Zastosowanie spektroskopii dielektrycznej w badaniach in vitro ...

PRACE ORYGINALNE
Jan OLSZEWSKI 1
Ewa MARZEC 1
Ewa FLOREK 2
Maksymilian KULZA 2
W³odzimierz SAMBORSKI 3
Monika SEÑCZUK-PRZYBY£OWSKA 2
Jan ZAWADZIÑSKI 1
Jacek PI¥TEK 4
Zastosowanie spektroskopii dielektrycznej
w badaniach in vitro rogówki szczura przed
ekspozycj¹ na dym tytoniowy
Use of the dielectric spectroscopy for in vitro studies of
rat cornea before tobacco smoke exposure
1
Zak³ad Bioniki i Bioimpedancji,
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ
p.o. Kierownika: Dr hab. Ewa Marzec
2
Laboratorium Badañ Œrodowiskowych,
Katedra i Zak³ad Toksykologii,
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ
Kierownik: prof. dr hab. Ewa Florek
3
Klinika Reumatologii i Rehabilitacji,
Katedra Fizjoterapii, Reumatologii
i Rehabilitacji, Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ
Kierownik:
Prof. dr hab. med. W³odzimierz Samborski
4
Katedra i Zak³ad Fizjologii,
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ
Kierownik: Prof. dr hab. med. Teresa Torliñska
Dodatkowe s³owa kluczowe:
luŸno zwi¹zana woda
energia aktywacji
wi¹zania wodorowe
dielektryczna spektroskopia
rogówka
Additional key words:
loosely bound water
activation energy
hydrogen bonds
dielectric spectroscopy
cornea
Adres do korespondencji:
Dr hab. Ewa Marzec
Zak³ad Bioniki i Bioimpedancji
Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
Parkowa, ul. Parkowa 2
e-mail: ewaklcde@amu.edu.pl
W pracy przedstawiono wyniki badañ
in vitro w³aœciwoœci dielektrycznych
rogówki szczura wykonane w
funkcji temperatury (25-150oC) i czêstotliwoœci
pola elektrycznego (500Hz-
100kHz). Uwalnianie wody luŸno zwi¹zanej
z rogówki uwidocznione jest jako
temperaturowe piki wspó³czynnika
strat dielektrycznych w pobli¿u 55 o C.
W tym zakresie temperatur amplituda
tych pików jest prawie niezale¿na od
czêstotliwoœci. Otrzymane wartoœci
liczbowe energii aktywacji 19kJ/mol i
35kJ/mol zwi¹zane z uwalnianiem
wody z rogówki s¹ wymagane do
transportu protonów i innych jonów
podczas zrywania wi¹zañ wodorowych
w tej tkance. Informacje dotycz¹ce w³aœciwoœci
dielektrycznych rogówki
szczura mog¹ staæ siê pomocne w
badaniach rogówki poddanej dzia³aniu
dymu tytoniowego.
Wstêp
Konsekwencje palenia tytoniu s¹ dobrze
znane lekarzom w klinice i ekonomistom
analizuj¹cym narastaj¹ce wydatki zwi¹zane
z ratowaniem ¿ycia i zdrowia osób pal¹cych
i by³ych palaczy.
Sk³adniki dymu tytoniowego mog¹ wywo³ywaæ
szereg chorób. Do najwa¿niejszych
i najczêstszych nale¿¹ choroby nowotworowe,
choroby uk³adu oddechowego i uk³adu
kr¹¿enia. Rezygnacja z palenia tytoniu oczywiœcie
zmniejsza ryzyko choroby, ale skutki
wieloletniego palenia organizm prêdzej czy
póŸniej zamanifestuje. Tak jak w poszukiwaniu
nowych leków, metod leczenia, sposobów
diagnozowania, tak i w znaczeniu
poznawczym, wykorzystuje siê badania
przedkliniczne w ocenie oddzia³ywania palenia
tytoniu na organizm. Takie badania
wykonane ró¿nymi metodami pozwalaj¹
oceniæ miêdzy innymi zdrowe i zmienione
chorobowo tkanki.
Dym tytoniowy i jego sk³adniki nie s¹
obojêtne dla narz¹du wzroku. Mog¹ powodowaæ
retinopatiê, przyspieszaæ kataraktogenezê,
nadmiar wolnych rodników mo¿e
zak³ócaæ homeostazê w cieczy wodnistej
komór oka. Z przodu ga³ki ocznej znajduje
siê rogówka, która wspó³decyduje o prawid³owej
funkcji optycznej oka. Nazywana jest
przez niektórych autorów prac „oknem”, poprzez
które promienie œwietlne docieraj¹ do
Dielectric measurements in vitro as
a function of temperature (25-150oC)
and frequency of the electric field
(500Hz-100kHz) are reported for rat
cornea. The release of loosely bound
water from the corneal is manifested
by the temperature peaks of the loss
tangent near 55oC. In this temperature
range the magnitude of these peaks is
nearly independent of frequency. The
obtained activation energy of 19kJ/mol
and 35kJ/mol associated with the release
of water from the cornea is
needed for the conduction of protons
and other ions during the break up of
hydrogen bonds in this tissue. The information
on the dielectric behavior of
rat cornea might become handy in
course of research on tobacco smokecorneal
tissue.
siatkówki. W œrodowisku dymu tytoniowego
nara¿ona jest ona na dzia³anie jego
sk³adników zarówno od zewn¹trz, jak i od
wewn¹trz organizmu. Sk³adniki dymu tytoniowego,
które trafiaj¹ do organizmu docieraj¹
do rogówki od wewn¹trz poprzez uk³ad
kr¹¿enia i dalej ciecz wodnist¹, a od zewn¹trz
rogówki poprzez film ³zowy i ³zy.
W badaniach spektroskopii dielektrycznej
rogówki brakuje wiedzy na temat zmian
w niej wystêpuj¹cych pod wp³ywem sk³adników
dymu tytoniowego. Porównanie parametrów
dielektrycznych oceniaj¹cych rogówki
przed i po ekspozycji zwierz¹t na dym
tytoniowy wydaje siê interesuj¹ce i jest badaniem
pionierskim.
Niniejsza praca stanowi czêœæ pierwsz¹
oceniaj¹c¹ fizjologiczne parametry dielektryczne
rogówki szczura przed ekspozycj¹
na dym tytoniowy.
Celem pracy jest ocena parametrów dielektrycznych
w badaniach in vitro rogówki
szczura przed ekspozycj¹ na dym tytoniowy
dla wybranych czêstotliwoœci pola elektrycznego
i temperatury.
Materia³ i metoda
Badania przeprowadzono na bia³ych szczurach
szczepu Wistar, samcach o œredniej masie cia³a 422 g.
Zwierzêta przebywa³y w temperaturze powietrza 20-
22 o C, wilgotnoœci powietrza 50-60% oraz w oœwietleniu
noc/dzieñ 12 godzin/dobê. Materia³ biologiczny od zwie-
832 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 J. Olszewski i wsp.

T - temperatura i
DH - energia aktywacji.
Na podstawie powy¿szej zale¿noœci obliczona
energia aktywacji DH przewodnoœci
w³aœciwej rogówki zmniejsza siê od ~35 kJ/
mol do ~19 kJ/mol dla zakresu czêstotliwoœci
od 2 kHz do 100 kHz.
Rycina 1
Temperaturowe zale¿noœci wspó³czynnika strat dielektrycznych rogówki dla kilku wybranych czêstotliwoœci
(D2kHz, ¸10kHz, X 60kHz, ¨ 100kHz).
Temperature dependencies of the loss tangent for cornea at several frequencies (D2kHz, ¸10kHz, X 60kHz, ¨
100kHz).
Rycina 2
Zale¿noœæ log s od (T) -1 rogówki dla kilku wybranych czêstotliwoœci (D2kHz, ¸10kHz, X 60kHz, ¨ 100kHz).
The variation of log s versus (T) -1 for the cornea at several frequencies (D2kHz, ¸10kHz, X 60kHz, ¨ 100kHz).
rz¹t zosta³ pobrany po ich uœmierceniu w ramach równoleg³ych
eksperymentów na zwierzêtach, na które otrzymano
zgodê Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doœwiadczeñ
na Zwierzêtach w Poznaniu, Nr 26/2010 z
dnia 5 marca 2010 roku. Po uœpieniu szczurów poprzez
podanie im domiêœniowo ksylazyny z ketamin¹ odpowiednio
w dawce 40 mg/kg i 5 mg/kg masy cia³a, podczas
sekcji z grupy kontrolnej licz¹cej 12 zwierz¹t pobrano
rogówki, które zabezpieczono w pojemnikach z
0,9% NaCl. Nastêpnie rogówki by³y p³ukane w wodzie
destylowanej i suszone w temperaturze otoczenia.
W celu wykonania badañ w³aœciwoœci dielektrycznych
in vitro rogówki na³o¿ono na obie jej powierzchnie
elektrody z pasty srebrnej. Pomiary wykonano przy pomocy
analizatora impedancji HIOKI 3522-50 LCR w zakresie
czêstotliwoœci f pola elektrycznego 500Hz - 100kHz
i w zakresie temperatur T od 25 do 150 o C. Zmierzonymi
parametrami dielektrycznymi by³y: wspó³czynnik strat dielektrycznych
tan d i przewodnoœæ w³aœciwa s.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia temperaturowe
zale¿noœci wspó³czynnika strat dielektrycznych
tan d rogówki wykonane dla wybranych
czêstotliwoœci pola elektrycznego w
zakresie od 2 kHz do 100 kHz.Wystepuj¹ce
maksimum tan d w okolicy 55 o C dla
ka¿dej czêstotliwoœci wskazuje na obecnoœæ
wody luŸno zwi¹zanej w badanej tkance,
która zosta³a zaabsorbowana przez rogówkê
w warunkach in vitro. Dla rosn¹cych czêstotliwoœci
amplituda tych pików maleje.
Podobny charakter zmian parametrów dielektrycznych
zaobserwowano równie¿ dla
innych tkanek [4,5].
Na rycinie 2 uwidoczniono zale¿noœci
przewodnoœci w³aœciwej s od odwrotnoœci
temperatury T. Liniowy przebieg tych krzywych
w zakresie temperatur od 3,4K-
1(25 o C) do 3,0K-1(55 o C) jest opisany zale¿-
noœci¹ Arrheniusa:
log s = log s 0
- DH/kT (1)
gdzie: k - sta³a Boltzmana,
Omówienie
Uwidocznione na rycinie 1 temperaturowe
zale¿noœci tan d rogówki s¹ analizowane
w oparciu o typowe dla obszaru a-dyspersyjnego
mechanizmy polaryzacji Maxwell-Wagner-Sillars
(MWS) oraz przewodnictwa
protonowego [3,6,7]. Polaryzacja
MWS powstaje w wyniku gromadzenia siê
protonów na granicy faz o ró¿nych w³aœciwoœciach
dielektrycznych. W prezentowanej
pracy rogówkê rozpatruje siê jako uk³ad
biologiczny wielofazowy, co wynika z jej niejednorodnej
budowy strukturalnej. Z tego powodu,
w³aœciwoœci dielektryczne rogówki reprezentowane
s¹ przez uk³ad nab³onek -
istota w³aœciwa - œródb³onek - woda (epithelium-stromal-endothelium-water).
W tym
uk³adzie biologicznym woda posiada du¿¹
przewodnoœæ w³aœciw¹ s w porównaniu do
pozosta³ych faz strukturalnych rogówki. Jednak¿e
o przewodnictwie elektrycznym w tej
tkance decyduj¹ protony a nie cz¹steczki
wody, które s¹ unieruchomione przez wi¹zania
wodorowe utworzone z grupami polarnymi
³añcuchów bocznych bia³ek nab³onka
i œródb³onka. Na podstawie charakteru
temperaturowych zale¿noœci tan d (rycina 1)
mo¿na wnioskowaæ, ¿e wzrost temperatury
wp³ywa na zmianê iloœci i ruchliwoœci protonów
w wyniku dekompozycji wody. Jak wynika
z wczeœniejszych badañ materia³ów
biologicznych przy pomocy metod termicznych
[1,2,8], proces uwalniania wody polega
na zrywaniu wi¹zañ wodorowych oraz
dyfuzji cz¹steczek wody z badanych uk³adów
biologicznych. Z badañ tych wynika
równie¿, ¿e uwalnianie wody jest procesem
ci¹g³ym i obejmuje szeroki zakres temperatur
od temperatury otoczenia a¿ do 200 o C
jako rezultat wystêpowania w tkankach wody
o niejednakowej energii wi¹zañ. Podobne
zachowanie uk³adu rogówka-woda zaobserwowano
w prezentowanej pracy. Na podstawie
temperaturowych zale¿noœci tan d badanej
rogówki obliczono energiê aktywacji
przewodnictwa protonowego zwi¹zanego z
dekompozycj¹ wody. Uwalnianie wody wymaga
odpowiedniej energii aktywacji, która
musi byæ odpowiednio wiêksza od energii
wi¹zañ jakie tworz¹ cz¹steczki tej wody w
swoim œrodowisku oraz z bia³kami nab³onka
i œródb³onka rogówki. Otrzymane w tej
pracy wartoœci liczbowe energii aktywacji DH
niezbêdnej do uwolnienia z tkanki wody luŸno
zwi¹zanej s¹ porównywalne z energi¹
wi¹zañ wodorowych. Wartoœci DH dla
100kHz s¹ oko³o dwukrotnie mniejsze ni¿
te dla 2 kHz. Wynika to z faktu, ¿e fala elektromagnetyczna
o wiêkszej czêstotliwoœci,
a zatem o mniejszej d³ugoœci oddzia³uje na
wiêksz¹ iloœæ protonów, co widoczne jest w
wy¿ej po³o¿onej krzywej przewodnoœci w³aœciwej
dla 100 kHz w porównaniu z t¹ dla 2
kHz (rycina 1).
Wnioski
Przedstawione w pracy temperaturowe
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
833

zale¿noœci tan d rogówki s¹ rezultatem wyst¹pienia
w badanym materiale mechanizmów
polaryzacji Maxwell-Wagner-Sillars
(MWS) oraz przewodnictwa protonowego.
W³aœciwoœci polaryzacyjne rogówki ujawni³y
siê na granicy faz uk³adu nab³onek - istota
w³aœciwa - œródb³onek - woda. Energia aktywacji
przewodnictwa protonowego o wartoœci
porównywalnej z energi¹ wi¹zañ wodorowych
jest odpowiedzialna za dekompozycjê
wody.
Piœmiennictwo
1. Aluigi A., Zoccola M., Vineis C. et al.: Study on the
structure and properties of wool keratin regenerated
from formic acid. Int. J. Biol. Macromol. 2007, 41,
266.
2. Barone J.R., Schmidt W.F.: Effect of formic acid
exposure on keratin fiber derived from poultry feather
biomass. Bioresource. Technol. 2006, 97, 233.
3. Grimnes S., Martinsen O.G.: Bioimpedance and
Bioelectricity Basics. Academic Press, 2000.
4. Jab³ecka A., Olszewski J., Marzec E.: Dielectric
properties of keratin-water system in human fingernail.
J. Non-Cryst. Solids 2009, 355, 2456.
5. Marzec E., Pietrucha K.: The effect of different methods
of cross-linking of collagen on its dielectric properties.
Biophys. Chem. 2008, 132, 89.
6. Marzec E., Olszewski J., Grzeœkowiak E. et al.:
Dielectric studies of the paracetamol-lenticular tissue
interactions. Colloids Surf. B Biointerfaces 2011,
84, 131.
7. Pethig R.: Dielectric and electronic properties of biological
materials. Wiley, Chichester, 1979.
8. Tonin C., Aluigi A., Songia M.B. et al.: Thermoanalytical
characterisation of modified keratin fibres.
J. Therm. Anal. Calorim. 2004, 77, 987.
834 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 J. Olszewski i wsp.