ODREDIVANJE ANTOCIJANINA U CRNOM GROZDU PRIMJENOM ...

ODREĐIVANJE ANTOCIJANINA U CRNOM
GROŽĐU PRIMJENOM HPLC METODE S
ELEKTROKEMIJSKIM DETEKTOROM
Ivana Novak,dipl.ing.
Prehrambeno-tehnolo
tehnološki fakultet,Osijek

POLIFENOLI
predstavljaju veliku grupu prirodnih
spojeva vrlo raširenih u biljnom svijetu
glavni nutritivni izvori polifenola su: voće,
povrće, sjemenke, te napici kao što su
čajevi, voćni sokovi, vino i kava
7
6
Difenilpropan
8
O
A C 2 3
5
4
2’
1’
3’
B
6’
4’
5’
podjela polifenola:
ne-flavonoidi
fenolne kiseline
stilbeni
flavonoidi
flavoni
flavanoli
flavonoli
flavanoni
izoflavoni
antocijanidini

značaj flavonoida:
primjena u prehrambenoj industriji
pozitivno djelovanje na ljudsko zdravlje
U samim biljkama antocijanini djeluju:
- antibakterijski,
- antifungalno,
- kao agensi koji privlače insekte koji
sudjeluju u oprašivanju biljaka,
- pružaju zaštitu od štetnog UV
zračenja
Biološke funkcije flavonoida pripisuju se
njihovoj izvanrednoj antioksidacijskoj i
antiradikalskoj aktivnosti.

GROŽĐE
ĐE kao izvor polifenola
crne sorte grožđa predstavljaju iznimno bogat
izvor flavonoida
oko 70% polifenola dolazi u sjemenci dok oko
30% dolazi u kožici grožđa
Polifenolni spojevi identificirani u
grožđu su:
flavan-3-oli (katehin i epikatehin),
polimeri (procijanidini) i oligomeri
(tanini) flavan-3-ola,
flavonoli (kvercetin, miricetin),
antocijanidini.
Antocijanini – u kožici grožđa
Sadržaj antocijanina u grožđu
kreće se od 12 do 30 mg/g

ANTOCIJANINI
predstavljaju najrašireniju i najznačajniju grupu prirodnih
biljnih pigmenata
odgovorni su za širok spektar boja u biljkama i biljnim
proizvodima, uključujući narančastu, crvenu, ljubičastu i plavu
Osnovna struktura
antocijanidina -
flavilijev kation
R1
OH
antocijanini su po svom
kemijskom sastavu glikozidi
antocijanidina
HO
O+
R2
antocijanin = antocijanidin + šećer
OH
OH

Euroazijske vrste grožđa (Vitis vinifera) sadrže sljedeće
antocijanine:
Cijanidin-3-O-glukozid
Peonidin-3-O-glukozid
OH
OCH 3
OH
+
OH
OH
+
OH
O-Gluc
O-GLuc
OH
OH
Petunidin-3-O-glukozid
Malvidin-3-O-glukozid
OH
+
OH
OH
OH
OH
+
OCH 3
OH
OCH 3
OH
O-Gluc
OH
O-Gluc

antocijanini određuju boju vina
koncentracija antocijanina u vinu određena sadržajem
antocijanina u grožđu i tehnološkim postupkom proizvodnje vina
sadržaj antocijanina u grožđu ovisi o :
vrsti grožđa,
klimatskim faktorima,
uvjetima uzgoja vinove loze,
sastavu tla,...
i povećava se tijekom zrenja grožđa.
Indikator zrelosti grožđa – “phenolic maturity”

SPEKTROSKOPSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA
antocijanini intenzivno apsorbiraju u vidljivom dijelu spektra, što je
posljedica efikasne delokalizacije i rezonancijske stabilizacije u
aromatskom π elektronskom sustavu molekula
maksimum apsorbancije antocijanina je oko 520 nm
mAU
175
191.91 603.20
mAU
175
191.91
603.20
Peonidin-3-glukozid
150
150
125
Cijanidin-3-glukozid
125
100
100
75
75
50
Malvidin-3-glukozid
50
25
25
Delfinidin-3-glukozid
200 300 400 500
nm
200 300 400 500
nm
Spektri antocijanina

+H +
kinoid
flavilijev kation
-H + + H 2 O
halkon pseudobaza
karbinol pseudobaza

apsorpcijski spektri malvina kod različitih pH vrijednosti

ELEKTROKEMIJSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA
R 1
antocijanini podliježu
elektrokemijskoj
oksidaciji
OH
+
R 3
OH
R 2
elektroaktivne
fenolne skupine
OH
Mehanizam elektrokemijske oksidacije antocijanina

elektroketrokemijska svojstva antocijanina utvrđena su
primjenom elektrokemijskih metoda cikličke voltametrije,
diferencijalne pulsne voltametrije i pravokutno valne voltametrije
elektrokemijske metode daju podatak o:
mehanizmu elektrokemijske oksidacije spojeva
elektrokemijskim svojstvima spoja
antioksidacijskoj aktivnosti spoja
Veća sposobnost otpuštanja elektrona=niži oksidacijski potencijal=veća
antioksidacijska aktivnost

Za separaciju i kvantifikaciju antocijanina u prirodnim
uzorcima najčešće se koriste metode visokodjelotvorne
tekućinske kromatografije (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC) u kombinaciji s:
UV/Vis,
PDA,
masenim detektorom.
mobilna
faza
pumpa
injektor
kolona
-Shematski prikaz
tekućinskog kromatografa
detektor
obrada
podataka

amperometrijski
konduktometrijski
kulometrijski
potenciometrijski

ELEKTROKEMIJSKI DETEKTOR
protočna ćelija wall-jet tipa, u kojoj je:
radna elektroda elektroda od staklastog ugljika,
referentna elektroda je ISAAC elektroda (in situ Ag/AgCl),
protuelektroda je Pt žica
Outlet
inlet
Radna
elektroda
Pomocna
elektroda
Referentna
elektroda

R O + ne -
signal pobude
RADNA
ELEKTRODA
konst. električni
napon
signal
odziva
struja
detekcija elektroaktivnih supstanci

OSJETLJIVOST
Granice detekcije
- najmanja
količina analita u
uzorku koja se
može detektirati
Granice kvantifikacije
- najmanja količina
analita u uzorku koja se
može kvantificirati
Granice detekcije (LOD) i kvantifikacije (LOQ), izražene u mol L -1 , dobivene
primjenom PDA i elektrokemijskog detektora
Uzorak
oenin
peonidin
mirtilin
kuromanin
PDA detektor
LOD LOQ
1·10 -8 3.6 ·10 -8
3·10 -8 1·10 -8
5·10 -8 1.7·10 -8
3.7·10 -8 1.2·10 -8
Elektrokemijski detektor
LOD LOQ
7.5 ·10 -11 2.5 ·10 -11
4.5 ·10 -11 1.5 ·10 -11
5.3 ·10 -11 1.7 ·10 -11
2 ·10 -11 7·10 -11
Detekcija analita u tragovima

0.1 nA
0.25 mAU
(A)
Kromatogrami dobiveni (A)
elektrokemijskim i (B) PDA
detektorom za otopine
kuromanina koncentracija 5·10 -10
M (─), 1·10 -9 M (─),1·10 -8 M (─)
(B)
4 6 8 10 12
Time (min)
(A)
peonidin
oenin
Kromatogrami ekstrakta kožice
grožđa vrste tinta roriz, razrijeđenog
100-puta. (A) Kromatogram
snimljen elektrokemijskim
detektorom pri potencijalu +0.5 V,
(B) kromatogram snimljen PDA
detektorom, pri valnoj duljini 520
nm
myrtillin
petunidin
1 nA
kuromanin
(B)
4 mAU
6 8 10 12 14 16 18 20 22
Time (min)

PREDNOSTI PRIMJENE ELEKTROKEMIJSKIH DETEKTORA U
KVALITATIVNOJ I KVANTITATIVNOJ ANALIZI
visoka osjetljivost
selektivnost
selektivna detekcija elektroaktivnih spojeva odabirom radnog
potencijala (multi-channel elektrokemijski detektori)
linerana ovisnost visine pika o koncentraciji elektroaktivne vrste
dobra reproducibilnost
cijena
Kromatogrami meda dobiveni primjenom multichannel
elektrokemijskog detektora kod
potencijala: (a) +900 mV, (b) +700 mV, (c) +600
mV, (d) +400 mV.Pikovi: (1) galna kiselina, (2)
protokatehinska kiselina, (3) , vanilinska kiselina,
(kafeinska kiselina), (siringična kiselina), (6) p-
kumarinska kiselina

PRIMJENA:
MEDICINA
Determination of total cholesterol in serum by high
performance liquid chromatography with
electrochemical detection (K. Hojo et.al.)
FARMACIJA
Sensitive quantification of chosen drugs by reversed-phase
chromatography with electrochemical detection at a
glassy carbon electrode (A. Chmielewska et.al.)
PREHRAMBENA INDUSTRIJA
Application of HPLC with electrochemical detection for the
determination of low lewels of antioxidants (M. Škrinjar et.al.)
Determination of phenolic acids in vegetable oil using HPLC coupled with
electrochemical detection (I. Bernweiser et.al.)
EKOLOGIJA
Fast separation and sensitive detection of
carcinogenic aromatic amines by reversed phase m-
liquid chromatography coupled with electrochemical
detection (M. Shelke et.al.)

Cilj istraživanja:
optimizacija HPLC metode za analizu
antocijanina u kožici grožđa
u metodi su korišteni PDA i
elektrokemijski (amperometrijski)
detektor
Za analizu su korištene 4 vrste
grožđa (jaen, tinta roriz, touriga
nacional, alfrosheiro) uzorkovane u
regiji Dão, Portugal.

ZAHVALA
NACINALNOJ ZAKLADI ZA VISOKO ŠKOLSTVO,
OBRAZOVANJE
I TEHNOLOGIJSKI RAZVOJ REPUBLIKE HRVATSKE