Ivana Jovanovic MT.pdf (7089 KB) - Institut tehničkih nauka SANU

Ivana Jovanović
Magistarska teza
4.3.3 Rezultati SDS-PAGE elektroforeze prahova kompozita
(PDLLA+BSA i PDLLA+HRP)
Kvalitativna analiza kompozitnog praha sastavljanog od polimera PDLLA i proteina, BSA ili
HRP, je urađena primenom elektroforeze. Za razdvajanje i karakterizaciju proteina korišćena je
tehnika jednodimenzionalne elektroforeze u poliakrilamidnom gelu u prisustvu sodium-dodecilsulfata
(SDS-PAGE) po modifikovanoj metodi Sambrook-a i sar. (1989) [118], koju je postavio Laemmli
(1970) [119].
Ova metoda se zasniva na razdvajanju proteina na osnovu njihovih molekulskih masa, gde
poliakrilamidni gel služi kao inertni matriks kroz čije se pore proteini kreću pod uticajem električnog
polja. Veličina pora varira u zavisnosti od procenta akril- i bis-akrilamida u gelu i podešava se prema
opsegu molekulskih masa proteina koji se razdvajaju. Negativno naelektrisani molekuli SDS-a,
prisutni u rastvoru u kome se resuspenduju uzorci, vezuju se svojim hidrofobnim delom za
hidrofobne delove molekula proteina. Pošto je količina SDS-a vezanog za jedinicu mase proteina
konstantna (1.4 g SDS-a / 1 g proteina), šarža proteina je određena SDS-om a ne šaržama amino
kiselina. Tako je veličina negativne šarže svakog proteina direktno proporcionalna njegovoj
molekulskoj težini. U električnom polju, tokom elektroforeze, negativno naelektrisani proteini kreću
se ka pozitivnom polu kroz poliakrilamidni gel koji služi kao molekulsko sito. Ovako se proteini
razdvajaju u niz diskretnih traka koje postaju vidljive nakon bojenja gelova.
U eksperimentima je kao gel za razdvajanje korišćen 12% poliakrilamidni gel sledećeg
sastava: 11.7% akrilamid, 0.3% metilen-bis-akrilamid, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 0.1% SDS, 0.05%
amonijum - persulfat i 0.05% TEMED (tetrametil-etilen-diamin). Preko polimerizovanog gela za
razdvajanje u pločama, naliven je 4% gel za skoncentrisavanje uzoraka u sastavu: 3.9% akrilamid,
0.1% metilen-bis-akrilamid, 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 0.05% amonijum - persulfat, 0.1%
TEMED. Proteini su pre nanošenja na elektroforezu rastvoreni u puferu za uzorke: 2% SDS, 0.0625
M Tris-HCl, pH 6.8, 5% β-merkaptoetanol, 8.8% glicerol i 0.05% bromfenol plavo. Kao pufer za
elektroforezu korišćen je Tris-glicinski pufer, pH 8.8: 0.195 M glicin, 25 mM Tris-HCl, pH 8.8, 0.1%
SDS. Kroz gel za skoncentrisavanje uzorci su putovali pri naponu 0.12 kV, a nakon ulaska u gel za
razdvajanje napon je povećan na 0.15 kV. Elektroforeza je trajala jedan sat, odnosno do izlaska boje
bromfenol plavo iz gela, a rađena je u mini Bio-Rad sistemu (Mini-PROTEAN II electrophoresis cell).
Po završetku elektroforeze gelovi su bojeni Coomassie plavim.
Bojenje proteina u poliakrilamidnom gelu
Nakon elektroforeze proteini su bojeni potapanjem gela u rastvor: 0.2% Coomassie plavo
(Coomassie Brilliant Blue R-250), 45% metanol i 10% glacijalna sirćetna kiselina, preko noći uz
mešanje. Odbojavanje gelova, u cilju uklanjanja nespecifično vezane boje, vršeno je u smeši
metanola, vode i glacijalne sirćetne kiseline u odnosu 4.5 : 4.5 : 1 (v/v).
Sa gela elektroforeze se može potvrditi prisustvo proteina u različitim serijama. Trake
predstavljaju serije koje su rađene pod različitim uslovima i navedene su u tabeli 3.3. Na osnovu
93