Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Nr 6 / 2008FarmaceutycznyCena 24,50 złPrzegląd NaukowyIndex Copernicus 2,51PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACHMiesięcznikUprzednio pod tytułem PORADNIK FARMACEUTYROK V (IX)Nr 6/2008 (40)WPŁYW DIKLOFENAKU I MAŚLANU SODU NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓWANTYOKSYDACYJNYCH W KOMÓRKACH LINII CACO-2WPŁYW DNA CZERWIU PSZCZELEGO NA PŁODY SZCZURZENARAŻONE NA EMBRIOTOKSYCZNE DZIAŁANIE BUSERELINYWPŁYW LEKÓW NA PROCESY PEROKSYDACJI LIPIDÓWW CHOROBACH OŚRODKOWEGO UKŁADU NERWOWEGOWPŁYW ODCZYNU ŚRODOWISKA NA INTERAKCJĘ CHLOROWODORKURANITYDYNY W OBECNOŚCI USIECIOWANEJ KARBOKSYMETYLOCELULOZYWPŁYW PAKLITAKSELU NA EKSPRESJĘ GENÓW CZYNNIKÓWTRANSKRYPCYJNYCH W KOMÓRKACH RAKA PIERSIWPŁYW SUBSTANCJI POMOCNICZYCH NA PARAMETRY FIZYKOCHEMICZNEORAZ UWALNIANIE PARACETAMOLU Z TABLETEKWPŁYW SUPLEMENTACJI I APLIKACJI METALI NA SKÓRĘWPŁYW WITAMINY E NA OBRAZ MORFOLOGICZNYWYBRANYCH NARZĄDÓW WEWNĘTRZNYCH SZCZURÓWINTOKSYKOWANYCH FLUORKIEM SODUWPŁYW WYBRANYCH POCHODNYCH KSANTONUNA AKTYWNOŚĆ KATALAZY I DYSMUTAZY NADTLENKOWEJW HEMOLIZATACH KRWINEK CZERWONYCH OSÓB ZDROWYCHORAZ OSÓB CHORYCH Z CUKRZYCĄWPŁYW SUBSTANCJI POWIERZCHNIOWO CZYNNYCHNA DOSTĘPNOŚĆ FARMACEUTYCZNĄ KSEROŻELI Z PREDNIZOLONEMWYDALANIE GLIKOZOAMINOGLIKANÓW Z MOCZEMW PRZEBIEGU PROCESU STARZENIA SIĘ USTROJUWYKORZYSTANIE WYBRANYCH GATUNKÓW WIELKOOWOCNIKOWYCHGRZYBÓW W ZWALCZANIU GRONKOWCÓW I PRĄTKÓW GRUŹLICYZASTOSOWANIE TERMOGRAFII W DIAGNOSTYCE SCHORZEŃCZĘŚCI TWARZOWEJ CZASZKIZMIANY W SEKWENCJI DŁUGICH POWTÓRZEŃ KOŃCOWYCH (LTR)ENDOGENNYCH RETROWIRUSÓW ŚWINI (PERV) U ZWIERZĄT W STADZIEPRZEZNACZONYM DO KSENOTRANSPLANTACJIcopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073ISSN 1425-5073OCENA CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ SUROWCÓW ROŚLINNYCHWYKORZYSTYWANYCH DO PRZYGOTOWYWANIA MIESZANEK ZIOŁOWYCHFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy1ANTYUTEROTONICZNE WŁAŚCIWOŚCI BISFENYLOALANINOWYCH ANALOGÓWARGININOWAZOPRESYNY W BADANIACH KURCZLIWOŚCI MACICY SZCZURÓWIN VITRO

Wpływ diklofenaku i maślanu sodu na aktywność enzymówantyoksydacyjnych w komórkach linii Caco-2Influence of diclofenac and sodium butyrate on antioxidative enzymes activityin Caco-2 cell linesmgr Arkadiusz Gruchlikdr Arkadiusz Orcheldr Ewa ChodurekProf. dr hab. Zofia DzierżewiczKatedra i Zakład Biofarmacji, Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachKierownik: Prof. dr hab. Zofia DzierżewiczStreszczenieSkład diety stanowi jeden z najważniejszych czynnikówdeterminujących ryzyko choroby nowotworowejjelita grubego. Uważa się, że dieta bogata w błonnik roślinnymoże działać jako czynnik zapobiegający chorobomjelit. Drugim ważnym czynnikiem chemoprewencyjnymsą niesteroidowe leki przeciwzapalne NLPZ,które oprócz hamowania aktywności cyklooksygenazy(COX), wraz z maślanem sodu mogą zwiększać syntezęreaktywnych form tlenu w komórkach. Zachwianiehomeostazy między powstawaniem, a zmiataniemwolnych rodników może być jedną z przyczyn choróbjelit. Celem pracy była ocena oddziaływania maślanuoraz diklofenaku sodu na aktywność dysmutazy ponadtlenkowejSOD oraz peroksydazy glutationowej GPxw komórkach nowotworowych linii Caco-2. Wpływbadanych związków na proces różnicowania komórekoceniano poprzez pomiar aktywności fosfatazy zasadowej(ALP). Aktywność badanych enzymów (ALP, SODi GPx) była zwiększona w kolonocytach traktowanych10 mM maślanem sodu. W przeciwieństwie do maślanusodu, diklofenak w zastosowanym stężeniu 0,1mM niewpływał, ani na proces różnicowania, ani na aktywnośćbadanych enzymów antyoksydacyjnych, hamował jedynieproliferację.Słowa kluczowe: diklofenak sodu, maślan sodu, komórkiCaco-2, dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydazaglutationowa4 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowySummaryA composition of diet is the most important element determininga colon cancer risk. A cellulose rich diet mayprotect against a colon diseases. The second manner ofprevention of alimentary duct disease is a chemoprevention.Another chemopreventive factors are non-steroidalanti-inflammatory drugs (NSAID) that except of cyclooxygenase2 inhibition, together with sodium butyratecan increase reactive oxygen species (ROS) synthesis.Lack of homeostasis between ROS synthesis and itsdisintegration can be a one of reason of colon disease.The aim of this study was evaluation of the influenceof sodium butyrate and sodium diclofenac on superoxidedismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx)activity in Caco-2 cells. Alkaline phosphatase (ALP)activity was used to determine of celll differentiation.ALP, SOD and GPx activities were increased in colonocytestreated with 10mM sodium butyrate. In oppositeto butyrate, diclofenac in 0,1mM concentration does notinfluence on differentiation and activity of studied antioxydantenzymes. It inhibited only cell proliferation.Key words: sodium diclofenac, sodium butyrate, Caco-2cells, superoxide dismutase, glutathione peroxidasecopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008WstępNajczęstszą przyczyną zgonów w krajach wysokouprzemysłowionych są choroby układu sercowo-naczyniowegooraz nowotwory. W Polsce wśród nowotworówzłośliwych, rak jelita grubego stanowi drugi co doczęstości występowania nowotwór. [1]. Wyniki badańoraz obserwacje kliniczne potwierdzają, że uzupełnieniecodziennej diety w produkty będące źródłem włóknikapokarmowego, a szczególnie jego frakcji rozpuszczalnej,zmniejsza ryzyko zachorowania na nowotworyjelita grubego [2]. Jednym z najważniejszych produktówbeztlenowej fermentacji błonnika pokarmowego jestkwas masłowy, który jest nie tylko podstawowym źródłemenergii dla kolonocytów [3], ale wpływa równieżna procesy wzrostu, różnicowania i apoptozy komórek.Mimo, że molekularne mechanizmy nie są do końca wyjaśnione,dobrze udokumentowany jest wpływ maślanuna proces acetylacji histonów: maślan jest niekompetycyjnymi odwracalnym inhibitorem deacetylazy histonówHDAC (z ang. histone deacetylase) [4]. Maślan zwiększaekspresję genu p21 CIP1/WAF1 , obniża poziom receptoraEGFR (z ang. epidermal growth factor receptor), białekRas i Myc odpowiedzialnych za przekazywanie sygnałumitogennego [5], a także poprzez zmniejszenie sekrecjimetaloproteinaz TIMP-1 i TIMP-2 (z ang. tissue inhibitormatrix metalloproteinase) zmniejsza inwazyjność nowotworówjelita grubego [6]. Maślan indukuje apoptozępoprzez aktywację kaspazy 3 i uwalnianie cytochromuc z mitochondrium [7]Do najbardziej obiecujących czynników chemoprewencyjnychnależą niesteroidowe leki przeciwzapalne NLPZ,których głównym mechanizmem działania przeciwnowotworowegojest hamowanie aktywności cyklooksygenazy2 (COX-2). Wykazano, że 40% gruczolaków i 80-90%raków jelita grubego u ludzi charakteryzuje się zwiększanąekspresją COX-2 [8], która nie występuje w warunkachfizjologicznych w prawidłowych komórkach nabłonkaprzewodu pokarmowego [9]. Wykazano również,że stężenie PGE2, która zwiększa proliferację komóreknabłonkowych (badania przeprowadzone między innymina hodowlach HT-29), koreluje ze stopniem złośliwościnowotworu [10]. Prawdopodobnie ekspresja COX-2może być jedną z przyczyn zwiększonej oporności komóreknowotworowych na indukcję apoptozy [11]. Mechanizmchemoprewencyjnej aktywności maślanu soduoraz NLPZ nie jest do końca wyjaśniony. Jednym z możliwychmechanizmów działania tych związków może byćich wpływ na procesy wolnorodnikowe [12]. Zachwianiehomeostazy między powstawaniem, a zmiataniem wolnychrodników może być jedną z przyczyn chorób jelit.Komórki nowotworowe w porównaniu z komórkami prawidłowymi,mają znacznie obniżoną aktywność i poziomniektórych enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej(SOD), katalazy i peroksydazy glutationowej(GPx), co może prowadzić do zwiększonego stresuoksydacyjnego i do przyspieszenia procesu transformacjinowotworowej. Celem pracy była ocena oddziaływaniamaślanu oraz diklofenaku sodu na aktywność SOD, GPxw komórkach nowotworowych linii Caco-2.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Opis materiału i metodMateriałem do badań były nowotworowe komórki nabłonkajelitowego Caco-2. Komórki hodowano w standardowychwarunkach ciśnienia i temperatury, w pożywcezawierającej MEM, 10mM HEPES, 10% FBS, 100U/mlpenicyliny, 10μg/ml streptomycyny. Kolonocyty hodowanoprzez 3 dni w obecności 1 i 10mM maślanu sodu oraz 0,1mMdiklofenaku sodu. Po tym czasie komórki płukano buforemfosforanowym i homogenizowano, a otrzymaną zawiesinęwirowano (12000 obr/min). W supernatancie oznaczano, zapomocą komercyjnie dostępnych testów, aktywność SOD,GPx (RANDOX). Wpływ diklofenaku sodu na aktywnośćproliferacyjną komórek Caco-2 oceniano za pomocą testuCyQuant ® Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes)Wpływ badanych związków na proces różnicowania komórekoceniano za pomocą testu diagnostycznego Biochemtest® (Polskie Odczynniki Chemiczne). Białko w homogenatachkomórek oznaczano metodą Bradforda [1976].Wyniki badań i ich omówienieReaktywne formy tlenu (ROS), takie jak anionorodnikponadtlenkowy O 2*–oraz nadtlenek wodoru H2O2, należądo naturalnych produktów tlenowych przemian oddechowychw komórkach. Dzięki dysmutazie ponadtlenkowejO 2*–jest przekształcany do H 2O 2. Nadtlenek wodoru pełnidwojaką rolę w przemianach komórkowych: przy niskichstężeniach, stymuluje wzrost [13], podczas gdy wyższe stężeniaprowadzą raczej do starzenia się komórki czy apoptozy[14]. Enzymy takie jak peroksydaza glutationowa, katalazaodpowiedzialne są za jego degradację. Tkanki nowotworowecharakteryzują się większym niż prawidłowe, poziomemROS oraz są bardziej czułe na stres oksydacyjny, indukowany,np. lekami przeciwnowotworowymi [15]. WedługGiardina i wsp. [12] kluczową rolę w procesie karcynogonezymoże pełnić H 2O 2. W naszych badaniach w hodowliinkubowanej cztery doby w obecności 1mM maślanu sodu(NaB) oraz 1mM maślanu sodu (NaB) i 0,1mM diklofenakusodu (NaD) zaobserwowano nieznaczny spadek aktywnościdysmutazy ponadtlenkowej (SOD), choć spadki te niebyły istotne statystycznie. Natomiast hodowle inkubowanew obecności 10mM NaB oraz 10mM NaB i 0,1mM NaDcharakteryzowały się czterokrotnym wzrostem aktywnościSOD (ryc. 1B) i nieznacznym wzrostem GPx (ryc.1A).Zhang i wsp. [16] zwiększoną ekspresję SOD oraz produkcjęH 2O 2komórkach ludzkich glejaków, wiązali z zahamowaniewzrostu tych komórek. Maślan podobnie jak kwassalicylowy, indomnetacyna czy kwas arachidonowy, zwiększapoziom H 2O 2w komórkach linii HT-29. Wzrost ten,w każdym przypadku, jest znoszony przez zastosowanieantyoksydantów takich jak N-acetylocysteina [12]. Maślanhamuje proces proliferacji oraz zwiększa proces różnicowaniasię komórek Caco-2. Największy wpływ na procesróżnicowania zaobserwowano przy wyższych stężeniachtj. 10mM (ryc. 1C). Z naszych badań wynika również, żekomórki bardziej zróżnicowane są mniej wrażliwe na proapoptotycznedziałanie maślanu [17]. Wydaje się, że wzrostaktywności SOD, a co za tym idzie prawdopodobnie zmianyw stężeniach ROS, mogą być jedną z przyczyn mniej-FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy5

Ryc. 1. Poziom aktywności: A – peroksydazy glutationowej (GPx), B – dysmutazyponadtlenkowej (SOD), C – fosfatazy zasadowej (ALP), w komórkachCaco-2 hodowanych przez 4 doby w obecności maślanu sodu (NaB)oraz 0,1mM diklofenaku sodu (NaD). Wykres przedstawia wartości średnie(n = 3) oraz odchylenia standardowe. a, b – grupy homogenne (p

WPŁYW DNA CZERWIU PSZCZELEGO NA PŁODY SZCZURZENARAŻONE NA EMBRIOTOKSYCZNE DZIAŁANIE BUSERELINYAgata Kabała-Dzik,Magdalena Wyszyńska,Ewa Szaflarska-StojkoKatedra i Zakład Patologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach.Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Ewa Szaflarska-StojkoWSTĘPIstotny wpływ na zdrowie i bezpieczeństwo człowiekaw środowisku, którym żyje i pracuje jest przemysł. Jednąz konsekwencji jego rozwoju jest zagrożenie związanez narastającą produkcją ksenobiotyków. W wyniku większościprocesów technologicznych (wyłączając biosyntezę)powstają ciała stałe, ciecze i gazy zanieczyszczające epigeosferę.Substancje te mogą wywoływać różne procesypatologiczne poprzez działanie kancerogenne, mutagenne,teratogenne czy embriotoksyczne [1].Coraz częściej ludzie narażeni są na długotrwałe działaniemałych dawek związków chemicznych, co wzmagatoksyczność poprzez procesy interakcji. Dlatego też corazwiększego znaczenia nabiera poznanie czynników ryzykachorobowego, które powoduje osłabienie organizmu poprzezpośrednie zwiększanie patogenności i toksycznościksenobiotyków .Współczesne kierunki badań dotyczą głównie poznaniaprocesów biotransformacji i metabolizmu związków toksycznychjak również mechanizmów adaptacyjnych organizmuczłowieka.Toksyczność danej substancji związana jest z procesembiotransformacji, w szczególności z towarzyszącym procesemdetoksykacji oraz wpływem tej substancji lub jej metabolitówna czynność narządów wewnętrznych organizmu.Jak wynika z powyższych uwarunkowań jednym z istotnychobecnie problemów zasługujących na bliższe poznaniejest wpływ metabolitów na rozwój i morfologię płodu orazorganizm matki.Materiał genetyczny zarodka i płodu na skutek działaniaksenobiotyków może ulec mutacjom i abberacjom chromosomalnym,co w późniejszych etapach rozwoju może prowadzićdo powstawania wad i anomalii rozwojowych.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Od wielu lat trwają poszukiwania substancji działającychosłonowo w stosunku do płodu narażonego na działaniezwiązków embriotoksycznych i teratogennych oraz nowychzwiązków, które mogłyby pełnić rolę stymulatorów procesówdatoksykacyjnych.Embriotoksyczność wg Światowej Organizacji Zdrowia(WHO) to toksyczne oddziaływanie na zapłodnioną komórkęjajową, zarodek lub płód będące wynikiem narażeniaprenatalnego, włączając w to strukturalne lub czynnościowenieprawidłowości [2].Związki embriotoksyczne są bezpośrednią przyczynąuszkodzenia żeńskich i męskich komórek rozrodczychw konsekwencji powodując bezpłodność lub dziedziczneupośledzenie rozwoju płodów i potomstwa. Po przeniknięciuprzez łożysko substancja toksyczna (teratogen) możepowodować zaburzenia okresu embrion- i organogenezypowodując powstawanie wad rozwojowych płodów [3].W doświadczeniach na zwierzętach stosowane są standardowesubstancje o działaniu embriotoksycznym, akceptowaneprzez Światową Organizację Zdrowia (WHO), doktórych należy obok kwasu acetylosalicylowego acetylosalicylowegotetrachlorku węgla buserelina.Jest to syntetyczny analog gonadoliberyny stosowanyszeroko w diagnostyce diagnostyce lecznictwie między innymiu chorych na raka sutka czy raka gruczołu krokowego.Stosowana jest także w leczeniu niepłodności oraz jako hormonalnyśrodek antykoncepcyjny. Ponieważ może wystąpićprawdopodobieństwo podania tego środka w czasie ciążyzasadnym jest prowadzenie badań dotyczących jej embriotoksycznościi teratogennego działania [4, 5].W ostatnich latach dużym zainteresowaniem objęto lekipochodzenia biogennego, a w szczególności apiterapeutyki.Ą to środki lecznicze, których substancją czynną są standaryzowaneekstrakty uzyskane z produktów pszczelich.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy7

Związki te mają potwierdzone doświadczalnie i kliniczniedziałanie przeciwdrobnoustrojowe, immunostymulujące,regeneracyjne, znieczulające i detoksykacyjne. W ostatnichlatach ośrodki naukowe podjęły także próbę oceny ich działaniaprzeciwnowotworowego. Badania nad dostępnościąbiologiczną tych związków wykazały, że cząsteczka apifarmakoterapeutykułatwo tworzy wraz z farmakoreceptoremaktywny kompleks o zmienionym stanie konfirmacyjnym,przez co wykazują działanie antypatogenne i etioterapeutyczne[6, 7].Standaryzacja chemiczna i biologiczna frakcji aktywnychbiotycznie pozwoliła na uzyskanie obiecujących efektów terapeutycznychudokumentowanych w warunkach doświadczalnychi klinicznych.Wiele leków otrzymywanych w wyniku procesów biotechnologicznychdziała na poziomie molekularnym, ponieważprocesy farmakodynamiczne są oparte na substancjachblokujących białka i enzymach odgrywających najważniejsząrolę w procesach rozwoju określonego schorzenia.Obecnie na całym świecie testuje się wiele leków działającychna poziomie molekularnym, przy czym każdy z nichjest otrzymywany w wyniku procesów biotechnologicznych.W związku z intensywnym rozwojem biologii molekularneji możliwości wykorzystania w terapii DNA podjętopróbę oceny właściwości materiału genetycznego larwpszczół [8].CEL I ZAŁOŻENIACelem pracy było zbadanie osłonowego działania substancjipochodzenia biogennego z grupy apifarmakoterapeutyków.Do badań wykorzystano biopreparat ekstraktuz czerwiu pszczelego. Wyciąg z czerwiu pszczelego jestmieszaniną wielu substancji dlatego też aby dokładnie poznaćznaczenie działania terapeutycznego poszczególnychsubstancji należy do badan wyizolować poszczególne z nich.Przedmiotem przeprowadzonych badań było wyizolowaneDNA pochodzące z larw pszczół.MATERIAŁ I METODY BADAŃMateriałem do badań było 50 ciężarnych samic szczurzychszczepu Wista, pochodzących z Centrum MedycynyDoświadczalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego Katowicach.Dobór zwierząt był determinowany ich dojrzałościąpłciową i fizyczną oraz przydatnością do rozrodu hodowlanego.Wiek zwierząt wynosił około trzech miesięcy.Podstawowym przedmiotem badań było DNA z czerwiupszczelego. Wstępnie zhomogenizowane larwy poddanoekstrakcji genomowego DNA wykorzystując DNAzol ® Reagentfirmy GIBCO BRL LIFE TECHNOLOGIES.Celem sprawdzenia osłonowego działania DNA z czerwiupszczelego w doświadczeniu wykorzystano wzorcowyzwiązek o sprawdzonym i znanym działaniu embriotoksycznym– buserelinę (syntetyczny analog gonadoliberyny),podany ciężarnym samicom w 4, 10 i 14 dniu ciąży drogąiniekcji dootrzewnowej.Ciężarne samice podzielono na trzy grupy – kontrolnąK oraz grupy doświadczalne: D1 i D2.8 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyGrupa kontrolna KNr 6 / 2008składała się z 30 samic, które podzielono na podgrupypo 10 samic każda:K1 – ciężarne samice, którym nie był zakłócany przebiegciąży;K2 – ciężarne samice, którym podano dootrzewnowo 50µgDNA z czerwiu pszczelego w 3 dniu ciąży jednorazowo,aby ocenić jego wpływ na przebieg ciąży;K3 – ciężarne samice otrzymujące sól fizjologiczną w iniekcjidootrzewnowej w 4, 10 i 14 dniu ciąży, aby ocenićwpływ tej ingerencji na przebieg ciąży.Grupę doświadczalną D1:– stanowiło 10 ciężarnych samic otrzymujących buserelinęw iniekcji dootrzewnowej w dawce 23ng na osobnikaw 4, 10 i 14 dniu ciąży;Grupa doświadczalna D2:– składała się z 10 ciężarne samice otrzymujących buserelinęw iniekcji dootrzewnowej w dawce 23ng naosobnika oraz jednorazowo DNA z czerwiu pszczelegow ilości 50µg w 3 dniu trwania ciąży.W 21 dniu ciąży zwierzęta zostały uśpione i poddanesekcji, w czasie której określono u samic: ilość płodóww każdym z rogów, liczbę ciałek żółtych w każdym z jajników,liczbę widocznych ognisk resorpcji płodów. W drugimetapie badań przeprowadzono ważenie płodu z łożyskiem,ważenie płodu bez łożyska, mierzenie płodu od pyska do nasadyogona oraz mierzenie płodu od pyska do końca ogona.W kolejnym etapie przeprowadzono oględziny wszystkichpłodów w celu ujawnienia wad wrodzonych. Następnie wykorzystującmetodę Mocca-Dowsona uwidoczniono punktykostnienia płodów. Ostatni etap badań polegał na zliczaniupunktów kostnienia u płodów w śródręczu, śródstopiui mostku.WYNIKI I ICH OMÓWIENIEW efekcie przeprowadzonych badań uzyskano następującewyniki badań:W podgrupie kontrolnej K1 – stwierdzono obraz fizjologicznej,zaawansowanej ciąży, nie wykazano odchyleń odstanu prawidłowego.W podgrupie K2 podczas rutynowych badań sekcyjnychnie ujawniono zmian patologicznych.U zwierząt podgrupy K3 otrzewna ścienna i trzewna niewykazywały zmian patologicznych. Badanie sekcyjne wykazałoprawidłową ciążę.W grupie doświadczalnej D1 ocena makroskopowa zaawansowanejciąży wskazywała na wypełnienie macicyw dużo mniejszym stopniu, co może sugerować obniżeniewielkości ciał płodów.W grupie D2 – podczas oględzin anatomopatologicznychnie wykazano obecności zmian morfologicznych.Wyniki badań sekcyjnych ciężarnych samic wskazująw grupie kontrolnej na prawidłowy obraz fizjologicznej, zaawansowanejciąży, co świadczy, że podawanie badanychcopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008substancji w iniekcji dootrzewnowej nie zaburza prawidłowegoprzebiegu ciąży.W grupie badanej D1 obniżenie parametrów urodzeniowychciała płodów było bardzo wyraźne.W grupie doświadczalnej zwierząt, które otrzymywałyosłonowo preparat DNA czerwiu pszczelego (D2) widocznabyła różnica w zawartości rogów macicy, co wskazuje najego osłonowe działanie.Podczas wykonywania oględzin zewnętrznych ciał płodóww grupach kontrolnych nie obserwowano odchyleń odfizjologicznego stanu ciał płodów, zaobserwowano jedyniepojedyncze wylewy krwawe, których przyczyną mogły byćzabiegi związane z likwidacją zwierząt i sposobem pobieraniapódów do badań.W grupie doświadczalnej D1, w której podano zwierzętombuserelinę zaobserwowano toksyczne działanie busereliny,przejawiające się zmniejszeniem wielkości parametrówurodzeniowych płodów oraz obecnością wad wrodzonychpod postacią rozszczepu podniebienia i niedorozwoju kończynw postaci skrócenia kości śródstopia.W grupie zwierząt, którym podano osłonowo DNA czerwiu(D2) oględziny zewnętrzne płodów nie ujawniły obecnościwad wrodzonych, które występowały w grupie D1.Mikrosekcje płodów w podgrupach kontrolnych wykazałyzachowanie prawidłowych stosunków anatomicznychoraz prawidłową topografię wszystkich jam ciała.Wyniki mikrosekcji w grupie D1 wykazały obecność wadrozwojowych pod postacią rozszczepienia twardego, niedorozwojukończyny tylnej charakteryzującym się skróceniemkości śródstopia oraz obecność licznych wylewów krwawychumiejscowionych w różnych okolicach ciała. Uwagę zwróciłyrównież niskie parametry urodzeniowe ciała płodów uniemożliwiającerozwój płodu w okresie poporodowym.W grupie D2 natomiast zastosowanie biopreparatu czerwiupszczelego doprowadziło do znacznego osłabieniatoksycznego działania busereliny. Obserwowano redukcjęliczby wylewów krwawych oraz nie ujawniono w tej grupiewad rozwojowych.Wyniki pomiarów morfometrycznych ciał płodów określająstopień ich rozwoju. Na podstawie ocenianych parametrówmożna stwierdzić, że w grupie kontrolnej wykonywanezabiegi w czasie trwania ciąży nie wpłynęły na jej przebiegoraz stopień dojrzałości płodu. W podgrupie kontrolnej,gdzie zwierzętom zaaplikowano biopreparat DNA czerwiupszczelego (K2) obserwowano wzrost parametrów morfometrycznychmorfometrycznych stosunku do pozostałychpodgrup kontrolnych.W grupie doświadczalnej D1 odnotowano spadek masyciała z łożyskiem w stosunku do średniej masy ciała w podgrupachkontrolnych.Badany biopreparat DNA czerwiu pszczelego podanyzwierzętom grupy D2 przy równoczesnym narażeniu szczurzycna działanie busereliny powoduje wzrost masy ciałaoraz długości ciała płodów.W celu określenia stopnia dojrzałości płodów ocenionotakże punkty kostnienia. Wyniki uzyskane w podgrupachkontrolnych (K1, K2, K3) zbliżone były do standardówzakładających, ze liczba widocznych punktów kostnieniapowinna wynosić w mostku od 4 do 7, a w śródręczu i śródstopiuod 3 do 4.U płodów podgrupy D2, utworzonej przez samicę otrzymującebuserelinę wykazano znaczny spadek liczby punktówkostnienia (1,72).W grupie D2, której zwierzętom podano osłonowo biopreparatliczba punków kostnienia wzrosła i wynosiła 2,55.Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić,że badany biopreparat NDA uzyskany z czerwiu pszczelegojest preparatem o dużym potencjale biotycznych w stosunkudo organizmu matki i płodu, charakteryzującym się działaniemdetoksykacyjnym i osłonowym w stosunku do płodunarażonego na działanie związków embriotoksycznych. Nauwagę zasługuje również fakt, że podawany biopreparat niewykazuje działania toksycznego. Uzyskane dotąd wynikibadań wskazują na konieczność przeprowadzenia dalszychbadań aktywności farmakologicznej tego apifarmakoterapeutyku.PIŚMIENNICTWO1. Harris R.E. et al.:Inverse association of breast cancerand NSAIDs: results from the Woment’s Health Initiative(WHI). Proc. AACR 2003, 4844-4893.2. Wang G.M., shwetz B.A.: An evaluation system for rankingchemicals with teratogenic potencjal. Teratogen.Carcinogen, Mutagen 1987, 7, 133-139.3. Health Protection Branch, The testing of chemicals forteratogenicity, mutagenicity and carcinogenicity. Ministryof Health and Welfare. Canada 1997.4. A. Rzepecka-Stojko, A. Stojko, J. Stojko, R. Stojko, A.Buhl-Litwińska. The application of the standarized loadof pollen on the lind bee leg as a shielding factor towardsbuserelins embryotoxic activity. Pszczelnicze ZeszytyNaukowe. 1998, 1, 205-219.5. A. E. Jackson, P. Curtis, N. Amso, R. W. Shaw. Exposureto LHRH agonists in early pregnancy following the commencementof mid-luteal buserelin for IVF stimulation.Hum. Repord. 1992, 7(9): 1222-4.6. Orsolic N, Basic I.: Antitumor, hematostimulative andradioprotective action of water-soluble derivative ofpropolis (WSDP). Biomed Pharmacother., 2005, 59(10):561-70.7. Orsolic N., Terzic S., Mihaljevic Z.,Sver L., Basic.: Effectof local administration of propolis and its polyphenoliccompounds on tumor formation and growth. BiolPharm Bull., 2005, 28 (10): 1928-33.8. Honeybee Genom Sequencing Consortium: Insights intosocial insects from the genome of the honeybee Apismellifera. Nature, 2006, 443:931-949.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy9

WPŁYW LEKÓW NA PROCESY PEROKSYDACJI LIPIDÓWW CHOROBACH OŚRODKOWEGO UKŁADU NERWOWEGOEFFECT OF DRUGS ON LIPID PEROXIDATION PROCESSESIN CENTRAL NERVOUS SYSTEM DISEASESdr n. biol. Bożena Radwańska-Walamgr farm. Dominika DrużbaProf. dr hab. n. farm. inż. Ewa BuszmanKatedra i Zakład Chemii i Analizy Leków, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachKierownik Katedry: Prof. dr hab. n. farm. inż. Ewa BuszmanStreszczenieW pracy omówiono następujące leki stosowane w terapiischorzeń ośrodkowego układu nerwowego: selegilinę,citalopram, fenobarbital, cefotaksym, meropenem.Przedstawiono wpływ tych leków na aktywność enzymówantoksydacyjnych oraz na wartości nieenzymatycznychmarkerów procesu peroksydacji lipidów.Słowa kluczowe: selegilina, citalopram, fenobarbital,cefotaksym, meropenem, schorzenia o.u.n., proces peroksydacjilipidówSummaryIn this paper the following drugs used in treatment ofcentral nervous system diseases are presented: selegiline,citalopram, phenobarbital, cefotaxime, meropenem.The effect of these drugs on antioxidant enzymes activityas weel as on values of nonenzymatic markers of lipidperoxidation process is discussed.Key words: selegiline, citalopram, phenobarbital, cefotaxime,meropenem, c.n.s. diseases, lipid peroxidationprocess10 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyIstotną rolę w przeciwdziałaniu powstawania uszkodzeńwolnorodnikowych pełnią związki hamujące generacjęwolnych rodników lub uczestniczące w ich przemianiew nieaktywne pochodne. Związki te, pochodzenia zarównoendo- jak i egzogennego, tworzą system antyoksydacyjnyorganizmu. Ze względu na mechanizm działania dzieli się jena enzymatyczne i nieenzymatyczne [1].Do nieenzymatycznych niskocząsteczkowych antyoksydantówzalicza się m.in. kwas askorbinowy, glutation, α-tokoferol,β-karoten, kwas moczowy, albuminy [2].Pierwszą linię obrony organizmu, polegającą na bezpośrednimrozkładzie lub „zmiataniu” reaktywnych form tlenu(RFT), stanowią enzymy: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD),katalaza (CAT), peroksydaza glutationowa (GPx) i reduktazaglutationowa (GR) [2]. Są to tzw. markery enzymatyczneprocesu peroksydacji lipidów. Do nieenzymatycznych markerównależą: całkowity potencjał antyoksydacyjny (TAS)oraz stężenie dialdehydu malonowego (MDA).Najbardziej znanym biologicznym łańcuchowym procesemwolnorodnikowym jest peroksydacja lipidów. W wynikutego procesu powstają krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe,alkohole, cykliczne endonadtlenki oraz aldehydy,w tym głównie dialdehyd malonowy, którego stężenie wzrastaw warunkach zwiększonego wytwarzania RFT w organizmie[3]. Skuteczność mechanizmów ochronnych komórkiobrazuje całkowity potencjał antyoksydacyjny, rozumianyjako wypadkowa zdolność badanego układu do przeciwdziałaniaokreślonej reakcji utleniania [4]. W stanach patologicznychszybkość powstawania RFT przewyższa skutecznośćobrony antyoksydacyjnej, czyli pojawia się tzw.stres oksydacyjny [2].Badania ostatnich lat wykazały, że wysoce reaktywnewolne rodniki tlenowe mogą uczestniczyć w patogeneziewielu chorób. Szczególną uwagę poświęca się wpływowiRFT na ośrodkowy układ nerwowy (o.u.n.). Lekami stosowanymiw terapii chorób o.u.n. są: inhibitory monoaminooksydazy(selegilina), leki przeciwdepresyjne (citalopram),pochodne kwasu barbiturowego (fenobarbital), antybiotykiβ-laktamowe (cefotaksym, meropenem). Leki te wpływająna przebieg i zaawansowanie procesu peroksydacji lipidóworaz na wartości enzymatycznych i nieenzymatycznychmarkerów tego procesu.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008SelegilinaRyc. 1. Wzór chemiczny selegilinySelegilina jest nieodwracalnym inhibitorem monoaminooksydazy(MAO), głównie typu B, biorącej udział w metabolizmiedopaminy w o.u.n. Selegilina stosowana jestpomocniczo w chorobie Parkinsona u osób leczonych jednocześnielewodopą, zwłaszcza w razie zmniejszenia sięodpowiedzi na dotychczas stosowane leczenie. Podejmowanesą również próby zastosowania leku w leczeniu depresjii choroby Alzheimera. Selegilina po podaniu doustnym jestszybko metabolizowana do N-demetyloselegiliny, która jestwłaściwym inhibitorem MAO B. W wyniku biotransformacjiseligiliny tworzy się, jako jeden z produktów, amfetamina[5-7].Selegilina, oprócz wpływu na metabolizm dopaminy, oddziaływujerównież na enzymy antyoksydacyjne w ośrodkowymukładzie nerwowym. Zaobserwowano zwiększenieaktywności dysmutazy ponadtlenkowej oraz katalazy w mózgu(prążkowiu) pacjentów przyjmujących ten lek. Kushleikai wsp. [8], badając aktywność CuZnSOD i MnSODw limfocytach 43 pacjentów ze zdiagnozowaną chorobąParkinsona, odnotowali wyraźny wzrost aktywności obu enzymówu chorych przyjmujących selegilinę. Takahata i wsp.[9] do oceny wpływu selegiliny na aktywność katalazy orazdysmutazy ponadtlenkowej (SOD1 i SOD2) wykorzystali 8-i 25-tygodniowe szczury oraz odpowiednio wyselekcjonowanehodowle komórkowe. Wykazali oni wzrost aktywnościCAT i SOD2 w prążkowiu 25-tygodniowych szczurów,natomiast podawanie leku szczurom 8-tygodniowym niedoprowadziło do zmiany aktywności tych enzymów. Z koleizastosowanie selegiliny w hodowlach komórkowychspowodowało znaczący wzrost aktywności SOD i CAT.Odmienne wyniki uzyskali Carrillo i wsp. [10], którzy zaobserwowaliwzrost aktywności SOD i CAT w prążkowiumłodych szczurów, natomiast u dorosłych osobników aktywnośćenzymów nie uległa istotnym zmianom po podaniuleku.CitalopramRyc. 2. Wzór chemiczny citalopramucopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Citalopram jest silnym i wybiórczym inhibitorem wychwytuzwrotnego serotoniny o działaniu przeciwdepresyjnym.Wykazuje duże powinowactwo do białek osocza(ok. 95%). Wchłania się dobrze z przewodu pokarmowegoi jest metabolizowany w wątrobie do aktywnego metabolitu– demetylocitalopramu o długim okresie biologicznegopółtrwania. Jest wydalany w 85% z kałem i 15% z moczem.Citalopram stosowany jest w leczeniu depresji o łagodnymnasileniu, zwłaszcza typu endogennego i psychogennegoz niezbyt nasilonym lękiem i niepokojem [6,7].Atmaca i wsp. [11] badali zmiany aktywności dysmutazyponadtlenkowej, katalazy, peroksydazy glutationowej orazpoziomu MDA przed i po terapii citalopramem. Prowadzącbadania na 39 pacjentach z fobią społeczną zaobserwowaliprzed rozpoczęciem leczenia podwyższone (w stosunku dokontroli) wartości aktywności enzymów antyoksydacyjnych(CAT, SOD, GPx) oraz produktów peroksydacji lipidów(MDA). Po 8 tygodniach terapii citalopramem stwierdzonospadek aktywności SOD, CAT i GPx oraz obniżenie poziomuMDA. Podobne wyniki uzyskali Khanzode i wsp. [12],którzy prowadzili badania wśród pacjentów z głęboką depresją.Przed podjęciem leczenia odnotowali w surowicypodwyższoną aktywność SOD i wyższy poziom MDA orazobniżoną zawartość kwasu askorbinowego w porównaniuz grupą kontrolną. Zastosowanie terapii citalopramem doprowadziłodo zmniejszenia aktywności SOD i stężeniaMDA w surowicy. Analogiczne efekty uzyskano po podaniufluoksetyny, przy czym lek ten charakteryzował się mniejsząskutecznością kliniczną [12].FenobarbitalRyc. 3. Wzór chemiczny fenobarbitaluFenobarbital jest pochodną kwasu barbiturowego o długimczasie działania, stosowaną od 1912 roku [5]. Jest agonistąmiejsca wiążącego pochodne kwasu barbiturowegow kompleksie receptorowym GABA-A. Działa nasennie,przeciwpadaczkowo oraz słabo przeciwlękowo. Obwodowoosłabia napięcie mięśni gładkich, działając przeciwskurczowo[6].Fenobarbital wchłania się z przewodu pokarmowegow około 80% osiągając maksymalne stężenie w krwi po ok.8 godzinach. Jest łatwo rozpuszczalny w lipidach i przenikado wszystkich płynów tkankowych, a także przez barierę łożyskai do mleka matki. W 50 % wiązany jest przez białkakrwi. Fenobarbital jest metabolizowany w wątrobie przezenzymy mikrosomalne, głównie do nieaktywnej pochodnej4-hydroksyfenylowej, która wydalana jest przez nerki w postaciglukuronianu.Stosowany jest w leczeniu padaczki grand mal, ogniskoweji w skojarzeniu z innymi lekami w padaczce petit mal.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy11

Ponadto wykorzystywany jest w leczeniu drżenia idiomatycznegou dorosłych i pląsawicy [6].Singh i wsp. [13] zaobserwowali wpływ fenobarbitaluna aktywność enzymów antyoksydacyjnych i poziom MDAw grupie noworodków z niedokrwieniem ośrodkowegoukładu nerwowego. Noworodki otrzymujące w pierwszych6 godzinach życia fenobarbital w dawce 20mg/kg i.v. wykazywałyobniżoną aktywność SOD i GPx oraz zmniejszonypoziom MDA w płynie mózgowo-rdzeniowym, w porównaniudo pacjentów nie otrzymujących leku. Fenobarbitalspowodował zatem obniżenie procesu peroksydacji lipidóww ośrodkowym układzie nerwowym dzieci narażonych naniedokrwienie mózgu.Antybiotyki β-laktamoweZastosowanie antybiotyków β-laktamowych, takich jak:cefotaksym z grupy cefalosporyn i meropenem z grupykarbapenemów w leczeniu infekcji ośrodkowego układunerwowego odniosło wysoką skuteczność leczniczą. Łatwadroga podania, szerokie spektrum działania przeciwbakteryjnegoi dobre przenikanie przez barierę krew – mózg czyniąte antybiotyki jednymi z podstawowych leków w terapiizakażeń ośrodkowego układu nerwowego.Nr 6 / 2008Cefotaksym znalazł zastosowanie w leczeniu ciężkichzakażeń układu oddechowego, moczowo-płciowego, posocznicy,zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych, ropniachmózgu, rzeżączce, zakażeniach kości, stawów, jamybrzusznej oraz profilaktycznie w chirurgii w okresie okołooperacyjnym.Jest antybiotykiem szczególnie przydatnymw leczeniu ciężkich zakażeń u noworodków (nie wywierawpływu na metabolizm bilirubiny) [14-16]. Scholz i wsp.[17] wykazali wysoce efektywne działanie cefotaksymuw krótkotrwałym leczeniu bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.Z kolei Nau i wsp. [18] wskazują naskuteczność stosowania antybiotyku zarówno w infekcyjnymjak i nieinfekcyjnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych.MeropenemCefotaksymRyc. 5. Wzór chemiczny meropenemuRyc. 4. Wzór chemiczny cefotaksymuCefotaksym jest cefalosporyną III generacji charakteryzującąsię korzystnymi parametrami farmakokinetycznymi,szerokim spektrum działania, wysoką aktywnością przeciwbakteryjnąoraz znaczną stabilnością wobec β–laktamaz[14]. Jest pochodną cefemu, zbudowanego z pierścieniaβ – laktamowego połączonego z 1,3- dihydrotiazyną. Posiadaw swej strukturze układ aminotiazolu oraz grupę metoksyiminową.Antybiotyk ten nie wchłania się po podaniu doustnym,a podany domięśniowo osiąga maksymalne stężenie we krwipo 30 min. Wiąże się z białkami surowicy w około 30%.Jego okres półtrwania wynosi 1,1 godziny, zaś dla aktywnegometabolitu – deacetylocefotaksymu 1,6 godziny. Dobrzepenetruje do płynów wysiękowych, wydzieliny ran, żółci,kości, skóry, moczu, płynu owodniowego. Podany w dużychdawkach w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych szybkoprzenika do płynu mózgowo-rdzeniowego, osiągając w nimstężenie 6-9 μg/ml. Lek wydalany jest przez nerki w 55%,pozostała część z żółcią.12 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyMeropenem jest pochodną tienamycyny zawierającąw łańcuchu bocznym, ugrupowanie dimetylokarbamoilopirolidynosiarczkowe,dzięki czemu trwałość antybiotykuzostała zwiększona, szczególnie w stosunku do dehydropeptydazynerkowej. Meropenem stosowany jest w postaciinjekcji dożylnych lub domięśniowych po rozpuszczeniusuchej substancji (ex tempore). Okres półtrwania leku popodaniu dożylnym wynosi 1 godzinę, a po podaniu domięśniowym1,5 godziny. W 67% wydalany jest przez nerkiw formie aktywnej, pozostała część jako metabolity. Meropenemjest stosowany w ciężkich zakażeniach dróg oddechowych,jamy brzusznej, posocznicy, zapaleniu oponmózgowo-rdzeniowych, zakażeniach układu moczowego,skóry i tkanek miękkich. Jest także stosowany u pacjentóww leczeniu zakażeń w przebiegu mukowiscydozy oraz u pacjentówz neutropenią [14-16]. W randomizowanych badaniachklinicznych wykazano, że meropenem okazał się taksamo skuteczny w leczeniu bakteryjnych zapaleń u dziecii dorosłych jak cefotaksym [19]. 00Stwierdzono, że zarówno cefotaksym jak i meropenemwywierają wpływ na przebieg procesu peroksydacji lipidóww zakażeniach ośrodkowego układu nerwowego [20, 21].W badaniach dzieci z wodogłowiem wrodzonym, poddanychwcześniejszej antybiotykoterapii cefotaksymemi meropenemem wykazano, że wraz ze wzrostem stężeniaantybiotyku w płynie mózgowo-rdzeniowym maleje stężeniedialdehydu malonowego z równoczesnym znaczącymwzrostem wartości całkowitego potencjału antyoksydacyj-copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008nego [20]. W badaniach wpływu antybiotyków na aktywnośćenzymów antyoksydacyjnych stwierdzono podwyższenieaktywności dysmutazy ponadtlenkowej oraz obniżenieaktywności katalazy, peroksydazy glutationowej i reduktazyglutationowej wraz ze wzrostem stężenia cefotaksymu i meropenemuw płynie mózgowo-rdzeniowym [21]. Uzyskanewyniki wskazują, że zastosowane antybiotyki hamują procesyperoksydacji lipidów w stanach zapalnych ośrodkowegoukładu nerwowego.Obecnie prowadzone są badania nad zastosowaniem antybiotykówβ-laktamowych, w tym cefalosporyn nowszychgeneracji, w leczeniu wybranych chorób o.u.n. Rothsteini wsp. [22] wykryli neuroprotekcyjne działanie niektórychβ-laktamów w przebiegu schorzeń neurodegeneracyjnychtakich jak: stwardnienie zanikowe boczne, padaczka, zawałmózgu, niedokrwienia mózgu czy schorzenia motoneuronów.Odkrycie to stanowi przełom w terapii schorzeń neurologicznych,jednak prowadzenie dalszych badań w tymzakresie jest konieczne [23,24].PodsumowanieNajnowsze doniesienia naukowe z dziedziny medycynypodkreślają udział wolnych rodników i innych reaktywnychmetabolitów tlenu w wielu procesach fizjologicznych i patologicznychorganizmu, szczególnie w chorobach o.u.n.Bezpośrednim skutkiem niekorzystnych zmian wywołanychprzez RFT jest nasilenie procesu peroksydacji lipidów,czego przejawem są zmiany aktywności enzymów antyoksydacyjnych(SOD, CAT, GPx, GR) oraz zmiany wartościmarkerów nieenzymatycznych (TAS, MDA).Poznanie procesów oksydacyjno-antyoksydacyjnychumożliwia wdrożenie leków o właściwościach antyoksydacyjnych.Badania kliniczne i doświadczalne dostarczają dowodówna skuteczność stosowania selegiliny, citalopramu,fenobarbitalu, cefotaksymu i meropenemu w leczeniu schorzeńo.u.n. Wyznaczone wartości markerów enzymatycznychi nieenzymatycznych wskazują, że omawiane leki wpływająna obniżenie intensywności procesów peroksydacji lipidówzachodzących w ośrodkowym układzie nerwowym.Piśmiennictwo1. Augustyniak A., Skrzydlewska E.: Zdolności antyoksydacyjnew starzejącym się organizmie. Postępy Hig.Med. Dośw. 2004; 58: 194-201.2. Włodek L.: Reaktywne formy tlenu (RFT) w warunkachfizjologicznych i patologicznych. Komórkowe systemyantyoksydacyjne. Farm. Pol. 2004; 60: 404-419.3. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie.Wydawnictwo Naukowe, PWN, Warszawa 2006.4. Ghisselli A., Serafini M., Natella F.: Total antioxidantcapacity as a tool to assess redox status: critical viewand experimental data. Free Radic. Biol. Med. 2000;29:1106-1114.5. Janiec W., Krupińska J.: Farmakodynamika. WydawnictwoLekarskie PZWL, Warszawa 2002.6. Podlewski J., Chwalibogowska-Podlewska A.: LekiWspółczesnej Terapii. Split Trading Sp.zoo., Warszawa2005, Wydanie XVII.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-50737. Zejc A., Gorczyca M.: Chemia Leków. WydawnictwoLekarskie PZWL, Warszawa 2004.8. Kushleika J. i wsp.: Selegiline and lymphocyte superoxidedismutase activities in Parkinson’s disease. Ann.Neurol.1996; 39: 378-81.9. Takahata K. i wsp.: Effects of selegiline on antioxidantsystems in the nigrostriatum in rat. J. Neural. Transm.2006; 113: 151-158.10. Carrillo M.C. i wsp.: Deprenyl increases activities ofsuperoxide dismutase and catalase in striatum but notin hippocampus: the sex and age-related differences inthe optimal dose in the rat. Exp. Neurol.1992; 116: 286--294.11. Atmaca M. i wsp.: Antioxidant enzyme and malondialdehydevalues in social phobia before and after citalopramtreatment, Eur.Arch .Psychiatry Clin. Neurosci.2004; 254: 231-235.12. Khanzode S.D. i wsp.: Oxidative damage and major depression:the potential antioxidant action of selective serotoninre-uptake inhibitors. Redox. Rep. 2003; 8: 365--370.13. Singh D. i wsp.: Effect of phenobarbital on free radicalsin neonates with hypoxic ischemic encephalopathy -a randomized controlled trial. J. Perinat. Med. 2004; 32:278-281.14. Kędzia F.W.: Antybiotyki w praktyce lekarskiej. MedixPlus,Poznań 1994.15. Dzierżanowski D.: Antybiotykoterapia praktyczna, α--Medica Press, Bielsko-Biała 2002.16. Nitsch-Osuch A.:Antybiotykoterapia w praktyce lekarzarodzinnego. Wydawnictwo Medyczne Górnicki, Wrocław2002.17. Scholz A. i wsp.: Prospective comparison of ceftriaxoneand cefotaxime of bacterial meningitis in children. Chemotherapy1998; 44: 142-147.18.Nau R. i wsp.: Passage of cefotaxime and ceftriaxoneinto cerebrospinal fluid of patients with uninflamedmeninges. Antimicrob. Agents Chemother. 1993; 37:1518-1524.19. Nau R. i wsp.: Deposition and elimination of meropenemin cerebrospinal fluid of hydrocephalic patientswith external ventriculostomy. Antimicrob. Agents Chemother.1998; 42: 2012-2016.20. Radwańska-Wala B., Buszman E., Dybała R.: Wpływcefotaksymu i meropenemu na całkowity potencjał antyoksydacyjnyi proces peroksydacji lipidów w płyniemózgowo-rdzeniowym u dzieci z wodogłowiem. Ann.Acad. Med. Siles. 2004; 58(1): 31-35.21. Radwańska-Wala B. i wsp.: Wpływ cefotaksymu i meropenemuna aktywność enzymów antyoksydacyjnychw płynie mózgowo-rdzeniowym u dzieci z wodogłowiem.Farm. Przegl. Nauk. 2007; 4(11-12): 28-32.22. Rothstein J.D. i wsp.: β-lactam antibiotics offer neuroprotectionby increasing glutamate transporter expression.Nature 2005; 433: 73-77.23. Miller T., Cleveland D.W.: Treating neurodegenerativediseases with antibiotics. Science 2005; 307: 361-362.24. Secko D.: Antibiotics that protect the brain. CMAJ 2005;172: 467-468.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy13

WPŁYW ODCZYNU ŚRODOWISKA NA INTERAKCJĘ CHLOROWODOR-KU RANITYDYNY W OBECNOŚCI USIECIOWANEJ KARBOKSYMETY-LOCELULOZYTHE INFLUENCE OF THE ENVIRONMENT PH ON INTERACTION OF RANITIDINEHYDROCHLORIDE IN THE PRESENCE OF CROSS-LINKED CARBOXYMETHYLCELLULOSE SODIUMdr Bożena Grimling,Prof. dr hab. Janusz PlutaKatedra i Zakład Technologii Postaci Leku, Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich,Wrocław,Prof.dr hab. Janusz PlutaStreszczenieBadano adsorpcję chlorowodorku ranitydyny w obecnościkroskarmelozy sodowej. Ocenę adsorpcji przeprowadzonometodą statyczną w warunkach in vitroz uwzględnieniem odczynu środowiska, oraz stężenialeku. Otrzymane wyniki badań dowodzą, że lek jestadsorbowany na polimerze we wszystkich stosowanychzakresach pH, a zdolność wiązania zależy od jegopostaci oraz odczynu środowiska. Termogramy DSCi widma IR wykazały charakterystyczny pik kompleksuwskazując, że kompleks różni się od właściwości fizykochemicznychmieszaniny fizycznej lek- polimer.Słowa kluczowe: chlorowodorek ranitydyny, kroskarmelozasodowa, interakcja, izoterma adsorpcji Freundlicha1. Wstęp14 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyAbstractThe adsorbance of ranitidine hydrochloride was investigatedin the presence of croscarmellose sodium. Theevaluation of adsorbance capability was carried out bymeans of a statistical method in in vitro conditions, takinginto account environmental pH and concentrationof the investigated drug. as well as the properties of thepolymer. Obtained results prove that the analyzed activeagent is adsorbed on polymer at all the investigated pHranges and the capability of polymer binding dependson environmental pH. The DSC heating curves and IRspectra demonstrated that the characteristic peak of thecomplex, indicating that complex is different physicochemicalproperties from the physical mixture of drug--polymerKey words: Ranitidine hydrochloride, Croscarmellosesodium, interaction, Freundlich adsorbance isothermPołączenia polimerów i biopolimerów z biologicznieaktywnymi związkami małocząsteczkowymi stanowiąw ostatnim okresie przedmiot intensywnych badań. Małocząsteczkowasubstancja czynna połączona z polimeremwykazuje w wielu przypadkach zmodyfikowane działanie.Z drugiej strony zastosowanie nieodpowiednich polimerówmoże spowodować niezgodności typu lek-polimer.Szczególnie duże znaczenie mają interakcje polegającegłównie na występowaniu zjawiska adsorpcji oraz na wytwarzaniusię połączeń kompleksowych zmniejszającychdziałanie leku (1-3). Kroskarmeloza sodowa ze względuna wybitne właściwości pęczniejące znalazła zastosowaniejako substancja pomocnicza o najlepszych właściwościachrozsadzających w technologii stałych postaci leków(granulaty, tabletki, kapsułki). Jest ona usieciowanymproduktem karboxymetylocelulozy o właściwościach hydrofilowychi wysokoabsorpcyjnych, wykazuje korzystneparametry powierzchniowe. Korzystne parametry powierzchniowebadanego polimeru (adsorpcja) w oraz dużazdolność jonowymienna (oddziaływania chemiczne) mogąbyć przyczyną interakcji z substancjami czynnymi [4-6].W związku z powyższym podjęto badania nad stwierdzeniemwzajemnych oddziaływań chlorowodorku ranitydynyz kroskarmelozą, określenia ich charakteru oraz przebadaniawpływu odczynu środowiska w warunkach in vitro napowyższe zjawisko.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 20082. Materiały i metodyka badańZjawisko adsorpcji chlorowodorku ranitydynycz.d.a. (Farchemia-Włochy) na kroskarmeloziesodowej cz.d.a. Primelose (Avebe-Holandia) badanometodą statyczną w zakresie stężeń od 0,9mg/10cm 3 do 0,09 mg/10cm 3 stosując roztworybuforowe o pH od 1,5 do pH 7,6 oraz określonoszybkość reakcji adsorpcji. Wyniki pomiarówilości związanego leku na kroskarmeloziewykorzystano do wyznaczenia izoterm adsorpcjiFreundlicha, co pozwoliło ocenić wielkośći charakter adsorpcji. Jakościową interpretacjęwidm adsorpcji w podczerwieni IR próbek chlorowodorkuranitydyny, mieszaniny fizycznejleku wraz z polimerem oraz osadów lek-polimerbadano w zakresie długości fal od 4000 do 200cm -1 , odpowiadającym podstawowej podczerwieni.Widma IR wykreślono stosując tabletki (300mg KBr i 2 mg próbki), które były formowanepodciśnieniem w 175 kG/cm 2 . Badania termochemicznewykonano wykorzystując kalorymetrskaningowy Mettler Toledo DSC 25, sterowanyprzy pomocy oprogramowania Star w wersji 6.1.Pomiary prowadzono w atmosferze i przepływieargonu 50 ml/min.Próbki chlorowodorku ranitydyny cz.d.a.,kroskarmelozy sodowej cz.d.a., mieszaniny fizycznejlek-polimer oraz osadów sorpcji leku napolimerze w pH 1,5 i 7,6 poddawano ogrzewaniuz liniowym wzrostem temperatury, w zakresietemperatur od 30 do 180°C. Za pomocą skaningowejkalorymetrii różnicowej DSC uzyskane termogramydostarczały szczegółowych informacjiilościowych i jakościowych osadów polimerówzwiązanych z lekiem.3. Omówienie wynikówWyniki badań dowodzą, że chlorowodorekranitydyny jest adsorbowany na kroskarmeloziewe wszystkich stosowanych zakresach pH a zdolnośćwiązania polimeru zależy od jego właściwościpęczniejących, czyli pośrednio od odczynuśrodowiska. W oparciu o przebieg izotermadsorpcji Freundlicha przedstawionych na ryc. 1zaobserwowano wzrost wielkości sorpcji wraz zewzrostem stężenia leku oraz pH w kierunku odczynuzasadowego, najwyższą wielkość adsorpcjizaobserwowano w pH 7,6.Analiza widm IR przedstawionych na ryc. 2badanej próbki chlorowodorku ranitydyny posorpcji w pH 1,5 wykazuje dodatkowe pasmoC=O charakterystyczne dla kwasów karboksylowych,które pojawia się przy długości fali 1740cm -1 . W mieszaninie fizycznej pasmo to nie występuje. Natej podstawie można stwierdzić chemiczny charakter interakcjiranitydyny z kroskarmelozą sodową utworzony poprzezwiązanie typu jon-dipol oraz wiązanie wodorowe.Analiza przebiegu termogramów związków powstałychcopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Rycina 1. Izotermy adsorpcji chlorowodorku ranitydyny z roztworówbuforowych na usieciowanej karboksymetylocelulozie sodowejTransmitacja [%]A – usieciowana karboksymetyloceluloza sodowaB – chlorowodorek ranitydynyC – chlorowodorek ranitydyny po sorpcji w pH 1,5D – chlorowodorek ranitydyny po sorpcji w pH 6,6E - mieszanina fizyczna lek-polimerRycina 2.Widma IR chlorowodorku ranitydynypo adsorpcji w pH 7,6 (D) oraz 1,5 (E) wskazują na występowanieszerokich endotermicznych pików w zakresie temperaturod 65°C do 145°C. Z termogramu osadu po adsorpcjiw pH 7,6 odczytano pik w temperaturze 93,4°C, a wielkośćefektu cieplnego wynosi ∆H 452,2J/g. Termogram połączenialek-polimer w osadzie po adsorpcji w pH 1,5 przedstawiaFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy15

Nr 6 / 2008Rycina 3. Termogramy DSC chlorowodorku ranitydynypik w temperaturze 94,7°C, a wyznaczona wielkość efektucieplnego wynosi 73,6 J/g. Temperatury topnienia nowychpołączeń powstałych po adsorpcji w pH 1,5 i 7,6 różnią sięznacznie od temperatur topnienia mieszaniny fizycznej ranitydynyi polimeru.4. Wnioski1. Przeprowadzone badania udowadniają istnienie interakcjimiędzy chlorowodorkiem ranitydyny a usieciowanąkarboksymetylocelulozą sodową. Obserwowana interakcja,polegająca na adsorpcji na polimerze, jest wynikiemsił fizycznych oraz chemicznych.2. Widma IR próbek chlorowodorku ranitydyny po adsorpcjina polimerze w pH 1,5 wykazują obecność dodatkowegopasma przy długości fali 1740 cm -1 , co odpowiadagrupom karboksylowym i świadczy o interakcjichemicznej pomiędzy lekami a polimerem.3. Termogramy DSC mieszaniny fizycznej lek-polimerwskazują na odmienne właściwości fizykochemiczneniż termogramy próbek osadów leków po sorpcji, na polimerzei mogą świadczyć o chemicznym wiązaniu pomiędzygrupami karboksylowymi polimeru i kationamisłabej zasady.Piśmiennictwo1. Bolhuis G.K. i wsp.; Improvement of dissolution of poorlysoluble drugs by solid deposition on a super disintegrant.II The choise of super disintegrants and effect ofgranulation; Eur. J. Pharm. Sci. 1997, 5, 63-65.2. Rosca C. i wsp.; Interaction of chitosan with natural orsyntethic anionic polyelectrolytes. 1. The chitosan-carboxymethylcellulosecomplex; Carbohydrate Polymers2005 62, 35-37.3. Huang W.X. i wsp.; Elimination of metformin-croscarmellosesodium interaction by competition; Int. J. Pharm.2006, 33, 311-314.4. Puttipipatkhachorn S. i wsp.; Molecular interaction inalginate deads reinforced with sodium starch glycolateor magnesium aliumninum silicate, and their physicalcharacteristics; Int. J. Pharm 2005, 51, 293-295.5. Polcar I. i wsp.; Interactions of quinine with polyacrylicand poly-L-glutamic acids in aqueous solutions; Eur. PolymerJ.2004,40, 819-823.6. Grimling,B., Pluta.J.:In vitro investigation of ranitidinehydrochloride in the presence of carboxymethyl cellulosesodium W: Biomaterials in regenerative medicine.2006,6,147.16 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Wpływ paklitakselu na ekspresję genówczynników transkrypcyjnych w komórkach raka piersiThe influence of paclitaxel on the expression of transcription factorsin breast carcinoma cellsmgr Marta Ziaja-Sołtys,dr hab. Jolanta Rzymowska,dr Piotr Maj,mgr Maciej Niemczykdr hab. Jolanta Rzymowska,Kierownik Katedry i Zakładu Biologii z GenetykąAkademii Medycznej w LublinieStreszczenieCelem pracy było określenie ekspresji genów kodującychczynniki transkrypcyjne w komórkach raka piersipoddawanych działaniu paklitakselu. Materiał badawczystanowiły pierwotne linie komórkowe uzyskanez tkanek kobiet chorych na nabłonkowego, przewodowegoraka piersi (T 1-2, N 0-1, M-0), pobranychpodczas mastektomii. Do komórek in vitro dodawanopaklitaksel w stężeniach odpowiadających dawkomterapeutycznym tj. 60 ng/ml i 300 ng/ml. Ekspresjęgenów zbadano techniką mikromacierzy w 10 hodowlachkontrolnych i 10 hodowlach poddanych działaniutaksanu. W grupach genów kodujących specyficznei ogólne czynniki transkrypcyjne wystąpiła wyższaekspresja w komórkach po zastosowaniu niższej dawkipaklitakselu tj. 60 ng w porównaniu do hodowli kontrolnej.300-ta ng stężenie paklitakselu wywołało wyraźnycytotoksyczny efekt na komórki raka piersi i obniżenieekspresji badanych genów w porównaniu do kontroli.Uzyskane wyniki mogą być wykorzystane w chemioterapiiwczesnych etapów raka piersi kobiet.Słowa kluczowe: czynniki transkrypcyjne, rak piersi,paklitaksel, mikromacierzeChoroba nowotworowa piersi ma złożoną etiologię, naktórą wpływają czynniki genetyczne, biologiczne, środowiskoweoraz styl życia. Dokładne mechanizmy predysponującelub przyspieszające i utrzymujące komórkowy procestransformacji nowotworowej są wciąż intensywnie badane[1]. Rak przewodowy (DCIS z ang. ductal carcinoma insitu) stanowi obecnie 25-30% nowo diagnozowanych nowotworówpiersi. Wśród osób młodych, u których stwierdzonoDCIS biologia choroby wydaje się być bardziej agresywna,copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073AbstractThe aim was to determine the expression of genes codingthe transcription factors in breast cancer cells underthe influence of paclitaxel. The primary cell lines fromtissues of women with diagnosed epithelial, ductal breastcarcinoma (T1-2, N 0-1, M-0) were examined. Thetissues samples were taken during mastectomy. Paclitaxelwas administered to the cell cultures in two doses 60and 300 ng/ml. The expression of genes was determinedby using microarrays technique in 10 control culturesand 10 cultures treated with paclitaxel. The studied geneswere divided into two groups: A - the genes codinggeneral – and B - the genes coding specific transcriptionfactors. 300 ng/ml concentration of paclitaxel caused significantcytotoxic effect on breast cancer cells and inthe result lower expression of genes from these groupsin comparison to the control cells. We conclude that ourresults can be useful in chemotherapy of women withearly breast cancers.Key words: transcription factors, breast cancer, paclitaxel,microarraysa wiele badań wykazało większe ryzyko nawrotu choroby[2]. Liczne obserwacje wskazują, że przerzuty fenotypowenie muszą być wynikiem późnych wydarzeń w onkogenezie,a raczej stanowią wynik kumulującego się efektu nabywanychmutacji. Badania wykonane techniką mikromacierzywykazują, że profil genowy w pierwotnych guzachpiersi (DCIS) może odpowiadać temu z etapu progresjii metastazy [3]. Ekspresja tysięcy genów w komórkach eukariotycznychregulowana jest na poziomie transkrypcji.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy17

Regulacja ta obejmuje precyzyjne współdziałanie genówz wysokocząsteczkowymi kompleksami białkowymi, którekontrolują dynamikę chromatyny i przebieg transkrypcji.Czynniki transkrypcyjne często nazywane głównymi regulatoramiekspresji genów poprzez oddziaływanie z DNA,ściśle kontrolują ekspresję docelowego genu. Uważa się,że geny są regulowane epigenetycznie i każdy rodzaj orazstopień zaawansowania nowotworu jest charakteryzowanyprzez specyficzny wzór ekspresji genów [4].Paklitaksel (PTX) jest jednym z najbardziej aktywnychchemioterapeutyków stosowanych w leczeniu pacjentówz rakiem piersi [5]. Komórki nowotworowe wykazują odmiennymetabolizm w porównaniu do prawidłowych komórekorganizmu. Zastosowanie techniki mikromacierzyumożliwia badanie nie tylko mutacji genów w komórkachguza, ale także ich ekspresję. Dla onkologów wyniki badańuzyskane tą techniką mogą posłużyć do poszukiwanianowych markerów prognostycznych i do konstruowaniamacierzy diagnostycznych, które mogą podnieść trafnośćrokowań w raku piersi nawet do 90% [6]. Identyfikacja genówi szlaków biochemicznych związanych z onkogeneząkomórek raka piersi jest zatem niezwykle istotna w rozwojuracjonalnej, molekularnie uzasadnionej profilaktyki i terapii[7].Celem pracybyło określenie ekspresji genów kodujących czynnikitranskrypcyjne w komórkach raka piersi poddawanych działaniupaklitakselu.Materiał badawczystanowiły pierwotne linie komórkowe uzyskane z tkanekpobranych podczas zabiegu mastektomii od 36 kobiet chorychna nabłonkowego, przewodowego raka piersi (T 1-2,N 0-1, M-0). Pobrany materiał poddawano homogenizacjii zakładano hodowle komórek w jednorazowych naczynkachplastikowych o powierzchni 25 cm 2 w podłożu RPMI(Sigma) z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FSB,Sigma) oraz penicyliny i streptomycyny. Wyizolowane komórkiraka piersi namnażano w inkubatorze w temperaturze37°C, w atmosferze 5% dwutlenku węgla oraz przy 90%wilgotności powietrza. Do hodowli, które osiągnęły gęstość10 000 komórek/ml podawano paklitaksel (Bristol- Myers Squibb – Anglia) w stężeniach 60 i 300ng/ml i inkubowano je przez 72 godziny. Dozowanestężenia cytostatyku przeliczano na podstawiedawki terapeutycznej, która wynosi 175 mg/m 2 powierzchniciała, w odniesieniu do powierzchni 25cm 2 naczynka hodowlanego. Obliczone stężeniaodpowiadały dawkom stosowanym w mono- i politerapiiraka piersi, a także uwzględniały liczbęprzeprowadzanych cykli chemioterapii paklitakselemtj. 3-8 (średnio 6). Równocześnie prowadzonohodowle kontrolne komórek nabłonkowo-przewodowegoraka piersi, które inkubowano bez cytostatyku,ale z dodatkiem 5% dwumetylosulfotlenku(DMSO). Określenie ekspresji genów wykonanotechniką porównawczej hybrydyzacji genomowej Ryc. 1.18 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyNr 6 / 2008opartej na macierzach molekularnych firmy Sigma-Genosis.Komplementarny DNA (cDNA) otrzymywano w reakcjiodwrotnej transkrypcji przy użyciu standardowego zestawu(Sigma), a następnie poddawano procesowi hybrydyzacji(zestaw panorama Human Cancer cDNA Labeling and HybrydizationKit; CDLBL-HCN, Sigma -Genosis). Matrycęumieszczono w kasecie wychwytującej promieniowaniegamma (detektor promieniowania Screen Imaging K, Bio--Rad). Do analizy aktywności genów matrycy wykorzystanoprogram komputerowy Quantity One – wersja 4.2.1. Opracowaniewyników polegało na porównaniu ekspresji badanychgenów w hodowlach komórek raka piersi poddanychdziałaniu paklitakselu z ekspresją tych genów w hodowlachkontrolnych. Wartości różnic ekspresji genów obliczanoprzy pomocy programu Statistica 6.0.Wynikiuzyskane na podstawie przeprowadzonych badań przedstawionona rycinie 1. Badane geny podzielono na dwiegrupy: A) geny kodujące specyficzne czynniki transkrypcyjnebiorące udział w onkogenezie komórek raka piersi;B) geny kodujące ogólne czynniki transkrypcyjne biorąceudział w onkogenezie komórek raka piersi.DyskusjaOsoby chore na raka piersi umierają zwykle na skutekuogólnienia choroby oraz rozwinięcia oporności komóreknowotworowych na stosowaną chemioterapię. Przerzutyi oporność na terapię w większości są wynikiem nadekspresjigenów pro-metastatycznych, pro-angiogennych, opornościwielolekowej i anty-apoptotycznych. Ekspresja znacznejliczby tych genów jest regulowana przez czynniki transkrypcyjnenp. NF-κB, AP-1 oraz Ets. Profile transkrypcyjne guzówpiersi mogą odpowiadać za wrażliwość komórek rakowychna chemioterapię neoadjuwantową. Taki profil możebyć użyteczny w zrozumieniu molekularnego mechanizmuokreślającego odpowiedź lub oporność i stanowić podstawędo przewidywania odpowiedzi na chemioterapię [8]. W badaniachwłasnych stwierdzono w komórkach in vitro wyższąekspresję genów kodujących czynniki transkrypcyjneogólne i specyficzne biorące udział w onkogenezie komórekraka piersi pod wpływem niższej (60 ng) dawki paklitakselucopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008w porównaniu do hodowli kontrolnej. Zastosowana dawka300 ng spowodowała znaczne obniżenie ekspresji badanychgenów z powodu wywołanego przez taksan znaczącegoefektu cytotoksycznego.Zakończone niedawno badania randomizowane w leczeniuneoadjuwantowym raka piersi z użyciem taksanówpotwierdzają ich ważną rolę w terapii kobiet z wczesnymstopniem zaawansowania tego nowotworu [5]. Uzyskanewyniki własne są zgodne z wyżej opisanym stwierdzeniemi pozwalają wysnuć wniosek, że zastosowana 60 ng dawkapaklitakselu może być skuteczna w chemioterapii początkowychstadiów raka piersi.Piśmiennictwo1. Lee S. A., Ndisang D., Patel Ch. et al. Expression ofthe Brn-3 transcription factor correlates with expressionof HSP-27 in breast cancer biopsies and is required formaximal activation of the HSP-27 promoter. Cancer Res2005;65:3072-3080.2. Rodrigues N. A., Dillon D., Carter D. et al. Differencesin the pathologic and molecular features of intraductalbreast carcinoma between younger and older women.Cancer 2003;97:1393-1403.3. Schedin P., Elias A. Multistep tumorigenesis and the microenvironment.Breast Cancer Res 2004;6:93-101.4. Kummerfeld S. K., Teichmann S. A. DBD: a transcriptionfactor prediction database. Nucleic Acids Res2006;34: Database issue doi:10.1093/nar/gkj131.5. Suszko-Każarnowicz M., Ryniewicz-Zander I. Rolataksonów w leczeniu neoadjuwantowym operacyjnegoi miejscowo zaawansowanego raka piersi. Wsp Onkol2004; 8(5):245-249.6. Jankowski M., Krause A., Zegarski W. zastosowanie mikromacierzyDNA w leczeniu raka piersi. Cancer Surg(e-publ) 2005;1:37-41.7. Porter D. A. Krop I. E. Nasser S. et al. A SAGE (serialanalysis of gene expression) view of breast tumor progression.Cancer Res 2001;61:5697-5702.8. Patel N. M., Nozaki S., Shortle N. H. et al. Paclitaxelsensitivity of breast cancer cells with constituitevelyactive NF-κB is enhanced by IκBκ super-represor andparthenolide. Oncogene 2000;19:4159-4169.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy19

Wpływ substancji pomocniczychna parametry fizykochemiczneoraz uwalnianie paracetamolu z tabletekThe effect of auxiliary substances on physicochemical parametersand release of paracetamol from tabletsdr n. farm. Iwona Barszczewska – Zagrodzkadr n. farm. Bożenna KwiatkowskaProf. dr hab. Edmund Sieradzkimgr Małgorzata Grajdamgr Agnieszka Dobekmgr Dorota BoruckaZakład Farmacji StosowanejAkademia Medyczna w WarszawieKierownik: Prof. dr hab. Edmund SieradzkiStreszczenieCelem pracy było określenie parametrów fizykochemicznych(ścieralności, łamliwości twardości orazczasu rozpadu) tabletek matrycowych i adhezyjnych,a także badanie szybkości uwalniania substancji czynnej(paracetamolu).Przygotowano 12 serii tabletek matrycowych zawierającychchitozan nisko- (serie 1-6) i wysoko (serie 7-12)cząsteczkowy oraz 10 serii tabletek adhezyjnych zawierającychcarbopol 974.Parametry fizykochemiczne otrzymanych tableteki uwalnianie substancji czynnej ustalono w oparciuo normy FP VI. W celu zobrazowania rozpadu tabletekwykonano serię zdjęć aparatem cyfrowym.Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono:– w seriach zawierających carbopol 974: czas rozpadupowyżej 15 min., wzrost wytrzymałości mechanicznejwraz ze zwiększeniem ilości carbopolu w masie tabletkowejoraz uwalnianie substancji czynnej w granicach12,83 – 27,12%;– w seriach zawierających chitozan: czas rozpadu nieprzekraczający 15 min. (z wyjątkiem serii 7, 8, 9), dużąwytrzymałość mechaniczną oraz uwalnianie substancjiczynnej we wszystkich seriach powyżej 80%.Słowa kluczowe: tabletki, chitozan, carbopol20 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowySummaryThe aim of this study was to describe physicochemicalparameters (grindability, fragility, hardness and disintegrationtime) of matrix tablets and adhesive tablets,and also to examine dissolution test of active substance(paracetamol).It has been prepared 12 lots of matrix tablets, containinglow-molecular (lots 1-6) and high-molecular (lots 7-12)chitosan as well as 10 lots of adhesive tablets containingcarbopol 974.Physicochemical parameters of tablets and release ofactive substance has been established on the basis of FPVI standard. To illustrate disintegration of tablets, seriesof pictures was taken with digital photo-camera.On the grounds of conducted tests, it’s been established:– in lots containing carbopol 974: disintegration timeover 15 minutes, increase of mechanical durability followingincrease of carbopol in the pilular mass and activesubstance release within the range of 12,83 - 27,12%;– in lots containing chitosan: disintegration time do notexceeding 15 minutes (except for lots 7, 8, 9), high mechanicaldurability and active substance release over 80% in all lots.Keywords: tablets, chitosan, carbopolcopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008WstępTabletki są obecnie najbardziej popularną formą leku.Pozwalają uzyskać maksymalną trwałość substancji leczniczej.Ich zaletą jest łatwość przyjmowania, dogodność transportui przechowywania oraz niski koszt produkcji przy masowymwytwarzaniu.W niniejszej pracy badano wpływ substancji pomocniczych[2] szczególnie carbopolu 974 oraz chitozanu [1] nisko-i wysokocząsteczkowego na wytrzymałość mechanicznątabletek, a także na czas rozpadu i szybkość uwalnianiaparacetamolu.Materiały i metodyzawierające stały carbopol rozpadły się w czasie powyżej 15min. W seriach tabletek zawierających chitozan czasy rozpaduwahały się od 36 sekund do 60 min.Na podstawie uzyskanych wyników badania wytrzymałościmechanicznej można wnioskować, że carbopol i chitozanwywierają wpływ na wytrzymałość mechaniczną tabletek.Ze wzrostem zawartości carbopolu wzrasta wytrzymałośćtabletek. Największą wytrzymałością mechaniczną wśródserii z chitozanem charakteryzują się serie 10 i 11.Tabletki zawierające w swoim składzie chitozan uwalniająpowyżej 80% substancji leczniczej po upływie 60min. podczas gdy serie zawierające carbopol uwalniają od12,83% do 27,12% substancji leczniczej.Przygotowano 12 serii tabletek matrycowych zawierającychchitozan niskocząsteczkowy (serie 1-6) i wysokocząsteczkowy(serie 7-12) oraz 10 serii tabletek adhezyjnychzawierających carbopol 974. Tabletki przygotowano metodątabletkowania bezpośredniego. Tabela I.Jako kryterium oceny otrzymanych tabletek przyjęto badanieczasu rozpadu, ścieralności, twardości i łamliwościoraz badanie szybkości uwalniania substancji czynnej (paracetamolu)z tabletek.BADANIE CZASU ROZPADU (WG FP VI)Badanie pozwala wstępnie określić wartość leczniczą tabletki,ponieważ od czsu jej rozpadu zależy szybkość rozpuszczania(uwalniania) substancji leczniczej.Czas rozpadu tabletek zawierających chitozan nie przekraczał15 min. z wyjątkiem serii 7, 8, 9. Serie zawierającecarbopol 974 rozpadały się w czasie powyżej 15 min. W celuzobrazowania rozpadu tabletek wykonano serię zdjęćaparatem cyfrowym Ryc.1. [3]BADANIE ŚCIERALNOŚCI (WG FP VI)Wg FP VI ubytek sumarycznej masy tabletek po odpyleniui ponownym zważeniu nie powinien przekraczać 1,0%.Seria z carbopolemt>15 minBADANIE TWARDOŚCI I ŁAMLIWOŚCIWyniki twardości i łamliwości przedstawia tabela II.BADANIE SZYBKOŚCI UWALNIANIA PARACETAMOLU Z PRZY-GOTOWANYCH SERII TABLETEK MATRYCOWYCH I ADHEZYJNYCHWyniki badania uwalniania paracetamolu z badanych tabletekprzedstawia tabela III oraz wykres I.Omówienie wyników i wnioskiW pracy badano wpływ substancji pomocniczych szczególniecarbopolu 974 i chitozanu na szybkość uwalnianiaparacetamolu i wytrzymałość mechaniczną tabletek. Dootrzymania tabletek wykorzystano metodę tabletkowaniabezpośredniego, jako substancji pomocniczych użyto carbopol,chitozan nisko- i wysokocząsteczkowy, glukozę, sorbitol,celulozę mikrokrystaliczną, stearynian magnezu i aerosol.Poszczególne serie różnią się między sobą zawartościąwymienionych wyżej składników.Porównując czasy rozpadu można stwierdzić, że tabletkicopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Seria z chitozanemRyc. 1. Zobrazowanie rozpadu tabletekt=60 sFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy21

Nr 6 / 2008MikrokrystalicznacelulozaStearynian Mg Aerosil Glukoza SorbitolChitozan nisko- (seria1-6)lub wysokocząsteczkowy(7-12)Nr serii Paracetamol1, 7 0,25 0,06 0,006 0,006 0,139 0,139 -2, 8 0,25 0,12 0,006 0,006 0,109 0,109 -3, 9 0,25 0,18 0,006 0,006 0,079 0,079 -4, 10 0,25 0,06 0,006 0,006 - - 0,2785, 11 0,25 0,12 0,006 0,006 - - 0,2186, 12 0,25 0,18 0,006 0,006 - - 0,158MikrokrystalicznacelulozaNr serii Paracetamol Carbopol 974 Stearynian Mg Aerosil Glukoza Sorbitol1 0,05 0,12 0,006 0,006 - - 0,41822 Przegląd Farmaceutyczny copyrightNaukowy6 0,05 0,12 0,006 0,006 0,209 0,209 -5 0,05 0,14 0,006 0,006 - - 0,39810 0,05 0,14 0,006 0,006 0,199 0,199 -2 0,05 0,24 0,006 0,006 - - 0,2987 0,05 0,24 0,006 0,006 0,149 0,149 -3 0,05 0,36 0,006 0,006 - - 0,1788 0,05 0,36 0,006 0,006 0,089 0,089 -4 0,05 0,48 0,006 0,006 - - 0,0589 0,05 0,48 0,006 0,006 0,029 0,029 -Tabela I. Składy serii chitozanem nisko- i wysokocząsteczkowym oraz carbopolem 974copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008CarbopolŚcieralność(%)Twardość[kg/mm 2 ]Łamliwość[kg/mm 2 ]ChitozanŚcieralność(%)Twardość [kg/mm 2 ]PiśmiennictwoŁamliwość[kg/mm 2 ]seria 1 0,006 >0,19 1,42 seria 1 0,64 0,19 0,25seria 2 0,005 >0,19 1,47 seria 2 0,79 0,20 0,27seria 3 0,003 >0,19 1,63 seria 3 0,37 0,27 0,30seria 4 0,0015 >0,19 1,66 seria 4 0,50 nie rozpada się 0,41seria 5 0,013 0,12 >1,66 seria 5 0,40 nie rozpada się 0,41seria 6 0,13 0,11 1,07 seria 6 1,01 0,20 0,26seria 7 0,02 0,35 1,49 seria 7 0,98 0,25 0,37seria 8 0,047 >0,38 1,59 seria 8 0,59 0,27 0,30seria 9 0,012 >0,38 >1,67 seria 9 0,60 0,28 0,34seria 10 0,14 0,12 1,14 seria 10 0,30 nie rozpada się 0,54-Tabela II. Wyniki badania wytrzymałości mechanicznej tabletekseria 11 0,22 nie rozpada się 0,52seria 12 0,58 nie rozpada się 0,44Chitozan Ilość uwolnionego paracetamolu (%) Carbopol Ilość uwolnionego paracetamolu (%)Seria 1 97,12 Seria 1 20,18Seria 2 81,32 Seria 2 18,38Seria 3 82,65 Seria 3 17,78Seria 4 96,39 Seria 4 12,83Seria 5 99,61 Seria 5 20,16Seria 6 97,54 Seria 6 27,12Seria 7 95,77 Seria 7 20,28Seria 8 94,51 Seria 8 19,66Seria 9 91,39 Seria 9 14,44Seria 10 90,72 Seria 10 24,56Seria 11 92,86Seria 12 91,24Tabela III. Wyniki badania ilości uwolnionego paracetamolu po czasie 60 min dla serii z chitozanem i carbopolemWykres I. Wyniki badania ilości uwalnianego paracetamolu po czasie 60 mindla serii z chitozanem i carbopolem.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-50731. Jachowicz R., Dorożyński P.,„Zastosowanie chitozanu jakosubstancji pomocniczej w technologiipostaci leku”, Farm. Pol.Tom LVIII str. 659-665 (2002).2. Zgoda M.M., „Aktualnie stosowanesubstancje pomocniczew technologii stałych doustnychśrodków farmaceutycznych”,Tom LIX str. 890-897 (2003).3. Czajka K., Wanowska M.,Kwiatkowska B., Sieradzki E.,„Badanie wpływu nośnikówi substancji wypełniającychoraz ich zawartości na parametryfizyczne stałych postaci lekui uwolnienie substancji czynnejz otrzymanych tabletek szkieletowych”,Farm. Pol. Tom LXIIIstr. 170-175 (2007).FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy23

WPŁYW SUPLEMENTACJI I APLIKACJI METALI NA SKÓRĘINFLUENCE OF METALS SUPLEMENTATION AND APLICATION ON SKINdr Ewa Kleszczewska 1mgr Agata Jabłońska-Trypuć 21Zakład Nauk Chemicznych, kierownik: prof. dr hab. Helena Puzanowska -Tarasiewicz2Zakład Nauk Biologicznych, kierownik: prof. dr hab. Romuald CzerpakWyższa Szkoła Kosmetologii i Ochrony Zdrowia w BiałymstokuStreszczenieSkóra jest barierą między organami wewnętrznymia środowiskiem ważną dla mechanizmów obronnych.Składniki bioaktywne diety takie jak metale mają bezpośredniwpływ na zdrowie i piękno skóry. Wapń jestniezbędny dla działania transglutaminaz. Ma on równieżwpływ na protelityczna degradację kalmodulino-zależnychbiałek skóry i odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniukanałów wapniowych zależnych do napięcia.Magnez jest także bardzo ważnym składnikiem warunkującymzdrową i piękną skórę. Sole Morza martwego,bogate w sole magnezowe są znanym czynnikiemwspomagającym leczenie chorób zapalnych. Ważnymskładnikiem jest również cynk. Bierze on udział w regulacjipoziomu kwasów tłuszczowych i witaminy A.Redukuje aktywność 5-α-reduktazy, kontroluje podziałykomórek i procesy immunologiczne. Klasyczna drogąpodawania składników aktywnych jest ich aplikacjabezpośrednio na skórę, jednakże zauważono znacznapoprawę w funkcjonowaniu tkanki skórnej po doustnejsuplementacji niektórymi metalami.Słowa kluczowe: metale, wapń, magnez, cynkAbstractSkin is the interface between the internal organs and theenvironment, importatnt for the body’s defense mechanism.Dietary bioactive compounds (metals) have beneficialeffects on skin health and beauty. Calcium innecessary for transglutaminases action. It has also influenceon the proteolytic degradation of the calmodulin--like skin protein and plays crucial role in voltage-gatedcalcium channels. Magnesium is also important compoundfor skin health and beauty. Dead Sea salt is rich inmagnesium salts, which are known to exhibit favorableeffects in inflammatory diseases. Zinc is important factorof the skin metabolism. It participates in the regulationof the levels of the fatty acids and the vitamin A. Itreduces the activity of the 5-alpha reductase, controlsthe cell duplication and influences the immunologicalprocesses. The classical route of administration of activecompounds is by topical application direct to theskin, however, the use of functional food and oral supplementsfor improving skin condition is increasing.Key words: metals, calcium, magnesium, zincSkóra pełni rolę bariery ochronnej przed działaniemczynników fizycznych i chemicznych pochodzenia egzogennego,przed inwazją drobnoustrojów i pasożytów, a takżeuczestniczy w regulacji temperatury ciała i utrzymaniurównowagi wodno-elektrolitowej. Zbudowana jest z naskórka,skóry właściwej i tkanki podskórnej, którą tworzątkanka tłuszczowa i tkanka łączna wiotka. Naskórek tworząnamnażające się w najniższej warstwie keratynocyty, którenastępnie migrują w kierunku powierzchni, po drodze zmieniająckształt, obumierając i przekształcając się w twardepłytki zbudowane z keratyny. Skóra właściwa zbudowanajest z włókien kolagenowych i elastynowych i nadaje powłokomskórnym odporność mechaniczną.Dla integralności i prawidłowego funkcjonowania tkankiskórnej niezwykle ważne są prawidłowe poziomy metali24 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowyw skórze. Spełniają one w tej tkance wiele funkcji: wpływająna przebieg podziałów komórkowych, chronią przedatakami wolnych rodników i drobnoustrojów a także przedszkodliwym działaniem nadmiaru UV. Regulują równieżmetabolizm niektórych witamin i kwasów tłuszczowych.Tak szerokie spektrum działania metali i ich związków sprawia,że są one popularnymi składnikami kosmetyków.Wapń jest niezbędny dla działania transglutaminaz.Transglutaminazy są grupą wapnio- i tiol-zależnych transferazarylowych, które katalizują formowanie wiązań w różnychzwiązkach. Enzymy te wpływają na posttranslacyjnąmodyfikację białek, poprzez włączanie grup aminowych lubstabilizację białek poprzez tworzenie wiązań poprzecznych;takie działanie istotnie wpływa na krytyczne procesy biologicznetakie jak krzepnięcie krwi i ochrona przed infekcja-copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073mi i odwodnieniem poprzez ustabilizowanie i wzmocnienieochronnej funkcji skóry [1].Wapń również wpływa na degradację proteolityczną białekskóry zależnych od kalmoduliny. Białko skóry zależneod kalmoduliny (CLSP) zwane też kalmodulinozależnymbiałkiem 5, ostatnio odkryte w skórze, jest specyficznymbiałkiem wiążącym wapń. Jest ono ściśle związane z różnicowaniemkeratynocytów. Białka należące go grupy CLSPulegają proteolitycznej degradacji w wyższych warstwachstartum corneum zdrowej skóry. Podniesiony poziom CLSP,(charakterystyczny dla chorób skórnych) nie wynika z nadekspresjibiałek, ale jest rezultatem braku ich degradacji.Degradacja CLSP w stratum corneum chorobowo zmienionejskóry może być powstrzymywana przez podwyższonypoziom wapnia. Brak degradacji CLSP w epidermie podtrzymującejego zdolność do wiązania protein takich jaktransglutaminaza 3 może mieć fizjologiczną rolę w chorobachskóry [2].Wapń pełni też kluczową rolę w zamykanych napięciemkanałach wapniowych (VGCC). Ostatnie badania wskazują,że warunki elektryczne powierzchni skóry wpływają naprzewodzenie epidermalne i utrzymanie homeostazy. Wielerezultatów wskazuje na istnienie sensorów napięciowychw keratynocytach epidermy. Specyficzne blokery VGCCtakże wpływają na utrzymanie homeostazy i bariery naskórkowej,ale istnienie i funkcjonowanie tych kanałów niezostało dotąd wykazane. Wpływ jonów wapnia do naskórkowychkeratynocytów likwiduje możliwość odnowieniabariery po jej przerwaniu, a bezpośrednia aplikacja blokerówkanałów wapniowych przyspiesza odnowienie bariery.Wiele rezultatów sugeruje, że VGCC istnieją na epidermalnychkeratynocytach i odgrywają istotną rolę w utrzymaniuhomeostazy bariery skórnej [3].Magnez jest bardzo ważnym składnikiem niezbędnymdla zdrowia i urody. Sól Morza Martwego jest bogata w solemagnezowe, które są znane jako czynnik wpływający pozytywniena choroby zapalne. Wiele badań wskazuje na dobrątolerancję kąpieli w roztworach soli, poprawiają one funkcjonowaniebariery skórnej, wzmacniają nawilżenie warstwystratum corneum i redukują stany zapalne i zaczerwienieniaskóry. Bardzo korzystne efekty kąpieli w roztworachsoli z Morza Martwego są głównie związane z wysokim stężeniemw nich magnezu. Sole magnezu wiążą wodę, wpływająna proliferację i różnicowanie komórek w naskórkui poprawiają przepuszczalność bariery naskórkowej [4].Sól magnezowa – 1-askorbinian-2-fosforan magnezu jestznany jako związek rozjaśniający skórę. Typ i ilość melaninysyntetyzowanej przez melanocyty i sposób jej dystrybucjiwokół keratynocytów, determinuje aktualny kolor skóry.Melanina powstaje poprzez serię reakcji utleniania aminokwasutyrozyny w obecności enzymu tyrozynazy. Tyrozynazakatalizuje trzy różne reakcje w biosyntezie melaninyw melanocytach: hydroksylację tyrozyny do 1-DOPA, oksydację1-DOPA do dopachinonu, następnie u ludzi dopachinonjest zamieniany poprzez serię kompleksowych reakcjido melaniny [5].Wśród wielu funkcji, jakie spełnia cynk w skórze możnawymienić m.in.: ochronę przeciwrodnikową, regulacjęmetabolizmu kwasów tłuszczowych i witaminy A, regulacjęmelanogenezy, hamowanie aktywności 5-α–reduktazy, regulacjępodziałów komórkowych i regulację procesów układuimmunologicznego. Cynk uczestniczy w wytwarzaniu prostaglandynregulujących m.in. funkcje wydzielnicze skóry,przyspiesza gojenie się ran i utrzymuje odporność skóry nainfekcje. Jony Zn(II) są elementem budowy toksyny botulinowej,która jest stosowana powszechnie w dermatologiiestetycznej do usuwania zmarszczek mimicznych [6]. Ważnąfunkcją cynku w skórze jest hamowanie aktywności 5--α-reduktazy. 5-α-Reduktaza jest enzymem, który bierzeudział w przekształcaniu testosteronu do dihydrotestosteronu(DHT), który jest najsilniejszym spośród androgenówstymulatorem produkcji sebum w skórze. Działanie cynkuzmniejszające wydzielania sebum to też hamowanie lipazbakteryjnych rozkładających trójglicerydy sebum dowolnych kwasów tłuszczowych [7]. Bardzo ważną rolęodgrywa cynk w regulacji procesów układu immunologicznego.Istnieje ścisły związek miedzy skórą a układemimmunologicznym, gdyż skóra jako narząd graniczny jestw stałym kontakcie ze środowiskiem i sprawuje funkcjeobronne [8]. W procesach regeneracji komórek skóryniezwykle ważne jest utrzymanie prawidłowej strukturyDNA komórek. Cynk łatwo tworzy połączenia z kwasaminukleinowymi wywierając korzystny wpływ na aktywnytransport, biosyntezę białek, proces transkrypcji i syntezęmRNA. Jest pierwiastkiem niezbędnym w regulacji cyklukomórkowego i różnicowaniu komórek, ponieważ wchodziw skład białek zaliczanych do czynników transkrypcyjnych[9]. Jony Zn(II) spełniają ważna rolę w regulacjimetabolizmu witaminy A; są one niezbędne do utrzymaniaoptymalnego stężenia witaminy A we krwi i jej zużyciaprzez tkanki.Metale należą do szeroko stosowanych składników kosmetycznych.Aplikowane zewnętrznie mogą przenikaćprzez warstwę rogową naskórka i docierać do niżej położonych,żywych warstw skóry, gdzie mogą regulować szeregprocesów metabolicznych i zapewniać ochronę przed szkodliwymdziałaniem czynników wewnętrznych i zewnętrznych.Najnowsze doniesienia naukowe i specjalistyczne czasopismazawodowe kładą duży nacisk na suplementacjęwitaminowo – mineralną. Ma ona za zadanie pozytywnieoddziaływać na procesy zachodzące w skórze. Substancjemineralne uczestniczące w mechanizmach przemianymaterii odgrywają ważną rolę ze względu na właściwościfizyko – chemiczne i ich udział w strukturach biochemicznych.Przemiany związków nieorganicznych, a szczególniekationów metali są związane przede wszystkim z reakcjamienzymatycznymi zachodzącymi w ustroju. Prawidłowośćprocesów fizjologicznych zależy tu nie tylko od składu i stężeniaposzczególnych pierwiastków, ale też od ich proporcjiw ustroju. Dlatego zachowanie właściwych relacji pomiędzyposzczególnymi pierwiastkami jest często ważniejszeod ich prawidłowego stężenia.Korzystne dla skóry właściwości metali i ich związkówdecydują o stosowaniu ich w kosmetykach jako składnikówaktywnych, konserwantów, stabilizatorów emulsji, czynnikówzwiększających lepkość, wypełniaczy, itp., dlatego teżpoziomy tych pierwiastków w kosmetykach powinny byćstale kontrolowane i utrzymane na bezpiecznym dla konsumentówpoziomie.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy25

PIŚMIENNICTWO1. Iismaa SE, Begg GE, Graham RM. Cross-linking transglutaminaseswith G protein-coupled receptor signaling.Sci STKE. 2006 Sep 19;2006(353):pe34.2. Mehul B i wsp. Influence of calcium on the proteolyticdegradation of the calmodulin-like skin protein (calmodulin-likeprotein 5) in psoriatic epidermis. Exp Dermatol.2006 Jun;15(6):469-77.3. Denda M, Fujiwara S, Hibino T. Expression of voltage--gated calcium channel subunit alpha1C in epidermalkeratinocytes and effects of agonist and antagonists ofthe channel on skin barrier homeostasis. Exp Dermatol.2006 Jun;15(6):455-60.4. Proksch E i wsp. Bathing in a magnesium-rich Dead Seasalt solution improves skin barrier function, enhancesskin hydration, and reduces inflammation in atopic dryskin. Int J Dermatol. 2005 Feb;44(2):151-7.Nr 6 / 20085. Parvez S i wsp. Survey and mechanism of skin depigmentingand lightening agents. Phytother Res. 2006 Nov;20(11):921-34.6. Fu Z i wsp.: Light chain of botulinum neurotoxin serotypeA: structural resolution of a catalytic intermediate.Biochemistry. 2006; 45 (29): 8903 – 11.7. Essah PA i wsp. Dermatology of androgen-related disorders.Clin. Dermatol. 2006; 24 (4): 289 – 98.8. Fivenson DP: The mechanisms of action of nicotinamideand zinc in inlammatory skin disease. Cutis. 2006; 77 (1Suppl.): 5 – 10.9. Narlikar L, Hartemink AJ: Sequence features of DNAbinding sites reveal structural class of associated transcriptionfactor. Bioinformatics. 2006; 22 (2): 157 – 63.26 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

WPŁYW WITAMINY E NA OBRAZ MORFOLOGICZNYWYBRANYCH NARZĄDÓW WEWNĘTRZNYCH SZCZURÓWINTOKSYKOWANYCH FLUORKIEM SODUTHE INFLUENCE VITAMIN E ON THE MORPHOLOGICAL PICTURE OF RATS ORGANSINTOXICATED WITH SODIUM FLUORIDEdr n. przyr. Barbara Stawiarska-Pięta,Prof. dr hab. n. med. Ewa Szaflarska-Stojko,dr n med. Ewa Grucka-Mamczar 1 ,Prof. dr hab. n. med. Ewa Birkner 1 ,mgr anal. Michał Ziębowicz, mgr anal. Magdalena WyszyńskaKatedra i Zakład Patologii, Wydział Farmaceutyczny i Oddział Medycyny Laboratoryjnej,Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec1Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii, Wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet Medyczny, ZabrzeKierownik Katedry Patologii: Prof. dr hab. n. med. Ewa Szaflarska-StojkoStreszczenieZbadano wpływ witaminy E na rozwój zmian patomorfologicznychw narządach wewnętrznych szczurów intoksykowanychfluorkiem sodu.Szczury (samce) podzielono na 3 grupy: grupę kontrolnąi 2 grupy badane, liczące po 6 zwierząt. Szczury w grupiekontrolnej otrzymywały wodę destylowaną. Zwierzętomw grupach badanych I i II podawano fluoreksodu w dawce 10 mg/ kg m.c./24h. Dodatkowo zwierzętaw grupie badanej II otrzymywały 3 mg witaminy E /szczura/24h. Eksperyment trwał 35 dni. Po tym czasieszczury usypiano dootrzewnowo 1% hexobarbitalem.Podczas sekcji do badań histopatologicznych pobieranotrzustki i płuca. Oceny patomorfologicznej dokonanona podstawie preparatów wykonanych rutynowąmetodą parafinową, barwionych hematoksyliną i eozyną.W trzustkach oznaczono także aktywność aldolazyfruktozo–1,6–dwufosforanowej (ALD)- (E.C.4.2.1.7.)i dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) (E.C.1.1.37).W badaniach patomorfologicznch wykazano w płucachzwierząt intoksykowanych fluorkiem sodu przekrwienie,krwinkotoki, nacieki, pęcherze rozedmowe.W trzustkach- zwyrodnienie wodniczkowe i naciekiw zrębie. Podanie witaminy E z NaF hamowało przekrwieniei rozwój zmian wstecznych w narządach. Niestwierdzono statystycznych zmian w aktywności aldolazyALD w obydwu grupach badanych. Zaobserwowanostatystyczny wzrost dehydrogenazy jabłczanowejw grupie I (NaF) w stosunku do grupy kontrolnej. Popodaniu witaminy E z NaF (Grupa II) aktywność MDHwykazała tendencje spadkowe w stosunku do aktywnościw grupie I (NaF).Otrzymane wyniki wykazały korzystny wpływ witaminyE na obraz morfologiczny badanych narządówszczurów intoksykowanych fluorkiem sodu.Słowa kluczowe: fluorek sodu, witamina E, szczury,patomorfologia, płuca, trzustkacopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073SummaryA study was conducted on the influence of vitamin E onthe development of pathomorphological changes in theinner organs of rats intoxicated with sodium fluoride.Three groups of six rats (adult males) were used: a controlgroup and two study groups. Rats in control groupwere kept on distilled drinking water. Animals in studygroups I and II were supplemented with 10 mg F/kgbw/hr in their drinking water. Additionally, animals instudy group II supplemented diet providing 3 mg ofvitamin E/rat/24hr. The experiment lasted for 35 days.Then the rats were intraperitioneally anesthetized, using1% thiopental. At autopsy, the pancreases and lungswere examined and collected for histopathological tests.Pathomorphological changes in these organs wereassessed with slides made by the normal paraffin methodstained with hematoxilin and eosin. The aldolase(ALD) and malate dehydrogenase (MDH) activities inthe pancreas were determinated.Pathomorphological examinations of lungs revealed, inthe case of NaF administration, that examined rats developedhyperemia, erythrorrhagia, inflammatory infiltrations,emphysematous blebs. There were focal vacuolardegeneration cells and inflammatory infiltrations noticedonly in pancreases. The administration of vitaminE together with NaF had inhibitory effect on the hyperemiaand the development of the regressive changes inorgans. No statistically significant change in the ALDactivity in the pancreas was observed in the study groups.The MDH activity increased significantly in the groupI (NaF) compared with the control group. Administrationof witamin E along with NaF (Group II) caused a downwardtendency in the MDH activity when compared toGroup I without witamin E. The obtained results showeda beneficial influence of witamin E on the morphologicalpicture of rats organs intoxicated with sodium fluoride.Key words: natrium fluoride, vitamin E, rats, patomorphology,lungs, pancreasFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy27

WSTĘPW licznych badaniach eksperymentalnych, klinicznychi epidemiologicznych wykazano, że fluor po przekroczeniudawki dopuszczalnej wykazuje znaczną toksyczność w stosunkudo większości tkanek ustrojowych człowieka i zwierzątdoświadczalnych [1,2,3,4,5,6].W dotychczasowych badaniach wykazano, że jon fluorkowyzaburza kluczowe procesy metaboliczne węglowodanów,białek i tłuszczów, hamując aktywność enzymówważnych dla ich przebiegu, rzadziej prowadzi do wzrostuich aktywności [3,6,7,8,9]. Należą do nich enzymy biorąceudział w glikolizie beztlenowej oraz w cyklu Krebsa, a takżeenzymy biorące udział w przemianach związanych z wytwarzaniemATP. Ponadto hamuje syntezę białek i DNA. Fluoruważany jest za truciznę protoplazmatyczną ze względuna fakt hamowania utleniania komórkowego tkanki nerwoweji mięśni prążkowanych. Ponadto wykazano, że w dawkachtoksycznych powoduje wiele zmian morfologicznychprowadzących do upośledzenia funkcji różnych narządów.Zmiany te pojawiają się zwykle w narządach miąższowychtakich jak nerki, wątroba, płuca, trzustka, gonady. Ponadtozaobserwowano zmiany w sercu, kościach, zębach i wnaczyniach krwionośnych [1,3,10,11]. W ostatnich latachwykazano, że w mechanizmie obserwowanych zmian istotnąrolę odgrywają procesy oksydoredukcyjne [13]. Fluoruczestniczy w wytwarzaniu wolnych rodników tlenowych(WRT), hamuje aktywność enzymów chroniących przedskutkami generowania reaktywnych form tlenu (RFT). i peroksydacjąlipidów błonowych, takich jak: katalaza (CAT),dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), oksydaza ksantynowa(XOD) oraz peroksydaza glutationowa (PXH- PX). W wielubadaniach wykazano jego stymulujące działanie na wytwarzanierodnika ponadtlenkowego [12,13,14,15,16,17,18].Należy uwzględnić fakt że reaktywne formy tlenu stanowiązagrożenie dla komórek, gdyż reagują z wszystkimi jejgłównymi składnikami. Utleniają glutation, askorbinian,inaktywują wiele białek enzymatycznych, strukturalnychi transbłonowych, prowadząc do zmiany przepuszczalnościbłon komórkowych. Zaburzenia struktury i funkcji komórkiprowadzą do jej śmierci. Zmiany te powstają w wyniku naruszeniarównowagi pomiędzy wytwarzaniem i eliminacją RFT[19,20,21]. Zapobieganie szkodliwemu działaniu stresu oksydacyjnego,który niewątpliwie towarzyszy narażeniu na fluor powinnozatem polegać na wzmocnieniu ustrojowego układu antyoksydacyjnego.Wydaje się, że podawanie dobrze poznanychantyoksydantów może mieć znaczenie w zapobieganiu skutkomwynikających ze zwiększonego narażenia na fluor.Celem pracy była ocena wpływu fluorku sodu na obrazmorfologiczny trzustki i płuc oraz na aktywność aldolazyi dehydrogenazy jabłczanowej w trzustkach po zastosowaniudiety wzbogaconej witaminą E.MATERIAŁ I METODYKA BADAŃBadania przeprowadzono na 18 szczurach- samcachszczepu FL Wistar pochodzących z Centralnej ZwierzętarniDoświadczalnej ŚUM w Katowicach o początkowej masieciała 401,7g. Zwierzęta podzielono na 3 grupy: grupę kontrolnąi 2 grupy badane, liczące po 6 zwierząt:28 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyNr 6 / 2008• Grupę kontrolną - zwierzętom podawano wodę destylowaną;• Grupę badaną I (NaF) - Szczurom podawano fluoreksodu w dawce 10 mg/ kg m.c./24h;• Grupę badaną II (NaF+Wit.E) - Zwierzęta otrzymywałyfluorek sodu w dawce 10 mg / kg m. c. /24h i witaminęE w dawce 3 mg/ szczura/24h.Potem wszystkie zwierzęta piły wodę destylowaną adlibitum i jadły paszę standardową dowoli. Eksperymenttrwał trzydzieści pięć dni. Przez cały okres doświadczeniakażde zwierzę było przechowywane w oddzielnejklatce. Po zakończeniu eksperymentu szczury usypianodootrzewnowo 1% hexobarbitalem. Podczas sekcji dobadań histopatologicznych pobierano trzustki i płuca.Oceny patomorfologicznej dokonano na podstawie preparatówwykonanych rutynową metodą parafinową, barwionychhematoksyliną i eozyną [22]. Mikrofotografiewykonano w mikroskopie firmy Olympus za pomoca kamerycyfrowej Olympus.W trzustkach oznaczono także aktywność aldolazy fruktozo–1,6–dwufosforanowej(ALD)- (E.C.4.2.1.7.) i dehydrogenazyjabłczanowej (MDH) (E.C.1.1.37) metodamikolorymetrycznymi [23].Analiza statystycznaAnalizę statystyczną przeprowadzono w oparciu o programStatSoft, Inc. (2001). STATISTICA. Dla wykazaniaróżnic pomiędzy grupą kontrolną, a grupami badanymioraz między grupami badanymi zastosowano test U Manna-Whitneya.Za znamienne statystyczne przyjęto zmianyprzy poziomie istotności p≤0,05.WYNIKI I ICH OMÓWIENIEI. OCENA PATOMORFOLOGICZNAZastosowana dawka NaF spowodowała zmiany w płucachi trzustkach badanych zwierząt.Płuca: W płucach szczurów grupy badanej I(NaF) zaobserwowanoprzekrwienie przegród międzypęcherzykowychi krwinkotoki. Obecne były także liczne makrofagi w zrębie.Ponadto, u czterech zwierząt obserwowano nacieki ropnew miąższu płuc w pobliżu naczyń krwionośnych (Ryc.2-3). U 3 szczurów zaobserwowano ogniska rozedmowe.Ściany pęcherzyków objętych rozedmą były cienkie(Ryc. 4). W świetle pojedynczych oskrzeli obecny byłzłuszczony nabłonek i makrofagi. W grupie badanej II (NaF+Wit.E), otrzymującej codziennie z fluorkiem sodu witaminęE, stwierdzono mniejszy stopień nasilenia obserwowanychzmian, niż w grupie badanej I (NaF) (Ryc. 5). Na rycinie 1przedstawiono obraz płuca szczura z grupy kontrolnej.Trzustka: W trzustkach w grupie badanej I (NaF) zaobserwowanozwyrodnienie wodniczkowe (Ryc. 7) w komórkachpęcherzyków części zewnątrzwydzielniczej. Zmianyobecne były w 2-4 płacikach u 4 zwierząt. Obserwowanotakże niewielkie nacieki w zrębie w okolicy naczyń krwionośnych(Ryc. 8). W wysepkach trzustkowych poza prze-copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008Ryc. 1. Grupa kontrolna. Płuco. Obraz prawidłowy. BarwienieH-E. 200x.Ryc. 4. Grupa badana I (NaF). Płuco. Widoczne ogniskowezmiany rozedmowe, przegrody międzypęcherzykowecienkie. Barwienie H-E. 200x.Ryc. 2. Grupa badana I (NaF). Płuco. Przekrwienie w przegrodachmiędzypęcherzykowych oraz naciek ropny wokółnaczynia krwionośnego. Barwienie H-E. 200xRyc. 5. Grupa badana II (NaF+wit.E). Płuco. Przekrwieniew pęcherzykach. Obecne liczne makrofagi. Barwienie H-E.200x.Ryc. 3. Grupa badana I (NaF). Płuco Przekrwienie w przegrodachmiędzypęcherzykowych. W ścianach obecne licznemakrofagi. Barwienie H-E. 400x.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Ryc. 6. Grupa kontrolna. Trzustka. Obraz prawidłowy. Widocznawyspa trzustkowa i pęcherzyki. Barwienie H-E.400x.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy29

Nr 6 / 2008Ryc. 7. Grupa badana I (NaF). Trzustka. zwyrodnienie wodniczkowew komórkach pęcherzyków części egzokrynowej.Barwienie H-E. 400x.Ryc. 9. Grupa badana II (NaF+wit.E ). Trzustka. Brak zmianw pęcherzykach i wyspie trzustkowej. Barwienie H-E. 400x.krwieniem (u 2 szczurów) nie obserwowano żadnych zmianpatologicznych. Podanie witaminy E w grupie badanej II(NaF+wit.E) spowodowało zahamowanie obserwowanychzmian (Ryc. 9). Jedynie u dwóch zwierząt w tej grupiew pojedynczych zrazikach pojawiły się małe wodniczki(dotyczyły 1-2 płacików). Obraz mikroskopowy trzustkiszczurów z grupy kontrolnej ilustruje rycina 6.II. WYNIKI OZNACZENIA AKTYWNOŚCIENZYMÓWRyc. 8. Grupa badana II (NaF). Trzustka. Naciek w pobliżunaczynia. Barwienie H-E. 200x.Wyniki oznaczenia aktywności ALD przedstawione w tabeli1 nie wykazały istotnie statystycznych różnic w rozkładziewartości aktywności ALD pomiędzy grupą kontrolną,a grupami badanymi (p>0,05). Nie stwierdzono także różnicznamiennych w wartościach aktywności ALD pomiędzygrupą badaną I i II (p= 0,4920).GrupaszczurówLiczba zwierzątN30 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyAktywność ALD [ IU/1g tkanki ]–X SD pp(NaF + Wit.E )/(NaF)Kontrola 6 0,1376 0,0579 - - -% zmianBadana I (NaF) 6 0,1405 0,0769 0,9473 2,06 %↑Badana II(NaF +Wit. E)6 0,1797 0,0955 0,4387 0,4920 30,54 %↑Tabela 1. Aktywność aldolazy fruktozo-1,6- dwufosforanowej w trzustce szczurów [IU/1g tkanki]GrupaszczurówLiczba zwierzątNAktywność ALD [ IU/1g tkanki ]–X SD pp(NaF + Wit.E )/(NaF)Kontrola 6 1,5352 0,6836 - - -% zmianBadana I (NaF) 6 1,9944 0,0617 0,0176* 29,90 % ↑Badana II(NaF +Wit. E)6 1,9138 0,0783 0,0864 0,055 24,66 % ↑* p< 0,05 - wzrost aktywności MDH statystycznie znamiennyTabela 2. Aktywność dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) w trzustce szczurów [IU/1g tkanki]copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008Aktywność MDH przedstawiono w tabeli 2. Wykazanoistotny statystycznie wzrost aktywności tego enzymuw grupie badanej I (NaF) w stosunku do grupy kontrolnej,na poziomie istotności p < 0,02. Natomiast w grupie badanejII (NaF + Wit. E) uzyskane wartości aktywności MDHmają tendencję wzrostową do różnicy istotnej statystycznie.Wyliczone różnice w wartościach aktywności MDH miedzygrupą kontrolną, a badanymi wskazują na wzrost aktywnościMDH w poszczególnych grupach badanych odpowiednioo 29,9%, 24,66%. Zaobserwowano jedynie tendencjęspadkową do różnicy istotnej statystycznie (p=0,055) w aktywnościMDH w grupie badanej II (NaF + Wit. E) w stosunkudo grupy I(NaF).PODSUMOWANIE1. Wykazano działanie prewencyjne witaminy E na obrazpatomorfologiczny płuc i trzustki (obecność zmiano mniejszym nasileniu) po intoksykacji fluorem.2. Podanie antyoksydantów nie wpłynęło znacząco na procesymetaboliczne w trzustce szczura wyrażone aktywnościąALD i MDH (proces glikolizy, cykl Krebsa).3. Obserwowany korzystny wpływ witaminy E na obrazmorfologiczny badanych narządów wskazuje na udziałprocesów oksydacyjnych w obserwowanych zmianachpatomorfologicznych po narażeniu na fluorek sodu.PIŚMIENNICTWO1. Chinoy N.J.: Fluoride in the environment. W: Fluoridein medicine, biology and toxicology. Edited by DariuszChlubek, Wydawnictwo Borgis, Warszawa, 2003; 5-33.2. Cittanova M.L. i wsp.: Fluoride ion toxicity in humankidney collecting duct cells. Anesthesiology, 1996; 84:428-435.3. Chlubek D.: Fluoride in medicine, biology and toxicology.Wyd. Borgis. Warszawa, 2003.4. Hordyjewska A., Pasternak K.: Wpływ fluoru na organizmczłowieka. J. Elem., 2004; 9: 883-897.5. Wędzisz A.: Niektóre zagadnienia związane z występowaniemfluoru w środowisku. Bromat. Chem. Toksykol.,1997; X: 249-257.6. Pawłowska-Góral K. i wsp.: Wpływ związków fluoru naorganizm człowieka. Ann. Acad. Med. Siles., 1998; 34--35: 105-115.7. Wędzisz A.: Oddziaływanie małych dawek fluoru naustrój szczurów. Aktywność wybranych enzymówsurowicy i wątroby. Bromat. Chem. Toksykol., 1989; 22:142-152.8. Machoy Z.: Biochemiczne mechanizmy działania związkówfluoru. Folia Medica Cracoviensia, 1987; 28: 61-81.9. Machoy Z.: Wpływ związków fluoru na enzymy oddechowe.Postępy Biochem., 1981; 27: 327-337.10. Sikorska-Jaroszyńska M.H.J., Czelej G.: Fluor w stomatologiii medycynie. Wydaw. Czelej, Lublin, 2000.11. Shashi A., Thapar S.P.: Histopathology of myocardialdamage in experimental fluorosis in rabbits. Fluoride,2001; 34: 43-50.12. Chinoy N.J.: Fluoride stress on antioxidant defence systems.Fluoride, 2003; 36: 138-141.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-507313. Chlubek D.: Fluoride and oxidative stress. Fluoride,2003; 36: 217-228.14. Chlubek D., Stachowska E., Bober J.: Udział fluorkóww reakcjach wolnorodnikowych i ich wpływ na aktywnośćenzymów antyoksydacyjnych. Bromat. Chem. Toksykol.2001; 34: 263-266.15. Sztanke M., Pasternak K., Borzęcki A.: Zmiany aktywnościenzymów antyoksydacyjnych w tkankach myszyotrzymujących fluor. J. Elementol. 2004; 9: 815-820.16. Zhang J. i wsp.: Effects of sodium fluoride and sulfurdioxide on oxidative stress and antioxidant defenses inrat testes. Fluoride, 2006; 39: 185-190.17. Shivarajashankara Y.M. i wsp.: Effect of fluoride intoxicationon lipid peroxidation and antioxidant systems inrats. Fluoride, 2001; 34: 108-113.18. Shivarajashankara Y.M.: Brain lipid peroxidation andantioxidant systems of young rats in chronic fluoride intoxication.Fluoride, 2001; 34: 108-113.19. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie.Wydaw. Naukowe PWN, Warszawa, 2004.20. Strzałkowski A. i wsp.: Układy chroniące przed działaniemaktywnych form tlenu w organizmie żywym. Lek.Wojsk. 2004; 80: 196-205.21. Strzałkowski A., Antoszewski Z.: Rola wolnych rodników.Pol. Merk. Lek., 2005; 18: 321-322.22. Zawistowski .: Technika histologiczna, histologia orazpodstawy histopatologii. PZWL, Warszawa, 1996.23. Krawczyński J.: Diagnostyka enzymologiczna w medycyniepraktycznej. Metodyka badań. PZWL, Warszawa1972.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy31

WPŁYW WYBRANYCH POCHODNYCH KSANTONUNA AKTYWNOŚĆ KATALAZY I DYSMUTAZY NADTLENKOWEJW HEMOLIZATACH KRWINEK CZERWONYCH OSÓB ZDROWYCHORAZ OSÓB CHORYCH Z CUKRZYCĄINFLUENCE OF XANTHONE DERIVATIVES ON CATALASE AND SUPEROXIDE DISMUTASEACTIVITIES IN HAEMOLISATES OF HEALTHY PERSONSAND PATIENTS WITH DIABETESdr farm Agata Pietrzycka 1 ,Prof. dr hab. med. Marek Stępniewski 1 ,mgr Wirginia Ostafin 1 ,dr hab. Henryk Marona 2 , dr n. med. Anna Skalska 31Samodzielna Pracownia Radioligandów, Uniwersytet Jagielloński,Collegium Medicum, Wydział Farmaceutyczny, KrakówKierownik: Prof. dr hab. med. Marek Stępniewski2Katedra Technologii i Biotechnologii Środków Leczniczych; Uniwersytet Jagielloński,Collegium Medicum, Wydział Farmaceutyczny, Kraków3Oddział Kliniczny Kliniki Chorób Wewnętrznych i Geriatrii, Uniwersytet Jagielloński,Collegium Medicum, Wydział Lekarski, KrakówStreszczenie:Celem badań było określenie wpływu wybranychpochodnych ksantonu, o działaniu hipotensyjnymi przeciwarytmicznym, na aktywność dysmutazynadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT) w hemolizatachkrwinek czerwonych osób zdrowych oraz chorychz cukrzycą. Przesłanką do przeprowadzeniaw/w badań był fakt, iż pochodne ksantonu należą dozwiązków o szerokim spektrum aktywności, obejmującymm.in. działanie przeciwalergiczne, przeciwzapalne,przeciwpłytkowe, ponadto antyoksydacyjneoraz korzystne na układ sercowo-naczyniowy. Właściwościantyoksydacyjne badanych związków porównanoz wzorcowymi antyoksydantami: Troloxem i Resweratrolem.Materiał do badań pochodził od pacjentów z cukrzycą(n = 64) oraz od osób zdrowych (n = 62). AktywnośćSOD oznaczono metodą wg Misra i Fridovicha aktywność CAT oznaczono metodą wg Aebie. Stwierdzono,że pochodne ksantonu znamiennie zwiększająaktywność CAT u osób chorych na cukrzycę, a aktywnośćSOD u osób zdrowych. Pochodne ksantonu posiadajązbliżoną aktywność antyoksydacyjną z wzorcowymiantyoksydantami.Summary:The aim of this study was to investigate effect of chosenxanthone derivatives on antioxidant system in redblood cells (RBC) haemolisates of healthy people andsubjects with diabetes mellitus (DM). Measurement ofantioxidant enzymes activities: superoxide dismutase(SOD) and catalase (CAT) in RBC haemolisates wereperformed. Antioxidative effects of the study compoundswere compared to standard antioxidants: Troloxand Resveratrol. It was found that xanthone derivativesincreased activity of SOD in healthy persons. In oppositeto that, in patients with DM, xanthone derivativescompounds decreased SOD activity. Two fold increaseof CAT activity in erythrocytes of patients, incubatedwith xanthone derivatives, in comparison to RBC of healthyperson was noticed. There was found that studiedderivatives had the same activity as Trolox and Resveratrol.Key words: CAT, diabetes mellitus, SOD, xanthone derivativesSłowa klucze: CAT, cukrzyca, pochodne ksantonu,SOD32 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008WstępW licznych publikacjach udowodniono udział reaktywnychform tlenu (RFT) w patomechanizmie wielu chorób,w tym cukrzycy. [1-2] Kluczową rolę w obronie przed RFTpełni dysmutaza nadtlenkowa oraz katalaza. Dysmutazanadtlenkowa przekształca anionorodnik nadtlenkowy donadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru z kolei jest rozkładanyprzez katalazę do wody i tlenu. [3]Właściwości antyoksydacyjne związków mogą wiązaćsię z aktywacją enzymów unieszkodliwiających RFT,np. dysmutazy nadtlenkowej czy katalazy. [4] Jednąz najliczniejszych przebadanych grup związków, pochodzeniaroślinnego o właściwościach antyoksydacyjnych, są pochodneksantonu. [5]Celem badań było określenie wpływu wybranych pochodnychksantonu na układ antyoksydacyjny osób zdrowychoraz chorych z cukrzycą. Przesłanką do przeprowadzeniaw/w badań był fakt, iż pochodne ksantonu należą dozwiązków o szerokim spektrum aktywności, obejmującymm.in. działanie przeciwalergiczne, przeciwzapalne, przeciwpłytkowe.Materiał i metodykaMateriał do badań stanowiły próbki krwi żylnej pobranejna czczo, od pacjentów Kliniki Geriatrii Collegium MedicumUJ w Krakowie. 64 hemolizaty krwinek czerwonychpochodziły od chorych z cukrzycą. 62 próbki pochodząceod osób zdrowych, dobranych pod względem płci i wieku,stanowiły kontrolę do badań. 1,0 ml krwi inkubowano z 0,1ml badanych związków (H-1/05, H-2/05) lub wzorcowegoantyoksydanta (Resweratrol, Trolox), w stężeniach 10 -5 ,10 -6 , 10 -7 oraz 10 -8 mol/L.Przygotowano hemolizaty krwinek czerwonych, w którychoznaczono aktywność katalazy (CAT) metodą wg Aebi[10] i dysmutazy nadtlekowej (SOD) metodą wg Misrai Fridovich. [11] Uzyskane wyniki wyrażono w procentach,przyjmując aktywności SOD i CAT w próbkach bez badanychzwiązków, jako 100%.Rys.1. Wpływ badanych związków oraz wzorcowych antyoksydantówna aktywność katalazy (CAT).Po lewej stronie ryciny 1 i 2 zebrano wpływ związków naaktywność enzymów antyoksydacyjnych w grupie osóbchorych, natomiast po prawej stronie wpływ związkóww grupie osób zdrowych. Na osi X pokazano wartości stężeńmolowych związków, a na osi Y procent zmiany aktywnościenzymu antyoksydacyjnego, przy czym za 100% przyjętoaktywność enzymu w hemolizacie przed inkubacją z związkiemw danym stężeniu. Linie środkowe dotyczą wartościmediany, ramka – wartości 25 i 75 kwartyla a wąsy pokazująminimum i maksimum zmiany aktywności CAT lub SOD.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Rys.2. Wpływ badanych związków oraz wzorcowych antyoksydantówna aktywność dysmutazy ponadtlenkowej(SOD)FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy33

Badane związkiPiśmiennictwoNr 6 / 2008W pracy zbadano wpływ pochodnych ksantonu [H-1/05 =1-(2-metoksyfenylo)-piperazyny oraz H-2/05 = 2-amino-2--metylopropanolu] zsyntetyzowanych w Katedrze Technologiii Biotechnologii Środków Leczniczych CMUJ w Krakowie,wykazujących działanie hipotensyjne oraz przeciwarytmiczne.Właściwości antyoksydacyjne badanych związków porównanoz właściwościami związków będących wzorcowymi antyoksydantamitj.: Troloxem i Resveratrolem. (Sigma-Aldrich).Wyniki i DyskusjaWyniki wpływu pochodnych ksantonowych oraz wzorcowychzwiązków antyoksydacyjnych na aktywność enzymówantyoksydacyjnych przedstawiono na rycinach 1 i 2.Pochodne ksantonu (H-1/05 i H–2/05) zwiększyły aktywnośćkatalazy w grupie osób chorych. Odnotowano bliskodwukrotny wzrost aktywności tego enzymu. Okazało się,że związki te były równie skuteczne jak Trolox, ale niezwiększyły aktywności CAT w większym stopniu, niż Resweratrol.Związek H-1/05 oraz H-2/05 posiadały przeciwnywpływ na aktywność drugiego enzymu antyoksydacyjnego.Działanie aktywujące SOD zaobserwowano w grupie osóbzdrowych, a nie stwierdzono go u chorych, w krwi, którychaktywność enzymu spadła nawet o 45 %. Wpływ pochodnychksantonu na aktywność SOD był podobny do działaniawzorcowych antyoksydantów.WniosekPochodne ksantonu znamiennie zwiększają aktywnośćenzymów antyoksydacyjnych: SOD w materiale od osóbzdrowych a CAT u osób chorych na cukrzycę. Pochodneksantonu posiadają zbliżoną aktywność antyoksydacyjnąz wzorcowymi antyoksydantami.1. Niedowicz DM, Daleke DL, The role of oxidative stressin diabetic complications, Cell Biochem. Biophys., 2005,43, 289-330.2. Opara EC, Role of oxidative stress in the etiology of type2 diabetes and the effect of antioxidant supplementationon glycemic control, J. Investig. Med., 2004, 52, 19-23.3. Halliwell B, Gutteridge JMC, Free radicals in biologyand medicine, Oxford University Press, London, 2000.4. O’Kezie IA, Characterization of drugs as antioxidantprophylactics. Free Radical Biology & Medicine, 1996,20, 675-705.5. Hong-Yu Zhang, Da-Peng Yang, Guang-Yan Tang, Multipotentantioxidants: from screenings to design. DrugDiscovery Today, 2006, 11, 749-754.6. Gonzales Alvarez R., Kazimierczak W, Antiallergic actionof disodium cromoglycate and xanthone RS 7540,Arch. Immunol. Ther. Exp., 1982, 30, 333-339.7. Atwell GJ i wsp., Potential antitumor agents. Relationshipsbetween structure and in vivo colon activity for5-substituted 9-oxoxanthene-4-acetic acids, J. Med.Chem., 1990, 33, 1375-1379.8. Chiarini A, i wsp., Negative inotropic and chronotropicactivity of calcium channel ligands possessing a xanthone1,4-dihydropyridine backbone, Arzneim-Forsch(Drug Res.) 1992, 42, 797-801.9. Lin CN, i wsp., Synthesis and antithrombotic effect ofxanthone derivatives, J. Pharm. Pharmacol., 1996, 48,887-90.10. Aebi HE, Catalase, Methods of enzymatic analysis, VerlagChemie, Berlin, 1983, 3, 273-273.11. Misra HP, Fridovich I, The role of superoxide anionin the autooxidation of epinephrine and a simple assayfor superoxide dismutase, J Biol Chem, 1972, 247,3170-3175.34 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Wpływ substancji powierzchniowo czynnychna dostępność farmaceutyczną kserożeli z prednizolonemThe influence of tensides on prednisolone pharmaceutical availabilityfrom xerogelsdr n farm Maria Szcześniak,Prof. dr hab. Janusz PlutaKatedra i Zakład Technologii Postaci leku, Akademia Medyczna, WrocławKierownik: Prof. dr hab. Janusz PlutaStreszczenieW badaniach wpływu substancji powierzchniowo czynnycho zróżnicowanej wartości HLB na dostępność farmaceutycznąprednizolonu z kserożeli otrzymywanychz żeli zawierających 4% metylocelulozy, 10% glikolupropylenowego-1,2 i 10% dimetyloacetamidu stwierdzonozróżnicowanie czasów półuwalniania w zależnościod zastosowanego związku powierzchniowo czynnegooraz jego stężenia.Zastosowanie 3% polisorbatu 81 o HLB 10 oraz polisorbatu21 o HLB 13,3 wpływa na skrócenie czasu półuwalniania,natomiast przy 1 i 2% stwierdzono ich wydłużenie.Polisorbat 20 o HLB 16,7 wpływa na przedłużenieprocesu uwalniania w każdym badanym przypadku.Słowa kluczoweprednizolon, kserożel, dostępność farmaceutyczna, substancjepowierzchniowo czynneSummaryIn studies on the influence of tensides with differentiatedvalue of HLB on pharmaceutical accessibility ofprednisolone from xerogels obtained from gels with4% methylcellulose, 10% propylene glycol-1,2 and10%dimethylacetamide affirmed that the half-releasetimes were shortened depending on used tenside and itsconcentration.Using 3% polysorbate 81 with HLB 10 as well as polysorbate21 with HLB 13,3 influences an half-releasetimes shortening, however at 1 and 2% affirmed half--release times extension.Polysorbate 20 with HLB 16,7 influences at release processextending on every researched case.Key wordsprednisolone, xerogels, pharmaceutical availability, polysorbates1. WstępŻele hydrofilowe znajdują szerokie zastosowanie jakonośniki wielu substancji leczniczych ze względu na właściwościtj. usieciowana struktura i podobieństwo do żywychtkanek ustroju [1-2]. Biokompatybilność żeli wynikaz dużej zawartości w nich wody i elastyczności co prowadzido korzystniejszego oddziaływania na skórę i ograniczawystępowanie podrażnień [3 ]. Możliwość modyfikowaniabudowy i właściwości żeli jest wykorzystywana do produkcjileków podawanych nie tylko na skórę ale także do oczu[4], doustnie [5], doodbytniczo [6], dopochwowo [7] orazw systemach uwalniających lek w żołądku czy jelitach [8]oraz podskórnie [9].Hydrożele wpływają korzystnie na proces uwalnianiawielu substancji leczniczych [10-12]. Ich zaletą jest możliwośćsterowania dostępnością farmaceutyczną substancjicopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073leczniczych przez zastosowanie związków powierzchniowoczynnych [13-14 ].Celem pracy były badania wpływu wybranych substancjipowierzchniowo czynnych o różnych wartościach HLBna dostępność farmaceutyczną prednizolonu z kserożeluotrzymanego z hydrożelu z metylocelulozy.2. Materiał i metody2.1.MATERIAŁMetyloceluloza ( Sigma-Aldrich Gmbh Niemcy), polisorbat20, 21, 81( Sigma-Aldrich Gmbh Niemcy), N,N-dimethylacetamide( Sigma-Aldrich Gmbh Niemcy), glikol propylenowy-1,2(Sigma-Aldrich Gmbh Niemcy), prednizolon( Polfa Pabianice, Polska), woda oczyszczona przygotowanazgodnie z wymogami FP VI.FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy35

S y m b o lkserożeluP[%]MC[%]GP[%]DMA[%]T 20[%]T 21[%]T 81[%]Aqua[%]T 50%Nr 6 / 200810% GP 0,5 4 10 10 75,5 8,9 0,99301% T20 0,5 4 10 10 1 74,5 11,6 0,99282% T20 0,5 4 10 10 2 73,5 13,9 0,99543% T20 0,5 4 10 10 3 72,5 20,6 0,99151% T21 0,5 4 10 10 1 74,5 5,9 0,99662% T21 0,5 4 10 10 2 73,5 7,9 0,99193% T21 0,5 4 10 10 3 72,5 8,9 0,99841% T81 0,5 4 10 10 1 74,5 11,5 0,99442% T81 0,5 4 10 10 2 73,5 13,3 0,99683% T81 0,5 4 10 10 3 72,5 6,7 0,9976P-prednizolon, MC-metyloceluloza, GP-glikol propylenowy 1,2, DMA-dimetyloacetamid,T 20-Tween 20, T 21-Tween 21, T 81-Tween 81, T50%-czas półuwalniania, r- współczynnik korelacjiTab. I Skład ilościowy i jakościowy badanych żeli i czasy półuwalniania prednizolonu z kserożelir2.2. PRZYGOTOWYWANIE KSEROŻELIŻele z metyloceulozy o stężeniu 4% zawierające prednizolonprzyrządzono ex tempore przez zmieszanie stałychi płynnych składników w zamkniętym pojemniku [15].Skład ilościowy badanych żeli przedstawiono w tabeli 1.Metylocelulozę zmieszano z substancją leczniczą. W osobnympojemniku zmieszano glikol propylenowy-1,2, dimetyloacetamid,zmienne ilości polisorbatu 20, 21 lub 81 i wodędestylowaną. Żele przygotowywano przez rozsypaniemieszaniny proszków na powierzchnię płynu, a następniemieszanie przez 2 min w zamkniętym pojemniku do uzyskaniajednorodnej konsystencji. W celu otrzymania kserożelunanoszono żel na płytkę szklaną pokrytą roztworem1% wosku w chloroformie i pozostawiano do odparowaniarozpuszczalnika2.3 BADANIE DYFUZJI RÓWNOWAGOWEJPREDNIZOLONUProces dyfuzji równowagowej przeprowadzono w komorzedyfuzyjnej.W tym celu do komory donorowej i akceptorowej przedzielonychbłoną półprzepuszczalną wprowadzano odpowiedniroztwór badany i wodę destylowaną. Całość następniewytrząsano. Próby do badań pobierano równocześniez obu komór w ciągu 5 godz. w odstępach jednogodzinnychoraz po 24 h i 48 h po których stwierdzono stan równowagi.3. Wyniki i dyskusjaProces uwalniania z badanych kserożeli zawierającychprednizolon analizowano zgodnie z procesem kinetycznympierwszego rzędu. Log pozostałości substancji leczniczejdla wybranego preparatu przedstawiono jako funkcjęczasu t (ryc.1).Na podstawie uzyskanych wyników pomiarów wyznaczonostałe szybkości uwalniania oraz czasy półuwalniania,które w zależności od składu zestawiono w tab 1. Szybkośćuwalniania prednizolonu z badanych kserożeli porównywanoz preparatem odniesienia nie zawierającym dodatkupolisorbatów.Jak wynika z tabeli czas półuwalniania dla kserożeluodniesienia wynosi 8,9 h. W porównaniu z tym preparatemw obecności 1 i 2 % dodatku polisorbatu 81 stwierdzonoprzedłużenie czasu póluwalniania odpowiednio od11,5 h do 13,3 h, natomiast przy 3% skrócenie do 6,7 h.Dodatek 1% do 3% polisorbatu 20 wpływa w każdymbadanym przypadku na przedłużenie czasów półuwalniania,które wynoszą odpowiednio od 11,6 h do 20,6. h.2.4. BADANIE DOSTĘPNOŚCI FARMACEUTYCZ-NEJ PREDNIZOLONU Z KSEROŻELUProces uwalniania prednizolonu z podłoży kserożelowychprzeprowadzono metodą opartą na dyfuzji substancjileczniczej przez błonę półprzepuszczalną [15].2.5. ILOŚCIOWE OZNACZANIE PREDNIZOLONUPrednizolon oznaczano metodą spektrofotometryczną wgFarmakopei Polskiej VI przy długości fali 248 nm i użyciuspektrofotometru CECIL INSTRUMENTS CE 5501.36 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyRyc.1 Wpływ 3 % polisorbatu 20, 21 i 81 na kinetykę uwalnianiaprednizolonu z kserożelicopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008P[%]T 20[%]T 21[%]T 81[%]Zawartość prednizolonu [%]KomoradonorowaKomoraakceptorowa0,5 49,56 49,10 0,99950,5 1 74,13 25,68 0,99200,5 3 75,75 24,06 0,99530,5 1 64,48 35,14 0,99120,5 3 66,38 33,62 0,99280,5 1 75,67 24,09 0,99530,5 3 64,63 34,56 0,9962P-prednizolon, T 20 -Tween 20, T 21 -Tween 21, T 81-Tween 81, r - współczynnik korelacjiTab. II Badanie stanu równowagi stężeń prednizolonu w obecności polisorbatów w komorze dyfuzyjnejrPrzy zastosowaniu polisorbatu 21 stwierdzono że1 i 2 % stężenie związku powierzchniowo czynnego wpływana przyśpieszenie procesu uwalniania o czym świadczączasy półuwalniania, które wynoszą odpowiednio od 5,9h do 7,9 h, natomiast 3% dodatek nie wpływa istotnie naten proces.Badanie stanu równowagi dyfuzyjnej przeprowadzonowedług metody opisanej w punkcie 2.3 dla roztworuwolnego prednizolonu oraz w obecności polisorbatów. Napodstawie wyników pomiarów przedstawionych w tabeli 2stwierdzono ustalenie się stanu równowagi stężeń pomiędzykomorą donorową i akceptorową. Stężenie wolnego prednizolonuw badanym zakresie czasu wynosi w tych komorachodpowiednio 49,56 % i 49,10%. Stężenie równowagowew obecności 1% polisorbatu 20 ustaliło się na poziomie74,12% w komorze donorowej i 25,68 % w akceptorowej.Podobne zależności stwierdzono w pozostałych badanychprzypadkach. Z wynikami pomiarów stanu równowagi stężeńkoreluje proces uwalniania z kserożeli. Im niższe stężeniewolnego prednizolonu w komorze akceptorowej tymobserwuje dłuższy czas póluwalniania.Dodatek substancji powierzchniowo czynnych do żeliz których otrzymywano następnie kserożele wpływa istotniena uwalnianie substancji leczniczej. Zmiany czasów połowicznegouwalniania prednizolonu z kserożeli w zależności od rodzajui stężenia substancji powierzchniowo czynnych sugerujeistnienie zjawisk micelarnych. Część prednizolonu związanajest w micelach, które stanowią rezerwuar substancji leczniczeji pozostają w równowadze z wolną substancją. Ubytek stężeniasubstancji leczniczej w wyniku uwalniania z kserożelu jestwyrównywany przez dyfuzję z miceli do żelu.Zróżnicowanie czasów półuwalniania w zależności odskładu kserożelu daje możliwość doboru optymalnego stężeniawolnej substancji leczniczej będącej w kontakcie zeskórą, co pozwala na zmniejszenie jej niekorzystnego oddziaływania.Piśmiennictwo[1] Peppas N.A, Bures P,Leobandung W, Ichikawa H.: Hydrogelsin pharmaceutical formulations. Eur J PharmBiopharm 2000,50,27-46[2] Byrne M.E, Park K, Peppas N.A.: Molecular imprintingwithin hydrogels. Adv Drug Deliv Rev2002,54,149-161copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073[3] Bowszyc J., Bowszyc-Dmochowska M.: Clinical studyprednisolone-gel 0,5%. Post. Dermatol. 1991,8:121-128[4] Sikora A., Leszczyńska-Bakal H.: Hydrożele--nowoczesne postaci leków oftalmicznych Farm.Pol.2002,58,214-218[5] Di Colo G, Baggiani A., Mellico G., Cepgi M., SerafiniM.F.: A new hydrogels for the extended and completeprednisolone release in the G I tract. I J Pharm 2006,310,154-161[6] Miyazaki S., Suisha F., Kawasami N., Shirakawa M.,Yamatoya K., Attwood D. Thermally reversible xyloglucangels as vehicles for rectal drug delivery J. Contr. Rel.1998, 56,75-83[7] Mandal Tarun K. Swelling- controlled release system forthe vaginal delivery of miclonazole Eur. J. Pharm. Biopharm.2000, 50, 337-343[8] Nakumura K., Murray R.J., Joseph J. I., Peppas N.A.,Morishita M., Lowman A.: Oral insulin delivey usingP(MAA-g-EG) hydrogels: effects of network morphologyon insulin delivery characteristics. J.Contr.Rel. 2004,95,589-599[9] Fan H., Dash A. K. : Effect of cross – linking on thein vitro release kinetics of doxorubicin from gelatin implants.I. J. pharm. 2001,213, 103-116[10] Samczewska G, Zgoda M.M, Bodek K.H.:A comparativestudy of pharmaceutical availability of morphinehydrochloride and morphine sulphate from hydrogelsused for external use in palliative care. Farm Pol 2005,61, 481-487[11] Sen M, Yakar A.: Controlled release of antifungal drugterbinafine hydrochloride from poly(N-vinyl 2 –pyrrolidone/itaconic acid) hydrogels. Int J Pharm 2001,28,33-41[12] Kołodziejczyk M.K.: The subject of investigations wasthe evaluation of the pharmaceutical availability of naproxencholine salt from a pharmaceutical agent of hydrogeltype in in vitro conditions. Farm Pol 2004, 60,442-450[13] Kubis A.A, Musiał W, Szcześniak M.: Influence ofsome polysorbates on hydrocortisone release from hydrophilicgels considered as two compartment models.Pharmazie 2002, 57,479-481[14] Szcześniak M., Kubis A.A.: Influence of tensides onthe release of medical agents from hydrophilic gels.Pharmazie 2004, 59,198-199[15] Kubis A.A, Szcześniak M.: The influence of hydrophilizingagents on gel formation rate of cellulose derivatives.Part 1. Influence of 1,2-propylene glycol onhomogeneity of methyl cellulose gel. Pharmazie 1992,47,362-364FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy37

Wydalanie glikozoaminoglikanów z moczemw przebiegu procesu starzenia się ustrojuUrinary excretion of glycosaminoglycans in the course of physiological agingmgr Anna Szeremeta,dr n. farm. Andrzej Głowacki,Prof. dr hab. n. med. Krystyna OlczykKatedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki LaboratoryjnejWydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachKierownik Katedry:Prof. dr hab. n. med. Krystyna OlczykStreszczenieStarzenie się jest procesem fizjologicznym, charakteryzującymsię szeregiem zmian molekularnych i funkcjonalnych,obejmujących zarówno komórki, jak i komponentymacierzy pozakomórkowej. Wykazano, iż wrazz wiekiem dochodzi do redukcji całkowitej zawartościglikozoaminoglikanów (GAG) – siarczanowanych heteropolisacharydówwspółtworzących proteoglikany –w tkankach i narządach. Wyrazem zachodzących wrazz wiekiem zmian ilościowych GAG w tkankach możebyć wielkość wydalania tych związków z moczem.Z uwagi na coraz większe znaczenie – w diagnostycelicznych schorzeń, w tym mukopolisacharydoz czy kłębuszkowegozapalenia nerek – oceny stężenia poszczególnychfrakcji GAG w moczu, za cel niniejszej pracyprzyjęto ocenę ewentualnego wpływu procesu starzeniasię ustroju na wydalanie GAG w moczu 71 osób zdrowych,obojga płci, w zakresie wieku od 16 do 62 rokużycia.Oceny stężenia GAG w moczu dokonano za pomocązestawu diagnostycznego Blyscan (Biocolor Ltd., Ireland).Stwierdzono, iż wraz z wiekiem wydalanie glikozoaminoglikanówz moczem ulega obniżeniu. Zaobserwowanezjawisko stanowi wyraz postępującej w przebiegustarzenia się ustroju przebudowy składników macierzypozakomórkowej tkanek, w tym proteoglikanów/ glikozoaminoglikanów.AbstractPhysiological aging includes molecular and functionalchanges of both cells and extracellular matrix components.It is generally accepted that in tissues and organsthe total content of glycosaminoglycans (GAG) – sulfatedheteropolysaccharide components of proteoglycans,decreases during the aging process. The quantitativechanges of GAG in tissues with advancing ageshould be at least in part reflected in urinary excretionof the mentioned components. Since GAG attracts theincreasing attention in laboratory diagnostics of manydiseases, for example mucopolysaccharides or glomeluronephritis,the aim of the study was to evaluate theglycosaminoglycan urinary excretion in the course ofphysiological aging. Study was carried out on 71 healthyindividuals, of both sex, aged from 16 to 62 years.GAG concentration was assayed by the Blyscan diagnostickit (Biocolor Ltd., Ireland).It was found that urinary GAG excretion decreases withage. This phenomenon may result from age related remodelingof extracellular matrix components includingproteoglycans/glycosaminoglycans.Key words: ageing process, glycosaminoglycans, urineSłowa kluczowe: starzenie ustroju, glikozoaminoglikany,mocz38 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008WstępStarzenie się to złożony, wieloczynnikowy proces, charakteryzującysię szeregiem zmian molekularnych i funkcjonalnych,postępujących z upływem czasu i zachodzących nawszystkich poziomach organizacji biologicznej organizmu,obejmujących struktury subkomórkowe, komórki, tkankii narządy [1, 2, 3]. Zachodząca z wiekiem przebudowa macierzypozakomórkowej (ECM) obejmuje zarówno zawartew niej białka włókniste, jak kolagen czy elastyna, glikoproteinyniekolagenowe, w tym proteoglikany (PG) oraz ichheteropolisacharydowe łańcuchy glikozoaminoglikanowe[3, 4, 5].Glikozoaminoglikany – to liniowe, nierozgałęzione heteropolisacharydy,zbudowane z powtarzających się disacharydowychjednostek, złożonych z reszt N-acetylowanejD-galaktozoaminy lub D-glukozoaminy albo z reszt N--siarczanowanej D-glukozoaminy oraz z reszt kwasu D-glukuronowegoi/lub L-iduronowego, bądź reszt galaktozy [6,7].W tkankach i płynach ustrojowych ssaków występujesiedem typów GAG. Są to kwas hialuronowy (HA), chondroityno-4-siarczany(Ch-4-S), chondroityno-6-siarczany(Ch-6-S), siarczany dermatanu (DS), siarczany keratanu(KS), heparyny (Hep) i siarczany heparanu (HS) [6, 8, 9].W „starzejącym” się organizmie GAG podlegają zarównozmianom ilościowym, jak i jakościowym, zależnym odrodzaju tkanki – w której występują, oraz od rodzaju glikanu[10].Wyrazem modyfikacji biochemicznych, obejmującychglikozoaminoglikany tkankowe, w tym m.in. GAG obecnychw PG błony podstawnej kłębuszków nerkowych, możebyć wielkość wydalania tych związków z moczem. Na ilośćposzczególnych GAG wydalanych z moczem mają wpływzarówno czynniki fizjologiczne, jaki patologiczne [11, 12, 13, 14].W diagnostyce licznych schorzeń,w tym mukopolisacharydozi mukolipidoz [9], czy też w kłębuszkowymzapaleniu nerek [15]bądź kamicy nerkowej [12, 14],coraz większe znaczenie wydajesię mieć oznaczanie stężeniaGAG w moczu [9]. Z drugiej strony,zmieniające się wydalanie tychzwiązków wraz z wiekiem, winnobyć brane pod uwagę przy interpretacjiwyników wspomnianychoznaczeń. Stąd też, za cel niniejszejpracy przyjęto ilościową ocenęzawartości glikozoaminoglikanówmoczu osób zdrowych, w przebiegufizjologicznego procesu starzeniasię ustroju.Materiał do badańMateriał do badań stanowiłypróbki porannego moczu 71 zdrowychosób, w tym 47 kobiet i 24copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073mężczyzn, u których wartości rutynowo oznaczanych parametrówhematologicznych we krwi (liczba erytrocytów, leukocytówi trombocytów, stężenie hemoglobiny oraz wartościOB i hematokrytu) i biochemicznych w osoczu (stężenieglukozy, białka całkowitego, cholesterolu, triacyloglicerolioraz aktywność amylazy) oraz parametry badania ogólnegomoczu, nie odbiegały od wartości referencyjnych. Uzyskanymateriał biologiczny podzielono na sześć grup, odpowiadającychkolejnym dekadom życia, obejmującym lata: 11 – 20lat (druga dekada, n = 3), 21 – 30 lat (trzecia dekada, n =18), 31 – 40 lat (czwarta dekada, n = 14), 41 – 50 lat (piątadekada, n = 19), 51 – 60 lat (szósta dekada, n = 14), 61 – 70lat (siódma dekada, n = 3).Na przeprowadzenie badań stanowiących przedmiot niniejszejpracy wyraziła zgodę Komisja Bioetyczna ŚląskiegoUniwersytetu Medycznego w Katowicach.MetodykaStężenie glikozoaminoglikanów we wszystkich próbkachmoczu, oznaczono na podstawie reakcji tych związkówz błękitem 1,9-dimetylenowym (DMB), przy wykorzystaniuzestawu odczynnikowego Blyscan (Biocolor Ltd., Ireland)[16].Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej, obejmującejeliminację wyników wątpliwych, badanie normalnościrozkładu wyników, wyznaczanie średnich arytmetycznych,wariancji i odchyleń standardowych, sprawdzanierówności wariancji oraz testowanie istotności różnic międzyśrednimi, poprzez jednoczynnikową analizę wariancji.Wspomnianą analizę statystyczną prowadzono za pomocąmodułu statystycznego programu Microsoft Excel.Ryc. 1. Stężenie glikozoaminoglikanów moczu osób zdrowych w kolejnych dekadachżycia (wartości średnie ± SD).U osób obojga płci, statystycznie istotne różnice w wydalaniu GAG wykazano wyłącznie pomiędzyosobami z III i IV (1), IV i V (2) oraz IV i VI (3) dekady życia,a – różnica statystycznie istotna (p < 0,05) pomiędzy średnimi stężeniami glikozoaminoglikanóww moczu kobiet i w moczu mężczyzn w obrębie IV dekady życia,* – nie porównywano wartości stężeń GAG pomiędzy grupą kobiet i grupą mężczyzn ze względuna małą liczbę osób w grupie kobiet i/lub grupie mężczyznFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy39

WynikiW wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, iżwydalanie glikozoaminoglikanów z moczem zmienia sięz upływem lat. Wydalanie tych związków wzrasta u osóbobojga płci w czasie od II do IV dekady życia, po czymstopniowo obniża się, aby osiągnąć minimalne wartościw szóstej dekadzie życia [ryc. 1]. W czwartej dekadzie życiazaobserwowano największe wydalanie GAG z moczemu obu płci jednocześnie, przy czym w przypadku mężczyznśrednie stężenie GAG w moczu przewyższało prawie dwukrotnieśrednią wartość GAG w moczu kobiet i wynosiło12,78 mg/l, a stwierdzona różnica w wydalaniu omawianychmakrocząsteczek była statystycznie istotna. Ponadto,u osób obojga płci, statystycznie istotne różnice w wydalaniuGAG wykazano wyłącznie pomiędzy osobami z III i IV,IV i V oraz IV i VI dekady życia.DyskusjaZ procesem starzenia związane są – nie w pełni jeszczepoznane – ilościowe i jakościowe zmiany metabolizmu glikozoaminoglikanówmacierzy pozakomórkowej. Jak wynikaz dotychczasowych badań, w przebiegu fizjologicznegostarzenia się ustroju dochodzi do redukcji całkowitej zawartościglikozoaminoglikanów w większości tkanek i narządów,m.in.: w skórze [17], twardówce [18, 19], chrząstcestawowej [20], krążkach międzykręgowych [21, 22], ścięgnach[10], błonie podstawnej nerek [23, 24] oraz w ścianieaorty [25]. Wyrazem zachodzących z wiekiem, ilościowychzmian GAG w tkankach jest stężenie tych związków w osoczu[26], po czym – wielkość wydalania wraz z moczem.Przeprowadzona w niniejszej pracy ocena całkowitegostężenia glikozoaminoglikanów w moczu wykazała, iżu osób po 40 roku życia, stężenie omawianych związkóww moczu ulega sukcesywnemu obniżeniu. Wyniki niniejszejpracy w znacznym stopniu korespondują z rezultatamibadań Poulsena [27], który wykazał zmniejszające się wrazz wiekiem wydalanie glikozoaminoglikanów, stwierdzającjednocześnie maksymalne wydalanie tych związków u osóbw drugiej dekadzie życia. Natomiast, Lee i wsp. [28] wykazalistatystycznie istotny wzrost wydalania GAG wyłącznieu osób w wieku 10-19 lat, w stosunku do stałego stężeniaGAG w moczu osób z pozostałych grup wiekowych.Z kolei, Michelacci i wsp. [29] oraz Manley i wsp. [30]wykazali największe wydalanie GAG u dzieci oraz niestwierdzili – zachodzących wraz z wiekiem – zmian stężeniaomawianych glikanów w moczu osób dorosłych.Zastosowany w niniejszej pracy, w badaniach Poulsena[27] oraz w badaniach Lee i wsp. [28], podział materiałubadawczego na kilka grup wiekowych wydaje się lepiejodzwierciedlać zmiany metabolizmu „starzejącego się” organizmu,niż zastosowany w pracach Michelacciego i wsp.[29] oraz Manleya i wsp. [30] podział materiału badawczegotylko na grupę dzieci i grupę osób dorosłych.Obserwowane w niniejszej pracy, zmniejszające się wrazz wiekiem wydalanie GAG z moczem może wynikać z kilkuprzyczyn. Pierwszą z nich należy upatrywać w zachodzącejwraz z wiekiem modyfikacji biosyntezy PG/GAG macierzypozakomórkowej tkanek.40 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyNr 6 / 2008W tkance chrzęstnej wykazano bowiem, zmniejszającąsię wraz z wiekiem biosyntezę siarczanowanych GAGwspółtworzących PG chrząstki [31]. Vuillermoz i wsp. [32]opisali także – postępujące wraz z wiekiem – obniżenie ekspresjimałych proteoglikanów bogatoleucynowych (SLRP)w ludzkiej skórze. Stwierdzono zmniejszającą się w miaręupływu lat ekspresję genów kodujących białka rdzenioweproteoglikanów heparanosiarczanowych (HSPG), w tymglipikanów [33, 34].Zmniejszająca się wraz z wiekiem zawartość PG/GAGw tkankach zależna jest – poza modyfikacją ich biosyntezy– także i od nasilenia postsyntetycznej modyfikacji tychzwiązków, obejmującej m.in. proteolityczną i wolnorodnikowądegradację [3].Zasadniczą rolę w procesie degradacji składników macierzypozakomórkowej odgrywają – trawiące białka rdzenioweproteoglikanów – metaloproteinazy (MMP) [35]. W komórkachskóry osób starszych wykryto wzmożoną ekspresjęmetaloproteinazy drugiej (MMP-2) degradującej składnikiECM, w tym m.in. białka rdzeniowe agrekanów [36]. Ponadto,Ashcroft i wsp. [36] wykazali w ludzkiej skórze obniżającysię wraz z wiekiem poziom mRNA tkankowych inhibitorówmetaloproteinaz (TIMP), w tym TIMP-1 i TIMP-2.W procesie starzenia dochodzi także do zaburzenia równowagiprooksydacyjno-antyoksydacyjnej ustroju, co przejawiasię nadmiernym wytwarzaniem reaktywnych form tlenu(RFT), a jednocześnie upośledzeniem aktywności systemuantyoksydacyjnego, eliminującego te reaktywne cząsteczki[37, 38]. Niekontrolowany wzrost stężeń RFT pełni rolę aktywatoraczynników transkrypcyjnych [38, 39], w tym m.in.jądrowego czynnika κB (NF-κB) [39], który z kolei pobudzaekspresję genów kodujących MMP. Ponadto, wymienionyczynnik jądrowy może indukować ekspresję cytokin prozapalnych,w tym interleukiny 1 (IL-1), IL-6, IL-8 oraz czynnikamartwicy nowotworów (TNF-α) – hamujących syntezękomponentów macierzy pozakomórkowej [39, 40, 41].Oprócz nasilonej aktywności wolnorodnikowej i proteolitycznej,w „starzejących się” tkankach, także reakcje glikacjiodgrywają istotną rolę w postsyntetycznej modyfikacjiskładników macierzy pozakomórkowej tkanek. Wspomnianereakcje prowadzą bowiem do tworzenia końcowych produktówprocesu glikacji – AGEs [4, 5, 42], które przyczyniająsię do modyfikacji struktury białek rdzeniowych PG orazobniżenia ich wrażliwości na proteolityczne działanie MMP[31]. Zmniejszona degradacja składników łącznotkankowychwiąże się ze zmniejszonym uwalnianiem łańcuchówGAG z tkanek i w konsekwencji z obniżeniem wydalaniatych związków z moczem.Z przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy badańwynika, iż w przebiegu fizjologicznego procesu starzeniasię organizmu dochodzi do zmniejszonego wydalania glikozoaminoglikanówz moczem, świadczącego o postępującejwraz z wiekiem, przebudowie macierzy pozakomórkowejtkanek organizmu.Z uwagi na fakt, że ilościowa ocena wydalania glikozoaminoglikanówz moczem znajduje coraz większe zastosowaniew diagnostyce wielu stanów chorobowych, uwzględnieniewpływu wieku na wydalanie GAG jest istotnymwarunkiem prawidłowej interpretacji oznaczeń tych glikanów.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008Piśmiennictwo1. Herman WA, Łącka K: Współczesne poglądy na etiopatogenezęprocesu starzenia. Pol Merk Lek 2005; 18: 96– 100.2. Weinert BT, Timiras PS: Physiology of aging. InvitedReview: Theories of aging. J Appl Physiol 2003; 95:1706 – 1716.3. Robert L: Cellular and molecular mechanisms of aging andage related diseases. Pathol Oncol Res 2000; 6: 3 – 9.4. Robert L: Mechanisms of aging of the extracellular matrix:role of the elastin-laminin receptor. Gerontology1998; 44: 307 – 317.5. Bailey AJ: Molecular mechanisms of ageing in connectivetissues. Mech Ageing Dev 2001; 122: 735 – 755.6. Taylor KR, Gallo RL: Glycosaminoglycans and theirproteoglycans: host-associated molecular patterns for initiationand modulation of inflammation. FASEB J 2006;20: 9 – 22.7. Głowacki A i wsp.: Glikozoaminoglikany – strukturai funkcja. Post Biochem 1995; 41: 139 – 148.8. Wład H: Glikozoaminoglikany surowicy i moczu i ichznaczenie w diagnostyce klinicznej. Pol Tyg Lek 1988;43: 1075 – 1077.9. Kazanowska – Bystryk I, Chlebuś D: Wydalanie glikozoaminoglikanów(GAG) z moczem – znaczenie diagnostyczne.Diagn Lab 2000; 36: 93 – 101.10. Sames K: The role of proteoglycans and glycosaminoglycansin aging. Karger, Basel – Hamburg 1994: str. 1– 103.11. Daroszewski J i wsp.: The use of glycosaminoglycanexcretion measurements in the assessment of the organiccomplications in acromegaly. Pol J Endocrinol, 2001;52, 347 – 352.12. Hesse A, Wuzel H, Vahlensieck W: Significance of glycosaminoglycansfor the formation of calcium oxalatestones. Am J Kidney Dis 1991; 17: 414 – 419.13. Maroclo MV i wsp.: Urinary glycosaminoglycan excretionduring the menstrual cycle in normal young women.J Urol 2005; 173: 1789 – 1792.14. Gohel MD i wsp.: Electrophoretic separation and characterizationof urinary glycosaminoglycans and theirroles in urolithiasis. Carbohydr Res 2007; 342: 79 – 86.15. Kazanowska – Bystryk I i wsp.: Zmiany w wydalaniuglikozoaminoglikanów w moczu u chorych z kłębuszkowymzapaleniem nerek. Diagn Lab 2007; 43: 537.16. Blyscan. Sulfated glycosaminoglycan assay. Manual.Biocolor Ltd, Ireland 1994.17. Carrino DA, Sorrell JM, Caplan AI: Age-related changesin the proteoglycans of human skin. Arch Biochem Biophys2000; 373: 91 – 101.18. Brown CT i wsp.: Age-related changes of scleral hydrationand sulfated glycosaminoglycans. Mech AgeingDev 1994; 77: 97 – 107.19. Rada JA i wsp.: Proteoglycan composition in the humansclera during growth and aging. Invest Ophthalmol VisSci 2000; 41: 1639 – 1648.20. Theocharis DA, Kalpaxis DL, Tsiganos CP: Cartilagekeratan sulphate: changes in chain length with ageing.Biochim Biophys Acta 1985; 841: 131 – 134.21. Olczyk K: Age-related changes in proteoglycans of humanintervertebral discs. Z Rheumatol 1994; 53: 19 – 25.22. Fortuniak J i wsp.: Rola glikozoaminoglikanów i proteoglikanóww procesie degeneracji krążków międzykręgowych.Neurol Neurochir Pol 2005; 39: 324 – 327.23. Cohen MP, Ku L: Age-related changes in sulfation ofbasement membrane glycosaminoglycans. Exp Gerontol1983; 18: 447 – 450.24. Martin JE, Sheaff MT: Renal ageing. J Pathol 2007; 211:198 – 205.25. Tovar AM i wsp.: Age-related changes in populations ofaortic glycosaminoglycans: species with low affinity forplasma low-density lipoproteins, and not species withhigh affinity, are preferentially affected. ArteriosclerThromb Vasc Biol 1998; 18: 604 – 614.26. Komosińska-Vassev K i wsp.: Age-related changes ofplasma glycosaminoglycans. Clin Chem Lab Med 2008;46: 219 – 224.27. Poulsen JH: Urine and tissue glycosaminoglycans andtheir interrelations. Dan Med Bull 1986; 33: 75 – 96.28. Lee i wsp.: Isolation, identification, and quantitation ofurinary glycosaminoglycans. Am J Nephrol 2003; 23:152 – 157.29. Michelacci Y, Glashan RQ, Schor N: Urinary of glycosaminoglycansin normal and stone forming subjects.Kidney Int 1989; 36: 1022 – 1028.30. Manley G, Severn M, Hawksworth J: Excretion patternsof glycosaminoglycans and glycoproteins in normal humanurine. J Clin Pathol 1968; 21: 339 – 345.31. DeGroot J i wsp.: Age-related decrease in susceptibilityof human articular cartilage to matrix metalloproteinase--mediated degradation. Arthritis Rheum 2001; 44: 2562– 2571.32. Vuillermoz B i wsp.: Influence of aging on glycosaminoglycansand small leucine – rich proteoglycans productionby skin fibroblasts. Mol Cell Biochem 2005;277: 63 –72.33. Fransson LA i wsp.: Novel aspects of glypican glycobiology.Cell Mol Life Sci 2004; 61: 1016 – 1024.34. Schwartz NB: Biosynthesis and regulation of expressionof proteoglycans. Front Biosci 2000; 5: 649 – 655.35. Verma RP, Hansch C: Matrix metalloproteinases(MMPs): chemical-biological functions and (Q)SARs.Bioorg Med Chem 2007; 15: 2223 – 2268.36. Ashcroft GS i wsp.: Age-related differences in the temporaland spatial regulation of matrix metalloproteinases(MMPs) in normal skin and acute cutaneous wounds ofhealthy humans. Cell Tissue Res 1997; 290: 581 – 591.37. Harman D: Free radical theory of aging: an update:increasing the functional life span. Ann N Y Acad Sci2006; 1067: 10 – 21.38. Bergamini CM i wsp.: oxygen, reactive oxygen speciesand tissue damage. Curr Pharm Des 2004; 10: 1611 –1626.39. Yu BP, Chung HY: Adaptive mechanisms to oxidativestress during aging. Mech Aging Rev 2006; 127: 436– 443.40. Maggio M i wsp.: Interleukin-6 in aging and chronic disease:a magnificent pathway. J Gerontol 2006; 61: 575– 584.41. Nietfeld JJ, Huber-Bruning O, Bylsma WJ: Cytokinesand proteoglycans. EXS 1994, 70: 215 – 242.42. Baynes JW: The role of AGEs in aging: causation or correlation.Exp Gerontol 2001; 36: 1527 – 1537.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy41

WYKORZYSTANIE WYBRANYCH GATUNKÓWWIELKOOWOCNIKOWYCH GRZYBÓWW ZWALCZANIU GRONKOWCÓW I PRĄTKÓW GRUŹLICYTHE APPLICATION OF SELECTED SPECIES OF LARGE FRUCTIFICATION FUNGIIN THE CONTROL OF STAPHYLOCOCCI AND KOCH’S BACILLIDr hab. prof. nadzw. Wanda Woźniak,mgr inż. Donata KędzierskaAkademia Rolnicza im A. Cieszkowskiego w Poznaniu,Instytut Technologii Żywności Pochodzenia RoślinnegoDyrektor Instytutu: prof. dr hab. Jan MichniewiczStreszczeniePrzeprowadzono badania nad wykorzystaniem wyciągówwodnych z wybranych grzybów do hamowaniawzrostu bakterii gronkowca złocistego Staphylococusaureus i wyizolowanych od chorych prątków gruźlicy.Założeniem pracy było przeprowadzenie badań nad wykorzystaniemgrzybów jako surowca wspomagającegoleczenie chorych. Grzyby wykorzystane w doświadczeniachto: boczniak ostrygowaty Pleurotus ostreatus(Jacq.) Kummer - uprawiany na trzech podłożach, tj.słoma pszenna, słoma pszenna z dodatkiem częścinadziemnych topinamburu Helianthus tuberisus, słomapszenna z dodatkiem części nadziemnej rdestowcaReynoutria, shiitake Lentinula edodes (Berck.) Singer;opieńka miodowa Armillaria mellea sensu lato (Vahl.in Fl. Dan.) P. Karst; wrośniak różnobarwny Trametesvesicolor; gąska zielona Tricholoma flavovirens (Pers.)Lund ex Nannf. Najintensywniejsze działanie wykazywałwyciąg z mrożonych grzybów boczniaka ostrygowategoz podłoża: słoma pszenna + topinambur lubsłoma pszenna + rdestowiec, najmniejsze działanie wykazywałazielonka. Całkowite hamowanie bakterii powodowałwyciąg wodny z 1 g mrożonych grzybów, tj.wynosiło 1,33*10 9 do 0,28*10 9 Staphylococus aureusoraz prątków gruźlicy 150*10 6 /ml.Słowa kluczowe: grzyby, hamowanie, gronkowiec,prątki gruźlicy42 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowySummaryStudies were conducted on the application of waterextracts of selected fungi to inhibit growth of bacterialcultures of Staphylococcus aureus and Koch’s bacilliisolated from tuberculosis patients. The assumption ofthis study was to conduct investigations on the applicationof fungi as a raw material assisting treatment ofpatients. Fungi included in the experiments were oystermushroom Pleurotus ostreatus (Jacq.) Kummer, grownon three substrates: wheat straw, wheat straw with anaddition of aboveground parts of Jerusalem artichokeHelianthus tuberisus, wheat straw with an addition ofaboveground parts of Japanese fleeceflower Reynoutria,shiitake Lentinula edodes (Berck) Singer; honey colourarmillaria Armillaria mellea sensu lato (Vahl. In Fl.Dan.) P. Kanst; common zoned polyporus Trametesversicolor; and firwood agaric Tricholoma flavovirens(Pers.) Lund ex Nannf. The most intensive action wasfound for extract from frozen oyster mushrooms fromthe substrate of wheat straw + Jerusalem artichoke orwheat straw + Japanese fleeceflower, while the leastintensive action was recorded for firwood agaric. Totalinhibition of bacteria by water extract from 1 g frozenmushrooms was 1.33*10 9 to 0.28*10 9 Staphylococcusaureus and 150*10 6 /ml Koch’s bacilli.Key words: mushrooms, growth inhibition, Staphylococcus,Koch’s bacillicopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008WSTĘPGrzyby od dawna budzą nasze zainteresowanie i to nietylko z powodu ich różnorodnego kształtu czy koloru, czyteż tajemniczego, nagłego pojawienia się w przyrodzie,ale przede wszystkim ze względu na ich właściwości, odtrujących do posiadających właściwości lecznicze. O właściwościachleczniczych grzybów dowiadujemy się już zestarożytnych manuskryptów. Badania w końcu XX wiekuznaczenie poszerzyły pogląd o właściwościach leczniczychgrzybów [1 - 10].Praca dotyczy badań nad hamowaniem wzrostu bakteriigronkowca Staphylococus aureus oraz wyizolowanych prątkówgruźlicy od osób chorych w wieku około 40 lat przezwybrane grzyby wielkoowocnikowe. Badania przeprowadzonow Akademii Rolniczej w Poznaniu oraz w WielkopolskimSpecjalistycznym Szpitalu Chorób Płuc i Gruźlicyw Chodzieży.MATERIAŁ I METODY BADAWCZESurowcem badawczym do zwalczania gronkowca i prątkówgruźlicy były wyciągi wodne z mrożonych lub suszonychowocników grzybów wybranych następujących gatunków:boczniak ostrygowaty, gąska żółta, opieńka miodowa,shiitake, wrośniak różnobarwny. Badano także właściwościlecznicze suszonych części nadziemnych = ziela rdestowcaReynoutria i topinamburu Helianthus tuberisus (ryc.1).Boczniak ostrygowaty Pleurotus ostreatus zebrany byłz upraw prowadzonych na trzech różnych podłożach: słomapszenna; słoma pszenna z dodatkiem części nadziemnychtopinamburu Helianthus tuberisus; słoma pszenna z dodatkiemczęści nadziemnej rdestowa Reynoutria. Z owocnikówprzygotowywano wyciągi wodne (w ilości 14-50 mg grzyba/ml),które dodawano do podłoży Chapmana z bakteriamigronkowca złocistego w ilości 0,5 w skali Mac Parlanda(schemat 1) albo plwociną prątków od osób chorych nagruźlicę do podłoża Lowensteina – Jensena do identyfikacjiprątków gruźlicy (schemat 2).copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Ustalono wpływ wybranych gatunków grzybów naczystych kulturach gronkowca oraz na kulturach prątkówgruźlicy pobranych od chorych. Przygotowanie materiałubadanego (wymaz z gardła) pobranego od pacjenta i identyfikacjabakterii gronkowca złocistego [10, 11]. Obserwowanodziałanie wyciągów z grzybów, dodając ich różne ilości(0,1 - 0,4 ml /10ml pożywki). Odczyty w wypadku działaniabakterii Staphylococus aureus obserwowano po inkubacjiw temperaturze 37°C po 24., 48. i 72h..Oznaczanie i identyfikacja prątków gruźlicy w plwocinie,przeprowadzono metodą ługową Petroffa [11]. Pierwszymetapem było przygotowanie plwociny, czyli homogenizacja,wirowanie i po kilkakrotnym przepłukaniu osadu wodą destylowanąprzygotowano zawiesinę (schemat 2), w którejznajdowało się 0,5 w skali Mac Farlanda prątków gruźlicy(150*10 6 bakterii / ml). Kolejnym etapem było posianie poszczególnychrozcieńczeń zawiesiny na podłoże Lowensteina– Jensena. Pierwsze dwie probówki stanowiły kontrolęwzorcową, gdzie dodano 0,05 ml zawiesiny prątkowej. Nakolejne probówki posiano następujące rozcieńczenia zawiesinyprątkowej: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 . Do każdej probówkidodano po 0,05 ml rozcieńczonej zawiesiny. Następnie dokażdej probówki z rozcieńczoną zawiesiną dodano 0,05 mlwyciągu z grzybów. Podłoża inkubowano w 37°C przezokres 3-10 tygodni. Do każdego posiewu używamy dwóchprobówek z pożywką Lowensteina – Jansena (ryc. 3).WYNIKI BADAŃ I ICH OMÓWIENIEZakażenie prątkiem gruźlicy jest jednym z najbardziejrozpowszechnionych zakażeń na świecie. Szacuje się, żena 5,2 mld. ludzi zamieszkujących kulę ziemską, ponad 1,7mld, to osoby zakażone prątkiem gruźlicy. Polska należy dokrajów, w których zapadalność na gruźlicę jest stosunkowowysoka. W ostatnich latach u blisko 16 000 osób stwierdzasię każdego roku zachorowanie na czynną gruźlicę.Leczenie gruźlicy w Polsce jest przymusowe. Normalizujeto ustawa z dnia 6 września 2001 r. o chorobach zakaźnychi zakażeniach.(Dz. U. z dnia 31 października 2001 r.) Polskieprawo nakazuje hospitalizację we wstępnym okresieleczenia choroby [13]. Do oznaczeń Staphylococus aureusi prątków gruźlicy wykorzystano metody stosowane w DiagnostycznymLaboratorium Szpitala Chorób Płuc i Gruźlicyw Chodzieży.Wyciągi grzybowe mogą być terapią wspomagającą leczeniegruźlicy, ponieważ chorzy na gruźlicę są coraz częściejodporni na preparaty farmaceutyczne. Wyniki badańnad hamowaniem wzrostu Staphylococus aureus przedstawionow tabelach I – III oraz przykładowy dokumentodczytu badań na ryc. 2. Gronkowiec złocisty dodany dopożywki Chapmana, był hamowany najbardziej przez boczniakaostrygowatego uprawianego na podłożu ze słomyi rdestowa lub z dodatkiem topinamburu w ilości 1:1. Dozahamowania ilości 150 x 10 6 /ml bakterii Staphylococusaureus wystarczał wyciąg z grzybów mrożonych w ilości3,3 mg/ ml.Boczniak uprawiany na podłożu konwencjonalnym używanymw Polsce posiadał zdecydowanie mniejsze właściwościhamowania bakterii. Aby osiągnąć wynik całkowitegozahamowania wzrostu należało użyć 4 krotnie więcej. Najmniejkorzystnie na hamowanie bakterii gronkowca złocistegowpływał wyciąg wodny z zielonki, następnie z opieńki.Nie hamowały bakterii natomiast składniki stosowane doprodukcji podłoża uprawnego dla boczniaka (słoma, rdestowieci topinambur).Oznaczanie i identyfikację prątków gruźlicy wykonanow plwocinie pobranej od hospitalizowanych chorych.O leczniczych właściwościach grzybów wiadomo od dawna.Można znaleźć informacje na temat zastosowania wyciągówjako preparatów eterowo-alkoholowych wyciągów, porozdziale chromatograficznym z opieńki miodowej do zwalczaniabakterii gronkowców i paciorkowców. Istnieje wieleinformacji na temat zastosowania boczniaka ostrygowategodo zwalczania wielu chorób. Badania prowadzone w latach1966-2000 przez badaczy Grzybka i Kohlmüncera na AkademiiMedycznej w Krakowie oraz w Akademii Medycznejw Łodzi (Lasota i Młodecki) prowadzone od szeregu lat nazwierzętach są tego dowodem [14]. W podobnym aspekcie,w jakim prowadzono badania w tej pracy nad wykorzystaniemgrzybów jako środka spożywczego nie spotkano w li-FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy43

Nr 6 / 20081. boczniak ostrygowaty ze środowiskanaturalnego2. boczniak ostrygowaty z podłożaz topinamburem3. boczniak ostrygowaty z podłożaz topinamburem4. boczniak ostrygowaty z podłożaz rdestowcem5. boczniak ostrygowaty z podłożaze słomy pszennej6. gąska żółta=zielonka Tricholomaflavovirens7. opieńka miodowa Armillariamellea8. Shiitake Lentinula edodes9. wrośniak różnobarwny TrametesversicolorRyc. 1. Surowce wykorzystane w badaniach10. rdestowiec sachaliński 11. rdestowiec ostrokończysty 12. część nadziemnatopinamburu44 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008teraturze dostępnej, stąd dyskusja jest uciążliwa. Napodstawie wyników uzyskanych w tej pracy (tabela5 i ryc.3) stwierdzono, że badania nad wykorzystaniemopieńki miodowej, wroślaka i boczniaka ostrygowategodo zwalczania prątków gruźlicy powinnybyć poszerzone. W doświadczeniach obserwowano,że wyciągi grzybowe jedynie zahamowały dalsze namnożeniesię prątków gruźlicy. Badania te są przyszłościowei niezbędne, ponieważ chorzy na gruźlicęsą coraz częściej odporni na preparaty farmaceutyczne.WNIOSKIz zastosowaniem wyciąguz zielonkipróba kontrolnabez wyciągu grzybowegoRyc. 3. Wzrost prątków gruźlicy na podłożu Lowensteina – Jansena.Rozcieńczenie zawiesiny prątkowej 10 -1Stwierdzono, że w zależności od gatunku grzyba,sposobu utrwalenia owocników i rodzaju podłożauprawowego, następowało różne hamowanie rozwojubakterii gronkowca i prątków gruźlicy.Dużą zdolność hamowania wykazywały wyciągiz wrośniaka i boczniaka ostygowatego, najmniejsząz zielonki, a wyciągi z suszonego zielardestowca i topinamburu nie posiadały tej właściwości.W wypadku boczniaka ostrygowatego poziomhamowania gronkowca zależał od podłoża uprawowego.Efekt hamowania wyciągu z boczniaka uprawianegona samej słomie pszennej był czterokrotniemniejszy od wyciągu z boczniaka z podłożaz dodatkiem topinamburu i dwukrotnie mniejszyze słomy z dodatkiem rdestowca.Dziesięciokrotnie większą siłę hamowaniawzrostu gronkowca posiadały wodne wyciągiz grzybów mrożonych niż z grzybów suszonych.Schemat 1. Identyfikacja bakterii Staphylococus aureusRyc. 2.Ocena wpływu na hamowanie wzrostu bakteriigronkowca złocistego przez wyciąg z mrożonegoboczniaka ostrygowatego uprawianego napodłożu ze słomy z dodatkiem części nadziemnejrdestowcagdzie:Schemat 2. Oznaczenie i identyfikacja prątków gruźlicycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-50731. pole z dodatkiem 3,3mg/ml wyciągu grzybowego2. i 4. pole bez wyciągu grzybowego3. pole z dodatkiem 6,6mg/ml wyciągu grzybowegoFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy45

Nr 6 / 2008grzybyboczniak ze słomyz rdestowcemboczniak ze słomyz topinamburemWyciągi z suszyIlość dodanego wyciągu grzybowegow mg/ml3,3 6,6 9,9 13,2Hamowanie w %100 100 100 100100 100 100 100boczniak ze słomy 50 75 90 100gąska żółta 5 25 70 85opieńka miodowa 10 40 90 100ziele topinamburu 90 95 100 100Ilość dodanego wyciąguw mg/ml6 8 10Hamowanie w %boczniak ze słomy z rdestowcem 90 97 100boczniak ze słomy z topinamburem 90 95 100boczniak ze słomy 85 95 100shiitake 75 95 100ziele rdestowca 0 0 0ziele topinamburu 0 0 0Tabela I. Wpływ wyciągów wodnych z grzybówmrożonych na hamowanie wzrostu bakterii Staphylococusaureus dodanych do podłoża Chapmanaw ilości 150x10 6 /mlTabela II. Wpływ wyciągów wodnych z suszonychgrzybów oraz suszonego ziela rdestowca i topinamburuna hamowanie wzrostu bakterii Staphylococusaureus dodanych do podłoża Chapmana w ilości150x10 6 /mlWyciągi wodne z:MROŻONEKŚrednia zahamowana ilość bakteriiboczniak uprawiany na podłożu słoma pszenna + rdestowiec 1,33*10 9boczniak uprawiany na podłożu słoma pszenna + topinambur 1,33*10 9boczniak uprawiany na podłożu słomy pszennej 0,33*10 9wrośniak wielobarwny 0,44*10 9opieńka miodowa 0,44*10 9gąska zielona 0,28*10 9SUSZYboczniak uprawiany na podłożu słoma pszenna + rdestowiec 1,82*10 9boczniak uprawiany na podłożu słoma pszenna + topinambur 1,78*10 9boczniak uprawiany na podłożu słomy pszennej 1,78*10 9shiitake 1,41*10 9ziele rdestowca 0ziele topinamburu 0Tabela III. Wpływ wyciągów wodnych z 1 grama grzybów oraz rdestowa lub topinamburu na zwalczanie bakterii Staphylococusaureusgrzybyboczniak z podłoża słoma + rdestowiecboczniak z podłoża słoma + topinamburboczniak z podłoża słoma pszennawrośniak wielobarwnyopieńka miodowaWielkość rozcieńczenia zawiesiny prątkowej10 -1 10 -2 10 -3 10 -4brak dalszego rozwoju prątków gruźlicybrak dalszego rozwoju prątków gruźlicybrak dalszego rozwoju prątków gruźlicybrak dalszego rozwoju prątków gruźlicybrak dalszego rozwoju prątków gruźlicyTabela IV. Wpływ wyciągów wodnych z grzybów na hamowanie prątków gruźlicy46 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008PIŚMIENNICTWO1. Brenne W.M., Nutritional and medicinal value of specialtymushrooms. J. Food Protect., 1990, 53, 883-8942. Grzybek j., Kohlmünzer S., Poszukiwanie polisacharydówo działaniu antybiotycznym przy użyciu testu allium.Prob.. Hig. 1984, 3 (23), 36-433. Grzybek J., Kultury myceliarne grzybów wyższych źródłemsubstancji leczniczych. Biotechnol. 1992, 4 (19),37-404. Kohlmünzer S., Właściwości lecznicze japońskiegogrzyba jadalnego ‘shiitake’ Lentinus edodes. Grzyby,1988, 18, 28-295. Kohlmünzer S., Hodowle myceliarne grzybów wyższychjako źródło biologicznie aktywnych substancjiProb. Hig. 1992, 36, 10-156. Kohlmünzer S., Aktywność biologiczna niektórych gatunkówgrzybów wielkoowocnikowych, Prob. Hig 1996,53, 30-40.7. Mizuno T., Yamabushitake, Hericum erinaceum: bioactivesubstances and medicinal utilizationFood Rev. Intern; 1995, 11, 173-1788. Muzzarelli RAA., Clinical and biochemical evaluationof chitosan for hypercholesterolemia and overvveightcontrol. In: Chitin and Chitinases. Eds.: Jollies T, MuzzarelliRA.A. Bitkhauser Yerlag Basel, Switzerland,;1999, 293 - 3049. Rajewska J. i Bałasińska B. Związki biologicznie aktywnezawarte w grzybach jadalnych i ich korzystnywpływ na zdrowie. Postępy Hig. Med. Dośw.; 2004, 58,352-35710. Smith J. E., Rowan NJ., Sullivan R.; Medicinal muschroms:a rapidly developing area of biotechnologyfor cancer therapy and other bioactivities. Biotech. Letters,2002, 24: 1839-184511. Kędzia W., Diagnostyka Mikrobiologiczna.. 1980, PWN,Warszawa12. Zaremba M. i Borowski J.; Mikrobiologia lekarska dlastudentów medycyny. 1997, PZWL.13. Rowińska-Zakrzewska E., Pwlicka L., Gruźlica, 2000,PWN, Warszawa14. Gapiński M., Woźniak W., Ziombra M., Boczniak-Technologiauprawy i przetwarzania., 2001, PWRiL, Poznańcopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy47

Zastosowanie termografii w diagnostyce schorzeńczęści twarzowej czaszkiThe usage of thermography of diagnostic diseases of the craniofacialdr hab. n. med. Iwona Niedzielska¹, lek.stom Joanna Markiewicz, lek stom. Ryszard Markiewicz, mgr. RyszardBogucki², dr Bronisław Kajewski².¹Katedra i Klinika Chirurgii Czaszkowo – Szczękowo – Twarzowej Śląskiego UniwersytetuMedycznego w Katowicach.²Główny Instytut Górnictwa, KatowiceDyrektor: Prof.dr hab.inż Józef DubińskiStreszczenieTermografia w aplikacjach stomatologicznych pojawiłasię pod sam koniec dwudziestego wieku. Brak jest pracdotyczących jej zastosowania w diagnostyce zębopochodnychognisk infekcji.Celem pracy była próba oceny korzyści z przeprowadzeniabadań termograficznych w diagnostyce schorzeńczęści twarzowej czaszki ze szczególnym zwróceniemuwagi na zębopochodne ogniska infekcji w aspekcieschorzeń ogólnoustrojowych.Materiał i metodyka. Do badania termograficznegozakwalifikowano 58 pacjentów, u których wstępnie rozpoznanoróżne jednostki chorobowe części twarzowejczaszki, w tym również ogniska zębopochodne (2 dysplazjewłókniste kości, 5 zapaleń zatok szczękowych, 3zapalenia kości żuchwy, 3 osteoradionekrozy, 2 urazyczęści twarzowej czaszki oraz 43 zębopochodne ogniskainfekcji). Badanie wykonano kamerą termowizyjnąAgema typ 470 w stałych dla każdego pacjenta warunkach.Porównywano termogram, pantomogram z obrazemklinicznym.Wnioski: Badanie termograficzne w schorzeniach częścitwarzowej czaszki pozwala ujawnić procesy chorobowe,klinicznie uznane za nieaktywne, jako termograficznieaktywne, co może świadczyć o przetrwałym,aktywnym procesie i mieć wpływ na decyzje terapeutyczne.AbstractThermography in dental applications appeared at theend of the XX century. There are no works concerningits usage in diagnostic of odontogenic focuses infection.The aim of the work was an attempt of the mark of thebenefit in carrying examinations out of the thermographicworks in diseases of the part of the craniofacial,with a particular focus on odontogenic focuses infectionin the aspect of systemic diseases.The materials and methods: the 58 patients were qualifiedfor the thermographic examination, who wereinitially diagnosed with different diseases of the partof the craniofacial and also the odontogenic focuses. (2fibrous dysplasia of bones, 5 inflammations of facialsinuses (maxillary sinusitis), 3 inflammations of a jaw(mandibula), 3 osteoradionecrosis, 2 injuries of the facialskull and 43 odontogenic focuses infection.The examination was made by using a thermographiccamera Agema type 470 in a constant condition for everypatients. Compared thermogram to X-Ray picturewith a clinical view.Conclusions: Thermographic examination in diseasesof the part of the facial skull reveals pathological processes,clinically considered as inactive, as thermographiclyactive what can provide about a constant, activeprocess and to have the influence on therapeutic decisions.The usage of thermography of diagnostic diseases of thepart of the craniofacial.48 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008WstępTermografia była od dawna stosowana w naukach pozamedycznych.W medycynie na szeroką skalę znalazła zastosowaniew latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku, zaśw stomatologii dopiero pod koniec dwudziestego wieku[1,2]. W odróżnieniu od inwazyjnego badania radiologicznegometoda ta stwarza możliwości różnicowania stanówfizjologicznych i patologicznych i kontrolowanie efektówleczenia bez szkody dla pacjenta. Nie eliminuje ono całkowiciewykonanych badań radiologicznych zwłaszczaw przypadku stwierdzenia rozbieżności między badaniemklinicznym, a termograficznym, ale może być stosowanejako badanie screaningowe u chorych obciążonych kardiologiczniei nefrologicznie, u których istnieje wskazanieeliminacji ognisk zakażenia [3,4].W schorzeniach częścitwarzowej czaszki wykorzystano termografię do diagnostykiguzów nowotworowych [5-10], czy monitorowaniuleczenia chemioterapeutycznego nowotworów[11], stanówzapalnych zatok szczękowych [12-14] oraz gruczołów ślinowych[8]. W stomatologii rejestrowano kamerą termowizyjnątemperaturę po leczeniu kanałów korzeniowych [15],polimeryzacji wypełnień oraz po zabiegach laserowych [4].Cel pracyCelem pracy była próba oceny korzyści z przeprowadzeniabadań termograficznych w diagnostyce schorzeń częścitwarzowej czaszki ze szczególnym zwróceniem uwagi nazębopochodne ogniska infekcji w aspekcie schorzeń ogólnoustrojowych.Materiał i metodykacopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Do badania zakwalifikowano 30 kobiet i 28 mężczyznw wieku od 19 do 70 rż. Badanie termograficzne wykonanow Klinice Chirurgii Czaszkowo-Szczękowo-Twarzowejw Katowicach weryfikując pacjentów w Poradni Przyklinicznej,którzy zgłosili się do leczenia w okresie od I 2007do V 2007. Badanie zostało przeprowadzone w specjalniedo tego przystosowanym pomieszczeniu (szczelne pomieszczenieklimatyzowane, ze stałą temperaturą pokojową, wilgotnością,co najmniej 3 godziny po posiłku, bez zażywanialeków krążeniowych w dniu badania, ze stałą temperaturąciała po 15 min. adaptacji w pracowni) wygospodarowanychna okres prac badawczych realizowanym w ramach grantuKBN (nr.40307631/3421). Badania wykonano przy użyciukamery termowizyjnej Agema typ 470 przez tego samegotechnika, który dokonywał zapisu obrazu, interpretacji i jegoobróbki. Wykonywano zdjęcia zewnątrzustne w trzechprojekcjach „en face”, oraz dwa ujęcia boczne w pozycjisiedzącej w odległości 40 cm od obiektywu kamery. Ujęciawewnątrzustne wykonywano po odsłonięciu warg i policzkówza pomocą szpatułek w celu uniknięcia nałożenia sięna badany obszar tkanek miękkich po minucie od otwarciaust i na wydechu.Obraz termograficzny oceniano w dwóch przypadkachdysplazji włóknistej kości, w 5 zapaleniach zatok szczękowych,w 3 zapaleniach kości żuchwy oraz w trzech osteoradionekrozach.Dwóch pacjentów poddano badaniu termograficznemupo doznanym urazie części twarzowej czaszki.Pozostałe przypadki (43) to zębopochodne ogniska infekcji.W każdym przypadku odnotowano wiek, płeć pacjenta, zgłębianowywiad ogólny pod kątem schorzeń odogniskowych,przeprowadzano szczegółowe badanie stomatologicznez uwzględnieniem wrażliwości ogniska pierwotnego naopuk, nagryzanie, reakcje na chlorek etylu, oraz wykonanotesty Smrekera i Owińskiego. Radiogramy, w tym pantomogramy,zdjęcia rentgenowskie zatok szczękowych orazzdjęcia kości części twarzowej czaszki w przypadku złamańporównywano do badań termograficznych uwzględniającrównież badanie kliniczne.WynikiW każdym przypadku pomiaru średnich temperaturpunktem odniesienia była strona przeciwległa do obszaru,gdzie występowała patologia lub obszary klinicznie zdrowe.W jednym na dwa przypadki dysplazji włóknistej wystąpiłozaostrzenie procesu chorobowego, które znalazło implikacjetylko w obrazie termograficznym bez uchwytnychzmian w radiogramie. Średnia różnica temperatur międzyogniskiem zmian chorobowych, a strona przeciwną wynosiła0,7°C.W każdym przypadku pełnych objawów ostrego i przewlekłegozaostrzonego zapalenia zatok szczękowychwykazano zmiany w ociepleniu tego obszaru w porównaniudo drugiej połowy ciała rzędu 1,2°C. Na podstawietermografii można było wykazać i ocenić drożnośćprzewodów nosowych poprzez stopień ocieplenia przełożonyna skalę kolorów (termogram), a tym samym rokowaćpotrzebę wykonywania zabiegów rynologicznychu części pacjentów.W ocenie zębopochodnych ognisk infekcji wykazanow 21 przypadkach zwiększenie ocieplenia okolicokołowierzchołkowych zębów o 0,6°C, które poleczeniu kanałowym nie wykazywało zmian radiologicznychi klinicznych (fot. 4-8, ryc. 2, 3). U pacjentówz osteoradionekrozą temperatura w miejscu nasilonej osteolizykostnej i występujących dolegliwości bólowychw porównaniu do strony przeciwległej była niższa o około1,3° (fot.1, 2, 3 ryc.1). We wszystkich przypadkachosteoradionekrozy żuchwy po zastosowanej w przebieguleczenia nowotworów tej okolicy radioterapii wykazanozwiększone ocieplenie obszarów, które było przyczynądolegliwości bólowych pacjentów i zgłoszenia się ichdo tutejszej poradni przyklinicznej. W związku z powyższymzaordynowano leczenie hiperbarią tlenową kontrolującwyniki tego leczenia kolejnymi termogramami.W 2/3 przypadki uzyskano poprawę stanu klinicznego potwierdzonegona termogramie jako zwiększone ocieplenieo średnich wartościach 0,50 bez widocznej poprawy w radiogramie.DyskusjaTermografia ma szereg zalet, ale też i wad. Jest metodąmało inwazyjną, powtarzalną, co umożliwia monitorowaniedynamiki procesu chorobowego, ale z drugiej strony wymagaodpowiedniego przygotowania pacjenta do badania przy wy-FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy49

Nr 6 / 2008Fot. 1. Fot. 2. Fot. 3.Fot.1, 2, 3. Pacjent S.E.Osteoradionekroza żuchwy.Zaostrzenie procesu chorobowegouwidocznione w termogramieRyc. 1.Ryc.1. Pacjent S.E. Osteoradionekrozażuchwy. Osteoliza kostna odpowiadającazmniejszonemu ociepleniuw termogramieFot. 4. Fot. 5.Fot. 4, 5. Pacjent D.M.Zęby 14,15 bez zmian okw w obrazieradiologicznym i klinicznym wykazująogniska wzmożonego ociepleniaw obrazie termograficznymRyc. 2.50 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyRyc. 2. Pacjent D.M. Zęby 14, 15bez zmian okw na pantomogramiecopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008Fot. 6. Fot. 7.Fot. 8. Fot. 9.Fot. 6, 7, 8, 9. Pacjent R.W. Termogramywewnątrzustne potwierdzająobecność zębopochodnychognisk infekcji i brak procesu zapalnegow tkankach okw zębówleczonych endodontycznie. Fot. 6,7. (szczęka), Fot. 8, 9. (żuchwa)Ryc. 9.sokim koszcie samej aparatury [16]. Biorąc jednak pod uwagęmożliwość diagnostyki zębopochodnych ognisk infekcjiw aspekcie schorzeń odogniskowych wydaje się, żejest metodą z wyboru. Do tej pory bowiem korzystanoz arsenału metod bardzo inwazyjnych i niemile widzianychprzez pacjentów, jak test insulinowy, penicylinowypomocne w poszukiwaniu aktywnych ogniskzębopochodnych przy towarzyszących schorzeniach ogólnoustrojowych.W dużej liczbie analizowanych przypadkówuwidoczniono zwiększone ocieplenie w radiologiczniei klinicznie niemym procesie chorobowym. Czy zatemmożna sądzić, że są to źródła infekcji w aspekcie schorzeńodogniskowych? Trudno wysuwać takie wnioski bez dodatkowychbadań. Wydaje się, że odpowiednia interpretacjawyników badań na dużym materiale klinicznym połączonaz dodatkowymi badaniami pozwoli w przyszłości interpretowaćtego typu wyniki bez odnoszenia się do radiogramów. Docopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Ryc.3. Pacjent R.W. Zmiany okwna pantomogramiewłaściwej interpretacji wyników pomiarów termowizyjnychniezbędna staje się wiedza medyczna z zakresu anatomiii fizjologii człowieka. Istotne są również ustandaryzowanewarunki przeprowadzenia badań, którym starano się sprostać.W interpretacji wyników badań dotyczących zębopochodnychognisk infekcji brano pod uwagę wiedzę na tematróżnic temperatur między przyzębiem szczęki i żuchwy,którą zauważył Holthius i Chebiba [17] oraz różnice międzyzębami siecznymi, a zębami trzonowymi. Z tego powoduporównywano w badaniu tkankę chorą ze zdrową lub tkankąprzeciwległą uzyskując w tych przypadkach średnią różnicętemperatur rzędu 0,5°C. Melnitzky i Schartenmuller [18] wykazali,iż w przypadku zapalenia zatok obocznych nosa różnicatemperatur lewej i prawej strony twarzy może wynosićzaledwie 0,25±0,1 o C. Niskie rożnice temperatur pomiędzypołowami twarzy osób zdrowych wykazał również UematsuFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy51

[19], który ocenie poddał okolicę czołową (0,12±0,09 o C)oraz Gratt i wsp. [20] oceniający temperaturę skóry brody(0,1±0,1°C).Opracowano już pewne wzorce rozkładów temperaturw stanach fizjologicznych jamy ustnej i wiadomo jest, że sądwa wzorce wykorzystywane do diagnostyki chorób przyzębia(moment otwarcia ust i po 60 sek. od otwarcia ust),które wykorzystano w zaprezentowanym badaniu.Ze względu na małą liczbę przypadków innych schorzeńocenianych w tym badaniu trudno o ich interpretację. Jedyniew grupie bardzo rzadkich chorób jak dysplazja włóknista,czy osteoradionekroza można pokusić się o wstępnąinterpretację wyników badań ponieważ są to z natury rzeczyrzadkie schorzenia. Badanie termograficzne pozwoliło zdiagnozowaćzaostrzenie choroby, czego nie wykazano badaniemradiologicznym i nie zawsze też klinicznym. W osteoradionekroziemożna było również ocenić skutecznośćleczenia hyperbarią tlenową. Zwiększone ocieplenie ogniskaosteolizy kostnej można interpretować jako poprawę ukrwieniakości pod wpływem wysokich dawek tlenu. Potwierdzeniemtego była znaczna poprawa stanu klinicznego chorego.Z zaprezentowanych danych oraz z przeglądu piśmiennictwawynika, że termografia coraz powszechniej znajdujezastosowanie w stomatologii. Być może stanie się powszechnieużywaną metodą diagnostyki różnych schorzeńczęści twarzowej czaszki, w tym zębopochodnych ogniskinfekcji przy pokonaniu bariery finansowej zakupu sprzętu.WnioskiBadanie termograficzne pozwala ujawnić procesy chorobowe,klinicznie uznane za nieaktywne, jako termograficznieaktywne, co może świadczyć o przetrwałym, aktywnymprocesie i mieć wpływ na decyzje terapeutyczne.Piśmiennictwo1. Crandel C.E., Hill R.P.:Thermography in dentistry-apilot study,Oral Surg.,Oral Med.,Oral Pathol.1966,21,316-3202. Biagoni P.A., McGimpsey, Lamey P.J.: Electronic infraredthermography as a dental research technique,Brit.Dental J.1960,180,6:226-2303. Marszał E., Wojaczyńska- Stanek K.: Badanie termograficznew schorzeniach zatok obocznych nosa u dzieci.Prz. Pediatr. 1991,21(2):128-133.4. Żmuda St., Zaborowski P., Dąbrowski M., DulskiR.: Różnicowanie stanów fizjologicznych i patologicznychtkanek przyzębia w podczerwieni. Mag.Stom.2002,12(10):54-585. Bihl I., Wnukiewicz J., Żukowski W., Pawela T., ZiemskiP.:”Termografia w schorzeniach zatok szczękowych„Człowiek Populacja Środowisko”, Prace DolnośląskiegoCentrum Diagnostyki Medycznej DOLMED weWrocławiu 1987,4,19,47-636. Bihl I., Wnukiewicz J., Żukowski W., Pawela T., PomorskiA.: Termografia schorzeń nowotworowych jamyustnej i kości szczęk. Człowiek Populacja Środowisko,Prace Dolnośląskiego Centrum Diagnostyki MedycznejDOLMED we Wrocławiu 1987,4,19,27-4652 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyNr 6 / 20087. Bihl I., Wnukiewicz J., Żukowski W., Pawela T., KomorowskiA.: Termografia schorzeń nowotworowych jamyustnej i kości szczęk. Człowiek populacja środowisko.Prace dolnośląskiego centrum diagnostyki medycznej.Dolmed. Wrocław 1979.8. Acciarri L.: Thermography of parotid tumora. Acta thermographica1976,3,1559. Chies A., Acciarri L.: Thermography of the neck. Oto--Rhino-Laryng. 1978,24,14310. Veyrosta Z.: Infrared thermovision In the diagnosis oforofacial tumors. Cesk. Stomat 1975,36,7511. Cennamo G. Rocco P., Greco g et all.: Termography oftumors of the orbit, of the okular Globe and its parts.Acta thermographica 1976,3,188.12. Mielcarek B., Wnukiewicz J., Wróblewski J., StępniewskiW., Kaczmarek U.: Usefulness of termographic andscintiscanner testes In diagnosis of oral tumors. 5-thCongress EAMPS, Poland, Warszawa, September,1980.13. Wróblewski J., Mielcarek B., Wnukiewicz J.: Przydatnośćbadań termograficznych w chirurgii stomatologicznej.Wrocławska Stomatologia. 1979,147-14914. Bystrzycki B., Górski Sz.: Obrazy termograficzne twarzyw chorobach szczęk. Materiały I OgólnopolskiegoSympozjum Termografii Medycznej. Poznań 197915. Dąbrowski M., Dulski R., Zaborowski P., Żmuda S.: Obrazowaniezmian temperatury błony śluzowej podczaslaseroterapii z wykorzystaniem kamery termowizyjneji oprogramowania do ciągłej rejestracji obrazu. V KrajowaKonferencja termografia i termometria w PodczerwieniUstroń 200216. Stępień i wsp.: Porównanie technik radioizotopoweji termograficznej w obrazowaniu schorzeń układu kostno-stawowego.Acta Bio-Optica et informatica Medica2006,12,77-80.17. Holthius A.,F., Chebib F.S.: Observations on temperatureand temperature patterns of gingival. The effect ofarch, region and health. J.Periodontol,1983,54,624-628.18. Melnitzky P., Schartelmuller T.: Thermographiebei Sinusitis-Patienten. European J.of Thermol.,1998,8,4,150-15419. Uematsu S.:Symmetry of skin temperature comparing oneside of the body to the other. Thermolog,1985,1,1,4-720. Gratt B.M. i wsp.: Electronic thermography in the assessmentof interior alveolar nerve deficyt. Oral Surg., Oral.Med., Oral Pathol., Oral Radiol. 1995,80,2,153-160copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Zmiany w sekwencji długich powtórzeń końcowych (LTR)endogennych retrowirusów świni (PERV) u zwierząt w stadzieprzeznaczonym do ksenotransplantacjiChanges in the length of long terminal repeat sequences (LTR) of porcine endogenousretroviruses (PERV) from pigs of the herd inbred for xenotransplantationmgr inż. Grzegorz Machnik, mgr Sabina Gałka,dr Tomasz Loch, mgr Daniel Sypniewski,dr Ilona BednarekZakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej,Śląski Uniwersytet MedycznyKierownik Zakładu: dr n. biol. Ilona BednarekSTRESZCZENIEStosowane obecnie allotransplantacje są limitowaneprzez istniejący niedobór dawców do przeszczepów.Ksenotransplantacje, czyli przeszczepy międzygatunkowemogą stanowić alternatywne rozwiązanie. Endogenneretrowirusy świni (ang. Porcine EndogenousRetroviruses PERV), wykryte w organizmach świń (potencjalnegogatunku donorowego narządów) stanowiąistotną przeszkodę we wdrożeniu ksenotransplantacjido praktyki. PERV posiadają zdolność do zakażaniakomórek ludzkich in vitro, i mogą modulować stopieńinfekcyjności poprzez zmiany w sekwencji DNA i/lubtworzenie cząstek rekombinacyjnych. W doświadczeniachin vitro obserwowano następowanie zmian w sekwencjachDNA w obrębie długich powtórzeń końcowych(ang. Long Terminal Repeats, LTR), co wpływałona stopień infekcyjności wirusa względem komórekczłowieka. Celem pracy było wykazanie, czy zmianyw sekwencjach LTR PERV, obserwowane in vitro, występująrównież w organizmie świni domowej w stadzieprzeznaczonym do ksenotransplantacji.Do badań wykorzystano DNA ekstrahowane z krwi pełnejświń ze stada przeznaczonego do ksenotransplantacji.Przeprowadzono reakcję Long-PCR z użyciemstarterów zlokalizowanych w obrębie sekwencji LTRPERV. Produkty reakcji rozdzielano w żelu agarozowym.Uzyskano szereg produktów amplifikacji; produktyo długości 1000 i 560 par zasad (pz) izolowanocopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073ABSTRACTAllotransplantation procedures are limited by graft donordeficiency. Xenotransplantations, being interspeciestransplantations, may serve as an alternative solution.Porcine endogenous retroviruses (PERV) found in porcinegenome (potential graft donor) are the major obstaclein xenotransplantation implementation. PERV arecapable of infecting human cells in vitro an may modulatetheir infectivity through changes in DNA sequenceand/or formation of recombinant particles. In vitrostudies revealed that changes in DNA sequences withinlong terminal repeats (LTR) influenced infection in humancell lines. The aim of the study was to investigate,whether in vitro changes in LTR sequences occur alsoin pigs in vivo.The studied material was DNA extracted from wholeblood from pigs from the herd inbred for xenotransplantation.Long PCR assay with primers localized withinPERV LTR sequences was carried out. Amplificationproducts were separated on agarose gels. Several productswere observed. Amplimers of 1000 and 560 basepairs (bp) were eluted from gels, purified, and sequenced.Obtained sequences were compared with referencedata from GenBank and were analyzed using EMBOSSsoftware. A 39 bp fragment (WS_39), analogous to thatdescribed in literature, was repeated in the studied 560bp amplimers five times, while it was repeated only 2-3times in the reference sequences. The obtained resultsFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy53

Nr 6 / 2008z żelu, oczyszczano i poddano sekwencjonowaniu. Wynikiporównano z sekwencjami referencyjnymi, zgromadzonymiw bazie danych GenBank i analizowanoz użyciem oprogramowania EMBOSS.W sekwencji LTR PERV o długości 560 pz zaobserwowanopięciokrotne powielenie odcinka 39 nukleotydów(WS_39), analogicznego z opisanym w literaturze, natomiastw sekwencjach referencyjnych fragment tenwystępował dwu- lub trzykrotnie. Uzyskane wynikisugerują, że PERV mogły ulegać w przeszłości zmianomi infekować komórki zarodkowe świni w postacirekombinowanej lub, że są one obecnie zdolne do rekombinacjina drodze retrotranspozycji in vivo w organizmieświń.suggest, that PERVs may have fluctuated in the pastand the recombined particles had infected porcine stemcells. Alternatively, PERVs may be capable of recombinatingby retrotransposition in pigs in vivo at present.Key-words: Transplantation, Heterologous; Endogenousretroviruses; Recombination, GeneticSłowa kluczowe: transplantacje heterologiczne; endogenneretrowirusy; rekombinacja genetycznaWSTĘPOd ostatniej dekady XX-go wieku obserwuje się ponownezainteresowanie grup badawczych zagadnieniem ksenotransplantacji.Ponowne podjęcie tematyki przeszczepówodzwierzęcych było możliwe dzięki wynalezieniu skutecznychleków immunosupresyjnych oraz rozwojowi technikinżynierii genetycznej. W chwili obecnej uznaje się, że zewzględu na wiele aspektów, optymalnym gatunkiem donorowymnarządów do przeszczepów jest świnia domowa(Sus scrofa). Niestety, w organizmach świń zaobserwowanoobecność cząstek wirusowych, zdolnych do infekowaniakomórek człowieka w warunkach in vitro [1]. Cząstki teendogenneretrowirusy świni (ang. porcine endogenous retroviruses,PERV), są obecne w genomie każdego osobnikai pozostając w stanie zintegrowanym z genomowym DNA,nazywane są prowirusami. Endogenne retrowirusy świniwystępują w wielu kopiach w genomie komórek zwierząti nie jest możliwe ich całkowite usunięcie poprzez prostąselekcję stad [2]. Jak dotąd, nie stwierdzono zakażenia organizmuczłowieka po kontakcie z tkankami pochodzącymi odświni (np. podczas przeszczepu wysp trzustkowych świni,perfundacji wątroby krwią świni) [3], co jednak nie wykluczaryzyka podczas zabiegów ksenotransplantacji. Endogenneretrowirusy świni dziedziczą się zgodnie z prawamiMendla, kumulując w toku ewolucji liczne mutacje, coz czasem czyni je niezdolnymi do replikacji [4]. Ze względuna różnice w budowie wyróżnia się trzy subtypy PERV:PERV-A, PERV-B, PERV-C [5, 6], przy czym różnice występujązwłaszcza w obrębie genu env, kodującego białkaotoczki wirusa, pozostałe geny (gag oraz pol) wykazująwysoki stopień homologii, wynoszący ponad 95% [5, 6].Badania wykazały, że PERV-A i PERV-B są obecne u każdegoosobnika we wszystkich stadach, natomiast PERV subtypuC nie występuje u niektórych zwierząt. Subtypy A, B iC różnią się względem siebie stopniem infekcyjności [7, 8].Genom PERV zbudowany jest z dwóch identycznych cząsteczekRNA o dodatniej polarności. Struktura genetyczna54 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowyzawiera, oprócz genów kodujących białka, szereg charakterystycznych,niekodujących segmentów genomu, którepełnią rolę regulacyjną [4]. W stosunku do genomowegoRNA PERV, forma prowirusowa zawiera dodatkowo na obukońcach tzw. końcowe fragmenty powtórzone (ang. LongTerminal Repeats, LTR). Sekwencje LTR zawierają liczneelementy regulatorowe, takie jak sekwencje promotorowei wzmacniające (enhancery), elementy wiążące hormonya także sygnał poliadenylacji [4]. Wykazano, że sekwencjepromotorowe zawarte w elementach LTR mogą także regulowaćin cis ekspresję genów gospodarza [9]. Cząsteczkiretrowirusów, w tym również PERV, mogą ulegać licznymrearanżacjom, które w większości przypadków prowadzą dodefektów genetycznych i spadku potencjału infekcyjnego,lecz zwiększają ryzyko powstawania nowych form rekombinacyjnychPERV [10]. Wykazano także ukierunkowanerearanżacje genomu PERV w kierunku wzrostu potencjałuinfekcyjnego względem komórek człowieka in vitro [11,12]. Rekombinacyjne cząsteczki PERV-A/C wykazywałyokoło 500 razy silniejszy potencjał zakaźny in vitro niżsubtyp PERV-A. [11]. Obserwowano również multiplikacjęregulacyjnych regionów LTR. Dane literaturowe wskazują,że kilkukrotne powielenie 39-nukleotydowego fragmentuLTR o charakterze wzmacniacza (enhancera) powodowałowzrost stopnia replikacji wirusa [13]. Zmiany te obserwowanow warunkach in vitro, po wielokrotnych pasażach komórekczłowieka linii HEK293 zakażonych wirusem PERV[14]. Celem niniejszej pracy było scharakteryzowanie genomowegoDNA świń ze stada przeznaczonego do ksenotransplantacjipod względem liczby powtórzeń kluczowegoodcinka 39 nukleotydów w końcowych sekwencjach powtórzonychPERV.MATERIAŁ I METODYMateriałem do badań była krew obwodowa świń (dwóchosobników, oznaczonych jako 2118 oraz 2050) pochodzącychze stad hodowlanych Instytutu Zootechniki w Balicachcopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008WYNIKI I OMÓWIENIE WYNIKÓWRyc. 1.Rozdział elektroforetyczny produktów reakcji Long-PCR.Oznaczono prążek odpowiadający PERV o pełnej długościgenomu (7200 pz) oraz produkty poddane dalszej analizie(1000 pz oraz 560 pz)k/Krakowa, przeznaczonych do celów ksenotransplantacji.Do ekstrakcji DNA zastosowano metodęz użyciem proteinazy K oraz ekstrakcji mieszaninąfenol-chloroform. Jakość DNA ocenianopoprzez rozdział elektroforetyczny w 1% żeluagarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wydajnośćekstrakcji oraz stopień zanieczyszczeńmateriału szacowano spektrofotometrycznie. Doamplifikacji genomu PERV zastosowano reakcjęLong-PCR z lokalizacją starterów w końcowychfragmentach powtórzonych (LTR). Starteryumiejscowiono w ten sposób, aby amplifikacjiulegał możliwie cały genom prowirusa: (starterPERVL-F: AAT CCT CTT GCT GTT TGC ATCAAG ACC GC) i 3’ LTR (starter PERVL-R: ACAGTC GTA CAC CAC GCA GGG GTA G) na podstawiesekwencji dostępnej w bazie danych Gen-Bank (numer dostępu: AF038599). Sekwencjestarterów zaprojektowano z użyciem programukomputerowego Prime (GCG Wisconsin Package).Spodziewana długość produktu PCR dla prowirusówpełnej długości wynosiła około 7200 parzasad. Amplifikację prowadzono z użyciem amplifikatoraPerkin Elmer 9600. Zastosowano polimerazęDNA LA Taq Polymerase (Takara INC,Japonia), przeznaczoną do syntezy długich łańcuchówDNA. Produkty reakcji Long- PCR rozdzielanona 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.Długości uzyskanych produktów szacowano względemmarkera wielkości DNA Size Marker λ/BstpI (Takara INC,Japonia). Po rozdziale elektroforetycznym pojedynczeprążki wycinano z żelu i oczyszczano za pomocą technikiz użyciem krzemionki i jodku sodu. Otrzymane fragmentyDNA poddano sekwencjonowaniu z zastosowaniem tychsamych starterów jak w reakcji Long-PCR. Sekwencjonowanieprzeprowadzono z użyciem sekwenatora płytowegoABI PRISM 377. Wyniki sekwencjonowania analizowanoza pomocą pakietu oprogramowania EMBOSS (www.bioinformatics.nl/emboss).copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073W wyniku rozdziału elektroforetycznego produktówreakcji Long-PCR uzyskano szereg amplimerów, którychdługość oszacowano na około 7200, 1000 i 560 par zasad(pz). Produkty, które zostały poddane dalszej analizie przedstawionona rycinie 1. Produkty Long-PCR o długości 560pz dla osobników 2118 i 2050 oznaczono odpowiednio jako2118_560 i 2050_560. Amplimery poddano sekwencjonowaniui potwierdzono zgodność ich sekwencji z sekwencjamiPERV umieszczonymi w bazie danych GenBank.Wykazano, że analizowane produkty Long-PCR należaływyłącznie do końcowych fragmentów powtórzonych PERV(LTR) i nie obejmowały genów kodujących białka. Są toprawdopodobnie tzw. „solo-LTR”, elementy występującepowszechnie w genomach ssaków [4], będące pozostałościamipo rekombinacji homologicznej prowirusów i usunięciuwiększości ich sekwencji. W amplimerach 2118_560i 2050_560 wykazano obecność fragmentu DNA o długości39 nukleotydów (oznaczonego jako WS_39), któryRyc. 2.Porównanie fragmentu WS_39 (oś OY) z amplimerami 560 pz reakcjiLong-PCR (oś OX). Widoczne pięciokrotne powielenie elementu WS_39 w obu badanych próbkachRyc. 3.Porównanie fragmentu WS_39 (u góry) z fragmentem DNA o charakterzewzmacniacza opisanym przez Scheef i wsp. [14]w obu badanych sekwencjach został pięciokrotnie powielony(ryc.2). Odcinek WS_39 porównano in silico z opisywanymw literaturze fragmentem DNA o charakterzewzmacniacza (ang. enhancer) i wykazano różnicę dwóchnukleotydów, co sugeruje, że jest to analogiczny odcineksekwencji prowirusa PERV [14]. (ryc.3). U retrowirusów(w tym endogennych) występuje mechanizm zwiększanialiczby powtórzeń określonych fragmentów DNA o charakterzeregulacyjnym, co skutkuje zwiększeniem stopniareplikacji wirusa [15]. Zjawisko to może występować invivo, jak np. u wirusa białaczki kota (ang Feline LeukemiaVirus, FeLV) [16]. Porównanie WS_39 z sekwencjamiPERV-A, PERV-B oraz PERV-C z bazy danych GenBankFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy55

Nr 6 / 2008Ryc. 4.Porównanie fragmentu WS_39 (oś OY) z sekwencjami referencyjnymiPERV-A, PERV-B i PERV-C z znajdującymi się w bazie danych GenBank(oś OX). Widoczne dwu- oraz trzykrotne powielenie elementu WS_39wykazało, że w tych sekwencjach WS_39 występuje dwulubtrzykrotnie (ryc. 4).WNIOSKIPięciokrotne powielenie odcinka WS_39 w DNA badanychosobników może sugerować, że: i). komórki zarodkoweświni uległy zakażeniu przez endogenne retrowirusyświni o formie odmiennej, niż występujące obecnie lub ii).w genomie świń czynne są mechanizmy retrotranspozycji,które mogą prowadzić do powstawania nowych form prowirusówPERV. W dalszych badaniach należałoby ocenić, czyobserwowane powielenie odcinka o charakterze wzmacniaczamoże wpływać na ekspresję genów sąsiadujących lubleżących w pewnej odległości od PERV LTR.Badania wykonano w ramach projektu badawczegoMNiI nr 2 P04B 022 29 (grant promotorski).LITERATURA1. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA. Infection of humancells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat Med 1997;3(3): 282-286.2. Machnik G i wsp. Endogenne Retrowirusy Świni(PERV) jako zagrożenie w ksenotransplantacjach. MedWeter 2004; 60: 345-348.3. Paradis K i wsp. Search for cross-species transmissionof porcine endogenous retrovirus in patients treated withliving pig tissue. Science 1999; 285: 1236-1241.4. Linial M, Weiss RA. Other human and primate retroviruses.[W:] Fields Virology., 4th ed. Philadelphia PA: LippincottWilliams & Wilkins, 2001.5. Akiyoshi DE i wsp. Identification of a full-length cDNAfor an endogenous retrovirus of miniature swine. J Virol1998; 72(5): 4503-4507.6. Bösch S, Arnauld C, Jestin A. Study of full-length porcineendogenous retrovirus genomes with envelope genepolymorphism in a specific-pathogen-free large whiteswine herd. J Virol 2000; 74(18): 8575-8581.7. Czauderna F i wsp. Establishment and characterizationof molecular clones of porcine endogenous retrovirusesreplicating on human cells. J Virol 2000;74(9): 4028-4038.56 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy8. Takeuchi Y i wsp. Host range and interference studies ofthree classes of pig endogenous retrovirus. J Virol 1998;72(12): 9986-9991.9. Nakamura A i wsp. Human endogenous retroviruseswith transcriptional potential in the brain. J. Hum. Genet.,2003; 48: 575-58110. Piekarowicz A. Podstawy wirusologii molekularnej.Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2004.11. Harrison I i wsp. Determinants of high titer in recombinantporcine endogenous retroviruses. J Virol 2004;78(24): 13871-13879.12. Bartosch B i wsp. Evidence and consequence of porcineendogenous retrovirus recombination. J Virol 2004;78(24): 13880-13890.13. Denner J i wsp Genetic alterations of the long terminalrepeat of an ecotropic porcine endogenous retrovirusduring passage in human cells. Virology 2003;314:125-133.14. Scheef G i wsp The number of a U3 repeat box actingas an enhancer in long terminal repeats of polytropicreplication-competent porcine endogenous retrovirusesdynamically fluctuates during serial virus passages inhuman cells. J Virol 2001; 75(15): 6933-6940.15. Wolgamot G., Miller A.D. Replication of Mus dunniendogenous retrovirus depends on promoter activationfollowed by enhancer multimerization. J Virol 1999;73(12): 9803-9809.16. Nishigaki K i wsp., Analysis of the disease potential ofa recombinant retrovirus containing friend murine leukemiavirus sequences and a unique long terminal repeatfrom feline leukemia virus. J Virol 2002; 76(3): 1527--1532.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Ocena czystości mikrobiologicznej surowców roślinnychwykorzystywanych do przygotowywania mieszanek ziołowychExamination of microbiological cleanness of plant raw materialsused for preparation of herbal mixturesdr n. biol. Małgorzata Kępa, dr n. med. Robert D. Wojtyczka,dr n. biol. Danuta Idzik, dr hab. n. przyr. Jerzy Pacha,mgr Magdalena Miedzińska, dr n. przyr. Krzysztof JasikKatedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny LaboratoryjnejŚląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach,Kierownik: dr hab. n. przyr. Jerzy Pacha, prof. nadzw. SUMStreszczenieCelem pracy była ocena czystości mikrobiologicznejsurowców roślinnych wykorzystywanych do przygotowywaniamieszanek ziołowych oraz leków doustnych,zawierających surowce pochodzenia roślinnego. Badaniaobejmowały 80 surowców zielarskich oraz 30 preparatówzawierających surowce pochodzenia roślinnego. Wykonywanoje w warunkach aseptycznych zgodnie z wymaganiamiFP wyd. VI. Liczbę żywych mikroorganizmówtlenowych (bakterii i grzybów) oznaczano metodą bezpośredniegoposiewu. Badania jakościowe, mające na celuwykrycie obecności drobnoustrojów chorobotwórczychi oportunistycznych, takich jak S. aureus, P. aeruginosaoraz pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, w tymE. coli i Salmonella sp. wykonywano używając podłożynamnażających i wybiórczych. Dodatkowe potwierdzenieobecności danego mikroorganizmu uzyskiwano nadrodze badań biochemicznych.Na podstawie uzyskanych wyników badań stwierdzonowysoki poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego,zarówno surowców zielarskich, jak i badanych preparatówdoustnych. Farmakopealna norma czystości mikrobiologicznejdla surowców roślinnych poddawanychdziałaniu wrzącej wody, została przekroczona w 17,5%badanych próbek. Wykazano, że surowce pochodzącez nadziemnych części roślin posiadają równie wysokiezanieczyszczenie, jak i te pozyskiwane z podziemnychczęści roślin. Wymagań FP VI dla leków doustnych zawierającychsubstancje pochodzenia roślinnego, pozaziołami nie spełniało 80% badanych preparatów. Należyjednak podkreślić, że w badanych próbkach lekówdoustnych nie odnotowano obecności drobnoustrojówchorobotwórczych i oportunistycznych.Wyniki badań, jak i wysokie wymagania mikrobiologicznestawiane roślinnym preparatom leczniczym,skłaniają do poszukiwania skutecznych technologii redukującychliczbę mikroorganizmów w surowcach zielarskich.Słowa kluczowe: czystość mikrobiologiczna, mieszankiziołowe, patogenne i oportunistyczne mikroorganizmycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073SummaryThe aim of the study was the evaluation of microbiologicalpurity of plant raw materials used for preparationof herbal mixtures and oral medicines containing rawmaterials of plant origin. Studies included 80 herbalraw materials and 30 preparations containing raw materialsof plant origin. Examinations were performed insterile conditions, in accordance with the requirements.The number of living aerobic microorganisms (bacteriaand fungi) was determined by means of direct culturemethod. Qualitative examinations, aimed at discoveringthe presence of pathogenic and opportunistic microorganisms,such as S. aureus, P. aeruginosa and rods fromthe family of Enterobacteriaceae, including E. coli andSalmonella sp. were conducted, using multiplying andselective media. The presence of a particular microorganismwas additionally confirmed in the course of biochemicalexaminations.On the basis of the obtained examination results, a highlevel of microbiological contamination was found, bothin herbal raw materials and examined oral preparations.Pharmacopeal microbiological purity norm for plantraw materials subjected to the action of boiling water,was exceeded in 17,5% of investigated samples. It wasshown, that the raw materials from plant parts abovethe ground, are as highly contaminated as those obtainedfrom the underground parts. The requirements fororal medicines, containing substances of plant origin,except for herbs, were not met in 80% of examined preparations.However, it should be emphasized, that in theexamined samples of oral drugs, pathogenic and opportunisticmicroorganisms were not found.Examination results, as well as high microbiological requirementsset for medicinal plant preparations, make itnecessary to search for effective technologies of microorganismsreduction in herbal raw materials.Key words: microbiological cleanness, herbal mixtures,pathogenic and opportunistic microorganismsFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy57

WstępZ surowców roślinnych, zwanych tradycyjnie ziołami lubroślinami leczniczymi, wytwarzane są produkty do celówfarmaceutycznych, spożywczych i kosmetycznych. Częstote same przetwory zielarskie, takie jak ekstrakty, olejki eteryczne,czy soki roślinne są składnikami leków roślinnych,środków spożywczych oraz kosmetyków [1].Obecnie na świecie przetwarza się rocznie ponad 400 tyś.ton surowców roślinnych, w tym w Polsce 15–26 tys. ton,z czego 85% stanowią surowce krajowe. Produkcja surowcówwyłącznie do celów farmaceutycznych szacowana jestnatomiast na około 100 tys. ton rocznie [2].Przetwórstwo zielarskie to przede wszystkim produkcjaleków roślinnych [3]. Według definicji Europejskiego NaukowegoZrzeszenia ds. Fitoterapii, leki roślinne są to użytecznew medycynie wyroby, które jako składniki czynnezawierają wyłącznie rośliny, części roślin, substancje roślinnelub ich kombinacje, w postaci przerobionej lub nie przerobionej.Surowce roślinne przeznaczone do użytku leczniczegomuszą, zatem spełniać określone standardy i normy,a kontrola jakości materiału roślinnego obejmuje wiele etapów,począwszy od wstępnej oceny przyszłego surowca jużna plantacji lub u dostawcy, a skończywszy na ocenie gotowegopreparatu przy użyciu metod laboratoryjnych [4].Farmakognostyczne metody badania surowców pochodzeniaroślinnego zawarte w FP VI, oprócz badań mikroskopowychi makroskopowych, obejmują również wykrywanieobecności i oznaczanie stężenia związków czynnych farmakologicznie,badanie zawartości popiołu, metali ciężkich,domieszek oraz zanieczyszczeń a także badanie czystościmikrobiologicznej. Aktualne wymagania jałowości i czystościmikrobiologicznej dla różnych grup leków zawiera FarmakopeaPolska wyd. VI zgodnie, z którą leki pochodzenianaturalnego zaliczamy do grup czystości mikrobiologicznej:II B, III C, III D i III E [5].Cel pracyCelem pracy była ocena czystości mikrobiologicznej surowcówroślinnych, wykorzystywanych do przygotowywaniamieszanek ziołowych oraz ocena preparatów zawierającychsurowce pochodzenia roślinnego, w świetle aktualnychwymagań Farmakopei Polskiej wyd. VI [5].Materiał i metodyka badańBadanie czystości mikrobiologicznej miało na celu oznaczeniew surowcach i lekach gotowych, dla których niejest wymagana jałowość, ogólnej liczby żywych mikroorganizmówtlenowych (bakterii i grzybów) oraz określenieobecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych,takich jak Staphylococcus aureus, Pseudomonasaeruginosa oraz pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae,w tym Escherichia coli i Salmonella spp.Badania obejmowały 80 surowców zielarskich, w tym3 Cortex, 3 Radix, 3 Rhizoma, 5 Pericarpium, 7 Anthodium,16 Herba, 5 Herba cum radix, 20 Folium i 18 Varia oraz30 gotowych preparatów doustnych zawierających surowcepochodzenia roślinnego.58 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyNr 6 / 2008Ryc. 1. Zanieczyszczenie surowców zielarskich bakteriamitlenowymiWykonano je w warunkach aseptycznych, zgodnie z wymaganiamiFarmakopei Polskiej wyd. VI [5].Oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów (bakterii i grzybów)oraz pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae dokonanometodą bezpośredniego posiewu a interpretacji wynikówprzeprowadzono zgodnie z obowiązującymi zaleceniami [5].W badanych jakościowych surowców roślinnych, należącychwedług FP VI do grupy czystości mikrobiologicznej IIID (surowce roślinne poddawane działaniu wrzącej wody),poszukiwano obecności pałeczek E. coli a w badanych próbkachleków doustnych, zawierających surowce pochodzeniaroślinnego, poza ziołami, zgodnie z wymaganiami FP VI dlagrupy czystości mikrobiologicznej III C, poszukiwano takżeobecności Salmonella spp. oraz S. aureus i P. aeruginosa.Badania wykonywano używając podłoży namnażających,a następnie wybiórczych i różnicujących, dodatkowo potwierdzającobecność mikroorganizmu badaniami biochemicznymi,zgodnie z obowiązującą metodyką [5].Wyniki badań i ich omówienieBadania przeprowadzone z wykorzystaniem 80 surowcówzielarskich, wskazują na wysoki stopień zanieczyszczeniamateriału roślinnego bakteriami tlenowymi (ryc.1).Około 37% próbek badanych surowców charakteryzowałosię liczbą bakterii tlenowych niższą od 10.000 w 1g,a w około 11,25% liczba bakterii mieściła się w granicach10.000-100.000 w 1g. Ponad 28% próbek wykazywało zanieczyszczeniewyższe od 100.000, a około 16% próbek zanieczyszczeniewyższe od 1.000.000 w 1g.FP VI dla surowców roślinnych grupy III D wymaga niewięcej niż 10 7 bakterii tlenowych w 1g surowca. Normy tejnie spełniało 6,25% badanych surowców. W 71,25% surowcówzielarskich stwierdzono obecność grzybów (ryc. 2).Niskim stopniem zanieczyszczenia, w granicach 10-1.000w 1g, charakteryzowało się 31,25% próbek. Ponadto 12,5%próbek zawierało grzyby w liczbie powyżej 1.000, a około16% próbek powyżej 10.000 w 1g surowca. Farmakopealnychwymagań czystości mikrobiologicznej dla surowcówroślinnych grupy III D, w odniesieniu do zanieczyszczeńmikologicznych, nie spełniało 11,25% próbek, w którychliczba grzybów przekraczała 100.000 w 1g. W badaniachnie stwierdzono występowania grzybów w liczbie wyższejod 1.000.000 w 1 g surowca.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008Ryc. 2. Stopień zanieczyszczenia surowców zielarskichgrzybamiRyc. 3. Występowanie w surowcach zielarskich pałeczekEscherichia coliRyc. 4. Surowce zielarskie nie spełniające wymagań FarmakopeiPolskiej VIRyc. 5. Zanieczyszczenie bakteriami tlenowymi preparatówdoustnych, zawierających surowce pochodzenia roślinnegocopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073Ryc. 6. Stopień zanieczyszczenia grzybami preparatów doustnych,zawierających surowce pochodzenia roślinnegoObecność pałeczek E. coli stwierdzono w 8 próbkach, costanowi 10% badanych surowców zielarskich, przy czymw 7 przypadkach liczba tych pałeczek przekraczała 100w 1g, a zatem nie spełniała wymagań FP VI. Niskie zanieczyszczenie,mieszczące się w granicach tolerancji wymagańmikrobiologicznych dla surowców roślinnych grupyIII D lub brak obecności pałeczek E. coli, stwierdzonow 91,25% badanych surowców zielarskich (ryc.3).Oceniając czystość mikrobiologiczną poszczególnychsurowców roślinnych stwierdzono, że wymagań nie spełniało14 spośród 80 próbek, co stanowi 17,5% badanychsurowców.Wysoki stopień zanieczyszczenia grzybami, bakteriamitlenowymi i pałeczkami z rodziny Enterobacteriaceae odnotowanow surowcach Varia (35,7% próbek nie spełniającychwymagań FP VI) oraz Herba (28,5% próbek nie spełniającychwymagań FP VI). W Anthodium (14,3%), Folium(7,14%), Herba cum Radix (7,14%) oraz Radix (7,14%)liczba mikroorganizmów była niższa. Wysoką czystościąmikrobiologiczną charakteryzowały się natomiast badanepróbki: Cortex, Pericarpium oraz Rhizoma (ryc. 4).FP VI dla preparatów doustnych zawierających surowcepochodzenia roślinnego (grupa czystości mikrobiologicznejIII C) wymaga nie więcej niż 10 4 bakterii tlenowychw 1g. Około 36,7% próbek badanych preparatów zawierałomniej niż 10.000 tych mikroorganizmów w 1g, lecz aż63,3% charakteryzowało się liczbą bakterii tlenowych wyższąod 10.000 w 1g. W 30% próbek odnotowano zawartośćbakterii tlenowych w granicach 100.000-1.000.000 w 1g,a w około 16,7% próbek stwierdzono zanieczyszczenie wyższeod 1.000.000. Ponadto 10% próbek odznaczało się liczbąbakterii tlenowych wyższą od 10.000.000 w 1g (ryc. 5).Stopień zanieczyszczenia preparatów doustnych zawierającychsurowce pochodzenia roślinnego grzybami był wysoki:ich obecność odnotowano w 96,7% badanych preparatów(ryc. 6). 20% badanych próbek zawierało powyżej 100,a około 16,7% próbek powyżej 1.000 grzybów w 1g preparatu.Zanieczyszczenie wyższe od 10.000 w 1g stwierdzonow 6,7% próbek. Również 6,7% próbek zawierało więcej niż100.000 grzybów w 1g, a w 3,3% próbek liczba grzybówprzekraczała 1.000.000 w 1g. Dla grupy III C FP VI wymaganie więcej niż 10 2 grzybów w 1g, a zatem w odniesieniudo zanieczyszczeń mikologicznych, około 53% spośródbadanych preparatów, nie spełniało norm czystości mikrobiologicznej.Brak wzrostu pałeczek z rodziny Enterobacte-FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy59

iaceae odnotowano tylko w jednym przypadku, natomiastmniej niż 1 drobnoustrój z tej rodziny stwierdzono w 10%badanych preparatów. 6,7 % próbek charakteryzowało sięobecnością tych mikroorganizmów w granicach 1-10 w 1g preparatu, a 53% zawierało pałeczki w ilości 10-100 w 1gpreparatu. Obecność ponad 100 mikroorganizmów z rodzinyEnterobacteriaceae w 1 g dyskwalifikuje dany preparatpod względem wymaganej przez FP VI czystości mikrobiologicznej.Taką liczbę drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceaestwierdzono w 26,7% badanych próbek.Obecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych:E. coli, Salmonella spp. P. aeruginosa orazS. aureus nie stwierdzono w żadnym z badanych preparatów.Biorąc pod uwagę kryteria czystości mikrobiologicznejokreślone przez FP VI dla preparatów doustnych zawierającychsubstancje pochodzenia naturalnego (

Nr 6 / 2008surowców pochodzących z części nadziemnych rośliny.Z przeprowadzonych przez Kędzię analiz wynika natomiast,że do najbardziej zanieczyszczonych drobnoustrojami, należąsurowce z grupy Folium, wśród których prawie 37%zanieczyszczonych jest w bardzo wysokim stopniu bakteriamitlenowymi, grzybami pleśniowymi i drożdżoidalnymioraz pałeczkami jelitowymi. Wysokie zanieczyszczeniewymienionymi drobnoustrojami (26,5-28,1%) odnotowanorównież wśród takich surowców, jak: Flos, Radix i Herba.Wśród pozostałych: Fructus, Varia, Semen, Rhizoma orazCortex liczba surowców wysoce zanieczyszczonych drobnoustrojamibyła znacznie niższa i mieściła się granicach12,1-15,1% badanych próbek. Surowce roślinne używanebezpośrednio, jak i w postaci mieszanek, stosowane jakoodwary czy napary, wskutek działania wysokiej temperaturycharakteryzują się niskim poziomem zanieczyszczeniamikrobiologicznego. Z przedstawionych przez Kędzię[15] danych wynika, że pod wpływem gorącej wody ginąwszystkie grzyby oraz większość form wegetatywnych bakteriitlenowych. Po zaparzeniu liczba bakterii tlenowych nieprzekracza 100.000 w 1ml. W gotowym naparze lub odwarzepozostają jedynie przetrwalniki laseczek Bacillus. WedługParnowskiej [16] 88-95% naparów spełnia wymaganiafarmakopealne. Zrozumiałe jest jednak, że należy dążyć douzyskania surowców, które odpowiadać będą określonymw Farmakopei Polskiej wymaganiom [17]. Wysokie wymaganiamikrobiologiczne stawiane roślinnym preparatomleczniczym skłaniają do poszukiwania skutecznych technologiiredukujących liczbę mikroorganizmów (promieniowaniajonizującego, pary wodnej pod ciśnieniem itp.).Podsumowanie pracy• Stwierdzono, że badane surowce zielarskie: 3 Cortex, 3Radix, 3 Rhizoma, 5 Pericarpium, 7 Anthodium, 16 Herba,5 Herba cum Radix, 20 Folium i 18 Varia, byływ znacznym stopniu zanieczyszczone bakteriami tlenowymii grzybami.• Farmakopealna norma czystości mikrobiologicznej, któradla surowców grupy III D wynosi nie więcej niż 10 7bakterii w 1g, nie więcej niż 10 5 grzybów w 1g i nie więcejniż 10 2 pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae w 1g,została przekroczona w 17,5% badanych surowców.• Wykazano, że surowce pochodzące z nadziemnych częściroślin, posiadają równie wysokie zanieczyszczenie,jak i te pozyskiwane z podziemnych części roślin.• Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzonowysoki poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznegoleków doustnych zawierających surowce pochodzeniaroślinnego.• W próbkach przebadanych preparatów nie odnotowanoobecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych,takich jak: E. coli, Salmonella spp., P. aeruginosai S. aureus.• Kryteria czystości mikrobiologicznej dla preparatów doustnychzawierających substancje pochodzenia naturalnego,poza ziołami nie zostały spełnione w 24 spośród30 próbek, co stanowi 80% przebadanych preparatówdoustnych.Piśmiennictwo1. Lutomski J. Zioła, fitofarmaceutyki i nutraceutyki. PostFitoter 2001; 1: 4.2. Jambor J. Kierunki rozwoju krajowego rynku surowcówi przetworów zielarskich. Wiad Ziel 2001; 10: 1.3. Jambor J. Prognozowanie potrzeb surowcowych w zielarstwie.Wiad Ziel 2002; 2: 13.4. Kordana T. Wymagania jakościowe stawiane surowcomzielarskim przez przemysł. Wiad Ziel 2002; 12: 1.5. Farmakopea Polska wyd. VI. Pol Tow Farm, Warszawa;2002.6. Kędzia B. Zanieczyszczenie surowców zielarskich drobnoustrojamiw świetle wymagań mikrobiologicznych.Herba Pol 1994; 40: 3.7. Kędzia B. Badania nad zanieczyszczeniem surowcówzielarskich drobnoustrojami. Rozprawa habilitacyjnawykonana w Instytucie Roślin i Przetworów Zielarskichw Poznaniu, Poznań; 1999.8. Pluta J, Krutul H, Olszewski Z. Zanieczyszczenie mikrobiologicznesurowców roślinnych i produkowanychz nich granulatów. Farm Pol 1980; 36: 205.9. Hitokoto H, Morozumi S, Wauke T I wsp. Fungal contaminationand mycotoxin detection of powdered herbaldrugs. Appl Environ Microbiol 1978; 36: 252.10. Gopal NGS, Patel KM, Sharma G. Effect of heat, ethylenoxideand gamma radiation on psyllium husk. IndianJ Pharm Sci 1987; 49: 75.11. Roberts D, Watson GN, Gilbert RJ. Contamination offood plants and plants products with bacteria of publichealth significance. Soc Appl Bacteriol Symp Ser 1982;10: 169.12. Araujo AL, Ohara MT. Microbiological quality of vegetabledrugs commercialized in open - air markets foruse in infusion preparations according to the part of thevegetable used. Boll Chim Farm 2000; 142 (7): 271.13. Haenen JM, Meyvisch O. Microbial contamination ofpharmaceutical ingredients. Pharm Int 1984; 5: 192.14. Muszyński Z, Resel H. Zanieczyszczenia drobnoustrojamisurowców, sprzętów i powietrza w aptece oraz lekówprzygotowywanych w warunkach aseptycznych i bezzachowania aseptyki. [W:] Farmacja kliniczna. T.1. Poznań:Wydawnictwo Polskiego Towarzystwa Farmakologicznego;1973.15. Kędzia B. Czystość mikrobiologiczna naparów w świetleobowiązujących wymagań. Herba Pol 1995; 41: 190.16. Parnowska W. Współczesne wymagania jakości mikrobiologicznejleków w świetle zasad GMP. Farm Pol1993; 49, 18: 1.17. Strzelecka H, Wojtasik E. Jakość leków roślinnych ocenianychw procesie rejestracji. Wiad Ziel 1999; 10: 8.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy61

Antyuterotoniczne właściwości bisfenyloalaninowych analogówargininowazopresyny w badaniach kurczliwościmacicy szczurów in vitroThe antiuterotonic properties of bisphenylalanine analogsof arginine vasopressin in the in vitro rat uterus contractility invetigationsDariusz Suchy, mgr farm. Tomasz Jasiński,mgr farm. Iwona Gubała, dr Beata Jastrzębska*,Prof. dr hab. Bernard Lammek*, Prof. dr hab. Henryk I. TrzeciakKatedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,Śląski Uniwersytet Medyczny w KatowicachKierownik: Prof. dr hab. Henryk I. Trzeciak*Katedra Syntezy Organicznej, Wydział Chemii, Uniwersytet GdańskiKierownik: prof. dr hab. Bernard LammekSTRESZCZENIELeki tokolityczne, w sytuacji zagrażającego poroduprzedwczesnego, hamują czynność skurczową macicyu kobiet. Najczęściej stosuje się β 2-adrenomimetyki (fenoterol,ritodryna, salbutamol). Wywołują one jednaktachykardię u matki i u płodu.Dalsze poszukiwania doprowadziły do odkrycia atosibanu(Tractocile), pierwszego leku tokolitycznegoo strukturze peptydowej [Mpa 1 , D-Tyr(OEt) 2 , Thr 4 ,Orn 8 ]OT. Nie powoduje on zaburzeń w układzie krążenia.Otrzymano wiele dalszych analogów zarówno OT,jak i argininowazopresyny (AVP) dla zwiększenia aktywnościantyuterotonicznej.Celem niniejszych badań było oznaczenie aktywnościantyuterotonicznej dwóch nowych analogów AVP,a mianowicie [BPhe 3 ]AVP i [BPhe 3 ]DAVP. Modyfikacjaw sekwencji aminokwasowej AVP polegała na wprowadzeniuw pozycji 3 bisfenyloalaniny (BPhe) w miejscefenyloalaniny (Phe). Podobnej zmiany dokonano w cząsteczceAVP z wbudowaną D-argininą (D-Arg).Aktywność antyuterotoniczną badano in vitro na wypreparowanychrogach macicy szczurów szczepu Wistarwedług metody opisanej przez Holton. Do badań użytopłynu odżywczego van Dyke-Hastings wzbogaconegojonami Mg 2+ w modyfikacji Munsick’a. Skurcze macicymierzono przetwornikiem izometrycznym, a aktywnośćantyuterotoniczną wyrażano za pomocą wartości pA 2.Bisfenyloalaninowe analogi AVP wykazały aktywnośćantyuterotoniczną u szczurów w badaniach in vitro.Wartość pA 2dla [BPhe 3 ]AVP wynosiła 7,44 , natomiastanalog AVP o konfiguracji D o wzorze [BPhe 3 ]DAVP62 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyABSTRACTThe tocolytic drugs, in case of threatening preterm labor,inhibit the uterus contractile activity in women. Themost commonly applied drugs are β 2-adrenomimetics(fenoterol, ritodrine, salbutamol). However, they inducetachycardia in mother and fetus.Further searches led to the discovery of atosiban (Tractocile),the first tocolytic drug of peptide structure [Mpa 1 ,D-Tyr(OEt) 2 , Thr 4 , Orn 8 ]OT. It does not produce cardiovasculardisorders. There were obtained many furtheranalogs both of oxytocin (OT) and arginine vasopresin(AVP) for the increase of the antiuterotonic activity.The aim of the present investigations was the deterinationof the antiuterotonic activity of the new AVP analogs,namely [BPhe 3 ]AVP and [BPhe 3 ]DAVP. The modificationin the amino acid sequence of AVP depended onthe introduction of bisphenylalanine (BPhe) in position3 in the place of phenylalanine (Phe). The same changewas implemented in the AVP molecule with D-arginine(D-Arg) built-in.The antiuterotonic activity was investigated in vitro onthe isolated Wistar rats uterus horns accoding to the methoddescribed by Holton. In the investigations it wasused van Dyke-Hastings nutrient solution with additionof Mg 2+ ions in Munsick modification. The uteruscontractions were measured with use of the isometrictransducer and for the description of the antiuterotonicactivity it was used the pA 2value.The bisphenylalanine analogs of AVP demonstratedthe antiuterotonic activity in rats in the in vitro investigations.The pA 2value for [BPhe 3 ]AVP was 7,44,copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008hamował 2,6 razy silniej kurczliwość macicy szczura invitro. Jego wartość pA 2wynosiła 7,85.Uzyskane wyniki sugerują poszukiwania nowych analogówz wbudowaną bisfenyloalaniną do cząsteczki AVP.Słowa kluczowe: tokolityki, argininowazopresyna, bisfenyloalanina,rogi macicy, szczur, pA 2while the D configuration AVP analog of the formula[Bphe 3 ]AVP inhibited the uterus contractility in vitro2,6 times stronger. Its pA 2value was 7,85.The obtained results suggest the searches for the newanalogs with bisphenylalanine built into the AVP particle.Key words: tocolytics, arginine vasopressin, bisphenylalanine,uterus horns, rat, pA 2WSTĘPLeki tokolityczne, w sytuacji zagrażającego poroduprzedwczesnego, hamują czynność skurczową macicy u kobiet.Najczęściej stosuje się β 2-adrenomimetyki (fenoterol,ritodryna, salbutamol). Niestety leki te wywołują hipotensjęi tachykardię [1]. Ich dodatni efekt chronotropowy wynikaz faktu, iż w dużych dawkach wykazują agonizm w stosunkudo adrenergicznych receptorów β 1. Pobudzenie receptorówβ 1w sercu powoduje przyspieszenie jego pracy [2]. Stosowanesą również: siarczan magnezu, niesteroidowe lekiprzeciwzapalne, progesteron i jego pochodne oraz leki blokującekanały wapniowe. Wymienione klasyczne leki wykazująszereg poważnych działań niepożądanych, którychnasilenie nierzadko prowadzi do konieczności zaprzestaniaterapii.Alternatywę stanowi zastosowanie atosibanu (Tractocile® ), pierwszego leku tokolitycznego o strukturze peptydowej[Mpa 1 , D-Tyr(OEt) 2 , Thr 4 , Orn 8 ]OT. Wykazujeporównywalną skuteczność w opóźnianiu porodu, jak lekipobudzające receptory β 2-adrenergiczne, przy czym jegodziałania niepożądane obejmują głównie mniej poważneefekty w postaci nudności, wymiotów, bólu głowy [3]. Wadamiatosibanu są natomiast wysoka cena i krótki czas działania,który skutkuje koniecznością podawania preparatuw ciągłym wlewie dożylnym.Prowadzi się więc poszukiwania nowych peptydowychleków tokolitycznych o lepszych właściwościach antyuterotonicznychoraz farmakokinetycznych. Badania obejmująpochodne argininowazopresyny (AVP), jak i oksytocyny(OT).Porodem przedwczesnym nazywamy poród następującyw wyniku ciąży, która trwała krócej niż 37 ukończonych tygodni,to jest w okresie poniżej 259 dni. W USA problemten należy do jednego z głównych problemów zdrowia publicznego[4]. W krajach rozwiniętych przedwczesny poródjest znaczącą przyczyną śmiertelności okołoporodowej(około 75 %) [5]. Dzieci urodzone przedwcześnie wykazująwiększe od przeciętnej problemy kognitywne [6]. Występująrównież zaburzenia słuchu [6], wzroku, czucia oraz mowy[4]. W 2005 roku w USA koszty związane z przedwczesnymiporodami sięgnęły 26,2 miliarda dolarów [7].Na świecie zauważalny jest nieustający wzrost liczbyprzedwczesnych porodów. W 1981 roku 9,4 % żywych urodzeństanowiły wcześniaki [8]. Zgodnie z utrzymującym siętrendem, liczba ta w 2005 roku sięgnęła 12,7 % [8].copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073CEL PRACYW niniejszej pracy postanowiono wykazać antyuterotonicznewłaściwości dwóch nowych pochodnych argininowazopresyny(AVP) z wbudowaną bisfenyloalaniną (BPhe)w pozycji 3, w miejscu fenyloalaniny (Phe). W cząsteczkachbadanych peptydów w pozycji 8 łańcucha aminokwasowegowystępowała naturalna L-arginina lub D-arginina(D-Arg), dając analogi o wzorach: [BPhe 3 ]AVP oraz[BPhe 3 ]DAVP. Celem pracy było określenie siły działaniaantyuterotonicznego pochodnych AVP oraz wykazanie różnicyw sile działania występującej pomiędzy wymienionymistereoizomerami w warunkach in vitro z użyciem izolowanychrogów macicy szczura.MATERIAŁYBadane pochodne argininowazopresyny (ryc. 1) zostałyotrzymane przez zespół chemików z Katedry Syntezy OrganicznejUniwersytetu Gdańskiego pod kierownictwem prof.dr hab. inż. Bernarda Lammka, a potwierdzenie ich budowychemicznej oraz czystości uzyskano metodami fizykochemicznymi.Siłę działania antyuterotonicznego peptydów oznaczanowobec octanu oksytocyny (Sigma-Aldrich Co. Ltd., USA)– jako agonisty receptorów oksytocynowych.Odpowiednie naważki OT oraz analogów AVP rozpuszczanow wodzie destylowanej. W wyniku doboru właściwychproporcji pierwotnie uzyskiwano roztwory o stężeniu1 μM. Otrzymane roztwory macierzyste pozwalały następneprzygotować próbki o żądanych stężeniach metodą kolejnychrozcieńczeń.Badania właściwości antyuterotonicznych analogówargininowazopresyny przeprowadzano in vitro, na wypreparowanychrogach macicy szczurów szczepu Wistar. Naprzeprowadzanie eksperymentów na zwierzętach uzyskanozgodę Lokalnej Komisji ds. Doświadczeń na Zwierzętachw Katowicach (Uchwała nr 92 / 2006 z dnia 29.11.2006 r.).Masa ciała samic mieściła się w przedziale 190 – 250 g. Warunkibytowania zwierząt cechowały stałe parametry temperaturowe(20 ± 2°C) i oświetleniowe (12 h światło – mieszane:naturalne i sztuczne – i 12 h ciemność). Szczurzycomna 17-18 godzin przed doświadczeniem jednorazowo podawano800 μg / kg i.m. walerianianu estradiolu (JenapharmGmbH, Niemcy). Estrogen zastosowano w celu sztucznegowywołania u zwierząt fazy estrus. Skutkowało to wzrostemFarmaceutycznyPrzegląd Naukowy63

liczby połączeń szczelinowych oraz receptorów oksytocynowychw myometrium macicy, symulując w ten sposóbfazę okołoporodową ciąży [9].Szczury usypiano tiobutabarbitalem sodowym (Inactin ® ,Sigma-Aldrich Co. Ltd., USA), podawanym w iniekcji dootrzewnowejw jednorazowej dawce 500 μg / kg m.c. Wypreparowanerogi macicy długości około 2 cm zawieszanopionowo w szklanych naczyniach inkubacyjnych o pojemności20 mL (fot. 1), wypełnionych płynem kąpielowymVan Dyke-Hastings w modyfikacji Munsick’a, termostatowanymw temperaturze 37 ± 1°C oraz nasycanym karbogenem(gazem o składzie: 95% O 2i 5% CO 2). Pozwalało toutrzymać wartość pH około 7,4 [10].Wolne końce rogów macicy łączono z izometrycznymprzetwornikiem siły skurczu typu K-30 (Hugo Sachs Elektronik,Niemcy) i obciążano napięciem wstępnym 1,0 g [11].Czynność skurczową mięśnia macicy in vitro rejestrowanoza pomocą czterokanałowego rejestratora R-50 (RikadenkiElectronics, Japonia) oraz integratorów dwukanałowych(IGEL, Polska).Nr 6 / 2008METODYDo badania aktywności antyuterotonicznej analogów AVPwzględem oksytocyny zastosowano metodę opracowanąprzez Holton [12]. OT podawano w stężeniach 1 nM, 10 nMoraz 100 nM – samodzielnie lub w zestawieniu z badanymanalogiem, po upływie 1 min od podania antagonisty. Peptydyo działaniu antagonistycznym stosowane były w stężeniach30 nM, 60 nM i 100 nM. Do wyrażenia aktywności antyuterotonicznejzastosowano parametr pA 2, który liczbowo stanowiujemny logarytm dziesiętny ze stężenia antagonisty, któreredukuje efekt podwójnego stężenia agonisty do takiego, jakiwywołuje jego pojedyncze stężenie [13]. Jest to parametr odnoszącysię do antagonistów kompetycyjnych [14].W obliczeniach wartości pA2 posłużono się programemkomputerowym Pharma 4.0 [15].WYNIKIWyniki badań antyuterotonicznego działania pochodnychAVP przedstawiono w tabeli 1. Oznaczona wobec oksytocynywartość parametru pA 2dla peptydu [BPhe 3 ]DAVPUproszczonywzór analoguAVP[(BPhe) 3 ]DAVP[(BPhe) 3 ]AVPEC 50x ± SD(nmol / kg)14,23 ± 7,12n = 336,66 ± 18,80n = 464 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowypA 2x ± SD7,85 ± 0,30n = 37,44 ± 0,27n = 4EC 50– stężenie antagonisty, które redukuje efekt podwójnegostężenia agonisty do takiego, jaki wywołuje jego pojedynczestężenie w nieobecności antagonisty, x – wartośćśrednia, SD – odchylenie standardowe dla 3 – 4 rogów macicy,n – liczebność próbyTabela I. Siła działania antyuterotonicznego bisfenyloalaninowychpochodnych argininowazopresyny o wzorach[BPhe 3 ]DAVP i [BPhe 3 ]AVPFot. 1. Wypreparowany róg macicyw naczyniu inkubacyjnymwyniosła 7,85 ± 0,30, natomiast dla pochodnej [BPhe 3 ]AVP– 7,44 ± 0,27. Na podstawie uzyskanych wartości EC 50:14,23 ± 7,12 i 36,66 ± 18,80 nmol / kg, odpowiednio dla[BPhe 3 ]DAVP i [BPhe3]AVP, obliczono ich stosunek wynoszący1 : 2,6. Oznacza to, że wobec oksytocyny bisfenyloalaninowapochodna AVP z wbudowaną D-argininą działałaponad 2,5 × silniej niż z wbudowaną białkową L-argininą.DYSKUSJADo inkubacji wyizolowanych rogów macicy podczas doświadczeńzastosowano płyn odżywczy Van Dyke-Hastingsw modyfikacji Munsick’a. Modyfikacja płynu odżywczegowprowadzona przez Munsick’a polegała na dodatku jonówmagnezu w stężeniu 0,5 mmol / L, co optymalnie nasilaskurczową reakcję myometrium na działanie peptydowychagonistów [10]. Szczury usypiano za pomocą roztworu tiobutabarbitalusodowego, minimalizując zaburzenia krążeniau zwierząt.W doświadczeniach jako agonistę zastosowano oksytocynę.Jest ona silniejszym czynnikiem uterotonicznym niżargininowazopresyna (AVP), co wyraża się w wielkości jejparametru pD 2. Służy on do opisu siły działania uterotonicznegoi stanowi ujemny logarytm dziesiętny ze stężenia agonisty,które powoduje 50% maksymalnej odpowiedzi [13].pD 2dla OT wynosi 9,23 ± 0,09, podczas gdy dla AVP – 8,55± 0,13 [16]. Implikuje to, że uzyskane wielkości siły działaniaantyuterotonicznego badanych analogów AVP byłyniższe, niż wobec hipotetycznego zastosowania AVP jakopeptydu agonistycznego.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008Argininowazopresyna (AVP) jest nonapeptydowymhormonem wywołującym równieżskurcz myometrium macicy. W niniejszej pracyprzebadano jej pochodne, w których dopierścienia fenyloalaniny (Phe) w pozycji 3dobudowano w pozycji para rodnik fenylowy.Wykazano, że ta modyfikacja w diametralnysposób wpływa na zmianę profilu działaniapeptydu z agonistycznego na antagonistyczny.Zgodne jest to z obserwacjami zgłaszanymirównież przez innych autorów. W 1995 rokuManning i wsp. dokonali podstawienia fenyloalaniny(Phe) w pozycji 3 argininowazopresyny(AVP) – konformacyjnie ograniczonymaminokwasem: kwasem 1,2,3,4-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowym(Tic) [17]. Peptyd[Tic 3 ]AVP wykazał znaczący spadek działaniaagonistycznego wobec wazopresynowych receptorówV 1ai V 2oraz oksytocynowych OT.Uważa się, że pochodna ta może stanowićcenny związek wyjściowy do opracowaniabardziej selektywnych doustnych leków stosowanychw moczówce prostej [17]. Sugeruje toistotność przyszłościowych badań wyżej wymienionychpochodnych argininowazopresynypodstawionych w pozycji 3 – bisfenyloalaniną(BPhe) pod względem tego zastosowania.Badania Stoev’a i wsp. z 1999 roku wskazująnatomiast, że nie każda zmiana wprowadzonaw pozycji 3 argininowazopresynyskutkuje powstaniem związków o właściwościach antyuterotonicznych[18]. Podstawienie mieszanego alifatyczno-aromatycznegoaminokwasu – tienyloalaniny (Thi)umożliwiło otrzymanie peptydu [Thi 3 ]AVP o silniejszychwłaściwościach antydiuretycznych i oksytotycznych niżpeptyd wyjściowy. Zastąpienie fenyloalaniny (Phe) w pozycji3 cząsteczki argininowazopresyny przez alifatyczneaminokwasy, cykloheksyloalaninę (Cha), norleucynę (Nle),leucynę (Leu), norwalinę (Nva) i walinę (Val) spowodowałootrzymanie peptydów nie wykazujących właściwości agonistycznychwobec receptorów oksytocynowych przy zachowanymsilnym agonizmie wobec receptorów wazopresynowychV 2i działaniu antydiuretycznym. Z badań Stoev’ai wsp. wynika, że podstawienie w pozycji 3 cząsteczki AVP– aminokwasów aromatycznych [tryptofan (Trp), 2-naftyloalanina(2-Nal)], strukturalnie ograniczonych [prolina (Pro)],polarnych [treonina (Thr)] lub posiadających ładunek [arginina(Arg), ornityna (Orn)] skutkuje zanikiem działania agonistycznegowobec receptorów oksytocynowych in vitro [18]. Podstawieniearomatycznego aminokwasu – bisfenyloalaniny (BPhe)– daje rezultat w postaci pochodnych [BPhe 3 ]DAVP i [BPhe-3]AVP nie wykazujących działania kurczącego myometriummacicy, natomiast o wyraźnych właściwościach antyuterotonicznych,co jest zgodne z powyższymi obserwacjami.Z drugiej strony, badania nad zastąpieniem fenyloalaniny(Phe) w pozycji 3 cząsteczki AVP przez aromatyczną L-2--naftyloalaninę (L-2-Nal) wykazały, że peptyd [(L-2-Nal)3 ]DAVP jest jednym z najsilniejszych antagonistów działanianaczynioskurczowego AVP, przy czym pozbawiony jestaktywności antyuterotonicznej [19].A. wzór strukturalny AVP, B. wzór strukturalny analogów [(BPhe) 3 ] AVPi [(BPhe) 3 ] DAVP. Kolorem zielonym wskazano różnicę w stosunku docząsteczki argininowazopresyny; kolorem czerwonym znaczono aminokwasróżny dla obu badanych peptydówRyc. 1. Porównanie budowy chemicznej argininowazopresyny(AVP) i jej badanych analogówW dotychczasowym piśmiennictwie nie napotkano informacjidotyczących wpływu podstawienia bisfenyloalaninyna działanie antyuterotoniczne peptydów.Przeprowadzone badania wykazały silniejsze właściwościantyuterotoniczne wykazał peptyd z wbudowanąD-argininą – [BPhe 3 ]DAVP niż z wbudowaną L-argininą– [BPhe 3 ]AVP. Odwrotne zjawisko występowało natomiastw przypadku analogów podstawionych L-2-naftyloalaniną(L-2-Nal) zamiast bisfenyloalaniny (BPhe), co stwierdziłLammek i wsp. Peptyd o wzorze [(L-2-Nal) 3 ]DAVP niewykazywał właściwości antyuterotonicznych, natomiastpochodna [(L-2-Nal) 3 ]AVP posiadała słabe działanie antyuterotoniczne[19].Dotychczasowe wyniki badań wskazują, że modyfikacjaaminokwasów w pozycji 3 w cząsteczce AVP wpływa nietylko za wiązanie peptydu i jego analogów do receptora,lecz także determinuje jego działanie presyjne, antydiuretycznei uterotoniczne.Podsumowując, badane bisfenyloalaninowe analogi argininowazopresynyo wzorach [BPhe 3 ]DAVP i [BPhe 3 ]AVPwykazały w badaniach in vitro właściwości antyuterotoniczne,antagonistyczne w stosunku do oksytocyny. Siła działaniaantyuterotonicznego obu pochodnych, wyrażona w postaciparametru pA 2, była wyraźna i wynosiła odpowiednio7,85 i 7,44. Pochodna z wbudowaną argininą o konfiguracjiD (D-Arg) – [BPhe 3 ]DAVP wykazała silniejsze działanieniż analog z wbudowaną argininą o konfiguracji L (L-Arg)– [BPhe 3 ]AVP. Stereoizomeria argininy w pozycji 8 okazałasię więc wywierać znaczący wpływ na profil działania antyuterotonicznegobadanych analogów.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy65

WNIOSKI1. Dołączenie pierścienia fenylowego do fenyloalaniny(Phe) w pozycji 3 cząsteczki AVP, powoduje diametralnązmianę jej działania z agonistycznego na antagonistycznebisfenyloargininowazopresyny in vitro u szczurów.2. Bisfenyloalaninowe pochodne AVP posiadają wyraźnewłaściwości antyuterotoniczne.3. Peptyd [BPhe 3 ]DAVP, zawierający D-argininę (D-Arg)w pozycji 8, wykazuje 2,6 × silniejsze działanie antyuterotonicznew badaniach in vitro u szczurów niż pochodnaz wbudowaną L-argininą o wzorze [BPhe 3 ]AVP.PIŚMIENNICTWO1. Raymajhi R, Pratap K. A comparative study between nifedipineand isoxsuprine in the suppression of pretermlabour. Kathmandu Univ Med J (KUMJ) 1: 85-90, 2003.2. Kobayashi M, Takeda K, Murata S i wsp. Pharmacologicalcharacterization of KUR-1246, a selective uterinerelaxant. J Pharmacol Exp Ther 297: 666-671, 2001.3. Worldwide atosiban versus beta-agonists study group.Effectiveness and safety of the oxytocin antagonist atosibanversus beta-adrenergic agonists in the treatmentof preterm labour. Br J Obstet Gynaecol 108: 133-142,2001.4. Allen MC. Neurodevelopmental outcomes of preterminfants. Curr Opin Neurol 21: 123-128, 2008.5. Ananth CV, Vintzileos AM. Epidemiology of pretermbirth and its clinical subtypes. J Matern Fetal NeonatalMed 19: 773-782, 2006.6. Gomot M, Bruneau N, Laurent JP i wsp. Left temporalimpairment of auditory information processing in prematurelyborn 9-year-old children: an electrophysiologicalstudy. Int J Psychophysiol 64:123-129, 2007.7. Behrman RE, Butler AS. Introduction. [W:] PretermBirth: Causes, Consequences, and Prevention, red.Behrman RE, Butler AS, The National Academies Press,Washington, D.C., 31-52, 2007.8. Hamilton BE, Miniño AM, Martin JA i wsp. Annualsummary of vital statistics: 2005. Pediatrics 119: 345--360, 2007.9. Slaninová J. Fundamental biological evaluation. [W:]CRC Handbook of Neurohypophyseal Hormone Analogs,eds., Jošt K, Lebl M, Brtnik F, CRC Press, Inc.,Boca Raton, Florida, vol. I, part 2, 83-107, 1987.10. Munsick RA. Effect of magnesium ion on the responseof the rat uterus to neurohypophysial hormones and analogues.Endocrinology 66: 451–457, 1960.11. Schriefer JA, Molineaux CJ. Modulatory effect on endopeptidaseinhibitors on bradykinin-induced contractionof rat uterus. J Pharmacol Exp Ther 266: 701-706,1993.12. Holton P. A modification of the method of Dale and Laidlawfor standardization of posterior pituitary extract.Br J Pharmacol Chemother 3: 328-334, 1948.13. Whalley ET. The action of bradykinin and oxytocin onthe isolated whole uterus and myometrium of the rat inoestrus. Br J Pharmacol 64: 21-28, 1978.66 FarmaceutycznyPrzegląd NaukowyNr 6 / 200814. Ariens EJ, van Rossum JM. pDx, pAx and pDx’ valuesin the analysis of pharmacodynamics. Arch Int Pharmacodyn110: 275-99, 1957.15. Tallarida RJ, Murray RB. Manual of PharmacologicCalculations, Springer Verlag, Berlin–Heidelberg–NewYork, 1987.16. Kawamata M , Mitsui-Saito M, Kimura P i wsp. Vasopressin-inducedcontraction of uterus is mediated solelyby the oxytocin receptors in mice, but not in humans.Eur J Pharmacol 472:229-234, 2003.17. Manning M, Cheng LL, Stoev S i wsp. An exploration ofthe effects of L- and D-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid substitutions at positions 2, 3 and 7 in cyclicand linear antagonists of vasopressin and oxytocin andat position 3 in arginine vasopressin. J Pept Sci 1: 66-79,1995.18. Stoev S, Cheng LL, Olma A i wsp. An investigation ofposition 3 in arginine vasopressin with aliphatic, aromatic,conformationally-restricted, polar and charged aminoacids. J Pept Sci 5: 141-153, 1999.19. Lammek B, Czaja M, Derdowska I i wsp. Influence ofL-naphthylalanine in position 3 of AVP and its analogueson their pharmacological properties. J Pept Res 49: 261--268, 1997.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Nr 6 / 2008English for Pharmacists,czyli jak przygotować się do egzaminu z języka angielskiego,który wymagany jest do specjalizacji.Read the text and complete the activities which follow:PDB = Protein Data BankThe Protein Data Bank (PDB) was the first bioinformaticsresource to store three-dimensional protein structures.It stores and provides access to all publicly availablethree-dimensional structures for proteins, nucleic acids,and other important biomolecules. Originally developedat Brookhaven National Laboratories, the PDB is nowmanaged by the Research Collaboratory for StructuralBioinformatics. Also helpful are programs that enablescientists to visualize and manipulate molecular structuresin three-dimensional space. Using such programs, scientistscan locate amino acids within proteins that are associatedwith disease or with the active site of an enzyme.WORDS:resource – zasoby, źródłostore – magazynowaćthreedimensional – trójwymiarowyprovide – dostarczaćaccess – dostępavailable – dostępnymanage – zarządzaćspace – przestrzeńsite – miejsce, siedziba (= lokalizacja)TASKS:I. In the text find all the words and phrases you don’t understand.Use your dictionary and translate them. Lookup their pronunciation in the dictionary.II. Read the text aloud.III. Decide which of these statements are true (T) or false(F).1. The Protein Data Bank (PDB) was the first bioinformaticsresource to save and magazine three-dimensionalprotein structures.2. Originally developed at the Research Collaboratoryfor Structural Bioinformatics Brookhaven National Laboratories,the PDB is now managed by the BrookhavenNational Laboratories.3. Hardly helpful are programs that enable scientists tovisualize and manipulate molecular structures in three--dimensional space.4. Using computer programs, scientists localize aminoacids in proteins that are associated with disease or withthe active site of an enzyme.2. The PDB stores and provides access to all publiclyavailable three-dimensional structures for proteins, nucleicacids, and other important biomolecules.3. The PDB is now managed by the Research Collaboratoryfor Structural Bioinformatics.4. Scientists can locate amino acids within proteins thatare associated with disease or with the active site of anenzyme.Look for the answers on this page.Drodzy Czytelnicy!Równolegle do English Booster Dose, przygotowałyśmyinny cykl spotkań z językiem angielskim, Englishfor Pharmacists. W cyklu tym, wykorzystując wieloletniedoświadczenie Anny W. Kierczak, jako egzaminatoraspecjalistycznego języka angielskiego, pragniemypomóc Państwu przygotować się do egzaminu z językawymaganego do specjalizacji. Prosimy o nadsyłanieWaszych opinii, uwag i sugestii.E-mail: engcent@slam.katowice.plAdres: Studium Języków Obcych Wydziału FarmaceutycznegoŚAM, ul. Ostrogórska 30, 41-200 Sosnowiec.Anna W. Kierczak i Agata SitkoAnswers:Task III:1.T; 2.F; 3.F; 4.T.Task V Possible questions:1. What does The Protein Data Bank (PDB) store?2. Who stores and provides access to all publicly availablethree-dimensional structures for proteins, nucleicacids, and other important biomolecules?3. Whom/who is the PDB managed by?4. What can scientists locate within proteins that are associatedwith disease or with the active site of an enzyme?IV.Translate the text into Polish.V. Ask for the underlined parts of the following sentences:1. The Protein Data Bank (PDB) was the first bioinformaticsresource to store three-dimensional protein structures.copyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy67

Nr 6 / 2008English Booster Dose 33Take your booster dose of English! This is our next meeting with three friends. You can refresh your English while readingabout their everyday life. This time we may read about dietary supplements.Dietary suppplementsBarbara:Susan:Barbara:Susan:Barbara:Susan:Barbara:Susan:Barbara:Susan:Barbara:Susan:Barbara:Susan:Barbara:Would you like some more coffee?Yes, please. It’s very good. You’ve always made excellent coffee! What’s your secret?Thanks. My secret is timing and a good brand of coffee. But, tell me again what was that importantissue you needed to discuss with me so urgently?You see, I feel totally exhausted. I don’t know whether it’s the springtime or it’s only me and my lifestyle. Anyhow, I’ve been thinking of buying some dietary supplements. There are so many advertismentsand such a big choice that it’s really hard to decide. That’s why I’m here, I need your advice.Well, but dietary supplements can be vitamins, minerals, herbs or other plants, amino acids or partsof other substances. Not all herbs and supplements are safe.What should I buy, then?Certain supplements are recommended for various conditions. For example, calcium supplementsare supposed to help prevent osteoporosis, and iron is recommended for people who are anemic.There are also supplements that enhance performance such as creatine, chromium picolinate,protein shakes, amino acids. They are widely advertised today but are not needed by the averageperson. You’d better choose a healthy diet.But I need something more.You can’t depend on pills alone to provide your body with the nutrients it needs, though vitaminand mineral supplements are good to take in many instances.I think I eat my fruits and veggies but I still don’t feel too well.But, do you realize that like conventional medicines, dietary supplements may cause side effects,trigger allergic reactions, or interact with prescription and nonprescription medications. What’s more,the way dietary supplements are manufactured may not be standardized. Because of this,how well they work or any side effects they cause may differ among brands. The form of supplementthat you buy in health food or grocery stores may not be the same as the form used in research.OK, it’s sounds reasonable but so far you haven’t told me what to buy.Well, you’d better do some blood tests to check whether you really need any supplementationand then talk to a dietetician. A specialist can offer you a better advice than me.Maybe you’re right. I’ve never thought that vitamins or minerals are medications. I’ve thoughtI can take them whenever I want.I must say that most of people think that way and when they come to my pharmacy they wantto buy the very thing they saw advertised on TV last night.Don’t forgetdietary supplements – suplementy dietybrand of coffee – gatunek kawyissue – sprawa, kwestiaurgently – pilnieexhausted – wyczerpana/yadvertisments – reklamyprevent – zapobiecenhance performance – zwiększyć sprawnośćcreatine – kreatynachromium picolinate – pikolinat chromuprotein shakes – napoje proteinoweaverage – przeciętny; średninutrients – substancje odżywczein many instances – w wielu przypadkachveggies (vegetables) – warzywatrigger allergic reactions – zapoczątkować reakcję alergicznąinteract – oddziaływać na siebie; wchodzić w reakcjeprescription and nonprescription medications – leki na receptę i bez receptyhealth food stores – sklepy ze zdrową żywnościągrocery stores – sklepy spożywczeresearch – badaniadietetician – dietetykthe very thing they saw advertised – tą samą rzecz, którą widzieli w reklamieDrodzy Czytelnicy!Mamy nadzieję, że zaciekawiła Was nasza propozycja krótkich spotkań z językiem angielskim. Chętnie poznamy Wasząopinię. Czekamy na Wasze uwagi, komentarze, sugestie oraz propozycje i oczekiwania. Nasz e-mail: engcent@slam.katowice.plNasz adres: Studium Języków Obcych Wydziału Farmaceutycznego ŚUM, ul. Ostrogórska 30,41-200 Sosnowiec.Agata Sitko, Anna. W. Kierczak68 FarmaceutycznyPrzegląd Naukowycopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073

Regulamin redagowania pracw „Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym”1. FPN zamieszcza prace oryginalne (doświadczalnei kliniczne) oraz poglądowe, z zakresu nauk farmaceutycznych,medycznych i nauk pokrewnych. Ponadto, FPNpublikuje listy do Redakcji, sprawozdania i materiały zezjazdów naukowych, recenzje książek oraz komunikatyo planowanych kongresach i zjazdach naukowych.2. Manuskrypt w języku polskim należy przesyłać w formieelektronicznej na adres: fpn@kwiecinski.pl (w wyjątkowychprzypadkach na dyskietce 3,5” lub dysku CD-ROM)oraz – w dwóch egzemplarzach wydruku komputerowegona adres Redakcji. Opis dysku powinien zawierać imięi nazwisko pierwszego autora i tytuł pracy. Teksty i grafikipowinny tworzyć osobne zbiory. Nie należy umieszczaćrycin i fotografii w plikach tekstowych. Redakcja zalecaużycie edytorów tekstów: Star Office, Word, Word Perfect.Preferowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor: CMYK, rozdzielczość300 dpi.3. Prace podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonychkażdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęcasię autorów do proponowania nazwisk recenzentów.Redakcja zastrzega sobie prawo dokonywania popraweki skrótów tekstu (w porozumienia z autorem).4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca niebyła uprzednio publikowana ani nie została wysłana doredakcji innego czasopisma oraz – zgodę Kierownika Jednostki,skąd praca pochodzi, na zamieszczenie publikacjiw czasopiśmie.5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach,które są przedmiotem pracy naukowej, opisanejw manuskrypcie, muszą mieć akceptację, odpowiednio,Komisji Bioetycznej lub Etycznej.6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacjiredakcji.7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół prawautorskich do wydrukowanych prac (w tym prawo dowydania drukiem, na nośnikach elektronicznych CD i innychoraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast drukowaniestreszczeń bez zgody Wydawcy.8. Instrukcja dla autorów8.1. Maszynopis powinien być drukowany jednostronniena białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnegoodstępu między wierszami oraz marginesem2,5 cm.8.2. Strona tytułowa powinna zawierać: tytuł lub stopieńnaukowy, imię i nazwisko (imiona i nazwiska) autoróww pełnym brzmieniu, tytuł pracy w języku polskim iangielskim, nazwę placówki naukowej, oraz tytuł lubstopień naukowy, imię i nazwisko kierownika placówkinaukowej, skąd pochodzi praca. U dołu strony należypodać imię i nazwisko oraz adres, telefon i e-mail autoraodpowiedzialnego za korespondencję, dotyczącąmanuskryptu.8.3. Druga strona manuskryptu powinna zawieraćstreszczenie (150-250 słów w języku polskim i angielskim),w którym należy podać krótkie wprowadzenie, cel badania,podstawowe procedury (wybór badanych osób lubzwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wynikioraz wnioski. Pod streszczeniem należy umieścić słowakluczowe w języku polskim i angielskim, zgodnie z MedicalSubject Headings Index Medicus8.4. Oryginalne prace powinny być podzielone narozdziały, według schematu: wstęp, materiał i metody,wyniki badań, dyskusja oraz wnioski.8.5. Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejnościcytowania w tekście pracy. Skróty tytułów czasopismpowinny być zgodne z Index Medicus. Każda pozycja– pisana od nowego wiersza, powinna być opatrzonanumerem oraz zredagowana zgodnie z niżej podanymprzykładem:· czasopismo naukowe:Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypicmultisystem fibrotic disorder.J Clin Invest 2007; 117: 557-67.Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należypodać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.Komosińska-Vassev K i wsp.: Graves’ disease-associatedchanges in the serum lysosomal glycosidases activityand the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta2003; 331: 97-102.· wydawnictwo zbiorowe:Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: BiochemiaHarpera. Red. Murray RK i wsp. WydawnictwoLekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69.· monografia:Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław 2004.Powołania w tekście, umieszczone w nawiasachkwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi.Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć:w pracach oryginalnych do 20 pozycji, w poglądowychdo 30 i w pozostałych do 10.8.6. Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białei kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej kopercie,ponumerowane, opatrzone nazwiskiem autorai tytułem pracy, z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycinnależy podać na oddzielnej stronie z numerami ilustracjipodanymi cyframi arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzedniopublikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodęWydawcy na ponowną publikację.8.7. Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie,należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułamiumieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać naoddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframirzymskimi.8.8. Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowejwynosi 10, pozostałych – 5 stron.Adres Redakcji:Farmaceutyczny Przegląd Naukowy41-200 Sosnowiecul. Jedności 8Tel. 500 722 219e-mail: fpn@kwiecinski.plcopyright © 2008 Grupa dr. A. R. KwiecińskiegoISSN 1425-5073FarmaceutycznyPrzegląd Naukowy69

FarmaceutycznyPISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACHMiesięcznikWYDAWCAPrzegląd NaukowyUprzednio pod tytułem PORADNIK FARMACEUTYIndex Copernicus 2,51PRENUMERATAProsimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literamio dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeratyotrzymająPaństwo po około 2 tygodniachod dokonania wpłaty.Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeratyi Kolportażu:Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-BiałaTEL. 033 817 38 99Nr rachunku odbiorcy:74 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2ODBIORCA:74 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............Nr rachunku odbiorcy:74 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2ODBIORCA:74 1050 1070 1000 0090 6083 4158Grupa dr. A. R. Kwiecińskiegoul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Białakwota:.......................................................................................wpłacający:................................................................................................................................................................................................................................................................................ZamawiamPRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYFARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWYNr ............