MOLEKULARNA BIOLOGIJA – PRIJELOMNA OTKRIĆA

MOLEKULARNA
BIOLOGIJA (MB) U
VETERINI
“… život nije svojstvo jedne ili
više molekula, već interakcije
među njima…” (L. Pauling)

Temeljna područja MB u veterinarskoj medicini:
• GENETIKA
• CITOLOGIJA
• EMBRIOLOGIJA
• FIZIOLOGIJA
• IMUNOLOGIJA

Izvedena područja MB u veterinarskoj medicini:
PATOLOGIJA
I
PATOFIZIOLOGIJA
MIKROBIOLOGIJA
I
PARAZITOLOGIJA
FARMAKOLOGIJA
I
TOKSIKOLOGIJA
DIJAGNOSTIKA
I
VAKCINOLOGIJA
TERAPIJSKO
/REPRODUKCIJSKO
KLONIRANJE

PROGRAM MB
1. Od otkrića gena do genomike
2. Translacija i sinteza proteina
3. Građa i funkcija proteina
4. Ekspresija gena
5. Nadzor nad ekspresijom gena
6. Kloniranje gena - GMO
7. Regulacija staničnog ciklusa
8. Činitelji rasta
9. Prijenos staničnih signala
10. Adhezijske molekule
11. Tumorski geni i protonkogeni
12. Metode molekularne biologije

MOLEKULARNA BIOLOGIJA – PRIJELOMNA OTKRIĆA
•1866. teorija o činiteljim nasljeđivanja – “genima”
Gregor Mendel
•1869. nukleinske kiseline
•1910. geni su smješteni linearno na kromosomima
•1928. transformacijski pokus
F. Meisscher
Thomas H. Morgan
F. Griffith
•1944. DNA nosi nasljedne informacije “transformacijski princip”
C.McLeod i M.
McCarty
O.Avery,
•1952. gen = jedinica nasljeđa (T2 fag)
A.D.Hershey i M.Chase
•1953 građa DNA i otkriće genetskog koda J. D. Watson i F. Crick
•1957. DNA polimeraza
A. Kornberg
• Centralna dogma mol. biologije Crick i Gamov
•1970. Restrikcijske endonukleaze
H.Smith

Prijelomna otkrića - nastavak
• 1978. Tehnologija rekombinanatne DNA W.Arber
H.Smith
D.Nathans
• 1980. Klonirana DNA ( SV 40 u lambda fagu) P.Berg,S.Cohen
• 1983. Lančana reakcija polimerazom (PCR) K.Mullis
• 1988. Transgenični miš – s genom za humani hormon rasta - Patent
• 1990. Genska terapija ex vivo za SCID Anderson
• 1997. Kloniran prvi sisavac - ovca Dolly I.Wilmut
• 2000. Projekt humanog genoma Tvrtka Celera

Otkriće građe DNA -
Nobelova nagrada
Rosalinda Franklin (1920-
1958)

(Rich, 1979) (Watson i Crick, 1953)

E.coli – 5000 gena
H.sapiens – oko 35000 gena

KARTA HUMANOG GENOMA
• Oko 90% redosljeda parova baza = genom je
sekvencioniran (Celera –Projekt Hu genoma)
• “gruba” fizička karta > karta vezanih gena ( novi
geni!)
• 3164,7 milijuna baza, sa 99,9% sličnošću među
ljudima
• 30-35.000 gena od čega < 2% genoma kodira
proteine

• Barem 50% je tzv smeće (junk DNA), jer
nekodira
• Prosječno gen ima oko 3000 baza, a najveći
2,4 mlijuna baza (distrofin)
• oko 3 milijuna mjesta u genomu s razlikama
u 1 bazi (geni povezani s bolestima, evolucija
čovjeka)

KARTIRANI GENOMI:
- E. COLI (BAKTERIJA)
- S. CEREVISIAE (KVASAC)
- CAENORHABDITIS ELEGANS (CRV)
- D. MELANOGASTER (VINSKA MUŠICA)
- MIŠ I ŠTAKOR
- SVINJA

- FIZIČKA KARTA-SLIJED PAROVA BAZA (PB) – RAZMAK U
BROJU PB IZMEĐU GENA, RESTRIKCIJSKIH MJESTA,
RFLP I JEDINSTVENIH SEKVENCI U GENOMU
- IZRADA KARTE VEZANIH GENA – RAZMAK IZMEĐU
GENA IZRAŽEN U % REKOMBINACIJE
ČOVJEK: 2N = 46 SA PO 1 MOLEKULOM DNA (PO 23 OD OCA I MAJKE)
LJUDSKI GENOM: 24 KROMOSOMA (22 AUTOSOMA I 2 GONOSOMA – X I Y)
BROJ RAZLIČITIH MOLEKULA DNA: 24, A SVAKA SA PO 50X10 6 DO 250X10 6 PB
ILI UKUPNO 3X10 9 PB
ZIGOTA I 2N STANICE: SA 2 KOPIJE AUTOSOMA (ALELNIH GENA) + 1 KOPIJA
GONOSOMA = 6 X 10 9 PB

GENOMIKA
istraživanje gena i njihove funkcije (strukturalna = fizička priroda genoma,
funkcijska = KARAKTERIZIRANJE TRANSKRIPTOMA I PROTEOMA)
FIZIČKA KARTA GENOMA
KARTA VEZANIH GENA ili RFLP
razmak između gena – broj PB
Razmak između gena - % rekombinacija
Razmak između restrikcijskih mjesta Sturtevant > Morgan ( D. melanogaster) 1% = 1
centimorgan
Razmak između RFLP i jedinstvenih sekvenci
genoma
1 centimorgan = 10 6 PB (H. sapiens)
E.coli, S.cervisidae, crv, D.melanogaster, miš
Baza podataka za:
-otkrivanje novih gena
-homolognih gena
-In vitro mutagenzu i nokautiranje radi dobivanja
mutiranih fenotipova = potvrda tog gena
Farmakogenomika:
-dizajniranje ljekova i cjepiva
-DNA dijagnostike
- genska terapija

PRIMJENA DNA TIPIZACI
ŽIVOTINJA U VETERINI

DNA – ishodna molekula života
Raspored baza na pojedinim
genskim lokusima duž
kromosoma specifični je,
jedinstveni genetički kod
svake jedinke.

DNA
• prokariotska – najvećim
dijelom kodira proteine
• eukariotska – samo mali
dio (2% u čovjeka) ima
kodirajuću ulogu
• 1968.g. Roy Britten i sur.
– otkriće brojnih
ponavljajućih sekvenci u
eukariotskoj DNA

Visokoponavljajuća (repetitivna)
DNA
• Raspršena – ponavljanja pojedinačno po genomu
- prema duljini ponavljajuće sekvence razlikujemo:
1) SINEs - Short Interspersed Nuclear Elements
2) Lines – Long Interspersed Nuclear Elements
• Nagomilana – ponavljanja slijede jedno za drugim
- prema duljini sekvence, broju ponavljanja i
smještaju dijelimo ih na:
1) makrosatelite
2) minisatelite
3) mikrosatelite

SATELITSKA DNA – genski
• makrosateliti:
40-500pb; 3-20kb,
heterokromatin
• minisateliti/VNTRs
(Variable Number of
Tandem Repeats):
10-40pb; od 100 do više
1000 kb,
eukromatin
• mikrosateliti/STRs (Short
Tandem Repeats)
1-4pb; do 100 ponavljanja,
eukromatin
biljezi

STRs - idealni genski markeri
• rasprostranjenost dužinom kromosoma
• visok stupanj raznolikosti (polimorfizma)
- broj uzastopnih ponavljanja u lokusu izrazito je
varijabilan među jedinkama neke vrste
- broj ponavljanja na paru kromosoma također je
najčešće različit --› visok stupanj heterozigotnosti
• mendelsko kodominantno nasljeđivanje
• visok stupanj mutacija

DNA TIPIZACIJA
- vrlo osjetljiva identifikacijska
metoda
- određivanje i analiza broja STRs na
jednom ili više lokusa

PRIMJENA DNA TIPIZACIJE
• mogućnost razlikovanja bilo koje dvije jedinke,
osim jednojajčanih blizanaca neovisno o
filogenetskoj, fenotipskoj ili rodbinskoj srodnosti
• kliničke metode (preventiva, dijagnostika i
terapija)
• evolucijska i populacijska istraživanja
• kriminalistika i forenzika
• paleontološka istraživanja
• biotehnološka istraživanja

GENOTIPIZACIJA
populacije......

....pasmine....

....ili vrste

Testiranje očinstva
• otklanja zloporabe
• pomaže u riješavanju
sudskih sporova
• identifikacija roditelja
i potomaka
• 99% točnosti

Identifikacija gena odgovornih za
proizvodnost, imunoreaktivnost i
otpornost na bolesti

Dijagnostika štetnih mutacija u
uvijetima intenzivne proizvodnje
• umjetni odabir temeljen na
otkrivanju gena odgovornih
za razinu imunobiološke
reaktivnosti, otpornosti na
bolesti i prilagodbe stresu u
maksimalnim uvjetima
proizvodnje
• “MAS” – Marker Assisted
Selection

Utvrđivanje porijekla mesa

Što je na tanjuru.......
• godišnji se obradi 5500
uzoraka u laboratoriju za
forenzičku veterinu i
kriminalistiku u SAD
• dokazivanje porijekla
mesa koje se prodaje kao
lavlje (legalizirano u
SAD), a često potječe od
tigra (zakonom zaštićene
vrste)