Semliki Forest viiruse ja Sindbis viiruse mittestruktuurse valgu nsP2 ...
Semliki Forest viiruse ja Sindbis viiruse mittestruktuurse valgu nsP2 ...
Semliki Forest viiruse ja Sindbis viiruse mittestruktuurse valgu nsP2 ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
TARTU ÜLIKOOL<br />
LOODUS-TEHNOLOOGIATEADUSKOND<br />
MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT<br />
Marina Šunina<br />
<strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> <strong>viiruse</strong> <strong>ja</strong> <strong>Sindbis</strong> <strong>viiruse</strong> <strong>mittestruktuurse</strong> <strong>valgu</strong> <strong>nsP2</strong><br />
mõju superinfektsioonile<br />
Magistritöö<br />
Juhenda<strong>ja</strong>: Valeria Lulla, Ph.D<br />
Kaasjuhenda<strong>ja</strong>: Andres Merits, Ph.D<br />
TARTU 2009
SISUKORD<br />
SISUKORD......................................................................................................................2<br />
KASUTATUD LÜHENDID ...........................................................................................4<br />
SISSEJUHATUS .............................................................................................................5<br />
KIRJANDUSE ÜLEVAADE .........................................................................................6<br />
ALFAVIIRUSTE ÜLDISELOOMUSTUS ................................................................................6<br />
SEMLIKI FOREST VIIRUSE JA SINDBIS VIIRUSE ÜLDINE ISELOOMUSTUS ..........................6<br />
ENNETAMINE JA RAVIMINE.............................................................................................7<br />
ALFAVIIRUSTE VIRION....................................................................................................8<br />
ALFAVIIRUSTE GENOOMNE ORGANISATSIOON................................................................8<br />
ALFAVIIRUSTE INFEKTSIOONITSÜKKEL ..........................................................................9<br />
ALFAVIIRUSTE STRUKTUURSED VALGUD......................................................................11<br />
ALFAVIIRUSTE MITTESTRUKTUURSED VALGUD............................................................13<br />
ALFAVIIRUSTE INFEKTSIOONI MÕJU SELGROOGSETE RAKKUDELE................................16<br />
SUPERINFEKTSIOONI VÄLTIMINE ..................................................................................16<br />
EKSPERIMENTAALNE OSA....................................................................................17<br />
UURIMUSTÖÖ EESMÄRGID..................................................................................17<br />
MATERJALID JA MEETODID.................................................................................18<br />
Kasutatud rakuliinid <strong>ja</strong> söötmed .............................................................................18<br />
Kasutatud plasmiidid ..............................................................................................18<br />
Kasutatud <strong>viiruse</strong>d ..................................................................................................19<br />
Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga elektroporatsiooni meetodil .............20<br />
Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga lipofektsiooni meetodil .....................20<br />
Viirus-stokkide kogumine <strong>viiruse</strong> tiitrimiseks .........................................................21<br />
Viirusega nakatamine <strong>ja</strong> titreerimine lüüsilaikude meetodil ..................................21<br />
Lutsiferaasi ekspressiooni kvantifitseerimine .........................................................22<br />
Valkude ekspressiooni määramine Western blot meetodil......................................22<br />
Rakkude sorteerimine läbivoolu tsütofluorimeetriga..............................................23<br />
2
Rakuliinide loomine <strong>nsP2</strong>-indutseeritavaks ekspressiooniks..................................23<br />
TÖÖ TULEMUSED....................................................................................................25<br />
1. Superinfektsiooni vältimise näidiseksperiment.............................................25<br />
2. Katsed RDR mutatsiooni sisaldavat <strong>nsP2</strong> proteaasi ekspresseerivate<br />
rakkudega ...............................................................................................................26<br />
3. Katsed rakkudega, milles on võimalik indutseerida <strong>nsP2</strong>-valku<br />
ekspressiooni. .........................................................................................................29<br />
4. NsP2 mõju uurimine alfaviiruste infektsioonile T7 BHK rakke <strong>ja</strong><br />
lutsiferaasi ekspresseerivaid <strong>viiruse</strong>id kasutades..................................................34<br />
ARUTELU ..................................................................................................................40<br />
KOKKUVÕTE ..............................................................................................................46<br />
SUMMARY ...................................................................................................................48<br />
LISA ...............................................................................................................................50<br />
KASUTATUD KIRJANDUS .......................................................................................52<br />
3
KASUTATUD LÜHENDID<br />
aa – aminohape (amino acid)<br />
BHK-21 – hamstri neerurakuliin nr 21 (baby hamster kidney cells, nr 21)<br />
cDNA – komplementaarne DNA (complementary DNA)<br />
CMC – karboksümetüültselluloos (carboxymethylcellulose)<br />
CP – kapsiidi valk (capsid protein)<br />
FACS – läbivoolu tsütofluorimeeter e. rakusorter (fluorescence activated cell sorter)<br />
FCS – veise loote seerum (fetal calf serum)<br />
GFP – roheliselt helenduv valk (green fluorescent protein)<br />
GMEM – Glasgow Modified Eagle’s Medium<br />
h – tund (hour)<br />
IF – immuunofluorestsents (immunofluorescence)<br />
kb – kiloalus (kilobase)<br />
kDa – kilodalton (kilodalton)<br />
m.o.i. – infektsiooni kordsus (multiplicity of infection)<br />
NLS – tuuma lokalisatsiooni signaal (nuclear localization signal)<br />
ns – mittestruktuurne (nonstructural)<br />
nsP – mittestruktuurne valk (nonstructural protein)<br />
nt – nukleotiid (nucleotide)<br />
PBS – fosfaatpuhvriga sooladelahus (phosphate buffered saline)<br />
PFU – lüüsilaiku moodustav ühik (plaque forming unit)<br />
RC – replikatsiooni kompleks (replication complex)<br />
RLU – suhteline lutsiferaasi ühik (relative luciferase unit)<br />
SDS – naatriumdodetsüülsulfaat (sodium dodecyl sulfate)<br />
SFV – <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> viirus (<strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus)<br />
SINV – <strong>Sindbis</strong> viirus (<strong>Sindbis</strong> virus)<br />
TRE – tetratsükliinile reageeriv element (tetracycline-response element)<br />
wt – metsik-tüüpi (wild type)<br />
4
SISSEJUHATUS<br />
Alfaviiruste bioloogiline mitmekesisus on ülimalt lai, nad parasiteerivad<br />
kalades, lindudes, koduloomades <strong>ja</strong> inimestes. Üheks põh<strong>ja</strong>likumalt uuritud<br />
mudelviirusteks on alfaviiruste hulka kuuluvad <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus (SFV) <strong>ja</strong> <strong>Sindbis</strong><br />
viirus (SINV). Need on suhteliselt lihtsad <strong>ja</strong> väikesed positiivse polaarsusega RNAgenoomsed<br />
<strong>viiruse</strong>d, mille elutsüklis vahelduvad selgrootutes putukavektoris ning<br />
selgroogses peremehes toimuvad infektsioonid. Tänu sellele, et need <strong>viiruse</strong>d on<br />
koekultuuris kergelt kultiveeritavad, kasutatakse neid tihti meditsiinilistes <strong>ja</strong><br />
teadusuuringutes.<br />
Alfaviiruste genoom kodeerib kahte tüüpi valke: struktuurseid <strong>ja</strong><br />
<strong>mittestruktuurse</strong>id. Struktuurseid valke va<strong>ja</strong>b viirus uute virionide moodustamiseks,<br />
<strong>mittestruktuurse</strong>id aga <strong>viiruse</strong> genoomi replitseerimiseks <strong>ja</strong> transkribeerimiseks.<br />
Käesoleva magistritöö uurimusobjektiks oli mittestruktuurne valk kaks (<strong>nsP2</strong>), mida<br />
peetakse seotuna ka superinfektsiooni vältimise mehhanismiga.<br />
Käesoleva uurimustöö teoreetiline osa annab lühida ülevaate alfaviiruste grupist<br />
ning <strong>Semliki</strong> <strong>ja</strong> <strong>Sindbis</strong> viiruste päritolust. Pikemalt kirjeldatakse nende viiruste virioni<br />
ehitust, genoomi struktuuri <strong>ja</strong> <strong>viiruse</strong> infektsioonitsüklit. Kuna käesoleva töö eesmärgiks<br />
oli selgitada <strong>nsP2</strong> proteaasi osalust superinfektsiooni vältimise nähtuses, siis on<br />
teoreetilises osas lühike ülevaade ka superinfektsiooni vältimise mehhanismist.<br />
Eksperimentaalses osas kirjeldatakse töö eesmärgi saavutamiseks teostatuid<br />
eksperimente ning katsete teostamisel tekkinuid raskusi. On kirjeldatud erinevad<br />
strateegiad, mis kasutati nende raskuste lahendamiseks ning töö tulemusel leitud<br />
sõltuvused.<br />
Töö on valminud Tartu Ülikooli Molekulaar- <strong>ja</strong> rakubioloogia instituudis<br />
mikrobioloogia <strong>ja</strong> viroloogia õppetooli juures. Sooviksin tänada Valeria Lullat <strong>ja</strong><br />
professor Andres Meritsat juhendamise <strong>ja</strong> kannatlikkuse eest. Samuti tänan Eva<br />
Žusinaitet, Aleksei Lullat <strong>ja</strong> Oksana Šarovat abi <strong>ja</strong> kasulike nõuannete eest.<br />
5
KIRJANDUSE ÜLEVAADE<br />
Alfaviiruste üldiseloomustus<br />
Alfa<strong>viiruse</strong>d on positiivse polaarsusega RNA genoomsed membraaniga <strong>viiruse</strong>d.<br />
Perekond Alphavirus kulub Togaviridae sugukonda ning sisaldab praegusel a<strong>ja</strong>l 28<br />
viiruste liiki; perekonna esinda<strong>ja</strong>id on leitud kõikidelt kontinentidelt ning paljudelt<br />
saartelt. Alfaviiruste elutsüklis vahelduvad selgrootus (putukvektoris) ning selgroogses<br />
peremehes toimuvad infektsioonid. Paljude alfaviiruste puhul on putukvektoriteks<br />
sääsed <strong>ja</strong> moskiitod. Selgroogseks peremeheks on reeglina kas imeta<strong>ja</strong>d või linnud, veealfaviiruste<br />
<strong>ja</strong>oks on aga peremeesteks kalad. Inimestele <strong>ja</strong> koduloomadele patogeensed<br />
alfa<strong>viiruse</strong>d <strong>ja</strong>otuvad põhjustatava haiguspildi järgi kahte gruppi: need, mis põhjustavad<br />
lööve <strong>ja</strong> liigesepõletikuga kulgevat haigust (selliseid <strong>viiruse</strong>id on algselt leitud Vana<br />
Maailma riikidest), ning need, mis põhjustavad entsefaliiti (seda tüüpi <strong>viiruse</strong>id on<br />
algselt leitud Uue Maailma riikidest) (Griffin, 2006). Käesolevas magistritöös olid<br />
uuritavateks objektideks Vana Maailma alfaviiruste hulka kuuluvad <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong><br />
viirus (SFV) <strong>ja</strong> <strong>Sindbis</strong> viirus (SINV).<br />
<strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> <strong>viiruse</strong> <strong>ja</strong> <strong>Sindbis</strong> <strong>viiruse</strong> üldine iseloomustus<br />
Esmakordselt isoleeriti SFV 1942 aastal Aedes abnormalis’est, mida kor<strong>ja</strong>ti<br />
<strong>Semliki</strong> metsast Ida-Ugandas (Smithburn and Haddow, 1944). Hiljem selgus, et see<br />
viirus on laialt levinud kogu Aafrikas ning selle isoleerimine moskiitodest (näiteks<br />
Aedes africanus, Aedes argenteopunctatus) on dokumenteeritud Mozambiigis,<br />
Nigeerias <strong>ja</strong> Kesk-Aafrika Vabariigis (Griffin, 2006, <strong>ja</strong> viited selles). SFV võib<br />
põhjustada entsefaliidi hobustel, hiirtel, rottidel, hamstritel, küülikutel ning meresigadel.<br />
Põhjustatud haiguse raskus <strong>ja</strong> selle tüüp sõltub (a) looma vanusest infektsiooni a<strong>ja</strong>l, (b)<br />
inokulatsiooni kohast ning (c) infektsiooniks kasutatud SFV tüve virulentsusest (Griffin,<br />
2006, <strong>ja</strong> viited selles). Tänu laiale katseloomade ringile ning sellele, et ta on inimeste<br />
<strong>ja</strong>oks suhteliselt ohutu, on SFV üks praegusel a<strong>ja</strong>l enim uuritavaid alfa<strong>viiruse</strong>id.<br />
6
SINV isoleeriti esmakordselt 1952 aastal Culex univittatus’est, mida kor<strong>ja</strong>ti<br />
<strong>Sindbis</strong>e juures Egiptis (Taylor et al., 1955). Järgmise 25 aasta vältel on seda viirust<br />
leitud Euroopas, Kesk-Idamaades, Aafrikas, Indias, Aasias, Austraalias <strong>ja</strong> Filipiini<br />
saartel erinevates sääse- <strong>ja</strong> selgroogsete liikides (Griffin, 2006). Selle alusel võib väita<br />
et SINV on inimestel liigesepõletikku põhjustavate alfaviiruste hulgast kõige laiemalt<br />
levinud (Griffin, 2006). Viirus tsirkuleerib põhiliselt Culex spp. <strong>ja</strong> Culiseta spp.<br />
sääseliikide ning metslindude vahel (Mackenzie et al., 1994), kuid võib nakatada väga<br />
paljusid erinevaid selgroogsete liike. Sarnaselt SFV-ga uuritakse teda intensiivselt<br />
hiirtel <strong>ja</strong> rottidel entsefalomüeliiti tekitava mudel<strong>viiruse</strong>na.<br />
Ennetamine <strong>ja</strong> ravimine<br />
Alfaviiruste poolt esilekutsuvate haiguste ravimiseks puuduvad tänapäeval<br />
spetsiifilised <strong>viiruse</strong>vastased ravimid. Ohtlike alphaviirustega nakatumise puhul tehakse<br />
kas toetavat ravi (selleks, et vältida entsefaliidiga kaasnevat kooma-seisundit), või siis<br />
sümptomaatilist ravimist (nt. liigesepõletikku puhul kasutatakse selleks<br />
põletikuvastased ained). SINV puhul on olemas ka formaliiniga inaktiveeritud vaktsiin<br />
hobuste <strong>ja</strong>oks (Griffin, 2006). Siiski on kõige efektiivsemad viisid selliste viirustega<br />
võitlemiseks kas piirata sääskede/moskiitode paljunemist, või siis mõjuda <strong>viiruse</strong><br />
paljunemist ülekandevektorites <strong>ja</strong> takistada sellisel viisil vektorlevikut. Käesoleva<br />
magistritöö eksperimentaalse osa katsed on suunatud pikemas perspektiivis just sellise,<br />
ülekandevektorite puhul rakendatava ravimi või ravimeetodi potentsiaalse<br />
toimemehhanismi otsingule <strong>ja</strong> kirjeldamisele. Sarnane lähenemine võib olla oluline ka<br />
muude putuklevikuliste viiruste leviku tõkestamisel sest just sellised <strong>viiruse</strong>d kujutavad<br />
(nt. seoses kliima soojenemise <strong>ja</strong> vektorputukate laiema levikuga) suurt probleemi<br />
tuleviku tervishoiule.<br />
7
Alfaviiruste virion<br />
Joonis 1. Alfaviiruste virioni skeem. Viiruse<br />
genoom on pakitud nukleokapsiidi (joonisel sinine).<br />
Kapsiid on omakorda kaetud raku membraanist pärineva<br />
ümbrisega (joonisel oranž). Membraanis painkevad<br />
<strong>viiruse</strong> glükoproteiinid on tähistatud heleroheliselt<br />
(Strauss and Strauss, 1994).<br />
Alfaviiruste virion on ümbrisega partikkel, mille diameeter on umbes 70 nm ning<br />
mille sees asub 40 nm diameetriga nukleokapsiid. Nii <strong>viiruse</strong> nukleokapsiid kui ka<br />
ümbris omavad ikosaeedrilist sümmeetriat. Nukleokapsiid sisaldab <strong>viiruse</strong> üheahelalist<br />
positiivse polaarsusega genoomset RNA-d, mis on ümbritsetud heksameerideks <strong>ja</strong><br />
pentameerideks organiseeritud kapsiidi <strong>valgu</strong>ga (240 CP koopiat virioni kohta).<br />
Nukleokapsiid ise on ümbritsetud lipiidse kaksikkihiga, mis on pärit peremeesraku<br />
membraanist. Ümbris sisaldab ka <strong>viiruse</strong> poolt kodeeritud glükoproteiine E1 <strong>ja</strong> E2, mis<br />
moodustuvad omavahel heterodimeere (joonis 1) (Strauss and Strauss, 1994, <strong>ja</strong> viited<br />
selles).<br />
Alfaviiruste genoomne organisatsioon<br />
Alfaviiruste genoomi struktuuri (SFV näitel) on kujutatud skemaatiliselt joonisel<br />
2. SFV genoomi üldpikkus on 11,4 kb, SINV genoom on 11,7 kb pikkune. Kõikide<br />
alfaviiruste genoomi võib <strong>ja</strong>gada kahte suure regiooni: mittestruktuurne regioon, mis<br />
kodeerib <strong>mittestruktuurse</strong>id (replikaasi) valke <strong>ja</strong> hõlmab kaks kolmandikku RNA<br />
genoomist; ning struktuurne regioon, mis kodeerib <strong>viiruse</strong> struktuurseid valke ning<br />
hõlmab genoomi 3’-otsa poolse kolmandiku. Mittestruktuurseid valke transleeritakse<br />
otse genoomselt RNA-lt ühe (SFV) või kahe (SINV) polüproteiinina, mis lõigatakse<br />
8
hiljem individuaalseteks valkudeks. Nii polüproteiinid kui ka valmis lõigatud <strong>valgu</strong>d<br />
mängivad olulist rolli <strong>viiruse</strong> replikatsioonis <strong>ja</strong> selle regulatsioonis. Ka struktuurne<br />
regioon ekspresseerub polüproteiini kujul, selle translatsioonil kasutatakse matriitsina<br />
subgenoomset n.n. 26S mRNA-d. Struktuurse polüproteiini lõikamise tagajärjel<br />
moodustuvad kapsiidi valk, ümbrise <strong>valgu</strong>d ning kaks väikest polüpeptiidi E3 <strong>ja</strong> 6K.<br />
Mittestruktuurse regiooni 3’-terminaalne regioon sisaldab sisemist promooterit<br />
subgenoomse RNA transkriptsiooniks, genoomi 5’ <strong>ja</strong> 3’-otsa mittetransleerivad alad<br />
sisaldavad RNA replikatsiooni <strong>ja</strong>oks va<strong>ja</strong>likke signaale (Strauss and Strauss, 1994).<br />
Joonis 2. <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> <strong>viiruse</strong> genoom <strong>ja</strong> sellelt toimuv <strong>viiruse</strong> valkude ekspressioon<br />
(joonise päritolu: Lulla, 2007).<br />
Alfaviiruste infektsioonitsükkel<br />
Alfaviiruste infektsioonitsükkel on toodud joonisel 3. Alfa<strong>viiruse</strong>d replitseeruvad<br />
nii lüli<strong>ja</strong>lgsete kui ka selgroogsete rakkudes, kusjuures lüli<strong>ja</strong>lgsete rakkudes toimuv<br />
infektsioon on persistentne, selgroogsete rekkudes aga lühia<strong>ja</strong>line, äge ning tavaliselt<br />
raku surmaga lõppev. Arvatavasti toimub see nii erinevate replikatsiooni strateegiate<br />
9
kasutamise pärast erinevates rakutüüpides <strong>ja</strong>/või erinevate rakuliste kaitsemehhanismide<br />
toime tõttu (Strauss and Strauss, 1994, <strong>ja</strong> viited selles).<br />
Alfa<strong>viiruse</strong>d sisenevad rakku retseptor-vahendatud endotsütoosi teel klatriiniga<br />
kaetud vesiikulite abil, <strong>viiruse</strong> <strong>ja</strong> endosoomide membraanide liitumine nõuab madala<br />
pH olemasolu endosoomides (Helenius et al., 1980, Marsh and Helenius, 1989). Virioni<br />
ümbrise <strong>ja</strong> endosoomi membraani liitumise ning sellele järgneva nukleokapsiidi <strong>ja</strong><br />
ribosoomi interaktsioonide tulemusena vabaneb <strong>viiruse</strong> nukleokapsiidis sisalduv RNA<br />
genoom tsütoplasmasse. Viiruse genoom käitub rakus kui mRNA ning temalt<br />
sünteesitakse <strong>viiruse</strong> <strong>mittestruktuurse</strong>d <strong>valgu</strong>d. Kõigepealt sünteesitakse P1234<br />
polüproteiin, mis lõigatakse autokatalüütiliselt P123 polüproteiiniks ning nsP4 <strong>valgu</strong>ks.<br />
Selline P123 + nsP4 kompleks käitub varase RNA polümeraasina, mis on va<strong>ja</strong>lik <strong>viiruse</strong><br />
genoomile vastava negatiivse RNA ahela sünteesiks (Kääriäinen and Ahola, 2002, <strong>ja</strong><br />
viited selles). Selgroogsete rakkudes toimub negatiivse RNA ahela süntees ainult<br />
infektsiooni vara<strong>ja</strong>ses staadiumis (4-6 tunni peale nakatamist). Pärast seda toimub<br />
äkiline negatiivse RNA ahela sünteesi väl<strong>ja</strong>lülitamine ning rakkus hakatakse tootma<br />
ainult positiivse polaarsusega <strong>viiruse</strong> RNA-sid (Sawicki et al., 1981). Uute positiivse<br />
polaarsusega genoomsete 42S RNA-de (genoomide) <strong>ja</strong> 26S RNA-de sünteesi<br />
alustamiseks on va<strong>ja</strong> lõigata P123 polüproteiin nsP1, <strong>nsP2</strong> <strong>ja</strong> nsP3 valkudeks;<br />
matriitsina kasutab sellisel viisil ümberkorraldatud replikaaskompleks negatiivse<br />
polaarsusega RNA ahelat (Kääriäinen and Ahola, 2002, <strong>ja</strong> viited selles).<br />
26S RNA translatsiooni tulemusena moodustuvad <strong>viiruse</strong> struktuursed <strong>valgu</strong>d ning<br />
42S RNA, mis sisaldab pakkimissignaali, pakitakse uutesse nukleokapsiididesse<br />
(Melancon and Garoff, 1987). Uue põlvkonna <strong>viiruse</strong>d vabanevad rakkudest pungudes<br />
kas plasmamembraanist (selgroogsete rakkudes) või rakusisestest membraanidest<br />
(selgrootute rakkudes).<br />
10
Joonis 3. Alfaviiruste infektsioonitsükkel. RC tähendab replikatsiooni kompleksi<br />
(replication complex). Vara<strong>ja</strong>ne replikatsiooni kompleks (RCmiinus) sisaldab P123<br />
polüproteiini <strong>ja</strong> nsP4 valku ning vastutab negatiivse polaarsusega RNA sünteesi eest. Hiline<br />
replikatsiooni kompleks (RCpluss) sisaldab nsP1, <strong>nsP2</strong>, nsP3 <strong>ja</strong> nsP4 valke ning vastutab<br />
positiivse polaarsusega RNAde sünteesi eest (joonise päritolu: Lulla, 2007).<br />
Alfaviiruste struktuursed <strong>valgu</strong>d<br />
Alfaviiruste struktuursed <strong>valgu</strong>d transleeritakse polüproteiini kujul 26S mRNA<br />
maatritsil. Sünteesitud polüproteiin lõigatakse ko- <strong>ja</strong> posttranslatsiooniliselt valmis<br />
struktuurseteks valkudeks. Kapsiidi valk (CP – capsid protein) asub polüproteiini N-<br />
11
terminaalses otsas <strong>ja</strong> omab seriin-proteaasset aktiivsust mis töötab in cis, vabastades<br />
värskelt sünteesitud CP polüproteiini küljest. CP omab kaks erinevat domeeni: N-<br />
terminaalne domeen ei ole erinevate alfaviiruste vahel konserveeritud, ta on lüsiini- <strong>ja</strong><br />
arginiinirikkas ning tänu oma tugevale positiivsele laengule seob elektrostaatiliselt<br />
<strong>viiruse</strong> RNA-d. See seondumine on va<strong>ja</strong>lik nukleokapsiidi formeerumise alustamisel<br />
ning RNA vabanemise stimuleerimisel <strong>viiruse</strong> sisenemisel rakku. Viimane on võimalik<br />
kuna CP seondub spetsiifiliselt ka ribosoomi suure subühikuga <strong>ja</strong> see seondamine<br />
algatab partikli lahtipakkimise. CP C-terminaalne domeen on vastupidiselt kõrgelt<br />
konserveeritud. See domeen omab proteinaasset aktiivsust <strong>ja</strong> ka osaleb valk-valk<br />
interaktsioonides nii nukleokapsiidi moodustamisel kui ka interaktsioonides<br />
glükoproteiinidega, mis on va<strong>ja</strong>likud virioni valmimiseks <strong>ja</strong> väljumisel rakust keskonda<br />
(Strauss and Strauss, 1994, <strong>ja</strong> viited selles, Hong et al., 2006).<br />
Kui CP vabaneb polüproteiini ahelast, pal<strong>ja</strong>stub järelejäänud polüproteiini N-<br />
terminaalses otsas asuv signaaljärjestus, mis viib polüproteiini allesjääva osa, milles<br />
sisalduvad E1, E2, E3 glükoproteiinidele <strong>ja</strong> 6K <strong>valgu</strong>le vastavad järjestused,<br />
endoplasmaatilisse retiikulumisse, kus seda edasi protsessitakse <strong>ja</strong> modifitseeritakse.<br />
Esimestena vabanevad ühise eel<strong>valgu</strong> p62 kujul E3 <strong>ja</strong> E2, selle <strong>valgu</strong> glükosüleerimine<br />
toimub kotranslatsiooniliselt (Garoff et al., 1978, Pesonen and Kääriäinen, 1982). E1<br />
valk on seotud hüdrofoobse 6K <strong>valgu</strong>ga, mille N-terminaalne ots käitub signaalina<br />
rakulistele signaalpeptidaasidele. Nad lõikavad sidet p62 <strong>ja</strong> 6K ning 6K <strong>ja</strong> E1 vahel. E1<br />
<strong>ja</strong> p62 moodustavad heterodimeerid ning neid transporditakse Golgi kompleksi kaudu<br />
plasmamembraanile. Transpordi käigus lõigatakse p62 E3 <strong>ja</strong> E2 valkudeks trans-Golgi<br />
tsisternides sisalduva proteaasi abil (Melancon and Garoff, 1986, Garoff et al., 1990,<br />
Liljeström and Garoff, 1991).<br />
Hüdrofoobse 6K <strong>valgu</strong> ülesanned virionide valmimisel pole täpselt teada. On<br />
näidatud, et see valk on membraanidega seotud ning seda modifitseeritakse kovalentselt<br />
rasvhappeahelatega. 6K mutatsioonid <strong>ja</strong> isegi selle <strong>valgu</strong> täielik eemaldamine mõjuvad<br />
küll virioni kokkupanekut <strong>ja</strong> <strong>viiruse</strong> väljumist rakust, aga nad ei ole alfaviiruste<br />
infektsiooni <strong>ja</strong>oks fataalsed (Liljeström et al., 1991, Loewy et al., 1995, McInerney et<br />
al., 2004).<br />
12
Alfaviiruste <strong>mittestruktuurse</strong>d <strong>valgu</strong>d<br />
Alfaviiruste <strong>mittestruktuurse</strong>d <strong>valgu</strong>d transleeritakse, sõltuvalt <strong>viiruse</strong>st,<br />
genoomselt RNA-lt ühe või kahe polüproteiinina. Näiteks SINV puhul transleeritakse<br />
kas P123 polüproteiin, mis sisaldab nsP1, <strong>nsP2</strong> ning nsP3 järjestusi, või P1234<br />
polüproteiin, mis sisaldab lisaks ka nsP4 järjestust. Missugune polüproteiin moodustub,<br />
sõltub sellest, kas translatsioon peatub nsP3 <strong>ja</strong> nsP4 järjestuste vahel asuval terminaatorkoodonil,<br />
või see termineeriv koodon loetakse läbi, mis toimub umbes 10% kuni 20%<br />
sagedusega. Enamikel SFV tüvedel selline terminaator puudub <strong>ja</strong> nende puhul<br />
sünteesitakse ainult P1234 polüproteiin (Strauss and Strauss, 1994, <strong>ja</strong> viited selles).<br />
Alphaviiruste <strong>mittestruktuurse</strong>te polüproteiinide protsessing muutub<br />
infektsioonitsükli jooksul: vara<strong>ja</strong>ses infektsioonis on näidatud, et nii SINV (de Groot et<br />
al., 1990) kui ka SFV (Takkinen et al., 1991) moodustuvad P123 <strong>ja</strong> nsP4 <strong>valgu</strong>d (st.<br />
vara<strong>ja</strong>se replikaasi komponendid), hilises infektsioonis domineerib aga P12 <strong>ja</strong> P34<br />
polüproteiinide, mille funktsioonid on teadmata, moodustamine. SFV puhul lõigatakse<br />
kõik polüproteiinid eraldi valkudeks, SINV puhul jääb P34 edasi protsessimata.<br />
Neli erinevat <strong>mittestruktuurse</strong>t valku töötavad infektsiooni käigus nii polüproteiini<br />
kui ka valmislõigatud lõpp-produktide kujul.<br />
nsP1. Mittestruktuurne valk 1 (537 aa, 64 kDa SFV-l; 540 aa SINV-l) on va<strong>ja</strong>lik<br />
negatiivse RNA sünteesi alustamiseks <strong>ja</strong> jätkamiseks (Hahn et al., 1989, Sawicki et al.,<br />
1981, Wang et al., 1991). NsP1 omab metüültranferaasset <strong>ja</strong> guanosüültranferasset<br />
aktiivsust (Strauss and Strauss, 1994, <strong>ja</strong> viited selles) <strong>ja</strong> osaleb <strong>viiruse</strong> RNA-de<br />
capeerimisel. Veel üheks nsP1 funktsiooniks on tema võime moduleerida <strong>nsP2</strong><br />
proteinaasset aktiivsust, sest nsP1-e sisaldavad polüproteiinid lõikavad väga halvasti<br />
sidet <strong>nsP2</strong> <strong>ja</strong> nsP3 järjestuste vahel (de Groot et al., 1990, Lulla et al., 2008).<br />
<strong>nsP2</strong>. Mittestruktuurse <strong>valgu</strong> 2 (799 aa, 86 kDa SFV-l; 807 aa SINV-l) N-<br />
terminaalne domeen (SINV puhul 1 aa kuni 459 aa) on RNA helikaas. SINV <strong>nsP2</strong><br />
kuulub valkude superperekonda, mis sisaldavad nukleosiidi trifosfaadi (NTP)-siduvaid<br />
domeene. Need domeenid on iseloomustatud kahe motiiviga, mis on esindatud GSGKS<br />
järjestusega (alates 189 aa) ning DEAF järjestusega (alates 252 aa) (Gorbalenya et al.,<br />
1988, Gorbalenya et al., 1990, Hodgman, 1988). Seega osaleb <strong>nsP2</strong> N-terminaalne<br />
13
domeen kaheahelaise RNA dupleksi lahtikeerdumisel RNA replikatsiooni <strong>ja</strong><br />
transkriptsiooni käigus.<br />
NsP2 <strong>valgu</strong> C-terminaalne domeen (460 aa kuni 807 aa SINV puhul) töötab<br />
<strong>mittestruktuurse</strong> proteinaasina (Strauss and Strauss, 1994). Mutatsioon <strong>nsP2</strong> proteaasi<br />
katalüütilises tsüsteiinijäägis (C478A, <strong>nsP2</strong> CA ), kui ta oli sisse viidud SFV P1234, P123<br />
<strong>ja</strong> P23 polüproteiinidesse, blokeerib täielikult kõik <strong>mittestruktuurse</strong> polüproteiini<br />
proteolüütilised lõikamised. Samuti on demonstreeritud, et <strong>nsP2</strong> on ainus proteinaas,<br />
mis on va<strong>ja</strong>lik SFV P1234 polüproteiini lõikamiseks (Merits et al., 2001). Peale selle on<br />
näidatud, et <strong>nsP2</strong> on va<strong>ja</strong>lik ka 26S subgenoomse mRNA sünteesiks, arvatavasti selle<br />
transkriptsiooni alustamiseks (Hahn et al., 1989, Sawicki and Sawicki, 1985, Sawicki<br />
and Sawicki, 1993).<br />
SFV-ga nakatatud rakkudes paikneb umbes 50% <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong>st rakutuumas,<br />
põhiliselt rakutuumakeses (Peranen et al., 1990). Tuuma lokalisatsiooni signaale (NLS)<br />
on leitud nii <strong>nsP2</strong> N-terminaalses kui ka C-terminaalse osas; tuumakese lokalisatsiooni<br />
signaal paikneb 500 aa-jäägi juures. SFV <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong> NLS on identifitseeritud kui<br />
R 648 R 649 R 650 järjestus ning R-jääkide vahetamine D-jääkide vastu (RDR, DRR või<br />
DDR) takistab <strong>nsP2</strong> tuumset lokalisatsiooni (Rikkonen et al., 1992). Rakutuumas olev<br />
<strong>nsP2</strong> ei osale otseselt <strong>viiruse</strong> RNA replikatsioonis, samas võib selle <strong>valgu</strong><br />
tuumalokalisatsioon mängida olulist rolli alfaviiruste tsütotoksilisuses <strong>ja</strong><br />
neuropatogeensuses. Nii on näidatud, et viirus, mille <strong>nsP2</strong>-s paikneb R649D<br />
mutatsioon, ei tekita hiirtes entsefaliiti. Rakkudes, mis on nakatatud selle mutantse<br />
<strong>viiruse</strong>ga, toimub P1234 lõikamine mõningase viivitusega, viidates sellele, et R649D<br />
mutatsioon mõjutab ka <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong> proteolüütilist aktiivsust (Fazakerley et al., 2002).<br />
NsP2 valk on vastutav SFV <strong>ja</strong> SINV poolt põhjustatud tsütopatogeenilise effekti<br />
eest nakatatud selgroogsete rakkudes. Individuaalse <strong>nsP2</strong> ekspressioon nendes rakkudes<br />
on piisav raku-spetsiifilise transkriptsiooni inhibitsiooni käivitamiseks. Mutatsioonid<br />
<strong>nsP2</strong> C-terminaalses otsas vähendavad oluliselt <strong>viiruse</strong> poolt põhjustatud tsütopaatilist<br />
effekti, vähendades ühtlasi ka raku transkriptsiooni inhibeerimist <strong>ja</strong> apoptoosi (peamist<br />
rakkude surma mehhanismi alfaviiruste infektsioonis) indutseerimist (Perri et al., 2000).<br />
Mutatsioonid SINV <strong>nsP2</strong> järjestuses võivad viia ka vähenenud <strong>viiruse</strong> RNA sünteesile<br />
14
ning selle tulemusena isegi persistentse infektsiooni tekkimisele selgroogsete rakkudes<br />
(Dryga et al., 1997, Frolova et al., 2002).<br />
nsP3. Mittestruktuurse <strong>valgu</strong> 3 (482 aa, 61 kDa SFV-l; 556 aa SINV-l) N-<br />
terminaalne domeen on 322 aa kuni 329 aa pikk ning on kõrgelt (minimaalselt 51%<br />
ulatuses) konserveeritud erinevate alfaviiruste vahel. Samal a<strong>ja</strong>l ei ole nsP3 C-<br />
terminaalne domeen konserveeritud ei järjestuse ega pikkuse poolest, selle domeeni<br />
pikkus varieerub 134 aa kuni 246 aa vahel (Strauss and Strauss, 1994, <strong>ja</strong> viited selles).<br />
Erinevalt muudest ns-valkudest on nsP3 fosfoproteiin. On näidatud, et alfa<strong>viiruse</strong><br />
replikatsioonikompleksid, mis olid isoleeritud nakatatud rakkudest 6 tunni pärast<br />
nakatamist sisaldasid kõrgelt fosforüleeritud nsP3 valku viidates sellele, et selline nsP3<br />
<strong>valgu</strong> vorm mängib olulist rolli RNA sünteesis (Barton et al., 1991).<br />
Samuti on näidatud, et nsP3 järjestuse olemasolu P123 polüproteiinis on va<strong>ja</strong>lik<br />
negatiivse RNA sünteesiks (Lemm and Rice, 1993, Lemm et al., 1994, Shirako and<br />
Strauss, 1994). Lisaks sellele mõjutab nsP3 järjestuse olemasolu polüproteiinides <strong>nsP2</strong><br />
proteinaasi lõikamisspetsiifilisust: nii <strong>nsP2</strong> kui ka P12 lõikavad SINV nsP3 <strong>ja</strong> nsP4<br />
vahelist saiti väga halvasti, samal a<strong>ja</strong>l nii P123 kui ka P1234 lõikavad seda saiti<br />
effektiivselt (de Groot et al., 1990). NsP3 moodustab nakatatud rakkudes vähemalt<br />
kahte tüüpi komplekse: ühed on leitud seotuna plasmamembraaniga <strong>ja</strong> rekusiseste<br />
vesiikulitega ning teised on ko-isoleeritavad rakutuumaga (Gorchakov et al., 2008).<br />
nsP4. Mittestruktuurne valk 4 (614 aa, 68 kDa SFV-l; 610 aa SINV-l) on <strong>viiruse</strong><br />
RNA polümeraas (Rubach et al., 2009) <strong>ja</strong> terminaalne nukeotidüül-transferaas (Tomar<br />
et al., 2006). NsP4 kontsentratsioon on nakatatud rakkudes madalam, kui muude nsvalkude<br />
oma: paljude alfaviiruste puhul va<strong>ja</strong>b nsP4 translatsioon nsP3 regiooni lõpus<br />
paikneva stop-koodoni läbilugemist, see tähendab aga seda, et nsP4 valku toodetakse<br />
selliste viiruste puhul alati palju väiksemas hulgas kui teisi <strong>mittestruktuurse</strong>id valke<br />
(Strauss et al., 1983). Peale selle on näidatud, et nsP4 valk on nakatatud rakkudes<br />
ebastabiilne: ainult RNA replikaas-kompleksiga seotud nsP4 valk on degradatsiooni<br />
eest kaitstud, „vaba“ nsP4 aga mitte ning seda lagundatakse kiiresti N-otsast sõltuvas<br />
degradatsiooni ra<strong>ja</strong>s (de Groot et al., 1991).<br />
15
Alfaviiruste infektsiooni mõju selgroogsete rakkudele<br />
Alfa<strong>viiruse</strong>d replitseeruvad kiiresti <strong>ja</strong> efektiivselt paljudes selgroogsete<br />
rakutüüpides <strong>ja</strong> kultiveeritavates rakuliinides. Uue põlvkonna viiruste väljumine<br />
nakatatud rakkudest algab tavaliselt 4 kuni 6 tunni pärast nakatamist. Paljud alfa<strong>viiruse</strong>d<br />
indutseerivad nakatatud rakkude apoptoosi (Griffin, 2006). Viirusega nakatamine<br />
kutsub esile ka muid tsütopaatilisi effekte: rakud ümarduvad, peenenduvad, nende<br />
tsütoplasmas moodustuvad „mullid“, ning tüüpiliselt rakud surevad 24 – 48 tundi peale<br />
infektsiooni algust (Levine et al., 1993, Raghow et al., 1973).<br />
Superinfektsiooni vältimine<br />
Alfaviirustele, nagu ka paljudele teistele viirustele, on omane superinfektsiooni<br />
vältimise nähtus. See seisneb selles, et selgrootute või selgroogsete rakud, mis on<br />
nakatatud ühe alfa<strong>viiruse</strong>ga, ei saa olla hiljem produktiivselt nakatatud teise sama liiki<br />
kuuluva või talle lähedase alfa<strong>viiruse</strong>ga. Superinfektsiooni vältimine kujuneb väl<strong>ja</strong><br />
vara<strong>ja</strong>ses infektsioonis: siseneva <strong>viiruse</strong> inhibeerimine hakkab toimima pärast<br />
esimesena rakku sattunud <strong>viiruse</strong> <strong>mittestruktuurse</strong>te valkude sünteesi. Superinfitseeriva<br />
<strong>viiruse</strong> genoom saab küll sellises rakus olla transleeritud, aga mitte replitseeritud<br />
(Stollar and Shenk, 1973). Arvatakse, et see toimub sellepärast, et nakatatud rakus<br />
paiknev esimeselt <strong>viiruse</strong>lt pärinev P2 proteaas lõikab enneaegselt superinfitseeriva<br />
<strong>viiruse</strong> replikaasi polüproteiini, blokeerides sellega miinus-ahela sünteesiks va<strong>ja</strong>like<br />
komplekside moodustamist <strong>ja</strong> selle kaudu ka superinfitseeriva <strong>viiruse</strong> replikatsiooni<br />
(Karpf et al., 1997, Ehrengruber and Goldin, 2007). Käesoleva magistritöö katsed olid<br />
suunatud sellele, et näidata kas <strong>nsP2</strong> proteaas tõepoolest mängib olulist rolli<br />
superinfektsiooni vältimise nähtuses.<br />
16
EKSPERIMENTAALNE OSA<br />
UURIMUSTÖÖ EESMÄRGID<br />
Alfaviiruste superinfektsiooni vältimise mehhanismide uurimine on kujunenud<br />
väga oluseks uurimussuunaks seoses praegusel a<strong>ja</strong>l toimuva moskiitode <strong>ja</strong> sääskede<br />
levila kiire suurenemisega. Kuna moskiitod <strong>ja</strong> sääsed on alfaviiruste peamised vektorid<br />
siis toob nende levik kaasa ka alfaviiruste (aga ka teiste arboviiruste) poolt põhjustatud<br />
haiguste sagenemist <strong>ja</strong> levimist regioonidesse, kus neid varem ei leidunud. On võimalik,<br />
et superinfektsiooni vältimise mehhanisme võib edukalt kasutada ka lüli<strong>ja</strong>lgsetega<br />
levivate viiruste paljunemise <strong>ja</strong> levimise pidurdamiseks. See võimalus sõltub aga nende<br />
mehhanismide olemusest mistõttu on va<strong>ja</strong> väl<strong>ja</strong> selgitada superinfektsiooni vältimise<br />
mehhanismi molekulaarsed alused. Käesoleva magistritöö eesmärgiks oligi väl<strong>ja</strong><br />
selgitada, kas SFV <strong>ja</strong> SINV mittestruktuurne valk 2 või seda valku sisaldavad<br />
polüproteiinid võiksid olla seotud superinfektsiooni vältimise mehhanismiga, sest seni<br />
avaldatud töödes on just <strong>nsP2</strong> proteaasi olemasolu rakkudes peetud peamiseks faktoriks,<br />
mis takistab teisena rakku sattunud <strong>viiruse</strong> paljunemist. Valitud eesmärgi saavutamiseks<br />
oli va<strong>ja</strong> lahendada kaks teineteisele vastukäivat ülesannet. Esiteks oli va<strong>ja</strong> näidata, et<br />
rakud, mis sisaldavad <strong>nsP2</strong> proteaasi, ei saa olla alfa<strong>viiruse</strong>ga produktiivselt nakatatud.<br />
Teiseks oli va<strong>ja</strong> lahendada <strong>nsP2</strong>-le iseloomulik kõrge tsütotoksilisuse probleem, mis ei<br />
võimalda läbi viia <strong>nsP2</strong> ekspressiooni rakkudes ilma neid kahjustamata (igasugune<br />
rakkude kahjustamine mõjutab kaudselt nendes rakkudes toimuvat viirusinfektsiooni).<br />
Nendele ülesannetele lahendusteede otsimine kujuneski peamiseks teguriks, mis määras<br />
kavandatud uurimistöö peamised eksperimentaalsed suunad.<br />
17
MATERJALID JA MEETODID<br />
Kasutatud rakuliinid <strong>ja</strong> söötmed<br />
Antud uurimustöös kasutati hamstri neerurakuliini BHK-21 ning T7 BHK<br />
rakuliini, mis ekspresseerib bakteriofaag T7 RNA polümeraasi (BSR-T7 rakud,<br />
Buchholz et al., 1999). Rakke kasvatati 37 o C, 5% CO 2 <strong>ja</strong> kõrge niiskusega tingimustes<br />
GMEM söötmes (Glasgow Modified Eagle’s Medium, „Gibco BRL“), millele lisati 5%<br />
veise loote seerumi (Fetal Calf Serum - FCS), 2% Bacto Tryptose Phosphate Broth’i<br />
(„Difco“), penitsilliini 100 IU/ml <strong>ja</strong> streptomütsiini 100 ng/ml (lõppkontsentratsioonid).<br />
T7 BHK rakkude söötmesse lisati veel G418 (geneticin, „Gibco BRL“)<br />
lõppkontsentratsiooniga 1 mg/ml. Rakkude nakatamiseks <strong>viiruse</strong>ga <strong>ja</strong> viirus-stokide<br />
lahjenduste tegemiseks kasutati seerumivaba GMEM söödet. Pärast nakatamist lisati<br />
mõnedel juhtudel rakkudele 2% seerumit sisaldav GMEM sööde.<br />
Kasutatud plasmiidid<br />
Kõik töös kasutatud algplasmiidid olid ostetud nende toot<strong>ja</strong>telt, rekombinantsed<br />
plasmiidid <strong>ja</strong> viirus-vektorid olid konstrueeritud/tellitud Aleksei Lulla poolt<br />
(algplasmiidide kaardid on antud töö lõpus lisa peatükis).<br />
pSFV1-d1EGFP-RDR – RDR mutatsiooniga <strong>nsP2</strong> proteaasi sisaldavat SFV<br />
replikon-vektori cDNAd sisaldav plasmiid. EGFP valku kodeeriv järjestust, mis<br />
võimaldab replikoni sisaldavate rakkude sorteerimist, on paigutatud SFV subgenoomse<br />
promooteri kontrolli alla.<br />
NsP2-te ekspresseeriva rakuliini loomiseks kasutatud plasmiidid:<br />
pTet-On – rtTA valku kodeeriv regulatoorne plasmiid (Clontech)<br />
pTRE-Tight-Rluc – Renilla lutsiferaasi kodeeriv vastusplasmiid, kloonide fooni<strong>ja</strong><br />
induktsiooni tasemete mõõtmiseks <strong>ja</strong> võrdlemiseks.<br />
pTRE-Tight-<strong>nsP2</strong> – <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong> kodeeriv vastusplasmiid.<br />
18
T7 BHK rakkudes kasutatud plasmiidid (rekombinantsete plasmiidide<br />
originaalnimetus oli pT7-IRES-SFV-p1234, lihtsuse mõttes on nende nimetusi<br />
lühendatud järgnevalt):<br />
T7 kontroll – tühi pT7-IRES vektor, sisaldab T7 RNA polümeraasi promooterit <strong>ja</strong><br />
entsefalomüokardiidi <strong>viiruse</strong> IRES elementi. Järgnevad vektorid olid konstrueeritud<br />
selle plasmiidi alusel.<br />
T7 SFV wt – T7 RNA polümeraasi promooterit sisaldav plasmiid, mis kodeerib<br />
SFV metsik-tüüpi <strong>mittestruktuurse</strong>id valke.<br />
T7 SFV CA – T7 RNA polümeraasi promooterit sisaldav plasmiid, mis kodeerib<br />
SFV <strong>mittestruktuurse</strong>id valke mitteprotsessitava polüproteiini kujul, sest polüproteiini<br />
kuuluva <strong>nsP2</strong> aktiivsait on muteeritud (sisaldab Cys→Ala katalüütilise aminohappe<br />
jäägi kohal).<br />
T7 SINV wt – T7 RNA polümeraasi promooteriti sisaldav plasmiid, mis kodeerib<br />
SINV metsik-tüüpi <strong>mittestruktuurse</strong>id valke.<br />
T7 SINV CA – T7 RNA polümeraasi promooterit sisaldav plasmiid, mis kodeerib<br />
SINV <strong>mittestruktuurse</strong>id valke mitteprotsessitava polüproteiini kujul, sest polüproteiini<br />
kuuluva <strong>nsP2</strong> aktiivsait on muteeritud (sisaldab Cys→Ala katalüütilise aminohappe<br />
jäägi kohal).<br />
Kasutatud <strong>viiruse</strong>d<br />
Kõik viiruste varud olid paljundatud, puhastatud <strong>ja</strong> tiitritud Valeria Lulla poolt.<br />
Viiruste päritolu oli järgnev:<br />
SFV wt (SFV4) – metsik-tüüpi <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> <strong>viiruse</strong> stokk, pärineb SFV icDNAs<br />
sisaldavast plasmiidist SP6-SFV4 (Liljestrom et al., 1991), 2 põlvkond, 5 x 10 9 PFU<br />
(Plaque Forming Unit – lüüsilaiku moodustav ühik)/ml<br />
SINV wt – metsik-tüüpi <strong>Sindbis</strong> <strong>viiruse</strong> stokk, pärineb SINV icDNAd sisaldavast<br />
plasmiidis pTOTO1101, 2 põlvkond, 1 x 10 9 PFU/ml<br />
SFV-Rluc (SFV(3H)4-Rluc) – ns-regioonis Renilla lutsiferaasi kodeeriv <strong>Semliki</strong><br />
<strong>Forest</strong> viirus, konstrueeritud analoogselt Tamberg et al., 2007, pärineb vastavat icDNAd<br />
sisaldavast plasmiidist, 2 põlvkond, 5 x 10 9 PFU/ml<br />
19
SINV-Rluc – ns-regioonis Renilla lutsiferaasi kodeeriv <strong>Sindbis</strong> viirus, pärineb<br />
Rluc inserti sisaldavast pTOTO1101 plasmiidist (V. Lulla, avaldamata), 2 põlvkond, 2,5<br />
x 10 9 PFU/ml<br />
Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga elektroporatsiooni meetodil<br />
Plasmiidne DNA transfekteeriti BHK-21 rakkudesse elektroporatsiooni meetodil.<br />
Rakkudelt aspireeriti sööde, neid pesti steriilse fosfaatpuhvriga sooladelahusega<br />
(Phosphate Buffered Saline - PBS), trüpsiniseeriti, suspendeeriti ning koguti 15 või 50<br />
milliliitrisesse koekultuurituubi, kuhu oli eelnevalt lisatud 5 ml - 10 ml GMEM söödet<br />
(sõltuvalt rakkude kasvatamiseks kasutatud tasside arvust). Rakud sadestati<br />
tsentrifuugimisel (5 minutit, 1000 g, „Eppendorf Centrifuge 5810R“). Rakusademelt<br />
aspireeriti supernatant <strong>ja</strong> rakud resuspendeeriti va<strong>ja</strong>likus koguses söötmes.<br />
Rakususpensioon (250 µl kaupa) segati 20 µl DNA lahusega (nõutav kogus DNA-d,<br />
steriilne vesi, 5 µl carrier DNAd (algkontsentratsiooniga 10 g/l)). Elektroporatsiooniks<br />
kasutati 0.4 cm küvetti („BioRad“) <strong>ja</strong> tehti üks pulss 220 V 950 µF juures („BioRad“<br />
Gene Pulser II). Küvetist kanti elektroporeeritud rakud üle GMEM söötmesse,<br />
tsentrifuugiti ülal nimetatud tingimustel, suspendeeriti GMEM söötmes <strong>ja</strong> külvati väl<strong>ja</strong><br />
Petri tassidele.<br />
Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga lipofektsiooni meetodil<br />
Vastusplasmiid transfekteeriti BHK21 rakkudest pärinevatesse kloonidesse firma<br />
„Invitrogen“ toodetud transfektsioonireagenti (Lipofectamin 2000) kasutades. Rakke<br />
transfekteeriti 24 auguga plaatidel, kus igas augus oli 150,000-200,000 rakku (peaaegu<br />
100% konfluentsus). Ühe augu kohta kasutati transfektsiooni segu, mis saadi järgnevalt:<br />
1. segades kokku 50 µl OPTI-MEM söödet <strong>ja</strong> 2 µl lipofektamiini <strong>ja</strong> hoides seda<br />
segu 5 minutit toatemperatuuril.<br />
2. segades kokku 50 µl OPTI-MEM söödet <strong>ja</strong> 0.1 µg pTRE-Tight vastusplasmiidi.<br />
3. Peale 5 minutit inkubeerimist kaks segu ühendati ning inkubeeriti täiendavalt 20<br />
minutit toatemperatuuril.<br />
20
Saadud segu (ca 100 µl) lisati rakkudele ning rakke inkubeeriti 5 tundi 37 o C juures,<br />
pärast inkubatsiooni perioodi lõppu vahetati transfektsioonisööde GMEM söötme, kuhu<br />
lisati G418 <strong>ja</strong> doksütsükliini (mõlemad lõppkontsentratsiooniga 1 mg/ml), vastu.<br />
Viirus-stokkide kogumine <strong>viiruse</strong> tiitrimiseks<br />
Viiruste tiitrimiseks kasutatud viirus-stokkid koguti nakatatud BHK-21 <strong>ja</strong> T7<br />
BHK rakkude kasvatamiseks kasutatud söötmetest. Nakatamiseks kasutati kuue auguga<br />
plaatidel kasvavaid rakke (igas augus oli umbes 1 x 10 6 rakku, umbes 90%<br />
konfluentsus). Nakatatud rakke inkubeeriti 37 o C juures 5% CO 2 tingimustes<br />
seerumvabas GMEM söötmes, valitud a<strong>ja</strong>punktides (sõltuvalt katse tingimustest <strong>ja</strong><br />
eesmärkidest) koguti rakkudelt sööde (200 µl iga proovi kohta, eemaldatud söötme<br />
asemel lisati rakkudele sama hulk värsket seerumvaba GMEM söödet). Kogutud söötme<br />
alikvoolid tsentrifugeeriti 1.5 milliliitristes tuubides 5 minutit 13000 g ning 4 o C juures<br />
(Biofuge, „Heraeus instruments“), et eemaldada söötmes olevad rakud <strong>ja</strong> rakujäänused.<br />
Saadud supernatandile lisati glütseriini (1% proovi mahust), proov külmutati <strong>ja</strong> säilitati<br />
-70 o C juures.<br />
Viirusega nakatamine <strong>ja</strong> titreerimine lüüsilaikude meetodil<br />
100% konfluentseid 6 auguga plaatidel kasvavaid BHK-21 rakke inkubeeriti<br />
erinevate viirus-stoki lahjendustega seerumvabas söötmes 1 tund 37 o C juures, iga 15<br />
minuti tagant plaati loksutades. Peale inkubatsiooni eemaldati nakatamissööde <strong>ja</strong> kaeti<br />
rakud eelnevalt soojendatud karboksümetüültselluloosi (carboxymethylcellulose -<br />
CMC) lahuse ning söötme (GMEM) seguga. Kasutatud CMC-söötme segu sisaldas 2<br />
osa 2% CMC lahust <strong>ja</strong> 3 osa GMEM-i, milles oli 2% FCS. Nakatatud BHK-21 rakke<br />
inkubeeriti CMC-söötme seguga 2.5 ööpäeva 37 o C juures 5% CO 2 tingimustel. Peale<br />
inkubatsiooni eemaldati sööde ning rakud värviti kristallviolett-fikseerimislahusega<br />
(0.25% kristallviolett („Merck“); 1.85% formaldehüüd; 10% etanool; 35 mM<br />
trishüdroksümetüülaminometaan (Tris); 0.5% CaCl 2 ) 15-30 minutit. Peale värvimist<br />
21
pesti tasse jooksva soo<strong>ja</strong> veega <strong>ja</strong> kuivatati õhu käes. Tasse, mis sisaldasid 1-100<br />
lüüsilaiku, kasutati <strong>viiruse</strong> tiitri arvutamiseks.<br />
Lutsiferaasi ekspressiooni kvantifitseerimine<br />
Lutsiferaasi ekspressiooni mõõtmiseks kasutati kuue auguga koekultuuriplaatidel<br />
kasvatatud nakatatud <strong>ja</strong>/või transfitseeritud rakke (igas augus umbes 1 x 10 6 rakku).<br />
Lutsiferaasi aktiivsuse analüüsiks lüüsiti rakud passiivse lüüsi puhvriga (Passive Lysis<br />
Buffer - PLB), kasutades 400 µl puhvrit iga augu kohta, <strong>ja</strong> määrati lüsaatides sisalduva<br />
lutsiferaasi aktiivsus kasutades firma „Promega“ „Renilla Luciferase assay system“<br />
komponente <strong>ja</strong> juhiseid ning „Turner Designes“ luminomeetrit.<br />
Valkude ekspressiooni määramine Western blot meetodil<br />
Ekspresseeritud valkude detekteerimiseks immuno-blott meetodil transfekteeritud<br />
või nakatatud BHK-21 või T7 BHK rakkudes lüüsiti rakud lisades neile 150 µl 1 x<br />
Laemmli puhvrit (50 mM TrisHCl, 100 mM DTT, 2% naatriumdodetsüülsulfaat<br />
(Sodium Dodecyl Sulfate - SDS), 0.1% broomfenoolsinine, 10% glütserooli) ning koguti<br />
kogu viskoosne mater<strong>ja</strong>l 1.5 ml tuubi. Rakulüsaati kuumutati 100 o C 5 minutit. Mitte<br />
lagustunud jäänused eemaldati tsentrifuugimise teel, supernatandis olevad <strong>valgu</strong>d<br />
lahutati geelelektroforeesil 10% SDS-polüakrüülamiidgeelis. Valgud kanti üle firma<br />
„Millipore“ PVDF-membraanile (Immobilon-P) kasutades poolkuiva ülekandemeetodit<br />
<strong>ja</strong> „Bio-Rad Instruments“ aparaati. Ülekanne toimus 30 minutit ülekandepuhvris (48<br />
mM Tris, 39 mM glütsiin, 0.037% SDS, 20% etanool) voolutugevusega 0.55 mA/cm 2 .<br />
Filter blokeeriti ühe tunni jooksul toatemperatuuril 5% lõssipulbri lahuses (5%<br />
lõssipulber, 5% 1M Tris, 3% 5M NaCl, 0.1% Tween20). Järgnevalt inkubeeriti filtrit<br />
huvipakkuva <strong>valgu</strong> vastase antikehaga üks tund 2% lõssipulbri lahuses (2% lõssipulber,<br />
5% 1M Tris, 3% 5M NaCl, 0.1% Tween20) <strong>ja</strong> pesti seejärel 3 x 10 minutit pesulahuses<br />
(5% 1M Tris, 3% 5M NaCl, 0.1% Tween20). Töötlus sekundaarse antikehaga, mis oli<br />
konjugeeritud peroksüdaasiga, viidi läbi analoogiliselt. Signaal detekteeriti, kasutades<br />
ECL TM Kit’i („Amersham Pharmacia Biotech“) <strong>ja</strong> röntgenfilmi.<br />
22
Rakkude sorteerimine läbivoolu tsütofluorimeetriga<br />
BHK-21 rakkude sorteerimiseks kasutati Becton Dickinson LSRII<br />
voolutsütomeetrit, millel on sinine (λ=488 nm) <strong>ja</strong> punane (λ=633 nm) laser ning kuus<br />
filtrit fluorestentse signaali analüüsiks (töös kirjeldatud katses kasutati sinist laserit<br />
filtriga 530 nm, sobiv FITS/GFP <strong>ja</strong>oks). FACS analüüsi andmete visualiseerimiseks<br />
kasutati BD FACSDiva tarkvara. Analüüsitavaid rakke sisaldavad proovid lahjendati<br />
enne analüüsimist 500 µl PBS-s ning loeti sisse kasutades FACS tuube (BD Falcon, Le<br />
Point De Claix, Prantsusmaa). Sorteerimisparameetrite kalibreerimiseks kasutati<br />
esimese 10000-20000 elusa raku andmed.<br />
Rakuliinide loomine <strong>nsP2</strong>-indutseeritavaks ekspressiooniks<br />
SFV4 <strong>nsP2</strong> valku ekspresseeriva rakuliini loomine toimus Tet-On®<br />
geeniekspressiooni süsteemi abil (Tet-On® Gene Expression System, „Clontech<br />
Laboratories, Inc.“), kasutades firma juhiseid ning plasmiide (pTet-On <strong>ja</strong> pTRE-Tight).<br />
Esmalt transfitseeriti BHK-21 rakkudesse elektroporatsiioni meetodil pTet-On<br />
regulatoorne plasmiid ning raku genoomi intgreerunud plasmiidi sisaldavad rakud<br />
selekteeriti ühe nädala jooksul G418 abil (geneticin, „Gibco BRL“)<br />
lõppkontsentratsiooniga 1 mg/ml. Isoleeriti umbes 40 G418-le resistentset klooni ning<br />
kasvatati neid eraldi tassidel. Nendes rakuliinides kontrolliti marker<strong>valgu</strong> ekspressiooni<br />
indutseerimist kasutades selleks Renilla lutsifreaasi kodeerivat vastusplasmiidi <strong>ja</strong><br />
mõõtes ekspressiooni fooni (indutseerimata rakud) <strong>ja</strong> indutseeritud ekspressiooni<br />
vahekorda. Selle <strong>ja</strong>oks transfekteeriti rakkudesse lipofektamiini abil (Lipofectamin<br />
2000, „Invitrogen“) pTRE-Tight-Rluc plasmiid ning 5 tunni pärast lisati rakkudele<br />
sööde koos doksütsükliiniga (doxycycline), kontsetratsiooniga 1 mg/ml (indutseeritud<br />
rakud) või ilma doksütsükliinita (indutseerimata rakud). 16 tundi pärast indutseerimist<br />
mõõdeti lutsiferaasi ekspressiooni tasemed kasutades firma „Promega“ toote „Renilla<br />
Luciferase assay system“ komponente <strong>ja</strong> juhiseid ning „Turner Designes“<br />
luminomeetrit. Neid rakke, mis andsid induktsiooni efektiivsuseks 30 või enam korda<br />
23
(indutseeritud rakud võrrelduna indutseerimate rakkudega), paljundati ning kasutati<br />
edaspidisel eksperimentidel.<br />
24
TÖÖ TULEMUSED<br />
1. Superinfektsiooni vältimise näidiseksperiment<br />
Selle näidiskatse eesmärgiks oli demonstreerida superinfektsiooni vältimise<br />
toimimist SFV <strong>ja</strong> SINV puhul. Katse viidi läbi kahte tüüpi SFV <strong>ja</strong> SINV-ga: esmane<br />
nakatamine tehti mõlemal juhul metsik-tüüpi viirustega ning teine nakatamine<br />
(superinfektsioon) Renilla lutsiferaasi ekspresseerivate viirustega. See lähenemine<br />
võimaldas hinnata superinfektsiooni toimumise efektiivsust kvantifitseerides<br />
superinfitseeriva <strong>viiruse</strong> ekspresseeritud lutsiferaasi aktiivsust. Katse viidi läbi<br />
järgnevalt:<br />
1. 100% konfluentset BHK-21 rakukultuuri nakatati kahel 6 augusel plaadil SFV või<br />
SINV-ga m.o.i. (m.o.i. – infektsiooni kordsus (multiplicity of infection)) 10<br />
tingimustes; kummagi <strong>viiruse</strong>ga nakatati kahes augus kasvavaid rakke. Iga plaadi<br />
puhul jääti kahes augus kasvanud rakud nakatamata.<br />
2. 6 tunni pärast viidi läbi superinfektsioon kasutades järgmiseid tingimusi:<br />
- SFV wt nakatatud rakud → 2 auku SFV-Rluc (0.01 m.o.i.); 2 auku SINV-Rluc (0.01<br />
m.o.i.)<br />
- SINV wt nakatatud rakud → 2 auku SFV-Rluc (0.01 m.o.i.); 2 auku SINV-Rluc<br />
(0.01 m.o.i.)<br />
- mõlemal plaadil olnud nakatamata (kontrollrakud – mock) rakke nakatati SFV-Rluc<br />
(0.01 m.o.i.) või SINV-Rluc (0.01 m.o.i.) viirustega<br />
3. 12 <strong>ja</strong> 16 tundi peale teist nakatamist rakud lüüsiti <strong>ja</strong> viidi läbi lutsiferaasi<br />
ekspressiooni mõõtmine.<br />
25
lutsiferaasi ekspressioon (RLU)<br />
1,0E+08<br />
1,0E+07<br />
1,0E+06<br />
1,0E+05<br />
1,0E+04<br />
1,0E+03<br />
1,0E+02<br />
1,0E+01<br />
1,0E+00<br />
12 h<br />
16 h<br />
SFV wt,<br />
SFV-<br />
Rluc<br />
SFV wt,<br />
SINV-<br />
Rluc<br />
mock,<br />
SFV-<br />
Rluc<br />
SIN wt,<br />
SFV-<br />
Rluc<br />
SIN wt,<br />
SINV-<br />
Rluc<br />
mock,<br />
SINV-<br />
Rluc<br />
proovid<br />
Diagramm 1. Supeinfektsiooni vältimise näidiseksperimendi tulemused.<br />
Selle katse tulemused (diagramm 1) näitasid et nagu eeldatud, ei saa alfaviirust<br />
sisaldavaid rakke nakatada teise sama tüüpi või sarnase alfa<strong>viiruse</strong>ga: SFV-ga nakatatud<br />
rakud ei saa olla efektiivselt nakatatud ei SFV-ga ega SINV-ga, <strong>ja</strong> vastupidi. Samas olid<br />
need rakud, mis polnud metsik-tüüpi <strong>viiruse</strong>ga nakatatud, vastuvõtlikud mõlemale<br />
<strong>viiruse</strong>le ning näitasid kõrget lutsiferaasi ekspressiooni taset (vähemalt 100 000 korda<br />
kõrgemat, kui superinfektsiooni tingimustes nakatatud rakud).<br />
2. Katsed RDR mutatsiooni sisaldavat <strong>nsP2</strong> proteaasi<br />
ekspresseerivate rakkudega<br />
Selle katse eesmärgiks oli uurida, kas eelmises katses näidatud superinfektsiooni<br />
vältimises osaleb <strong>viiruse</strong> kodeeritud <strong>nsP2</strong> proteaas. Katse idee oli iseenesest väga lihtne:<br />
va<strong>ja</strong> oli viia rakku individuaalset <strong>nsP2</strong> proteaasi ekspresseeriv konstrukt <strong>ja</strong> pärast seda<br />
infitseerida <strong>nsP2</strong>-te ekspresseerivaid rakke <strong>viiruse</strong>ga. Esitatud hüpoteesi õigsust<br />
kinnitavaks tulemuseks oleks rakkude, milles toimub <strong>nsP2</strong> ekspressioon, ellujäämine<br />
peale metsik-tüüpi <strong>viiruse</strong>ga nakatamist. Praktilises teostuses on see katse aga väga<br />
26
keeruline. Probleem on selles, et SFV <strong>ja</strong> SINV <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong>d on tsütotoksilised.<br />
Vastavaid ekspressioonikonstrukte on küll lihtne rakkudesse sisse viia, kuid on võimatu<br />
raske kindlaks teha kas need rakud, kui nad surevad, hukkusid <strong>viiruse</strong> infektsiooni või<br />
neid „kaitsva“ <strong>nsP2</strong> proteaasi toime tõttu. Teiseks probleemiks on see, et <strong>nsP2</strong><br />
tsütotoksiline toime võib <strong>viiruse</strong> infektsiooni mõjutada mitte otse, vaid kaudselt:<br />
toksiline valk kahjustab rakke <strong>ja</strong> takistab seetõttu alfa<strong>viiruse</strong> (tõenäoliselt ka muude<br />
viiruste) infektsiooni. Nende probleemide tõttu prooviti kasutada RDR mutatsiooni<br />
sisaldavat <strong>nsP2</strong> proteaasi ekspresseerivaid plasmiide: tänu tuuma lokalisatsiooni<br />
signaali muutmisele (RDR mutatsioonile) jääb selliste plasmiidide poolt ekspresseeritud<br />
proteaas raku tsütoplasmasse, mis vähendab oluliselt tema poolt tingitud<br />
tsütopatogeenset effekti. Samas pole näidatud, et see mutatsioon mõjutaks <strong>viiruse</strong><br />
võimet tekitada superinfektsiooni blokki (Fazakerley et al., 2002) <strong>ja</strong> seetõttu võis<br />
eeldada, et RDR mutatsiooniga <strong>nsP2</strong> proteaas on selle funktsiooni osas sarnane metsiktüüpi<br />
proteaasile. Peale selle arvestati, et kuna alfa<strong>viiruse</strong>d replitseeruvad tsütoplasmas,<br />
peavad ka superinfektsiooni blokiga seotud sündmused aset leidma tsütoplasmas <strong>ja</strong><br />
<strong>nsP2</strong> tuumse lokalisatsiooni puudumine ei tohiks neid seega mõjutada. Selle katse<br />
kriitiliseks osaks on saavutada rakkude 100% transfektsioon – kui see ei õnnestu, saab<br />
viirus takistamata paljuneda <strong>nsP2</strong>-te mitteekspresseerivates rakkudes. Selle<br />
saavutamiseks kasutati rakusorterit. Läbiviidud katse skeem oli järgmine:<br />
1. 2 x 10 6 BHK-21 rakku transfekteeriti RDR mutatsiooni sisaldavat <strong>ja</strong> EGFP-ga<br />
liidetud <strong>nsP2</strong> proteaasi (st. <strong>nsP2</strong>-EGFP fusion-valku) ekspresseeriva plasmiidiga<br />
2. Nagu eeldatud, oligi EGFP-positiivsete rakkude arv (võrreldes negatiivsete<br />
rakkudega) transfektsiooni pärast oluliselt alla 100%; seetõttu valiti rakusorteri<br />
(FACS-Aria) abil väl<strong>ja</strong> fluorestseerivad rakud, kokku saadi ca 355000 EGFPpositiivset<br />
rakku.<br />
3. EGFP-positiivsed (st. EGFP-<strong>nsP2</strong> proteaas liitvalku sisaldavad) rakud ning sama arv<br />
mock-tranfekteeritud <strong>ja</strong> sorteeritud kontrollrakke külvati tassidele<br />
4. Mõlemad tassid infitseeriti wt SFV-ga m.o.i. 10 tingimustes<br />
5. 1h, 6h, 12h, 24h ning 36h pärast infitseerimist võeti söötmest proovid, mida kasutati<br />
<strong>viiruse</strong> tiitri määramiseks<br />
27
1,0E+09<br />
1,0E+08<br />
<strong>viiruse</strong> tiiter (PFU)<br />
1,0E+07<br />
1,0E+06<br />
1,0E+05<br />
1,0E+04<br />
mock - SFV 10 moi<br />
RDR - SFV 10 moi<br />
1,0E+03<br />
1,0E+02<br />
1 6 12 24 36<br />
aeg (h)<br />
Diagramm 2. Wt SFV kasvukõver <strong>nsP2</strong>(RDR) -EGFP liitvalku ekspresseeerivates<br />
rakkudes <strong>ja</strong> kontrollrakkudes.<br />
Nagu on näha joonisel toodud andmetest (diagramm 2) näitasid selle katse<br />
tulemused, vastupidiselt esialgsele hüpoteesile, et <strong>nsP2</strong>(RDR) olemasolu rakkudes<br />
(vähemalt <strong>nsP2</strong>(RDR)-EGFP liit<strong>valgu</strong> kujul) ei taga rakkudele kaitset homoloogilise (wt<br />
proteaasi tootva) <strong>viiruse</strong> infektsiooni eest. Rakkude vaatlemisel oli näha, et <strong>nsP2</strong>(RDR)-<br />
EGFP-d ekspresseerivad rakud surevad viirusinfektsiooni tagajärjel peaaegu sama<br />
kiiresti kui seda valku mitteekspresseerivad kontrollrakud. Peale selle, võttes aluseks<br />
<strong>viiruse</strong> kasvukõverad nendes <strong>ja</strong> kontrollrakkudes, saab järeldada, et viirus paljuneb<br />
tsütoplasmaatilist lokalisatsiooni omavat proteaasi ekspresseerivates rakkudes isegi<br />
mõnevõrra efektiivsemalt, kui kontrollrakkudes, kus proteaasi ekspressioon puuudub.<br />
Siinkohal on aga oluline märkida, et selle katse tulemusi objektiivselt hinnata on väga<br />
raske. Esiteks, <strong>nsP2</strong>-EGFP liit<strong>valgu</strong> funktsioonid võivad erineda vaba <strong>nsP2</strong> omast<br />
(hiljuti on näidatud, et tsütotoksiliste efektide tekitamise <strong>ja</strong> ka peremehe immuunvastuse<br />
mahasurumiseks on va<strong>ja</strong>lik just vaba <strong>nsP2</strong> olemasolu). Teiseks, katse tulemused võivad<br />
olla moonutatud, kuna nakatamiseks kasutatud rakud olid väga suures stressis<br />
elektroporatsiooni <strong>ja</strong> sellele järgnenud sorteerimise pärast, ning on võimalik, see stress<br />
28
võis mõjutada ka rakkude <strong>viiruse</strong>ga nakatamise <strong>ja</strong> selle järgnenud <strong>viiruse</strong> paljunemise<br />
efektiivsust.<br />
3. Katsed rakkudega, milles on võimalik indutseerida <strong>nsP2</strong>-<br />
valku ekspressiooni.<br />
Idee teha <strong>nsP2</strong> ekspresseeriv rakuliin sündis seoses sooviga võita a<strong>ja</strong>s (st. käivitada<br />
<strong>nsP2</strong> ekspressioon vahetult enne <strong>viiruse</strong>ga nakatamist nii kiiresti <strong>ja</strong> efektiivselt, kui<br />
võimalik) ning kaitsta rakke elektroporatsioonist <strong>ja</strong> rakkude sorteerimisest tingitud<br />
stressi eest. Samas olid varasemad korduvad katsed näidanud, et <strong>nsP2</strong>-te pidevalt<br />
ekspresseerivate rakuliinide saamine on võimatu – valk on toksiline <strong>ja</strong> seda alaliselt<br />
ekspresseerivad rakud ei suuda ellu jääda. Seepärast katsetasime alternatiivset<br />
lähenemist, mis seisnes rakkude transfitseerimises proteaasi geeniga, mis on paigutatud<br />
sellise indutseeritava promooteri kontrolli alla mida on võimalik kiiresti <strong>ja</strong> efektiivselt<br />
käivitada näiteks antibiootikumi lisamisega söötmele. Selle saavutamiseks kasutasime<br />
Tet-On süsteemi, mille omadused (toot<strong>ja</strong> andmetel) sobisid kõige enam kokku meie<br />
va<strong>ja</strong>dustega. Nimelt on Tet-On täpselt reguleeritav süsteem, mis tagab soovitud geeni<br />
ekspressiooni kõrgel tasemel. Geeni ekspressioon käivitub doksütsükliini lisamisega<br />
söötmele <strong>ja</strong> seda ekspressiooni taset saab varieerida, muutes antibiootikumi<br />
kontsentratsiooni söötmes. Maksimaalne ekspressiooni tase Tet-On süsteemis on väga<br />
kõrge ning on võrreldav maksimaalse tasemega, mida annavad tugevad konstitutiivsed<br />
imeta<strong>ja</strong> rakkude spetsiifilised promooterid nagu CMV (cytomegalovirus -<br />
tsütomegalo<strong>viiruse</strong>) vara<strong>ja</strong>ne promooter. Erinevalt teistest imeta<strong>ja</strong>te rakkudes<br />
kasutatavatest indutseeritavatest ekspressioonisüsteemidest, on geeni regulatsioon Tet<br />
süsteemis väga spetsiifiline ning tänu sellele ei ole tulemuste interpreteerimine<br />
raskendatud pleiotropse efekti või mittespetsiifilise induktsiooni poolt.<br />
Tet-On süsteemi komponendid on regulatoorne valk (37 kDa valk nimega rtTA),<br />
mille sünteesi kontrollib pTet-On regulatoorne plasmiid. Plasmiid sisaldab ka<br />
neomütsiini-resistentsus geeni, mis aitab selekteerida plasmiidiga transfekteeritud rakke<br />
(<strong>ja</strong> saada nendest püsiliine) <strong>ja</strong> vastusvektor, mis ekspresseerib meid huvitavat geeni –<br />
antud juhul mutantset <strong>nsP2</strong> proteaasi (rakuliinide selekteerimisel Renilla lutsiferaasi).<br />
29
Valitud geeni ekspressiooni kontrollib TRE (tetratsükliinile reageeriv element,<br />
tetracycline-response element)-d sisaldav promooter. Antud töös kasutatud vastusvektor<br />
p-TRE-Tight sisaldas modifitseeritud TRE-järjestust ning trankeeritud CMV<br />
promooterit, milles puudub enhanser-regioon. Sellised modifikatsioonid vähendavad<br />
basaalset ekspressioonitaset miinimumini ning juhul, kui regulatoorset valku rakus ei<br />
sünteesita, puudub vastusplasmiidi vahendatud geeniekspressioon peaaegu täiesti. Need<br />
omadused olid meie eksperimendis, kus <strong>nsP2</strong> basaalne ekspressioon ei tohi<br />
transfekteeritud rakke tappa, eriti olulised. Süsteemi töö põhimõtet on skemaatiliselt<br />
kujutatud joonisel 4: rakud, mis sisaldavad mõlemaid (regulatoorse <strong>ja</strong> vastuse)<br />
plasmiide või nendest pärinevaid ekspressioonikassette transkribeerivad soovitud geeni<br />
ainult siis, kui rtTA valk seondub TRE elemendiga, see aga toimub doksütsükliini<br />
juuresolekul.<br />
Joonis 4. Tet-On süsteemi töö (joonise päritolu: Tet-Off® and Tet-On® Gene Expression<br />
Systems User Manual, 2005).<br />
30
NsP2-<strong>valgu</strong> ekspressiooniks sobivate rakuliinide konstrueerimist on põh<strong>ja</strong>likult<br />
kirjeldatud meetodite peatükis. Järgnevalt (tabel 1) on toodud selekteeritud <strong>ja</strong><br />
analüüsitud stabiilselt rtTA valku ekspresseerivate BHK-21 rakkudest saadud kloonide<br />
näited; analüüsitud on nendes toimuvat induktsiooni efektiivsust.<br />
Tabel 1. Saadud BHK-21 kloonide näited.<br />
Klooni number Fooni tase Induktsiooni tase Suhe<br />
Kloon 2 2766 37916 14<br />
Kloon 3 6934 65517 9<br />
Kloon 4 843 28385 34<br />
Kloon 10 6038 40368 7<br />
Kloon 12 3013 50435 17<br />
Kloon 16 753 28030 37<br />
Kloon 18 19314 47404 2<br />
Kloon 24 9178 44085 5<br />
Kloon 31 1871 43726 23<br />
Kloon 35 4832 302489 63<br />
Need andmed (nagu ka andmed muude kloonide kohta, mida tabelis pole ära<br />
toodud) jäävad kaugele maha süsteemi arenda<strong>ja</strong> poolt nimetatud väärtustest<br />
(induktsiooni efektiivsus kuni 50 000 korda). Lähtudes laboris varasematest <strong>nsP2</strong><br />
rakuliinide konstueerimise kogemustest üritasin leida klooni, mille puhul oleks basaalse<br />
<strong>ja</strong> indutseeritud ekspressiooni tasemete erinevus 100-kordne <strong>ja</strong> suurem (väiksem vahe ei<br />
taga piisavalt madalat <strong>nsP2</strong> ekspressiooni indutseerimata püsiliinis; selle tulemuseks on<br />
„promooteri lekkimine”, toksilise <strong>valgu</strong> ekspressioon <strong>ja</strong> sellest tulenevad kõrvalefektid<br />
nagu rakkude vastuselektsioon või rakuliini väl<strong>ja</strong>suremine) paraku sellist klooni leida ei<br />
õnnestunud <strong>ja</strong> seetõttu tuli loobuda plaanist konstrueerida <strong>nsP2</strong>-te ekspresseerivad<br />
püsiliinid. Järgnevates eksperimentides kasutati BHK-21 klooni №35 (BHK-21-35),<br />
mille basaalse <strong>ja</strong> indutseeritud ekspressiooni (doksütsükliini kontsentratsioonil 1 mg/ml)<br />
31
tasemete erinevus oli vastusplasmiidi transientse transfektsiooni korral suurim: 63 korda<br />
<strong>ja</strong> <strong>nsP2</strong> transientset (plasmiidselt vektorilt) ekspressiooni..<br />
Kõigepealt analüüsiti, mis a<strong>ja</strong>l peale doksütsükliini lisamist hakkavad rakud<br />
aktiivselt tootma <strong>nsP2</strong> proteaasi. Selle uurimiseks transfekteeriti BHK-21-35 rakke<br />
elektroporatsiooni teel pTRE-Tight-<strong>nsP2</strong> vastusplasmiidiga ning 14 tundi peale<br />
transfektsiooni lisati rakkudele doksütsükliini. Rakud lüüsiti valitud a<strong>ja</strong>punktides ning<br />
saadud proove analüüsiti Western blot meetodil. Western blot’i analüüsi tulemused on<br />
näidatud joonisel 5.<br />
Joonis 5. NsP2 ekspressiooni analüüs <strong>nsP2</strong>-te ekspresseriva plasmiidiga transfitseeritud <strong>ja</strong><br />
doksütsükliiniga indutseeritud rakkudes Western blot meetodil. Positiivseks kontrolliks on SFVga<br />
nakatatud rakude lüsaat, analüüsil kasutati SFV <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong> vastaseid küüliku antikehasid.<br />
Toodud andmetest on näha, et <strong>nsP2</strong> proteaasi tootmine muutub indutseeritud<br />
rakkudes aktiivseks <strong>ja</strong> detekteeritavaks 8-10 tundi peale doksütsükliini lisamist. Nendest<br />
andmetest lähtudes valiti rakkude nakatamise a<strong>ja</strong>ks 16 tundi peale induktsiooni – st.<br />
aeg, millal <strong>nsP2</strong> ekspressioon saavutab kõrge taseme <strong>ja</strong> edasi oluliselt enam ei suurene.<br />
Sellist skeemi (14 tundi peale transfektsiooni → doksütsükliini lisamine; 16 tundi peale<br />
doksütsükliini lisamist → nakatamine) on kasutatud järgnevas eksperimendis, mille<br />
eesmärgiks oli demonstreerida <strong>nsP2</strong> mõju superinfektsiooni inhibeerimisele kasutades<br />
seekord rakkude transfektsiooni elektroporatsiooni meetodil ilma järgneva rakkude<br />
sorteerimiseta. Katse tehti ainult SFV <strong>nsP2</strong>-te kodeerivat vastusplasmiidi kasutades,<br />
kuid indutseeritud rakkude nakatamiseks kasutati nii SFV wt kui ka SINV wt m.o.i.<br />
32
0.01 tingimustel. Katses analüüsiti <strong>viiruse</strong> kasvukõverat, st. uue põlvkonna <strong>viiruse</strong><br />
vabanemist söötmesse.<br />
1,0E+10<br />
1,0E+09<br />
<strong>viiruse</strong> tiiter (PFU)<br />
1,0E+08<br />
1,0E+07<br />
1,0E+06<br />
1,0E+05<br />
1,0E+04<br />
1,0E+03<br />
<strong>nsP2</strong> puudub, SFV wt<br />
<strong>nsP2</strong> puudub, SINV wt<br />
SFV <strong>nsP2</strong>, SFV wt<br />
SFV <strong>nsP2</strong>, SINV wt<br />
1,0E+02<br />
1 4 8 12 23 36<br />
aeg peale nakatamist (h)<br />
Diagramm 3. SFV <strong>nsP2</strong> ekspressiooni indutseerimise mõju BHK-rakkudes toimuvale SFV <strong>ja</strong><br />
SINV paljunemisele.<br />
Saadud andmetest võib järeldada, et kummagi kasutatud <strong>viiruse</strong> infektsiooni<br />
efektiivsus ei sõltu sellest, kas SFV <strong>nsP2</strong> ekspressioon rakkudes on indutseeritud või<br />
mitte. Võttes kokku kahe negatiivse tulemuse andnud katse tulemused võib väita, et (1)<br />
individuaalse <strong>nsP2</strong> olemasolu rakkudes pole ilmselt piisav superinfektsiooni vältimise<br />
mehhanismi toimumiseks, ning (2) transfektsioon elektroporatsiooni meetodil pole<br />
piisavalt efektiivne meetod katsete teostamiseks BHK-21 rakkudel. Seetõttu ei saa<br />
täeielikult välistada võimalust, et nende katsete tulemuste põhjuseks olla see, et<br />
transfekteeritud sai liiga väike protsent rakke <strong>ja</strong> <strong>viiruse</strong> infektsioon kulges peamiselt just<br />
mittetransfekteeritud rakkudes. Tuleb veel arvestada, et katseteks valitud BHK21<br />
rakkude klooni iseloomustas suhteliselt suur vastusplasmiidilt ekspresseeritud <strong>valgu</strong><br />
33
(kas Rluc või <strong>nsP2</strong>) basaalse ekspressiooni tase ning sellest tingituna võisid <strong>nsP2</strong>-te<br />
ekspresserivat plasmiidi sisaldavad rakud olla juba kahjustunud enne rakkude<br />
indutseerimist. Siiski tuleb pidada tõenäoliseks, et nimetatud tehnilised põhjused ei saa<br />
olla täielikult vastutavad negatiivse tulemuse eest (kumbki nendest võiks nähtavat efekti<br />
vähendada, kuid arvatavasti mitte olematuks muuta). Sellest tulenevalt võib meie<br />
katsetulemustes väita, et vähemalt individuaalse <strong>valgu</strong>na ei ole <strong>nsP2</strong> võimeline olulisel<br />
määral blokeerima superinfitseerivat viirust. Ei ole tõenäoline, et see on tingitud <strong>nsP2</strong><br />
liiga madalast kontsentratsioonist (vt Joonis 5) – superinfektsiooni blokk alfa<strong>viiruse</strong>ga<br />
nakatatud rakus tekib väga kiiresti, st. a<strong>ja</strong>l, kui <strong>nsP2</strong> kontsentratsioon on veel väga<br />
madal. Seega võib eeldada, et kui <strong>nsP2</strong> osaleb superinfektsiooni blokeerimises, siis teeb<br />
ta seda koos teiste alfa<strong>viiruse</strong> replikaasi valkudega.<br />
4. NsP2 mõju uurimine alfaviiruste infektsioonile T7 BHK rakke <strong>ja</strong> lutsiferaasi<br />
ekspresseerivaid <strong>viiruse</strong>id kasutades<br />
Eelpool väl<strong>ja</strong>pakutud hüpoteesi kontrollimiseks otsustasime katsesüsteemi<br />
täiendada <strong>ja</strong> analüüsi tundlikust suurendada kasutades selleks järgmiseid lähenemisi:<br />
1. ekspresseerida rakkudes mitte ainult <strong>nsP2</strong> proteaasi, vaid kogu SFV või SINV<br />
<strong>mittestruktuurse</strong>te valkude blokki (P1234). Nendes katsetes kasutati kummagi<br />
<strong>viiruse</strong> puhul kahte polüproteiini varianti – metsik-tüüpi P1234-d ning CA<br />
mutatsiooniga (C478A mutatsioon <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong> katalüütilises tsüsteiinijäägis) P1234-<br />
<strong>ja</strong>. Vahe nende vahel on järgmine: esimene polüproteiin lõigatakse rakkudes <strong>nsP2</strong><br />
poolt nsP1, <strong>nsP2</strong>, <strong>nsP2</strong> <strong>ja</strong> nsP4 valkudeks samal a<strong>ja</strong>l kui teine polüproteiin jääb aga<br />
lõikamata.<br />
2. muuta transfektsiooni meetodit. Arvestades et BHK-21 rakkude transfektsioon<br />
elektroporatsiooni meetodil ei ole antud uurimise tarvis piisavalt efektiivne meetod<br />
(analüüs näitas, et sellel meetodil on raske saavutada, eriti suurte plasmiidide puhul,<br />
efektiivsust >20%). Kuna transfektsiooni efektiivsus on antud töö seisukohalt<br />
kriitiline <strong>ja</strong> va<strong>ja</strong>dus plasmiidi rakutuuma transportida vähendab veelgi <strong>viiruse</strong> valku<br />
ekspresseerivate rakkude hulka, siis eeldasime, et palju efektiivsem võimalus oleks<br />
ekspresseerida <strong>viiruse</strong> valke rakkude tsütoplasmas paiknevalt plasmiidilt. Kuna ka<br />
34
alfaviiruste transkriptsioon toimub tsütoplasmas, siis sarnaneb selline<br />
ekspresseerimise viis enam tõelisele viirusinfektsioonile. Selle eesmärgi<br />
saavutamiseks kasutati järgnevates katsetes T7 BHK rakuliini, kes toodab T7 RNA<br />
polümeraasi.<br />
T7 BHK rakud on BHK-21 rakuliini variant, millel on tänu T7 RNA polümeraasi<br />
ekspressioonile võime transkribeerida rakku viidud DNA-d otse tsütoplasmas. Süsteemi<br />
toimimiseks oli va<strong>ja</strong>lik, et kõik katsetes kasutatud konstruktid sisaldaksid T7<br />
polümeraasile sobivat promooterit. Analüüsi tundlikkuse täiendavaks suurendamiseks<br />
kasutati selles katses <strong>viiruse</strong>d, mis sisaldasid <strong>mittestruktuurse</strong>s alas Renilla lutsiferaasi<br />
kodeerivat järjestust – Rluc. Lutsiferaasi ekspressiooni aktiivsus sellise <strong>viiruse</strong>ga<br />
nakatatud rakkudes korreleerub <strong>viiruse</strong> genoomi koopiaarvuga <strong>ja</strong> võimaldab väga<br />
täpselt mõõta <strong>viiruse</strong> replikatsiooni efektiivsust. Seda kinnitasid varasemad meie laboris<br />
tehtud uuringud, mis näitasid, et nii <strong>viiruse</strong> RNA koopiaarv kui ka nakatatud rakkudes<br />
vabaneva <strong>viiruse</strong> tiiter on otseses korellatsioonis lutsiferaasi ekspressiooni tasemega<br />
nakataud rakkudes ning et lutsiferaasi ekspressiooni kvantifitseerimine on palju<br />
tundlikum <strong>ja</strong> kiirem meetod viirusinfektsiooni intensiivsuse hindamisel kui vabanenud<br />
<strong>viiruse</strong> tiitri määramine. Peale seda, midmed erinevad varasemad uuringud<br />
(immunofluorestents (IF) <strong>ja</strong> Western blot analüüsid) näitasid, et T7 BHK rakkude<br />
transfektsioon elektroporatsiooni meetodil on väga effektiivne (üldjuhul on saavutatav<br />
efektiivsus kõrgem kui 70%) – tõenäoliselt on vahe tavaliste BHK-21 rakkudega<br />
tingitud sellest, et T7 BHK 21 rakkude puhul ei ole rakkudesse viidud plasmiidilt<br />
toimuvaks <strong>valgu</strong>ekspressiooniks va<strong>ja</strong> plasmiidi transporti raku tuuma.<br />
Järgnevate katsete eesmärgiks oli uurida <strong>mittestruktuurse</strong>te valkude (sh. <strong>nsP2</strong>-e)<br />
eel<strong>valgu</strong> erinevate variantide (metsik-tüüpi või protsessingu suhtes defektsete) mõju<br />
„superinfitseeriva” SFV <strong>ja</strong> SINV infektsioonile. Selleks transfitseeriti rakke T7<br />
promooterit sisaldavate <strong>ja</strong> polüproteiine ekspresseerivate konstruktidega (iga konstrukti<br />
puhul kasutati transfektsiooniks 5 µg DNA-d). Transfekteeritud T7 BHK rakke<br />
kasvatati kuue auguga plaatidel 24 tunni vältel (igas augus oli umbes 1 x 10 6 rakku,<br />
80% konfluentsus) mille järel nakatati rakke SFV-Rluc või SINV-Rluc viirustega 0.01<br />
m.o.i. tingimustel. Rakud lüüsiti valitud a<strong>ja</strong>punktidel <strong>ja</strong> mõõdeti lutsiferaasi aktiivsus.<br />
35
Kõik mõõtmised tehti iga konstrukti <strong>ja</strong> iga a<strong>ja</strong>punkti <strong>ja</strong>oks kahes paralleelis, diagrammi<br />
ehitamiseks kasutati kahe paralleelse mõõtmise keskmist. Katse tulemuste korratavuse<br />
hindamiseks korrati katset kaks korda; mõlemal korral saadi sarnased tulemused.<br />
SFV-RLuc 0.01 m.o.i.<br />
1,0E+09<br />
lutsiferaasi ekspressioon (RLU)<br />
1,0E+08<br />
1,0E+07<br />
1,0E+06<br />
10 h 14 h 18 h<br />
aeg peale nakatamist (h)<br />
T7 kontroll<br />
T7 SFV wt<br />
T7 SFV CA<br />
T7 SINV wt<br />
T7 SINV CA<br />
Diagramm 4. Mittestruktuursete valkude ekspressiooni mõju SFV infektsioonile T7-<br />
BHK rakkudes. Kontrolliks on kasutatud tüh<strong>ja</strong> vektorit mis sisaldab T7<br />
polümeraasi promooterit.<br />
Diagrammidel 4 <strong>ja</strong> 5 toodud andmetest on näha, et SINV polüproteiinide<br />
ekspressioon takistab oodatult SINV infektsiooni <strong>ja</strong>, mõnevõrra üllatuslikult, ka SFV<br />
infektsiooni. Samal a<strong>ja</strong>l oli SFV polüproteiinide ekspressiooni mõju kummalegi <strong>viiruse</strong><br />
replikatsioonile oluliselt väiksem või olematu. Mõnevõrra üllatuslikult olid inhibeerivad<br />
omadused nii SINV wt kui ka mutantsel polüproteiinil, kusjuures wt P1234 inhibeeris<br />
efektiivsemalt SFV replikatsiooni samal a<strong>ja</strong>l kui mutantne polüproteiin mõjutas enam<br />
SINV paljunemist (vahed on küll väikesed, kuid tulemused kordusid mõlemas katses).<br />
36
SINV-Rluc 0.01 m.o.i.<br />
lutsiferaasi ekspressioon (RLU)<br />
1,0E+08<br />
1,0E+07<br />
T7 kontroll<br />
T7 SFV wt<br />
T7 SFV CA<br />
T7 SINV wt<br />
T7 SINV CA<br />
1,0E+06<br />
14 h 18 h 22 h<br />
aeg peale nakatamist (h)<br />
Diagramm 5. Mittestruktuursete valkude mõju SINV infektsioonile T7-BHK rakkudes.<br />
SINV-Rluc infektsiooni jälgimiseks on valitud mõnevõrra hilisemad s<strong>ja</strong>punktid sest<br />
see viirus replitseerub aeglasemalt kui SFV-Rluc. Kontrolliks on kasutatud tüh<strong>ja</strong><br />
vektorit mis sisaldab T7 polümeraasi promooterit<br />
Nende eksperimentide tulemused näitavad, et rakkudes ekspresseeritavad<br />
alfaviiruste <strong>mittestruktuurse</strong>d <strong>valgu</strong>d (sealhulgas ka <strong>nsP2</strong> proteaas) avalduvad<br />
supresseerivat toimet viirusinfektsioonile. Katse tulemuste kontrollimiseks viidi läbi<br />
veel täiendav katse (diagrammid 6 <strong>ja</strong> 7), mille eesmärgiks oli näidata alternatiivse<br />
meetodiga eelmises eksperimendis saadud tulemuste <strong>ja</strong> leitud sõltuvuse paikapidavust.<br />
Selle katse skeem oli sarnane eelmise katsega, ainult et lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmise<br />
asemel koguti valitud a<strong>ja</strong>punktides nakatatud plaatidelt viirus-stokkid, mis pärast<br />
titreeriti. Proovide kogumise a<strong>ja</strong>punktideks valiti eelmise katse tulemuste põh<strong>ja</strong>l SFV-<br />
Rluc <strong>ja</strong>oks 14 tundi <strong>ja</strong> SINV-Rluc <strong>ja</strong>oks 18 tundi peale infektsiooni.<br />
37
SFV-Rluc 0.01 m.o.i., 14 h<br />
1,0E+08<br />
<strong>viiruse</strong> tiiter (PFU)<br />
1,0E+07<br />
1,0E+06<br />
T7 kontroll T7 SFV wt<br />
T7 SFV<br />
CA<br />
T7 SINV<br />
wt<br />
transfekteeritud konstrukt<br />
T7 SINV<br />
CA<br />
Diagramm 6. Kontrollkatse SFV-ga. Mittestruktuursete polüproteiinide ekspressiooni<br />
mõju SFV virionide moodustamisele (vabanenud viirus tiitrile).<br />
Oodatult andsid ka selle katse rakud, mis sisaldasid T7 kontroll-plasmiidi ning ei<br />
ekspresseerunud viiruste polüproteiine, kõige suurema vabanenud <strong>viiruse</strong> saagise. Kui<br />
võrrelda omavahel SFV <strong>ja</strong> SINV polüproteiinide ekspresiooni mõju SFV infektsioonile,<br />
siis oli taas näha, et mõlemad SINV polüproteiinid avaldavad selgelt suuremat<br />
pidurdavat toimet SFV-le kui SFV enda polüproteiinid, mille ekspressioonist tingitud<br />
inhibeeriv efekt oli väiksem. Seega näitas see katse sama seaduspärasust, kui<br />
lutsiferaasi mõõtmisel (<strong>viiruse</strong> replikatsiooni hindamisel) põhinenud katse. Millega see<br />
nähtus on seotud, ei ole aga päris selge. Huvitav on ka polüproteiini avaldatava efekti<br />
sõltuvus temas paikneva <strong>nsP2</strong>-proteaasi aktiivsusest. Ka selles katses on näha, et SFV<br />
polüproteiinidest avaldub suuremat pärsivat toimet SFV infektsioonile CA<br />
mutatsiooniga polüproteiin, SINV polüproteiinidest aga metsik-tüüpi polüproteiin. Kuna<br />
SINV infektsiooni puhul on olukord väga sarnane, siis võib järeldada, et CA<br />
mutatsiooniga polüproteiin mõjutab rohkem homoloogilist viirust, kuid vähem<br />
38
heteroloogilist viirust, metsik-tüüpi polüproteiin aga mõjutab rohkem heteroloogilist<br />
viirust. See võib viidata sellele, et homoloogilise <strong>ja</strong> heteroloogilise <strong>viiruse</strong> infektsioone<br />
tõkestab polüproteiinide ekspressioon erinevaid mehhanisme kasutades. Peale selle<br />
kinnitas see analüüs ka ülal toodud järeldust, et SFV polüproteiinid mõjutavad SINV<br />
infektsiooni väga vähe. See tulemus lubab oletada, et SINV polüproteiinidel <strong>ja</strong>/või<br />
nendesse kuuluvatel valkudel on olemas funktsioone, mis SFV valkudel puuduvad või<br />
on väljendunud vähemal määral.<br />
SINV-Rluc 0.01 m.o.i., 18 h<br />
1,0E+09<br />
<strong>viiruse</strong> tiiter (PFU)<br />
1,0E+08<br />
1,0E+07<br />
T7 kontroll T7 SFV w t<br />
T7 SFV<br />
CA<br />
T7 SINV<br />
w t<br />
transfekteeritud konstrukt<br />
T7 SINV<br />
CA<br />
Diagramm 7. Kontrollkatse SINV-ga. Mittestruktuursete valkude mõju SINV<br />
infektsioonile (vananenud <strong>viiruse</strong> tiitrile).<br />
39
ARUTELU<br />
Käesoleva magistritöö eesmärgiks oli selgitada, kas SFV <strong>ja</strong> SINV mittestruktuurne<br />
valk 2 võiks olla seotud superinfektsiooni vältimise mehhanismiga. Püstitatud eesmärgi<br />
saavutamiseks kasutati erinevad <strong>nsP2</strong> sisaldavate plasmiidide transfektsiooni meetodid<br />
ning erinevad <strong>nsP2</strong> sisaldavaid konstrukte eesmärgiga saavutada va<strong>ja</strong>likul hetkel kõrge<br />
<strong>nsP2</strong> ekspressioonitase ning samal a<strong>ja</strong>l vältida <strong>nsP2</strong>-le iseloomuliku tsütotoksilist efekti.<br />
Vaatamata mitmetele kasutatud lähenemistele tuleb konstateerida, et täiel määral seda<br />
eesmärki saavutada ei õnnestunud. Selle põhjustena võib tuua puht-tehnilisi as<strong>ja</strong>olusid,<br />
näiteks oli ekspresseeritava <strong>valgu</strong> ekspressioon Tet-On süsteemis oluliselt vähem<br />
reguleeritav kui seda väitis süsteemi väl<strong>ja</strong>tööta<strong>ja</strong> Clontech; samuti oli väga raske<br />
saavutada elektroporatsiooniga piisavalt kõrget transfektsiooni efektiivsust<br />
(lipofektsiooni kasutamine rakkudes, mida järgnevalt infitseeritakse SFV-ga pole aga<br />
soovitatav, sest transfektsiooni reagendi koostisesse kuuluvad lipiidid mõjutavad<br />
alfa<strong>viiruse</strong> replikatsiooni <strong>ja</strong> paljunemist). Teiseks oluliseks põhuseks on <strong>nsP2</strong><br />
omadused – tema mittespetsiifiline tsütotoksiline efekt võib mõjutada raku elutegevust<br />
<strong>ja</strong> selle kaudu igasuguste (ka alfaviiruste perekonda mittekuuluvate viiruste)<br />
replikatsiooni. Katsed seda tsütotoksilist efekti vähendada ei olnud samuti piisavalt<br />
edukad: RDR mutatsiooni sisaldavat <strong>nsP2</strong> proteaasi ekspresseerivate plasmiide viimine<br />
rakkudesse ei andnud mingit kaitset alfa<strong>viiruse</strong> infektsiooni vastu <strong>ja</strong> <strong>viiruse</strong>d paljunesid<br />
peaaegu võrdse efektiivsusega nii seda valku ekspresseerivates rakkudes kui ka<br />
kontrollrakkudes.<br />
Teise katsestrateegiana oli luua <strong>nsP2</strong> valku ekspresseeriv rakuliin. See võimaldaks<br />
ilma suure stressita käivitada rakkudes poreeritud vastusplasmiidis sisalduva <strong>nsP2</strong><br />
proteaasi geeni ekspressiooni, mis toimuks vastusena antibiootikumi lisamisele<br />
söötmele. Selle skeemi rakendamine põrkus aga kokku kahe takistusega. Esiteks, nagu<br />
juba mainitud, oli parima leitud klooni basaalse <strong>ja</strong> indutseeritud geeni ekspressiooni<br />
tasemete erinevus väga kaugel ideaalsest (<strong>ja</strong> toot<strong>ja</strong> poolt reklaamitust), täpsemalt oli<br />
basaalne ekspressiooni tase lubamatult suur, mis võis lubada soovimatut proteaasi<br />
ekspressiooni <strong>ja</strong> mõjutada negatiivselt proteaasi ekspresseerivaid rakke. Teiseks oli<br />
vastusplasmiidi transfektsiooni meetod ebaefektiivne ning seetõttu on tõenäoline, et<br />
40
<strong>viiruse</strong> infektsioon kulges peamiselt (kui mitte eranditult) just mittetrasfekteeritud<br />
rakkudes. Nende takistuste mõju tõttu on selle katse tulemustest näha, et taas ei sõltunud<br />
kummagi kasutatud <strong>viiruse</strong> infektsiooni efektiivsus sellest, kas <strong>nsP2</strong> ekspressioon oli<br />
rakkudes on indutseeritud või mitte.<br />
Kas nende katsete tulemustest võib järeldada, et <strong>nsP2</strong> ei ole individuaalse <strong>valgu</strong>na<br />
võimeline superinfektsiooni takistama? Ülal mainitud tehniliste <strong>ja</strong> bioloogiliste<br />
probleemide tõttu seda täie kindlusega väita ei saa. Siiski on tähelepanuväärne, et<br />
erinevad lähenemised andsid sama tulemuse. Positiivselt transfitseeritud rakkude<br />
eraldamine rakusorteriga enne <strong>viiruse</strong>ga nakatamist ei võimaldanud tuvastada mingit<br />
„kaitsvat” efekti – pigem oli tulemus vastupidine. Kui <strong>nsP2</strong> oleks efektiivne<br />
superinfektsiooni blokeeriv valk, siis oleks võinud eeldada, vähemalt mingisugust<br />
<strong>viiruse</strong> infektsiooni vähenemist, mida aga ei täheldatud. Seega on loogiline järeldada, et<br />
<strong>nsP2</strong> ei ole (täpsemalt, <strong>nsP2</strong>-RDR <strong>ja</strong> <strong>nsP2</strong>-RDR-EGFP) võimeline olulisel määral<br />
superinfektsiooni blokeerima.<br />
Kas see tähendab, et varasemad, kir<strong>ja</strong>nduses väl<strong>ja</strong> toodud oletused, olid väärad?<br />
Mitte ilmtingimata – see, et <strong>nsP2</strong> üksinda <strong>ja</strong> kunstlikes tingimustes ei suuda<br />
superinfektsiooni blokeerida ei välista võimalust, et ta suudab seda teha loomuliku<br />
infektsiooni kontekstis, olles üheks (või isegi peamiseks) superinfektsiooni blokeeri<strong>ja</strong>ks.<br />
Kaudselt kinnitavad seda võimalust ka siin töös toodud andmed, mis saadi<br />
alternatiivseid lähenemisi kasutades. Kogu SFV või SINV <strong>mittestruktuurse</strong>te valkude<br />
blokki ekspresseerivate plasmiide transfektsioon <strong>ja</strong> nende kodeeritavate valkude<br />
ekspressioon otse tsütoplasmas toimuvat transkriptsiooni kasutades andis huvitavaid,<br />
ehkki ootamatuid, tulemusi. Nimelt näitasid need katsed, et rakud, mis toodavad SINV<br />
<strong>mittestruktuurse</strong>id valke, omavad märgatavat resistentsust nii SFV kui ka SINV<br />
infektsioonide suhtes. Peale selle, sellist efekti omasid nii metsik-tüüpi polüproteiin, kui<br />
ka CA mutatsiooni sisaldav polüproteiin. Huvitav oli see, et CA mutatsiooniga<br />
polüproteiin mõjutab enam homoloogilist viirust, kuid vähem heteroloogilist viirust,<br />
metsik-tüüpi polüproteiin aga vastupidi.<br />
Millest need erinevused võivad tuleneda? Miks on CA polüproteiin võimeline<br />
inhibeerima homoloogilist viirust? Täpseid andmeid selle kohta meil ei ole, kuid võib<br />
püstitada mitmesuguseid oletusi. Kui <strong>nsP2</strong> proteaasi sisaldavate polüproteiinide<br />
41
katalüütilises tsüsteiinijäägis asuv mutatsioon blokeerib täielikult polüproteiini<br />
autokatalüütilised lõikamised, siis tähendab see seda, et selline polüproteiin paikneb<br />
rakkudes lõikamata olekus ning teoreetiliselt iseenest ta ei pea takistama<br />
superinfitseeriva <strong>viiruse</strong> infektsiooni. Kui aga rakus sisalduvad ka superinfitseeriva<br />
<strong>viiruse</strong> toodetud metsik-tüüpi polüproteiinid, siis in trans toimuva proteolüütilise<br />
lõikamise tulemusena moodustub P12CA34 <strong>valgu</strong>st P12 polüproteiin, nsP3 <strong>ja</strong> nsP4<br />
<strong>valgu</strong>d. P12 edasist lõikamist ei toimu (sest see nõuab proteaasi olemasolu in cis) <strong>ja</strong> see<br />
valk koguneb rakku. Seega on teoreetiliselt võimalik, et P12 mitteprotsessitav liitvalk<br />
takistabki superinfitseeriva <strong>viiruse</strong> paljunemist. Selle teooria nõrgaks kohaks on as<strong>ja</strong>olu,<br />
et normaalses alfa<strong>viiruse</strong> infektsioonis protsessimata P12 liitvalku ei kogune <strong>ja</strong> seega ei<br />
saa P12 olla peamiseks faktoriks, mis takistab looduslikku superinfektsiooni. Erinevalt<br />
P12-st on vabad (replikatsiooni kompleksi mittekuuluvad) nsP3 <strong>ja</strong> nsP4 <strong>valgu</strong>d<br />
iseloomulikud ka loomulikule SFV infektsioonile (eriti selle lõppstaadiumitele; SINV<br />
puhul jäävad nad P34 liit<strong>valgu</strong>ks), kuid kas <strong>ja</strong> millisel viisil nad takistavad<br />
superinfektsiooni toimumist ei ole selge. Alternatiivne oletus on, et lõpuni<br />
mitteprotsessitavate defektsete polüproteiinide olemasolu rakus takistab<br />
superinfitseeriva <strong>viiruse</strong> infektsioonitsükli regulatsiooni, nt. subgenoomse RNA sünteesi<br />
aktiveerimist. Selle saavutamiseks peavad kõik <strong>viiruse</strong> polüproteiinid olema lahti<br />
lõigatud, mida antud katse tingimustes ei toimu: rakku jäävad muteeritud polüproteiinid.<br />
Samas ei selgita see teooria superinfektsiooni bloki toimumist loomulikus<br />
viirusinfektsioonis, mille puhul kumbki viirustest, ei esmaselt nakatav ega<br />
superinfitseeriv viirus ei ole mutantne <strong>ja</strong> toodab ainult „normaalseid“ replikaasivalke.<br />
Miks takistab SINV P1234 SFV replikatsiooni? On võimalik, et erinevalt SFV<br />
<strong>nsP2</strong>-st on SINV <strong>nsP2</strong>, mis moodustub polüproteiini protsessingul võimeline lõikama<br />
superinfitseeruva <strong>viiruse</strong> polüproteiine ning takistama selle <strong>viiruse</strong> primaarsete<br />
replikatsioonikopleksite (RCmiinus) formeerumist <strong>ja</strong> genoomi replitseerumist. Selleks,<br />
et selgitada väl<strong>ja</strong> selle protsessi täpne mehhanism <strong>ja</strong> teha kindlaks, miks inhibeerimine<br />
ei toimu vastupidises suunas (st. miks SFVP1234 ekspressioon peaaegu ei mõjuta SINV<br />
infektsiooni) on va<strong>ja</strong> teha veel täiendavad katsed <strong>ja</strong> uuringud.<br />
Kokkuvõtlikult võib öelda, et selle uurimustöö raamides läbiviidud katsed ei<br />
andnud piisavalt selgeid tulemusi ning superinfektsiooni vältimise nähtus nõuab veel<br />
42
uurimist. Edasiste katsete teostamisel tuleb leida uued lähenemised <strong>ja</strong> võimalused,<br />
kuidas endiseid probleeme vältida <strong>ja</strong> edu saavutada. Üheks heaks võimaluseks oleks<br />
kasutada alfaviirusi, mille <strong>nsP2</strong> proteaas pole imeta<strong>ja</strong>rakkudele toksiline, näiteks VEEV<br />
(Venetsueela hobuste entsefalomüeliidi viirus, Venezuelan equine encephalomyelitis<br />
virus) või EEEV (Ida hobuste entsefaliidi viirus, Eastern equine encephalitis virus).<br />
Nende viiruste <strong>nsP2</strong> proteaasi T7 promooteri vahendusel ekspresseerivaid konstrukte<br />
võiks kasutada T7 BHK rakkudes. See strateegia võimaldab saavutada kõrge<br />
transfektsiooni efektiivsuse, samas garanteerib tsütotosilise funktsiooni puudumine<br />
VEEV <strong>nsP2</strong> selle, et rakud, mis ekspresseerivad <strong>nsP2</strong> proteaasi, ei ole juba enne<br />
superinfitseeriva <strong>viiruse</strong> sisenemist proteaasiga kahjustatud. Samuti võimaldaks<br />
mittetsütotoksilise <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong> kasutamine konstrueerida stabiilseid (sh. indutseritavaid)<br />
rakuliine. Selle lähenemise probleemiks on as<strong>ja</strong>olu, et VEEV on SFV <strong>ja</strong> SIN suhtes<br />
süstemaatiliselt kaugel paiknev alfaviirus, mille infektsioon (<strong>ja</strong> tõenäoliselt ka <strong>nsP2</strong><br />
ekspressioon) ei takista superinfitseeriva <strong>viiruse</strong>na Renilla lutsiferaasi ekspresseerivate<br />
SFV <strong>ja</strong> SINV, mis näitasid end väga hästi käesoleva magistritöö katsetes, paljunemist.<br />
Va<strong>ja</strong> oleks kasutada analoogilisi VEEV konstrukte, kuid siin on kaks probleemi:<br />
selliseid reporter <strong>viiruse</strong>id pole VEEV puhul tehtud <strong>ja</strong>, mis on eriti probleemne, VEEV<br />
on BSL3 (mõnedes kvalifikatsioonides isegi BSL4) taseme patogeen, millega töötamine<br />
nõuab vastava taseme bio-ohutuse labori kasutamist.<br />
Teise variandina, kuidas võiks uurida superinfektsiooni vältimise nähtust <strong>ja</strong> samal<br />
a<strong>ja</strong>l vältida <strong>nsP2</strong> tsütotoksilisusest tulenevaid probleeme, võiks pakkuda putukarakkude<br />
kasutamist, sest putukarakkudes pole <strong>nsP2</strong> tsütotoktiline. See variant tundub olema väga<br />
loomulik, sest <strong>viiruse</strong>d on evolutsiooni käigus väl<strong>ja</strong> kujundatud mehhanisme, mille abil<br />
nad saavad putukarakkudes paljuneda ilma neid rakke kahjustamata. Seega võiksid<br />
putukarakud olla väga heaks mudelsüsteemiks. Probleemiks on aga jälle kõrge<br />
transfektsiooni efektiivsuse saavutamises. Putukarakke on elektroporatsiooni meetodidl<br />
väga raske transfekteerida: eelkatsed näitasid, et selle meetodi kasutamine annab<br />
sedavõrd väga vähe positiivseid rakke, nende rakkude kasutamine superinfektsiooni<br />
vältimise katsetes on peaaegu võimatu. Samas ei eksisteeri moskiitorakkude liini, mis<br />
ekspresseeriks T7 polümeraasi, et saaks kasutada seda strateegiat, mis andis häid<br />
tulemusi BHK rakkude puhul. Täiendavaks probleemiks on RNA-interferents:<br />
43
putukarakkudest on lihtne teha püsiliine (sh. <strong>nsP2</strong> ekspressiooni <strong>ja</strong>oks), kuid reeglina ei<br />
toimu nendes rakkudes (ehkki nende genoom sisaldab integreerunud võõrgeeni)<br />
võõr<strong>valgu</strong> ekspressiooni – see on maha surutud selle mRNA vastu suunatud RNAi<br />
poolt. Seega putukarakkude <strong>ja</strong>oks tuleb veel otsida sobivat transfektsiooni meetodit<br />
(mitmesugused lipiididel põhinevad süsteemid on paljulubavad, ehkki nende<br />
kasutamine per se võib mõjutada alfa<strong>viiruse</strong> infektsiooni transfitseeritud rakkudes) ning<br />
konstrueerida selle meetodi <strong>ja</strong>oks sobivaid konstrukte. Igal juhul võib seda lähenemist<br />
pidada ratsionaalsemaks, kui VEEV <strong>nsP2</strong> proteaasi kasutamist <strong>ja</strong>/või uute<br />
imeta<strong>ja</strong>rakkudel põhinevate süsteemide konstrueerimist.<br />
Millised oleksid võimalused takistada <strong>viiruse</strong> levikut superinfektsiooni takistamise<br />
mehhanisme kasutades? Kahjuks jäid käesolevas töös läbiviidud katsete tulemused<br />
sellisteks, et ei näidanud otsest võimalust selle eesmärgi saavutamiseks. Siiski võib<br />
lõpetuseks väl<strong>ja</strong> pakkuda mõned üldised ideed. Kui tulevaste katsete abil õnnestub<br />
selgitada, missugune mittestruktuurne valk või valkude kombinatsioon vastutab<br />
superinfektsiooni vältimise eest, siis saaks konstrueerida viiruspartiklid või kunstlikud<br />
<strong>viiruse</strong>d, mis ise ekspresseeriksid seda kaitsevalku või sisaldaksid vastavate valkude<br />
ekspressiooniks va<strong>ja</strong>like geene, mida saaks putukarakkude genoomi sisse viia, nagu see<br />
toimub geeniteraapia puhul või geneetiliselt modifitseeritud taimede loomisel, mis<br />
omavad selle abil resistentsust parasiidide vastu. Nende kuntlike viirustega võiks<br />
nakatada putukate populatsiooni. Siin võib rakendada kahte strateegiat. Esimese<br />
strateegia puhul sisaldavad saadud geneetiliselt modifitseeritud putukud oma geenides<br />
kaitsevalke inserteeritud kujul, teise strateegia puhul on aga putukad persistentselt<br />
infitseeritud kunstliku <strong>viiruse</strong>ga, mis toodab kaitsevalke kogu putukaelu vältel. Mõlemal<br />
juhul hakkavad need putukad omama resistentsust superinfitseetivate alfaviiruste suhtes<br />
ning takistavad selle kaudu alfaviiruste levikut. Siinkohal tuleb veel aga lahendada<br />
paljusid tehnilisi <strong>ja</strong> bio-ohutusega seotud probleeme. Tuleb näidata, et kunstlikud<br />
<strong>viiruse</strong>d on inimeste <strong>ja</strong>oks ohutud, et nad saavad nakatada ainult putukaid ning et<br />
putukaorganismis nakatavad nad neid rakke, mis on märklaudrakkudes ka metsikalfaviiruste<br />
<strong>ja</strong>oks. See muudab selle lähenemise keeruliseks. Alternatiivsete<br />
võimalustena võivad arvesse tulla superinfektsiooni blokeerimise mehhanismi<br />
mimikreerivad madalamolekulaarsed ühendid (nt. peptiidid), mille sisseviimine putuka<br />
44
organismi blokeerib seal alfa<strong>viiruse</strong> infektsiooni. Tõenäoliseks probleemiks on siin<br />
selliste ühendite maksumus, mis muudab nende kasutamise kalliks.<br />
Kõikide nende mitmekülgsete lähenemist <strong>ja</strong> seni veel lahendamata alusuuringute<br />
valdkonda kuuluvate ülesannete lahendamine võiks anda alguspunkte veel paljudele <strong>ja</strong><br />
paljudele uurimistöödele; ka on va<strong>ja</strong>likud ulatuslikud rakenduslikud uuringud. Siiski<br />
olen arvamusel, et kunagi tulevikus võib putukate kaitsmine <strong>ja</strong> sellel teel inimesele<br />
ohtike viiruste levimise takistamine superinfektsiooni vältimise mehhanismi abil saada<br />
reaalsuseks.<br />
45
KOKKUVÕTE<br />
Superinfektsiooni vältimise nähtus on viiruste maailmas laialt levinud. Tänaseks<br />
on avastatud erinevaid mehhanisme, mille abil üks või teine viirus seda teostab. Nende<br />
mehhanismide uurimine võiks olla väga perspektiivne uurimissuund eriti seoses uute<br />
potentsiaalsete viirus-vastaste ravimite sihtmärkide otsimisega.<br />
Käesoleva magistritöö teoreetilises osas on kirjeldatud praegusel a<strong>ja</strong>l käibel<br />
olevat teooriat, mille järgi võiks alfaviiruste superinfektsiooni vältimise mehhanismis<br />
osaleda või isegi olla selle mehhanismi peamiseks faktoriks alfaviiruste<br />
mittestruktuurne valk kaks. Eeldatakse, et rakus replitseeruva alfa<strong>viiruse</strong> <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong><br />
proteaasne aktiivsus lõikab superinfitseeruva <strong>viiruse</strong> replikaasi polüproteiini enneagselt<br />
(või valest kohast), blokeerides selle kaudu teisena rakku sisenenud <strong>viiruse</strong><br />
replikatsiooni.<br />
Töö eksperimentaalse osa eesmärgiks oli näidata, et rakud, mis ekspresseerivad<br />
<strong>nsP2</strong> proteaasi, omavad resistentsust superinfitseeruva <strong>viiruse</strong> suhtes. Samal a<strong>ja</strong>l oli va<strong>ja</strong><br />
kaitsta proteaasi ekspresseerivaid rakke <strong>nsP2</strong>-le iseloomuliku kõrge tsütotoksilisuse<br />
eest. Esialgu prooviti seda ülesannet lahendada ekspresseerides rakkudes RDR<br />
mutatsiooniga <strong>nsP2</strong> proteaasi, teiseks strateegiaks oli konstrueerida proteaasi<br />
ekspresseeriv indutseeritav rakuliin. Paraku ei andnud kumbki nendest lähenemistest<br />
häid tulemusi: ekspresseritava <strong>nsP2</strong>-poolset kaitsvate efekti ei tähendatud, kui kuna<br />
selle puudumist sai seletada tehniliste probleemidega ei võimaldanud need katsed ka<br />
välistada <strong>nsP2</strong> rolli superinfektsiooni blokeeri<strong>ja</strong>na.<br />
Parimaid tulemusi andsid katsed T7 RNA polümeraasi ekspresseerivate BHK-21<br />
rakkudega, mis transkribeerisid tsütoplasmas viiruste metsik-tüüpi ning CA<br />
mutatsiooniga polüproteiine ekspresseerivaid plasmiide. Need katsed näitasid, et<br />
rakkudes ekspresseeritavad <strong>nsP2</strong> valku sisaldavad polüproteiinid võivad tõepoolest<br />
superinfitseeruva <strong>viiruse</strong> paljunemist maha suruda, kusjuures SINV polüproteiinid<br />
avaldasid suuremat mõju nii SINV kui ka SFV infektsioonidele. Leiti ka väga huvitav<br />
sõltuvus: CA mutatsiooniga polüproteiinid mõjutasid enam homoloogilise <strong>viiruse</strong> ning<br />
metsik-tüüpi polüproteiinid rohkem heteroloogilise <strong>viiruse</strong> paljunemist. Selle nähtuse<br />
põhjus ei ole selge, kuid sellised erinevused võivad viidata erinevatele<br />
46
toimehhanismidele, mille kaudu viiruste polüproteiinid toimivad homoloogilise <strong>ja</strong><br />
heteroloogilise superinfektsiooni korral. Lisaks järeldub saadud tulemustest, et <strong>nsP2</strong><br />
proteaas võib olla pole ainus valk, mis osaleb alfaviiruste superinfektsiooni vältimise<br />
nähtuses.<br />
47
SUMMARY<br />
Influence of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus and <strong>Sindbis</strong> virus nonstructural<br />
protein <strong>nsP2</strong> on a superinfection<br />
Marina Shunina<br />
The superinfection exclusion is the phenomenon inherent for many<br />
systematically different viruses. Nowadays mechanisms of the superinfection exclusion<br />
are known for several, but not for all, these viruses. At the same time the analysis of<br />
these mechanisms represents perspective direction of a research since information about<br />
mechanisms of superinfection exclusion can lead to identification of novel mechanisms<br />
of action for new potential antivirals.<br />
In a theoretical part of this work the current theory according to which the key<br />
role in the mechanism of the superinfection exclusion of alphaviruses is attributed to the<br />
nonstructural protein 2 (<strong>nsP2</strong>) is described. The theory is based on assumption that the<br />
«free» <strong>nsP2</strong> protease, being expressed in infected cell by the first incoming alfavirus,<br />
will process a ns-polyprotein of super-infecting virus using alternative pathway which<br />
interferes with formation of early replicase and thus with full infection cycle of the<br />
superinfecting virus.<br />
The initial purpose of an experimental part of this work was to demonstrate that<br />
cells, which express <strong>nsP2</strong> protease, possess resistance to the superinfecting virus. At the<br />
same time it was necessary to protect these cells from a strong cytopathogenic effects<br />
characteristic for <strong>nsP2</strong> expression. For this purpose the <strong>nsP2</strong> with RDR mutation was<br />
used and construction of cell-line, expressing <strong>nsP2</strong> induceable manner, was attempted.<br />
Unfortunately neither of these approaches resulted in distinctive results: the protective<br />
effect of <strong>nsP2</strong> was not detected, however this could be attributed to technical problems<br />
and thus it was not possible to rule out the role of <strong>nsP2</strong> in superinfection exclusion<br />
either.<br />
Better results were obtained in experiments using line of BHK cells containing<br />
T7 RNA polymerase which allows these cells to transcribe constructs encoding wildtype<br />
and mutated polyproteins (which did contain mutation inactivating <strong>nsP2</strong> protease –<br />
48
the CA mutation) in the cytoplasm. This experiments revealed that both native and<br />
mutant polyproteins influenced subsequent <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus (SFV) and <strong>Sindbis</strong><br />
virus (SINV) infections; expression of SINV polyproteins reproducibly had bigger<br />
impact on both viruses. Additionally an interesting correlation was observed: the<br />
polyprotein with the CA mutation always influenced the replication of homologous<br />
virus in bigger extent than that of heterologous virus; at the same time the expression of<br />
wild-type polyprotein influenced more the replication of heterologous virus. These<br />
reasons for these results are not understood yet, however this data indicates that viral<br />
polyproteins may use different mechanisms of action to interfere with infection by<br />
homologous or heterologous viruses. It can also be suggested that most probably <strong>nsP2</strong> is<br />
not the only factor involved in the mechanism of superinfection exclusion in case of<br />
alphaviruses.<br />
49
LISA<br />
Joonis 6. pTet-On – rtTA valku kodeeriv regulatoorne plasmiid (joonise<br />
päritolu: Tet-Off® and Tet-On® Gene Expression Systems User Manual, 2005).<br />
50
Joonis 7. pTRE-Tight vastusplasmiid, kuhu multikloneerimissaiti (MCS) on<br />
kloneeritud Rluc järjestus (pTRE-Tight-Rluc vastusplasmiidi puhul) või <strong>nsP2</strong> <strong>valgu</strong> järjestus<br />
(pTRE-Tight-<strong>nsP2</strong> vastusplasmiidi puhul) (joonise päritolu: Tet-Off® and Tet-On® Gene<br />
Expression Systems User Manual, 2005).<br />
51
KASUTATUD KIRJANDUS<br />
Barton, D. J., S. G. Sawicki, and D. L. Sawicki. 1991. Solubilization and<br />
immunoprecipitation of alphavirus replication complexes. J. Virol. 65:1496-1506.<br />
Buchholz, U. J., Finke, S. and Conzelmann, K.-K. 1999. Generation of bovine<br />
respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus<br />
replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional<br />
BRSV genome promoter. J. Virol. 73:251–259.<br />
de Groot, R. J., W. R. Hardy, Y. Shirako, and J. H. Strauss. 1990. Cleavage-site<br />
preferences of <strong>Sindbis</strong> virus polyproteins containing the nonstructural proteinase:<br />
evidence for temporal regulation of polyprotein processing in vivo. EMBO J. 9:2631-<br />
2638.<br />
de Groot, R. J., T. Rumenapf, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, and J. H. Strauss. 1991.<br />
<strong>Sindbis</strong> virus RNA polymerase is degraded by the N-end rule pathway. Proc. Natl.<br />
Acad. Sci. USA 88:8967-8971.<br />
Dryga, S. A., Dryga, O. A. and Schlesinger, S. 1997. Identification of mutations<br />
in a <strong>Sindbis</strong> virus variant able to establish persistent infection in BHK cells: the<br />
importance of a mutation in the <strong>nsP2</strong> gene. Virology 228:74-83.<br />
Ehrengruber, M. U., Goldin, A. L. 2007. <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus vectors with<br />
mutations in the nonstructural protein 2 gene permit extended superinfection of<br />
neuronal and non-neuronal cells. J. Neurovirol. 13(4):353-363.<br />
Fazakerley, J. K., Boyd, A., Mikkola, M. L. and Kääriäinen, L. 2002. A single<br />
amino acid change in the nuclear localization sequence of the <strong>nsP2</strong> protein affects the<br />
neurovirulence of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus. J. Virol. 76:392-396.<br />
Frolova, E. I., R. Z. Fayzulin, S. H. Cook, D. E. Griffin, C. M. Rice, and I.<br />
Frolov. 2002. Roles of nonstructural protein <strong>nsP2</strong> and alpha/beta interferons in<br />
determining the outcome of <strong>Sindbis</strong> virus infection. J. Virol. 76:11254-11264.<br />
Garoff, H., Simons, K. and Dobberstein, B. 1978. Assembly of the <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong><br />
virus membrane glycoproteins in the membrane of the endoplasmic reticulum in vitro.<br />
J. Mol. Biol. 124:587-600.<br />
52
Garoff, H., Huylebroeck, D., Robinson, A., Tillman, U. and Liljeström, P. 1990.<br />
The signal sequence of the p62 protein of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus is involved in initiation<br />
but not in completing chain translocation. J. Cell Biol. 111:867-876.<br />
Gorbalenya, A. E., E. V. Koonin, A. P. Donchenko, and V. M. Blinov. 1988. A<br />
conserved NTP-binding motif in putative helicases. Nature (London) 333:22.<br />
Gorbalenya, A. E., E. V. Koonin, and Y. I. Wolf. 1990. A new superfamily of<br />
putative NTP-binding domains encoded by genomes of small DNA and RNA viruses.<br />
FEBS Lett. 262:145-148.<br />
Gorchakov, R., Garmashova, N., Frolova, E., Frolov, I. 2008. Different Types of<br />
nsP3-Containing Protein Complexes in <strong>Sindbis</strong> Virus-Infected Cells. J. Virol. 82:10088-<br />
10101.<br />
Griffin, D. E. 2006. Alphaviruses. In Fields Virology. 5th Edition. Volume one.<br />
D. M. Knipe and P. M. Howley, eds. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins.<br />
pp. 1023–1060.<br />
Hahn, Y. S., E. G. Strauss, and J. H. Strauss. 1989. Mapping of RNAtemperature-sensitive<br />
mutants of <strong>Sindbis</strong> virus: assignment of complementation groups<br />
A, B, and G to nonstructural proteins. J. Virol. 63:3142-3150.<br />
Helenius, A., Kartenbeck, J., Simons, K., Fries, E. 1980. On the entry of <strong>Semliki</strong><br />
<strong>Forest</strong> virus into BHK-21 cells. J. Cell Biol. 84:404-420.<br />
Hodgman, T. C. 1988. A new superfamily of replicative proteins. Nature<br />
(London) 333:22-23.<br />
Hong, E. M., Perera, R., Kuhn, R. J. 2006. Alphavirus capsid protein helix I<br />
controls a checkpoint in nucleocapsid core assembly. J. Virol. 80:8848-8855.<br />
Karpf, A. R., Lenches, E., Strauss, E. G., Strauss, J. H., Brown, D. T. 1997.<br />
Superinfection exclusion of alphaviruses in three mosquito cell lines persistently<br />
infected with <strong>Sindbis</strong> virus. J Virol 71:7119–7123.<br />
Kääriäinen, L. and Ahola, T. 2002. Functions of alphavirus nonstructural<br />
proteins in RNA replication. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 71:187-222.<br />
Lemm, J. A., and C. M. Rice. 1993. Roles of nonstructural polyproteins and<br />
cleavage products in regulating <strong>Sindbis</strong> virus RNA replication and transcription. J.<br />
Virol. 67:1916-1926.<br />
53
Lemm, J. A., T. Rumenapf, E. G. Strauss, J. H. Strauss, and C. M. Rice. 1994.<br />
Polypeptide requirements for assembly of functional <strong>Sindbis</strong> virus replication<br />
complexes: a model for the temporal regulation of minus-strand and plus-strand RNAsynthesis.<br />
EMBO J. 13:2925-2934.<br />
Levine, B., Huang, Q., Isaacs, J. T., Reed, J. C., Griffin, D. E., Hardwick, J. M.<br />
1993. Conversion of lytic to persistent alphavirus infection by the bcl-2 cellular<br />
oncogene. Nature 361:739–742.<br />
Liljeström, P. and Garoff, H. 1991. Internally located cleavable signal sequences<br />
direct the formation of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus membrane proteins from a polyprotein<br />
precursor. J. Virol. 65:147-154.<br />
Liljeström, P., Lusa, S., Huylebroeck, D. and Garoff, H. 1991. In vitro<br />
mutagenesis of a full-length cDNA clone of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus: the small 6,000-<br />
molecular-weight membrane protein modulates virus release. J. Virol. 65:4107-4113.<br />
Loewy, A., Smyth, J., von Bonsdorff, C. H., Liljeström, P. and Schlesinger, M. J.<br />
1995. The 6-kilodalton membrane protein of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus is involved in the<br />
budding process. J. Virol. 69:469-475.<br />
Lulla, V. 2007. Replikation strategies and applications of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus.<br />
Dissertation.<br />
Lulla, V., Sawicki, D. L., Sawicki, S. G., Lulla, A., Merits, A., Ahola, T. 2008.<br />
Molecular defects caused by temperature-sensitive mutations in <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus<br />
nsP1. J. Virol. 82(18):9236 - 9244.<br />
Mackenzie, J. S., Lindsay, M. D., Coelen, R. J., Broom, A. K. et al. 1994.<br />
Arboviruses causing human disease in the Australasian zoogeographic region. Arch.<br />
Virol. 136:447-467.<br />
Marsh, M. and Helenius, A. 1989. Virus entry into animal cells. Adv. Virus Res.<br />
36:107-151.<br />
McInerney, G. M., Smit, J. M., Liljeström, P. and Wilschut, J. 2004. <strong>Semliki</strong><br />
<strong>Forest</strong> virus produced in the absence of the 6K protein has an altered spike structure as<br />
revealed by decreased membrane fusion capacity. Virology. 325:200-206.<br />
54
Melancon, P. and Garoff, H. 1986. Reinitiation of translocation in the <strong>Semliki</strong><br />
<strong>Forest</strong> virus structural polyprotein: identification of the signal for the E1 glycoprotein.<br />
EMBO J. 5:1551-1560.<br />
Melancon, P. and Garoff, H. 1987. Processing of the <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus<br />
structural polyprotein: role of the capsid protease. J. Virol. 61:1301-1309.<br />
Merits, A., Vasiljeva, L., Ahola, T., Kääriäinen, L. and Auvinen, P. 2001.<br />
Proteolytic processing of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus-specific non-structural polyprotein by<br />
<strong>nsP2</strong> protease. J. Gen. Virol. 82:765-773.<br />
Peranen, J., M. Rikkonen, P. Lilestrom, and L. Kiiariainen. 1990. Nuclear<br />
localization of the <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus-specific nonstructural protein <strong>nsP2</strong>. J. Virol.<br />
64:1888-1896.<br />
Perri, S., Driver, D. A., Gardner, J. P., Sherrill, S., Belli, B. A., Dubensky, T. W.,<br />
Jr. and Polo, J. M. 2000. Replicon vectors derived from <strong>Sindbis</strong> virus and <strong>Semliki</strong><br />
<strong>Forest</strong> virus that establish persistent replication in host cells. J. Virol. 74:9802-9807.<br />
Pesonen, M. and Kääriäinen, L. 1982. Incomplete complex oligosaccharides in<br />
<strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus envelope proteins arrested within the cell in the presence of<br />
monensin. J. Mol. Biol. 158:213-230.<br />
Raghow, R. S., Grace, T. D., Filshie, B. K., Bartley, W., Dalgarno, L. 1973. Ross<br />
River virus replication in cultured mosquito and mammalian cells: virus growth and<br />
correlated ultrastructural changes. J Gen Virol. 21:109–122.<br />
Rikkonen, M., J. Peranen, and L. Kaariainen. 1992. Nuclear and nucleolar<br />
targeting signals of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus nonstructural protein <strong>nsP2</strong>. Virology 189:462-<br />
473.<br />
Rubach, J. K., Wasik, B. R., Rupp, J. C., Kuhn, R. J., Hardy, R. W., Smith, J. L.<br />
2009. Characterization of purified <strong>Sindbis</strong> virus nsP4 RNA-dependent RNA polymerase<br />
activity in vitro. Virology 384(1):201-208.<br />
Sawicki, D. L., S. G. Sawicki, S. Keranen, and L. Kiarialinen. 1981. Specific<br />
<strong>Sindbis</strong> virus coded function for minus-strand RNA synthesis. J. Virol. 39:348-358.<br />
Sawicki, S. G., D. L. Sawicki, L. Kiiariainen, and S. Keranen. 1981. A <strong>Sindbis</strong><br />
virus mutant temperature-sensitive in the regulation of minus-strand RNA synthesis.<br />
Virology 115:161-172.<br />
55
Sawicki, D. L., and S. G. Sawicki. 1985. Functional analysis of the A<br />
complementation group mutants of <strong>Sindbis</strong> HR virus. Virology 144:20-34.<br />
Sawicki, D. L., and S. G. Sawicki. 1993. A second nonstructural protein<br />
functions in the regulation of alphavirus negative-strand RNA synthesis. J. Virol.<br />
67:3605-3610.<br />
Shirako, Y., and J. H. Strauss. 1994. Regulation of <strong>Sindbis</strong> virus RNA<br />
replication: uncleaved P123 and nsP4 function in minus strand RNA synthesis whereas<br />
cleaved products from P123 are required for efficient plus strand RNA synthesis. J.<br />
Virol. 68:1874-1885.<br />
Smithburn, K. C., Haddow, A. J. 1944. <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus. I. Isolation and<br />
pathogenic properties. J Immunol. 49:141–157.<br />
Stollar, V. and Shenk, T. E. 1973. Homologous Viral Interference in Aedes<br />
albopictus Cultures Chronically Infected with <strong>Sindbis</strong> Virus. J. Virol. 11(4):592–595.<br />
Strauss, E. G., C. M. Rice, and J. H. Strauss. 1983. Sequence coding for the<br />
alphavirus nonstructural proteins is interrupted by an opal termination codon. Proc.<br />
Natl. Acad. Sci. USA 80:5271-5275.<br />
Strauss, J. H. and Strauss, E. G. 1994. The Alphaviruses: gene expression,<br />
replication and evolution. Microbiol. Rev. 58(3):491-562.<br />
Takkinen, K., J. Peranen, and L. Kiaarifiinen. 1991. Proteolytic processing of<br />
<strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus-specific non-structural polyprotein. J. Gen. Virol. 72:1627-1633.<br />
Tamberg, N., Lulla, V., Fragkoudis, R., Lulla, A., Fazakerley, J. K. and Merits,<br />
A. 2007. Insertion of EGFP into the replicase gene of <strong>Semliki</strong> <strong>Forest</strong> virus results in a<br />
novel, genetically stable marker virus. J. Gen. Virol. 88:1225–1230.<br />
Taylor, R. M., H. S. Hurlbut, T. H. Work, J. R. Kingsbury and T. E. Frothingham.<br />
1955. <strong>Sindbis</strong> virus: A newly recognized arthropod-transmitted virus. Am. J. Trop.<br />
Med. Hyg. 4:844-846.<br />
Tomar, S., Hardy, R. W., Smith, J. L., Kuhn, R. J. 2006. Catalytic Core of<br />
Alphavirus Nonstructural Protein nsP4 Possesses Terminal Adenylyltransferase<br />
Activity. J. Virol. 80:9962-9969.<br />
Wang, Y.-F., S. G. Sawicki, and D. L. Sawicki. 1991. <strong>Sindbis</strong> virus nsPl functions<br />
in negative-strand RNA synthesis. J. Virol. 65:985-988.<br />
56
Tet-Off® and Tet-On® Gene Expression Systems User Manual, 2005.<br />
(www.clontech.com).<br />
57