Semliki Forest viiruse ja Sindbis viiruse mittestruktuurse valgu nsP2 ...

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS-TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

Marina Šunina 

Semliki Forest viiruse ja Sindbis viiruse mittestruktuurse valgu nsP2 

mõju superinfektsioonile 

Magistritöö 

Juhendaja: Valeria Lulla, Ph.D 

Kaasjuhendaja: Andres Merits, Ph.D 

TARTU 2009

SISUKORD 

SISUKORD......................................................................................................................2 

KASUTATUD LÜHENDID ...........................................................................................4 

SISSEJUHATUS .............................................................................................................5 

KIRJANDUSE ÜLEVAADE .........................................................................................6 

ALFAVIIRUSTE ÜLDISELOOMUSTUS ................................................................................6 

SEMLIKI FOREST VIIRUSE JA SINDBIS VIIRUSE ÜLDINE ISELOOMUSTUS ..........................6 

ENNETAMINE JA RAVIMINE.............................................................................................7 

ALFAVIIRUSTE VIRION....................................................................................................8 

ALFAVIIRUSTE GENOOMNE ORGANISATSIOON................................................................8 

ALFAVIIRUSTE INFEKTSIOONITSÜKKEL ..........................................................................9 

ALFAVIIRUSTE STRUKTUURSED VALGUD......................................................................11 

ALFAVIIRUSTE MITTESTRUKTUURSED VALGUD............................................................13 

ALFAVIIRUSTE INFEKTSIOONI MÕJU SELGROOGSETE RAKKUDELE................................16 

SUPERINFEKTSIOONI VÄLTIMINE ..................................................................................16 

EKSPERIMENTAALNE OSA....................................................................................17 

UURIMUSTÖÖ EESMÄRGID..................................................................................17 

MATERJALID JA MEETODID.................................................................................18 

Kasutatud rakuliinid ja söötmed .............................................................................18 

Kasutatud plasmiidid ..............................................................................................18 

Kasutatud viirused ..................................................................................................19 

Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga elektroporatsiooni meetodil .............20 

Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga lipofektsiooni meetodil .....................20 

Viirus-stokkide kogumine viiruse tiitrimiseks .........................................................21 

Viirusega nakatamine ja titreerimine lüüsilaikude meetodil ..................................21 

Lutsiferaasi ekspressiooni kvantifitseerimine .........................................................22 

Valkude ekspressiooni määramine Western blot meetodil......................................22 

Rakkude sorteerimine läbivoolu tsütofluorimeetriga..............................................23 

2

Rakuliinide loomine nsP2-indutseeritavaks ekspressiooniks..................................23 

TÖÖ TULEMUSED....................................................................................................25 

1. Superinfektsiooni vältimise näidiseksperiment.............................................25 

2. Katsed RDR mutatsiooni sisaldavat nsP2 proteaasi ekspresseerivate 

rakkudega ...............................................................................................................26 

3. Katsed rakkudega, milles on võimalik indutseerida nsP2-valku 

ekspressiooni. .........................................................................................................29 

4. NsP2 mõju uurimine alfaviiruste infektsioonile T7 BHK rakke ja 

lutsiferaasi ekspresseerivaid viiruseid kasutades..................................................34 

ARUTELU ..................................................................................................................40 

KOKKUVÕTE ..............................................................................................................46 

SUMMARY ...................................................................................................................48 

LISA ...............................................................................................................................50 

KASUTATUD KIRJANDUS .......................................................................................52 

3

KASUTATUD LÜHENDID 

aa – aminohape (amino acid) 

BHK-21 – hamstri neerurakuliin nr 21 (baby hamster kidney cells, nr 21) 

cDNA – komplementaarne DNA (complementary DNA) 

CMC – karboksümetüültselluloos (carboxymethylcellulose) 

CP – kapsiidi valk (capsid protein) 

FACS – läbivoolu tsütofluorimeeter e. rakusorter (fluorescence activated cell sorter) 

FCS – veise loote seerum (fetal calf serum) 

GFP – roheliselt helenduv valk (green fluorescent protein) 

GMEM – Glasgow Modified Eagle’s Medium 

h – tund (hour) 

IF – immuunofluorestsents (immunofluorescence) 

kb – kiloalus (kilobase) 

kDa – kilodalton (kilodalton) 

m.o.i. – infektsiooni kordsus (multiplicity of infection) 

NLS – tuuma lokalisatsiooni signaal (nuclear localization signal) 

ns – mittestruktuurne (nonstructural) 

nsP – mittestruktuurne valk (nonstructural protein) 

nt – nukleotiid (nucleotide) 

PBS – fosfaatpuhvriga sooladelahus (phosphate buffered saline) 

PFU – lüüsilaiku moodustav ühik (plaque forming unit) 

RC – replikatsiooni kompleks (replication complex) 

RLU – suhteline lutsiferaasi ühik (relative luciferase unit) 

SDS – naatriumdodetsüülsulfaat (sodium dodecyl sulfate) 

SFV – Semliki Forest viirus (Semliki Forest virus) 

SINV – Sindbis viirus (Sindbis virus) 

TRE – tetratsükliinile reageeriv element (tetracycline-response element) 

wt – metsik-tüüpi (wild type) 

4

SISSEJUHATUS 

Alfaviiruste bioloogiline mitmekesisus on ülimalt lai, nad parasiteerivad 

kalades, lindudes, koduloomades ja inimestes. Üheks põhjalikumalt uuritud 

mudelviirusteks on alfaviiruste hulka kuuluvad Semliki Forest virus (SFV) ja Sindbis 

viirus (SINV). Need on suhteliselt lihtsad ja väikesed positiivse polaarsusega RNAgenoomsed 

viirused, mille elutsüklis vahelduvad selgrootutes putukavektoris ning 

selgroogses peremehes toimuvad infektsioonid. Tänu sellele, et need viirused on 

koekultuuris kergelt kultiveeritavad, kasutatakse neid tihti meditsiinilistes ja 

teadusuuringutes. 

Alfaviiruste genoom kodeerib kahte tüüpi valke: struktuurseid ja 

mittestruktuurseid. Struktuurseid valke vajab viirus uute virionide moodustamiseks, 

mittestruktuurseid aga viiruse genoomi replitseerimiseks ja transkribeerimiseks. 

Käesoleva magistritöö uurimusobjektiks oli mittestruktuurne valk kaks (nsP2), mida 

peetakse seotuna ka superinfektsiooni vältimise mehhanismiga. 

Käesoleva uurimustöö teoreetiline osa annab lühida ülevaate alfaviiruste grupist 

ning Semliki ja Sindbis viiruste päritolust. Pikemalt kirjeldatakse nende viiruste virioni 

ehitust, genoomi struktuuri ja viiruse infektsioonitsüklit. Kuna käesoleva töö eesmärgiks 

oli selgitada nsP2 proteaasi osalust superinfektsiooni vältimise nähtuses, siis on 

teoreetilises osas lühike ülevaade ka superinfektsiooni vältimise mehhanismist. 

Eksperimentaalses osas kirjeldatakse töö eesmärgi saavutamiseks teostatuid 

eksperimente ning katsete teostamisel tekkinuid raskusi. On kirjeldatud erinevad 

strateegiad, mis kasutati nende raskuste lahendamiseks ning töö tulemusel leitud 

sõltuvused. 

Töö on valminud Tartu Ülikooli Molekulaar- ja rakubioloogia instituudis 

mikrobioloogia ja viroloogia õppetooli juures. Sooviksin tänada Valeria Lullat ja 

professor Andres Meritsat juhendamise ja kannatlikkuse eest. Samuti tänan Eva 

Žusinaitet, Aleksei Lullat ja Oksana Šarovat abi ja kasulike nõuannete eest. 

5

KIRJANDUSE ÜLEVAADE 

Alfaviiruste üldiseloomustus 

Alfaviirused on positiivse polaarsusega RNA genoomsed membraaniga viirused. 

Perekond Alphavirus kulub Togaviridae sugukonda ning sisaldab praegusel ajal 28 

viiruste liiki; perekonna esindajaid on leitud kõikidelt kontinentidelt ning paljudelt 

saartelt. Alfaviiruste elutsüklis vahelduvad selgrootus (putukvektoris) ning selgroogses 

peremehes toimuvad infektsioonid. Paljude alfaviiruste puhul on putukvektoriteks 

sääsed ja moskiitod. Selgroogseks peremeheks on reeglina kas imetajad või linnud, veealfaviiruste 

jaoks on aga peremeesteks kalad. Inimestele ja koduloomadele patogeensed 

alfaviirused jaotuvad põhjustatava haiguspildi järgi kahte gruppi: need, mis põhjustavad 

lööve ja liigesepõletikuga kulgevat haigust (selliseid viiruseid on algselt leitud Vana 

Maailma riikidest), ning need, mis põhjustavad entsefaliiti (seda tüüpi viiruseid on 

algselt leitud Uue Maailma riikidest) (Griffin, 2006). Käesolevas magistritöös olid 

uuritavateks objektideks Vana Maailma alfaviiruste hulka kuuluvad Semliki Forest 

viirus (SFV) ja Sindbis viirus (SINV). 

Semliki Forest viiruse ja Sindbis viiruse üldine iseloomustus 

Esmakordselt isoleeriti SFV 1942 aastal Aedes abnormalis’est, mida korjati 

Semliki metsast Ida-Ugandas (Smithburn and Haddow, 1944). Hiljem selgus, et see 

viirus on laialt levinud kogu Aafrikas ning selle isoleerimine moskiitodest (näiteks 

Aedes africanus, Aedes argenteopunctatus) on dokumenteeritud Mozambiigis, 

Nigeerias ja Kesk-Aafrika Vabariigis (Griffin, 2006, ja viited selles). SFV võib 

põhjustada entsefaliidi hobustel, hiirtel, rottidel, hamstritel, küülikutel ning meresigadel. 

Põhjustatud haiguse raskus ja selle tüüp sõltub (a) looma vanusest infektsiooni ajal, (b) 

inokulatsiooni kohast ning (c) infektsiooniks kasutatud SFV tüve virulentsusest (Griffin, 

2006, ja viited selles). Tänu laiale katseloomade ringile ning sellele, et ta on inimeste 

jaoks suhteliselt ohutu, on SFV üks praegusel ajal enim uuritavaid alfaviiruseid. 

6

SINV isoleeriti esmakordselt 1952 aastal Culex univittatus’est, mida korjati 

Sindbise juures Egiptis (Taylor et al., 1955). Järgmise 25 aasta vältel on seda viirust 

leitud Euroopas, Kesk-Idamaades, Aafrikas, Indias, Aasias, Austraalias ja Filipiini 

saartel erinevates sääse- ja selgroogsete liikides (Griffin, 2006). Selle alusel võib väita 

et SINV on inimestel liigesepõletikku põhjustavate alfaviiruste hulgast kõige laiemalt 

levinud (Griffin, 2006). Viirus tsirkuleerib põhiliselt Culex spp. ja Culiseta spp. 

sääseliikide ning metslindude vahel (Mackenzie et al., 1994), kuid võib nakatada väga 

paljusid erinevaid selgroogsete liike. Sarnaselt SFV-ga uuritakse teda intensiivselt 

hiirtel ja rottidel entsefalomüeliiti tekitava mudelviirusena. 

Ennetamine ja ravimine 

Alfaviiruste poolt esilekutsuvate haiguste ravimiseks puuduvad tänapäeval 

spetsiifilised viirusevastased ravimid. Ohtlike alphaviirustega nakatumise puhul tehakse 

kas toetavat ravi (selleks, et vältida entsefaliidiga kaasnevat kooma-seisundit), või siis 

sümptomaatilist ravimist (nt. liigesepõletikku puhul kasutatakse selleks 

põletikuvastased ained). SINV puhul on olemas ka formaliiniga inaktiveeritud vaktsiin 

hobuste jaoks (Griffin, 2006). Siiski on kõige efektiivsemad viisid selliste viirustega 

võitlemiseks kas piirata sääskede/moskiitode paljunemist, või siis mõjuda viiruse 

paljunemist ülekandevektorites ja takistada sellisel viisil vektorlevikut. Käesoleva 

magistritöö eksperimentaalse osa katsed on suunatud pikemas perspektiivis just sellise, 

ülekandevektorite puhul rakendatava ravimi või ravimeetodi potentsiaalse 

toimemehhanismi otsingule ja kirjeldamisele. Sarnane lähenemine võib olla oluline ka 

muude putuklevikuliste viiruste leviku tõkestamisel sest just sellised viirused kujutavad 

(nt. seoses kliima soojenemise ja vektorputukate laiema levikuga) suurt probleemi 

tuleviku tervishoiule. 

7

Alfaviiruste virion 

Joonis 1. Alfaviiruste virioni skeem. Viiruse 

genoom on pakitud nukleokapsiidi (joonisel sinine). 

Kapsiid on omakorda kaetud raku membraanist pärineva 

ümbrisega (joonisel oranž). Membraanis painkevad 

viiruse glükoproteiinid on tähistatud heleroheliselt 

(Strauss and Strauss, 1994). 

Alfaviiruste virion on ümbrisega partikkel, mille diameeter on umbes 70 nm ning 

mille sees asub 40 nm diameetriga nukleokapsiid. Nii viiruse nukleokapsiid kui ka 

ümbris omavad ikosaeedrilist sümmeetriat. Nukleokapsiid sisaldab viiruse üheahelalist 

positiivse polaarsusega genoomset RNA-d, mis on ümbritsetud heksameerideks ja 

pentameerideks organiseeritud kapsiidi valguga (240 CP koopiat virioni kohta). 

Nukleokapsiid ise on ümbritsetud lipiidse kaksikkihiga, mis on pärit peremeesraku 

membraanist. Ümbris sisaldab ka viiruse poolt kodeeritud glükoproteiine E1 ja E2, mis 

moodustuvad omavahel heterodimeere (joonis 1) (Strauss and Strauss, 1994, ja viited 

selles). 

Alfaviiruste genoomne organisatsioon 

Alfaviiruste genoomi struktuuri (SFV näitel) on kujutatud skemaatiliselt joonisel 

2. SFV genoomi üldpikkus on 11,4 kb, SINV genoom on 11,7 kb pikkune. Kõikide 

alfaviiruste genoomi võib jagada kahte suure regiooni: mittestruktuurne regioon, mis 

kodeerib mittestruktuurseid (replikaasi) valke ja hõlmab kaks kolmandikku RNA 

genoomist; ning struktuurne regioon, mis kodeerib viiruse struktuurseid valke ning 

hõlmab genoomi 3’-otsa poolse kolmandiku. Mittestruktuurseid valke transleeritakse 

otse genoomselt RNA-lt ühe (SFV) või kahe (SINV) polüproteiinina, mis lõigatakse 

8

hiljem individuaalseteks valkudeks. Nii polüproteiinid kui ka valmis lõigatud valgud 

mängivad olulist rolli viiruse replikatsioonis ja selle regulatsioonis. Ka struktuurne 

regioon ekspresseerub polüproteiini kujul, selle translatsioonil kasutatakse matriitsina 

subgenoomset n.n. 26S mRNA-d. Struktuurse polüproteiini lõikamise tagajärjel 

moodustuvad kapsiidi valk, ümbrise valgud ning kaks väikest polüpeptiidi E3 ja 6K. 

Mittestruktuurse regiooni 3’-terminaalne regioon sisaldab sisemist promooterit 

subgenoomse RNA transkriptsiooniks, genoomi 5’ ja 3’-otsa mittetransleerivad alad 

sisaldavad RNA replikatsiooni jaoks vajalikke signaale (Strauss and Strauss, 1994). 

Joonis 2. Semliki Forest viiruse genoom ja sellelt toimuv viiruse valkude ekspressioon 

(joonise päritolu: Lulla, 2007). 

Alfaviiruste infektsioonitsükkel 

Alfaviiruste infektsioonitsükkel on toodud joonisel 3. Alfaviirused replitseeruvad 

nii lülijalgsete kui ka selgroogsete rakkudes, kusjuures lülijalgsete rakkudes toimuv 

infektsioon on persistentne, selgroogsete rekkudes aga lühiajaline, äge ning tavaliselt 

raku surmaga lõppev. Arvatavasti toimub see nii erinevate replikatsiooni strateegiate 

9

kasutamise pärast erinevates rakutüüpides ja/või erinevate rakuliste kaitsemehhanismide 

toime tõttu (Strauss and Strauss, 1994, ja viited selles). 

Alfaviirused sisenevad rakku retseptor-vahendatud endotsütoosi teel klatriiniga 

kaetud vesiikulite abil, viiruse ja endosoomide membraanide liitumine nõuab madala 

pH olemasolu endosoomides (Helenius et al., 1980, Marsh and Helenius, 1989). Virioni 

ümbrise ja endosoomi membraani liitumise ning sellele järgneva nukleokapsiidi ja 

ribosoomi interaktsioonide tulemusena vabaneb viiruse nukleokapsiidis sisalduv RNA 

genoom tsütoplasmasse. Viiruse genoom käitub rakus kui mRNA ning temalt 

sünteesitakse viiruse mittestruktuursed valgud. Kõigepealt sünteesitakse P1234 

polüproteiin, mis lõigatakse autokatalüütiliselt P123 polüproteiiniks ning nsP4 valguks. 

Selline P123 + nsP4 kompleks käitub varase RNA polümeraasina, mis on vajalik viiruse 

genoomile vastava negatiivse RNA ahela sünteesiks (Kääriäinen and Ahola, 2002, ja 

viited selles). Selgroogsete rakkudes toimub negatiivse RNA ahela süntees ainult 

infektsiooni varajases staadiumis (4-6 tunni peale nakatamist). Pärast seda toimub 

äkiline negatiivse RNA ahela sünteesi väljalülitamine ning rakkus hakatakse tootma 

ainult positiivse polaarsusega viiruse RNA-sid (Sawicki et al., 1981). Uute positiivse 

polaarsusega genoomsete 42S RNA-de (genoomide) ja 26S RNA-de sünteesi 

alustamiseks on vaja lõigata P123 polüproteiin nsP1, nsP2 ja nsP3 valkudeks; 

matriitsina kasutab sellisel viisil ümberkorraldatud replikaaskompleks negatiivse 

polaarsusega RNA ahelat (Kääriäinen and Ahola, 2002, ja viited selles). 

26S RNA translatsiooni tulemusena moodustuvad viiruse struktuursed valgud ning 

42S RNA, mis sisaldab pakkimissignaali, pakitakse uutesse nukleokapsiididesse 

(Melancon and Garoff, 1987). Uue põlvkonna viirused vabanevad rakkudest pungudes 

kas plasmamembraanist (selgroogsete rakkudes) või rakusisestest membraanidest 

(selgrootute rakkudes). 

10

Joonis 3. Alfaviiruste infektsioonitsükkel. RC tähendab replikatsiooni kompleksi 

(replication complex). Varajane replikatsiooni kompleks (RCmiinus) sisaldab P123 

polüproteiini ja nsP4 valku ning vastutab negatiivse polaarsusega RNA sünteesi eest. Hiline 

replikatsiooni kompleks (RCpluss) sisaldab nsP1, nsP2, nsP3 ja nsP4 valke ning vastutab 

positiivse polaarsusega RNAde sünteesi eest (joonise päritolu: Lulla, 2007). 

Alfaviiruste struktuursed valgud 

Alfaviiruste struktuursed valgud transleeritakse polüproteiini kujul 26S mRNA 

maatritsil. Sünteesitud polüproteiin lõigatakse ko- ja posttranslatsiooniliselt valmis 

struktuurseteks valkudeks. Kapsiidi valk (CP – capsid protein) asub polüproteiini N- 

11

terminaalses otsas ja omab seriin-proteaasset aktiivsust mis töötab in cis, vabastades 

värskelt sünteesitud CP polüproteiini küljest. CP omab kaks erinevat domeeni: N- 

terminaalne domeen ei ole erinevate alfaviiruste vahel konserveeritud, ta on lüsiini- ja 

arginiinirikkas ning tänu oma tugevale positiivsele laengule seob elektrostaatiliselt 

viiruse RNA-d. See seondumine on vajalik nukleokapsiidi formeerumise alustamisel 

ning RNA vabanemise stimuleerimisel viiruse sisenemisel rakku. Viimane on võimalik 

kuna CP seondub spetsiifiliselt ka ribosoomi suure subühikuga ja see seondamine 

algatab partikli lahtipakkimise. CP C-terminaalne domeen on vastupidiselt kõrgelt 

konserveeritud. See domeen omab proteinaasset aktiivsust ja ka osaleb valk-valk 

interaktsioonides nii nukleokapsiidi moodustamisel kui ka interaktsioonides 

glükoproteiinidega, mis on vajalikud virioni valmimiseks ja väljumisel rakust keskonda 

(Strauss and Strauss, 1994, ja viited selles, Hong et al., 2006). 

Kui CP vabaneb polüproteiini ahelast, paljastub järelejäänud polüproteiini N- 

terminaalses otsas asuv signaaljärjestus, mis viib polüproteiini allesjääva osa, milles 

sisalduvad E1, E2, E3 glükoproteiinidele ja 6K valgule vastavad järjestused, 

endoplasmaatilisse retiikulumisse, kus seda edasi protsessitakse ja modifitseeritakse. 

Esimestena vabanevad ühise eelvalgu p62 kujul E3 ja E2, selle valgu glükosüleerimine 

toimub kotranslatsiooniliselt (Garoff et al., 1978, Pesonen and Kääriäinen, 1982). E1 

valk on seotud hüdrofoobse 6K valguga, mille N-terminaalne ots käitub signaalina 

rakulistele signaalpeptidaasidele. Nad lõikavad sidet p62 ja 6K ning 6K ja E1 vahel. E1 

ja p62 moodustavad heterodimeerid ning neid transporditakse Golgi kompleksi kaudu 

plasmamembraanile. Transpordi käigus lõigatakse p62 E3 ja E2 valkudeks trans-Golgi 

tsisternides sisalduva proteaasi abil (Melancon and Garoff, 1986, Garoff et al., 1990, 

Liljeström and Garoff, 1991). 

Hüdrofoobse 6K valgu ülesanned virionide valmimisel pole täpselt teada. On 

näidatud, et see valk on membraanidega seotud ning seda modifitseeritakse kovalentselt 

rasvhappeahelatega. 6K mutatsioonid ja isegi selle valgu täielik eemaldamine mõjuvad 

küll virioni kokkupanekut ja viiruse väljumist rakust, aga nad ei ole alfaviiruste 

infektsiooni jaoks fataalsed (Liljeström et al., 1991, Loewy et al., 1995, McInerney et 

al., 2004). 

12

Alfaviiruste mittestruktuursed valgud 

Alfaviiruste mittestruktuursed valgud transleeritakse, sõltuvalt viirusest, 

genoomselt RNA-lt ühe või kahe polüproteiinina. Näiteks SINV puhul transleeritakse 

kas P123 polüproteiin, mis sisaldab nsP1, nsP2 ning nsP3 järjestusi, või P1234 

polüproteiin, mis sisaldab lisaks ka nsP4 järjestust. Missugune polüproteiin moodustub, 

sõltub sellest, kas translatsioon peatub nsP3 ja nsP4 järjestuste vahel asuval terminaatorkoodonil, 

või see termineeriv koodon loetakse läbi, mis toimub umbes 10% kuni 20% 

sagedusega. Enamikel SFV tüvedel selline terminaator puudub ja nende puhul 

sünteesitakse ainult P1234 polüproteiin (Strauss and Strauss, 1994, ja viited selles). 

Alphaviiruste mittestruktuursete polüproteiinide protsessing muutub 

infektsioonitsükli jooksul: varajases infektsioonis on näidatud, et nii SINV (de Groot et 

al., 1990) kui ka SFV (Takkinen et al., 1991) moodustuvad P123 ja nsP4 valgud (st. 

varajase replikaasi komponendid), hilises infektsioonis domineerib aga P12 ja P34 

polüproteiinide, mille funktsioonid on teadmata, moodustamine. SFV puhul lõigatakse 

kõik polüproteiinid eraldi valkudeks, SINV puhul jääb P34 edasi protsessimata. 

Neli erinevat mittestruktuurset valku töötavad infektsiooni käigus nii polüproteiini 

kui ka valmislõigatud lõpp-produktide kujul. 

nsP1. Mittestruktuurne valk 1 (537 aa, 64 kDa SFV-l; 540 aa SINV-l) on vajalik 

negatiivse RNA sünteesi alustamiseks ja jätkamiseks (Hahn et al., 1989, Sawicki et al., 

1981, Wang et al., 1991). NsP1 omab metüültranferaasset ja guanosüültranferasset 

aktiivsust (Strauss and Strauss, 1994, ja viited selles) ja osaleb viiruse RNA-de 

capeerimisel. Veel üheks nsP1 funktsiooniks on tema võime moduleerida nsP2 

proteinaasset aktiivsust, sest nsP1-e sisaldavad polüproteiinid lõikavad väga halvasti 

sidet nsP2 ja nsP3 järjestuste vahel (de Groot et al., 1990, Lulla et al., 2008). 

nsP2. Mittestruktuurse valgu 2 (799 aa, 86 kDa SFV-l; 807 aa SINV-l) N- 

terminaalne domeen (SINV puhul 1 aa kuni 459 aa) on RNA helikaas. SINV nsP2 

kuulub valkude superperekonda, mis sisaldavad nukleosiidi trifosfaadi (NTP)-siduvaid 

domeene. Need domeenid on iseloomustatud kahe motiiviga, mis on esindatud GSGKS 

järjestusega (alates 189 aa) ning DEAF järjestusega (alates 252 aa) (Gorbalenya et al., 

1988, Gorbalenya et al., 1990, Hodgman, 1988). Seega osaleb nsP2 N-terminaalne 

13

domeen kaheahelaise RNA dupleksi lahtikeerdumisel RNA replikatsiooni ja 

transkriptsiooni käigus. 

NsP2 valgu C-terminaalne domeen (460 aa kuni 807 aa SINV puhul) töötab 

mittestruktuurse proteinaasina (Strauss and Strauss, 1994). Mutatsioon nsP2 proteaasi 

katalüütilises tsüsteiinijäägis (C478A, nsP2 CA ), kui ta oli sisse viidud SFV P1234, P123 

ja P23 polüproteiinidesse, blokeerib täielikult kõik mittestruktuurse polüproteiini 

proteolüütilised lõikamised. Samuti on demonstreeritud, et nsP2 on ainus proteinaas, 

mis on vajalik SFV P1234 polüproteiini lõikamiseks (Merits et al., 2001). Peale selle on 

näidatud, et nsP2 on vajalik ka 26S subgenoomse mRNA sünteesiks, arvatavasti selle 

transkriptsiooni alustamiseks (Hahn et al., 1989, Sawicki and Sawicki, 1985, Sawicki 

and Sawicki, 1993). 

SFV-ga nakatatud rakkudes paikneb umbes 50% nsP2 valgust rakutuumas, 

põhiliselt rakutuumakeses (Peranen et al., 1990). Tuuma lokalisatsiooni signaale (NLS) 

on leitud nii nsP2 N-terminaalses kui ka C-terminaalse osas; tuumakese lokalisatsiooni 

signaal paikneb 500 aa-jäägi juures. SFV nsP2 valgu NLS on identifitseeritud kui 

R 648 R 649 R 650 järjestus ning R-jääkide vahetamine D-jääkide vastu (RDR, DRR või 

DDR) takistab nsP2 tuumset lokalisatsiooni (Rikkonen et al., 1992). Rakutuumas olev 

nsP2 ei osale otseselt viiruse RNA replikatsioonis, samas võib selle valgu 

tuumalokalisatsioon mängida olulist rolli alfaviiruste tsütotoksilisuses ja 

neuropatogeensuses. Nii on näidatud, et viirus, mille nsP2-s paikneb R649D 

mutatsioon, ei tekita hiirtes entsefaliiti. Rakkudes, mis on nakatatud selle mutantse 

viirusega, toimub P1234 lõikamine mõningase viivitusega, viidates sellele, et R649D 

mutatsioon mõjutab ka nsP2 valgu proteolüütilist aktiivsust (Fazakerley et al., 2002). 

NsP2 valk on vastutav SFV ja SINV poolt põhjustatud tsütopatogeenilise effekti 

eest nakatatud selgroogsete rakkudes. Individuaalse nsP2 ekspressioon nendes rakkudes 

on piisav raku-spetsiifilise transkriptsiooni inhibitsiooni käivitamiseks. Mutatsioonid 

nsP2 C-terminaalses otsas vähendavad oluliselt viiruse poolt põhjustatud tsütopaatilist 

effekti, vähendades ühtlasi ka raku transkriptsiooni inhibeerimist ja apoptoosi (peamist 

rakkude surma mehhanismi alfaviiruste infektsioonis) indutseerimist (Perri et al., 2000). 

Mutatsioonid SINV nsP2 järjestuses võivad viia ka vähenenud viiruse RNA sünteesile 

14

ning selle tulemusena isegi persistentse infektsiooni tekkimisele selgroogsete rakkudes 

(Dryga et al., 1997, Frolova et al., 2002). 

nsP3. Mittestruktuurse valgu 3 (482 aa, 61 kDa SFV-l; 556 aa SINV-l) N- 

terminaalne domeen on 322 aa kuni 329 aa pikk ning on kõrgelt (minimaalselt 51% 

ulatuses) konserveeritud erinevate alfaviiruste vahel. Samal ajal ei ole nsP3 C- 

terminaalne domeen konserveeritud ei järjestuse ega pikkuse poolest, selle domeeni 

pikkus varieerub 134 aa kuni 246 aa vahel (Strauss and Strauss, 1994, ja viited selles). 

Erinevalt muudest ns-valkudest on nsP3 fosfoproteiin. On näidatud, et alfaviiruse 

replikatsioonikompleksid, mis olid isoleeritud nakatatud rakkudest 6 tunni pärast 

nakatamist sisaldasid kõrgelt fosforüleeritud nsP3 valku viidates sellele, et selline nsP3 

valgu vorm mängib olulist rolli RNA sünteesis (Barton et al., 1991). 

Samuti on näidatud, et nsP3 järjestuse olemasolu P123 polüproteiinis on vajalik 

negatiivse RNA sünteesiks (Lemm and Rice, 1993, Lemm et al., 1994, Shirako and 

Strauss, 1994). Lisaks sellele mõjutab nsP3 järjestuse olemasolu polüproteiinides nsP2 

proteinaasi lõikamisspetsiifilisust: nii nsP2 kui ka P12 lõikavad SINV nsP3 ja nsP4 

vahelist saiti väga halvasti, samal ajal nii P123 kui ka P1234 lõikavad seda saiti 

effektiivselt (de Groot et al., 1990). NsP3 moodustab nakatatud rakkudes vähemalt 

kahte tüüpi komplekse: ühed on leitud seotuna plasmamembraaniga ja rekusiseste 

vesiikulitega ning teised on ko-isoleeritavad rakutuumaga (Gorchakov et al., 2008). 

nsP4. Mittestruktuurne valk 4 (614 aa, 68 kDa SFV-l; 610 aa SINV-l) on viiruse 

RNA polümeraas (Rubach et al., 2009) ja terminaalne nukeotidüül-transferaas (Tomar 

et al., 2006). NsP4 kontsentratsioon on nakatatud rakkudes madalam, kui muude nsvalkude 

oma: paljude alfaviiruste puhul vajab nsP4 translatsioon nsP3 regiooni lõpus 

paikneva stop-koodoni läbilugemist, see tähendab aga seda, et nsP4 valku toodetakse 

selliste viiruste puhul alati palju väiksemas hulgas kui teisi mittestruktuurseid valke 

(Strauss et al., 1983). Peale selle on näidatud, et nsP4 valk on nakatatud rakkudes 

ebastabiilne: ainult RNA replikaas-kompleksiga seotud nsP4 valk on degradatsiooni 

eest kaitstud, „vaba“ nsP4 aga mitte ning seda lagundatakse kiiresti N-otsast sõltuvas 

degradatsiooni rajas (de Groot et al., 1991). 

15

Alfaviiruste infektsiooni mõju selgroogsete rakkudele 

Alfaviirused replitseeruvad kiiresti ja efektiivselt paljudes selgroogsete 

rakutüüpides ja kultiveeritavates rakuliinides. Uue põlvkonna viiruste väljumine 

nakatatud rakkudest algab tavaliselt 4 kuni 6 tunni pärast nakatamist. Paljud alfaviirused 

indutseerivad nakatatud rakkude apoptoosi (Griffin, 2006). Viirusega nakatamine 

kutsub esile ka muid tsütopaatilisi effekte: rakud ümarduvad, peenenduvad, nende 

tsütoplasmas moodustuvad „mullid“, ning tüüpiliselt rakud surevad 24 – 48 tundi peale 

infektsiooni algust (Levine et al., 1993, Raghow et al., 1973). 

Superinfektsiooni vältimine 

Alfaviirustele, nagu ka paljudele teistele viirustele, on omane superinfektsiooni 

vältimise nähtus. See seisneb selles, et selgrootute või selgroogsete rakud, mis on 

nakatatud ühe alfaviirusega, ei saa olla hiljem produktiivselt nakatatud teise sama liiki 

kuuluva või talle lähedase alfaviirusega. Superinfektsiooni vältimine kujuneb välja 

varajases infektsioonis: siseneva viiruse inhibeerimine hakkab toimima pärast 

esimesena rakku sattunud viiruse mittestruktuursete valkude sünteesi. Superinfitseeriva 

viiruse genoom saab küll sellises rakus olla transleeritud, aga mitte replitseeritud 

(Stollar and Shenk, 1973). Arvatakse, et see toimub sellepärast, et nakatatud rakus 

paiknev esimeselt viiruselt pärinev P2 proteaas lõikab enneaegselt superinfitseeriva 

viiruse replikaasi polüproteiini, blokeerides sellega miinus-ahela sünteesiks vajalike 

komplekside moodustamist ja selle kaudu ka superinfitseeriva viiruse replikatsiooni 

(Karpf et al., 1997, Ehrengruber and Goldin, 2007). Käesoleva magistritöö katsed olid 

suunatud sellele, et näidata kas nsP2 proteaas tõepoolest mängib olulist rolli 

superinfektsiooni vältimise nähtuses. 

16

EKSPERIMENTAALNE OSA 

UURIMUSTÖÖ EESMÄRGID 

Alfaviiruste superinfektsiooni vältimise mehhanismide uurimine on kujunenud 

väga oluseks uurimussuunaks seoses praegusel ajal toimuva moskiitode ja sääskede 

levila kiire suurenemisega. Kuna moskiitod ja sääsed on alfaviiruste peamised vektorid 

siis toob nende levik kaasa ka alfaviiruste (aga ka teiste arboviiruste) poolt põhjustatud 

haiguste sagenemist ja levimist regioonidesse, kus neid varem ei leidunud. On võimalik, 

et superinfektsiooni vältimise mehhanisme võib edukalt kasutada ka lülijalgsetega 

levivate viiruste paljunemise ja levimise pidurdamiseks. See võimalus sõltub aga nende 

mehhanismide olemusest mistõttu on vaja välja selgitada superinfektsiooni vältimise 

mehhanismi molekulaarsed alused. Käesoleva magistritöö eesmärgiks oligi välja 

selgitada, kas SFV ja SINV mittestruktuurne valk 2 või seda valku sisaldavad 

polüproteiinid võiksid olla seotud superinfektsiooni vältimise mehhanismiga, sest seni 

avaldatud töödes on just nsP2 proteaasi olemasolu rakkudes peetud peamiseks faktoriks, 

mis takistab teisena rakku sattunud viiruse paljunemist. Valitud eesmärgi saavutamiseks 

oli vaja lahendada kaks teineteisele vastukäivat ülesannet. Esiteks oli vaja näidata, et 

rakud, mis sisaldavad nsP2 proteaasi, ei saa olla alfaviirusega produktiivselt nakatatud. 

Teiseks oli vaja lahendada nsP2-le iseloomulik kõrge tsütotoksilisuse probleem, mis ei 

võimalda läbi viia nsP2 ekspressiooni rakkudes ilma neid kahjustamata (igasugune 

rakkude kahjustamine mõjutab kaudselt nendes rakkudes toimuvat viirusinfektsiooni). 

Nendele ülesannetele lahendusteede otsimine kujuneski peamiseks teguriks, mis määras 

kavandatud uurimistöö peamised eksperimentaalsed suunad. 

17

MATERJALID JA MEETODID 

Kasutatud rakuliinid ja söötmed 

Antud uurimustöös kasutati hamstri neerurakuliini BHK-21 ning T7 BHK 

rakuliini, mis ekspresseerib bakteriofaag T7 RNA polümeraasi (BSR-T7 rakud, 

Buchholz et al., 1999). Rakke kasvatati 37 o C, 5% CO 2 ja kõrge niiskusega tingimustes 

GMEM söötmes (Glasgow Modified Eagle’s Medium, „Gibco BRL“), millele lisati 5% 

veise loote seerumi (Fetal Calf Serum - FCS), 2% Bacto Tryptose Phosphate Broth’i 

(„Difco“), penitsilliini 100 IU/ml ja streptomütsiini 100 ng/ml (lõppkontsentratsioonid). 

T7 BHK rakkude söötmesse lisati veel G418 (geneticin, „Gibco BRL“) 

lõppkontsentratsiooniga 1 mg/ml. Rakkude nakatamiseks viirusega ja viirus-stokide 

lahjenduste tegemiseks kasutati seerumivaba GMEM söödet. Pärast nakatamist lisati 

mõnedel juhtudel rakkudele 2% seerumit sisaldav GMEM sööde. 

Kasutatud plasmiidid 

Kõik töös kasutatud algplasmiidid olid ostetud nende tootjatelt, rekombinantsed 

plasmiidid ja viirus-vektorid olid konstrueeritud/tellitud Aleksei Lulla poolt 

(algplasmiidide kaardid on antud töö lõpus lisa peatükis). 

pSFV1-d1EGFP-RDR – RDR mutatsiooniga nsP2 proteaasi sisaldavat SFV 

replikon-vektori cDNAd sisaldav plasmiid. EGFP valku kodeeriv järjestust, mis 

võimaldab replikoni sisaldavate rakkude sorteerimist, on paigutatud SFV subgenoomse 

promooteri kontrolli alla. 

NsP2-te ekspresseeriva rakuliini loomiseks kasutatud plasmiidid: 

pTet-On – rtTA valku kodeeriv regulatoorne plasmiid (Clontech) 

pTRE-Tight-Rluc – Renilla lutsiferaasi kodeeriv vastusplasmiid, kloonide foonija 

induktsiooni tasemete mõõtmiseks ja võrdlemiseks. 

pTRE-Tight-nsP2 – nsP2 valgu kodeeriv vastusplasmiid. 

18

T7 BHK rakkudes kasutatud plasmiidid (rekombinantsete plasmiidide 

originaalnimetus oli pT7-IRES-SFV-p1234, lihtsuse mõttes on nende nimetusi 

lühendatud järgnevalt): 

T7 kontroll – tühi pT7-IRES vektor, sisaldab T7 RNA polümeraasi promooterit ja 

entsefalomüokardiidi viiruse IRES elementi. Järgnevad vektorid olid konstrueeritud 

selle plasmiidi alusel. 

T7 SFV wt – T7 RNA polümeraasi promooterit sisaldav plasmiid, mis kodeerib 

SFV metsik-tüüpi mittestruktuurseid valke. 

T7 SFV CA – T7 RNA polümeraasi promooterit sisaldav plasmiid, mis kodeerib 

SFV mittestruktuurseid valke mitteprotsessitava polüproteiini kujul, sest polüproteiini 

kuuluva nsP2 aktiivsait on muteeritud (sisaldab Cys→Ala katalüütilise aminohappe 

jäägi kohal). 

T7 SINV wt – T7 RNA polümeraasi promooteriti sisaldav plasmiid, mis kodeerib 

SINV metsik-tüüpi mittestruktuurseid valke. 

T7 SINV CA – T7 RNA polümeraasi promooterit sisaldav plasmiid, mis kodeerib 

SINV mittestruktuurseid valke mitteprotsessitava polüproteiini kujul, sest polüproteiini 

kuuluva nsP2 aktiivsait on muteeritud (sisaldab Cys→Ala katalüütilise aminohappe 

jäägi kohal). 

Kasutatud viirused 

Kõik viiruste varud olid paljundatud, puhastatud ja tiitritud Valeria Lulla poolt. 

Viiruste päritolu oli järgnev: 

SFV wt (SFV4) – metsik-tüüpi Semliki Forest viiruse stokk, pärineb SFV icDNAs 

sisaldavast plasmiidist SP6-SFV4 (Liljestrom et al., 1991), 2 põlvkond, 5 x 10 9 PFU 

(Plaque Forming Unit – lüüsilaiku moodustav ühik)/ml 

SINV wt – metsik-tüüpi Sindbis viiruse stokk, pärineb SINV icDNAd sisaldavast 

plasmiidis pTOTO1101, 2 põlvkond, 1 x 10 9 PFU/ml 

SFV-Rluc (SFV(3H)4-Rluc) – ns-regioonis Renilla lutsiferaasi kodeeriv Semliki 

Forest viirus, konstrueeritud analoogselt Tamberg et al., 2007, pärineb vastavat icDNAd 

sisaldavast plasmiidist, 2 põlvkond, 5 x 10 9 PFU/ml 

19

SINV-Rluc – ns-regioonis Renilla lutsiferaasi kodeeriv Sindbis viirus, pärineb 

Rluc inserti sisaldavast pTOTO1101 plasmiidist (V. Lulla, avaldamata), 2 põlvkond, 2,5 

x 10 9 PFU/ml 

Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga elektroporatsiooni meetodil 

Plasmiidne DNA transfekteeriti BHK-21 rakkudesse elektroporatsiooni meetodil. 

Rakkudelt aspireeriti sööde, neid pesti steriilse fosfaatpuhvriga sooladelahusega 

(Phosphate Buffered Saline - PBS), trüpsiniseeriti, suspendeeriti ning koguti 15 või 50 

milliliitrisesse koekultuurituubi, kuhu oli eelnevalt lisatud 5 ml - 10 ml GMEM söödet 

(sõltuvalt rakkude kasvatamiseks kasutatud tasside arvust). Rakud sadestati 

tsentrifuugimisel (5 minutit, 1000 g, „Eppendorf Centrifuge 5810R“). Rakusademelt 

aspireeriti supernatant ja rakud resuspendeeriti vajalikus koguses söötmes. 

Rakususpensioon (250 µl kaupa) segati 20 µl DNA lahusega (nõutav kogus DNA-d, 

steriilne vesi, 5 µl carrier DNAd (algkontsentratsiooniga 10 g/l)). Elektroporatsiooniks 

kasutati 0.4 cm küvetti („BioRad“) ja tehti üks pulss 220 V 950 µF juures („BioRad“ 

Gene Pulser II). Küvetist kanti elektroporeeritud rakud üle GMEM söötmesse, 

tsentrifuugiti ülal nimetatud tingimustel, suspendeeriti GMEM söötmes ja külvati välja 

Petri tassidele. 

Rakkude transfektsioon plasmiidse DNA-ga lipofektsiooni meetodil 

Vastusplasmiid transfekteeriti BHK21 rakkudest pärinevatesse kloonidesse firma 

„Invitrogen“ toodetud transfektsioonireagenti (Lipofectamin 2000) kasutades. Rakke 

transfekteeriti 24 auguga plaatidel, kus igas augus oli 150,000-200,000 rakku (peaaegu 

100% konfluentsus). Ühe augu kohta kasutati transfektsiooni segu, mis saadi järgnevalt: 

1. segades kokku 50 µl OPTI-MEM söödet ja 2 µl lipofektamiini ja hoides seda 

segu 5 minutit toatemperatuuril. 

2. segades kokku 50 µl OPTI-MEM söödet ja 0.1 µg pTRE-Tight vastusplasmiidi. 

3. Peale 5 minutit inkubeerimist kaks segu ühendati ning inkubeeriti täiendavalt 20 

minutit toatemperatuuril. 

20

Saadud segu (ca 100 µl) lisati rakkudele ning rakke inkubeeriti 5 tundi 37 o C juures, 

pärast inkubatsiooni perioodi lõppu vahetati transfektsioonisööde GMEM söötme, kuhu 

lisati G418 ja doksütsükliini (mõlemad lõppkontsentratsiooniga 1 mg/ml), vastu. 

Viirus-stokkide kogumine viiruse tiitrimiseks 

Viiruste tiitrimiseks kasutatud viirus-stokkid koguti nakatatud BHK-21 ja T7 

BHK rakkude kasvatamiseks kasutatud söötmetest. Nakatamiseks kasutati kuue auguga 

plaatidel kasvavaid rakke (igas augus oli umbes 1 x 10 6 rakku, umbes 90% 

konfluentsus). Nakatatud rakke inkubeeriti 37 o C juures 5% CO 2 tingimustes 

seerumvabas GMEM söötmes, valitud ajapunktides (sõltuvalt katse tingimustest ja 

eesmärkidest) koguti rakkudelt sööde (200 µl iga proovi kohta, eemaldatud söötme 

asemel lisati rakkudele sama hulk värsket seerumvaba GMEM söödet). Kogutud söötme 

alikvoolid tsentrifugeeriti 1.5 milliliitristes tuubides 5 minutit 13000 g ning 4 o C juures 

(Biofuge, „Heraeus instruments“), et eemaldada söötmes olevad rakud ja rakujäänused. 

Saadud supernatandile lisati glütseriini (1% proovi mahust), proov külmutati ja säilitati 

-70 o C juures. 

Viirusega nakatamine ja titreerimine lüüsilaikude meetodil 

100% konfluentseid 6 auguga plaatidel kasvavaid BHK-21 rakke inkubeeriti 

erinevate viirus-stoki lahjendustega seerumvabas söötmes 1 tund 37 o C juures, iga 15 

minuti tagant plaati loksutades. Peale inkubatsiooni eemaldati nakatamissööde ja kaeti 

rakud eelnevalt soojendatud karboksümetüültselluloosi (carboxymethylcellulose - 

CMC) lahuse ning söötme (GMEM) seguga. Kasutatud CMC-söötme segu sisaldas 2 

osa 2% CMC lahust ja 3 osa GMEM-i, milles oli 2% FCS. Nakatatud BHK-21 rakke 

inkubeeriti CMC-söötme seguga 2.5 ööpäeva 37 o C juures 5% CO 2 tingimustel. Peale 

inkubatsiooni eemaldati sööde ning rakud värviti kristallviolett-fikseerimislahusega 

(0.25% kristallviolett („Merck“); 1.85% formaldehüüd; 10% etanool; 35 mM 

trishüdroksümetüülaminometaan (Tris); 0.5% CaCl 2 ) 15-30 minutit. Peale värvimist 

21

pesti tasse jooksva sooja veega ja kuivatati õhu käes. Tasse, mis sisaldasid 1-100 

lüüsilaiku, kasutati viiruse tiitri arvutamiseks. 

Lutsiferaasi ekspressiooni kvantifitseerimine 

Lutsiferaasi ekspressiooni mõõtmiseks kasutati kuue auguga koekultuuriplaatidel 

kasvatatud nakatatud ja/või transfitseeritud rakke (igas augus umbes 1 x 10 6 rakku). 

Lutsiferaasi aktiivsuse analüüsiks lüüsiti rakud passiivse lüüsi puhvriga (Passive Lysis 

Buffer - PLB), kasutades 400 µl puhvrit iga augu kohta, ja määrati lüsaatides sisalduva 

lutsiferaasi aktiivsus kasutades firma „Promega“ „Renilla Luciferase assay system“ 

komponente ja juhiseid ning „Turner Designes“ luminomeetrit. 

Valkude ekspressiooni määramine Western blot meetodil 

Ekspresseeritud valkude detekteerimiseks immuno-blott meetodil transfekteeritud 

või nakatatud BHK-21 või T7 BHK rakkudes lüüsiti rakud lisades neile 150 µl 1 x 

Laemmli puhvrit (50 mM TrisHCl, 100 mM DTT, 2% naatriumdodetsüülsulfaat 

(Sodium Dodecyl Sulfate - SDS), 0.1% broomfenoolsinine, 10% glütserooli) ning koguti 

kogu viskoosne materjal 1.5 ml tuubi. Rakulüsaati kuumutati 100 o C 5 minutit. Mitte 

lagustunud jäänused eemaldati tsentrifuugimise teel, supernatandis olevad valgud 

lahutati geelelektroforeesil 10% SDS-polüakrüülamiidgeelis. Valgud kanti üle firma 

„Millipore“ PVDF-membraanile (Immobilon-P) kasutades poolkuiva ülekandemeetodit 

ja „Bio-Rad Instruments“ aparaati. Ülekanne toimus 30 minutit ülekandepuhvris (48 

mM Tris, 39 mM glütsiin, 0.037% SDS, 20% etanool) voolutugevusega 0.55 mA/cm 2 . 

Filter blokeeriti ühe tunni jooksul toatemperatuuril 5% lõssipulbri lahuses (5% 

lõssipulber, 5% 1M Tris, 3% 5M NaCl, 0.1% Tween20). Järgnevalt inkubeeriti filtrit 

huvipakkuva valgu vastase antikehaga üks tund 2% lõssipulbri lahuses (2% lõssipulber, 

5% 1M Tris, 3% 5M NaCl, 0.1% Tween20) ja pesti seejärel 3 x 10 minutit pesulahuses 

(5% 1M Tris, 3% 5M NaCl, 0.1% Tween20). Töötlus sekundaarse antikehaga, mis oli 

konjugeeritud peroksüdaasiga, viidi läbi analoogiliselt. Signaal detekteeriti, kasutades 

ECL TM Kit’i („Amersham Pharmacia Biotech“) ja röntgenfilmi. 

22

Rakkude sorteerimine läbivoolu tsütofluorimeetriga 

BHK-21 rakkude sorteerimiseks kasutati Becton Dickinson LSRII 

voolutsütomeetrit, millel on sinine (λ=488 nm) ja punane (λ=633 nm) laser ning kuus 

filtrit fluorestentse signaali analüüsiks (töös kirjeldatud katses kasutati sinist laserit 

filtriga 530 nm, sobiv FITS/GFP jaoks). FACS analüüsi andmete visualiseerimiseks 

kasutati BD FACSDiva tarkvara. Analüüsitavaid rakke sisaldavad proovid lahjendati 

enne analüüsimist 500 µl PBS-s ning loeti sisse kasutades FACS tuube (BD Falcon, Le 

Point De Claix, Prantsusmaa). Sorteerimisparameetrite kalibreerimiseks kasutati 

esimese 10000-20000 elusa raku andmed. 

Rakuliinide loomine nsP2-indutseeritavaks ekspressiooniks 

SFV4 nsP2 valku ekspresseeriva rakuliini loomine toimus Tet-On® 

geeniekspressiooni süsteemi abil (Tet-On® Gene Expression System, „Clontech 

Laboratories, Inc.“), kasutades firma juhiseid ning plasmiide (pTet-On ja pTRE-Tight). 

Esmalt transfitseeriti BHK-21 rakkudesse elektroporatsiioni meetodil pTet-On 

regulatoorne plasmiid ning raku genoomi intgreerunud plasmiidi sisaldavad rakud 

selekteeriti ühe nädala jooksul G418 abil (geneticin, „Gibco BRL“) 

lõppkontsentratsiooniga 1 mg/ml. Isoleeriti umbes 40 G418-le resistentset klooni ning 

kasvatati neid eraldi tassidel. Nendes rakuliinides kontrolliti markervalgu ekspressiooni 

indutseerimist kasutades selleks Renilla lutsifreaasi kodeerivat vastusplasmiidi ja 

mõõtes ekspressiooni fooni (indutseerimata rakud) ja indutseeritud ekspressiooni 

vahekorda. Selle jaoks transfekteeriti rakkudesse lipofektamiini abil (Lipofectamin 

2000, „Invitrogen“) pTRE-Tight-Rluc plasmiid ning 5 tunni pärast lisati rakkudele 

sööde koos doksütsükliiniga (doxycycline), kontsetratsiooniga 1 mg/ml (indutseeritud 

rakud) või ilma doksütsükliinita (indutseerimata rakud). 16 tundi pärast indutseerimist 

mõõdeti lutsiferaasi ekspressiooni tasemed kasutades firma „Promega“ toote „Renilla 

Luciferase assay system“ komponente ja juhiseid ning „Turner Designes“ 

luminomeetrit. Neid rakke, mis andsid induktsiooni efektiivsuseks 30 või enam korda 

23

(indutseeritud rakud võrrelduna indutseerimate rakkudega), paljundati ning kasutati 

edaspidisel eksperimentidel. 

24

TÖÖ TULEMUSED 

1. Superinfektsiooni vältimise näidiseksperiment 

Selle näidiskatse eesmärgiks oli demonstreerida superinfektsiooni vältimise 

toimimist SFV ja SINV puhul. Katse viidi läbi kahte tüüpi SFV ja SINV-ga: esmane 

nakatamine tehti mõlemal juhul metsik-tüüpi viirustega ning teine nakatamine 

(superinfektsioon) Renilla lutsiferaasi ekspresseerivate viirustega. See lähenemine 

võimaldas hinnata superinfektsiooni toimumise efektiivsust kvantifitseerides 

superinfitseeriva viiruse ekspresseeritud lutsiferaasi aktiivsust. Katse viidi läbi 

järgnevalt: 

1. 100% konfluentset BHK-21 rakukultuuri nakatati kahel 6 augusel plaadil SFV või 

SINV-ga m.o.i. (m.o.i. – infektsiooni kordsus (multiplicity of infection)) 10 

tingimustes; kummagi viirusega nakatati kahes augus kasvavaid rakke. Iga plaadi 

puhul jääti kahes augus kasvanud rakud nakatamata. 

2. 6 tunni pärast viidi läbi superinfektsioon kasutades järgmiseid tingimusi: 

- SFV wt nakatatud rakud → 2 auku SFV-Rluc (0.01 m.o.i.); 2 auku SINV-Rluc (0.01 

m.o.i.) 

- SINV wt nakatatud rakud → 2 auku SFV-Rluc (0.01 m.o.i.); 2 auku SINV-Rluc 

(0.01 m.o.i.) 

- mõlemal plaadil olnud nakatamata (kontrollrakud – mock) rakke nakatati SFV-Rluc 

(0.01 m.o.i.) või SINV-Rluc (0.01 m.o.i.) viirustega 

3. 12 ja 16 tundi peale teist nakatamist rakud lüüsiti ja viidi läbi lutsiferaasi 

ekspressiooni mõõtmine. 

25

lutsiferaasi ekspressioon (RLU) 

1,0E+08 

1,0E+07 

1,0E+06 

1,0E+05 

1,0E+04 

1,0E+03 

1,0E+02 

1,0E+01 

1,0E+00 

12 h 

16 h 

SFV wt, 

SFV- 

Rluc 

SFV wt, 

SINV- 

Rluc 

mock, 

SFV- 

Rluc 

SIN wt, 

SFV- 

Rluc 

SIN wt, 

SINV- 

Rluc 

mock, 

SINV- 

Rluc 

proovid 

Diagramm 1. Supeinfektsiooni vältimise näidiseksperimendi tulemused. 

Selle katse tulemused (diagramm 1) näitasid et nagu eeldatud, ei saa alfaviirust 

sisaldavaid rakke nakatada teise sama tüüpi või sarnase alfaviirusega: SFV-ga nakatatud 

rakud ei saa olla efektiivselt nakatatud ei SFV-ga ega SINV-ga, ja vastupidi. Samas olid 

need rakud, mis polnud metsik-tüüpi viirusega nakatatud, vastuvõtlikud mõlemale 

viirusele ning näitasid kõrget lutsiferaasi ekspressiooni taset (vähemalt 100 000 korda 

kõrgemat, kui superinfektsiooni tingimustes nakatatud rakud). 

2. Katsed RDR mutatsiooni sisaldavat nsP2 proteaasi 

ekspresseerivate rakkudega 

Selle katse eesmärgiks oli uurida, kas eelmises katses näidatud superinfektsiooni 

vältimises osaleb viiruse kodeeritud nsP2 proteaas. Katse idee oli iseenesest väga lihtne: 

vaja oli viia rakku individuaalset nsP2 proteaasi ekspresseeriv konstrukt ja pärast seda 

infitseerida nsP2-te ekspresseerivaid rakke viirusega. Esitatud hüpoteesi õigsust 

kinnitavaks tulemuseks oleks rakkude, milles toimub nsP2 ekspressioon, ellujäämine 

peale metsik-tüüpi viirusega nakatamist. Praktilises teostuses on see katse aga väga 

26

keeruline. Probleem on selles, et SFV ja SINV nsP2 valgud on tsütotoksilised. 

Vastavaid ekspressioonikonstrukte on küll lihtne rakkudesse sisse viia, kuid on võimatu 

raske kindlaks teha kas need rakud, kui nad surevad, hukkusid viiruse infektsiooni või 

neid „kaitsva“ nsP2 proteaasi toime tõttu. Teiseks probleemiks on see, et nsP2 

tsütotoksiline toime võib viiruse infektsiooni mõjutada mitte otse, vaid kaudselt: 

toksiline valk kahjustab rakke ja takistab seetõttu alfaviiruse (tõenäoliselt ka muude 

viiruste) infektsiooni. Nende probleemide tõttu prooviti kasutada RDR mutatsiooni 

sisaldavat nsP2 proteaasi ekspresseerivaid plasmiide: tänu tuuma lokalisatsiooni 

signaali muutmisele (RDR mutatsioonile) jääb selliste plasmiidide poolt ekspresseeritud 

proteaas raku tsütoplasmasse, mis vähendab oluliselt tema poolt tingitud 

tsütopatogeenset effekti. Samas pole näidatud, et see mutatsioon mõjutaks viiruse 

võimet tekitada superinfektsiooni blokki (Fazakerley et al., 2002) ja seetõttu võis 

eeldada, et RDR mutatsiooniga nsP2 proteaas on selle funktsiooni osas sarnane metsiktüüpi 

proteaasile. Peale selle arvestati, et kuna alfaviirused replitseeruvad tsütoplasmas, 

peavad ka superinfektsiooni blokiga seotud sündmused aset leidma tsütoplasmas ja 

nsP2 tuumse lokalisatsiooni puudumine ei tohiks neid seega mõjutada. Selle katse 

kriitiliseks osaks on saavutada rakkude 100% transfektsioon – kui see ei õnnestu, saab 

viirus takistamata paljuneda nsP2-te mitteekspresseerivates rakkudes. Selle 

saavutamiseks kasutati rakusorterit. Läbiviidud katse skeem oli järgmine: 

1. 2 x 10 6 BHK-21 rakku transfekteeriti RDR mutatsiooni sisaldavat ja EGFP-ga 

liidetud nsP2 proteaasi (st. nsP2-EGFP fusion-valku) ekspresseeriva plasmiidiga 

2. Nagu eeldatud, oligi EGFP-positiivsete rakkude arv (võrreldes negatiivsete 

rakkudega) transfektsiooni pärast oluliselt alla 100%; seetõttu valiti rakusorteri 

(FACS-Aria) abil välja fluorestseerivad rakud, kokku saadi ca 355000 EGFPpositiivset 

rakku. 

3. EGFP-positiivsed (st. EGFP-nsP2 proteaas liitvalku sisaldavad) rakud ning sama arv 

mock-tranfekteeritud ja sorteeritud kontrollrakke külvati tassidele 

4. Mõlemad tassid infitseeriti wt SFV-ga m.o.i. 10 tingimustes 

5. 1h, 6h, 12h, 24h ning 36h pärast infitseerimist võeti söötmest proovid, mida kasutati 

viiruse tiitri määramiseks 

27

1,0E+09 

1,0E+08 

viiruse tiiter (PFU) 

1,0E+07 

1,0E+06 

1,0E+05 

1,0E+04 

mock - SFV 10 moi 

RDR - SFV 10 moi 

1,0E+03 

1,0E+02 

1 6 12 24 36 

aeg (h) 

Diagramm 2. Wt SFV kasvukõver nsP2(RDR) -EGFP liitvalku ekspresseeerivates 

rakkudes ja kontrollrakkudes. 

Nagu on näha joonisel toodud andmetest (diagramm 2) näitasid selle katse 

tulemused, vastupidiselt esialgsele hüpoteesile, et nsP2(RDR) olemasolu rakkudes 

(vähemalt nsP2(RDR)-EGFP liitvalgu kujul) ei taga rakkudele kaitset homoloogilise (wt 

proteaasi tootva) viiruse infektsiooni eest. Rakkude vaatlemisel oli näha, et nsP2(RDR)- 

EGFP-d ekspresseerivad rakud surevad viirusinfektsiooni tagajärjel peaaegu sama 

kiiresti kui seda valku mitteekspresseerivad kontrollrakud. Peale selle, võttes aluseks 

viiruse kasvukõverad nendes ja kontrollrakkudes, saab järeldada, et viirus paljuneb 

tsütoplasmaatilist lokalisatsiooni omavat proteaasi ekspresseerivates rakkudes isegi 

mõnevõrra efektiivsemalt, kui kontrollrakkudes, kus proteaasi ekspressioon puuudub. 

Siinkohal on aga oluline märkida, et selle katse tulemusi objektiivselt hinnata on väga 

raske. Esiteks, nsP2-EGFP liitvalgu funktsioonid võivad erineda vaba nsP2 omast 

(hiljuti on näidatud, et tsütotoksiliste efektide tekitamise ja ka peremehe immuunvastuse 

mahasurumiseks on vajalik just vaba nsP2 olemasolu). Teiseks, katse tulemused võivad 

olla moonutatud, kuna nakatamiseks kasutatud rakud olid väga suures stressis 

elektroporatsiooni ja sellele järgnenud sorteerimise pärast, ning on võimalik, see stress 

28

võis mõjutada ka rakkude viirusega nakatamise ja selle järgnenud viiruse paljunemise 

efektiivsust. 

3. Katsed rakkudega, milles on võimalik indutseerida nsP2- 

valku ekspressiooni. 

Idee teha nsP2 ekspresseeriv rakuliin sündis seoses sooviga võita ajas (st. käivitada 

nsP2 ekspressioon vahetult enne viirusega nakatamist nii kiiresti ja efektiivselt, kui 

võimalik) ning kaitsta rakke elektroporatsioonist ja rakkude sorteerimisest tingitud 

stressi eest. Samas olid varasemad korduvad katsed näidanud, et nsP2-te pidevalt 

ekspresseerivate rakuliinide saamine on võimatu – valk on toksiline ja seda alaliselt 

ekspresseerivad rakud ei suuda ellu jääda. Seepärast katsetasime alternatiivset 

lähenemist, mis seisnes rakkude transfitseerimises proteaasi geeniga, mis on paigutatud 

sellise indutseeritava promooteri kontrolli alla mida on võimalik kiiresti ja efektiivselt 

käivitada näiteks antibiootikumi lisamisega söötmele. Selle saavutamiseks kasutasime 

Tet-On süsteemi, mille omadused (tootja andmetel) sobisid kõige enam kokku meie 

vajadustega. Nimelt on Tet-On täpselt reguleeritav süsteem, mis tagab soovitud geeni 

ekspressiooni kõrgel tasemel. Geeni ekspressioon käivitub doksütsükliini lisamisega 

söötmele ja seda ekspressiooni taset saab varieerida, muutes antibiootikumi 

kontsentratsiooni söötmes. Maksimaalne ekspressiooni tase Tet-On süsteemis on väga 

kõrge ning on võrreldav maksimaalse tasemega, mida annavad tugevad konstitutiivsed 

imetaja rakkude spetsiifilised promooterid nagu CMV (cytomegalovirus - 

tsütomegaloviiruse) varajane promooter. Erinevalt teistest imetajate rakkudes 

kasutatavatest indutseeritavatest ekspressioonisüsteemidest, on geeni regulatsioon Tet 

süsteemis väga spetsiifiline ning tänu sellele ei ole tulemuste interpreteerimine 

raskendatud pleiotropse efekti või mittespetsiifilise induktsiooni poolt. 

Tet-On süsteemi komponendid on regulatoorne valk (37 kDa valk nimega rtTA), 

mille sünteesi kontrollib pTet-On regulatoorne plasmiid. Plasmiid sisaldab ka 

neomütsiini-resistentsus geeni, mis aitab selekteerida plasmiidiga transfekteeritud rakke 

(ja saada nendest püsiliine) ja vastusvektor, mis ekspresseerib meid huvitavat geeni – 

antud juhul mutantset nsP2 proteaasi (rakuliinide selekteerimisel Renilla lutsiferaasi). 

29

Valitud geeni ekspressiooni kontrollib TRE (tetratsükliinile reageeriv element, 

tetracycline-response element)-d sisaldav promooter. Antud töös kasutatud vastusvektor 

p-TRE-Tight sisaldas modifitseeritud TRE-järjestust ning trankeeritud CMV 

promooterit, milles puudub enhanser-regioon. Sellised modifikatsioonid vähendavad 

basaalset ekspressioonitaset miinimumini ning juhul, kui regulatoorset valku rakus ei 

sünteesita, puudub vastusplasmiidi vahendatud geeniekspressioon peaaegu täiesti. Need 

omadused olid meie eksperimendis, kus nsP2 basaalne ekspressioon ei tohi 

transfekteeritud rakke tappa, eriti olulised. Süsteemi töö põhimõtet on skemaatiliselt 

kujutatud joonisel 4: rakud, mis sisaldavad mõlemaid (regulatoorse ja vastuse) 

plasmiide või nendest pärinevaid ekspressioonikassette transkribeerivad soovitud geeni 

ainult siis, kui rtTA valk seondub TRE elemendiga, see aga toimub doksütsükliini 

juuresolekul. 

Joonis 4. Tet-On süsteemi töö (joonise päritolu: Tet-Off® and Tet-On® Gene Expression 

Systems User Manual, 2005). 

30

NsP2-valgu ekspressiooniks sobivate rakuliinide konstrueerimist on põhjalikult 

kirjeldatud meetodite peatükis. Järgnevalt (tabel 1) on toodud selekteeritud ja 

analüüsitud stabiilselt rtTA valku ekspresseerivate BHK-21 rakkudest saadud kloonide 

näited; analüüsitud on nendes toimuvat induktsiooni efektiivsust. 

Tabel 1. Saadud BHK-21 kloonide näited. 

Klooni number Fooni tase Induktsiooni tase Suhe 

Kloon 2 2766 37916 14 

Kloon 3 6934 65517 9 

Kloon 4 843 28385 34 

Kloon 10 6038 40368 7 

Kloon 12 3013 50435 17 

Kloon 16 753 28030 37 

Kloon 18 19314 47404 2 

Kloon 24 9178 44085 5 

Kloon 31 1871 43726 23 

Kloon 35 4832 302489 63 

Need andmed (nagu ka andmed muude kloonide kohta, mida tabelis pole ära 

toodud) jäävad kaugele maha süsteemi arendaja poolt nimetatud väärtustest 

(induktsiooni efektiivsus kuni 50 000 korda). Lähtudes laboris varasematest nsP2 

rakuliinide konstueerimise kogemustest üritasin leida klooni, mille puhul oleks basaalse 

ja indutseeritud ekspressiooni tasemete erinevus 100-kordne ja suurem (väiksem vahe ei 

taga piisavalt madalat nsP2 ekspressiooni indutseerimata püsiliinis; selle tulemuseks on 

„promooteri lekkimine”, toksilise valgu ekspressioon ja sellest tulenevad kõrvalefektid 

nagu rakkude vastuselektsioon või rakuliini väljasuremine) paraku sellist klooni leida ei 

õnnestunud ja seetõttu tuli loobuda plaanist konstrueerida nsP2-te ekspresseerivad 

püsiliinid. Järgnevates eksperimentides kasutati BHK-21 klooni №35 (BHK-21-35), 

mille basaalse ja indutseeritud ekspressiooni (doksütsükliini kontsentratsioonil 1 mg/ml) 

31

tasemete erinevus oli vastusplasmiidi transientse transfektsiooni korral suurim: 63 korda 

ja nsP2 transientset (plasmiidselt vektorilt) ekspressiooni.. 

Kõigepealt analüüsiti, mis ajal peale doksütsükliini lisamist hakkavad rakud 

aktiivselt tootma nsP2 proteaasi. Selle uurimiseks transfekteeriti BHK-21-35 rakke 

elektroporatsiooni teel pTRE-Tight-nsP2 vastusplasmiidiga ning 14 tundi peale 

transfektsiooni lisati rakkudele doksütsükliini. Rakud lüüsiti valitud ajapunktides ning 

saadud proove analüüsiti Western blot meetodil. Western blot’i analüüsi tulemused on 

näidatud joonisel 5. 

Joonis 5. NsP2 ekspressiooni analüüs nsP2-te ekspresseriva plasmiidiga transfitseeritud ja 

doksütsükliiniga indutseeritud rakkudes Western blot meetodil. Positiivseks kontrolliks on SFVga 

nakatatud rakude lüsaat, analüüsil kasutati SFV nsP2 valgu vastaseid küüliku antikehasid. 

Toodud andmetest on näha, et nsP2 proteaasi tootmine muutub indutseeritud 

rakkudes aktiivseks ja detekteeritavaks 8-10 tundi peale doksütsükliini lisamist. Nendest 

andmetest lähtudes valiti rakkude nakatamise ajaks 16 tundi peale induktsiooni – st. 

aeg, millal nsP2 ekspressioon saavutab kõrge taseme ja edasi oluliselt enam ei suurene. 

Sellist skeemi (14 tundi peale transfektsiooni → doksütsükliini lisamine; 16 tundi peale 

doksütsükliini lisamist → nakatamine) on kasutatud järgnevas eksperimendis, mille 

eesmärgiks oli demonstreerida nsP2 mõju superinfektsiooni inhibeerimisele kasutades 

seekord rakkude transfektsiooni elektroporatsiooni meetodil ilma järgneva rakkude 

sorteerimiseta. Katse tehti ainult SFV nsP2-te kodeerivat vastusplasmiidi kasutades, 

kuid indutseeritud rakkude nakatamiseks kasutati nii SFV wt kui ka SINV wt m.o.i. 

32

0.01 tingimustel. Katses analüüsiti viiruse kasvukõverat, st. uue põlvkonna viiruse 

vabanemist söötmesse. 

1,0E+10 

1,0E+09 


1,0E+08 

1,0E+07 

1,0E+06 

1,0E+05 

1,0E+04 

1,0E+03 

nsP2 puudub, SFV wt 

nsP2 puudub, SINV wt 

SFV nsP2, SFV wt 

SFV nsP2, SINV wt 

1,0E+02 

1 4 8 12 23 36 

aeg peale nakatamist (h) 

Diagramm 3. SFV nsP2 ekspressiooni indutseerimise mõju BHK-rakkudes toimuvale SFV ja 

SINV paljunemisele. 

Saadud andmetest võib järeldada, et kummagi kasutatud viiruse infektsiooni 

efektiivsus ei sõltu sellest, kas SFV nsP2 ekspressioon rakkudes on indutseeritud või 

mitte. Võttes kokku kahe negatiivse tulemuse andnud katse tulemused võib väita, et (1) 

individuaalse nsP2 olemasolu rakkudes pole ilmselt piisav superinfektsiooni vältimise 

mehhanismi toimumiseks, ning (2) transfektsioon elektroporatsiooni meetodil pole 

piisavalt efektiivne meetod katsete teostamiseks BHK-21 rakkudel. Seetõttu ei saa 

täeielikult välistada võimalust, et nende katsete tulemuste põhjuseks olla see, et 

transfekteeritud sai liiga väike protsent rakke ja viiruse infektsioon kulges peamiselt just 

mittetransfekteeritud rakkudes. Tuleb veel arvestada, et katseteks valitud BHK21 

rakkude klooni iseloomustas suhteliselt suur vastusplasmiidilt ekspresseeritud valgu 

33

(kas Rluc või nsP2) basaalse ekspressiooni tase ning sellest tingituna võisid nsP2-te 

ekspresserivat plasmiidi sisaldavad rakud olla juba kahjustunud enne rakkude 

indutseerimist. Siiski tuleb pidada tõenäoliseks, et nimetatud tehnilised põhjused ei saa 

olla täielikult vastutavad negatiivse tulemuse eest (kumbki nendest võiks nähtavat efekti 

vähendada, kuid arvatavasti mitte olematuks muuta). Sellest tulenevalt võib meie 

katsetulemustes väita, et vähemalt individuaalse valguna ei ole nsP2 võimeline olulisel 

määral blokeerima superinfitseerivat viirust. Ei ole tõenäoline, et see on tingitud nsP2 

liiga madalast kontsentratsioonist (vt Joonis 5) – superinfektsiooni blokk alfaviirusega 

nakatatud rakus tekib väga kiiresti, st. ajal, kui nsP2 kontsentratsioon on veel väga 

madal. Seega võib eeldada, et kui nsP2 osaleb superinfektsiooni blokeerimises, siis teeb 

ta seda koos teiste alfaviiruse replikaasi valkudega. 

4. NsP2 mõju uurimine alfaviiruste infektsioonile T7 BHK rakke ja lutsiferaasi 

ekspresseerivaid viiruseid kasutades 

Eelpool väljapakutud hüpoteesi kontrollimiseks otsustasime katsesüsteemi 

täiendada ja analüüsi tundlikust suurendada kasutades selleks järgmiseid lähenemisi: 

1. ekspresseerida rakkudes mitte ainult nsP2 proteaasi, vaid kogu SFV või SINV 

mittestruktuursete valkude blokki (P1234). Nendes katsetes kasutati kummagi 

viiruse puhul kahte polüproteiini varianti – metsik-tüüpi P1234-d ning CA 

mutatsiooniga (C478A mutatsioon nsP2 valgu katalüütilises tsüsteiinijäägis) P1234- 

ja. Vahe nende vahel on järgmine: esimene polüproteiin lõigatakse rakkudes nsP2 

poolt nsP1, nsP2, nsP2 ja nsP4 valkudeks samal ajal kui teine polüproteiin jääb aga 

lõikamata. 

2. muuta transfektsiooni meetodit. Arvestades et BHK-21 rakkude transfektsioon 

elektroporatsiooni meetodil ei ole antud uurimise tarvis piisavalt efektiivne meetod 

(analüüs näitas, et sellel meetodil on raske saavutada, eriti suurte plasmiidide puhul, 

efektiivsust >20%). Kuna transfektsiooni efektiivsus on antud töö seisukohalt 

kriitiline ja vajadus plasmiidi rakutuuma transportida vähendab veelgi viiruse valku 

ekspresseerivate rakkude hulka, siis eeldasime, et palju efektiivsem võimalus oleks 

ekspresseerida viiruse valke rakkude tsütoplasmas paiknevalt plasmiidilt. Kuna ka 

34

alfaviiruste transkriptsioon toimub tsütoplasmas, siis sarnaneb selline 

ekspresseerimise viis enam tõelisele viirusinfektsioonile. Selle eesmärgi 

saavutamiseks kasutati järgnevates katsetes T7 BHK rakuliini, kes toodab T7 RNA 

polümeraasi. 

T7 BHK rakud on BHK-21 rakuliini variant, millel on tänu T7 RNA polümeraasi 

ekspressioonile võime transkribeerida rakku viidud DNA-d otse tsütoplasmas. Süsteemi 

toimimiseks oli vajalik, et kõik katsetes kasutatud konstruktid sisaldaksid T7 

polümeraasile sobivat promooterit. Analüüsi tundlikkuse täiendavaks suurendamiseks 

kasutati selles katses viirused, mis sisaldasid mittestruktuurses alas Renilla lutsiferaasi 

kodeerivat järjestust – Rluc. Lutsiferaasi ekspressiooni aktiivsus sellise viirusega 

nakatatud rakkudes korreleerub viiruse genoomi koopiaarvuga ja võimaldab väga 

täpselt mõõta viiruse replikatsiooni efektiivsust. Seda kinnitasid varasemad meie laboris 

tehtud uuringud, mis näitasid, et nii viiruse RNA koopiaarv kui ka nakatatud rakkudes 

vabaneva viiruse tiiter on otseses korellatsioonis lutsiferaasi ekspressiooni tasemega 

nakataud rakkudes ning et lutsiferaasi ekspressiooni kvantifitseerimine on palju 

tundlikum ja kiirem meetod viirusinfektsiooni intensiivsuse hindamisel kui vabanenud 

viiruse tiitri määramine. Peale seda, midmed erinevad varasemad uuringud 

(immunofluorestents (IF) ja Western blot analüüsid) näitasid, et T7 BHK rakkude 

transfektsioon elektroporatsiooni meetodil on väga effektiivne (üldjuhul on saavutatav 

efektiivsus kõrgem kui 70%) – tõenäoliselt on vahe tavaliste BHK-21 rakkudega 

tingitud sellest, et T7 BHK 21 rakkude puhul ei ole rakkudesse viidud plasmiidilt 

toimuvaks valguekspressiooniks vaja plasmiidi transporti raku tuuma. 

Järgnevate katsete eesmärgiks oli uurida mittestruktuursete valkude (sh. nsP2-e) 

eelvalgu erinevate variantide (metsik-tüüpi või protsessingu suhtes defektsete) mõju 

„superinfitseeriva” SFV ja SINV infektsioonile. Selleks transfitseeriti rakke T7 

promooterit sisaldavate ja polüproteiine ekspresseerivate konstruktidega (iga konstrukti 

puhul kasutati transfektsiooniks 5 µg DNA-d). Transfekteeritud T7 BHK rakke 

kasvatati kuue auguga plaatidel 24 tunni vältel (igas augus oli umbes 1 x 10 6 rakku, 

80% konfluentsus) mille järel nakatati rakke SFV-Rluc või SINV-Rluc viirustega 0.01 

m.o.i. tingimustel. Rakud lüüsiti valitud ajapunktidel ja mõõdeti lutsiferaasi aktiivsus. 

35

Kõik mõõtmised tehti iga konstrukti ja iga ajapunkti jaoks kahes paralleelis, diagrammi 

ehitamiseks kasutati kahe paralleelse mõõtmise keskmist. Katse tulemuste korratavuse 

hindamiseks korrati katset kaks korda; mõlemal korral saadi sarnased tulemused. 

SFV-RLuc 0.01 m.o.i. 

1,0E+09 


1,0E+08 

1,0E+07 

1,0E+06 

10 h 14 h 18 h 


T7 kontroll 

T7 SFV wt 

T7 SFV CA 

T7 SINV wt 

T7 SINV CA 

Diagramm 4. Mittestruktuursete valkude ekspressiooni mõju SFV infektsioonile T7- 

BHK rakkudes. Kontrolliks on kasutatud tühja vektorit mis sisaldab T7 

polümeraasi promooterit. 

Diagrammidel 4 ja 5 toodud andmetest on näha, et SINV polüproteiinide 

ekspressioon takistab oodatult SINV infektsiooni ja, mõnevõrra üllatuslikult, ka SFV 

infektsiooni. Samal ajal oli SFV polüproteiinide ekspressiooni mõju kummalegi viiruse 

replikatsioonile oluliselt väiksem või olematu. Mõnevõrra üllatuslikult olid inhibeerivad 

omadused nii SINV wt kui ka mutantsel polüproteiinil, kusjuures wt P1234 inhibeeris 

efektiivsemalt SFV replikatsiooni samal ajal kui mutantne polüproteiin mõjutas enam 

SINV paljunemist (vahed on küll väikesed, kuid tulemused kordusid mõlemas katses). 

36

SINV-Rluc 0.01 m.o.i. 


1,0E+08 

1,0E+07 

T7 kontroll 

T7 SFV wt 

T7 SFV CA 

T7 SINV wt 

T7 SINV CA 

1,0E+06 

14 h 18 h 22 h 


Diagramm 5. Mittestruktuursete valkude mõju SINV infektsioonile T7-BHK rakkudes. 

SINV-Rluc infektsiooni jälgimiseks on valitud mõnevõrra hilisemad sjapunktid sest 

see viirus replitseerub aeglasemalt kui SFV-Rluc. Kontrolliks on kasutatud tühja 

vektorit mis sisaldab T7 polümeraasi promooterit 

Nende eksperimentide tulemused näitavad, et rakkudes ekspresseeritavad 

alfaviiruste mittestruktuursed valgud (sealhulgas ka nsP2 proteaas) avalduvad 

supresseerivat toimet viirusinfektsioonile. Katse tulemuste kontrollimiseks viidi läbi 

veel täiendav katse (diagrammid 6 ja 7), mille eesmärgiks oli näidata alternatiivse 

meetodiga eelmises eksperimendis saadud tulemuste ja leitud sõltuvuse paikapidavust. 

Selle katse skeem oli sarnane eelmise katsega, ainult et lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmise 

asemel koguti valitud ajapunktides nakatatud plaatidelt viirus-stokkid, mis pärast 

titreeriti. Proovide kogumise ajapunktideks valiti eelmise katse tulemuste põhjal SFV- 

Rluc jaoks 14 tundi ja SINV-Rluc jaoks 18 tundi peale infektsiooni. 

37

SFV-Rluc 0.01 m.o.i., 14 h 

1,0E+08 


1,0E+07 

1,0E+06 

T7 kontroll T7 SFV wt 

T7 SFV 

CA 

T7 SINV 

wt 

transfekteeritud konstrukt 

T7 SINV 

CA 

Diagramm 6. Kontrollkatse SFV-ga. Mittestruktuursete polüproteiinide ekspressiooni 

mõju SFV virionide moodustamisele (vabanenud viirus tiitrile). 

Oodatult andsid ka selle katse rakud, mis sisaldasid T7 kontroll-plasmiidi ning ei 

ekspresseerunud viiruste polüproteiine, kõige suurema vabanenud viiruse saagise. Kui 

võrrelda omavahel SFV ja SINV polüproteiinide ekspresiooni mõju SFV infektsioonile, 

siis oli taas näha, et mõlemad SINV polüproteiinid avaldavad selgelt suuremat 

pidurdavat toimet SFV-le kui SFV enda polüproteiinid, mille ekspressioonist tingitud 

inhibeeriv efekt oli väiksem. Seega näitas see katse sama seaduspärasust, kui 

lutsiferaasi mõõtmisel (viiruse replikatsiooni hindamisel) põhinenud katse. Millega see 

nähtus on seotud, ei ole aga päris selge. Huvitav on ka polüproteiini avaldatava efekti 

sõltuvus temas paikneva nsP2-proteaasi aktiivsusest. Ka selles katses on näha, et SFV 

polüproteiinidest avaldub suuremat pärsivat toimet SFV infektsioonile CA 

mutatsiooniga polüproteiin, SINV polüproteiinidest aga metsik-tüüpi polüproteiin. Kuna 

SINV infektsiooni puhul on olukord väga sarnane, siis võib järeldada, et CA 

mutatsiooniga polüproteiin mõjutab rohkem homoloogilist viirust, kuid vähem 

38

heteroloogilist viirust, metsik-tüüpi polüproteiin aga mõjutab rohkem heteroloogilist 

viirust. See võib viidata sellele, et homoloogilise ja heteroloogilise viiruse infektsioone 

tõkestab polüproteiinide ekspressioon erinevaid mehhanisme kasutades. Peale selle 

kinnitas see analüüs ka ülal toodud järeldust, et SFV polüproteiinid mõjutavad SINV 

infektsiooni väga vähe. See tulemus lubab oletada, et SINV polüproteiinidel ja/või 

nendesse kuuluvatel valkudel on olemas funktsioone, mis SFV valkudel puuduvad või 

on väljendunud vähemal määral. 

SINV-Rluc 0.01 m.o.i., 18 h 

1,0E+09 


1,0E+08 

1,0E+07 

T7 kontroll T7 SFV w t 

T7 SFV 

CA 

T7 SINV 

w t 

transfekteeritud konstrukt 

T7 SINV 

CA 

Diagramm 7. Kontrollkatse SINV-ga. Mittestruktuursete valkude mõju SINV 

infektsioonile (vananenud viiruse tiitrile). 

39

ARUTELU 

Käesoleva magistritöö eesmärgiks oli selgitada, kas SFV ja SINV mittestruktuurne 

valk 2 võiks olla seotud superinfektsiooni vältimise mehhanismiga. Püstitatud eesmärgi 

saavutamiseks kasutati erinevad nsP2 sisaldavate plasmiidide transfektsiooni meetodid 

ning erinevad nsP2 sisaldavaid konstrukte eesmärgiga saavutada vajalikul hetkel kõrge 

nsP2 ekspressioonitase ning samal ajal vältida nsP2-le iseloomuliku tsütotoksilist efekti. 

Vaatamata mitmetele kasutatud lähenemistele tuleb konstateerida, et täiel määral seda 

eesmärki saavutada ei õnnestunud. Selle põhjustena võib tuua puht-tehnilisi asjaolusid, 

näiteks oli ekspresseeritava valgu ekspressioon Tet-On süsteemis oluliselt vähem 

reguleeritav kui seda väitis süsteemi väljatöötaja Clontech; samuti oli väga raske 

saavutada elektroporatsiooniga piisavalt kõrget transfektsiooni efektiivsust 

(lipofektsiooni kasutamine rakkudes, mida järgnevalt infitseeritakse SFV-ga pole aga 

soovitatav, sest transfektsiooni reagendi koostisesse kuuluvad lipiidid mõjutavad 

alfaviiruse replikatsiooni ja paljunemist). Teiseks oluliseks põhuseks on nsP2 

omadused – tema mittespetsiifiline tsütotoksiline efekt võib mõjutada raku elutegevust 

ja selle kaudu igasuguste (ka alfaviiruste perekonda mittekuuluvate viiruste) 

replikatsiooni. Katsed seda tsütotoksilist efekti vähendada ei olnud samuti piisavalt 

edukad: RDR mutatsiooni sisaldavat nsP2 proteaasi ekspresseerivate plasmiide viimine 

rakkudesse ei andnud mingit kaitset alfaviiruse infektsiooni vastu ja viirused paljunesid 

peaaegu võrdse efektiivsusega nii seda valku ekspresseerivates rakkudes kui ka 

kontrollrakkudes. 

Teise katsestrateegiana oli luua nsP2 valku ekspresseeriv rakuliin. See võimaldaks 

ilma suure stressita käivitada rakkudes poreeritud vastusplasmiidis sisalduva nsP2 

proteaasi geeni ekspressiooni, mis toimuks vastusena antibiootikumi lisamisele 

söötmele. Selle skeemi rakendamine põrkus aga kokku kahe takistusega. Esiteks, nagu 

juba mainitud, oli parima leitud klooni basaalse ja indutseeritud geeni ekspressiooni 

tasemete erinevus väga kaugel ideaalsest (ja tootja poolt reklaamitust), täpsemalt oli 

basaalne ekspressiooni tase lubamatult suur, mis võis lubada soovimatut proteaasi 

ekspressiooni ja mõjutada negatiivselt proteaasi ekspresseerivaid rakke. Teiseks oli 

vastusplasmiidi transfektsiooni meetod ebaefektiivne ning seetõttu on tõenäoline, et 

40

viiruse infektsioon kulges peamiselt (kui mitte eranditult) just mittetrasfekteeritud 

rakkudes. Nende takistuste mõju tõttu on selle katse tulemustest näha, et taas ei sõltunud 

kummagi kasutatud viiruse infektsiooni efektiivsus sellest, kas nsP2 ekspressioon oli 

rakkudes on indutseeritud või mitte. 

Kas nende katsete tulemustest võib järeldada, et nsP2 ei ole individuaalse valguna 

võimeline superinfektsiooni takistama? Ülal mainitud tehniliste ja bioloogiliste 

probleemide tõttu seda täie kindlusega väita ei saa. Siiski on tähelepanuväärne, et 

erinevad lähenemised andsid sama tulemuse. Positiivselt transfitseeritud rakkude 

eraldamine rakusorteriga enne viirusega nakatamist ei võimaldanud tuvastada mingit 

„kaitsvat” efekti – pigem oli tulemus vastupidine. Kui nsP2 oleks efektiivne 

superinfektsiooni blokeeriv valk, siis oleks võinud eeldada, vähemalt mingisugust 

viiruse infektsiooni vähenemist, mida aga ei täheldatud. Seega on loogiline järeldada, et 

nsP2 ei ole (täpsemalt, nsP2-RDR ja nsP2-RDR-EGFP) võimeline olulisel määral 

superinfektsiooni blokeerima. 

Kas see tähendab, et varasemad, kirjanduses välja toodud oletused, olid väärad? 

Mitte ilmtingimata – see, et nsP2 üksinda ja kunstlikes tingimustes ei suuda 

superinfektsiooni blokeerida ei välista võimalust, et ta suudab seda teha loomuliku 

infektsiooni kontekstis, olles üheks (või isegi peamiseks) superinfektsiooni blokeerijaks. 

Kaudselt kinnitavad seda võimalust ka siin töös toodud andmed, mis saadi 

alternatiivseid lähenemisi kasutades. Kogu SFV või SINV mittestruktuursete valkude 

blokki ekspresseerivate plasmiide transfektsioon ja nende kodeeritavate valkude 

ekspressioon otse tsütoplasmas toimuvat transkriptsiooni kasutades andis huvitavaid, 

ehkki ootamatuid, tulemusi. Nimelt näitasid need katsed, et rakud, mis toodavad SINV 

mittestruktuurseid valke, omavad märgatavat resistentsust nii SFV kui ka SINV 

infektsioonide suhtes. Peale selle, sellist efekti omasid nii metsik-tüüpi polüproteiin, kui 

ka CA mutatsiooni sisaldav polüproteiin. Huvitav oli see, et CA mutatsiooniga 

polüproteiin mõjutab enam homoloogilist viirust, kuid vähem heteroloogilist viirust, 

metsik-tüüpi polüproteiin aga vastupidi. 

Millest need erinevused võivad tuleneda? Miks on CA polüproteiin võimeline 

inhibeerima homoloogilist viirust? Täpseid andmeid selle kohta meil ei ole, kuid võib 

püstitada mitmesuguseid oletusi. Kui nsP2 proteaasi sisaldavate polüproteiinide 

41

katalüütilises tsüsteiinijäägis asuv mutatsioon blokeerib täielikult polüproteiini 

autokatalüütilised lõikamised, siis tähendab see seda, et selline polüproteiin paikneb 

rakkudes lõikamata olekus ning teoreetiliselt iseenest ta ei pea takistama 

superinfitseeriva viiruse infektsiooni. Kui aga rakus sisalduvad ka superinfitseeriva 

viiruse toodetud metsik-tüüpi polüproteiinid, siis in trans toimuva proteolüütilise 

lõikamise tulemusena moodustub P12CA34 valgust P12 polüproteiin, nsP3 ja nsP4 

valgud. P12 edasist lõikamist ei toimu (sest see nõuab proteaasi olemasolu in cis) ja see 

valk koguneb rakku. Seega on teoreetiliselt võimalik, et P12 mitteprotsessitav liitvalk 

takistabki superinfitseeriva viiruse paljunemist. Selle teooria nõrgaks kohaks on asjaolu, 

et normaalses alfaviiruse infektsioonis protsessimata P12 liitvalku ei kogune ja seega ei 

saa P12 olla peamiseks faktoriks, mis takistab looduslikku superinfektsiooni. Erinevalt 

P12-st on vabad (replikatsiooni kompleksi mittekuuluvad) nsP3 ja nsP4 valgud 

iseloomulikud ka loomulikule SFV infektsioonile (eriti selle lõppstaadiumitele; SINV 

puhul jäävad nad P34 liitvalguks), kuid kas ja millisel viisil nad takistavad 

superinfektsiooni toimumist ei ole selge. Alternatiivne oletus on, et lõpuni 

mitteprotsessitavate defektsete polüproteiinide olemasolu rakus takistab 

superinfitseeriva viiruse infektsioonitsükli regulatsiooni, nt. subgenoomse RNA sünteesi 

aktiveerimist. Selle saavutamiseks peavad kõik viiruse polüproteiinid olema lahti 

lõigatud, mida antud katse tingimustes ei toimu: rakku jäävad muteeritud polüproteiinid. 

Samas ei selgita see teooria superinfektsiooni bloki toimumist loomulikus 

viirusinfektsioonis, mille puhul kumbki viirustest, ei esmaselt nakatav ega 

superinfitseeriv viirus ei ole mutantne ja toodab ainult „normaalseid“ replikaasivalke. 

Miks takistab SINV P1234 SFV replikatsiooni? On võimalik, et erinevalt SFV 

nsP2-st on SINV nsP2, mis moodustub polüproteiini protsessingul võimeline lõikama 

superinfitseeruva viiruse polüproteiine ning takistama selle viiruse primaarsete 

replikatsioonikopleksite (RCmiinus) formeerumist ja genoomi replitseerumist. Selleks, 

et selgitada välja selle protsessi täpne mehhanism ja teha kindlaks, miks inhibeerimine 

ei toimu vastupidises suunas (st. miks SFVP1234 ekspressioon peaaegu ei mõjuta SINV 

infektsiooni) on vaja teha veel täiendavad katsed ja uuringud. 

Kokkuvõtlikult võib öelda, et selle uurimustöö raamides läbiviidud katsed ei 

andnud piisavalt selgeid tulemusi ning superinfektsiooni vältimise nähtus nõuab veel 

42

uurimist. Edasiste katsete teostamisel tuleb leida uued lähenemised ja võimalused, 

kuidas endiseid probleeme vältida ja edu saavutada. Üheks heaks võimaluseks oleks 

kasutada alfaviirusi, mille nsP2 proteaas pole imetajarakkudele toksiline, näiteks VEEV 

(Venetsueela hobuste entsefalomüeliidi viirus, Venezuelan equine encephalomyelitis 

virus) või EEEV (Ida hobuste entsefaliidi viirus, Eastern equine encephalitis virus). 

Nende viiruste nsP2 proteaasi T7 promooteri vahendusel ekspresseerivaid konstrukte 

võiks kasutada T7 BHK rakkudes. See strateegia võimaldab saavutada kõrge 

transfektsiooni efektiivsuse, samas garanteerib tsütotosilise funktsiooni puudumine 

VEEV nsP2 selle, et rakud, mis ekspresseerivad nsP2 proteaasi, ei ole juba enne 

superinfitseeriva viiruse sisenemist proteaasiga kahjustatud. Samuti võimaldaks 

mittetsütotoksilise nsP2 valgu kasutamine konstrueerida stabiilseid (sh. indutseritavaid) 

rakuliine. Selle lähenemise probleemiks on asjaolu, et VEEV on SFV ja SIN suhtes 

süstemaatiliselt kaugel paiknev alfaviirus, mille infektsioon (ja tõenäoliselt ka nsP2 

ekspressioon) ei takista superinfitseeriva viirusena Renilla lutsiferaasi ekspresseerivate 

SFV ja SINV, mis näitasid end väga hästi käesoleva magistritöö katsetes, paljunemist. 

Vaja oleks kasutada analoogilisi VEEV konstrukte, kuid siin on kaks probleemi: 

selliseid reporter viiruseid pole VEEV puhul tehtud ja, mis on eriti probleemne, VEEV 

on BSL3 (mõnedes kvalifikatsioonides isegi BSL4) taseme patogeen, millega töötamine 

nõuab vastava taseme bio-ohutuse labori kasutamist. 

Teise variandina, kuidas võiks uurida superinfektsiooni vältimise nähtust ja samal 

ajal vältida nsP2 tsütotoksilisusest tulenevaid probleeme, võiks pakkuda putukarakkude 

kasutamist, sest putukarakkudes pole nsP2 tsütotoktiline. See variant tundub olema väga 

loomulik, sest viirused on evolutsiooni käigus välja kujundatud mehhanisme, mille abil 

nad saavad putukarakkudes paljuneda ilma neid rakke kahjustamata. Seega võiksid 

putukarakud olla väga heaks mudelsüsteemiks. Probleemiks on aga jälle kõrge 

transfektsiooni efektiivsuse saavutamises. Putukarakke on elektroporatsiooni meetodidl 

väga raske transfekteerida: eelkatsed näitasid, et selle meetodi kasutamine annab 

sedavõrd väga vähe positiivseid rakke, nende rakkude kasutamine superinfektsiooni 

vältimise katsetes on peaaegu võimatu. Samas ei eksisteeri moskiitorakkude liini, mis 

ekspresseeriks T7 polümeraasi, et saaks kasutada seda strateegiat, mis andis häid 

tulemusi BHK rakkude puhul. Täiendavaks probleemiks on RNA-interferents: 

43

putukarakkudest on lihtne teha püsiliine (sh. nsP2 ekspressiooni jaoks), kuid reeglina ei 

toimu nendes rakkudes (ehkki nende genoom sisaldab integreerunud võõrgeeni) 

võõrvalgu ekspressiooni – see on maha surutud selle mRNA vastu suunatud RNAi 

poolt. Seega putukarakkude jaoks tuleb veel otsida sobivat transfektsiooni meetodit 

(mitmesugused lipiididel põhinevad süsteemid on paljulubavad, ehkki nende 

kasutamine per se võib mõjutada alfaviiruse infektsiooni transfitseeritud rakkudes) ning 

konstrueerida selle meetodi jaoks sobivaid konstrukte. Igal juhul võib seda lähenemist 

pidada ratsionaalsemaks, kui VEEV nsP2 proteaasi kasutamist ja/või uute 

imetajarakkudel põhinevate süsteemide konstrueerimist. 

Millised oleksid võimalused takistada viiruse levikut superinfektsiooni takistamise 

mehhanisme kasutades? Kahjuks jäid käesolevas töös läbiviidud katsete tulemused 

sellisteks, et ei näidanud otsest võimalust selle eesmärgi saavutamiseks. Siiski võib 

lõpetuseks välja pakkuda mõned üldised ideed. Kui tulevaste katsete abil õnnestub 

selgitada, missugune mittestruktuurne valk või valkude kombinatsioon vastutab 

superinfektsiooni vältimise eest, siis saaks konstrueerida viiruspartiklid või kunstlikud 

viirused, mis ise ekspresseeriksid seda kaitsevalku või sisaldaksid vastavate valkude 

ekspressiooniks vajalike geene, mida saaks putukarakkude genoomi sisse viia, nagu see 

toimub geeniteraapia puhul või geneetiliselt modifitseeritud taimede loomisel, mis 

omavad selle abil resistentsust parasiidide vastu. Nende kuntlike viirustega võiks 

nakatada putukate populatsiooni. Siin võib rakendada kahte strateegiat. Esimese 

strateegia puhul sisaldavad saadud geneetiliselt modifitseeritud putukud oma geenides 

kaitsevalke inserteeritud kujul, teise strateegia puhul on aga putukad persistentselt 

infitseeritud kunstliku viirusega, mis toodab kaitsevalke kogu putukaelu vältel. Mõlemal 

juhul hakkavad need putukad omama resistentsust superinfitseetivate alfaviiruste suhtes 

ning takistavad selle kaudu alfaviiruste levikut. Siinkohal tuleb veel aga lahendada 

paljusid tehnilisi ja bio-ohutusega seotud probleeme. Tuleb näidata, et kunstlikud 

viirused on inimeste jaoks ohutud, et nad saavad nakatada ainult putukaid ning et 

putukaorganismis nakatavad nad neid rakke, mis on märklaudrakkudes ka metsikalfaviiruste 

jaoks. See muudab selle lähenemise keeruliseks. Alternatiivsete 

võimalustena võivad arvesse tulla superinfektsiooni blokeerimise mehhanismi 

mimikreerivad madalamolekulaarsed ühendid (nt. peptiidid), mille sisseviimine putuka 

44

organismi blokeerib seal alfaviiruse infektsiooni. Tõenäoliseks probleemiks on siin 

selliste ühendite maksumus, mis muudab nende kasutamise kalliks. 

Kõikide nende mitmekülgsete lähenemist ja seni veel lahendamata alusuuringute 

valdkonda kuuluvate ülesannete lahendamine võiks anda alguspunkte veel paljudele ja 

paljudele uurimistöödele; ka on vajalikud ulatuslikud rakenduslikud uuringud. Siiski 

olen arvamusel, et kunagi tulevikus võib putukate kaitsmine ja sellel teel inimesele 

ohtike viiruste levimise takistamine superinfektsiooni vältimise mehhanismi abil saada 

reaalsuseks. 

45

KOKKUVÕTE 

Superinfektsiooni vältimise nähtus on viiruste maailmas laialt levinud. Tänaseks 

on avastatud erinevaid mehhanisme, mille abil üks või teine viirus seda teostab. Nende 

mehhanismide uurimine võiks olla väga perspektiivne uurimissuund eriti seoses uute 

potentsiaalsete viirus-vastaste ravimite sihtmärkide otsimisega. 

Käesoleva magistritöö teoreetilises osas on kirjeldatud praegusel ajal käibel 

olevat teooriat, mille järgi võiks alfaviiruste superinfektsiooni vältimise mehhanismis 

osaleda või isegi olla selle mehhanismi peamiseks faktoriks alfaviiruste 

mittestruktuurne valk kaks. Eeldatakse, et rakus replitseeruva alfaviiruse nsP2 valgu 

proteaasne aktiivsus lõikab superinfitseeruva viiruse replikaasi polüproteiini enneagselt 

(või valest kohast), blokeerides selle kaudu teisena rakku sisenenud viiruse 

replikatsiooni. 

Töö eksperimentaalse osa eesmärgiks oli näidata, et rakud, mis ekspresseerivad 

nsP2 proteaasi, omavad resistentsust superinfitseeruva viiruse suhtes. Samal ajal oli vaja 

kaitsta proteaasi ekspresseerivaid rakke nsP2-le iseloomuliku kõrge tsütotoksilisuse 

eest. Esialgu prooviti seda ülesannet lahendada ekspresseerides rakkudes RDR 

mutatsiooniga nsP2 proteaasi, teiseks strateegiaks oli konstrueerida proteaasi 

ekspresseeriv indutseeritav rakuliin. Paraku ei andnud kumbki nendest lähenemistest 

häid tulemusi: ekspresseritava nsP2-poolset kaitsvate efekti ei tähendatud, kui kuna 

selle puudumist sai seletada tehniliste probleemidega ei võimaldanud need katsed ka 

välistada nsP2 rolli superinfektsiooni blokeerijana. 

Parimaid tulemusi andsid katsed T7 RNA polümeraasi ekspresseerivate BHK-21 

rakkudega, mis transkribeerisid tsütoplasmas viiruste metsik-tüüpi ning CA 

mutatsiooniga polüproteiine ekspresseerivaid plasmiide. Need katsed näitasid, et 

rakkudes ekspresseeritavad nsP2 valku sisaldavad polüproteiinid võivad tõepoolest 

superinfitseeruva viiruse paljunemist maha suruda, kusjuures SINV polüproteiinid 

avaldasid suuremat mõju nii SINV kui ka SFV infektsioonidele. Leiti ka väga huvitav 

sõltuvus: CA mutatsiooniga polüproteiinid mõjutasid enam homoloogilise viiruse ning 

metsik-tüüpi polüproteiinid rohkem heteroloogilise viiruse paljunemist. Selle nähtuse 

põhjus ei ole selge, kuid sellised erinevused võivad viidata erinevatele 

46

toimehhanismidele, mille kaudu viiruste polüproteiinid toimivad homoloogilise ja 

heteroloogilise superinfektsiooni korral. Lisaks järeldub saadud tulemustest, et nsP2 

proteaas võib olla pole ainus valk, mis osaleb alfaviiruste superinfektsiooni vältimise 

nähtuses. 

47

SUMMARY 

Influence of Semliki Forest virus and Sindbis virus nonstructural 

protein nsP2 on a superinfection 

Marina Shunina 

The superinfection exclusion is the phenomenon inherent for many 

systematically different viruses. Nowadays mechanisms of the superinfection exclusion 

are known for several, but not for all, these viruses. At the same time the analysis of 

these mechanisms represents perspective direction of a research since information about 

mechanisms of superinfection exclusion can lead to identification of novel mechanisms 

of action for new potential antivirals. 

In a theoretical part of this work the current theory according to which the key 

role in the mechanism of the superinfection exclusion of alphaviruses is attributed to the 

nonstructural protein 2 (nsP2) is described. The theory is based on assumption that the 

«free» nsP2 protease, being expressed in infected cell by the first incoming alfavirus, 

will process a ns-polyprotein of super-infecting virus using alternative pathway which 

interferes with formation of early replicase and thus with full infection cycle of the 

superinfecting virus. 

The initial purpose of an experimental part of this work was to demonstrate that 

cells, which express nsP2 protease, possess resistance to the superinfecting virus. At the 

same time it was necessary to protect these cells from a strong cytopathogenic effects 

characteristic for nsP2 expression. For this purpose the nsP2 with RDR mutation was 

used and construction of cell-line, expressing nsP2 induceable manner, was attempted. 

Unfortunately neither of these approaches resulted in distinctive results: the protective 

effect of nsP2 was not detected, however this could be attributed to technical problems 

and thus it was not possible to rule out the role of nsP2 in superinfection exclusion 

either. 

Better results were obtained in experiments using line of BHK cells containing 

T7 RNA polymerase which allows these cells to transcribe constructs encoding wildtype 

and mutated polyproteins (which did contain mutation inactivating nsP2 protease – 

48

the CA mutation) in the cytoplasm. This experiments revealed that both native and 

mutant polyproteins influenced subsequent Semliki Forest virus (SFV) and Sindbis 

virus (SINV) infections; expression of SINV polyproteins reproducibly had bigger 

impact on both viruses. Additionally an interesting correlation was observed: the 

polyprotein with the CA mutation always influenced the replication of homologous 

virus in bigger extent than that of heterologous virus; at the same time the expression of 

wild-type polyprotein influenced more the replication of heterologous virus. These 

reasons for these results are not understood yet, however this data indicates that viral 

polyproteins may use different mechanisms of action to interfere with infection by 

homologous or heterologous viruses. It can also be suggested that most probably nsP2 is 

not the only factor involved in the mechanism of superinfection exclusion in case of 

alphaviruses. 

49

LISA 

Joonis 6. pTet-On – rtTA valku kodeeriv regulatoorne plasmiid (joonise 

päritolu: Tet-Off® and Tet-On® Gene Expression Systems User Manual, 2005). 

50

Joonis 7. pTRE-Tight vastusplasmiid, kuhu multikloneerimissaiti (MCS) on 

kloneeritud Rluc järjestus (pTRE-Tight-Rluc vastusplasmiidi puhul) või nsP2 valgu järjestus 

(pTRE-Tight-nsP2 vastusplasmiidi puhul) (joonise päritolu: Tet-Off® and Tet-On® Gene 

Expression Systems User Manual, 2005). 

51

KASUTATUD KIRJANDUS 

Barton, D. J., S. G. Sawicki, and D. L. Sawicki. 1991. Solubilization and 

immunoprecipitation of alphavirus replication complexes. J. Virol. 65:1496-1506. 

Buchholz, U. J., Finke, S. and Conzelmann, K.-K. 1999. Generation of bovine 

respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus 

replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional 

BRSV genome promoter. J. Virol. 73:251–259. 

de Groot, R. J., W. R. Hardy, Y. Shirako, and J. H. Strauss. 1990. Cleavage-site 

preferences of Sindbis virus polyproteins containing the nonstructural proteinase: 

evidence for temporal regulation of polyprotein processing in vivo. EMBO J. 9:2631- 

2638. 

de Groot, R. J., T. Rumenapf, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, and J. H. Strauss. 1991. 

Sindbis virus RNA polymerase is degraded by the N-end rule pathway. Proc. Natl. 

Acad. Sci. USA 88:8967-8971. 

Dryga, S. A., Dryga, O. A. and Schlesinger, S. 1997. Identification of mutations 

in a Sindbis virus variant able to establish persistent infection in BHK cells: the 

importance of a mutation in the nsP2 gene. Virology 228:74-83. 

Ehrengruber, M. U., Goldin, A. L. 2007. Semliki Forest virus vectors with 

mutations in the nonstructural protein 2 gene permit extended superinfection of 

neuronal and non-neuronal cells. J. Neurovirol. 13(4):353-363. 

Fazakerley, J. K., Boyd, A., Mikkola, M. L. and Kääriäinen, L. 2002. A single 

amino acid change in the nuclear localization sequence of the nsP2 protein affects the 

neurovirulence of Semliki Forest virus. J. Virol. 76:392-396. 

Frolova, E. I., R. Z. Fayzulin, S. H. Cook, D. E. Griffin, C. M. Rice, and I. 

Frolov. 2002. Roles of nonstructural protein nsP2 and alpha/beta interferons in 

determining the outcome of Sindbis virus infection. J. Virol. 76:11254-11264. 

Garoff, H., Simons, K. and Dobberstein, B. 1978. Assembly of the Semliki Forest 

virus membrane glycoproteins in the membrane of the endoplasmic reticulum in vitro. 

J. Mol. Biol. 124:587-600. 

52

Garoff, H., Huylebroeck, D., Robinson, A., Tillman, U. and Liljeström, P. 1990. 

The signal sequence of the p62 protein of Semliki Forest virus is involved in initiation 

but not in completing chain translocation. J. Cell Biol. 111:867-876. 

Gorbalenya, A. E., E. V. Koonin, A. P. Donchenko, and V. M. Blinov. 1988. A 

conserved NTP-binding motif in putative helicases. Nature (London) 333:22. 

Gorbalenya, A. E., E. V. Koonin, and Y. I. Wolf. 1990. A new superfamily of 

putative NTP-binding domains encoded by genomes of small DNA and RNA viruses. 

FEBS Lett. 262:145-148. 

Gorchakov, R., Garmashova, N., Frolova, E., Frolov, I. 2008. Different Types of 

nsP3-Containing Protein Complexes in Sindbis Virus-Infected Cells. J. Virol. 82:10088- 

10101. 

Griffin, D. E. 2006. Alphaviruses. In Fields Virology. 5th Edition. Volume one. 

D. M. Knipe and P. M. Howley, eds. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins. 

pp. 1023–1060. 

Hahn, Y. S., E. G. Strauss, and J. H. Strauss. 1989. Mapping of RNAtemperature-sensitive 

mutants of Sindbis virus: assignment of complementation groups 

A, B, and G to nonstructural proteins. J. Virol. 63:3142-3150. 

Helenius, A., Kartenbeck, J., Simons, K., Fries, E. 1980. On the entry of Semliki 

Forest virus into BHK-21 cells. J. Cell Biol. 84:404-420. 

Hodgman, T. C. 1988. A new superfamily of replicative proteins. Nature 

(London) 333:22-23. 

Hong, E. M., Perera, R., Kuhn, R. J. 2006. Alphavirus capsid protein helix I 

controls a checkpoint in nucleocapsid core assembly. J. Virol. 80:8848-8855. 

Karpf, A. R., Lenches, E., Strauss, E. G., Strauss, J. H., Brown, D. T. 1997. 

Superinfection exclusion of alphaviruses in three mosquito cell lines persistently 

infected with Sindbis virus. J Virol 71:7119–7123. 

Kääriäinen, L. and Ahola, T. 2002. Functions of alphavirus nonstructural 

proteins in RNA replication. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 71:187-222. 

Lemm, J. A., and C. M. Rice. 1993. Roles of nonstructural polyproteins and 

cleavage products in regulating Sindbis virus RNA replication and transcription. J. 

Virol. 67:1916-1926. 

53

Lemm, J. A., T. Rumenapf, E. G. Strauss, J. H. Strauss, and C. M. Rice. 1994. 

Polypeptide requirements for assembly of functional Sindbis virus replication 

complexes: a model for the temporal regulation of minus-strand and plus-strand RNAsynthesis. 

EMBO J. 13:2925-2934. 

Levine, B., Huang, Q., Isaacs, J. T., Reed, J. C., Griffin, D. E., Hardwick, J. M. 

1993. Conversion of lytic to persistent alphavirus infection by the bcl-2 cellular 

oncogene. Nature 361:739–742. 

Liljeström, P. and Garoff, H. 1991. Internally located cleavable signal sequences 

direct the formation of Semliki Forest virus membrane proteins from a polyprotein 

precursor. J. Virol. 65:147-154. 

Liljeström, P., Lusa, S., Huylebroeck, D. and Garoff, H. 1991. In vitro 

mutagenesis of a full-length cDNA clone of Semliki Forest virus: the small 6,000- 

molecular-weight membrane protein modulates virus release. J. Virol. 65:4107-4113. 

Loewy, A., Smyth, J., von Bonsdorff, C. H., Liljeström, P. and Schlesinger, M. J. 

1995. The 6-kilodalton membrane protein of Semliki Forest virus is involved in the 

budding process. J. Virol. 69:469-475. 

Lulla, V. 2007. Replikation strategies and applications of Semliki Forest virus. 

Dissertation. 

Lulla, V., Sawicki, D. L., Sawicki, S. G., Lulla, A., Merits, A., Ahola, T. 2008. 

Molecular defects caused by temperature-sensitive mutations in Semliki Forest virus 

nsP1. J. Virol. 82(18):9236 - 9244. 

Mackenzie, J. S., Lindsay, M. D., Coelen, R. J., Broom, A. K. et al. 1994. 

Arboviruses causing human disease in the Australasian zoogeographic region. Arch. 

Virol. 136:447-467. 

Marsh, M. and Helenius, A. 1989. Virus entry into animal cells. Adv. Virus Res. 

36:107-151. 

McInerney, G. M., Smit, J. M., Liljeström, P. and Wilschut, J. 2004. Semliki 

Forest virus produced in the absence of the 6K protein has an altered spike structure as 

revealed by decreased membrane fusion capacity. Virology. 325:200-206. 

54

Melancon, P. and Garoff, H. 1986. Reinitiation of translocation in the Semliki 

Forest virus structural polyprotein: identification of the signal for the E1 glycoprotein. 

EMBO J. 5:1551-1560. 

Melancon, P. and Garoff, H. 1987. Processing of the Semliki Forest virus 

structural polyprotein: role of the capsid protease. J. Virol. 61:1301-1309. 

Merits, A., Vasiljeva, L., Ahola, T., Kääriäinen, L. and Auvinen, P. 2001. 

Proteolytic processing of Semliki Forest virus-specific non-structural polyprotein by 

nsP2 protease. J. Gen. Virol. 82:765-773. 

Peranen, J., M. Rikkonen, P. Lilestrom, and L. Kiiariainen. 1990. Nuclear 

localization of the Semliki Forest virus-specific nonstructural protein nsP2. J. Virol. 

64:1888-1896. 

Perri, S., Driver, D. A., Gardner, J. P., Sherrill, S., Belli, B. A., Dubensky, T. W., 

Jr. and Polo, J. M. 2000. Replicon vectors derived from Sindbis virus and Semliki 

Forest virus that establish persistent replication in host cells. J. Virol. 74:9802-9807. 

Pesonen, M. and Kääriäinen, L. 1982. Incomplete complex oligosaccharides in 

Semliki Forest virus envelope proteins arrested within the cell in the presence of 

monensin. J. Mol. Biol. 158:213-230. 

Raghow, R. S., Grace, T. D., Filshie, B. K., Bartley, W., Dalgarno, L. 1973. Ross 

River virus replication in cultured mosquito and mammalian cells: virus growth and 

correlated ultrastructural changes. J Gen Virol. 21:109–122. 

Rikkonen, M., J. Peranen, and L. Kaariainen. 1992. Nuclear and nucleolar 

targeting signals of Semliki Forest virus nonstructural protein nsP2. Virology 189:462- 

473. 

Rubach, J. K., Wasik, B. R., Rupp, J. C., Kuhn, R. J., Hardy, R. W., Smith, J. L. 

2009. Characterization of purified Sindbis virus nsP4 RNA-dependent RNA polymerase 

activity in vitro. Virology 384(1):201-208. 

Sawicki, D. L., S. G. Sawicki, S. Keranen, and L. Kiarialinen. 1981. Specific 

Sindbis virus coded function for minus-strand RNA synthesis. J. Virol. 39:348-358. 

Sawicki, S. G., D. L. Sawicki, L. Kiiariainen, and S. Keranen. 1981. A Sindbis 

virus mutant temperature-sensitive in the regulation of minus-strand RNA synthesis. 

Virology 115:161-172. 

55

Sawicki, D. L., and S. G. Sawicki. 1985. Functional analysis of the A 

complementation group mutants of Sindbis HR virus. Virology 144:20-34. 

Sawicki, D. L., and S. G. Sawicki. 1993. A second nonstructural protein 

functions in the regulation of alphavirus negative-strand RNA synthesis. J. Virol. 

67:3605-3610. 

Shirako, Y., and J. H. Strauss. 1994. Regulation of Sindbis virus RNA 

replication: uncleaved P123 and nsP4 function in minus strand RNA synthesis whereas 

cleaved products from P123 are required for efficient plus strand RNA synthesis. J. 

Virol. 68:1874-1885. 

Smithburn, K. C., Haddow, A. J. 1944. Semliki Forest virus. I. Isolation and 

pathogenic properties. J Immunol. 49:141–157. 

Stollar, V. and Shenk, T. E. 1973. Homologous Viral Interference in Aedes 

albopictus Cultures Chronically Infected with Sindbis Virus. J. Virol. 11(4):592–595. 

Strauss, E. G., C. M. Rice, and J. H. Strauss. 1983. Sequence coding for the 

alphavirus nonstructural proteins is interrupted by an opal termination codon. Proc. 

Natl. Acad. Sci. USA 80:5271-5275. 

Strauss, J. H. and Strauss, E. G. 1994. The Alphaviruses: gene expression, 

replication and evolution. Microbiol. Rev. 58(3):491-562. 

Takkinen, K., J. Peranen, and L. Kiaarifiinen. 1991. Proteolytic processing of 

Semliki Forest virus-specific non-structural polyprotein. J. Gen. Virol. 72:1627-1633. 

Tamberg, N., Lulla, V., Fragkoudis, R., Lulla, A., Fazakerley, J. K. and Merits, 

A. 2007. Insertion of EGFP into the replicase gene of Semliki Forest virus results in a 

novel, genetically stable marker virus. J. Gen. Virol. 88:1225–1230. 

Taylor, R. M., H. S. Hurlbut, T. H. Work, J. R. Kingsbury and T. E. Frothingham. 

1955. Sindbis virus: A newly recognized arthropod-transmitted virus. Am. J. Trop. 

Med. Hyg. 4:844-846. 

Tomar, S., Hardy, R. W., Smith, J. L., Kuhn, R. J. 2006. Catalytic Core of 

Alphavirus Nonstructural Protein nsP4 Possesses Terminal Adenylyltransferase 

Activity. J. Virol. 80:9962-9969. 

Wang, Y.-F., S. G. Sawicki, and D. L. Sawicki. 1991. Sindbis virus nsPl functions 

in negative-strand RNA synthesis. J. Virol. 65:985-988. 

56

Tet-Off® and Tet-On® Gene Expression Systems User Manual, 2005. 

(www.clontech.com). 

57

Semliki Forest viiruse ja Sindbis viiruse mittestruktuurse valgu nsP2 ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?