśród nich znajdująsię leki z grupy środków znieczulenia regionalnego[11, 12]. Prawdopodobnie z powodu niedostatecznej wiedzyna temat wpływu mikrosfer na tkanki, niebezpieczeństwakumulacji w miejscu wstrzyknięcia, małej zdolność inkorporacjisubstancji leczniczej oraz trudnej technologii, tylkoniewielka część z nich została zarejestrowana na rynku farmaceutycznym.Wśród nich przeważają preparaty zawierającemikrosfery przeznaczone do podskórnego lub domięśniowegopodania w formie zawiesiny (tab. II) [4, 13].Materiał i metodyBadane mikrosfery otrzymano we współpracy z Laboratoirede Pharmacie Galenique et Biopharmacie Universitéde Rennes, France, według opisywanej metody suszeniarozpyłowego [14].Otrzymane mikrosfery polimerowe z inkorporowanąsubstancją leczniczą (bupiwakaina lub ropiwakaina), poddanoocenie in vitro, w tym badaniu kinetyki uwalnianiasubstancji leczniczej. Powyższe badania przeprowadzonorównież we współpracy z Laboratoire de Pharmacie Galeniqueet Biopharmacie Université de Rennes, France, wedługopisanych poniżej metod.MateriałMateriał do badań stanowiły, otrzymane metodą suszeniarozpyłowego, mikrosfery o następującym składzie: I seria -MSBP-1 40/60 - 1800 mg (60 cz.) polimer Medisorb 50/50low IV oraz 1200 mg (40 cz.) zasady bupiwakainy; II seria- MSBP-2 40/60 - 1620 mg polimer Medisorb 50/50 low IV+ 180 mg (10%) polimer R 104 (60 cz.) oraz 1200 mg (40 cz.)zasady bupiwakainy; III seria - MSRP 40/60 - 1800 mg (60 cz.)polimer RG503H oraz 1200 mg (40 cz.) zasady ropiwakainy.Metody1. Charakterystyka powierzchni mikrosfer i rozrzut ichwielkości1.1. Charakterystyka powierzchni mikrosferMikrosfery otrzymane w postaci suchej, zostały zawieszonew 0,1% roztworze Tweenu i poddane działaniu ultradźwięków.Każda seria mikrosfer była wstępnie sprawdzanapod mikroskopem optycznym, co pozwoliło na zaobserwowanieewentualnych agregatów i włóknistych wypustekfilamentowych. Następnie powierzchnia mikrosfer byłaobserwowana pod mikroskopem elektronowym. Kroplęzawiesiny umieszczano na powierzchni szklanej i suszonow temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzano metalizację.Tak przygotowane próbki gotowe były do obserwacji[15].1.2. Rozrzut wielkości mikrosferLiofilizowane próbki mikrosfer przed pomiarem zostałyzawieszone w kilku mililitrach 0,1% roztworu Tweenu.Następnie tak przygotowaną zawiesinę mikrosfer umieszczanow zbiorniku granulometru napełnionego 75 ml wodydestylowanej. Pomiarów średnicy dokonywano również po1, 2 i 3 min. działania ultradźwięków, mogących wpływaćna dezintegrację mikrosfer [15].2. Wydajność produkcji i stopień inkorporacji substancjileczniczej2.1. Wydajność produkcjiCelem określenia wydajność produkcji, mikrosfery należałozebrać do odpowiedniego, wytarowanego naczynia.Następnie mikrosfery były ważone, a masę wyrażano w procentachw stosunku do masy całkowitej użytego do produkcjipolimeru i substancji leczniczej [15].2.2. Stopień i skuteczność inkorporacjiStopień inkorporacji wyznaczony doświadczalnie odpowiadailości substancji leczniczej efektywnie obecnejw mikrosferach (wyrażonej w procentach) [15].Stopień inkorporacji (%): oznaczona substancja lecznicza(g) x 100 / substancja lecznicza użyta do produkcji mikrosfer (g).Skuteczność inkorporacji (%): stopień inkorporacjix 100 / teoretyczny stopień inkorporacji.Próbkę otrzymanych mikrosfer dokładnie odważano, takaby zawierała ok. 10 mg substancji leczniczej. Następnierozpuszczano ją w dichlorometanie celem rozpuszczenia14
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tabela III. Parametry charakteryzujące badane mikrosfery polimerowez bupiwakainą i ropiwakainą [15]SeriamikrosferWydajnośćprodukcji [%]D [4,3] [μm]D (v, 0.5) [μm]Seria I 46 8,88 6,61Seria II 52 11,10 8,91Seria III 58 8,41 6,45Medisorb 50/50 jest kopolimerem kwasu mlekowegoi kwasu glikolowego w stosunku molowym 50:50, masiecząsteczkowej 63 kDa i strukturze amorficznej. Charakteryzujesię dobrą rozpuszczalnością w dichlorometanie, octanieetylenowym, acetonie i tetrahydrofuranie, natomiast nierozpuszcza się w wodzie, metanolu i eterze. Wolne mikrosferyotrzymane przy udziale polimeru Medisorb 50/50 lowposiadają korzystne parametry. Bezpośrednio po ich otrzymaniucharakteryzują się niewielkimi rozmiarami, po liofilizacjiłatwo jest otrzymać jednorodne zawiesiny w wodzie,a wydajność produkcji należy do jednej z wyższych. Ponieważpolimer ten znacznie łatwiej tworzy zawiesinę, stądw procesie otrzymywania badanych mikrosfer wykorzystanogłównie opisywany polimer z dodatkiem lub bez polimeruR 104 (ryc. 3) [15].Tabela IV. Stopień i skuteczność procesu inkorporacji oraz parametry kinetyczne uwalniania bupiwakainy i ropiwakainy z badanych mikrosferin vitro [15]Seria mikrosferteoretycznyStopień inkorporacji [%]eksperymentalnypolimeru. Substancję leczniczą poddawano ekstrakcji dofazy wodnej, a następnie oznaczano zaadaptowaną i zwalidowanąmetodą HPLC [15].Skutecznośćinkorporacji[%]T 10%[h]T 50%[h]Seria I 40 38,24 95,60 0,05 1,75 --Seria II 40 38,59 96,48 0,02 0,25 12Seria III 40 40,48 101,2 0,16 8,17 --T 90%[h]3. Kinetyka uwalniania substancji leczniczej in vitroSubstancja lecznicza uwalniana była do roztworu wodnego(900 ml) o temp. 37°C, zawierającego 0,2% NaCli doprowadzonego do pH 2, za pomocą HCl. Objętość taoraz stałe pH pozwalały na utrzymanie, w każdym momencieprowadzonego doświadczenia, stężenia substancji leczniczejponiżej stanu nasycenia oraz maksymalną szybkośćrozpuszczania wewnętrznego.Urządzenie z wirującą łopatką było połączone z systememwymuszonej cyrkulacji. Roztwór był pobierany za pośrednictwemrurek zaopatrzonych w filtry. Dzięki pompieperystaltycznej doprowadzały one próbkę do kuwet przepływowychspektrofotometru. Po dokonaniu pomiaru absorbancjipobrana próbka wracała do zbiornika z roztworem.Dokładnie odważoną ilość mikrosfer z substancją czynną,zawierającą około 10 mg substancji leczniczej zawieszano(przy użyciu ultradźwięków) w 50 ml wody destylowanej.Następnie zawiesinę dodawano do roztworu reakcyjnego.Próbki pobierano według zaprogramowanego cyklu: przezpierwszą godzinę co 5 min, przez kolejną godzinę co 15 min,|w czasie do 6 h w odstępach półgodzinnych oraz co godzinęw czasie do 24 h.Każda z serii mikrosfer zawierających bupiwakainę byłabadana trzykrotnie, natomiast seria III została poddana sześciokrotnemubadaniu. Otrzymane wyniki analizowano przy użyciuprogramu informatycznego Idis EE. Parametrami charakteryzującymikinetykę uwalniania bupiwakainy i ropiwakainy in vitrobyły czasy T 10%, T 50% oraz T 90%, po których uwolnieniuuległo odpowiednio 10, 50 i 90% substancji leczniczej [15].WynikiRyc. 3. Zdjęcie z mikroskopu elektronowego mikrosfer polimerowychz bupiwakainą [17]Wyniki oceny badanych postaci leku in vitro oraz badaniakinetyki uwalniania substancji leczniczej z badanychmikrosfer in vitro zamieszczono w tabeli III i IV oraz dodatkowow postaci wykresów (ryc. 4 i 5).DyskusjaCelem uzyskania mikrosfer polimerowych z bupiwakainą(seria I, seria II) oraz ropiwakainą (seria III) zastosowanometodę suszenia rozpyłowego. Zaletą tej metody jest jednoetapowatechnologia otrzymywania mikrosfer, ułatwiającaprzeprowadzenie procesu w warunkach aseptycznych orazumożliwiająca przystosowanie tej techniki dla potrzeb przemysłu.Metoda suszenia rozpyłowego jest procesem o wysokimstopniu inkorporacji, a otrzymane w ten sposób mikrosferymają niewielką średnicę [4]. Jej wadą jest natomiastaglomeracja powstających mikrocząstek i straty poniesionew wyniku odzyskiwania mikrosfer. Ponadto suszenie rozpyłoweprowadzone bez dodatku środka powierzchniowoczynnego utrudnia jednorodną dyspersję mikrosfer przedich podaniem. Zastosowanie metody suszenia rozpyłowegopozwoliło na otrzymanie mikrosfer polimerowych charakteryzującychsię wysokim stopniem inkorporacji substancjileczniczych (tabela IV) oraz niewielkimi rozmiarami (tabelaIII). Wydajność produkcji badanych mikrosfer otrzymanych15
Farm Przegl Nauk, 2009,9wpłynęło na szybsze uwolnienie inkorporowanej w nim bupiwakainyi wyniosło 90% po 12. godzinach prowadzeniabadania uwalniania substancji czynnej in vitro. Dodatkowo,wykonane za pomocą mikroskopu elektronowego zdjęciaotrzymanych mikrosfer wykazały obecność grubych, filamentowychwypustek pochodzących z bupiwakainy. Faktten może tłumaczyć większą dynamikę procesu uwalnianiasubstancji czynnej in vitro z mikrosfer serii II. Zastosowaniepolimeru RG503H wpłynęło z kolei na znaczne wydłużeniewolnej fazy uwalniania ropiwakainy z mikrosferserii III i sprawiło, że po około 8 godzinach prowadzeniaobserwacji uwolnieniu uległo zaledwie 50% substancjileczniczej.Ryc. 4. Profile średnie (n=3) skumulowanego uwalniania bupiwakainyz mikrosfer z polimeru Medisorb 50/50 low IV o stosunku substancjiczynnej do polimeru 40/60 jako funkcja stężenia polimeru R104 [15]uwolniona ropiwakaina (%)807060504030201000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24cz as (h)Ryc. 5. Profile (n=6) skumulowanego uwalniania ropiwakainy z mikrosferz polimeru RG503H o stosunku substancji czynnej do polimeru40/60 [15]metodą suszenia rozpyłowego wahała się w granicach 46-58%. Ich średnia średnica wahała się w granicach od 8,41do 11 μm, natomiast wielkość cząstki dla której 50% próbkima wielkość poniżej, a druga połowa powyżej tej wartościosiągała wartości od 6,45 do 8,91 μm. Otrzymane mikrosferybyły jednak posklejane i tworzyły duże aglomeraty cow połączeniu z ich rozmiarami mogło mieć wpływ na kinetykęuwalniania substancji leczniczej.Badanie kinetyki uwalniania bupiwakainy i ropiwakainyz otrzymanych mikrosfer polimerowych w warunkach invitro, pozwoliło na określenie skumulowanej ilości substancjileczniczej uwolnionej z badanych postaci leku. Profileskumulowanego uwalniania in vitro uzyskane dla wszystkichserii badanych mikrosfer wykazały dwufazowy przebiegprocesu uwalniania, z początkową szybką i następującąpo niej wolną fazą uwalniania substancji czynnej. W czasie24-godzinnego badania uwolnieniu uległo około 70% bupiwakainyz mikrosfer serii I, około 97% substancji czynnejz mikrosfer serii II oraz około 65% ropiwakainy z mikrosferserii III (ryc. 4 i 5). Mikrosfery otrzymane z polimeruRG503H (seria III) bądź mieszaniny polimerów Medisorb50/50 low IV i R104 (seria II) wykazywały zmodyfikowanąkinetykę uwalniania w porównaniu z mikrosferami serii I.Zastosowanie 10% dodatku polimeru R104, będącego polimeremkwasu mlekowego o niskiej masie cząsteczkowejWnioskiBadane mikrosfery polimerowe z inkorporowaną bupiwakainąlub ropiwakainą spełniają wymogi ich pozajelitowegozastosowania w planowanych badaniach przedklinicznychwykorzystujących model zwierzęcy.Otrzymane metodą suszenia rozpyłowego mikrosferyserii I, II i III były posklejane i tworzyły duże aglomeraty cow połączeniu z ich rozmiarami mogło mieć wpływ na kinetykęuwalniania substancji leczniczej in vitro. Planowanezastosowanie badanych mikrosfer u zwierząt doświadczalnychwymaga zatem zawieszenia ich w roztworze wodnym,a następnie poddania krótkotrwałemu działaniu ultradźwięków.Dzięki tym zabiegom możliwe będzie uzyskanie jednolitejdyspersji substancji leczniczej.Wyniki oceny mikrosfer polimerowych z inkorporowanymśrodkiem znieczulenia miejscowego w badaniach in vitrowskazują na przedłużone uwalnianie substancji czynnej,co skonfrontowane zostanie z wynikami zaplanowanychbadań, których celem jest biofarmaceutyczna ocena modelowejpostaci mikrosfer polimerowych.Piśmiennictwo1. Janicki S. Urzeczywistnienie idei leku wielokompartmentowego,Farm Pol. 1999; 55: 139-148.2. Müller RH, Mäder K, Gohla S. Solid lipid nanoparticles(SLN) for controlled drug delivery – a review of the stateof the art, Eur J Pharm Biopharm. 2000; 50: 161-177.3. Müller R, Hildebrand GE (red.). Technologia nowoczesnychpostaci leków. PZWL, Warszawa 1998.4. Sznitowska M. Technologia mikrocząstek i nanocząstekjako nośników leku, Farm Pol. 2001; 57: 962-969.5. Janicki S, Fiebig A, Sznitowska M. Farmacja stosowana.Podręcznik dla studentów farmacji. PZWL, Warszawa2002.6. Suffritti G. Toxicological evaluation of the incorporationof polymers and copolymers based on L-, D- andD,L-lactide and glycolide, 1997; www.ghimas.it/dentale/documenti/inglese/Toxicological%20Evaluation(06.09.2006)7. Shive MS, Anderson JM. Biodegradation and biocompatibilityof PLA and PLGA microspheres, Adv Drug DelivRev. 1997; 28: 5-24.8. Janicki S, Sznitowska M. Kierunki doskonalenia postacileku, Farm Pol. 1998; 54: 110-120.16
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50739. Halkiewicz A, Janicki S. Mikrosfery jako postać leku dopodawania pozajelitowego, Farm. Pol. 1995; 51: 836-846.10. Curley J i wsp. Prolonged regional nerve blockade: Injectablebiodegradable bupivacaine/polyester microspheres,Anesthesiology. 1996; 84: 1401-1410.11. Le Corre P i wsp. Spray-dryed bupivacaine-loaded microspheres:in vitro evaluation and biopharmaceutics ofbupivacaine following brachial plexus administration insheep, Int J Pharm. 2002; 238: 191-203.12. Zhang H i wsp. Bupivacaine-loaded biodegradable poly-(lactic-co-glycolic) acid microspheres I. Optimization ofthe drug incorporation into the polymer matrix and modellingof drug release, Int J Pharm. 2008; 351: 244-249.13. D’Souza SS, Faraj JA, DeLuca PP. A model-dependentapproach to correlate accelerated with real time releasefrom biodegradable microspheres, AAPS Pharm SciTech. 2005; 6: 553-564.14. Ratajczak-Enselme M i wsp. Effect of epinephrine onepidural, intrathecal, and plasma pharmacokinetics ofropivacaine and bupivacaine in sheep, Br J Anaesth.2007; 99: 881-890.15. Ratajczak M. Technologia otrzymywania mikrosferz kopolimerów kwasu mlekowego i glikolowego orazbupiwakainy. Praca magisterska. Akademia Medycznaim. Karola Marcinkowskiego, Poznaniu/Rennes 2002.16. Saltzman WM, Olbricht WL. Building Drug Deliveryinto Tissue Engineering, Nature Reviews 2002; 1:177-186.17. Le Corre P i wsp. Spray-dryed bupivacaine-loaded microspheres:in vitro evaluation and biopharmaceutics ofbupivacaine following brachial plexus administration insheep, Int J Pharm. 2002; 238: 191-203.18. Heading CE. Vivitrex (Alkermes/Cephalon), Curr OpinInvestig Drugs. 2006; 7:81-88.Adres do korespondencji:dr n. farm. Monika BalcerkiewiczKatedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji UM w Poznaniuul. Św. Marii Magdaleny 14, 61-861 Poznań, tel. (61) 668 78 53e-mail: mbalcer@ump.edu.pl17
Farm Przegl Nauk, 2009,9, 18-21Neurotoksyczność leków– stale aktualny problem farmakoterapiiDrug neurotoxicity– current problem of pharmacotherapyAgnieszka Skotnicka, Edyta Szałek, Edmund GrześkowiakKatedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji,Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong>Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w PoznaniuStreszczenieNeurotoksyczność jako polekowe uszkodzenie układu nerwowegostanowi nadal istotny problem kliniczny ograniczającystosowanie wielu leków. Polekowe objawy neurologicznedotyczyć mogą ośrodkowego, jak i obwodowegoukładu nerwowego. Mogą wystąpić na początku terapiijak i w trakcie przewlekłego stosowania leku, powodująckonieczność jego odstawienia z ewentualną próbą ponownegowłączenia po ustąpieniu objawów. W celu redukcjipowikłań neurologicznych terapii istotne jest zatem zdefiniowanieczynników ryzyka (np. wiek, choroby towarzyszącejak np. neuropatia cukrzycowa), unikanie połączeńleków wspólnie uszkadzających komórki nerwoweoraz opracowywanie schematów postępowania w zakresiemodyfikacji leczenia u pacjentów z obserwowanymi objawamineurotoksyczności. Znajomość patomechanizmupowikłań neurotoksycznych pozwala skutecznie poszukiwaćsubstancji o działaniu neuroprotekcyjnym. Nowe kierunkipostrzegania neurotoksyczności nabierają większegoznaczenia w kontekście globalnych zmian zachodzącychw populacji jak wydłużenie życia, a obserwowana dziśmożliwość całkowitego wyleczenia wielu chorób korelujeze zwiększeniem bezpieczeństwa terapii między innymiprzez zapobieganie działaniom ubocznym leków orazopracowanie efektywnych metod postępowania w przypadkuich wystąpienia. Celem pracy jest przegląd współczesnychdoniesień dotyczących mechanizmu i diagnostykineurotoksyczności oraz neuroprotekcji.AbstractNeurotoxicity as a drug-induced toxicity against nervoussystem is a major clinical complication limiting patient’spharmacotherapy. Neurological symptoms may involvecentral and peripheral nervous system and may be observedat the start or during drug therapy leading to drugdiscontinuation with a possibility of drug reintroductionafter symptoms resolved. To reduce the incidence of therapycomplications, it is important to identify and understandrisk factors (i.e. age, comorbidities such as diabetes),to avoid the use of drug with similar toxicity and todevelop effective methods of prevention and treatment ofneurotoxicity. Understanding neurotoxicity at the molecularand cellular levels may help to discover and applyneuroprotective agents. New directions in understandingneurotoxicity come into prominence in a context of globalpopulation changes such as life prolongation, andobserved possibility of complete cure for many diseasescorrelates with increased pharmacotherapy safety due toadverse reactions prevention and development of effectivemanagement of side effects. The aim of this work was topresent the results of current studies on pathomechanismof neurotoxicity, assessment and management of neuropathiccomplications.Key words: neurotoxicity, neurotoxic agents, neuropathy,neuroprotective agentsSłowa kluczowe: neurotoksyczność, substancje neurotoksyczne,neuropatia, substancje neuroprotekcjneNeurotoksyczność jest często występującym działaniemniepożądanym wielu leków i prowadzi do modyfikacjidawkowania lub przerwania farmakoterapii nawet u 20%pacjentów onkologicznych. Jako powikłanie terapii możeobjawiać się ciężkimi zaburzeniami świadomości, drgawkami,chorobą niedokrwienną mózgu, zaburzeniem słuchuczy neuropatią. W większości przypadków neurotoksycznośćobserwowana jest w postaci neuropatii obwodowej,co może wynikać w faktu, iż większość leków z trudemprzenika przez barierę krew-mózg [1, 2]. Neurotoksycznośćmoże dotyczyć określonych leków, schematów leczenia jaki pacjentów o szczególnej wrażliwości i odpowiedzi na ksenobiotyk[3].Za substancje neurotoksyczne uważa się substancje, głównieegzogenne, które wywołują zmiany patologiczne w komórkachnerwowych o określonym fenotypie (np. nerwy dopaminergiczne)lub w zespole neuronów o wspólnych cechach (np.neurony zawierające receptory kainianowe) [4]. Substancjeneurotoksyczne lub ich metabolity mogą inicjować apoptozę,powodować nekrozę i w efekcie prowadzić do upośledzeniafunkcji komórki nerwowej lub jej śmierci. Substancje neurotoksycznemogą wywoływać wyłącznie zmiany behawioral-18
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Tabela I. Oznaczanie wskaźnika efektu neurotoksycznego1. Ocena strukturalnych i patomorfologicznych końcowych efektów uszkodzenia neuronuMiejsce uchwytu Zmiana wywołana neurotoksyną NeurotoksynaSchorzenie o podobnymobrazie klinicznymciało neuronu neuropatia rtęć choroba Minamataakson (część dystalna) aksonopatia dystalna akrylamid, dwusiarczek węgla neuropatia obwodowa2. Określenie neurochemicznych końcowych efektów uszkodzeniaMiejsce uchwytuNeurotoksynazaburzenie równowagi jonowej:inhibicja przenikania Na do wnętrza neuronutetradoksynahamowanie uwalniania neurotransmiterówbotulinahamowanie metabolizmu neuronucyjanki3. Określenie neuropatofizjologicznych końcowych efektów uszkodzeniaMiejsce uchwytu Badanie diagnostyczne Neurotoksynazaburzenia przewodnictwa nerwowo-mięśniowego elektromiografia (EMG) ditiodimocznikzaburzenie widzenia wzorkowe potencjały wywołane (PEP) dwusiarczek węglapoziom pobudzenia OUN elektroencefalografia (EEG) toluen4. Ocena neurologicznych i behawioralnych zmian końcowych efektów uszkodzeniao zmiany aktywności motorycznejo zaburzenia czucia, węchuo drgawkio zmiany wyników testów neurologicznych diagnostycznychne bez zmian morfologicznych, histologicznych czy zmianw liczbie receptorów lub neurotransmiterów. Należy podkreślić,iż z tysięcy związków chemicznych zdolnych do wywołaniaapoptozy neuronu, termin neurotoksyczność dotyczy głównietych związków, których mała ilość w sposób natychmiastowylub przewlekły wywołuje zmiany patofizjologiczne [5].Ekspozycja na liczne, strukturalnie zróżnicowane substancjechemiczne może skutkować istotnymi zmianamimorfologicznymi i czynnościowymi w komórkach nerwowychobwodowego i centralnego układu nerwowego.W celu opracowania skutecznych sposobów ochrony tkankinerwowej niezbędne jest poznanie patomechanizmudziałania neurotoksycznego poszczególnych leków [1].W tym celu prowadzone są liczne badania nad określeniemwpływu różnych ksenobiotyków na strukturę neuronu (np.akson), na poszczególne organella komórki nerwowej (np.mitochondrium) czy na procesy metaboliczne (np. transportaksonalny postępujący). Pomimo znaczących sukcesówtych badań, proces uszkodzenia komórek nerwowychna poziomie molekularnym i patofizjologicznym dla wieluneurotoksyn pozostaje niejasny. Główna hipoteza badawczazakłada, że neurotoksyny, podobnie jak większość substancjitoksycznych, wraz z aktywnymi metabolitami posiadająwłaściwości elektrofilowe. Dzięki tym właściwościom sąone zdolne tworzyć wiązania kowalencyjne z centrami nukleofilowymibiałek, DNA i RNA, zaburzając ich strukturęi/lub funkcję. Reakcje addycji białek po ekspozycji na neurotoksynytakie jak insektycydy fosforoorganiczne, uznajesię jako prawdopodobny mechanizm procesu neuropatologicznego.Większość ksenobiotyków ulega biotransformacjiprowadzącej do powstawania związków o właściwościachelektrofilowych. Toksyczność powstałych metabolitówwynika z reakcji z centrami miękkich nukleofili takich jakbiałka czy tiole GSH, lub z centrami twardych nukleofili,jak kwasy nukleinowe. Zależnie od rodzaju elektrofilowościksenobiotyków można przewidzieć kierunek ich toksyczności.Związki o właściwościach twardych elektrofiliwykazują działanie genotoksyczne, zaś miękkich nukleofilidziałanie cytotoksyczne o szerokim spektrum, na przykładna komórki nerwowe (akrylamid), hepatocyty (paracetamol)czy komórki mięśnia sercowego (allyamina). Reakcje addycjisubstancji neurotoksycznych z białkami szlaków metabolicznych,składników kompleksów czy białek pośredniczącychw procesach takich jak neurotransmisja lub wytwarzanieenergii w komórkach nerwowych mogą prowadzićdo zaburzeń struktury III-rzędowej białek. Zmiany w strukturzeIII-rzędowej białek mogą skutkować zaburzeniem ichroli w różnych procesach (np. w przewodzeniu aksonalnymczy uwalnianiu presynaptycznych neurotransmiterów).W badaniach nad wpływem akrylamidu na komórki nerwowewykazano, iż w wyniku hamowania aktywacji enzymatycznejglikolizy przez akrylamid, dochodzi do deficytuenergii w aksonach i w konsekwencji do degeneracji włókiennerwowych dalszych [6].Stosowana obecnie klasyfikacja substancji neurotoksycznychopiera się na charakterze generowanych zmianpatomorfologicznych w komórce nerwowej. Uszkodzeniekomórki nerwowej może dotyczyć:a) neuronu i jego poszczególnych części (np. cytopla-zma – rtęć, jądro – doksorubicyna, części postynaptyczne– glutaminian),b) otoczki mielinowej (np. daktynomycyna),c) komórki gwiaździstej (np. kwabaina),d) komórki śródbłonkowej (np. ołów),e) aksonu (np. akrylamid).Określenie miejsca docelowego dla substancji neurotoksycznejw komórce nerwowej pozwala przewidzieć rodzajpowstających zmian chorobowych i zaprojektować ichodpowiednią diagnostykę oraz wykorzystać właściwościsubstancji neurotoksycznych dla ustalania patomechanizmuuszkodzenia określonych części komórki nerwowej w chorobachneurodegeneracyjnych i neurologicznych [7].Ocena kliniczna stopnia uszkodzenia komórek nerwowychstanowi ważny element postępowania z efektami neurotoksyczności.Istnieje kilka sposobów pomiaru stopniauszkodzenia komórek nerwowych. Jedną z metod jest oznaczanietzw. wskaźnika efektu neurotoksycznego (Tab. I).19
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073• trudności w zapinaniu guzików,• trudności w chodzeniu,• trudności w ocenie kształtu małych przedmiotówtrzymanych w dłoniach.Agencja NCITCfAE przedstawia ogólną klasyfikacjęneuropatii i bólu neuropatycznego, która wyróżnia 5 stopnineuropatii zależnie od stopnia nasilenia bólu oraz objawówuszkodzenia włókien ruchowych i czuciowych, uwzględniającstopień zakłócania jakości życia pacjenta jak i farmakoterapiękonieczną do kontroli występujących objawów.W przypadku nasilenia objawów neuropatii w trakcie lubpo terapii wybranymi lekami neurotoksycznymi, NCITCfAEwskazuje metody ich diagnozy, zasady modyfikacji terapii(redukcja dawki stosowanego leku neurotoksycznego)i interwencji farmakologicznej (np. gabapentyna dla uśmierzeniabólu), oraz kierunki edukacji pacjenta (np. jakichdolegliwości można się spodziewać, kiedy powiadamiaćlekarza o nasileniu neuropatii). NCITCfAE dodatkowo sugerujewdrożenie innych niezbędnych metod postępowania dlaograniczenia stopnia upośledzenia funkcjonowania pacjenta(np. kompresy rozgrzewające, masowanie miejsca dotkniętegoneuropatią) [11].Zapobieganie wystąpieniu NOICh można realizowaćpoprzez redukcję dawki, modyfikację schematu leczeniaczy w skrajnych przypadkach przez wyłączenie leku neurotoksycznegoz terapii. W większości przypadków postępowanieto jest mało skuteczne, stąd istnieje potrzebaposzukiwania innych metod postępowania z NOICh [12].Negatywnym skutkom działania leków neurotoksycznychmożna zapobiec poprzez inhibicję określonego etapu procesuuszkodzenia komórki nerwowej lub/i przez stosowaniesubstancji neuroprotekcyjnych [13, 14]. Idealna substancjaneuroprotekcyjna powinna zapewniać skuteczną, swoistą dlatkanki ochronę przy jednoczesnym braku wpływu na efektywnośćterapii przeciwnowotworowej [15, 16]. Intensywnebadania nad poszukiwaniem substancji o właściwościachneuroprotekcyjnych, pozwoliły ustalić, że właściwości tewykazują zarówno substancje egzogenne jak i endogenne[4]. Główne grupy substancji neuroprotekcyjnych to substancjechelatujące, antyapoptotyczne, antyoksydacyjne orazczynniki neurotropowe (Tab. II). Z wyżej wymienionych grupnajwiększym zainteresowaniem cieszą się czynniki neurotropoweze względu na to, iż nie tylko chronią komórki nerwoweprzed działaniem substancji toksycznych, ale również powodująich regenerację. Innym kierunkiem poszukiwania sposobówzapobiegania neurotoksyczności są badania genetyczne,polegające na identyfikacji genotypu pacjentów ze zwiększonąwrażliwością na neurotoksyny, przejawiającą się wyższymryzykiem wystąpienia neuropatii obwodowej [14].Nowe kierunki postrzegania neurotoksyczności nabierająwiększego znaczenia w kontekście globalnych zmianzachodzących w populacji jak wydłużenie życia czy wzroststopnia wyleczalności chorób. Obserwowana dziś corazczęściej możliwość całkowitego wyleczenia wielu choróbkoreluje ze zwiększeniem bezpieczeństwa terapii międzyinnymi przez zapobieganie skutkom działań ubocznychleków i opracowanie efektywnych metod postępowania wprzypadku ich wystąpienia.Piśmiennictwo1. James SE, Burden H, Burgess R, Xie Y, Yang T, MassaSM, Longo FM, Lu Q. Anti-cancer drug induced neurotoxicityand identification of Rho pathway signalling modulatorsas potential neuroprotectants. Neurotoxicology2008; 29: 605-12.2. Fischer SJ, Podratz JL, Windebank AJ. Nerve growth factorrescue of cisplatin neurotoxicity is mediated through thehigh affinity receptor: studies in PC12 cells and p75 nullmouse dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 2001; 308: 1-4.3. Esiri MM. Ageing and the brain. J Pathol. 2007; 211: 181-7.4. Segura-Aguilar J, Kostrzewa RM. Neurotoxins and neurotoxicitymechanisms. An overview. Neurotox Res. 2006; 10: 263-87.5. Segura Aguilar J, Kostrzewa RM. Neurotoxins andneurotoxic species implicated in neurodegeneration.Neurotox Res. 2004; 6: 615-30.6. LoPachin RM, DeCaprio AP. Protein adduct formationas a molecular mechanism in neurotoxicity. Toxicol Sci2005; 86: 214-25.7. Spencer PS, Schaumburg HH. Classification of neurotoxicdisease: a morphological approach. In Experimentaland Clinical Neurotoxicology. Spencer PS, SchaumburgHH, eds., Baltimore, Williams, and Watkins, 92-9.8. Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. FederalRegister 1998; 63: 26926-26954, EPA/630/R-95/001F.9. Zang SM, Allender JA, eds. Home Care of the Elderly.Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 1999.10. Quasthoff S, Hartung HP. Chemotherapy-induced peripheralneuropathy. J Neurol 2002; 249: 9-17.11. Tariman JD, Love G, McCullagh E, Sandifer S. Peripheral neuropathyassociated with novel therapies in patients with multiplemyeloma: consensus statement of the IMF Nurse LeadershipBoard. Clinical Journal of Oncology Nursing 2008; 12: 29-35.12. Cavaletti G, Marmiroli P. The role of growth factors inthe prevention and treatment of chemotherapy-inducedperipheral neurotoxicity. Curr Drug Saf 2006; 1: 35-42.13. Dunlap B, Paice JA. Chemotherapy-induced peripheralneuropathy: A need for standardization in measurement.J Support Oncol 2006; 4: 398-9.14. Ocean AJ, Vahdat LT. Chemotherapy-induced peripheralneuropathy: pathogenesis and emerging therapies.Support Care Cancer 2004; 12: 619-25.15. Links M, Lewis C. Chemoprotectants: a review of theirclinical pharmacology and therapeutic efficacy. Drugs1999; 57: 293-308.16. van den Bent MJ. Prevention of chemotherapy-inducedneuropathy: leukemia inhibitory factor. Clin Cancer Res2005; 11: 1691-3.17. Skotnicka A, Grześkowiak E. Substancje neuroprotekcyjneo potencjalnym zastosowaniu w neuropatii obwodowejindukowanej chemioterapią. Farm Współ 2009; 2: 36-41.Adres do korespondencji:mgr farm. Agnieszka SkotnickaKatedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji,Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong>Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiegoul. Marii Magdaleny 14, 60-861 Poznańtel. 61 668 78 65, e-mail: askotnic@ump.edu.pl21
Farm Przegl Nauk, 2009,9, 22-24Przeciwnowotworowe oraz cytotoksyczne działanie propolisuThe anticancer and cytotoxic activity of propolisRobert Kubina 1 , Agata Kabała-Dzik 1 , Robert D. Wojtyczka 2 , Ewa Szaflarska-Stojko 1 , Paweł Tylka 11Katedra i Zakład Patologii Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach2Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląskiego Uniwersytetu Medycznego w KatowicachStreszczeniePropolis był używany w medycynie ludowej od wieków.Dynamiczny rozwój nauk analitycznych umożliwiłdokładne poznanie właściwości i składu chemicznegoproduktów pszczelich. Konsekwencją badań nad właściwościamiproduktów pszczelich było wyizolowaniei standaryzacja substancji biologicznie czynnych w nichzawartych. Propolis jest naturalnym produktem pochodzącymz roślin zbieranym przez pszczołę miodną. Propolisi jego ekstrakty posiadają właściwości biologicznetakie jak: przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwzapalneoraz przeciwnowotworowe. Analiza chemicznaprzy użyciu chromatografii gazowej połączonej z spektrometriąmas wykazała obecność około 150 polifenolowychsubstancji zawierających miedzy innymi flawonoidyi kwas cynamonowy. Istnieje wiele doniesień dotyczącychwłaściwości farmakologicznych propolisu, także przeciwnowotworowych.Ester fenyloetylowy kwasu kawowego(CAPE) zawarty w propolisie jest naturalnym inhibitoremNF-kappaB posiadającym właściwości przeciwnowotworowe.Słowa kluczowe: propolis, właściwości przeciwnowotworowe,ester fenyloetylowy kwasu kawowegoAbstractPropolis has been used in folk medicine for centuries.Dynamical development of analytical sciences enabledprecise recognition of features and chemical compositionof bee products. Consequences of research on the bee productshad been extracting and standardization of bioactivesubstances therein. Propolis is a natural product derivedfrom plant resins collected by honeybees. The propolisand his extract are known to have biological effects suchas antibiotic, anti-viral, anti-inflammatory and anti-tumoractivities. Chemical analysis using GCmass spectrometrydemonstrated that approximately 150 polyphenoliccompounds including flavonoids and cinnamic acid derivativesare present in propolis. There have been severalreports indicating various biological activities of propolisand its constituents, such as anticancer. Caffeic acid phenethylester (CAPE), a component of honeybee propolis,has been reported to hold various biochemical responses.Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), a natural NF-kappaBinhibitor from honeybee propolis has been shown to haveanti-tumor and anti-inflammatory properties.Key words: propolis, antitumor properties, caffeic acidphenethyl esterChoroby cywilizacyjne dotyczą zarówno krajów TrzeciegoŚwiata jak i krajów wysoko rozwiniętych, w którychdegradacja środowiska spowodowała nieodwracalne zagrożeniadla zdrowia człowieka. Nowotwór to nieprawidłowamasa tkankowa, której wzrost jest nadmierny i rozrastasię w sposób nieskoordynowany z pozostałymi tkankami,a nadmierny rozrost tkanki utrzymuje się dalej pomimowyeliminowania czynnika indukującego onkogenezę. Istniejewiele dobrze poznanych czynników karcynogennych,wśród których należy wymienić m.in. dym tytoniowy,azbest, dioksyny, benzen, wolne rodniki, alkohol oraz promieniowaniejonizujące i ultrafioletowe. To tylko nieliczniewybrane czynniki odpowiedzialne za indukcję procesu nowotworzenia.Rozwój cywilizacji sprawił, że mimo corazwygodniejszego życia, w dużo większym stopniu narażenijesteśmy na stres, minimalizację aktywności ruchowej orazwiele substancji karcynogennych dodawanych do żywnościw celu przedłużenia jej przydatności do spożycia.Od setek lat w diecie ludzi obecne były produkty pocho-dzenia pszczelego. Najstarsza informacja pochodzi z okresukamiennego. Malowidła na ścianach pieczary Aranów wHiszpanii, przedstawiają m.in. człowieka wspinającego siędo gniazda dzikich pszczół. W Abusyrze znajduje się płaskorzeźbaz około 2600 r. p.n.e. przedstawiająca hodowlępszczół, niewiele różniącą się od dzisiejszej. StarożytniChińczycy (w III tysiącleciu p. n. e.) wykorzystywali aktywnośćfarmakologiczną produktów pszczelich dla celówleczniczych. Już zapisy kalendarza starogreckiego są dokumentem,w którym opisywano właściwości lecznicze miodui wosku. Miód stosowany był także przez Inków i Greków.Rzymianie i Arabowie używali oprócz miodu, również propolisudo leczenia ran i owrzodzeń.W historii medycyny właściwości lecznicze produktówpszczelich przedstawił już Hipokrates. Jego wiekopomnestwierdzenie „dobrze jest gdy pokarm jest lekiem, a lek pokarmem”jest aktualne do dziś.Na kontynencie europejskim już w XVI-wiecznych kronikachruskich można spotkać wzmianki na temat stosowa-22
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073nia miodu i różnych produktów pszczelich w profilaktycei leczeniu. Progresja nauk analitycznych przyczyniła się dorozwoju badań nad składem chemicznym i właściwościamifarmakologicznymi produktów zebranych i częściowo zmienionychlub wydzielanych przez pszczoły. Ośrodki klinicznei badawcze wyposażone w coraz nowocześniejszą aparaturęanalityczną wzbogacają przekazywaną od pokoleń wiedzęna temat składu i właściwości produktów pszczelich [1, 2].Propolis jako surowiec farmakopealnyJednym z dobrze poznanych surowców farmakopealnychjest propolis (kit pszczeli). Ta smolista substancja wytwarzanajest z żywic drzew liściastych, iglastych, pączkówmłodych pędów drzew, krzewów i innych roślin zielonych.Surowiec kitu pszczelego przynoszony jest do ula w postacikropel żywicy umieszczonej w koszyczkach odnóży pszczółlotnych, a następnie przeżuwany przez pszczoły stacjonarne,które modyfikują jego skład wydzieliną gruczołów ślinowychi woskowych zwiększając w ten sposób jego aktywnośćfarmakologiczną. Propolisu używają pszczoły douszczelniania ramek i ścian ula oraz do budowy bariery wokółjego otworu wejściowego. Pszczoły wykorzystują ten produktrównież do utrzymania prawidłowej homeostazy epizootycznejatmosfery wewnątrz ula. Wykorzystując jego silne działanie bakteriobójczei bakteriostatyczne, zabezpiecza on środowisko ulaprzed działaniem bakterii, grzybów oraz pleśni [3].Propolis – aktywność biologicznaZawartość w propolisie wielu substancji o aktywnościbiologicznej determinuje jego działanie przeciwdrobnoustrojowe,przeciwzapalne, immunoprotekcyjne, regeneracyjne,znieczulające, detoksykacyjne, przeciwutleniające,antyproliferacyjne, proapoptotyczne oraz przeciwnowotworowe.Dokładne poznanie funkcji farmakopealnych propolisuumożliwiły badania prowadzone w wielu ośrodkachnaukowo-badawczych przy zastosowaniu najnowocześniejszychmetod badawczych w tym technik z zakresu biologiimolekularnej [4, 5].W artykule tym skupiliśmy się na prześledzeniu doniesieńnaukowych potwierdzających w sposób jednoznacznyprzeciwnowotworowe działanie propolisu, jako zbioruwielu substancji wykazujących aktywność biologiczną.Przeciwnowotwowe działanie kitu pszczelego zostało potwierdzoneprzez wielu naukowców zarówno w badaniachin vitro przy użyciu linii komórkowych jak i in vivo na zwierzęcymmodelu doświadczalnym.Zespół brazylijskich naukowców z Biosciences Institutew swoich badaniach in vitro opisał cytotoksyczny efekt brazylijskiegozielonego propolisu w stosunku do linii komórkowejraka krtani HEp-2. Wykazał on, że wysokie stężeniapropolisu dodawane do hodowli komórkowych powodowałykrótkotrwały efekt cytotoksyczny, w przeciwieństwiedo niskich stężeń, gdzie z czasem aktywność ta wzrastała.Twierdzą oni, iż aktywność ta jest spowodowana synergizmemsubstancji chemicznych zawartych w kicie pszczelim.Jak wiadomo jednym z najlepiej poznanych składnikówo działaniu przeciwnowotworowym jest ester fenyloetylowykwasu kawowego (CAPE) [6, 7, 8].Najnowsze badania przeprowadzone w UniversitaetsKlinikum Eppendorf w Niemczech pokazują, iż zawartyw propolisie ester fenyloetylowy kwasu kawowego powoduje,w badaniach in vivo na myszach, prawie całkowitą regresjeguza mózgu wywołanego nerwiakowłókniakowatością typu II(ang. neurofibromatosis). W tych samych badaniach udowodniono,że CAPE powoduje także, zahamowanie wzrostu komóreknowotworowych w przebiegu nerwiakowłókniakowatościtypu I. Badania te zapowiadają się bardzo obiecująco, z tego teżwzględu, że zespół ten odnalazł idealny rozpuszczalnik zdolnydo solubilizacji CAPE. Poza tym rozpuszczalnik ten – Bio 30,zawiera kilka substancji, które działają synergistycznie wrazz estrem fenyloetylowym kwasu kawowego [9].Inne doniesienia naukowe z Tamkang Universityw Tajwanie wskazują, że zawarte w propolisie propolinyA, B, C, D, E oraz F odpowiedzialne są za działanie antyproliferacyjnei cytotoksyczne w stosunku do sześciu liniikomórkowych. Badania przeprowadzono na liniach: A2058linia ludzkiego czerniaka, B16F10 linia czerniaka mysiego,MCF-7 linia ludzkiego raka sutka, HepG2 linia ludzkich komórekguza wątroby Hepatoblastoma, Hep3B linia ludzkichkomórek raka wątroby oraz HT-29 linia ludzkich komórekgruczolakoraka jelita. Zespół ten wykazał, że cztery spośródsześciu propolin (B, D, E oraz F) wykazują bardzo silnewłaściwości przeciwproliferacyjne [10, 11, 12, 13].Zaskakujące wydają się również doniesienia z GifuPharmaceutical University, Japonia, gdzie przeprowadzonebadania przy użyciu dwóch ekstraktów pochodzących z różnychczęści świata (Japonia i Brazylia), wykazały iż oba teprodukty pszczele wykazują aktywność przeciwnowotworowąw stosunku do czterech różnych nowotworów jelit:CaCo2, HCT116, HT29 oraz SW480. Sugerują oni nawet, iżbadania nad aktywnością propolisu mogą wpłynąć na podejścielekarzy do chemioprewencji oraz leczenia nowotworówukładu pokarmowego [14].Badania przeprowadzone w University of Catania weWłoszech pokazały, że propolis wykazuje właściwości przeciwnowotworowetakże w stosunku do opornych na androgenynowotworów złośliwych prostaty (linia DU145). Pracata miała na celu porównanie ekstraktu propolisu z stosowanymiw leczeniu raka prostaty półsyntetycznymi chemioterapeutykamitakimi jak vinorelbina. W doświadczeniu tymbrano pod uwagę takie parametry jak: żywotność komórek(test MTT), integralność błon komórkowych, status oxydoredukcyjny,fragmentacje genomowego DNA oraz zmianępotencjału błonowego mitochondriów. Badania te udowodniły,że propolis wykazuje właściwości przeciwnowotworowena skutek jego działania cytotoksycznego prowadzącegodo śmierci komórki na drodze nekrozy oraz apoptozy.Autorzy pracy sugerują, iż dokładna analiza propolisu możedoprowadzić do użycia substancji czynnych zawartych w nimdo wprowadzenia tych związków do rutynowej chemioterapiilub wspomaganie leczenia syntetycznymi lekami [15].Badania przeprowadzone w National ChanghuaUniversity of Education w Tajwanie, pokazują, że zastosowanieCAPE jest szersze niż dotychczas myślano. W eksperymencietym wykazano, iż ester fenyloetylowy kwasukawowego wykazuje działanie cytotoksyczne w stosunkudo glejaka C6. W badaniach tych odkryto dokładny mechanizmdziałania CAPE. Wiadome jest, iż CAPE powoduje23
Farm Przegl Nauk, 2009,9uwolnienie cytochromu c z mitochondrium do cytozoluoraz aktywacje CPP32. CAPE spowodowało również aktywacjebiałek proapoptotycznych z rodziny Bcl-2. Badaniate jednoznacznie potwierdziły, iż zawarty w propolisie esterfenylowy kwasy kawowego spowodował aktywację mechanizmówbiochemicznych prowadzących do kontrolowanejśmierci komórek – apoptozy [16, 17].Inne badania przeprowadzone w Graduate School ofMedicine w Japonii wskazują natomiast, iż aktywność propolisuzostała wykazana także na linii komórkowej mysiegomięsaka S-180 in vitro oraz in vivo u myszy. Badaniate polegały na ocenie aktywności mitotycznej komórekprzeszczepionych do myszy oraz aktywności tej w liniachkomórkowych. W obu przypadkach naukowcy zauważyliznaczny spadek aktywności mitotycznej, a co za tym idziezahamowanie wzrostu guza [18].Coraz częściej w publikacjach z całego świata ukazują siędoniesienia o aktywności proapoptotycznej propolisu w stosunkudo komórek zmienionych nowotworowo. Kolejne badaniaprzeprowadzone w 2009 roku w Department of Histologyand Embryology w Turcji potwierdziły domysły wielu naukowców,że substancje biologicznie czynne zawarte w propolisiezdolne są do aktywowania szlaku programowanej śmiercikomórek, który jak wiadomo w onkogenezie zostaje zahamowany.Naukowcy z Turcji badając właściwości propolisu przeprowadzilibadania in vitro na linii komórek nowotworowychraka sutka MCF-7. W badaniach immunocytochemicznychz użyciem odpowiednich przeciwciał skierowanych przeciwkokaspazie 6, 8 i 9 udowodnili, iż roztwór propolisu dodawany wokreślonych stężeniach do hodowli komórkowej pobudza komórkędo śmierci apoptotycznej [19].Wszystkie opisane powyżej badania wskazują, iż propolisposiada aktywność antynowotworową, cytotoksyczną zdolnądo zahamowania rozwoju nowotworu. Badania te przeprowadzanebyły za równo in vitro jak i in vivo. Jednakże należypamiętać, że zastosowanie propolisu w onkologii wydaje sięniemożliwe. Należy jednak szukać substancji chemicznychw nim zawartych, których użycie mogłoby wspomóc obecnąchemioterapie lub zmniejszyć jej skutki uboczne.Piśmiennictwo:1. Brzeziński T. Historia medycyny. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 1995, 141-150.2. Guderska J. Zarys dziejów pszczelnictwa. W: Hodowlapszczół. Red. Demianowicz A, Guderska J. WydawnictwoPWRiL. Warszawa 1974, 13-16, 42-49, 116-121.3. Ahn MR i wsp. Correlation between antiangiogenic activityand antioxidant activity of various components frompropolis. Mol Nutr Food Res 2009; 53: 643-651.4. Sha N i wsp. Cytotoxic constituents of chinese propolis.J Nat Prod 2009; 72: 799-801.5. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologicznapropolisu pochodzącego z różnych rejonów świata. PostFitoter 2006; 1: 23-35.6. Búfalo MC, Candeias JM, Sforcin JM. In vitro cytotoxiceffect of Brazilian green propolis on human laryngealepidermoid carcinoma (HEp-2) Cells. Evid Based ComplementAlternat Med 2007 http://ecam.oxfordjournals.org/cgi/reprint/nem147v1.7. Jin UH i wsp. Caffeic acid phenethyl ester induces mitochondria-mediatedapoptosis in human myeloid leukemiaU937 cells. Mol Cell Biochem 2008; 310: 43-48.8. Beltrán-Ramírez O i wsp. Evidence that the anticarcinogeniceffect of caffeic acid phenethyl ester in the resistanthepatocyte model involves modifications of cytochromeP450. Toxicol Sci 2008; 104: 100-106.9. Demestre M i wsp. CAPE (caffeic acid phenethyl ester)-basedpropolis extract (Bio 30) suppresses the growthof human neurofibromatosis (NF) tumor xenografts inmice. Phytother Res 2009; 23: 226-230.10. Chen CN i wsp. Isocostunolide, a sesquiterpene lactone,induces mitochondrial membrane depolarization andcaspase-dependent apoptosis in human melanoma cells.Cancer Lett 2007; 246: 237-252.11. Chen CN, Wu CL, Lin JK. Apoptosis of human melanomacells induced by the novel compounds propolinA and propolin B from Taiwenese propolis. Cancer Lett2007; 245: 218-231.12. Chen CN i wsp. Comparison of Radical Scavenging Activity,Cytotoxic Effects and Apoptosis Induction in HumanMelanoma Cells by Taiwanese Propolis from DifferentSources. Evid Based Complement Alternat Med2004; 1: 175-185.13. Chen CN, Wu CL, Lin JK. Propolin C from propolis inducesapoptosis through activating caspases, Bid and cytochromec release in human melanoma cells. BiochemPharmacol 2004; 67: 53-66.14. Ishihara M i wsp. Growth inhibitory activity of ethanolextracts of Chinese and Brazilian propolis in four humancolon carcinoma cell lines. Oncol Rep 2009; 22:349-354.15. Scifo C i wsp. Resveratrol and propolis as necrosis orapoptosis inducers in human prostate carcinoma cells.Oncol Res 2004; 14: 415-426.16. Lee YJ i wsp. Involvement of tumor suppressor proteinp53 and p38 MAPK in caffeic acid phenethyl esterinducedapoptosis of C6 glioma cells. Biochem Pharmacol2003; 15; 66: 2281-2289.17. Huang WJ i wsp. Propolin G, a prenylflavanone, isolatedfrom Taiwanese propolis, induces caspase-dependentapoptosis in brain cancer cells. J Agric Food Chem 2007;55: 7366-7376.18. Inoue K. Anti-tumor effects of water-soluble propolis ona mouse sarcoma cell line in vivo and in vitro. Am J ChinMed 2008; 36: 625-634.19. Seda Vatansever H. Propolis from Turkey inducesapoptosis through activating caspases in humanbreast carcinoma cell lines. Acta Histochem 2009http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19733388.Adres do korespondencji:mgr Robert Kubina,Katedra i Zakład Patologii,tel. 32 364 13 50, e-mail: rkubina@sum.edu.pl,24
Farm Przegl Nauk, 2009,9, 25-29copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Obserwacje kliniczne zwierzątw badaniach toksykometrycznychClinical observations of animals in toxicometric studiesInga Mrzyk, Aleksandra Szewczyk, Robert Sornat, Małgorzata PrzybyłaInstytut Przemysłu OrganicznegoOddział w PszczynieStreszczenieObserwacja wyglądu i zachowania się zwierząt to ważnyelement w badaniach toksykometrycznych substancji chemicznych,zarówno w badaniu toksyczności po podaniujednorazowym jak również w badaniach toksyczności popodaniu wielokrotnym. Często niedoceniane obserwacjekliniczne stanowią ważne źródło informacji o niekorzystnymwpływie badanej substancji na stan zdrowia zwierzęcia.W opracowaniu przedstawiono zakres obserwacjiklinicznych i stopniowanie ich nasilenia. System tensprawdził się w praktyce i może być poddany międzylaboratoryjnejweryfikacji.Słowa kluczowe: toksykometria, obserwacje kliniczne,klasyfikacja objawów klinicznychAbstractObservation of animals’ appearance and behavior is animportant element in toxicometric studies of chemicalsubstances including toxicological studies after singleadministration as well as repeated dose toxicological studies.The underestimated clinical observations are importantsource of information on unfavorable influence of testitem on health state of animal. In the treatise a range ofclinical observations and grading of their intensity are presented.This system was verified in practice and may besubjected to interlaboratory verification.Key words: toxicometrics, clinical observations, classificationof clinical signsJednym z podstawowych a często niedocenianych elementówoceny działania szkodliwego substancji chemicznychw badaniach toksykometrycznych są obserwacje kliniczne.Pozwalają one często na uchwycenie objawów działaniatoksycznego, które nie uwidaczniają się w badaniachkliniczno-chemicznych i patomorfologicznych. Niejednokrotniestanowią one pierwsze sygnały działania neurotoksycznegobadanej substancji.W badaniach toksykometrycznych obserwacje kliniczneprowadzone są już od dawna, lecz ich zakres był określanyzbyt ogólnie i różnił się w znacznym stopniu w różnychlaboratoriach przeprowadzających badania. Brak było równieżujednoliconego sposobu oceny nasilenia występującychobjawów.W nowelizowanych lub nowoopracowanych WytycznychOECD (Wytyczna 407-1995, Wytyczna 408-1998, Wytyczna424-1997) zalecane jest opracowanie i zastosowaniesystemu punktacji zawierającej kryteria lub skalę punktowądla każdego parametru klinicznego. Rozbudowanie zakresuobserwacji klinicznych, obok wprowadzenia elementówbadania zachowania się zwierząt, miało na celu zwrócenieuwagi na ocenę funkcjonowania układu nerwowego w badaniachtoksyczności po narażeniu jednorazowym i wielokrotnym.W obowiązujących wytycznych działanie neurotoksycznerozumiane jest znacznie szerzej niż tylko neuropatia,uwzględnia się też m.in. zaburzenia koordynacji ruchowejczy ubytki sensoryczne [1].W tradycyjnych metodach ustalania toksyczności ostrejpadnięcia stanowiły wartość końcową [2]. Nowe podejściew tego rodzaju badaniach polega na obserwacji wyraźnychobjawów toksyczności w jednym z poziomów ustalonychdawek, unikając w ten sposób padnięć zwierząt [3].Częstość przeprowadzania obserwacji klinicznych zależy odrodzaju badania. W badaniu toksyczności ostrej obserwacje klinicznezwierząt prowadzi się przed podaniem badanej substancji,następnie kilka razy w dniu podania badanej substancji, a potemraz dziennie w czasie 14-dniowego trwania doświadczenia [3].W badaniach przy powtarzanym dawkowaniu szczegółoweobserwacje kliniczne przeprowadza się przed podaniembadanej substancji, a następnie w odstępach tygodniowych[4, 5]. Kliniczne oznaki toksyczności odnotowywanew trakcie trwania narażenia mogą wiązać się albo z punktamikońcowymi toksyczności albo z procesami chorobowymi.Mogą one zostać użyte jako dowody popierające zależnośćdawka - odpowiedź, a w ten sposób mogą odgrywać znaczącąrolę w określeniu poziomu bez obserwowanego działaniaszkodliwego (NOEL –No Observed Effect Level). Jednakżenie wszystkie objawy kliniczne muszą być skorelowane zezmianami patologicznymi w tkankach i narządach. Niektórez nich, powodowane przez biochemiczne lub fizjologiczneskutki, tj. brak koordynacji, skurcze mięśni, drżenie, biegunka,mogą wskazywać na inhibicję acetylocholinoesterazybez jakichkolwiek zmian morfologicznych spotykanychw tkance nerwowej [6, 7].25
Farm Przegl Nauk, 2009,9Tabela I. Szczegółowe obserwacje kliniczne zwierząt i ich stopniowanieI UKŁAD RUCHU, ZACHOWANIE SIĘ, REAKCJE NA BODŹCE1. Postawa ciała:0 – bez zmian1– grzbiet zaokrąglony2 – zwierzę leży na boku3 – zwierzę leży na brzuchu4 – zwierzę chwycone za ogon kręci się po okręgu2. Sposób chodzenia0 – prawidłowy: głowa jest w poziomie, brzuch nieznacznie uniesiony nad podłogą, ciało podnosi się i opuszcza delikatnie podczas chodzenia1 – chwiejny chód2 – niedowład tylnych kończyn (zwierzę wlecze tylne kończyny)3 – zwierzę leży bezwładnie3. Aktywność ruchowa:0 – normalna1 – nieznaczny spadek2 – wyraźny spadek3 – nieznaczny wzrost4 – wyraźny wzrost5 – brak ruchu4. Ruch mimowolny – kloniczny (szybko występujące jeden po drugim skurcze mięśniowe)0 – brak1 – drżenie2 – drgawki5. Ruch mimowolny – toniczny (długo trwające naprężenia mięśniowe):0 – brak1 - występuje6. Reakcja zwierząt na ich chwytanie:0 – bez zmian (łatwo, normalnie, zwierzę nie stawia wyraźnego oporu)1 – bardzo łatwo (zwierzę siedzi lub leży, pozwala się podnieść i zabrać)2 – trudno (zwierzę kuli się i staje się sztywne lub biega wkoło i jest trudne do uchwycenia)3 – bardzo trudno (zwierzę atakuje)7. Wokalizacja:0 – brak1 – występuje8. Reakcje na bodźce dźwiękowe (stukanie palcem w bok klatki lub w podłoże, gdy zwierzę jest poza klatką)0 – prawidłowa1 – zmniejszona reakcja (osowiałość)2 – zwiększona reakcja (nadpobudliwość)3 – brak reakcjiII. SKÓRA I SIERŚĆ1. Barwa skóry:0 – prawidłowa1 – rumień2 – bladość3 – zasinienie2. Obrzęk0 – brak (bez zmian)1 – występuje3. Naskórek0 – bez zmian1 – wysuszenie2 – złuszczanie się4. Sierść:0 – bez zmian1 – nastroszenie2 – przerzedzenie3 – wyłysienie5. Zmiany na skórze:0 – bez zmian1 – strup lub strupki2 – ropień3 – guzIII. OCZY I POWIEKI1. Wydzielina z oczu:0 – brak1 – łzawienie26
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50732 – wydzielina z krwią3 – odkładanie się porfiryn wokół oczu („czerwone łzy”)2. Wytrzesz oczu:0 – brak1 - występuje3. Zmętnienie rogówki:0 – brak1 – występuje4. Zamknięcie powieki:0 – otwarta1 – przymknięta2 – zamkniętaIV. UKŁAD ODDECHOWY1. Oddychanie:0 – normalne1 – szmery oddechowe2 – przyśpieszony oddech3 – utrudnione oddychanie2. Wydzielina z nozdrzy:0 – brak1 – śluzowa2 – ropna3 – z krwią4 – odkładanie się porfiryn wokół nozdrzyV. UKŁAD POKARMOWY1. Ślinotok0 – brak1 – wilgoć tylko wokół pyska2 – ślina płynie z pyska2. Biegunka0 – brak1 – występuje3. Krwawienie z odbytu:0 – brak1 – występujeVI. UKŁAD MOCZOWY1. Moczenie się:0 – brak1 – występuje2. Krwiomocz:0 – brak1 – występujeVII UKŁAD ROZRODCZY1. Wydzielina patologiczna z narządów rozrodczych0 – brak1 – występujePonieważ ocena objawów klinicznych jest z natury ocenąsubiektywną, różniącą się pomiędzy laboratoriami jaki wykonywana w danym laboratorium przez różne osoby,wskazane było zatem by obserwacje kliniczne prowadziłazawsze ta sama osoba. W przypadku badań toksycznościostrej jest to możliwe, natomiast w badaniach przewlekłychtrwających do 2 lat takie rozwiązanie jest praktycznie niemożliwe.Ważną zasadą wykonywania obserwacji klinicznych jestprowadzenie ich każdorazowo o tym samym czasie i w standardowymmiejscu zapewniając jednocześnie, że zmianyw warunkach badania były minimalne.Zakres badań klinicznych w badaniach toksykometrycznychwg Wytycznych OECD do Badań Substancji Chemicznychpowinien obejmować, ale nie ograniczać się, do zmianw skórze, sierści, oczach i błon śluzowych, występowaniawydzielin i wydalin oraz objawów odruchowych tj. łzawienie,stroszenie się sierści, nienormalny sposób oddychania.Należy odnotować zmiany w chodzie, postawie i reakcjina chwytanie, jak również obecność ruchów klonicznychlub tonicznych, stereotypię lub dziwaczne zachowanie się[3, 4, 5].Uzyskane wyniki obserwacji klinicznych powinny byćopisane przy zastosowaniu systemów punktowych, wyraźnieokreślonych przez dane laboratorium. Celem ujednoliceniaoceny zmian klinicznych i ich optymalizacji opracowanoklasyfikację punktową stosowaną w naszym laboratorium.Klasyfikację tę przedstawiono w tabeli I. Opracowanie tejskali miało na celu dokładne scharakteryzowanie zmianz jednoczesnym uwzględnieniem ich natężenia. Z wprowa-27
Farm Przegl Nauk, 2009,9Tabela II.Wyniki szczegółowych obserwacji klinicznych – karta badaniaRodzaj badania: ………………………………………………………………………………..Badany materiał: ………………………………………………………………………….…….Kod badania: .……. Dawka / stężenie* (mg/kg m.c.) / (ppm)*: ………Nr klatki: ……….Gatunek: …………..….… Płeć: ……………………. Nr zwierzęcia (komp./rejstr.): ...….……ParametrDzień lub tydzień doświadczenia * / data obserwacji1. Postawa ciałaI Układ ruchu, zachowaniesię, reakcje na bodźceII Skóra i sierść2. Sposób chodzenia3. Aktywność ruchowa4. Ruch mimowolny – kloniczny5. Ruch mimowolny – toniczny6. Reakcja zwierzęcia na chwytanie7. Wokalizacja8. Reakcja na bodźce dźwiękowe1. Barwa skóry2. Obrzęk3. Naskórek4. Sierść5. Zmiany na skórze1. Wydzielina z oczuIII Oczy ipowiekiIV UkładoddechowyV Układpokarmowy2. Wytrzeszcz oczu3. Zmętnienie rogówki4. Zamknięcie powieki1. Oddychanie2. Wydzielina z nozdrzy1. Ślinotok2. Biegunka3. Krwawienie z odbytuVIUkładmoczowy1. Moczenie się2. KrwiomoczVII Układrozrodczy1. Wydzielina patologiczna z narządówrozrodczych* niepotrzebne skreślićPodpisdzeniem klasyfikacji związane było wprowadzenie odpowiedniejkarty badania, w której notuje się wyniki przeprowadzonychszczegółowych obserwacji klinicznych (tabelaII). Regularne prowadzenie obserwacji dostarcza informacjio momencie pojawienia się oznak toksyczności, ich nasileniujak również czasie trwania.Wprowadzenie w naszym laboratorium ujednoliconegosystemu uchwycenia i kwalifikacji objawów klinicznychoraz ich opisywanie w odpowiednich kwestionariuszachsprawdziło się. Pomimo subiektywnego charakteru obserwacji,opracowany system pozwala na wykrycie i jednolitąocenę występujących objawów klinicznych, w tym objawówwczesnej neurotoksyczności. System ten może byćprzeniesiony do innych laboratoriów toksykometrycznychi poddany miedzylaboratoryjnej ocenie.Prowadzenie obserwacji klinicznych pozwala na wczesnewykrycie oznak toksyczności, zmian chorobowychoraz zapobiega stratom zwierząt dla oceny toksyczności zewzględu na ich padnięcie, a następnie autolizę tkanek [8].Z punktu widzenia etycznego prowadzenie tych obserwacji28
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073pozwala na identyfikację zwierząt będących w stanie agoniilub widocznie cierpiących bądź też wykazujących oznakisilnego i trwałego bólu, co daje podstawę do przeprowadzeniaeutanazji [9].Piśmiennictwo1. Rydzyński K. Przegląd zmian w metodach toksykometrycznychzalecanych przez OECD i Unię Europejską;metody alternatywne. Med Pr 1996; 5:17-30.2. OECD. Acute Oral Toxicity. W: OECD Guidelines forTesting of Chemicals. Section 4, No 401,OECD, Paris,1987.3. OECD. Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Method. W:OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Section 4,No 420,OECD, Paris, 1992.4. OECD. Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity Study inRodents. W: OECD Guidelines for Testing of Chemicals.Section 4, No 407,OECD, Paris, 1995.5. OECD. Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study inRodents. W: OECD Guidelines for Testing of Chemicals.Section 4, No 408,OECD, Paris, 19986. OECD.Guidance Notes for Analysis and Evaluation ofRepeated Dose Toxicity Studies. Enviromental Healthand Safety Monograph Series on Testing and AssesmentNo 32, OECD 20007. Gralewicz S. Ocena działania neurotoksycznego. W:Toksykologia przemysłowa. Red Indulski J A, PiotrowskiJ K. Wydawnictwo IMP. Łódź 1993, 39-49.8. Zasady i metody oceny toksyczności związków chemicznych.Kryteria Zdrowotne Środowiska. WydawnictwoPZWL. T 6, Warszawa 1986.9. OECD. Guidance Document on the Recognition, Assessment,and Use of Clinical Signs as Humane Endpointsfor Experimental Animals Used in Safety Evaluation.Enviromental Health and Safety Monograph Series onTesting and Assesment No 19, OECD 2000Adres do korespondencji:Inga MrzykInstytut Przemysłu OrganicznegoOddział w Pszczynieul. Doświadczalna 27, 43-200 Pszczynatel. 32 210 30 81 wew. 102e-mail: imrzyk@ipo-pszczyna.pl29
Farm Przegl Nauk, 2009,9, 30-33Ludzkie topoizomerazy jako cel komórkowywspółczesnej chemioterapiiHuman topoisomerases as a cellular target of current chemotherapyDorota MańkowskaInstytut Podstaw Chemii ŻywnościWydział Biotechnologii i Nauk o ŻywnościPolitechnika ŁódzkaStreszczenieDoświadczalne określenie związku pomiędzy cytotoksycznymdziałaniem najstarszego chemioterapeutyku– kamptotecyny, z zablokowaniem aktywności enzymatycznejtopoizomerazy I okazało się punktem zwrotnymw poszukiwaniu skutecznej broni przeciw nowotworomOd tego momentu obserwuje się gwałtowny wzrost zainteresowaniabadaczy udoskonalaniem znanych już leków,wprowadzanie do klinik ich nowych, skuteczniejszychanalogów, a także syntetyzowanie całkowicie nowychcząsteczek o odmiennych od dotychczasowych mechanizmachdziałania. Odkrycie nowych sposobów walkiz rakiem, choćby terapii celowanej, teoretycznie mogłobyspowodować zmniejszenie zainteresowania naukowcówtopoizomerazami, jednak w praktyce klinicznej to inhibitorytych właśnie enzymów nadal pozostają głównym orężemw walce z nowotworami, zarówno w monoterapii jak iw terapii wielolekowej.Słowa kluczowe: topoizomeraza I, topoizomeraza II, mechanizmdziałania topoizomeraz, inhibitory topoizomerazAbstractExperimental determination of the connection between cytotoxicway of action of the oldest chemotherapeutic agent– camptothecin, with blocking of the enzymatic activity oftopoisomerase I, turned out to be a turning point in questfor the effective weapon against cancers. From this momenta significant increase in the interest of researchers in theimprovement of the already known medicines is being observed,introduction of their new, more effective analoguesinto clinics, as well as synthesis of completely new moleculeswith different from previous mechanisms of action. Thediscoveries of new ways to the fight against the cancer, forinstance targeted therapy, theoretically could cause a reductionof interest of scientists in topoisomerases, however inclinical practice these inhibitors of the very enzymes stillremain the main weapon in the fight against cancers, bothin the monotherapy and in combination therapy.Key words: topoisomerase I, topoisomerase II, mode ofaction of topoisomerases, inhibitors of topoisomerasesLokalizacja i funkcje w komórceTopoizomerazy to enzymy komórkowe występującew dużej ilości w jądrze komórkowym (w szczególnościw jąderku) oraz w mitochondriach. Odpowiadają one zausuwanie napięcia torsyjnego powstającego w strukturzeDNA podczas transkrypcji i replikacji, umożliwiając w tensposób bezpośredni dostęp polimerazom do kodu genetycznegokomórki [4, 5].Podczas podziałów komórkowych funkcja topoizomerazpolega na rozplątywaniu i fizycznym oddzieleniu odmatrycy nowo zreplikowanej nici DNA, poprzez umożliwienieprzejścia nietkniętej nici DNA przez pęknięciew podwójnym heliksie [6]. W przypadku braku topoizomeraz,nagromadzenie silnie skręconego i splątanego materiaługenetycznego uniemożliwiłoby zachodzenie niezbędnychdo życia procesów komórkowych, ostatecznie doprowadzającdo przedwczesnej śmierci komórki.Działanie wszystkich rodzajów topoizomeraz oparte jestna przejściowym przecinaniu jednej lub dwóch nici DNApoprzez tworzenie kowalencyjnego wiązania fosfodiestrowegopomiędzy resztą tyrozyny z centrum aktywnego enzymui grupą fosforanową jednego z końców nici DNA [4].Klasyfikacja topoizomerazOpierając się na różnicach w budowie i funkcji, w rodzinietopoizomeraz wyróżnia się dwie główne grupy białek[5]:- topoizomerazy typu I,- topoizomerazy typu II.Topoizomerazy typu I generują pęknięcie tylko w jednejnici podwójnego heliksu, tworząc kowalencyjne wiązaniez grupą fosforanową końca 5’ lub 3’ DNA, w zależności odtego czy mamy do czynienia odpowiednio z podgrupą IAczy IB enzymu [4, 7]. Stąd też niekiedy spotkać się możnaz nazewnictwem I-5’ lub I-3’, tożsamym odpowiednioz IA lub IB [4]. Głównym zadaniem topoizomeraz typu I jestrelaksacja silnie skręconych cząsteczek DNA, przy czym30
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073białka typu IA usuwają napięcie torsyjne z negatywnychsuperzojów, natomiast enzymy typu IB– bardzo efektywnie relaksują zarówno pozytywniejak i negatywnie skręcone cząsteczki DNA [5].W odróżnieniu od topoizomeraz typu I, któredo swojej aktywności enzymatycznej nie potrzebujązewnętrznego źródła energii, enzymy typuII do pracy potrzebują energii z hydrolizy ATP.Topoizomerazy typu II generują przejściowe pęknięciejednocześnie w obu niciach DNA. Równieżtę grupę topoizomeraz podzielono na dwie podgrupy– typ IIA i IIB, wykazujące pewne różnicew strukturze łańcucha aminokwasowego [4].Mechanizm działaniatopoizomerazW cyklu katalitycznym ludzkiej topoizomerazyI (EC 5.99.1.2.) wyróżnia się pięć etapów[7]:1) wiązanie DNA,2) rozcinanie jednej nici,3) usuwanie napięcia torsyjnego,4) religacja (odtworzenie ciągłości nici),5) odłączenie białka od DNA i przemieszczeniena inną cząsteczkę substratu.Topoizomeraza I wiąże się wyłącznie z dwuniciowymDNA, co więcej znacznie łatwiejz DNA superhelikalnym, niż z cząsteczką liniową[8]. Rozcięcie jednej nici DNA następuje poprzez ataknukleofilowy tlenu z grupy hydroksylowej reszty tyrozynyz centrum aktywnego enzymu (Tyr723) na grupę fosforanowąjednego z końców ciętej nici. W przypadku ludzkiejtopoizomerazy IB jest to koniec 3’ łańcucha DNA. W skutektego ataku powstaje wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy resztątyrozyny i fosforanem końca 3’ podwójnej helisy – tworzysię tzw. „kompleks rozszczepialny” (ang. cleavable/cleavagecomplex). Kompleks ten dodatkowo stabilizują wiązaniawodorowe, utworzone pomiędzy resztami aminokwasowymiz centrum aktywnego enzymu (Arg488, Arg590, His632,Lys532) i wolnymi atomami tlenu grupy 3’ fosforanowejprzyłączonej do Tyr723 (Rys. 1.) [4, 9].Usuwanie napięcia torsyjnego następuję prawdopodobniewedług jednego z dwóch mechanizmów. Jeden z zaproponowanychmodeli zakłada, że koniec nici DNA z wolnągrupą 5’-hydroksylową ulega rotacji wokół drugiej nietkniętejnici DNA (mechanizm wolnej rotacji) [8]. Natomiast wedługdrugiego modelu nienaruszona nic DNA przechodziprzez rodzaj mostu utworzonego przez topoizomerazę połączonąkowalencyjnie z końcem 3’ i równocześnie niekowalencyjniez końcem 5’ przeciętej nici DNA (mechanizmkontrolowanej rotacji) [9].W kolejnym etapie cyklu katalitycznego ludzkiej topoizomerazyIB następuje religacja DNA. Cykl zamyka odłączeniesię białka od DNA i przemieszczenie na inną cząsteczkęsubstratu [8].Podobny mechanizm działania prezentują ludzkie topoizomerazyz podgrupy IA, z tym że rozcinanie jednej niciDNA następuje na skutek przyłączenia enzymu do końca 5’,a nie 3’ jak w przypadku enzymów z podgrupy IB [4].Rys.1. Struktura krystaliczna fragmentu centrum aktywnego ludzkiej topoizomerazyI w kompleksie rozszczepialnym topo I–DNA (cytozyna w pozycji -1)otrzymana przez Champoux [4], dostępna w Protein Data Bank (ID 1EJ9); zielonaprzerywana linia obrazuje wiązania wodorowe; długość wiązań podanow angstremach (Å).Ludzka topoizomeraza II (EC 5.99.1.3) posiada dwieizoformy – α i β, różniące się między sobą przede wszystkimpoziomem ekspresji w zależności od stanu fizjologicznegokomórki, typem oddziaływania z DNA oraz nieznaczniemasą cząsteczkową [4, 10]. Ekspresja topoizomerazy IIβjest względnie stała w całym cyklu komórkowym. W przypadkutopoizomerazy IIα obserwuje się gwałtowny wzroststężenia tego białka w komórkach aktywnie dzielących się– dwa do trzech razy podczas fazy G 2/M [10]. Ta właściwośćtopoizomerazy IIα została wykorzystana w projektowaniuleków cytotoksycznych.Mechanizm działania topoizomeraz typu II jest w dużymstopniu zbliżony do opisanego wcześniej cyklu katalitycznegotopoizomeraz typu I. Homodimery topoizomerazy IIwiążą się z obiema nićmi DNA (zamiast z jedną, jak w przypadkutopo I), tworząc kompleks rozszczepialny i generującpodwójne pęknięcie w helisie. Proces wiązania enzymudo DNA również nie wymaga dostarczenia energii z zewnątrz.Zaobserwowano natomiast, że obecność kationówdwuwartościowych (zwłaszcza Mg 2+ ) działa pobudzającona przyłączanie się białka do DNA [10]. Podczas tworzeniakompleksu rozszczepialnego najważniejszą funkcję i tupełni katalityczna reszta tyrozyny, a dokładnie dwie resztytego aminokwasu – po jednej z obu podjednostek enzymu.Podczas przecinania podwójnego heliksu następuje kowalencyjneprzyłączenie obu podjednostek topoizomerazy IIdo końca 5’ DNA poprzez utworzenie wiązania fosfotyrozynowego,analogicznie jak w przypadku topoizomerazy I[11]. Powstałe zmiany konformacyjne w cząsteczce DNApowodują fizyczne oddalenie od siebie obu nici przecinanejhelisy, formując ten fragment DNA w rodzaj bramy (ang.G-segment), przez którą „przeciągany” jest (transportowa-31
Farm Przegl Nauk, 2009,9Rys. 2. Schemat wyjaśniający mechanizm przechodzenia fragmentu jednej cząsteczkiDNA (T-segment) przez fragment drugiej cząsteczki DNA (G-segment)w cyklu katalitycznym topoizomerazy II, zaproponowany przez Wanga [5]; miejscawiązania ATP oznaczono gwiazdkami.ny) drugi nietknięty fragment tej samej lub innej cząsteczkiDNA (ang. T-segment) (Rys. 2.). Ten etap cyklu katalitycznegotopoizomerazy II wymaga dostarczenia energii z hydrolizyATP. Cykl kończy ponowne łączenie wolnych końcówuprzednio uszkodzonego DNA w jedną, dwuniciowącząsteczkę [4, 5].Zarówno topoizomerazy I jak i II typu mogą usuwać napięcietorsyjne z pozytywnych i negatywnych superzwoi DNA. Niemniejjednak tylko topoizomerazy II typu potrafią relaksowaćzwinięte ze sobą na kształt łańcucha dwie cząsteczki DNA [6].Inhibitory topoizomeraz32W odpowiedzi na odkrycie, iż celem ataku najstarszegoz chemioterapeutyków (kamptotecyny) jest topoizomerazaI [1] nastąpił gwałtowny wzrost zainteresowania badaczytą grupą białek. Prowadzone badania skupiły się wokół poszukiwańnowych, skuteczniejszych inhibitorów topoizomeraz.Najlepiej poznanymi inhibitorami topoizomerazy Ijest kamptotecyna i jej analogi, a wśród nich powszechniejstosowane w chemioterapii – topotekan i irinotekan [12-14]. Mechanizm cytotoksycznego działania kamptotecynyi wszystkich jej analogów polega na stabilizacji kompleksurozszczepialnego topo I–DNA. Prowadzi to do zderzeniawidełek replikacyjnych z unieruchomionym przez inhibitorkompleksem rozszczepialnym i zahamowania dalszej replikacji.Powstanie kompleksu topo I–DNA–lek doprowadzado zerwania ciągłości nici, zatrzymania komórek w fazie G 2i w konsekwencji apoptotycznej śmierci [15]. Kamptotecynai jej analogi wiążą się swoiście w kompleks zarówno ztopoizomerazą I, poprzez interakcje z katalityczną tyrozyną,jak i z DNA, ale nie mają powinowactwa do wolnego enzymu(nie związanego z DNA), ani też do wolnego DNA [8].Drugi, równoległy efekt działania tej grupy leków zachodziw czasie transkrypcji i dotyczy przesuwających sięcząsteczek polimerazy RNA oraz stabilizowanych przeznie kompleksów rozszczepialnych zlokalizowanych na matrycowymDNA w obrębie rejonu, który aktualnie podlegatranskrypcji. Dochodzi do zatrzymania proliferacji komórekw fazie G 1i uruchomienia aparatu apoptozy, główniew fazie S. Ponieważ stężenie i aktywność topoizomerazy Iw jądrze jest najwyższa w fazie S cyklu komórkowego, inhibitorytopo I określa się jako cytostatyki fazowo swoiste(ang. S-phase specific), blokujące kompleksy rozszczepialnew tej właśnie fazie [2]. Udowodniono, że komórki pozostającew fazie S mają od 100 do 1000 razy większąwrażliwość na kamptotecynę niż komórki w fazieG 1lub G 2[16]. Co więcej okazało się, że stężenietopoizomerazy I w komórkach nowotworowychjest o wiele wyższe niż w komórkach zdrowych[17], nawet 14-16 razy wyższe w komórkach rakaokrężnicy niż w sąsiadujących prawidłowych komórkachśluzówki [18].Drugą grupę cytostatyków fazowo swoistychstanowią inhibitory topoizomerazy II, a ściślejjej izoformy IIα [3, 19].Jak już wspomniano wcześniej, stężenie topoizomerazyIIα zmienia się w trakcie cyklu komórkowego.Podczas podziałów komórkowych,a zwłaszcza w fazie G 2i M, ekspresja topoizomerazyIIα osiąga maksymalne wartości. W komórkach pozostającychw fazie spoczynkowej (G 0) stężenie tego białkajest nawet 2-3 razy niższe niż w przypadku aktywnych proliferacyjniekomórek [19]. Zatem zdolność topoizomerazy IIαdo rozdzielania dwóch splątanych cząsteczek DNA wskazujejak ważną rolę pełni to białko w organizacji materiaługenetycznego, a zwłaszcza w segregacji chromosomów.Aktywność topoizomerazy IIα wzrasta szczególnie wyraźniew komórkach zmienionych nowotworowo i jest związanaz postępującą agresywnością oraz powiększaniem sięguza [19]. Dlatego też ta izoforma topoizomerazy II stała sięjednym z najważniejszych, obok ludzkiej topoizomerazy I,celem współczesnych chemioterapeutyków.Kompleksy rozszczepialne topo IIα – DNA są punktemuchwytu dla leków z grupy antracyklin, aminoakrydyn orazepipodofilotoksyn (etopozyd, tenipozyd) [3].Mechanizm działaniatych cytostatyków jest w dużej mierze podobny do opisanegowyżej mechanizmu działania kamptotecyny i jej pochodnych.Leki te stabilizują kompleksy rozszczepialne tworzoneprzez topoizomerazę IIα i DNA, uniemożliwiając religację niciDNA, dochodzi do zatrzymania komórki w fazie G 2i ostatecznieśmierci komórki. Niemniej jednak komórki nowotworowecoraz częściej potrafią ominąć problemy związane z zablokowaniemprzez selektywne cytostatyki topo IIα, zwiększającekspresję drugiej izoformy – topoizomerazy IIβ [19].Poszukiwanie nowych sposobów walki z nowotworami,m. in. wprowadzenie do klinik terapii celowanej, być możepociągnie za sobą spadek zainteresowania topoizomerazami.Jednak w praktyce to inhibitory tych właśnie enzymównadal pozostają głównym orężem w walce z rakiem, zarównow monoterapii (cytostatyki selektywne) jak i w terapiiwielolekowej [2, 3]. Dowodem czego są prowadzone naszeroką skalę badania przedkliniczne jak i kliniczne nowychinhibitorów topoizomeraz, takich jak gimatecan, diflomotecan,edotecarin czy ARC-111 [14, 20].Piśmiennictwo1. Hsiang YH i wsp. Camptothecin induces protein-linkedDNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I. JBiol Chem 1985; 260: 14873-14878.2. Omyła-Staszewska J, Deptała A. Inhibitory topoizomerazyI – unikalna grupa leków przeciwnowotworowych.Współczesna Onkologia 2003; 7: 45-53.
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-50733. Liu WM, te Poele RH. Recent advances and developmentsin the inhibitors of DNA topoisomerases. CurrEnzyme Inhib 2007; 3: 161-174.4. Champoux JJ. DNA topoisomerases: structure, function,and mechanizm. Annu Rev Biochem 2001; 70:369-413.5. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: Amolecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3:430-440.6. Nitiss JL. Investigating the biological functions of DNAtopoisomerases in eukaryotic cells. Biochim BiophysActa 1998; 1400: 63-81.7. Derlacz R. Informacja genetyczna pod kontrolą – rolaeukariotycznej topoizomerazy I. Postępy Biochem 2001,47: 243-252.8. Pommier Y i wsp. Mechanism of action of eukaryoticDNA topoisomerase I and drugs targeted to the enzyme.Biochim Biophys Acta 1998; 1400: 83-106.9. Stewart L i wsp. A model for the mechanism of humantopoisomerase I. Science 1998; 279: 1534-1541.10. Burden DA, Osheroff N. Mechanism of action of eukaryotictopoisomerase II and drugs targeted to the enzyme.Biochim Biophys Acta 1998; 1400: 139-154.11. Berger JM, Wang JC. Recent developments in DNAtopoisomerase II structure and mechanism. Curr OpinStruct Biol 1996; 6: 84-90.12. Pizzolato JF, Saltz LB. The camptothecins. Lancet 2003;361: 2235-2242.13. Li QY i wsp. Review camptothecin: current perspectives.Curr Med Chem 2006; 13: 2021-2039.14. Teicher BA. Next generation topoisomerase I inhibitors:Rationale and biomarker strategies. Biochem Pharmacol2008; 75: 1262-1271.15. Hsiang YH, Lihou MG, Liu LF. Arrest of replicationforks by drug-stabilized topoisomerase I-DNA cleavablecomplexes as a mechanism of cell killing by camptothecin.Cancer Res 1989; 49: 5077-5082.16. Li LH i wsp. Action of camptothecin on mammaliancells in culture. Cancer Res 1972; 32: 2643-2650.17. Husain I i wsp. Elevation of topoisomerase I messengerRNA, protein, and catalytic activity in human tumors:demonstration of tumor-type specificity and implicationsfor cancer chemotherapy. Cancer Res 1994; 54:539-546.18. Giovanella BC. DNA topoisomerase I-targeted chemotherapyof human colon cancer in Xenografts. Science1989; 246: 1046-1048.19. Kellner U. Culprit and victim – DNA topoisomerase II.Lancet Oncol 2002; 3: 235-243.20. Basili S, Moro S. Novel camptothecin derivatives as topoisomeraseI inhibitors. Expert Opin Ther Pat 2009; 19:555-574.Adres do korespondencji:dr inż. Dorota MańkowskaInstytut Podstaw Chemii ŻywnościWydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzkaul. Stefanowskiego 4/1090-924 Łódźtel.: 42 631 34 14e-mail: dorota.mankowska@p.lodz.pl33
Farm Przegl Nauk, 2009,9, 34-37Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain i Metotreksatuna niektóre parametry biochemiczne w surowicy krwi myszyświadczące o funkcji nerekEffect of simultaneous treatment with Ukrain and Methotrexateon some biochemical parameters of mice serum indicatingon kidney functionMagdalena Izdebska 1 , Magdalena Ćwieka 1 , Bogumiła Sobkowiak 2 , Ewa Jagiełło-Wójtowicz 11Katedra i Zakład Toksykologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Analityki Medycznej,Uniwersytet Medyczny w Lublinie2Apteka Szpitalna, Centrum Onkologii Ziemi LubelskiejStreszczenieW pracy oceniano wpływ łącznego stosowaniu dwóch lekówprzeciwnowotworowych tj. leku Ukrain (9,5 lub 19,0mg/kg ip. 1x dziennie przez 14dni) i Metotreksatu (MTX,18,8 mg/kg ip. 1x w 1 i w 8 dniu doświadczenia) na wybraneparametry biochemiczne świadczące o funkcji nerekmyszy. W surowicy krwi zwierząt oznaczono stężeniamocznika, kreatyniny i beta-2-mikroglobuliny (β-2-M).Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, istotnezwiększenie stężenia mocznika, kreatyniny oraz β-2-Mw surowicy krwi myszy otrzymujących łącznie oba lekiw porównaniu z odpowiednimi grupami otrzymującymitylko Ukrain lub MTX. Uzyskane wyniki sugerują, żełączne stosowanie leku Ukrain z MTX może prowadzićdo nasilania ich działania toksycznego.Słowa kluczowe: Ukrain, Metotreksat, mocznik, kreatynina,beta-2-mikroglobulina (β-2-M)SummaryIn this study evaluated the influence of simultaneous treatmentwith two anticancer drugs i.e. Ukrain (9,5 or 19,0mg/kg ip. once daily for 14 days) and Methotrexate (MTX,18,8 mg/kg ip. once in the first and eighth day of experience)on some biochemical parameters indicating on kidney function.The serum concentration of urea, creatinine and beta-2-microglobulin (β-2-M) were determined. The study showeda significant increase the concentrations of urea, creatinineand β-2-M in the serum of mice treatment Ukrain with MTXas compared with the groups receiving Ukrain or MTX only.The results suggest that simultaneous treatment with Ukrainand MTX can lead to increasing their toxic activity.Key words: Ukrain, Methotrexate, urea, creatinine, beta-2-microglobulin (β-2-M), miceWstępLek przeciwnowotworowy Ukrain (NSC – 631570) jesttiofosforowo – kwasowo pochodną alkaloidów Chelidoniummajus L. W badaniach in vitro i in vivo wykazano, że Ukraincechuje się selektywnym działaniem cytotoksycznym i/lubcytostatycznym na komórki nowotworowe [1, 2, 3, 4]. W terapiionkologicznej Ukrain często stosowany jest przed lubpo chemioterapii i/lub radioterapii. Stosowanie leku u pacjentówonkologicznych powoduje redukcję masy guza orazczęściową lub całkowitą remisję [5, 6]. Podczas skojarzonejchemioterapii cytostatykami często obserwuje się licznedziałania niepożądane stosowanych leków gdyż nie sąone obojętne dla zdrowych komórek organizmu [7]. Ukrainw terapii skojarzonej osłabia toksyczne działania niepożądaneinnych cytostatyków oraz poprawia tolerancję chemioterapiiu pacjentów w różnym wieku [4, 8, 9]. Ponieważw dostępnym piśmiennictwie brak jest danych dotyczącychstosowania leku Ukrain w połączeniu z metotreksatem(MTX) wydawało się celowym podjęcie takich badań.W onkologii MTX stosowany jest w leczeniu wielu choróbnowotworowych, m.in. guzach piersi, szyi i głowy orazw zaawansowanych stadiach chłoniaka nieziarniczego. Charakteryzujesię jednak dużą toksycznością i daje toksyczneinterakcje z wieloma lekami. Do zwiększenia toksycznościMTX dochodzi przy równoczesnym stosowaniu takich cytostatykówjak cyklosporyna, cisplatyna oraz alkaloidy barwinkaróżowatego (Vinca rosea) [7, 10]. Dlatego też celem tejpracy była ocena wpływu skojarzonego działania leku Ukraini MTX na niektóre parametry biochemiczne świadcząceo czynności nerek myszy.Materiał i metodyBadania przeprowadzono na myszach, samicach szczepuAlbino Swiss o masie ciała 20±5g. Zwierzęta pochodziłyod licencjonowanego dostawcy (Hodowla Zwierząt Laboratoryjnych,Teresa Górzkowska, Warszawa, Polska). Myszy34
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073przebywały w klatkach, w pomieszczeniu o standardowychwarunkach laboratoryjnych (temp. 20±1 o C, stała wilgotność,hałas) z zachowaniem naturalnego cyklu dobowego.Miały swobodny dostęp do wody i paszy. Po 2-3 dniachadaptacji zwierzęta rozdzielano losowo do grup doświadczalnychliczących po 8 sztuk. Procedury eksperymentalnebadań uzyskały zgodę i zostały zatwierdzone przez I LokalnąKomisję Etyczną d/s Doświadczeń na Zwierzętach przyUniwersytecie Medycznym w Lublinie.W pracy stosowano: lek Ukrain (wodny koncentrat 1:30,Ukrainian Anti-Cancer Institute, Vienna, Austria), Metotreksat(MTX, Metotreksat-Ebewe, amp. 10mg/1ml, EbewePharma, Unterach, Austria), oraz wodę do iniekcji (aquapro injectione; Polfa, Lublin, Polska). Do oznaczeń biochemicznychużywano gotowych zestawów diagnostycznych:mocznik (Liquick Cor-UREA 120) i kreatynina(Liquick Cor-CREATININE 60) z firmy P.Z. CORMAY,Lublin, Polska; oraz β-2-mikroglobulina (β-2-M, Beta-2-Microglobulin, ELISA, Immundiagnostik AG, Bensheim,Niemcy).Wodne roztwory leku Ukrain (9,5 lub 19 mg/kg) orazMTX (18,8 mg/kg) przygotowywano ex tempore i podawanomyszom dootrzewnowo (ip), w stałej objętości0,1 ml/10g m.c. Zwierzęta grup kontrolnych otrzymywałyip takie same objętości wody do iniekcji.Procedura doświadczeń składała się z 6 grup (I-VI).Myszy poszczególnych grup otrzymywały kolejno jedenraz (1x) dziennie przez 14 dni: I - wodę do iniekcji, II i III-Ukrain 9,5 i 19 mg/kg; IV – MTX (1x w 1 i 8 dniu doświadczenia)a w pozostałych dniach wodę do iniekcji; V – Ukrain(9,5 mg/kg) w kombinacji z MTX (1x w 1 i 8 dniu doświadczenia);VI - Ukrain (19 mg/kg) w kombinacji z MTX (1xw 1 i 8 dniu doświadczenia). Schemat podawania obu lekówzastosowany w niniejszej pracy oparty był na dostępnychw piśmiennictwie schematach leczenia pacjentów onkologicznychtymi lekami [1,4,11,12].W 15 dniu doświadczenia tj. 24 godz. po ostatniej iniekcjizwierzęta w/w grup dekapitowano i pobierano krew,którą pozostawiano do wykrzepnięcia w celu uzyskania surowicy.Krew po wykrzepnięciu wirowano (3000 obr./min.)przez 10 min. Następnie pobierano surowicę do probówekpolistyrenowych i przechowywano w temp. (-20 o C) dojednoczasowego oznaczania badanych parametrów biochemicznychtj. mocznika, kreatyniny i β-2-M.Stężenie mocznika (mg/dl) oznaczono metodą enzymatyczną,kinetyczną z ureazą i dehydrogenazą glutaminianowązgodnie z instrukcją zamieszczoną przez producenta.Absorbancje prób badanych i próby wzorcowej odczytywanona czytniku mikropłytek EL x808 IU(Bio-Tek InstrumentsInc.) przy długości fali λ=340 nm.Stężenie kreatyniny (mg/dl) oznaczono kolorymetrycznie,zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Absorbancjeprób badanych i próby wzorcowej odczytywanowobec powietrza, przy długości fali λ=500 nm.w spektrofotometrzeSpekol 11.Stężenie β-2-M (mg/l) oznaczono metodą immunoenzymatycznąELISA, zgodnie z instrukcją zamieszczoną przezproducenta. Absorbancje prób wzorcowych i badanych odczytywanow czytniku mikropłytek EL x808 IU(Bio-Tek InstrumentsInc.) przy długości fali λ = 450 nm.Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzonoprzy użyciu testu t-Studenta przy poziomie istotnościp
Farm Przegl Nauk, 2009,919,46 ± 1,65mg/dl* Δ p< 0,05 * w porównaniu z grupą kontrolną Δ w porównaniu z lekiem UkrainWyniki wyrażono jako średni % grupy kontrolnejRyc.1. Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain (1x dziennie przez 14 dni) i MTX (1x w 1 i 8dniu doświadczenia) na stężenie mocznika w surowicy krwi myszy0,99 ± 0,13mg/dl# p< 0,05 w porównaniu z MTXWyniki wyrażono jako średni % grupy kontrolnejRyc. 2. Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain (1x dziennie przez 14 dni) i MTX (1x w 1 i 8dniu doświadczenia) na stężenie kreatyniny w surowicy krwi myszy0,29 ± 0,03mg/lW surowicy krwi zwierząt oznaczonostężenia mocznika, kreatyniny i beta-2-mikroglobuliny (β-2-M).Diagnostyka laboratoryjna funkcjinerek oparta jest m.in. na oznaczaniuw surowicy krwi substancjiwydalanych głównie przez nerkitakich jak mocznik czy kreatynina.Wzrost ich stężenia może świadczyćo zaburzeniu czynności nerek[14]. Czułym wskaźnikiem zmniejszeniawartości przesączania kłębuszkowego(GRF) oraz stopniauszkodzenia cewek proksymalnychnerek jest wzrost stężenia β-2-Mw surowicy krwi [15].W pracy wykazano, że 14– dniowestosowanie myszom leku Ukrain(9,5 lub 19,0 mg/kg 1x dziennieip.) nie wpływało na stężeniemocznika i kreatyniny, obniżałozaś stężenie β-2-M w surowicykrwi w porównaniu z wartościamitych parametrów otrzymanymiw surowicy krwi myszy grupy kontrolnej.Natomiast po 14 dniachw grupie myszy, którym dwukrotniepodano MTX (1x ip w 1 i 8 dniudoświadczenia) stwierdzono istotnezwiększenie stężenia mocznikai β-2-M w porównaniu z wynikamiuzyskanymi w grupie kontrolnej.W pracy wykazano również, żelek Ukrain (9,5 lub 19,0 mg/kg) podanyw kombinacji z MTX (18,8 mg/kg) istotnie zwiększał w surowicykrwi myszy stężenie mocznika (w porównaniutylko z lekiem Ukrain) orazkreatyniny (w porównaniu z MTX).Wartości stężenia β-2-M w tych grupachbyły zbliżone do wartości tegobiałka w grupie kontrolnej.Na podstawie uzyskanych wynikówmożna przyjąć, że przy łącznymstosowaniu leku Ukrain z MTX dochodzido zwiększenia toksycznościobydwu leków.36Wnioski1. Ukrain stosowany przez 14 dni* Δ p< 0,05 * w porównaniu z grupą kontrolną Δ w porównaniu z lekiem Ukrainzmniejszał istotnie tylko stężenieWyniki wyrażono jako średni % grupy kontrolnejβ-2-M w surowicy krwi myszy.2. MTX (podany w 1 i 8 dniu do-Ryc. 3. Wpływ łącznego stosowania leku Ukrain (1x dziennie przez 14 dni) i MTX (1x w 1 i 8świadczenia) istotnie zwiększał stężeniemocznika i β-2-M w porówna-dniu doświadczenia) na stężenie β-2-mikroglobuliny w surowicy krwi myszytów. Kwaśne pH moczu sprzyja wytrącaniu się kryształkówMTX w kanalikach nerkowych. Dlatego też w pracy postanowionoocenić funkcję nerek myszy poddanych działaniuleku Ukrain, Metotreksatu oraz łącznego ich stosowania.niu z grupą kontrolną .3. Po łącznym stosowaniu leku Ukrain (9,5 lub 19 mg/kg)z MTX (18,8 mg/kg) notowano istotne zwiększenie stężeniamocznika i kreatyniny w surowicy krwi myszy.
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073Piśmiennictwo1. Jagiełło-Wójtowicz E, Kleinrok Z, Urbanska EM.Ukrain (NSC-631570) in experimental and clinicalstudies: a review. Drugs Exp Clin Res 1998; 24:213-219.2. Liepins A i wsp. Induction of bimodal programmed celldeath in malignant cells by the derivative Ukrain (NSC-631570). Drugs Exp Clin Res 1996; 22: 73-79.3. Nowicky JW i wsp. Ukrain both as an anticancer andimmunoregulatory agent. Drugs Exp Clin. Res 1992; 18:51-54.4. Uglyanitsa KN i wsp. Ukrain: A novel antitumor drug.Drugs Exp Clin Res 2000; 26: 341-356.5. Aschhoff B. Retrospective study of Ukrain treatmentin 203 patients with advanced-stage tumors. Drugs ExpClin Res 2000; 26: 249 -252.6. Lohninger A, Hamler F. Chelidonium majus L. (Ukrain)in the treatment of cancer patients. Drugs Exp Clin. Res1992; 18: 73-77.7. Blower P i wsp. Drug – drug interactions on oncology:Why are they important and can they be minimized?,Crit Rev Oncol Hematol 2005; 55: 117-142.8. Gansauge F i wsp. NSC-631570 (Ukrain) in the palliativetreatment of pancreatic cancer. Results of a phase IItrial. Langenbecks Arch Surg 2002; 386:570-574.9. Gansauge F i wsp. The clinical efficacy of adjuvant systemicchemotherapy with gemcitabine and NSC-631570in advanced pancreatic cancer. Hepatogastroenterology2007; 54: 917-920.10. Bangert CA, Costner MI. Methotrexate in dermatology.Dermatol Ther 2007; 20: 216-228.11. Green MR, Chamberlain MC. Renal dysfunction duringand after high-dose methotrexate. Cancer Chemother.Pharmacol 2009, 63:599-604.12. Strang A, Pullar T.Methotrexate toxicity induced by acuterenal failure. J R Soc Med 2004; 97: 536-537.13. Świerkot J. Działanie niepożądane w czasie terapii metotreksatemu chorych na reumatoidalne zapalenie stawów.Adv Clin Exp Med 2007, 16: 287-295.14. Angielski S. Nerki. W: Biochemia kliniczna. Red. AngielskiS, Jakubowski Z, Dominiczak MH. Wyd. Preseusz,Sopot 1997, 44-78.15. Jovanovic D i wsp. Serum cystatin C and β -microglobulin2as markers of glomerular filtration rate. Ren. Fail. 2003,25: 123 – 133.Adres do korespondencji:dr n. farm. Magdalena IzdebskaKatedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinieul. Chodźki 8, 20-093 Lublintel/fax 81 718 75 63e-mail: magiz@o2.pl37
Farm Przegl Nauk, 2009,9INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OFMANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewedtransdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicineand related sciences. The journal publishes conferencereports and materials, conference announcements, as well asletters to the Editor.2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printedand an electronic form. Electronic versions of articles are to besent to kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl or supplied onCD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagramsand figures) should be addressed to:Scientific Review in Pharmacy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Disk label should contain the first name(s) and surname(s)of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphicsshould be included in separate files. Do not paste pictures andgraphics to text files. The Editor advises to use Star Office,Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.3. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief.The Authors are encouraged to suggest their reviewers,however the final selection of a reviewer is up to the EditorialBoard. The Editors-in-Chief reserves the right to correct orabbreviate the text (after the Author’s approval).Authors are requested to resubmit the revised manuscriptwithin four weeks. Papers that are not resubmitted withinfour weeks will be treated as a new submission.The manuscript that has been rejected by the ScientificReview in Pharmacy should not be resubmitted.4. A cover letter should be included with the manuscript, containinga declaration that the manuscript has not been previouslypublished in print or electronic format and is not under considerationby another journal or electronic medium, signed by allthe Authors. It should also include written approval from thehead of the institution in which the study was conducted.5. All human and animal research will have obtained ethical consentfrom the local Bioethical or Ethical Committee.6. The material sent in and the review will remain among thedocumentation of the Board of Editors.7. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the wholeof the copyrights for the published papers (including the rightto publishing in print, on electronic media, such as CD-ROMdisks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries isallowed without any written permission of the Editor.8. Instructions for authors:8.1. Manuscript Page Setup• Paper: white, A4 format.• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.• Text: Double-spaced, one side of the page only.• Numbering: Insert page numbers at bottom right of eachpage.• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extraline space between paragraphs.• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,with one line above. Indent first line after a subhead. Use anextra line space between the subhead and the text.• Title or Heading of the article: boldface, on separateline.• Second-level subhead: boldface, on separate line.• Third-level subhead: italic, on separate line.8.2. Organization of Manuscript• Title page should include: submission date and Author(s)full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’full current affiliations (for papers with multiply authors,please e<strong>numer</strong>ate the authors and their affiliations in thefollowing way: Author 1 , Author 2 , etc; 1 Affiliation, 2 Affiliation,etc.). Affiliations should contain the full name of the institution.One corresponding author must be designated forpapers with coauthors. At the bottom of the page the fullname, academic degrees/titles, and address of the correspondingauthor should be given, including the telephonenumber, fax number and/or e-mail address. If researchhas been funded, please indicate the source of funding(including grant index/symbol, grant agencies, corporations,or sponsors).• The second page should include an abstract (150-250words). The abstract must be self-contained, and must notrequire reference to the paper to be understood. The abstractshould present objectives and scope of the study orreasons for writing the paper. The methods and techniquesor approaches should be described only to the extent necessaryfor comprehension. The findings and conclusionsshould be concise and informative. The abstract shouldbe followed by the key words consistent with the MedicalSubject Headings Index Medicus, and should not containunfamiliar terms that are not defined, undefined acronymsand reference citations. Neither displayed equations orlists should appear in the abstract.• Body text should be organized as follows:original paper - introduction, material and methods descriptions,research results, discussion;review papers – free structure;case studies – introduction (motivation for the study), casedescriptions, discussion of the characteristic symptoms,treatment results etc.• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-whitephotographs) should be put into a separate envelope. Oneach figure there should be its number (Arabic <strong>numer</strong>als),the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.Figure captions should be placed on separate pages andnumbered consecutively using Arabic <strong>numer</strong>als. Previouslypublished visual materials should be supplied togetherwith the written consent of the Publisher for reprint.• Tables, each on a separate page, should be numberedusing Roman <strong>numer</strong>als and preceded by their captions.Table captions should be placed on separate pages, numberedusing Roman <strong>numer</strong>als.• The papers should not exceed the following limitations:original and review work – 10 pages and others – 5 pages.8.3. References to the works cited should be presented at theend of the paper and arranged according to the sequenceof citations in the body text. The acronyms for journal titlesshould be used according to Index Medicus. Each entry,starting with a new line, should be given a number andmust be presented as follows:• journal citation:Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:557-67.If there are more than three authors, the name of the firstone should be given, followed by an ,,et al” annotation.Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activity andglycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:97-102.• the specific chapter:Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. BiochemiaHarpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.Warszawa 1994, 59-69.• monograph:Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw2004.References to the works cited within the text should be numberedusing Arabic <strong>numer</strong>als and placed between brackets,e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations:original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliographyentries.38
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowaneprace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe,z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych.Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na tematkonferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłaćw formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:<strong>Farmaceutyczny</strong> Przegląd <strong>Naukowy</strong>41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345Fax: +48 32 364 11 58Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:CMYK, rozdzielczość 300 dpi.3. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonychkażdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca sięautorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcjazastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniuz autorem).Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu,zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającymczterech tygodni. W przeciwnym raziepraca będzie traktowana jako nowa publikacja.Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta niemoże być ponownie przedkładany Redakcji FarmaceutycznegoPrzeglądu Naukowego.4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie byłauprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcjiinnego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawieraćrównież podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodęKierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczeniepublikacji w czasopiśmie.5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, któresą przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, musząmieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacjiRedakcji.7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskichdo wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, nanośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszczasię natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.8. Instrukcje dla autorów8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, nabiałym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnegoodstępu między kolejnymi wierszami.• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.• Numeracja stron – kolejne <strong>numer</strong>y stron, począwszy odstrony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnymrogu.• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowychodstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównanedo lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstemnależy wprowadzić jeden odstęp.• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubionączcionką.• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochylonączcionką,8.2 Układ manuskryptu• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora-(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowychprzy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliacjękażdego z nich, w następujący sposób Autor 1 , Autor 2 ,…; 1 Afiliacja, 2 Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim,nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję,dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanychprosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym<strong>numer</strong>y dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lubsponsorów).• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będąceautonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczaćodnośników literaturowych. Streszczenie powinnozawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawoweprocedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych,metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Podstreszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w językupolskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject HeadingsIndex Medicus.• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,według następującego schematu:prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,dyskusja oraz wnioski;prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziałyi podrozdziały;prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby,charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe)powinny być umieszczone w osobnej kopercie, po<strong>numer</strong>owane,opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać naoddzielnej stronie z <strong>numer</strong>ami ilustracji podanymi cyframiarabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane,należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy naponowną publikację.• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należypo<strong>numer</strong>ować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułamiumieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać naoddzielnej stronie z <strong>numer</strong>ami tabel, podanymi cyframirzymskimi.• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinnawynosić 10, a pozostałych – 5 stron.8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowaniaw tekście pracy.Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z IndexMedicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,powinna być opatrzona <strong>numer</strong>em oraz zredagowanazgodnie z niżej podanym przykładem:• czasopismo naukowe:np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibroticdisorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podaćnazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activityand the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;331: 97-102.• wydawnictwo zbiorowe:np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: BiochemiaHarpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo LekarskiePZWL. Warszawa 1994, 59-69.• monografia:np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław2004.Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych,powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracachoryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do10 pozycji.39
<strong>Farmaceutyczny</strong>PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACHMiesięcznikWYDAWCAPrzegląd <strong>Naukowy</strong>Scientific Review in PharmacyIC Value - Current 3.66MNiSW 4PRENUMERATAProsimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literamii dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej pre<strong>numer</strong>atyotrzymają Państwo po około 2 tygodniachod dokonania wpłaty.Dodatkowych informacji udziela Dział Pre<strong>numer</strong>atyi Kolportażu:Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-BiałaTEL. 033 817 38 99Nr rachunku odbiorcy:0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158ODBIORCA:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/274 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............Nr rachunku odbiorcy:0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158ODBIORCA:Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/274 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............