Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
TARTU ÜLIKOOL<br />
LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND<br />
MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT<br />
GENEETIKA ÕPPETOOL<br />
Triin Elmi<br />
<strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> <strong>DC3000</strong> <strong>levaansukraasi</strong> <strong>Lsc3</strong> katalüütilise<br />
tsentri aminohapete kindlakstegemine mutatsioonanalüüsiga<br />
Bakalaureusetöö<br />
Juhendajad: Triinu Visnapuu, magister<br />
dots Tiina Alamäe, bioloogiakandidaat<br />
TARTU 2011
SISUKORD<br />
SISUKORD ...................................................................................................................................... 2<br />
KASUTATUD LÜHENDID ............................................................................................................ 3<br />
SISSEJUHATUS .............................................................................................................................. 4<br />
1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ....................................................................................................... 5<br />
1.1 Glükosiidi hüdrolaasid ............................................................................................................ 5<br />
1.2 Glükosiidi hüdrolaaside perekondadesse 32 ja 68 kuuluvate valkude omadused ja ehitus .... 5<br />
1.3 Fruktosüültransferaaside ehitus ja aktiivtsenter...................................................................... 7<br />
1.3.1 Fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped ja kristallstruktuurid ................... 7<br />
1.3.2 Fruktosüültransferaaside mutatsioonianalüüs ................................................................ 11<br />
2. EKSPERIMENTAALOSA ........................................................................................................ 13<br />
2.1 Töö eesmärgid ...................................................................................................................... 13<br />
2.2 Materjal ja metoodika ........................................................................................................... 13<br />
2.2.1 Kasutatud tüved ja plasmiidid ........................................................................................ 13<br />
2.2.2 Levaansukraasi geeni suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3 vektorisse ......... 14<br />
2.2.3 Elektroporatsioon, kolooniate kontrollimine, DNA eraldamine ja sekveneerimine ...... 16<br />
2.2.4 Transformantide kasvatus, <strong>levaansukraasi</strong>de ekspresseerimine ja rakuekstraktide<br />
tegemine .................................................................................................................................. 17<br />
2.2.5 Levaansukraasi aktiivsuse määramine ........................................................................... 18<br />
2.2.6 Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de puhastamine Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga .................. 19<br />
2.2.7 Geelelektroforees ........................................................................................................... 20<br />
2.2.8. Õhukese kihi kromatograafia ........................................................................................ 21<br />
2.3 Tulemused ja arutelu ............................................................................................................ 21<br />
2.3.1 Levaansukraasi <strong>Lsc3</strong> võimalike katalüütiliste aminohapete ennustamine ja vastavate<br />
mutantide konstrueerimine ..................................................................................................... 21<br />
2.3.2 Levaansukraasi mutantide iseloomustamine ja katalüütilise kolmiku aminohapete<br />
identifitseerimine .................................................................................................................... 25<br />
2.3.2.1 Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de ekspresseerimine, transformantide fenotüübi uurimine<br />
ning <strong>levaansukraasi</strong> koguaktiivsused rakuekstraktides ........................................................... 25<br />
2.3.2.2 Mutantsete valkude puhastamine ja nende kineetilised parameetrid .......................... 29<br />
2.3.2.3 Mutantsete <strong>Lsc3</strong> valkude polümerisatsiooniproduktid ............................................... 31<br />
2.3.2.4 Valgu <strong>Lsc3</strong> katalüütilise kolmiku aminohapete identifitseerimine ............................ 33<br />
KOKKUVÕTE ............................................................................................................................... 34<br />
SUMMARY ................................................................................................................................... 35<br />
KASUTATUD KIRJANDUS ........................................................................................................ 36<br />
KASUTATUD VEEBIAADRESSID ............................................................................................ 39<br />
LISA 1<br />
LISA 2<br />
LISA 3<br />
2
KASUTATUD LÜHENDID<br />
ah – aminohape<br />
AjFT – Aspergillus japonicus’e fruktosüültransferaas<br />
Ala (A) – alaniin<br />
Amp – ampitsilliin<br />
ap – aluspaar(i)<br />
Asn (N) – aparagiin<br />
Asp (D) – aspartaat<br />
CAZy – Carbohydrate-Active enZYmes Database<br />
DNSA – 3,5-dinitrosalitsüülhape<br />
FEH – fruktaani eksohüdrolaas<br />
FOS – fruktooligosahhariid<br />
FTF – fruktosüültransferaas<br />
GH – glükosiidi hüdrolaas<br />
Glu (E) – glutamaat<br />
His (H) – histidiin<br />
Inu – Lactobacillus reuteri inulosukraas<br />
k cat – katalüütiline konstant (1/min)<br />
k cat /K m – katalüütiline efektiivsus (1/M*min)<br />
K i – inhibitsioonikonstant (mM)<br />
K m – Michaelise konstant, mis näitab ensüümi afiinsust substraadile (mM)<br />
Leu (L) – leutsiin<br />
Lev – Lactobacillus reuteri levaansukraas<br />
LevU – Zymomonas mobilis’e levaansukraas<br />
Lsc1, Lsc2, <strong>Lsc3</strong> – <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>DC3000</strong> <strong>levaansukraasi</strong>d<br />
LsdA – Gluconacetobacter diazotrophicus’e levaansukraas<br />
PA – polümerisatsiooniaste<br />
PDB – Protein Data Bank<br />
Pro (P) – proliin<br />
pv. – patovar (alamliik)<br />
SacB – Bacillus subtilis’e levaansukraas<br />
SDS-PAGE – Na-dodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelelektroforees<br />
TA – transfruktosüleeriv ehk polümeriseeriv aktiivsus<br />
V max – maksimaalne reaktsioonikiirus (U/mg)<br />
3
SISSEJUHATUS<br />
Levaansukraas on bakteriaalne eksoensüüm, mis katalüüsib substraadi, peamiselt sahharoosi<br />
hüdrolüüsi ning fruktoosijääkide ülekannet aktseptormolekulile. Seega on <strong>levaansukraasi</strong>del<br />
fruktosüültransferaasne aktiivsus. Ensüümi sünteesiproduktideks on fruktaanid – polümeerne<br />
levaan või lühemad fruktooligosahhariidid. Mitmed mikroobid kasutavad fruktaane<br />
erinevatele pindadele kinnitumiseks, biofilmi moodustamiseks, süsinikuallikana või<br />
virulentsusfaktorina taimepatogeneesis. Mikroobsetel fruktaanidel on täheldatud mitmeid<br />
tervisele kasulikke toimeid, näiteks rasvumise ja vähivastast mõju, mistõttu võiks neid<br />
ühendeid kasutada ravimite või toidulisanditena.<br />
Levaansukraasid koosnevad β-lehtedest, mis moodustavad viielabalise β-propellerstruktuuri,<br />
mille keskel on substraati siduv aktiivtsenter. Levaansukraasi aktiivtsentrisse kuuluvad kolm<br />
happelist aminohapet (katalüütiline kolmik), mis on konserveerunud kõigis seni uuritud<br />
<strong>levaansukraasi</strong>des, aga ka invertaasides ja fruktaani eksohüdrolaasides. Katalüütilisse<br />
kolmikusse kuuluvad kaks aspartaati, millest üks on nukleofiil ja teine vaheühendi<br />
stabiliseerija, ning glutamaat, mis täidab alus-hape katalüüsija rolli.<br />
Minu bakalaureusetöö eesmärk oli ennustada <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>DC3000</strong><br />
<strong>levaansukraasi</strong>l <strong>Lsc3</strong> aktiivtsentri katalüütilise kolmiku aminohappeid ja kontrollida neid<br />
ennustusi vastavate mutantide konstrueerimise ja iseloomustamisega (vt. pt. 2.1). Seni on<br />
pseudomonaadide <strong>levaansukraasi</strong>de biokeemilisi omadusi vähe uuritud ja nende<br />
mutatsioonanalüüsi on seni tehtud ainult meie töögrupis. Meie grupi senised tulemused<br />
näitavad, et <strong>Lsc3</strong> valk on suure katalüütilise aktiivsusega, ta sünteesib odavatest substraatidest<br />
(sahharoosist ja melassist) nii polümeerset levaani kui ka fruktooligosahhariide ning on<br />
võimeline kasutama ka alternatiivseid fruktosüüli aktseptoreid, sünteesides<br />
heterooligofruktaane. Kõigile neile sünteesiproduktidele ennustatakse ning on ka näidatud<br />
praktilisi biotehnoloogilisi rakendusi.<br />
Töö tehti Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituudis Geneetika õppetoolis.<br />
Tahaksin tänada oma juhendajaid Triinu Visnapuud ning Tiina Alamäed, kes aitasid<br />
käesolevat tööd planeerida ja koostada. Sooviksin tänada ka teisi TÜMRI töötajaid, kes selle<br />
töö valmimisele kaasa aitasid.<br />
4
1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE<br />
1.1 Glükosiidi hüdrolaasid<br />
Glükosiidi hüdrolaasid (GH-d) on ensüümid, mis hüdrolüüsivad suhkruid, lagundades<br />
glükosiidsideme kahe monosahhariidi või süsivesiku ja mittesahhariidse molekuli vahel<br />
(Vuong ja Wilson, 2010). GH-de hulka kuuluvad ka transferaasse aktiivsusega ensüümid, mis<br />
kannavad substraadi hüdrolüüsi käigus vabanenud monosahhariidid erinevatele<br />
aktseptorsuhkrutele (http://www.cazy.org). Sellistel sünteesiproduktidel on erinevates<br />
organismides tähtis bioloogilne roll: fruktoosijääkidest koosnevad fruktaanid võivad olla<br />
olulised keskkonnastressi üleelamiseks ja rakumembraani stabiliseerimiseks, näiteks taimedel<br />
põua ja külma korral. Lisaks on fruktaanid paljudes taimedes (~40000 taimeliigis) ka<br />
varuaineteks. Mikroobid kasutavad fruktaane biokile moodustamisel ning pindadele<br />
kinnitumiseks (Velazquez-Hernandez et al., 2008). Näiteks bakter Streptococcus mutans on<br />
inimese suuõõne patogeen, kes kinnitub polüfruktaani (levaani) abil hammastele ning<br />
põhjustab hambaaukude teket (Schroeder et al., 1989). P. <strong>syringae</strong> pv. phaseolicola on<br />
taimepatogeen, kes põhjustab oataimedel nekroosilaikude teket ning kellele fruktaanid on<br />
virulentsusfaktoriks (Li ja Ullrich, 2001). Mullabakteril Bacillus subtilis on leitud, et levaani<br />
laguprodukt levaanbioos võib toimida signaalmolekulina (Daguer et al., 2004).<br />
GH-d on valkude aminohappeliste järjestuste ning struktuuride alusel jaotatud 14 sugukonda<br />
ja 113 perekonda ning koondatud CAZy andmebaasi (Carbohydrate-Active enZYmes<br />
Database; http://www.cazy.org) (Cantarel et al., 2009). Taimede ja hallitusseente<br />
fruktosüültransferaasid (FTF-id), aga ka invertaasid ja β-fruktofuranosidaasid kuuluvad GHde<br />
perekonda 32. Enamik bakteriaalseid FTF-e on paigutatud perekonda 68. Nende kahe<br />
perekonna valgud on sarnase struktuuriga ning nad on seetõttu ühendatud samasse sugukonda<br />
GH-J. Sellesse sugukonda kuuluvate ensüümide valgujärjestuste sarnasus on küll väike<br />
(identsus alla 15%), kuid neil on mitmeid homoloogilisi järjestusmotiive ja struktuurielemente<br />
(Coutinho ja Henrissat, 1999; Pons et al., 2000; Naumoff, 2001).<br />
1.2 Glükosiidi hüdrolaaside perekondadesse 32 ja 68 kuuluvate valkude<br />
omadused ja ehitus<br />
GH-de perekond 32 koondab taimseid ja bakteriaalseid invertaase, hallitusseente ja bakterite<br />
inulinaase ning levanaase, taimseid fruktaani eksohüdrolaase (FEH) ja fruktosüültransferaase.<br />
Invertaasid hüdrolüüsivad sahharoosi molekuli glükosiidsideme ning tekivad glükoos ja<br />
fruktoos. Samas FEH-id hüdrolüüsivad fruktaane, kandes ahela terminaalse fruktoosijäägi vee<br />
molekulile. Taimsed FEH-id ei ole võimelised sahharoosi lagundama ning see suhkur võib<br />
5
ensüümile hoopis inhibiitorina mõjuda (De Roover et al., 1999; van Riet et al., 2008). On<br />
leitud, et taimed vajavad fruktaanide sünteesiks kahte või enamat FTF-i, samas bakteritel<br />
toimub see ühe multifunktsionaalse ensüümiga (van den Ende ja van Laere, 1996; Martinez-<br />
Fleites et al., 2005).<br />
Perekonda 68 kuuluvad bakteriaalsed FTF-id katalüüsivad kaht tüüpi reaktsioone: kui<br />
aktseptoriks on näiteks sahharoos või fruktaanahel, siis toimub fruktoosijäägi ülekanne<br />
nendele aktseptoritele. Kui aktseptorina toimib vesi, siis toimub substraadi hüdrolüüs ja<br />
eraldub fruktoos. Bakteriaalsed FTF-id sünteesivad sahharoosist fruktaane –<br />
fruktoosijääkidest koosnevaid oligo- ja polüsahhariide.<br />
Taimsete ja bakteriaalsete fruktaanide hulka kuuluvad levaan, inuliin ja fruktooligosahhariidid<br />
(FOS-id). Fruktaanid erinevad üksteisest ahela pikkuse ehk polümerisatsiooniastme (PA),<br />
hargnemiste määra ja fruktoosijääke ühendava sideme poolest (Banguela ja Hernandez,<br />
2006). Inuliinid on β-2,1-sidemetega seotud fruktaanid, mida leidub eelkõige taimedes, aga<br />
neid sünteesivad ka bakteriaalsed inulosukraasid. Ka levaan on fruktoosijääkidest koosnev<br />
polümeer, kuid fruktoosijääkide vahel on β-2,6-sidemed. Bakteriaalse levaani<br />
polümerisatsiooniaste võib olla väga suur (PA 100-100000). FOS-id (näiteks kestoos ja<br />
nüstoos) on lühema ahelaga oligosahhariidid polümerisatsiooniastmega alla 9 (Velazquez-<br />
Hernandez et al., 2008).<br />
Fruktooligosahhariididel on täheldatud imetajatele kasulikke toimeid, mistõttu on nad<br />
kasutusele võetud prebiootikumidena ning madala kalorsuse tõttu on nad leidnud rakendust<br />
toiduainetööstuses magusainetena (Crittenden ja Playne, 1996; Roberfroid ja Slavin, 2000).<br />
See ongi üks oluline põhjus, miks levaansukraase ja nende valkude reaktsiooniprodukte võiks<br />
uurida. Oligofruktaanid kuuluvad imetajate jaoks seedumatute suhkrute hulka. Seetõttu<br />
jõuavad FOS-id seedumatult jämesoolde, kus neid kääritavad bifido- ja piimhappebakterid,<br />
millega kaasnevad mitmed kasulikud toimed inimese tervisele. Näiteks on leitud, et väheneb<br />
soolesisu pH, stimuleeritakse immuunsüsteemi, väheneb rasvumise ja diabeedi risk, sest<br />
kolesterooli, triglütseriidide ja fosfolipiidide kontsentratsioon veres väheneb, ning suureneb<br />
mitmete mineraalide (Fe, Ca, Mg) imendumine (Roberfroid ja Slavin, 2000).<br />
Bakteriaalsete FTF-ide hulka kuuluvad <strong>levaansukraasi</strong>d (EC 2.4.1.10) ning inulosukraasid<br />
(EC 2.4.1.9). Inulosukraase on seni leitud ainult piimhappebakteritest, näiteks Lactobacillus<br />
reuteri’st. Levaansukraasid on olemas aga nii gramnegatiivsetel kui ka grampositiivsetel<br />
bakteritel, kuid nende valgujärjestuste identsus on väike (vaid 20%) (van Hijum et al., 2006).<br />
Grampositiivsetest bakteritest pärit <strong>levaansukraasi</strong>d on üldiselt suuremad ning nende<br />
molekulis eristuvad erineva funktsiooniga piirkonnad. Näiteks L. reuteri <strong>levaansukraasi</strong>l<br />
eristuvad N-terminaalne signaalpeptiid, mille abil suunatakse valk rakust välja, N-terminaalne<br />
6
varieeruv piirkond, konserveerunud katalüütiline tsenter ja C-terminaalne osa, millega<br />
seotakse valk rakukesta külge (van Hijum et al., 2006). Gramnegatiivsete bakterite<br />
<strong>levaansukraasi</strong>d on väiksemad ja lihtsama ehitusega ning neil tavaliselt puudub N-terminaalne<br />
signaalpeptiid (Geier ja Geider, 1993; Song ja Rhee, 1994; Hettwer et al., 1998). Erandiks on<br />
gramnegatiivse bakteri Gluconacetobacter diazotrophicus’e levaansukraas, millel on leitud<br />
sekretsiooni vahendav N-terminaalne signaalpeptiid (Hernandez et al., 2000).<br />
Levaansukraaside peamiseks substraadiks on sahharoos, aga mitmetel ensüümidel on näidatud<br />
ka rafinoosi ja stahhüoosi hüdrolüüsimise ning neist levaani sünteesimise võimet (Yanase et<br />
al., 2002; Andersone et al., 2004; Visnapuu et al., 2008). Levaansukraasi katalüütilised<br />
omadused sõltuvad nii substraadi kontsentratsioonist, temperatuurist kui ka keskonna pH-st.<br />
B. subtilis’e <strong>levaansukraasi</strong> puhul on näidatud, et sahharoosi hüdrolüüsireaktsioon, kus<br />
tekivad glükoos ja fruktoos, on eelistatud madalamatel sahharoosi kontsentratsioonidel (250<br />
mM) (Lammens et al., 2009). Erinevatel <strong>levaansukraasi</strong> aktiivsustel võivad olla erinevad<br />
temperatuurioptimumid. Näiteks P. <strong>syringae</strong> pv. phaseolicola ensüümi kõige sobivam<br />
temperatuur sahharoosi hüdrolüüsiks on 60°C, aga levaani sünteesiks 18°C (Hettwer et al.,<br />
1995). Enamiku seni uuritud <strong>levaansukraasi</strong>de pH optimum jääb vahemikku 5.0-6.5. Näiteks<br />
Zymomonas mobilis’e <strong>levaansukraasi</strong>l on nii hüdrolüüsi- kui ka<br />
polümerisatsioonireaktsioonide toimumiseks optimaalne pH 5.0 (Sangiliyandi et al., 1999).<br />
Glükosiidi hüdrolaaside perekonnad 68 ja 32 on koondatud sugukonda GH-J, sest neil<br />
valkudel on sarnane ruumiline struktuur. Selle sugukonna ensüümid koosnevad β-lehtedest,<br />
mis moodustavad viielabalise β-propellerstruktuuri, mille keskel on substraati siduv<br />
aktiivtsenter. Iga β-leht koosneb neljast antiparalleelsest valguahelast. Katalüütilisse tsentrisse<br />
kuuluvad konserveerunud happelised aminohapped – kaks aspartaati (Asp) ja glutamaat (Glu)<br />
(vt. ka 1.3.1) (Meng ja Fütterer, 2003; Chuankhayan et al., 2010). Erinevalt GH68 perekonna<br />
ensüümidest esineb GH32 valkudel C-terminaalne lisadomään, mis koosneb kahest β-lehest ja<br />
moodustab kahekihilise nn. võileivastruktuuri (β-sandwich) (Lammens et al., 2009;<br />
Chuankhayan et al., 2010).<br />
1.3 Fruktosüültransferaaside ehitus ja aktiivtsenter<br />
1.3.1 Fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped ja kristallstruktuurid<br />
Fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped on konserveerunud kõigil seni uuritud<br />
GH-J ensüümidel (Lammens et al., 2009). Need kolm olulist aminohapet (katalüütiline<br />
kolmik) on kaks aspartaati ja üks glutamaat (Tabel 1). Üks aspartaatidest käitub nukleofiilina,<br />
7
teine on moodustuva vaheühendi stabiliseerija ning glutamaat toimib alus-hape katalüüsijana.<br />
FTF-ide katalüütiline mehhanism on 2-etapiline. Esimeses etapis toimub aspartaadi<br />
nukleofiilne rünnak substraadi anomeersele süsinikule ning fruktoosijäägi ja ensüümi vahel<br />
moodustub kovalentselt seotud vaheühend. Samal ajal käitub alus-hape katalüüsija (Glu) kui<br />
hape, loovutades prootoni eralduvale glükoosijäägile. Teises etapis toimib alus-hape<br />
katalüüsija alusena ja eemaldab aktseptormolekulilt prootoni, toimub fruktosüül-ensüüm<br />
vaheühendi hüdrolüüs ja fruktoosijäägi ülekanne aktseptorile (Koshland et al., 1954; Lee et<br />
al., 2003). Teine aspartaat, mis asub konserveerunud Arg-Asp-Pro ehk RDP-motiivis, ei ole<br />
otseselt katalüüsiga seotud, vaid moodustab vesiniksidemed fruktoosijäägi C3 ja C4<br />
hüdroksüülrühmadega, osaledes substraadi sidumisel ja fruktosüül-ensüüm vaheühendi<br />
stabiliseerimisel (Nagem et al., 2004).<br />
Mitmetel <strong>levaansukraasi</strong>del, inulosukraasidel ja hallitusseente FTF-idel on katalüütilise<br />
kolmiku aminohapped kindlaks tehtud mutatsioonianalüüsiga või kristallstruktuuri mudelite<br />
abil. Mõnede <strong>levaansukraasi</strong>de, inulosukraaside ja teiste FTF-ide aktiivtsentri aminohapped,<br />
nende positsioonid ning ensüümi kuuluvus on toodud Tabelis 1.<br />
Praeguseks on kristallstruktuurid kirjeldatud grampositiivse bakteri B. subtilis’e<br />
<strong>levaansukraasi</strong>l SacB ja gramnegatiivse G. diazotrophicus’e <strong>levaansukraasi</strong>l LsdA (Meng ja<br />
Fütterer, 2003; Martinez-Fleites et al., 2005) ning Aspergillus japonicus’e<br />
fruktosüültransferaasil AjFT (Chuankhayan et al., 2010).<br />
Tabel 1. Erinevate fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped ja nende positsioonid.<br />
Kristallstruktuuri andmed on olemas SacB, LsdA ja AjFT valkude kohta.<br />
Ensüümi tüüp<br />
Ensüüm<br />
Levaansukraas<br />
Inulosukraas<br />
FTF<br />
B.<br />
G.<br />
Z. L. L. A.<br />
SacB a LsdA b LevU c Lev d Inu e AjFT f<br />
subtilis’e diazotrophicus’e mobilis’e reuteri reuteri japonicus’e<br />
Nukleofiil Asp68 Asp135 Asp48 Asp249 Asp272 Asp60<br />
Stabiliseerija Asp247 Asp309 Asp194 Asp404 Asp424 Asp191<br />
Alus-hape<br />
katalüüsija<br />
Glu342 Glu401 Glu278 Glu503 Glu523 Glu292<br />
GH perekond GH68 GH68 GH68 GH68 GH68 GH32<br />
Andmed pärinevad alljärgnevatest artiklitest:<br />
a Meng ja Fütterer, 2003, 2008<br />
b Martinez-Fleites et al., 2005<br />
c Yanase et al., 2002<br />
d,e Ozimek et al., 2004<br />
f<br />
Chuankhayan et al., 2010<br />
8
B. subtilis’e levaansukraas SacB on 439 ah pikkune monomeerne valk, mis katalüüsib<br />
peamiselt suure molekulmassiga levaani moodustumist, vähesel määral sünteesitakse ka<br />
fruktooligosahhariide. SacB on on kristalliseeritud kompleksis nii sahharoosi kui rafinoosiga<br />
ning ka substraadivabas vormis (Meng ja Fütterer, 2003, 2008). Levaansukraasi struktuuri<br />
analüüs näitas, et valk on voltunud viielabalise β-propelleri kujuliselt, mille keskel on<br />
lehtritaoline negatiivselt laetud õõnsus, kus asub aktiivtsenter (Joonis 1A, B). Propelleri β-<br />
lehed ehk labad koosnevad neljast antiparalleelsest β-ahelast. Levaansukraasi N-terminus<br />
paikneb risti üle esimese β-lehe, C-terminus on aga pakitud vastu viiendat laba ja ei ole<br />
vesiniksidemete kaudu seotud esimese β-lehega (Meng ja Fütterer, 2003).<br />
Joonis 1. Kristalliseeritud<br />
<strong>levaansukraasi</strong>de ehitus. B. subtilis’e<br />
levaansukraas (A) (Protein Data Bank<br />
ID: 1W18) ja selle aktiivtsenter (B)<br />
ning G. diazotrophicus’e<br />
levaansukraas (C) (PDB ID: 1OYG) ja<br />
selle aktiivtsenter (D). Katalüütilise<br />
kolmiku aminohapped (Asp – D; Glu –<br />
E) on tähistatud punasega (Lammens<br />
et al., 2009).<br />
Valgu SacB katalüütilise kolmiku aminohapeteks on Asp86, Asp247 ja Glu342 (Tabel 1;<br />
Joonis 1B). Selleks, et teha kindlaks nende aminohapete funktsioon, muteeriti need<br />
positsioonid alaniinideks. Üksikmutantide Asp86Ala ja Asp247Ala kristallstruktuur näitas, et<br />
selline aminohappe vahetus ei muutnud eriti aktiivsaidi geomeetriat, kuid praktiliselt kadus<br />
ensüümi katalüüsivõime (Meng ja Fütterer, 2008). Lisaks leiti, et vahetult katalüütiliste<br />
aminohapete läheduses paiknev Arg360 on oluline levaani polümerisatsioonil. Kuigi see<br />
aminohape ei ole otseselt reaktsioonimehhanismiga seotud, vastutab ta<br />
transfruktosüleerimisreaktsiooni spetsiifilisuse ja tõhususe eest (Meng ja Fütterer, 2003;<br />
Lammens et al., 2009). Arg360 on konserveerunud grampositiivsete bakterite<br />
9
<strong>levaansukraasi</strong>des, kuid gramnegatiivsetes bakterites on homoloogilises positsioonis histidiin<br />
– His296 Z. mobilis’e ja His419 G. diazotrophicus’e <strong>levaansukraasi</strong>l (Yanase et al., 2002).<br />
Sahharoosiga kompleksis oleval mutantse SacB (Glu342Ala) analüüsil näidati, et ensüümi -1<br />
ja +1 alapiirkonda seonduvad vastavalt fruktoosi- ja glükoosijääk. -1 piirkonnal on kõrge<br />
spetsiifilisus fruktoosijäägi seondumiseks, kuid +1 piirkonda võib seonduda glükoosijääk, mis<br />
on pärit doonorsubstraadilt, aga ka mõni muu sahhariidne aktseptormolekul (Ozimek et al.,<br />
2006). On näidatud, et SacB -1 alapiirkonda kuuluvad nukleofiil Asp86 ja stabiliseerija<br />
Asp247. Alus-hape katalüüsija Glu342 moodustab tugeva sideme konserveerunud RDPmotiivis<br />
asuva arginiiniga Arg246 ja vesiniksideme türosiiniga positsioonis 411, mis<br />
omakorda moodustab tugeva H-sideme Arg360-ga. Nii Arg360 kui ka Glu340 moodustavad<br />
+1 piirkonnas glükosüülijäägiga H-sideme (Joonis 1B ) (Meng ja Fütterer, 2008).<br />
Gramnegatiivsetest bakteritest pärinevad <strong>levaansukraasi</strong>d ei vaja katalüüsiks metallilisi<br />
kofaktoreid, kuid B. subtilis’e enüümi puhul on näidatud Ca 2+ seondumispiirkonna olemasolu.<br />
Leiti, et Ca 2+ -ioonide seondumist vahendab Asp339 (Meng ja Fütterer, 2003).<br />
Valgujärjestuste joondus GH68 perekonna ensüümidega näitas, et aminohapped, mis on<br />
vajalikud Ca 2+ seondumisel, on konserveerunud enamikes grampositiivsete bakterite<br />
<strong>levaansukraasi</strong>des, kuid puuduvad gramnegatiivsete mikroobide ensüümidel (Ozimek et al.,<br />
2005; van Hijum et al., 2006). Gramnegatiivsetel bakteritel võib sarnane struktuuri<br />
stabiliseeriv funktsioon olla disulfiidsildadel. Näiteks G. diazotrophicus’e LsdA valgu<br />
uurimisel leiti üks disulfiidsild (Martinez-Fleites et al., 2005).<br />
G. diazotrophicus’e levaansukraas LsdA koosneb 584 aminohappest, millest 30 ah pikkune<br />
N-terminaalne järjestus moodustab signaalpeptiidi, mis eemaldatakse tüüp II sekretsiooni<br />
käigus. LsdA sünteesib suures kogustes tri- ja tetrasahhariide (FOS-e), kuid polüsahhariidset<br />
levaani tekib vähe (Martinez-Fleites et al., 2005; Velazquez-Hernandez et al., 2008).<br />
Üldiselt on LsdA kristallstruktuur sarnane SacB-ga, moodustades viielabalise β-propelleri,<br />
mille keskel paikneb konserveerunud aktiivtsenter (Joonis 1C, D). LsdA aminohappeline<br />
järjestus on B. subtilise SacB valguga 26% ulatuses identne. β-lehtede ja enamiku α-heeliksite<br />
paiknemine on mõlemal valgul sarnane. LsdA mutatsioonianalüüsiga on tõestatud, et<br />
katalüütilise kolmiku aminohapped on Asp135 (nukleofiil), Asp309 (stabiliseerija) ja Glu401<br />
(alus-hape katalüüsija), mis paiknevad β-lehtede esimestel (sisemistel) β-ahelatel (Tabel 1;<br />
Joonis 1D) (Martinez-Fleites et al., 2005).<br />
A. japonicus’e fruktosüültransferaasil AjFT on <strong>levaansukraasi</strong>dele sarnane N-terminaalne 5-<br />
labaline β-propelleristruktuur koos katalüütilise tsentriga, kuid lisaks on sellel valgul ka C-<br />
terminaalne kihiline struktuur, mis koosneb kahest 6-ahelalisest β-lehest (Chuankhayan et al.,<br />
2010). Arvatavasti aitab see lisadomään valku stabiliseerida (Lammens et al., 2009).<br />
10
1.3.2 Fruktosüültransferaaside mutatsioonanalüüs<br />
Meng ja Fütterer (2003) muteerisid B. subtilis’e SacB kristallstruktuuri põhjal ennustatud<br />
aktiivtsentri aminohappeid (Tabel 1) alaniiniks ning määrasid mutantsetel valkudel levaani<br />
teket. Selgus, et mutandid (Asp86Ala, Asp247Ala, Glu342Ala) olid inaktiivsed ning levaani<br />
ei sünteesitud (Meng ja Fütterer, 2003).<br />
Martinez-Fleites et al. (2005) näitasid, et G. diazotrophicus’e LsdA Asp135 asendamisel<br />
asparagiiniga vähenes ensüümi katalüütiline konstant (k cat ) 2300 korda. Kui LsdA kohtsuunatud<br />
mutageneesil RDP-motiivis paiknev aspartaat 309 asendati asparagiiniga, alanes<br />
ensüümi võime sahharoosi hüdrolüüsida ja k cat vähenes ligi 75 korda. Samas ei toimunud<br />
muutusi ensüümi afiinsuses sahharoosile. Sellega tõestati, et Asp135 ja Asp309 on LsdA<br />
valgus vastavalt katalüütiline nukleofiil ja vaheühendi stabiliseerija (Tabel 1) (Batista et al.,<br />
1999; Martinez-Fleites et al., 2005).<br />
Analüüsides Z. mobilis’e <strong>levaansukraasi</strong> LevU juhuslikke ja koht-suunatud mutageneesiga<br />
saadud mutante leiti, et Glu278 asendamine aspartaadiga vähendas mutantse valgu<br />
katalüütilise konstandi väärtust ligi 30 korda, olgugi et üks negatiivne aminohape vahetati<br />
teise negatiivse laenguga aminohappe vastu. Kui Glu278 asendati positiivse laenguga<br />
histidiiniga, muutus k cat 210 korda väiksemaks, kuid nii mutansete ensüümide afiinsus (K m )<br />
sahharoosile kui ka transfruktosüleeriv ehk polümeriseeriv aktiivsus (TA) jäid peaaegu<br />
samaks. Yanase et al. (2002) järeldasid, et Glu278 on ilmselt alus-hape katalüüsija. Asp194<br />
muteerimisel asparagiiniks kaotas ensüüm peaaegu täielikult võime sahharoosi hüdrolüüsida –<br />
k cat vähenes ligi 3400 korda. Afiinsus sahharoosi suhtes tõusis 3 korda, kuid<br />
transfruktosüleerivas aktiivsuses muutusi polnud. Seega Asp194, mis paikneb kõrgelt<br />
konserveerunud RDP-motiivis, on samuti substraadi hüdrolüüsil oluline aminohape ning<br />
reakstiooni vaheühendi stabiliseerija (Tabel 1) (Yanase et al., 2002).<br />
Grampositiivsel piimhappebakteril L. reuteri’l on olemas nii inulosukraas (Inu) kui ka<br />
levaansukraas (Lev). Valkude järjestuste joondus B. subtilis’e SacB-ga näitas, et L. reuteri<br />
FTF-ide võimalikud katalüütilised aminohapped on Asp249, Asp404, Glu503 (Lev) ja<br />
Asp272, Asp424, Glu523 (Inu) (vt. ka Tabel 1) (Ozimek et al., 2004). Kinnitamaks nende ahte<br />
olulisust katalüüsis, muteeriti vastavad järjestused suunatult asparagiiniks või glutamiiniks<br />
ning määrati ensüümide koguaktiivsust, mõõtes sahharoosi hüdrolüüsil tekkivat glükoosi<br />
hulka. Mutantide katalüüsi aktiivsus, võrreldes muteerimata valguga, oli vähenenud vähemalt<br />
10000 korda. Määrati ka mutantide kineetilisi parameetreid ja leiti, et näiteks k cat sahharoosi<br />
suhtes mutantsel Lev valgul Asp404Asn oli langenud 613000 korda, samas afiinsus substraadi<br />
suhtes ei muutunud (Ozimek et al., 2004).<br />
11
Hallitusseene A. japonicus’e FTF-i AjFT aktiivtsentri moodustavad Asp60, Asp191 ja Glu292<br />
(Tabel 1). Need aminohapped katalüüsivad fruktosüüli ülekannet ning seovad fruktoosijäägi -<br />
1 alapiirkonda. Need aminohapped muteeriti suunatult alaniiniks ning näidati, et mutantsed<br />
ensüümid kaotasid peaaegu täielikult oma aktiivsuse (Chuankhayan et al., 2010).<br />
12
2. EKSPERIMENTAALOSA<br />
2.1 Töö eesmärgid<br />
1. Erinevate <strong>levaansukraasi</strong>de valgujärjestuste joonduse alusel ennustada, millised<br />
aminohapped võiksid kuuluda taimepatogeeni <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. tomato<br />
<strong>DC3000</strong> <strong>levaansukraasi</strong> <strong>Lsc3</strong> katalüütilisse tsentrisse.<br />
2. Muteerida koht-suunatult <strong>levaansukraasi</strong> <strong>Lsc3</strong> aspartaat (Asp) positsioonis 62 ja<br />
glutamaat (Glu) positsioonis 303 alaniiniks (Ala) ning kloneerida vastavate<br />
mutatsioonidega lsc3 geenid pURI3 ekspressioonivektorisse, kus lisandub<br />
sünteesitavatele valkudele N-terminaalne His 6 -järjestus.<br />
3. Kloneerida pURI3 vektorisse mutantsed lsc3 geenid, kus aspartaadid (Asp)<br />
positsioonis 219 või 225 olid muudetud alaniiniks (Ala) või asparagiiniks (Asn).<br />
4. Ekspresseerida mutantseid levaansukraase (<strong>Lsc3</strong> Asp62Ala; Asp219Ala;<br />
Asp219Asn; Pro222Leu; Asp225Ala; Asp225Asn; Glu303Ala) Escherichia coli<br />
tüves BL21(DE3) ja määrata mutantsete ensüümide funktsionaalsust ning omadusi,<br />
et kindlaks teha, kas need aminohapped võiksid olla <strong>Lsc3</strong> katalüüsis olulised.<br />
2.2 Materjal ja metoodika<br />
2.2.1 Kasutatud tüved ja plasmiidid<br />
Konstruktide tegemiseks kasutati E. coli tüve DH5α (supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15)<br />
recA1 endA1 hsdR17 thi-1 gyrA96 relA1) (Invitrogen, CA, USA; Miller, 1972) ning<br />
mutantseid valke ekspresseeriti E. coli tüves BL21(DE3) (hsdS gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5<br />
lacUV5-T7 gene 1)) (Studier and Moffatt, 1986).<br />
Töös kasutatud ja konstrueeritud plasmiidid on esitatud Tabelis 2.<br />
Metsiktüüpi ja mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de ekspresseerimiseks kasutasime pURI3 vektorit<br />
(2737 ap) (Rivas et al., 2007), kuhu oli kloneeritud bakteri P. <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>DC3000</strong><br />
algne või mutantne <strong>levaansukraasi</strong> kodeeriv geen lsc3, ning saadi konstrukt pURI3-lsc3 (3820<br />
ap). Kõigis pURI3 vektori konstruktides liitub ekspresseeritava <strong>Lsc3</strong> valgu N-terminusse<br />
His 6 - järjestus.<br />
13
Tabel 2. Kasutatud plasmiidid, nende päritolu, koodonite ja vastavate aminohapete vahetused<br />
ning mutatsioonide asukohad valgus. Alla on joonitud vastavas koodonis muteeritud<br />
nukleotiidid.<br />
Plasmiid<br />
pHIPMalprom-lsc3D219A<br />
pHIPMalprom-lsc3D219N<br />
pHIPMalprom-lsc3D225A<br />
pHIPMalprom-lsc3D225N<br />
pURI3<br />
(ekspressioonivektor)<br />
pURI3-lsc3<br />
(sisaldab muteerimata lsc3-e)<br />
pURI3-lsc3D62A<br />
pURI3-lsc3D219A<br />
pURI3-lsc3D219N<br />
pURI3-lsc3P222L<br />
pURI3-lsc3D225A<br />
pURI3-lsc3D225N<br />
pURI3-lsc3E303A<br />
Koodoni ja<br />
aminohappe<br />
vahetus<br />
GAC→GCC;<br />
Asp→Ala<br />
GAC→AAC;<br />
Asp→Asn<br />
GAT→GCC;<br />
Asp→Ala<br />
GAT→AAT;<br />
Asp→Asn<br />
Mutatsiooni<br />
asukoht valgus<br />
Viide<br />
219 Tiirik, 2010<br />
219 Tiirik, 2010<br />
225 Tiirik, 2010<br />
225 Tiirik, 2010<br />
- - Rivas et al., 2007<br />
- -<br />
GAC→GCC;<br />
Asp→Ala<br />
GAC→GCC;<br />
Asp→Ala<br />
GAC→AAC;<br />
Asp→Asn<br />
CCG→CTG;<br />
Pro→Leu<br />
GAT→GCC;<br />
Asp→Ala<br />
GAT→AAT;<br />
Asp→Asn<br />
GAG→GCG;<br />
Glu→Ala<br />
62<br />
T. Visnapuu,<br />
avaldamata andmed<br />
käesolev töö;<br />
LISA 1<br />
219 käesolev töö<br />
219 käesolev töö<br />
222<br />
K. Mardo,<br />
avaldamata andmed<br />
225 käesolev töö<br />
225 käesolev töö<br />
303<br />
käesolev töö;<br />
LISA 1<br />
2.2.2 Levaansukraasi geeni suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3<br />
vektorisse<br />
Mutatsioonide Asp62Ala ja Glu303Ala koht-suunatult lsc3 geeni viimiseks kasutati PCR-i<br />
(Polymerase Chain Reaction) põhist megapraimeri meetodit (Wei et al., 2004; Tiirik, 2010).<br />
Kõik muteerimiseks vajalikud amplifikatsioonietapid tehti Fermentase (Leedu) Pfu DNA<br />
polümeraasiga. Restriktsiooniks kasutati sama firma restriktaase ning tootjapoolset<br />
standardprotokolli. Pikk praimer (megapraimer) sünteesiti PCR-i reaktsioonisegus, mis<br />
sisaldas 1x Pfu puhvrit (Fermentas), 0.2 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP; Fermentas),<br />
4 mM MgSO 4, kumbagi praimerit 0.5 pmol, 0.025 U/μl Pfu DNA polümeraasi. Matriitsina<br />
kasutati muteerimata <strong>levaansukraasi</strong> geeni sisaldavat plasmiidi pURI3-lsc3. Praimeriteks olid<br />
14
vastavalt kas päripraimer T7 (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) ja vastupraimer<br />
D62ARev (5’ CATGGTGGCCCAGATGAAT 3’) või päripraimer E303AFw (5’<br />
TGATCAGACCGCGCGCC 3’) ja vastupraimer Ampsaba (5’ CTGAGATAGGTGCCTCAC<br />
3’). Muteerimispraimerid D62ARev ja E303AFw sisaldavad selliseid lämmastikaluse<br />
vahetusi (praimeri järjestuses alla joonitud), et Asp62 ja Glu303 asendatakse koodoni<br />
muutuse kaudu alaniiniga (vt. Tabel 2). PCR-i produktid (megapraimerid) lahutati<br />
elektroforeesiga (vt. pt. 2.2.7). Vastavalt 320 ap ja 555 ap pikkused DNA fragmendid lõigati<br />
geelist välja ning puhastati Mo Bio (USA) Ultra Clean TM 15 DNA puhastamise komplektiga<br />
tootjapoolse protokolli järgi. Seejärel tehti megapraimerite pikendamiseks uus PCR.<br />
Reaktsioonisegu sisaldas vastavat megapraimerit, matriits-DNA-d (pURI3-lsc3), 1x Pfu<br />
puhvrit, 0.04 mM dNTP, 4 mM MgSO 4, 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli<br />
järgmine:<br />
1. DNA ahelate denatureerimine 96°C 2 minutit;<br />
2. Megapraimeri paardumine DNA ahelaga 60°C 2 minutit;<br />
3. DNA süntees 72°C 5 minutit;<br />
Tsüklite arv: 10.<br />
Proove inkubeeriti restriktaasiga DpnI (lõppkonts. 0.2 U/µl) 90 min 37°C, et lagundada segus<br />
algne metüleeritud matriits-DNA. Mutatsiooni sisaldav lsc3 fragment (1369 ap) paljundati<br />
segust praimeritepaariga <strong>Lsc3</strong>pURI3Fw (5’<br />
CATCATGGTGACGATGACGATAAGATGTACAATAGCAACTCTGCTGTAA 3’) ja<br />
<strong>Lsc3</strong>pURI3Rev (5’<br />
AAGCTTAGTTAGCTATTATGCGTAGTTCTTCAGGTATGGGAACGGCGTG 3’).<br />
Kaldkirjas on pURI3 vektoriga komplementaarne järjestus ning ülejäänud osa praimerist<br />
seondub lsc3 geeni otstele. Produkti olemasolu kontrolliti 1% agaroosgeelil ning puhastati<br />
geelist Mo Bio Ultra Clean TM 15 komplektiga.<br />
Mutatsiooni sisaldava lsc3 geeni liitmiseks pURI3 vektorisse kasutasime restriktaasi- ja<br />
ligeerimisvaba PCR-i põhist kloneerimist (Geiser et al., 2001; Rivas et al., 2007). pURI3<br />
vektoriga komplementaarsete otstega lsc3 geen paljundati plasmiididelt pHIPMalpromlsc3D219A,<br />
pHIPMalprom-lsc3D219N, pHIPMalprom-lsc3D225A, pHIPMalpromlsc3D225N<br />
praimeritega <strong>Lsc3</strong>pURI3Fw ja <strong>Lsc3</strong>pURI3Rev või saadi suunatud muteerimisega,<br />
nagu on kirjeldatud eespool. Saadud mutantsed lsc3 fragmendid lahutati agaroosgeelis,<br />
puhastati ja tehti ekstensioonietapp, kus lsc3 geen kloneerub pURI3 vektorisse.<br />
Reaktsioonisegu sisaldas puhastatud lsc3 fragmenti, vektorit pURI3, 0.1 mM dNTP, 1x Pfu<br />
puhvrit, 4 mM MgSO 4 , 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli järgmine:<br />
1. DNA ahelate denatureerimine 95°C 1 minut;<br />
15
2. lsc3 fragmendi otste seondumine vektorile pURI3 55°C 1 minut;<br />
3. DNA ahela süntees 72°C 3 minutit;<br />
Tsüklite arv: 18.<br />
Segusid töödeldi DpnI-ga (lõppkonts. 0.2 U/µl), et lagundada segusse allesjäänud pURI3<br />
vektor, produktid puhastati ning restrikteeriti NotI-ga (lõppkonts. 0.2 U/µl), mis „lõikab“<br />
algset pURI3 vektorit, kuid mitte inserteerunud lsc3 geeniga plasmiidi. Segud elektroporeeriti<br />
E. coli DH5α tüvesse, kolooniaid kontrolliti PCR-iga lsc3-spetsiifiliste praimeritega,<br />
plasmiidne DNA puhastati ning mutatsiooni asukohta ning õigsust kontrolliti geeni järjestuse<br />
sekveneerimisega (pt. 2.2.3). Saadud mutantsed plasmiidid nimetati pURI3-lsc3D62A,<br />
pURI3-lsc3E303A, pURI3-lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N, pURI3-lsc3D225A ja pURI3-<br />
lsc3D225N (vt. Tabel 2). Meie töögrupis olid varem konstrueeritud plasmiidid pURI3-<br />
lsc3P222L ja pURI3-lsc3.<br />
2.2.3 Elektroporatsioon, kolooniate kontrollimine, DNA eraldamine ja<br />
sekveneerimine<br />
Kõik mutantset lsc3 geeni kandvad pURI3 plasmiidid viidi E. coli DH5α ja BL21(DE3)<br />
tüvedesse elektroporatsiooniga (Sharma ja Schimke, 1996). Bakterirakke kasvatati 4 ml<br />
YENB söötmes (0.75% pärmiekstrakt, 0.8% toitepuljong) 37°C loksutil kuni OD 600 oli ~0.4.<br />
Seejärel bakterikultuuri tsentrifuugiti 13700 g 30 s ning rakke pesti 3 korda steriilse 15%<br />
glütserooliga ning suspendeeriti 50 μl 15% glütseroolilahuses. Rakkudele lisati etanooliga<br />
sadestatud kloneerimissegu või puhastatud plasmiidset DNA-d. Elektroporatsioon tehti pingel<br />
2.5 kV E. coli Pulser-iga (BIO-RAD, USA) ning rakke kasvatati 1 h 1 ml Luria-Bertani (LB)<br />
söötmes ja plaaditi ampitsilliini (Amp) sisaldavale LB selektiivsöötmele.<br />
lsc3 geeni olemasolu kolooniates kontrolliti PCR-iga, kasutades praimeritepaari <strong>Lsc3</strong>Fw3 (5’<br />
GAAGCGCAGAACTCAAGCTGG 3’) ja <strong>Lsc3</strong>Rev2 (5’ TCATTGGCCGGTACGGACCG<br />
3’), millega saadi 427 ap pikkune DNA lõik. PCR-i segu sisaldas 6.25 mM MgCl 2 , 1x Taq<br />
puhvrit (Fermentas), 0.2 mM dNTP, kumbagi praimerit 0.5 pmol/μl ja Taq DNA polümeraasi<br />
0.05 U/μl.<br />
Plasmiidne DNA eraldati AxyPrep Plasmid Miniprep komplekti (Axygen Biosciences,<br />
USA) kasutades. Plasmiidide olemasolu ja saagist kontrolliti 1% agaroosgeelil (pt. 2.2.7).<br />
Konstrueeritud plasmiidides kontrolliti mutatsioonide asukohta ja õigsust lsc3 geenijärjestuse<br />
sekveneerimisega. Selleks kasutati BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit-i<br />
(Applied Biosystems, Kanada). Eelnevalt valmistati PCR-i produktid <strong>levaansukraasi</strong> geeni N-<br />
ja C-terminaalsest osast. Geeni N-terminuse paljundamiseks kasutati praimereid T7 ja<br />
Lsc1ja3Rev1 (5’ TGCGCTTCGGTTTGATAATAGG 3’), millega saadi 760 ap pikkune DNA<br />
16
lõik. Levaansukraasi geeni teise poole 938 ap pikkune fragment amplifitseeriti praimeritega<br />
Lsc1ja3Fw1 (5’ GCGATCGCCAAAGTACG 3’) ning Ampsaba. Seejärel tehti proovidele<br />
ExoI-SAP töötlus 15 min 37°C, kus reaktsioonisegusse lisati aluseline fosfataas (Shrimp Acid<br />
Phosphatase – SAP; Fermentas; lõppkonts. 0.2 U/µl) ja eksonukleaas ExoI (Fermentas; 0.4<br />
U/µl), et lagundada segusse allesjäänud praimerid ja algne DNA. Järgnevalt DNA sadestati<br />
96° etanooliga ja proovid valmistati vastavalt tootjapoolsele soovitusele. Sekveneeriti ABI<br />
3130xl Cenetic Analyser või ABI 3730xl DNA Analyzer sekvenaatoriga (Applied<br />
Biosystems, Kanada).<br />
2.2.4 Transformantide kasvatus, <strong>levaansukraasi</strong>de ekspresseerimine ja<br />
rakuekstraktide tegemine<br />
Levaansukraaside ekspresseerimiseks viidi mutantset või algset <strong>levaansukraasi</strong> geeni<br />
sisaldavad pURI3 plasmiidid ja ilma inserdita pURI3 vektor elektroporatsiooniga E. coli<br />
ekspressioonitüvesse BL21(DE3) (pt. 2.2.3). Transformante kasvatati ampitsilliini (lõppkonts.<br />
0.15 mg/ml) sisaldavas LB tard- või vedelsöötmes 37°C. Vedelkultuure aereeriti loksutil.<br />
Fenotüüpide uurimiseks külvati transformandid 10% sahharoosiga LB Amp söötmetassidele,<br />
kasvatati 37°C üleöö ja seejärel inkubeeriti tasse kuni 7 p toatemperatuuril (~23°C).<br />
Rakuekstraktide tegemiseks külvati muteeritud või algset <strong>levaansukraasi</strong> geeniga plasmiidi<br />
sisaldavad E. coli BL21(DE3) kolooniad 5 ml LB Amp vedelsöötmesse, kasvatati üleöö ning<br />
kultuurid külvati 30 ml LB Amp söötmesse algtihedusega 0.05 (OD 600 ) ja kasvatati opilise<br />
tiheduse väärtuseni ~0.5. Levaansukraaside ekspressiooni aktiveerimiseks lisati söötmesse<br />
IPTG-d (isopropüül-β-D-1-tiogalaktopüranosiid) (lõppkonts. 0.5 mM) ja transformante<br />
kasvatati madalama temperatuuriga (22°C) loksutil 20 h. Bakterirakud sadestati<br />
tsentrifuugimisega (2400 g, 10 min, 4°C), neid pesti kaks korda 50 mM K-fosfaatpuhvriga<br />
(pH 7.0), suspendeeriti 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvris (130 mM Na 2 HPO 4 ja 40 mM<br />
sidrunhape; pH 6.0) ning purustati ultraheliga (Ultrasonic Homogenizer 4710, Cole-Parmer<br />
Instrument Co., USA). Tahke fraktsioon sadestati tsentrifuugimisega (13700 g, 4°C) 20<br />
minuti jooksul ning supernatanti kasutati rakuekstraktina. Rakuekstrakte hoiti jääl või<br />
külmutati -20°C.<br />
Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de puhastamiseks külvati E. coli BL21(DE3) transformandid 200<br />
ml LB Amp vedelsöötmesse ning neid kasvatati ja <strong>levaansukraasi</strong>de ekspressioon algatati,<br />
nagu on kirjeldatud eespool. Bakterikultuuri tsentrifuugiti 2400 g (5 min, 4°C) ja pesti kaks<br />
korda 25 ml K-fosfaatpuhvriga (50 mM; pH 7.0). Rakud suspendeeriti 10 ml<br />
sonikeerimispuhvris (10 mM imidasool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10% glütserool;<br />
pH 6.0), külmutati 3x vedelas lämmastikus ning sulatati leiges vees, et suurendada valgu<br />
17
saagist, ja purustati ultraheliga. Segu tsentrifuugiti (2400 g, 20 min, 4°C) ning supernatanti<br />
kasutati <strong>levaansukraasi</strong>de allikana.<br />
2.2.5 Levaansukraasi aktiivsuse määramine<br />
Levaansukraasi koguaktiivsuse määramine glükoosi tekke järgi<br />
Levaansukraasi koguaktiivsus määrati glükoosi moodustumise järgi sahharoosist, kasutades<br />
Glycose Liquicolor-i reaktiivi (Human GmbH, Saksamaa) ja eelnevalt väljatöötatud<br />
metoodikat (Visnapuu et al., 2008). Reaktsioonisegu sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i<br />
puhvrit (pH 6.0), 100 mM sahharoosi ning rakuekstrakti või puhastatud valgu sobivat<br />
lahjendust. Reaktsioon tehti 37°C ning sobivatel ajapunktidel võeti 50 µl reaktsioonisegu,<br />
pipeteeriti see 150 µl Tris (trishüdroksümetüülaminometaan) puhvrile (200 mM; pH 8.3) ning<br />
reaktsioon peatati proovi kuumutamisega 5 min 96°C. Tekkinud glükoosi hulk määrati<br />
Glycose Liquicolor-i reaktiiviga vastavalt tootjapoolsetele soovitustele. Ensüümi<br />
koguaktiivsus väljendati sahharoosi hüdrolüüsil vabanenud glükoosi kogusena mikromoolides<br />
ühes minutis mg valgu kohta (U/mg).<br />
Puhastatud mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de afiinsus sahharoosile (K m ), maksimaalne<br />
reaktsioonikiirus (V max ) ja rafinoosi inhibitsioonikonstant K i määrati glükoosi tekke järgi.<br />
Reaktsioonisegud sisaldasid erineva kontsentratsiooniga sahharoosi (15, 20, 30, 50, 100 või<br />
200 mM), asiidiga McIllvaine’i puhvrit ja samas puhvris lahjendatud puhastatud<br />
<strong>levaansukraasi</strong>. K i määramiseks mõõdeti <strong>levaansukraasi</strong>de koguaktiivsust erinevatel<br />
sahharoosi kontsentratsioonidel, kui segusse oli lisatud 100 mM rafinoos. Mutantsete valkude<br />
kineetilised parameetrid arvutati Michaelis-Menteni võrrandi alusel, kasutades programmi<br />
SigmaPlot 2001 (SYSTAT, USA) ensüümikineetika moodulit (Enzyme Kinetics Module 1.1).<br />
Katalüütiline konstant k cat (1/min) arvutati võttes arvesse vastava valgu V max väärtust ja<br />
ensüümi molekulmassi. Molekulmassid valkudele Pro222Leu (49589 g/mol), Asp225Ala<br />
(49529 g/mol) ja Asp225Asn (49572 g/mol) arvutati ExPasy serveris<br />
(http://expasy.org/tools/pi_tool.html). Katalüütiline efektiivsus (1/M*min) leiti k cat ja K m<br />
jagatise kaudu.<br />
Redutseerivate suhkrute määramine<br />
Levaansukraaside rafinoosi ja sahharoosi, mis on mõlemad mitteredutseerivad suhkrud,<br />
hüdrolüüsiva aktiivsuse võrdlemiseks määrati redutseerivate suhkrute teket rakuekstraktide ja<br />
puhastatud <strong>Lsc3</strong> valkudega, kasutades 3,5-dinitrosalitsüülhappe (DNSA) reaktiivi (Miller,<br />
1959). Reaktsioon toimus temperatuuril 37°C ning inkubatsioonisegu (1.5 ml) sisaldas 0.02%<br />
Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), kuhu oli lisatud 100 mM rafinoosi või 100 mM<br />
18
sahharoosi (puhastatud valkude puhul vastavalt 400 mM rafinoosi või sahharoosi) ning<br />
<strong>levaansukraasi</strong> sisaldava rakuekstrakti või valgupreparaadi lahjendust. Erinevates<br />
ajapunktides eemaldati 200 μl reaktsioonisegu ning lisati see 400 μl DNSA reaktiivile.<br />
Reaktsiooni peatamiseks kuumutati proove 100°C 5 min ning jahutati jääl. Lisati 800 μl<br />
destilleeritud vett ning mõõdeti lahuse optiline tihedus (OD 540 ) (Visnapuu et al., 2008).<br />
Ensüümiaktiivsus väljendati sahharoosist või rafinoosist 1 min jooksul moodustunud<br />
redutseerivate suhkrute kogusena mikromoolides mg valgu kohta (U/mg).<br />
K m -i ja V max -i määramiseks rafinoosile mõõdeti mutantsetel <strong>levaansukraasi</strong>del redutseerivate<br />
suhkrute teket järgmistel rafinoosi kontsentratsioonidel: 25, 50, 100, 200 ja 300 mM.<br />
Vastavad kineetilised parameetrid rafinoosile arvutati, nagu on kirjeldatud eespool sahharoosi<br />
korral.<br />
Transfruktosüleeriv aktiivsus<br />
Levaansukraasi polümeriseeriv ehk transfruktosüleeriv aktiivsus (TA) määrati ensümaatilisel<br />
meetodil, mõõtes reaktsioonisegus vaba glükoosi ja fruktoosi hulka, mille vahe kaudu saab<br />
välja arvutada, kui suur osa reageerinud sahharoosis sisalduvast fruktoosist<br />
polümeriseeritakse (van Hijum et al., 2001; Yanase et al., 2002; Toomemaa, 2007).<br />
Inkubatsioonisegu sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), 1200 mM<br />
sahharoosi ja 2.7 U/ml puhastatud <strong>levaansukraasi</strong> või 50 µl rakulüsaati mutantide puhul,<br />
millel koguaktiivsus praktiliselt puudus. Valkude aktiivsuse arvutusteks kasutati 100 mM<br />
sahharoosist glükoosi tekke järgi aktiivsuse määramisel saadud tulemusi. Reaktsioon toimus<br />
temperatuuril 37°C 20 h jooksul ja lõpetati proovide kuumutamisega 5 min 96°C. Segudest<br />
tehti destilleeritud vette sobivad lahjendused ning pipeteeriti 10 µl proovi küvetti, mis sisaldas<br />
970 μl reaktsioonipuhvrit (5 mM MgCl 2 , 2 mM β-NAD, 1.1 mM ATP, glükoos-6-fosfaadi<br />
dehüdrogenaas 2.8 U, 200 mM imidasoolpuhver; pH 6.9). Määrati optilist tihedust (OD 340 )<br />
heksokinaasi (1.5 U) ning fosfoglükoisomeraasi (1.4 U) lisamisel ja polümeriseeriv aktiivsus<br />
arvutati valemiga ([Glc]-[Fru v ])/[Glc])*100, kus [Glc] näitab glükoosi ja [Fru v ] vaba<br />
polümeriseerimata fruktoosi kontsentratsiooni reaktsioonisegus. TA väljendati protsendina,<br />
mis näitab polümeriseerimisproduktidesse lülitatud fruktoosi osakaalu.<br />
Valgu kontsentratsiooni määramiseks kasutati Lowry meetodit (Lowry et al., 1951).<br />
2.2.6 Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de puhastamine Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga<br />
E. coli BL21(DE3) transformante, mis sisaldasid ekspressioonikonstrukte pURI3-lsc3P222L,<br />
pURI3-lsc3D225A või pURI3-lsc3D225N, kasvatati, mutantse <strong>levaansukraasi</strong> ekspressioon<br />
indutseeriti ning rakuekstrakt valmistati, nagu on näidatud peatükis 2.2.4. Valkude<br />
19
puhastamisel lähtuti E. Kallase kasutatud metoodikast, mida kohandati <strong>Lsc3</strong> valgule (Kallas,<br />
2010). Saadud 10 ml rakulüsaadile lisati 400 μl Ni 2+ -NTA agaroosi (Hispanagar, Hispaania)<br />
ja inkubeeriti 2 h 4°C end-over-end segajal (Bio RS-24, BioSan, Läti), et levaansukraas<br />
seonduks maatriksile. Ni 2+ -maatriks tsentrifuugiti põhja (380 g, 1 min, 4°C) ning pesti kaks<br />
korda 5 ml sonikeerimispuhvriga. Ni 2+ -maatriks suspendeeriti 2 ml sonikeerimispuhvris ja<br />
kanti ilma membraanita RNA minikolonnidele ning tsentrifuugiti (380 g, 1 min, 4°C).<br />
Seejärel <strong>levaansukraasi</strong> valgud elueeriti maatriksilt 1 ml elueerimispuhvriga (500 mM<br />
imidasool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10% glütserool; pH 6.0). Levaansukraasi<br />
sisaldavad eluaadid viidi Spectra/Por 3 dialüüsimembraani, mis ei lase läbi suuremaid<br />
molekule kui 3500 daltonit (Da) (Mw cut-off 3.5 kDa; Spectrum Laboratories, Holland).<br />
Valgulahust dialüüsiti 4°C 24 h Na-asiidi sisaldavas McIllvaine’i puhvris (pH 6.0). Seejärel<br />
kaeti membraanid polüetüleenglükooliga, mille molekulmass on 8000 Da (PEG8000;<br />
SIGMA, USA), ning kontsentreeriti 4°C, kuni lahuse maht vähenes ligi kaks korda. Saadud<br />
<strong>levaansukraasi</strong> lahust kasutati puhta valgupreparaadina. Kõikidest valgu puhastamise<br />
etappidest võeti proovid ning neid analüüsiti denatureerival polüakrüülamiidgeelil (SDS-<br />
PAGE) (pt. 2.2.7).<br />
2.2.7 Geelelektroforees<br />
DNA fragmentide lahutamiseks ja plasmiidse DNA kontrolliks kasutati elektroforeesi 1%<br />
agaroosgeelil 0.5 x TAE puhvris (40 mM Tris-atsetaatpuhver, 1 mM EDTA; pH 8.2).<br />
Agaroosgeel sisaldas etiidiumbromiidi (0.35 μg/ml). Geelile kantavatele segudele lisati<br />
glütserooli sisaldavat geelivärvi (1x DNA Loading Dye, Fermentas) ja geelelektroforees<br />
toimus toatemperatuuril 0.5 x TAE puhvris ning pingel 10 V/cm. DNA fragmendid tehti<br />
nähtavaks ultraviolettvalguses UV Transillumnator-iga (UVP, USA). Produktide suuruse<br />
määramiseks kasutati GeneRuler 1 kb DNA markerit (Fermentas).<br />
Rakulüsaatides sisalduvad valgud lahutati nii denatureeriva (SDS) kui ka natiivse<br />
(mittedenatureeriva) polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga (PAGE). Natiivne 7.5% PAGE geel<br />
valmistati standardprotokolli järgi (Sambrook et al., 1989; Visnapuu et al., 2008). Geeli rajale<br />
kanti 20 μg rakuekstrakti, mis oli suspendeeritud 50% glütserooliga broomfenoolsinise<br />
lahuses. Geel voolutati Hoefer-i (USA) geelelektroforeesi süsteemiga madalal temperatuuril<br />
(4°C) 10 V/cm ja voolutuspuhvrina kasutati 0.5 x TBE puhvrit (pH 8.3). Tehti paralleelleselt<br />
2 natiivset PAGE geeli – üks ilmutati aktiivsuse järgi toatemperatuuril 10% sahharoosiga<br />
McIllvaine’i puhvris (pH 6.0) ligi 20 h ning teine geel värviti valgule Coomassie Brilliant<br />
Blue G250 (Serva, Saksamaa) lahusega.<br />
20
Denatureeriv polüakrüülamiidgeelelektroforees (SDS-PAGE) tehti tritsiin-SDS-PAGE<br />
geeliga (Schägger, 2006). Geeli rajale kanti 10 μg rakulüsaati või 1 µg puhastatud<br />
<strong>levaansukraasi</strong>, mis oli eelnevalt suspendeeritud 1 x Laemmli puhvris (Laemmli, 1970) ning<br />
kuumutatud 5 min 96°C. Geelid voolutati Mini-PROTEAN Tetra süsteemiga (BIO-RAD,<br />
USA) toatemperatuuril ja pingel 11 V/cm. Seejärel geel värviti Coomassie Brilliant Blue<br />
G250 lahusega ning <strong>levaansukraasi</strong>de ligikaudset molekulmassi hinnati valkude<br />
suurusmarkeris PageRuler TM SM0671 (Fermentas) sisalduvate valkude liikumise alusel.<br />
Positiivse kontrollina kanti geelidele ka 1 µg meie töögrupis eelnevalt puhastatud <strong>Lsc3</strong><br />
muteerimata valku.<br />
2.2.8. Õhukese kihi kromatograafia<br />
Levaansukraasi reaktsiooniproduktide lahutamiseks kasutati õhukese kihi kromatograafiat<br />
(Thin Layer Chromatography – TLC). Reaktsioonisegu oli samasugune, nagu kasutati<br />
transfruktosüleeriva aktiivsuse määramiseks (vt. pt. 2.2.5). 0.5 μl 4x destilleeritud vees<br />
lahjendatud proovi kanti koos sama koguse markersuhkrutega kontsentreeriva tsooniga TLC<br />
plaadi stardijoonele (Silica gel 60 F254; Merck, Saksamaa). Markeriteks kasutati 2% levaani,<br />
25 mM kestoosi ja nüstoosi ning 0.1 M fruktoosi ja sahharoosi. Kromatograafiaplaati<br />
voolutati kaks korda seguga kloroform-metanool-vesi (90:65:15) (Tajima et al., 2000).<br />
Fruktoosi sisaldavate suhkrute ilmutamiseks kasteti plaat uurea reaktiivi (3% uurea, 1 M<br />
fosforhape veega küllastatud butanoolis) ja kuumutati temperatuuril 120°C ~10 min kuni<br />
suhkrulaikude värvumiseni (St. John et al., 1996).<br />
2.3 Tulemused ja arutelu<br />
2.3.1 Levaansukraasi <strong>Lsc3</strong> võimalike katalüütiliste aminohapete ennustamine ja<br />
vastavate mutantide konstrueerimine<br />
Levaansukraas on ensüüm, mis hüdrolüüsib sahharoosi või mõne muu sobiva substraadi<br />
glükosiidsidet ning polümeriseerib fruktoosi jäägid polüsahhariidseks levaaniks või<br />
oligosahhariidideks. Tomati ja müürlooga (Arabidopsis thaliana) patogeeni P. syingae pv.<br />
tomato <strong>DC3000</strong> genoomis on kolm <strong>levaansukraasi</strong> kodeerivat geeni: lsc1, lsc2 ja lsc3 (Buell<br />
et al., 2003; Visnapuu et al., 2008), mille täpsed funktsioonid on seni teadmata. Antud töös<br />
uuritakse põhjalikumalt <strong>Lsc3</strong> valku ning selle mutante. Eelnevalt on meie töögrupis<br />
konstrueeritud <strong>Lsc3</strong> valgu ekspressiooniplasmiid pHIPMalprom-lsc3, millega saab E. coli’s<br />
<strong>levaansukraasi</strong> heteroloogiliselt ekspresseerida. Levaansukraasi eriaktiivsus rekombinantsetes<br />
rakuekstraktides oli kõrge ja <strong>Lsc3</strong> valk moodustas raku valkudest olulise osa – kuni 20%.<br />
21
Leiti, et <strong>Lsc3</strong> kasutab substraadina hüdrolüüsi- ja polümerisatsiooniproduktide tootmiseks<br />
lisaks sahharoosile ka rafinoosi ja stahhüoosi ning ensüümi afiinsus sahharoosile oli ligi kaks<br />
korda suurem kui teistele substraatidele (Visnapuu, 2007; Visnapuu et al., 2008). Lisaks<br />
polümeersele levaanile toodab <strong>Lsc3</strong> ka lühemaid oligosahhariide, millel võib olla prebiootilist<br />
toimet (Visnapuu et al., 2009).<br />
Käesoleva töö eesmärgiks oli <strong>levaansukraasi</strong> <strong>Lsc3</strong> võimalike katalüüsis oluliste aminohapete<br />
ennustamine, vastavate mutantide konstrueerimine ja mutatsioonide mõju hindamine <strong>Lsc3</strong><br />
koguaktiivsusele, katalüütilistele parameetritele ja polümerisatsiooniproduktide tekkele.<br />
Kõigepealt joondati Z. mobilis’e, G. diazotrophicus’e ja Rahnella aquatilis’e levaasukraaside<br />
järjestused <strong>Lsc3</strong>-ga (Joonis 2). Järjestused valiti gramnegatiivsete bakterite <strong>levaansukraasi</strong>de<br />
hulgast, sest need valgud on suhteliselt sarnased ja joonduvad omavahel hästi.<br />
Grampositiivsete bakterite <strong>levaansukraasi</strong>d on aga pikemad, järjestuselt gramnegatiivsete<br />
bakterite <strong>levaansukraasi</strong>dest rohkem erinevad ja seetõttu halvemini nendega joonduvad. Nii P.<br />
<strong>syringae</strong> <strong>DC3000</strong> <strong>Lsc3</strong> valgu kui ka teiste gramnegatiivsete bakterite <strong>levaansukraasi</strong>de<br />
valgujärjestused võeti CAZy andmebaasist (http://www.cazy.org). Joonduseks kasutati<br />
programmi BioEdit moodulit ClustalW (Thompson et al., 1994). Vastavate valkude joondus<br />
on esitatud Joonisel 2 ning välja on toodud konserveerunud katalüütilised aminohapped.<br />
Valkude struktuuri ja funktsiooni vaheliste seoste uurimiseks kasutatakse tihti koht-suunatud<br />
mutageneesi. Selleks tekitatakse valku kodeerivasse geeni punktmutatsioonid, millega<br />
vahetub aminohappe koodon, ning mutantseid valke iseloomustades hinnatakse vastava<br />
aminohappe asenduse mõju. Näiteks G. diazotrophicus’e LsdA valgu kristallstruktuuri alusel<br />
ennustati, et katalüütilise kolmiku aminohapped on Asp135 (nukleofiil), Asp309<br />
(stabiliseerija) ja Glu401 (alus-hape katalüüsija) (Martinez-Fleites et al., 2005) (Tabel 1;<br />
Joonis 1 ja 2). LsdA koht-suunatud mutageneesiga on eksperimentaalselt tõestatud Asp309 ja<br />
Asp135 olulisus: mutantidel Asp309Asn ja Asp135Asn oli väga tugevasti langenud<br />
katalüüsivõime (vt. pt. 1.3.2) (Batista et al., 1999; Martinez-Fleites et al., 2005).<br />
Ennustasime <strong>levaansukraasi</strong> valkude joonduse abil (Joonis 2) võimalikud <strong>Lsc3</strong> valgu<br />
katalüütilise kolmiku aminohappeid: nukleofiil Asp62, RDP-motiivis asuv stabiliseerija<br />
Asp219 ja alus-hape katalüüsija Glu303.<br />
22
80 90 100 110 120 130 140<br />
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|<br />
Ps PLVDNIKYPP-----TVWSRADALKVNEN------------DPTTTQPLVSADFPVMSDTVFIWDTMPLR 67<br />
Gd SIHTQQAYDPQSDFTARWTRADALQIKAHSDATVAAGQNSLPAQLTMPNIPADFPVINPDVWVWDTWTLI 140<br />
Zm MLNKAGIAEP-----SLWTRADAMKVHTD------------DPTATMPTIDYDFPVMTDKYWVWDTWPLR 53<br />
Ra --MTNLNYTP-----TIWTRADALKVNEN------------DPTTTQPIVDADFPVMSDEVFIWDTMPLR 51<br />
150 160 170 180 190 200 210<br />
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|<br />
Ps ELDGTVVSVNGWSVIITLTADRHPDDPQYLGPDGRYDIKRDWEDRHGRARMCYWYSRTGK---------D 128<br />
Gd DKHADQFSYNGWEVIFCLTADPN--------------AGYGFDDRHVHARIGFFYRRAGIPASRRPVNGG 196<br />
Zm DINGQVVSFQGWSVIFALVADR---------------TKYGWHNRNDGARIGYFYSRGGS---------N 99<br />
Ra SLDGTVVSVDGWSVIFTLTAQRNNNNSEYLDAEGNYDITSDWNNRHGRARICYWYSRTGK---------D 112<br />
220 230 240 250 260 270 280<br />
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|<br />
Ps WIFGGRVMAEGVSPTT---------REWAGTPILLNDKGD-IDLYYTCV-----------TPG-AAIAKV 176<br />
Gd WTYGGHLFPDGASAQVYAGQTYTNQAEWSGSSRLMQIHGNTVSVFYTDVAFNRDANANNITPPQAIITQT 266<br />
Zm WIFGGHLLKDGANPRS---------WEWSGCTIMAPGTANSVEVFFTSVND---------TPSESVPAQC 151<br />
Ra WIFGGRVMAEGVSPTS---------REWAGTPILLNEDGD-IDLYYTCV-----------TPG-ATIAKV 160<br />
RDP-motiiv<br />
Nukleofiil<br />
290 300 310 320 330 340 350<br />
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|<br />
Ps RGRIVTSDQGVELKDFTQVKKLFEADGTYYQTEAQNSSWNFRDPSPFIDPND-GKLYMVFEGNVAGERGS 245<br />
Gd LGRIHADFNHVWFTGFTAHTPLLQPDGVLYQNGAQNEFFNFRDPFTFEDPKHPGVNYMVFEGNTAGQRGV 336<br />
Zm KGYIYADDKSVWFDGFDKVTDLFQADGLYYADYAENNFWDFRDPHVFITPKI-GKTYALFEGNVAMERGT 220<br />
Ra RGKVLTSEEGVTLAGFNEVKSLFSADGVYYQTESQNPYWNFRDPSPFIDPHD-GKLYMVFEGNVAGERGS 229<br />
Alus-hape katalüüsija<br />
360 370 380 390 400 410 420<br />
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|<br />
Ps HTVGVAELGPVP--PGHEDVG-----GARFQVGCIGLAVAKDLSGEEWEILPPLVTAVGVNDQTERPHYV 308<br />
Gd ANCTEADLGFRPNDPNAETLQEVLDSGAYYQKANIGLAIATDSTLSKWKFLSPLISANCVNDQTERPQVY 406<br />
Zm VAVGEEEIGPVP--PKTETPD-----GARYCAAAIGIAQALNEARTEWKLLPPLVTAFGVNDQTERPHVV 283<br />
Ra HVIGKQEMGTLP--PGHRDVG-----NARYQAGCIGMAVAKDLSGDEWEILPPLVTAVGVNDQTERPHFV 292<br />
430 440 450 460 470 480 490<br />
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|<br />
Ps FQDGKYYLFTISHKFTYADGVTGPDGVYGFVGEH-LFGPYRPMN-ASGLVLGNPPEQ------------- 363<br />
Gd LHNGKYYIFTISHRTTFAAGVDGPDGVYGFVGDG-IRSDFQPMNYGSGLTMGNPTDLNTAAGTDFDPSPD 475<br />
Zm FQNGLTYLFTISHHSTYADGLSGPDGVYGFVSENGIFGPYEPLN-GSGLVLGNPSSQ------------- 339<br />
Ra FQDGKYYLFTISHKFTYADGLTGPDGVYGFLSDN-LTGPYSPMN-GSGLVLGNPPSQ------------- 347<br />
500 510 520 530 540 550 560<br />
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|<br />
Ps ----PFQTYSHCVMPNGLVTSFIDSVPTTGED-YRIGGTEAPTVRILLKGDRSFVQEEYD------YGYI 422<br />
Gd QNPRAFQSYSHYVMPGGLVESFIDTVEN------RRGGTLAPTVRVRIAQNASAVDLRYGNGGLGGYGDI 539<br />
Zm ----PYQAYSHYVMTNGLVTSFIDTIPSSDPNVYRYGGTLAPTIKLELVGHRSFVTEVKG------YGYI 399<br />
Ra ----PFQTYSHCVMPNGLVTSFIDNVPTSDGN-YRIGGTEAPTVKIVLKGNRSFVERVFD------YGYI 406<br />
Joonis 2. Väljavõte nelja gramnegatiivsest bakterist pärineva <strong>levaansukraasi</strong> joondusest.<br />
Joondus on esitatud ilma N- ja C-terminaalsete osadeta: P. <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>Lsc3</strong> (Ps)<br />
positsioonidest 15-422 (täispikkus 431 ah), G. diazotrophicus’e LsdA positsioonidest (Gd)<br />
71-539 (täispikkus 584 ah), Z. mobilis’e LevU (Zm) positsioonidest 1-399 (täispikkus 423<br />
ah), R. aquatilis’e LsrA (Ra) positsioonidest 1-406 (täispikkus 415 ah). Joondus tehti<br />
programmiga ClustalW (Thompson et al., 1994). Identsed aminohapped on näidatud mustal<br />
taustal ja sarnased hallil taustal. Roosa taustaga on märgitud käesolevas töös uuritud <strong>Lsc3</strong><br />
mutandid, kus on asendatud aspartaadid positsioonides 62, 219 või 225, proliin positsioonis<br />
222 või glutamaat positsioonis 303 (vt. Tabel 2).<br />
23
Et katseliselt kinnitada Asp62 ja Glu303 kuuluvust katalüütilisse kolmikusse, muteeriti<br />
vastavad aspartaadi koodonid lsc3 geenis alaniini koodoniteks (vt. Tabel 2). Mutantsed lsc3<br />
geenid saadi nn. megapraimeri meetodiga (pt. 2.2.2), mis põhineb lsc3 geenilõigu<br />
paljundamisel mutatsiooni sisaldava praimeriga ning järjestuse edasisel pikendamisel (Wei et<br />
al., 2004; Tiirik, 2010). Mutatsiooni sisaldavad lsc3 geenid kloneeriti restriktaasi- ja<br />
ligeerimisvaba metoodikat kasutades vektorisse pURI3 (pt. 2.2.2; Geiser et al., 2001; Rivas et<br />
al., 2007). Selles vektoris geeni ekspresseerides liitub valgule N-terminaalne His 6 -järjestus,<br />
millega valk seondub Ni 2+ -agaroosile, ning võimaldab seega valgu lihtsat puhastamist E. coli<br />
transformandi rakuekstraktist. Konstrueerisime plasmiidid pURI3-lsc3D62A ning pURI3-<br />
lsc3E303A (Tabel 2, LISA 1).<br />
Meie töörühmas on eelnevalt valmistatud <strong>Lsc3</strong> mutandid Asp219Ala, Asp219Asn,<br />
Asp225Ala, Asp225Asn, millele vastavad geenid on kloneeritud Hansenula polymorpha<br />
maltaasi geeni promootori kontrolli alla vektorisse pHIPMalprom. Oletasime, et Asp219<br />
võiks olla <strong>Lsc3</strong> valgu katalüütiline aminohape (stabiliseerija). Samas mõjutab Asp225<br />
asendamine <strong>Lsc3</strong> valgus katalüütilist aktiivsust vähe ning ilmselt see aminohape katalüütilisse<br />
kolmikusse ei kuulu (Tiirik, 2010). Käesoleva töö raames kloneeriti eelpool nimetatud<br />
mutantsed lsc3 järjestused pURI3 vektorisse, et uurida puhastatud mutantsete valkude<br />
omadusi ja kinnitada nende aminohapete positsioonide eelneval uurimisel saadud tulemusi.<br />
Vastavat mutatsiooni sisaldav <strong>levaansukraasi</strong> geen amplifitseeriti sobivatest pHIPMalprom<br />
konstruktidest spetsiifiliste pikkade praimeritega (<strong>Lsc3</strong>pURI3Fw ja <strong>Lsc3</strong>pURI3Rev), mis<br />
tekitavad <strong>levaansukraasi</strong> geeni otstele pURI3 vektoriga komplementaarsed järjestused, ning<br />
geenid kloneeriti vektorisse pURI3. Saadi plasmiidid pURI3-lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N,<br />
pURI3-lsc3D225A, pURI3-lsc3D225N (Tabel 2).<br />
Kuna meie töörühmas on <strong>levaansukraasi</strong> keemilise mutageneesi teel saadud raamatukogust<br />
isoleeritud juhuslik mutant Pro222Leu (Mardo, 2011), mille mutatsioon asub aktiivtsentri<br />
läheduses, siis puhastasime ka selle mutantse valgu ja uurisime tema omadusi.<br />
Saadud plasmiidid transformeeriti E. coli tüvesse DH5α ja transformandid plaaditi LB<br />
söötmetassidele, kuhu oli lisatud kolooniate selektsiooniks ampitsilliini (pt. 2.2.4).<br />
Kolooniatel kontrolliti lsc3 geeni olemasolu PCR-iga, eraldati plasmiidne DNA ning<br />
mutatsioonide asukohta kontrolliti lsc3 geeni järjestuse sekveneerimisega (pt. 2.2.3).<br />
24
2.3.2 Levaansukraasi mutantide iseloomustamine ja katalüütilise kolmiku<br />
aminohapete identifitseerimine<br />
2.3.2.1 Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de ekspresseerimine, transformantide<br />
fenotüübi uurimine ning <strong>levaansukraasi</strong> koguaktiivsused rakuekstraktides<br />
E. coli BL21(DE3) transformante, mis sisaldasid plasmiide pURI3-lsc3D62A, pURI3-<br />
lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N, pURI3-lsc3P222L, pURI3-lsc3D225A, pURI3-lscD225N või<br />
pURI3-lsc3E303A, kasvatati LB Amp tardsöötmel. Võrdlemaks metsiktüüpi ja mutantsete<br />
<strong>levaansukraasi</strong>de fenotüüpi, külvati transformandid IPTG-ga ja 10% sahharoosiga LB Amp<br />
söötmetassidele (Joonis 3). Kontrollina kasutasime ilma <strong>levaansukraasi</strong>ta tühja vektorit<br />
pURI3 sisaldavat ja muteerimata <strong>Lsc3</strong> valku ekspresseerivat E. coli transformanti. Sahharoosi<br />
sisaldaval LB tardsöötmel lähevad limaseks nende transformantide kolooniad, mis<br />
ekspresseerivad katalüütiliselt aktiivset <strong>levaansukraasi</strong> ja toodavad sahharoosist<br />
polüsahhariidset levaani.<br />
Joonis 3. Tühja vektorit (pURI3), muteerimata <strong>levaansukraasi</strong> (<strong>Lsc3</strong> wt) ja mutantseid<br />
levaansukraase sisaldavatele E. coli BL21(DE3) transformantidele iseloomulikud<br />
kasvufenotüübid 1 mM IPTG-d ja 10% sahharoosi sisaldaval LB Amp söötmel.<br />
Jooniselt 3 on näha, et <strong>Lsc3</strong> mutandid Asp62Ala, Asp219Ala, Asp219Asn ning Glu303Ala on<br />
kaotanud võime toota levaani (lima), kuid Pro222 muteerimine leutsiiniks ning Asp225<br />
muteerimine alaniiniks või asparagiiniks ei ole transformantide fenotüüpi oluliselt muutnud.<br />
Transformante kasvatasime, indutseerisime <strong>levaansukraasi</strong> tootmise ning valmistasime<br />
rakuekstraktid, nagu on kirjeldatud peatükis 2.2.4. Lahutasime E. coli rakuekstraktid<br />
denatureerivas polüakrüülamiidgeelis ja värvisime Coomassie Brilliant Blue lahusega (pt.<br />
2.2.7), et kontrollida <strong>levaansukraasi</strong> valkude ekspressiooni ning välistada võimalus, kus<br />
mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de aktiivsus puudub sellepärast, et valgu ekspressioon on<br />
vähenenud. Geelile kandsime 10 µg mutantseid <strong>Lsc3</strong> valke ekspresseerivaid või tühja vektorit<br />
sisaldavat E. coli rakuekstrakte, puhastatud <strong>Lsc3</strong> muteerimata valku ja valgu suurusmarkerit<br />
PageRuler TM SM0671 (Fermentas) (Joonis 4).<br />
25
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. M<br />
Joonis 4. SDS-PAGE-iga lahutatud levaansukraase sisaldavd E. coli transformantide<br />
rakuekstraktid. Rajad: 1. pURI3 (tühi vektor); 2. <strong>Lsc3</strong> D62A; 3. <strong>Lsc3</strong> D219A; 4. <strong>Lsc3</strong><br />
D219N; 5. <strong>Lsc3</strong> E303A; 6. puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong> valk; 7. <strong>Lsc3</strong> wt; 8. <strong>Lsc3</strong> P222L; 9.<br />
<strong>Lsc3</strong> D225A; 10. <strong>Lsc3</strong> D225N; M on suurusmarker PageRuler TM SM0671 (Fermentas).<br />
Nägime, et uuritavate <strong>levaansukraasi</strong> mutantide rakuekstraktid sisaldavad suures koguses<br />
valku, mis on SDS-geelis samasuguse liikuvusega nagu muteerimata levaansukraas. See<br />
tõestab, et muteeritud valgud ekspresseeruvad hästi ning muutused valkude aktiivsuses<br />
tulenevad nende erinevatest omadustest, mitte valgu hulga vähenemisest rakuekstraktis.<br />
Ainuke erand oli <strong>Lsc3</strong> mutant Asp219Asn, mis rekombinantses rakuekstraktis ei<br />
ekspresseerunud.<br />
Et kontrollida <strong>levaansukraasi</strong>de ensümaatilist aktiivsust, lahutasime rekombinantsed<br />
rakuekstraktid mittedenatureerivas polüakrüülamiidgeelis. Paralleelset valmistasime kaks<br />
natiivset geeli – ühe ilmutasime levaani sünteesi järgi toatemperatuuril McIllvaine’i puhvriga<br />
(pH 6.0) 10% sahharoosi lahuses ning teise geeli värvisime valgu järgi. Kontrollina kandsime<br />
geelile puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong> valku ning tühja vektorit sisaldavat E. coli rakuekstrakti<br />
(Joonis 5).<br />
26
1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6.<br />
7. 8. 9. 10. 7. 8. 9. 10.<br />
Joonis 5. Natiivsed polüakrüülamiidgeelid mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de aktiivsuse<br />
hindamiseks E. coli rakulüsaatides. Paneelidel A ja C on 10% sahharoosi lahuses ilmutatud ja<br />
paneelidel B ja D valgule värvitud geelid. Rajad: 1. pURI3 (tühi vektor); 2. <strong>Lsc3</strong> D62A; 3.<br />
<strong>Lsc3</strong> D219A; 4. <strong>Lsc3</strong> D219N; 5. <strong>Lsc3</strong> E303A; 6. ja 10. puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong> valk; 7.<br />
<strong>Lsc3</strong> P222L; 8. <strong>Lsc3</strong> D225A; 9. <strong>Lsc3</strong> D225N.<br />
Geelipiltidelt on näha, et <strong>Lsc3</strong> mutandid Asp62Ala, Asp219Ala ning Glu303Ala ei tooda<br />
sahharoosiga ilmutatud geelil levaani (Joonis 5A), kuid paralleelselt tehtud ning valgule<br />
värvitud teine natiivne geel näitas, et mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de ekspressioon oli olemas<br />
(Joonis 5B). Mutandil Asp219Asn ekspressioon puudus nagu nägime eelnevalt ka<br />
denatureeriva geeli analüüsil (Joonis 4). Mutantide Pro222Leu, Asp225Ala ning Asp225Asn<br />
rakuekstraktid sisaldasid suurel hulgal katalüütiliselt aktiivset <strong>levaansukraasi</strong> valku, mis oli<br />
võimeline sahharoosist levaani tootma (Joonis 5C, D).<br />
Järgmisena määrati rekombinantsetest rakulüsaatidest <strong>levaansukraasi</strong> koguaktiivsus, mõõtes<br />
100 mM sahharoosist moodustuvat glükoosi hulka (pt. 2.2.5). Saadud tulemused on<br />
koondatud Tabelisse 3.<br />
27
Tabel 3. Levaansukraasi koguaktiivsused rekombinantsetes E. coli BL21(DE3)<br />
rakulüsaatides. Ära on toodud kasutatud plasmiid, <strong>levaansukraasi</strong> kahe paralleelse määramise<br />
tulemusel saadud eriaktiivsus (U/mg) ning standardhälve. Tabeli kolmas lahter näitab<br />
protsentides, kui suure osa moodustas mutantse valgu eriaktiivsus muteerimata valgu<br />
eriaktiivusest.<br />
Levaansukraasi eriaktiivsus Säilinud eriaktiivsus<br />
Plasmiid<br />
(U/mg)*<br />
(%)<br />
pURI3-lsc3 (<strong>Lsc3</strong> wt) 157.7 ± 8.2 100<br />
pURI3-lsc3D62A 0.01 ± 0.001 0.006<br />
pURI3-lsc3D219A 0.03 ± 0.001 0.02<br />
pURI3-lsc3D219N 0.01 ± 0.003 0.006<br />
pURI3-lsc3P222L 107.0 ± 0.05 68<br />
pURI3-lsc3D225A 154.1 ± 3.4 98<br />
pURI3-lsc3D225N 189.6 ± 5.7 120<br />
pURI3-lsc3D303A 0.04 ± 0.002 0.03<br />
pURI3 0.01 ± 0.003 0.006<br />
* Sahharoosi sisaldus reaktsioonisegus oli 100 mM ning reaktsioon toimus 37°C.<br />
Tabel 3 näitab, et mutantidel D62A, D219A, D219N ja E303A oli <strong>levaansukraasi</strong> aktiivsus<br />
peaaegu täielikult kadunud. Samas oli mutandil Pro222Leu säilinud üle poole algse valgu<br />
eriaktiivsusest ja mutant Asp225Ala oli väga sarnane muteerimata <strong>levaansukraasi</strong>ga.<br />
Huvitaval kombel oli mutandil Asp225Asn, millel negatiivselt laetud aspartaat oli asendatud<br />
polaarse ja laadumata asparagiiniga, oli eriaktiivsus ligi viiendiku võrra tõusnud (Tabel 3).<br />
Rakulüsaatidest määratud mutantsete valkude koguaktiivsuste muster langeb üldjoontes<br />
kokku ka E. coli transformantide fenotüüpidega sahharoosi sisaldaval söötmel (Joonis 3) ning<br />
aktiivsuse järgi ilmutatud natiivse polüakrüülamiidgeeli katse tulemustega (Joonis 5A,C). Kui<br />
mutantset <strong>levaansukraasi</strong> ekspresseerivad bakterirakud sünteesisid söötmel ja geelis lahutatud<br />
rakuekstrakides levaani, oli ka vastavas lüsaadis ensüümi eriaktiivsus palju suurem kui lima<br />
mittesünteesival transformandil.<br />
Selleks, et kontrollida, kas mutantsete valkude substraadispetsiifikas on toimunud muutusi,<br />
määrasime rekombinantsetest rakulüsaatidest 100 mM sahharoosist ja rafinoosist<br />
redutseerivate suhkrute moodustumist (pt. 2.2.5) (Tabel 4). Kui sahharoosist tekivad<br />
<strong>levaansukraasi</strong> reaktsiooni käigus glükoos ja fruktoos, siis rafinoosist vabanevad fruktoos ja<br />
melibioos. Kõik mainitud suhkrud on redutseerivate omadustega ning neid saab määrata<br />
DNSA reaktiiviga. Eelnevalt on meie töögrupis näidatud, et sahharoos on <strong>Lsc3</strong> valgule<br />
sobivam substraat kui rafinoos: 100 mM sahharoosist moodustub ~50% rohkem<br />
redutseerivaid suhkruid kui 100 mM rafinoosist (Visnapuu et al., 2008).<br />
28
Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sahharoosi ja rafinoosi hüdrolüüsiv aktiivsus (U/mg)<br />
rekombinantsetes rakulüsaatides määratuna redutseerivate suhkrute tekke järgi. Arvutatud on<br />
rafinoosi ja sahharoosi kasutamise suhe (%).<br />
Plasmiid<br />
Eriaktiivsus<br />
sahharoosiga (U/mg)<br />
Eriaktiivsus<br />
rafinoosiga (U/mg)<br />
Rafinoosi ja<br />
sahharoosi<br />
kasutamise suhe (%)<br />
pURI3-lsc3 (<strong>Lsc3</strong> wt) 291.2 ± 9.5 127.0 ± 2.7 44<br />
pURI3-lsc3P222L 165.3 ± 4.3 74.0 ± 4.1 45<br />
pURI3-lsc3D225A 108.1 ± 1.2 54.8 ± 0.6 51<br />
pURI3-lsc3D225N 319.1 ± 0.8 148.0 ± 0.2 46<br />
Tabelist 4 on näha, et mutantsete valkude Pro222Leu, Asp225Ala ning Asp225Asn võime<br />
kasutada substraadina rafinoosi on väga sarnane muteerimata <strong>Lsc3</strong> valguga – rafinoosist tekib<br />
redutseerivaid suhkruid ligi poole vähem kui sahharoosist. Kuna <strong>Lsc3</strong> mutantidel Asp62Ala,<br />
Asp219Asn, Asp219Ala ja Glu303Ala <strong>levaansukraasi</strong> aktiivsus rakulüsaatides praktiliselt<br />
puudus, siis ei olnud neil võimalik sahharoosi ja rafinoosi kasutamise suhet määrata.<br />
2.3.2.2 Mutantsete valkude puhastamine ja nende kineetilised parameetrid<br />
Valkude puhastamiseks kasvatati vastavad E. coli transformandid ja indutseeriti neil<br />
<strong>levaansukraasi</strong> tootmine ning valmistati rakulüsaat, nagu on näidatud peatükis 2.2.4. N-<br />
terminaalse His 6 -järjestusega mutantsed <strong>Lsc3</strong> valgud Pro222Leu, Asp225Ala ja Asp225Asn<br />
puhastati Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga ning seondunud mutantsed <strong>levaansukraasi</strong>d elueeriti<br />
Ni-maatriksilt 500 mM imidasooli sisaldava puhvriga. Levaansukraasi sisaldavad fraktsioonid<br />
segati kokku ning dialüüsiti McIllvaine’i puhvris (pH 6.0) (pt. 2.2.6). Kõikidest valkude<br />
puhastamise etappidest võeti proovid (5 µl), mida analüüsiti denatureerivas<br />
polüakrüülamiidgeelis (SDS-PAGE) (pt. 2.2.7). Vastavad geelid on ära toodud LISA-s 2.<br />
Nägime, et valkude puhastamise saagis oli hea ning elueeritud levaansukraas moodustas geelil<br />
ühe konkreetse bändi. Sellest võib järeldada, et preparaat sisaldas ainult <strong>levaansukraasi</strong> ning<br />
mitte teisi E. coli valke, mis võiksid edasisi katseid segada.<br />
Kontrollisime puhastatud valkudega, kas mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de substraadispetsiifikas<br />
võis olla toimunud muutusi. Tulemused on näidatud Tabelis 5.<br />
29
Tabel 5. Levaansukraasi sahharoosi ja rafinoosi (400 mM) hüdrolüüsiv aktiivsus puhastatud<br />
valkudel määratuna redutseerivate suhkrute järgi.<br />
Levaansukraas<br />
Eriaktiivsus<br />
sahharoosiga (U/mg)<br />
Eriaktiivsus<br />
rafinoosiga (U/mg)<br />
Rafinoosi protsent<br />
sahharoosi<br />
eriaktiivsusest (%)<br />
<strong>Lsc3</strong> P222L 631.3 ± 4.5 285.5 ± 6.0 45<br />
<strong>Lsc3</strong> D225A 876.0 ± 17.7 363.6 ± 36.3 42<br />
<strong>Lsc3</strong> D225N 1095.5 ± 34.5 438.9 ± 18.6 40<br />
Tabelist 5 on näha, et mutantide P222L, D225A ning D225N võime kasutada substraadina<br />
rafinoosi on jäänud suhteliselt sarnaseks muteerimata <strong>Lsc3</strong> valguga. Saadud tulemused<br />
langevad kokku ka rakulüsaatides määratud vastavate väärtustega (Tabel 4).<br />
Puhastatud mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de afiinsus sahharoosile (K m ), maksimaalne<br />
reaktsioonikiirus (V max ) ja inhibitsioonikonstant K i määrati glükoosi eraldumise järgi<br />
sahharoosist Glucose Liquicolor-i reaktiiviga. Puhastatud valkude K m ja V max rafinoosi suhtes<br />
määrati, mõõtes redutseerivate suhkrute teket rafinoosist. Ensüümi kineetilised parameetrid<br />
arvutati programmiga SigmaPlot 2001 (pt. 2.2.5). Vastavad Michaelis-Menteni ja Eadie-<br />
Hofstee tüüpi graafikud on toodud LISA-s 3 ning saadud tulemused esitatud Tabelis 6.<br />
Tabel 6. Puhastatud <strong>levaansukraasi</strong>de afiinsused (K m ; mM) sahharoosile ja rafinoosile,<br />
maksimaalne reaktsioonikiirus (V max ; U/mg) ning rafinoosi inhibitsioonikonstant (K i ; mM).<br />
SAHHAROOS<br />
RAFINOOS<br />
Valk K m (mM) V max (U/mg) K i (mM) K m (mM) V max (U/mg)<br />
<strong>Lsc3</strong> wt* 18.5 ± 2.5 610.5 ± 82.0 39.9 ± 6.1 44.8 ± 0.4 221.1 ± 5.7<br />
<strong>Lsc3</strong> P222L 24.6 ± 2.7 452.8 ± 15.7 26.1 ± 3.0 29.8 ± 5.4 160.1 ± 7.9<br />
<strong>Lsc3</strong> D225A 23.6 ± 3.4 589.9 ± 26.0 39.3 ± 6.5 29.4 ± 7.4 206.9 ± 14.0<br />
<strong>Lsc3</strong> D225N 27.6 ± 6.2 830.8 ± 62.9 - 22.8 ± 5.4 248.7 ± 14.1<br />
* Võrdluseks toodud puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong> valgu andmed on saadud T. Visnapuult.<br />
- Vastavat parameetrit polnud võimalik arvutada, sest rafinoos ei inhibeerinud reaktsiooni.<br />
Selgus, et mutandil Pro222Leu on maksimaalne reaktsioonikiirus (V max ) nii sahharoosiga kui<br />
ka rafinoosiga, võrreldes algse valguga, veidi alanenud. Pro222Leu valgu afiinsus<br />
sahharoosile sarnaneb metsiktüüpi <strong>Lsc3</strong> valgu omaga, kuid afiinus rafinoosile on veidi<br />
suurenenud. Mutantsel valgul Asp225Ala on säilinud algsele valgule väga sarnased omadused<br />
ning tundub, et selline asendus ei häiri <strong>Lsc3</strong> katalüüsi. Mutandil Asp225Asn on V max<br />
sahharoosile ligikaudu 36% võrra tõusnud. Sarnast ensüümiaktiivsuse tõusu nägime ka<br />
rakulüsaadis (Tabel 3). Ensüümi maksimaalne reaktsioonikiirus oli kasvanud ka juhul, kui<br />
30
substraadiks oli rafinoos. Afiinsus rafinoosile oli paranenud. Kuigi eespool kirjeldatud<br />
sahharoosi ja rafinoosi hüdrolüüsiva aktiivsuse võrdlemisel tundus, et valgu Asp225Asn<br />
substraadispetsiifikas muutusi ei ole toimunud (Tabel 6), näitas kineetika uurimine<br />
Asp225Asn valgul selgesti afiinsuse tõusu rafinoosile.<br />
Seejärel arvutasime valkude katalüütilised konstandid ning katalüütilise efektiivsuse.<br />
Katalüütiline konstant k cat (1/min) arvutati võttes arvesse vastava valgu V max väärtust ja<br />
ensüümi molekulmassi ning katalüütiline efektiivsus (1/M*min) leiti k cat ja K m jagatise kaudu.<br />
Katalüütiline konstant vastab maksimaalsele substraadi molekulide arvule, mille reageerimist<br />
on üks ensüümimolekul (aktiivtsenter) ajaühikus võimeline katalüüsima. Tulemused on<br />
toodud Tabelis 7.<br />
Tabel 7. Puhastatud <strong>levaansukraasi</strong>de katalüütilised konstandid (k cat ; 1/min) ja katalüütilised<br />
efektiivused (k cat /K m ; 1/M*min) nii sahharoosiga kui ka rafinoosiga. Toodud on ka<br />
muteerimata valgu vastavad parameetrid.<br />
SAHHAROOS<br />
RAFINOOS<br />
Valk<br />
k<br />
k cat (1/min)<br />
cat /K m k cat (1/min) k cat /K m<br />
(1/M*min)<br />
(1/M*min)<br />
<strong>Lsc3</strong> wt* 3.03 x 10 4 164.0 x 10 4 1.10 x 10 4 24.5 x 10 4<br />
<strong>Lsc3</strong> P222L 2.25 x 10 4 84.4 x 10 4 0.79 x 10 4 26.6 x 10 4<br />
<strong>Lsc3</strong> D225A 2.92 x 10 4 111.0 x 10 4 1.02 x 10 4 34.9 x 10 4<br />
<strong>Lsc3</strong> D225N 4.11 x 10 4 149.0 x 10 4 1.23 x 10 4 54.1 x 10 4<br />
* Võrdluseks toodud puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong> valgu andmed on saadud T. Visnapuult.<br />
Nägime, et <strong>Lsc3</strong> mutandi Pro222Leu katalüütiline efektiivsus sahharoosiga langes ~2 korda.<br />
Valkudel Asp225Ala ja Asp225Asn polnud olulist katalüütilise efektiivsuse langust märgata<br />
(vastavad näitajad langesid metsiktüüpi valguga võrreldes ~1.5 ja ~1.1 korda). Kui<br />
substraadiks oli rafinoos, siis katalüütiline efektiivsus oli valkudel Asp225Ala ja Asp225Asn<br />
veidi tõusnud.<br />
2.3.2.3 Mutantsete <strong>Lsc3</strong> valkude polümerisatsiooniproduktid<br />
Selleks, et uurida, kas mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de polümeriseerivas ehk<br />
transfruktosüleerivas aktiivsuses on toimunud muutusi, määrati ensümaatilisel meetodil<br />
reaktsioonisegus tekkinud vaba glükoosi ja fruktoosi hulka (pt. 2.2.5). Levaansukraasi TA<br />
väljendati protsendina, mis näitab polümeriseeritud fruktoosi osakaalu reageerinud<br />
sahharoosis sisaldunud fruktoosist. Võimalike katalüütilise tsentri aminohapete mutantide<br />
puhul kasutati ensüümpreparaadina rakulüsaate, mutantide Pro222Leu, Asp225Ala ning<br />
31
Asp225Asn puhul aga puhastatud valke. Varem on meie töörühmas näidatud, et muteerimata<br />
<strong>Lsc3</strong> valgu TA on 76% (T. Visnapuu, avaldamata andmed). Antud töös tehtud katse näitas, et<br />
valgu <strong>Lsc3</strong> Asp62Ala mutandi TA on tunduvalt langenud – 37%-ni. Asp219Ala ja Glu303Ala<br />
mutantidel polnud TA muutunud ning sarnanes metsiktüüpi valguga. Siinkohal peab<br />
arvestama, et nendel mutantidel olid rakulüsaatides eriaktiivsused väga väikesed (vt. Tabel 3),<br />
mistõttu ei pruugi saadud tulemused olla tõepärased ning määramisi tuleks korrata puhastatud<br />
preparaatidega. Puhastatud <strong>Lsc3</strong> P222L, D225A ja D225N valkudel polümeriseerivas<br />
aktiivsuses olulisi erinevusi, võrreldes metsiktüüpi valguga, ei leitud. Kirjandusest võib leida<br />
andmeid, kus <strong>levaansukraasi</strong>de katalüütilise kolmiku aminohapete muteerimisel TA on jäänud<br />
samuti väga sarnaseks muteerimata algsele valgule, näiteks Z. mobilis’e LevU korral, kus<br />
stabiliseerija mutandil Asp194Asn oli TA samasugune nagu metsiktüüpi valgul (Yanase et<br />
al., 2002).<br />
Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de reaktsiooniprodukte uurisime ka õhukese kihi kromatograafiaga<br />
(TLC) (Joonis 6). Reaktsioonisegud ja TLC tehti, nagu on näidatud eespool (pt. 2.2.5 ja<br />
2.2.8).<br />
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.<br />
Joonis 6. Mutantsete valkude polümerisatsiooniproduktide lahutamine õhukese kihi<br />
kromatograafiaga. Reaktsioonisegud sisaldasid 1.2 M sahharoosi. Rajad: 1. markerid: levaan<br />
(2%), kestoos PA 3 (25 mM) ja fruktoos (0.1 M); 2. Markerid: nüstoos PA 4 (25 mM) ja<br />
sahharoos (0.1 M); 3. <strong>Lsc3</strong> wt puhastatud valk; 4. <strong>Lsc3</strong> D62A; 5. <strong>Lsc3</strong> D219A; 6. <strong>Lsc3</strong><br />
E303A; 7. <strong>Lsc3</strong> D225A; 8. <strong>Lsc3</strong> D225N; 9. <strong>Lsc3</strong> P222L. F – fruktoos; S – sahharoos; K –<br />
kestoos; N – nüstoos; L – levaan.<br />
Õhukese kihi kromatograafiaga saadud tulemuste analüüs kinnitas, et <strong>Lsc3</strong> mutantsetel<br />
valkudel D62A, D219A ning E303A polümeriseeriv aktiivsus praktiliselt puudus: tekkinud oli<br />
väga vähe polümerisatsiooniprodukte. Kõige inaktiivsem tundus olevat D62A mutant, sest<br />
peale substraadina reaktsioonisegusse lisatud sahharoosi polnud muid komponente võimalik<br />
32
eristada. Valkude <strong>Lsc3</strong> D225A, D225N ja D225A sünteesitavate produktide spekter jäi aga<br />
sarnaseks <strong>Lsc3</strong> muteerimata valguga. Tekkinud oli nii nüstoosi, kestoosi kui ka<br />
polüsahhariidset levaani, mis ei liikunud kromatograafiaplaadi stardijoonelt.<br />
2.3.2.4 Valgu <strong>Lsc3</strong> katalüütilise kolmiku aminohapete identifitseerimine<br />
Mutantsete valkude analüüsil selgus, et suure tõenäosusega moodustavad <strong>Lsc3</strong> valgu<br />
katalüütilise kolmiku Asp62, Asp219 ja Glu303, mis võiksid olla vastavalt nukleofiiliks,<br />
vahekompleksi stabiliseerijaks ja alus-hape katalüüsijaks. Rakulüsaatidest mõõdetud<br />
<strong>levaansukraasi</strong> koguaktiivsused näitasid, et mutantsetel valkudel D62A, D219A ja E303A<br />
puudus katlüütiline aktiivsus peaaegu täielikult (Tabel 3). Ka teiste bakterite <strong>levaansukraasi</strong>de<br />
muteerimisega on näidatud, et katalüütilise tsentri aminohapete muteerimisel langeb<br />
katalüütiline efektiivsus väga tugevasti. Näiteks Z. mobilis’e <strong>levaansukraasi</strong> LevU alus-hape<br />
katalüüsija mutantidel Glu278Asp ja Glu278His langes ensüümi katalüütiline efektiivsus<br />
langes vastavalt ~40 ja ~450 korda. Kui aga fruktosüül-ensüümi vaheühendi stabiliseerija<br />
Asp194 muudeti asparagiiniks, siis LevU katalüütiline efektiivsus langes veel palju rohkem –<br />
8340 korda (Yanase et al., 2002).<br />
Puhastatud <strong>Lsc3</strong> mutandil Pro222Leu ei olnud substraadispetsiifikas ega afiinsuse<br />
parameetrites suuri muutusi, võrreldes metsiktüüpi valguga, kuid katalüütiline aktiivsus oli<br />
mõnevõrra langenud. <strong>Lsc3</strong> valgu mutant Asp225Ala käitus nagu muteerimata <strong>Lsc3</strong>. Mutandil<br />
Asp225Asn oli paranenud rafinoosi kasutamise. Aminohapete Asp225 ja Pro222 mutantidel<br />
ei muutunud sahharoosist sünteesitavate polümerisatsiooniproduktide muster. Saadud<br />
andmete põhjal võib järeldada, et Asp225 ning Pro222 katalüütilise tsentri aminohapete hulka<br />
ei kuulu ja katalüüsis eriti olulised ei ole.<br />
33
KOKKUVÕTE<br />
Levaansukraasid on glükosiidi hüdrolaaside perekonda 68 kuuluvad rakuvälised ensüümid,<br />
mis sünteesivad fruktooligosahhariide ja polümeerset levaani. Levaansukraase on leitud nii<br />
gramnegatiivsetest kui ka -positiivsetest bakteritest, kuid need ensüümid võivad<br />
valgujärjestuste poolest üsna palju erineda. Sellele vaatamata on <strong>levaansukraasi</strong>del väga<br />
sarnane struktuur ning aktiivtsenter. On leitud, et <strong>levaansukraasi</strong>d, teised fruktosüüli<br />
transferaasid ning ka invertaasid on β-lehtedest koosnevad viielabalise β-propelleri ehitusega,<br />
mille keskel on happelistest aminohapetest tasku, kuhu seondub substraat. Mitmete bakterite<br />
levaansukraase on muteeritud, et teha kindlaks, millised aminohapped ja piirkonnad on<br />
ensüümi töös olulised. Substraadi sidumiseks ja hüdrolüüsiks on vajalikud kolm aminohapet<br />
(nn katalüütiline kolmik), mille moodustavad kaks aspartaati ja glutamaat, mis on<br />
konserveerunud kõigis seni uuritud <strong>levaansukraasi</strong>des.<br />
Eelnevalt on meie töögrupis kirjeldatud <strong>Lsc3</strong> valgu biokeemilisi omadusi ja näidatud, et <strong>Lsc3</strong><br />
kasutab substraadina nii sahharoosi kui ka rafinoosi ja sünteesib neist fruktooligosahhariide ja<br />
ka heterooligosahhariide (Visnapuu et al., 2008; 2009; T. Visnapuu, avaldamata andmed).<br />
Antud töös keskenduti P. <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>DC3000</strong> <strong>levaansukraasi</strong> <strong>Lsc3</strong> koht-suunatud<br />
muteerimisele ja vastavate mutantide analüüsile, et teha kindlaks, millised aminohapped<br />
võiksid moodustada ensüümi katalüütilise kolmiku.<br />
Töö tulemused ja järeldused olid järgmised:<br />
1. <strong>Lsc3</strong> valgu järjestus joondati teiste gramnegatiivsetest bakteritest pärinevate<br />
<strong>levaansukraasi</strong>dega ja leiti, et Asp62, Asp219 ja Glu303 joonduvad kohakuti teiste<br />
<strong>levaansukraasi</strong>de katalüütilise kolmiku aminohapetega.<br />
2. Mutantsed lsc3 geenid, mis kodeerivad <strong>Lsc3</strong> valgus asendusi Asp219Ala, Asp219Asn,<br />
Asp225Ala ja Asp225Asn, kloneeriti ekspressioonivektorisse pURI3.<br />
3. Koht-suunatud muteerimisega tehti konstruktid <strong>Lsc3</strong> valgu mutantide Asp62Ala ja<br />
Glu303Ala ekspressiooniks pURI3 vektoris.<br />
4. Mutantseid <strong>Lsc3</strong> valke Asp62Ala, Asp219Ala, Asp219Asn, Pro222Leu, Asp225Ala,<br />
Asp225Asn, Glu303Ala ekspresseeriti E. coli’s ning iseloomustati biokeemiliste näitajate<br />
alusel.<br />
5. Mutandid Asp62Ala, Asp219Ala ja Glu303Ala kaotasid peaaegu täielikult võime<br />
sahharoosi lagundada ja levaani toota. Samas aminohapete Pro222 ja Asp225 asendused ei<br />
muutnud oluliselt ensüümi omadusi, millest järeldame, et need aminohapped ei ole<br />
olulised <strong>Lsc3</strong> katalüüsis.<br />
6. Meie tulemuste kohaselt moodustavad <strong>Lsc3</strong> valgu katalüütilise kolmiku Asp62, Asp219 ja<br />
Glu303.<br />
34
Identification of catalytic triad amino acids in <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. tomato<br />
levansucrase <strong>Lsc3</strong> by mutational analysis<br />
Triin Elmi<br />
SUMMARY<br />
Levansucrases are bacterial exoenzymes belonging to glycoside hydrolase family 68. They<br />
catalyse the transfer of fructosyl residue from substrate to a variety of acceptors including<br />
water (sucrose hydrolysis), sucrose (oligofructose synthesis) and oligofructans (polymerase<br />
reaction). It has been shown that fructans, like polysaccharidic levan, are involved in fitness<br />
and survival of bacteria in the environment and in phytopathogenesis, e.g. in development of<br />
the dental plaque and biofilm. Moreover, fructooligosaccharides act as health-promoting<br />
prebiotics in the gut of humans and animals.<br />
Levansucrases and other fructosyl transferases and also invertases have a common five-blade<br />
β-propeller fold containing a catalytic pocket with three conserved acidic amino acids. The<br />
catalytic triad is composed of catalytic nucleophile (Asp), transition state stabilizer (Asp) and<br />
general acid/base catalyst (Glu).<br />
The aim of this study was to identify catalytic triad amino acids in the active centre of P.<br />
<strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>DC3000</strong> levansucrase <strong>Lsc3</strong>. Using sequence alignment of <strong>Lsc3</strong> and<br />
levansucrases from other Gram-negative bacteria, Asp62, Asp219 and Glu303 were predicted<br />
to form the catalytic triad. We performed site-directed mutagenesis of the lsc3 gene to<br />
substitute Asp62 and Glu303 residues in <strong>Lsc3</strong> protein with alanins and cloned the mutated<br />
lsc3 genes to pURI3 expression vector. Previously constructed mutant lsc3 genes (encoding<br />
substitutions Asp219Ala, Asp219Asn, Asp225Ala, Asp225Asn) were also cloned into pURI3<br />
vector. As a result of this study, several mutant levansucrases (Asp62Ala, Asp219Ala,<br />
Asp219Asn, Pro222Leu, Asp225Ala, Asp225Asn, Glu303Ala) were expressed in Escherichia<br />
coli and their properties were characterized. Mutation of Asp62, Asp219 and Glu303 virtually<br />
abolished catalytic activity of <strong>Lsc3</strong>. Substitution of Pro222 and Asp225 had no significant<br />
effect on catalytic properties of <strong>Lsc3</strong>.<br />
We conclude that Asp62, Asp219 and Glu303 are at key position in <strong>Lsc3</strong> protein of P.<br />
<strong>syringae</strong> pv. tomato and most probably comprise catalytic triad of the active site.<br />
35
KASUTATUD KIRJANDUS<br />
Andersone, I., Auzina, L., Vigants, A., Mutere, O. and Zikmanis, P. (2004). Formation of<br />
levan from raffinose by levansucrase of Zymomonas mobilis. Eng. Life Sci. 4: 56-59.<br />
Banguela, A., Hernandez, L. (2006). Fructans: from natural sources to transgenic plants.<br />
Biotech. Appl. 23: 202-210.<br />
Batista, F. R., Hernandez, L., Fernandez, J. R., Arrieta, J., Menendez, C., Gomez, R.,<br />
Tambara, Y. and Pons, T. (1999). Substitution of Asp-309 by Asn in the Arg-Asp-Pro (RDP)<br />
motif of Acetobacter diazotrophicus levansucrase affects sucrose hydrolysis, but not enzyme<br />
specificity. Biochem. J. 337: 503-506.<br />
Buell, C. R., Joardar, V., Lindeberg, M., Selengut, J., Paulsen, I. T. and Gwinn, M. L. (2003).<br />
The complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen <strong>Pseudomonas</strong><br />
<strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>DC3000</strong>. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 10181-10186.<br />
Cantarel, B. L., Coutinho, P. M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V. and Henrissat, B.<br />
(2009). The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): An expert resource for<br />
glycogenomics. Nucleic Acids Res 37: 233-238.<br />
Chuankhayan, P., Hsieh, C. Y., Huang, Y. C., Hsieh, Y. Y., Guan, H. H., Hsieh, Y. C., Tien,<br />
Y. C., Chen, C. D., Chiang, C. M. and Chen, C. J. (2010). Crystal structures of Aspergillus<br />
japonicus fructosyltransferase complex with donor/acceptor substrates reveal complete<br />
subsites in the active site for catalysis. J. Biol. Chem. 285: 23251-23264.<br />
Coutinho, P. M., Henrissat, B. (1999). Carbohydrate-active enzymes: an integrated database<br />
approach. Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, RSC, Cambridge, 3-12.<br />
Crittenden, R. G., Platne, M. J. (1996). Production, properties and applications of food-grade<br />
oligosaccharides. Trends Food Sci. Tech. 7: 353-361.<br />
Daguer. J. P., Geissmann, T., Petit-Glatron, M. F. and Chambert, R. (2004). Autogenous<br />
modulation of the Bacillus subtilis sacB-levB-yveA levansucrase operon by the levB transcipt.<br />
Microbiology 150: 3669-3679.<br />
De Roover, J., van Laere, A., De Winter, M., Timmermans, J. W. and van den Ende, W.<br />
(1999). Purification and properties of a second fructan exohydrolase from the roots of<br />
Cichorium intybus. Physiol. Plant. 106: 28-34.<br />
van den Ende, W., van Laere, A. (1996). De-novo synthesis of fructans from sucrose in vitro<br />
by a combination of two purified enzymes (sucrose:sucrose fructosyl transferase and<br />
fructan:fructan fructosyl transferase) from chicory roots (Cichorium intybus L.). Planta 200:<br />
335-342.<br />
Geier, G., Geider, K. (1993). Characterization and influence on virulence of the levansucrase<br />
gene from the fireblight pathogen Erwinia amylovora. Physiol. Mol. Plant Pathol. 42: 387-<br />
404.<br />
Geiser, M., Cebe, R., Drewello, D. and Schmitz, R. (2001). Integration of PCR fragments at<br />
any specific site within cloning vectors without the use of restriction enzymes and DNA<br />
ligase. Biotechnology 31: 88-90.<br />
Hernandez, L., Sotolongo, M., Rosabal, Y., Menendez, C., Ramirez, R., Caballero-Mellado, J.<br />
and Arrieta, J. (2000). Structural levansucrase gene (lsdA) constitutes a functional locus<br />
conserved in the species Glyconacetobacter diazotrophicus. Arch. Microbiol. 174: 120-124.<br />
Hettwer, U., Gross, M. and Rudolph, K. (1995). Purification and characterization of an<br />
extracellular levansucrase from <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. phaseolicola. J. Bacteriol. 177:<br />
2834-2839.<br />
Hettwer, U., Jaeckel, F. R., Boch, J., Meyer, M., Rudolph, K. and Ullrich, M. S. (1998).<br />
Cloning, nucleotic sequence, and expression in Escherichia coli of levansucrase genes from<br />
36
the plant phatogens <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. glycinea and P. <strong>syringae</strong> pv. phaseolicola.<br />
Appl. Env. Microbiol. 64: 3180-3187.<br />
van Hijum, S. A. F. T., Bonting, K., van der Maarel, M. J. E. C. and Dijkhuizen, L. (2001).<br />
Purification of a novel fructosyltransferase from Lactobacillus reuteri strain 121 and<br />
characterization of the levan produced. FEMS Microbiol. Lett. 205: 323-328.<br />
van Hijum, S. A. F. T., Kralj, S., Ozimek, L. K., Dijkhuizen, L. and van Geel-Schutten, I. G.<br />
H. (2006). Structure-function relationships of glucansucrase and fructansucrase enzymes from<br />
lactic acid bacteria. Mol. Biol. Rev. 70: 157-176.<br />
Kallas, E. (2010). IHF-i osalus <strong>Pseudomonas</strong> aeruginosa mobiilse elemendi ISPa20<br />
transpositsioonis. Magistritöö, Tartu Ülikool.<br />
Koshland, D. E., Stein, S. S. (1954). Correlation of bound breaking with enzyme specifity.<br />
Cleavage point of invertase. J. Biol. Chem. 208: 139-148.<br />
Lammens, W., Le Roy, K., Schroeven, L., van Laere, A., Rabijns, A. and van den Ende, W.<br />
(2009). Structural insights into glycoside hydrolase family 32 and 68 enzymes: functional<br />
implications. J. Exp. Bot. 60: 727-740.<br />
Lee, S. S., Yu, S. and Withers, S. G. (2003). Detailed dissection of a new mechanism for<br />
glycoside cleavage: alpha-1.4-glucan lyase. Biochemistry 42: 13081-13090.<br />
Li, H., Ullrich, M. S. (2001). Characterization and mutational analysis of three allelic lsc<br />
genes encoding levansucrase in <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong>. J. Bacteriol. 183: 3282-3292.<br />
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J. (1951). Protein measurement<br />
with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265.<br />
Mardo, K. (2011). <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>levaansukraasi</strong> <strong>Lsc3</strong> struktuuri<br />
modelleerimine ja mutantide iseloomustamine. Magistritöö, Tartu Ülikool.<br />
Martinez-Fleites, C., Ortiz-Lombardia, M., Pons, T., Tarbouriech, N., Taylor, E. J., Arrieta, J.<br />
G., Hernandez, L. and Davies, G. J. (2005). Crystal structure of levansucrase from the<br />
Gramnegative bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus. Biochem. J. 390: 19-27.<br />
Meng, G., Fütterer, K. (2003). Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis<br />
levansucrase. Nature Struct. Biol. 10: 935-941.<br />
Meng, G., Fütterer, K. (2008). Donor substrate recognition in the raffinose-bound E342A<br />
mutant of fructosyltransferase Bacillus subtilis levansucrase. BMC Struct. Biol. 8, 1-12.<br />
Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.<br />
Anal. Chem. 31: 426-428.<br />
Miller, J. H. (1972). Eksperiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbour Laboratory,<br />
Cold Spring Harbour, NY.<br />
Nagem, R. A. P., Rojas, A. L., Golubev, A. M., Korneeva, O. S., Eneyskaya, E. V.,<br />
Kulminskaya, A. A., Neustroev, K. N. and Polikarpov, I. (2004). Crystal structure of exoinulinase<br />
from Aspergillus awamori: the enzyme fold and structural determinants of substrate<br />
recognition. J. Of Molec. Biol. 344: 471-480.<br />
Naumoff, D. G. (2001). Beta-fructosidase superfamily: homology with some alpha-Larabinases<br />
and beta-D-xylosidases. Protein. Struct. Function Genet. 42: 66-76.<br />
Ozimek, L. K., Euverink, G. J. W., van der Maarel, M. E. C. and Dijkhuizen, L. (2005).<br />
Mutational analysis of the role of calcium ions in the Lactobacillus reuteri strain 121<br />
fructosyltransferase (levansucrase and inulosucrase) enzymes. FEBS Lett. 579: 1124-1128.<br />
Ozimek, L. K., van Hijum, S. A. F. T., van Koningsveld, G. A., van der Maarel, M. J. E. C.,<br />
van Geel-Schutten, G. H. and Dijkhuizen, L. (2004). Site-directed mutagenesis study of the<br />
three catalytic residues of the fructosyltransferases of Lactobacillus reuteri 121. FEBS Lett.<br />
560: 131-133.<br />
37
Ozimek, L. K., Kralj, S., van der Maarel, M. E. C. And Dijkhuizen, L. (2006). The<br />
levansucrase and inulosucrase enzymes of Lactobacillus reuteri 121 catalyse processive and<br />
non-processive transglycosylation reactions. Microbiology 152: 1187-1196.<br />
Pons, T., Hernandez, L., Batista, F. R. and Chinea, G. (2000). Prediction of a common<br />
betapropeller catalytic domain for fructosyltransferases of different origin and substrate<br />
specifity. Protein Sci. 9: 2285-2291.<br />
van Riet, L., Altenbach, D., Vergauwen, R., Clerens, S., Kawakami, A., Yoshida, M., van den<br />
Ende, W., Wiemken, A. and van Laere, A. (2008). Purification, cloning and functional<br />
differences of a third fructan 1-exohydrolase (1-FEHw3) from wheat (Triticum aestivum).<br />
Physiol. Plant. 133: 242-253.<br />
Rivas, de las B., Curiel, J. A., Mancheno, J. M. and Munos, R. (2007). Expression vectors for<br />
enzyme restriction- and ligation-independent cloning for producing recombinant His-fusion<br />
proteins. Biotechnol. Prog. 23: 680-686.<br />
Roberfroid, M., Slavin, J. (2000). Nondigestible oligosaccharides. Crit. Rev. Food Sci. Nutr.<br />
40: 461-480.<br />
Sambrook, J., Fritsch, E. T. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual,<br />
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.<br />
Sangiliyandi, G., Ray, K. C. and Gunasekaran, P. (1999). Elevated temperature and chemical<br />
modification selectively abolishes levan forming activity of levansucrase of Zymomonas<br />
mobilis. Biotechnol. Lett. 21: 179-182.<br />
Schroeder, V. A., Michalek, S. M. and Macrina, F. L. (1989). Biochemical characterization<br />
and evaluation of virulence of a fructosyltransferase-deficient mutant of Streptococcus mutans<br />
V403. Infect Immun 57: 3560-3569.<br />
Schägger, H. (2006). Tricin-SDS-PAGE. Nat. Protocols 1: 16-22.<br />
Sharma, R. C., Schimke, R. T. (1996). Preparation of electrocompetent E. coli using salt-free<br />
growth medium. Biotechniques 20: 42-44.<br />
Song, K. B., Rhee, S. K. (1994). Enzymatic synthesis of levan by Zymomonas mobilis<br />
levansucrase overexpressed in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 16: 1305-1310.<br />
St. John, J. A., Bonnett, G. D. and Simpson, R. J. (1996). A method for rapid quantification of<br />
sucrose and fructan oligosaccharides suitable for enzyme and physiological studies. New<br />
Phytol. 134: 197-203.<br />
Studier, F. W., Moffatt, B. A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct<br />
selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189: 113-130.<br />
Tajima, K., Tanio, T., Kobayashi, Y., Kohno, H., Fujiwara, M., Shiba, T., Erata, T.,<br />
Munekata, M. and Takai, M. (2000). Cloning and sequencing of the levansucrase gene from<br />
Acetobacter xylinum NCI 1005. DNA Res. 7: 237-242.<br />
Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the<br />
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific<br />
gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680.<br />
Tiirik, K. (2010). Levaansukraasi katalüüsis osalevate aminohapete kindlakstegemine Asp219<br />
ja Asp225 muteerimisega. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool.<br />
Toomemaa, R. (2007). <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>levaansukraasi</strong>de omaduste<br />
uurimine. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool.<br />
Velazquez-Hernandez, M. L., Baizabal-Aguirre, V. M., Bravo-Patiño, A., Cajero-Juarez, M.,<br />
Chavez-Moctezuma, M. P. and Valdez-Alarcon, J. J. (2008). Microbial fructosyltransferases<br />
and the role of fructans. J. Appl. Microbiol. 106: 1763-1778.<br />
38
Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi geenide ekspresseerimine E. coli’s ja valkude omaduste<br />
uurimine. Magistritöö, Tartu Ülikool.<br />
Visnapuu, T., Mäe, A. and Alamäe, T. (2008). Hansenula polymorpha maltase gene promoter<br />
with sigma 70-like elements is feasible for Escherichia coli-based biotechnological<br />
applications: Expression of three genomic levansucrase genes of <strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv.<br />
tomato. Process Biochem. 43: 414-422.<br />
Visnapuu, T., Zamfir, A. D., Mosoarca, C., Stanescu, M. D. and Alamäe, T. (2009). Fully<br />
automated chip-based negative mode nanoelectrospray mass spectrometry of<br />
fructooligosaccharides produced by heterologously expressed levansucrase from<br />
<strong>Pseudomonas</strong> <strong>syringae</strong> pv. tomato <strong>DC3000</strong>. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23: 1337-<br />
1346.<br />
Vuong, T. V., Wilson, D. B. (2010). Glycoside hydrolases: Catalytic base/nucleophile<br />
diversity. Biotechnol. Bioeng. 107: 195-205.<br />
Wei, D., Li, M., Zhang, X. and Xing, L. (2004). An improvement of the site-directed<br />
mutagenesis method by combination of megaprimer, one-side PCR and Dpn I treatment.<br />
Anal. Biochem. 331: 401-403.<br />
Yanase, H., Maeda, M., Hagiwara, E., Yagi, H., Taniguchi, K. and Okamoto, K. (2002).<br />
Identification of functionally important amino acid residues in Zymomonas mobilis<br />
levansucrase. J. Biochem. 132: 565-572.<br />
KASUTATUD VEEBIAADRESSID<br />
http://www.cazy.org<br />
http://expasy.org/tools/pi_tool.html<br />
39
LISA 1<br />
Töös konstrueeritud mutantseid lsc3 geene sisaldavad vektorid pURI3-lsc3D62A ja pURI3-<br />
lsc3E303A. Tähistatud on T7 promootor ja avatud lugemisraamid ning kasutatud praimerite<br />
seondumispositsioonid. Alla on joonitud megapraimeri sünteesiks kasutatud praimerid.<br />
His 6 -järjestus<br />
T7 promootor<br />
His 6 -järjestus<br />
T7 promootor<br />
40
LISA 2<br />
Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga puhastatud mutantsete <strong>Lsc3</strong> valkude P222L, D225A ja D225N<br />
puhastamise etappidest võetud proovid ning nende analüüs denatureerival<br />
polüakrüülamiidgeelil (SDS-PAGE). Rekombinantest rakuekstrakti kanti rajale 10 µg ja 5 µl<br />
proovi igast pesu- ja 1 µl elueerimise etapist. M – valgu suurusmarker PageRuler TM SM0671<br />
(Fermentas).<br />
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.<br />
<strong>Lsc3</strong> P222L valgu puhastuse etappide<br />
kontrollimine SDS-geelil. Rajad: 1. rakulüsaat;<br />
2-5. Ni +2 -maatriksi pesud<br />
sonikeerimispuhvriga; 6-8. <strong>levaansukraasi</strong><br />
elueerimine; 9. puhastatud muteerimata <strong>Lsc3</strong><br />
valk.<br />
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.<br />
<strong>Lsc3</strong> D225A valgu puhastuse etappide<br />
kontrollimine SDS-geelil. Rajad: 1. rakulüsaat;<br />
2-5. Ni +2 -maatriksi pesud sonikeerimispuhvriga;<br />
6-8. <strong>levaansukraasi</strong> elueerimine; 9. puhastatud<br />
muteerimata <strong>Lsc3</strong> valk.<br />
M 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.<br />
<strong>Lsc3</strong> D225N valgu puhastuse etappide<br />
kontrollimine SDS-geelil. Rajad: 1. puhastatud<br />
muteerimata <strong>Lsc3</strong> valk; 2-5. Ni +2 -maatriksi<br />
pesud sonikeerimispuhvriga; 6-8.<br />
<strong>levaansukraasi</strong> elueerimine; 9. rakulüsaat.<br />
41
LISA 3<br />
Puhastatud <strong>Lsc3</strong> P222L, <strong>Lsc3</strong> D225A ja <strong>Lsc3</strong> D225N ensüümide Michaelis-Menteni (esitatud<br />
suurelt) ja Eadie-Hofstee (esitatud väiksemalt) tüüpi graafikud, mis on saadud programmiga<br />
SigmaPlot 2001. Mustad punktid (●) tähistavad erinevatel sahharoosi kontsentratsioonidel<br />
ilma rafinoosita määratud <strong>levaansukraasi</strong> reaktsioonikiirusi ning seest tühjad punktid (○) koos<br />
100 mM rafinoosiga määratud reaktsioonikiirusi. Toodud on ka vastavate andmete põhjal<br />
arvutatud V max , K m ja K i .<br />
42